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KR20180057720A - 다가 Fv 항체 - Google Patents

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KR20180057720A
KR20180057720A KR1020187013310A KR20187013310A KR20180057720A KR 20180057720 A KR20180057720 A KR 20180057720A KR 1020187013310 A KR1020187013310 A KR 1020187013310A KR 20187013310 A KR20187013310 A KR 20187013310A KR 20180057720 A KR20180057720 A KR 20180057720A
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KR1020187013310A
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크리스티나 엘방거
이피카 푸체크
토르슈텐 로스
토마스 뮐러
에리히 라이코피크
우베 로이슈
마르틴 트레더
미하엘 바이헬
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아피메트 게엠베하
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Abstract

서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬로 통합된 이중항체-유닛을 포함하는 삼중 특이적 항체 분자가 기술된다. 특정 예에서, 두 개의 단쇄 Fv(scFv) 단편이 두 개의 추가 항원 결합 부위를 제공하는 상기 이중항체 유닛과 윈위적으로 연결된다.

Description

다가 Fv 항체
본 발명은 다가 및 다중 특이적 Fv-항체 유도체, 구체적으로 이중항체-유닛을 포함하는 Fv 항체 분자에 관한 것이다.
이중 특이적 항체는 두 개의 상이한 치료적 표적과 관계(engage)되거나 또는 두 가지 별개의 기능을 수행하는데 사용되어 왔다. 그러한 항체는 예를 들어 특정 표적 세포로 면역 효과자 세포, 예를 들어 T- 또는 NK-세포를 모집하는데 사용될 수 있다. 분자에 기반된 다양한 항체-단편이 알려져 있고, 예를 들어 암 치료에서 연구 중에 있다.
이중 특이적 항체는 항체 가변 도메인만을 이용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 도메인 사이의 링커 서열은 분자 내 방식으로 접히거나 쌍을 이루어 결합할 수 없는 정도로 단축될 수 있다. 예를 들어 2 내지 12 개 잔기의 그러한 짧은 링커는 상기 단량체적 단쇄 가변 단편 (scFv) 분자의 형성을 방지하고 이량체적(dimeric) "이중항체(diabody)"를 형성하는 상이한 폴리펩티드 사슬의 상보적 가변 도메인 간의 분자 간 VH/VL 페어링(pairing)을 유리하게 한다 (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448). 그러한 이중항체는 이중 특이적 항체를 구축하는데 사용될 수 있고, 이는 각각 짧은 링커에 의해서 다른 항체의 VL 도메인에 연결된 하나의 항체로부터의 VH 도메인으로 이루어진 (또는 그 반대) 2 개의 단쇄 폴리펩티드 융합 생성물의 비-공유적 결합에 의해서 수득된다.
WO 03/025018는 4 개의 결합 도메인을 갖는 동일한 단쇄 폴리펩티드에 의해서 형성된 구조를 갖는 이중 특이적 항원-결합 분자를 개시한다. 각 폴리펩티드 사슬의 말단 부분의 VH 및 VL 도메인은 짧은 링커에 의해서 연결되고 다른 폴리펩티드 사슬의 상응하는 VH 및 VL 도메인과 분자 간(inter)에서 결합되는 반면, 각 폴리펩티드 사슬의 다른 VH 및 VL 도메인은 상기 동일한 사슬 내에서 서로 분자 내(intra)적으로 결합하여 항원-결합 scFv 유닛을 생성한다. 그러한 구조물은 동종이량체로서, 즉 이들은 쌍으로 서로 결합하는 동일한 단쇄 폴리펩티드로 이루어진다.
게다가, 암세포에 대한 더 큰 선택성을 허여하고, 건강한 조직을 보존하여, 약물이 암세포를 박멸하는데 효과적인 더 넓은 용량 범위 및 치료적 적용성을 가능하게 하는 두 개의 종양 항원을 표적하는 삼중 특이적 항체가 요구된다. 예를 들어, 하나의 삼중 특이적 항체는 두 개의 상이한 종양 항원을 표적하는데 사용될 수 있고, 제3 특이성과 함께 사용되어 T-세포 또는 NK-세포가 세포 독성 효과를 발휘할 수 있도록 한다.
WO 2009/007124는 "삼중항체(triplebody)"로서 지정되고 일렬(tandem)-배열로 세 개의 상이한 특이성(종양 마커에 대한 CD123 및 CD3 및 NK 세포 상의 CD16에 대한 것)을 갖는 세 개의 scFv 단편으로 이루어진 단쇄 Fv (scFv)의 삼중 특이적 융합을 개시한다. 상기 분자는 추가적으로 중심에 위치한 scFv에서 이황화 결합에 의해서 안정화된다. 그러한 분자는 이중 양성 종양 세포의 이중-표적화를 가능하게 하고 NK 세포 상의 CD16에 대해 단일가적(monovalently)으로 결합한다.
본원발명은 결합하여 두 개의 항원 결합 부위를 이루는 두 쌍의 가변 도메인으로 이루어진 이중항체-유닛을 포함하는 다가 Fv 항체와 관련된다. "항원 결합 부위(antigen binding site)"는 VH/VL 도메인 쌍의 Fv 항원 결합 부위, 즉 VH/VL 항원 결합 부위, 또는 단일 도메인 항원 결합 부위를 의미한다. 각 가변 도메인 쌍은 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된다. 상기 이중항체-유닛은 하나의 폴리펩티드 (단쇄 이중항체-유닛) 또는 두 개의 폴리펩티드(이중항체-유닛)로 이루어진다. 하나 이상의 가변 도메인 쌍은 상기 폴리펩티드에서 이 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단에 위치한 다른 가변 도메인 및 C-말단에 다른 가변 도메인으로 연결된다. 따라서, 그러한 폴리펩티드는 서로 연결된 네 개 이상의 가변 도메인을 포함하고, 서로 연결된 두 개의 병치(juxtapose)된 가변 도메인은 상기 이중항체-유닛의 하나의 가변 도메인 쌍이고, 하나의 다른 가변 도메인은 상기 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단에 위치하고, 다른 추가 가변 도메인은 상기 이중항체-유닛의 상기 가변 도메인 쌍에 대해 C-말단에 위치한다. 상기 이중항체 유닛의 상기 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단에 연결된 가변 도메인은 가변 경쇄 (VL) 도메인 또는 가변 중쇄 (VH) 도메인 일 수 있고, 또한 상기 이중항체 유닛의 상기 가변 도메인 쌍에 대해 C-말단에 연결된 도메인은 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)일 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 서로 연결된 네 개 이상의 가변 도메인, 즉 C-말단이 다른 가변 도메인에 연결된 상기 이중항체-유닛의 상기 가변 도메인 쌍과 연결된 N-말단 측으로 연결된 가변 도메인을 포함하는 Fv 폴리펩티드일 수 있다. 구체예에서, 여섯 개, 여덟 개 또는 열 개의 가변 도메인이 그러한 Fv 폴리펩티드에서 서로 연결된다.
상기 다가 Fv 항체는 4가 이상이고 네 개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 따라서, 네 개 이상의 가변 도메인 중 두 개는 이중항체-유닛의 다른 가변 도메인 쌍과 결합하여 두 개의 항원 결합 부위(제1 및 제2)를 이루는 상기 이중항체-유닛의 두 개의 병치된 가변 도메인 쌍인 네 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 Fv 항체의 Fv 폴리펩티드는 상응하는 가변 도메인과 결합하여 추가 (제3) 항원 결합 부위를 이루는 Fv 폴리펩티드의 N-말단에서의 하나 이상의 추가 (제3) 가변 도메인 및 상응하는 가변 도메인과 결합하여 추가 (제4) 항원 결합 부위를 이루는 Fv 폴리펩티드의 C-말단에서의 하나 이상의 추가 (제4) 가변 도메인을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 다가 Fv 항체의 4 개 이상의 항원 결합 부위가 두 개의 Fv 폴리펩티드 간에 형성되고 다른 구체예에서 상기 4 개 이상의 항원 결합 부위가 단일 Fv 폴리펩티드의 분자 내 접힘에 의해서 형성된다.
따라서, 특정 구체예에서 동일한 폴리펩티드에서 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단 및 C-말단에 연결된 각 다른 가변 도메인은 추가 항원 결합 부위 부분이다. 따라서, 상기 이중항체-유닛의 하나의 가변 도메인 쌍 (제1 쌍)은 상기 이중항체-유닛의 다른 가변 도메인 쌍과 결합하여 두 개의 항원 결합 부위(제1 및 제2 항원 결합 부위)를 이루고, 추가로 N-말단에 위치한 가변 도메인은 상응하는 가변 도메인과 결합하여 제3 항원 결합 부위를 이루고, C-말단에 위치한 추가 가변 도메인은 상응하는 가변 도메인과 결합하여 제4 항원 결합 부위를 이룬다. 따라서, 그러한 다가 Fv 항체는 4가 이상이다. 특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 상기 추가 가변 도메인을 포함하는 이 항원 결합 부위는 scFv-유닛 또는 단쇄 이중항체-유닛 (scDb)이다. 다른 구체예에서 동일한 폴리펩티드 (제1 폴리펩티드) 에서 상기 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단 및 C-말단에 연결된 상기 추가 가변 도메인은 상기 이중항체-유닛의 제2 (다른) 가변 도메인 쌍을 포함하여 다른 폴리펩티드(제2 폴리펩티드)의 상응하는 VH 또는 VL과 결합되어 두 (제1 및 제2) 폴리펩티드의 가변 도메인 간에 다른 두 개의 VH/VL (제3 및 제4) 항원 결합 부위를 형성한다.
특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛의 두 쌍의 가변 도메인은 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 가변 경쇄 도메인 (VL-VL) 쌍 및 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 가변 중쇄 (VH-VH) 쌍이고, 상기 VL-VL 쌍 및 VH-VH 쌍은 결합하여 두 개의 VL/VH (제1 및 제2) 항원 결합 부위를 이룬다.
특정 구체예에서 상기 다가 항체 분자는 이중항체-유닛, 즉 예를 들어, 여섯 개, 여덟 개 또는 열 개의 서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 하나의 폴리펩티드 사슬에 통합된 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍을 포함한다.
상기 이중항체-유닛은 서로 연결된 두 개의 가변 도메인 쌍으로 이루어져 그러한 도메인은 분자 내에서 기능적 Fv 유닛, 즉 VH/VL 항원 결합 유닛으로 접히지 못하고, 대신 서로 연결된 두 개의 가변 도메인의 다른 쌍과 결합하여 두 개의 항원 결합 부위를 제공하기 위한 2가 이량체, 즉 이중항체를 형성한다. 가변 경쇄 도메인 (VL-VL) 쌍 서로 간 및 가변 중쇄 도메인 (VH-VH) 쌍 서로 간을 연결함으로써 각 쌍 내에서 상기 도메인의 분자 내적 페어링은 동일한 종류의 도메인, 즉 VH-VH 또는 VL-VL 때문에 예방된다. 상기 이중항체-유닛의 단단하고 컴팩트한 구조는 다가 항체의 제조, 바른 접힘을 용이하게 하고, 항체의 안정성을 증가시킨다. 그러한 이중항체-유닛은 더 컴팩트한 분자가 되도록 하여 상기 항체 분자의 안정성에 유익한 두 개의 비-공유적으로 결합된 VH 및 VL 도메인에 의해서 상기 항체 분자 내에 두 개의 VH/VL 항원 결합 부위를 생성한다. 특정 구체예에서 상기 두 개의 가변 도메인 쌍은 짧은 링커에 의해서 연결된다.
특정 예에서 두 개의 단쇄 Fv (scFv) 단편은 이중항체-유닛에 원위치(distally)로 연결되어 두 개의 추가적인 VH/VL 항원 결합 부위를 제공한다(도 1 및 2). 따라서, 그러한 다가 항체 분자는 4 개 이상의 항원 결합 부위; 이중항체-유닛에 의해서 두 개 및 두 개의 scFv-유닛에 의해서 두 개를 제공하므로 4가 이상이다. 상기 각 원위치로 연결된 scFv 단편은 상기 폴리펩티드에서 VH-VL 또는 VL-VH 순으로 배열될 수 있다.
그러한 4가 항체 분자는 4가, 5가 또는 6가 삼중 특이적 항체를 생성하는데 이점이 있다. 이러한 신규한 삼중 특이적 항체는, 예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스에 감염된 세포와 같은, 표적 세포를 죽이기 위한 면역 효과자 세포를 모집하는데 사용될 수 있다. 그러한 본 발명에 따른 삼중 특이적 항체가 4가 이상이어서, 이들은 3가 및 삼중 특이적 단쇄 단편에 비해 증가된 기능적 활성을 제공한다. 본 발명에 따른 삼중 특이적 및 4가인 항체는 표적 세포뿐 아니라 면역 효과자 세포 모두에 대한 4 개의 결합 부위 중 2 개에 의해서 2 가적으로 결합한다. 예를 들어, 상기 표적 세포에 대한 2가 결합은 결합력(avidity)을 증가시킬 뿐 아니라, 상기 세 개의 항원 특이성 중 두 개가 표적 세포의 세포 표면 상에 두 개의 상이한 항원, 예를 들어 두 개의 상이한 종양 항원에 대한 것일 때, 상기 표적화 특이성은 증가된다. 반면, 상기 모집된 면역 효과자 세포의 세포독성 효율은 조절될 수 있고, 구체적으로 상기 항체가 면역 효과자 세포에 2가적으로 결합할 때 증가된다. 다른 예에서, 그러한 삼중 특이적 항체는 상기 효과자 세포에 대한 상이한 항원에 대한 두 가지 특이성 및 종양 세포, 뉴론, 또는 바이러스에 감염된 세포에 대한 제3 특이성을 가질 수 있고, 성장-인자, 시토킨 또는 다른 비-세포-결합 리간드와 같은 가용성 당백질과 결합하여 결과적으로 중화시킨다.
특정 예에서 상기 분자 내 페어링을 예방하는 짧은 링커에 의해 연결된 이중항체-유닛의 가변 도메인은 가변 경쇄 도메인 (VL-VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH-VH)이다 (도 1 및 2). 이러한 특정 도메인 배열은 본 발명에 따른 다중 특이적 및 다가 항체 분자의 올바른 폴딩을 촉진시킴이 발견되었다. 구체적으로 4가, 삼중 특이적 또는 사중 특이적 Fv 항체 분자의 경우, 이러한 조치(measure)는 세 개 이상의 상이한 특이성에 대한 가변 도메인을 갖는 Fv 항체 분자의 올바른 결합을 가능하게 하고, 단일 폴리펩티드 내 부정확한 결합 (단량체) 또는 제1과 제2 폴리펩티드의 올바른 이종이량체화 대신 두 개의 동일한 Fv 폴리펩티드 내 이종이량체화를 예방하기 위해 채용될 수 있다 (실시예 2). 본 발명자들은 짧은 링커에 의해서 연결된 두 개의 상응하는 가변 경 도메인 제2 쌍과 연결된 짧은 링커에 의해서 연결된 두 개의 가변 중 도메인 제1 쌍에 의해서 형성된 이중항체-유닛과 같은 삼중 특이적 항체 분자로 통합함으로써 세 개의 특이성에 대한 가변 도메인 간의 올바른 결합 및 상기 가변 도메인을 제공하는 두 개의 상이한 폴리펩티드를 얻었다. 따라서, 이중항체-유닛에서 그러한 가변 도메인 배열, 즉, 가변 도메인의 제1 폴리펩티드에서 VL-VL 및 가변 도메인의 제2 폴리펩티드에서 VH-VH는 4가 및 삼중 특이적 또는 사중-특이적 Fv 항체의 올바른 결합 및 접힘을 가능하도록 한다. 본 발명자들 그러한 이중항체 유닛 또는 단쇄 이중항체 유닛에서의 VL-VL/ VH-VH 배열은 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인을 포함하는 긴 폴리펩티드를 Fv 항체 분자로의 올바른 접힘 (예를 들어, 도 1) 또는 상이한 길이를 갖는 두 개의 폴리펩티드의 기능적 이량체적 Fv 항체 분자로의 올바른 접힘 및 이종이량체화 (예를 들어, 도 2, 5, 6a, 6b)를 강제함을 발견하였다.
다른 구체예에서 하나 이상의 단쇄 이중항체-유닛 (scDb)은 원거리로 하나 이상의 추가 항원 결합 부위를 제공하는 이중항체-유닛에 연결된다. 따라서, 상기 이중항체 유닛의 하나 이상의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드에서 하나 이상의 scDb에 연결된 이중항체-유닛의 하나의 가변 도메인 쌍을 포함한다. 예를 들어, 두 개의 scDb 유닛은 상기 이중항체-유닛에 원거리로 연결되어 각 단쇄 이중항체-유닛 당 추가의 두 개의 항원 결합 부위를 제공한다 (도 4 및 5). 따라서, 그러한 다가 항체 분자는 4 개 이상의 항원 결합 부위를 제공하므로 4가 이상이다. 일 구체예에서 두 개 이상의 scDb 유닛이 이중항체-유닛으로 연결되는 경우, 네 개의 항원 결합 부위를 제공하는 두 개의 원거리 방향의 scDb 유닛 및 상기 이중항체-유닛에 의해 제공된 두 개의 항원 결합 부위 때문에 그러한 다가 항체는 6가 이상이다. 상기 각 원거리의 scDb-유닛에서, 상기 가변 도메인은 상기 폴리펩티드에서 VH-VL-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VL-VL-VH-VH 또는 VH-VH-VL-VL의 순으로 배열될 수 있다.
특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛은 서로 결합되어 두 개의 항원-결합 부위를 형성하는 두 개의 폴리펩티드 상에 배열된 두 쌍의 가변 도메인으로 이루어지고, 상기 두 개의 폴리펩티드 각각은 상기 이중항체 유닛의 두 쌍의 가변 도메인 각각에 대해 원거리로 위치한 하나 이상의 다른 단쇄 단편 및/또는 단쇄 이중항체 단편을 포함한다. (도 6A, 6b, 7, 8a 및 8b). 따라서, 그러한 다가 항체 분자는 5 개 이상의 항원 결합 부위; 이중항체-유닛에 의한 두 개의 결합 부위, 상기 이중항체 유닛의 가변 도메인 제1 쌍에 대한 N-말단 및 C-말단의 두 개의 scFv-유닛 또는 scDb-유닛에 의한 두 개 이상의 결합 부위 및 상기 이중항체 유닛의 다른 폴리펩티드의 이중항체 유닛의 다른 쌍의 가변 도메인에 대한 N-말단 또는 C-말단의 하나 이상의 결합 부위를 제공하므로 7가 이상이다.
특정 예에서 본 발명은 서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 항체 분자를 의미하고, 상기 여섯 개 이상의 가변 도메인 중 제1의 두 개의 가변 도메인을 포함하는 이중항체-유닛은 상기 폴리펩티드에 통합되고 상기 이중항체-유닛의 제1의 두 개의 가변 도메인은 상기 이중항체-유닛의 다른 두 개의 가변 도메인, 즉 제2의 두 개의 가변 도메인에 결합되어 두 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 제2의 두 개의 가변 도메인은 제1의 두 개의 가변 도메인을 갖는 동일한 폴리펩티드에 위치하거나 제1 폴리펩티드와 결합된 분리된 제2 폴리펩티드에 위치할 수 있다. 상기 이중항체 유닛에 의해 제공되는 상기 두 개의 항원 결합 부위는 제1 및 제2 가변 도메인 간에 형성되고, 상기 제1쌍의 가변 도메인의 각 가변 도메인은 제2 쌍의 가변 도메인의 다른 가변 도메인과 함께 항원-결합 부위를 형성한다. 따라서, 상기 이중항체-유닛은 상기 제1 및 제2의 두 개의 가변 도메인에 의해서 형성되고, 상기 두 개의 가변 도메인은 제1뿐 아니라 제2의 두 개의 가변 도메인에서 분자 내 페어링을 예방하는 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된다.
따라서, 특정 구체예에서 본 발명은 서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는, 즉 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 다가 항체 분자를 의미하고, 상기 폴리펩티드의 두 개의 가변 도메인은 분자 내 페어링을 예방하는 펩티드 링커에 의해서 연결되고 상기 두 개의 가변 도메인은 펩티드 링커에 의해서 연결된 두 개의 다른 상응하는 가변 도메인과 결합하여 분자 내 페어링을 예방하고, 상기 네 개의 가변 도메인은 상기 네 개의 가변 도메인 간에 두 개의 항원 결합부위를 형성한다. 예를 들어, 그러한 항체는 Fv 항체, 구체적으로 4가이고 삼중 특이적인 Fv 항체이다.
상기 항체 분자는 다가, 즉, 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는다. 이는 네 개의 항원 결합 부위를 가질 때 4가이고; 다섯 개의 항원 결합 부위를 가질 때 5가이고 및 여섯 개의 항원 결합 부위를 가질 때 6가이다. "4가(tetravalent)"는 네 개의 Fv 항원-결합 부위를 포함하는, 구체적으로 이루어진 항체 분자를 의미하고, 상기 각 Fv 항원-결합 부위는 서로 결합된 동일한 항원 에피토프 특이성의 가변 중 쇄 (VH) 도메인 및 가변 경쇄 (VL) 도메인을 갖는 VH/VL 쌍을 포함한다. 따라서, 그러한 4가 항체 분자는 여덟 개의 가변 항체 도메인, 즉 네 개의 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 네 개의 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함한다. 상기 4가 항원-결합 분자가 여덟 개 이상의 항체 가변 도메인을 포함하므로, 이의 분자량은 100 kDa을 초과하고, 3가 및 삼중 특이적 단쇄 Fv 분자와 비교하여 그러한 분자의 더 긴 반감기를 유발한다.
특정 예에서 상기 항체 분자는 다중 특이적, 즉 상이한 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는다. 특정 예에서 상기 항체 분자는 삼중 특이적이다.
삼중 특이적 및 4가 항체 분자는 제1 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항원-결합 부위, 제2 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항원-결합 부위 및 제3 항원 에피토프에 대히 특이성을 갖는 두 개의 항원-결합부위를 포함한다. 따라서, 그러한 삼중 특이적 및 4가 항체 분자는 3 개의 상이한 항원 에피토프에 대해 상이한 특이성을 가지는, 즉 포함한다. 예를 들어, 그러한 항원-결합 분자는 제1 항원 에피토프에 특이성을 갖는 제1 항원-결합 부위, 제2 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 제2 항원-결합 부위, 제3 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 제3 및 제4 항원-결합부위를 포함한다. 5가 및 삼중 특이적 항체 분자는 제1 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 두 개의 항원-결합 부위, 제2 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 두 개의 항원-결합 부위 및 제3 항원 에피토프에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원-결합부위를 포함한다. 대안적으로, 5가 및 삼중 특이적 항체 분자는 제1 항원 에피토프에 대한 세 개의 항원-결합 부위 및 제2 및 제3 항원 에피토프 각각에 대한 하나의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 6가 및 삼중 특이적 항체 분자는 특정 구체예에서 상기 세 개의 항원 에피토프 각각에 대해 두 개의 항원-결합 부위, 또는 대안적으로 상기 세 개의 항원 에피토프 각각에 대한 하나 내지 세 개의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 예에서 상기 항체 분자는 Fv 항체 분자이다. "Fv 항체(Fv antibody)"는 단지 가변 (V) 항체 도메인을 포함하지만 불변 항체 영역 또는 그 단편이 결여된 면역글로불린의 Fv-유도체를 의미한다. 각 가변 경쇄 도메인 (VL)은 상응하는 가변 중쇄 도메인 (VH)과 결합되어 Fv 항원 결합 부위 (VH/VL 항원 결합 부위)를 형성한다. 상기 가변 항체 도메인은 펩티드 링커 또는 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 융합 폴리펩티드를 이룬다. 본 발명에 따른 상기 Fv 항체, 즉, 항원-결합 분자는 단일 폴리펩티드의 단량체 또는 다량체적 폴리펩티드가 될 수 있다. 다량체적 항원-결합 분자, 즉 Fv 항체, 구체적으로 다가 Fv 항체는, 예를 들어, 두 개의 폴리펩티드를 갖는 이량체, 세 개의 폴리펩티드를 갖는 삼량체 또는 네 개의 폴리펩티드를 갖는 사량체일 수 있다. 상기 이량체는 상이한 아미노산 조성을 갖는 두 개의 폴리펩티드로 이루어진 경우 이종이량체이거나, 두 개의 동일한 폴리펩티드로 이루어진 경우 동종이량체이다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 아미드 결합으로 연결된 아미노산 잔기의 폴리머를 의미한다. 상기 폴리펩티드는, 바람직하게는, 분지되지 않은 단쇄 융합 단백질이다. 상기 폴리펩티드 내에서 상기 항체 가변 (Fv) 도메인은 서로 연결된다. "Fv 폴리펩티드(Fv polypeptide)"는 항체 가변 (Fv) 도메인이 서로 연결된 융합 폴리펩티드를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 추가적으로 N-말단 및/또는 C-말단에 연속적인 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 C-말단에 상기 폴리펩티드의 정제뿐 아니라 검출에도 유용할 수 있는 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열의 예는 여섯 개의 His-잔기로 이루어진 His-태그와 같은 His-태그, DYKDDDDK 옥타펩티드 (서열번호 38)와 같은 FLAG-태그 또는 WSHPQFEK 옥타펩티드 (서열번호 39)와 같은 STREP® II-Tag 또는 EPEA 테트라펩티드 (서열번호 40)와 같은 C-Tag이다. 다량체적 항원-결합 분자를 위하여, 상이한 태그 서열이 상이한 폴리펩티드에 대해, 예를 들어, 이량체적 분자의 제1 폴리펩티드에 대해서는 His-태그 및 제2 폴리펩티드에 대해서는 FLAG-태그가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서 상기 폴리펩티드는 항원-결합 부위 및 추가의 불변 항체 도메인, 예를 들어 CL, CH 및/또는 Fc-도메인을 제공하는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 구체예는 하나 이상의 불변 항체 도메인, 예를 들어 Fc 도메인과 융합된 Fv 폴리펩티드 또는 Fv 항체을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서 상기 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 다른 시약, 예를 들어, 독소, 면역-조절제 또는 신호 발생제와 결합(couple)될 수 있다.
"링커(linker)"는 하나의 도메인의 C-말단 및 다른 병치된 도메인의 N-말단 사이 또는 그 반대로 상기 폴리펩티드에서 두 개의 병치된 가변 도메인을 연결하는 펩티드를 의미한다. 상기 아미노산 조성물과 관련하여 펩티드는 Fv, 즉 VH/VL 항원 결합 부위의 형성을 방해하지 않고 삼중 특이적과 같은 다중-특이적 분자의 이량체화와 같은 다량체화를 방해하지 않는 것으로 선택된다. 예를 들어, 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커는 일반적으로 프로테아제 저항성을 제공한다. 어떤 구체예에서 (G2S)x 펩티드 링커가 예를 들어, x = 1 내지 20, 예를 들어, (G2S), (G2S)2, (G2S)3, (G2S)4, (G2S)5, (G2S)6, (G2S)7 또는 (G2S)8 로 사용되거나, 또는 (G3S)x 가 예를 들어, x = 1 내지 15로 사용되거나, 또는 (G4S)x 펩티드 링커가 예를 들어, x = 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6으로 사용된다. 상기 링커의 아미노산 서열은 예를 들어 파지-디스플레이(display)법에 의해서 최적화되어 항원 결합 및 상기 폴리펩티드의 생산 수득률을 개선시킬 수 있다.
상기 링커의 길이는 상기 항원-결합 폴리펩티드 이량체의 유연성에 영향을 미친다. 상기 항원-결합 폴리펩티드 이량체의 요구되는 유연성은 표적 항원 밀도 및 표적 항원의 접근성, 즉 상기 표적 항원 상의 에피토프에 의존한다. 더 긴 링커는 더 민첩한(agile) 항원-결합 부위와 함께 더욱 유연한 항원-결합 폴리펩티드를 제공한다. 상기 이량체적 항원-결합 폴리펩티드의 형성에 대한 링커 길이의 영향은 예를 들어, Todorovska 등, 2001 Journal of Immunological Methods 248:47-66; Perisic 등, 1994 Structure 2:1217-1226; Le Gall 등, 2004, Protein Engineering 17:357-366 및 WO 94/13804에 기술되어 있다.
이중항체-유닛은 상기 항체 분자의 폴리펩티드에 통합된다. "이중항체 유닛(diabody unit)"은 두 개의 VL/VH 항원 결합 부위에 연결된 두 쌍의 가변 도메인인 제1 쌍 및 제2 쌍으로 이루어진 2가 Fv-모듈을 의미한다. 각 가변 도메인쌍은 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된다. 특정 구체예에서 상기 2가 Fv-모듈은 두 개의 병치된 가변 도메인의 제1 및 제2 쌍으로 이루어지고, 상기 각 쌍에서 두 개의 가변 도메인은 짧은 링커에 의해서 연결된 가변 도메인 간에 분자 내 결합을 배제하는 짧은 펩티드 링커에 의해서 융합된다. 상기 제1 쌍의 가변 도메인은 제2 쌍의 가변 도메인과 결합하여 두 쌍의 가변 도메인으로 두 개의 Fv 항원 결합 부위를 형성하도록 한다. 따라서, 두 개의 Fv 항원 결합 부위 각각은 상기 제1 쌍 가변 도메인의 하나의 가변 도메인 및 제2 쌍의 가변 도메인의 하나의 가변 도메인에 의해서 형성된다. 따라서, 그러한 이중항체-유닛은 짧은 펩티드 링커 3, 3a에 의해서 직접적으로 연결되지 않는 두 개의 가변 도메인의 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다 (도 1 및 2). 상기 두 쌍의 병치된 가변 도메인은 이량체적 이중항체 유닛을 형성하는 두 개의 분리된 폴리펩티드에 위치하거나 (도 2, 3, 5-8) 또는 상기 두 쌍의 병치된 가변 도메인은 단쇄 이중항체 유닛을 형성하는 동일한 폴리펩티드 상에 위치한다 (도 1, 4). 각 가변 도메인 쌍에서 상기 짧은 링커 3, 3a은 하나의 가변 도메인의 C-말단을 다른 가변 도메인의 N-말단 또는 그 반대로 연결한다. 각 쌍에서 상기 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 예를 들어, VL-VH, VH-VL, VH-VH 또는 VL-VL로 배향될 수 있고, 상기 쌍의 두 가변 도메인은 상이한 항원 에피토프 특이성 또는 동일한 항원 에피토프 특이성을 갖는다. 특정 예에서 상기 두 개의 가변 도메인은 하나의 가변 도메인의 N-말단 및 상기 쌍의 다른 가변 도메인의 C-말단 사이에 펩티드 결합에 의해서 직접적으로 연결된다. 상기 이중항체-유닛의 제1 및 제2 쌍 가변 도메인 각각에서 두 개의 가변 도메인을 연결하는 짧은 펩티드 링커의 길이는 상기 링커에 의해 연결된 가변 도메인 간의 분자 내 결합을 배제한다. 그러한 링커는 "짧은(short)", 즉 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 약 12 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 아미노산 잔기가 0 개인 경우 상기 링커는 펩티드 결합이다. 그러한 짧은 링커는 상기 두 쌍의 가변 도메인 간의 올바른 이량체화 및 두 개의 Fv 항원 결합 부위의 형성을 선호한다. 상기 링커를 약 12 개 이하의 아미노산 잔기로 짧게 하는 것은 일반적으로 동일한 폴리펩티드 사슬의 인접한 도메인이 서로 상호 작용하는 것을 방지한다. 본 발명의 일 구체예에서 이러한 링커는 약 3 내지 약 12 개, 예를 들어 5 내지 10 개, 구체적으로 7 내지 9 개의 연속된 아미노산 잔기로 이루어진다. 상기 링커의 길이는 상기 이중항체-유닛 내 특정 도메인 배향으로 조절될 수 있다. 예를 들어, (G2S)2 링커는 이중항체 유닛에서 VH-VL 쌍 또는 VL-VH 쌍에 대해 사용될 수 있고 및 (G2S)3 링커는 VH-VH 쌍 또는 VL-VL 쌍에 대해 사용될 수 있고 또는 (G2S)2 링커는 VH-VH 쌍에 대해 사용될 수 있고 및 (G2S)3 링커는 이중항체 유닛의 VL-VL 쌍에 대해 사용될 수 있다 (또는 그 반대로). 게다가, 상기 쌍의 가변 항체 도메인 간에 12 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 링커를 갖는 두 개의 폴리펩티드가 올바르게 서로 이량체화하는 것은 원칙적으로 가능하다 (예를 들어 Le Gall 등, 2004, Protein Engineering 17:357-366 참조).
특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛은 단쇄 이중항체-유닛이다 (도 1). "단쇄 이중항체-유닛(single chain diabody-unit)"은 긴 링커에 의해 제2 쌍의 가변 도메인으로 연결된 제1 쌍의 가변 도메인으로 이루어져, scFv 유닛에서 사용된 "긴 링커(long linker)"로 정의되고 다음 단락에 기술된 바와 같은 제1 및 제2 쌍의 가변 도메인의 분자 내 결합을 허용한다. 예를 들어, 그러한 긴 링커는 12 개 이상, 구체적으로 약 15 내지 약 50 개, 바람직하게는 약 15 내지 약 35 개, 구체적으로 약 15 내지 약 25 개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 단쇄 이중항체의 도메인은 상기 단쇄 이중항체-유닛의 N-말단에서 C-말단으로 VL-VH-VL-VH, VL-VL-VH-VH, VH-VH-VL-VL 또는 VH-VL-VH-VL 의 순서로 배열될 수 있다.
특정 구체예에서 본 발명의 상기 항체 분자는 단쇄 이중항체-유닛을 포함하는 단일 폴리펩티드로 이루어진다 (도 1, 4). 특정 구체예에서 상기 항체 분자는 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 세 개 이상의 단쇄 이중항체-유닛을 포함한다 (도 4). 다른 구체예에서 본 발명의 항체 분자는 하나의 이중항체-유닛으로 원거리로 연결된 하나 이상의 단쇄 이중항체-유닛을 포함한다(도 5).
"단쇄 Fv (scFv) 유닛(single-chain Fv (scFv) unit)"은 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 가변 중쇄 도메인 (VH)으로 이루어진 단일 폴리펩티드의 단편에 의해서 형성된 Fv 항원 결합 부위를 나타낸다. 상기 가변 도메인 상기 scFv 유닛의 N-말단에서 C-말단으로 VL-VH 또는 VH-VL로서 배향될 수 있다. 상기 가변 도메인은 하나의 가변 도메인의 C-말단 및 다른 가변 도메인의 N-말단 사이 또는 그 반대로 펩티드 링커에 의해서 연결된다. 상기 펩티드 링커는 분자 내적으로 접히고 Fv 항원 결합 부위를 형성하도록 길고 유연하다 (일반적으로 약 12 개 이상의 아미노산 잔기로 이루어짐). 추가적인 아미노산 잔기는 추가의 유연성을 제공한다. 예를 들어, 그러한 긴 링커는 12 개 이상, 구체적으로 약 15 내지 약 50 개, 바람직하게는 약 15 내지 약 35 개, 구체적으로 약 15 내지 약 25 개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 상기 링커 길이는 상기 scFv 유닛 내 N-말단에서 C-말단으로의 특정 도메인 배향으로 조정될 수 있다. 예를 들어, (G2S)6 링커는 VH-VL scFv유닛에 대해 사용될 수 있고 (G2S)7 링커는 VL-VH scFv 유닛에 대해 사용될 수 있다.
상기 scFv 유닛은 scFv 유닛의 가변 도메인 및 상기 이중항체 유닛의 가변 도메인 간의 펩티드 링커에 의해서 상기 이중항체-유닛에 연결된다. 상기 펩티드 링커의 길이는 병치된 가변 도메인 간의 입체 장애를 피하고 상기 분자의 안정성을 유지하기 위해서 선택되고 예를 들어, 5 내지 50 개, 구체적으로 5 내지 35 개, 바람직하게는, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기일 수 있다.
특정 예에서 상기 이중항체-유닛은 상기 항체 분자의 접힘을 유용하게 하고 안정성을 개선시키기 위해 항체 분자 내의 중심에 위치한다. 그러한 예에서, 상기 이중항체-유닛은 N-말단 및 C-말단이 추가의 원위 가변 도메인과 연결된다. 특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛은 두 개 (도 1, 2, 8a, 8b), 세 개 (도 6a, 6b) 또는 네 개 (도 7)의 scFv-유닛과 연결된다. 특정 예에서 상기 항체 분자, 구체적으로 삼중 특이적 Fv 항체 분자는 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 N-말단에 scFv 유닛, C-말단에 scFv 유닛 및 두 개의 scFv 유닛 사이에 위치한 이중항체-유닛의 두 개의 가변 도메인 제1 쌍을 포함한다 (도 1 및 2). 이러한 상기 이중항체-유닛의 두 개의 가변 도메인 제1 쌍은 Fv 항원-결합 부위를 이루기 위하여 결합하지 않는다. 예를 들어, 상기 이중항체-유닛이 이량체적 이중항체-유닛이면 상기 병치된 가변 도메인 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인 각각은 추가의 가변 도메인에 연결된다. 구체적으로, 상기 병치된 가변 도메인 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인 각각은 scFv 유닛의 추가 가변 도메인과 연결된다 (도 2). 추가적 예에서 병치된 가변 도메인 제2 쌍의 하나 또는 둘 모두의 가변 도메인은 추가적으로 추가 가변 도메인에 연결될 수 있다 (도 6a, 6b, 7). 상기 이중항체-유닛이 단쇄 이중항체 유닛이면 상기 제1 쌍의 병치된 가변 도메인은 N-말단이 추가 가변 도메인에 연결되고 제2 쌍의 병치된 가변 도메인은 C 말단이 추가 가변 도메인에 연결된다. 구체적으로, 상기 제1 쌍의 병치된 가변 도메인은 N-말단이 scFv 유닛의 추가 가변 도메인에 연결되고 제2 쌍의 병치된 가변 도메인은 C-말단이 다른 scFv 유닛의 추가 가변 도메인에 연결된다 (도 1). 다른 구체예에서 상기 제1 단쇄 이중항체 유닛의 제1 쌍의 가변 도메인은 N-말단이 제2 단쇄 이중항체 유닛의 추가 가변 도메인에 연결되고 상기 제1 단쇄 이중항체의 제2 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 제3 단쇄 이중항체 유닛의 추가 가변 도메인에 연결되어 서로 연결된 세 개의 단쇄 이중항체 유닛을 포함하는 하나의 폴리펩티드를 생성한다 (도 4). 추가적 예에서 하나 이상의 추가 가변 도메인은 상기 제1 및 제2 쌍의 병치된 가변 도메인 사이에 위치할 수 있다.
특정 예에서 상기 이중항체-유닛이 단쇄 이중항체 유닛이면, 상기 다가 항체는 이 폴리펩티드의 두 개의 다른 병치된 가변 도메인, 즉 제2 쌍의 가변 도메인과 결합된 두 개의 병치된 가변 도메인, 즉 제1 쌍의 병치된 가변 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드로 이루어진다 (도 1). 그러한 항체 구조물은 다중 특이적, 구체적으로 이중-, 삼중-, 또는 사중 특이적 항체를 제공하는데 유리하다. 특정 구체예에서 그러한 다가의, 구체적으로 삼중 특이적 Fv 항체는 N-말단에서 C-말단으로 서로 연결된 여덟 개 이상의 가변 도메인, N-말단에 scFv-유닛을 형성하는 제1 및 제2 가변 도메인을 갖고, 상기 N-말단의 scFv-유닛은 C-말단이 제3 가변 도메인 및 제4 가변 도메인을 포함하는 이중항체-유닛의 제1 쌍의 가변 도메인의 제3 가변 도메인에 연결되고, 상기 제4 가변 도메인은 C-말단이 제5 및 제6 가변 도메인을 포함하는 이중항체-유닛의 제2 쌍 가변 도메인의 제5 가변 도메인으로 연결되고, 상기 제6 가변 도메인은 C-말단이 상기 C-말단의 scFv-유닛의 제7 가변 도메인으로 연결되고, 상기 scFv-유닛은 제7 및 제8 가변 도메인에 의해서 형성된다 (도 1). 상기 가변 도메인은 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단으로, 하기의 배향 중 하나로 배열될 수 있다: VH-VL-VL-VH-VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VH-VL-VL-VL-VH, VL-VH-VL-VH-VL-VH-VH-VL 또는 VH-VL-VL-VL-VH-VH-VL-VH. 특정 구체예에서 상기 이중항체-유닛의 한 쌍의 가변 도메인은 VH-VH 배향을 갖고 상기 이중항체 유닛의 다른 쌍의 가변 도메인은 VL-VL 배향을 갖는다 (도 1).
전술한 바와 같은 8 개의 가변 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드로 이루어진 항체 분자의 4가 구체예는 삼중 특이적 항체에 유리하다. 예를 들어, 그러한 삼중 특이적 항체는 종양 세포와 같은 표적 세포에 대해 제1 및 제2 항원 특이성을 제공할 수 있고, T- 또는 NK-세포와 같은 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 그러한 삼중 특이적 항체는 효과자 세포 상의 상이한 항원에 대한 두 개의 특이성 및 종양 세포 상의 하나의 항원에 대한 제3 특이성을 가질 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 두 개의 원위 scFv 유닛은 상기 표적 세포에 대한 제1 및 제2 특이성을 가질 수 있고, 상기 두 개의 scFv 유닛 사이에 이중항체 유닛은 면역 효과자 세포에 대한 특이성을 가질 수 있다; 즉, N-말단에서 C-말단으로 제1 및 제2 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고; 제3 및 제5 가변 도메인은 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖고, 제4 및 제6 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖고 제7 및 제8 가변 도메인은 표적 세포에 대해 제2 특이성을 갖는다 (도 1). 다른 구체예에서 상기 두 개의 원위 scFv 유닛은 상기 면역 효과자 세포에 대한 특이성을 가질 수 있고, 상기 이중항체-유닛에 의해 형성된 두 개의 항원 결합 부위는 상기 표적 세포에 대해 두 가지 상이한 특이성을 가질 수 있다; 즉 N-말단에서 C-말단으로 제1 및 제2 뿐 아니라 제7 및 제8 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖고, 제3 및 제5 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제1 특이성을 갖고 제4 및 제6 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제2 특이성을 갖는다. 추가의 대안적 구체예에서 상기 폴리펩티드는 여덟 개 이상의, 예를 들어, 10, 12 이상의 가변 도메인을 가질 수 있고, 두 개 이상의 scFv 유닛 및/또는 하나 이상의 이중항체 유닛을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서 상기 하나의 폴리펩티드로 이루어진 다가 항체 분자는 서로 연결된 세 개의 단쇄 이중항체 유닛을 포함한다 (도 4). 그러한 항체 분자는 N-말단에서 C-말단으로 서로 연결된 12 개 이상의 가변 도메인을 갖는다. 하나의 특정 구체예에서, 제2 단쇄 이중항체-유닛의 한 쌍의 가변 도메인은 VH-VH 배향을 갖고, 제2 단쇄 이중항체 유닛의 다른 쌍의 가변 도메인은 VL-VL 배향을 갖는다 (도 4). 그러한 항체 분자는 6 가이고, 하나 내지 여섯 개의 상이한 항원 특이성, 구체적으로 두 개 또는 세 개의 상이한 항원 특이성에 대한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
특정 예에서 상기 항체, 구체적으로 Fv 항체 분자는 이량체적 이중항체 유닛 형태로 이중항체 유닛을 포함한다. 그러한 예에서 상기 항체 분자는 두 개의 폴리펩티드의 이량체이고, 상기 이중항체 유닛의 두 개의 병치된 가변 도메인의 제1 쌍은 서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드에 통합되고, 상기 병치된 가변 도메인의 제1 쌍은 제2 폴리펩티드에서 병치된 두 개의 가변 도메인의 다른 제2 쌍과 결합된다. 바람직하게는, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 비-공유적으로 결합된다 (도 2, 3, 5, 6a, 6b, 7, 8a 및 8b8b). 그러나, 일부 구체예에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 예를 들어, 이황화 결합 또는 화학적 링커에 의해서 공유적으로 결합될 수 있다.
일부 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드는 6 개의 가변 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 두 개 이상의 가변 도메인을 포함한다 (도 2). 그러한 구체예에서 상기 제2 폴리펩티드는 이중항체 유닛의 일부이고, 바람직하게는 비-공유적으로, 상기 제1 폴리펩티드로 통합된 두 개의 병치된 가변 도메인의 다른 쌍과 결합된다. 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드 사슬이 6 개의 가변 도메인으로 이루어지고, 상기 제2 폴리펩티드가 두 개의 가변 도메인으로 이루어지는 경우, 상기 가변 도메인은 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단으로, 예를 들어, 하기의 배향으로 배열될 수 있다: VH-VL-VH-VH-VL-VH (제1 폴리펩티드) 및 VL-VL (제2 폴리펩티드); VL-VH-VH-VH-VH-VL (제1 폴리펩티드) 및 VL-VL (제2 폴리펩티드); VH-VL-VL-VL-VH-VL (제1 폴리펩티드) 및 VH-VH (제2 폴리펩티드); VL-VH-VL-VL-VH-VL (제1 폴리펩티드) 및 VH-VH (제2 폴리펩티드) 또는 VH-VL-VL-VL-VL-VH (제1 폴리펩티드) 및 VH-VH (제2 폴리펩티드). 상기 VH-VH 순서로 한 쌍의 두 개의 가변 도메인을 갖고 상기 VL-VL 배향으로 다른 쌍의 두 개의 가변 도메인을 갖는 이중항체 유닛은 구체적으로 다중-특이적, 예를 들어 삼중 특이적인 항체 분자의 올바른 접힘을 선호한다.
전술한 바와 같은 6 개 이상의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 두 개 이상의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체 분자의 4가 구체예는 삼중 특이적 항체에 유리하다. 제1 및 제2 폴리펩티드의 상이한 크기 때문에, 상기 폴리펩티드는 상등액으로부터 용이하게 분리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 삼중 특이적 항체는 종양 세포와 같은 표적 세포에 대해 제1 및 제2 특이적이고, T- 또는 NK-세포와 같은 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이적이다. 다른 구체예에서 상기 삼중 특이적 항체 분자는 제1 및 제2 바이러스적 항원 또는 바이러스적 항원 에피토프에 대한 제1 및 제2 특이성 및 T- 또는 NK-세포와 같은 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 제공한다. 다른 구체예에서 상기 삼중 특이적 항체 분자는 바이러스적 항원에 대한 제1 특이성, 표적 세포 상의 항원에 대한 제2 특이성 및 T- 또는 NK-세포와 같은 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 제공한다. 다른 예에서, 그러한 삼중 특이적 항체는 T- 또는 NK-세포와 같은 효과자 세포에 대해 제1 및 제2 특이성, 및 종양 세포 상의 종양 항원과 같은 표적 세포 또는 바이러스적 항원에 대해 제3 특이성을 가질 수 있다. 상기 효과자 세포에 대한 제1 및 제2 특이성은 동일한 유형의 효과자 세포에 대한 동일한 항원의 상이한 항원 또는 에피토프일 수 있다.
일부 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드에 형성된 두 개의 원위적 scFv 유닛은 상기 표적 세포에 대한 제1 및 제2 특이성을 가질 수 있고, 제1 및 제2 폴리펩티드 사이에 형성된 두 개의 scFv 유닛 간의 이중항체-유닛은 면역 효과자 세포에 대한 특이성을 가질 수 있다; 즉, 제1 폴리펩티드에서 N-말단에서 C-말단으로 상기 제1 및 제2 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고; 상기 제3 및 제4 가변 도메인은 면역 효과자에 대한 제3 특이성을 갖고, 제5 및 제6 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 제2 폴리펩티드에서 상기 제1 및 제2 가변 도메인은 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖는다 (도 2). 다른 구체예에서 상기 6 개의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드에서 두 개의 원위적 scFv 유닛은 면역 효과자 세포에 대한 특이성을 가질 수 있고, 제1 폴리펩티드의 이중항체 유닛 뿐 아니라 제2 폴리펩티드의 두 개의 가변 도메인에 의해서 형성된 두 개의 항원 결합 부위는 표적 세포에 대해 두 개의 상이한 특이성을 갖는다; 즉, 제1 폴리펩티드에서 N-말단에서 C-말단으로 상기 제1 및 제2 뿐 아니라 제5 및 제6 가변 도메인은 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖고, 제3 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고, 제4 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 제2 폴리펩티드에서 상기 제1 가변 도메인은 표적 세포의 제2 특이성에 대한 특이성을 갖고 상기 제2 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖는다.
다른 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드는 여섯 개 이상의 가변 도메인을 포함하고 및 상기 제2 폴리펩티드는 네 개 (도 6a, 6b) 또는 여섯 개의 (도 7) 가변 도메인을 포함한다. 그러한 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드는 이중항체-유닛의 제1 쌍의 가변 도메인을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드는 바람직하게는 서로 비-공유적으로 결합되어 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 간에 두 개의 항원 결합 부위를 형성하는 이중항체-유닛의 제2 쌍의 가변 도메인을 포함한다. 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드 사슬이 여섯 개의 가변 도메인으로 이루어지고 상기 제2 폴리펩티드가 네 개의 가변 도메인으로 이루어지는 경우 상기 제2 폴리펩티드에서 이중항체 유닛의 병치된 가변 도메인 쌍은 제2 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 추가의 항원 결합 부위를 제공하는 scFv 유닛으로 연결된다 (도 6a, 6b). 그러한 구체예는 5가이고 한 개 내지 다섯 개의 상이한 항원 특성, 구체적으로 두 개 또는 세 개의 상이한 항원 특성에 대한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 제1 폴리펩티드에서 VH-VH 배향으로 한 쌍인 두 개의 가변 도메인 및 제2 폴리펩티드에서 VL-VL 배향으로 다른 쌍인 두 개의 가변 도메인을 갖는 이중항체-유닛은 구체적으로 다중특이적, 예를 들어 삼중 특이적의 항체 분자의 올바른 접힘을 선호한다.
다른 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드 사슬이 여섯 개의 가변 도메인으로 이루어지고 상기 제2 폴리펩티드가 네 개의 가변 도메인으로 구성되는 경우, 상기 제2 폴리펩티드에서 이중항체 유닛의 병치된 가변 도메인 쌍은 N-말단 또는 C-말단이 두 개의 추가 항원 결합 부위를 제공하는 scFv 유닛으로 연결된다 (도 7). 그러한 구체예는 6가이고 하나 내지 여섯 개의 상이한 항원 특이성, 구체적으로 두 개 또는 세 개의 상이한 항원 특이성에 대한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서 상기 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드에서 VH-VH 배향으로 한 쌍의 가변 도메인 및 상기 제2 폴리펩티드에서 VL-VL 배향으로 다른 쌍의 가변 도메인을 갖는다. 다른 대안적인 구체예에서 다가, 예를 들어 삼중 특이적인 Fv 항체 분자는 하나 이상의 이량체적 이중항체 유닛을 포함할 수 있다. 그러한 대안적인 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드는 여섯 개 이상의 가변 도메인을 포함할 수 있고 상기 제2 폴리펩티드는 네 개 (도 3) 또는 여섯 개의 (도 8a, 8b) 가변 도메인을 포함할 수 있다. 구체예에서 상기 제1 폴리펩티드가 여섯 개 이상의 가변 도메인을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드가 네 개의 가변 도메인을 포함하는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 네 개의 병치된 가변 도메인은 상기 제1 폴리펩티드에 통합된 상응하는 네 개의 병치된 가변 도메인과 결합되어 일렬(tandem)의 두 개의 병치된 이중항체-유닛을 형성한다. 상기 남아있는 제1 폴리펩티드의 두 개 이상의 추가 가변 도메인은 상기 이렬의 이중항체 유닛으로부터 원위적으로 위치하고, scFv 유닛을 형성한다 (도 8a. 9b). 다른 구체예에서, 상기 제1 폴리펩티드가 여섯 개의 가변 도메인을 포함하고 상기 제2 폴리펩티드가 여섯 개의 가변 도메인을 포함하는 경우, 상기 제1 폴리펩티드의 여섯 개의 가변 도메인은 제2 폴리펩티드의 상응하는 여섯 개의 가변 도메인과 결합되어 세 개의 병치된 이중항체-유닛을 형성한다 (도 3). 각 폴리펩티드가 여섯 개의 가변 도메인을 포함하는 제1 및 제2 폴리펩티드로 구성된 후자의 구체예는 동종이량체의 형태로 삼중 특이적, 즉 동일한 두 개의 폴리펩티드가 서로 결합되어 세 개의 항원 특이성 각각에 대해 2가적 결합을 제공하는 항체를 제공할 수 있는 이점을 갖는다.
특정 예에서 4가, 삼중 특이적 Fv 항체는 일렬의 이중항체에 의해서 제공된다. 그러한 삼중 특이적 Fv 항체 분자는 제1 및 제2 폴리펩티드로 이루어지고, 각 폴리펩티드는 서로 연결된 네 개의 가변 도메인을 포함한다. 그러한 Fv 항체 분자에서 상기 링커 길이는 가변 도메인의 분자 내 페어링을 배제하여 상기 분자가 그 자체로 접힐 수 없지만, 다른 폴리펩티드의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록, 즉, 결합되도록 한다. 상기 도메인은 상응하는 VH 및 VL 도메인이 이량체화하는 동안 서로 결합되도록 배열된다. 분자 간 공유 결합의 부재에도 불구하고, 상기 이량체는 한 번 형성되면 매우 안정하고, 손상되지 않도록 남아 있어 단량체 형태로 되돌아가지 않는다. 일부 구체예에서 상기 삼중 특이적 Fv 항체 분자는 이량체적 이중항체 유닛을 포함하고, 한 쌍의 두 개의 병치된 가변 도메인은 VH-VH 배향을 갖고 다른 쌍의 두 개의 병치된 가변 도메인은 VL-VL 배향을 갖는다. 상기 이중항체 유닛에서 그러한 가변 도메인 배향은 두 개의 삼중 특이적 폴리펩티드의 올바른 결합을 촉진시킨다. 구체적으로, 그러한 배향은 일렬의 이중항체의 형태로 삼중 특이적 Fv 항체 분자를 가능하도록 하는데, 두 개의 상이한 폴리펩티드의 이종이량체이기 때문이다. 따라서, 그러한 배향은 바람직하게는 삼중 특이적 일렬의 이중항체의 올바른 이종이량체화를 가능하게 한다. 따라서, 일부 구체예에서 상기 삼중 특이적 Fv 항체 분자는 일렬의 이중항체이다 (도 3). 그러한 삼중 특이적 일렬의 이중항체에서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드의 가변 도메인은 상기 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단으로, 예를 들어 하기의 배향으로 배열될 수 있다: VL-VH-VH-VL (제1 폴리펩티드) 및 VH-VL-VL-VH (제2 폴리펩티드) 또는 그 반대 (도 3). 일렬의 이중항체의 형태인 그러한 삼중 특이적 항체는 종양 세포와 같은 표적 세포에 대해 제1 및 제2 특이성 및 T- 또는 NK-세포와 같은 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 제공할 수 있다. 다른 예에서, 그러한 삼중 특이적 항체는 상기 효과자 세포 상의 상이한 항원에 대해 두 개의 특이성 및 종양 세포 상의 항원에 대해 제3 특이성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서 상기 폴리펩티드에서 외부적으로 위치한 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제1 및 제2 특이성을 가질 수 있고 상기 외부적으로 위치한 가변 도메인 간의 상기 폴리펩티드에서 중심에 위치한 두 개의 가변 도메인은 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖는다; 즉, 상기 폴리펩티드에서 N-말단에서 C-말단으로, 상기 제1 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고; 상기 제2 및 제3 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖고, 제4 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 및 제2 폴리펩티드에서 상기 제1 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 상기 제2 및 제3 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖고 및 제4 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖는다 (도 3). 다른 구체예에서 상기 폴리펩티드에 외부적으로 위치한 가변 도메인은 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 가질 수 있고 상기 외부적으로 위치한 가변 도메인 간의 폴리펩티드에서 중심에 위치한 두 개의 가변 도메인은 표적 세포에 대한 제1 및 제2 특이성을 가진다; 즉, 상기 제1 폴리펩티드의 N-말단에서 C-말단으로, 상기 제1 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 에피토프 특이성을 갖고; 상기 제2 가변 도메인은 사익 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고, 상기 제3 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 상기 제4 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖고, 상기 제2 폴리펩티드에서 제1 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖고, 상기 제2 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제2 특이성을 갖고, 상기 제3 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대한 제1 특이성을 갖고 및 상기 제4 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖는다. 다른 구체예에서 상기 면역 효과자 세포에 대한 제3 특이성을 갖는 가변 도메인은 항체 분자에서 측방향(laterally)으로 위치한다; 즉 상기 제1 폴리펩티드에서 N-말단에서 C-말단으로, 상기 제1 및 제2 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖고; 상기 제3 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제1 특이성을 갖고, 상기 제4 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제2 특이성을 갖고, 및 상기 제2 폴리펩티드에서 상기 제1 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제2 특이성을 갖고, 상기 제2 가변 도메인은 상기 표적 세포에 대해 제1 특이성을 갖고 상기 제3 및 제4 가변 도메인은 상기 면역 효과자 세포에 대해 제3 특이성을 갖는다.
다른 구체예에서 상기 일렬의 이중항체는 하나 이상의 추가의 항원 결합 도메인, 구체적으로 상기 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 scFv-유닛에 접합(conjugate)된다. 바람직한 구체예에서 상기 일렬의 이중항체는 펩티드 링커에 의해서 상기 하나 이상의 scFv-유닛에 접합된다. 구체적으로 그러한 항체 분자는 제1 및 제2 폴리펩티드로 이루어지고, 폴리펩티드 둘 모두 여섯 개의 가변 도메인으로 이루어지고, 상기 각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각 폴리펩티드의 N-말단 또는 각 폴리펩티드의 C-말단(도 8a)에 scFv-유닛을 포함한다 (도 8b). 그러한 항체 분자는 6가이고 한 개 내지 여섯 개의 상이한 항원 특이성, 구체적으로 두 개 또는 세 개의 상이한 항원 특이성에 대한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서 상기 항체 분자 내에서 중심에 위치한 이중항체-유닛은 상기 제1 폴리펩티드에서 VH-VH 배향으로 한 쌍의 가변 도메인 및 제2 폴리펩티드에서 VL-VL 배향으로 다른 쌍의 가변 도메인을 갖는다. 특정 예에서 상기 다가 항체 분자, 구체적으로 여기서 기술된 Fv 항체 분자는 삼중 이상으로 특이적이고 4가 이상인 항체 분자이다. 그러한 항체 분자는 동일한 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 두 개 이상의 항원-결합 부위를 포함한다. 이에 따라, 결합력, 즉, 상기 항원 에피토프와 항원-결합 분자간의 상호 작용의 강도가 증가된다. 상기 삼중 특이적 항체 분자의 결합력은 본 발명의 5가 및 6가 구체예에 의해서 더 증가될 수 있다. 5가 분자는 삼중 특이적 항체의 세 개의 에피토프 특이성 중 두 개에 대한 두 개 이상의 결합 부위를 제공할 수 있고, 6가 구체예는 세 개의 에피토프 특이성 각각에 대한 2 개의 항원-결합 부위를 제공할 수 있다. 대안적으로, 상기 다중 특이성, 즉, 특이성(specifitisspecificities)의 수는 4가, 5가 및 6가 구체예에 의해서 증가될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 분자는 사중-특이적일 수 있다. 더 높은 결합력의 이점은 표적에 대한 상호작용 및 유지의 안정성의 증가이다. 예를 들어, 상기 표적이 T-세포 또는 NK-세포와 같은 세포 독성적 면역 효과자 세포인 경우, 더 높은 결합력은 상기 항체 분자의 증가된 세포 독성적 잠재력을 유발할 수 있다. 다른 예에서, 상기 표적가 종양 세포인 경우, 더 높은 결합력은 상기 표적에 대한 유지 시간을 개선시키고 상기 표적에 대한 분리율(off-rate)를 감소시킨다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 삼중 특이적 및 4가 Fv 항체 분자는 동일한 종류의 종양 세포의 두 개의 상이한 항원 에피토프에 대한 제1 및 제2 항원-결합 부위 특이성 및 T-세포 또는 NK-세포와 같은 면역 효과자 세포 상의 항원 에피토프에 대한 제3 및 제4 항원 결합 부위 특이성을 포함한다. 그러한 항체 분자는 특정 종류의 종양 세포에 대한 특이성뿐 아니라 결합력도 증가시키고, 면역 효과자 세포에 대한 활성 또는 억제에 대한 결합력을 증가시켜, 항원-결합 분자의 유리하게 증가된 특이적 세포 독성 잠재성을 유발한다. 두 개의 별개의 항원 에피토프에 대한 결합은 표적화 특이성에 대한 증가 및 비-표적(off-target) 세포독성을 감소시킴으로써 치료 창(therapeutic window)를 연장시킨다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 에피토프 특이성에 대한 2 개 이상의 항원-결합 부위, 예를 들어, 한 개, 두 개 또는 세 개의 에피토프 특이성, 즉, 표적에 대한 두 개의 결합 부위를 제공하기 때문에 결합력 및/또는 생물적 활성을 유리하게 증가시킨 다중-특이적 항체 분자를 제공한다.
중요하게는, 구조적 복잡성에도 불구하고, 그러한 다중-특이적, 예를 들어, 삼중 특이적 및 다가, 예를 들어, 본 발명의 4가, 항체 분자는 안정하다.
다른 예에서, 그러한 다중-특이적, 예를 들어, 삼중 특이적, 항체는 효과자 세포 세포, 예를 들어, NK-세포 또는 T-세포에 대해 2 개의 특이성 및 종양 세포 상의 하나의 항원에 대한 제3 특이성을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 분자는 종양 세포 또는 예를 들어, 바이러스에 감염된 세포와 같은 감염제를 파괴시키기 위해 면역 효과자 세포의 세포 독성 잠재력으로 전용(redirect)하기 위한 상이한 방식으로 이용될 수 있다. 일부 구체예에서 상기 다중-특이적, 예를 들어, 삼중 특이적 항체 분자는 표적에 대해 두 개 상이한 항원 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 두 개 상이한 에피토프는 동일한 항원 상에 있어 탈출 돌연변이(escape mutant)를 방지하거나 효능을 증진시킬 수 있거나, 또는 상기 2 개의 에피토프가 상기 표적의 두 개의 상이한 항원 상에 있을 수 있다. 다른 구체예에서 상기 삼중 특이적 항체 분자는 면역 효과자 세포 상의 두 개의 상이한 항원 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 제1 항원-결합 부위는 예를 들어, CD16, CD16A 또는 CD3의 활성화 수용체에 대한 특이성을 갖고 제2 항원-결합 부위는 예를 들어 CD137, OX-40 또는 CD28의 공동-자극적 수용체에 대한 특이성을 갖는다. 다른 예에서, 제1 항원-결합 부위는 CD16 또는 CD16A에 대한 특이성을 갖고 제2 항원-결합 부위는 NK-세포 상의 다른 활성화 수용체, 예를 들어, NKG2D, DNAM, NCR에 대한 특이성을 가질 수 있다.
다른 구체예에서 상기 삼중 특이적, 구체적으로 Fv, 항체 분자는 종양 세포 상의 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제1 항원-결합 부위, 면역 효과자 세포 상의 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제2 항원-결합 부위 및 성장 인자, 시토킨, 케모킨, 미토젠 및 알부민의 군으로부터 선택된 가용성 단백질 상의 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제3 항원-결합 부위를 갖는다. 그러한 가용성 단백질의 예는 IL-6, BAFF, APRIL, TGF-베타, IL-10, VEGF-A, TGF-알파, EGF, HB-EGF, 헤레굴린(Heregulin), 안지오포에틴-2 및 인간 혈청 알부민 (HSA)이다.
대안적인 구체예에서 상기 항체 분자는 한 유형의 세포에 존재하는 항원의 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 하나 이상의 다른 유형의 세포 상의 항원 에피토프에 대한 특이성을 갖는 세 개의 항원-결합 부위를 갖는다.
"효과자 세포(effector cell)"는 세포 독성, 식균 작용, 항원 제시 또는 시토킨 방출을 자극하거나 유발할 수 있는 면역계의 세포이다. 그러한 효과자 세포는 예를 들어 T-세포, 자연 살해 (NK)-세포, 감마 델타(gd) T-세포, 자연 살해 T (NKT)-세포, 과립구, 단핵구(monocyte), 대식세포, 수지상 세포, 선천성 림프구 세포 (innate lymphoid cell; ILC) 및 항원-제시 세포이고, 이에 제한되지 않는다. 효과자 세포에 대한 적절한 특이성의 예는 CD2, CD3 및 CD3ε과 같은 CD3 서브유닛, CD5, CD28 및 T-세포의 T-세포 수용체 (TCR) 또는 CD134 (OX40); NK-세포의 CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336 (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2A, NKG2C 및 NKG2D, DNAM, NCR; 과립구의 CD18, CD64 및 CD89; 단핵구 및 대식세포의 CD18, CD32, CD47, CD64, CD89 및 만노스 수용체; 수지상 세포의 CD64 및 만노스 수용체; 및 CD35의 다른 구성을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 구체예에서 이러한 효과자 세포의 특이성, 즉 세포 표면 분자는 다중 특이적, 예를 들어 삼중 특이적인 항체 분자와 결합 시 세포 용해 또는 세포 사멸을 유도하여 세포 살해를 매개하기에 적합하다.
CD3 항원은 T-세포 상의 T-세포 수용체 복합체의 구성이다. 효과자 세포에 대한 특이성이 CD3인 경우, 본 발명에 따른 상기 항원-결합 분자의 CD3에 대한 결합은 T-세포의 세포 독성 활성을 유발한다. 항체 분자가 CD3 및 종양 세포와 같은 표적 세포에 결합함으로써, 상기 표적 세포의 세포 용해가 유도될 수 있다.
상기 CD16A (FcγRIIIA) 항원은 NK-세포의 표면 상에 발현된 수용체이다. NK-세포는 고유의 세포 유리 활성을 가지며, 본 발명에 따른 항체 분자의 CD16 또는 CD16A에 결합함으로써 NK 세포의 표적에 대한 세포 독성 활성이 유발될 수 있다.
"표적(target)"은 항원 에피토프가 위치하고 항체 분자가 결합할 부위이다. 표적의 예는 가용제, 세포 상의 항원, 예를 들어 뎅기 바이러스, 헤르페스 심플렉스, 인플루엔자 바이러스, HIV, HCV, CMV로부터 유래된 바이러스 또는 박테리아 항원과 같은 감염제, 또는 바이러스 및 박테리아의 침입을 용이하게 하는 세포 상의 항원 또는 예를 들어 뉴론, 표지 항원, 또는 IL-2/IL2R과 같은 자가 면역 표적을 운반하는 세포, 자가면역 마커 또는 자가면역 항원 또는 종양 세포와 같은 세포이다. 하나 이상의 항원-결합 부위가 효과자 세포에 대한 특이성을 갖는 구체예에서, 상기 표적은 효과자 세포가 예를 들면, 면역과 같은 개별적인 생물적 반응을 유도하거나 또는 유발하도록 전용되어야 하는 종양 세포가 될 수 있다.
종양 세포에 대해 적합한 특이성은 개별적인 종양 세포 상의 종양 항원 및 세포 표면 항원, 예를 들어 특이적 종양 마커일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "종양 항원(tumor antigen)"은 종양 결합된 항원 (TAA) 및 종양 특이적 항원 (TSA)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "종양 결합된 항원(tumor associated antigen)" (TAA)은 태아 생존(종양태아(onco-fetal) 항원) 동안 및 선택된 기관에서 출색 후 종양 세포 및 정상 세포 상에 존재하나 종양 세포에 비해 훨씬 낮은 농도인 단백질을 의미한다. TAA는 또한 종양 세포 부근의 간질에 존재할 수 있으나 신체의 다른 곳의 간질에서 더 적은 양으로 발현된다. 반대로, 용어 "종양 특이적 항원(tumor specific antigen)" (TSA)은 종양 세포에 의해서 발현된 단백질을 의미한다. 용어 "세포 표면 항원(cell surface antigen)"은 세포의 표면 상에서 항체 의해 인지될 수 있는 임의의 항원 또는 이의 단편 분자를 의미한다.
종양 세포의 특이성의 예는 CD19, CD20, CD26, CD29, CD30, CD33, CD52, CD200, CD267, EGFR, EGFR2, EGFR3, EGFRvIII, HER2, HER3, IGFR, IGF-1R, Ep-CAM, PLAP, Thomsen-Friedenreich (TF) 항원, TNFRSF17, gpA33, MUC-1 (뮤신(mucin)), IGFR, CD5, IL4-R 알파, IL13-R, FcεRI, MHC 클래스 I/펩티드 복합체 및 IgE를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 종양 특이성이 CD19 항원에 대한 것인 본 발명에 따른 항체 분자는 CD19 항원이 림프구성 백혈병 (lymphoblastic leukemia; ALL) 부터 비-호지킨성 림프종(non-Hodgkin's lymphoma; NHL)에 이르기까지 실질적으로 모든 B-계통 악성 종양에서 발현되지 ‹š문에 B-세포 악성 종양의 면역 치료로 사용될 수 있다.
종양 특이성이 CD30에 대한 것인 본 발명에 따른 항체 분자는 구체적으로 호지킨성 질환 및 T-세포성 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다.
종양 특이성이 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 또는 EGFRvIII 돌연변이에 대한 것인 본 발명에 따른 항체 분자는 신경 교종, 유방암, 난소암, 전립선암, 폐암, 두암 및 목암; 예를 들어, 간세포 암, 간경화 또는 만성 간염과 같은 간 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
신체에서 본 발명에 따른 항체 분자의 혈청-반감기를 증가시키기 위해, 상기 항체 분자는 필요에 따라 인간 혈청 알부민(HSA), 또는 페길화, 사일릴화, 파실레이트화 또는 글리코실화된 알부민과 융합될 수 있다 (예를 들어, Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:7804-7812 참조). 일부 구체예에서 상기 항체 분자는 삼중 이상 특이적이고 알부민, 예를 들어 HAS에 대해 하나 이상, 예를 들어 하나 또는 두 개의 특이성을 갖는 항원-결합 부위를 포함한다. 그러한 삼중 이상 특이적인 항체 분자는 예를 들어, 4가, 5가 또는 6가 항체 분자일 수 있다.
표적 세포 또는 효과자 세포 상에 특이성을 갖는 가변 도메인은 의도하는 항원에 대한 특이성을 갖는 가변 단편 (Fv)를 선택함으로써 얻을 수 있다. 이는 예를 들어, 단쇄 Fv (scFv) 파지 디스플레이 라이브러리를 스크링닝하거나 또는 하이브리도마 기술을 통해 성취될 수 있다. 예를 들어, 인간 scFv 서열의 IgM-기반된 파지 디스플레이 라이브러리는 원하는 항원에 대해 특이적인 결합제를 풍부하게 하기 위해 여러 차례의 인비트로 선택을 가할 수 있다. 선택된 scFv의 친화도는 친화성 성숙에 의해 더 증가될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서 하나 이상의, 바람직하게는 모든 항체 가변 도메인이 완전히 인간성이거나, 인간화되거나, 또는 키메릭인 도메인이다. 인간화된 항체는 예를 들어 CDR-접목과 같은 잘-설립된 방법에 의해서 생산될 수 있다 (예를 들어, Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.) 참조). 따라서, 통상의 기술자는 인간화되거나 또는 완전히 인간성인 버전의 항원-결합 분자 및 설치류 또는 비-영장류과 같은 비-인간 소스로부터 이 분야에 알려진 표준적 분자 생물학적 기술을 이용하여 가변 도메인을 쉽게 만들어 인간 면역계에서 면역원성을 감소시키고 항원-결합 분자의 효율을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 모든 항체 가변 도메인 및 인간화되거나 또는 완전히 인간성인; 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 분자는 인간화되거나 또는 완전히 인간성이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "완전히 인간성 (fully human)"은 가변 도메인 및 상기 폴리펩티드에서 가변 도메인을 연결하는 펩티드의 아미노산 서열이 인간으로부터 유래하거나 찾을 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 특정 구체예에서 상기 가변 도메인은 인간성이거나 인간화되지만 상기 항체 가변 도메인을 연결하는 펩티드가 아닐 수 있다.
통상의 기술자는 이 분야에 알려진 설립된 기술 및 표준 방법을 이용하여 본 명세서에 기술된 항체 분자를 과도한 부담 없이 용이하게 구축하거나 얻을 수 있을 것이다 (예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, edited by John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); 또는 Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.); Antibody Engineering / edited by Rol and E. Kontermann and Stefan D
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bel, Springer Verlag Berlin Heidelberg (2010) 참조).
본 명세서에 기술된 일 구체예에 따른 항체 분자는 상기 항체 분자를 형성하는 개별적인 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구체예는 본 명세서에서 상기에 기술된 항체 분자의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 통상의 기술자에게 알려진 방법, 예를 들어 펩티드 링커에 의해서 분리되거나 상기 폴리펩티드의 펩티드 결합에 의해서 직접적으로 연결된 항체 가변 도메인을 인코딩하는 유전자를 적절한 프로모터 및 선택적으로 적절한 전사 종결자에 작동적으로 연결된 유전적 구조물에 결합시키고, 이를 박테리아 또는 예를 들어 CHO 세포와 같은 다른 적절한 발현 시스템에 발현시켜서 구축될 수 있다. 벡터 시스템 및 사용된 숙주에 의존하여, 구성적이고 유도성인 프로모터를 포함하는 적합한 수의 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 개별적인 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하도록 선택된다.
상기 폴리뉴클레오티드는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터로 삽입되어 본 발명의 다른 구체예를 보여줄 수 있다. 이러한 재조합 벡터는 이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 구축될 수 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 본 발명의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻고 발현하는데 사용될 수 있다. 대장균(E.coli)에서의 발현을 위한 발현 벡터의 예는 pSKK (LeGall 등, J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27)이고 또는 포유류 세포에서 발현을 위한 pcDNA5 (Invitrogen) 가 있다.
따라서, 본 명세에서 기술된 항체 분자는 상기 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터를 숙주 세포로 도입하고 상기 숙주 세포를 상기 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에 배양하여 생산할 수 있고, 단리하거나, 선택적으로 정제할 수 있다.
본 발명의 조성물의 다른 구체예에서, 예를 들어, 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같은 항체 분자 및 하나 이상의 추가 구성을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
다른 구체예에서 상기 항체 분자는 약제 또는 진단용으로 사용된다. 구체적으로, 상기 항체 분자는 면역 치료용이다. 예를 들어, 상기 항체 분자는 종양, 바이러스 또는 퇴행성 신경성 질환의 치료용이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 개인을 면역 치료로 치료하는 방법을 추가로 포함하고, 구체적으로 상기 개인은 종양, 바이러스, 또는 퇴행성 신경성 질환으로 고통받는 것이다.
본 발명은 상기 항체 분자, 구체적으로 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같은 항체 분자 및 하나 이상의 추가 구성을 포함하는 조성물을 유효량으로 개체, 예를 들어 환자에게 암 (예를 들어, 비-호지킨성 림프종; 만성 림프구성 백혈병)을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 본 발명에 따른 항원-결합 분자는 약제로 사용될 수 있다.
도 1은 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 VH-VL-VH-VH-VL-VL-VL-VH 배향으로 서로 연결된 여덟 개의 가변 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드로 이루어진 4가의 삼중 특이적 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 이러한 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 다른 배열이 상기 기술된 바와 같이 가능하다. 두 개의 단쇄 Fv (scFv) 유닛 2는 펩티드 링커 5에 의해서 단쇄 이중항체 유닛 1에 원거리로 연결되고, 하나의 scFv 유닛 2의 가변 경쇄 (VL) 도메인은 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 상기 이중항체 유닛 1의 제1 쌍의 가변 도메인 중 가변 중쇄 (VH) 도메인의 N-말단에 연결된다. 상기 scFv 유닛 2의 VL은 N-말단이 상기 scFv 유닛의 VH에 펩티드 링커 4에 의해서 연결된다. 상기 제1 쌍의 가변 도메인의 VH는 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 상기 제1 쌍의 가변 도메인의 다른 VH 도메인에 연결된다. 상기 제1 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 긴 펩티드 링커 4에 의해서 둘 모두 VL 도메인인 상기 이중항체의 제2 쌍의 가변 도메인의 N-말단에 연결된다. 상기 제2 쌍의 가변 도메인의 두 VL 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 연결된다. 상기 이중항체의 제2 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 상기 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 다른 scFv 유닛의 VL 도메인의 N-말단에 연결된다. 상기 폴리펩티드의 C-말단에 scFv 유닛 2는 긴 링커 4에 의해서 VH 도메인과 연결된 VL 도메인으로 이루어진다. 상기 두 scFvs 유닛 2는 상이한 특이성을 갖는 항원 결합 부위를 갖고 상기 이중항체 유닛 1은 동일한 특이성에 대한 두 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
도 2는 제1 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 VH-VL-VH-VH-VL-VH 배향으로 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 N-말단 7a에서 C-말단 8a으로 VL-VL 배향으로 서로 연결된 두 개의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진 4가의 삼중 특이적 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 이러한 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 다른 배열이 상기 기술된 바와 같이 가능하다. 상기 Fv 항원 결합 분자는 상기 제2 폴리펩티드에서 제2 쌍의 두 개의 가변 도메인과 결합된 상기 제1 폴리펩티드에 통합된 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인으로부터 형성된 이량체인 이중항체 유닛을 포함한다. 상기 제1 폴리펩티드에 통합된 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인의 상기 두 개의 가변 도메인 각각은 scFv 유닛 2에 연결된다. 상기 각각의 scFv 유닛 2에서 상기 가변 도메인은 긴 펩티드 링커 4에 의해서 연결된다. N-말단의 scFv 유닛 2는 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 상기 이중항체 유닛 1의 제1 쌍의 가변 도메인의 N-말단으로 연결된다. 이 제1 쌍의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해 연결된 두 개의 VH 도메인으로 이루어진다. 상기 이중항체 유닛 1의 제1 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 scFv 유닛 2의 N-말단으로 연결된다. 상기 두 개의 scFvs 유닛 2는 상이한 특이성을 갖는 항원 결합 부위를 갖고 상기 이중항체 유닛 1은 동일한 특이성에 대한 두 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
도 3은 비-공유적으로 결합된 이종이량체(heterodimer)를 형성하는 제1 및 제2 폴리펩티드로 이루어진 삼중 특이적 일렬(tandem)의 이중항체 형태인 4가의 삼중 특이적 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 일렬의 이중항체는 상기 제2 폴리펩티드의 중앙에 위치한 한 쌍의 VL-VL 도메인과 상기 제1 폴리펩티드의 중앙에 위치한 한 쌍의 VH-VH 도메인에 의해 형성된 이량체인 이중항체 유닛 1을 포함한다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 내 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3, 3a에 의해서 제1 폴리펩티드에서 N-말단 7에서 C-말단 8으로 VL-VH-VH-VL 배향으로 및 제2 폴리펩티드에서 N-말단 7a에서 C-말단 8a으로 VH-VL-VL-VH 배향으로 서로 연결된다. 상기 N-말단 및 C-말단에 위치한 가변 도메인은 상기 N-말단 및 C-말단에서 상이한 특이성을 갖는 항원 결합 부위를 갖고 상기 중앙의 이중항체 유닛 1은 동일한 특이성에 대한 두 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
도 4는 상기 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 서로 연결된 12 개의 가변 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드 이루어진 6가 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 배향은 단지 하나의 예시이고 병치된(juxtaposed) 가변 도메인의 각 쌍에 대해 나타낸 다른 배열이 가능하다. 두 개의 단쇄 이중항체 유닛 1a, 1b는 펩티드 링커 5에 의해서 단쇄 이중항체 유닛 1c으로 원거리로 연결되고, 여기서 하나의 단쇄 이중항체 유닛 1a의 가변 도메인은 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 이중항체 유닛 1c의 제1 쌍의 가변 도메인 중 한 가변 도메인의 N-말단으로 연결되고 상기 단쇄 이중항체 유닛 1b의 가변 도메인은 N-말단이 링커 5에 의해서 단쇄 이중항체 유닛 1c의 제2 쌍의 가변 도메인 중 한 가변 도메인의 C-말단으로 연결된다. 상기 세 개의 단쇄 이중항체 유닛 1a, 1b, 1c 각각의 제1 및 제2 쌍의 가변 도메인은 긴 펩티드 링커 4에 의해서 연결된다. 상기 단쇄 이중항체 유닛 1a, 1b, 1c 각각에서, 제1 쌍의 가변 도메인 중 하나의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 상기 제1 쌍의 가변 도메인 중 다른 가변 도메인으로 연결되고 상기 제2 쌍의 가변 도메인 중 두 개의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 연결된다.
도 5는 제1 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 서로 연결된 10 개의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 N-말단 7a에서 C-말단 8a으로 서로 연결된 두 개의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드 이루어진 6가 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 도면에서 구체적인 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 병치된 가변 도메인의 각 쌍에 대해 나타낸 다른 배열이 가능하다. 상기 Fv 항원 결합 분자는 상기 제2 폴리펩티드에서 제2 쌍의 두 개의 가변 도메인과 결합된 제1 폴리펩티드의 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인에 의해서 형성된 이량체인 이중항체 유닛 10을 포함한다. 제1 폴리펩티드의 제1 쌍의 두 개의 가변 도메인 중 두 개의 가변 도메인 각각은 단쇄 이중항체 유닛 1a, 1b에 연결된다. 상기 단쇄 이중항체 유닛 1a, 1b 각각에서 두 쌍의 병치된 가변 도메인은 긴 펩티드 링커 4에 의해서 연결된다. 상기 N-말단의 단쇄 이중항체 유닛 1a는 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 상기 이중항체 유닛 10의 제1 쌍의 가변 도메인의 N-말단으로 연결된다. 이 제1 쌍의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 연결된 두 개의 VH 도메인으로 이루어진다. 상기 이중항체 유닛 10의 제1 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 펩티드 링커 5에 의해서 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 단쇄 이중항체 유닛 1b의 N-말단으로 연결된다.
도 6은 제1 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 N-말단 7a에서 C-말단 8a으로 서로 연결된 네 개의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진 5가 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 병치된 가변 도메인의 각 쌍에 대한 다른 배열이 상기 도면에 나타낸 바와 같이 가능하다. 상기 Fv 항원 결합 분자는 상기 제2 폴리펩티드에서 제2 쌍의 두 가변 도메인과 결합된 제1 폴리펩티드의 제1 쌍의 두 가변 도메인에 의해 형성된 이량체인 이중항체 유닛 10을 포함한다. 상기 제1 폴리펩티드의 제1 쌍의 두 가변 도메인 중 두 가변 도메인 각각은 scFv 유닛 2에 연결된다. 상기 각 scFv 유닛 2에서, 상기 가변 도메인은 긴 펩티드 링커 4에 의해 연결된다. N-말단의 상기 scFv 유닛 2는 C-말단이 상기 이중항체 유닛 10의 상기 제1 쌍의 가변 도메인의 N-말단에 펩티드 링커 5에 의해서 연결된다. 상기 제1 쌍의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해서 연결된 두 가변 도메인으로 구성된다. 상기 이중항체 유닛 10의 제1 쌍의 가변 도메인은 C-말단이 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 scFv 유닛 2의 N-말단으로 펩티드 링커 5에 의해서 연결된다. A) 네 개의 도메인을 포함하는 상기 제2 폴리펩티드는 C-말단이 scFv 유닛 2와 연결된 이중항체 유닛 10의 제2 쌍의 가변 도메인으로 구성되고 B) 네 개의 도메인을 포함하는 상기 제2 폴리펩티드는 N-말단이 scFv 유닛의 2와 연결된 이중항체 유닛 10의 제2 쌍의 가변 도메인으로 구성된다.
도 7은 제1 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 N-말단 7a에서 C-말단 8a으로 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진 6가 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 병치된 가변 도메인의 각 쌍에 대한 다른 배열이 상기 도면에 나타낸 바와 같이 가능하다. 상기 Fv 항원 결합 분자는 상기 제2 폴리펩티드에서 제2 쌍의 두 가변 도메인과 결합된 제1 폴리펩티드의 제1 쌍의 두 가변 도메인에 의해 형성된 이량체인 이중항체 유닛 10을 포함한다. 상기 이중항체 유닛 10의 각 가변 도메인은 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 scFv 유닛 2로 연결된다. 상기 각 scFv 유닛 2에서, 상기 가변 도메인은 긴 펩티드 링커 4에 의해 연결된다. 상기 네 개의 scFv 유닛 2 각각은 이중항체 유닛 10의 가변 도메인에 펩티드 링커 5에 의해서 연결된다. 이 제1 쌍의 가변 도메인은 짧은 펩티드 링커 3에 의해 연결된 두 개의 가변 도메인으로 이루어지고, 상기 이중항체 유닛의 제2 쌍의 가변 도메인은 짧은 링커 3a에 의해서 연결된 두 개의 가변 도메인으로 이루어진다.
도 8은 비-공유적으로 결합된 이량체를 형성하는 제1 및 제2 폴리펩티드로 이루어진 일렬의 이중항체 유닛을 포함하는 6 가 Fv 항원-결합 분자를 보여준다. 상기 일렬의 이중항체는 제2 폴리펩티드에서 중심에 위치한 가변 도메인 쌍과 제1 폴리펩티드에서 중심에 위치한 가변 도메인 쌍에 의해 형성된 이량체인 이중항체 유닛 10a를 포함한다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드에서 가변 도메인은 각 폴리펩티드의 N-말단 7에서 C-말단 8으로 짧은 펩티드 링커 3, 3a에 의해 서로 연결된다. 상기 도메인 배향은 단지 하나의 예시이고 병치된 가변 도메인의 각 쌍에 대한 다른 배열이 상기 도면에 나타낸 바와 같이 가능하다. 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 일렬의 이중항체 유닛에 링커 5에 의해서 연결된 scFv 유닛 2를 포함한다. A) 제1 및 제2 폴리펩티드의 C-말단에 연결된 scFv 유닛 2. B) 제1 및 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결된 scFv 유닛 2.
그림 9는 aTriFlex-생성물의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 길고 짧은 폴리펩티드가 잘 발현되었다 (화살표). a) aTriFlex_140 및 aTriFlex_142, b) aTriFlex_138 및 c) aTriFlex_139.
도 10은 aTriFlex-생성물의 IMAC 정제를 보여준다: a) aTriFlex_140, b) aTriFlex_138 및 c) 및 aTriFlex_142 및 d) aTriFlex_139.
그림 11은 aTriFlex-생성물의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 길고 짧은 폴리펩티드가 잘 발현되었다. A) aTriFlex_101, B) aTriFlex_102, C) aTriFlex_103 및 D) aTriFlex_104.
도 12는 단일 또는 이중-양성 세포주에 대한 삼중 특이적 항체 분자의 결합을 보여준다. 이중-양성인 CD19+/CD30+ MEC 1 뿐 아니라 단일-양성인 CD19+/CD30- Raji 및 CD19-/CD30+ KARPAS-299 세포도 상기 삼중 특이적 항체 분자의 연속적 희석(serial dilution)으로 염색되었고, 세포 표면에 결합된 항체를 항-His mAb, 다음 FITC-결합된(conjugated) 염소 항-마우스 IgG로 검출하였다. 유세포분석에 의해서 결정된 평균 형광 세기를 비-선형 회귀 분석에 의해 KD 값을 계산하는데 사용하였다. 삼중 특이적 항체 분자의 KD 값을 두 개의 독립적인 시험으로 결정하였다.
도 13은 단일- 또는 이중-양성인 표적 세포주에 대한 삼중 특이적 항체 분자의 세포독성 활성을 보여준다. 표시된 삼중 특이적 항체 분자의 연속적 희석의 존재 하에 이중-양성인 CD19+/CD30+ MEC-1 표적 세포 뿐 아니라 단일-양성인 CD19+/CD30-Raji 및 CD19-/CD30+ KARPAS-299 세포에도 효과자 세포로서 농축된 NK-세포와 함께 4 시간 칼세인(calcein)-방출 세포독성 분석을 수행하였다. 상기 용해된 표적 세포로부터 방출된 형광 칼세인을 사용하여 항체-매개된 표적 세포 용해 및 비-선형 회귀에 의한 EC50 값의 결정을 위한 S자형 용량-반응 곡선의 모델링을 계산하였다. aTriFlex 구조물에 대한 EC50 값을 두 개의 독립적인 시험에서 결정하여, 플롯팅하였다.
하기의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 추가적으로 설명한다.
실시예 1
삼중 특이적 Fv 항원-결합 분자를 인코딩하는 DNA 발현 구조물의 클로닝
CHO 세포에서 삼중 특이적 구조물의 발현을 위해, 모든 분자의 코딩 서열을 pcDNA5/FRT 벡터로부터 유래된 적절하게 변형된 발현 시스템으로 단일-유전자 또는 이중 유전자 구조물로서 클로닝하였다. 두 개의 프로모터 벡터를 두 유전자 구조물(이종이량체적 삼중 특이적 구조물)의 클로닝 및 발현에 사용하였다. 삼중 특이적인 하나의 유전자 구조물을 위해 상기 일반적인 pcDNA5/FRT 발현 벡터를 사용하였다. 간단하게, 상이한 링커(길고 짧은 링커)에 의해서 분리된 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 유전자 서열을 Life Technologies GeneArt (레젠스부르크, 독일)에 의해서 합성하고 서브 클로닝 하였다. 생성된 구조물을 상이한 제한 효소(BamHI, HindIII, XhoI, EcoRV, PacI) 또는 상이한 VH/VL 효과자를 통해 소화시키고 표적 결합 도메인을 상응하는 프라이머로 PCR을 통해 증폭시켰다. 이후 서로 중첩되는 상이한 DNA-조각 및 선형화된 백본(backbone) 2 프로모터 벡터 또는 pcDNA5/FRT 벡터를 하나의 등온 반응에서 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)를 통해 서로 연결하였다. 모든 발현 구조물을 항체 분비 및 정제를 용이하게 하기 위해 각각 제1 유전자 카세트에 대한 N-말단의 단일 펩티드 및 C-말단의 6개 히스티딘 (6xHis)-태그 또는 제2 유전자 카세트에 대한 C-말단의 FLAG-태그에 대한 코딩 서열을 포함하도록 고안하였다. 모든 구조물의 서열을 유전자 카세트 1에 대한 5´-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3´ 및 5´-TCATGTCTGGATCCGGCCTTG-3´ 및 유전자 카세트 2에 대한 5´-GCCTGGAGACGCCATCC-3´ 및 5´-GCAGAATTCCACCACACTGG-3´의 프라이머 쌍을 이용하여 GATC (콘스탄츠, 독일)에서 DNA 시퀀싱에 의해 결정하였다.
숙주 세포 배양
CHO-K1 Chinese Hamster 난소 세포의 유도체 (ATCC, CCL-61) (Kao and Puck, 1968)인 Flp-In CHO 세포 (Life Technologies)를 L-글루타민, 10 % FCS 및 100㎍/mL 제오신으로 보충된 Ham's F-12 Nutrient Mix에서 배양하였다. 부착 세포를 0.25 % 트립신-EDTA로 분리하고, Life Technologies에 의해서 제공된 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 계대 배양(subculture)하였다.
현탁액에서의 성장에 적응시키기 위해, 세포를 조직 배양 플라스크로부터 분리하고 37 ℃, 5 % CO2 및 120 rpm에서 진탕 플라스크 중에 후속 배양을 위한 무-혈청 HyClone CDM4 CHO 배지에 두었다. 상기 현탁액-적응된 Flp-In CHO 숙주 세포의 배양물에 대한 표준 배지는 L-글루타민, HT 보충제, 페니실린/스트렙토마이신 및 100 ㎍/mL 제오신으로 보충된 HyClone CDM4 CHO였다. 현탁액-적응된 세포를 10 % DMSO를 포함하는 배지에서 동결 보존시키고 MycoAlert Mycoplasma 검출 키트 (Lonza)를 사용하여 마이코플라즈마에 대한 음성을 시험하였다.
안정적으로 형질주입된(stably transfected ) 세포 풀의 형성
분비된 단일-유전자 또는 이중-유전자의 삼중 특이적 항체를 안정적으로 발현하는 재조합 Flp-In CHO 세포주를 현탁액-적응된 숙주 세포의 형질주입에 의해서 생성하였다. 이를 위해, 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 대상이 되는 단백질 (pcDNA5/FRT) 및 Flp 재조합효소 (pOG44, Life Technologies)를 코딩하는 발현 플라스미드 (2.5 ㎍)를 공동- 형질주입시키기 하루 전에 제오신 없이 표준 배지에 세포를 넣었다. 간단하게, 벡터 DNA 및 형질주입 시약을 총 100 ㎕의 OptiMEM I 배지에서 DNA:PEI 비율 1:3 (㎍/㎍)으로 혼합하고 10 분 동안 인큐베이션 한 후 1 mL의 CHO-S-SFMII 배지(Life Technologies)에 현탁된 2·106 개의 Flp-In CHO 세포에 첨가하였다. 24 시간 인큐베이션한 후, 500 ㎍/mL 히그로마이신 B를 첨가하고 배양물을 CHO-S-SFMII 배지 중에 0.1·106 개의 생존 세포/mL의 밀도로 희석하고 T75 배양 플라스크에 접종하여 안정적으로 형질주입된 세포의 선별을 시작하였다. Flp 재조합효소는 부위-특이적 DNA 재조합을 통해 통합된 FRT 부위에서 Flp-In CHO 세포의 게놈으로 상기 발현 구조물의 삽입을 매개한다 (O' Gorman 등, 1991). 선별 동안 생존 세포의 밀도를 일주일에 두 번 측정하고, 세포를 원심 분리하고 최대 밀도 0.1·106 개 생존 세포/mL로 신선한 선별 배제에 현탁하였다. 재조합 단백질 생성물을 안정적으로 발현하는 세포 풀을 2 내지 3 주간 선별한 후 회수(recover)하여 각 시점의 세포를 진탕 플라스크 내 표준 배양 배지로 옮겼다. 재조합 분비된 단백질의 발현을 Criterion Stain-Free (Bio-Rad) 기술을 이용하여 세포 배양 상등액의 단백질 젤 전기영동에 의해서 확정하였다. 안정화 세포 풀을 50 % ProFreeze (Lonza) 및 7.5 % DMSO를 함유하는 배지에서 동결 보존 하였다.
페드 -배치(fed-batch) CHO 세포 현탁 배양물에서 재조합 단백질의 생산
재조합 단백질을 안정하게 형질주입된 CHO 세포주의 10-일 페드-배치 배양물에서 상기 세포 배양물 상등액으로의 분비에 의해서 생산하였다. 이를 위해서, 삼중 특이적 항체를 안정하게 발현시키는 세포 풀을 가스 투과성 캡(Corning)을 갖는 폴리카르보네이트 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 표준 배양 배지 중에 6·105 세포/mL의 시작 밀도로 시딩하고 140 rpm에서 교반하면서 37 ℃ 및 5 % CO2에서 배양하였다. 페드-배치 배양동안, 배지를 0일에 40 mL/L ActiCHO Feed A (GE Healthcare) 및 4 mL/L ActiCHO Feed B (GE Healthcare)로 보충하고 3, 5, 및 7일에 두 배로 보충하였다. 세포 배양물 상등액을 전형적으로 >75 % 배양 생존율에서 10 일 후 수확하였다. 시료를 공급(feeding)하기 전에 격일로 생산 배지로부터 수집하고, 생존력을 평가하였다. 수확하는 날엔, 세포 배양물 상등액을 추가 사용 전에 원심분리 및 Millipore Express PLUS 멤브레인 필터 (Millipore)를 사용하여 진공 필터 (0.22 μm) 함으로써 제거하였다.
삼중 특이적 Fv 항체의 정제
삼중 특이적 항체를 IMAC 및 예비 SEC를 포함하는 두 단계 과정에서 정화된 CHO 세포 배양물 상등액으로부터 정제하였다. 필요에 따라, 3차 크로마토그래피적 단계 (FLAG-친화성 크로마토그래피)를 추가 연마를 위해 적용하였다. IMAC를 위해서, 상기 정화된 상등액을 HisTrap 세파로오스 컬럼에 로드하였다. Tris/NaCl 완충액 pH 7.5으로 세척한 후, 단백질을 각각 15 mM, 125 mM, 및 500 mM의 삼-단계 구배의 이미다졸로 용출하였다. 상기 분획의 순도는 SE-HPLC 및 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 수용가능한 순도를 나타내는 분획을 모으고 Superdex 200 prep grade 컬럼을 사용하여 예비 겔 여과를 가하였다. FLAG 친화성 크로마토그래피는 경우에 따라 추가 연마를 위한 것이다. 따라서, 상기 단백질을 FLAG 친화성 컬럼에 로드하고, PBS로 세척하고, pH 3.5에서 글리신/HCl 완충액을 이용하여 용출하였다. 정제된 삼중 특이적 항체를 함유하는 용출 분획을 붓고, 10 mM 소듐 아세테이트 pH 5.0에 대해 투석하고, 한외여과에 의해 약 1 mg/mL의 전형적인 농도로 농축하였다. 최종 시료의 순도 및 균질성 (약 90 %)을 환원 및/또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 후, 분석적 SE-HPLC에 의해서도 FLAG-태그 뿐 아니라 His-태그에도 특이적인 항체로 면역블롯팅을 하여 평가하였다. 정제된 단백질을 추가 사용 전까지 -80 ℃에서 분취하여 보관하였다.
실시예 3에 기술된 삼중 특이적 Fv 항체 분자에 대한 생물물리학적 데이터의 예; aTriFlex_101 (실시예 3a), aTriFlex_102 (실시예 3b), aTriFlex_103 (실시예 3c) 및 aTriFlex_104 (실시예 3d)를 표 1에 나타내었다. 상기 분획의 SDS-PAGES를 도 11에 나타내었다: 모든 삼중 특이적, 4가 Fv 항체 분자를 수용 가능한 역가(titer)로 독립적인 도메인 순서, 예를 들어, VH-VL-VH-VH-VL-VH (aTriFlex_101) 또는 VL-VH-VH-VH-VH-VL (aTriFlex_102)로 발현시켰다. 상기 삼중 특이적, 4가 Fv 항체 분자는 저장뿐 아니라 열 안정성도 매우 우수하고 필적하였다.
이름 대략적 발현 역가
[mg/L]		 정제
(IMAC/
FLAG/SEC)		 % 순도
(SE-HPLC)		 TM (DSF)
[℃]		 % 순도
T=7d; 5 ℃
(SE-HPLC)		 % 순도
T=7d; 25 ℃
(SE-HPLC)		 % 순도
3 x FT
(SE-HPLC)
aTriFlex_101 135 IMAC / SEC 92.2 46.7 91.2 94.9 69.7
aTriFlex_102 103 IMAC / SEC /FLAG 94.7 52.7 94.8 95.5 92.5
aTriFlex_103 130 IMAC / SEC 94.8 47.5 94.7 95.5 86.4
aTriFlex_104 125 IMAC / SEC 87.8 48.7 92.3 93.8 77.8
표 1: 삼중 특이적 Fv 항체 분자의 생물물리학적 데이터
실시예 2
이중항체 유닛의 상이한 도메인 순서를 갖는 삼중 특이적 항체 분자의 제조
도 2에 따른 형태의 네 개의 상이한 Fv 항체 분자를 상기 이중항체 유닛 내 두 개의 가변 도메인 쌍의 상이한 도메인 배열 (N → C 말단)을 갖는 실시예 1에 기재된 바에 따라 구축하였다. 상기 이중항체 유닛의 가변 도메인은 하기의 표에 굵은 글씨로 나타낸 바와 같다:
aTriFlex_138: VH-VL / VH-VL 이중항체 유닛:
Figure pct00002
aTriFlex_139: VL-VH / VL-VH 이중항체 유닛:
Figure pct00003
aTriFlex_140: VL-VL / VH-VH 이중항체 유닛:
Figure pct00004
aTriFlex_142: VH-VH / VL-VL 이중항체 유닛:
Figure pct00005
상기 Fv 항체 분자를 CHO 세포에서 발현시켰고 생산된 세포 배양물 상등액의 SDS-PAGE 분석은 상기 긴 폴리펩티드 1 및 짧은 폴리펩티드 2가 잘 발현되어 변성 조건 하에 분리된 밴드로서 작동(run)함을 보여준다 (도 9a, 9b, 9c).
실시예 1에 기재된 바와 같이 단일 IMAC-단계에 의해서 정제한 후, aTriFlex_140 (도 10a) 에 대해서 순도 76%가 수득되었고, aTriFlex_142 (도 10c)에 대해서 순도 78%가 수득되었다. 따라서, VL-VL / VH-VH 이중항체 유닛 (aTriFlex_140) 또는 VH-VH / VL-VL 이중항체 유닛 (aTriFlex_142)을 갖는 다중-특이적 Fv 항체 분자는 바르게 접힌 Fv 항체 분자의 현저하게 높은 비율을 보여준다. 그러나, 몇 개의 서로 중첩된 분자 종이 수득되었고 이들 이중항체 유닛에서 VH-VL / VH-VL 및 VL-VH / VL-VH 교대(alternating) 도메인 순서를 갖는 aTriFlex_138 및 aTriFlex_139 각각으로부터 분리된 이종-이량체인 항체 분자는 없었다 (도 10b, 10d). 따라서, 상기 이중항체 유닛에서 상기 가변 도메인의 VL-VL / VH-VH 배향은 두 개의 상이한 폴리펩티드 1 및 2가 서로 결합하여 4가, 삼중 특이적 항체 분자로 이종-이량체화 하도록 한다.
실시예 3
하기의 항-CD16A, 항-CD19 및 항-CD30 항체 가변 도메인을 포함하는 다중 항체 분자를 생산하였다.
링커:
하기의 펩티드 링커를 상기 실시예에서 사용하였다:
scFv-유닛 내 링커 (4) : VH-VL 에 대한 (G2S)6 및 VL-VH에 대한 (G2S)7
이중항체-유닛 내 링커 (3, 3a) : (G2S)3
이중항체-유닛과 scFv-유닛을 연결하는 링커 (5): (G2S)3
a) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제 1폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 포함하는 제2 폴리펩티드 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 대해 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자(도 2에 나타낸 바와 같은 aTriFlex_101). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VH-VH 도메인 쌍 및 상기 제2 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이는 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00006
아미노산 서열:
폴리펩티드 1:
Figure pct00007
폴리펩티드 2:
Figure pct00008
b) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 (aTriFlex_102). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 제1 폴리펩티드 내 VH-VH 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍에 의해서 형성된다.
Figure pct00009
아미노산 서열:
폴리펩티드 1:
Figure pct00010
Figure pct00011
폴리펩티드 2:
Figure pct00012
c) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (aTriFlex_103). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VH-VH 도메인 쌍 및 상기 제2 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍에 의해서 형성된다.
Figure pct00013
아미노산 서열:
폴리펩티드 1:
Figure pct00014
폴리펩티드 2:
Figure pct00015
d) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (aTriFlex_104). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VH-VH 도메인 쌍 및 상기 제2 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍에 의해서 형성된다.
Figure pct00016
아미노산 서열:
폴리펩티드 1:
Figure pct00017
폴리펩티드 2:
Figure pct00018
폴리펩티드 1 (여섯 개의 가변 도메인) 및 폴리펩티드 2 (두 개의 가변 도메인)의 상이한 크기에도 불구하고, 상기 항체 분자 a), b), c) 및 d)는 만족스럽게 발현될 수 있었다. 정제된 항체 분자 a)-d)의 열 안정성뿐 아니라 저장 안정성은 매우 우수하였다. 모든 구조물 a)-d)가 유동 세포 계측법에서 일차 NK 세포, Raji, Karpas-299 및 MEC-1 세포주와 결합한다.
e) 도 3에 나타낸 바와 같은, 네 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 네 개의 가변 도메인 및 C-말단 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (TeTrisAb_1). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VH-VH 도메인 쌍 및 상기 제2 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이의 배향은 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00019
아미노산 서열:
폴리펩티드 1:
Figure pct00020
폴리펩티드 2:
Figure pct00021
f) 도 1에 나타낸 바와 같은, 여덟 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 단일 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (scTriFlex_2). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 동일한 폴리펩티드 내에서 병치된 제2 쌍의 VL-VL 도메인에 결합된 제1 쌍의 VH-VH 도메인에 의해서 형성된다. 상기 VH-VH 도메인 쌍은 상기 링커 (G2S)6에 의해서 VL-VL 쌍에 연결된다.
Figure pct00022
아미노산 서열:
Figure pct00023
Figure pct00024
g) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (도 2에 나타낸 바와 같은). 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드내에 VL-VL 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내에 VH-VH 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이는 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00025
폴리펩티드 1:
Figure pct00026
(서열번호 12)
폴리펩티드 2:
Figure pct00027
h) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 네 개의 가변 도메인 및 C-말단 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19, EGFRvIII 및 CD16A에 특이성을 갖는, 5가, 사중-특이적 Fv 항체 분자 (도 6a에 나타낸 바와 같은). 상기 CD16A에 대한 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내에 VL-VL 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내에 VH-VH 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이는 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00028
폴리펩티드 1:
Figure pct00029
(서열번호 14)
폴리펩티드 2:
Figure pct00030
(서열번호 15)
i) 10 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 두 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는 6가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (도 5에 나타낸 바와 같은). CD16A에 대해 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내에 VH-VH 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이는 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00031
폴리펩티드 1:
Figure pct00032
폴리펩티드 2:
Figure pct00033
j) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19, EGFRvIII 및 CD16A에 특이성을 갖는 6가, 사중-특이적 Fv 항체 분자 (도 7에 나타낸 바와 같은).
Figure pct00034
폴리펩티드 1:
Figure pct00035
(서열번호 18)
폴리펩티드 2:
Figure pct00036
k) 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 네 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는 5가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자 (도 6b에 나타낸 바와 같은). CD16A에 대해 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내에 VH-VH 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이는 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00037
폴리펩티드 1:
Figure pct00038
(서열번호 20)
폴리펩티드 2:
Figure pct00039
Figure pct00040
(서열번호 21)
I) 네 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 네 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖는 도 3에 나타낸 바와 같은 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자. 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 제1 폴리펩티드 내 VL-VL 도메인 쌍 및 제2 폴리펩티드 내에 VH-VH 도메인 쌍에 의해서 형성되고, 이 배향은 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2의 올바른 이종이량체화를 보장한다.
Figure pct00041
폴리펩티드 1:
Figure pct00042
폴리펩티드 2:
Figure pct00043
m) 도 8a에 나타낸 바와 같은, 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단의 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19, EGFRvIII 및 CD16A에 특이성을 갖는 6가, 사중-특이적 Fv 항체 분자. 각 제1 및 제2 폴리펩티드는 C-말단에 scFv 유닛을 포함한다.
Figure pct00044
폴리펩티드 1:
Figure pct00045
(서열번호 24)
폴리펩티드 2:
Figure pct00046
(서열번호 25)
n) 도 8b에 나타낸 바와 같은, 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단 His-태그를 갖는 제1 폴리펩티드; 및 여섯 개의 가변 도메인 및 C-말단 FLAG-태그를 갖는 제2 폴리펩티드로 이루어진, CD30, CD19, EGFRvIII 및 CD16A에 특이성을 갖는 6가, 사중-특이적 Fv 항체 분자. 각 제1 및 제2 폴리펩티드는 N-말단에 scFv 유닛을 포함한다.
Figure pct00047
폴리펩티드 1:
Figure pct00048
Figure pct00049
(서열번호 26)
폴리펩티드 2:
Figure pct00050
(서열번호 27)
o) 도 1에 나타낸 바와 같은, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖고, 여덟 개의 가변 도메인 및 C-말단의 His-태그를 갖는 단일 폴리펩티드로 이루어진, 4가, 삼중 특이적 Fv 항체 분자. 상기 중심에 위치한 이량체인 이중항체 유닛은 상기 동일한 폴리펩티드 내에서 제2 쌍의 병치된 VL-VL 도메인에 결합된 제1 쌍의 VH-VH 도메인에 의해서 형성된다. 상기 VH-VH 쌍은 상기 링커 (G2S)6에 의해서 VL-VL 쌍에 연결된다.
Figure pct00051
폴리펩티드 1:
Figure pct00052
p) 도 4에 나타낸 바와 같은, CD30, CD19 및 CD16A에 특이성을 갖고, 12 개의 가변 도메인 및 C-말단 His-태그를 갖는 단일 폴리펩티드로 이루어진, 6가4가4가(hexavalenttetravalenttetravalent), 삼중 특이적 Fv 항체 분자. 상기 폴리펩티드는 서로 연결된 세 개의 단쇄 이중항체 유닛을 포함한다.
Figure pct00053
폴리펩티드 1:
Figure pct00054
실시예 4
삼중 특이적 항체 분자에 의해 매개되는 세포-결합 및 세포독성 활성의 평가
연구 과정
세포 및 세포 배양
CD19+/CD30+ MEC-1 (DSMZ, cat.: ACC 497), CD19+/CD30- Raji (DSMZ, cat.: ACC 319), 및 CD19-/CD30+ KARPAS-299 (DSMZ, cat.: ACC 31) 세포를 본 명세서에서 세포주 공급자에 의해 권장된 바와 같은 완전한 RPMI 배지라고 언급되는 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FCS) (cat.: 10270-106), 100　U/mL 페니실린 G, 100　㎍/mL 스트렙토마이신 (cat: 1540-122), 및 2　mM L-글루타민 (cat: 25030-024; 모두 Invitrogen, Karlsruhe, Germany)으로 보충된 RPMI 1640 (cat.: 21875-034) 또는 IMDM (cat.: 12440-053) 배지에서 표준 조건 하에 배양하였다. PBMC를 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 지원자의 연막 (buffy coat)으로 부터 분리되었다 (German Red Cross, Mannheim, Germany). 상기 연막 시료를 2 x 3 배 부피의 PBS(Invitrogen, cat.: 14190-169)로 희석하고, Histopaque-1077 (Stemcell Technologies, 상품명 : 07861)의 쿠션 상에 놓고, 800　x　g에서 25 분간 실온에서 쉼 없이 원심분리 하였다. 계면에 위치한 PBMC를 수집하여 NK 세포 농축을 위해 사용하기 전 PBS로 3회 세척하였다. 제조업체의 지침에 따라, 훼손되지 않은 인간 NK 세포의 면역자기 단리를 위한 EasySepTM 인간 NK 세포 농축 키트 (Stemcell Technologies, cat.: 19055) 및 Big Easy EasySepTM 마그넷을 이용하여 PBMS 집단으로부터 NK 세포를 농축하였다.
세포-결합 분석 및 유동 세포계측 분석
표시된 세포주의 분취량을 2% 열-불활성화된 FCS (Invitrogen, cat.: 10270-106), 0.1% 소듐 아자이드 (Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: A1430.0100)를 함유하는 FACS 완충액 (PBS, Invitrogen, cat.: 14190-169)에서 단계적 희석된 His-태그된 항체 100 ㎕와 함께 얼음에서 45 분 간 인큐베이션 하였다. NK 세포의 염색을 1　mg/mL 다클론 인간 항체 (Gammanorm, Octapharma, Langenfeld, Germany, cat.: PZN-2451445)로 보충된 FACS 완충액에서 수행하여 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 차단하였다.
FACS 완충액으로 반복해서 세척한 후, 세포-결합된 항체를 10　㎍/mL 항-His mAb 13/45/31-2 (Dianova, Hamburg, Germany, cat.: DIA910-1MG), 그 다음 15　㎍/mL FITC-결합된 염소 항-마우스 항체 (Dianova, cat.: 115-095-062)로 검출하였다. 그런 다음 상기 세포를 다시 세척하고, 죽은 세포를 제외하기 위해 2　㎍/mL 프로피디움 이오디드 (PI) (Sigma, cat.: P4170)를 함유하는 FACS 완충액 0.2　mL에 재현탁시켰다. MXP 소프트웨어 (Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)를 이용한 Beckman-Coulter FC500 MPL 유동 세포계측기를 이용하거나, 또는 Millipore Guava EasyCyte 유동 세포계측기 (Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용해서 2-5　x　103 개의 생존 세포의 형광을 측정하였다. 상기 세포 시료의 평균 형광 세기 평균은 CXP 소프트웨어 (Beckman-Coulter) 또는 Incyte 소프트웨어 (Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용해서 계산하였다. 2차 및 3차 시약만으로 염색된 세포의 형광 세기 값을 뺀 후, 그 값을 GraphPad Prism (GraphPad Prism version 6.00 for Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA)을 이용하여 분석하는데 사용하였다. KD의 계산을 위해, 일-부위-결합 (쌍곡선)에 대한 방정식을 사용하였다.
세포독성 분석
칼세인-방출 세포독성 분석을 위해, 표적 세포를 10　μM 칼세인 AM (Invitrogen, cat.: C3100MP)으로 30 분 간 RPMI　1640 배지 중에 37 ℃에서 라벨링하고, 세척하고, 96 웰 마이크로 플레이트의 개별적인 웰에서 증가하는 항체 농도의 존재 하에 총 부피 200　μL 중 효과자-대-표적 (E:T) 비율 5:1로 효과자 세포와 함께 1　x　104 세포를 시딩하였다. 습한 5% CO2 분위기의 37 ℃에서 표시된 시간 동안 인큐베이션 한 후, 상등액으로 방출된 칼세인의 형광 (F)을 520　nm에서 플레이트 리더(Victor 3, Perkin Elmer, Turku Finland, cat.: 1420-012)로 측정하였다. 특이적인 세포 용해를 [F(시료)-F(자발적)]/[F(최대)-F(자발적)]x100%로 계산하였다. F(자발적)은 효과자 세포 및 항체의 부재 중 표적 세포로부터 방출되는 형광을 나타내고, F(최대)는 1% Triton X 100 (Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: 3051.2)에 의해서 유도된 총 세포 용해 후 방출된 것을 나타낸다. 회귀 곡선이 EC50을 계산하기에 적합하였다 (GraphPad Prism 버전 6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA).
삼중 특이적 항체 분자의 활성
상이한 배향으로 배열된 동일한 항체 가변 도메인을 포함하는 도 2에 설명된 바와 같이 삼중 특이적 항체 분자를 대표하는 삼중 특이적 항체 분자인, 실시예 3에 기재된 바와 같은 aTriFlex_101, aTriFlex_102, aTriFlex_103 및 aTriFlex_104 (실시예 3a), 3b), 3c) 및 3d) 참조)의 결합을 단일 양성 CD19+/CD30- Raji 및 CD19-/CD30+ KARPAS-299 세포뿐 아니라 이중-양성인 CD19+/CD30+ MEC-1 세포에 대해 유동 세포계측을 이용하여 입증하였다. CD19에 대한 해리 상수는 6 내지 64 nM의 범위이고, CD30에 대해서는 16 내지 45 nM이다 (도 12). 이중-양성 MEC-1 세포에서 9 내지 47 nM 범위의 해리 상수가 관찰되었고, 일반적으로 각각 단일-양성 Raji 및 KARPAS-299 세포에 대해 수득된 데이터를 확정하였다.
세포 독성 분석에서, 단일 양성 CD30+/CD19-Raji 상의 89 내지 580 pM 범위 및 CD19-/CD30+ KARPAS-299 세포 상의 155 내지 952 pM 범위의 EC50 값이 관찰되었다. 이중-양성 CD19+/CD30+ MEC-1 세포 상에서, 67 내지 235 pM 범위의 EC50 값이 관찰되어 활성이 11 배 개선되었음을 나타내었다 (도 13).
전체적으로, 삼중 특이적 항체 분자는 본 연구에서 시험된 세포주 상에서 유사한 활성을 보였다; 그러나, 다른 항원 쌍에 대해 상기 세포 표면 상의 항원 밀도 및 기하학의 영향은 단일-양성 세포와 비교하여 이중-양성 세포에 대한 겉보기 친화도에서의 더 뚜렷한 증가를 유도하는 구조체의 활성에 강한 영향을 미칠 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Affimed GmbH <120> Novel Multivalent Fv Antibodies <130> A 3305PCT <150> EP 15189665.1 <151> 2015-10-13 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 780 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Fv polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 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Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn 130 135 140 Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 145 150 155 160 Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro 165 170 175 Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile 180 185 190 Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp 195 200 205 Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 210 215 220 Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 225 230 235 <210> 36 <211> 755 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Fv polypeptide <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 130 135 140 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 145 150 155 160 Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 165 170 175 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 180 185 190 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 210 215 220 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val 260 265 270 Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly 275 280 285 Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val 290 295 300 Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg 305 310 315 320 Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn 340 345 350 Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 355 360 365 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser 370 375 380 Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp 385 390 395 400 Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 405 410 415 Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile 420 425 430 Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr 435 440 445 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 450 455 460 Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys 465 470 475 480 Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln 485 490 495 Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val 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Claims (25)

  1. 두 쌍의 가변 도메인으로 이루어진 이중항체-유닛(diabody-unit)을 포함하는 다가(multivalent) Fv 항체로서,
    상기 하나의 쌍은 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 가변 경쇄 도메인의 쌍 (VL-VL)이고, 다른 하나의 쌍은 하나의 폴리펩티드에서 서로 연결된 가변 중쇄 도메인의 쌍 (VH-VH)이고,
    상기 VL-VL 쌍 및 VH-VH 쌍은 결합(associate)되어 두 개의 항원 결합 부위를 이루고, 하나 이상의 가변 도메인 쌍은 네 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드에서 두 개 이상의 추가 가변 도메인에 연결된 것이고,
    상기 폴리펩티드에서 상기 추가 가변 도메인 중 하나는 상기 가변 도메인 쌍에 대해 N-말단에 위치하고, 다른 추가 가변 도메인은 상기 가변 도메인 쌍에 대해 C-말단에 위치하는 것인 다가 Fv 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 Fv 항체는 4가 (tetravalent) 이상인 것인 다가 Fv 항체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 이중항체-유닛의 VL-VL 쌍 및 VH-VH 쌍은 결합하여 두 개의 항원 결합 부위를 이루고, 상기 추가로 N-말단에 위치한 가변 도메인은 상응하는 가변 도메인과 결합하여 제3 항원 결합 부위를 이루고, 상기 C-말단에 위치한 가변 도메인은 상응하는 가변 도메인과 결합하여 제4 항원 결합 부위를 이루는 것인 다가 Fv 항체.
  4. 청구항 2에 있어서, 서로 연결된 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로서, 상기 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍(1, 1c, 10, 10a)은 상기 폴리펩티드에 통합되는 것인 다가 Fv 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가변 도메인 VL-VL 쌍 및 가변 도메인 VH-VH 쌍에서 두 가변 도메인은 12 개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 링커 (3, 3a)로 연결되는 것인 다가 Fv 항체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 7가 (heptavalent) 또는 6가 (hexavalent)인 것인 다가 Fv 항체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드에서 상기 이중항체-유닛의 두 개의 가변 도메인 쌍은 상기 폴리펩티드의 다른 두 개의 가변 도메인 쌍과 결합된 것인 다가 Fv 항체 분자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드에서 상기 이중항체-유닛의 가변 도메인 쌍은 다른 폴리펩티드의 다른 가변 도메인 쌍에 비-공유적으로 결합된 것인 다가 Fv 항체 분자.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 다른 폴리펩티드는 두 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드는 이의 N-말단에 scFv-유닛 및 이의 C-말단에 scFv-유닛을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여섯 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드는 이의 N-말단에 단쇄 이중항체-유닛 및 이의 C-말단에 단쇄 이중항체-유닛을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 Fv 항체 분자는 단일 폴리펩티드로 이루어진 것인 다가 Fv 항체 분자.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 Fv 항체 분자는 열 개의 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 두 개의 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드로 이루어지고, 상기 제1 폴리펩티드는 N-말단에 단쇄 이중항체 유닛 및 C-말단에 단쇄 이중항체 유닛을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 제1 폴리펩티드와 결합되어 이중항체 유닛을 이루는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  14. 청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 서로 연결된 여섯 개의 가변 도메인, 상기 N-말단에서 scFv-유닛을 형성하는 제1 및 제2 가변 도메인을 갖고, 상기 N-말단의 scFv-유닛은 C-말단이 제3 가변 도메인에 연결되고, 상기 제3 가변 도메인은 12 개 이하의 잔기로 이루어진 펩티드 링커에 의해서 제4 가변 도메인에 연결되고, 상기 제4 가변 도메인은 C-말단이 상기 C-말단의 scFv-유닛에 연결되고, 상기 scFv-유닛은 제5 및 제6 가변 도메인에 의해서 형성된 것인 다가 Fv 항체 분자.
  15. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 서로 연결된 여덟 개의 가변 도메인, 상기 N-말단에서 scFv-유닛을 형성하는 제1 및 제2 가변 도메인을 갖고, 상기 N-말단의 scFv-유닛은 C-말단이 제3 가변 도메인에 연결되고, 상기 제3 가변 도메인은 12 개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 링커에 의해 제4 가변 도메인에 연결되고, 상기 제4 가변 도메인은 C-말단이 제5 가변 도메인에 연결되고, 상기 제5 가변 도메인은 C-말단이 12 개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 링커에 의해서 제6 가변 도메인에 연결되고, 상기 제6 가변 도메인은 C-말단이 상기 C-말단의 scFv-유닛에 연결되고, 상기 scFv-유닛은 제7 및 제8 가변 도메인에 의해서 형성되는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 경쇄 도메인의 쌍 (VL-VL)은 네 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드에서 N-말단이 다른 가변 도메인으로 및 C-말단이 다른 가변 도메인으로 연결되고, 상기 가변 중쇄 도메인의 쌍 (VH-VH)은 네 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드에서 N-말단이 다른 가변 도메인으로 및 C-말단이 다른 가변 도메인으로 연결되는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 여섯 개의 가변 도메인을 포함하고, 상기 각각의 폴리펩티드는 C-말단 또는 N-말단에 scFv 유닛을 포함하는 것인 다가 Fv 항체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중항체-유닛에서 상기 가변 도메인은 동일한 에피토프 특이성 또는 상이한 에피토프 특이성을 갖는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fv 항체 분자는 면역 효과자 세포 상에 존재하는 항원에 대해서 특이성을 갖는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 Fv 항체는 동일 종류의 면역 효과자 세포에 특이성을 갖는 두 개의 항원 결합 부위를 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fv 항체는 종양 항원에 대해 하나 이상의 특이성을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 Fv 항체는 두 개의 종양 항원에 특이성을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  23. 청구항 19 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fv 항체는 바이러스 항원에 대해 하나 이상의 특이성을 포함하는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  24. 청구항 7에 있어서, 상기 6 개 이상의 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드는 6 개 이상의 가변 도메인을 갖는 다른 폴리펩티드와 결합되는 것인 다가 Fv 항체 분자.
  25. 약제로서 사용하기 위한 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 따른 다가 Fv 항체 분자.
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