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KR20180096321A - Fusion nano liposome-nucleic acid for quantitative diagnosis of multi ribonucleic acid marker, method for theoretical stability evaluation thereof, uses thereof and preparation method thereof - Google Patents

Fusion nano liposome-nucleic acid for quantitative diagnosis of multi ribonucleic acid marker, method for theoretical stability evaluation thereof, uses thereof and preparation method thereof Download PDF

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KR20180096321A
KR20180096321A KR1020170022884A KR20170022884A KR20180096321A KR 20180096321 A KR20180096321 A KR 20180096321A KR 1020170022884 A KR1020170022884 A KR 1020170022884A KR 20170022884 A KR20170022884 A KR 20170022884A KR 20180096321 A KR20180096321 A KR 20180096321A
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KR
South Korea
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nucleic acid
nano
liposome
fusion
acid construct
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KR1020170022884A
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Korean (ko)
Inventor
엄숭호
신승원
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
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Publication date
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Abstract

The present invention relates to a liposome-nucleic acid nano-fusion for the quantitative diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, containing, in a liposome, a silica sphere having bound to the surface thereof a nucleic acid nano-structure having a first nucleic acid structure which is branched and has a cyclic end and a second nucleic acid structure which is branched and has a cyclic end, wherein the first nucleic acid structure and the second nucleic acid structure are bonded with the nucleic acid nano-structure; a theoretical stability evaluation method for the nano-fusion; an imaging system using the nano-fusion in disease diagnosis; and a production method for the nano-fusion. By using the liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention, the difference in aspects of RNA expression among various cell lines may be quantitatively compared; and the difference among cells in a single cell line may be confirmed, thereby enabling real-time diagnosis of multiple intracellularly-expressed cancer-specific RNA markers acquired in an actual clinical setting, and on the basis thereof, information necessary for diagnosis and treatment may be easily acquired.

Description

다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체, 이의 이론적 안정성 평가 방법, 이의 응용, 및 이의 제조 방법{FUSION NANO LIPOSOME-NUCLEIC ACID FOR QUANTITATIVE DIAGNOSIS OF MULTI RIBONUCLEIC ACID MARKER, METHOD FOR THEORETICAL STABILITY EVALUATION THEREOF, USES THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a liposome-nucleic acid nano-fused compound for the diagnosis of multiple ribonucleic acid markers, a method for evaluating the stability of liposomes, a method for evaluating the stability of liposomes, a method for evaluating the stability of liposomes, a method for preparing the liposome-nucleic acid nano- AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체, 상기 나노융합체 분자동력학적 시뮬레이션 기법을 이용하여 안정성을 확인하고 이를 질병 진단에 활용하는 이미징 시스템, 질병 진단 방법, 및 상기 나노융합체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation, an imaging system which confirms stability using the nano-fusion molecular dynamics simulation technique and uses it for disease diagnosis, a disease diagnosis method, .

현재 대부분의 암 진단은 금속, 고분자 중합체 등 인체에 유해한 물질을 사용하고 정확한 진단을 위해서 적게는 3일, 많게는 한 달 이상이 소요된다. 그리고 대부분의 진단체가 가시광선 파장대의 빛을 발생하지 않기 때문에 암이 상당히 진행되어 종양을 형성하기 전까지는 눈으로만 암을 진단하는 데에 한계가 있다. 또한 같은 이유로 진단이 생체 내에서 실시간으로 진행되는 데에 한계가 발생한다.Currently, most cancer diagnoses use substances harmful to human body such as metal, polymer, etc. It takes less than 3 days and more than one month for accurate diagnosis. Since most diagnostic agents do not produce light in the visible light wavelength range, there is a limit to the diagnosis of cancer only by the eye until the cancer progresses considerably and the tumor is formed. For the same reason, limitations arise in that the diagnosis proceeds in real time in the living body.

이에 따라 최근에는 인체 유해성을 최소화하기 위해 생체 친화적 물질로 진단체를 제작하는 연구가 상당수 진행되고 있다. 핵산은 이들 중 많은 주목을 받고 있는 물질로 나노생명공학기술을 통해 다양한 형태로 제작되고 있다. 이렇게 만들어진 핵산 나노구조체에 형광체를 붙여 암 진단에 사용하는 기술이 크게 이목을 끌고 있다.Recently, many researches have been carried out to fabricate a group of biocompatible materials in order to minimize human harm. Nucleic acid has attracted much attention among them and is being produced in various forms through nanobiotechnology. The technique of attaching phosphors to the nucleic acid nanostructures thus prepared and using them for cancer diagnosis has drawn considerable attention.

그러나 핵산이 생체를 구성하는 물질인 만큼 생체 내에 삽입되었을 시 효소에 의해 부서지게 되어 본래 기능을 상실하게 될 가능성이 매우 높다. 또한 진단체가 암 세포 뿐 아니라 일반 세포에까지 비 특이적으로 결합하는 것을 최소화하기 위해 표적물질과 결합시키는 과정이 요구된다. 하지만 현재까지 상기 요구사항들을 동시에 만족시키는 연구는 아직까지 많이 진행되고 있지 않은 실정이다. 게다가 삼중음성유방암 등과 같이 특이적인 표적체가 발현되지 않는 암세포는 진단에 상당한 어려움을 겪고 있다.However, since nucleic acid is a constituent of a living body, it is very likely that the nucleic acid will be destroyed by an enzyme when it is inserted into a living body and lose its original function. Also, a process is required to bind the target substance to minimize the non-specific binding of the diagnostic agent to cancer cells as well as to normal cells. However, to date, there have not been many studies to satisfy the above requirements at the same time. In addition, cancer cells that do not express a specific target such as triple-negative breast cancer suffer from considerable difficulty in diagnosis.

한편, 최근 대상 세포의 RNA의 발현 양상에 따라 암 전주기에 해당하는 진단이 가능한 것으로 밝혀지고 있으며, 그중에서 특정 miRNA의 발현 양상은 초기암에서 빠르게 변화하는 것이 알려져있다. 이로 인해 진단 마커로서 miRNA의 중요성이 나날이 부각되고 있다. 또한 한 부위에서 발생한 암조직 내부에 존재하는 종양 이질성 (Tumor heterogeneity) 으로 인해 정밀한 치료가 어려운 실정으로, 정밀한 환자 맞춤형 치료를 위해서 세포 간 차이를 확인하여 시공적인 (Spatio-temporal) 정보를 얻는 것이 중요하게 여겨지고 있다. Recently, it has been shown that the expression of RNA of the target cell can be diagnosed in the whole cancer cycle. Among them, the expression pattern of a specific miRNA rapidly changes in early cancer. As a result, the importance of miRNA as a diagnostic marker has been increasingly recognized. In addition, it is difficult to precise treatment because of the tumor heterogeneity in cancer tissue in one site. It is important to obtain spatial-temporal information by confirming intercellular differences for precise patient-customized treatment. .

이러한 필요성에 근거하여 단일 세포 실시간 중합효소 연쇄반응 (Single cell real time polymerase chain reaction), 고효율 시퀀싱 (High-throughput sequencing) 등 기술들이 개발되고 있으나, 이 역시 분석에 필요한 시간 및 비용이 크다는 뚜렷한 한계를 가지고 있다. 또한 위의 문제점을 극복하기 위하여 나노기술을 이용한 세포내 실시간 분석을 위해 다양한 진단 시스템들이 보고되고 있으나(국내등록특허 제1464100호), 진단 시스템의 세포내 전달이 세포간 특성으로 크게 좌우되기 때문에 세포 종류에 따른 정량적 비교가 불가능하며, 이로 인해 실질적인 임상 적용에 문제가 있다.Based on these needs, technologies such as single-cell real-time polymerase chain reaction (PCR) and high-throughput sequencing have been developed, but this also has a significant limitation on the time and cost required for the analysis Have. In order to overcome the above problems, various diagnostic systems have been reported for real-time intracellular analysis using nanotechnology (Korean Patent No. 1464100). However, since intracellular delivery of the diagnostic system is largely dependent on intercellular characteristics, Quantitative comparisons according to the type are not possible, and thus there is a problem in practical clinical application.

이에, 다종의 세포주 간 RNA 발현 양상 차이를 비교하여, 빠르게 암을 진단할 수 있는 고성능 암 진단체가 요구되고 있는 실정이다.Accordingly, there is a need for a high-performance cancer diagnostic agent capable of quickly diagnosing cancer by comparing differences in the expression patterns of RNAs between a plurality of cell lines.

본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 고효율, 저비용인 동시에 세포 간의 정량 비교가 가능한 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by developing a liposome-nucleic acid nano-fused product for the diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation, which is capable of high-efficiency, low-cost and comparative comparison between cells in order to overcome the problems of the prior art.

따라서 본 발명의 목적은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a nucleic acid construct comprising a first nucleic acid construct in the form of a branch having a cyclic terminal; The present invention also provides a liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosing multiple ribonucleic acid marker determinations, wherein the liposome comprises a silica spherical body having a surface-bound nucleic acid nanostructure bonded with a second nucleic acid structure having a branched end having a cyclic terminal.

본 발명의 다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biomedical imaging system including the liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosis of the multiple ribonucleic acid marker quantitation.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing the liposome-nucleic acid nano-fused product for diagnosing the multiple ribonucleic acid marker quantitation.

본 발명의 또다른 목적은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosing multiple ribonucleic acid marker quantitation.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention as described above, the present invention provides a nucleic acid construct comprising a first nucleic acid construct in the form of a branch having a cyclic terminal; The present invention provides a liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosing multiple ribonucleic acid marker determinations, wherein the liposome comprises a silica spherical body having a surface-bound nucleic acid nanostructure conjugated with a second nucleic acid structure having a branched end.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the first nucleic acid construct may have a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 are bound in Y-form.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the second nucleic acid construct may be one in which the linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 6 are combined in the Y-branch form.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the linear nucleic acid may further comprise a fluorescent substance at the 5 'end.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the first nucleic acid construct may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the second nucleic acid construct may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct may be further labeled with a fluorophore and a quencher.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산구조체는 표적 RNA와 상보적서열을 가지는 염기서열의 한 쪽 말단에 소광제가 추가로 표지된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the nucleic acid construct may further comprise a quencher at one end of a base sequence having a complementary sequence to the target RNA.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 실리카 구형체는 50 내지 90 nm인 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the spherical silica spheres may be 50 to 90 nm.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 실리카 구형체는 핵산 나노 구조체가 표면에 결합되기 전에, 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차적으로 처리하여 표면개질된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the spherical silica spheres are prepared by sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride before the nucleic acid nanostructure is bonded to the surface, It may be modified.

본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 리포솜은 양이온성 지질로 이루어진 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the liposome may be composed of a cationic lipid.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cationic lipid may be composed of a cationic lipid composed of DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and cholesterol.

또한, 본 발명은 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공한다.The present invention also provides a biomedical imaging system comprising the liposome-nucleic acid nano-fusion.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the system may be to measure intracellular fluorescence.

또한, 본 발명은 질병의 진단을 필요로 하는 개체에 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 투여하고 형광을 측정하는 단계를 포함하는 질병 진단 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of diagnosing a disease, comprising administering the liposome-nucleic acid nano-fusion to a subject in need of diagnosis of disease and measuring fluorescence.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질병은 암일 수 있다.In one embodiment of the invention, the disease may be cancer.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 투여는 경구 투여, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사, 동맥 주사 또는 피하 주사를 통해 이루어지는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the administration may be by oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intraarterial injection or subcutaneous injection.

이에 더하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for preparing a liposome-nucleic acid nano-fused compound for the diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation comprising the steps of:

고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 제조한 후, 리가아제 효소를 이용하여 서로 접합시켜 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계(S1);(S1) a nucleotide nano-structure is prepared by preparing a first nucleic acid construct having a branched end and a second nucleic acid construct having a branched end and having a cyclic terminal and ligating with each other using a ligase enzyme, ;

용매에 실리케이트 용액을 첨가하여 실리카 나노입자체를 합성하는 단계(S2);Adding a silicate solution to the solvent to synthesize the silica nano-particles themselves (S2);

상기 S2 단계의 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차처리하는 단계(S3);(S3) sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride to the nano-particles themselves in step S2;

상기 S3 단계의 나노입자체와 S1 단계의 핵산 나노 구조체를 반응시켜 핵산 나노구조체를 제조하는 단계(S4);(S4) reacting the nanoparticles of step S3 and the nucleic acid nanostructure of step S1 to prepare a nucleic acid nanostructure;

상기 S4 단계의 핵산 나노구조체에 양이온성 지질을 첨가한 후 초음파 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체를 제조하는 단계(S5).(S5) a cationic lipid is added to the nucleic acid nanostructure of step S4 and then the liposome-nucleic acid nano-fusion is prepared by ultrasonication.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S2 단계의 용매는 메탄올, 에탄올, 증류수, 및 암모니아수를 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the solvent of step S2 may include methanol, ethanol, distilled water, and ammonia water.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 메탄올 및 에탄올은 6 : 4 내지 8 : 2의 부피비율로 혼합되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the methanol and ethanol may be mixed in a volume ratio of 6: 4 to 8: 2.

아울러, 본 발명은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법으로,In addition, the present invention is an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nano-fusion substance for diagnosing the multiple ribonucleic acid marker quantitation,

상기 방법은 나노융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법을 제공한다.Wherein the method comprises the step of measuring the hydrogen bonding energy occurring within the nano fusions.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the measurement may be performed at 35 to 40 占 폚.

본 발명에 따른 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포솜-핵산 나노융합체는 다종의 세포주간 RNA 발현 양상 차이의 정량적 비교 및 단일 세포주내 세포간 차이를 확인할 수 있는 효과를 가진다. 이를 통해 실제 임상에서 얻어진 세포내에 발현되고 있는 암특이적 RNA 마커의 다중 실시간 진단이 가능해지고, 이를 토대로 하여 진단 및 치료에 필요한 정보를 쉽고 빠르게 얻을 수 있는 장점이 있다. The liposome-nucleic acid nano-fusion for the diagnosis of multiple ribonucleic acid markers according to the present invention has the effect of quantitatively comparing the differences in the expression levels of various cell-day RNAs and confirming the intercellular differences in a single cell line. Thus, it is possible to perform multi-real-time diagnosis of cancer-specific RNA markers expressed in cells obtained in actual clinics, and it is possible to obtain information necessary for diagnosis and treatment easily and quickly on the basis thereof.

특히 세포 내에서 그 농도가 절대적으로 적은 마이크로 리보핵산을 표적으로 하여 고감도 진단이 가능하므로, 상대적으로 표적물질이 많이 발현되지 않는 초기 암의 진단 및 예후를 예측하는 것이 가능하며, 세포막 내외부에 발현되는 다양한 표적물질을 표적화할 수 있기 때문에 삼중음성유방암 등과 같이 진단이 어려운 암종 역시 용이하게 진단이 가능하다.In particular, it is possible to predict the diagnosis and prognosis of early cancers in which a target substance is not expressed in a relatively large amount, because micro-ribonucleic acid having a concentration in the cell is absolutely low can be targeted and highly sensitive diagnosis can be performed. Because it can target a variety of target substances, it is also possible to diagnose easily the cancer which is difficult to diagnose such as triple negative breast cancer.

이에 더하여, 다양한 형광체를 사용하여 다양한 종류의 miRNA 농도에 따른 다중 비색(Multi-colorimetric) 진단 평가가 가능하고, 단일 세포 내에서 다양한 종류의 miRNA 진단을 통해 세포 간 이종성(Heterogeneity)을 평가할 수 있는 특징이 있으며, 융합체 표면의 리포솜 이중막이 생체 내에서 진단체가 분해되는 것을 늦춰주기 때문에 생체 내 적용이 용이한 장점이 있다.In addition, it is possible to evaluate multi-colorimetric diagnosis with various kinds of miRNA by using various phosphors and to evaluate intercellular heterogeneity through the diagnosis of various kinds of miRNAs in a single cell , And the liposome bilayer membrane on the surface of the fused body slows down the degradation of the diagnostic agent in vivo, so that it is advantageous to be easily applied in vivo.

도 1은 본 발명의 세포내 실시간 다중 RNA 마커 진단을 위한 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법 및 진단 방법을 도시적으로 나타낸 도면이다.
도 2의 위쪽은 핵산 나노 구조체(afc-DNA)의 제조방법을 나타낸 것이고, 아래쪽은 핵산 나노 구조체의 합성을 전기영동기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 확인하기 위한 시뮬레이션 조건을 나타낸 도면이다.
도 4는 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 도 3의 조건에 따라 oxDNA 프로그램을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실리카 나노입자체의 표면에 핵산 나노구조체를 접합하는 과정과 결과를 나타낸 도면으로, 5a는 접합 과정의 모식도를 나타낸 것이고, 5b는 온도에 따른 결합 안정성(37도)을 확인한 결과이며, 5c는 표면 처리 단계별 입자체 크기 변화를 나타낸 것이고, 5d는 실리카 표면에 붙은 핵산 나노구조체를 형광현미경을 통해 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체의 제조 단계에 따른 크기와, 크기에 따른 형광 시그널 증폭 및 표면 전하 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에서 제조된 리포좀-핵산 나노융합체를 두가지 종류(MCF-7 및 SK-BR-3)의 유방암 세포주에 처리하여, 세포 내 전달이 잘 이루어지는지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 나노융합체가 다중 진단능을 가지는지 확인한 결과로, 5종의 유방암 세포주(HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 및 SK-BR-3)를 대상으로 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체를 처리한 후, 유세포 분석을 통해 얻어지는 결과를 현재 표준적으로 사용되고 있는 RT-PCR의 결과와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 대상 miRNA를 핵산 나노구조체에 처리하고, 그로 인해 발생하는 형광시그널의 증대를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 9b는 대상 miRNA를 다양한 농도로 혼합하고, 상기 혼합액에의 농도에 따른 형광시그널의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 9c는 상기 형광시그널의 변화를 색깔로 변환한 결과를 나타낸 도면이다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a diagram showing a method for producing liposome-nucleic acid nano-fusion and a diagnostic method for diagnosis of intracellular real-time multi-RNA markers of the present invention.
The upper part of FIG. 2 shows a method of producing a nucleic acid nano-structure (afc-DNA), and the lower part shows a result of confirming the synthesis of a nucleic acid nanostructure through an electrophoresis technique.
3 is a view showing simulation conditions for confirming the three-dimensional structure of the nucleic acid nanostructure.
FIG. 4 is a view showing the result of confirming the three-dimensional structure of the nucleic acid nanostructure through the oxDNA program according to the conditions of FIG.
5a is a schematic view of the bonding process, 5b is a result of confirming the bonding stability (37 ° C) according to the temperature, and FIG. 5 is a view showing a process and a result of bonding the nucleic acid nanostructure to the surface of the silica nanoparticle itself. 5c is a graph showing a change in particle size per surface treatment step, and 5d is a diagram showing a result of visualizing a nucleic acid nanostructure attached to a silica surface through a fluorescence microscope.
FIG. 6 is a graph showing the results of checking fluorescence signal amplification and surface charge change according to the size and size of the liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the results of confirming intracellular delivery by treating the liposome-nucleic acid nano-fusion prepared in the present invention on two types of breast cancer cell lines (MCF-7 and SK-BR-3).
FIG. 8 shows that the nano-fused product of the present invention had multiple diagnostic functions. As a result, five types of breast cancer cell lines (HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA- ) Of the present invention, the results obtained by flow cytometry after the treatment of the liposome-nucleic acid nano-fusion of the present invention are compared with the results of RT-PCR which is currently used as standard.
FIG. 9A shows the results of measuring the increase of the fluorescence signal generated by subjecting the target miRNA to the nucleic acid nanostructure, FIG. 9B shows the result of mixing the target miRNA at various concentrations, and comparing the fluorescence signal FIG. 9C is a graph showing a result of converting the change of the fluorescence signal into a color. FIG.

본 발명자들은 실시간 세포내 다중 RNA 마커 진단이 가능한 암세포 진단체를 개발하기 위해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have completed the present invention by studying to develop a cancer cell population capable of diagnosing multiple RNA markers in real time cells.

따라서 본 발명은 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체 및 이를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템을 제공하는 것을 그 특징으로 한다.Accordingly, the present invention provides a nucleic acid construct comprising a first nucleic acid construct in the form of a branch having an annular end; And a liposome-nucleic acid nano-fused compound for diagnosing multiple ribonucleic acid marker determinations, wherein the spherical form of the nucleic acid having the nucleic acid nanostructure bonded to the surface thereof is contained in the liposome, And a diagnostic imaging system.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법을 제공한다:The present invention also provides a method of preparing a liposome-nucleic acid nano-fused compound for the diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation comprising the steps of:

고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 제조한 후, 리가아제 효소를 이용하여 서로 접합시켜 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계(S1);(S1) a nucleotide nano-structure is prepared by preparing a first nucleic acid construct having a branched end and a second nucleic acid construct having a branched end and having a cyclic terminal and ligating with each other using a ligase enzyme, ;

용매에 실리케이트 용액을 첨가하여 실리카 나노입자체를 합성하는 단계(S2);Adding a silicate solution to the solvent to synthesize the silica nano-particles themselves (S2);

상기 S2 단계의 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차처리하는 단계(S3);(S3) sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride to the nano-particles themselves in step S2;

상기 S3 단계의 나노입자체와 S1 단계의 핵산 나노 구조체를 반응시켜 핵산 나노구조체를 제조하는 단계(S4);(S4) reacting the nanoparticles of step S3 and the nucleic acid nanostructure of step S1 to prepare a nucleic acid nanostructure;

상기 S4 단계의 핵산 나노구조체에 양이온성 지질을 첨가한 후 초음파 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체를 제조하는 단계(S5).(S5) a cationic lipid is added to the nucleic acid nanostructure of step S4 and then the liposome-nucleic acid nano-fusion is prepared by ultrasonication.

이때, 상기 제조방법은 본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체를 제조할 수 있다면, 적절하게 단계의 순서 및/또는 구성을 변경할 수 있으며 상기 단계에 제한되는 것은 아니다.At this time, if the liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention can be produced, the sequence and / or configuration of the step can be appropriately changed, and the production method is not limited to the above step.

본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체는 질병의 진단을 위해 사용될 수 있으며, 이를 위해 본 발명의 일실시예에서는 세포 내에서 구현 가능하도록 형광체를 표지한 핵산구조체 2종을 실리카 구형체에 부착한 다음 리포좀으로 상기 구형체 표면을 코팅하였다(도 1 참조). 이때, 본 발명의 일실시예에서는 지지를 위한 구형체로 실리카를 이용하였으나, 생체 내 사용가능한 나노사이즈의 구형체라면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 제조된 나노융합체의 크기는 체내에 주입할 수 있는 크기 및 모양이라면 적절하게 조절 가능 하지만, 바람직하게는 직경이 50 nm 내지 90 nm인 구형으로 제조할 수 있다.The liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention can be used for diagnosis of diseases. To this end, in one embodiment of the present invention, two kinds of nucleic acid constructs each having a fluorescent substance labeled thereon are attached to a silica spherical body The surface of the spherical body was coated with a liposome (see Fig. 1). In this case, silica is used as a sphere for supporting in the embodiment of the present invention, but it is not limited to this, and any nano-sized spherical body usable in vivo can be used, and the size of the nano- Size and shape, but can preferably be formed into a spherical shape having a diameter of 50 nm to 90 nm.

본 발명에서 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 점착성 말단을 가지는 선형핵산이 Y자 가지형태로 결합하거나 상기 Y자 가지형태로 반복 결합하게 함으로써 나뭇가지 형태로 제조할 수 있으며, 상기 점착성 말단이 가지는 최소 3개의 5' 말단에 형광체를 표지하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct may be prepared in the form of a twig by allowing the linear nucleic acid having the sticky end to bind in Y-form or repeatedly bind in the Y-form, May be, but is not limited to, labeling the phosphors on at least three 5 ' ends.

상기 핵산구조체는 고리형 말단을 가지는 것으로, 세포 내부 신호를 검출하기 위하여, 세포 내 표적 메신저 리보핵산(mRNA) 또는 표적 마이크로 리보핵산(miRNA)과 상보적으로 결합할 수 있도록 상기 표적 리보핵산과 상보적인 서열 및 고리형 핵산구조체로 묶이게 하는 짧은 서열을 포함하는 핵산을 Y자 가지의 어느 한 쪽 이상의 말단에 부착한 것일 수 있다. 이때, 상기 표적 리보핵산과 상보적인 서열의 한 쪽 말단에 소광제를 추가로 표지함으로써, 상기 표적 리보핵산과 결합하는 고리형 핵산구조체가 형광체와 소광제 사이의 포스터 공명에너지전달현상(Forster Resonance Energy Transfer, FRET)을 토대로 작동될 수 있도록 하였다. 즉, 상기 고리형 핵산구조체가 표적 리보핵산과 결합하지 않으면, 포스터공명에너지전달효과로 인해 빛이 발생하지 않고, 결합하면 형광체에서 빛이 발생할 수 있도록 하였다.The nucleic acid construct has a cyclic terminal and is designed to complement a target ribonucleic acid (mRNA) or a target microRNA (miRNA) in order to detect intracellular signals. And a nucleic acid containing a short sequence that binds to the nucleotide sequence and the nucleotide sequence is attached to one or more ends of the Y-branch. At this time, by additionally labeling a quencher at one end of the sequence complementary to the target ribonucleic acid, a cyclic nucleic acid structure binding to the target ribonucleic acid is transferred to a Forster Resonance Energy Transfer, FRET). That is, if the cyclic nucleic acid construct is not bound to the target ribonucleic acid, light is not generated due to the effect of the poster resonance energy transfer.

바람직하게 상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY) 또는 쿠마린(coumarin)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 6-FAM, Texas 615, Alexa Fluor 488, Cy5, 또는 Cy3일 수 있으며, 바람직하게 상기 소광제는 탐라(TAMRA), 비에이치큐(BHQ), 아이오와블랙 알큐(Iowa Black RQ) 또는 엠지비엔에프큐(MGBNFQ, molecular grove binding non-fluorescence quencher)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Iowa Black RQ 일 수 있으나, 생체 내 사용 가능한 형광체 또는 소광제라면 이에 한정되지 않고 당업자가 적절하게 변경하여 사용할 수 있다.Preferably, the phosphor may be fluorescein, Texas Red, rhodamine, alexa, cyanine, BODIPY or coumarin, more preferably fluorescein, Preferably, the quencher may be selected from the group consisting of TAMRA, BHQ, Iowa Black RQ, or MJVUQQ, such as 6-FAM, Texas 615, Alexa Fluor 488, Cy5, (MGBNFQ, molecular grove binding non-fluorescence quencher), more preferably Iowa Black RQ. However, the present invention is not limited thereto, and any suitable phosphor or quencher may be used in the art.

본 발명의 리포솜은 사용 목적에 따라 세포와의 상호작용을 조절할 수 있도록 지질조성을 달리할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 표적 세포에 비특이적으로 세포막과 융합하여 본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체가 세포질 내로 유입될 수 있도록 양전하를 띄는 지질로 리포솜을 제조하였으며, 바람직하게 상기 양전하를 띄는 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)를 이용하여 제조할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The liposome of the present invention may have a different lipid composition to control the interaction with cells depending on the purpose of use. In one embodiment of the present invention, liposomes are prepared with lipid positively charged so that the liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention can be introduced into the cytoplasm by fusing with the cell membrane nonspecifically to the target cell. Preferably, May be prepared by using DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), but the present invention is not limited thereto.

또한, 본 발명의 리포솜-핵산형광 융합체는 동일한 용액(용매)에 각각 첨가한 핵산나노융합체(제1핵산구조체 및 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체) 및 리포솜을 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 바람직하게는 핵산 나노융합체가 표면 처리된 실리카 나노입자체 및 리포솜의 혼합 중량비는 제한이 없으며, 본 발명의 일실시예에서와 같이 핵산 나노융합체가 포함된 용액 및 리포솜이 포함된 용액을 8:7의 무게비로 혼합할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 동일한 용액(용매)를 사용해야 삼투압에 의한 리포솜의 파열을 방지할 수 있으며, 바람직하게 상기 용액은 증류수 또는 PBS(Phosphate buffer saline)와 같은 인산염 용액을 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the liposome-nucleic acid fluorescent fusion of the present invention can be prepared by using a nucleic acid nano-fusion substance (a silica spherical substance in which a nucleic acid nanostructure bonded with a first nucleic acid construct and a second nucleic acid construct are bonded to a surface) added to the same solution (solvent) And the mixture weight ratio of the silica nanoparticles and the liposomes on which the nucleic acid nano-fusion is surface-treated is not limited. As in the embodiment of the present invention, the solution containing the nucleic acid nano-fusion and the liposome May be mixed in a weight ratio of 8: 7, but the present invention is not limited thereto. In this case, the same solution (solvent) may be used to prevent rupture of the liposome by osmotic pressure. Preferably, the solution may include distilled water or a phosphate solution such as PBS (Phosphate buffer saline).

또한, 본 발명의 S2 단계의 용매는 메탄올, 에탄올, 증류수, 및 암모니아수를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 메탄올 및 에탄올은 6 : 4 내지 8 : 2의 부피비율로 혼합되는 것일 수 있다.In addition, the solvent of step S2 of the present invention may include methanol, ethanol, distilled water, and ammonia water, and the methanol and ethanol may be mixed in a volume ratio of 6: 4 to 8: 2.

본 발명에 따른 리포솜-핵산 나노융합체는 제1핵산구조체와 제2핵산구조체의 말단에 상이한 색조의 형광체를 표지함으로써, 상기 색조의 발현에 따라 정량적 진단이 가능하도록 한 특징이 있다.The liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention is characterized in that quantitative diagnosis is possible according to the expression of the color tone by marking phosphors of different hues at the ends of the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct.

따라서 본 발명의 리포솜-핵산 나노융합체는 생체 진단 이미징 시스템으로 활용될 수 있으며, 상기 시스템은 다중 RNA 마커를 포획하여 특이적인 형광물질의 활성화시킴으로써, miRNA 농도에 따른 형광 시그널 변화 및 색상 환산에 따라, 세포간 정량 비교가 가능한 특징을 가지는 것이다.Therefore, the liposome-nucleic acid nano-fusion of the present invention can be utilized as a biomedical imaging system. The system captures multiple RNA markers to activate a specific fluorescent substance, thereby, depending on the fluorescence signal change and color conversion according to the miRNA concentration, And it is possible to compare quantitatively between cells.

이에 더하여, 본 발명은 질병의 진단을 필요로 하는 개체에 상기 리포솜-핵산 나노융합체를 투여하고 세포 내 형광을 측정하는 단계를 포함하는 질병 진단 방법을 제공할 수 있다. 상기 투여는 경구 투여, 정맥 주사, 복강 주사, 근육 주사, 동맥 주사 또는 피하 주사 방법을 통해 이루어질 수 있으며, 상기 개체란 질병의 진단을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 또는 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 상기 진단 방법은 진단을 필요로 하는 질병의 종류에 따라 핵산 서열을 변경하고 리포솜-핵산 형광 나노융합체를 제조할 수 있기 때문에 어느 하나의 질병에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 암 진단을 목적으로 하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 본 발명의 일실시예에 따라 유방암 진단을 목적으로 하는 것일 수 있다.In addition, the present invention can provide a disease diagnosis method comprising administering the liposome-nucleic acid nano-fusion to a subject in need of diagnosis of disease and measuring intracellular fluorescence. The administration may be carried out by oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, arterial injection or subcutaneous injection. The term " subject " means a subject requiring diagnosis of a disease, - refers to mammals such as human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, or cows. In addition, the diagnosis method is not limited to any one disease because it can change the nucleic acid sequence and produce liposome-nucleic acid fluorescent nano-fusion according to the type of disease requiring diagnosis, , And most preferably for the purpose of diagnosing breast cancer according to one embodiment of the present invention.

나아가 본 발명의 리포솜-핵산 형광 나노융합체는 내부가 비어 있어, 다양한 물질을 포함하도록 제조할 수 있다. 내부에 포함할 수 있는 물질에는 제한이 없으나, 바람직하게는 치료제를 포함하도록 함으로써 생체 진단 이미징과 동시에 치료용 시스템으로 활용할 수 있다.Furthermore, the liposome-nucleic acid fluorescent nano-fusion of the present invention can be manufactured to contain various materials because the interior thereof is empty. There is no limitation on the substance that can be contained therein, but it is preferable to include a therapeutic agent so that it can be utilized as a therapeutic system simultaneously with the biomedical imaging.

아울러, 본 발명은 상기 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법으로, 상기 방법은 나노융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention is an evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nano-fusion substance for diagnosing multiple ribonucleic acid marker quantitation, wherein the method comprises the step of measuring the hydrogen bonding energy generated in the nano fusion substance To provide a method of evaluation.

상기 평가방법은 oxDNA 시뮬레이션에 의해서 수행되는 것으로, 상기 oxDNA는 대단위-입자 DNA 모델을 구현하기 위해 개발된 시뮬레이션 코드로서, 분자동력학을 통해서 핵산 나노융합체의 물리적 안정성을 이론적으로 평가하는 것이 가능하게 한다.The above evaluation method is performed by oxDNA simulation. The oxDNA is a simulation code developed to realize a large-particle DNA model, and makes it possible to theoretically evaluate the physical stability of a nucleic acid nano-fusion through molecular dynamics.

본 발명에서 상기 수소결합 에너지의 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하며, 상기 평가방법은 나노융합체 또는 핵산 나노구조체의 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 일정시간(x105) 동안 측정하여, 상기 수소결합 에너지가 일정하게 유지되는 것이 확인될 때, 제조된 나노융합체 또는 핵산 나노구조체에 구조적 안정성이 있는 것으로 판단한다.In the present invention, the measurement of the hydrogen bonding energy is performed at 35 to 40 DEG C, wherein the hydrogen bonding energy generated in the nano-fusion or the nucleic acid nanostructure is measured for a predetermined time (x 10 5 ) , And when it is confirmed that the hydrogen bonding energy is kept constant, it is judged that the produced nano-fusion or nucleic acid nanostructure has structural stability.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

본 실시예에서는 효과적인 암진단 및 임상 적용을 위해, 대상 miRNA는 기존 연구에서 암과의 연관성이 깊은 것으로 알려진 miRNA들인 miR-21 및 miR-22로 선택하여 사용하였다. 진단 프로브의 단순 세포내 전달은 세포 특이적인 세포내 이입률로 인해 정량 분석이 어려운 한계가 있는 것으로, 예를 들면 진단 프로브가 세포 특성으로 인해 단순히 세포내로 다량 전달된 경우, 진단 프로브 자체의 Background noise로 인해 실제 대상 miRNA가 없을 경우에도 positive false를 야기할 가능성이 있으며, 대상 miRNA가 있을 경우에도 negative false를 야기하기도 한다. 이에 현재까지 개발된 나노기술 기반의 진단 프로브는 대부분 상대적 정량만이 가능한 특성을 가지고 있는 바, 본 발명자들은 상기 한계를 극복하고자, 세포내 효율적인 miRNA의 진단을 위해, 도 1에 도시된 방법과 같이 특이적인 리포좀-핵산 나노융합체를 개발하였다.For effective cancer diagnosis and clinical application, the subject miRNAs were selected from miR-21 and miR-22 miRNAs known to be highly related to cancer in the existing studies. The simple intracellular delivery of diagnostic probes has limitations in quantitative analysis due to cell-specific intracellular transfer rates. For example, when a diagnostic probe is simply transferred into a cell due to its cell characteristics, Background noise , There is a possibility of causing a positive false even in the absence of the actual target miRNA, and even in the presence of the target miRNA, it may cause a negative false. Therefore, in order to overcome the above limitations, the inventors of the present invention have found that, in order to diagnose miRNA efficiently in cells, the diagnostic probes based on nanotechnology based on the method shown in FIG. 1 Specific liposome-nucleic acid nano-fusions.

실시예 1. 리포좀-핵산 나노융합체의 제조Example 1. Preparation of liposome-nucleic acid nano-fusion

1-1. 핵산 나노구조체 합성 및 분자동력학 시뮬레이션1-1. Synthesis of nucleic acid nanostructures and simulation of molecular dynamics

제1핵산구조체(fc1-DNA) 및 제2핵산구조체(fc2-DNA)를 이루는 핵산 올리고머의 염기서열과 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열은 표 1에 나타내었다. TE buffer(10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에 녹인 후, 각 핵산 올리고머를 동일한 몰수비(0.1 mM)로 혼합하였다. 이후 용액의 온도를 60℃에서 20℃까지 분당 1℃씩 서서히 낮추는 과정을 통해 제1핵산 구조체 및 제2핵산구조체를 합성하였다. The nucleotide sequences of the nucleic acid oligomers constituting the first nucleic acid construct (fc1-DNA) and the second nucleic acid construct (fc2-DNA) and the sequence having the complementary sequence with the target RNA are shown in Table 1. After dissolving in TE buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA), each nucleic acid oligomer was mixed at the same molar ratio (0.1 mM). Thereafter, the temperature of the solution was gradually lowered from 60 ° C to 20 ° C at a rate of 1 ° C per minute to synthesize the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct.

핵산 나노 구조체(afc-DNA)의 합성은 도 2의 위쪽에 나타낸 것과 같이 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체 사이의 리가아제 효소를 통한 접합으로 수행되었다. 동일 몰수의 단위 핵산 나노구조체 혼합액 (0.1 mM)을 3 Weiss unit의 T4 리가아제 효소 및 버퍼에 하였다(4℃, 16시간). 도 2 아래에 나타낸 것과 같이, 핵산 나노구조체 합성은 전기영동기법을 통해 확인되었다. The synthesis of the nucleic acid nanostructure (afc-DNA) was carried out by ligating the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct via the ligase enzyme as shown in the upper part of Fig. The same molar quantity of the unit nucleic acid nanostructure mixture (0.1 mM) was added to the 3 Weiss unit of T4 ligase enzyme and buffer (4 ° C, 16 hours). As shown below in Figure 2, the synthesis of nucleic acid nanostructures was confirmed by electrophoresis.

합성된 핵산 나노구조체의 삼차원적 구조를 확인하기 위해 oxDNA 프로그램을 사용하였으며, 구체적인 시뮬레이션 조건은 도 3에 나타내었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명에서 합성된 핵산구조체와 핵산 나노구조체는 내부에서 발생하는 수소결합 에너지가 일정하게 유지되어, 안정성을 가진다는 것을 확인하였다.An oxDNA program was used to confirm the three-dimensional structure of the synthesized nucleic acid nanostructure. Specific simulation conditions are shown in FIG. 3, and the results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, it was confirmed that the nucleic acid construct and the nucleic acid nano structure synthesized in the present invention had stable stability due to the constant hydrogen bond energy generated therein.

fc1-DNAfc1-DNA Target
(miR-22)Target
(miR-22) AAG CUG CCA GUU GAA GAA CUG U(서열번호 7)AAG CUG CCA GUU GAA GAA CUG U (SEQ ID NO: 7) fc1-afc1-a IowaBlackRQ/GCGAGACAGTTCTTCAACTGGCAGCTTCTCGC/Cy3/AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA(서열번호 1) IowaBlackRQ / GCGAGACAGTTCTTCAACTGGCAGCTTCTCGC / Cy3 / AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA (SEQ ID NO: 1) fc1-bfc1-b Marinablue/CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT(서열번호 2) Marinablue / CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT (SEQ ID NO: 2) fc1-cfc1-c AGT CTG GAT CCG CAT GAC ATT CGC CGT AAG(서열번호 3)AGT CTG GAT CCG CAT GAC ATT CGC CGT AAG (SEQ ID NO: 3) fc2-DNAfc2-DNA Target
(miR-21)Target
(miR-21) UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A(서열번호 8)UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A (SEQ ID NO: 8) fc2-afc2-a IowaBlackFQ/GCGAGTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCGC/FAM/AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA(서열번호 4) IowaBlackFQ / GCGAGTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCGC / FAM / AGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA (SEQ ID NO: 4) fc2-bfc2-b Amine/CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT(서열번호 5) Amine / CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT (SEQ ID NO: 5) fc2-cfc2-c GAC TTG GAT CCG CAT GAC ATT CGC CGT AAG(서열번호 6)GAC TTG GAT CCG CAT GAC ATT CGC CGT AAG (SEQ ID NO: 6)

1-2. 다양한 크기의 실리카 나노입자체 합성 및 핵산 나노입자체 부착1-2. Synthesis of silica nanoparticles in various sizes and attachment of nucleic acid nano-particles themselves

입자체 합성을 위해서, 최종 부피가 46mL가 되도록 메탄올과 에탄올을 다양한 부피 비율로 혼합한 후, 1 mL의 증류수와 3 mL의 암모니아수(28~30 w/w%)를 첨가해주었고, 10분간 교반한 뒤 Tetraethyl orthosilicate (TEOS) 용액 0.6 ml을 서서히 처리하여 실리카 나노입자체를 제조하였다. 제조된 실리카 나노입자체는 원심분리를 통해(15,000 G, 30분) 3회 이상 에탄올로 씻어내었다. To synthesize the liposomes, methanol and ethanol were mixed in various volume ratios so as to have a final volume of 46 mL, and 1 mL of distilled water and 3 mL of ammonia water (28-30 w / w%) were added. After that, 0.6 ml of tetraethyl orthosilicate (TEOS) solution was slowly treated to prepare silica nanoparticles. The prepared silica nanoparticles were rinsed with ethanol at least 3 times through centrifugation (15,000 G, 30 minutes).

에탄올로 씻어낸 후, 200 mg의 실리카 나노입자체에 0.8 mL의 APTMS(아미노프로필트리메톡시실란, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane), 38 ml의 에탄올, 2 ml의 증류수, 및 0.25 ml의 아세트산을 첨가하였다. 이후 3회 이상의 원심분리를 통해 에탄올, 아세토니트릴 (Acetonitrile)로 씻어내고, 115.2 mg의 염화시아누르(cyanuric chloride)를 처리한 후 2시간 동안 교반해주었다. 3회 이상 아세토니트릴, 에탄올, 증류수, 붕산염 버퍼용액 (Borate buffer, pH 8.5)로 씻어내었다.After washing with ethanol, 0.8 ml of APTMS (3-Aminopropyl) trimethoxysilane), 38 ml of ethanol, 2 ml of distilled water, and 0.25 ml of acetic acid were added to 200 mg of the silica nanoparticle itself . Then, the mixture was washed with ethanol, acetonitrile, and 115.2 mg of cyanuric chloride, followed by stirring for 2 hours. Washed three times or more with acetonitrile, ethanol, distilled water, and borate buffer solution (pH 8.5).

마지막으로 4 mg의 실리카 나노입자체 당 25 pmole의 아민기가 말단에 치환된 핵산 나노 구조체를 처리한 후 16시간 이상 반응시켜 핵산 나노융합체를 제조하였다. 미반응된 핵산 나노 구조체는 원심분리를 통해 증류수로 씻어내 제거하였다.Finally, a nucleic acid nano-fused product was prepared by treating nucleic acid nanostructures in which amine groups of 25 pmoles were substituted at the ends of 4 mg of silica nanoparticles per se and reacted for 16 hours or longer. Unreacted nucleic acid nanostructures were washed away with distilled water through centrifugation.

1-3. 양이온성 인지질막 처리1-3. Cationic phospholipid membrane treatment

핵산 나노입자체가 결합된 실리카 나노입자체에 양이온성 지질인 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)을 처리하였다. 반응에 앞서 3.5 mg의 DOTAP 인지질은 1.4 ml의 증류수에 10 % 진폭 (amplitude, Qsonica Q500)로 초음파 처리하여 분산시켰다(4℃에서 분산되어 반응 전까지 저온 보관됨). DOTAP 용액과 나노융합체 용액을 혼합하고, 1시간 동안 교반하며 반응시킨 뒤, 원심분리를 통해 증류수, 생리식염수로 씻어주었다.DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), a cationic lipid, was treated on the silica nanoparticles bound to the nucleic acid nanoparticles themselves. Prior to the reaction, 3.5 mg of DOTAP phospholipid was dispersed by ultrasonication in 1.4 ml of distilled water at 10% amplitude (Qsonica Q500) (dispersed at 4 ° C and stored at low temperature until reaction). The DOTAP solution and the nano-fused solution were mixed, reacted for 1 hour with stirring, and then washed with distilled water and physiological saline through centrifugation.

실시예 2. 실리카 나노입자체 합성 및 핵산 나노구조체 접합Example 2: Synthesis of silica nanoparticles and bonding of nucleic acid nanostructures

본 실시예 2에서 핵산 나노구조체의 시그널 증폭과 효율적인 세포내 전달을 위해 다양한 크기의 실리카 나노입자체를 제조하여, 최적의 실리카 나노입자체 크기를 도출하고자하였다. 메탄올과 에탄올 혼합액을 사용한 합성법을 기반으로 하여, 20~270 nm의 크기를 갖는 실리카 나노입자체를 합성하였다. In this Example 2, various sizes of silica nanoparticles were prepared for signal amplification of nucleic acid nanostructures and efficient intracellular delivery, and the optimum size of the silica nanoparticles was determined. Based on the synthetic method using a mixture of methanol and ethanol, silica nanoparticles having a size of 20 to 270 nm were synthesized.

이후 도 5a에 나타낸 것과 같이 핵산 나노구조체를 표면에 접합하기 위해 실리카 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차적으로 처리하여 핵산 나노 구조체의 아민기 (Amine group)과 반응할 수 있도록 하였다. Then, as shown in FIG. 5A, in order to bond the nucleic acid nanostructure to the surface, aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride are sequentially treated on the silica nanoparticle itself to obtain an amine of the nucleic acid nanostructure And to react with the amine group.

또한 도 5b에서는 실리카 표면에 부착된 형광인자가 37℃에서 시간이 지남에 따라 어느 정도 떨어지는지 확인한 결과를 나타낸 것으로, 실리카 나노입자체의 크기에 따라 핵산 나노구조체에서 발생하는 형광 시그널의 강도가 달라지고, 최적점이 있는 것을 확인하였다.In FIG. 5B, fluorescence signals attached to the surface of the silica were observed at 37 ° C. over time. As a result, the intensity of the fluorescence signal generated from the nucleic acid nanostructure was different according to the size of the silica nanoparticle itself And that there is an optimal point.

실시예 3. 양이온성 인지질막 처리 및 세포 내 miRNA 검출능 확인Example 3. Cationic phospholipid membrane treatment and confirmation of intracellular miRNA detection ability

본 발명에서는, 효율적인 세포내 전달 및 엔도조말 탈출 (Endosomal escape)을 위해서, 핵산 나노 구조체가 코팅된 실리카 나노입자체(즉, 핵산 나노융합체)를 양이온성 인지질인 DOTAP (Dioleoyl-trimethylammonium-propane) 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체로 제조하여 진단에 사용한다. 본 실시예에서는 DOTAP 처리에 따른 입자체의 크기 및 표면 전하 변화를 확인하였다. In the present invention, for the purpose of efficient intracellular delivery and endosomal escape, a silica nanoparticle coated with a nucleic acid nanostructure (i.e., a nucleic acid nano-fusion) is treated with a cationic phospholipid DOTAP (Dioleoyl-trimethylammonium-propane) To produce a liposome-nucleic acid nano-fused product for use in diagnosis. In the present embodiment, the size and surface charge change of the particle along with the DOTAP treatment were confirmed.

그 결과, 도 5c에 나타낸 것과 같이, 다양한 크기의 실리카 나노입자체 표면에 핵산 나노구조체를 부착하고 이후 DOTAP를 처리하여 다양한 크기의 나노융합체를 제작하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있으며, 메탄올 및 에탄올의 혼합 부피 비율이 8:2일 때 제작된 실리카 나노입자체를 사용하여 최종 나노융합체를 제작한 경우는 51.38 nm의 크기를, 6:4일 때는 80.56 nm의 크기를, 4:6일 때는 134.21 nm의 크기를, 2:8일 때는 225.70 nm의 크기를, 0:10일 때는 264.40 nm의 크기를 가진다는 것을 알 수 있다. 또한 도 5d에서 확인할 수 있는 것과 같이, 마이크로 크기의 실리카 비드의 표면에 동일한 아미노프로필 트리메톡시실란과 사이아누릭 클로라이드 화학반응을 통해 부착된 핵산 나노구조체를 형광현미경(Zeiss Axiovert 200M, Carl Zeiss)을 통해 확인하여 본 발명에서 실리카 나노입자체 표면의 핵산 나노융합체 부착을 검증하였다.As a result, it can be confirmed that it is possible to attach nucleic acid nanostructures to the surface of silica nanoparticles of various sizes and then to treat DOTAP to produce nano-sized fusions of various sizes, as shown in FIG. 5C. When the final volume ratio of the silica nanoparticles was 8: 2, the size of the final nano-fused product was 51.38 nm, 80.56 nm at 6: 4, and 134.21 nm at 4: 6 The size of 225.70 nm at 2: 8 and 264.40 nm at 0:10. 5d, the nucleic acid nanostructures attached through the chemical reaction of the same aminopropyltrimethoxysilane and cyanuric chloride on the surface of the micro-sized silica beads were observed under a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M, Carl Zeiss) To confirm the attachment of the nucleic acid nano-fusions on the surface of the silica nanoparticles in the present invention.

도 6에서 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체의 제조 단계에 따른 크기와, 크기에 따른 형광 시그널 증폭 및 표면 전하 변화를 확인한 결과를 나타내었다. 형광세기는 형광광도계 (SpectraMax M5, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였고, 표면 전하의 변화는 동적빛산란 기법으로 측정하였다 (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). 도 6a는 본 발명의 제조단계를 모식적으로 나타낸 것이며, 다양한 분율의 메탄올/에탄올 혼합액을 사용하게 제작된 실리카 나노입자체의 표면에 핵산 나노구조체를 부착하고, 최종적으로 DOTAP을 처리하여 표면을 코팅하였다. 도 6b 및 6c는 는 메탄올 및 에탄올의 혼합 부피 비율에 따른 실리카 구형체의 크기와 주사전자현미경 (JEM-3010, JEOL)을 이용하여 촬영된 이미지를 나타낸 것이고, 도 6d는 구형체 크기에 따라 결합되는 핵산 나노구조체의 양과 형광 시그널을 나타낸 것이다. 해당 결과에서 구형체의 크기에 따라 핵산 나노구조체의 표면에 응집되는 양이 달라지고 그로인해 형광시그널의 크기가 변화한다는 것을 알 수 있다. 도 6e는 DOTAP 처리 전/후의 표면 전하 변화를 나타낸 것으로, DOTAP를 처리할 때 표면 전하가 음전하에서 양전하로 바뀌는 결과를 통해 DOTAP (양전하)으로 표면이 코팅되는 것을 확인할 수 있다.FIG. 6 shows fluorescence signal amplification and surface charge changes according to the size and size of the liposome-nucleic acid nano-fusion according to the present invention. Fluorescence intensity was measured using a fluorescence spectrophotometer (SpectraMax M5, Molecular Devices) and the change in surface charge was measured using a dynamic light scattering technique (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). FIG. 6A is a schematic view showing a manufacturing step of the present invention. In FIG. 6A, a nucleic acid nanostructure is attached to the surface of a silica nano-particle itself manufactured using a methanol / ethanol mixture of various fractions, Respectively. 6B and 6C show the size of silica spheres according to the mixing volume ratio of methanol and ethanol and images taken by using a scanning electron microscope (JEM-3010, JEOL). FIG. And the amount of the nucleic acid nanostructure and the fluorescence signal. From the results, it can be seen that the amount of aggregation on the surface of the nucleic acid nanostructure varies depending on the size of the spherical sphere, thereby changing the size of the fluorescence signal. FIG. 6E shows changes in surface charge before and after the DOTAP treatment. As a result of the surface charge being changed from negative to positive when DOTAP is treated, it is confirmed that the surface is coated with DOTAP (positive charge).

제조된 리포좀-핵산 나노융합체를 두가지 종류(MCF-7 및 SK-BR-3)의 유방암 세포주에 처리하여, 세포 내 전달이 잘 이루어지는지를 확인하였다. 도 7a에 나타낸 것과 같이, DOTAP가 존재할 때 보다 세포 내로 잘 전달된다는 것을 확인하였고, 최종 크기 70 nm 가량의 리포좀-핵산 나노융합체가 세포내로 가장 잘 전달되는 것으로 확인하였다.The prepared liposome-nucleic acid nano-fusion was treated with two types (MCF-7 and SK-BR-3) of breast cancer cell lines to confirm intracellular delivery. As shown in FIG. 7A, it was confirmed that DOTAP was more efficiently delivered into the cells than in the presence of DOTAP, and it was confirmed that the liposome-nucleic acid nano-fusion of about 70 nm in size was best delivered into the cells.

도 7b에서 확인할 수 있는 것과 같이, 유세포 분석 (MacsQuant VYB, Miltenyi Biotec)을 통해 확인한 결과 본 발명의 핵산 나노 구조체가 세포내로 전달될 때, 형광체가 동일한 비율로 나타나 세포 내로 핵산구조체가 동일한 비율로 전달될 수 있다는 것을 확인하였다.As can be seen from FIG. 7B, when the nucleic acid nanostructure of the present invention was transferred into the cells, the fluorescence was observed at the same rate, and the nucleic acid structure was transferred into the cells at the same rate, as confirmed by flow cytometry analysis (MacsQuant VYB, Miltenyi Biotec) .

실시간 세포내 다중 진단능을 확인하기 위해, 5종의 유방암 세포주(HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 및 SK-BR-3)를 대상으로 본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체를 처리한 후, 유세포 분석을 통해 얻어지는 결과를 현재 표준적으로 사용되고 있는 RT-PCR의 결과와 비교하였다. 모든 암세포는 24-well plate에서 배양되었으며, 1 x 105 개의 세포를 대상으로 0.5 mg의 리포좀-핵산 나노융합체가 처리되었다. 처리 후 37℃, 5% CO2 농도에서 2시간 동안 배양 후 세포를 추출하여 유세포 분석 측정하였다. RT-PCR의 경우, TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 측정되었으며, 동 업체에서 제공하는 miRNA 특이적 프라이머 키트를 구매하여 사용하였다(miR-21: Hs04231424_s1, miR-22: Hs00993773_g1). 대상 miRNA의 발현 정도를 본 발명에서 제시한 방식으로 얻어진 결과와 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과를 도 8a에서 비교하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 그 결과 사용된 다섯가지 종류의 암세포종 모두에서 RT-PCR에서 얻어진 결과와 본 발명에서 제시된 방식으로 얻어진 결과의 상대적 비율이 일치하는 것을 확인하였다.(HCC-1937, MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-231 and SK-BR-3) of the present invention were tested on five types of breast cancer cell lines After treatment of the nucleic acid nano-fusion, the results obtained by flow cytometry were compared with the results of RT-PCR, which is currently used as standard. All cancer cells were cultured in a 24-well plate and treated with 0.5 mg of liposome-nucleic acid nano-fusion at 1 × 10 5 cells. After the treatment, the cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 2 hours, and analyzed for flow cytometry. For the RT-PCR, miRNA-specific primer kit (miR-21: Hs04231424_s1, miR-22: Hs00993773_g1) was purchased and used by TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) . The degree of expression of the target miRNA was compared with the result obtained by the present invention method and the result confirmed by RT-PCR in FIG. 8A. The primer sequences used are shown in Table 2 below. As a result, it was confirmed that the relative proportions of the results obtained by the RT-PCR and the results obtained by the method of the present invention in all five kinds of cancer cell types used coincide with each other.

결과적으로 세포간 miR-21과 miR-22의 발현 양상 차이를 정량적으로 비교하는 것이 가능함을 확인하였고, 동일 세포주 내 세포간 차이에 관한 데이터를 얻는 것이 가능함을 확인하였다.As a result, it was confirmed that it is possible to quantitatively compare differences in the expression patterns of intercellular miR-21 and miR-22, and it was confirmed that it is possible to obtain data on intercellular differences in the same cell line.

실시예 4. 핵산 나노구조체 개발 및 대상 miRNA 검출능 확인Example 4. Development of nucleic acid nanostructure and confirmation of target miRNA detection ability

본 발명의 리포좀-핵산 나노융합체는 대상 miRNA와 특이적인 결합을 할 수 있는 Molecular beacon 구조와 나노구조체가 세포내로 전달되었을 때, 나노구조체 자체적인 정량화가 가능한 표지 형광인자로 구성된다는 것을 앞선 실시예를 통해서 확인하였다. 또한 합성된 리포좀-핵산 나노융합체의 구조적 안정성은 전기영동 기법과 분자동력학적 시뮬레이션을 통해 검증되었고, 대상 miRNA에 대한 특이적 검출능의 경우, 다양한 농도의 대상 miRNA의 혼합액과 다른 종류의 miRNA와의 비교 실험을 통해 miRNA 특이성 및 검출능이 유효한 것을 확인하였다. 구조적 안정성을 확인하기 위해 사용된 분자동력학적 시뮬레이션 프로그램은 프리웨어인 oxDNA를 사용하였다. oxDNA 시뮬레이션 상에서 본 발명에 사용된 동일한 염기서열을 갖는 핵산 가닥을 입력하고, 시간이 지남에 따라 내부 에너지가 안정적으로 유지되는 것을 도 4에서 확인하였다. 또한 검출능을 확인하기 위해 다양한 농도의 대상 miRNA를 핵산 나노구조체에 처리하고, 그로 인해 발생하는 형광시그널의 증대를 형광광도계 (SpectraMax M5, Molecular Devices)를 사용하여 측정하여 도 9a에 나타내었다. 핵산 나노구조체간 조립 과정 이후에도 대상 miRNA의 검출능에 변화가 없음을 확인하였고, 대상으로하는 miR-21과 miR-22를 다양한 농도로 혼합하고, 혼합액에서 대상으로하는 miRNA의 농도에만 의존적으로 형광시그널이 증가하는 것을 도 9b에서 확인하였다. 이와 같이 얻어진 형광시그널을 색깔로 변환하여 나타낸 결과는 도 9c와 같다.The liposome-nucleic acid nano-fusion of the present invention is composed of a molecular beacon structure capable of specific binding to the target miRNA and a labeling fluorescent substance capable of quantifying the nanostructure itself when the nanostructure is delivered into the cell. Respectively. The structural stability of the synthesized liposome-nucleic acid nano-fusions was also verified by electrophoresis and molecular dynamics simulation. In the case of the specific detection ability of the target miRNA, the comparison of the mixture of the target miRNAs with the different miRNAs Through experiments, we confirmed that miRNA specificity and detection ability were effective. The molecular dynamics simulation program used to check structural stability was oxDNA, a freeware. The nucleic acid strand having the same base sequence as used in the present invention was input into the oxDNA simulation, and it was confirmed in FIG. 4 that the internal energy stably maintained over time. In order to confirm the detection ability, target miRNAs of various concentrations were treated in a nucleic acid nanostructure, and the increase of the resulting fluorescence signal was measured using a fluorescence photometer (SpectraMax M5, Molecular Devices) and is shown in FIG. It was confirmed that there was no change in the detection ability of the target miRNA after the assembly of the nucleic acid nanostructures and the miR-21 and miR-22 were mixed at various concentrations and the fluorescence signal was dependent only on the miRNA concentration in the mixture. 9b. ≪ / RTI > The result of converting the thus obtained fluorescence signal into color is shown in Fig. 9C.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> FUSION NANO LIPOSOME-NUCLEIC ACID FOR QUANTITATIVE DIAGNOSIS OF MULTI RIBONUCLEIC ACID MARKER, METHOD FOR THEORETICAL STABILITY EVALUATION THEREOF, USES THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> MP17-005 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-a <400> 1 gcgagacagt tcttcaactg gcagcttctc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-b <400> 2 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-c <400> 3 agtctggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-a <400> 4 gcgagtcaac atcagtctga taagctactc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-b <400> 5 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-c <400> 6 gacttggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-22 target RNA <400> 7 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 target RNA <400> 8 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> FUSION NANO LIPOSOME-NUCLEIC ACID FOR QUANTITATIVE DIAGNOSIS OF          MULTI RIBONUCLEIC ACID MARKER, METHOD FOR THEORETICAL STABILITY          EVALUATION THEREOF, USES THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> MP17-005 <160> 8 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-a <400> 1 gcgagacagt tcttcaactg gcagcttctc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-b <400> 2 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc1-c <400> 3 agtctggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-a <400> 4 gcgagtcaac atcagtctga taagctactc gcaggctgat tcggttcatg cggatcca 58 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-b <400> 5 cttacggcga atgaccgaat cagcct 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fc2-c <400> 6 gacttggatc cgcatgacat tcgccgtaag 30 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-22 target RNA <400> 7 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 target RNA <400> 8 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (26)

고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체; 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체가 접합된 핵산 나노 구조체가 표면에 결합된 실리카 구형체를 리포솜 내부에 포함하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
A first nucleic acid construct in the form of a branch having an annular end; And a nucleic acid nano structure conjugated with a branched second nucleic acid structure having a cyclic terminal, wherein the nucleic acid nanostructure comprises a silica spherical body bound to the surface thereof in the interior of the liposome, wherein the liposome-nucleic acid nano-fused compound is used for diagnosing multiple ribonucleic acid marker determinations.
제1항에 있어서,
상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
Wherein the first nucleic acid construct is a form in which the linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 are bound in the Y-branch form, and the liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosing multiple ribonucleic acid marker determinations.
제1항에 있어서,
상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
Wherein the second nucleic acid construct is a form in which linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 6 are bound in a Y-branch form.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 2 or 3,
Wherein the linear nucleic acid further comprises a fluorescent substance at the 5 ' end of the liposome-nucleic acid nano-fusion.
제 2 항에 있어서,
상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
3. The method of claim 2,
Wherein the first nucleic acid construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA.
제 3 항에 있어서,
상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method of claim 3,
Wherein the second nucleic acid construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA.
제 1 항에 있어서,
상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
Wherein the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct are further labeled with a fluorescent substance and a light extinguishing agent.
제 1 항에 있어서,
상기 실리카 구형체는 50 nm 내지 80 nm인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
Wherein the silica spheres are 50 nm to 80 nm. The liposome-nucleic acid nano-fusions for diagnosing multiple ribonucleic acid marker quantitation are also provided.
제 1 항에 있어서,
상기 실리카 구형체는 핵산 나노 구조체가 표면에 결합되기 전에, 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차적으로 처리하여 표면개질된 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
Wherein the silica spheres are surface-modified by sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride before the nucleic acid nanostructure is bonded to the surface. Liposome-nucleic acid nano-fusion for marker detection.
제 1 항에 있어서,
상기 리포솜은 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
The method according to claim 1,
The liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosing multiple ribonucleic acid markers is characterized in that the liposome is composed of a cationic lipid.
제 10 항에 있어서,
상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체.
11. The method of claim 10,
Wherein the cationic lipid comprises DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and a cationic lipid comprising cholesterol as a constituent component.
제 1 항의 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체를 포함하는 생체 진단 이미징 시스템.
A biodiagnostic imaging system comprising the liposome-nucleic acid nano-fusion for diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation of claim 1.
제 12 항에 있어서,
상기 시스템은 세포 내 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는, 생체 진단 이미징 시스템.
13. The method of claim 12,
RTI ID = 0.0 &gt; 1, &lt; / RTI &gt; wherein said system measures intracellular fluorescence.
하기 단계를 포함하는 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법:
고리형 말단을 가지는 가지형태의 제1핵산구조체, 및 고리형 말단을 가지는 가지형태의 제2핵산구조체를 제조한 후, 리가아제 효소를 이용하여 서로 접합시켜 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계(S1);
용매에 실리케이트 용액을 첨가하여 실리카 나노입자체를 합성하는 단계(S2);
상기 S2 단계의 나노입자체에 아미노프로필 트리메톡시실란(Aminopropyl trimethoxysilane) 및 사이아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride)를 순차처리하는 단계(S3);
상기 S3 단계의 나노입자체와 S1 단계의 핵산 나노 구조체를 반응시켜 핵산 나노구조체를 제조하는 단계(S4);
상기 S4 단계의 핵산 나노구조체에 양이온성 지질을 첨가한 후 초음파 처리하여 리포좀-핵산 나노융합체를 제조하는 단계(S5).
A method for preparing a liposome-nucleic acid nano-fused product for diagnosing multiple ribonucleic acid marker quantitation comprising the steps of:
(S1) a nucleotide nano-structure is prepared by preparing a first nucleic acid construct having a branched end and a second nucleic acid construct having a branched end and having a cyclic terminal and ligating with each other using a ligase enzyme, ;
Adding a silicate solution to the solvent to synthesize the silica nano-particles themselves (S2);
(S3) sequentially treating aminopropyl trimethoxysilane and cyanuric chloride to the nano-particles themselves in step S2;
(S4) reacting the nanoparticles of step S3 and the nucleic acid nanostructure of step S1 to prepare a nucleic acid nanostructure;
(S5) a cationic lipid is added to the nucleic acid nanostructure of step S4 and then the liposome-nucleic acid nano-fusion is prepared by ultrasonication.
제 14 항에 있어서,
상기 제1핵산구조체는 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the first nucleic acid construct is a form in which the linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 3 are bound in the Y-branch form, and the method for producing the liposome-nucleic acid nano- .
제 14 항에 있어서,
상기 제2핵산구조체는 서열번호 4 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 선형핵산들이 Y자 가지형태로 결합한 형태인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the second nucleic acid construct is a form in which the linear nucleic acids selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 4 to 6 are bound in the Y-branch form, and a method for producing the liposome-nucleic acid nano- .
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 선형핵산은 5' 말단에 형광체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
17. The method according to claim 15 or 16,
Wherein the linear nucleic acid further comprises a fluorescent substance at the 5 'terminus. 2. The method for producing a liposome-nucleic acid nano-fusion according to claim 1,
제 15 항에 있어서,
상기 제1핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
16. The method of claim 15,
Wherein the first nucleic acid construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA.
제 16 항에 있어서,
상기 제2핵산구조체는 고리형 말단이 표적 RNA와 상보적 서열을 가지는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
17. The method of claim 16,
Wherein the second nucleic acid construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, wherein the cyclic terminus has a complementary sequence to the target RNA. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 8. &lt; / RTI &gt;
제 14 항에 있어서,
상기 제1핵산구조체 및 제2핵산구조체는 형광체 및 소광제가 추가로 표지된 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the first nucleic acid construct and the second nucleic acid construct are further labeled with a fluorophore and a light extinguishing agent.
제 14 항에 있어서,
상기 실리카 구형체는 50 nm 내지 80 nm인 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the silica spheres are 50 nm to 80 nm. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 8. &lt; / RTI &gt;
제 14 항에 있어서,
상기 양이온성 지질은 DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) 및 콜레스테롤을 구성 성분으로 하는 양이온성 지질로 이루어진 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the cationic lipid is composed of a cationic lipid comprising DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane) and cholesterol as a constituent component, and a liposome-nucleic acid nano- .
제 14 항에 있어서,
상기 S2 단계의 용매는 메탄올, 에탄올, 증류수, 및 암모니아수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the solvent in step S2 comprises methanol, ethanol, distilled water, and aqueous ammonia. 2. The method of claim 1, wherein the solvent is methanol, ethanol, distilled water, and ammonia water.
제 23 항에 있어서,
상기 메탄올 및 에탄올은 6 : 4 내지 8 : 2의 부피비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 제조방법.
24. The method of claim 23,
Wherein the methanol and ethanol are mixed in a volume ratio of 6: 4 to 8: 2. &Lt; Desc / Clms Page number 20 &gt;
제 1 항의 다중 리보핵산 마커 정량진단용 리포좀-핵산 나노융합체의 안정성을 이론적으로 평가하는 평가방법으로,
상기 방법은 나노융합체 내부에서 발생하는 수소결합 에너지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 평가방법.
The evaluation method for theoretically evaluating the stability of the liposome-nucleic acid nano-fused compound for diagnosis of multiple ribonucleic acid marker quantitation of claim 1,
Wherein the method comprises measuring hydrogen bonding energy generated within the nano fusions.
제 25 항에 있어서,
상기 측정은 35 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 평가방법.
26. The method of claim 25,
RTI ID = 0.0 &gt; 40 C, &lt; / RTI &gt;
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