KR20180095098A - 암 적응증에 대한 다중양식 치료 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 다중양식 요법과 관련된 조성물 및 방법을 포함한다. 본원에 기재된 다중양식 요법은 치료적 효익을 제공할 필요가 있는 대상체, 예를 들어, 암을 갖는 대상체에 치료적 이점을 제공하기 위해 협력 방식으로 작용하는 복수의 제제를 제공하고/하거나 투여한다.

Description

암 적응증에 대한 다중양식 치료 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법

관련 출원

본 출원은 2016년 1월 11일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/277130, 2016년 7월 7일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/359448, 2016년 8월 4일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/370915, 및 2016년 11월 11일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/420973에 대한 우선권을 주장하며, 상기 특허들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2017년 1월 5일에 생성된 상기 ASCII 카피는 R2081-7020WO_SL.txt로 명명되며, 24,800 바이트 크기이다.

적혈구는, 예를 들어, 독성 대사물을 분해하거나, 생체이물질(xenobiotics)을 비활성화시키기 위한 약물 전달 시스템으로서, 그리고 기타 생체의학 분야에 사용하기 위해 고려되어 왔다.

본 발명은 다중양식 치료와 관련된 조성물 및 방법을 포함한다. 치료는, 예를 들어, 암을 치료하는 데 유용하다. 본원에 기재된 다중양식 치료는 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 암을 갖는 대상체에 치료적 효익을 제공하기 위해 조화된 방식으로 작용하는 복수의 제제를 제공하고/하거나 투여한다. 일반적으로, 본원에 기재된 다중양식 치료는 조화된 방식(예를 들어, 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상적)으로 작용하는 복수의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는(예를 들어, 발현하거나 함유하는) 조작된 적혈구, 예를 들어, 제핵 적혈구의 제조물의 대상체로의 투여를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 복수의 제제, 예를 들어, 복수의 폴리펩티드(예를 들어, 외인성 폴리펩티드), 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드, 제2 외인성 폴리펩티드, 및 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 복수의 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 제공하며, 복수의 외인성 폴리펩티드의 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상 활성을 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 제공하며, 여기서

a) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 동일 표적에 대해 작용하며, 선택적으로 표적은 세포 표면 수용체 및/또는 내인성 인간 단백질이거나;

b) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 내인성 인간 단백질에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드는, 예를 들어, 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 또는 1 nM 미만의 Kd로 제2 내인성 인간 표적 단백질에 결합하거나;

c) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적은 동일한 생물학적 경로의 일원이고, 선택적으로 표적은 세포 표면 수용체, 내인성 인간 단백질, 또는 둘 모두이거나;

d) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 아폽토시스-촉진 폴리펩티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 아폽토시스-촉진 폴리펩티드, 예를 들어, TRAIL 수용체 리간드, 예를 들어, TRAIL 폴리펩티드를 포함하거나;

e) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 서로 근접하여 존재하고, 예를 들어, 적어도 1, 2, 5, 10, 30, 또는 60초; 1, 2, 5, 10, 30, 또는 60분, 또는 1, 2, 3, 6, 12, 또는 14시간의 기간 동안 10, 7, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.2, 또는 0.1 nm 미만 떨어져 있거나;

f) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 서로에 대해 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 또는 1 nM 미만의 Kd를 갖거나;

g) 제1 외인성 폴리펩티드는 항원-제시 폴리펩티드, 예를 들어, MHC 분자, 예를 들어, MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 항원, 예를 들어, 암 항원을 포함하거나;

h) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 상이한 표적에 대해 작용하고, 선택적으로 표적 중 적어도 하나는 세포 표면 수용체 및/또는 내인성 인간 단백질이고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 세포 유형, 예를 들어, 암세포에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 세포 유형, 예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 결합하거나;

i) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드는 중량 또는 카피 수를 기준으로 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 약 100:1 내지 1:100의 존재비를 갖거나;

j) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드는 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 약 100:1 내지 1:100의 비로 제1 표적 및 제2 표적 각각에 대한 Kd를 갖거나;

k) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대한 제1 활성(예를 들어, 결합)을 갖고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대한 제2 활성(예를 들어, 결합)을 갖고, 예를 들어, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 단일 표적에 결합하거나;

l) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적은 동일 경로의 일부이고, 선택적으로 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용하고, 동시에 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용하거나;

m) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적은 상이한 경로의 일부이고, 선택적으로 제1 및 제2 경로 둘 모두는 제공된 세포 반응을 촉진하도록 작용하거나;

n) 제1 외인성 폴리펩티드는 원하는 부위, 예를 들어, 인간 세포로 제핵 적혈구를 국소화시키고, 제2 외인성 폴리펩티드는 치료 활성, 예를 들어, 면역조절 활성, 예를 들어, T 세포 활성화 활성 또는 항원 제시 활성을 갖거나(예를 들어, 암 백신을 위함);

o) 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적, 예를 들어, 제1 세포, 예를 들어, 제1 세포 유형, 예를 들어, 암세포에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적, 예를 들어, 제2 세포, 예를 들어, 제2 세포 유형, 예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 결합하거나;

p) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드는 비-인간 단백질이거나;

q) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드 둘 모두는 효소, 예를 들어, 생합성 효소이거나;

r) 제1 외인성 폴리펩티드는 중간체 분자의 형성을 촉진하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 중간체 분자에 대해 작용하거나;

s) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드는 경로의 연속적 단계에 대해 작용한다.

본원의 양태 중 임의의 양태, 예를 들어, 상기 양태는 본원의 구현예들 중 하나 이상, 예를 들어, 하기 구현예들을 특징으로 할 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 상승작용적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 부가적 활성을 갖는다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 근접-의존성 활성을 갖는다. 표적 모이어티 또는 모이어티들과의 상호작용 전, 상호작용 동안, 또는 상호작용 후 복수의 폴리펩티드 사이의 근접은 생체 내 또는 시험관 내에서 상기 근접의 부재하에서 관찰되지 않는 특성 또는 결과를 제공할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적 모이어티, 예를 들어, 표적 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포) 상의 제1 표적 세포 폴리펩티드와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적 모이어티, 예를 들어, 표적 세포 상의 제2 표적 세포 폴리펩티드와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합한다(예를 들어, 제1 및 제2 표적 세포 폴리펩티드의 결합은 표적 세포의 생물학적 특성을 변경시킨다). 구현예에서, 제1 및 제2 표적은 표적 세포 상의 다합체 복합체의 서브유닛이다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 적혈구와 표적 세포의 융합을 촉진하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 임의의 표의 폴리펩티드(예를 들어, 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4 중 임의의 표의 인간 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드)이다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 서로 상호작용하고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드는, 예를 들어, 절단 또는 인산화에 의해 제2 외인성 폴리펩티드를 변형시키거나, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 이량체 또는 다합체 단백질을 형성한다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 구현예에서, 상이한 외인성 폴리펩티드의 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 또는 전부는 서로에 대해 미리 선택된 수준의 상동성, 예를 들어, 서로에 대해 적어도 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는다. 구현예에서, 상이한 외인성 폴리펩티드 중 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개), 또는 전부는 참조 서열과 미리 선택된 수준의 상동성, 예를 들어, 참조 서열(참조 서열은 전체 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부, 예를 들어, 미리 선택된 도메인을 포함함)과 적어도 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 상이한 외인성 폴리펩티드 중 복수 또는 전부는 항체 또는 항체 분자이다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 항체 서열 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 참조 서열은 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부, 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편, 중쇄 가변 영역 또는 이의 일부, 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 또는 상기의 임의의 조합물을 포함한다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 적어도 2개, 그러나 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 상이한 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 제핵 적혈구에 의해 보유되지 않은 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 외인성 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 제핵 적혈구에 의해 보유되지 않은 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 인코딩된다.

일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 선택적으로 제3 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2개 또는 3개)은 막횡단 폴리펩티드 또는 표면-고정 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 표적 세포 상의 모이어티와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적 세포의 특성을 변경시키고, 예를 들어, 표적 세포를 사멸시키거나, 활성화시킨다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드는 중량 또는 카피 수를 기준으로 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 또는 약 100:1 내지 1:100의 존재비를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 모두는 화학량론적 작용 방식을 갖거나, 둘 모두는 촉매 작용 방식을 갖거나, 둘 모두는 유사한 존재비, 예를 들어, 1:1 또는 약 2:1 내지 1:2로 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 중량 또는 카피 수를 기준으로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100배(선택적으로, 최대 10배 또는 100배)만큼 제2 외인성 폴리펩티드보다 더 풍부하다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 중량 또는 카피 수를 기준으로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100배(선택적으로, 최대 10배 또는 100배)만큼 제1 외인성 폴리펩티드보다 더 풍부하다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 화학량론적 작용 방식을 갖고, 제2 폴리펩티드는 촉매 작용 방식을 갖고, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 더 풍부하다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 화학량론적 작용 방식을 갖고, 제1 폴리펩티드는 촉매 작용 방식을 갖고, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 더 풍부하다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 표적화 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:

a) 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성;

b) 약 10 내지 200 fL의 세포 부피 또는 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론, 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론의 세포 직경;

c) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈; 또는 적어도 약 20, 25, 또는 30 pg/세포의 헤모글로빈; 또는

d) 아넥신 V(Annexin V) 염색에 의해 측정시 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만인 외엽의 포스파티딜세린 함량.

일부 구현예에서, 복수의 외인성 폴리펩티드 중 적어도 하나, 예를 들어, 전부는 당화된다. 일부 구현예에서, 복수의 외인성 폴리펩티드 중 적어도 하나, 예를 들어, 전부는 인산화된다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 그물적혈구이다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들은 소르타제 전달 기호(sortase transfer signature)(즉, 소르타제 반응에 의해 생성될 수 있는 서열), 예를 들어, LPXTG(SEQ ID NO:17)가 결여되어 있다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암, 예를 들어, 본원에 기재된 암이다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 제1 및 제2 세포 표면 모이어티, 예를 들어, 막횡단 수용체를 근접시키는 것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티, 예를 들어, 막횡단 수용체를 근접시키는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 제공하는 단계를 포함하는 복수의 근접-의존성 분자를 전달하거나, 제시하거나, 발현시키는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구를 생성하고, 적혈구 전구체와 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 접촉시키고, 세포를 제핵이 발생하도록 하는 조건하에 배치하는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 복수의 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구, 예를 들어, 적어도 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 세포를 포함하는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 조작된 적혈구(RBC), 예를 들어, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구, 및 표적 세포의 세포 복합체, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 복합체를 제공하며, 복합체는 외인성 폴리펩티드 중 하나에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 세포 복합체는 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 복합체는 조작된 RBC 이외에 적어도 2개의 세포 유형, 예를 들어, 암세포 및 면역 효과기 세포를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 조작된 RBC, 예를 들어, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구, 및 본원에 기재된 다중양식 쌍을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 반응 혼합물을 증명한다. 일부 구현예에서, 핵산은 적혈구에서 활성인 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 본원(예를 들어, 표 1, 표 2, 및 표 3)에 기재된 적어도 2개의 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 제3 외인성 폴리펩티드를 인코딩한다.

일부 양태에서, 본 개시는 표적 세포 또는 대상체에 대한 정보를 제공하고, 예를 들어, 수신하는 단계, 상기 정보에 반응하여 복수의 외인성 폴리펩티드를 선택하는 단계, 및 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 RBC 또는 RBC 전구체에 도입하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 조작된 RBC(예를 들어, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구)를 제조하는 방법을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 후보 적혈구 세포, 예를 들어, RBC를 제공하는 단계, 및 복수의 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드의 다중양식 쌍을 인코딩하는 핵산이 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 조작된 적혈구 세포, 예를 들어, RBC(예를 들어, 제핵 RBC, 예를 들어, 그물적혈구)를 평가하는 방법을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 후보 적혈구, 예를 들어, RBC를 제공하는 단계, 및, 예를 들어, 단백질 검출에 의해 복수의 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드의 다중양식 쌍이 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 조작된 적혈구, 예를 들어, RBC(예를 들어, 제핵 RBC, 예를 들어, 그물적혈구)를 평가하는 방법을 포함한다.

본 발명의 개시는 일부 양태에서 표적과 상호작용하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하고, 하기 중 하나 이상에 해당하는 제핵 적혈구 세포를 제공한다:

(a) 제2 외인성 폴리펩티드는 항체를 절단하는 모이어티, 예를 들어, 힌지 영역, CH2 영역, 또는 힌지와 CH2 영역 사이를 절단하는 모이어티, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드를 포함하거나;

(b) 제2 외인성 폴리펩티드는 표적 상의 부위를 변형시키고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 특이적이고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 결합하거나, 표적에 결합하고(예를 들어, 특이적으로 결합하고), 표적을 변형시키고, 예를 들어, 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 표적에 대한 모이어티를 제거하거나, 표적에 모이어티를 부착하는 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하거나;

(c) 제2 외인성 폴리펩티드는 표적의 2차, 3차 또는 4차 구조를 변형시키고, 구현예들에서 또 다른 분자, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드 또는 제1 외인성 폴리펩티드가 아닌 분자와 상호작용하는 표적의 능력을 변경시키고, 예를 들어, 감소시키거나 증가시키는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소, 예를 들어, 프로테아제를 포함하고, 선택적으로 표적은 항체, 또는 보체 인자를 포함하거나;

(d) 제2 외인성 폴리펩티드는 표적, 예를 들어, 제1 표적 도메인과 제2 표적 도메인, 예를 들어, 제1 기질에 결합하는 제1 표적 도메인과 제2 기질에 결합하는 제2 표적 도메인 사이의 폴리펩티드를 절단하는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하거나;

(e) 표적은 폴리펩티드, 탄수화물(예를 들어, 글리칸), 지질(예를 들어, 인지질), 또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이거나;

(f) 제1 외인성 폴리펩티드는 표적, 예를 들어, 항체에 결합하나, 절단하지 않고, 제2 외인성 폴리펩티드는 결합, 예를 들어, 공유 결합, 예를 들어, 항체 내의 공유 결합을 절단하거나;

(g) 표적은 항체(예를 들어, 항-약물 항체)를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드는 항체 표적의 가변 영역에 결합하거나;

(h) 표적은 항체(예를 들어, 항-약물 항체)를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드는 항체 표적의 불변 영역에 결합하거나;

(i) 제1 외인성 폴리펩티드는 약 1 내지 2 pM, 2 내지 5 pM, 5 내지 10 pM, 10 내지 20 pM, 20 내지 50 pM, 50 내지 100 pM, 100 내지 200 pM, 200 내지 500 pM, 500 내지 1000 pM, 1 내지 2 nM, 2 내지 5 nM, 5 내지 10 nM, 10 내지 20 nM, 20 내지 50 nM, 50 내지 100 nM, 100 내지 200 nM, 200 내지 500 nM, 500 내지 1000 nM, 1 내지 2 μM, 2 내지 5 μM, 5 내지 10 μM, 10 내지 20 μM, 20 내지 50 μM, 또는 50 내지 100 μM의 표적에 대한 친화성을 갖거나;

(j) 제2 외인성 폴리펩티드는 약 10^-1 내지 10^-7 M, 10^-1 내지 10^-2 M, 10^-2 내지 10^-3 M, 10^-3 내지 10^-4 M, 10^-4 내지 10^-5 M, 10^-5 내지 10^-6 M, 또는 10^-6 내지 10^-7 M의 표적에 대한 K_M을 갖거나;

(k) 표적에 대한 제2 외인성 폴리펩티드의 K_M(M으로 측정됨)에 의해 나누어진 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 K_d(M으로 측정됨)의 비는 약 1x10^-9 내지 2x10^-9, 2x10^-9 내지 5x10^-9, 5x10^-9 내지 1x10^-8, 1x10^-8 내지 2x10^-8, 2x10^-8 내지 5x10^-8, 5x10^-8 내지 1x10^-7, 1x10^-7 내지 2x10^-7, 2x10^-7 내지 5x10^-7, 5x10^-7 내지 1x10^-6, 1x10^-6 내지 2x10^-6, 2x10^-6 내지 5x10^-6, 5x10^-6 내지 1x10^-5, 1x10^-5 내지 2x10^-5, 2x10^-5 내지 5x10^-5, 5x10^-5 내지 1x10^-4, 1x10^-4 내지 2x10^-4, 2x10^-4 내지 5x10^-4, 5x10^-4 내지 1x10^-3, 1x10^-3 내지 2x10^-3, 2x10^-3 내지 5x10^-3, 5x10^-3 내지 1x10^-2, 1x10^-2 내지 2x10^-2, 2x10^-2 내지 5x10^-2, 5x10^-2 내지 1x10^-1, 1x10^-1 내지 2x10^-1, 2x10^-1 내지 5x10^-1, 또는 5x10^-1 내지 1이거나;

(l) 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드의 관찰된 반응 속도는 유사하지만 달리 유사한 반응 조건하에서 제1 외인성 폴리펩티드가 결여된 제핵 세포의 반응 속도보다 크거나;

(m) 적혈구 세포 상의 제1 외인성 폴리펩티드의 평균 수 대 적혈구 세포 상의 제2 외인성 폴리펩티드의 평균 수의 비는 약 50:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 또는 1:50이거나;

(n) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성은 변형된(예를 들어, 절단된) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성보다 크거나;

(o) 제핵 적혈구 세포의 치료적 유효 용량은 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 양에 대한 화학량론보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);

(p) 유효 용량 내의 제핵 적혈구 세포의 수는 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적, 예를 들어, 표적 분자의 수보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);

(q) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 유효 용량, 또는 제핵 적혈구 세포의 시험관 내 유효량에 포함된 제2 외인성 폴리펩티드의 수는 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(r) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 유효 용량, 또는 제핵 적혈구 세포의 시험관 내 유효량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수는 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(s) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 유효 용량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수 및 제2 외인성 폴리펩티드의 수는 각각 표적에 대한 참조 값보다 적고, 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(t) 제2 외인성 폴리펩티드는 적어도 10^-1 M, 10^-2 M, 10^-3 M, 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 또는 10^-7 M의 K_M으로 표적을 변형(예를 들어, 절단)시키거나;

(u) 제2 외인성 폴리펩티드는 샤페론을 포함하거나;

(v) 제1 외인성 폴리펩티드는 표면-노출된 부분을 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 표면 노출된 부분을 포함하거나;

(w) 제핵 적혈구 세포의 유효량은 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구 세포의 유효량보다 적다(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적다).

구현예들에서, (b) 제2 외인성 폴리펩티드는 표적 상의 부위를 변형시키고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 특이적이고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 결합하거나, 표적에 결합하고(예를 들어, 특이적으로 결합하고), 표적을 변형시키고, 예를 들어, 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 표적에 대한 모이어티를 제거하거나, 표적에 모이어티를 부착하는 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하고, 표적은 선택적으로 항체, 예를 들어, 항-약물 항체이다. 구현예들에서, 변형은 또 다른 분자, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드 또는 제1 외인성 폴리펩티드가 아닌 분자와 상호작용하는 표적의 능력을 변경시키고, 예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다.

구현예들에서, (d) 제2 외인성 폴리펩티드는 표적, 예를 들어, 제1 표적 도메인과 제2 표적 도메인, 예를 들어, 제1 기질에 결합하는 제1 표적 도메인과 제2 기질에 결합하는 제2 표적 도메인 사이의 폴리펩티드를 절단하는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함한다. 구현예들에서, 제1 표적 도메인은 제2 표적 도메인으로부터 방출된다. 구현예들에서, 절단은 제1 기질에 대한 제1 표적 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 친화성 및 제2 기질에 대한 제2 표적 도메인의 친화성을 변경시킨다. 구현예에서, 표적은 항체를 포함하고, 제1 표적 도메인은 하나 이상의 CDR을 포함하고, 제2 표적 도메인은 불변 영역, 예를 들어, Fc 영역의 일부를 포함한다.

구현예들에서, (a) 내지 (w) 중 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (e)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (i)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (j)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (m)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (q)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (a) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (i)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (j)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (m)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (q)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (e) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (i) 및 (j)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (i) 및 (m)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (i) 및 (q)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (i) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (i) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (j) 및 (m)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (j) 및 (q)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (j) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (j) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (m) 및 (q)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (m) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (m) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (q) 및 (r)이 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (q) 및 (s)가 존재한다. 구현예들에서, 적어도 (r) 및 (s)가 존재한다.

구현예들에서, 적어도,

(a) 및 (b), (a) 및 (c), (a) 및 (d), (a) 및 (e), (a) 및 (f), (a) 및 (g), (a) 및 (h), (a) 및 (i), (a) 및 (j), (a) 및 (k), (a) 및 (l), (a) 및 (m), (a) 및 (n), (a) 및 (o), (a) 및 (p), (a) 및 (q), (a) 및 (r), (a) 및 (s), (a) 및 (t), (a) 및 (u), (a) 및 (v), (a) 및 (w),

(b) 및 (c), (b) 및 (d), (b) 및 (e), (b) 및 (f), (b) 및 (g), (b) 및 (h), (b) 및 (i), (b) 및 (j), (b) 및 (k), (b) 및 (l), (b) 및 (m), (b) 및 (n), (b) 및 (o), (b) 및 (p), (b) 및 (q), (b) 및 (r), (b) 및 (s), (b) 및 (t), (b) 및 (u), (b) 및 (v), (b) 및 (w),

(c) 및 (d), (c) 및 (e), (c) 및 (f), (c) 및 (g), (c) 및 (h), (c) 및 (i), (c) 및 (j), (c) 및 (k), (c) 및 (l), (c) 및 (m), (c) 및 (n), (c) 및 (o), (c) 및 (p), (c) 및 (q), (c) 및 (r), (c) 및 (s), (c) 및 (t), (c) 및 (u), (c) 및 (v), (c) 및 (w),

(d) 및 (e), (d) 및 (f), (d) 및 (g), (d) 및 (h), (d) 및 (i), (d) 및 (j), (d) 및 (k), (d) 및 (l), (d) 및 (m), (d) 및 (n), (d) 및 (o), (d) 및 (p), (d) 및 (q), (d) 및 (r), (d) 및 (s), (d) 및 (t), (d) 및 (u), (d) 및 (v), (d) 및 (w),

(e) 및 (f), (e) 및 (g), (e) 및 (h), (e) 및 (i), (e) 및 (j), (e) 및 (k), (e) 및 (l), (e) 및 (m), (e) 및 (n), (e) 및 (o), (e) 및 (p), (e) 및 (q), (e) 및 (r), (e) 및 (s), (e) 및 (t), (e) 및 (u), (e) 및 (v), (e) 및 (w),

(f) 및 (g), (f) 및 (h), (f) 및 (i), (f) 및 (j), (f) 및 (k), (f) 및 (l), (f) 및 (m), (f) 및 (n), (f) 및 (o), (f) 및 (p), (f) 및 (q), (f) 및 (r), (f) 및 (s), (f) 및 (t), (f) 및 (u), (f) 및 (v), (f) 및 (w),

(g) 및 (h), (g) 및 (i), (g) 및 (j), (g) 및 (k), (g) 및 (l), (g) 및 (m), (g) 및 (n), (g) 및 (o), (g) 및 (p), (g) 및 (q), (g) 및 (r), (g) 및 (s), (g) 및 (t), (g) 및 (u), (g) 및 (v), (g) 및 (w),

(h) 및 (i), (h) 및 (j), (h) 및 (k), (h) 및 (l), (h) 및 (m), (h) 및 (n), (h) 및 (o), (h) 및 (p), (h) 및 (q), (h) 및 (r), (h) 및 (s), (h) 및 (t), (h) 및 (u), (h) 및 (v), (h) 및 (w),

(i) 및 (j), (i) 및 (k), (i) 및 (l), (i) 및 (m), (i) 및 (n), (i) 및 (o), (i) 및 (p), (i) 및 (q), (i) 및 (r), (i) 및 (s), (i) 및 (t), (i) 및 (u), (i) 및 (v), (i) 및 (w),

(j) 및 (k), (j) 및 (l), (j) 및 (m), (j) 및 (n), (j) 및 (o), (j) 및 (p), (j) 및 (q), (j) 및 (r), (j) 및 (s), (j) 및 (t), (j) 및 (u), (j) 및 (v), (j) 및 (w),

(k) 및 (l), (k) 및 (m), (k) 및 (n), (k) 및 (o), (k) 및 (p), (k) 및 (q), (k) 및 (r), (k) 및 (s), (k) 및 (t), (k) 및 (u), (k) 및 (v), (k) 및 (w),

(l) 및 (m), (l) 및 (n), (l) 및 (o), (l) 및 (p), (l) 및 (q), (l) 및 (r), (l) 및 (s), (l) 및 (t), (l) 및 (u), (l) 및 (v), (l) 및 (w),

(m) 및 (n), (m) 및 (o), (m) 및 (p), (m) 및 (q), (m) 및 (r), (m) 및 (s), (m) 및 (t), (m) 및 (u), (m) 및 (v), (m) 및 (w),

(n) 및 (o), (n) 및 (p), (n) 및 (q), (n) 및 (r), (n) 및 (s), (n) 및 (t), (n) 및 (u), (n) 및 (v), (n) 및 (w),

(o) 및 (p), (o) 및 (q), (o) 및 (r), (o) 및 (s), (o) 및 (t), (o) 및 (u), (o) 및 (v), (o) 및 (w),

(p) 및 (q), (p) 및 (r), (p) 및 (s), (p) 및 (t), (p) 및 (u), (p) 및 (v), (p) 및 (w),

(q) 및 (r), (q) 및 (s), (q) 및 (t), (q) 및 (u), (q) 및 (v), (q) 및 (w),

(r) 및 (s), (r) 및 (t), (r) 및 (u), (r) 및 (v), (r) 및 (w),

(s) 및 (t), (s) 및 (u), (s) 및 (v), (s) 및 (w),

(t 및 (u), (t) 및 (v), (t) 및 (w),

(u) 및 (v), (u) 및 (w), 또는

(v) 및 (w)가 존재한다.

구현예들에서, 표적은 감염성 성분 이외의 것, 예를 들어, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 진균 성분, 또는 기생충 성분 이외의 것이다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 표적-결합 도메인을 포함한다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분은 표적에 결합한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분은 효소 활성, 예를 들어, 프로테아제 활성을 포함한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분은 표적을 효소적으로 변형시키고, 예를 들어, 절단한다. 구현예들에서, 표적은 항-약물 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드는 항-약물 항체가 결합하는 폴리펩티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 항-약물 항체를 절단하여 Fab 부분 및 Fc 부분을 생성하는 프로테아제를 포함한다. 구현예들에서, 제핵 적혈구는 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구보다 신속한 속도로 대상체의 신체로부터 표적을 청소할 수 있다. 구현예들에서, 제핵 적혈구는, 예를 들어, 절단 동안 표적 또는 표적에 대해 작용하는 제2 외인성 단백질의 반응 생성물과 복합체화된다.

본 발명의 개시는 또한 특정 양태에서 막횡단 도메인 및 항-약물 항체에 결합할 수 있는 표면-노출된 폴리펩티드를 포함하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및 막횡단 도메인 및 표면-노출된 IdeS 폴리펩티드를 포함하는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구 세포를 제공한다.

본 발명의 개시는 또한 일부 양태에서 항체를 절단할 수 있는 프로테아제, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드, 및 막 고정 도메인, 예를 들어, 막횡단 도메인, 예를 들어, 타입 I 또는 타입 II 적혈구 막횡단 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 개시는 또한 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 개시는 또한 일부 양태에서 항체를 절단할 수 있는 프로테아제, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 서열, 막 고정 도메인, 예를 들어, 막횡단 도메인을 인코딩하는 제2 서열(여기서, 제1 및 제2 서열은 작동 가능하게 연결되어 융합 단백질을 형성함); 및 선택적으로, 적혈구 세포에서 활성인 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 개시는 또한 일부 양태에서 표적과 상호작용하는 제1 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 제1 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 제2 핵산 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 제2 핵산 서열, 및 선택적으로, 적혈구 세포에서 활성인 프로모터 서열을 포함하는 핵산 조성물을 제공한다.

구현예들에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 연속적이거나, 별도의 분자(예를 들어, 혼합된 분자 또는 별도의 용기 내의 분자)이다. 구현예들에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 동일한 오픈 리딩 프레임의 일부이며, 그 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 구현예들에서, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명의 개시는 일부 양태에서 하기를 포함하는 키트를 제공한다:

(A) 막 고정 도메인, 예를 들어, 막횡단 도메인 (A-ii)에 융합된 복수의 결합 모이어티(예를 들어, 항체 분자, 예를 들어, scFv 도메인)(A-i)를 인코딩하는 핵산(여기서, (A-i) 및 (A-ii)는 적혈구 세포에서 발현을 유도하는 핵산에 작동 가능하게 연결됨); 및

(B) 막 고정 도메인, 예를 들어, 막횡단 도메인 (B-ii)에 선택적으로 융합된 복수의 효소(예를 들어, 프로테아제)(B-i)를 인코딩하는 핵산(여기서, (B-i) 및 (B-ii)는 적혈구 세포에서 발현을 유도하는 핵산에 작동 가능하게 연결됨).

본 발명의 개시는 일부 양태에서 표적 폴리펩티드와 본원에 기재된 적혈구 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적, 예를 들어, 표적 폴리펩티드의 단편을 제조하는 방법, 예를 들어, 제1 표적 도메인을 포함하는 표적의 단편을 제조하는 방법, 예를 들어, 가변 영역 단편을 제조하는 방법, 또는 불변 영역 함유 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적을 절단하여 단편을 제공한다. 구현예들에서, 표적 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체이다. 구현예들에서, 표적 폴리펩티드의 단편은 면역 반응 및/또는 염증을 활성화시키지 않는다. 구현예들에서, 접촉은 표적 폴리펩티드를 포함하는 대상체에 적혈구 세포를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 개시는 또한 특정 양태에서, 예를 들어, 억제제(표적)의 전구체와 본원에 기재된 적혈구 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 억제제, 예를 들어, 경쟁적 억제제를 제조하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적과 상호작용하고, 예를 들어, 표적을 절단한다. 구현예들에서, 억제제는 항체 단편(예를 들어, Fab 단편)이다. 구현예들에서, 표적은 절단되어 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편인 억제제를 생성하는 항체이다. 구현예들에서, 억제제는 면역 반응 및/또는 염증을 활성화시키지 않는다. 구현예들에서, 억제제의 전구체는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체이다. 구현예들에서, 접촉은 억제제의 전구체를 포함하는 대상체에 적혈구 세포를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 개시는 또한 일부 양태에서 폴리펩티드와 본원에 기재된 적혈구 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 표적, 예를 들어, 폴리펩티드를 전환하거나 활성화시키고, 예를 들어, 프로드러그를 약물로 전환하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적(예를 들어, 프로드러그)과 상호작용하고, 예를 들어, 표적을 절단한다. 구현예들에서, 프로드러그는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체이다. 구현예들에서, 약물은 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편이다. 구현예들에서, 약물은 면역 반응 및/또는 염증을 활성화시키지 않는다. 구현예들에서, 접촉은 폴리펩티드, 예를 들어, 프로드러그를 포함하는 대상체에 적혈구 세포를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 개시는 또한 일부 양태에서 내인성 폴리펩티드와 본원에 기재된 적혈구 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 내인성 폴리펩티드를 제1 활성 상태로부터 제2 활성 상태로(예를 들어, 비활성 상태로부터 활성 상태로 또는 활성 상태로부터 비활성 상태로) 전환하는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적과 상호작용하고, 예를 들어, 표적을 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 또 다른 분자와 상호작용하고, 예를 들어, 또 다른 분자에 결합하는 이의 능력을 변경시킨다. 구현예들에서, 내인성 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체이다. 구현예들에서, 접촉은 내인성 폴리펩티드를 포함하는 대상체에 적혈구 세포를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 개시는 일부 양태에서 대상체에 본원에 기재된 적혈구 세포를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 표적(예를 들어, 항체, 예를 들어, 항-약물 항체)의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적과 상호작용하고, 예를 들어, 표적을 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 또 다른 분자와 상호작용하고, 예를 들어, 또 다른 분자에 결합하는 이의 능력을 변경시킨다. 본 발명의 개시는 또한 특정 양태에서 대상체에 본원에 기재된 적혈구 세포를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 항체의 억제 단편(예를 들어, Fab 단편)을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개시는 또한 대상체에 본원에 기재된 적혈구 세포를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질병, 예를 들어, 암을 치료하는 방법을 제공한다.

구현예들, 예를 들어, 상기 기재된 방법 중 임의의 방법의 구현예들에서, 적혈구 세포는 표적과 상호작용하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하고,

(a) 제2 외인성 폴리펩티드가 항체를 절단하는 모이어티, 예를 들어, 힌지 영역, CH2 영역, 또는 힌지와 CH2 영역 사이를 절단하는 모이어티, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드를 포함하거나;

(b) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적 상의 부위를 변형시키고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 특이적이고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 결합하거나, 표적에 결합하고(예를 들어, 특이적으로 결합하고), 표적을 변형시키고, 예를 들어, 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 표적에 대한 모이어티를 제거하거나, 표적에 모이어티를 부착하는 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하고, 표적이 선택적으로 항체이거나;

(c) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적의 2차, 3차 또는 4차 구조를 변형시키고, 구현예들에서 또 다른 분자, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드 또는 제1 외인성 폴리펩티드가 아닌 분자와 상호작용하는 표적의 능력을 변경시키고, 예를 들어, 감소시키거나 증가시키는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소, 예를 들어, 프로테아제를 포함하고, 선택적으로 표적이 항체, 또는 보체 인자를 포함하거나;

(d) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적, 예를 들어, 제1 표적 도메인과 제2 표적 도메인, 예를 들어, 제1 기질에 결합하는 제1 표적 도메인과 제2 기질에 결합하는 제2 표적 도메인 사이의 폴리펩티드를 절단하는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하거나;

(e) 표적이 폴리펩티드, 탄수화물(예를 들어, 글리칸), 지질(예를 들어, 인지질), 또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이거나;

(f) 제1 외인성 폴리펩티드가 표적, 예를 들어, 항체에 결합하나, 절단하지 않고, 제2 외인성 폴리펩티드가 결합, 예를 들어, 공유 결합, 예를 들어, 항체 내의 공유 결합을 절단하거나;

(g) 표적이 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드가 항체 표적의 가변 영역에 결합하거나;

(h) 표적이 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드가 항체 표적의 불변 영역에 결합하거나;

(i) 제1 외인성 폴리펩티드가 약 1 내지 2 pM, 2 내지 5 pM, 5 내지 10 pM, 10 내지 20 pM, 20 내지 50 pM, 50 내지 100 pM, 100 내지 200 pM, 200 내지 500 pM, 500 내지 1000 pM, 1 내지 2 nM, 2 내지 5 nM, 5 내지 10 nM, 10 내지 20 nM, 20 내지 50 nM, 50 내지 100 nM, 100 내지 200 nM, 200 내지 500 nM, 500 내지 1000 nM, 1 내지 2 μM, 2 내지 5 μM, 5 내지 10 μM, 10 내지 20 μM, 20 내지 50 μM, 또는 50 내지 100 μM의 표적에 대한 친화성을 갖거나;

(j) 제2 외인성 폴리펩티드가 약 10^-1 내지 10^-7 M, 10^-1 내지 10^-2 M, 10^-2 내지 10^-3 M, 10^-3 내지 10^-4 M, 10^-4 내지 10^-5 M, 10^-5 내지 10^-6 M, 또는 10^-6 내지 10^-7 M의 표적에 대한 K_M을 갖거나;

(k) 표적에 대한 제2 외인성 폴리펩티드의 K_M(M으로 측정됨)에 의해 나누어진 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 K_d(M으로 측정됨)의 비가 약 1x10^-9 내지 2x10^-9, 2x10^-9 내지 5x10^-9, 5x10^-9 내지 1x10^-8, 1x10^-8 내지 2x10^-8, 2x10^-8 내지 5x10^-8, 5x10^-8 내지 1x10^-7, 1x10^-7 내지 2x10^-7, 2x10^-7 내지 5x10^-7, 5x10^-7 내지 1x10^-6, 1x10^-6 내지 2x10^-6, 2x10^-6 내지 5x10^-6, 5x10^-6 내지 1x10^-5, 1x10^-5 내지 2x10^-5, 2x10^-5 내지 5x10^-5, 5x10^-5 내지 1x10^-4, 1x10^-4 내지 2x10^-4, 2x10^-4 내지 5x10^-4, 5x10^-4 내지 1x10^-3, 1x10^-3 내지 2x10^-3, 2x10^-3 내지 5x10^-3, 5x10^-3 내지 1x10^-2, 1x10^-2 내지 2x10^-2, 2x10^-2 내지 5x10^-2, 5x10^-2 내지 1x10^-1, 1x10^-1 내지 2x10^-1, 2x10^-1 내지 5x10^-1, 또는 5x10^-1 내지 1이거나;

(l) 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드의 관찰된 반응 속도가, 유사하지만 달리 유사한 반응 조건하에서 제1 외인성 폴리펩티드가 결여된 제핵 세포의 반응 속도보다 크거나;

(m) 적혈구 세포 상의 제1 외인성 폴리펩티드의 평균 수 대 적혈구 세포 상의 제2 외인성 폴리펩티드의 평균 수의 비가 약 50:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 또는 1:50이거나;

(n) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성이 변형된(예를 들어, 절단된) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성보다 크거나;

(o) 제핵 적혈구 세포의 치료적 유효 용량이 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 양에 대한 화학량론보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);

(p) 유효 용량 내의 제핵 적혈구 세포의 수가 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적, 예를 들어, 표적 분자의 수보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);

(q) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 유효 용량에 포함된 제2 외인성 폴리펩티드의 수가 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(r) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 유효 용량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수가 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(s) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 유효 용량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수 및 제2 외인성 폴리펩티드의 수가 각각 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;

(t) 제2 외인성 폴리펩티드가 적어도 10^-1 M, 10^-2 M, 10^-3 M, 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 또는 10^-7 M의 K_M으로 표적을 변형(예를 들어, 절단)시키거나;

(u) 제2 외인성 폴리펩티드가 샤페론을 포함하거나;

(v) 제1 외인성 폴리펩티드가 표면-노출된 부분을 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표면 노출된 부분을 포함하거나;

(w) 제핵 적혈구 세포의 유효량이 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구 세포의 유효량보다 적은(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적은) 것 중 하나 이상에 해당한다.

외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 융합 단백질을 포함하는 본원에 기재된 조성물 및 방법 중 임의의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서,

i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%는 동일한 서열을 갖거나,

ii) 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%는 동일한 막횡단 영역을 갖거나,

iii) 융합 단백질은 전장의 내인성 막 단백질을 포함하지 않고, 예를 들어, 전장의 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하고, 상기 세그먼트는 전장의 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여되어 있거나;

iv) 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산만큼 상이하지 않거나,

v) 외인성 폴리펩티드는 소르타제 전달 기호가 결여되어 있거나,

vi) 외인성 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열의 별개의 융합 폴리펩티드 상에 존재하는 모이어티를 포함하거나;

vii) 외인성 폴리펩티드는 단일 융합 폴리펩티드로 존재하거나;

viii) 융합 단백질은 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;

ix) 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 융합 단백질은 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 아미노산 내에 있는 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합이다.

본원에 기재된 세포 시스템은 세포 시스템의 일부가 아닌 또 다른(하나 이상의) 항-증식, 항-신생물 또는 항-종양 약물 또는 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 그와 같은 약물 또는 치료는 화학요법 약물, 예를 들어, 세포독성 약물(예를 들어, 알킬화제, 항대사물, 항-종양 항생제, 국소이성화효소 억제제, 유사분열 억제제, 코르티코스테로이드); 암 성장 차단제, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 및 프로테아솜 억제제; T 세포 요법(예를 들어, CAR-T 세포 요법)(예를 들어, PMID: 26611350 참조), 자연살세포(NK) 세포 면역조절(예를 들어, PMID: 26697006 참조); 및 암 백신(PMID: 26579225); 다른 화학 약물, 예를 들어, L-아스파라기나제 및 보르테조미브(bortezomib)(Velcade®)를 포함한다. 예를 들어, 호르몬-민감성 암에 대해 호르몬 요법(또는 항-호르몬 요법)이 사용될 수 있다.

본원에 기재된 세포 시스템은 또한 암에 대한 비-약물 요법, 예를 들어, 수술, 방사선요법, 또는 냉동요법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 치료 방법은 2개 이상의 다른 요법 또는 약물과 조합된 본원에 기재된 세포 시스템을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 유방암은 수술 또는 방사선요법 및 화학요법 칵테일 또는 생물학적 제제(예를 들어, 항-HER2 항체)와 조합된 본원에 기재된 세포 시스템의 조합으로 치료될 수 있다.

본 발명의 개시는 상기 양태 및/또는 구현예 중 어느 하나 이상의 모든 조합뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에 기재된 구현예 중 어느 하나 이상과의 조합을 고려한다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 예를 들어, 본원의 임의의 표에서 본원에 참조된 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참조로서 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원의 임의의 표를 포함하는 본원에 명시된 서열 등록 번호는 2016년 1월 11일 현재의 데이터베이스 항목을 참조한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 등록 번호를 언급하는 경우, 서열 변이체 모두가 포함된다.

도 1은 유동세포분석법을 통해 측정된 Raji 아폽토시스 검정의 결과를 제시하는 한 세트의 그래프이다. Raji 세포는 CFSE 표지되고, 형질도입되지 않은 적혈구 분화 세포(대조군) 및 단일 또는 다수의 TRAIL 변이체로 형질도입된 적혈구 분화 세포와 공동 배양되거나, 2개의 상이한 단독으로 형질도입된 세포와 공동 배양된다. Raji(CFSE+) 및 아넥신 V+인 세포의 백분율로 결정된 아폽토시스 백분율. (상단) 다양한 조건의 CFSE 및 아넥신 V 염색의 유동세포분석법 플롯. (하단) 다양한 조건의 아폽토시스 백분율의 그래프.
도 2는 인큐베이션 5시간 전 또는 5시간 후에 항-토끼 Fc 형광단 표지된 항체로 표지된 대조군 적혈구 세포(UNT) 또는 IdeS-발현 적혈구 세포(IDES)로부터의 평균 형광 강도를 제시하는 막대 그래프이다.
도 3은 대조군 세포(UNT) 또는 Ide-S 발현 세포(IdeS-RCT)로부터의 상층액 중 표적 항체의 온전한 중쇄 또는 중쇄의 단편을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 화살표는 중쇄(Hc), 중쇄 단편(Hc-단편), 및 경쇄(Lc)를 나타낸다.
도 4는 제1 외인성 폴리펩티드(백색), 제2 외인성 폴리펩티드(선영), 및 제3 외인성 폴리펩티드(밀집한 선영)을 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이며, 여기서 각각의 외인성 폴리펩티드는 표적, 예를 들어, 원치 않는 표적을 포획할 수 있는 포획 제제를 포함한다. 적혈구 세포는 이중 포획에 관여할 수 있으며, 여기서 이는 단일 또는 다수의 가용성 인자에 결합하기 위해 하나 초과의 외인성 폴리펩티드를 이용한다.
도 5는 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이며, 여기서 각각의 외인성 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 원치 않는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체를 포획할 수 있다.
도 6은 표적, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 원치 않는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체에 결합하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및 표적을 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다. 제2 외인성 폴리펩티드는 프로테아제, 예를 들어, IdeS를 포함할 수 있다.
도 7은 표적, 예를 들어, 약물을 이용한 치료에 대한 반응에서 대상체에 의해 생성된 원치 않는 항-약물 항체에 결합하는 제1 외인성 폴리펩티드, 표적을 절단하는 제2 외인성 폴리펩티드, 및, 예를 들어, 대상체가 항-약물 항체를 생성하는 약물에 대한 대안인 치료 단백질을 포함하는 임의의 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 8은 치료 활성을 갖는 제1 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 항-CD40 항체 분자), 제1 외인성 폴리펩티드를 억제하는 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, CD40 또는 이의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 표적화 제제, 예를 들어, 항-CD20 항체 분자를 포함하는 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 9는 제1 표적화 제제를 갖는 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 표적화 제제를 갖는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 10은 길항제 및/또는 효능제를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 11은 표적화 제제(예를 들어, 항-CD4 항체 분자) 및 내부 페이로드(예를 들어, IDO)를 포함하는 다이어그램 또는 적혈구 세포이다.
도 12는 표적화 제제를 포함하는 제1 외인성 폴리펩티드 및 표적의 효능제를 포함하는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 13은 표적화 제제(예를 들어, 항-BCMA 항체 분자)를 포함하는 제1 외인성 폴리펩티드 및 포획 제제를 포함하는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.
도 14는 표적화 제제를 포함하는 제1 외인성 폴리펩티드 및 제공된 활성, 예를 들어, 아폽토시스를 촉진하는 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, TRAIL)를 포함하는 적혈구 세포의 다이어그램이다.

정의

본원에 사용되는 용어 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편을 나타낸다. 용어 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포함한다. 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자, 예를 들어, 이특이적 항체 분자이다. 항체 분자의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화물-결합 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예를 들어, sdAb(VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 항체 단편, 예를 들어, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 항체의 분리된 에피토프 결합 단편, 맥시바디(maxibodies), 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies), 인트라바디(intrabodies), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), v-NAR 및 비스-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 "조합 요법" 또는 "조합하여 투여됨"은 2개(또는 그 초과)의 상이한 제제 또는 치료가 특정 질병 또는 질환에 대한 치료 요법의 일부로서 대상체에 투여되는 것을 의미한다. 치료 요법은 대상체에 대한 별도의 제제의 효과가 중첩되도록 하는 각각의 제제의 투여의 용량 및 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 제제의 전달은 동시적이거나 동반적이며, 제제는 공동-제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 제제는 공동 제형화되지 않으며, 처방 요법의 일부로서 순차적 방식으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조합된 2개 이상의 제제 또는 치료의 투여는 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 단독으로 전달되거나 다른 제제 또는 치료의 부재하에서의 하나의 제제 또는 치료로 관찰되는 것보다 크도록 수행된다. 2개의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 부가적인 것을 초과(예를 들어, 상승작용)할 수 있다. 각각의 치료제의 순차적 또는 실직적인 동시 투여는 경구 경로, 정맥내 경로, 근내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합물의 제1 치료제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 반면, 조합물의 제2 치료제는 경구 투여될 수 있다.

용어 "조화된" 또는 "조화된 방식"은 복수의 제제가 치료적 효익을 제공하기 위해 함께 작용하는 것을 의미한다. 조화된 활성의 유형은 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 및 보상 활성을 포함한다. 구현예에서, 동일한 제핵 RBC에서 전달된 복수의 외인성 폴리펩티드에 의해 제공된 치료적 효익의 수준은 복수의 폴리펩티드 각각이 상이한 제핵 RBC로부터 전달된 경우에 관찰되는 것보다 크다.

본원에 사용되는 "제핵"은 핵이 결여된 세포, 예를 들어, 성숙 적혈구로의 분화를 통해 핵을 상실한 세포를 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "외인성 폴리펩티드"는 상기 유형의 야생형 세포에 의해 생성되지 않거나, 외인성 폴리펩티드를 함유하는 세포에서보다 야생형 세포에서 낮은 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 세포로 도입된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드이며, 상기 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "다중양식 요법"은 조화된 기능(예를 들어, 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상 활성)을 갖는 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개 이상)의 외인성 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 제공하는 요법, 예를 들어, 제핵 적혈구 요법을 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "경로" 또는 "생물학적 경로"는 순차적 방식으로 함께 작용하는 복수의 생물학적 분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 나타낸다. 경로의 예는 신호 전달 캐스케이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 경로는 세포외 신호의 검출로 시작하고, 표적 유전자의 전사에서의 변화로 종료한다. 일부 구현예에서, 경로는 세포질 신호의 검출로 시작하고, 표적 유전자의 전사에서의 변화로 종료한다. 경로는 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형인 경우, 이는 복수의 입력(수렴), 또는 복수의 출력(분기)을 가질 수 있다.

본원에 사용되는 "근접-의존성" 분자는 단독인 경우보다는 제2 분자와 근접한 경우에 상이한, 예를 들어, 더 큰 활성을 갖는 제1 분자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 한 쌍의 근접-의존성 리간드는 리간드가 서로 떨어져 있는 경우보다 리간드가 근접한 경우에 하류 인자를 더욱 강하게 활성화한다.

본원에 사용되는 "수용체 성분"은 그 자체로 또는 복합체의 일부로서 수용체로 작용하는 폴리펩티드를 나타낸다. 따라서, 수용체 성분은 폴리펩티드 수용체 및 수용체 복합체의 일부로서 작용하는 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "상승작용" 또는 "상승작용적"은 개별적 효과에 비해 2개 이상의 제제(예를 들어, 제핵 적혈구의 일부인 폴리펩티드)의 조합의 부가적인 것을 초과하는 효과를 의미한다. 특정 구현예에서, 상승작용적 활성은 제1 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구의 효과와 비교하여 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리페티드를 포함하는 제핵 적혈구의 부가적인 것을 초과하는 효과이다. 일부 구현예에서, 제1 제제가 검출 가능한 수준의 출력 X를 생성하고, 제2 제제가 검출 가능한 수준의 출력 X를 생성하고, 제1 및 제2 제제가 함께 부가적인 수준을 초과하는 출력 X를 생성하는 경우에 상승작용적 활성이 존재한다.

본원에 사용되는 용어 폴리펩티드의 "변이체"는 상기 폴리펩티드에 비해 적어도 하나의 서열 차이, 예를 들어, 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 변이체는 상기 폴리펩티드와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다. 변이체는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 전장 폴리펩티드에 비해 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두(각각 독립적)에 최대 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 100개의 아미노산이 결여되어 있다.

예시적인 외인성 폴리펩티드 및 이의 용도

구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 치료제는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 10개 이상)의 상이한 외인성 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드, 지질, 또는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 치료제는 본원에 기재된 2개 이상의 상이한 단백질을 포함하는 외인성 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구는 본원에 기재된 2개 이상의 상이한 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 전부)은 인간 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체이다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드는 동일 표적에 대해 작용하고, 다른 구현예에서, 이들은 2개 이상의 상이한 표적에 대해 작용한다. 일부 구현예에서, 내인성 인간 단백질 또는 가용성 인자(예를 들어, 폴리펩티드, 소분자, 또는 세포-비함유 핵산)로부터 단일 표적 또는 복수의 표적이 선택된다.

외인성 단백질 중 하나 이상은 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 특징적인 번역후 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 단백질 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)은 당화되거나, 인산화되거나, 당화 및 인산화된다. 당단백질의 시험관 내 검출은 과요오드산-쉬프(Periodic acid-Schiff)(PAS) 방법의 변형을 이용하여 SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블롯에서 일상적으로 달성된다. 당단백질의 세포 국소화는 당 분야에 공지된 렉틴 형광 컨쥬게이트를 이용하여 달성될 수 있다. 인산화는 포스포-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.

번역후 변형은 또한 소수성 기에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 프레닐화, 또는 글리피화), 보조인자에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 리포일화(lipoylation), 플라빈 모이어티(예를 들어, FMN 또는 FAD), 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation), 또는 레티닐리덴 쉬프 염기 형성), 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신(hypusine) 형성, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, 또는 S-아실화), 포르밀화, 아세틸화, 알킬화(예를 들어, 메틸화 또는 에틸화), 아미드화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 말로닐화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 예를 들어, ADP-리보실화, 산화, 포스페이트 에스테르(O-결합) 또는 포스포르아미데이트(N-결합) 형성(예를 들어, 인산화 또는 아데닐릴화), 프로피오닐화, 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, ISG화(ISGylation), 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화(Neddylation), 또는 아미노산의 화학적 변형(예를 들어, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화(eliminylation), 또는 카르바밀화), 이황화 브릿지의 형성, 라세미화(예를 들어, 프롤린, 세린, 알라닌, 또는 메티오닌의 라세미화)를 포함한다. 구현예에서, 당화는 당단백질을 발생시키는 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 트립토판으로의 글리코실기의 첨가를 포함한다. 구현예에서, 당화는, 예를 들어, O-결합 당화 또는 N-결합 당화를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 융합 단백질, 예를 들어, 내인성 적혈구 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 막횡단 단백질, 예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편과의 융합체이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 이량체화 또는 다합체화를 촉진하는 도메인, 예를 들어, 이량체화 도메인을 선택적으로 포함하는 제2 융합 외인성 폴리펩티드와 융합된다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 항체 분자의 일부, 예를 들어, Fc 도메인 또는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이종이량체화를 촉진하는 놉-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이(예를 들어, T366Y 놉 및 Y407T 홀)를 포함한다.

예시적인 인간 폴리펩티드, 예를 들어, 표 1 내지 4 중 임의의 표로부터 선택된 인간 폴리펩티드는 하기를 포함한다:

a) 인간 폴리펩티드의 천연 발생 형태, 예를 들어, 질병 상태와 관련되지 않은 인간 폴리펩티드의 천연 발생 형태;

b) 데이터베이스, 예를 들어, 2017년 1월 11일자의 GenBank 데이터베이스에 나타나는 서열을 갖는 인간 폴리펩티드, 예를 들어, 데이터베이스, 예를 들어, 2017년 1월 11일자의 GenBank 데이터베이스에 나타나는 서열을 갖는 질병 상태와 관련되지 않은 인간 폴리펩티드의 천연 발생 형태;

c) a) 또는 b)의 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5 또는 10개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 서열을 갖는 인간 폴리펩티드;

d) a) 또는 b)의 서열로부터 아미노산 잔기에 있어서 1, 2, 3, 4, 5 또는 10% 이하만큼 상이한 서열을 갖는 인간 폴리펩티드;

e) a) 또는 b)의 서열과 실질적으로 상이하지 않은 서열을 갖는 인간 폴리펩티드; 또는

f) a) 또는 b)의 서열을 갖는 인간 폴리펩티드와 생물학적 활성, 예를 들어, 효소적 활성(예를 들어, 특이성 또는 턴오버) 또는 결합 활성(예를 들어, 결합 특이성 또는 친화성)에 있어서 실질적으로 상이하지 않은 c), d), 또는 e)의 서열을 갖는 인간 폴리펩티드. f) 하의 후보 펩티드가 본원에 기재된 바와 같이 제조되고, 유사한 활성에 대해 스크리닝될 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 제핵 RBC에서 발현된다면 본원에서 동등할 것이다.

구현예들에서, 외인성 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 또는 이의 단편, 예를 들어, 상기 단락의 a), b), c), d), e), 또는 f)의 인간 폴리펩티드의 전부 또는 단편을 포함한다. 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 상기 단락의 a), b), c), d), e), 또는 f)의 인간 폴리펩티드의 전부 또는 단편, 및 추가의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 구현예에서, 추가의 아미노산 서열은 상이한 인간 폴리펩티드에 대해 상기 단락의 a), b), c), d), e), 또는 f)의 인간 폴리펩티드의 전부 또는 단편을 포함한다.

본 발명은 기능적 단편 또는 이의 변이체(예를 들어, 표 1 내지 4에 나열된 수용체의 리간드-결합 단편 또는 이의 변이체)가 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 유사한 활성에 대해 스크리닝될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 제핵 RBC에서 발현된다면 본원에서 동등할 것으로 생각한다.

구현예들에서, 2개 이상의 외인성 제제(예를 들어, 폴리펩티드)는 본원에 기재된 바와 같이 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상적인 관련 기능을 갖는다. 일부 구현예에서, 이들 서술자 중 하나 초과가 제공된 RBC에 적용된다.

제제-부가적 배치(configuration)

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 제제-부가적인 경우, 함께 작용하는 제제의 효과는 단독으로 작용하는 어느 한 제제의 효과보다 크다. 구현예에서, 2개의 제제는 RBC(예를 들어, RBC 표면 상)에서 상이한(예를 들어, 상보적) 기능을 가지며, 함께 작용하여 더 강한 효과(단독으로 작용하는 제제 중 어느 하나에 비함), 예를 들어, 표적에 대한 더 높은 결합 친화성, 또는 표적, 예를 들어, 단일 표적에 의한 더 큰 정도의 신호 전달의 조절을 갖는다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 제제는 각각 동일 표적, 예를 들어, 동일 표적 단백질 내의 상이한 에피토프에 결합한다.

구현예에서, 제제는 상호 연관되어 있다, 예를 들어, 이종이량체 복합체의 일원이다. 구현예에서, 제제는 단독으로 작용하는 경우보다 함께 작용하는 경우에 표적에 대한 더 큰 결합력을 갖는다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 제제는 어느 한 제제 단독보다 표적에 대한 더 단단한 결합을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 수용체 성분, 예를 들어, 사이토카인 수용체 성분, 예를 들어, 인터루킨 수용체 성분, 예를 들어, IL-1 수용체 성분의 이종이량체는 어느 한 수용체 성분 단독보다 높은 친화성으로 표적, 예를 들어, IL-1에 결합한다. 많은 신호전달 분자는 이들의 리간드에 결합하기 위해 세포 표면 상에서 이종이량체 또는 이종다합체를 형성한다. 예를 들어, 사이토카인 수용체는 이종이량체 또는 이종다합체일 수 있다. 예를 들어, IL-2 수용체는 3개의 상이한 분자 IL2Ra, IL2Rb, 및 IL2Rg를 포함한다. IL-13 수용체는 IL13Ra 및 IL4R의 이종이량체이다. IL-23 수용체는 IL23R 및 IL12Rb1의 이종이량체이다. TNFa 수용체는 구현예들에서 TNFR1 및 TNFR2의 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 표 1의 사이토카인, 또는 이의 사이토카인 수용체-결합 단편 또는 변이체를 포함한다. 발현된 사이토카인은 통상적으로 이의 표적 수용체를 통해 결합하고 신호를 보낼 수 있는 야생형 인간 수용체 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 갖는다. 사이토카인 및 이의 수용체의 표가 표 1로 본원에 제공된다. 사이토카인은 RBC의 표면 상에 존재할 수 있다.

[표 1] 사이토카인 및 수용체

일부 구현예에서, 제제는 순환에서 항체, 예를 들어, 항-약물 항체의 포획을 위한 상이한 항체-결합 분자, 예를 들어, Fc-결합 분자이다. 구현예들에서, 제제는 개별적 항체 또는 옵소닌화 입자의 보다 높은 친화성 결합을 가능하게 하기 위해 서로 비-경쟁적이다. 예를 들어, 구현예들에서, 하나 이상의 제제는 단백질 A, Fc 수용체 1(FcR1), FcR2a, FcR2b, FcR3, FcR4, FcRn(신생아 Fc 수용체) 또는 이들의 항체-결합 단편 또는 변이체로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 표적은 순환 암세포, 예를 들어, 암성 B 세포, T 세포, 림프계 세포, 또는 순환 종양 세포(CTC)이다. 구현예들에서, 조작된 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 암세포를 포획하고 이를 순환으로부터 제거하기 위해 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 제제는 세포 표면 상의 상이한 단백질에 결합하여 요법의 특이성을 향상시킨다. 예를 들어 제제는 항-EPCAM 및 항 CD45 항체 분자를 포함하여 CTC를 포획하거나, 항-CD19 및 항-CD20 항체 분자를 포함하여 B 세포 계통 급성 백혈병 세포를 포획한다.

제핵 적혈구 세포는 표적(예를 들어, 항-약물 항체)과 상호작용하는 제1 외인성 폴리펩티드 및 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 프로테아제, 예를 들어, IdeS)를 포함할 수 있다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 대상체, 예를 들어, 암, 예를 들어, 본원에 기재된 암을 갖는 대상체에 투여된다.

구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구 세포의 유효량은 제1 외인성 폴리펩티드가 결여되거나 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구 세포의 유효량보다 적다(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적다). 구현예들에서, 미리 선택된 양은 제핵 적혈구 세포의 유효 용량 또는 시험관 내 유효량이다. 구현예들에서, 미리 선택된 양(예를 들어, 시험관 내 유효량)은 검정에 효과적인 양, 예를 들어, 미리 선택된 기간, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간 내에 기질의 적어도 10%, 20%, 30%, 405, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 생성물로 전환하는 데 효과적인 양이다. 구현예들에서, 미리 선택된 양(예를 들어, 시험관 내 유효량)은 5시간 내에 표적 항체의 적어도 50%를 절단하는 데 효과적이다. 검정은, 예를 들어, 용액 중의 가용성의 변형되지 않은(예를 들어, 절단되지 않은) 표적의 수준에서의 감소를 측정할 수 있다.

구현예들에서, 표적에 대한 참조 값은 투여시 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수이다. 구현예들(예를 들어, 시험관 내 유효량의 세포를 포함하는 구현예들)에서, 표적에 대한 참조 값은 검정을 위한 반응 혼합물에서의 표적의 수이다.

제1 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 결합 제제)

제1 외인성 폴리펩티드는 표적에 결합할 수 있다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 항체, 예를 들어, 항-약물 항체를 인지하는 결합 도메인을 포함한다.

구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 결합 도메인 및 막 고정 도메인(예를 들어, 막횡단 도메인, 예를 들어, 타입 I 또는 타입 II 적혈구 막횡단 도메인)을 포함한다. 구현예들에서, 막 고정 도메인은 개질제(예를 들어, 프로테아제) 도메인의 C-말단 또는 N-말단이다. 구현예들에서, 막횡단 도메인은 GPA 또는 이의 막횡단 부분, 예를 들어, 본원의 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 GPA 또는 이의 막횡단 부분, 또는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 결합 도메인의 C-말단이다.

구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 WO2007030708호, 예를 들어, 이의 34 내지 45 페이지에 기재된 어드레스 모이어티 또는 표적화 모이어티를 포함하며, 상기 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

제1 외인성 폴리펩티드로서 사용하기 위해 적절하게 적합화될 수 있는 단백질의 다른 예는 표적이 수용체 리간드인 경우와 같은 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함한다. 역으로, 제1 외인성 폴리펩티드는 표적이 수용체인 수용체 리간드를 포함할 수 있다. 표적 리간드는 폴리펩티드 또는 소분자 리간드일 수 있다.

추가 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 인간 피브로넥틴("Fn3")의 10번째 타입 III 도메인과 같은 면역글로불린-유사 폴드를 갖는 폴리펩티드로부터 유래된 도메인을 포함할 수 있다. 미국 특허 번호 6,673,901; 6,462,189를 참조한다. Fn3는 작고(약 95개의 잔기), 단량체이고, 가용성이고, 안정적이다. 이는 환원 환경에서 개선된 안정성을 허용하는 이황화 결합을 갖지 않는다. 구조는 Fn3이 9개 대신 7개의 베타-가닥을 갖는 것을 제외하고는 Ab VH 도메인의 것과 유사한 베타-샌드위치로 기재될 수 있다. Fn3의 각 말단에 3개의 루프가 존재하며; 이들 루프 중 3개의 위치는 VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3의 위치에 해당한다. 94개의 아미노산의 Fn3 서열은 하기와 같다:

CDR-유사 루프의 아미노산 위치는 잔기 23 내지 30(BC 루프), 52 내지 56(DE 루프) 및 77 내지 87(FG 루프)로 정의될 것이다. 따라서, CDR-유사 루프 중 하나 이상은 변형되거나 무작위화되어 Fn3 결합 도메인의 라이브러리를 생성할 수 있고, 이는 이후 원하는 어드레스 결합 부위에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. PCT 공보 WO0232925호를 또한 참조한다. Fn3은 면역글로불린 상과(IgSF)의 큰 아과의 예이다. Fn3 패밀리는 세포 부착 분자, 세포 표면 호르몬 및 사이토카인 수용체, 샤페로닌, 및 탄수화물-결합 도메인을 포함하며, 이들 모두는 또한 결합제로서 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 또한, 전사 인자 NF-kB의 DNA 결합 도메인의 구조는 또한 Fn3 폴드와 밀접하게 관련이 있으며, 또한 결합제로서 사용하기 위해 적합화될 수 있다. 유사하게, 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민은 표적화 모이어티로 사용하기 위해 적합화될 수 있는 면역글로불린-유사 폴드를 함유한다.

또 다른 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 동역학 및 어드레스 부위로의 결합에 대한 선택성을 기초로 하여 선택된, 예를 들어, 합성적으로 개발된 조작된 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드의 서열은 스크린 또는 선택 방법을 이용하여, 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 효모 2-하이브리드 스크린에 의해 설계된다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 가용성 수용체에 대한 펩티드 리간드(선택적으로, 표적은 가용성 수용체를 포함함), 표적에 결합하는 합성 펩티드, 보체 조절 도메인(선택적으로, 표적은 보체 인자를 포함함), 또는 세포 표면 수용체에 대한 리간드(선택적으로, 표적은 세포 표면 수용체를 포함함)를 포함한다.

제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 프로테아제)

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드(표적을 변형시킴)는 표 4에 기재된 인자이다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 표 4에 기재된 프로테아제이다. 구현예들에서, 프로테아제는 박테리아 프로테아제, 인간 프로테아제, 또는 식물 프로테아제, 또는 이들의 단편 또는 변이체이다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드(표적을 변형시킴)는 프로테아제이다. 예시적은 프로테아제는 아미노펩티다제; 디펩티다제; 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜 펩티다제; 펩티딜-디펩티다제; 세린-타입 카르복시펩티다제; 메탈로카르복시펩티다제; 시스테인-타입 카르복시펩티다제; 오메가펩티다제; 세린 프로테이나제; 시스테인 프로테이나제; 아스파르트산 프로테이나제; 금속단백분해효소; 또는 공지되지 않은 메커니즘의 프로테이나제로 분류되는 것을 포함한다.

아미노펩티다제는 세포질 아미노펩티다제(류실 아미노펩티다제), 막 알라닐 아미노펩티다제, 시스티닐 아미노펩티다제, 트리펩티드 아미노펩티다제, 프롤릴 아미노펩티다제, 아르기닐 아미노펩티다제, 글루타밀 아미노펩티다제, x-pro 아미노펩티다제, 박테리아 류실 아미노펩티다제, 고온성 아미노펩티다제, 클로스트리듐 아미노펩티다제, 세포질 알라닐 아미노펩티다제, 리실 아미노펩티다제, x-trp 아미노펩티다제, 트립토파닐 아미노펩티다제, 메티오닐 아미노펩티다제, d-입체특이적 아미노펩티다제, 및 아미노펩티다제를 포함한다. 디펩티다제는 x-his 디펩티다제, x-arg 디펩티다제, x-메틸-his 디펩티다제, cys-gly 디펩티다제, glu-glu 디펩티다제, pro-x 디펩티다제, x-pro 디펩티다제, met-x 디펩티다제, 비-입체특이적 디펩티다제, 세포질 비-특이적 디펩티다제, 막 디펩티다제, 및 베타-ala-his 디펩티다제를 포함한다. 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜 펩티다제는 디펩티딜-펩티다제 I, 디펩티딜-펩티다제 II, 디펩티딜 펩티다제 III, 디펩티딜-펩티다제 IV, 디펩티딜-디펩티다제, 트리펩티딜-펩티다제 I, 및 트리펩티딜-펩티다제 II를 포함한다. 펩티딜-디펩티다제는 펩티딜-디펩티다제 A 및 펩티딜-디펩티다제 B를 포함한다. 세린-타입 카르복시펩티다제는 리소좀성 pro-x 카르복시펩티다제, 세린-타입 D-ala-D-ala 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 C, 및 카르복시펩티다제 D를 포함한다. 메탈로카르복시펩티다제는 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B, 리신(아르기닌) 카르복시펩티다제, gly-X 카르복시펩티다제, 알라닌 카르복시펩티다제, 무라모일펜타펩티드 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 H, 글루타메이트 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 M, 무라모일테트라펩티드 카르복시펩티다제, 아연 D-ala-D-ala 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 A2, 막 pro-x 카르복시펩티다제, 튜불리닐-tyr 카르복시펩티다제, 및 카르복시펩티다제 T를 포함한다. 오메가펩티다제는 아실아미노아실-펩티다제, 펩티딜-글리신아미다제, 피로글루타밀-펩티다제 I, 베타-아스파르틸-펩티다제, 피로글루타밀-펩티다제 II, n-포르밀메티오닐-펩티다제, 프테로일폴리-[감마]-글루타메이트 카르복시펩티다제, 감마-glu-X 카르복시펩티다제, 및 아실무라모일-ala 펩티다제를 포함한다. 세린 프로테이나제는 키모트립신, 키모트립신 C, 메트리딘(metridin), 트립신, 트롬빈, 응고 인자 Xa, 플라스민, 엔테로펩티다제, 아크로신(acrosin), 알파-용해 프로테아제, 글루타밀, 엔도펩티다제, 카텝신 G, 응고 인자 VIIa, 응고 인자 IXa, 쿠쿠미시(cucumisi), 프롤릴 올리고펩티다제, 응고 인자 XIa, 브라키우린(brachyurin), 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타제, 백혈구 엘라스타제, 응고 인자 XIIa, 키마제(chymase), 보체 성분 clr55, 보체 성분 cls55, 고전적-보체 경로 c3/c5 전환효소, 보체 인자 I, 보체 인자 D, 대안적-보체 경로 c3/c5 전환효소, 세레비신(cerevisin), 하이포더민 C(hypodermin C), 리실 엔도펩티다제, 엔도펩티다제 1a, 감마-레니(gamma-reni), 베놈빈 AB(venombin AB), 류실 엔도펩티다제, 트립타제, 스쿠텔라린(scutelarin), 켁신(kexin), 섭틸리신(subtilisin), 오리진(oryzin), 엔도펩티다제 K, 써모마이콜린(thermomycolin), 써미타제(thermitase), 엔도펩티다제 SO, T-플라스미노겐 활성제, 단백질 C, 췌장 엔도펩티다제 E, 췌장 엘라스타제 II, IGA-특이적 세린 엔도펩티다제, U-플라스미노겐, 활성제, 베놈빈 A, 푸린, 미엘로블라스틴(myeloblastin), 세메노겔라제(semenogelase), 그랜자임 A(granzyme A) 또는 세포독성 T-림프구 프로테이나제 1, 그랜자임 B 또는 세포독성 T-림프구 프로테이나제 2, 스트렙토그리신 A(streptogrisin A), 트렙토그리신 B(treptogrisin B), 글루타밀 엔도펩티다제 II, 올리고펩티다제 B, 리물러스 응고 인자 C, 리물러스 응고 인자, 리물러스 응고 효소, 옴프틴(omptin), 억제인자 렉사(repressor lexa), 박테리아 선도 펩티다제 I, 및 토가비린(togavirin), 플라비린(flavirin)을 포함한다. 시스테인 프로테이나제는 카텝신 B, 파파인, 피신, 키모파파인, 아스클레파인(asclepain), 클로스트리파인(clostripain), 스트렙토파인(streptopain), 악티니드(actinide), 카텝신 1, 카텝신 H, 칼파인, 카텝신 T, 글리실, 엔도펩티다제, 암 응고촉진제, 카텝신 S, 피코르나인 3C(picornain 3C), 피코르나인 2A, 카리카인(caricain), 아나나인(ananain), 줄기 브로멜라인, 과일 브로멜라인, 레구마인(legumain), 히스톨리사인(histolysain), 및 인터루킨 1-베타 전환 효소를 포함한다. 아스파르트산 프로테이나제는 펩신 A, 펩신 B, 가스트리신(gastricsin), 키모신, 카텝신 D, 네오펜테신(neopenthesin), 레닌(renin), 레트로펩신, 프로-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 전환 효소, 아스퍼질로펩신 I(aspergillopepsin I), 아스퍼질로펩신 II, 페니실로펩신(penicillopepsin), 리조푸스펩신(rhizopuspepsin), 엔도티아펩신(endothiapepsin), 무코로펩신(mucoropepsin), 칸디다펩신(candidapepsin), 사카로펩신(saccharopepsin), 로도토룰라펩신(rhodotorulapepsin), 피사로펩신(physaropepsin), 아크로실린드로펩신(acrocylindropepsin), 폴리포로펩신(polyporopepsin), 피크노포로펩신(pycnoporopepsin), 사이탈리도펩신 A(scytalidopepsin A), 사이탈리도펩신 B, 잔토모나펩신(xanthomonapepsin), 카텝신 E, 배리어펩신(barrierpepsin), 박테리아 선도 펩티다제 I, 슈도모나펩신(pseudomonapepsin), 및 플라스멥신(plasmepsin)을 포함한다. 금속단백분해효소는 아트로리신 A(atrolysin A), 미생물 콜라게나제, 류콜리신(leucolysin), 사이질 콜라게나제, 네프릴리신(neprilysin), 엔벨리신(envelysin), IgA-특이적 메탈로엔도펩티다제, 프로콜라겐 N-엔도펩티다제, 티멧(thimet) 올리고펩티다제, 신경용해소, 스트로멜리신 1(stromelysin 1), 메프린 A(meprin A), 프로콜라겐 C-엔도펩티다제, 펩티딜-lys 메탈로엔도펩티다제, 아스타신(astacin), 스트로멜리신 2, 마트릴리신(matrilysin) 젤라틴분해효소, 에어로모놀리신(aeromonolysin), 슈돌리신( pseudolysin), 써몰리신(thermolysin), 바실로리신(bacillolysin), 아우레올리신(aureolysin), 코콜리신(coccolysin), 미콜리신(mycolysin), 베타-용해 메탈로엔도펩티다제, 펩티딜-asp 메탈로엔도펩티다제, 호중구 콜라게나제, 젤라틴분해효소 B, 리슈만놀리신(leishmanolysin), 사카롤리신(saccharolysin), 자가용해소, 듀테롤리신(deuterolysin), 세랄리신(serralysin), 아트롤리신 B(atrolysin B), 아트롤리신 C, 아트록사제(atroxase), 아트롤리신 E, 아트롤리신 F, 아다말리신(adamalysin), 호릴리신(horrilysin), 루베를리신(ruberlysin), 보트로파신(bothropasin), 보트롤리신(bothrolysin), 오피올리신(ophiolysin), 트리메렐리신 I(trimerelysin I), 트리메렐리신 II, 무크롤리신(mucrolysin), 피트릴리신(pitrilysin), 인슐리신(insulysin), O-시알로당단백질 엔도펩티다제, 루셀리신(russellysin), 미토콘드리아, 중간체, 펩티다제, 닥틸리신(dactylysin), 나르딜리신(nardilysin), 마그놀리신(magnolysin), 메프린 B(meprin B), 미토콘드리아 가공 펩티다제, 대식세포 엘라스타제, 코리올리신(choriolysin), 및 톡실리신(toxilysin)을 포함한다. 공지되지 않은 메커니즘의 프로테이나제는 써모프신(thermopsin) 및 다중촉매 엔도펩티다제 복합체를 포함한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 상기 중 임의의 것의 단편 또는 변이체를 포함한다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 IdeS 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, IdeS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8로 하기에 기재되는 서열 또는 SEQ ID NO:8의 서열의 단백질분해 활성 단편(예를 들어, 적어도 100, 150, 200, 250, 또는 300개의 아미노산의 단편) 또는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 핵산을 포함하는 일부 구현예에서, 핵산은 SEQ ID NO:8로 하기 기재되는 서열, 또는 이의 단백질분해 활성 단편, 또는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 IdeS 폴리펩티드를 인코딩한다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 개질제 도메인(예를 들어, 프로테아제 도메인, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드) 및 막 고정 도메인(예를 들어, 막횡단 도메인, 예를 들어, 타입 I 또는 타입 II 적혈구 막횡단 도메인)을 포함한다. 구현예들에서, 막 고정 도메인은 개질제(예를 들어, 프로테아제) 도메인의 C-말단 또는 N-말단이다. 구현예들에서, 막횡단 도메인은 GPA 또는 이의 막횡단 부분을 포함한다. 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 하기의 서열:

또는 이의 막횡단 부분, 또는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖는다. 구현예들에서, GPA 폴리펩티드는 개질제(예를 들어, 프로테아제) 도메인의 C-말단이다.

일부 구현예에서, 링커, 예를 들어, 글리신-세린 링커, 예를 들어, GGSGGSGG(SEQ ID NO:10) 및/또는 GGGSGGGS(SEQ ID NO:11)의 서열을 포함하는 링커가 IdeS 폴리펩티드와 막횡단 폴리펩티드 사이에 배치된다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 프로테아제, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드는 선도 서열, 예를 들어, GPA 선도 서열, 예를 들어, MYGKIIFVLLLSEIVSISA(SEQ ID NO:12)를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드는 태그, 예를 들어, HA 태그 또는 FLAG 태그를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 프로테아제(예를 들어, 면역글로불린 분해 효소, 예를 들어, 면역글로불린-G 분해 효소, 예를 들어, IdeS)는 힌지 영역, CH2 영역, 또는 힌지와 CH2 영역 사이에서 면역글로불린을 절단한다. 구현예들에서, 프로테아제는 하기 서열 중 하나, 예를 들어, 하기 서열에서 2개의 이탤릭체의 글리신 사이 또는 이탤릭체의 알라닌과 글리신 사이에서 면역글로불린을 절단한다.

인간 IgG1 힌지/CH2 서열 CPPCPAPELLGGPSVF (SEQ ID NO:13)

인간 IgG2 힌지/CH2 서열 CPPCPAPPVAGPSVF (SEQ ID NO:14)

인간 IgG3 힌지/CH2 서열 CPRCPAPELLGGPSVF (SEQ ID NO:15)

인간 IgG4 힌지/CH2 서열 AHHAQAPEFLGGPSVF (SEQ ID NO:16)

구현예들에서, 프로테아제(예를 들어, 박테리아 프로테아제), 예를 들어, IdeS 또는 IgA 프로테아제는 IgG를 절단한다.

구현예들에서, 프로테아제(예를 들어, 파파인 패밀리 프로테아제, 예를 들어, 파파인)는 Fc와 Fab 영역 사이의 면역글로불린, 예를 들어, 중쇄의 위치 224와 225 사이의 히스티딘-트레오닌 결합 및/또는 중쇄의 위치 233과 234 사이의 글루탐산-류신 결합을 절단한다.

구현예들에서, 프로테아제 또는 다른 개질제는 표 4에 나열된 표적에 대해 작용한다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 WO2007030708호, 예를 들어, 이의 45 내지 46 페이지에 기재된 촉매성 모이어티를 포함하며, 상기 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

제2 외인성 폴리펩티드는 표적에 대해 작용하여 화학적 변화를 유도함으로써 표적의 활성을 조절할 수 있는 모이어티, 예를 들어, 표적 내 반응을 촉매할 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 제2 외인성 폴리펩티드는 천연 발생 효소, 이의 활성(예를 들어, 촉매적으로 활성) 단편, 또는 조작된 효소, 예를 들어, 효소 활성을 갖도록 조작된 단백질, 예를 들어, 세린 프로테아제 활성 모티프를 함유하도록 설계된 단백질을 포함할 수 있다. 제2 외인성 폴리펩티드의 촉매 도메인은 표적 내에서 원하는 화학적 변화를 유도하는 데 효과적인 아미노산의 배열을 포함할 수 있다. 이들은 천연 효소의 N-말단 또는 C-말단의 트렁케이션된 형태, 돌연변이된 형태, 효소원, 또는 완전한 구상 도메인일 수 있다.

제2 외인성 폴리펩티드는 단독으로는 혼잡하고, 절단 부위와의 결합시 많은 상이한 생체분자를 인지하고, 비교적 불량한 반응 동역학을 가질 수 있는 효소적으로 활성인 부위를 포함할 수 있다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 제2 외인성 폴리펩티드 근처의 표적의 국소 농도를 증가시킴으로써 특이성을 제공하거나 개선한다.

제2 외인성 폴리펩티드는 구현예들에서 다른 효소(예를 들어, 대상체에 이미 존재하는 효소)에 의해 인지되고 작용되도록 표적을 변형시킬 수 있다. 구현예에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적의 활성이 억제되거나 상향조절되도록 표적의 구조를 변경시키는 모이어티를 포함한다. 많은 천연 발생 효소는 다른 효소를 활성화시키고, 이들은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 따라 이용될 수 있다.

제2 외인성 폴리펩티드는 프로테아제, 글리코시다제, 리파제, 또는 다른 가수분해효소, 아미다제(예를 들어, N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제, PGRP-L 아미다제), 또는 다른 효소 활성, 예를 들어, 이성화효소, 전이효소(키나제를 포함함), 리아제, 산화환원효소, 산화효소, 알돌라제, 케톨라제, 글리코시다제, 전이효소 등을 포함할 수 있다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 인간 리소자임, 인간 리소자임의 기능성 부분, 인간 PGRP-L, 인간 PGRP-L의 기능성 부분, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 A2의 기능성 부분, 또는 기질 금속단백분해효소(MMP) 세포외 효소, 예를 들어, MMP-2(젤라틴분해효소 A) 또는 MMP-9(젤라틴분해효소 B)을 포함한다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는, 예를 들어, 키모트립신, 트립신 또는 엘라스타제 또는 칼리크레인과 같은 포유동물 효소를 포함하는 키모트립신 패밀리, 또는 섭틸리신과 같은 박테리아 효소를 포함하는 섭틸리신 패밀리의 세린 프로테이나제이다. 일반적인 3차원 구조는 2개의 패밀리 사이에서 상이하나, 이들은 동일한 활성 부위 구조를 가지며, 촉매작용이 동일한 메커니즘을 통해 진행된다. 세린 프로테이나제는 기질 잔기와 상호작용하는 다양한 효소 하위부위에서의 아미노산 치환과 관련된 상이한 기질 특이성을 나타낸다. 촉매 트라이어드를 형성하는 3개의 잔기인 His-57, Asp-102 및 Ser-195(키모트립시노겐 넘버링)가 촉매 과정에서 중요하다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 식물 프로테아제, 예를 들어, 파파인, 악티니딘 또는 브로멜라인, 여러 포유동물 리소좀 카텝신, 세포질 칼파인(칼슘-활성화), 및 여러 기생충 프로테아제(예를 들어, 트리파노소마(Trypanosoma), 주혈흡충(Schistosoma))를 포함하는 시스테인 프로테이나제이다. 파파인은 원형(archetype)이며, 상기 패밀리의 가장 잘 연구된 일원이다. 세린 프로테이나제와 마찬가지로, 촉매작용은 공유 중간체의 형성을 통해 진행되며, 시스테인 및 히스티딘 잔기를 포함한다. 필수 Cys-25 및 His-159(파파인 넘버링)는 Ser-195 및 His-57과 각각 동일한 역할을 한다. 친핵체는 하이드록실 기가 아니라 티올레이트 이온이다. 티올레이트 이온은 His-159의 인접한 이미다졸륨 기와의 이온 쌍의 형성을 통해 안정화된다. 공격 친핵체는 둘 모두의 단계에서 티올레이트-이미다졸륨 이온 쌍이며, 이후 물 분자는 필요하지 않다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 아스파르트산 프로테이나제이며, 이의 대부분은 펩신 패밀리에 속한다. 펩신 패밀리는 소화 효소, 예를 들어, 펩신 및 키모신뿐만 아니라 리소좀 카텝신 D, 가공 효소, 예를 들어, 레닌, 및 특정 진균 프로테아제(페니실로펩신, 리조푸스펩신, 엔도티아펩신)를 포함한다. 제2의 패밀리는 바이러스 프로테이나제, 예를 들어, 레트로펩신으로도 지칭되는 AIDS vims(HIV)로부터의 프로테아제를 포함한다. 세린 및 시스테인 프로테이나제와 대조적으로, 아스파르트산 프로테이나제에 의한 촉매작용은 공유 중간체를 포함하지 않지만, 사면체형 중간체가 존재한다. 친핵체 공격은 2개의 동시적인 양성자 이동에 의해 달성된다: 하나의 이동은 물 분자로부터 2개의 카르복실 기의 다이어드로, 그리고 두번째 이동은 다이어드로부터 기질의 카르보닐 산소로 동시적인 CO-NH 결합 절단과 함께 이루어진다. "푸쉬-풀(push-pull)" 메커니즘으로 지칭될 수 있는 이러한 일반적인 산-염기 촉매작용은 비-공유 중성 사면체형 중간체의 형성을 발생시킨다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 금속단백분해효소이며, 이는 박테리아, 진균뿐만 아니라 더 고등한 유기체에서 발견될 수 있다. 이들은 이들의 서열 및 구조에 있어서 매우 상이하나, 대다수의 효소는 촉매적으로 활성인 아연(Zn) 원자를 함유한다. 일부 경우에서, 아연은 활성의 손실 없이 코발트 또는 니켈과 같은 또 다른 금속으로 대체될 수 있다. 박테리아 써몰리신은 널리 특성규명되었으며, 이의 결정 구조는 아연이 2개의 히스티딘 및 1개의 글루탐산에 의해 결합된 것을 나타낸다. 많은 효소는 서열 HEXXH를 함유하며, 이는 아연에 대해 2개의 히스티딘 리간드를 제공하는 반면, 세번째 리간드는 글루탐산(써몰리신, 네프릴리신, 알라닐 아미노펩티다제) 또는 히스티딘(아스타신)이다. 다른 패밀리는 Zn 원자의 결합의 별개의 방식을 나타낸다. 촉매 메커니즘은 절단이 용이한 결합의 카르보닐 기에서 아연-결합된 물 분자의 공격 후 비-공유 사면체형 중간체의 형성을 발생시킨다. 이러한 중간체는 이탈기로의 글루탐산 양성자의 이동에 의해 추가로 분해된다.

구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 이성화효소(예를 들어, 분해되어 화학 결합을 형성하거나, 입체형태적 변화를 촉매하는 이성화효소)를 포함한다. 구현예들에서, 이성화효소는 라세미화효소(예를 들어, 아미노산 라세미화효소), 입체이성체효소, 시스-트랜스 이성화효소, 분자내 산화환원효소, 분자내 전이효소, 또는 분자내 리아제이다.

구현예들에서, 제2 외인성 프로테아제는 샤페론을 포함한다. 예를 들어, 샤페론은 일반적인 샤페론(예를 들어, GRP78/BiP, GRP94, GRP170), 렉틴 샤페론(예를 들어, 칼넥신(calnexin) 또는 칼레티쿨린(calreticulin)), 비-고전적 분자 샤페론(예를 들어, HSP47 또는 ERp29), 폴딩 샤페론(예를 들어, PDI, PPI, 또는 ERp57), 박테리아 또는 원시세균 샤페론(예를 들어, Hsp60, GroEL/GroES 복합체, Hsp70, DnaK, Hsp90, HtpG, Hsp100, Clp 패밀리(예를 들어, ClpA 및 ClpX), Hsp104)일 수 있다. 구현예들에서, 제핵 적혈구는 공동-샤페론, 예를 들어, 이뮤노필린(immunophilin), Sti1, p50 (Cdc37), 또는 Aha1을 포함한다. 구현예들에서, 분자 샤페론은 샤페로닌이다.

제2 외인성 단백질(표적을 변형시킴)에 대한 후보는 이들의 활성을 기초로 하여 스크리닝될 수 있다. 시험되는 각각의 분자의 특정 활성에 따라, 상기 분자에 적절한 검정이 이용될 수 있다. 예를 들어, 제2 외인성 단백질이 프로테아제인 경우, 프로테아제를 스크리닝하기 위해 이용되는 검정은 프로테아제에 의해 생성된 절단 생성물을 검출하는 검정, 예를 들어, 크로마토그래피 또는 젤 전기영동 기반 검정일 수 있다.

일 실시예에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 키나제 활성을 가질 수 있다. 키나제 활성에 대한 검정은 관심 표적에 공유적으로 혼입되는 포스페이트의 양을 측정할 수 있다. 예를 들어, 관심 표적에 혼입되는 포스페이트는 신틸레이션 계수기를 사용하여 방사선 방출을 측정함으로써 정량될 수 있는 포스페이트의 방사성 동위원소일 수 있다.

표적 및 적응증

구현예들에서, 표적은 표 4에 나열된 표적이다.

구현예들에서, 표적은 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGF 베타로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자이다. 구현예들에서, 표적은 표 3에 나열된 억제 리간드이고, 제1 외인성 폴리펩티드는 선택적으로 표 3의 상응하는 표적 수용체로부터의 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적은 표 3의 표적 수용체이고, 제1 외인성 폴리펩티드는 선택적으로 표 3의 상응하는 억제 리간드로부터의 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 면역 체크포인트 분자를 절단하는 프로테아제, 예를 들어, 트립신을 포함한다. 예를 들어, 암을 치료하기 위한 구현예들에서, T 세포는, 예를 들어, 이의 수용체(예를 들어, 표 3의 수용체)와 T 세포 억제를 차단하는 분자를 접촉시킴으로써 활성화되거나 비활성화가 방지된다.

구현예들에서, 표적은 항체, 예를 들어, 인간 항체이다.

본원에 기재된 조작된 적혈구 세포는 또한 약물에 대한 항체를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 도 7 참조). 적혈구 세포는 대상체에서 항-약물 항체의 수준을 감소시킬 수 있고, 선택적으로 질병을 치료하는 치료 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 적혈구 세포는 표적에 결합하는 제1 외인성 폴리펩티드를 포함하며, 예를 들어, 표적은 항-약물 항체이다. 적혈구 세포는 표적을 비활성화시키는, 예를 들어, 절단하는 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, IdeS)를 추가로 포함할 수 있다. 적혈구 세포는 선택적으로 제3 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 대상체에서 항-약물 항체가 발생한 이전 치료제와 동일한 질병을 치료하는 치료 단백질, 예를 들어, 대상체에서 항-약물 항체가 발생한 이전 치료제와 동일하거나 상이한 치료 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 구현예들에서, 대상체는 항-CD20 항체 분자, 항-VEGF-A 항체 분자, 항-HER2 항체 분자, G-CSF 유사체, 예를 들어, 과립구집락자극인자, 항 EGFR 항체 분자(예를 들어, 세툭시맙(cetuximab)), 에리트로포이에틴, 예를 들어, 에포에틴(epoetin), 또는 인터페론, 예를 들어, IFNβ1a 또는 IFNβ1b에 대한 항-약물 항체를 포함한다. 그와 같은 치료 방법에서, 환자는 본원에 기재된 조작된 적혈구 세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 항-약물 항체의 존재, 예를 들어, 중화 항-약물 항체의 존재에 대해 시험될 수 있다.

제제-상승작용적 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 제제-상승작용적인 경우, 제제는 단일 경로 내의 2개 이상의 상이한 표적에 대해 작용한다. 구현예에서, 2개 이상의 제제의 동시의 작용은 개별적 제제 중 임의의 제제의 작용보다 크다. 예를 들어, 제1 및 제2 폴리펩티드는 동일한 하류 표적에 신호를 보내는 세포 수용체에 대한 리간드이다. 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적 세포 수용체에 대한 리간드를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적 세포 수용체에 대한 리간드를 포함하며, 예를 들어, 제1 및 제2 표적 세포 수용체는 동일한 하류 표적에 신호를 보낸다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용하고, 동시에 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용하고, 예를 들어, 제1 표적으로의 제1 외인성 폴리펩티드의 결합 및 제2 표적으로의 제2 외인성 폴리펩티드의 결합에 있어서 일부 일시적인 중첩이 존재한다. 일부 구현예에서, 동시 작용은 어느 한 표적이 단독으로 또는 독립적으로 작용되는 경우에 예상되는 것보다 큰 크기의 상승작용적 반응을 발생시킨다.

구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 아폽토시스를 매개하는 제1 세포 수용체 및 제2 세포 수용체에 대한 리간드이다. 구현예에서, 제제는 2개 이상의 TRAIL 수용체 리간드, 예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 TRAIL 폴리펩티드, 또는 TRAIL 수용체에 결합하는 항체 분자를 포함하며, 표적 세포, 예를 들어, 암세포에서 아폽토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, TRAIL 수용체 리간드를 포함하는 제핵 RBC가 NSCLC를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, TRAIL 수용체 리간드를 포함하는 RBC는 표적화 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 구현예에서, 제1 표적 및 제2 표적은 동일한 기질, 예를 들어, 기질 단백질과 상호작용한다. 구현예에서, 제1 표적 및 제2 표적은 상이한 기질과 상호작용한다.

TRAIL(TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드)은 아폽토시스를 유도하는 TNF 패밀리의 일원이다. TRAIL은 적어도 2개의 수용체 TRAIL R1 및 TRAIL R2를 갖는다. TRAIL 수용체 효능제, 예를 들어, 수용체 중 하나 이상에 결합하는 TRAIL의 돌연변이체, 또는 TRAIL R1 또는 TRAIL R2 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 항체 분자(예를 들어, 문헌[Gasparian et al., Apoptosis 2009 Jun 14(6), Buchsbaum et al. Future Oncol 2007 Aug 3(4)] 참조)가 광범위한 암에 대한 임상 요법으로 개발되었다. TRAIL 수용체 효능제의 임상 시험은 다른 이유들 중에서 많은 원발성 암이 단일 수용체를 통한 신호전달에 민감하지 않고, 오히려 세포독성을 유도하기 위해 둘 모두의 수용체의 연대를 필요로 한다는 사실로 인해 실패하였다(Marconi et al., Cell Death and Disease (2013) 4, e863). 일 구현예에서, 조작된 적혈구에서 발현된 제제는 조합시 세포가 둘 모두의 TRAIL 수용체와 동시에 연대하고 이를 효능화하는 것을 가능하게 하여 이에 따라 표적 암세포의 아폽토시스의 상승작용적 유도를 발생시키는 단일 수용체-특이적 TRAIL 효능제이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 이의 표면 상에 TRAIL R1에 결합하는 제1 폴리펩티드 및 TRAIL R2에 결합하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 구현예들에서, 각각의 폴리펩티드는 다른 수용체에 대한 Kd보다 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500배 더 강한 TRAIL R1 또는 TRAIL R2에 대한 Kd를 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, TRAIL R1-특이적 리간드 및 TRAIL R2-특이적 리간드를 포함하는 제핵 적혈구는 대략 동일한 친화성으로 TRAIL R1 및 TRAIL R2에 결합하는 리간드를 포함하는 제핵 적혈구보다 더 나은 TRAIL R1 및 TRAIL R2의 이종이량체화를 촉진한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 1개, 2개, 또는 그 초과는 TNF 상과의 일원이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 사멸 수용체 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2) 중 하나 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 TNFRSF10A/TRAILR1, TNFRSF10B/TRAILR2, TNFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF10D/TRAILR4, 또는 TNFRSF11B/OPG 중 하나 이상에 결합한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 MAPK8/JNK, 카스파제 8, 및 카스파제 3 중 하나 이상을 활성화한다.

일부 구현예에서, TRAIL 폴리펩티드는 본원의 SEQ ID NO:1 내지 5 중 임의의 SEQ ID NO의 서열, 또는 이와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 TRAIL 효능제이다. 서열 동일성은, 예를 들어, BLAST(기본 로컬 정렬 검색 도구)에 의해 측정된다. SEQ ID No 1 내지 5는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Mohr et al. BMC Cancer (2015) 15:494]에 추가로 기재된다.

TRAIL 수용체 리간드의 모든 조합이 구상된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 제제는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:5; 또는 SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5, 또는 상기 중 임의의 것의 단편 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에서, TRAIL 수용체 리간드는 항체 분자를 포함한다. 구현예들에서, 항체 분자는 TRAIL R1 및 TRAIL R2 중 하나 또는 둘 모두를 인지한다. 항체 분자는, 예를 들어, 마파투무맙(Mapatumumab)(인간 항-DR4 mAb), 티가투주맙(Tigatuzumab)(인간화 항-DR5 mAb), 렉사투무맙(Lexatumumab)(인간 항-DR5 mAb), 코나투무맙(Conatumumab)(인간 항-DR5 mAb), 또는 아포맙(Apomab)(인간 항-DR5 mAb)일 수 있다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 TRAIL 수용체에 결합하는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5개 이상)의 상이한 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 TRAIL 수용체에 결합하는 적어도 하나의 항체 분자 및 적어도 하나의 TRAIL 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 제제는 경로의 상류 및 하류 단계를, 예를 들어, 동시에 표적화함으로써 제제-상승작용적으로 작용하는 다중-단계 경로의 조정자이다.

증식적 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 증식적인 경우, 제1 제제는 제1 경로의 일부인 제1 분자에 대해 작용하고, 제2 제제는 제2 경로의 일부인 제2 분자에 대해 작용하며, 상기 경로들은 원하는 반응에 대해 함께 작용한다.

일부 구현예에서, 원하는 반응은 세포 사멸, 예를 들어, 암세포의 사멸이다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 암 치료에서, 예를 들어, 종양 또는 종양 미세환경으로 인해 무반응이거나 또는 달리 비-기능성인 내인성 또는 외인성 항-종양 T 세포를 활성화시키는 것이 이로울 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 다수의 T 세포 활성화 경로를 촉발하여 항암 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 조작된 적혈구 세포는 T 세포 증식을 촉진한다. 구현예들에서, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개 이상)의 T 세포 활성화 리간드는 표 2의 리간드 또는 이의 T-세포 활성화 변이체(예를 들어, 단편)를 포함한다.

구현예들에서, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개 이상)의 T 세포 활성화 리간드는 표 2의 표적 수용체에 결합하는 항체 분자 또는 이의 T-세포 활성화 변이체(예를 들어, 단편)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 T 세포를 자극하고, 면역-종양학 환경에서 무반응을 극복하기 위한 상이한 T 세포 활성화 리간드, 예를 들어, CD80, 41BB-리간드, CD86, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 4-1BBL, OX40L, 및 CD40L, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 구현예들에서, 이들 단백질은 상보적 활성화 경로를 통해 신호를 전달한다. 일부 구현예에서, 리간드는 활성화 사이토카인, 인터페론, 또는 TNF 패밀리 일원(예를 들어, 표 1의 TNF 패밀리 일원), 예를 들어, IFNa, IL2, 또는 IL6 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 구현예에서, 제제는 상기 부류의 분자의 조합물이다. 제제는 표적 수용체에 대한 내인성 리간드 또는 항체 분자로부터 유래될 수 있다.

[표 2] T 세포 활성화

일부 구현예에서, 항-IL6 또는 TNFa 항체 분자는 본원의 SEQ ID NO:6 또는 7의 서열, 또는 이와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

또 다른 예로서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 T 세포 활성화 리간드 및 면역-종양학 환경에서 면역 억제 분자(예를 들어, 면역 억제 수용체), 예를 들어, CD80 및 항-PD1을 억제하는 제제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나의 제제는 활성화 4-1BBL, 또는 이의 단편 또는 변이체이고, 제2 제제는 PD1 신호전달을 차단하는 항체 분자(예를 들어, PD1 또는 PD-L1에 대한 항체 분자)이다. 따라서, 구현예들에서, 표적 T 세포는 활성화되며, 억제되는 것이 방지된다. 면역 억제 분자를 억제하는 제제의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타의 억제제(예를 들어, 이들에 결합하는 항체 분자), 또는 이의 기능성 변이체(예를 들어, 단편)를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 억제 분자를 억제하는 제제는 표 3의 억제 리간드의 억제제, 또는 이의 억제 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 면역 억제 분자를 억제하는 제제는 표 3의 표적 수용체에 결합하는 항체 분자, 또는 이의 단편 또는 변이체이다.

[표 3] T 세포 억제

일부 구현예에서, 암을 치료하기 위한 제제 중 하나는 활성화 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-12, 또는 표 1의 또 다른 활성화 사이토카인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에서, 목적은 T 세포를 활성화시키거나 억제하는 것이다. T 세포가 본원에 기재된 바와 같은 활성화 또는 억제 수용체를 또한 발현할 수 있는 다른 면역 세포보다 우선적으로 표적화되도록 하기 위해, 적혈구(예를 들어, 그물적혈구) 상의 제제 중 하나는 표적화 모이어티, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 또는 또 다른 T 세포 마커에 결합하는 항체 분자를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 본원에서 "국소화 배치"를 제목으로 하는 섹션에 더욱 상세히 기재된다. 일부 구현예에서, 특이적 T 세포 서브타입 또는 클론이 향상(항-종양 특이성을 갖는 T 세포)되거나, 억제될 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구(예를 들어, 그물적혈구) 상의 제제 중 하나 이상은 항원-특이적 방식으로 T 세포 수용체에 선택적으로 결합할 펩티드-MHC 분자이다.

일부 구현예에서, 복수의 제제는 복합체 표적, 예를 들어, 다수의 특이성을 갖는 복잡한 면역 반응을 일으키는 것이 바람직한 종양 세포로부터 유래된 다수의 항원을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 일부 구현예에서 항원 및 공동자극 분자를 포함하며, 예를 들어, 여기서 적혈구 세포는, 예를 들어, 암 예방접종을 위해 APC로 작용할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 제1 표적 및 제2 표적을 갖는 대상체에 투여된다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적에 대해 작용한다. 선택적으로, 제핵 적혈구는 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하고, 환자는 제3 표적을 포함한다. 구현예들에서, 제3 외인성 폴리펩티드는 제3 표적에 대해 작용한다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포는 제1 경로에서 제1 표적의 효능제 또는 길항제인 제1 외인성 폴리펩티드를 포함하고, 제2 경로에서 제2 표적의 효능제 또는 길항제인 제2 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 제1 및 제2 경로는 원하는 반응에 대해 함께 작용한다. 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드는 둘 모두 효능제일 수 있거나, 둘 모두 길항제일 수 있거나, 하나는 효능제이고, 다른 하나는 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상은 면역 체크포인트 효능제 또는 길항제이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 표적화 제제를 추가로 포함한다.

독립적 기능 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 독립적 기능 관계를 갖는 경우, 제제는 2개의 별개의(예를 들어, 상보적) 기능을 갖는다. 예를 들어, 제1 제제는 제1 표적에 결합하고, 제2 제제는 제2 표적에 결합한다. 환자는 제1 또는 제2 표적이 결여되어 있을 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 제제는 상이한 경로에 존재한다.

패혈증, 종양 용해 증후군, 및 사이토카인 폭풍으로 표시되는 다른 질환에서, 손상은 염증성 사이토카인의 다양한 혼합에 의해 유발된다. 하나의 사이토카인에 대한 기존 단일요법은 종종 상기 급성 질환을 치료하기에 불충분하다. 또한, 때때로 임상적 손상을 예방하기 위해 시간 내에 사이토카인 폭풍의 조종자를 측정하는 것이 불가능할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 펩티드는 2개의 상이한 사이토카인에 결합하는 분자(예를 들어, 항체 분자)이다. 일부 구현예에서, 제제는 상이한 사이토카인에 결합하고 이를 중화시키고, 따라서 조작된 적혈구 생성물은 사이토카인 폭풍으로부터 다각적인 보호를 제공한다.

구현예들에서, 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어, IL-1, IL02, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 또는 IL-36을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 표 1의 사이토카인 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인은 TNFa이고, 제2 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어, IL-6, 또는 상기 중 임의의 것의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, 제제는 항-TNFa, 항-IL-6, 또는 항-IFNg 항체 분자, 또는 이들의 임의의 조합물, 또는 상기 중 임의의 것의 단편 또는 변이체를 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 제1 표적을 갖지만 제2 표적을 갖지 않는 대상체, 또는 제1 표적 또는 제2 표적을 갖는 것으로 공지되지 않은 환자에 투여된다. 구현예들에서, 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 실질적으로 결합되지 않은 채로 유지된다. 선택적으로, 제핵 적혈구는 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하며, 환자는 제3 표적이 결여되어 있거나, 제3 표적을 갖는 것으로 공지되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 복수의 외인성 폴리펩티드를 포함하며, 환자는 복수의 외인성 폴리펩티드 중 하나 또는 서브셋에 대한 표적을 갖지 않거나, 갖는 것으로 공지되어 있지 않다.

독립적 기능 배치의 예는 도 4에 제시된다. 도 4의 적혈구 세포는 제1 외인성 폴리펩티드(백색), 제2 외인성 폴리펩티드(선영), 및 임의의 제3 외인성 폴리펩티드(밀집한 선영)를 포함한다. 제1 외인성 폴리펩티드는 제1 표적, 예를 들어, 사이토카인 A에 결합할 수 있고, 제2 외인성 폴리펩티드는 제2 표적, 예를 들어, 사이토카인 B에 독립적으로 결합할 수 있다. 이러한 조작된 적혈구 세포는 둘 모두의 사이토카인이 대상체에 존재하는 경우 둘 모두를 포획하고 청소한다. 사이토카인 중 단지 하나가 대상체에 존재하는 경우, 조작된 적혈구 세포는 상기 사이토카인을 청소할 수 있다. 구현예들에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2개 또는 전부)은 항체 분자, 예를 들어, scFvs를 포함하며, 선택적으로 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 구현예들에서, 표적은 복수의 사이토카인, 케모카인, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

국소화 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 국소화 관계를 갖는 경우, 제1 제제는 작용 부위에 국소화되지 않는 경우의 활성에 비해 제2 또는 다른 제제 또는 제제들의 활성을 향상시키는 작용 부위로 RBC를 국소화시킨다(예를 들어, 표적으로의 제1 제제의 결합에 의하며, 표적 영역에서 제2 제제의 국소화 농도의 증가가 존재함). 일부 구현예에서, 하나의 제제는 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 작용 부위로 표적화하는 역할을 하며, 하나 이상의 제제는 치료 효과를 갖는다. 구현예에서, 제1 제제의 결합은 제2 제제에 의해 결합된 존재물, 예를 들어, 폴리펩티드의 활성을 증가시킨다. 구현예에서, 제1 제제는 제2 제제에 의해 결합된 존재물, 예를 들어, 폴리펩티드의 기질 또는 생성물에 결합한다. RBC를 국소화하는 제제는, 예를 들어, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드, 또는 표적 세포 상의 세포 표면 분자에 결합하는 항체일 수 있다.

도 9에 제시된 바와 같이, 세포는 하나 이상의 표적화 제제를 포함할 수 있다. 표적화 제제는 외인성 폴리펩티드일 수 있다. 구현예들에서, 2개의 표적화 제제를 포함하며, 이는 표적화 제제 중 하나만 포함하는 달리 유사한 적혈구 세포에 비해 표적에 대한 적혈구 결합의 특이성 및/또는 친화성 및/또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 적혈구 세포는 선택적으로 치료 활성, 예를 들어, 항암 활성을 갖는 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 치료 활성을 갖는 외인성 폴리펩티드는 효소, 포획 시약, 효능제, 또는 길항제를 포함할 수 있다.

구현예들에서, 표적화 모이어티는 수용체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 구현예들에서, 표적화 모이어티는 항체 분자, 예를 들어, scFv를 포함한다.

또 다른 예로서, 표적화 제제는 암세포, 예를 들어, 고형 종양 세포 또는 그 근처에 결합하고, 제2 제제(예를 들어, 제2 폴리펩티드)는 항암 기능을 갖는다. 일부 구현예에서, 작용 부위는 종양 혈관구조이다. 구현예들에서, 표적화 제제는 신생혈관구조의 마커에 결합하고, 예를 들어, 인테그린, 예를 들어, avB1, avB3, 또는 avB5, 또는 a4b1 인테그린, 예를 들어, 합성 펩티드 크노틴(knottin)(Kim et al, JACS 2016, 137(1)) 또는 내인성 또는 천연 리간드, 예를 들어, 에키스타틴(echistatin), RGD, EETI2.5F, 또는 VCAM-1에 결합하거나, 신생혈관구조에서 또한 풍부하게 발견되는 전립선-특이적 막 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 제제는 암세포 마커, 예를 들어, CD269(예를 들어, 다발골수종 세포에서 발현됨) 또는 CD123(예를 들어, ALM 세포에서 발현됨), CD28(예를 들어, T 세포에서 발현됨; CD28은 CD80/CD86에 의해 결합될 수 있음), NY-ESO-1(예를 들어, 난소암에서 발현됨)에 결합한다.

치료제는, 예를 들어, 항암 효과를 가질 수 있으며, 이 중에 몇몇 전략이 있다. 예를 들어, 치료제는 종양 세포가 성장하기 위해 선택적으로 필요로 하는 대사물을 분해하는 효소, 예를 들어, 아스파라기나제, 메티오닌 감마 리아제(MGL), 세린 데하이드로게나제, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 치료제는 혈관의 추가 성장을 방지하기 위한 혈관신생의 억제제, 예를 들어, 안지오포이틴(angiopoitin)의 억제제 또는 VEGF 또는 VEGFR의 억제제일 수 있다. 치료제는 T 세포를 활성화시키기 위한 면역자극 분자, 사이토카인 또는 T 세포 활성화 리간드일 수 있다(예를 들어, 표1 및 표 2 참조). 치료제는 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 또는 염증 대식세포에 결합할 수 있고, 효과기 세포를 포획하고, 종양에 근접시킬 수 있다. 치료제는 세포 사멸의 직접 매개체, 예를 들어, TRAIL 또는 FAS-L 또는 다른 사망 리간드, 또는 독소일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 TRAIL 수용체의 효능제, 예를 들어, 효능제 항체 분자를 포함한다. 구현예들에서, 치료제는 아폽토시스-촉진제이다. 구현예들에서, 치료제는 애쥬번트를 포함한다. 이들 치료제 중 임의의 치료제에 대해, 최종 결과는 종양 부위에 국소화되고, 이에 따라 효능을 증가시키는 위치에 항-종양 효과를 집중시키는 적혈구 치료제이다.

일부 구현예에서, 예를 들어, B 세포 암을 치료하기 위해, 제1 외인성 폴리펩티드는 세포를 암세포에 표적화할 수 있는 표면-노출된 항-CD20 항체 분자를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드는 암세포를 억제(예를 들어, 사멸)할 수 있는 표면-노출된 항-CD40 항체 분자를 포함한다. 적혈구 세포는, 예를 들어, 도 8에 예시된 바와 같이 항-CD40 항체 분자의 억제제를 추가로 포함할 수 있다.

제1 외인성 폴리펩티드는 표적화 제제를 포함할 수 있고, 제2 외인성 폴리펩티드는 효소를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 11). 예를 들어, 일부 구현예에서, 예를 들어, 암을 치료하기 위해, 적혈구 세포는 암세포에 결합하는 표적화 제제를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 암세포를 억제(예를 들어, 암세포를 사멸시키고, 암세포의 무반응을 유도하고, 암세포의 성장을 억제함)하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 표적화 제제는 T 세포, 예를 들어, 암성 T 세포의 표면 상의 CD4에 결합하는 항-CD4 항체를 포함할 수 있다. 제2 폴리펩티드는 표면-노출되거나 세포내, 예를 들어, 세포내이고, 막 결합되지 않을 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 효소는 트립토판을 고갈시키고, 암성 T 세포에서 무반응을 유도할 수 있는 IDO 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 ADA 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 효소는 프로테아제일 수 있다.

구현예들에서, 표적 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 및/또는 질병 세포이다. 표적화 제제는 항체 분자, 예를 들어, scFv를 포함할 수 있다.

제1 외인성 폴리펩티드는 표적화 제제를 포함할 수 있고, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적의 효능제를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 12 참조). 구현예들에서, 표적화 제제는 수용체 또는 이의 단편 또는 변이체, 항체 분자, 리간드 또는 이의 단편 또는 변이체, 사이토카인 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 감쇠자, 활성제, 세포-사멸 제제, 또는 세포독성 분자(예를 들어, 소분자, 단백질, RNA, 예를 들어, 안티센스 RNA, 또는 TLR 리간드)를 포함한다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 세포내 폴리펩티드이고, 예를 들어, 막 회합되지 않은 폴리펩티드이며, 일부 구현예에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표면-노출된 폴리펩티드이다.

적혈구 세포는 표적화 제제 및 포획 제제를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 13). 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드는 형질 세포에 결합하는 표적화 제제, 예를 들어, 항-BCMA 항체 분자를 포함할 수 있다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드는 표적이 내인성 수용체와 상호작용하는 것을 방지하고, 예를 들어, 수용체 결합 부위와 중첩되는 모이어티에서 표적에 결합하는 방식으로 표적에 결합한다. 구현예들에서, 표적화 모이어티는 질병 부위의 수용체에 결합한다. 구현예들에서, 표적화 제제는 리간드 또는 사이토카인 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 항체 분자, 예를 들어, scFv를 포함한다. 구현예들에서, 포획 제제는 수용체 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 항체 분자, 예를 들어, scFv를 포함한다. 구현예들에서, 리간드는 원치 않는 사이토카인 또는 케모카인이다.

표적화 제제는 적혈구 세포를 세포의 특정 서브타입으로 유도할 수 있다. 세포는 표적 세포에서 제공된 활성 또는 경로를 촉진하고, 예를 들어, 세포 사멸을 감쇠시키거나, 활성화시키거나, 유도할 수 있는 제2 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 14는 표적 세포에 결합할 수 있는 제1 외인성 폴리펩티드를 포함하는 적혈구 세포를 도시한다. 적혈구는 암세포를 억제(예를 들어, 암세포를 사멸시키거나, 암세포의 성장을 억제함)하는 제2 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드는 세포-사멸 제제, 예를 들어, 아폽토시스-촉진 제제, 예를 들어, 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 TRAIL 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 적혈구 세포는 또한 표면 노출되거나 세포내에 존재하는 표적화 제제 및 감쇠자 또는 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 표적화 제제 및 효소, 예를 들어, IDO 또는 ADA 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.

근접-기반 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 근접-기반 관계를 갖는 경우, 2개의 제제는 더 강하게 작용하고, 예를 들어, 이들이 물리적으로 분리되는 경우보다 이들이 서로 근접한 경우에 더 현저한 효과를 발휘한다. 구현예들에서, 2개의 제제는 이들이 서로 직접 결합되는 경우, 이들이 복합체(예를 들어, 제3의 제제에 의해 연결됨)의 일부인 경우, 이들이 동일한 세포막에 존재하는 경우, 또는 이들이 세포막의 동일한 서브섹션(예를 들어, 지질 뗏목 내, 지질 뗏목 외부, 또는 세포골격 성분과 같은 세포내 구조에 직접적 또는 간접적으로 결합됨)에 존재하는 경우에 근접하여 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제1 표적 분자에 결합하고, 제2 폴리펩티드는 제2 표적 분자에 결합하고, 이러한 결합은 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자가 서로 근접하게 이동시키고, 예를 들어, 서로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 분자는 표적 세포 상의 세포 표면 수용체이다.

근접-기반 예는 도 4에 제시된다. 도 4의 적혈구 세포는 임의의 제1 외인성 폴리펩티드(백색), 제2 외인성 폴리펩티드(밝은 회색), 및 제3 외인성 폴리펩티드(어두운 회색)를 포함한다. 제2 및 제3 외인성 폴리펩티드는 표적, 예를 들어, 사이토카인 B의 동일한 폴리펩티드 사슬 내의 상이한 에피토프에 결합한다. 적혈구에 마운팅된 제2 및 제3 외인성 폴리펩티드는 제2 및 제3 외인성 폴리펩티드가 자유 폴리펩티드인 경우보다 높은 결합력으로 표적에 결합한다. 예로서, 2개 이상의 외인성 폴리펩티드는 동일한 표적 상의 상이한 부위에 결합할 수 있으며, 표적은 사이토카인, 효소, 또는 항체이다.

스캐폴드 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 스캐폴드 관계를 갖는 경우, 제제는 2개 이상의 표적을 함께 모아서 표적이 서로 상호작용할 가능성을 증가시킨다. 구현예에서, 제1 및 제2 제제는 RBC의 표면, 예를 들어, 2개의 복합체화된 폴리펩티드에서 서로 회합된다(스캐폴드를 형성함). 구현예에서, 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 이특이적 항체 분자, 예를 들어, 본원, 예를 들어, 표 1, 표 2, 및 표 3 중 임의의 표에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2개)의 단백질을 인지하는 항체 분자를 포함한다.

표적은, 예를 들어, 단백질, 세포, 소분자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 표적은 단백질이다. 구현예에서, 제1 및 제2 표적은 세포이다.

또 다른 예로서, RBC는, 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)와 암세포를 서로 근접시켜서 면역 효과기 세포에 의해 암 세포의 사멸을 촉진한다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 암세포의 세포 표면 마커에 결합하고, 제2 폴리펩티드는 면역 효과기 세포의 세포 표면 마커에 결합한다. 제1 및 제2 폴리펩티드는, 예를 들어, 항체 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암세포 마커는 CD19(예를 들어, B 세포 급성 백혈병에서 발현됨), EpCAM(예를 들어, CTC에서 발현됨), CD20(예를 들어, B 세포 급성 백혈병에서 발현됨), CD45(예를 들어, CTC에서 발현됨), EGFR, HER2(예를 들어, 유방암 세포에서 발현됨)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포 마커는 CD3이다.

일부 구현예에서, RBC는, 예를 들어, 암 백신을 위해, 예를 들어, 항원 제시(예를 들어, 하나의 세포가 항원 제시 세포이고, 다른 세포가 T 세포인 경우)를 촉진하기 위해 면역 효과기 세포를 또 다른 면역 세포와 근접시킨다.

일부 구현예에서, RBC는 제1 항체 분자 도메인 및 제2 항체 분자 도메인을 포함하는 외인성 융합 폴리펩티드를 발현하며, 여기서 외인성 폴리펩티드는 이특이적 항체로서 작용하고, 예를 들어, 제1 항체 분자 도메인은 제1 세포 상의 제1 표적에 결합하고, 제2 항체 분자 도메인은 제2 세포, 예를 들어, 상이한 세포 유형 상의 제2 표적에 결합한다.

다합체 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 다합체 배치를 갖는 경우, 제제는 서로 조합되고, 예를 들어, 서로 결합하여 표적에 대한 기능 또는 활성을 갖는 복합체를 형성한다. 구현예에서, 제제는 세포 표면 복합체, 예를 들어, MHCI의 서브유닛이며, 기능은 펩티드에 결합하는 것이다. 구현예에서, 제제는 MHCII의 서브유닛이며, 기능은 펩티드에 결합하는 것이다. 구현예에서, 제제는 세포 표면 분자, 예를 들어, MHCI의 서브유닛 및 펩티드, 예를 들어, MHCI 분자에 로딩된 펩티드이며, 기능은 펩티드를 제시하는 것이다. 구현예에서, 제제는 MHCII의 서브유닛 및 펩티드, 예를 들어, MHCII 분자에 로딩된 펩티드이며, 기능은 펩티드를 제시하는 것이다. 일 구현예에서, 복합체는 기능성 MHC I이고, 제제는 MHC I(알파 사슬 1 내지 3) 및 베타-2 마이크로글로불린, 또는 이들의 단편 또는 변이체이다. 일 구현예에서, 복합체는 MHC II이고, 제제는 MHC II 알파 사슬 및 MHC II 베타 사슬, 또는 이들의 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, MHC 분자는 인간 MHC 클래스 I 또는 II, 예를 들어, MHC II 알파 서브유닛 및 MHC II 베타 서브유닛 또는 서브유닛 또는 이의 항원-제시 단편 둘 모두를 포함하는 융합 분자를 포함한다. 이들 2개의 폴리펩티드를 갖는 RBC가 일부 구현예에서 면역 유도 또는 항원 제시를 위해 사용된다. 일부 구현예에서, RBC는 MHC 분자와 항원 사이의 융합체인 단일 단백질, 예를 들어, 단일쇄 펩티드-MHC 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체의 막 구속되지 않은 성분, 예를 들어, 펩티드 또는 베타-2 마이크로글로불린은 표면으로의 트래피킹(trafficking) 전에 세포 내의 또 다른 제제와 어셈블리되거나, 세포에 의해 분비된 후 다합체의 막 구속된 성분에 의해 표면에 포획되거나, 조작된 적혈구에 정제된 형태로 첨가된다.

항원은 일부 구현예에서, 예를 들어, 암 백신을 위한 암 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 또는 35개의 아미노산 길이이다.

일부 구현예에서, 복합체는 상이한 폴리펩티드 사슬로부터 유래된 다수의 서브도메인을 포함하며, 이들 모두는 복합체가 활성이 되기 위해 발현되어야 한다.

보상 배치

2개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)가 보상 관계를 갖는 경우, 제1 제제는 제2 제제의 바람직하지 않은 특징을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제2 제제는 제공된 수준의 면역원성을 갖고, 제1 제제는, 예를 들어, 면역 세포에 부정적으로 신호전달하거나(표 3 참조), 제2 제제의 항원성 에피토프를 차폐함으로써 면역원성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 제공된 반감기를 갖고, 제1 제제는 제2 제제의 반감기를 증가시킨다. 예를 들어, 제1 제제는 샤페론 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.

제핵 적혈구 세포는 치료 단백질 및 이의 억제제를 공동 발현할 수 있다(예를 들어, 도 8). 억제제는 치료 단백질을 활성화시키기 위해 체내의 원하는 위치에서 방출(예를 들어, 치료제에 결합하는 것을 중단하나, 세포의 표면 상에 남아 있음)될 수 있다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 치료 활성을 갖는 제1 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 항-CD40 항체 분자), 제1 외인성 폴리펩티드를 억제하는 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, CD40 또는 이의 단편 또는 변이체)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(예를 들어, CD40)는 적혈구 세포가 원하는 위치, 예를 들어, 암세포에 이를 때까지 제1 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 항-CD40)의 활성을 억제할 수 있고, 예를 들어, 표적외 효과를 제한할 수 있다. 제2 외인성 폴리펩티드(예를 들어, CD40 또는 이의 변이체)는 제1 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 항-CD40)가 결합하는 표적(예를 들어, 내인성 CD40)의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 표적의 존재하에서 경쟁하는 약하게 결합하는 변이체일 수 있다. 구현예들에서, 제2 외인성 폴리펩티드에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 Kd는 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 Kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 20, 50, 또는 100배 더 크다. 적혈구 세포는 선택적으로 표적화 제제, 예를 들어, 항-CD20 항체 분자를 포함하는 제3 외인성 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 대상체의 원하는 부위에서 약물(예를 들어, 인슐린)이 되는 프로드러그(예를 들어, 프로인슐린)를 포함한다.

3개 이상의 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는 제핵 적혈구

구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)는 3개 이상, 예를 들어, 적어도 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000개의 제제를 포함한다. 구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구의 집단은 3개 이상, 예를 들어, 적어도 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000개의 제제를 포함하며, 예를 들어, 집단 내의 상이한 RBC는 상이한 제제를 포함하거나, 집단 내의 상이한 RBC는 상이한 복수의 제제를 포함한다. 구현예들에서, RBC 또는 RBC의 집단 내의 제제의 중 2개 이상(예를 들어, 전부)은 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상 활성을 갖는다.

구현예들에서, RBC는 RBC 전구 세포와 제제를 인코딩하는 복수의 mRNA를 접촉시킴으로써 생성된다.

진핵생물 디스플레이 스크리닝. 구현예에서, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 결합 검정에 사용하기 위해 세포의 조합성의 매우 다양한 푸울(pool)이 생성된다. 세포-표면 단백질을 인코딩하는 조합성의 매우 다양한 핵산 라이브러리가 생성될 수 있다. 상기 라이브러리는, 예를 들어, 완전히 가변적인 서열로 구성될 수 있거나, 매우 가변적인 조합 서열에 융합된 고정된 서열을 포함할 수 있다. 이들은 전기천공, 형질감염 또는 바이러스 형질도입과 같은 방법을 이용하여 혼합물로서 또는 개별적으로 적혈구 전구세포에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 이후 원하는 수준의 성숙까지 분화 배지에서 성장된다. 일 구현예에서, 세포는 매우 다중화된 시험관 내 검정에 사용된다. 세포는 미세역가 플레이트에서 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션된다. 웰은 원하는 수준의 엄격성으로 세포-양립성 완충액을 이용하여 세척된다. 남아 있는 세포는 분리되고, 특정 서열의 농축에 대해 분석된다. 일 구현예에서, 분석은 결합된 집단에서 농축된 아미노산 모티프를 확인하기 위해, 예를 들어, 질량분광법을 이용하여 단백질 수준에서 수행된다. 구현예에서, 분석은 결합된 집단에서 농축된 해당 아미노산 모티프로 동정되는 핵산 서열을 확인하기 위해 핵산 수준(RNA 또는 DNA)에서 수행된다. 구현예에서, 매우 다양한 세포 집단이 동물 모델(건강하거나 병에 걸린 모델)에 주입된다. 일 구현예에서, 세포는 이들의 생체 내 분포 또는 국소화를 시각화하기 위해 형광 표지된다. 동물의 다양한 조직이 이후 수집되고, 특정 아미노산 모티프 또는 해당 아미노산 모티프로 동정되는 핵산 서열의 상대 농축에 대해 분석될 수 있다.

발현 최적화. 상대적 전사 또는 번역 능력을 평가하기 위해 많은 수의 변이체가 개별적 세포에 동시에 형질감염될 수 있다. 구현예들에서, 단백질 코딩 서열의 라이브러리는 다양한 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 코돈 표현, 아미노산 변화, 및 다른 서열 차이를 갖도록 설계되고 합성된다. 이러한 라이브러리는 전기천공, 형질감염 또는 바이러스 형질도입과 같은 방법을 이용하여 혼합물로서 또는 개별적으로 적혈구 전구세포에 도입된다. 일 구현예에서, 세포는 이후 원하는 수준의 성숙까지 분화 배지에서 성장된다.

제핵 적혈구의 물리적 특징

일부 구현예에서, 본원에 기재된 RBC(예를 들어, 그물적혈구)는 본원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 물리적 특징, 예를 들어, 삼투 취약성, 세포 크기, 헤모글로빈 농도, 또는 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 외인성 단백질을 발현하는 제핵 RBC는 야생형의 미처리 RBC와 유사한 물리적 특징을 갖는다. 대조적으로, 저장성으로 로딩된 RBC는 때때로 비정상적인 물리적 특징, 예를 들어, 증가된 삼투 취약성, 변경된 세포 크기, 감소된 헤모글로빈 농도, 또는 세포막의 외엽 상에서의 증가된 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.

일부 구현예에서, 제핵 RBC는 세포에 의해 보유되지 않거나, 정제되지 않았거나, RBC 외부에 완전히 존재하지 않는 외인성 핵산에 의해 인코딩된 외인성 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, RBC는 안정제가 결여된 조성물에 존재한다.

삼투 취약성

일부 구현예에서, 제핵 적혈구는 외인성 폴리펩티드를 포함하지 않는 분리된 배양되지 않은 적혈구 세포와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 삼투 취약성은 WO2015/073587호의 실시예 59의 방법을 이용하여 검정될 수 있다.

세포 크기

일부 구현예에서, 제핵 RBC는 야생형의 처리되지 않은 RBC와 대략적인 직경 또는 부피를 갖는다.

일부 구현예에서, RBC의 집단은 약 4, 5, 6, 7, 또는 8 마이크론의 평균 직경을 갖고, 선택적으로 집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3 마이크론 미만이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RBC는 약 4 내지 8, 5 내지 7, 또는 약 6 마이크론의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, RBC의 직경은 약 1 마이크론 미만, 약 20 마이크론 초과, 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론이다. 세포 직경은 일부 구현예에서 Advia 120 혈액학 시스템을 이용하여 측정된다.

일부 구현예에서, RBC의 평균 적혈구 용적의 용적은 10 fL, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL 초과, 또는 150 fL 초과이다. 일 구현예에서, RBC의 평균 적혈구 용적은 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL 미만, 또는 200 fL 미만이다. 일 구현예에서, RBC의 평균 적혈구 용적은 80 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 펨토리터(fL)이다. 일부 구현예에서, RBC의 집단은 본 단락에 기재된 평균 적혈구 용적을 가지며, 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fL 미만이다. 평균 적혈구 용적은 일부 구현예에서 혈액학적 분석 장치, 예를 들어, 쿨터 계수기(Coulter Counter)를 이용하여 측정된다.

헤모글로빈 농도

일부 구현예에서, 제핵 RBC는 야생형의 처리되지 않은 RBC와 유사한 헤모글로빈 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, RBC는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 초과 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈을 포함한다. 일부 구현예에서, RBC는 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30 pg, 선택적으로 최대 약 30 pg의 전체 헤모글로빈을 포함한다. 헤모글로빈 수준은 일부 구현예에서 WO2015/073587호의 실시예 33의 드랍킨 시약(Drabkin's reagent) 방법을 이용하여 결정된다.

포스파티딜세린 함량

일부 구현예에서, 제핵 RBC는 야생형의 미처리된 RBC와 대략적으로 동일한 세포막의 외엽 상의 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 포스파티딜세린은 주로 야생형의 미처리된 RBC의 세포막의 내엽에 존재하며, 저장성 로딩은 포스파티딜세린이 외엽에 분포하도록 할 수 있으며, 여기서 이는 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 일부 구현예에서, RBC의 집단은 아넥신 V 염색에 대해 양성인 약 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 세포를 포함한다. 포스파티딜세린 노출은, 일부 구현예에서, 예를 들어, WO2015/073587호의 실시예 54의 방법을 이용하여 PS에 우선적으로 결합하는 아넥신-V-FITC에 대한 염색 및 유동세포분석법에 의한 FITC 형광 측정에 의해 평가된다.

다른 특징

일부 구현예에서, RBC의 집단은 GPA에 대해 양성인 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%(선택적으로, 최대 90 또는 100%)의 세포를 포함한다. GPA의 존재는 일부 구현예에서 FACS를 이용하여 검출된다.

일부 구현예에서, RBC는 대상체에서 적어도 30, 45, 또는 90일의 반감기를 갖는다.

일부 구현예에서, RBC를 포함하는 세포의 집단은 약 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 톱니적혈구를 포함한다.

일부 구현예에서, RBC는 제핵되고, 예를 들어, 본원에 기재된 치료 제조물로서 사용되는 RBC를 포함하는 세포의 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 초과가 제핵된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, RBC는 비기능성인, 예를 들어, 비활성화된 핵을 함유한다.

제핵 적혈구를 제조하는 방법

외인성 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는(예를 들어, 발현하는) 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 제조하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.

일부 구현예에서, 조혈 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산들과 접촉되며, 세포는 배양시 확장되고 분화된다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드가 단일 핵산, 예를 들어, 단일 벡터에서 인코딩된다. 구현예들에서, 단일 벡터는 각각의 유전자에 대한 별도의 프로모터를 가지며, 중간에 프로테아제 절단 부위를 갖는 단일 폴리펩티드로 초기에 전사되는 2개의 단백질을 가져, 이후의 단백질 분해성 처리는 2개의 단백질, 또는 임의의 다른 적합한 배치를 발생시킨다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩티드는 2개 이상의 핵산에서 인코딩되며, 예를 들어, 각각의 벡터는 폴리펩티드 중 하나를 인코딩한다.

핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있다. 레트로바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 렌티바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV 1), 및 스푸마바이러스, 예를 들어, 거품형성 바이러스를 예로서 포함하는 다수의 바이러스가 유전자 전달 비히클로 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 포함되는 WO2014/183071호 또는 WO2014/183066호에 기재된 바와 같은 소르태깅(sortagging)을 이용하여 생성된다.

일부 구현예에서, RBC는 적어도 1000, 2000, 5000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000배(선택적으로, 최대 100,000, 200,000, 또는 500,000배) 확장된다. 세포의 수는 일부 구현예에서 자동화 세포 계수기를 이용하여 측정된다.

일부 구현예에서, RBC의 집단은 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%(선택적으로, 최대 약 80, 90, 또는 100%)의 제핵 RBC를 포함한다. 일부 구현예에서, RBC의 집단은 1% 미만의 살아 있는 제핵 세포를 함유하고, 예를 들어, 검출 가능하지 않은 살아 있는 제핵 세포를 함유한다. 제핵은 일부 구현예에서 핵 염색을 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 RBC는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 발현은 일부 구현예에서 폴리펩티드에 대한 표지된 항체를 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 RBC는 제핵되고, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4 이상)의 외인성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, RBC의 집단은 약 1x10⁹ 내지 2x10⁹, 2x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 2x10¹⁰, 2x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 1x10¹¹ 내지 2x10¹¹, 2x10¹¹ 내지 5x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 2x10¹², 2x10¹² 내지 5x10¹², 또는 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 세포를 포함한다.

물리적으로 근접한 상승작용적 제제

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 서로 물리적으로 근접한 제1 제제 및 제2 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제제는 이들이 서로 물리적으로 근접한 경우에 상승작용적으로 작용하나, 이들이 별도인 경우에는 그렇지 않다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 제제는 공유적으로 연결되며, 예를 들어, 이들은 융합 단백질의 일부이거나, 화학적으로 함께 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 제제는 비공유적으로 연결되며, 예를 들어, 서로 직접 결합되거나 스캐폴드에 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 제제는 나노입자(예를 들어, 1 내지 100, 100 내지 2,500, 또는 2,500 내지 10,000 nm 직경) 리포솜, 소포, 비드, 중합체, 임플란트 또는 폴리펩티드 복합체의 일부(예를 들어, 이에 연결됨)이다.

일부 구현예에서, 조성물은 서로 물리적으로 근접한(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 연결됨) 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 본원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)의 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 임의의 표의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 이에 대한 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개 이상)은 사이토카인, 인터루킨, 사이토카인 수용체, Fc-결합 분자, T-세포 활성화 리간드, T 세포 수용체, 면역 억제 분자, 공동자극 분자, MHC 분자, APC-결합 분자, 독소, 표적화 제제, 항암제, 암세포 마커, 암세포 마커에 결합하는 제제, 또는 TRAIL 수용체 리간드를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2, 3개 이상)은 TRAIL 수용체 리간드, 예를 들어, 본원의 SEQ ID NO:1 내지 5 중 임의의 SEQ ID NO의 서열, 또는 이와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열, 또는 TRAIL 수용체에 결합하는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 제제는 제1 TRAIL 수용체, 예를 들어, TRAIL-RI에 결합하고, 제2 제제는 제2 TRAIL 수용체, 예를 들어, TRAIL-RII에 결합한다. 구현예들에서, 근접한 2개의 TRAIL 수용체 리간드는 TRAIL 수용체 리간드 단독과 비교하여 표적 세포에서 상승작용적 정도의 아폽토시스를 제공한다. 본원의 실시예 1은 암세포가 근접(예를 들어, 제핵 적혈구의 표면 상)한 2개의 TRAIL 수용체 리간드를 포함하는 조성물로 처리되는 경우에 상승작용적 활성을 입증한다.

하나 이상의 제제를 포함하는 조작된 적혈구

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 외인성 제제를 포함하는 조작된 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 제공한다. 더욱 특히, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 제공한다. 적혈구는 선택적으로 제2의 상이한 외인성 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드를 선택적으로 추가로 포함하는 적혈구에 의해 포함된 외인성 폴리펩티드)는 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드이다. 구현예들에서, 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 임의의 표로부터 선택되거나, 이의 단편 또는 변이체, 또는 이에 대한 항체 분자이다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드를 선택적으로 추가로 포함하는 적혈구에 의해 포함된 외인성 폴리펩티드)는, 예를 들어, 암의 치료를 위해 자극성 리간드, 예를 들어, CD80, CD86, 41BBL, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는, 예를 들어, 암, 예를 들어, 다발골수종의 치료를 위해 암세포 항원, 예를 들어, CD269를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드를 선택적으로 추가로 포함하는 적혈구에 의해 포함된 외인성 폴리펩티드)는 면역 체크포인트 분자를 억제한다. 구현예들에서, 외인성 폴리펩티드는 조작된 적혈구(예를 들어, 막횡단 부분 및 표면-노출된 부분을 포함함)의 표면에 위치하며, 면역 체크포인트 분자에 결합한다. 구현예들에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1 또는 PD-L1이다. 구현예들에서, 면역 체크포인트 분자는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGF 베타이다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드를 선택적으로 추가로 포함하는 적혈구에 의해 포함된 외인성 폴리펩티드)는 면역 체크포인트 분자를 억제한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 억제 항체 분자(예를 들어, 항체, 예를 들어, 일특이적 항체, 모노클로날 항체, 또는 단일쇄 항체)이다. 항체 분자는, 예를 들어, 인간화 또는 완전한 인간 항체일 수 있다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 융합 단백질, 예를 들어, Fc-수용체 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 면역 체크포인트 단백질과 상호작용하는 제제, 예를 들어, 항체 분자이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 면역 체크포인트 수용체의 리간드와 상호작용하는 제제, 예를 들어, 항체 분자이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 CTLA-4의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab)/예르보이(Yervoy) 또는 트레멜리무맙(tremelimumab))이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-1의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab)/Opdivo®; 펨브롤리주맙(pembrolizumab)/Keytruda®; 피딜리주맙(pidilizumab)/CT-011)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-L1의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, MPDL3280A/RG7446; MEDI4736; MSB0010718C; BMS 936559)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PDL2의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 Fc 융합체 또는 소분자 억제제)(예를 들어, PDL2/Ig 융합 단백질, 예를 들어, AMP 224)이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 B7-H3(예를 들어, MGA271), B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드의 억제제(예를 들어, 억제 항체 또는 소분자 억제제), 또는 이들의 조합물이다.

면역 체크포인트 분자의 억제제는 적어도 4개의 주요 범주로 나누어질 수 있다: i) T 세포 또는 자연살(NK) 세포 상에서 직접 억제 경로를 차단하는 항체 분자와 같은 제제(예를 들어, PD-1 표적화 항체, 예를 들어, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙, TIM-3을 표적으로 하는 항체, 및 LAG-3, 2B4, CD160, A2aR, BTLA, CGEN-15049, 또는 KIR을 표적으로 하는 항체), ii) T 세포 또는 NK 세포 상에서 직접 자극 경로를 활성화시키는 항체와 같은 제제(예를 들어, OX40, GITR, 또는 4-1BB를 표적으로 하는 항체), iii) 면역 세포 상에서 억제 경로를 차단하거나, 면역 세포의 억제 집단을 고갈시키기 위해 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하는 항체 분자와 같은 제제(예를 들어, CTLA-4 표적화 항체, 예를 들어, 이필리무맙, VISTA를 표적으로 하는 항체, 및 PD-L2, Gr1, 또는 Ly6G를 표적으로 하는 항체), 및 iv) 암세포 상에서 직접 억제 경로를 차단하거나, 암세포에 대한 세포독성을 향상시키기 위해 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하는 항체 분자와 같은 제제(예를 들어, 리툭시맙, PD-L1을 표적으로 하는 항체, 및 B7-H3, B7-H4, Gal-9, 또는 MUC1을 표적으로 하는 항체). 본원에 기재된 상기 제제는, 예를 들어, 당 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 설계되고 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Templeton, Gene and Cell Therapy, 2015; Green and Sambrook, Molecular Cloning, 2012]).

본원에 기재된 폴리펩티드에 대한 비히클

본원의 많은 구현예에서 하나 이상(예를 들어, 2개 이상)의 외인성 폴리펩티드가 적혈구 상 또는 내에 위치되는 한편, 본원에 기재된 임의의 외인성 폴리펩티드 또는 외인성 폴리펩티드의 조합물은 또한 또 다른 비히클 상 또는 내에 위치될 수 있음이 이해된다. 비히클은, 예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 소체, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 또는 엑소좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 발명의 개시는, 예를 들어, 표면 상에 본원에 기재된 하나 이상의 제제를 포함하는 비히클(예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 소체, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 또는 엑소좀)을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 PD-1에 결합하는 폴리펩티드(예를 들어, PD-1에 결합하는 항체 분자 또는 PD-1의 효능제, 예를 들어, PD-L1), PD-L1에 결합하는 폴리펩티드(예를 들어, PD-L1에 결합하는 항체 분자), CD20에 결합하는 폴리펩티드(예를 들어, CD20에 결합하는 항체 분자), 또는 TRAIL 수용체에 결합하는 폴리펩티드(예를 들어, TRAIL 수용체의 효능제)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 임의의 표의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 또는 이의 효능제 또는 길항제, 또는 이에 대한 항체 분자로부터 선택된 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 비히클은 본원에 기재된 2개 이상의 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 제제 중 임의의 쌍을 포함한다.

일부 구현예에서, 비히클은 적혈구 세포를 포함한다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 유핵 적혈구, 적혈구 전구세포, 또는 제핵 적혈구이다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 일반 골수성 전구세포(CMP), 배반포 콜로니-형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 거핵세포-적혈구 전구세포(MEP) 세포, 적혈구 콜로니-형성 단위(CFU-E), 그물적혈구, 적혈구, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 정염적혈모구, 또는 이들의 조합물이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 무한증식 또는 무한증식화 세포이다.

막 내에 캡슐화된 세포

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포 또는 본원에 기재된 다른 비히클은 막, 예를 들어, 반-투과성 막 내에 캡슐화된다. 구현예들에서, 막은 다당류, 예를 들어, 음이온성 다당류 알기네이트를 포함한다. 구현예들에서, 반투과성 막은 세포가 통과하는 것을 허용하지 않지만, 작은 분자 또는 거대분자, 예를 들어, 대사물, 단백질, 또는 DNA의 통과는 허용한다. 구현예들에서, 막은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Lienert et al., "Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics" Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107 (2014)]에 기재된 것이다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 막은 세포를 면역계로부터 차폐하고/하거나 근접한 복수의 세포를 유지시켜, 서로 또는 서로의 생성물과의 상호작용을 촉진한다.

본원의 조성물, 예를 들어 제핵 적혈구를 이용한 처리 방법

외인성 제제(예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는(예를 들어, 발현하는) 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 투여하는 방법은, 예를 들어, WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.

구현예들에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구는 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에게 투여된다. 치료될 수 있는 예시적 포유동물은 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의 적용 둘 모두에 적용 가능하다.

일부 구현예에서, RBC는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월마다 환자에게 투여된다.

일부 구현예에서, RBC의 용량은 약 1x10⁹ 내지 2x10⁹, 2x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 2x10¹⁰, 2x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 1x10¹¹ 내지 2x10¹¹, 2x10¹¹ 내지 5x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 2x10¹², 2x10¹² 내지 5x10¹², 또는 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 세포를 포함한다.

일부 구현예에서, RBC는 2주 내지 1년, 예를 들어, 1개월 내지 1년 이상, 예를 들어, 적어도 2주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 6개월, 1년, 2년의 기간에 걸쳐 환자의 혈류에서 투여된 RBC의 기능을 유지하기에 충분한 투여 요법(투여 용량 및 주기성)으로 환자에게 투여된다.

일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 제핵 적혈구(예를 들어, 그물적혈구)를 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암이다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 적혈구 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 적혈구의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 적혈구, 예를 들어, 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다.

암의 유형은 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담관암, 방광암, 골암, 장암, 뇌종양, 유방암, 공지되지 않은 원발성 암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 유암종, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신 융모 종양(GTT), 털세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, NSCLC, 림프종, 흑색종 피부암, 중피종, 남성암, 기태 임신, 구강암 및 입인두암, 골수종, 비강암 및 부비동암, 코인두암, 비-호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 속발성 암, 피부암(비-흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 공지되지 않은 원발성 암, 자궁암, 질암, 및 외음부암을 포함한다.

추가 표

[표 4] 예시적 개질제, 예를 들어, 프로테아제

실시예

실시예 1. 표면 상에서 2개의 상이한 TRAIL 수용체 리간드를 발현하는 eRBC의 제제-상승작용적 활성

TRAIL 수용체 효능제 DR4.2(SEQ ID 2) 및 DR5.2(SEQ ID 5)에 대한 유전자를 합성하였다. 유전자를 인간 글리코포린 A에 대한 유전자의 업스트림의 렌티바이러스 벡터(SBI)에 클로닝하였고, 이는 12개의 아미노산 Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:19)) 가요성 링커 및 HA 에피토프 태그(YPYDVPDY(SEQ ID NO:20))에 의해 분리되었다.

정상 인간 공여자로부터의 동원 말초 혈액 세포로부터 유래된 인간 CD34+ 세포를 AllCells Inc.로부터 동결된 채로 구입하였다. 세포를 1% FBS를 갖는 PBS에서 해동하였다. 이후, 세포를 1E5 세포/㎖의 밀도로 StemSpan CC100 Cytokine Mix를 갖는 StemSpan SFEM 배지에서 배양하였다. 배지를 5일째에 분화 배지로 바꾸었다.

바이러스 생성 프로토콜을 다음과 같이 수행하였다. 간략하게, HEK293T 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 세포를 패키징 플라스미드와 함께 작제물을 함유하는 렌티벡터로 형질감염시켰다. 배지 교환을 형질감염 24시간 후에 수행하고, 바이러스를 형질감염 72시간 후에 수확하였다. 해동 후 6일째에, 세포를 1:1의 세포 부피 대 바이러스 부피 비로 동등한 부피의 각각의 바이러스로 형질도입하고, 5 내지 10 ㎍/㎖의 폴리브렌으로 1.5시간 동안 845xg에서 회전식 접종하였다.

형질도입된 세포를 문헌[Hu et al., Blood 18 April 2013 Vol 121, 16]의 방법에 따라 규정된 배지에서 적혈구 계통 세포 및 성숙 제핵 그물적혈구로 분화시켰다. 간략하게, 세포 배양 절차는 3단계로 이루어졌다. 기본 배양 배지의 조성은 Iscove의 변형 둘베코 배지(Modified Dulbecco's Medium), 2% 인간 말초 혈액 혈장, 3% 인간 AB 혈청, 200 ㎎/㎖ Holohuman 트랜스페린, 3 IU/㎖ 헤파린, 및 10 ㎎/㎖ 인슐린이었다. 첫번째 단계(0일 내지 6일)에서, 10^5/㎖ 농도의 CD341 세포를 10 ng/㎖ 줄기 세포 인자, 1 ng/㎖ IL-3, 및 3 IU/㎖ 에리트로포이어틴의 존재하에서 배양하였다. 두번째 단계(7일 내지 11일)에서, IL-3를 배양 배지에서 제외하였다. 21일까지 지속된 세번째 단계에서, 세포 농도를 11일째에 10^6/㎖ 및 15일째에 5x10^6/㎖로 각각 조정하였다. 이러한 단계에 대한 배지는 기본 배지 및 3 IU/㎖ 에리트로포이어틴이었고, 트랜스페린의 농도를 1 ㎎/㎖로 조정하였다.

트랜스진의 발현을 상보적 형광 염료 플루오레세인(Fluorescein) 및 DyLight 650에 화학적으로 컨쥬게이션된 가용성 TRAIL R1 및 TRAIL R2(Sigma-Aldrich Inc.로부터 구입함)로 표지하고, 유동세포분석법에 의해 염색하여 모니터링하였다. 리간드 DR4.2 및 DR5.2 둘 모두의 발현 수준을 유동세포분석법을 통해 확인하였다.

종양 세포주 아폽토시스 검정을 문헌[Marconi et al., Cell Death and Disease 2013]의 변형된 형태에 따라 수행하였다. 간략하게, DR4.2 및 DR5.2를 발현하는 완전히 성숙한 제핵 그물적혈구를 1:1의 비율로 24시간 동안 CFSE-표지된 Raji 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 아넥신 V로 염색하고, 유동세포분석법으로 분석하였다. 아폽토시스 백분율을 또한 아넥신 V에 대해 양성으로 염색된 CFSE 양성 Raji 세포에서 결정하였다.

도 1에 제시된 바와 같이, CFSE-표지된 Raji 세포를 형질도입하지 않고 배양된 그물적혈구, DR4.2 형질도입시켜 배양된 그물적혈구, DR5.2 형질도입시켜 배양된 그물적혈구, 또는 DR4.2 형질도입하고 DR5.2 형질도입하여 배양된 그물적혈구의 혼합물과 인큐베이션하는 경우, 백그라운드에 비해 최소 세포 사멸이 관찰되었다. 그러나, CFSE-표지된 Raji 세포가 DR4.2 및 DR5.2 둘 모두로 동시에 형질도입되고, 따라서 둘 모두의 단백질을 동시에 발현하는 배양된 그물적혈구와 함께 인큐베이션되는 경우, 유의한 양의 세포 사멸이 관찰되었다(Raji 세포를 이용한 상기 검정에서 달성 가능한 TRAIL-유도 아폽토시스의 최대량과 동등함 - 예를 들어, 문헌[Marconi et al., Cell Death and Disease 2013] 참조). 이러한 데이터는 단일한 조작된 적혈구의 표면 상에서의 TRAIL 수용체 효능제의 협력 작용이 단일 TRAIL 수용체 효능제를 발현하는 세포 및 심지어 상이한 TRAIL 수용체 효능제를 각각 발현하는 세포의 혼합물에 비해 상승작용적 방식으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 나타낸다.

세포 집단은 AS-3 첨가 용액에서 제형화될 수 있고, 버킷림프종에 걸린 환자에 정맥내 투여될 수 있다. 환자는 이후 림프절 크기의 감소, 간비장비대의 개선, 및/또는 구역 및 구토의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 증상에서의 개선을 나타낼 것으로 예견된다.

실시예 2. 패혈증 치료에 사용하기 위한 5개의 사이토카인을 포함하는 포획 eRBC의 생성

항-TNFa(SEQ ID 7), 항-IL6(SEQ ID 6), CD14(Uniprot # P08571), IFNGR1(Uniprot # P15260), 및 IL12R1(Uniprot # P42701)에 대한 유전자는 상업적 공급자에 의해 합성된다. 유전자를 인간 글리코포린 A에 대한 유전자의 업스트림의 렌티바이러스 벡터(SBI)에 클로닝하며, 이는 12개의 아미노산 Gly-Ser(GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:19)) 가요성 링커 및 HA 에피토프 태그(YPYDVPDY(SEQ ID NO:20))에 의해 분리된다.

실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 CD34+ 세포는 배양될 수 있고, 바이러스는 생성될 수 있다. 형질도입된 세포를 본원에 기재된 바와 같이 분화시킨다.

트랜스진의 발현을 평가하기 위해, 세포를 리간드 TNFa, IL-6, IFNg, 및 IL-12(Life Technologies로부터 구입함), 뿐만 아니라 상보성 형광 염료에 화학적으로 컨쥬게이션된 지질다당류(ThermoFisher)로 동시에 표지한다. 세포를 (a) 제제가 세포의 표면에서 모두 발현되고, (b) 제제가 이들의 표적 리간드에 결합할 수 있는지 확인하기 위해 유동세포분석법으로 분석한다.

세포 집단을 AS-3 첨가 용액에서 제형화하고, 패혈증을 앓고 있는 환자에 정맥내 투여한다. 환자는 이후 순환 사이토카인 수준의 감소, 혈관 누출 증후군의 감소 또는 예방, 및 개선된 생존에 의해 측정되는 바와 같이 증상에서의 개선을 나타낼 것으로 예견된다.

실시예 3. 암 백신으로 사용하기 위한 종양 항원의 조합 라이브러리를 포함하는 eRBC

인간 CD34+ 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다. 세포는 본원에 기재된 바와 같이 적혈구 계통 세포로 분화된다.

흑색종 암세포의 샘플을 생검에 의해 환자로부터 분리한다. 세포를 용해시키고, 실리카 컬럼 정제(ThermoFisher)를 이용하여 전체 RNA를 추출하고, 흡광도 분광법에 의해 RNA 함량에 대해 정량하고, -80℃에서 보관한다.

적혈구 배양물의 최종 분화 4일 전에, 세포를 수집하고, 혈청-비함유 IMDM으로 2회 세척하고, Opti-MEM에서 10-40x10^6 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁한다. 이후, 0.5 ㎖의 세포 현탁액을 20 ㎍의 mRNA와 혼합하고, 300 V 및 150 uF의 조건에서 Easyject Plus 장치(EquiBio, Kent, United Kingdom)를 이용하여 0.4-㎝ 큐벳에서 전기천공한다. 전기천공 후, 신선한 적혈구 성숙 매질을 세포 현탁액에 첨가하고, 세포를 5% CO2가 보충된 가습 분위기에서 37℃에서 추가로 인큐베이션한다.

완전히 성숙한 그물적혈구를 세포 용해질의 질량 분광법 분석에 의해 단백질 발현에 대해 특성규명한다. RNA 대신 PBS가 투여되는 전기천공되지 않은 세포 및 전기천공된 세포가 외인성 암-유래 단백질로부터 내인성 그물적혈구 단백질을 확인하기 위한 대조군으로 사용된다.

세포 집단을 AS-3 첨가 용액에서 제형화하고, 흑색종을 앓고 있는 환자에 정맥내 투여한다. 환자는 이후 CT 스캐닝 및 흑색종 피부 병변의 해상도에 의한 전이 질량의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 흑색종 항원에 대한 면역 반응을 나타낼 것으로 예견된다.

실시예 4: 비-호지킨 림프종(NHL)에 대한 항-종양 요법으로서의 적혈구의 유전 공학

적혈구가 이들의 각각의 표적에 결합하고, 강력한 면역 반응을 활성화시킬 수 있는지 평가하기 위해 표면 상에서 PD-1 및 PD-L1에 대한 항체(RCT-항PD-1 및 RCT-항PD-L1)를 발현하는 적혈구를 생성시켰다. 재조합 PD-1 및 PD-L1에 대한 RCT-항PD-1 및 RCT-항PD-L1의 결합을 각각 유동세포분석법을 이용하여 결정하였고, 매우 특이적인 것으로 나타났다. 표면 상에 N-말단으로부터 C-말단으로 이필리무맙-기반 항-CTLA4 scFv 항체 도메인, 에피토프 태그, 및 전장 GPA(세포외, 막횡단, 및 세포질 도메인)를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 적혈구를 또한 생성시켰다. 항-CTLA4 폴리펩티드의 강력한 발현이 유동세포분석법 검정에서 관찰되었으며, 95.2% 초과의 세포가 항-CTLA4를 인코딩하는 벡터로 형질감염시킨 후에 항-CTLA4를 발현하였다.

기능 활성을 시험관 내 Jurkat 세포 IL-2 분비 검정을 이용하여 시험하였다. 이러한 검정에서, Jurkat 세포를 CD3/CD28 사량체를 이용한 자극에 의해 유도된 PD-L1을 발현하는 NHL 세포(Z138)와 인큐베이션함으로써 IL-2 분비가 억제된다. IL-2 분비는 Jurkat 및 Z138 세포와 RCT-항PD-1 또는 RCT-항PD-L1을 배양함으로써 구제되었으나, 대조군 RCT는 그렇지 않았다. RCT-항CTLA4는 또한 T 세포 IL-2 분비의 구제 및 회복을 나타내었다.

표준 항원 리콜 검정에서 활성화를 유도하는 이들 조작된 적혈구의 능력을 검정하였다. 항원 리콜 검정에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 인터페론-감마 분비에서 강력한 4 내지 6배의 증가가 입증되었다. 공여자 PBMC를 일반적인 독감 바이러스 항원으로 자극하였다. 면역 체크포인트 억제에 민감한 기억 T 세포를 대조군 PBMC 또는 대조군 RCT와 비교하여 RCT-항PD-1 또는 RCT-항PD-L1과의 공동 배양에 의한 활성화 및 감마 인터페론 분비에 대해 시험하였다.

이들 실험은 적혈구가 특정 세포-세포 상호작용 및 면역 체크포인트에 관여할 수 있음을 나타낸다.

또한, 표면 상에 항-CD20 단일쇄 가변 단편(RCT-항CD20)을 발현하는 적혈구를 생성시켰다. 시험관 내에서 CD20+ 림프종 세포에 결합하는 능력을 평가하였다. 이러한 실험은 유동세포분석법 및 면역형광 현미경검사를 이용하여 표적 세포에 대한 RCT-항CD20의 효율적이고 특이적인 결합을 입증하였다. RCT-항CD20 세포와 DoHH2(소포림프종), Ramos(버킷 림프종), Granta-519(외투 세포 림프종) 및 SU-DHL-4(광범위 큰 B 세포 림프종)의 림프종 서브타입을 대표하는 CD20+ 인간 림프종 세포주의 패널을 공동 배양함으로써 상기 상호작용이 아폽토시스를 유도할 수 있는지 또한 평가하였다. 모든 경우에서, RCT-항CD20 공동 배양은 RCT 또는 가용성 리툭시맙 모노클로날 항체 단독에 비해 증가된 아폽토시스를 발생시켰다. 시험관 내에서의 직접적인 종양 세포 사멸은 림프종 세포에서 CD20의 과-가교(hyper-crosslinking)로 인해 모노클로날 항체 단독보다 효과적인 것으로 가정된다. 이러한 효과는 수용체 클러스터링의 원위치 입증 및 아폽토시스 경로의 자극 둘 모두에 의해 제시되었다. 따라서, 이들 발견은 RCT에서 발현된 단백질에 대한 새로운 생물학 및 생체 내에서 림프종 종양에 대한 영향에 대한 보장된 시험을 입증한다.

실시예 5: 표적 단백질의 포획 및 변형

본 실시예에서, 표적 단백질을 포획하고 변형시키기 위해 트랜스제닉 제핵 적혈구 세포를 사용하였다. 대조군 세포 및 실험 세포는 각각 이들의 막 내에 표적 단백질에 결합시키기 위해 사용된 내인성 글리코포린 A(GPA)를 포함한다. 실험 세포는 막 앵커로서 GPA에 융합된 표면-노출된 IdeS를 포함하는 외인성 단백질을 발현하였다. IdeS는 항체를 절단하여 F(ab')2 단편 및 Fc 단편을 생성할 수 있다. 표적 단백질은 FITC로 형광 표지된 항-GPA 항체이다. 표적 항체의 불변 및 가변 영역 둘 모두를 FITC-표지하였고, 따라서 항체가 절단되는 경우, 둘 모두의 단편이 검출될 수 있다.

첫째로, 대조군 세포 및 IdeS-발현 세포를 항-GPA 항체에 결합하는 능력에 대해 FACS로 시험하였다. 대조군 및 IdeS-발현 세포 둘 모두는 FITC와 세포의 회합에 의해 측정된 바와 같이 항체에 결합하였다(데이터는 제시되지 않음). 또한, 대조군 및 IdeS-발현 세포 둘 모두는 형광 표지된 항-토끼 Fc 항체를 이용한 제2의 검출 방법에 의하거나 이를 이용하여 측정시 항체에 결합하였다(데이터는 제시하지 않음). 이들 측정은 세포가 표적 항체의 IdeS-매개 절단을 가능하게 하도록 인큐베이션되기 전에 초기 시점에서 수행되었다.

대조적으로, IdeS-발현 세포만 표적 항체를 절단할 수 있었다. 이는 대조군 또는 IdeS-발현 세포를 표적 항체와 인큐베이션하여 항체 절단이 발생하는 것을 나타내었다. 적혈구 세포의 표면 상의 온전한 항체를 검출하기 위해 형광 표지된 항-토끼 Fc 항체를 반응물에 첨가하였다. IdeS-발현 세포는 세포와의 항-토끼 Fc 회합에서 감소를 나타내었고(도 2), 이는 대조군 세포에 비해 IdeS-발현 세포의 표면에서 Fc의 낮은 수준을 나타낸다. 대조군 세포 또는 IdeS-발현 세포와 회합된 직접 FITC-표지된 표적 항체의 양에서 감소가 없었고, 이는 표적 항체의 적어도 FITC-표지된 가변 영역이 여전히 IdeS-발현 및 대조군 세포에 결합함을 나타낸다. 이러한 결과는 대조군 또는 IdeS-발현 세포의 상층액에서 온전한 항체 및 절단된 항체를 검출하기 위해 항 토끼 중쇄 및 항 토끼 경쇄 항체가 사용된 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 실험은 IdeS-발현 적혈구 세포가 항-GPA-항체를 절단하여 중쇄 단편의 출현을 발생시켰으나, 대조군 적혈구 세포는 그렇지 않음을 나타내었다(도 3).

따라서, 대조군 세포는 표적 항체에 결합할 수 있었으나, IdeS-발현 세포만 표적 항체에 결합하고 이를 절단할 수 있었다.

실시예 6: T 세포 증식을 촉진하는 RCT-항-PD-L1

본 실시예는 PBMC 단독과 비교하는 경우 RCT-항PD-L1과의 인큐베이션 후 T 세포의 전체 수에서의 4.4배 증가를 기초로 하여, RCT-항PD-L1과 PBMC의 공동 배양이 향상된 T-세포 증식을 발생시킨 것을 입증한다.

실시예 7: 공동자극 단백질을 발현하는 RCT

또 다른 각도에서 T-세포 활성화를 접근하면서, RCT를, 항원 제시 세포에서 발현되고, T-세포 상의 41-BB 수용체에 결합하는 공동 자극 단백질인 41-BB-L을 발현하도록 조작하였다(RCT-41-BB-L). 재조합 41-BB에 대한 RCT-41-BB-L의 결합을 유동세포분석법을 이용하여 결정하였다. PBMC와 RCT-41-BB-L의 공동 배양은 PBMC 단독에 비해 T-세포 증식에서 1.7배의 증가를 나타내었다. 최종적으로, RCT-41-BB-L을 41-BB 및 NFkB-Luc2P를 과발현하는 Jurkat 세포와 인큐베이션하는 경우, NFkB-매개 루시퍼라제 발현의 활성화가 대조군에 비해 30배 증가하였다.

실시예 8: 항-CD20 및 TRAIL 리간드를 공동 발현하는 적혈구 치료제

적혈구 세포가 항-CD20뿐만 아니라 Trail 리간드(아폽토시스 유도제)를 동시에 발현하도록 조작된 경우, Ramos 세포와 RCT-항CD20, RCT-Trail, 및 RCT-항CD20 +Trail(공동-발현됨)의 공동-배양은 48시간 후에 각각 32%, 47% 및 76% 아폽토시스를 발생시켰고, 이는 공동-발현 RCT의 상승작용적 세포-사멸 효과를 암시한다.

TRAIL 리간드 및 항-CD20 모이어티를 포함하는 세포 집단은 AS-3 첨가 용액에서 제형화될 수 있고, 환자, 예를 들어, 암에 걸린 환자에게 정맥내 투여될 수 있다.

<110> RUBIUS THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO MULTIMODAL THERAPEUTIC CELL SYSTEMS FOR CANCER INDICATIONS <130> 2018FPI-06-006/US <150> 62/420,973 <151> 2016-11-11 <150> 62/370,915 <151> 2016-08-04 <150> 62/359,448 <151> 2016-07-07 <150> 62/277,130 <151> 2016-01-11 <150> PCT/US 2017/013035 <151> 2017-01-11 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu 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Leu Gly Ile Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Arg Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 4 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met His His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 5 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Arg Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met His His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 6 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala 145 150 155 160 Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 210 215 220 Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Ile Lys Arg <210> 7 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 8 <211> 312 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 8 Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro 1 5 10 15 Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Lys 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Glu Lys Ile Glu Ala Tyr Leu Lys Lys His Pro Asp Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Met Phe Gly Asp Gln Glu Leu Leu Asp Val Arg Lys Val Ile 100 105 110 Asn Thr Lys Gly Asp Gln Thr Asn Ser Glu Leu Phe Asn Tyr Phe Arg 115 120 125 Asp Lys Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ala Arg Arg Ile Gly Val Met Pro 130 135 140 Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Gln Thr Thr Asp Val Asn Arg Thr Tyr Gln Glu Lys Asp Arg 165 170 175 Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile 195 200 205 Ser Asp Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp 225 230 235 240 Gly Ala Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr 245 250 255 Asp Ser Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly 260 265 270 Val Asn Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu 275 280 285 Asp Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly 290 295 300 Gln Asp Ser Trp Asn Gln Thr Asn 305 310 <210> 9 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val 1 5 10 15 Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp 20 25 30 Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val 35 40 45 Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu 50 55 60 Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val 65 70 75 80 Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg 85 90 95 Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro 100 105 110 Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr 115 120 125 Ser Asp Gln 130 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser 1 5 10 15 Ile Ser Ala <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala His His Ala Gln Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Any amino acid <400> 17 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 18 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Trp Ala Ala Thr Pro Thr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Gly Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser 65 70 75 80 Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 1 5

Claims (59)

1. 복수의 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구로서, 복수의 외인성 폴리펩티드의 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 제제-부가적, 제제-상승작용적, 증식적, 독립적 기능, 국소화-기반, 근접-의존성, 스캐폴드-기반, 다합체-기반, 또는 보상 활성을 갖는, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구.
2. 제1 외인성 폴리펩티드, 제2 외인성 폴리펩티드, 및 제3 외인성 폴리펩티드를 포함하는, 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구.
3. 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구로서,
   a) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 동일 표적에 대해 작용하며, 선택적으로 표적이 세포 표면 수용체 및/또는 내인성 인간 단백질이거나;
   b) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 내인성 인간 단백질에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가, 예를 들어, 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 또는 1 nM 미만의 Kd로 제2 내인성 인간 표적 단백질에 결합하거나;
   c) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적이 동일한 생물학적 경로의 일원이고, 선택적으로 표적이 세포 표면 수용체, 내인성 인간 단백질, 또는 둘 모두이거나;
   d) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 아폽토시스-촉진 폴리펩티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 아폽토시스-촉진 폴리펩티드, 예를 들어, TRAIL 수용체 리간드, 예를 들어, TRAIL 폴리펩티드를 포함하거나;
   e) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 서로 근접하여 존재하고, 예를 들어, 적어도 1, 2, 5, 10, 30, 또는 60초; 1, 2, 5, 10, 30, 또는 60분, 또는 1, 2, 3, 6, 12, 또는 14시간의 기간 동안 10, 7, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.2, 또는 0.1 nm 미만 떨어져 있거나;
   f) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 서로에 대해 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2, 또는 1 nM 미만의 Kd를 갖거나;
   g) 제1 외인성 폴리펩티드가 항원-제시 폴리펩티드, 예를 들어, MHC 분자, 예를 들어, MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 항원, 예를 들어, 암 항원을 포함하거나;
   h) 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 상이한 표적에 대해 작용하고, 선택적으로 표적 중 적어도 하나가 세포 표면 수용체 및/또는 내인성 인간 단백질이고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 세포 유형, 예를 들어, 암세포에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 세포 유형, 예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 결합하거나;
   i) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드가 중량 또는 카피 수를 기준으로 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 약 100:1 내지 1:100의 존재비를 갖거나;
   j) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드가 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 약 100:1 내지 1:100의 비로 제1 표적 및 제2 표적 각각에 대한 Kd를 갖거나;
   k) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대한 제1 활성(예를 들어, 결합)을 갖고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대한 제2 활성(예를 들어, 결합)을 갖고, 예를 들어, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 단일 표적에 결합하거나;
   l) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적이 동일 경로의 일부이고, 선택적으로 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대해 작용하고, 동시에 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 표적에 대해 작용하거나;
   m) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 표적에 대해 작용(예를 들어, 결합)하고, 제1 및 제2 표적이 상이한 경로의 일부이고, 선택적으로 제1 및 제2 경로 둘 모두가 제공된 세포 반응을 촉진하도록 작용하거나;
   n) 제1 외인성 폴리펩티드가 원하는 부위, 예를 들어, 인간 세포로 제핵 적혈구를 국소화하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 치료 활성, 예를 들어, 면역조절 활성, 예를 들어, T 세포 활성화 활성, T 세포 억제 활성, 또는 항원 제시 활성을 갖거나;
   o) 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 세포, 예를 들어, 제1 세포 유형, 예를 들어, 암세포에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 세포, 예를 들어, 제2 세포 유형, 예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 결합하거나;
   p) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드가 비-인간 단백질이거나;
   q) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드 둘 모두가 효소, 예를 들어, 생합성 효소이거나;
   r) 제1 외인성 폴리펩티드가 중간체 분자의 형성을 촉진하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 중간체 분자에 대해 작용하거나;
   s) 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드가 경로의 연속적 단계에 대해 작용하는,
   제핵 적혈구, 예를 들어, 그물적혈구.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 제제-부가적 활성을 갖는 제핵 적혈구.
5. 제4항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 암세포(예를 들어, 항-EPCAM 분자를 포함함)에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 암세포(예를 들어, 항-CD45 항체 분자를 포함함)에 결합하는 제핵 적혈구.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 제제-상승작용적 활성을 갖는 제핵 적혈구.
7. 제6항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 아폽토시스를 매개하는 제1 세포 수용체에 대한 리간드(예를 들어, TRAIL 수용체에 대한 리간드, 예를 들어, TRAIL 폴리펩티드를 포함함)를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 아폽토시스를 매개하는 제1 세포 수용체에 대한 리간드(예를 들어, TRAIL 수용체에 대한 리간드, 예를 들어, TRAIL 폴리펩티드를 포함함)를 포함하는 제핵 적혈구.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 증식적 활성을 갖는 제핵 적혈구.
9. 제8항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 표 2의 T 세포 활성화 리간드 또는 이의 T-세포 활성화 변이체(예를 들어, 단편)를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표 2의 제2의 T 세포 활성화 리간드 또는 이의 T-세포 활성화 변이체(예를 들어, 단편)를 포함하는 제핵 적혈구.
10. 제8항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 표 3의 억제 리간드의 억제제, 또는 이의 억제 단편 또는 변이체를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표 3의 억제 리간드의 제2 억제제, 또는 이의 억제 단편 또는 변이체를 포함하는 제핵 적혈구.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 독립적 기능 활성을 갖는 제핵 적혈구.
12. 제11항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 사이토카인에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 사이토카인에 결합하는 제핵 적혈구.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 국소화-기반 활성을 갖는 제핵 적혈구.
14. 제13항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 암세포 또는 그 근처에 결합(예를 들어, 종양 신생혈관구조에 결합)하는 표적화 모이어티를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 항암 기능을 갖는(예를 들어, 효소, 혈관신생의 억제제, 면역자극 분자, 또는 아폽토시스-촉진제를 포함함) 제핵 적혈구.
15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 근접-의존성 활성을 갖는 제핵 적혈구.
16. 제15항에 있어서, 표적 모이어티 또는 모이어티들과의 상호작용 전, 상호작용 동안, 또는 상호작용 후 복수의 폴리펩티드 사이의 근접이 생체 내 또는 시험관 내에서 상기 근접의 부재하에서 관찰되지 않는 특성 또는 결과를 제공하는 제핵 적혈구.
17. 제15항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 제1 표적 모이어티, 예를 들어, 표적 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포) 상의 제1 표적 세포 폴리펩티드와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제2 표적 모이어티, 예를 들어, 표적 세포 상의 제2 표적 세포 폴리펩티드와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합하는(예를 들어, 제1 및 제2 표적 세포 폴리펩티드의 결합은 표적 세포의 생물학적 특성을 변경시킴) 제핵 적혈구.
18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 스캐폴드-기반 활성을 갖는 제핵 적혈구.
19. 제18항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 암세포의 세포 표면 마커(예를 들어, CD19, EpCAM, CD20, CD45, EGFR, 또는 HER2)에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 면역 효과기 세포의 세포 표면 마커(예를 들어, CD3)에 결합하는 제핵 적혈구.
20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 다합체-기반 활성을 갖는 제핵 적혈구.
21. 제20항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 MHCII 알파 사슬을 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 MHCII 베타 사슬 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구.
22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 보상 활성을 갖는 제핵 적혈구.
23. 제22항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 치료 단백질이고, 제2 외인성 폴리펩티드가 제1 외인성 폴리펩티드의 억제제이고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드가 제2 외인성 폴리펩티드에 결합하는 것보다 강하게 제1 외인성 폴리펩티드가 표적에 결합하는 제핵 적혈구.
24. 제22항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 항-CD40 항체 분자를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 CD40 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제핵 적혈구.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 적혈구와 표적 세포의 융합을 촉진하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 임의의 표의 폴리펩티드인 제핵 적혈구.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 서로 상호작용하고, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드가, 예를 들어, 절단 또는 인산화에 의해 제2 외인성 폴리펩티드를 변형시키는 제핵 적혈구.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 외인성 폴리펩티드가 이량체 또는 다합체 단백질을 형성하는 제핵 적혈구.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개, 그러나 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 상이한 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 제핵 적혈구에 의해 보유되지 않은 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리펩티드가 제핵 적혈구에 의해 보유되지 않은 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 제핵 적혈구.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 및 선택적으로 제3 외인성 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2개 또는 3개)이 막횡단 폴리펩티드 또는 표면-고정 폴리펩티드인 제핵 적혈구.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 표적 세포 상의 모이어티와 상호작용하고, 예를 들어, 이에 결합하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표적 세포의 특성을 변경시키고, 예를 들어, 표적 세포를 사멸시키거나 활성화시키는 제핵 적혈구.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드 및 제2 외인성 폴리펩티드가 중량 또는 카피 수를 기준으로 약 1:1, 약 2:1 내지 1:2, 약 5:1 내지 1:5, 약 10:1 내지 1:10, 약 20:1 내지 1:20, 약 50:1 내지 1:50, 또는 약 100:1 내지 1:100의 존재비를 갖는 제핵 적혈구.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 모두가 화학량론적 작용 방식을 갖거나, 둘 모두가 촉매 작용 방식을 갖고, 둘 모두가 유사한 존재비, 예를 들어, 1:1 또는 약 2:1 내지 1:2로 존재하는 제핵 적혈구.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 중량 또는 카피 수를 기준으로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 50%, 또는 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100배(선택적으로, 최대 10배 또는 100배)만큼 제2 외인성 폴리펩티드보다 더 풍부한 제핵 적혈구.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 화학량론적 작용 방식을 갖고, 제2 폴리펩티드가 촉매 작용 방식을 갖고, 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드보다 더 풍부한 제핵 적혈구.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 제핵 적혈구:
    a) 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성;
    b) 약 10 내지 200 fL의 세포 부피 또는 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론, 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론의 세포 직경;
    c) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈; 또는 적어도 약 20, 25, 또는 30 pg/세포의 헤모글로빈; 또는
    d) 아넥신 V(Annexin V) 염색에 의해 측정시 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만인 외엽의 포스파티딜세린 함량.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 외인성 폴리펩티드 중 적어도 하나, 예를 들어, 전부가 당화되는 제핵 적혈구.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 그물적혈구인 제핵 적혈구.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들이 소르타제 전달 기호(sortase transfer signature), 예를 들어, LPXTG(SEQ ID NO:17)가 결여되어 있는 제핵 적혈구.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리펩티드가, 예를 들어, 융합 단백질이며,
    i) 적혈구 세포의 표면 상의 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%가 동일한 서열을 갖거나,
    ii) 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%가 동일한 막횡단 영역을 갖거나,
    iii) 융합 단백질이 전장의 내인성 막 단백질을 포함하지 않고, 예를 들어, 전장의 내인성 막 단백질의 세그먼트를 포함하고, 상기 세그먼트가 전장의 내인성 막 단백질의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500개의 아미노산이 결여되어 있거나;
    iv) 융합 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%가 서로 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 50개 초과의 아미노산만큼 상이하지 않거나,
    v) 외인성 폴리펩티드가 소르타제 전달 기호가 결여되어 있거나,
    vi) 외인성 폴리펩티드가 1, 2, 3, 4, 또는 5개 미만의 서열의 별개의 융합 폴리펩티드 상에 존재하는 모이어티를 포함하거나;
    vii) 외인성 폴리펩티드가 단일 융합 폴리펩티드로 존재하거나;
    viii) 융합 단백질이 내인성 막횡단 단백질과 모이어티의 접합부에 Gly-Gly를 함유하지 않거나;
    ix) 융합 단백질이 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 융합 단백질이 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나, 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 아미노산 내에 있는 세포외 영역에 Gly-Gly를 함유하지 않거나; 이들의 조합인,
    제핵 적혈구.
41. 표적과 상호작용하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구 세포로서,
    (a) 제2 외인성 폴리펩티드가 항체를 절단하는 모이어티, 예를 들어, 힌지 영역, CH2 영역, 또는 힌지와 CH2 영역 사이를 절단하는 모이어티, 예를 들어, IdeS 폴리펩티드를 포함하거나;
    (b) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적 상의 부위를 변형시키고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 특이적이고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 결합하거나, 표적에 결합하고(예를 들어, 특이적으로 결합하고), 표적을 변형시키고, 예를 들어, 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 표적에 대한 모이어티를 제거하거나, 표적에 모이어티를 부착하는 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하고, 표적이 선택적으로 항체이거나;
    (c) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적의 2차, 3차 또는 4차 구조를 변형시키고, 구현예들에서 또 다른 분자, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드 또는 제1 외인성 폴리펩티드가 아닌 분자와 상호작용하는 표적의 능력을 변경시키고, 예를 들어, 감소시키거나 증가시키는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소, 예를 들어, 프로테아제를 포함하고, 선택적으로 표적이 항체를 포함하거나;
    (d) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적, 예를 들어, 제1 표적 도메인과 제2 표적 도메인, 예를 들어, 제1 기질에 결합하는 제1 표적 도메인과 제2 기질에 결합하는 제2 표적 도메인 사이의 폴리펩티드를 절단하는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하거나;
    (e) 표적이 폴리펩티드, 탄수화물(예를 들어, 글리칸), 지질(예를 들어, 인지질), 또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이거나;
    (f) 제1 외인성 폴리펩티드가 표적, 예를 들어, 항체에 결합하나, 절단하지 않고, 제2 외인성 폴리펩티드가 결합, 예를 들어, 공유 결합, 예를 들어, 항체 내의 공유 결합을 절단하거나;
    (g) 표적이 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드가 항체 표적의 가변 영역에 결합하거나;
    (h) 표적이 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드가 항체 표적의 불변 영역에 결합하거나;
    (i) 제1 외인성 폴리펩티드가 약 1 내지 2 pM, 2 내지 5 pM, 5 내지 10 pM, 10 내지 20 pM, 20 내지 50 pM, 50 내지 100 pM, 100 내지 200 pM, 200 내지 500 pM, 500 내지 1000 pM, 1 내지 2 nM, 2 내지 5 nM, 5 내지 10 nM, 10 내지 20 nM, 20 내지 50 nM, 50 내지 100 nM, 100 내지 200 nM, 200 내지 500 nM, 500 내지 1000 nM, 1 내지 2 μM, 2 내지 5 μM, 5 내지 10 μM, 10 내지 20 μM, 20 내지 50 μM, 또는 50 내지 100 μM의 표적에 대한 친화성을 갖거나;
    (j) 제2 외인성 폴리펩티드가 약 10^-1 내지 10^-7 M, 10^-1 내지 10^-2 M, 10^-2 내지 10^-3 M, 10^-3 내지 10^-4 M, 10^-4 내지 10^-5 M, 10^-5 내지 10^-6 M, 또는 10^-6 내지 10^-7 M의 표적에 대한 K_M을 갖거나;
    (k) 표적에 대한 제2 외인성 폴리펩티드의 K_M(M으로 측정됨)에 의해 나누어진 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 K_d(M으로 측정됨)의 비가 약 1x10^-9 내지 2x10^-9, 2x10^-9 내지 5x10^-9, 5x10^-9 내지 1x10^-8, 1x10^-8 내지 2x10^-8, 2x10^-8 내지 5x10^-8, 5x10^-8 내지 1x10^-7, 1x10^-7 내지 2x10^-7, 2x10^-7 내지 5x10^-7, 5x10^-7 내지 1x10^-6, 1x10^-6 내지 2x10^-6, 2x10^-6 내지 5x10^-6, 5x10^-6 내지 1x10^-5, 1x10^-5 내지 2x10^-5, 2x10^-5 내지 5x10^-5, 5x10^-5 내지 1x10^-4, 1x10^-4 내지 2x10^-4, 2x10^-4 내지 5x10^-4, 5x10^-4 내지 1x10^-3, 1x10^-3 내지 2x10^-3, 2x10^-3 내지 5x10^-3, 5x10^-3 내지 1x10^-2, 1x10^-2 내지 2x10^-2, 2x10^-2 내지 5x10^-2, 5x10^-2 내지 1x10^-1, 1x10^-1 내지 2x10^-1, 2x10^-1 내지 5x10^-1, 또는 5x10^-1 내지 1이거나;
    (l) 표적을 변형시키는 제2 외인성 폴리펩티드의 관찰된 반응 속도가, 유사하지만 달리 유사한 반응 조건하에서 제1 외인성 폴리펩티드가 결여된 제핵 세포의 반응 속도보다 크거나;
    (m) 적혈구 세포 상의 제1 외인성 폴리펩티드의 평균 수 대 적혈구 세포 상의 제2 외인성 폴리펩티드의 평균 수의 비가 약 50:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 또는 1:50이거나;
    (n) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성이 변형된(예를 들어, 절단된) 표적에 대한 제1 외인성 폴리펩티드의 친화성보다 크거나;
    (o) 제핵 적혈구 세포의 치료적 유효 용량이 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 양에 대한 화학량론보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);
    (p) 유효 용량 내의 제핵 적혈구 세포의 수가 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적, 예를 들어, 표적 분자의 수보다 적거나(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적거나);
    (q) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 유효 용량, 또는 제핵 적혈구 세포의 시험관 내 유효량에 포함된 제2 외인성 폴리펩티드의 수가 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;
    (r) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 유효 용량, 또는 제핵 적혈구 세포의 시험관 내 유효량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수가 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;
    (s) 제핵 적혈구 세포의 미리 선택된 양, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포의 유효 용량에 포함된 제1 외인성 폴리펩티드의 수 및 제2 외인성 폴리펩티드의 수가 각각 표적에 대한 참조 값보다 적고(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적고), 예를 들어, 투여시의 대상체의 말초 혈액에서의 표적의 수보다 적거나;
    (t) 제2 외인성 폴리펩티드가 적어도 10^-1 M, 10^-2 M, 10^-3 M, 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 또는 10^-7 M의 K_M으로 표적을 변형(예를 들어, 절단)시키거나;
    (u) 제2 외인성 폴리펩티드가 샤페론을 포함하거나;
    (v) 제1 외인성 폴리펩티드가 표면-노출된 부분을 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 표면 노출된 부분을 포함하거나;
    (w) 제핵 적혈구 세포의 유효량이 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구 세포의 유효량보다 적은(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.99%만큼 적은) 것 중 하나 이상에 해당하는,
    제핵 적혈구.
42. 제41항에 있어서, (b) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적 상의 부위를 변형시키고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 특이적이고, 예를 들어, 표적 상의 부위에 결합하거나, 표적에 결합하고(예를 들어, 특이적으로 결합하고), 표적을 변형시키고, 예를 들어, 공유적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하거나, 표적에 대한 모이어티를 제거하거나, 표적에 모이어티를 부착하는 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하고, 표적이 선택적으로 항체, 예를 들어, 항-약물 항체인 제핵 적혈구 세포.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 변형이 또 다른 분자, 예를 들어, 제1 외인성 폴리펩티드 또는 제1 외인성 폴리펩티드가 아닌 분자와 상호작용하는 표적의 능력을 변경시키고, 예를 들어, 증가시키거나 감소시키는 제핵 적혈구 세포.
44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 제2 외인성 폴리펩티드가 표적, 예를 들어, 제1 표적 도메인과 제2 표적 도메인, 예를 들어, 제1 기질에 결합하는 제1 표적 도메인과 제2 기질에 결합하는 제2 표적 도메인 사이의 폴리펩티드를 절단하는 폴리펩티드, 예를 들어, 효소(예를 들어, 프로테아제)를 포함하는 제핵 적혈구 세포.
45. 제44항에 있어서, 제1 표적 도메인이 제2 표적 도메인으로부터 방출되는 제핵 적혈구 세포.
46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 절단이 제1 기질에 대한 제1 표적 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 친화성 및 제2 기질에 대한 제2 표적 도메인의 친화성을 변경시키는 제핵 적혈구 세포.
47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 항체를 포함하고, 제1 표적 도메인이 하나 이상의 CDR을 포함하고, 제2 표적 도메인이 불변 영역, 예를 들어, Fc 영역의 일부를 포함하는 제핵 적혈구 세포.
48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 감염성 성분 이외의 것, 예를 들어, 박테리아 성분, 바이러스 성분, 진균 성분, 또는 기생충 성분 이외의 것인 제핵 적혈구 세포.
49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드가 표적-결합 도메인을 포함하는 제핵 적혈구 세포.
50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분이 표적에 결합하는 제핵 적혈구 세포.
51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분이 효소 활성, 예를 들어, 프로테아제 활성을 포함하는 제핵 적혈구 세포.
52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 외인성 폴리펩티드의 표면-노출된 부분이 표적을 효소적으로 변형시키고, 예를 들어, 표적을 절단하는 제핵 적혈구 세포.
53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 항-약물 항체를 포함하고, 제1 외인성 폴리펩티드가 항-약물 항체가 결합하는 폴리펩티드를 포함하고, 제2 외인성 폴리펩티드가 항-약물 항체를 절단하여 Fab 부분 및 Fc 부분을 생성하는 프로테아제를 포함하는 제핵 적혈구 세포.
54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제핵 적혈구가 제2 외인성 폴리펩티드가 결여된 달리 유사한 제핵 적혈구보다 신속한 속도로 대상체의 신체로부터 표적을 청소할 수 있는 제핵 적혈구 세포.
55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제핵 적혈구가, 예를 들어, 절단 동안 표적 또는 표적에 대해 작용하는 제2 외인성 단백질의 반응 생성물과 복합체화되는 제핵 적혈구 세포.
56. 막횡단 도메인 및 항-약물 항체에 결합할 수 있는 표면-노출된 폴리펩티드를 포함하는 제1 외인성 폴리펩티드, 및
    막횡단 도메인 및 표면-노출된 IdeS 폴리펩티드를 포함하는 제2 외인성 폴리펩티드를 포함하는,
    제핵 적혈구 세포.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 복수의 세포, 예를 들어, 적어도 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 세포를 포함하는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물.
58. 암을 치료하기 위한, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 세포.
59. 제58항에 있어서, 암이 (ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담관암, 방광암, 골암, 장암, 뇌종양, 유방암, 공지되지 않은 원발성 암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 유암종, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신 융모 종양(GTT), 털세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, NSCLC, 림프종, 흑색종 피부암, 중피종, 남성암, 기태 임신, 구강암 및 입인두암, 골수종, 비강암 및 부비동암, 코인두암, 비-호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 속발성 암, 피부암(비-흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 공지되지 않은 원발성 암, 자궁암, 질암, 및 외음부암으로부터 선택되는 세포.

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