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KR20180104145A - 면역 크로마토그래피 장치 - Google Patents

면역 크로마토그래피 장치 Download PDF

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Publication number
KR20180104145A
KR20180104145A KR1020187025156A KR20187025156A KR20180104145A KR 20180104145 A KR20180104145 A KR 20180104145A KR 1020187025156 A KR1020187025156 A KR 1020187025156A KR 20187025156 A KR20187025156 A KR 20187025156A KR 20180104145 A KR20180104145 A KR 20180104145A
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KR
South Korea
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organic acid
sample
nitrite
specimen
immunochromatographic
Prior art date
Application number
KR1020187025156A
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English (en)
Inventor
게이타 스즈키
유야 가토
히사히코 이와모토
Original Assignee
다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명의 과제는, 아질산 화합물과, 유기산 등을 함유하는 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 장치 보존 중에 있어서의 아질산의 발생을 억제함으로써 보존 안정성을 향상시키고, 또한 장치 보존 중의 아질산의 발생을 억제함으로써, 장치의 사용시의 아질산 생성 효율을 높여, 고감도로 검출 대상을 검출하는 데 있다. 본 발명은, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치이며, 시료 적하 부재, 표지 물질 유지 부재, 크로마토그래프 매체 부재 및 흡수 부재가 이 순서대로 시료가 전개되도록 배치되고, 표지 물질 함유 부위보다 상류측에, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위를 갖고, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는 면역 크로마토그래피 장치에 관한 것이다.

Description

면역 크로마토그래피 장치
검체 중의 검출 대상을 검출하는 간편한 체외 진단 키트 또는 휴대용 진단 장치로서 중요성이 높은 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 면역 크로마토그래피 검출 방법에 관한 것이다.
최근 몇년간, 면역 크로마토그래피용 스트립 형식의 면역 검정은, 항체가 갖는 특이적 반응성을 이용하여, 검체 중의 검출 대상을 검출하는 간편한 체외 진단 키트 혹은 휴대용 진단 장치로서 범용성이 높아지고 있다.
특히, 최근에는, 인플루엔자 바이러스나 세균과 같은 병원체에 대한 감염의 유무를 검사하기 위한 면역 크로마토그래피법에 기초한 간편한 검사 도구에 대해서도 관심이 높아져, 연구 개발이 진행되어 왔다.
용혈성 연쇄구균(이하, 「용련균」이라고도 말함)의 진단은, 군 특이적인 다당체를 항원으로 하여 검사함으로써 행한다. 다당체의 추출법으로서는, 효소나 파지(phage), 염산이나 차아염소산 등을 사용한 방법이 알려져 있지만, 아질산을 사용하는 추출법이 가장 일반적이다.
아질산에 의한 추출법은, 다당체의 추출 효율이 높다는 점과 아질산이 저가격이며 취급이 용이하다는 점에 장점이 있다. 그러나, 아질산 자체가 불안정하며 분해되기 쉬운 화합물이기 때문에, 추출 전에 아질산나트륨 등의 아질산 화합물과 아세트산 등의 유기산을 혼합하여, 그때마다 아질산을 제조해야 한다는 점에 단점이 있다.
또한, 항상적으로 진단을 행하는 경우, 그때마다 아질산을 제조하는 것은 의사나 검사 기사 등에게는 큰 부담이 된다. 또한, 혼합 공정을 포함하기 때문에, 시약의 혼합 실수 등에 의해 올바른 안전한 진단을 행할 수 없게 될 가능성도 있다.
이 문제점을 극복하기 위해, 용혈성 연쇄구균으로부터의 다당 항원을 추출하는 공정을 간이화하기 위한 간편한 검사 도구에 대해서도 연구 개발이 진행되어 왔다.
예를 들어, 특허문헌 1에서는 생물(특히, 연쇄구균 A군 또는 B군)로부터의 다당 항원을 추출하는 방법에 있어서, a. 측정량의 아질산염이 배어들어 건조되어 있는 제1 흡수성 물질, b. 측정량의 중화 염기 및 완충액이 배어들어 건조되어 있는 제2 흡수성 물질, c. 측정량의 산의 수용액을 조합한 키트를 사용한 간이화한 추출 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1 참조).
연쇄구균과 등의 미생물/세균성 생물체에 특징적인 탄수화물 항원을 검출하기 위한 분석 장치나 방법에 관해서는, 이미 출시 판매되고 있는 것도 있으며, 예를 들어 면역 크로마토그래피 시약으로서는, 퀵 뷰 DipStick StrepA(DS 파마 바이오 메디컬)나 스트렙 A 테스트팩·플러스 OBC(산와 가가꾸 겡뀨쇼) 등이 있으며, 또한 슬라이드 라텍스 응집법 시약으로서는 A 스트렙토 AD 「세이켄」(덴카 세이켄) 등이 알려져 있다.
그런데, 면역 크로마토그래피 시약의 시판품에 있어서는, 일반적으로 검체의 시험에서 양성이라 판정되기 위해서는, 직접법에서는 용련균 농도가 1×106CFU/mL 이상일 것이 필요하다고 되어 있다.
그 때문에, 용련균 농도가 1×106CFU/mL 미만인 경우에는, 양성임에도 불구하고 음성이라고 판정된다는 문제나, 불용성 담체로 항체를 표지한 면역 크로마토그래피 시약은 일반적으로 효소 면역 측정법(EIA)과 비교하여 감도가 낮기 때문에, 양성인 경우에 관찰되는 라인이 명료하지 않다는 문제, 나아가 시료액 중에 피검출 물질(항원 등)이 존재하지 않음에도 불구하고 양성이라 판정되는, 소위 위양성(false positive)이 발생한다는 문제가 있었다.
또한, 불용성 담체(금 콜로이드 입자 및 착색 라텍스 입자 등)로 항체를 표지한 면역 크로마토그래피법에 있어서는, 측정 시료나 측정 환경, 측정 조건 등에 따라서는 불용성 담체의 응집이 일어나고, 비특이 반응이 일어나는 경우가 있으며, 전개 속도가 느리다는 등의 문제점은 해결할 수 없는 경우가 있다.
그 때문에, 개개의 측정 시료나 측정 환경, 측정 조건을 채용한 면역 크로마토그래피법에 있어서, 불용성 담체의 응집이 일어나지 않고, 비특이 반응이 일어나는 일이 없으며, 전개 속도가 빠른 검사약이 탐구되어 왔다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 지금까지 면역 크로마토그래피법으로 세균을 검사할 때에는, 사용하는 시료 추출액이나 검사 디바이스 중에 환상 올리고당 및/또는 아질산염을 함유시킨 검사약을 개발하였다(특허문헌 2 참조).
상기 검사약은, 시료 추출액인 전개액이 검사 디바이스 전개 중에 유지되고 있는 유기산이나, 검사 중에 생성되는 아질산에 의해 pH 조건이 변화되어도, 검체 또는 면역 크로마토그래피 디바이스 중의 단백질 성분 등이 변성·석출되어, 판정 라인에 걸려, 비특이적인 반응을 유발하지 않고, 또한 항체 고정 입자 콜로이드의 응집을 일으키지 않는, 검사 정밀도가 높고, 또한 전개 속도가 빠른 검사약이다.
또한 상기 검사 디바이스는, 아질산을 그때마다 용시 제조를 하지 않고, 검사 디바이스 상에서 환상 올리고당의 존재하에서 아질산을 생성시킬 수 있기 때문에 검사 효율, 검사 정밀도 및 에너지 절약화를 향상시키는 것이 가능하게 되어 있다.
일본 특허 공표 평7-503543호 공보 일본 특허 공개2015-34719호 공보
그러나, 상기 검사 디바이스에는, 보존 안정성이라는 관점에서 이하와 같은 개선해야 할 점이 있다는 것을 알 수 있었다.
유기산 및 아질산염을 함유시킨 종래의 검사 디바이스에 있어서는, 검사 디바이스의 보존 중에 일부의 유기산과 아질산염이 검사 디바이스 내에서 확산됨으로써, 양자가 접촉하여, 아질산이 발생해버릴 우려가 있다는 것을 알 수 있었다. 검사 디바이스의 보존 중에 아질산의 발생이 진행되면, 실제로 검사 디바이스를 사용할 때에는, 아질산의 발생이 불충분해져 검출 대상의 추출 효율이 저하되어버려, 검출 감도가 떨어져버린다. 따라서, 이 점에서 검사 디바이스의 보존 안정성을 향상시킬 여지가 있었다.
또한, 상기 검사 디바이스가 함유하는 환상 올리고당은, 아질산염의 안정화에는 필요했지만, 한편으로 환상 올리고당은 점성을 갖는 물질이기 때문에, 측정 시료, 측정 환경에 따라서는 위양성을 일으키기 쉬운 물질이었다. 따라서, 환상 올리고당을 사용하지 않고 디바이스 보존 중의 아질산염을 안정화할 수 있는 방법도 요망되고 있다.
그래서, 본 발명의 목적 및 과제는 보존 안정성이 향상되고, 검출 대상을 고감도로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 그것을 사용한 면역 크로마토그래피 검출 방법을 제공하는 데 있다.
특히, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 당해 장치 보존 중의 아질산의 발생을 억제함으로써, 보존 안정성이 향상된 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 그것을 사용한 면역 크로마토그래피 검출 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 면역 크로마토그래피 장치의 보존 안정성을 향상시킴으로써, 당해 장치의 사용시의 아질산 생성 효율을 높여, 검출 대상을 고감도로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 그것을 사용한 면역 크로마토그래피 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭하였다. 그 결과, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위가 특정한 위치 관계를 가짐으로써, 당해 장치 보존 중에 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체가 장치 내에서 확산되고, 양자가 접촉함으로써 일어나는 아질산의 발생을 억제할 수 있으며, 보존 안정성이 높은 면역 크로마토그래피 장치를 제공할 수 있었다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
1. 시료 적하 부재와, 표지 물질 함유 부위를 갖는 표지 물질 유지 부재와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체 부재와, 흡수 부재를 포함하고, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치이며,
상기 시료 적하 부재, 상기 표지 물질 유지 부재, 상기 크로마토그래프 매체 부재 및 상기 흡수 부재가 이 순서대로 시료가 전개되도록 배치되고,
상기 표지 물질 함유 부위보다 상류측에, 상기 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 상기 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위를 갖고,
상기 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 상기 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는
면역 크로마토그래피 장치.
2. 상기 유기산 또는 유기산 유도체가 하기 일반식 (1)로 표시되는 질소 함유 복소환 화합물인 상기 1에 기재된 면역 크로마토그래피 장치.
Figure pct00001
(식 (1) 중, R1, R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 카르보닐기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기를 나타내고, 알킬기는 서로 결합하여 환을 형성하고, 지환식 탄화수소환 혹은 방향족 탄화수소환을 형성해도 된다.
A는 단결합 또는 이중 결합을, X는 -C(=O)- 또는 -(CH2)n-을, Y는 탄소 원자 또는 질소 원자를 나타내고, n은 1 또는 2이다.
Z는 수소 원자, 수산기, 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, -C(=O)R3 또는 -O-C(=O)R3을 나타낸다. R3은 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, 알콕시기를 나타낸다.)
3. 상기 유기산 또는 유기산 유도체가 프탈이미드, N-아세틸프탈이미드, N-(tert-부톡시카르보닐옥시)프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-아세톡시숙신이미드 및 히단토인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 상기 1 또는 2에 기재된 면역 크로마토그래피 장치.
4. 상기 아질산 화합물이 아질산염인 상기 1 내지 3 중 어느 것에 기재된 면역 크로마토그래피 장치.
5. 상기 검출 대상이 그램 양성균인 상기 1 내지 4 중 어느 것에 기재된 면역 크로마토그래피 장치.
6. 상기 그램 양성균이 용혈성 연쇄구균인 상기 5에 기재된 면역 크로마토그래피 장치.
7. 상기 1 내지 6 중 어느 것에 기재된 면역 크로마토그래피 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는, 면역 크로마토그래피 키트.
8. 상기 7에 기재된 면역 크로마토그래피 키트를 사용하여 검체 중의 검출 대상을 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (i) 내지 (v)를 포함하는 면역 크로마토그래피 검출 방법.
(i) 검체 희석액에 의해 검체를 희석하여 얻어지는 검체 함유액을 시료 적하 부재에 적하하는 공정
(ii) 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체의 반응에 의해 생성된 아질산에 의해, 검체 중의 검출 대상으로부터 피검출 물질을 추출하는 공정
(iii) 표지 물질 유지 부재에 있어서 피검출 물질을 표지화하는 공정
(iv) 검체 함유액이 크로마토그래프 매체 부재 상을 이동하여, 검출부에 있어서 검출 대상을 검출하는 공정
(v) 검체 함유액이 흡수 부재에 의해 흡수되는 공정
본 발명에서는, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위가 특정한 위치 관계를 가짐으로써, 당해 장치 보존 중에 유기산 또는 유기산 유도체와, 아질산 화합물이 장치 내에서 확산, 접촉함으로써 일어나는 아질산의 발생을 억제할 수 있으며, 보존 안정성이 높은 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 그것들을 사용한 면역 크로마토그래피 검출 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은, 상술한 바와 같이 장치 보존 중에 있어서의 아질산의 발생을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 장치나 키트 사용시의 아질산 생성 효율을 높여, 검출 대상을 고감도로 검출하는 것이 가능하게 된다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태의 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 설명하기 위한 단면도이다.
도 2는, 본 발명의 다른 실시 형태의 면역 크로마토그래피 장치의 구조를 설명하기 위한 단면도이다.
도 3의 (a) 내지 도 3의 (d)는, 본 발명의 일 실시 형태의 면역 크로마토그래피 장치 등의 구조의 일부분을 설명하기 위한 단면도이다.
도 4의 (a), 도 4의 (b)는, 본 발명의 다른 실시 형태의 면역 크로마토그래피 장치의 구조의 일부분을 설명하기 위한 단면도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시 형태는, 검체 중의 검출 대상으로부터 피검출 물질(항원)을 추출하고, 이 피검출 물질(항원)에 특이적으로 결합하는 결합 물질(항체)과의 반응(항원-항체 반응)에 의해 형성되는 복합체를 크로마토그래프 매체에 전개시킴으로써, 검출 대상을 각종 검출 수단에 의해 확인하기 위한 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트, 면역 크로마토그래피 검출 방법(이하, 면역 크로마토그래피 검출계라 하는 경우가 있음)에 기초한 것이다.
이 항원과 가장 특이적으로 반응하여 결합하는 항체로서는, 이것과 특이적으로 결합하는, 예를 들어 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 혹은 그 밖의 공지된 항체를 임의로 사용할 수 있다.
상기 항체에는 표지를 붙여 둠으로써, 검출 대상의 검출이 가능하게 된다. 표지로서는, 효소, 발색 물질, 형광 물질 또는 방사성 물질 등을 임의로 사용할 수 있다. 예를 들어, 조작이 간단하고 검정 시간도 짧게 한다는 면역 크로마토그래피 검출 방법의 특색을 살리기 위해서나, 항체 및 항원 등의 종류를 고려하여 정하면 된다.
또한, 검출 수단은, 조작이 간단하고, 비교적 단시간에 판정할 수 있다는 면역 크로마토그래피 검출 방법의 특색을 나타내기 위해서는, 목시 판정으로 정확하게 판정할 수 있는 성능을 갖는 것을 특징으로 한다. 한편, 시간, 정밀도 등이 요구되는 경우에는, 분광 광도 검출 및 방사선 검출 등, 각종 검출 수단을 포함시켜 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서의 검출 대상으로서는, 본 발명의 면역 크로마토그래피 검출계에 의해 생성되는 아질산에 의해 세균에 특이한 항원 다당체가 추출되는 세균이면 적용 가능하다. 특히 두꺼운 펩티드 글리칸층을 갖는 그램 양성균을 포함하는 검출 대상에 있어서 바람직하게 사용된다.
예를 들어, 포도상구균, 연쇄구균, 폐렴구균, 간균, 탄저균, 세레우스균, 디프테리아균, 리스테리아, 파상풍균, 보툴리누스균 및 웰치균 등을 들 수 있다. 그 중에서도 구균류인 포도상구균, 연쇄구균 및 폐렴구균에 있어서 바람직하게 사용된다. 최적으로는 연쇄구균, 특히 용혈성 연쇄구균에 있어서 바람직하게 사용된다.
상기 검출 대상을 함유하는 검체로서는, 예를 들어 타액, 콧물, 비강 세척액, 비강 흡인액, 가래, 인두 세척액, 폐포 세정액, 직장 세척액, 변 현탁액, 소변 및 양수 등의 생체 시료 뿐만 아니라, 식품 추출액, 상수, 하폐수 및 배양액 등과 같은 시료일 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니다.
그 중에서도 본 발명은 이들 검체 중에 포함되며, 원인이 되는 균이 그램 양성균, 특히 용련균을 포함하는 경우에 유용하다. 본 발명은, 호흡기 질환 환자 등으로부터 채취되는 타액 등에 포함되는 용련균을 검출 대상으로 하고, 용련균으로부터 추출된 다당체를 피검출 물질로 하여 검출 대상의 용련균을 검출할 수 있다.
이하, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치, 면역 크로마토그래피 키트 및 면역 크로마토그래피 검출 방법을 실시하기 위한 형태를 순차 설명을 하지만, 본 발명은 이하에 기재하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
<면역 크로마토그래피 장치>
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치는, 시료 적하 부재와, 표지 물질 함유 부위를 갖는 표지 물질 유지 부재와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체 부재와, 흡수 부재를 포함하고, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체(이하, 통합하여 유기산 등이라고도 함)를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치이며, 시료 적하 부재, 표지 물질 유지 부재, 크로마토그래프 매체 부재 및 흡수 부재가 이 순서대로 시료가 전개되도록 배치되고, 표지 물질 함유 부위보다 상류측에, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위를 갖고, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는 면역 크로마토그래피 장치이다.
아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위가 상기와 같은 위치 관계를 가짐으로써, 상기 장치 보존 중에 유기산 등과 아질산 화합물이 장치 내에서 확산·접촉하는 것을 억제, 즉 아질산의 발생을 억제할 수 있다.
상기 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 상기 유기산 등을 함유하는 부위가 상기와 같은 위치 관계를 가짐으로써, 상기 장치 보존 중에 있어서의 아질산 화합물과 유기산 등이 장치 내에서 확산·접촉하는 것을 억제할 수 있는 것은, 아질산 화합물과 유기산 등의 반응이 한정적이기 때문이라고 추측된다.
본 명세서에 있어서 「부재」와, 「부위」는 의미가 상이한 것으로서 사용한다. 예를 들어, 「아질산 화합물(유기산 등)을 함유하는 부재」란, 아질산 화합물(유기산 등)을 함유하는 「부재」 전체를 의미하며, 「아질산 화합물(유기산 등)을 함유하는 부위」란, 아질산 화합물(유기산 등)을 함유하는 부재 중에서 실제로 아질산 화합물(유기산 등)을 함유하는 영역을 의미하는 것으로 한다. 또한, 「부위」가 부재의 일부 영역이 아니라 부재 전체를 나타내는 경우도 있다.
또한 본 명세서에 있어서는, 아질산 화합물을 함유하는 부위를 갖는 부재를 아질산 화합물 함유 부재, 유기산 등을 함유하는 부위를 갖는 부재를 유기산 등 함유 부재라 하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서 「시료 전개 방향」이란, 시료가, 시료 적하 부재에 적하된 후 흡수 부재로 흡수될 때까지 전개(이동)하는 방향을 말하며, 예를 들어 도 1에 도시한 면역 크로마토그래피 장치에 있어서는, 화살표(우측 화살표)로 나타내는 방향을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 「상류측」이란, 상기 「시료 전개 방향」과 정반대의 방향을 말하며, 흡수 부재를 기준으로 하여 시료 적하 부재 방향(측)을 말한다.
이하 도면을 참조하면서 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치의 일 실시 형태로서는, 도 1에 도시한 바와 같이 적어도 시료 적하 부재(1), 표지 물질 함유 부위를 갖는 표지 물질 유지 부재(2), 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체 부재(3) 및 흡수 부재(5)를 포함하는 복수의 부재로 구성되어 있다.
그리고, 상기 장치는, 시료 적하 부재(1), 표지 물질 유지 부재(2), 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체 부재(3), 및 흡수 부재(5)의 각 부재가 이 순서대로 시료가 전개되도록, 면역 크로마토그래피 장치를 구성하는 각 부재가 연결되어 배치되어 있다.
또한, 상기 부재 이외의 다른 부재를 상기 장치의 임의의 위치에 구비하고 있어도 되고, 예를 들어 도 2에 도시한 바와 같이, 시료 적하 부재(1)와 표지 물질 유지 부재(2) 사이에 다른 부재(예를 들어, 유기산 등 함유 부재(7) 등)가 설치되어 있어도 된다. 각 부재가 연결되는 양태로서는, 도 1에 도시한 바와 같이 각 부재끼리가 겹쳐서 연결되어 있어도 되고, 각 부재끼리는 겹치지 않고, 부재의 측면끼리가 시료 전개 방향측에서 접촉하여 연결되어 있어도 된다.
시료 적하 부재(1)란, 면역 크로마토그래피 장치에 있어서 검체를 함유하는 시료(이하, 간단히 시료라고도 함)를 적하하는 부위(이하, 시료 적하 부위(11)라 함)를 갖는 부재를 말하며, 도 1의 부호 1로 나타내는 부재를 말한다.
시료 적하 부위(11)는, 시료 적하 부재(1) 중 시료를 적하하는 일부분의 영역을 말한다. 시료 적하 부재(1)에 있어서의 시료 적하 부위(11)의 위치는 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 시료 적하 부재(1)의 양단 또는 그 부근이어도 되고, 시료 적하 부재(1)의 중앙 또는 그 부근이어도 된다. 시료 적하 부재(1)에는, 후술하는 아질산 화합물이나 유기산 등, 그 밖에 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 임의의 시약을 함유시킬 수 있다.
시료 적하 부재(1)는 시료가 신속히 흡수되지만, 유지력은 약하고, 빠르게 시료가 이동해가는 성질의 다공질 시트로 구성할 수 있다. 다공질 시트로서는, 예를 들어 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유 여과지, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 나일론 및 면포 등을 들 수 있다. 시료 적하 부재(1)의 형상으로서는, 시트 형상인 것을 사용할 수 있다.
표지 물질 유지 부재(2)란, 표지 성분에 의해 시약 성분을 표지한 표지 물질을 함유하는 부위(이하, 표지 물질 함유 부위(21)라 함)를 갖는 부재이며, 도 1의 부호 2로 나타내는 부재를 말한다.
표지 물질 함유 부위(21)는, 표지 물질 유지 부재(2) 중 실제로 표지 물질을 함유하는 영역을 말한다. 표지 물질 함유 부위(21)는 도 1에 도시한 바와 같이 표지 물질 유지 부재(2)의 일부분의 영역을 차지하는 것이어도 되고, 표지 물질 유지 부재(2)의 부재 전체의 영역을 차지하는 것이어도 된다.
표지 물질 함유 부위(21)가 표지 물질 유지 부재(2)의 일부분의 영역을 차지하는 것인 경우, 표지 물질 유지 부재(2)에 있어서의 표지 물질 함유 부위(21)의 위치는 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 표지 물질 유지 부재(2)의 양단 또는 그 부근이어도 되고, 표지 물질 유지 부재(2)의 중앙 또는 그 부근이어도 된다. 표지 물질 유지 부재(2)에는, 후술하는 아질산 화합물이나 유기산 등, 그 밖에 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 임의의 시약을 함유시킬 수 있다.
표지 성분으로서는, 예를 들어 금속 입자, 라텍스 입자, 효소 및 형광 화합물 등이 있으며, 그 중에서도 금속 입자가 바람직하다. 시약 성분으로서는, 분석물을 인식하는 능력을 갖는 입자 또는 분자이며, 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 혹은 그의 프래그먼트이다(제1 시약).
금속 입자로서는, 금, 은, 백금, 게르마늄, 로듐 및 팔라듐과 같은 귀금속의 단립자, 및 복합 입자를 임의로 바람직하게 사용할 수 있다. 그 중에서도 금이 색상의 변화에 민감하며, 특히 바람직하다.
금속 입자의 평균 입경은 바람직하게는 1nm 내지 500nm, 보다 바람직하게는 10nm 내지 250nm, 더욱 바람직하게는 35nm 내지 100nm이다. 또한, 상기 평균 입경을 갖는, 금의 나노 직경의 각종 금 입자를 금 나노 입자라 한다.
면역 크로마토그래피 검출 방법에 있어서는, 이 금의 입경, 입도 분포 및 색조 등을 고려하여 금 입자의 표면에 백금 입자를 담지시킨 금 복합 입자로 함으로써, 면역 크로마토그래피 검출 방법의 표지로 할 수 있으며, 단백질의 염색제로서의 유용성을 높이기 위해 사용할 수 있다. 또한, 금속 입자 표면에 결합할 수 있는 관능기와 항체와 결합할 수 있는 반응기를 갖는 금 표지 증폭제와 같은, 소위 증감제를 사용하면 측정 감도를 높일 수 있다.
표지 물질 유지 부재(2)로서는, 예를 들어 유리 섬유 또는 셀룰로오스의 막 등이 통상 사용된다. 표지 물질 유지 부재(2)의 형상으로서는, 시트 형상인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치는, 표지 물질 함유 부위(21)보다 상류측에, 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 유기산 등을 함유하는 부위를 갖는다. 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치는, 이러한 구성을 취함으로써 표지 물질 함유 부위(21)보다 상류측에서 아질산 화합물과 유기산 등이 반응하여 아질산을 발생시키고, 검출 대상으로부터 피검출 물질을 추출할 수 있다. 이 때문에, 검출 대상은 피검출 물질이 추출된 상태에서 표지 물질 함유 부위(21)로 이동하고, 피검출 물질(예를 들어, 다당체)을 표지화하는 것이 가능하게 된다.
아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위는, 동일 부재 내에 존재해도 되고, 각각 상이한 부재에 존재하고 있어도 된다. 상이한 부재에 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 존재하는 양태란, 표지 물질 함유 부위(21)보다 상류측에, 아질산 화합물 및 유기산 등 중 어느 한쪽을 함유하고, 상기 어느 한쪽을 함유하는 부재보다 상류측의 부재가 아질산 화합물 및 유기산 등의 다른쪽을 함유하는 양태를 의미한다.
또한, 동일한 부재 내에 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 존재하는 경우, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위는 동일 개소가 아닌 것은 당연하다. 장치 보존 중에 아질산 화합물과 유기산 등의 반응이 진행되어버리기 때문이다.
또한, 아질산 화합물을 함유하는 부위 및/또는 유기산 등을 함유하는 부위가 존재하는 부재로서는, 상기 시료 적하 부재(1)와, 표지 물질 유지 부재(2)의 두 부재만으로 한정되지 않는다. 시료 적하 부재(1)와 표지 물질 유지 부재(2)의 부재 사이에 다른 부재를 구비하는 경우에는, 당해 부재에 아질산 화합물 또는 유기산 등을 함유시킬 수도 있다. 이 경우, 당해 부재의 수는 하나여도 복수여도 된다.
예를 들어, 도 2에 도시한 바와 같이, 시료 적하 부재(1)와 표지 물질 유지 부재(2)의 부재 사이에 유기산 등 함유 부재(7)를 구비할 수 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 아질산 화합물을 함유하는 부위는 표지 물질 함유 부위보다 상류측에 존재하는 한, 유기산 등을 함유하는 부위보다도 시료 전개 방향의 상류측에 위치해도 되고, 반대로 유기산 등을 함유하는 부위보다도 시료 전개 방향의 하류측에 위치해도 된다. 단, 상술한 바와 같이 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위는 동일 개소는 아니다.
아질산 화합물을 함유하는 부위가 유기산 등을 함유하는 부위보다도 시료 전개 방향의 상류측에 위치하는 경우, 아질산 화합물이 장치 내에서 유기산 등을 함유하는 부위로 이동하고, 양자가 접촉·반응하여 아질산이 생성된다. 또한, 아질산 화합물을 함유하는 부위가 유기산 등을 함유하는 부위보다도 시료 전개 방향의 하류측에 위치하는 경우, 유기산 등이 장치 내에서 아질산 화합물을 함유하는 부위로 이동하고, 양자가 접촉·반응하여 아질산이 생성된다.
그 중에서도, 아질산 화합물을 함유하는 부위는, 시료 적하 부재(1)의 부재 내의 임의의 위치인 것이 바람직하고, 유기산 등을 함유하는 부위는, 유기산 등 함유 부재(7)의 부재 내의 임의의 위치인 것이 바람직하다.
또한, 아질산 화합물을 함유하는 부위 또는 유기산 등을 함유하는 부위 중, 하류측에 존재하는 어느 한쪽의 부위와 표지 물질 유지 부재(2) 내의 표지 물질 함유 부위(21)의 물리적인 거리는, 최단 거리가 20mm 내지 40mm인 것이 바람직하다. 20mm 미만이면 추출 효율이 떨어져 감도가 저하되고, 40mm를 초과하면 검출 시간이 길어지기 때문이다.
본 발명은, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가, 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는 구성을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 구성을 가짐으로써, 장치의 보존 중에 아질산 화합물과 유기산 등이 장치 내에서 접촉하는 것을 억제할 수 있으며, 즉 장치 보존시의 아질산의 발생을 억제할 수 있으며, 장치의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다.
여기서, 「두께 방향」이란, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 상술한 시료 적하 부재, 표지 물질 유지 부재, 크로마토그래프 매체 부재 및 흡수 부재 등의 각 부재의 두께 방향을 의미한다. 상기 부재가 시트 형상의 부재인 경우에는, 그 시트의 두께 방향을 나타낸다. 예를 들어, 도 1에 도시한 면역 크로마토그래피 장치에 있어서는, 화살표(상하 화살표)로 나타내는 방향을 말한다.
또한, 상기 각 부재가 적층하여 배치되는 경우, 상기 「두께 방향」이란, 「부재의 적층 방향」, 즉 상기 각 부재가 적층되는 방향을 의미한다. 또는, 「두께 방향」이란, 시료 전개 방향에 대하여 수직 방향을 의미한다고도 할 수 있다.
또한, 「접촉」이란, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 물리적으로 접촉하는 것을 의미한다.
그리고, 「아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는」이란, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위의, 두께 방향으로 접촉하는 영역의 시료 전개 방향의 길이(이하, 겹침의 길이라고도 함)가 0.5mm 이하인 경우를 말한다.
본 발명에 있어서, 두께 방향으로 접촉하는 영역의 시료 전개 방향의 길이는, 바람직하게는 0.3mm 이하, 보다 바람직하게는 0.1mm 이하이고, 더욱 바람직하게는 0mm이다. 두께 방향으로 접촉하는 영역의 시료 전개 방향의 길이가 0mm란, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가, 두께 방향으로 일절 접촉하지 않는 것을 의미한다.
두께 방향으로 접촉하는 영역의 시료 전개 방향의 길이가 0.5mm 이하이면, 장치 보존 중에 유기산 등과 아질산 화합물이 장치 내에서 확산되어, 양자가 접촉하는 것을 방지할 수 있다.
이하에, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가, 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않는 구성에 대하여 구체예를 들어 설명하지만, 본 발명의 실시 형태는 이하의 예로 제한되는 것은 아니다.
도 3의 (a), 도 3의 (b) 및 도 3의 (c)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않은, 본 발명의 실시 형태의 구성을 나타내는 구체예이다.
도 3의 (a) 및 도 3의 (b)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(A)」와 유기산 등을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(B)」끼리가 두께 방향으로 접촉하여 겹쳐 있지만, 아질산 화합물을 함유하는 부위(a)와 유기산 등을 함유하는 부위(b)끼리가 두께 방향으로 접촉하지 않은 양태이다.
도 3의 (c)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(A)」와 유기산 등을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(B)」가 「부재(C)」를 사이에 두고 겹치는 양태이다. 이것은, 「부재(A)」와 「부재(B)」끼리가 두께 방향으로 접촉하여 겹쳐 있지 않으며, 또한 아질산 화합물을 함유하는 부위(a)와 유기산 등을 함유하는 부위(b)끼리가 두께 방향으로 접촉하지 않은 양태이다. 또한, 부재(C)는 시료의 전개를 방해하는 것이어서는 안되고, 빠르게 시료가 이동해가는 성질의 다공질 시트로 구성하는 것이 바람직하다.
한편, 도 3의 (d)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(A)」와 유기산 등을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(B)」끼리가 두께 방향으로 접촉하여 겹쳐 있으며, 또한 아질산 화합물을 함유하는 부위(a)와 유기산 등을 함유하는 부위(b)끼리가 두께 방향으로 접촉하고 있는 양태이다.
이 도 3의 (d)의 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하고 있는 양태이기 때문에, 본 발명의 실시 형태의 구성과는 상이하다.
또한, 도 4의 (a) 및 도 4의 (b)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않은, 본 발명의 실시 형태의 구성을 나타내는 구체예이다.
도 4의 (a) 및 도 4의 (b)에 도시한 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(A)」와 유기산 등을 함유하는 부위를 포함하는 「부재(B)」끼리가 두께 방향으로는 겹치지 않고, 시료 전개 방향으로 「부재(A)」와 「부재(B)」가 접촉하고 있는 양태이다. 이들 양태는, 아질산 화합물을 함유하는 부위(a)와 유기산 등을 함유하는 부위(b)끼리가 두께 방향으로 접촉하고 있지 않다. 도 4의 (b)는, 아질산 화합물을 함유하는 부위(a)와 유기산 등을 함유하는 부위(b)끼리가 시료 전개 방향으로 접촉하지만, 두께 방향으로 접촉하고 있지는 않다.
본 발명에 있어서의 아질산 화합물은 산과 반응하여 아질산을 생성하는 것이며, 검사에 악영향이 미치지 않는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 아질산염이다. 아질산염으로서는, 예를 들어 아질산나트륨, 아질산칼륨, 아질산칼슘 및 아질산마그네슘 등의 무기 아질산염, 아질산메틸, 아질산에틸, 아질산 부틸 및 아질산아밀 등의 유기 아질산 화합물을 들 수 있다. 나아가, 그것들을 혼합하여 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는 무기 아질산염이며, 그 중에서도 아질산의 알칼리 금속염이 바람직하고, 아질산나트륨이 가장 바람직하다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서의 아질산 화합물의 함유량은, 바람직하게는 50mmol 내지 200mmol/장치이고, 보다 바람직하게는 75mmol 내지 175mmol/장치이다.
본 발명의 유기산 또는 유기산 유도체로서는, 아질산 화합물과 반응하여 아질산을 생성하는 것이며, 본 발명의 장치 내에 존재하는 단백질 등을 변성·석출시키지 않는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
유기산으로서는, 예를 들어 유기 술폰산, 유기 카르복실산 및 유기 인산 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 아세트산, 타르타르산, 이타콘산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 프탈산, 글리콜산, 클로로아세트산, 플루오로아세트산, 벤조산 및 벤젠술폰산 등을 들 수 있다. 또한, 고정화된 산, 예를 들어 폴리술폰산, 폴리카르복실산, 폴리스티렌 및 폴리아크릴산 등이어도 되고 전혀 한정되는 것은 아니다.
유기산 유도체로서는, 유기산 이미드, 유기산 아미드, 유기산 에스테르 및 유기산 무수물 등을 들 수 있다.
이들 유기산 또는 유기산 유도체는 저분자 화합물 뿐만 아니라, 올리고머상 혹은 폴리머상인 것을 사용할 수 있으며, 또한 2종 이상을 함유해도 된다.
그 중에서도, 면역 크로마토그래피 장치의 보존 안정성이나 후술하는 pH의 관점에서, 바람직하게는 카르보닐기를 갖는 질소 함유 복소환 화합물이며, 더욱 바람직하게는 하기 일반식 (1)로 표시되는 질소 함유 복소환 화합물이다.
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식 (1) 중, R1, R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 카르보닐기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기를 나타내고, 알킬기는 서로 결합하여 환을 형성하고, 지환식 탄화수소환 혹은 방향족 탄화수소환을 형성해도 된다.
A는 단결합 또는 이중 결합을, X는 -C(=O)- 또는 -(CH2)n-을, Y는 탄소 원자 또는 질소 원자를 나타내고, n은 1 또는 2이다.
Z는 수소 원자, 수산기, 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, -C(=O)R3 또는 -O-C(=O)R3을 나타낸다. R3은 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, 알콕시기를 나타낸다.
본 발명의 일반식 (1)로 표시되는 화합물로서는, 구체적으로는 프탈이미드, N-아세틸프탈이미드, N-(tert-부톡시카르보닐옥시)프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-아세톡시숙신이미드, N-카르보벤조옥시숙신이미드, 탄산디(N-숙신이미딜) 및 히단토인 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 프탈이미드, N-아세틸프탈이미드, N-(tert-부톡시카르보닐옥시)프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-아세톡시숙신이미드 및 히단토인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것이 바람직하다.
나아가, N-아세톡시숙신이미드 및 히단토인이 보다 바람직하고, N-아세톡시숙신이미드가 특히 바람직하다.
유기산 및/또는 유기산 유도체로서는, 이들을 혼합하여 사용하는 것도 가능하다.
상기 일반식 (1)로 표시되는 질소 함유 복소환 화합물을 사용함으로써, 아질산의 생성에 있어서의 pH 범위를 넓게 설정할 수 있기 때문에 바람직하다. 즉, 예를 들어 유기산으로서 시트르산을 사용한 경우에는, 유기산과 아질산 화합물의 반응시에 있어서의 pH 범위는 6.8 내지 7.0 부근으로 제한되지만, 상기 일반식 (1)로 표시되는 질소 함유 복소환 화합물을 사용함으로써, pH 범위를 6.5 내지 8.0 부근까지 넓게 설정할 수 있다. 이에 의해, 예를 들어 검체의 성분에 의해 전개액의 pH가 변화되었다고 해도, 효율적으로 아질산을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서의 유기산 등의 함유량은, 바람직하게는 10mmol 내지 40mmol/장치이며, 보다 바람직하게는 20mmol 내지 30mmol/장치이다. 상기 범위임으로써, 효율적으로 아질산을 생성할 수 있다.
크로마토그래프 매체 부재(3)는, 막 담체 상에 검출부(4)를 제작한 것이다. 막 담체로서는, 모세관 현상에 의해 시료를 흡수하여 이동시킬 수 있는 것이면, 특별히 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래프 매체 부재(3)는, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 및 이들의 혼합 섬유를 포함하는 인공 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 크로마토그래프 매체 부재(3)의 형상으로서는, 시트 형상인 것을 사용할 수 있다.
검출부(4)에는, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 혹은 그의 프래그먼트(제2 시약)가 니트로셀룰로오스의 시트 상에 담지 고정되어 있다.
흡수 부재(5)에는, 과잉의 시료를 신속히 흡수하는 능력을 갖는 재료인 유리 섬유 및 셀룰로오스 섬유 등을 포함하는 여과지가 범용되고 있지만, 흡수한 액체가 역류하지 않도록 유지하는 능력을 갖는 재료를 사용하면 보다 바람직하다(일본 특허 공개2012-189346호 공보). 흡수 부재(5)의 형상으로서는 시트 형상인 것을 사용할 수 있다.
또한 상술한 바와 같이, 상기 이외의 다른 부재를 본 발명의 장치의 임의의 위치에 구비하고 있어도 된다. 이들 부재로서는 시료가 신속히 흡수되지만, 유지력은 약하고, 빠르게 검체(검체 시료)가 이동해가는 성질의 다공질 시트로 구성할 수 있다.
다공질 시트로서는, 예를 들어 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유 여과지, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 나일론 및 면포 등을 들 수 있다. 이들 부재의 형상으로서는, 시트 형상인 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치는, 백킹 시트(6)를 함유할 수 있다. 백킹 시트(6)는 기재이다. 백킹 시트(6)의 편면에 점착제를 도포하거나, 점착 테이프를 부착함으로써 편면이 점착성을 갖는다. 이 점착면 상에 시료 적하 부재(1), 표지 물질 유지 부재(2), 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체 부재(3) 및 흡수 부재(5)의 일부 또는 전부가 밀착하여 설치되어 있다.
또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치가 상기 부재 이외를 함유하는 경우(예를 들어, 아질산 화합물 함유 부재나 유기산 등 함유 부재 등)도 마찬가지이다. 백킹 시트(6)는, 점착제에 의해 시료액에 대하여 불투과성, 비투습성이 되는 것이면, 기재로서는 특별히 한정되지 않는다.
검출부(4)에 사용하는 시약 성분(제2 시약) 및 표지 시약에 사용하는 시약 성분(제1 시약)은, 그 한쪽 또는 양쪽이 모노클로날 항체여도 되고, 폴리클로날 항체여도 된다. 바람직하게는, 검출부(4)에 사용하는 시약 성분(제2 시약)이 폴리클로날 항체이며, 표지 시약에 사용하는 시약 성분(제1 시약)이 모노클로날 항체인 경우이다.
모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 혹은 그 프래그먼트는 공지되어 있으며, 입수 가능하고, 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 항체 산생 동물종으로서는, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 토끼, 염소 및 말 등이다. 면역 글로불린으로서는, IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 어느 것이어도 된다.
그 중에서도, 표지 물질 유지 부재(2)에 사용하는 시약 성분(제1 시약) 및 검출부(4)에 사용하는 시약 성분(제2 시약)의 양쪽에, 토끼 유래의 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치는, 제품화하기 전에 통상 건조 처리가 실시된다. 건조 온도는 예를 들어 20℃ 내지 50℃, 건조 시간은 0.5시간 내지 1시간이다.
<면역 크로마토그래피 키트>
본 발명의 면역 크로마토그래피 키트는 상기한 면역 크로마토그래피 장치와, 검체를 희석하기 위한 검체 희석액을 포함한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 있어서 검체 희석액은, 전개액으로서도 사용할 수 있다. 검체 희석액을 전개액으로서 사용하는 경우에는, 검체와 검체 희석액(전개액)를 미리 혼합한 검체 함유액을 시료로 하여, 시료 적하 부재에 공급·적하하여 전개시킬 수도 있다. 또는, 먼저 검체를 시료 적하 부재에 공급·적하한 후, 검체 희석액(전개액)을 시료 적하 부재에 공급·적하하여 전개시켜도 된다.
통상, 전개액의 pH 조건은 산성인 편이 아질산 화합물과 유기산 등이 반응하여 생성되는 아질산의 생성 효율이 높고, 항원의 추출 효율을 높일 수 있다. 한편, pH 조건이 산성이면, 면역 크로마토그래피 장치나 후술하는 검체 희석액 중에 존재하는, 예를 들어 카제인 등의 단백질 또는 그의 염이나 검체 중에 포함되는 고점성 단백질 등이 석출되거나 또는 표지 물질의 응집이 일어나 전개 불량이 된다는 문제가 발생할 가능성이 있다.
따라서, 본 발명에 있어서의 전개액의 pH 조건으로서는, 아질산이 생성되는pH이며, 카제인 등의 단백질이나 검체 중에 포함되는 고점성 단백질 등이 석출되지 않고, 또한 표지 물질의 응집이 일어나지 않는 pH가 바람직하다. 상기 pH 조건으로서는, pH가 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 6.6 내지 8.0, 가장 바람직하게는 6.8 내지 7.5이다.
상기 pH이면 단백질의 석출이나 표지 물질의 응집이 일어나기 어렵다. 또한 상술한 바와 같이, 상기 pH의 범위에서 아질산을 효율적으로 생성하기 위해서는, 유기산 또는 유기산 유도체로서 상기 일반식 (1)로 표시되는 유기산 또는 유기산 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 있어서, 검체 희석액 중이나 면역 크로마토그래피 장치의 각 부위에는, 상술한 시약 이외에도 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서 각종 시약, 예를 들어 비이온성 계면활성제 등의 계면활성제, 염, 완충제, 그 밖에 각종 첨가제 등을 함유시킬 수 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 키트에 사용할 수 있는 비이온성 계면활성제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(상품명 「Tween」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-옥틸페닐에테르(상품명 「Triton」 시리즈), 폴리옥시에틸렌p-t-노닐페닐에테르(상품명 「TritonN」 시리즈), 알킬폴리글루코시드, 지방산 디에탄올아미드 및 알킬모노글리세릴에테르 등을 들 수 있다. 또한, 악영향을 미치지 않는 범위 내에서 비이온성 계면활성제 이외의 이온성 계면활성제 등을 배합하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치에 사용하는 비이온성 계면활성제의 함유량으로서는, 바람직하게는 0.2질량％ 내지 2.0질량％의 범위이며, 보다 바람직하게는 0.5질량％ 내지 1.5질량％의 범위에서 함유시킬 수 있다.
0.2질량％ 미만이면 전개가 불안정해져 정확한 판정을 행할 수 없거나, 또는 비특이적 반응을 억제할 수 없어 정확한 판정이 약간 어려워지는 경향을 나타낸다. 2.0질량％를 초과하면 필요 이상의 농도가 되어, 비특이적 반응의 억제에는 바람직한 영향을 부여하지 않을 뿐만 아니라, 기술적으로 무의미해져, 경제적이지 않고 낭비가 된다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치에 사용되는 염으로서는, 대표적인 것으로서는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 바람직하게는 염화나트륨이다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치에 사용되는 염의 농도로 해서는, 1mM 내지 500mM의 범위가 바람직하고, 5mM 내지 200mM의 범위가 보다 바람직하고, 10mM 내지 50mM의 범위가 더욱 바람직하다. 농도가 1mM보다 낮아지면, 예를 들어 0.1mM로 적어지면 단백질의 추출 작용이 불충분해진다. 500mM를 초과하면, 예를 들어 1M, 2M로 많아지면 기술적으로 무의미한 양이며, 필요 이상의 농도가 되어 경제적이지 않고 낭비가 된다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치에 사용되는 염으로서는, 1종 뿐만 아니라 2종 이상 배합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치에 사용하는 완충제로서는, 시료의 첨가나 시료의 증발이나 희석에 의한 농도의 변화, 외부로부터의 다소의 이물의 혼입에 의해서도 치명적인 영향을 발생하지 않는 작용(완충 작용)을 갖는 것이면 특별히 제한은 없다.
본 발명에서 완충제로서는, 예를 들어 인산 완충액(인산+인산나트륨), 아세트산 완충액(아세트산+아세트산나트륨), 시트르산 완충액(시트르산+시트르산나트륨), 붕산 완충액, 트리스 염산 완충액(트리스(히드록실메틸)아미노메탄+염산), TE 완충액(트리스+에틸렌디아민사아세트산), TAE 완충액(트리스+아세트산+에틸렌디아민사아세트산), TBE 완충액(트리스+붕산+에틸렌디아민사아세트산) 또는 HEPES 완충액(2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산) 및 Bicine 완충액(N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 완충제) 등을 들 수 있다.
바람직하게는 인산 완충액, 트리스 염산 완충액 및 아세트산 완충액 등이며, 보다 바람직하게는 트리스 염산 완충액이다. 본 발명의 면역 크로마토그래피 검출계에 있어서는, 악영향을 미치지 않는 범위 내이면 2종 이상의 완충제를 사용하는 것도 가능하며, 전혀 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 완충제의 농도로서는, 10mM 내지 500mM의 범위가 바람직하고, 10mM 내지 300mM의 범위가 보다 바람직하고, 30mM 내지 100mM의 범위가 더욱 바람직하다.
농도가 10mM보다 낮아지면 완충 작용이 불충분해져, 단백질 성분의 석출 억제나 표지 입자의 응집 억제도 불충분해진다. 500mM를 초과하면, 필요 이상의 농도가 되어 경제적이지 않고 낭비가 된다.
또한, 완충액의 pH 범위는 7.1 내지 9.8이 최적이다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치 중에는, 생물학적 친화성에 기초한 부반응을 억제하거나, 비특이적 반응을 억제하는 것이 공지된 첨가제, 예를 들어 항원 항체 반응의 촉진 혹은 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질(예를 들어, 소 혈청 알부민, 젤라틴 및 카제인 등), 고분자 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올 및 덱스트란 등), 이온성 계면활성제 또는 폴리 음이온(예를 들어, 덱스트란황산, 헤파린, 폴리스티렌술폰산 및 콘드로이틴황산 등), 혹은 항균제 등 중 1종 혹은 2종 이상을 첨가하여 사용하는 것도 가능하면서 유효하며, 전혀 방해하는 것은 아니다.
또한, 이들 항원 항체 반응의 촉진 혹은 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질, 고분자 화합물, 이온성 계면활성제 또는 폴리 음이온, 혹은 항균제 등 중 1종 혹은 2종 이상을, 고정상을 구성하는 크로마토그래프 매체 부재 상의, 이동상의 이동 경로 상에 유지시켜 두는 것도 가능하면서 유효하며, 전혀 방해하는 것은 아니다.
본 발명의 검체 희석액이나 면역 크로마토그래피 장치 중에 함유시키는 상기 첨가제의 농도로서는, 0.01질량％ 내지 20질량％의 범위가 바람직하고, 0.1질량％ 내지 10질량％의 범위가 보다 바람직하고, 0.5질량％ 내지 5질량％의 범위가 더욱 바람직하다. 0.01질량％ 미만이면, 비특이적 반응을 억제할 수 없어 정확한 판정을 행할 수 없다. 20질량％를 초과하면, 필요 이상의 농도가 되어 경제적이지 않고 낭비가 된다.
검체 희석액은, 통상 용매로서 물을 사용하고, 상기한 비이온성 계면활성제, 염 및 완충제 등 이외에, 예를 들어 항원 항체 반응의 촉진 또는 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질, 고분자 화합물(PVP 등), 이온성 계면활성제 혹은 폴리 음이온 또는 항균제, 킬레이트제 등 중 1종 혹은 2종 이상을 가해도 된다.
가하는 순서는 특별히 특정되지 않으며, 동시에 가해도 지장이 없다. 검출하는 검체와 검체 희석액을 미리 혼합한 검체 함유액을 시료 적하 부재 상에 공급·적하하여 전개시킬 수도 있고, 먼저 검체를 시료 적하 부재 상에 공급·적하한 후, 검체 희석액을 시료 적하 부재 상에 공급·적하하여 전개시켜도 된다.
각종 시약을 면역 크로마토그래피 장치에 함유시키는 경우, 그 방법으로서는, 예를 들어 각종 시약을 함유시키는 부위에 도포 또는 함침시킨 후, 건조시키는 방법에 의해 당해 부위에 담지 또는 유지시키는 형태로 할 수 있다.
또한, 각 부재의 전체가 아니라 일부분에 스폿적으로 각종 시약을 함유시키는 경우에는, 예를 들어 부재를 마스크한 후에 스프레이에 의해 분무하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 전형적인 키트 구성에 있어서의 판정의 원리를 이하의 1 내지 4에 설명한다.
1. 검체를 검체 희석액으로 희석 처리한 검체 함유액을 시료로 하여, 면역 크로마토그래피 장치의 시료 적하 부재(1)(시료 적하 부위(11))에 소정량(통상, 0.1ml 내지 2ml) 적하한다. 검체 함유액이 적하되면, 검체 함유액은 시료 적하 부재(1)에 신속히 흡수되어, 빠르게 표지 물질 유지 부재(2)로 이동을 시작한다.
2. 표지 물질 함유 부위(21)보다 시료 전개 방향의 상류측의 어느 위치에 유지된 아질산 화합물은, 이동해 온 검체 함유액의 수분에 용해하고, 검체와 함께 이동한다.
3. 이어서, 아질산 화합물을 용해하여 함유한 검체 함유액은, 표지 물질 함유 부위(21)보다 시료 전개 방향의 상류측의 어느 위치에 유지된 유기산 등과 접촉하고, 아질산 화합물과 유기산 등이 반응하여 아질산을 생성한다. 이 아질산은 검체 중에 예를 들어 검출 대상의 용련균 등이 존재하는 경우에, 해당 균체 표면의 다당체(피검출 물질)를 추출한다.
4. 이어서, 아질산을 함유하는 검체 함유액은, 표지 물질 함유 부위(21)로 이동한다. 표지 물질 함유 부위(21)를 검체 함유액이 통과할 때, 표지 물질 함유 부위(21)에 유지되어 있었던 표지 시약(제1 시약)이 검체 함유액의 수분에 용해되고, 피검출 물질(예를 들어 다당체 등)을 표지화하여, 검체와 함께 이동한다.
5. 이어서, 검체 함유액의 수분에 용해된 표지 시약은, 크로마토그래프 매체 부재(3) 상의 검출부(4)를 통과한다. 여기에서는, 검체 함유액 중에 피검출 물질(예를 들어, 다당체)이 존재하는 경우, 당해 피검출 물질은, 항원·항체의 특이적 결합 반응에 의해 검출부(4)에 담지 고정되어 있는 항체(제2 시약)와 표지 시약(제1 시약)에 의해 샌드위치 형상으로 끼워지도록 검출부에 고정되어, 검출부(4)가 착색됨으로써, 검출 대상을 검출할 수 있다. 검체 중에 피검출 물질(예를 들어, 다당체)이 존재하지 않는 경우에는, 검체 함유액의 수분에 용해한 표지 시약(제1 시약)은, 크로마토그래프 매체 부재(3) 상의 검출부(4)를 통과해도 특이적 결합 반응이 일어나지 않기 때문에, 검출부(4)가 착색되지 않는다.
6. 최후로 검체 함유액은, 흡수 부재(5)로 이동하여 흡수된다.
이와 같이 하여, 검체 중의 피검출 물질(예를 들어, 다당체)의 유무를 정확하게 판정할 수 있다.
<면역 크로마토그래피 검출 방법>
본 발명의 면역 크로마토그래피 검출 방법은 이하의 공정 (i) 내지 (v)를 포함하고, 상기한 면역 크로마토그래피 키트를 사용하여 검체 중의 검출 대상을 검출한다.
(i) 검체 희석액에 의해 검체를 희석하여 얻어지는 검체 함유액을 시료 적하 부재에 적하하는 공정
(ii) 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체의 반응에 의해 생성된 아질산에 의해, 검체 중의 검출 대상으로부터 피검출 물질을 추출하는 공정
(iii) 표지 물질 유지 부재에 있어서 피검출 물질을 표지화하는 공정
(iv) 검체 함유액이 크로마토그래프 매체 부재 상을 이동하여, 검출부에 있어서 검출 대상을 검출하는 공정
(v) 검체 함유액이 흡수 부재에 의해 흡수되는 공정
각 공정에 관한 상세한 설명은, 판정의 원리에서 상술한 내용과 마찬가지이다.
실시예
이하, 본 발명의 유효성을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
(시험예 1)
본 시험에서는, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 아질산 화합물을 함유하는 부위와 유기산 등을 함유하는 부위가 특정한 위치 관계를 가짐으로써, 당해 장치의 보존 안정성이 향상되는지 여부를 가속 안정성 시험에 의해 확인하였다.
[실시예 1]
<면역 크로마토그래피 키트의 제작>
본 실시예에서는, 검체 희석액 및 아질산나트륨을 포함하는 시료 적하 부재(1)와, 프탈이미드를 포함하는 유기산 등 함유 부재(7)와, 표지 물질 유지 부재(2)와, 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체 부재(3)와, 흡수 부재(5)를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트를 제작하였다.
(1) 크로마토그래프 매체 부재(3) 상으로의 검출부(4)의 제작
멤브레인으로서 니트로셀룰로오스를 포함하는 시트(밀리포어사제, 상품명: HF120, 250mm×25mm)를 사용하였다. 5질량％의 이소프로판올을 포함하는 10mM의 인산 완충액(pH 7.4)으로 1.0mg/ml의 농도가 되도록 토끼 유래 항용련균 폴리클로날 항체(제2 시약)(Meridian사제)를 희석하고, 그 희석된 용액 150μL를 항체 도포기(BioDot사제)에 의해 멤브레인 상에 1mm의 폭으로 도포하고, 50℃에서 30분간 건조시키고, 실온에서 밤새 건조시켜, 크로마토그래프 매체 부재(3) 상에 검출부(4)를 제작하였다.
(2) 표지 물질 용액의 제작
금 콜로이드 현탁액(다나까 기낀조꾸 고교사제: 평균 입자 직경 40nm) 0.5mL에, 인산 완충액(pH 7.4)으로 0.1mg/mL의 농도가 되도록 희석한 토끼 유래 항용련균 모노클로날 항체(제1 시약) 항체(Virostat사제) 0.1mL를 가하고, 실온에서 10분간 정치하였다. 이어서, 10질량％의 소 혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4)을 0.1ml 가하고, 충분히 교반한 후, 8000×g으로 15분간 원심 분리를 행하여, 상청을 제거한 후, 1질량％의 소 혈청 알부민을 포함하는 인산 완충액(pH 7.4) 0.1mL를 가하여, 표지 물질 용액을 제작하였다.
(3) 아질산나트륨을 포함하는 시료 적하 부재(1)의 제작
12×100mm의 유리 섬유 콘쥬게이트 패드(머크사제)에 4mol의 아질산나트륨을 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포하고, 동결 건조시켜, 시료 적하 부재(1)를 제작하였다.
(4) 프탈이미드를 포함하는 유기산 등 함유 부재(7)의 제작
12×100mm의 유리 섬유 콘쥬게이트 패드(머크사제)에 1mol의 프탈이미드를 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포하고, 동결 건조시켜, 프탈이미드를 포함하는 유기산 등 함유 부재(7)를 제작하였다.
(5) 면역 크로마토그래피용 시험편의 제작
상기 제작한 표지 물질 용액 200μl에 100μl의 25질량％ 트레할로오스 수용액과 80μl의 5질량％의 카제인(최종 농도: 1질량％)을 포함하는 인산 완충액(pH 9.0)을 가한 것을 12×100mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 표지 물질 유지 부재(2)를 제작하였다.
이어서, 백킹 시트를 포함하는 기재에 시료 적하 부재(1), 유기산 등 함유 부재(7), 표지 물질 유지 부재(2), 검출부(4)를 갖는 크로마토그래프 매체 부재(3), 흡수 부재(5)를 시료 전개 방향을 따라 이 순서로 연결되도록 접합하였다(도 2에 도시하는 순서).
또한, 시료 적하 부재(1)와 유기산 등 함유 부재(7)의, 부재의 두께 방향으에 접촉하고 있는 영역의 시료 전개 방향의 길이는 0mm로 하였다. 즉, 시료 적하 부재(1)와 유기산 등 함유 부재(7)가 시료 전개 방향으로 접촉하도록 연결하였다. 그리고, 재단기로 폭이 5mm가 되도록 재단하여, 면역 크로마토그래피용 시험편으로 하였다.
하기 표 1에, 시료 적하 부재(1)과 유기산 등 함유 부재(7)의 두께 방향으로 접촉하고 있는 영역의 시료 전개 방향의 길이(겹침의 길이)를 나타낸다.
(6) 검체 희석액의 제작
0.5질량％의 Tween 20, 0.6질량％ 폴리비닐피롤리돈(평균 분자량 36만), 1질량％의 소 혈청 알부민과 150mM 염화나트륨을 포함하는 20mM의 트리스 완충 용액(pH 8.0)을 포함하는, 검체를 희석하여 면역 크로마토그래피용 시험편으로 적하하여 전개하기 위한 검체 희석액으로 하였다.
<측정(가속 안정 시험)>
상기 제작한 면역 크로마토그래피용 시험편 및 검체 희석액을 사용하여, 이하의 가속 안정 시험으로 검체 중의 검출 대상인 용련균의 존재의 유무를 측정하고, 면역 크로마토그래피용 시험편의 보존 안정성의 평가를 행하였다.
상기 제작한 면역 크로마토그래피용 시험편을 50℃에서 0시간(인큐베이트 없음) 또는 2주간 인큐베이트하고, 그 후 불활성화한 A군 β 용혈성 연쇄구균(용련균)을 2×106org/mL가 되도록 가한 것을 양성 검체 시료로 하여 측정을 행하였다.
검체 시료 150μL를 면역 크로마토그래피용 시험편의 시료 적하 부위에 적하하여 전개시키고, 15분 후에 목시 판정을 하였다. 테스트 라인의 적색선을 목시 확인할 수 있는 것을 「+」, 선명하게 목시 확인할 수 있는 것을 「++」, 적색선을 어렴풋이 목시 확인할 수 있는 것을 「±」, 적색선을 목시 확인할 수 없는 것을 「-」로 하였다. 양성 검체 시료를 사용했을 때의 결과를 표 2에 나타낸다.
또한, 상기 용련균을 가하지 않는 검체 희석액을 음성 검체 시료로 하여 측정도 행하였다. 음성 검체 시료를 사용했을 때의 결과를 표 3에 나타낸다.
[비교예 1, 2]
면역 크로마토그래피용 시험편의 제작 조건(시료 적하 부재(1)와 유기산 등 함유 부재(7)의 겹침의 길이)을 표 1에 기재된 조건으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피 키트를 제작하고, 측정을 행하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
또한, 아질산나트륨은 시료 적하 부재(1)의 패드 전체에 도포되어 있으며, 프탈이미드는 유기산 등 함유 부재(7)의 패드 전체에 도포되어 있기 때문에, 시료 적하 부재(1)의 패드(부재)와 시료 적하 부재(1)의 패드(부재)의 겹침의 길이가, 실질적으로 아질산나트륨을 함유하는 부위와 프탈이미드를 함유하는 부위의 겹침의 길이에 상당한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 1은, 시료 적하 부재(1)와 유기산 등 함유 부재(7)가 부재의 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않기 때문에, 50℃에서 2주간 인큐베이트한 경우에도 양성 검체를 검출할 수 있으며, 보존 안정성이 높은 것을 알 수 있었다.
한편, 비교예 1 및 2는, 시료 적하 부재(1)와 유기산 등 함유 부재(7)가 부재의 두께 방향으로 실질적으로 접촉하고 있기 때문에(겹침 길이가 0.5mm 초과), 50℃에서 2주간 인큐베이트한 경우, 양성 검체를 검출 할 수 없어, 충분한 보존 안정성을 갖지 않음을 알 수 있었다.
(시험예 2)
본 시험에서는, 본 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 있어서 유기산 또는 유기산 유도체의 종류를 다양하게 변경하여, 시험예 1과 마찬가지로 가속 안정성 시험을 행하였다. 가속 안정 시험은 50℃에서 0시간(인큐베이트 없음), 2주간 또는 4주간 인큐베이트하여 행하였다.
[실시예 2]
유기산 등 함유 부재(7)에 프탈이미드를 포함하는 수용액이 아니라, N-아세틸프탈이미드를 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피용 시험편을 제작하여, 가속 안정성 시험을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 3]
유기산 등 함유 부재(7)에 프탈이미드를 포함하는 수용액이 아니라, N-(tert-부톡시카르보닐옥시)프탈이미드를 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피용 시험편을 제작하여, 가속 안정성 시험을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 4]
유기산 등 함유 부재(7)에 프탈이미드를 포함하는 수용액이 아니라, N-히드록시숙신이미드를 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피용 시험편을 제작하여, 가속 안정성 시험을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 5]
유기산 등 함유 부재(7)에 프탈이미드를 포함하는 수용액이 아니라, N-아세톡시숙신이미드를 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피용 시험편을 제작하여, 가속 안정성 시험을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 6]
유기산 등 함유 부재(7)에 프탈이미드를 포함하는 수용액이 아니라, 히단토인을 포함하는 수용액 0.6mL를 패드 전체에 도포한 것을 제외하고는, 실시예 1과 마찬가지로 면역 크로마토그래피용 시험편을 제작하여, 가속 안정성 시험을 행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00006
실시예 2 내지 6에 있어서의 유기산 또는 유기산 유도체는 모두, 상기 일반식 (1)로 표시되는 화합물이다. 어느 실시예도 50℃에서 2주간 인큐베이트한 경우에도 양성 검체를 검출할 수 있어, 보존 안정성이 높음을 알 수 있었다. 특히, 실시예 5(N-아세톡시숙신이미드) 및 실시예 6(히단토인)에서는, 50℃에서 4주간 인큐베이트한 경우에도 양성 검체를 검출할 수 있어, 보존 안정성이 특히 높음을 알 수 있었다.
본 발명을 특정한 양태를 사용하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은 당업자에게 있어서 명확하다. 또한 본 출원은, 2016년 3월 4일자로 출원된 일본 특허 출원(특원2016-042707)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
1: 시료 적하 부재
11: 시료 적하 부위
2: 표지 물질 유지 부재
21: 표지 물질 함유 부위
3: 크로마토그래프 매체 부재
4: 검출부
5: 흡수 부재
6: 백킹 시트
7: 유기산 등 함유 부재
A, B, C: 부재
a: 아질산 화합물을 함유하는 부위
b: 유기산 등을 함유하는 부위

Claims (7)

  1. 시료 적하 부재와, 표지 물질 함유 부위를 갖는 표지 물질 유지 부재와, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체 부재와, 흡수 부재를 포함하고, 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는, 검체 중의 검출 대상을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 장치이며,
    상기 시료 적하 부재, 상기 표지 물질 유지 부재, 상기 크로마토그래프 매체 부재 및 상기 흡수 부재가 이 순서대로 시료가 전개되도록 배치되고,
    상기 표지 물질 함유 부위보다 상류측에, 상기 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 상기 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위를 갖고,
    상기 아질산 화합물을 함유하는 부위와, 상기 유기산 또는 유기산 유도체를 함유하는 부위가 두께 방향으로 실질적으로 접촉하지 않고,
    상기 유기산 또는 유기산 유도체가 하기 일반식 (1)로 표시되는 질소 함유 복소환 화합물인
    면역 크로마토그래피 장치.
    Figure pct00007

    (식 (1) 중, R1, R2는 각각 독립적으로 수소 원자, 카르보닐기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기를 나타내고, 알킬기는 서로 결합하여 환을 형성하고, 지환식 탄화수소환 혹은 방향족 탄화수소환을 형성해도 된다.
    A는 단결합 또는 이중 결합을, X는 -C(=O)- 또는 -(CH2)n-을, Y는 탄소 원자 또는 질소 원자를 나타내고, n은 1 또는 2이다.
    Z는 수소 원자, 수산기, 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, -C(=O)R3 또는 -O-C(=O)R3을 나타낸다. R3은 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬기, 알콕시기를 나타낸다.)
  2. 제1항에 있어서, 상기 유기산 또는 유기산 유도체가 프탈이미드, N-아세틸프탈이미드, N-(tert-부톡시카르보닐옥시)프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-아세톡시숙신이미드 및 히단토인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 면역 크로마토그래피 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아질산 화합물이 아질산염인 면역 크로마토그래피 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상이 그램 양성균인 면역 크로마토그래피 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 그램 양성균이 용혈성 연쇄구균인 면역 크로마토그래피 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 면역 크로마토그래피 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피 키트.
  7. 제6항에 기재된 면역 크로마토그래피 키트를 사용하여 검체 중의 검출 대상을 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (i) 내지 (v)를 포함하는 면역 크로마토그래피 검출 방법.
    (i) 검체 희석액에 의해 검체를 희석하여 얻어지는 검체 함유액을 시료 적하 부재에 적하하는 공정
    (ii) 아질산 화합물과, 유기산 또는 유기산 유도체의 반응에 의해 생성된 아질산에 의해, 검체 중의 검출 대상으로부터 피검출 물질을 추출하는 공정
    (iii) 표지 물질 유지 부재에 있어서 피검출 물질을 표지화하는 공정
    (iv) 검체 함유액이 크로마토그래프 매체 부재 상을 이동하여, 검출부에 있어서 검출 대상을 검출하는 공정
    (v) 검체 함유액이 흡수 부재에 의해 흡수되는 공정
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