KR20180100125A - Mtap 널 암을 치료하기 위한 mat2a 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 환자를 MAT2A 억제제로 치료하는 유효성을 예측하기 위한 진단 및 예후 방법을 제공한다. 종양 세포에 MTAP 유전자가 부재하는지를 평가하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 널인 세포는 MAT2A 억제제에 의한 억제에 대해 감수성인, MAT2A 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성을 예측하는 방법이 제공된다.

Description

MTAP 널 암을 치료하기 위한 MAT2A 억제제

본 발명은 암 환자를 치료 및 진단하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 환자가 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 (MAT2A)의 억제제를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 것인지를 결정하는 방법에 관한 것이다.

종양원성 기능 획득 돌연변이 및 그의 상응하는 분자 경로의 확인 및 특징 규명은 상응하는 돌연변이를 수반한 암 환자에게 실질적인 혜택을 제공하는 수많은 표적화 요법 개발의 원동력이 되었다. 이는 기능 획득 점 돌연변이 (예컨대 돌연변이체 EGFR 비소세포 폐암에서의 에를로티닙 및 제피티닙 (Lynch & Haber, NEJM 2004 and Pao & Varmus PNAS 2004)), 게놈 증폭 (예컨대 HER2-증폭된 유방암에서의 트라스투주맙 (Slamon and Norton NEJM 2001)), 또는 종양원성 유전자 융합 (예컨대 BCR-ABL-양성 만성 골수성 백혈병에서의 이마티닙 (Druker & Sawyers NEJM 2001))에 의해 구동된 암에 대하여 선택적인 약물을 포함한다. 각각의 경우에 있어서, 상기 요법은 종양원성 돌연변이체 단백질을 직접적으로 억제하여, 그의 기능을 폐기시킨다. 종양 억제인자 유전자에 있어서의 기능 상실 돌연변이는 고도로 우세하며, 암의 분자 발병 기전에도 동등하게 중요하지만, 종양 억제인자에 있어서의 기능 상실 돌연변이에 근거하여 암을 선택적으로 표적으로 하는 요법의 예는 거의 없다 (Morris & Chan Cancer 2015). 이러한 불일치는 돌연변이체 단백질이 치료 혜택을 위해 직접적으로 억제될 수 없다는 간단한 관찰에 의해 설명될 수 있다. 동형접합성 결실에 의해 불활성화되는 종양 억제인자는 표적화 요법에서 가장 문제가 되며, 이는 잔여 단백질의 결여로 인해 결함 있는 종양 억제인자를 직접적으로 활성화, 안정화 또는 복구할 수 있는 치료 전략이 없어지기 때문이다.

S-아데노실메티오닌 신테타제로도 알려진 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 (MAT)는 메티오닌 및 ATP로부터의 S-아데노실 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet)의 합성을 촉매하는 세포성 효소이고, 메티오닌 순환의 속도 제한 단계로 간주된다. SAM은 폴리아민 생합성에서의 프로필아미노 공여자이고, DNA 메틸화에 대한 주요 메틸 공여자이며, 유전자 전사 및 세포성 증식 뿐만 아니라 2차 대사물의 생산에 관여한다.

2종의 유전자, 즉 MAT1A 및 MAT2A는 2가지 별개의 촉매적 MAT 이소형을 코딩한다. 세번째 유전자인 MAT2B는 MAT2A 조절성 서브유닛을 코딩한다. MAT1A는 성인의 간에서 특이적으로 발현되는 반면, MAT2A는 광범위하게 분포되어 있다. MAT 이소형은 촉매 동역학 및 조절 특성에 있어서 상이하기 때문에, MAT1A 발현 세포는 MAT2A 발현 세포보다 상당히 더 높은 SAM 수준을 갖는다. MAT2A 프로모터의 저메틸화 및 히스톤 아세틸화가 MAT2A 발현의 상향 조절을 일으키는 것으로 밝혀졌다.

간세포 암종 (HCC)에서는, MAT의 하향 조절 및 MAT2A의 상향 조절이 일어나며, 이는 MAT1A:MAT2A 스위치로서 알려져 있다. MAT2B의 상향 조절을 수반하는 스위치는 더 낮은 SAM 함량을 생성하여, 간세포암 세포에 성장 이점을 제공한다. MAT2A는 간세포암 세포의 성장을 촉진시키는데 있어서 중요한 역할을 하기 때문에, 항신생물 요법에 대한 표적이다. 최근 연구는 소형 간섭 RNA를 사용하여 침묵시키는 것이 간세포암 세포에서의 성장을 실질적으로 억제하고 아폽토시스를 유도한다는 것을 제시한 바 있다.

메틸티오아데노신 포스포릴라제 (MTAP)는 메틸티오아데노신 (MTA)을 아데닌 및 5-메틸티오리보스-1-포스페이트로 전환시키는 것을 촉매하는, 모든 정상 조직에서 발견되는 효소이다. 아데닌은 아데노신 모노포스페이트를 생성하기 위해 회수되고, 5-메틸티오리보스-1-포스페이트는 메티오닌 및 포르메이트로 전환된다. 이러한 회수 경로 때문에, MTA는, 예를 들어, 항대사물질, 예컨대 L-알라노신을 사용하여 새로운 퓨린 합성이 차단되는 경우에 대체 퓨린 공급원으로서 제공될 수 있다.

많은 인간 및 뮤린 악성 세포에는 MTAP 활성이 결여된다. MTAP 결핍은 조직 배양 세포에서 발견될 뿐만 아니라 이러한 결핍은 또한, 원발성 백혈병, 신경교종, 흑색종, 췌장암, 비소세포 폐암 (NSLC), 방광암, 성상세포종, 골육종, 두경부암, 점액양 연골육종, 난소암, 자궁내막암, 유방암, 연부 조직 육종, 비-호지킨 림프종, 및 중피종에 존재한다. 인간 MTAP를 코딩하는 유전자는 인간 염색체 9p 상의 영역 9p21로 매핑된다. 이러한 영역은 또한, 종양 억제인자 유전자 p16^INK4A (CDKN2A로도 알려짐), 및 p15^INK4B를 함유한다. 이들 유전자는 시클린 D-의존성 키나제 cdk4 및 cdk6 각각의 억제제인 p16 및 p15를 코딩한다.

p16^INK4A 전사체는 대안적으로, p14^ARF를 코딩하는 전사체 내로 스플라이싱된 ARF일 수 있다. p14^ARF는 MDM2와 결합하고 p53의 분해를 방지한다 (Pomerantz et al. (1998) Cell 92:713-723). 9p21 염색체 영역은 백혈병, NSLC, 췌장암, 신경교종, 흑색종, 및 중피종을 포함한 각종 암에서 동형 접합성으로 자주 결실되기 때문에 흥미롭다. 이러한 결실은 종종, 2개 이상의 유전자를 불활성화시킨다. 예를 들어, 문헌 [Cairns et al. ((1995) Nat. Gen. 11:210--212)]에는, 500종 초과의 원발성 종양을 연구한 후, 그러한 종양에서 확인된 거의 모든 결실이 MTAP, p14ARF 및 P16INK4A를 함유하는 170 kb 영역을 포함하였다고 보고되었다. 문헌 [Carson et al. (WO 99/67634)]에는 종양 발달 단계와, MTAP를 코딩하는 유전자와 p16을 코딩하는 유전자의 동형 접합체 상실 간에 상관관계가 존재한다고 보고되었다. 예를 들어, p16^INK4A가 아니라 MTAP 유전자의 결실이 발달의 초기 단계에 있는 암을 나타내는 것으로 보고된 반면, p16 및 MTAP를 코딩하는 유전자의 결실은 종양 발달의 보다 진보된 단계에 있는 암을 나타내는 것으로 보고되었다. 상기 문헌 [Garcia-Castellano et al.]에는 일부 골육종 환자에서 MTAP 유전자는 진단 시에 존재하였으나, 추후의 시점에 결실되었다고 보고되었다.

본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 종양 세포에서 MTAP의 스테이터스를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 상기 종양 세포를 MAT2A 억제제와 접촉시킴으로써 억제될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포에서 MTAP 유전자 발현의 수준, MTAP 유전자의 존재 또는 부재 또는 존재하는 MTAP 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 세포와 비교하여 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포를 특징규명하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양의 샘플에서, MTAP 유전자의 감소된 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 유전자의 감소된 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소는 상기 종양이 MAT2A 억제제에 대해 반응성인 것을 나타내는 것인, MAT2A 억제에 대한 상기 종양의 반응성을 결정하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 샘플에서 MTAP 유전자의 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 측정하기 위한 시약을 포함하며, 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트를 제공한다.

도 1a-f. 기능적 게놈학 스크리닝은 MTAP 손실이 있는 합성 치명적 유전자를 확인한다. p16/ INK4A /p14/ARF 유전자를 포괄하는 CDKN2A 게놈 영역에 근접하여 MTAP 유전자를 함유하는 염색체 9 및 9p21.3 영역을 도시하는 개략도. (b) 결장 암종 HCT116 MTAP wt 및 MTAP^-/- 동질유전자 세포주 쌍에서 shRNA 고갈 스크린을 도시하는 개략도. (c) HCT116 MTAP^-/- 세포에서의 MTAP 단백질 발현의 결여를 입증하는 면역블롯 분석. (d) HCT116 MTAP^-/- 대 MTAP wt 세포에서의 유전자 스코어. 유전자 스코어는 세포 내로 도입하기 이전과 비교해서 세포 배양 기간 말기에 HCT116 MTAP^-/- 세포 대 HCT116 MTAP wt 세포에서 그 유전자를 표적으로 하는 8개의 shRNA 각각의 존재량에 있어서의 SUM log2 배수 변화로서 계산되었다. (e) MTAP-결핍성 HCT116 세포에서 차별적으로 고갈된 것으로서 스코어링된 상위 10개 유전자. 후속 연구에서 추구하는 유전자는 녹색 (MAT2A), 적색 (PRMT5) 및 자홍색 (RIOK1)으로 강조표시된다. (f) 스크린 내의 HCT116 MTAP^-/- 대 HCT116 wt 세포에서 개별 MAT2A, PRMT5, 및 RIOK1 shRNA의 존재량에 있어서의 변화. 개별 shRNA는 녹색 (MAT2A), 적색 (PRMT5), 또는 자홍색 (RIOK1)으로 강조표시된다. 라이브러리 내의 나머지 shRNA는 회색 다이아몬드로서 제시된다.
도 2a-f. PRMT5는 유전적 제거 시 MTAP-널(null) 세포에서 선택적으로 필수적이지만 약리학적 표적화에서는 그렇지 않다. PRMT5 shRNA 및 p-LVX 비어있는 벡터 대조군 (EV)을 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. (b) PRMT5는 시험관내 MTAP-널 세포에서 선택적으로 필수적이다. 10일 연질 한천 콜로니 성장 검정에서 녹다운 없는 (dox 없음) 대조군과 비교해서, PRMT5 wt 또는 R368A 돌연변이체 구출을 수반하거나 또는 수반하지 않는, PRMT5 녹다운 (+dox) 시 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포의 퍼센트 성장. 콜로니를 크리스털 바이올렛으로 염색한 다음, 리-코르(Li-Cor)를 사용하여 정량화하였다 (평균±SD, n=3). (c) PRMT5 shRNA 및 shRNA-저항성 PRMT5 wt cDNA 또는 PRMT5 R368A 촉매적으로 죽은 돌연변이체 cDNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. (d) PRMT5 shRNA 및 p-LVX 비어있는 벡터 대조군 (EV), 또는 PRMT5 shRNA 및 shRNA-저항성 PRMT5 wt cDNA 또는 PRMT5 R368A 촉매적으로 죽은 돌연변이체 cDNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 대칭적 디-메틸아르기닌 마크의 면역블롯 분석. (e) HCT116 MTAP wt 대 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 20 μM 최고 용량으로부터 적정된 EPZ015666을 이용한 용량 반응 분석. 세포를 5일 동안 EPZ015666으로 처리하였고, 상기 화합물에 대한 그의 반응을 처리된 세포 대 처리되지 않은 대조군의 성장 배수로서 측정한다 (평균±SD, n=3). (f) 5일 동안 표시된 용량의 EPZ015666으로 처리된 HCT116 동질유전자 쌍에서 PRMT5-의존성 디-메틸아르기닌 마크의 면역블롯 분석. PRMT5 shRNA를 발현하는 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포를 대조군으로서 사용하였고, 6일 동안 독시시클린을 이용하여 PRMT5 녹다운을 유도하였다. Dox는 독시시클린 (200 ng/ml)을 6일 동안 부가하여, 세포 수집과 면역블롯 분석 이전에 PRMT5 shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다.
도 3a-d. MTA는 MTAP-결핍성 암에 축적된다. 메티오닌 재활용 및 회수 경로에 대한 개략도. MTAP는 폴리아민 생합성의 부산물인 메틸티오아데노신 (MTA)을 탈카르복실화 S-아데노실메티오닌 (dcSAM) 및 푸트레신에서 메티오닌 및 아데닌으로 다시 전환시켜 주는 메티오닌 회수 경로 내의 효소이다. MTAP 결실로 인해, SAM으로부터 1개 탄소 메틸 기 (CH3) 전이를 매개하는 효소인 메틸트랜스퍼라제의 활성에 대해 억제성인 그의 기질 MTA가 축적된다. SAM은 세포에서 MAT2A에 의해 생성된다. S-아데노실호모시스테인 (SAH)이 메틸 전이 반응의 부산물로서 생성되고, 이는 호모시스테인의 재메틸화를 통하여 메티오닌으로 다시 재순환된다. 대안적으로, 호모시스테인은 시스테인으로 전환되고, 글루타티온을 생성하는 황전환작용 경로 내로 향한다. (b) HCT116 동질유전자 쌍에서 표적화되지 않은 LC-MS를 이용하는 세포내 대사물 수준 분석. 폭포형 플롯은 HCT116 wt 대조군과 비교해서 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 평균 배수 변화 (FC)의 log₂ 대 대사물 ID를 명확하게 보여준다. HCT116 wt 대조군과 비교해서 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 평균 배수 변화 (FC)의 log₂ 대 각각의 대사물에 대한 log₁₀ p 값의 화산형 플롯이 또한 제시된다. MTA 및 dcSAM는 적색으로 강조표시된다. (c) HCT116 동질유전자 세포주에서 세포내 MTA 수준의 정량적 측정치 (평균±SD, n=3). (d) 다양한 종양 기원의 249개 암 세포주의 패널에서의 중앙 MTA 수준.
도 4a-e. MTA는 시험관내 및 생체내에서 PRMT5 활성을 억제한다. (a) N-메틸트랜스퍼라제의 패널의 MTA 감수성. 소형 분자, DNA 뿐만 아니라 리신 및 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라제의 패널을, 10 및 100 μM 농도의 MTA의 존재 하에 시험관내 검정을 사용하여 시험하였다. (b) 시험관내 검정에서 PRMT5 복합체 활성의 MTA 억제에 대한 용량 반응 곡선. (c) PRMT5는 시험된 모든 메틸트랜스퍼라제 중에서 MTA에 의한 억제에 대해 가장 감수성이다. MTA Ki 값의 폭포형 플롯이 제시되고, PRMT5 데이터 점이 적색으로 강조표시된다. (d) MTAP 결실은 세포에서 PRMT5의 기저 활성을 감소시킨다. 다양한 종양 기원의 MTAP wt 및 MTAP-결실된 암 세포주의 패널에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포주는 참조로서 포함되었다. H4R3me2s 마크의 수준은 리-코르 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고, 히스톤 H4의 총 수준에 대해 정규화하였으며, 평균 값±SEM이 막대 그래프 상에 보고되었다. p 값은 양측 비-대응표본 t-검정을 사용하여 계산되었다. (e) 5-메틸티오아데노신 전이 상태 유사체 억제제 (MTAPi)를 이용한 MTAP 약리학적 억제는 HCT116 wt 세포에서 대칭적 디-메틸아르기닌 마크 상의 감소를 초래한다. 3일 동안 250 또는 500 nM 하의 MTAP 억제제로 처리된 HCT116 MTAP^-/- 세포 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석.
도 5a-j. MAT2A는 MTAP-널 HCT116 세포에서 선택적으로 필수적이다. 비-표적화 shRNA (shNT), MAT2A shRNA, MAT2A shRNA 및 shRNA-저항성 MAT2A wt cDNA (+Resc), 또는 MAT2A shRNA 및 MTAP cDNA (+MTAP)를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. Dox는 독시시클린 (200 ng/ml)을 7일 동안 부가하여, 세포 수집과 분석 이전에 MAT2A shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다. (b) 시험관내에서의 MAT2A 녹다운은 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 동등한 SAM 고갈을 초래한다. SAM 수준은 MAT2A 녹다운을 수반한 경우 (+dox) 및 MAT2A 녹다운을 수반하지 않은 경우 (-dox)의 유도성 shMAT2A를 발현하는 HCT116 동질유전자 쌍에서 표적화된 LC-MS 분석을 사용하여 측정되었다. (c) MAT2A는 시험관내 MTAP-결핍성 HCT116 세포에서 선택적으로 필수적이다. 녹다운 없는 (-dox) 대조군과 비교해서, MAT2A wt (+Resc) 또는 MTAP (+MTAP) 구출을 수반하거나 또는 수반하지 않는, MAT2A 녹다운 (+dox) 시 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포의 퍼센트 성장은 4일 및 6일 시험관내 성장 검정에서 측정되었다 (평균±SD, n=5). 세포를 성장 검정을 위해 플레이팅하기 이전에 4일 동안 200 ng/ml dox로 미리 처리하였다. (d) MAT2A shRNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP wt 및 HCT116 MTAP^-/- 이종이식편에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. Dox는 독시시클린 (2,000 mg/kg)을 마우스 차우(chow)에 부가하여 MAT2A shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다. (e) 생체내에서의 MAT2A 녹다운은 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 이종이식편에서 동등한 SAM 고갈을 초래한다. SAM 수준은 MAT2A 녹다운을 수반거나 (dox) 또는 MAT2A 녹다운을 수반하지 않은 (dox 없음) 유도성 shMAT2A를 발현하는 HCT116 동질유전자 쌍으로부터 형성된 이종이식편에서 표적화된 LC-MS 분석을 사용하여 측정되었다. (f) MAT2A는 생체내 MTAP-결핍성 HCT116 세포에서 선택적으로 필수적이다. shMAT2A HCT116 동질유전자 쌍 세포주의 피하 이종이식편에서 MAT2A의 생체내 제거 시 종양 성장의 동역학. 일단 종양의 직경이 200-300 mm³에 도달하면 독시시클린 처리를 개시하였다 (평균±SEM, n=5-6). (g) MAT2A 녹다운 시 생체내에서 MTAP-결핍성 HCT116 세포의 성장은 MAT2A wt cDNA에 의해 구출된다. shNT, shMAT2A, 또는 shMAT2A 및 헤어핀-저항성 MAT2A cDNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 세포주의 피하 이종이식편에서 MAT2A의 생체내 제거 시 종양 성장의 동역학. 일단 종양의 직경이 200-300 mm³에 도달하면 독시시클린 처리를 개시하였다 (평균±SEM, n=5-6). (h) shNT, shMAT2A, 또는 shMAT2A 및 헤어핀-저항성 MAT2A cDNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 이종이식편에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. Dox는 독시시클린 (2,000 mg/kg)을 마우스 차우에 부가하여 MAT2A shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다. (i) MAT2A는 시험관내 MTAP-결실된 MCF7 세포에 필수적이다. 녹다운 없는 (-dox) 대조군과 비교해서, MAT2A wt (+Resc) 구출을 수반하거나 또는 수반하지 않는, MAT2A 녹다운 (+dox) 시 MCF7 세포의 퍼센트 성장은 7일 시험관내 성장 검정에서 측정되었다 (평균±SD, n=5). (j) 비-표적화 shRNA (shNT), MAT2A shRNA, MAT2A shRNA 및 shRNA-저항성 MAT2A wt cDNA (+Resc)를 안정적으로 발현하는 MCF7 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. Dox는 독시시클린 (200 ng/ml)을 7일 동안 부가하여, 세포 수집과 분석 이전에 MAT2A shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다.
도 6a-c. MAT2A 제거는 MTAP-널 세포에서 PRMT5 활성을 선택적으로 억제한다. PRMT 활성은 MAT2A의 유전적 제거 시 감소된다. 표시된 단백질의 면역블롯 분석은 비-표적화 shRNA (shNT), MAT2A shRNA, MAT2A shRNA 및 shRNA-저항성 MAT2A wt cDNA (+Resc), 또는 MAT2A shRNA 및 MTAP cDNA (+MTAP)를 안정적으로 발현하는 HCT116 동질유전자 세포주에서 수행되었다. Dox는 독시시클린 (200 ng/ml)을 7일 동안 부가하여, 세포 수집과 분석 이전에 MAT2A shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다. (b) PRMT5는 SAM에 대한 가장 낮은 친화도를 나타낸다. SAM Km 값 (μM)은 MTA에 의한 억제에 대한 그의 감수성에 관하여 분석된 모든 메틸트랜스퍼라제에 대하여 플롯되었다. (c) MTA 축적으로 인한 MTAP 결핍-유도된 대사 취약성의 수렴 현상과 PRMT5에 대한 MAT2A 제거 시 SAM의 감소된 수준으로 인해 MTAP-결실된, SAM-고갈된 환경에서 PRMT5 기능 감소가 초래되는 것으로 도시된 개략도.
도 7a-d. 다중 PRMT5 공동 복합체는 MTAP-널 세포에서 취약하다. RIOK1 shRNA, RIOK1 shRNA 및 비어있는 벡터 대조군 (EV), RIOK1 shRNA 및 shRNA-저항성 RIOK1 wt cDNA (wt RIOK1) 또는 RIOK1 K208R/D324N 촉매적으로 죽은 돌연변이체 cDNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포에서 표시된 단백질의 면역블롯 분석. Dox는 독시시클린 (200 ng/ml)을 6일 동안 부가하여, 세포 수집과 분석 이전에 PRMT5 shRNA 발현을 유도하였다는 것을 표시한다. (b) RIOK1은 시험관내 MTAP-널 세포에서 선택적으로 필수적이다. 10일 연질 한천 콜로니 성장 검정에서 녹다운 없는 (dox 없음) 대조군과 비교해서, RIOK1 wt 또는 RIOK1 K208R/D324N 돌연변이체 (RIOK1mut) 구출을 수반하거나 또는 수반하지 않는, RIOK1 녹다운 (dox) 시 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포의 퍼센트 성장. 콜로니를 크리스털 바이올렛으로 염색한 다음, 리-코르를 사용하여 정량화하였다 (평균±SD, n=3). (c) 추가적인 PRMT5-결합 파트너는 MTAP-널 세포에서 선택적으로 필수적이다. siRNA 풀로 형질감염 2회전 후 4일 성장 검정에서 측정된 바와 같이 NT 대조군에 대하여 정규화된 PRMT5, RIOK1, pICln, MEP50, COPR5, 또는 SMRACA4를 표적화하는 siRNA, 또는 비-표적화 siRNA (NT)로의 형질감염 시 HCT116 wt 및 HCT116 MTAP^-/- 세포의 퍼센트 성장 (평균±SD, n=5). (d) siRNA 풀을 사용하여 PRMT5 및 PRMT5 결합 파트너 녹다운의 qPCR 확증. 녹다운 효율은 비-표적화 (NT) siRNA 풀-형질감염된 세포에서 검출된 mRNA의 수준과 비교하여 계산되었다.
도 8a-b. (a) MAT2A 억제제 AGI-512로 처리된 MTAP 널 및 MTAP 야생형 HCT116 세포의 퍼센트 성장 억제. (b) MAT2A 억제제 AGI-673으로 처리된 MTAP 널 및 MTAP 야생형 HCT116 세포의 퍼센트 성장 억제.
도 9. HCT116 MTAP^-/- 및 MTAP wt 세포에서 PRMT5, MTAP 및 베타-액틴 단백질 및 SDMA 마크의 면역블롯 분석.
도 10. 생체내 같은 자리 MCF7 모델에서 Mat2a 녹다운의 효과.
도 11a-d. PRMT5는 MTAP-널 암에서 선택적 취약성이다.
도 12. MAT2A 고갈은 MTAP 널 세포에서 PRMT5 메틸 마크를 감소시킨다.

염색체 9p21 (Chr9p21)은 수많은 상이한 종양 유형을 포함하고 다형성 교모세포종에서 관찰된 >50%만큼의 결실 빈도의 빈도 범위인 (Parsons and Kinsler, Science 2008), 모든 인간 암의 대략 15%에서 동형접합성 결실된다 (Berhoukim Meyerson nature 2010). 9p21 유전자 자리는 p14-ARF 및 p16-INK4a 둘 다를 코딩하는 CDKN2a 유전자를 포함한다 (도 1a). 양쪽 단백질은 종양 억제 역할을 하며, p14-ARF는 p53을 안정화시키는 것으로 알려져 있고 (Kamijo & Sherr Cell 1997 and Zhang & Yarbough Cell 1998), p16-INK4a는 CDK4/6 세포 주기 키나제의 음성 조절을 통한 중요한 세포 주기 조절인자 및 강력한 종양 억제인자인 것으로 입증되었다 (Serrano & Beach Nature 1993). Chr9p21 결실은 30년 전에 처음으로 발견되었지만 (Chilcote NEJM 1985), CDKN2A 상실에 대한 분자적 표적화 요법은 규정하기 힘든 것으로 입증되었으며, Chr9p21이 결실된 종양을 표적으로 하는 대체 접근 방식을 확인하는 것이 필요할 수 있다.

특히, Chr9p21 결실은 종종 CDKN2A 근위 유전자의 공동 결실을 수반한다 (도 1a). 이들 공동 결실된 유전자 중 가장 중요한 것은 CDKN2a에 인접한 Chr9p21에 있는 MTAP이다 (도 1a). 이러한 MTAP 유전자는 CDKN2A의 100 kb 이내에 있고, MTAP의 동형접합성 결실이 CDKN2A 결실을 수반한 종양의 80-90%에서 발견된다 (Illie & Ladanyi Clin Canc Res 1993 and Zhang & Savarese Canc Genet Cytogenet 1996). MTAP는 메티오닌 회수 경로에 있어서 중요한 효소인 메틸티오아데노신 포스포릴라제를 코딩한다. MTAP는 폴리아민 합성의 부산물인 메틸티오아데노신을 대사시켜, MTA로부터 메티오닌 및 아데닌의 궁극적인 재생을 초래한다 (Zappia & Cartena-Farrina Adv Exp Med Biol 1988). 따라서, MTAP는 메티오닌 대사, 폴리아민 생합성 및 뉴클레오티드 대사 - 암 세포의 증식 대사에 있어서 각각 중요한 대사 경로 -의 교차점에 있다. 사실상, MTAP 결실이 퓨린 생합성의 억제제에 대한 감수성을 창출하는 것으로 보고되었지만 (Li and Bertino Oncol Res 2004), 이러한 대사적 취약성은 종양이 순환하는 아데닌을 흡수하고 퓨린 생합성 감수성을 벗어남에 따라 생체내에서 상실된다 (Rueffli-Brasse and Wickramasinghe JCI 2011). 본 발명자들은 MTAP 결실로 인해 Chr9p21 결실을 수반한 암에 다른 표적화가능한 부수적 취약성이 창출되는지 여부를 알아보고자 하였다.

암에서의 MTAP 상실로 인해 생기는 취약성에 관하여 스크리닝하기 위해, MTAP 스테이터스에서만 변하는 동질유전자 암 세포주 쌍에서 shRNA 고갈 스크리닝을 사용하였다. MTAP는 대사 효소를 코딩하지만, 본 발명자들은 MTAP 상실이 대사 이상으로 확장되는 생물학적 경로에서 부수적인 취약성을 창출할 수 있다고 가정하였다. 대사 경로와 비-대사 경로 간의 그러한 혼선에 앞서, 기능 획득 돌연변이체 IDH1/2 단백질에 의해 생성된 대사물인 2-히드록시글루타레이트가 알파-케토글루타레이트 의존성 디옥시게나제 효소 계열의 구성원을 억제할 수 있다는 관찰을 포함한다 (Xu & Xiong Cancer Cell 2011, Rohle & Mellinghoff Science 2013). 유사한 기전이 또한, 숙시네이트 데히드로게나제 (SDH) 또는 푸마레이트 히드라타제 (FH)에서의 돌연변이를 수반한 종양과 관련되었으며, 이들 효소의 기질이 높은 수준으로 축적된다 (Selak and Gottlieb, Cancer Cell 2005 and Issacs and Neckers, Cancer Cell 2005). 따라서, 암 대사체 상의 일탈이 비-대사 경로에 영향을 줄 수 있다. MTAP 결실이 대사 경로와 비-대사 경로에서 부수적인 취약성을 일으킬 것이라는 가설을 시험하기 위해, 대사체의 3000+ 유전자 뿐만 아니라 추가적인 3000+ 추가적인 비-대사 유전자를 표적으로 하는 shRNA 헤어핀으로 이루어지는 shRNA 라이브러리가 사용되었다.

이러한 스크린과 후속 연구를 통하여, 암에서의 MTAP 상실에 취약해지는 시그널링 축이 확인되었다. 이러한 시그널링 축의 중심은 아르기닌 메틸트랜스퍼라제인 PRMT5이다. 대사체적 및 생화학적 접근 방식을 사용하여, MTAP 효소 반응의 기질인 MTA가 MTAP-널 암에 축적된다는 것이 밝혀졌다. MTA는 PRMT5 효소 활성을 억제하고, MTAP-널 암에서 기저 PRMT5 메틸화 감소를 유발시킨다. 이러한 취약성은 PRMT5의 상류 및 하류 둘 다로 연장된다. 본 발명자들은 PRMT5 기질 S-아데노실 메티오닌 (SAM)을 생산하는 대사 효소 메티오닌-아데노실트랜스퍼라제-2A (MAT2A)가 키나제 RIOK1을 포함한 다수의 상이한 PRMT5 결합 파트너이기 때문에 MTAP-널 암에서도 선택적으로 필수적이라는 것을 제시한다.

HCT116 MTAP wt/ MTAP ^-/- 동질유전자 쌍에서 shRNA 고갈 스크린.

그의 상실이 MTAP-결핍성 세포의 선택적 사멸을 초래하는 유전자를 확인하기 위해, HCT116 결장 암종 세포주, 및 MTAP 유전자의 엑손 6을 결실시키기 위해 유전적으로 변형시킨 HCT116 세포의 동질유전자 클론에서 shRNA 기반 고갈 스크린을 수행하였다 (도 1b). 이러한 결실로 인해 MTAP 단백질 발현의 완전한 상실이 초래되었다 (도 1c). 잠재적인 합성 치명적 상호 작용에 대한 넓은 적용 범위를 제공하기 위해, 본 발명자들은 완전한 대사체 (3,067개 유전자), 미토콘드리아 프로테옴 (Pagliarini and Mootha Cell 2008), 에피게놈 (Arrowsmith and Shapira Nature Reviews Drug Discovery 2012), 키놈 (http://www.uniprot.org/), 및 다양한 생물학적 경로를 나타내는 >1500 추가적인 유전자를 포괄한 라이브러리를 구축하였다. HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 wt 세포는 유전자당 8개의 shRNA를 함유하는 shRNA 라이브러리로 형질도입하였고, 녹다운 세포 풀은 12 세포 분할을 위해 계대되었다. 배양이 끝날 무렵, 본 발명자들은 심층 서열분석을 통해 각각의 shRNA 바코드의 상대적 존재량을 측정하였고, 형질도입되지 않은 라이브러리 DNA와 비교해서 각각의 shRNA의 배수 고갈을 계산하였다. 이어서, 본 발명자들은 HCT116 MTAP^-/- 대 HCT116 wt 세포에서 유전자를 표적으로 하는 8개의 shRNA 각각의 존재량에 있어서의 log2 배수 변화 상의 차이에 근거하여 각각의 유전자에 대한 MTAP 선택성 스코어를 계산하였다 (도 1d).

이러한 분석은 대다수의 유전자 뿐만 아니라 shRNA 대조군이 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP wt 세포 둘 다에서 유사한 스코어를 나타내긴 하였지만 (도 1d), 유전자의 서브세트는 MTAP-결핍성 세포에서 선택적으로 고갈되었다는 것을 입증시켜 주었다 (도 1d-e). 이러한 스크린에서의 최고 히트는 대사 효소 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 II, 알파를 코딩하는 MAT2A였다 (도 1d-f). MAT2A는 메티오닌의 아데노실화를 통해 메틸 기의 만능 생물학적 공여자인 S-아데노실메티오닌 (SAM)의 합성을 촉매한다. 본 스크린에서 두번째로 우수한 스코어링 유전자는 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 5 (PRMT5)였는데 (도 1d-f), 이는 절대적 결합 파트너 WD45/MEP50 (WD 반복 도메인 45/메틸로솜 단백질 50), 및 다른 스캐폴딩 단백질과의 복합체에서 PRMT5를 포함하는 다중 단백질 메틸트랜스퍼라제 복합체의 촉매적 서브유닛이다 (Meister et al., 2001; Pesiridis et al., 2009). PRMT5는 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제의 유형 II PRMT 서브패밀리에 속하고, 표적 단백질에서 대칭적 디-메틸아르기닌의 형성을 촉매한다. 흥미롭게도, 여섯번째로 높은 스코어링 유전자인 RIOK1은 PRMT5의 결합 파트너인 Rio 도메인 함유 단백질을 코딩하여, PRMT5를 PRMT5 기질의 서브세트의 선택적 메틸화로 유도한다 (Guderian et al. 2011). 이들 데이터는 MAT2A 및 PRMT5-촉매된 반응이 MTAP-결핍성 세포의 생존 능력을 유지하는데 있어서 결정적이라는 것을 암시한다. 3가지 강조표시된 히트 모두가 치료학적 및 생물학적으로 흥미로운 표적을 나타내긴 하지만, 본 발명자들은 초기에는, 인간 암의 치료를 위하여 상기 효소를 표적으로 하여 현재 진행중인 PRMT5에 관심을 집중하였다 (Chan Penebre Nature Chem Bio 2015).

PRMT5는 유전적 제거 시 MTAP-널 세포에서 선택적으로 필수적이지만 약리학적 표적화에서는 그렇지 않다.

세포에서 MTAP 결핍과 PRMT5 기능 간의 연관성을 추가로 연구하기 위해, 본 발명자들은 PRMT5를 표적화하는 유도성 shRNA를 안정적으로 발현하는 HCT116 MTAP^-/- 및 HCT116 wt 세포주를 생성하였다. 본 발명자들은 PRMT5 단백질의 수준을 측정함으로써 PRMT5가 효율적으로 녹다운되었다는 것을 확증하였다. 본 발명자들의 게놈 스크리닝 결과와 일치하게도, 독시시클린-유도성 shRNA로의 PRMT5 녹다운은 MTAP WT 세포에서 보다는 MTAP 결실을 수반한 세포에서 더 완전한 성장 감소를 초래하였다 (도 2b). MTAP-널 세포에서의 shPRMT5-저항성 PRMT5 cDNA의 발현은 내인성 PRMT5 녹다운 시 성장 억제를 구출한 반면, 촉매적으로 죽은 R368A PRMT5 돌연변이체 (Pollack et al., 1999) cDNA의 발현은 그렇지 못하였다 (도 2b-c). 따라서, 본 발명자들의 shRNA의 항증식성 효과는 PRMT5 고갈에 기인한 것이지, 표적을 벗어난 shRNA 효과에 기인한 것이 아니다. R386A-돌연변이체 PRMT5에 의한 구출의 결여는 PRMT5 효소 활성이 MTAP^-/- 세포에 필수적이라는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, MTAP^-/- 및 WT 세포에서 PRMT5 단백질 수준이 동등하게 감소되면, MTAP^-/- 세포주에서 대칭적 디-메틸아르기닌 마크의 수준이 더 크게 감소되었고 PRMT5에 의해서는 구출되었지만, R368A-돌연변이체 cDNA의 경우에는 그렇지 못하였다 (도 2d). 이러한 발견은 본 발명자들의 스크리닝 결과의 검증을 제공하고, PRMT5 촉매적 기능이 MTAP-결핍성 세포의 성장을 유지하는데 있어서 결정적이라는 것을 추가로 암시한다.

이어서, 본 발명자들은 약리학적 도구를 사용하여 MTAP-결핍성 세포에서 PRMT5 기능에 관한 정보를 얻고자 하였다. PRMT5의 강력하고 선택적인 억제제인 EPZ015666이 최근에 개발되었다 (Chan-Penebre et al., 2015). 본 발명자들은 EPZ015666 화합물을 활용하였고, HCT116 동질유전자 쌍에서 용량 반응 분석을 수행하였다 (도 2e). 그러나, PRMT5의 유전적 표적화와는 달리, PRMT5의 약리학적 표적화시의 성장 억제는 MTAP-결핍성 유전적 배경에 대해 선택적이지 않았다 (도 2e). 이러한 발견은 PRMT5의 촉매적으로 죽은 돌연변이체가 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 성장 표현형을 구출하지 못하였다는 사실을 고려해볼 때 예상치 못한 것이었으며, 이는 이들 세포의 성장을 선택적으로 억제하는데 필요하였던 PRMT5의 촉매적 기능이 상실된다는 것을 암시한다 (도 2a). 흥미롭게도, PRMT5 기능의 유전적 제거의 경우와는 달리, 동등한 정도의 PRMT5 활성 억제는 전체 세포 용해물에서 PRMT5-의존성 디-메틸아르기닌 마크의 감소된 수준에 의해 입증되는 바와 같이, EPZ015666을 이용하여 MTAP^-/- 및 wt HCT116 세포 둘 다에서 달성되었다 (도 2f). MTAP-결핍성 세포의 성장에 대한 유전적 및 약리학적 PRMT5 제거의 강한 영향력 간의 상기와 같은 놀라운 불일치로 인해, 본 발명자들은 PRMT5 및 MTAP 배후의 기본 생물학과 대사에 관한 정보를 추가로 얻게 되었다.

MTAP 결핍은 변경된 대사 상태를 창출한다.

HCT116 동질유전자 쌍의 성장에 대한 PRMT5의 유전적 표적화 대 약리학적 표적화의 강한 영향력 상의 차이를 설명하기 위해, 본 발명자들은 MTAP 및 PRMT5 합성 치사의 본 발명자들의 기계론적 이해를 추가로 구축하고자 하였다. MTAP는 폴리아민 생합성의 부산물인 메틸티오아데노신 (MTA)을 메티오닌 및 아데닌으로 다시 전환시켜 주는 메티오닌 회수 경로 내의 효소이다 (도 3a). MTAP는 MTA의 분해를 촉매하는 것으로 알려진 포유류 세포 내의 유일한 효소이기 때문에, 본 발명자들은 MTAP 결핍이 MTA의 축적을 초래할 것으로 가정하였다. 본 발명자들은 먼저, HCT116 MTAP 동질유전자 쌍에서 세포내 대사물 수준의 더 넓은 비표적화 LC-MS 기반 대사체학 평가의 맥락에서 이러한 가설을 시험하였다 (도 3b). 이러한 분석 결과, 검출되었던 237개의 주석이 달린 대사물 중에서 MTA가 HCT116 wt 대조군과 비교해서 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 가장 큰 증가를 표시하였다는 사실이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 폴리아민 생합성 경로에서 MTA로부터의 상류의 대사물인 탈카르복실화 S-아데노실메티오닌 (dcSAM)이 두번째로 가장 큰 증가를 표시하였다. 이들 두 가지 대사물이 HCT116 MTAP^-/- 세포에 풍부하다는 것은 통계적으로 고도로 유의적이었다 (도 3b). HCT116 동질유전자 쌍에서의 MTA 수준의 정량적 측정을 이용하여 MTA의 상승을 추가로 확증하였다 (도 3c). 더욱이, 상이한 종양 기원의 249개 세포주를 포함하는 큰 암 세포주 패널의 스크린은 내인성 MTAP 결실을 수반한 세포의 배지에서 MTA의 매우 일관된 축적을 입증시켜 주었다 (도 3d).

MTA는 시험관내 및 생체내에서 PRMT5 활성을 억제한다.

MTA는 단백질 메틸트랜스퍼라제의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다 (Enouf et al., 1979). 이러한 개념을 직접적으로 시험하기 위해, 본 발명자들은 10 μM 및 100 μM MTA로의 처리 후 33종의 상이한 N-메틸트랜스퍼라제의 효소 활성을 평가하는 시험관내 생화학적 스크린을 수행하였다 (도 4a). MTA에 의한 억제는 상기 패널의 작은 서브세트에서만 관찰되었고, 가장 강력한 억제는 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 계열의 구성원인 PRMT5 및 PRMT4에 대하여 관찰되었다 (도 4a). 추가로, PRMT5는 광범위한 MTA 농도를 시험하는 후속 실험에서 MTA에 대한 강력한 감수성을 입증시켜 주었다 (도 4b). 그 다음, 본 발명자들은 PRMT5, PRMT4, 및 메틸트랜스퍼라제의 다양한 서브세트에 대한 MTA Ki를 분석하였다 (도 4c).

놀랍게도, PRMT5에 대한 MTA Ki (0.46 μM)는 임의의 다른 메틸트랜스퍼라제에 대한 것보다 >20배 더 낮았으며, 이는 PRMT5가 시험된 임의의 다른 메틸트랜스퍼라제보다 MTA에 의한 억제에 대해 훨씬 더 감수성이라는 것을 나타낸다. 이러한 생화학적 관찰 내용은, 라이브러리에서 나타났고 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 선택적으로 고갈되었던 모든 메틸트랜스퍼라제 중에서 PRMT5가 가장 강력한 히트였다는 것을 입증하는 본 발명자들의 shRNA 스크리닝 데이터와 일치한다 (도 1d).

이어서, 본 발명자들은 세포에서 PRMT5 활성에 대한 MTA 축적의 강한 영향력에 역점을 두었다. 본 발명자들의 생화학적 검정에서 측정된 MTA에 대한 PRMT5 IC₅₀ (3 μM) 및 MTAP-결핍성 세포에서 세포내 MTA 수준 (~100 μM)의 본 발명자들의 LC-MS 분석에 따라서, 본 발명자들은 MTAP-결핍성 세포에서의 MTA 축적이 PRMT5 활성의 억제를 초래하는데 충분할 것으로 가정하였다. HCT116 동질유전자 쌍의 전체 세포 용해물 내에서의 PRMT5-의존성 메틸 마크에 관한 본 발명자들의 분석 동안, 본 발명자들은 HCT116 MTAP^-/- 세포가 더 낮은 기저 수준의 메틸화를 나타내는 것으로 여겨진다고 인지하였다 (도 2d). 이러한 발견을 추가로 구체화하기 위해, 본 발명자들은 MTAP wt 및 MTAP-결실된 세포주의 서브세트의 전체 세포 용해물에서 PRMT5-의존성 메틸 마크의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다 (도 4d). 본 발명자들은 MTAP-결실된 세포주가 더 낮은 수준의 대칭적 디-메틸아르기닌 마크를 일관되게 명확하게 보여주었다는 사실을 관찰하였다 (도 4d). 최종적으로, 본 발명자들은 MTAP의 강력하고 세포 투과성인 전이 상태 유사체 억제제의 가용성을 활용하였다 (Basu et al., 2011; Longshaw et al., 2010). 본 발명자들은 HCT116 wt 세포를 3일 동안 MTAP 억제제로 처리하였고, 디-메틸아르기닌 마크의 수준에 대한 MTAP의 약리학적 억제의 강한 영향력을 측정하였다 (도 4e). MTA 수준을 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 관찰된 수준으로 증가시키는데 충분한 용량 하의 MTAP 억제제로 처리하면 (도 4e), MTAP의 유전적 제거 시 관찰되는 것과 유사하게 디-메틸아르기닌 메틸 마크의 수준이 감소되었다 (도 4e). 이들 데이터는 PRMT5 활성이 MTAP-널 세포에서 MTA에 의해 손상되어, 그의 단백질 기질의 메틸화가 감소되고 shRNA에 의한 PRMT5 활성의 추가적인 감소에 대한 취약성이 창출된다는 것을 강력하게 나타낸다. 더욱이, MTA가 PRMT5를 억제한다는 본 발명자들의 발견은 PRMT5 억제제 EPZ015666을 이용한 MTAP-선택적 성장 억제의 결여에 대한 설명을 제공해 준다. 이러한 억제제는 MTA-PRMT5 복합체의 경우에는 가능하지 않은 양이온-파이 분자 상호 작용을 통해 SAM-PRMT5 복합체와 선택적으로 결합한다 (Chan-Penebre et al., 2015). MTA는 PRMT5에 대한 SAM의 결합을 방지하고, EPZ015666은 SAM-결합된 PRMT5 하고만 상호 작용하기 때문에, MTA 결합은 EPZ015666 결합과 상호 배타적이다. 단일 효소의 두 억제제가 별도의 결합 부위와 결합하고 표적과의 상호 작용이 상호 배타적이 아닌 경우에만, 이들 두 억제제는 상승적일 수 있다 (Breitinger).

MAT2A는 MTAP -결핍성 세포에서 선택적으로 필수적이다.

이어서, 본 발명자들은 본 발명자들의 shRNA 스크린에서 최고의 히트인 MAT2A가 또한, MTAP-결핍성 세포에서 진실된 합성 치명적 표적을 나타내는지 여부를 시험하고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 HCT116 동질유전자 쌍을 활용하였고, 비-표적화 shRNA, MAT2A-표적화 shRNA를 안정적으로 발현하는 세포주 뿐만 아니라 shRNA-저항성 MAT2A cDNA로 추가적으로 재구성된 세포주 또는 MTAP cDNA를 발현한 세포주를 창출하였다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯에 의해 HCT116 세포에서의 MAT2A 및 MTAP 재발현, 및 효율적인 MAT2A 녹다운을 확증하였다 (도 5a). 본 발명자들은 또한, MAT2A 녹다운으로 인해, LC-MS 분석을 사용하여 HCT116 유전자형 둘 다에서 SAM의 감소된 세포성 수준이 초래되었다는 것을 확증하였다 (도 5b). 본 발명자들은 MTAP 재발현이 HCT116 MTAP^-/- 세포의 배지에 존재하는 높은 MTA 수준을 고갈시켰다는 것을 추가로 확증하였다. 이어서, 본 발명자들은 4일 및 6일 시험관내 성장 검정에서 HCT116 wt 대 HCT116 MTAP^-/- 세포에서 MAT2A 녹다운의 강한 영향력을 시험하였다 (도 5c). 그 결과는 본 발명자들의 게놈 스크린과 일치하였다. MAT2A 녹다운은 HCT116 MTAP^-/-의 성장을 선택적으로 약화시켰지만, HCT116 wt 세포는 그렇지 않았다 (도 5c). 중요하게도, 이러한 성장 결함은 shRNA-저항성 MAT2A cDNA 구축물의 도입에 의해 구출되었으며, 이는 shRNA의 표적에 적중한 효과를 나타내며, 또한 상기 결함은 MTAP 재발현에 의해 부분적으로 구출되었다 (도 5c).

본 발명자들의 발견의 시험관내에서 생체내 번역을 연구하기 위해, 본 발명자들은 유도성 MAT2A shRNA를 발현하는 HCT116 동질유전자 세포주를 이용하여 이종이식편 효능 연구를 시행하였다. 이들 연구에서는, 정립된 종양의 증식에 있어서 MAT2A의 역할을 평가하기 위해, 독시시클린으로 동물을 처리하기 이전에 종양을 형성시켰다. 생체내에서 MAT2A 녹다운의 효율은 웨스턴 블롯에 의해 확증되었다 (도 5d). 본 발명자들은 생체내에서 MAT2A 유전적 제거로 인해, 양쪽 유전자형의 HCT116 이종이식편 내에서의 SAM 수준의 유사한 감소를 유발하였다는 것을 추가로 확증하였다 (도 5e). 본 발명자들의 시험관내에서의 발견에 따르면, shRNA에 의한 MAT2A 고갈 시 생체내에서 MTAP-선택적 성장 억제가 관찰되었다 (도 5f). 이러한 생체내에서의 선택적 성장 억제가 표적에 적중한 효과였다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 shMAT2A의 야생형 MAT2A 구출 아암을 이용한 확장된 생체내 연구를 수행하였다 (도 5g 및 5h). 이러한 실험은 본 발명자들의 첫번째 생체내 연구에서 관찰된 효능을 확증시켜 주었고 (도 5g 및 5h), 시험관내 연구와 같이, MAT2A shRNA에 대해 저항성인 MAT2A cDNA를 발현하는 이종이식편에서 성장 억제가 구출되었다 (도 5g 및 5h).

최종적으로, 본 발명자들은 MTAP 유전자 자리에 내인성 결실을 보유하고 있는 모델에서 본 발명자들의 발견을 확증하고자 하였다. 따라서, 본 발명자들은 비-표적화 shRNA, MAT2A-표적화 shRNA를 안정적으로 발현하는 유방 암종 MCF7 세포주 뿐만 아니라 shRNA-저항성 MAT2A cDNA로 추가적으로 재구성된 세포주를 생성시켰다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯에 의해 재발현 및 MAT2A 녹다운의 효율을 명확하게 보여주었다 (도 5j). HCT116 모델 시스템에서 만들어진 관찰 내용과 일치하게, MAT2A 녹다운은 7일 성장 검정에서 MTAP-결실된 MCF7 세포의 성장을 약화시킨 반면 (도 5i), MAT2A cDNA 재구성은 성장 표현형의 완전한 구출을 초래하였다. 따라서, MAT2A는 본 발명자들의 모델에서 MTAP 결핍을 수반한 일관된 합성 치사를 입증한다.

MAT2A 상실은 MTAP 널 세포에서 PRMT5 활성을 선택적으로 억제한다.

PRMT5 및 MAT2A 둘 다가 MTAP의 진정한 합성 치명적 파트너임을 확증한 후, 본 발명자들은 본 발명자들의 스크린에서 이들 두 가지 최고 히트 간에 기계적인 연관성이 있는지 여부를 평가하고자 하였다. 실제로, MAT2A는 모든 세포성 메틸트랜스퍼라제의 활성에 필요한 SAM을 생성시키고, MAT2A 유전적 제거 시 SAM 수준이 감소하는 것은 PRMT5의 기능을 포함하여 그들의 기능에 광범위하게 강한 영향을 미치는 것으로 예상될 것이다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명자들의 MAT2A shRNA HCT116 동질유전자 쌍에서 뿐만 아니라 MAT2A의 녹다운 시 MTAP 재발현 세포주 및 재구성된 MAT2A에서 히스톤 H4에 대한 PRMT5-의존성 대칭적 디-메틸아르기닌 마크의 수준을 측정하였다 (도 6a). 흥미롭게도, 본 발명자들은 양쪽 유전자형의 HCT116 세포에서 SAM 수준에 있어서의 동등한 정도의 감소에도 불구하고 (도 5b), H4R3me2s 마크는 MTAP-결핍성 세포에서 선택적으로 감소되었지만, MTAP wt 세포에서는 그렇지 않았고, MAT2A 및 MTAP cDNA의 존재 하에 구출되었다는 것을 관찰하였다 (도 6a). PRMT5 활성에 대한 MTA의 강력한 억제성 영향력에 관한 본 발명자들의 관찰 내용과 조합하여, 이들 데이터는 MTAP-널 배경에 있어서의 PRMT5 기능이 SAM의 적당한 가용성에 고도로 의존적이라는 것을 암시한다. PRMT5는 SAM에 대한 낮은 친화도를 나타내는 것으로 문헌에 보고되었으므로 (Antonysamy et al., 2012; Sun et al., 2011), 본 발명자들은 본 발명자들의 시험관내 생화학적 패널 분석으로부터의 N-메틸트랜스퍼라제에 대한 SAM Km 값을 비교하였고, 실제로 PRMT5가 SAM에 대한 가장 낮은 친화도를 나타내었다는 것을 관찰하였다 (도 6b). 이러한 발견은, 특히 MTAP-결핍성 세포의 대사적으로 변경된 높은-MTA 환경에서 적당한 MAT2A 기능에 대한 PRMT5 의존성을 설명할 수 있다 (도 6c). 따라서, MTAP 결핍으로 인한 대사 취약성은 PRMT5의 상류로 확장되어 PRMT5 기질 SAM의 가용성에 대한 의존성을 창출하므로, SAM 생산 효소 MAT2A의 활성에 대한 의존성을 창출한다.

다중 PRMT5 공동 복합체는 MTAP-널 세포에서 취약하다.

Rio 도메인 함유 단백질 RIOK1은 본 발명자들의 shRNA 고갈 스크리닝 캠페인에서 또 다른 강력한 히트였다. 이는 PRMT5 결합 파트너이기 때문에, 본 발명자들은 HCT116 MTAP 동질유전자 세포에서 RIOK1의 유전적 제거 시 합성 치명적 표현형을 확증하고자 하였다. PRMT5 및 MAT2A에 대하여 수행되었던 특징 규명과 유사하게, 유도성 RIOK1 shRNA 세포주 뿐만 아니라 RIOK1 wt 구출 및 RIOK1 활성 부위 (D324N) 및 ATP-결합 도메인 (K208R) 촉매적으로 불활성 돌연변이체 (Angermayr et al., 2002; Widmann et al., 2012) 세포주가 창출되었다. RIOK1 녹다운 및 재발현 효율이 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다 (도 7a). 게놈 스크리닝에서의 본 발명자들의 발견을 확증해 보면, RIOK1 녹다운이 HCT116 wt 세포의 성장에 대한 최소한의 영향력을 나타내면서 HCT116 MTAP^-/- 세포의 성장의 선택적 억제를 초래하였다 (도 7b). 성장 표현형은 shRNA-저항성 wt RIOK1의 발현에 의해 구출되었고, 촉매적으로 불활성인 K208R, D324N 돌연변이체 RIOK1은 그렇지 않았다 (도 7b). 이들 데이터는 MTAP-결핍성 배경에서 MTA의 축적을 통해 창출된 대사 취약성이 PRMT5 결합 파트너 RIOK1에 대한 영향력을 통해 PRMT5의 하류로 추가로 연장된다는 것을 암시한다.

PRMT5는 절대적 결합 파트너 WD45/MEP50 (Wilczek et al., 2011), 상호 배타적 파트너 pICln 및 RIOK1 (Guderian et al., 2011), 특이성 COPR5의 핵 조절인자 (PRMT5의 협력인자) (Lacroix et al., 2008) 등을 포함한, 몇 가지 다량체성 단백질 공동 복합체에 참여한다. MEP50 뿐만 아니라 pICln 또는 PRMT5의 다른 결합 파트너는 본 발명자들의 shRNA 라이브러리에 나타내지 않았다. 따라서, MTAP-결핍성 세포의 취약성이 RIOK1 공동 복합체 이외의 PRMT5 공동 복합체로 추가로 연장될 수 있는 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 HCT116 동질유전자 쌍에서 PRMT5 그 자체, RIOK1, MEP50, pICln, 및 COPR5를 포함한 다중 PRMT5 공동 복합체 구성원의 siRNA 풀-매개된 녹다운을 수행하였다 (도 7c 및 7d). 본 발명자들은 PRMT5 공동 복합체의 각각의 구성원의 녹다운 시 MTAP-결핍성 세포의 성장의 선택적 억제를 관찰하였다 (도 7c). 중요하게도, 별도의 PRMT5-결합 단백질인, SMARCA4 유전자에 의해 코딩된 ATP-의존성 헬리카제 Brg1의 녹다운 (Pal et al., 2004)이 그의 MTAP 스테이터스에 상관없이 HCT116 세포의 성장을 억제하였다 (도 7c). 이들 데이터는 PRMT5로부터의 하류의 MTAP-결핍성 세포의 취약성이 RIOK1 공동 복합체에 국한되는 것이 아니라, 오히려 결합 파트너로서 PRMT5를 수반하는 몇 가지 공동 복합체에 광범위하게 영향을 미친다는 것을 암시한다. MTAP-널 세포에 MTA가 축적되면 PRMT5 활성이 감소되고, PRMT5의 표적화에 대한 부수적인 취약성이 창출된다. 이러한 취약성은 PRMT5의 상류 및 하류에 있는 대사적, 후성적 및 시그널링 경로 구성원으로 확장된다.

포유류 대사체는 고도의 유연성 및 중복성을 특징으로 할 수 있다 (Thielle & Pallson Nat Biotech 2013 and Folger and Shlomi Molec Sys Bio 2011). 따라서 MTA는 단독적이고 비-중복성 효소인 MTAP에 의해 소모된다는 점에서 이례적이다. 본 발명자들은 MTAP 결실시, MTA가 대략 100 uM의 세포내 농도로 축적되고 세포가 과량의 MTA를 배출하기 시작한다는 것을 관찰하였다. 이러한 MTA의 축적으로 인해, 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 PRMT5에서 예상치 못한 부수적인 취약성이 야기되었다. shRNA 라이브러리가 39종의 메틸트랜스퍼라제를 함유하긴 하지만, PRMT5는 그의 고도의 MTAP-선택성에 있어서 독득하였다. 메틸트랜스퍼라제의 생화학적 프로파일링은 이러한 현상에 대한 분자 기준을 밝혀내었다. 본 발명자들이 시험관내에서 시험한 32종의 메틸트랜스퍼라제 중에서, PRMT5가 MTA에 의한 억제에 대해 가장 감수성인 효소였다. MTA에 의한 PRMT5의 시험관내 억제는 MTAP-널 세포에서 관찰된 것과 매우 유사한 농도에서 일어나며, 이것이 생물학적으로 관련이 있는 현상이라는 것을 암시한다. 이와 일치하게, 본 발명자들은 MTAP 결실을 수반한 세포에서 PRMT5 메틸 마크의 기저 수준이 실질적으로 감소되었다는 것을 관찰하였다.

감소된 기저 PRMT5 활성은 shRNA에 의한 PRMT5의 추가 제거에 대한 취약성을 창출한다. 흥미롭게도, PRMT5 억제제 EPZ-015666으로 처리하면 MTAP-널 세포에서 선택적 성장 억제가 야기되지 않았다. EPZ-015666은 PRMT5의 매우 특색있는 방식의 억제를 나타낸다. 이러한 억제제는 SAM-비경쟁적이고, SAM 상의 부분적으로 양전하를 띤 메틸 기와의 특이한 양이온-파이 상호 작용을 통해 효소 결합된 SAM과의 중요한 결합 상호 작용을 형성한다 (Chan-penebre Nat Chem Bio 2015). MTA는 EPZ-015666과 이러한 상승적 결합 상호 작용을 형성할 수 없다 (CITE Chan-penebre). 따라서, 이러한 기존의 PRMT5 억제제는 MTAP-널 암에서 우선적인 활성을 나타내지 않는다. MTAP-널 암에서 PRMT5 취약성을 활용하기 위해서는, MTA-결합된 형태의 PRMT5와 결합하고 그러한 상태로 효소를 가두는 MTA-선택적 PRMT5 억제제를 개발할 필요가 있다. MTA-선택적 억제제는 비-선택적 억제제보다 더 큰 적정 약물 농도를 제공할 수도 있으며, 이는 정상 조직에서의 MTAP 발현이 낮은 MTA 수준을 유지함으로써 보호 효과를 제공해야 하기 때문이다. 마우스 유전학 연구는 PRMT5가 정상적인 생리학에서 중요한 역할을 하고; PRMT5 녹아웃이 배아 치사를 초래하며 (Tee 2010), CNS (Bezzi 2013), 골격근 (Zhang 2015) 및 조혈 계통 (Liu 2015)에서 조직 특이적 PRMT5 녹아웃 시 실질적인 독성이 유발된다는 것을 밝혀냈다. 이들 독성은 임상 설정에서 용량 제한적이 되어, PRMT5를 비-선택적 방식으로 표적화하는 작용제의 치료 잠재력이 좁아질 수 있다.

세포성 메틸트랜스퍼라제 활성은 소형 분자 대사물에 의한 조절성 제어를 받는다. 이전에, 메틸트랜스퍼라제는 기질 SAM과 생성물 SAH의 상대적인 균형에 의해 조절된다는 것이 정립되었다 (Vance Cui Biochim Biophys Acta 1997). 메틸트랜스퍼라제 반응을 시행하기 위한 세포성 균형의 측정치로서 세포성 '메틸화 잠재력'을 계산하기 위하여 SAM/SAH 비를 사용하였다 (Williams & Schalinske J Nutrition 2006). PRMT5가 MTA에 의해 억제될 수 있다는 본 발명자들의 관찰 내용은 SAM/MTA 비에 의해 조절될 수 있는 메틸트랜스퍼라제의 생화학적으로 별개의 계열의 모범 구성원으로서 PRMT5와 관련이 있다. 이러한 새로운 조절 방식은 MTA 수준이 현저하게 축적되는 MTAP-널 암 세포에서 매우 명확하게 드러났다. 정상 조직 전반에 걸친 MTA 수준에 관해서는 제한된 정보만이 존재하고 (Stevens & Oefner, J chromatography 2010), 더 넓은 MTA 스크리닝 결과, MTA 축적이 PRMT5의 억제를 초래하는 다른 설정이 밝혀질 수도 있다. 본 발명자들은 또한, PRMT5가 SAM에 대한 매우 약한 결합 친화도를 갖고 있다는 것을 인지한다. 이는 메틸트랜스퍼라제 계열 중에서 비정상적이며, 대부분의 포유류 메틸트랜스퍼라제가 SAM의 생리학적 농도보다 10배 내지 100배 아래의 SAM Km 값을 갖고 있기 때문이다 (Richon & Copeland Chem Biol Drug Design 2011). 이러한 생화학적 발견은 PRMT5가 SAM-감수성 메틸트랜스퍼라제로서 유지되는 것을 의미하고, 이러한 감수성은 MTAP-널 세포에서 MAT2A 고갈 시 관찰되는 PRMT5 메틸 마크 상의 감소에 의해 예시된다.

PRMT5는 수많은 증식성 및 생합성 프로세스, 예컨대 세포 주기 유전자의 발현을 제어하는 히스톤 메틸화 (Chung & Sif JBC 2013), EGFR 및 Raf와 같은 성장 인자 시그널링 성분의 메틸화 (Hsu & Hung Nat Cell Bio 2011, Andreu-Perez & Recio, Sci Signaling 2011), 및 리보솜 및 스플라이세오솜 복합체의 성숙화를 위해 필요한 주요 단백질 성분의 메틸화를 조절한다 (Ren & Xu, JBC 2010, and Friesen & Dreyfuss Mol Cell Bio 2001). 따라서 PRMT5 활성은 일정 범위의 증식 촉진성 및 생합성 경로의 협조적 상향 조절을 초래한다. MTAP-결핍성 암에서의 PRMT5의 취약성은 PRMT5의 상류 (MAT2A로) 및 PRMT5의 하류 (RIOK1 및 다른 PRMT5 공동 복합체 구성원으로) 둘 다로 확장된다. 집합적으로, 이들 단백질은 PRMT5의 하류에 있는 다중 생합성 경로에 영양소 가용성 (MAT2A 기질 메티오닌)에 관한 정보를 감지하고 전달하는 대사적-후성적-시그널링 축을 포함한다. 이러한 축은 MTAP-결핍성 암의 표적화 요법에 대한 아주 흥미로운 기회를 제시한다. MTA-선택적 PRMT5 억제제를 고안할 수 있는 잠재력 외에도, 본 발명자들의 작업은 MAT2A, RIOK1, 또는 다른 PRMT5 공동 복합체 구성원의 치료적 표적화가 MTAP-발현성 정상 조직은 보존하면서도 MTAP-널 암에 선택적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증시켜 준다. 따라서 이러한 취약성 축은 MTAP/p16/CDKN2A 유전자 자리의 결실을 수반한 인간 암의 ~15%를 해결하기 위한 치료용 표적으로서 추가로 간주할 가치가 있는 수많은 단백질을 포함한다.

AGI -512 및 AGI -673을 이용한 세포주 스크린

AG-512 및 AG-673은 생화학적 검정에서 각각 83 nM 및 143 nM의 IC₅₀을 명확히 보여주는 MAT2A 효소적 활성의 소형 분자 억제제이고, 각각 80 및 490 nM의 IC₅₀으로 세포에서 SAM의 생성을 억제하였다. 이들 화합물을 대상으로 하여, 그에 대한 MTAP 스테이터스 (널 또는 야생형)가 결정된 다양한 조직 기원을 갖는 몇 가지 암 세포주에 대항한 성장 억제에 관하여 스크리닝하였다. 그 결과가 표 1에 제시된다.

표 1

표 1에 제시된 데이터는 세포 배양물 또는 생체내에서 성장된 MTAP 널 종양 세포가 MAT2A 억제제에 의한 억제에 대한 예상치 못한 감수성을 제시한다는 것을 입증한다. 그 데이터는 MTAP 스테이터스가 MAT2A 억제제에 대한 종양의 감수성 수준을 결정한다고 나타낸다. MAT2A 억제제에 대한 종양의 감수성 수준은 종양 세포에 의해 발현된 MTAP의 스테이터스를 결정함으로써 평가될 수 있는 것으로 입증된다. 예를 들어, MTAP 유전자가 존재하지 않거나 (즉, MTAP 널) 또는 발현이 하향 조절되거나 또는 MTAP 단백질 기능이 손상되는 종양 세포는 정상적인 MTAP 유전자 발현과 MTAP 단백질 기능을 갖는 종양 세포보다 MAT2A 억제제에 대한 더 높은 감수성과 상관이 있다. 따라서, 이들 관찰 내용은 종양 성장에 대한 MAT2A 억제제의 효과를 예측하기 위한 가치있는 새로운 진단 방법의 기준을 형성할 수 있고, 종양 전문의에게 환자에게 가장 적절한 치료법을 선택하는데 도움이 되는 추가적인 도구를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능 또는 비기능을 특징으로 하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 MTAP의 부재, 즉 MTAP 널인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 MTAP 유전자의 발현이, 예를 들어, 이러한 암에서의 MTA의 수준이 PRMT5 메틸화 활성을 억제하기에 충분한 정도로 감소되는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 MTAP 단백질이, 예를 들어, 이러한 암에서의 MTA의 수준이 정상적인 PRMT5 메틸화 활성을 억제하는 정도로 상승되는 정도로 그 기능이 감소되거나 또는 비기능인 것을 특징으로 한다. PRMT5 억제제는 WO/2014/145214, WO/2014/100716, WO/2014/100730, WO/2014/100695, WO/2014/100734 및 WO/2011/079236에 기재된 것을 제한 없이 포함한다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MTAP 널 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 전술된 방법은, 예를 들어, 환자로부터 채취한 암의 샘플로부터, 암에서의 MTAP 유전자의 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다.

포유류에서의 "암"은 암의 전형적인 특징, 예컨대 비제어된 증식, 불멸성, 전이 가능성, 신속한 성장 및 증식 속도, 및 특정의 특징적인 형태학적 특색을 보유하고 있는 세포의 존재를 지칭한다. 용어 암 및 종양은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 종종, 암 세포는 고형 종양의 형태일 것이지만, 이러한 세포는 동물 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 또는 독립적인 세포, 예컨대 백혈병성 세포로서 혈류 내로 순환할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 환자에서 종양의 성장, 종양 전이, 또는 다른 암-유발 또는 신생물성 세포를, 부분적으로 또는 완전히, 반전, 완화, 진행 억제, 또는 방지하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는, 달리 나타내지 않는 한, 치료하는 작용을 지칭한다. "암을 치료하는 방법"은 동물에서 암 세포의 수를 줄이거나 제거하도록, 또는 암의 증상을 완화하도록 디자인된 작용의 절차 또는 과정을 지칭한다.

용어 "유효량" 또는 "유효한 양"은 추구하는 조직, 계 또는 동물 예를 들어 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 MAT2A 억제제 화합물 또는 또 다른 약물과의 조합물의 양을 의미한다. 한 실시양태에서, 반응은 종양 부피 또는 시간 경과에 따른 종양 부피의 증가율의 억제, 예를 들어, 정적 부피 또는 감소된 부피이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 암 세포의 수를 감소시키거나 또는 암 세포의 수의 증가율을 감소시키는 MAT2A 억제제의 양이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 암 세포의 적어도 일부의 분화, 예를 들어, 혈액 종양에서 미분화된 모세포의 기능적 호중구로의 전환을 야기하기에 충분한 MAT2A 억제제의 양이다. 치료 유효량은 암 세포가 전적으로 제거되거나, 또는 세포의 수가 0으로 또는 검출불가능하도록 감소되거나, 또는 암의 증상이 완전히 완화되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다.

종양 또는 종양 세포에서의 MTAP 유전자의 발현 수준 및 존재 또는 부재 및 MTAP 단백질의 기능은 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 종양 세포에서 MTAP 스테이터스를 결정하는 방법이 미국 특허 번호 5,942,393에 기재되어 있다. 문헌 [Norbori et al. ((1991) Cancer Res. 51:3193-3197); and (1993) Cancer Res. 53:1098-1101]에는 면역블롯 분석에서 종양 세포주 또는 원발성 종양 표본으로부터 단리된 MTAP 단백질을 검출하기 위해 소의 MTAP에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하는 것이 기재되어 있다. 문헌 [Garcia-Castellano et al. (2002, 상기 참조)]에는 OCT 동결된 블록 내에 매립된 골육종 종양 샘플을 스크리닝하기 위해 항인간 MTAP 치킨 항체를 사용하는 것이 기재되어 있다. MTAP 단백질 기능은 임의의 기능 상실 돌연변이를 확인하기 위해 MTAP 단백질을 스크리닝하거나 또는 샘플로부터 단백질을 달리 단리하고, MTA를 메티오닌 및/또는 아데닌으로 직접적 또는 간접적으로 전환시킬 수 있는 그의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에는, 암 세포를 유효량의 MAT2A 억제제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 암 세포는 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능을 특징으로 하는 것인, 상기 암 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 방법을 제공하한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양의 샘플에서 MTAP 유전자 발현의 감소된 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 결정하고; 환자에게 치료상 허용되는 양의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기 종양을 진단하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포에서 MTAP 유전자 발현의 수준, MTAP 유전자의 존재 또는 부재 또는 존재하는 MTAP 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 세포와 비교하여 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포를 특징규명하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에는, 종양 세포에서 MTAP의 스테이터스를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 상기 종양 세포를 MAT2A 억제제와 접촉시킴으로써 억제될 수 있는지 여부를 결정하는 방법이 제공된다.

표 1에서의 세포주의 추가의 게놈 분석 결과, KRAS 돌연변이가 존재하는 경우에 49개의 MTAP 야생형 세포주 중에서 24개 (49%)가 감수성인 것과 비교해서, KRAS 돌연변이를 또한 포함하고 있는 16개의 MTAP 널 세포주 중에서 14개 (88%)가 AGI-512 및 AGI-673을 이용한 MAT2A 억제에 대해 감수성인 것으로 밝혀졌다 (p.008). 더욱이, MTAP 널 스테이터스를 수반한 공동 돌연변이 p53 돌연변이의 존재가 p53 돌연변이의 부재와 비교해서 MAT2A 억제제에 대한 개선된 감수성과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 표 2를 참조한다.

표 2

* N-말단 단편 1-195

따라서, 본 발명의 방법은 암 또는 암 세포에서의 돌연변이체 KRAS 또는 p53 의 존재를 결정하는 것을 추가로 제공하며, 여기서 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재는 이러한 암 또는 암 세포가 MAT2A 억제제를 이용한 치료에 대해 감수성이라는 것을 나타낸다. 돌연변이체 KRAS, 또는 KRAS 돌연변이란, 그의 정상적인 기능을 변경시키는 활성화 돌연변이를 혼입하고 있는 KRAS 단백질, 및 그러한 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 돌연변이체 KRAS 단백질은 위치 12 또는 13에서 단일 아미노산 치환을 포함하고 있을 수 있다. 특정한 실시양태에서, KRAS 돌연변이체는 G12X 또는 G13X 치환을 포함하고 있다. 특정한 실시양태에서, 이러한 치환은 G12V, G12R, G12C 또는 G13D이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 치환은 G13D이다. "돌연변이체 p53" 또는 "p53 돌연변이"란 그의 종양 억제인자 기능을 억제 또는 없애는 돌연변이를 포함하고 있는 p53 단백질 (또는 이러한 단백질을 코딩하는 유전자)을 의미한다. 본 발명에 적용가능한 p53 돌연변이의 예가 표 2에 제시된다.

따라서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 암은 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능을 특징으로 하고, 돌연변이체 KRAS 또는 돌연변이체 p53의 존재를 추가로 특징으로 하는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 종양 세포에서 MTAP의 스테이터스 및 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 KRAS 또는 p53 돌연변이 이외에도, MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 상기 종양 세포를 MAT2A 억제제와 접촉시킴으로써 억제될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포에서 MTAP 유전자 발현의 수준, MTAP 유전자의 존재 또는 부재 또는 존재하는 MTAP 단백질의 수준을 측정하고, KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 세포와 비교하여 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능, 및 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재는 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포를 특징규명하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양의 샘플에서, MTAP 유전자의 감소된 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 KRAS 또는 p53 돌연변이와 조합하여 결정하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 유전자의 감소된 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소, 및 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재는 상기 종양이 MAT2A 억제제에 대해 반응성인 것을 나타내는 것인, MAT2A 억제에 대한 상기 종양의 반응성을 결정하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 샘플에서 MTAP 유전자의 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소, 및 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재를 측정하기 위한 시약을 포함하며, 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트를 제공한다.

본원에 기재된 방법에서, 종양 세포는 전형적으로, 암, 전암 병태, 또는 또 다른 형태의 비정상적인 세포 성장이 있는 것으로 진단되었고, 그 치료를 필요로 하는 환자로부터 유래될 것이다. 암은 폐암 (예를 들어 비소세포 폐암 (NSCLC)), 췌장암, 두경부암, 위암, 유방암, 결장암, 난소암, 또는 아래에 기재된 각종 다른 암 중 임의의 것일 수 있다.

본 발명의 방법에서, MTAP 발현 수준 및 MTAP 단백질 기능은 참조 세포, 예를 들어 비-암성 세포에서의 것과 비교하여 평가될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 종양 세포에 의해 발현된 MTAP의 수준은 유전자의 발현 수준을 결정하는 것으로 관련 기술분야에 알려진 표준 생물학적 검정 절차 중 임의의 것을 사용함으로써 평가될 수 있으며, 이러한 절차는, 예를 들어, 아래에 더 상세히 기재되는 바와 같은, ELISA, RIA, 면역침전, 면역블롯팅, 면역형광 현미경, RT-PCR, 계내 혼성화, cDNA 마이크로어레이 등을 포함한다. 본 발명의 방법에서, MTAP의 발현 수준은 생검을 검정함으로써 평가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 암 세포는 임의의 조직 유형, 예를 들어, 췌장, 폐, 방광, 유방, 식도, 결장, 난소일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 암 세포는 췌장이다. 또 다른 실시양태에서, 암 세포는 폐이다. 또 다른 실시양태에서, 암 세포는 식도이다. 종양 세포는 바람직하게, MTAP 널인 것으로 알려지거나 또는 예상되는 유형이다.

MAT2A 억제제는 MAT2A 기능을 조정하는 임의의 작용제, 예를 들어, MAT2A와 상호 작용하여 MAT2A 활성을 억제 또는 증강시키거나 또는 정상적인 MAT2A 기능에 달리 영향을 미치는 작용제이다. MAT2A 기능은 전사, 단백질 발현, 단백질 국재화, 및 세포성 또는 세포외 활성을 포함한 임의의 수준에서 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 방법에서, MAT2A 억제제는 임의의 MAT2A 억제제일 수 있다. 특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는, 예를 들어, MAT2A 핵산 (즉, DNA 또는 mRNA)과 결합하여 이를 억제함으로써 MAT2A 유전자 발현 또는 생성물 활성을 억제하는 올리고뉴클레오티드이다. 특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, siRNA, 마이크로RNA 또는 앱타머이다. 특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는, 예를 들어, WO2004065542에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드이다. 특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는, 예를 들어, 특허 출원 CN 2015-10476981 또는 문헌 [Wang et al., Zhonghua Shiyan Waike Zazhi, 2009, 26(2):184-186 or Wang et al., Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2008) volume 27]에 기재된 바와 같은 siRNA이다. 특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20150225719 또는 문헌 [Lo et al., PLoS One (2013), 8(9), e75628]에 기재된 바와 같은 마이크로RNA 올리고뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 MAT2A와 결합하는 항체이다.

특정한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 소형 분자 화합물, 예를 들어 AGI-512 또는 AGI-673이다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 문헌 [Zhang et al., ACS Chem Biol, 2013, 8(4):796-803]에 기재된 플루오린화 N,N-디알킬아미노스틸벤이다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 문헌 [Sviripa et al., J Med Chem, 2014, 57:6083-6091]에 기재된 2',6'-디할로스티릴아닐린, 피리딘 또는 피리미딘이다. 특정한 실시양태에서 상기 화합물은 다음 화합물 1a-12b로 이루어진 군으로부터 선택된다:

또 다른 실시양태에서, MAT2A 억제제는 WO2012103457에 개시된 화합물이다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 하기 화학식의 화합물이다:

X-Ar₁-CR^a=CR^b-Ar₂

여기서 R^a 및 R^b는 독립적으로 H, 알킬, 할로, 알콕시, 시아노이고; X는 Ar₁ 상의 적어도 1개의 할로겐, 예를 들어, 플루오린, 염소, 브로민, 또는 아이오딘 치환기를 나타내고; Ar₁ 및 Ar₂ 각각은 할로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴알킬아미노, 디알킬아미노의 N-옥시드, 트리알킬암모늄, 메르캅토, 알킬티오, 알카노일, 니트로, 니트로실, 시아노, 알콕시, 알케닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 술폰아미드, CONR₁₁R₁₂, NR₁₁CO(R₁₃), NR₁₁COO(R₁₃), NR₁₁CONR₁₂R_n (여기서 R₁₁, R₁₂, R₁₃은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 플루오린임)로 추가로 치환될 수 있는, 아릴, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 및 헤테로아릴, 예를 들어, 피리딜, 피롤리딜, 피페리딜, 피리미딜, 인돌릴, 티에닐이며; 단 Ar₂는 아릴 고리 내의 적어도 1개의 질소 원자 또는 아릴 고리 상의 적어도 1개의 질소 치환기, 예를 들어, Ar₂ 상의 NR^cR^dZ 치환기를 함유하며, 여기서 R^c는 H, 알킬, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴이고, R^d는 알킬 기이고, Z는 비공유 전자 쌍, H, 알킬, 산소이다.

또 다른 실시양태에서, MAT2A 억제제는 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 비오티닐화 유도체이다:

여기서 R^a 및 R^b는 상기 정의된 바와 같고, R₁ 내지 R₁₀은 독립적으로 H, 할로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 디알킬아미노의 N-옥시드, 아릴알킬아미노, 디알킬옥시아미노, 트리알킬암모늄, 메르캅토, 알킬티오, 알카노일, 니트로, 니트로실, 시아노, 알콕시, 알케닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 술폰아미드, CONR₁₁R₁₂, NR₁₁CO(R₁₃), NR₁₁COO(R₁₃), NR₁₁CONR₁₂R₁₃ (여기서 R₁₁, R₁₂, R₁₃은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 플루오린임)이며; 단 R₁ 내지 R₅ 중 적어도 하나는 할로겐, 예를 들어 플루오린 및/또는 염소이고; R₆ 내지 R₁₀ 중 적어도 하나는 질소 함유 치환기, 예를 들어, NR^cR^dZ 치환기이며, 여기서 R^c는 H, 알킬, 예를 들어, 저급 알킬, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴이고, R^d는 알킬 기이고, Z는 비공유 전자 쌍, H, 알킬, 산소이다.

또 다른 실시양태에서, MAT2A 억제제는 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 비오티닐화 유도체이다:

여기서 R₁, R₂, R₃, R₅, R₆, R₇, R₉, R₁₀, R^a, R^b 및 NR^cR^dZ는 상기 정의된 바와 동일하다. 본 개시내용의 한 측면에서, R^a, R^b는 둘 다 H이고, R₁, R₂, R₃, 또는 R₅ 중 하나 이상은 플루오린 또는 염소이고, R^c는 H 또는 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 기이고, R^d는 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 기이다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(3-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(4-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디에틸아닐린; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디페닐아닐린; (E)-1-(4-(2-플루오로스티릴)페닐)-4-메틸피페라진; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디메틸나프탈렌-1-아민; (E)-2-(4-(2-플루오로스티릴)페닐)-1-메틸-1H-이미다졸; (E)-4-(2,3-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,4-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,5-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-2-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-3-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디에틸아닐린; (E)-4-(3,4-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(3,5-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-N,N-디메틸-4-(2,3,6-트리플루오로스티릴)아닐린; (E)-N,N-디메틸-4-(2,4,6-트리플루오로스티릴)아닐린; (E)-4-(2-클로로-6-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디클로로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로펜에틸)-N,N-디메틸아닐린; 및 (E)-2-벤즈아미드-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 대상체에게 치료 유효량의 RIOK1 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 종양은 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능 또는 비기능을 특징으로 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 RIOK1 억제제와 공동 투여된다. 한 실시양태에서, 암은 MTAP의 부재, 즉 MTAP 널인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 MTAP 유전자의 감소된 발현을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재를 추가로 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 유효량의 RIOK1 억제제를 투여하는 것을 포함하는, MTAP 널 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 암은 돌연변이체 KRAS 또는 돌연변이체 p53을 포함하고 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 대상체에게 치료 유효량의 PRMT5 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 종양은 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 기능 또는 비기능을 특징으로 하는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, MAT2A 억제제는 PRMT5 억제제와 공동 투여된다. 한 실시양태에서, 암은 MTAP의 부재, 즉 MTAP 널인 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 MTAP 유전자의 감소된 발현을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 암은 KRAS 또는 p53 돌연변이의 존재를 추가로 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 유효량의 PRMT5 억제제를 투여하는 것을 포함하는, MTAP 널 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 암은 돌연변이체 KRAS 또는 돌연변이체 p53을 포함하고 있다.

환자 샘플을 지칭한 상기 방법 중 임의의 것에서, 이러한 샘플의 한 예는 종양 생검일 수 있다. 종양 세포 MTAP 발현의 평가를 위하여, 종양 세포, 또는 이들 종양 세포에 의해 생성된 단백질 또는 핵산을 함유하는 환자 샘플이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이들 실시양태에서, MTAP의 발현 수준은 종양 세포 샘플, 예를 들어, 환자로부터 수득된 종양 생검, 또는 종양으로부터 유래된 물질 (예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 또는 상기 본원에 기재된 바와 같은 다른 체액 또는 배설물)을 함유하는 다른 환자 샘플에서 MTAP의 양 (예를 들어, 절대 량 또는 농도)을 평가함으로써 평가될 수 있다. 물론 이러한 세포 샘플을 대상으로 하여, 이러한 샘플 중 마커의 양을 평가하기 이전에, 각종의 널리 알려진 수집 후 제조 및 저장 기술 (예를 들어, 핵산 및/또는 단백질 추출, 고정화, 저장, 동결, 한외여과, 농축, 증발, 원심분리 등)을 수행할 수 있다. 마찬가지로, 종양 생검을 대상으로 하여 수집 후 제조 및 저장 기술, 예를 들어, 고정화를 수행할 수도 있다.

또 다른 실시양태에서, MTAP의 발현은 세포로부터의 또는 환자 샘플 중의 mRNA/cDNA (즉, 전사된 폴리뉴클레오티드)를 제조하고, 이러한 mRNA/cDNA를, MTAP 핵산, 또는 그의 단편의 보체인 참조 폴리뉴클레오티드와 혼성화함으로써 평가된다. cDNA는 임의로, 참조 폴리뉴클레오티드와 혼성화하기 이전에 각종 폴리머라제 연쇄 반응 방법 중 임의의 것을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 하나 이상의 바이오마커의 발현은 마찬가지로, MTAP의 발현 수준을 평가하기 위한 정량적 PCR을 사용하여 검출될 수 있다.

정상 (즉, 비-암성) 인간 조직에서의 MTAP의 발현 수준은 각종 방식으로 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 정상적인 발현 수준은 비-암성인 것으로 여겨지는 세포의 특정 부분에서의 바이오마커의 발현 수준을 평가한 다음, 이러한 정상적인 발현 수준을 종양 세포의 일부분에서의 발현 수준과 비교함으로써 평가된다. 대안적으로, 및 특히 추가의 정보가 본원에 기재된 방법의 일상적인 수행의 결과로서 입수가능해짐에 따라, 본 발명의 바이오마커의 정상적인 발현에 대한 집단-평균 값이 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, MTAP의 '정상적인' 발현 수준은 암에 걸리지 않은 환자로부터 수득된 환자 샘플, 환자에서 암의 발병이 의심되기 전에 환자로부터 수득된 환자 샘플, 보관된 환자 샘플 등에서의 발현을 평가함으로써 결정될 수 있다.

생물학적 샘플에서 MTAP 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 예시적인 방법은 시험 대상체로부터 생물학적 샘플 (예를 들어 종양-연관 체액)을 수득하고 상기 생물학적 샘플을 폴리펩티드 또는 핵산 (예를 들어, mRNA, 게놈 DNA, 또는 cDNA)을 검출할 수 있는 화합물 또는 작용제와 접촉시키는 것을 수반한다. 따라서 본 발명의 검출 방법은, 예를 들어, 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 샘플에서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 노던 혼성화 및 계내 혼성화를 포함한다. 바이오마커 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던 혼성화를 포함한다. mRNA의 검출을 위한 생체내 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 노던 혼성화 및 계내 혼성화를 포함한다. 게다가, 바이오마커 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 단백질 또는 그의 단편에 대해 지시된 표지된 항체를 대상체에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.

이러한 진단 및 예후 검정의 일반적 원리는 돌연변이체 MTAP 유전자 및 프로브가 상호작용하고 결합하여, 따라서 반응 혼합물에서 제거 및/또는 검출될 수 있는 복합체를 형성하도록 하기에 적절한 조건 하에 및 충분한 시간 동안 돌연변이체 MTAP 유전자, 및 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 제조하는 것을 수반한다. 이들 검정은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정을 수행하는 하나의 방법은 MTAP 유전자 또는 그의 단편 또는 프로브를 기질로도 지칭되는 고체 상 지지체 상에 앵커링시키고, 반응 종료 시 고체 상에 앵커링된 표적 MTAP 유전자/프로브 복합체를 검출하는 것을 수반할 것이다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, MTAP 유전자의 존재 및/또는 농도에 대해 검정될 대상체로부터의 샘플은 담체 또는 고체 상 지지체 상에 앵커링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로브가 고체 상에 앵커링될 수 있고 대상체로부터의 샘플이 검정의 비앵커링된 구성성분으로서 반응하도록 하는 반대 상황이 가능하다.

검정 구성성분을 고체 상에 앵커링시키는 많은 방법이 확립되어 있다. 이들은 비제한적으로 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 통해 고정화된 돌연변이체 MTAP 유전자 또는 그의 단편 또는 프로브 분자를 포함한다. 이러한 비오티닐화 검정 구성성분은 관련 기술분야에 알려진 기술 (예를 들어, 비오티닐화 키트 (피어스 케미칼스(Pierce Chemicals), 일리노이주 락포드))을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조되고, 스트렙타비딘-코팅된 96웰 플레이트 (피어스 케미칼)의 웰 내에 고정화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 고정화된 검정 구성성분을 갖는 표면은 미리 제조되고 저장될 수 있다. 널리 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암, 및 마그네타이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 언급된 접근법으로 검정을 수행하기 위해, 비-고정화된 구성성분은 제2 구성성분이 앵커링된 고체 상에 첨가된다. 반응이 완료된 후, 비복합체화된 구성성분은, 형성된 임의의 복합체가 고체 상에 고정화된 상태로 유지되도록 하는 조건 하에 (예를 들어, 세척에 의해) 제거될 수 있다. 고체 상에 앵커링된 MTAP 유전자/프로브 복합체의 검출은 본원에 요약된 다수의 방법으로 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 프로브가 비앵커링된 검정 구성성분인 경우에, 이는 본원에 논의되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려된 검출가능한 표지로, 직접적으로 또는 간접적으로, 검정의 검출 및 판독의 목적을 위해 표지될 수 있다. 또한, 예를 들어 형광 공명 에너지 전달 (즉, FRET, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,631,169 (Lakowicz et al.); 미국 특허 번호 4,868,103 (Stavrianopoulos, et al.) 참조)의 기술을 활용함으로써 구성성분 (유전자 또는 프로브)의 추가의 조작 또는 표지화 없이 MTAP 유전자/프로브 복합체 형성을 직접적으로 검출하는 것이 가능하다. 제1 '공여자' 분자 상의 형광단 표지는, 적절한 파장의 입사광으로 여기될 때, 그의 방출된 형광 에너지가 제2 '수용자' 분자 상의 형광 표지에 의해 흡수되어 차례로 흡수된 에너지로 인해 형광을 낼 수 있도록 선택된다. 대안적으로, '공여자' 단백질 분자는 트립토판 잔기의 천연 형광 에너지를 단순히 활용할 수 있다. 표지는 상이한 파장의 광을 방출하여 '수용자' 분자 표지가 '공여자'의 것과는 차별화될 수 있도록 선택된다. 표지 사이의 에너지 전달의 효율은 분자를 분리하는 거리와 관련이 있으므로, 분자 사이의 공간적 관계가 사정될 수 있다. 결합이 분자 사이에 발생하는 상황에서, 검정에서의 '수용자' 분자 표지의 형광 방출은 최대여야만 한다. FRET 결합 사건은 관련 기술분야에 널리 알려진 표준 형광측정 검출 수단을 통해 (예를 들어, 형광측정기를 사용하여) 편리하게 측정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 바이오마커를 인식하는 프로브의 능력의 결정은 검정 구성성분 (프로브 또는 MTAP 유전자)을 표지하지 않으면서 실시간 생체분자 상호작용 분석 (BIA)과 같은 기술을 활용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 및 Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705] 참조). 본원에 사용된 바와 같이, "BIA" 또는 "표면 플라즈몬 공명"은, 상호작용물 중 어떠한 것도 표지하지 않으면서, 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하는 기술이다 (예를 들어, 비아코어(BIAcore)). 결합 표면에서의 질량의 변화 (결합 사건을 나타냄)는 표면 근처에서 광의 굴절률의 변경 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학 현상)을 발생시켜, 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있는 검출가능한 신호를 유발한다.

대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 유사한 진단 및 예후 검정은 액체 상 중 용질로서 MTAP 유전자 및 프로브로 수행될 수 있다. 이러한 검정에서, 복합체화된 바이오마커 및 프로브는 차등 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 표준 기술 중 임의의 것에 의해 비복합체화된 구성성분으로부터 분리된다. 차등 원심분리에서, MTAP 유전자/프로브 복합체는 복합체의 상이한 크기 및 밀도를 기반으로 하는 복합체의 상이한 침강 평형으로 인해, 일련의 원심분리 단계로부터 비복합체화된 검정 구성성분으로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rivas, G., and Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7] 참조). 표준 크로마토그래피 기술은 또한 비복합체화된 것들로부터 복합체화된 분자를 분리하는데 활용될 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 크기를 기반으로, 및 칼럼 포맷에서 적절한 겔 여과 수지의 활용을 통해 분자를 분리하고, 예를 들어, 상대적으로 더 큰 복합체는 상대적으로 더 작은 비복합체화된 구성성분으로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 비복합체화된 구성성분과 비교하여 MTAP 유전자/프로브 복합체의 상대적으로 상이한 전하 특성은, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피 수지의 활용을 통해 비복합체화된 구성성분으로부터 복합체를 구별하는데 이용될 수 있다. 이러한 수지 및 크로미토그래피 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D. S., and Tweed, S. A. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525] 참조). 또한, 겔 전기영동이 미결합된 구성성분으로부터 복합체화된 검정 구성성분을 분리하는데 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999] 참조). 이러한 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는, 예를 들어 크기 또는 전하를 기반으로 하여 분리된다. 전기영동 프로세스 동안 결합 상호작용을 유지하기 위해, 비-변성 겔 매트릭스 물질 및 환원제의 부재 하의 조건이 전형적으로 바람직하다. 특정한 검정 및 그의 구성성분에 대한 적절한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있을 것이다.

특정한 실시양태에서, MTAP mRNA의 수준은 관련 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 계내 및 시험관내 포맷 둘 다에 의해 결정될 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 그의 단리물, 뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포, 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 많은 발현 검출 방법은 단리된 RNA를 사용한다. 시험관내 방법의 경우에, mRNA의 단리에 대해 선택되지 않은 임의의 RNA 단리 기술이 종양 세포로부터의 RNA의 정제에 활용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999] 참조). 추가적으로, 다수의 조직 샘플은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 기술, 예컨대, 예를 들어, 촘크진스키(Chomczynski)의 단일-단계 RNA 단리 프로세스 (1989, 미국 특허 번호 4,843,155)를 사용하여 용이하게 프로세싱될 수 있다. 단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혼성화 또는 증폭 검정에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 하나의 바람직한 진단 방법은 단리된 mRNA를 검출될 유전자에 의해 코딩된 mRNA에 혼성화될 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 수반한다. 핵산 프로브는, 예를 들어, 전장 cDNA, 또는 그의 부분, 예컨대 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 뉴클레오티드 길이이고 엄격한 조건 하에 MTAP를 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단 검정에 사용하기에 적합한 다른 프로브는 본원에 기재되어 있다. mRNA와 프로브의 혼성화는 MTAP 유전자가 발현되고 있다는 것을 나타낸다. 하나의 포맷에서, mRNA는 고체 표면 상에 고정화되고, 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 전개시키고 겔로부터의 mRNA를 니트로셀룰로스와 같은 막으로 옮김으로써 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 포맷에서, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정화되고 mRNA는, 예를 들어, 아피메트릭스(Affymetrix) 유전자 칩 검정에서 프로브(들)와 접촉된다. 통상의 기술자는 MTAP 유전자에 의해 코딩된 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위한 알려진 mRNA 검출 방법을 용이하게 적합화할 수 있다.

샘플에서 MTAP mRNA의 수준을 결정하는 대안적인 방법은, 예를 들어, RT-PCR (미국 특허 번호 4,683,202 (Mullis, 1987)에 제시된 실험적 실시양태), 리가제 연쇄 반응 (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), 자기-지속 서열 복제 (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제 (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제 (미국 특허 번호 5,854,033 (Lizardi et al.)) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭의 프로세스, 이어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 기술을 사용하는 증폭된 분자의 검출을 수반한다. 이들 검출 스킴은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우에 이러한 분자의 검출에 특히 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역 (각각 플러스 및 마이너스 가닥, 또는 그 반대의 경우)에 어닐링하고 사이에 짧은 영역을 함유할 수 있는 핵산 분자의 쌍으로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이이고 약 50 내지 200개 뉴클레오티드 길이의 영역을 플랭킹한다. 적절한 조건 하에 및 적절한 시약을 사용하면, 이러한 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.

계내 방법의 경우에, mRNA는 검출 전에 종양 세포로부터 단리될 필요가 없다. 이러한 방법에서, 세포 또는 조직 샘플은 알려진 조직학적 방법을 사용하여 제조/프로세싱된다. 이어서, 샘플은 지지체, 전형적으로는 유리 슬라이드 상에 고정화되고, 이어서 바이오마커를 코딩하는 mRNA에 혼성화될 수 있는 프로브와 접촉된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, MTAP 단백질이 검출된다. MTAP 단백질을 검출하는데 있어서 바람직한 작용제는 MTAP 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 바람직하게는 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 무손상 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 (예를 들어, Fab 또는 F(ab')₂)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여, 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링시키는 (즉, 물리적으로 연결시키는) 것에 의한 프로브 또는 항체의 직접 표지화, 뿐만 아니라 직접 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지화를 포괄하는 것으로 의도된다. 간접 표지화의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용하고 DNA 프로브를 비오틴으로 단부-표지화하여 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 함으로써 1차 항체를 검출하는 것을 포함한다.

MTAP 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있는 기술을 사용하여 종양 세포로부터 단리될 수 있다. 이용된 단백질 단리 방법은, 예를 들어, 예컨대 문헌 [Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에 기재된 것들일 수 있다. 샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 여부를 결정하는데 다양한 포맷이 이용될 수 있다. 이러한 포맷의 예는 효소 면역검정 (EIA), 방사성 면역검정 (RIA), 웨스턴 블롯 분석, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 종양 세포가 본 발명의 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는데 사용하기 위한 알려진 단백질/항체 검출 방법을 용이하게 적합화할 수 있다. 하나의 포맷에서, 항체 또는 항체 단편 또는 유도체는 발현된 MTAP 단백질을 검출하는 방법 예컨대 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술에 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 일반적으로 항체 또는 MTAP 단백질을 고체 지지체 상에 고정화하는 것이 바람직하다. 적합한 고체 상 지지체 또는 담체는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 널리 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암, 및 마그네타이트를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체 또는 항원에 결합하는 많은 다른 적합한 담체를 인지할 것이고, 본 발명과 함께 사용하기 위해 이러한 지지체를 적합화할 수 있을 것이다. 예를 들어, 종양 세포로부터 단리된 MTAP 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에 전개될 수 있고 니트로셀룰로스와 같은 고체 상 지지체 상에 고정화될 수 있다. 이어서 지지체는 적합한 완충제로 세척하고, 이어서 검출가능하게 표지된 항체로 처리될 수 있다. 이어서 고체 상 지지체는 완충제로 재차 세척하여 미결합된 항체를 제거할 수 있다. 이어서 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양은 통상적인 수단으로 검출될 수 있다.

ELISA 검정의 경우에, 특이적 결합 쌍은 면역 또는 비-면역 유형의 것일 수 있다. 면역 특이적 결합 쌍은 항원-항체 시스템 또는 합텐/항-합텐 시스템에 의해 예시된다. 플루오레세인/항-플루오레세인, 디니트로페닐/항-디니트로페닐, 비오틴/항-비오틴, 펩티드/항-펩티드 등이 언급될 수 있다. 특이적 결합 쌍의 항체 구성원은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 동물을 특이적 결합 쌍의 항원 구성원으로 면역화하는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 항원 구성원, 예를 들어, 합텐이 면역원성이 아니면, 이는 담체 단백질에 공유적으로 커플링되어 이를 면역원성으로 만들 수 있다. 비-면역 결합 쌍은 2개의 구성성분이 서로에 대해 자연 친화도를 공유하지만 항체는 아닌 시스템을 포함한다. 예시적인 비-면역 쌍은 비오틴-스트렙타비딘, 내인성 인자-비타민 B₁₂, 폴산-폴레이트 결합 단백질 등이다.

다양한 방법이 항체를 특이적 결합 쌍의 구성원으로 공유적으로 표지하는데 이용가능하다. 방법은 특이적 결합 쌍의 구성원의 특성, 목적한 연결의 유형, 및 다양한 접합 화학물질에 대한 항체의 내성을 기반으로 하여 선택된다. 비오틴은 상업적으로 입수가능한 활성 유도체를 활용함으로써 항체에 공유적으로 커플링될 수 있다. 이들 중 일부는 단백질 상의 아미노 기에 결합하는 비오틴-N-히드록시숙신이미드; 카르보디이미드 커플링을 통해 탄수화물 모이어티, 알데히드 및 카르복실 기에 결합하는 비오틴 히드라지드; 및 술프히드릴 기에 결합하는 비오틴 말레이미드 및 아이오도아세틸 비오틴이다. 플루오레세인은 플루오레세인 이소티오시아네이트를 사용하여 단백질 아민 기에 커플링될 수 있다. 디니트로페닐 기는 2,4-디니트로벤젠 술페이트 또는 2,4-디니트로플루오로벤젠을 사용하여 단백질 아민 기에 커플링될 수 있다. 디알데히드, 카르보디이미드 커플링, 동종관능성 가교 및 이종이관능성 가교를 포함한 접합의 다른 표준 방법을 이용하여 특이적 결합 쌍의 구성원에 모노클로날 항체를 커플링시킬 수 있다. 카르보디이미드 커플링은 하나의 물질 상의 카르복실 기를 또 다른 물질 상의 아민 기에 커플링시키는 효과적인 방법이다. 카르보디이미드 커플링은 상업적으로 입수가능한 시약 1-에틸-3-(디메틸-아미노프로필)-카르보디이미드 (EDAC)을 사용함으로써 용이하게 된다.

이관능성 이미도에스테르 및 이관능성 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 포함한, 동종이관능성 가교제는 상업적으로 입수가능하고 하나의 물질 상의 아민 기를 또 다른 물질 상의 아민 기에 커플링시키는데 이용된다. 이종이관능성 가교제는 상이한 관능기를 보유하는 시약이다. 가장 흔한 상업적으로 입수가능한 이종이관능성 가교제는 하나의 관능기로서 아민 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 및 제2 관능기로서 술프히드릴 반응성 기를 갖는다. 가장 흔한 술프히드릴 반응성 기는 말레이미드, 피리딜 디술피드 및 활성 할로겐이다. 관능기 중 하나는, 조사 시 다양한 기와 반응하는 광활성 아릴 니트렌일 수 있다.

특이적 결합 쌍의 검출가능하게 표지된 항체 또는 검출가능하게 표지된 구성원은 방사성 동위원소, 효소, 형광원성, 화학발광 또는 전기화학 물질일 수 있는 리포터에 커플링시킴으로써 제조된다. 2종의 통상적으로 사용되는 방사성 동위원소는 ¹²⁵I 및 ³H이다. 표준 방사성 동위원소 표지 절차는 ¹²⁵I의 경우에 클로라민 T, 락토퍼옥시다제 및 볼턴-헌터 방법 및 ³H의 경우에 환원성 메틸화를 포함한다. 용어 "검출가능하게 표지된"은 표지의 고유 효소적 활성에 의해 또는 그 자체로 용이하게 검출될 수 있는 또 다른 구성성분의 표지에 대한 결합에 의해 용이하게 검출될 수 있는 그러한 방식으로 표지된 분자를 지칭한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 파이어플라이 및 레닐라를 포함한 루시페라제, β-락타마제, 우레아제, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 리소자임을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 효소 표지화는 항체를 특이적 결합 쌍의 구성원과 커플링시키기 위해 상기 기재된 바와 같은 디알데히드, 카르보디이미드 커플링, 동종이관능성 가교제 및 이종이관능성 가교제를 사용하여 용이하게 된다.

선택된 표지화 방법은 표지화될 효소 및 물질 상에서 이용가능한 관능기, 접합 조건에 대한 둘 다의 내성에 따른다. 본 발명에 사용된 표지화 방법은 비제한적으로 문헌 [Engvall and Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), Avrameas and Ternynck, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al., J. Immunoassay 4(3):209-327 (1983) 및 Jablonski, Anal. Biochem. 148:199 (1985)]에 기재된 것들을 포함하여 현재 이용된 임의의 통상적인 방법 중 하나일 수 있다. 표지화는 간접 방법 예컨대 스페이서 또는 특이적 결합 쌍의 다른 구성원을 사용함으로써 달성될 수 있다. 그의 예는 스트렙타비딘 및 비오티닐화 효소가 순차적으로 또는 동시에 첨가되어 비표지화된 스트렙타비딘 및 비오니틸화 효소로의 비오티닐화 항체의 검출이다. 따라서, 본 발명에 따르면, 검출에 사용되는 항체는 리포터로 직접적으로 또는 특이적 결합 쌍의 제1 구성원으로 간접적으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 항체가 특이적 결합 쌍의 제1 구성원에 커플링되면, 검출은 특이적 결합 복합체의 항체-제1 구성원을 상기 언급된 바와 같이 표지된 또는 비표지된 결합 쌍의 제2 구성원과 반응시킴으로써 수행된다. 더욱이, 비표지된 검출기 항체는 비표지된 항체를 비표지된 항체에 특이적인 표지된 항체와 반응시킴으로써 검출될 수 있다. 이러한 경우에 상기 사용된 바와 같은 "검출가능하게 표지된"은 비표지된 항체에 특이적인 항체가 결합할 수 있는 에피토프를 함유하는 것을 의미한다. 이러한 항-항체는 상기 논의된 임의의 접근법을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 항-항체는 상기 논의된 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 시스템과 반응함으로써 검출되는 비오틴에 커플링될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서 비오틴이 활용된다. 비오티닐화 항체는 차례로 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 복합체와 반응된다. 오르토페닐렌디아민, 4-클로로-나프톨, 테트라메틸벤지딘 (TMB), ABTS, BTS 또는 ASA를 사용하여 색원체성 검출을 수행할 수 있다.

본 발명을 실시하기 위한 하나의 면역검정 포맷에서, 포획 시약이 통상적인 기술을 사용하여 지지체의 표면 상에 고정화되어 있는 포워드 샌드위치 검정이 사용된다. 검정에 사용되는 적합한 지지체는 합성 중합체 지지체, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 치환된 폴리스티렌, 예를 들어 아민화 또는 카르복실화 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리아미드, 폴리비닐클로라이드, 유리 비드, 아가로스, 또는 니트로셀룰로스를 포함한다.

본 발명의 한 측면에서는, 종양 샘플에서 MTAP 유전자의 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 측정하기 위한 시약을 포함하며, 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트는 대상체가 MAT2A 억제제에 의한 억제에 대해 덜 감수성인 종양을 앓고 있거나 또는 이러한 종양의 발생 위험이 증가되었는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 MTAP 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 작용제; 및 상기 샘플에서 상기 단백질 또는 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단 (예를 들어, 상기 단백질 또는 그의 단편과 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA와 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트를 사용하여 수득된 결과를 해석하는 것에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 항체-기반 키트의 경우에, 키트는, 예를 들어, (1) MTAP 단백질에 결합하는 (예를 들어, 고체 지지체에 부착된) 제1 항체; 및, 임의로, (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합되는 제2, 상이한 항체를 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드-기반 키트의 경우에, 키트는, 예를 들어, (1) MTAP 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) MTAP 핵산을 증폭시키는데 유용한 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 예를 들어, 완충제, 보존제, 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지를 검출하는데 필요한 구성성분 (예를 들어, 효소 또는 기질)을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 시험 샘플에 대해 검정되고 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 대조군 샘플의 시리즈를 함유할 수 있다. 키트의 각각의 구성성분은 개별 용기 내에 동봉될 수 있고 모든 다양한 용기는 키트를 사용하여 수행된 검정의 결과를 해석하는 것에 대한 지침서와 함께 단일 포장물 내에 있을 수 있다.

본 발명은 추가로, 예를 들어, MTAP 유전자의 발현 수준을 결정하기 위하여 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해, MTAP 스테이터스, 즉 MTAP 유전자의 발현이 감소되었는지, MTAP 유전자가 부재하는지, 또는 MTAP 단백질이 부재하는지 또는 그의 기능이 감소되었는지 여부를 평가함으로써 MAT2A 억제제에 대한 환자의 예상되는 반응성을 진단하는 단계; 및 상기 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서는, 개개의 환자에 관한 임의의 추가적인 환경과 조합하여, MTAP 억제제에 대한 환자의 예상되는 반응성의 예측을 고려하여 주치의에 의해 적절한 것으로 판단된 바와 같이, 1종 이상의 추가적인 항암제 또는 치료가 MAT2A 억제제와 동시에 또는 순차적으로 공동 투여될 수 있다.

MAT2A 억제제에 대한 환자의 반응 가능성의 진단 후에 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 상기 환자에게 투여하는 정확한 방식은 담당의의 판단에 따라 좌우될 것임이 의학 분야의 통상의 숙련자에 의해 인지될 것이다. 투여량, 다른 항암제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등을 포함한 투여 방식은 MAT2A 억제제에 대한 환자의 반응 가능성의 진단, 뿐만 아니라 환자의 병태 및 병력에 의해 영향받을 수 있다.

본 발명의 맥락에서, MAT2A 억제제는 예를 들어 하기를 포함한, 세포독성제, 화학요법제 또는 항암제와 조합하여 투여될 수 있다: 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 작용제, 예컨대 시클로포스파미드 (CTX; 예를 들어 시톡산(CYTOXAN)®), 클로람부실 (CHL; 예를 들어 류케란(LEUKERAN)®), 시스플라틴 (CisP; 예를 들어 플라티놀(PLATINOL)®), 부술판 (예를 들어 밀레란(MYLERAN)®), 멜팔란, 카르무스틴 (BCNU), 스트렙토조토신, 트리에틸렌멜라민 (TEM), 미토마이신 C 등; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX), 에토포시드 (VP16; 예를 들어 VEPESID®), 6-메르캅토퓨린 (6MP), 6-티오구아닌 (6TG), 시타라빈 (Ara-C), 5-플루오로우라실 (5-FU), 카페시타빈 (예를 들어 XELODA®), 다카르바진 (DTIC) 등; 항생제, 예컨대 악티노마이신 D, 독소루비신 (DXR; 예를 들어 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®), 다우노루비신 (다우노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 등; 알칼로이드, 예컨대 빈카 알칼로이드 예컨대 빈크리스틴 (VCR), 빈블라스틴 등; 및 다른 항종양제, 예컨대 파클리탁셀 (예를 들어 탁솔(TAXOL)®) 및 파클리탁셀 유도체, 세포증식억제제, 글루코코르티코이드 예컨대 덱사메타손 (DEX; 예를 들어 데카드론(DECADRON)®) 및 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니손, 뉴클레오시드 효소 억제제 예컨대 히드록시우레아, 아미노산 고갈 효소 예컨대 아스파라기나제, 류코보린 및 다른 폴산 유도체, 및 유사한, 다양한 항종양제. 하기 작용제가 또한 추가적인 작용제로서 사용될 수 있다: 아미포스틴 (예를 들어 에티올(ETHYOL)®), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 리포 (예를 들어 독실(DOXIL)®), 겜시타빈 (예를 들어 겜자르(GEMZAR)®), 다우노루비신 리포 (예를 들어 다우녹솜(DAUNOXOME)®), 프로카르바진, 미토마이신, 도세탁셀 (예를 들어 탁소테레(TAXOTERE)®), 알데스류킨, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11 (이리노테칸), 10-히드록시 7-에틸-캄프토테신 (SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 1종 이상의 항호르몬제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항호르몬제"는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 천연 또는 합성 유기 또는 펩티드성 화합물을 포함한다. 항호르몬제는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 스테로이드 수용체 길항제, 항에스트로겐 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 다른 아로마타제 억제제, 42-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY 117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (예를 들어 파레스톤(FARESTON)®); 항안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 당단백질 호르몬 예컨대 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH) 및 LHRH (황체형성 호르몬-방출 호르몬)의 효능제 및/또는 길항제; 졸라덱스(ZOLADEX)® (아스트라제네카(AstraZeneca))로서 상업적으로 입수가능한, LHRH 효능제 고세렐린 아세테이트; LHRH 길항제 D-알라닌아미드 N-아세틸-3-(2-나프탈레닐)-D-알라닐-4-클로로-D-페닐알라닐-3-(3-피리디닐)-D-알라닐-L-세릴-N6-(3-피리디닐카르보닐)-L-리실-N6-(3-피리디닐카르보닐)-D-리실-L-류실-N6-(1-메틸에틸)-L-리실-L-프롤린 (예를 들어 안티드(ANTIDE)®, 아레스-세로노(Ares-Serono)); LHRH 길항제 가니렐릭스 아세테이트; 스테로이드성 항안드로겐 시프로테론 아세테이트 (CPA) 및 메게이스(MEGACE)® (브리스톨-마이어스 온콜로지(Bristol-Myers Oncology))로서 상업적으로 입수가능한, 메게스트롤 아세테이트; 유렉신(EULEXIN)® (쉐링 코포레이션(Schering Corp.))으로서 상업적으로 입수가능한, 비스테로이드성 항안드로겐 플루타미드 (2-메틸-N-[4,20-니트로-3-(트리플루오로메틸) 페닐프로판아미드); 비-스테로이드성 항안드로겐 닐루타미드, (5,5-디메틸-3-[4-니트로-3-(트리플루오로메틸-4'-니트로페닐)-4,4-디메틸-이미다졸리딘-디온); 및 다른 비-허용 수용체에 대한 길항제, 예컨대 RAR, RXR, TR, VDR 등에 대한 길항제.

화학치료 레지멘에서 상기 기재된 세포독성제 및 다른 항암제의 사용은 일반적으로 암 요법 분야에서 널리 특징화되고, 본원에서의 그의 사용은, 일부 조정 하에, 내약성 및 유효성을 모니터링하고 투여 경로 및 투여량을 제어하기 위한 동일한 고려사항에 속한다. 예를 들어, 세포독성제의 실제 투여량은 조직배양 방법을 사용함으로써 결정된 환자의 배양된 세포 반응에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 투여량은 추가적인 다른 작용제의 부재 하에 사용된 양과 비교하여 감소될 것이다. 효과적인 세포독성제의 전형적인 투여량은 제조업체에 의해 권장된 범위 내일 수 있고, 시험관내 반응 또는 동물 모델에서의 반응에 의해 나타낸 경우에, 최대 약 한 자릿수 농도 또는 양만큼 감소될 수 있다. 따라서, 실제 투여량은 의사의 판단, 환자의 병태, 및 1차 배양된 악성 세포 또는 조직배양된 조직 샘플의 시험관내 반응성, 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응을 기반으로 한 치료 방법의 유효성에 따를 것이다.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 1종 이상의 혈관신생 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양 또는 종양 전이를 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 혈관신생억제제는, 예를 들어 하기를 포함한다: VEGFR 억제제, 예컨대 SU-5416 및 SU-6668 (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 수젠 인크.(Sugen Inc.)), 또는 국제 출원 번호 WO 99/24440, WO 99/62890, WO 95/21613, WO 99/61422, WO 98/50356, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755, 및 WO 98/02437, 및 미국 특허 번호 5,883,113, 5,886,020, 5,792,783, 5,834,504 및 6,235,764에 기재된 바와 같은 것; VEGF 억제제 예컨대 IM862 (미국 워싱톤주 커크랜드 소재의 시트란 인크(Cytran Inc.)); 안지오자임, 리보자임(Ribozyme) (콜로라도주 볼더) 및 키론(Chiron) (캘리포니아주 에머리빌)으로부터의 합성 리보자임; 및 VEGF에 대한 항체, 예컨대 베바시주맙 (예를 들어 아바스틴(AVASTIM)™, 제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코), VEGF에 대한 재조합 인간화 항체; 인테그린 수용체 길항제 및 인테그린 길항제, 예컨대 α_vβ₃, α_vβ₅ 및 α_vβ₆ 인테그린, 및 그의 하위유형, 예를 들어 실렌기티드 (EMD 121974), 또는 항-인테그린 항체, 예컨대 예를 들어 α_vβ₃ 특이적 인간화 항체 (예를 들어 비탁신(VITAXIN)®); 예컨대 IFN-알파와 같은 인자 (미국 특허 번호 41530,901, 4,503,035, 및 5,231,176); 안지오스타틴 및 플라스미노겐 단편 (예를 들어 크링글 1-4, 크링글 5, 크링글 1-3 (O'Reilly, M. S. et al. (1994) Cell 79:315-328; Cao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 29461-29467; Cao et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:22924-22928); 엔도스타틴 (O'Reilly, M. S. et al. (1997) Cell 88:277; 및 국제 특허 공개 번호 WO 97/15666); 트롬보스폰딘 (TSP-1; Frazier, (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3:792); 혈소판 인자 4 (PF4); 플라스미노겐 활성화제/우로키나제 억제제; 우로키나제 수용체 길항제; 헤파리나제; 푸마길린 유사체 예컨대 TNP-4701; 수라민 및 수라민 유사체; 혈관신생억제 스테로이드; bFGF 길항제; flk-1 및 flt-1 길항제; 항-혈관신생제 예컨대 MMP-2 (매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제 및 MMP-9 (매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제. 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제의 예는 국제 특허 공개 번호 WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, 및 WO 99/07675, 유럽 특허 공개 번호 818,442, 780,386, 1,004,578, 606,046, 및 931,788; 영국 특허 공개 번호 9912961, 및 미국 특허 번호 5,863,949 및 5,861,510에 기재되어 있다. 바람직한 MMP-2 및 MMP-9 억제제는 MMP-1을 억제하는 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 것이다. 다른 매트릭스-메탈로프로테이나제 (즉 MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, 및 MMP-13)에 비해 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것들이 보다 바람직하다.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 1종 이상의 종양 세포 아폽토시스촉진제 또는 아폽토시스-자극 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 1종 이상의 신호 전달 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 신호 전달 억제제는, 예를 들어, 하기를 포함한다: erbB2 수용체 억제제, 예컨대 유기 분자, 또는 erbB2 수용체에 결합하는 항체, 예를 들어, 트라스투주맙 (예를 들어 헤르셉틴(HERCEPTIN)®); 다른 단백질 티로신-키나제의 억제제, 예를 들어 이마티닙 (예를 들어 글리벡(GLEEVEC)®); ras 억제제; raf 억제제 (예를 들어 BAY 43-9006, 오닉스 파마슈티칼스/바이엘 파마슈티칼스(Onyx Pharmaceuticals/Bayer Pharmaceuticals)); MEK 억제제; mTOR 억제제; 시클린 의존성 키나제 억제제; 단백질 키나제 C 억제제; 및 PDK-1 억제제 (상기 억제제의 여러 예의 설명, 및 암의 치료를 위한 임상 시험에서 그의 용도의 경우에 문헌 [Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313] 참조). ErbB2 수용체 억제제는, 예를 들어 하기를 포함한다: ErbB2 수용체 억제제, 예컨대 GW-282974 (글락소 웰컴 피엘씨(Glaxo Wellcome plc)), 모노클로날 항체 예컨대 AR-209 (미국 텍사스주 더 우드랜드 소재의 아로넥스 파마슈티칼스 인크.(Aronex Pharmaceuticals Inc.)) 및 2B-1 (키론), 및 erbB2 억제제 예컨대 국제 공개 번호 WO 98/02434, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 98/02437, WO 97/13760, 및 WO 95/19970, 및 미국 특허 번호 5,587,458, 5,877,305, 6,465,449 및 6,541,481에 기재된 것들.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 1종 이상의 추가적인 항증식제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 추가적인 항증식제는, 예를 들어 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 6,080,769, 6,194,438, 6,258,824, 6,586,447, 6,071,935, 6,495,564, 6,150,377, 6,596,735 및 6,479,513, 및 국제 특허 번호 WO 01/40217에 개시되고 청구된 화합물을 포함한, 효소 파르네실 단백질 트랜스퍼라제의 억제제 및 수용체 티로신 키나제 PDGFR의 억제제.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 방사선 치료 또는 방사성제약을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양을 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 방사선의 공급원은 치료되는 환자에 대해 외부 또는 내부일 수 있다. 공급원이 환자에 대해 외부일 때, 요법은 외부 빔 방사선 요법 (EBRT)으로 알려져 있다. 방사선의 공급원이 환자에 대해 내부일 때, 치료는 근접요법 (BT)으로 불린다. 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 방사성 원자는 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 아이오딘-123, 아이오딘-131, 및 인듐-111을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 MAT2A 억제제가 항체인 경우에, 항체를 이러한 방사성 동위원소로 표지하는 것이 또한 가능하다. 방사선 요법은 절제불가능한 또는 수술불가능한 종양 및/또는 종양 전이를 제어하는 표준 치료이다. 개선된 결과는 방사선 요법이 화학요법과 조합되었을 때 보여진 바 있다. 방사선 요법은 표적 영역에 고-용량 방사선이 전달되면 종양 및 정상 조직 둘 다에서 재생 세포의 사멸을 유발할 것이라는 원리를 기반으로 한다. 방사선 투여 레지멘은 일반적으로 방사선 흡수된 선량 (Gy), 시간 및 분할조사의 관점에서 정의되고, 종양학자에 의해 신중하게 정의되어야 한다. 환자가 받는 방사선의 양은 다양한 고려사항에 따를 것이지만, 가장 중요한 2개의 고려사항은 신체의 다른 주요한 구조 또는 기관과 관련한 종양의 위치, 및 종양이 퍼진 정도이다. 방사선 요법을 겪는 환자에 대한 전형적 치료 과정은 약 1.8 내지 2.0 Gy, 1주 5일의 단일 일일 분할로 환자에게 투여된 10 내지 80 Gy의 총 선량으로 1 내지 6주 기간에 걸친 치료 스케줄일 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 인간 환자에서의 종양이 본 발명 및 방사선의 조합 치료로 치료될 때 상승작용이 있다. 다시 말해서, 본 발명의 조합물을 포함하는 작용제에 의한 종양 성장의 억제는 방사선, 임의로 추가적인 화학치료제 또는 항암제와 조합될 때 증진된다. 보조 방사선 요법의 파라미터는, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 99/60023에 함유된다.

본 발명은 환자에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제 및 추가로, 동시에 또는 순차적으로, 항종양 면역 반응을 증진시킬 수 있는 1종 이상의 작용제로의 치료를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 종양 또는 종양 전이를 치료하는 상기 방법을 추가로 제공한다. 항종양 면역 반응을 증진시킬 수 있는 작용제는, 예를 들어 하기를 포함한다: CTLA4 (세포독성 림프구 항원 4) 항체 (예를 들어 MDX-CTLA4), 및 CTLA4를 차단할 수 있는 다른 작용제. 본 발명에 사용될 수 있는 특이적 CTLA4 항체는 미국 특허 번호 6,682,736에 기재된 것들을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 바람직하게는 임의의 목적을 위한 MAT2A 억제제로의 치료를 필요로 하는 인간, 보다 바람직하게는 암, 또는 전암성 병태 또는 병변을 치료하기 위한 이러한 치료를 필요로 하는 인간을 지칭한다. 그러나, 용어 "환자"는 또한 MAT2A 억제제로의 치료를 필요로 하는, 특히, 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물 예컨대 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류를 지칭할 수 있다.

암은 바람직하게, MAT2A 억제제의 투여에 의해 부분적으로 또는 완전히 치료가능한 임의의 암이다. 암은, 예를 들어, 폐암, 비소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포성암, 담도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 슈반세포종, 상의세포종, 수모세포종, 수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종, 예컨대 임의의 상기 암의 불응성 버전, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 전암성 병태 또는 병변은, 예를 들어, 구강 백색판증, 광선 각광증 (일광 각광증), 결장 또는 직장의 전암성 폴립, 위 상피 이형성증, 선종성 이형성증, 유전성 비폴립증 결장암 증후군 (HNPCC), 바렛 식도, 방광 이형성증, 및 전암성 자궁경부 병태로 이루어진 군을 포함한다.

MAT2A 억제제는 전형적으로, 관련 기술분야에 알려진 바와 같이, 환자가 치료되는 암의 가장 효과적인 치료 (효능 및 안전성 관점 둘 다로부터)를 제공하는 투여 레지멘으로 환자에게 투여될 것이다. 본 발명의 치료 방법을 수행하는데 있어서, MAT2A 억제제는 치료할 암의 유형, 사용할 MAT2A 억제제의 유형 (예를 들어, 소형 분자, 항체, RNAi, 리보자임 또는 안티센스 구축물), 및 예를 들어 공개된 임상 연구의 결과를 기반으로 한 처방 의사의 의학적 판단에 따라 관련 기술분야에 알려진 임의의 효과적인 방식으로, 예컨대 경구, 국소, 정맥내, 복막내, 근육내, 관절내, 피하, 비강내, 안내, 질, 직장, 또는 피내 경로에 의해 투여될 수 있다.

투여되는 MAT2A 키나제 억제제의 양 및 투여 시기는 치료할 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중 등) 및 병태, 치료할 질환 또는 병태의 중증도, 및 투여 경로에 따를 것이다. 예를 들어, 소형 분자 MAT2A 억제제는 환자에게 1일에 또는 1주에 0.001 내지 100 mg/kg 체중 범위의 용량으로 단일 또는 분할 용량으로, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 항체-기반 MAT2A 억제제, 또는 안티센스, RNAi 또는 리보자임 구축물은 환자에게 1일에 또는 1주에 0.1 내지 100 mg/kg 체중 범위의 용량으로 단일 또는 분할 용량으로, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 상기 범위의 하한치 미만인 투여량 수준이 더욱 적절할 수 있고, 다른 경우에는 훨씬 더 많은 용량이 어떠한 해로운 부작용도 유발하지 않으면서 사용될 수 있으며, 단 이러한 더 많은 용량은 먼저 하루에 걸친 투여를 위해 수회의 적은 용량으로 분할된다.

MAT2A 억제제는 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 하드 캔디, 분말, 스프레이, 크림, 살브, 좌제, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 제약상 허용되는 불활성 담체와 함께 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태의 투여는 단일 또는 다중 용량으로 수행될 수 있다. 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비-독성 유기 용매 등을 포함한다. 경구 제약 조성물은 적합하게 감미첨가되고/거나 향미첨가될 수 있다. 억제제는 스프레이, 크림, 살브, 좌제, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고 등의 형태로 다양한 제약상 허용되는 불활성 담체와 함께 조합될 수 있다. 이러한 투여 형태의 투여는 단일 또는 다중 용량으로 수행될 수 있다. 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질, 및 다양한 비-독성 유기 용매 등을 포함한다. 단백질성 억제제를 포함하는 모든 제제는 억제제의 생물학적 활성의 변성 및/또는 분해 및 손실을 방지하도록 선택되어야 한다.

MAT2A 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18^th edition (1990)]에 기재되어 있다. 억제제의 경구 투여를 위해, 활성제 중 하나 또는 둘 다를 함유하는 정제는 임의의 다양한 부형제 예컨대, 예를 들어, 미세결정질 셀룰로스, 나트륨 시트레이트, 칼슘 카르보네이트, 디칼슘 포스페이트 및 글리신과 함께, 다양한 붕해제 예컨대 전분 (및 바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 알긴산 및 특정 복합 실리케이트와 함께, 과립화 결합제 예컨대 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 함께 조합된다. 추가적으로, 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트 및 활석은 종종 정제화 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 젤라틴 캡슐에 충전제로 이용될 수 있고; 이와 관련하여 바람직한 물질은 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여를 위해 목적되는 경우에, 억제제는 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료, 및 목적되는 경우에, 유화제 및/또는 현탁화제와, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 그의 다양한 유사 조합으로서 이러한 희석제와 함께 조합될 수 있다. 활성제 중 하나 또는 둘 다의 비경구 투여를 위해, 참깨 또는 땅콩 오일 중 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액 뿐만 아니라 활성제 또는 그의 상응하는 수용성 염을 포함하는 멸균 수성 용액이 이용될 수 있다. 이러한 멸균 수성 용액은 바람직하게는 적합하게 완충되고, 또한 바람직하게는 예를 들어 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만든다. 이들 특정한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사 목적에 적합하다. 유성 용액은 관절내, 근육내 및 피하 주사 목적에 적합하다. 멸균 조건 하의 모든 이들 용액의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 표준 제약 기술에 의해 용이하게 달성된다. 단백질성 억제제의 투여를 위해 선택된 임의의 비경구 제제는 억제제의 생물학적 활성의 변성 및 손실을 방지하도록 선택되어야 한다.

추가적으로, 표준 제약 수행에 따라, 예를 들어, 크림, 로션, 젤리, 겔, 페이스트, 연고, 살브 등에 의해, 활성제 중 하나 또는 둘 다를 국소적으로 투여하는 것이 가능하다. 예를 들어, 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 농도로 MAT2A 억제제를 포함하는 국소 제제가 제조될 수 있다.

수의학적 목적을 위해, 활성제는 임의의 형태를 사용하여 및 상기 기재된 임의의 경로에 의해 동물에게 별개로 또는 함께 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 억제제는 캡슐, 볼루스, 정제, 액체 드렌치의 형태로, 주사에 의해 또는 이식물로서 투여된다. 대안으로서, 억제제는 동물 사료와 함께 투여될 수 있고, 이러한 목적을 위해 농축 사료 첨가제 또는 프리믹스가 정상 동물 사료를 위해 제조될 수 있다. 이러한 제제는 표준 수의학 수행에 따라 종래의 방식으로 제조된다.

모노클로날 항체 및 항체 단편의 생산 및 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 및 J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London]에 기재되어 있다. 인간화 항-MAT2A 항체 및 항체 단편은 또한 알려진 기술 예컨대 문헌 [Vaughn, T. J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539] 및 그에 인용된 참고문헌에 기재된 것들에 따라 제조될 수 있고, 이러한 항체 또는 그의 단편은 또한 본 발명을 수행하는데 유용하다.

본 발명에 사용하기 위한 MAT2A 억제제는 대안적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 구축물을 기반으로 할 수 있다. 안티센스 RNA 분자 및 안티센스 DNA 분자를 포함한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 MAT2A mRNA에 결합하여 단백질 번역을 방지하거나 또는 mRNA 분해를 증가킴으로써 MAT2A mRNA의 번역을 직접적으로 차단하도록 작용할 것이며, 이에 따라 세포에서 MAT2A 단백질 수준, 및 이에 따른 활성을 감소시킨다. 예를 들어, 적어도 약 15개 염기를 가지며 MAT2A를 코딩하는 mRNA 전사체 서열의 고유한 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 전형적인 포스포디에스테르 기술에 의해 합성될 수 있고, 예를 들어 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 서열이 알려져 있는 유전자의 유전자 발현을 특이적으로 억제하기 위한 안티센스 기술을 사용하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,566,135; 6,566,131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; 및 5,981,732 참조).

소형 억제성 RNA (siRNA)는 또한 본 발명에 사용하기 위한 억제제로서 기능할 수 있다. MAT2A 유전자 발현은 종양, 대상체 또는 세포를 소형 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 소형 이중 가닥 RNA의 생산을 야기하는 벡터 또는 구축물과 접촉시킴으로써 감소될 수 있으며, 이에 따라 MAT2A의 발현이 특이적으로 억제된다 (즉, RNA 간섭 또는 RNAi). 서열이 알려져 있는 유전자에 대한 적절한 dsRNA 또는 dsRNA-코딩 벡터를 선택하는 방법은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Tuschi, T., et al. (1999) Genes Dev. 13(24):3191-3197; Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Hannon, G.J. (2002) Nature 418:244-251; McManus, M.T. and Sharp, P. A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747; Bremmelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296:550-553]; 미국 특허 번호 6,573,099 및 6,506,559; 및 국제 특허 공개 번호 WO 01/36646, WO 99/32619, 및 WO 01/68836 참조).

리보자임은 또한 본 발명에 사용하기 위한 억제제로서 기능할 수 있다. 리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임 작용의 메카니즘은 상보적 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열 특이적 혼성화에 이어서 핵산내부분해 절단을 수반한다. 그에 의해, mRNA 서열의 핵산내절단을 특이적으로 및 효율적으로 촉매화하는 조작된 헤어핀 또는 해머헤드 모티프 리보자임 분자가 본 발명의 범주 내에서 유용하다. 임의의 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 초기에, 전형적으로 하기 서열, GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대한 표적 분자를 스캐닝함으로써 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 표적 유전자의 영역에 상응하는 약 15 내지 20개 리보뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열은 올리고뉴클레오티드 서열을 부적합하도록 만들 수 있는 예측된 구조적 특색, 예컨대 2차 구조에 대해 평가될 수 있다. 후보 표적의 적합성은 또한, 예를 들어, 리보뉴클레아제 보호 검정을 사용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 그의 접근가능성을 시험함으로써 평가될 수 있다.

억제제로서 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임은 둘 다 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 화학적 합성을 위한 기술 예컨대, 예를 들어, 고체 상 포스포르아마다이트 화학적 합성에 의한 것을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 RNA 분자는 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터 예컨대 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터를 포함하고 있는 매우 다양한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 변형은 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수 있다. 가능한 변형은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 플랭킹 서열의 분자의 5' 및/또는 3' 단부에의 첨가, 또는 올리고뉴클레오티드 백본 내의 포스포디에스테라제 연결보다 오히려 포스포로티오에이트 또는 2'-O-메틸의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되는 비-독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 지칭한다. 본 발명의 화합물이 산성일 때, 그의 상응하는 염은 편리하게는 무기 염기 및 유기 염기를 포함한 제약상 허용되는 비-독성 염기로부터 제조될 수 있다. 이러한 무기 염기로부터 유래된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리 (제2구리 및 제1구리), 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망가니즈 (제2망가니즈 및 제1망가니즈), 칼륨, 나트륨, 아연 등의 염을 포함한다. 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨 염이 특히 바람직하다. 제약상 허용되는 유기 비-독성 염기로부터 유래된 염은 1급, 2급, 및 3급 아민, 뿐만 아니라 시클릭 아민 및 치환된 아민 예컨대 천연 발생 및 합성 치환된 아민의 염을 포함한다. 염을 형성할 수 있는 다른 제약상 허용되는 유기 비-독성 염기는 이온 교환 수지 예컨대, 예를 들어, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N',N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민 및 트로메타민 등을 포함한다.

본 발명에 사용된 화합물이 염기성일 때, 그의 상응하는 염은 편리하게는 무기 및 유기 산을 포함한 제약상 허용되는 비-독성 산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 산은, 예를 들어, 아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브로민화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 질산, 파모산, 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등을 포함한다. 시트르산, 브로민화수소산, 염산, 말레산, 인산, 황산 및 타르타르산이 특히 바람직하다.

활성 성분으로서 MAT2A 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 포함하는 본 발명에 사용된 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료 성분 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 다른 치료제는 상기에 열거된 바와 같은, 세포독성제, 화학요법제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 증진시키는 작용제를 포함할 수 있다. 조성물은, 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로가 특정한 숙주, 및 활성 성분이 투여되는 병태의 특성 및 중증도에 따를 것이지만, 경구, 직장, 국소, 및 비경구 (피하, 근육내, 및 정맥내 포함) 투여에 적합한 조성물을 포함한다. 제약 조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 제시되고 제약 분야에 널리 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

실제로, 본 발명의 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)은 통상적인 제약 배합 기술에 따라 제약 담체와 친밀하게 혼합한 활성 성분으로서 조합될 수 있다. 담체는 투여, 예를 들어 경구 또는 비경구 (정맥내 포함) 투여에 목적되는 제제의 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 경구 투여에 적합한 이산 단위 예컨대 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카쉐 또는 정제로서 제시될 수 있다. 추가로, 조성물은 분말, 과립, 용액, 수성 액체 중의 현탁액, 비-수성 액체, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로 제시될 수 있다. 상기 제시된 통상의 투여 형태 이외에, MAT2A 억제제 화합물 (그의 각각의 구성성분의 제약상 허용되는 염 포함)는 또한 제어 방출 수단 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 조합 조성물은 임의의 제약 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 활성 성분을 1종 이상의 필수 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 혼합함으로써 제조된다. 이어서, 생성물은 목적되는 외형으로 편리하게 성형될 수 있다.

본 발명에 사용된 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)은 또한 1종 이상의 다른 치료 활성 화합물과 조합하여 제약 조성물에 포함될 수 있다. 다른 치료 활성 화합물은 상기 열거된 바와 같은, 세포독성제, 화학요법제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 증진시키는 작용제를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 MAT2A 억제제 화합물을 항암제와 조합하여 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항암제는 알킬화 약물, 항대사물, 미세관 억제제, 포도필로톡신, 항생제, 니트로소우레아, 호르몬 요법, 키나제 억제제, 종양 세포 아폽토시스의 활성화제, 및 항혈관신생제로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다. 이용되는 제약 담체는, 예를 들어, 고체, 액체, 또는 기체일 수 있다. 고체 담체의 예는 락토스, 백토, 수크로스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 및 스테아르산을 포함한다. 액체 담체의 예는 당 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 및 물이다. 기체 담체의 예는 이산화탄소 및 질소를 포함한다. 경구 투여 형태를 위한 조성물의 제조에 있어서, 임의의 편리한 제약 매질이 이용될 수 있다. 예를 들어, 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제 등을 사용하여 경구 액체 제제, 예컨대 현탁액, 엘릭시르 및 용액을 형성할 수 있지만; 담체, 예컨대 전분, 당, 미세결정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용하여 경구 고체 제제 예컨대 분말, 캡슐 및 정제를 형성할 수 있다. 투여의 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐은 고체 제약 담체가 이용되는 바람직한 경구 투여 단위이다. 임의로, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 본 발명에 사용된 조성물을 함유하는 정제는, 임의로 1종 이상의 부속 성분 또는 아주반트와의 압착 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된 자유-유동 형태 예컨대 분말 또는 과립 중 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말화 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 각각의 정제는 바람직하게는 약 0.05mg 내지 약 5g의 활성 성분을 함유하고, 각각의 카쉐 또는 캡슐은 바람직하게는 약 0.05mg 내지 약 5g의 활성 성분을 함유한다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하기 위해 의도된 제제는 전체 조성물의 약 5 내지 약 95 퍼센트에서 달라질 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 물질과 배합된 약 0.5mg 내지 약 5g의 활성제를 함유할 수 있다. 단위 투여 형태는 일반적으로 약 1mg 내지 약 2g의 활성 성분, 전형적으로 25mg, 50mg, 100mg, 200mg, 300mg, 400mg, 500mg, 600mg, 800mg, 또는 1000mg을 함유할 것이다.

비경구 투여에 적합한 본 발명에 사용된 제약 조성물은 물 중 활성 화합물의 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 계면활성제, 예컨대, 예를 들어, 히드록시프로필셀룰로스가 포함될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 오일 중 그의 혼합물에서 제조될 수 있다. 추가로, 미생물의 유해한 성장을 방지하기 위한 보존제가 포함될 수 있다. 주사용으로 적합한 본 발명에 사용된 제약 조성물은 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 게다가, 조성물은 이러한 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 형태일 수 있다. 모든 경우에, 최종 주사가능한 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사능을 위해 효과적으로 유동성이어야 한다. 제약 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에 안정하여야 하며; 따라서, 바람직하게는 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일, 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 본 발명을 위한 제약 조성물은 국소 사용, 예컨대, 예를 들어, 에어로졸, 크림, 연고, 로션, 살포성 분말 등에 적합한 형태일 수 있다. 추가로, 조성물은 경피 장치에 사용하기에 적합한 형태일 수 있다. 이들 제제는 통상적인 프로세싱 방법을 통해, MAT2A 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 활용하여 제조될 수 있다. 예로서, 크림 또는 연고는 친수성 물질 및 물을, 약 5 중량% 내지 약 10 중량%의 화합물과 함께 혼합하여 목적되는 점조도를 갖는 크림 또는 연고를 생성함으로써 제조된다.

본 발명을 위한 제약 조성물은 담체가 고체인 직장 투여에 적합한 형태일 수 있다. 혼합물이 단위 용량 좌제를 형성하는 것이 바람직하다. 적합한 담체는 코코아 버터 및 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 다른 물질을 포함한다. 좌제는 편리하게, 조성물을 연화된 또는 용융된 담체(들)와 혼합한 후에 금형에서 냉각 및 성형시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 언급된 담체 성분 이외에, 상기 기재된 제약 제제는, 적절한 경우에, 1종 이상의 추가적인 담체 성분, 예컨대 희석제, 완충제, 향미제, 결합제, 표면-활성제, 증점제, 윤활제, 보존제 (항산화제 포함) 등을 포함할 수 있다. 게다가, 다른 아주반트는 제제가 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 포함될 수 있다. MAT2A 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 함유하는 조성물은 또한 분말 또는 액체 농축물 형태로 제조될 수 있다.

본 발명을 실시하는데 사용된 화합물에 대한 투여량 수준은 대략적으로, 이들 화합물에 대하여 본원에 기재된 바와 같이, 또는 관련 기술분야에 기재된 바와 같을 수 있을 것이다. 그러나, 임의의 특별한 환자에 대한 구체적인 용량 수준은 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 약물 조합 및 요법이 진행중인 특별한 질환의 중증도를 포함한 각종 요인에 좌우될 것으로 이해된다.

관련 기술분야에 알려진 많은 대체 실험 방법이, 예를 들어 본 발명과 관련한 기술 분야에서 이용가능한 많은 우수한 매뉴얼과 텍스트북에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, edited by Harlow, E. and Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (e.g. ISBN 0-87969-544-7); Roe B.A. et al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons.(e.g. ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins", 2000, ed. J.Abelson, M.Simon, S.Emr, J.Thorner. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3^rd Edition, by Joseph Sambrook and Peter MacCallum, (the former Maniatis Cloning manual) (e.g. ISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et al. John Wiley & Sons (e.g. ISBN 0-471-50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (e.g. ISBN 0-471-11184-8); and Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc. (e.g. ISBN 0-12-213585-7)]을 사용한다), 또는 분자 생물학에서 실험 방법을 설명하는데 노력한 많은 대학 및 상업용 웹사이트에 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시에서 본원에 구체적으로 기재된 것을 성공적으로 대체할 수 있다.

참고문헌

Angermayr, M., Roidl, A., and Bandlow, W. (2002). Yeast Rio1p is the founding member of a novel subfamily of protein serine kinases involved in the control of cell cycle progression. Molecular microbiology 44, 309-324.

Antonysamy, S., Bonday, Z., Campbell, R.M., Doyle, B., Druzina, Z., Gheyi, T., Han, B., Jungheim, L.N., Qian, Y., Rauch, C., et al. (2012). Crystal structure of the human PRMT5:MEP50 complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 17960-17965.

Basu, I., Locker, J., Cassera, M.B., Belbin, T.J., Merino, E.F., Dong, X., Hemeon, I., Evans, G.B., Guha, C., and Schramm, V.L. (2011). Growth and metastases of human lung cancer are inhibited in mouse xenografts by a transition state analogue of 5'-methylthioadenosine phosphorylase. The Journal of biological chemistry 286, 4902-4911.

Chan-Penebre, E., Kuplast, K.G., Majer, C.R., Boriack-Sjodin, P.A., Wigle, T.J., Johnston, L.D., Rioux, N., Munchhof, M.J., Jin, L., Jacques, S.L., et al. (2015). A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nature chemical biology 11, 432-437.

Guderian, G., Peter, C., Wiesner, J., Sickmann, A., Schulze-Osthoff, K., Fischer, U., and Grimmler, M. (2011). RioK1, a new interactor of protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), competes with pICln for binding and modulates PRMT5 complex composition and substrate specificity. The Journal of biological chemistry 286, 1976-1986.

Lacroix, M., El Messaoudi, S., Rodier, G., Le Cam, A., Sardet, C., and Fabbrizio, E. (2008). The histone-binding protein COPR5 is required for nuclear functions of the protein arginine methyltransferase PRMT5. EMBO Rep 9, 452-458.

Longshaw, A.I., Adanitsch, F., Gutierrez, J.A., Evans, G.B., Tyler, P.C., and Schramm, V.L. (2010). Design and synthesis of potent "sulfur-free" transition state analogue inhibitors of 5'-methylthioadenosine nucleosidase and 5'-methylthioadenosine phosphorylase. J Med Chem 53, 6730-6746.

Meister, G., Eggert, C., Buhler, D., Brahms, H., Kambach, C., and Fischer, U. (2001). Methylation of Sm proteins by a complex containing PRMT5 and the putative U snRNP assembly factor pICln. Current biology : CB 11, 1990-1994.

Pal, S., Vishwanath, S.N., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., and Sif, S. (2004). Human SWI/SNF-associated PRMT5 methylates histone H3 arginine 8 and negatively regulates expression of ST7 and NM23 tumor suppressor genes. Molecular and cellular biology 24, 9630-9645.

Pesiridis, G.S., Diamond, E., and Van Duyne, G.D. (2009). Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. The Journal of biological chemistry 284, 21347-21359.

Pollack, B.P., Kotenko, S.V., He, W., Izotova, L.S., Barnoski, B.L., and Pestka, S. (1999). The human homologue of the yeast proteins Skb1 and Hsl7p interacts with Jak kinases and contains protein methyltransferase activity. The Journal of biological chemistry 274, 31531-31542.

Sun, L., Wang, M., Lv, Z., Yang, N., Liu, Y., Bao, S., Gong, W., and Xu, R.M. (2011). Structural insights into protein arginine symmetric dimethylation by PRMT5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 20538-20543.

Widmann, B., Wandrey, F., Badertscher, L., Wyler, E., Pfannstiel, J., Zemp, I., and Kutay, U. (2012). The kinase activity of human Rio1 is required for final steps of cytoplasmic maturation of 40S subunits. Molecular biology of the cell 23, 22-35.

Wiederschain, D., Wee, S., Chen, L., Loo, A., Yang, G., Huang, A., Chen, Y., Caponigro, G., Yao, Y.M., Lengauer, C., et al. (2009). Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell cycle 8, 498-504.

Wilczek, C., Chitta, R., Woo, E., Shabanowitz, J., Chait, B.T., Hunt, D.F., and Shechter, D. (2011). Protein arginine methyltransferase Prmt5-Mep50 methylates histones H2A and H4 and the histone chaperone nucleoplasmin in Xenopus laevis eggs. The Journal of biological chemistry 286, 42221-42231.

실시예

본 발명은 다음 실시예로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 논의된 구체적 방법 및 결과가 이후에 이어지는 청구범위에서 보다 완전하게 기재된 바와 같이 본 발명의 단지 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로도 이에 제한되는 것으로 간주되지 않는다는 것을 용이하게 인지할 것이다.

세포주

HCT116 결장 암종 MTAP wt 및 MTAP^-/- 동질유전자 세포주는 호리즌 디스커버리(Horizon Discovery)로부터 허가를 받았다. 다른 모든 세포주는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC), RIKEN 바이오리소스 센터 세포 은행, 또는 DSMZ로부터 수득하였다.

shRNA -기반 게놈 스크린

6317개 유전자를 표적화하는 50,468개 shRNA를 포함하는 shRNA 라이브러리를 온-칩 DNA 합성에 의해 셀렉타, 인크.(Cellecta, Inc.)에 의해 제조하였고, 연속해서 pRSI16-U6-sh-13kCB22-HTS6-UbiC-TagRFP-2A-Puro 벡터 (셀렉타, 인크.로부터 입수가능한 hGW 모듈 1 라이브러리) 내로 클로닝하였다. HCT116-MTAP^-/- 및 HCT116 MTAP WT 세포의 렌티바이러스 벡터 제조, 역가 측정 및 형질도입은 판매인 shRNA 라이브러리 스크리닝 참조 매뉴얼, v2a (www.cellecta.com) 및 문헌 [Kampmann and Weissman Nature Protocols 2014]에 따라서 시행되었다. shRNA 라이브러리 바코드 삽입물은 2-라운드 PCR에 의해 증폭시키고, 일루미나(Illumina) Hiseq 2000을 사용하여 서열분석하였다. 라이브러리 바코드와 정확히 일치하는 모든 판독치가 데이터 분석에 포함되었다.

안정한 유도성 shRNA 및 cDNA 구출 세포주의 생성.

모든 shRNA 구축물을 pLKO-Tet-on 렌티바이러스 백본 벡터 내로 클로닝하였다 (Wiederschain et al., 2009). MTAP, PRMT5, Mat2a, 및 RIOK1 wt 및 촉매적으로 죽은 돌연변이체 cDNA를 pLVX-IRES-neo/puro/blast 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 표적화된 특이적 서열은 다음과 같다:

shNT: 5'-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3'

shPRMT5: 5'-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3'

shMat2a: 5'-CAGTTTAATGAAGATCTAAAT-3'

shMat2a1: 5'-CTTGTGAAACTGTTGCTAA-3'

shRIOK1: 5'-GTCATGAGTTTCATTGGTAAA-3'.

모든 구축물은 서열분석함으로써 확증하였다. 렌티바이러스 기반 (shRNA 또는 cDNA 과발현) 구축물은 브로드 연구소로부터의 표준 TRC 프로토콜을 사용하여 제조하였다 (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/resources/protocols). 바이러스 형질도입 후, 적절한 약물 (푸로마이신, 네오마이신, 블라스티시딘)을 이용하여 shRNA 또는 cDNA-발현 세포 풀을 선별하였다.

siRNA 형질감염

판매인의 프로토콜에 따라서 리포펙타민 RNAiMAX (13778-150, 라이프 테크놀로지)를 사용하여 온-타겟 플러스 SMARTpool siRNA (다르마콘(Dharmacon))로 세포를 형질감염시켰다. 표적의 강건하고 지속적인 녹다운을 보장하기 위해, 2회의 순차적인 형질감염을 수행하였으며, 완전 성장 배지 (RPMI + 10% FBS)에서 24시간의 회복 간격을 두었다. 두번째 형질감염 후 24시간에, 세포를 트립신 처리하고, 계수한 다음, 96 웰 포맷 성장 검정을 위해 플레이팅하였다.

성장 검정

관련성이 있는 200 ng/ml 독시시클린으로 4일 전처리하거나 또는 siRNA 형질감염 후에, 세포를 웰당 2000개 또는 3000개 세포로 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 셀 타이터 글로(Cell titer glo) ATP 검정 (프로메가(Promega))을 도면 범례에 나타내어진 바와 같이 t₀ 및 세포 배양 주기가 끝날 무렵 평형 검정 플레이트 상에서 수행하였다. 퍼센트 성장은 t_end/t₀의 퍼센트 변화로서 계산되었다. 콜로니 형성 검정을 위하여, 세포를 웰당 1,000개 세포로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 비히클 대조군으로서 등가 부피의 멸균수를 사용하여 플레이팅 시점에 독시시클린 처리 (200 ng/ml)를 개시하였다. 10일 후에 콜로니를 고정시키고, 24시간 동안 4.5% 파라포름알데히드 용액 중의 0.05% 크리스털 바이올렛으로 염색하였다. 리-코르 영상 처리 소프트웨어 (리-코르 바이오사이언스(Li-Cor Bisciences; 미국 네브래스카주 링컨))를 사용하여 콜로니를 정량화하였다.

면역블롯팅

사용된 항체는 PRMT5 (2252S; 셀 시그널링 테크놀로지), Mat2a (sc-166452; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), MTAP (sc-100782; 산타 크루즈 바이오테크놀로지), H4R3me2s (A-3718; 에피젠텍(Epigentek)), 히스톤 H4 (ab10158; 압캠(abcam)), eIF4E (9742; 셀 시그널링), RIOK1 (A302-456A, 베틸 라보라토리즈, 인크.(Bethyl Laboratories, Inc.)), β-액틴 (3700S; 셀 시그널링 테크놀로지)이었다. 사용된 2차 항체는 IRDye 680RD 당나귀 항-토끼 (926-68073; 리-코르) 및 IRDye 800CW 당나귀 항-마우스 (926-32212; 리-코르)였다.

N- 메틸트랜스퍼라제 시험관내 활성 검정

MTA에 의한 메틸트랜스퍼라제 억제의 시험관내 스크리닝 뿐만 아니라 SAM Km 측정은 유로핀 CEREP 판랩(Eurofins CEREP Panlabs)에서 메틸트랜스퍼라제 검정의 패널을 사용하여 시행되었다.

대사물 추출 및 표적화된 LC-MS 분석

배지 분석을 위하여, 적어도 24시간 동안 배양하고 LC-MS 분석 이전에 20배 희석시킨 세포로부터 조건부 배지를 수집하였다. 세포내 대사물에 대하여, 세포 수에 대한 정규화 후 (샘플당 100,000개 세포를 분석하였다) 내부 표준으로서 부가된 d⁸-푸트레신를 수반한 찬 80/20 (v/v) 메탄올/물로 유기 추출을 수행하였다. 이어서, 샘플을 감압 하에 건조시키고, LC-MS 분석할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다.

급속 동결시킨 종양을, 중량 (mg)에 대하여 정규화한 후 d⁸-푸트레신 내부 표준을 함유하는 80/20 MeOH/물 (v/v)로 추출하였다. 종양 샘플을 1분 동안 최대 주파수 하에 조직 용해기를 사용하여 균질화시켰다. 균질화된 샘플을 4℃ 하에 15분 동안 14,000 RPM으로 원심분리시켰다. 웰당 2 mg의 조직에 등가인 부피의 상등액을 감압 하에 증발시키고, LC-MS 분석할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다. 주사하기 전에, 건조된 추출물을 0.1% 포름산을 수반한 LC-MS 등급 수에서 재구성하였다.

이와 같이 추출된 샘플은 기존에 보고된 바와 같이 (Jha et al., 2015) QExactive 오르비트랩 질량 분광계 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific; 미국 캘리포니아주 산호세)) 상에서 정량적 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법을 사용하여 분석하였다. 간략하게 언급하면, 써모 액셀라(Thermo Accela) 1250 펌프는 0.025% 헵타플루오로부티르산, 수중 0.1% 포름산 및 아세토니트릴의 구배를 400 μL/min으로 전달하였다. 고정 상은 아틀란티스(Atlantis) T3, 3 μm, 2.1x150 mm 칼럼이었다. QExactive 질량 분광계는 풀-스캔 방식으로 데이터를 획득하기 위해 70,000 분해능으로 사용되었다. 데이터 분석은 MAVEN (Melamud et al., 2010) 및 스폿파이어(Spotfire)에서 시행되었다. 외부 교정 곡선을 사용하여 정량화를 수행하였다.

결장암 이종이식편에서의 MAT2A 억제

생체내에서 MAT2A 억제의 효과를 연구하기 위해, 유도성 MAT2A shRNA를 발현하는 HCT116 동질유전자 세포주를 수반한 이종이식편을 제조하였다. 동물을 독시시클린으로 처리하기 전에 종양을 형성시켜, 정립된 종양의 증식에 있어서의 MAT2A의 역할을 평가하였다. 생체내에서 MAT2A 녹다운의 효율은 웨스턴 블롯에 의해 확증되었다. 생체내에서 MAT2A 유전적 제거는 MTAP^-/- 유전자형과 wt MTAP 유전자형 둘 다의 HCT116 이종이식편에서 SAM 수준을 감소시키는 것으로 확증되었다. 생체내에서 선택적 성장 억제가 표적에 적중한 효과였다는 것을 입증하기 위해, shMAT2A의 야생형 MAT2A 구출 아암을 이용하여 확장된 생체내 연구를 수행하였다. 본 실험은 본 발명자들의 첫번째 생체내 연구에서 관찰된 효능을 확증시켜 주었고, 시험관내 연구와 같이, MAT2A shRNA에 대해 저항성인 MAT2A cDNA를 발현하는 이종이식편에서 성장 억제가 구출되었다.

MAT2A 억제제 AG-512 및 AG-673을 이용한 종양 세포 성장 억제

AG-512 및 AG-673은 생화학적 검정에서 각각 83 nM 및 143 nM의 IC₅₀을 나타낸 MAT2A 효소적 활성의 소형 분자 억제제이고, 각각 80 및 490 nM의 IC₅₀으로 세포 중의 SAM의 생성을 억제하였다.

MTAP 유전자의 엑손 6을 결실시키도록 HCT116 세포의 동질유전자 클론을 유전적으로 변형시켜, 모 HCT116 세포와 비교해서 MTAP 발현이 완전히 상실되도록 하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 성장시키고, 4일 동안 MAT2A 억제제 AG-512 및 AG-673으로 처리하였다. 제0일 (즉, 약물 처리 개시일)에 검정된 대조군 플레이트와 비교해서 제4일에 웰에서의 ATP 수준을 측정함으로써 % 성장을 결정하였다. 도 8a에 제시된 바와 같이, AG-512는 8.98 μM의 IC₅₀으로 wt MTAP 세포의 종양 세포 성장을 억제하였지만, MTAP 널 세포에서는 143 nM의 IC₅₀으로 억제하였다. 유사하게, AG-673은 2.76 μM의 IC₅₀으로 wt MTAP 세포를 억제하였고, 552 nM의 IC₅₀으로 MTAP 널 세포를 억제하였다. 다양한 화학적 구조를 갖는 50개 초과의 소형 분자 억제제가 MTAP-널 종양 세포의 성장을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 SAM 수준을 감소시키는 화합물의 효력과 상관이 있었다.

세포주 패널에서의 MAT2A 억제

332개 세포주 (68개 MTAP 널, 224개 MTAP wt)를 96-웰 플레이트에서 성장시키고, 6일 동안 일정 용량 범위의 MAT2A 억제제 또는 AGI-673으로 처리하였다. 각각의 용량 점에 대한 퍼센트 (%) 성장을 계산하였고, 곡선 피트를 사용하여 GI₅₀ (성장의 50% 감소를 초래하는 약물의 농도)를 결정하였다. 감수성에 대한 한계치로서 GI₅₀ < 2 μM을 사용하여, 68개의 MTAP 널 세포주 중 36개 (53%)가 AGI-673 억제에 대해 감수성인 반면, 224개의 MTAP wt 세포주 중 34개 (15%)만이 감수성이었다 (p=2e-9). 추가의 게놈 분석 결과, KRAS 돌연변이 (G12X 또는 G13X)를 또한 포함하고 있는 16개의 MTAP 널 세포주 중에서 14개 (88%)가 AGI-673을 이용한 MAT2A 억제에 대해 감수성인 반면, KRAS 돌연변이가 존재하는 경우 49개의 MTAP 야생형 세포주 중에서 24개 (49%)만이 감수성이었다 (p.008).

참조로 포함

본원에 개시된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 다른 참고문헌은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.

등가물

관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용 실험만을 사용하여, 본원에 구체적으로 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위의 범주 내에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (22)

1. 대상체에게 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 MTAP 널(null) 암을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 예를 들어, 환자로부터 채취한 암의 샘플로부터, 암에서의 MTAP 유전자의 부재를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암이 KRAS 돌연변이를 포함하고 있는 것인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암이 p53 돌연변이를 포함하고 있는 것인 방법.
5. 종양 세포에서 MTAP의 스테이터스를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 상기 종양 세포를 MAT2A 억제제와 접촉시킴으로써 억제될 수 있는지 여부를 결정하는 방법.
6. 제5항에 있어서, MTAP 유전자의 부재가 결정되는 것인 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, KRAS 돌연변이의 존재를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능 및 KRAS 돌연변이의 존재는 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
8. 제5항 또는 제6항에 있어서, p53 돌연변이의 존재를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능 및 p53 돌연변이의 존재는 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
9. 종양 세포에서 MTAP 유전자 발현의 수준을 측정하거나, MTAP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 존재하는 MTAP 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 참조 세포와 비교하여 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능은 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인, 상기 종양 세포를 특징규명하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 종양 세포에서의 MTAP 유전자의 부재가 검출되는 것인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, KRAS 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능 및 KRAS 돌연변이의 존재는 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
12. 제9항 또는 제10항에 있어서, p53 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 MTAP 발현의 감소 또는 부재 또는 MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 감소된 수준 또는 기능 및 p53 돌연변이의 존재는 상기 종양 세포의 생존 또는 증식이 MAT2A 억제제에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
13. 종양 샘플에서 MTAP 유전자의 발현 수준, MTAP 유전자의 부재 또는 MTAP 단백질의 수준 또는 기능의 감소를 측정하기 위한 시약을 포함하며, 치료 유효량의 MAT2A 억제제를 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
14. 제13항에 있어서, 시약이 샘플에서 MTAP 유전자의 부재를 검출하기 위한 것인 키트.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, KRAS 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
16. 제13항 또는 제14항에 있어서, p53 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
17. 제3항, 제7항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KRAS 돌연변이가 G12X 또는 G13X 아미노산 치환인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 KRAS 돌연변이가 G12C, G12D G12R, G12V, 또는 G13D인 방법.
19. 제4항, 제8항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p53 돌연변이가 Y126_스플라이스, K132Q, M133K, R174fs, R175H, R196*, C238S, C242Y, G245S, R248W, R248Q, I255T, D259V, S261_스플라이스, R267P, R273C, R282W, A159V 또는 R280K인 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MAT2A 억제제가 하기 화학식의 화합물인 방법 또는 키트:
    X-Ar₁-CR^a=CR^b-Ar₂
    여기서 R^a 및 R^b는 독립적으로 H, 알킬, 할로, 알콕시, 시아노이고; X는 Ar₁ 상의 적어도 1개의 할로겐, 예를 들어, 플루오린, 염소, 브로민, 또는 아이오딘 치환기를 나타내고; Ar₁ 및 Ar₂ 각각은 할로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴알킬아미노, 디알킬아미노의 N-옥시드, 트리알킬암모늄, 메르캅토, 알킬티오, 알카노일, 니트로, 니트로실, 시아노, 알콕시, 알케닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 술폰아미드, CONR₁₁R₁₂, NR₁₁CO(R₁₃), NR₁₁COO(R₁₃), NR₁₁CONR₁₂R_n (여기서 R₁₁, R₁₂, R₁₃은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 플루오린임)로 추가로 치환될 수 있는, 아릴, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 및 헤테로아릴, 예를 들어, 피리딜, 피롤리딜, 피페리딜, 피리미딜, 인돌릴, 티에닐이며; 단 Ar₂는 아릴 고리 내의 적어도 1개의 질소 원자 또는 아릴 고리 상의 적어도 1개의 질소 치환기, 예를 들어, Ar₂ 상의 NR^cR^dZ 치환기를 함유하며, 여기서 R^c는 H, 알킬, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴이고, R^d는 알킬 기이고, Z는 비공유 전자 쌍, H, 알킬, 산소이다.
21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, MAT2A 억제제가 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 그의 비오티닐화 유도체인 방법 또는 키트:
    

    

    
    여기서 R^a 및 R^b는 상기 정의된 바와 같고, R₁ 내지 R₁₀은 독립적으로 H, 할로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 디알킬아미노의 N-옥시드, 아릴알킬아미노, 디알킬옥시아미노, 트리알킬암모늄, 메르캅토, 알킬티오, 알카노일, 니트로, 니트로실, 시아노, 알콕시, 알케닐옥시, 아릴, 헤테로아릴, 술포닐, 술폰아미드, CONR₁₁R₁₂, NR₁₁CO(R₁₃), NR₁₁COO(R₁₃), NR₁₁CONR₁₂R₁₃ (여기서 R₁₁, R₁₂, R₁₃은 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 플루오린임)이며; 단 R₁ 내지 R₅ 중 적어도 하나는 할로겐, 예를 들어 플루오린 및/또는 염소이고; R₆ 내지 R₁₀ 중 적어도 하나는 질소 함유 치환기, 예를 들어, NR^cR^dZ 치환기이며, 여기서 R^c는 H, 알킬, 예를 들어, 저급 알킬, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴이고, R^d는 알킬 기이고, Z는 비공유 전자 쌍, H, 알킬, 산소이다.
22. 제21항에 있어서, MAT2A 억제제가 (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(3-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(4-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디에틸아닐린; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디페닐아닐린; (E)-1-(4-(2-플루오로스티릴)페닐)-4-메틸피페라진; (E)-4-(2-플루오로스티릴)-N,N-디메틸나프탈렌-1-아민; (E)-2-(4-(2-플루오로스티릴)페닐)-1-메틸-1H-이미다졸; (E)-4-(2,3-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,4-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,5-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-2-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-3-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디에틸아닐린; (E)-4-(3,4-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(3,5-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-N,N-디메틸-4-(2,3,6-트리플루오로스티릴)아닐린; (E)-N,N-디메틸-4-(2,4,6-트리플루오로스티릴)아닐린; (E)-4-(2-클로로-6-플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디클로로스티릴)-N,N-디메틸아닐린; (E)-4-(2,6-디플루오로펜에틸)-N,N-디메틸아닐린; 및 (E)-2-벤즈아미드-4-(2,6-디플루오로스티릴)-N,N-디메틸아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법 또는 키트.

Images