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KR20180056778A - Foxm1 유래 펩티드 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

Foxm1 유래 펩티드 및 이를 포함하는 백신 Download PDF

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Publication number
KR20180056778A
KR20180056778A KR1020187012991A KR20187012991A KR20180056778A KR 20180056778 A KR20180056778 A KR 20180056778A KR 1020187012991 A KR1020187012991 A KR 1020187012991A KR 20187012991 A KR20187012991 A KR 20187012991A KR 20180056778 A KR20180056778 A KR 20180056778A
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KR
South Korea
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peptide
cancer
foxm1
present
hla
Prior art date
Application number
KR1020187012991A
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English (en)
Inventor
사치코 야마시타
테츠로 히키치
Original Assignee
온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 filed Critical 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 세포 독성 T 세포를 유도할 수 있는 FOXM1 유래 에피톱 펩티드를 제공한다. 본 발명은 더 나아가, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩티드를 제시하는 항원제시 세포, 및 상기 펩티드를 타겟하는 세포 독성 T 세포뿐만 아니라, 항원제시 세포 또는 CTL의 유도 방법도 제공한다. 본 발명은 또한 유효성분으로서 그들을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항원제시 세포, 세포 독성 T 세포 또는 약학적 조성물을 사용하여 암의 치료 및/또는 예방 방법, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 암에 대해 면역반응을 유도하는 방법도 또한 제공한다.

Description

FOXM1 유래 펩티드 및 이를 포함하는 백신
본 발명은 생물과학분야, 더 구체적으로는 암치료 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암 백신으로 효과가 있는 새로운 펩티드, 상기 펩티드를 사용하여 종양을 치료 및 예방의 단독 또는 모두를 위한 방법 및 상기 펩티드 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
CD8 양성 세포독성 T 림포싸이트(cytotoxic T lymphocytes; CTL)는 세포표면에 발현하는 주조직적합 복합체 종류 1(major histocompatibility complex (MHC) class I) 분자에서 제시되는 종양-관련된 항원(tumor-associated antigen (TAA))으로부터 유래된 에피톱 펩티드를 인식하고 이어서 종양세포를 죽이는 것으로 알려져 있다. 멜라노마 항원(MAGE) 패밀리를 발견한 이래, 많은 TAA가 면역학적 방법을 통해 발견되어 왔다(NPL1: Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80; NPL2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9). 이들 TAA의 일부는 현재 면역치료요법의 타겟으로서 임상 개발 과정에 있다.
복수의 TAA 몇몇에서 CTL에 의해 인식되는 에피톱 펩티드가 동정되었고, 이를 여러 타입의 암종을 위한 면역치료요법으로 적용하는 것이 기대되고 있다(비특허문헌 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55; 비특허문헌 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42; 비특허문헌 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9; 비특허문헌 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156(9) 3308-14; 비특허문헌 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8; 비특허문헌 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72; 비특허문헌 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66; 비특허문헌 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94). 지금까지, TAA-유래 에피톱 펩티드를 사용한 여러 임상시험이 보고되고 있으나, 불행하게도 많은 임상시험에서 주효율이 결코 높지만은 않았다(비특허문헌 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2000, 20(20): 4169-80; 비특허문헌 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42; 비특허문헌 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9): 909-15). 그러므로, 암 면역치료요법으로 적용가능한 새로운 CTL 에피톱 펩티드의 동정이 여전히 요구된다.
FOXM1(GenBank Accession No. NM_202003; Forkhead box M1)는 27,648 유전자를 대상으로 한 cDNA 마이크로 어레이에 의한 게놈 전체 유전자 발현 프로파일의 결과에서 간내담관암, 비소세포폐암 및 식도암 조직에서 발현이 항진하고 있는 유전자로 확인되어 보고되고 있다(비특허문헌 14: Obama K et al., Hepatology 2005,41 (6) : 1339-48; 비특허문헌 15: Yokomine K et al., Int J Cancer 2010, 126 (9) : 2153-63; 특허문헌1: WO2005/090603). 한편, 정상 조직의 FOXM1의 발현 수준이 암 조직에 비해 매우 낮다. 또한 FOXM1의 발현을 방해한 결과, 수모세포종 세포의 증식이 억제된 것으로부터(비특허문헌 16: Priller M et al., Clin Cancer Res 2011, 17 (21) : 6791-801), FOXM1는 암세포의 증식 조절에 관련된 유전자임이 시사되고 있다. 즉, FOXM1는 증식을 반복하는 많은 암종에 걸친 TAA이며, FOXM1에서 유래하는 에피토프 펩타이드가 암 환자를 대상으로 한 면역 요법에 적용할 수 있다고 생각했다.
최근, FOXM1 유래 HLA-A02 구속성 에피톱 펩티드(특허문헌 2: WO2009/025196) 및 HLA-A24 구속성 에피토프 펩타이드(특허문헌 3: WO2010/095428)가 동정되었다. 이들 펩티드에 의한 치료효과는 HLA-A02 타입 또는 HLA-A24 타입을 갖는 암 환자에서는 기대할 수 있으나, 그 이외의 암 환자에서는 기대할 수 없다.
[특허문헌 1] WO2005 / 090603 [특허문헌 2] WO2009 / 025196 [특허문헌 3] WO2010 / 095428
[비특허문헌 1] Boon T, Int J Cancer 1993, 54 (2) : 177-80 [비특허문헌 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183 (3) : 725-9 [비특허문헌 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88 (20) : 1442-55 [비특허문헌 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59 (13) : 3134-42 [비특허문헌 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59 (21) : 5554-9 [비특허문헌 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156 (9) : 3308-14 [비특허문헌 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57 (20) : 4465-8 [비특허문헌 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80 (2) : 169-72 [비특허문헌 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81 (3) : 459-66 [비특허문헌 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81 (3) : 387-94 [비특허문헌 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002, 20 (20) : 4169-80 [비특허문헌 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188 : 33-42 [비특허문헌 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10 (9) : 909-15 [비특허문헌 14] Obama K et al., Hepatology 2005, 41 (6) : 1339-48 [비특허문헌 15] Yokomine K et al., Int J Cancer 2010, 126 (9) : 2153-63 [비특허문헌 16] Priller M et al., Clin Cancer Res 2011, 17 (21) : 6791-801
발명의 개요
본 발명은 FOXM1-발현 세포에 특이적으로 반응하는 CTL을 유도할 수 있는 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드가 사람 백혈구세포 항원(human leukocyte antigen (HLA))와 복합체를 형성하여, 그 복합체를 자신의 표면상에 제시하는 항원-제시 세포(APC)에 의해 CD8 양성 T 세포에 제시될 때, 펩티드 특이적인 세포독성을 나타내는 CTL이 유도된다. 지금까지 동정된 CTL 유도능을 갖는 FOXM1 유래 펩티드는 HLA-A02 및 HLA-A24 구속성 펩티드이며, 항원제시세포가 이들 HLA를 발현하지 않는 경우 CTL을 유도할 수 없다. 그러므로, 종래의 펩티드는 이들 HLA를 갖지 않는 대상에서는 면역치료요법을 수행하기에 적합하지 않다. HLA-A33은 아시아인에서 흔히 보여지는 대립형질(allele)이며, HLA-A01은 백인에서 흔히 보여지는 HLA 대립형질이다(Cao K et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). HLA-A33 구속성 펩티드는 HLA-A33 양성 대상에게 투여하는 것이 이상적이고, HLA-A01 구속성 펩티드는 HLA-A01 양성 대상에게 투여되는 것이 이상적이다. 그러므로, 본 발명은 HLA-A33 또는 HLA-A01 구속성의 FOXM1 유래 펩티드이며, CTL 유도능력을 갖는 펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 공개되는 결과에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 FOXM1 및 HLA-A33 또는 HLA-A01를 발현하는 암세포에 대한 특이적이고 강력한 면역반응을 유도할 수 있는 에피톱 펩티드인 것으로 증명되었다.
그러므로, 본 발명의 목적 중 하나는 HLA-A33 또는 HLA-A01 구속성의 방식으로 CTL을 유도할 수 있는 FOXM1 유래 펩티드를 제공하는 것이다. 이들 펩티드는 시험관 내(in vitro), 생체 밖(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하는데 사용될 수 있거나, 또는 FOXM1-발현 암 세포에 대하여 면역반응을 유도할 목적으로 대상에게 투여되는데 사용될 수 있다. 바람직한 펩티드는 서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다; 더 바람직하게는 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이며, 더욱 바람직한 펩티드는 서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41,42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다.
본 발명의 펩티드에는 원래의 펩티드의 CTL-유도능력을 유지하는 한, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 펩티드도 포함한다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드의 어느 하나를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 비슷하게, 이들 폴리뉴클레오티드는 CTL-유도능력을 가진 APC를 유도하는데 사용될 수 있으며, FOXM1을 발현하는 암 세포에 대한 면역반응을 유도하기 위해 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 타입의 펩티드, 본 발명의 펩티드의 하나 또는 그 이상의 타입을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 APC, 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소좀(exosome) 및/또는 본 발명의 CTL을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 암의 치료 및/또는 예방뿐만 아니라 이의 수술 후 재발 방지에도 사용될 수 있다. 이들은 암에 대해 면역반응을 유도하기 위해 사용될 수도 있다. 대상에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드는 APC의 표면에 제시되며, 그 결과로 상기 펩티드를 타겟으로 하는 CTL이 유도된다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 목적은 CTL을 유도하기 위한 조성물을 제공하는 것이며, 여기서 상기 조성물은 본 발명의 펩티드의 하나 또는 그 이상의 타입, 본 발명의 펩티드의 하나 또는 그 이상의 타입을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 APC및/또는 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소좀을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 CTL-유도능력을 갖는 APC의 유도 방법을 제공하는 것이며, 여기서 상기 방법은 본 발명의 펩티드의 하나 또는 그 이상의 타입을 APC와 접촉하는 단계, 또는 본 발명의 펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 더 나아가 CD8-양성 T 세포를 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 APC와 함께 공-배양하는 단계, CD8-양성 T 세포를 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소좀과 함께 공-배양하는 단계, 또는 세포 표면에 HLA 항원에 의해 제시되는 본 발명의 펩티드에 결합하는 능력이 있는 T 세포 수용체(TCR)의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CD8-양성 T 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 CTL 유도 방법을 제공한다. 본 발명에서 바람직한 HLA 항원은 HLA-A33 또는 HLA-A01이다.
본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 APC를 제공하는 것이다. 본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드를 타겟팅하는 분리된 CTL을 제공한다. 이들 APC 및 CTL은 FOXM1-발현 암을 위한 면역치료요법에 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 면역치료요법의 대상이 되는 암은, 예를들어, HLA-A33 또는 HLA-A01의 동형접합체(homozygote) 또는 이형접합체(heterozygote)를 갖는 환자에게 존재하는 암이다. 따라서, 상기 APC 또는 CTL도 HLA-A33 또는 HLA-A01를 동형접합체 또는 이형접합체로 갖는 세포이다. 즉, 본 발명은 FOXM1 및, HLA-A33 및 HLA-A01로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA 항원을 발현하는 암을 위한 면역치료요법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상에서 암에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이며, 여기서 상기 방법은 대상에게 본 발명의 펩티드(들) 또는 상기 펩티드(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들), 본 발명의 APC(들), 본 발명의 펩티드(들)을 제시하는 엑소좀(들), 및/또는 본 발명의 CTL(들)을 포함하는 조성물을 상기 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 목적은 대상에서 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법뿐만 아니라 수술 후 재발을 방지하는 방법을 제공하는 것이며, 여기서 상기 방법은 대상에게 본 발명의 펩티드(들), 상기 펩티드(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들), 본 발명의 APC(들), 본 발명의 펩티드(들)을 제시하는 엑소좀(들), 및/또는 본 발명의 CTL(들)을 상기 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
상기에 더하여, 본 발명의 다른 목적 및 특징은 하기 상세한 설명에 첨부된 도면 및 실시예와 함께 읽을 때, 보다 충분히 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상기 요약 및 하기의 상세한 묘사는 실시예이고, 본 발명이나 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예를 제한하지 않는다. 특히, 본 발명이 여기에서 많은 구체적인 실시예와 함께 기술되지만, 그 기술은 본 발명의 예일 뿐, 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 뜻(spirit) 및 범위(scope) 내에서, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이 다양한 변형 및 적용이 당업자에게 일어날 수 있다. 동일하게, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성 및 이점은 상기 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 용이하게 당업자에게도 명백할 것이다. 상기 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동반되는 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가능한 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로 또는 여기서 통합된 참조문헌의 고려와 함께 상기로부터 명백할 것이다.
[도 1-1] 도 1은 FOXM1로부터 유래된 펩티드로 유도한 세포를 사용하여 실시한 인터페론 감마(IFN-γ) 효소-연계 면역스팟(ELISPOT) 어세이의 결과를 보여주는 사진 (a) 내지 (v)로 구성된다. 도면에서 "+"는 목적 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 보여주고; "-"는 특정 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 보여준다(음성대조).
FOXM1-A33-9-180(서열번호: 1)을 이용한 웰 번호 #6(a), FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)을 이용한 웰 번호 #3(b), FOXM1-A33-9-693(서열번호: 3)을 이용한 웰 번호 #4(c), FOXM1-A33-9-516(서열번호: 6)을 이용한 웰 번호 #3(d), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)을 이용한 웰 번호 #5(e), FOXM1-A33-9-289(서열번호: 11)를 이용한 웰 번호 #6(f), FOXM1-A33-9-228(서열번호: 12)를 이용한 웰 번호 #6(g), FOXM1-A33-9-502(서열번호: 17)를 이용한 웰 번호 #4(h), FOXM1-A33-9-321(서열번호: 18)를 이용한 웰 번호 #2(i), FOXM1-A33-9-341(서열번호: 20)를 이용한 웰 번호 #6(j), FOXM1-A33-10-514(서열번호: 22)를 이용한 웰 번호 #8(k), FOXM1-A33-10-179(서열번호: 24)를 이용한 웰 번호 #6(l), FOXM1-A33-10-501(서열번호: 26)를 이용한 웰 번호 #5(m), FOXM1-A33-10-124(서열번호: 32)를 이용한 웰 번호 #5(n), FOXM1-A33-10-595(서열번호: 33)를 이용한 웰 번호 #3(o), FOXM1-A33-10-546(서열번호: 36)를 이용한 웰 번호 #5(p), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39)를 이용한 웰 번호 #6(q), FOXM1-A33-10-607(서열번호: 41)를 이용한 웰 번호 #3(r), FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42)를 이용한 웰 번호 #2(s), FOXM1-A33-10-4(서열번호: 45)를 이용한 웰 번호 #6(t) 및 FOXM1-A33-10-388(서열번호: 46)를 이용한 웰 번호 #5(u)에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산이 인정됨이 음성대조군과의 비교에서 알 수 있다. 사진에서 사각으로 둘러싸인 반응을 나타낸 세포를 CTL 세포주 수립을 위해 증식시켰다. 한편, 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산이 없었던 전형적인 음성 데이터의 예로써 FOXM1-A33-10-288(서열번호: 25) (v)를 나타낸다.
[도 1-2] 도 1-1의 연속이다.
[도 2] 도 2는 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)(a), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)(b), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39 )(c) 및 FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42)(d)로 자극된 CTL 세포주에서 생산된 IFN-감마를 IFN-감마 효소-연계 면역흡착측정법(ELISA)로 측정한 결과를 보여주는 꺽은선 그래프 (A)~(D)로 구성된다. 이 결과는 각 펩티드에 의한 유도 후, 펩티드 특이적으로 IFN-감마를 생산하는 CTL 세포주가 수립된 것을 나타낸다. 도면에서 "+"는 목적 펩티드를 펄스한 표적 세포에 대한 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 보여주고; "-"는 어떤 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 보여준다. R/S 비율은 응답 세포(responder cell)인 CTL 세포주의 세포 수 및 이를 자극하는 표적 세포(stimulator cell)의 세포 수의 비율을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2) 및 FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)(b)로 유도된 후, 한계희석법으로 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여주는 일련의 꺽은 선 그래프 (a)~(b)로 구성된다. 이 결과는, CTL 클론의 펩티드 특이적인 IFN-감마 생산을 나타낸다. 도면에서, "+"는 목적 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대한 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여준다; "-"는 어떤 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여준다. R/S 비율은 응답 세포(responder cell)인 CTL 세포주의 세포 수 및 이를 자극하는 표적 세포(stimulator cell)의 세포 수의 비율을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 FOXM1 및 HLA-A*33:03을 모두 발현하는 표적 세포에 대해 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여주는 선 그래프이다. HLA-A*33:03 또는 전장 FOXM1 유전자로 도입한 표적 세포를 음성 대조로 하였다. FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)를 사용한 유도에 의해 수립된 CTL 클론은 FOXM1 및 HLA-A*33:03 유전자 모두를 도입한 COS7 세포에 대해 IFN-감마 생산을 보여준다(흑색 다이아몬드). 반면에, HLA-A*33:03(흰색 세모) 및 FOXM1(흰색 원) 중 하나로 도입된 COS7 세포에 대해서는 유의적으로 IFN-감마 생산을 보여주지 않았다.
[도 5-1] 도 5-1은 FOXM1로부터 유래된 펩티드로 유도한 세포를 이용하여 실시한 IFN-감마 효소결합면역스팟(ELISPOT) 어세이의 결과를 보여주는 사진 (a) 내지 (n)의 사진으로 이루어진다. 도면에서 "+"는 목적 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 보여주고; "-"는 어떤 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 보여준다(음성대조). FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48)를 이용한 웰 번호 #3(a), FOXM1-A01-9-539(서열번호: 49)를 이용한 웰 번호 #3(b), FOXM1-A01-9-631(서열번호: 50)를 이용한 웰 번호 #3(c), FOXM1-A01-9-231(서열번호: 52)를 이용한 웰 번호 #2(d), FOXM1-A01-9-663(서열번호: 53)를 이용한 웰 번호 #2(e), FOXM1-A01-9-494(서열번호: 55)를 이용한 웰 번호 #5(f), FOXM1-A01-9-341(서열번호: 20)를 이용한 웰 번호 #2(g), FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)를 이용한 웰 번호 #1(h), FOXM1-A01-10-263(서열번호: 57)를 이용한 웰 번호 #2(i), FOXM1-A01-10-308(서열번호: 58)를 이용한 웰 번호 #4(j), FOXM1-A01-10-232(서열번호: 59)를 이용한 웰 번호 #6(k), FOXM1-A01-10-663(서열번호: 60)를 이용한 웰 번호 #6(l) 및 FOXM1-A01-10-341(서열번호: 61)를 이용한 웰 번호 #6(m)에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산이 인정됨이 대조군과의 비교에서 알 수 있다. 사진에서 사각으로 둘러싸인 반응을 보인 세포를 CTL 세포주 수립을 위해 증식시켰다. 한편, 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산이 없었던 전형적인 음성 데이터의 예로는 FOXM1-A01-10-265(서열번호: 42)(n)을 나타낸다.
[도 5-2] 도 5-1의 연속이다.
[도 6] 도 6은 FOXM1-A01-10-566(서열번호 56)로 자극된 CTL 세포주에서 생산되는 IFN-감마를 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 꺽은 선 그래프이다. 이들 결과는 펩티드에 의한 유도 후, 펩티드 특이적으로 IFN-감마를 생산하는 CTL 세포주가 수립된 것을 나타낸다. 도면에서, "+"는 목적 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대한 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 보여주고; "-"는 어떤 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 보여준다. R/S 비율은 응답 세포(responder cell)인 CTL 세포주의 세포 수 및 이를 자극하는 표적 세포(stimulator cell)의 세포 수의 비율을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 FOXM1-A01-9-233(서열번호 48) 및 FOXM1-A01-11-566(서열번호 56)로 유도한 후, 한계희석법으로 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여주는 일련의 꺽은 선 그래프 (a)~(b)로 구성된다. 이 결과는, CTL 클론의 펩티드 특이적인 IFN-감마 생산을 보여준다. 도면에서, "+"는 목적 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대한 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여주고; "-"는 어떤 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포에 대한 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여준다. R/S 비율은 응답 세포(responder cell)인 CTL 세포주의 세포 수 및 이를 자극하는 표적 세포(stimulator cell)의 세포 수의 비율을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 FOXM1 및 HLA-A*01:01을 모두 발현하는 표적 세포에 대해 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 보여주는 꺽은 선 그래프이다. FOXM1 또는 HLA-A*01:01 유전자 중 어느 하나를 도입한 표적 세포를 음성대조군으로 하였다. FOXM1-A01-10-566(서열번호 56)를 사용한 유도에 의해 수립된 CTL 클론은 FOXM1 및 HLA-A*01:01 유전자 모두를 도입한 COS7 세포에 대해 IFN-감마 생산을 나타냈다(흑색 다이아몬드). 반면에, HLA-A*01:01(세모) 및 FOXM1(흰색 원) 중 어느 하나로 도입한 COS7 세포에 대해서는 유의적으로 IFN-감마 생산을이 나타나지 않았다.
실시예의 설명
비록 여기서 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 특정 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 검사 또는 실행에서 사용될 수 있지만 선호되는 방법, 장치 및 재료는 여기서 기술된다. 하지만 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 이러한 설명이 전적으로 설명하는 것일 뿐, 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명이 본 발명에 기재된 특정한 크기, 모양, 규모, 물질, 방법론, 프로토콜 등의 일반적인 실험 및 최적화에 따라 다를 수 있는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 기술에서 사용되는 전문용어는 오직 실시예 또는 특정 버전을 기술하려는 것이고, 이것은 오직 하기 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
I. 정의
본 명세서에서 사용된 하나("a", "an" 및 "the")는 따로 특별히 표시하지 않는 한 "적어도 하나"를 의미한다.
물질(substance)(예를 들어, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드 등)과 관련되어 사용된 용어 "분리된(isolated)" 및 "정제 된(purified)"은 아마도 천연자원(natural sourse)을 포함하는 적어도 하나의 물질을 주로 포함하지 않는 물질을 의미한다. 그러므로, "분리된" 또는 "정제된" 펩티드는 펩티드가 유래된 세포 또는 조직 자원으로부터 다른 세포 물질(cellular material), 예를 들어, 탄수화물, 지질 및 다른 오염된 단백질를 주로 포함하지 않음을 의미한다. 펩티드가 화학적으로 합성되었을 때는, "분리된" 또는 "정제된" 펩티드 전구물질 또는 다른 화학물질이 주로 포함되지 않은 펩티드를 의미한다. "세포 물질을 주로 포함하지 않는다"라는 구절은 펩티드가 분리된 세포의 세포 성분으로부터 별도로 분리되었거나 재조합적으로 생산된 펩티드의 제조를 포함한다. 그러므로, 세포 물질을 주로 포함하지 않는 펩티드는 30%, 20%, 10%, 또는 5%, 3%, 2% 또는 1%(건조무게 기준) 미만의 다른 세포 물질을 포함하는 펩티드의 제조를 포함한다.
펩티드가 재조합적으로 생산될 때, 분리된 또는 정제된 펩티드는 배양 배지를 주로 포함하지 않으며, 이는 펩티드 제조 부피의 20%, 10%, 또는 5%, 3%, 2% 또는 1%(건조무게 기준) 미만의 배양 배지를 포함하는 펩티드의 제조를 포함한다.
또는, 펩티드가 화학적으로 합성될 때, 분리된 또는 정제된 펩티드는 전구물질 또는 다른 화학물질을 주로 포함하지 않으며, 이는 펩티드의 제조 부피의 30%, 20%, 10%, 5%, 3%, 2% 또는 1%(건조무게 기준) 미만의 전구물질 또는 다른 화학물질을 포함하는 펩티드의 제조를 포함한다. 분리된 또는 정제된 펩티드인 특정한 펩티드 제조는 예를 들어, 소듐 도데실 셀페이트(sodium dodecyl sulfate(SDS))-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 코마시 브릴리언트 블루(coomassie brillliant blue) 염색 또는 이와 같은 겔에서 단일 밴드로 나타남으로서 확인될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 또는 정제된 것들이다.
본 발명에서 호환성 있게 사용된, 용어 "폴리 펩티드(polypeptide), "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 폴리머를 의미한다. 이들 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머에 더하여, 하나 또는 그 이상의 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머에도 또한 적용된다. 비-자연적으로 발생하는 아미노산은 아미노산 유사물, 아미노산 모방물(mimetic) 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아미노산(amino acid)"는 자연적으로 발생하는 아미노산뿐만 아니라, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 기능을 하는 아미노산 유사물 및 아미노산 모방물을 의미한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드로 코딩된 것뿐만 아니라, 세포에서 번역 후 수식된 아미노산(예를 들어, 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린 등)도 포함한다. 상기 구절, "아미노산 유사물(amino acid analog)"은 자연적으로 발생하는 아미노산으로서 같은 기본 화학적 구조(수소, 카복실그룹 및 R 그룹에 결합된 알파 탄소)를 가지지만 수식된 R 그룹 또는 수식된 백본을 갖는 화합물[예를 들어, 호모세린, 노르류신(norleucine), 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포니움 등]을 의미한다. 상기 구절 "아미노산 유사물(amino acid analog)"은 일반적으로 아미노산과 구조는 다르나 유사한 기능을 갖는 화합물을 의미한다. 상기 구절 "아미노산 모방물(amino acid mimetic)"은 일반적인 아미노산과 다른 구조를 갖지만 아미노산과 유사한 기능을 갖는 화합물을 의미한다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산 중 어느 하나일 수 있으며, 본 발명의 펩티드는 바람직하게 L-아미노산 폴리머이다.
본 명세서에서 호환적으로 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", “올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)” 및 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 폴리머를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "조성물(composition)"은 특정된 양에 특정된 성분들이 포함하는 산물 및 특정된 양에 특정된 성분의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 생산된 특정 산물을 포함하는 것을 고려한다. 상기 조성물이 약학적 조성물일 때, 상기 용어, "조성물"은 유효성분(들)및 비유효성분(들) 뿐만 아니라, 특정 두 개 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합화, 또는 집합, 하나 또는 그 이상의 성분의 분리, 또는 하나 또는 그 이상의 성분이 다른 타입과의 반응 또는 상호작용으로부터, 직접 또는 간접적으로 생성된 산물도 포함하는 것을 고려한다. 그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능 한 담체와 함께 본 발명의 화합물 또는 세포와의 혼합으로 만들어진 특정 조성물을 고려한다. 여기에 제한되지 않고, 본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)" 또는 "생리학적으로 허용 가능한 담체(physiologically acceptable carrier)"는 액체 또는 고체의 증량제, 희석제, 부형제, 용매 및 응축재료를 포함하며; 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 재료, 조성물, 물질 또는 배지를 포함한다.
별도로 명시하지 않는 한, 상기 용어 "암(cancer)"은 FOXM1 유전자를 과발현하는 암을 의미하며; 이의 예로는 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시예에서, "암"은 FOXM1 및, HLA-A33 및/또는 HLA-A01을 발현하는 암이다.
별도로 명시하지 않는 한, "세포독성 T 림포싸이트(cytotoxic T lymphocyte)" 및 "세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)" 및 "CTL"은 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 별도로 특별히 나타내지 않는 한, 이들은 비-자가세포(non-self cell)(예를 들어, 종양/암 세포, 바이러스-감염된 세포)를 인식할 수 있고 이와 같은 세포의 죽음을 유도할 수 있는 T 림포싸이트의 아형-그룹을 의미한다.
별도로 명시하지 않는 한, "HLA-A33"라는 용어는 HLA-A*33:03, HLA-A*33:01, HLA-A*33:04 등의 아형을 포함하는 HLA-A33 타입이라는 의미이다.
별도로 명시하지 않는 한, 상기 용어, "HLA-A01"은 HLA-A*01:01, HLA-A*01:03 및 HLA-A*01:04 등의 아형을 포함하는 HLA-A01 타입을 의미한다.
대상 또는 환자의 맥락에서, 본 명세서에서 사용된 구절, "대상(또는 환자)의 HLA 항원이 HLA-A33이다(HLA antigen of a subject(or patient) is HLA-A33)" 는 대상 또는 환자가 MHC 종류 I 분자로서, 동형접합체적으로(homozygously) 또는 이형접합체적으로(homozygously) HLA-A33 항원 유전자를 가지고 있고, 상기 HLA-A33 항원이 HLA 항원으로서 대상 또는 환자의 세포에서 발현됨을 의미한다. 유사하게 본 명세서에서 사용된 구절, "대상(또는 환자)의 HLA 항원이 HLA-A01이다"는 대상 또는 환자가 MHC(주요조직적합성 복합체) 클래스 I 분자로서, 동형접합체적으로 또는 이형접합체적으로 HLA-A01 항원 유전자를 가지고 있고, 상기 HLA-A01 항원이 HLA 항원으로서 대상 또는 환자의 세포에서 발현되고 있음을 의미한다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "치료(treatment)"라는 맥락에서 유용성을 갖는 한, 치료는 임상적 이득, 예를 들어, 대상에서 암의 크기, 확산 또는 전이 능력의 감소, 암 진행의 지연, 암의 임상적 증상들의 완화, 생존기간의 연장, 수술 후 재발 억제를 달성할 때, 치료는 "효과적(efficacious)"이라고 간주된다. 치료가 방지적으로 적용될 때, "효과적"은 암의 형성을 늦추거나 예방하거나, 암의 임상적 증상을 예방하거나 완화시키는 것을 의미한다. 효과는 특정한 종양 타입을 진단하거나 치료하기 위해 공적으로 알려진 특정 방법과 연관되어 결정된다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 "예방(방지)(prevention (prophylaxis))"라는 맥락에서 유용성을 갖는 한, 본 명세서에서 사용된 용어, "예방(방지)"은 암-관련된 사망율(mortality) 또는 이환율(morbidity)의 부담을 감소시키는 특정 일을 포함한다. 예방(방지)은 "첫 번째, 두 번째 및 세 번째 예방(방지) 수준"에서 수행될 수 있다. 첫 번째 예방 수준이 질병의 발병을 피하게 하는 것인 반면, 두 번째 및 세 번째 수준의 예방(방지)은 질병의 진행 및 증상의 출현을 예방하는 것은 물론이고, 기능을 회복시키고 질병 관련된 합병증을 감소시켜 이미 존재하고 있는 질병의 역효과를 줄이고자 하는 의도된 작업들도 포함한다. 다른 한편으로는, 예방(방지)은 특정 장애의 심각성을 줄이기 위한 것, 예를 들어, 종양 성장 및 전이를 감소시킬 의도로 광범위한 예방적 치료를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방(방지) 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방(방지)에는 암 세포의 증식억제, 종양위축 또는 퇴화, 암 발단 경감 및 억제유도, 종양 퇴화뿐만 아니라, 전이의 감소 또는 억제, 수술 후 재발 억제 및 생존율 연장과 같은 경우 중 어느 것을 포함한다. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방(방지)은 사망률을 줄이고, 암이 있는 개체의 예후를 개선하며, 종양마커의 혈중 수준을 줄이고, 암과 관련된 탐지 가능한 증상을 완화시키는 것이다. 예를 들어, 증상의 경감 또는 개선은 효과적인 치료 및/또는 예방(방지)으로 구성되고, 증상들이 안정적이거나 또는 10%, 20%, 30% 또는 그 이상이 완화된 상태를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항체(antibody)"는 지정된 단백질 또는 이의 펩티드에 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulins) 및 이의 단편을 의미한다. 항체는 인간 항체, 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화 항체, 다른 단백질 또는 방사성 표지와 융합된 항체 및 항체단편을 포함할 수 있다. 더욱이, 여기서 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되며, 특히 온전한 단일클론 항체, 다클론 항체, 두 개 또는 그 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(multispecific antibodies)(예를 들면, 이중 특이적 항체)및 이상적인 생물학적 활성 갖는 한 항체 단편을 특별히 다 포함한다. "항체"는 모든 종류의 항체(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)일 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술적 용어 및 과학적 용어는 모두 본 발명이 속하는 당업계의 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다.
II. 펩티드
HLA-A33은 아시아인에서 일반적으로 보이는 대립형질이고, HLA-A01은 백인에서 흔히 보이는 대립형질이다(Cao et al., Hum Immunol 2001; 62(9): 1009-30). 그러므로, HLA-A33 또는 HLA-A01에 구속성 FOXM1 유래의 CTL-유도성 펩티드를 제공하는 것에 의해, 많은 아시아인 또는 백인 집단에 FOXM1을 발현하는 암의 효과적인 치료방법을 제공할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 HLA-A33- 또는 HLA-A01-구속성의 방식으로 CTL을 유도할 수 있는 FOXM1 유래 펩티드를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 HLA-A33- 또는 HLA-A01-구속성의 방식으로 CTL을 유도할 수 있는 FOXM1 유래 펩티드이다. HLA-A33-구속성의 방식으로 CTL을 유도할 능력이 있는 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 들 수 있다. HLA-A01-구속성의 방식으로 CTL을 유도할 수 있는 펩티드는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 들 수있다.
이들 펩티드에 특이적인 세포독성을 갖는 CTL은 이들 펩티드로 펄스된 수상돌기세포(dendritic cell(DC)에 의해 시험관 내에서 T 세포를 자극되어 확립할 수 있다. 상기 확립된 CTL은 각 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대해 특이적인 세포독성 을 보여준다.
FOXM1 유전자는 암세포, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등과 같은 암 세포와 같은 암 세포에서 과발현되지만, 대부분의 정상 기관에서는 발현되지 않는다. 그러므로, 이는 면역치료요법을 위한 훌륭한 타겟이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 암 면역치료요법에 적절하게 사용될 수 있다. 바람직한 펩티드는 노나펩티드(9개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드) 또는 데카펩티드(10개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드)일 수 있고, 더 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다. 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 HLA-A33 및 FOXM1를 발현하는 세포에 대해 특이한 세포독성을 보이는 CTL을 유도하는데 적합하며, HLA-A33-양성 환자에서 암 면역치료요법을 위해 적절하게 사용될 수 있다. 보다 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 펩티드는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다. 또한 예를 들어, 서열번호 56으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드는, HLA-A01 및 FOXM1를 발현하는 세포에 대해 특이한 세포독성을 보이는 CTL을 유도하는데 적합하며, HLA-A01-양성 환자에서 암 면역치료요법을 위해 적절하게 사용될 수 있다. 더 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 56의 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다.
본 발명의 펩티드는, 결과물 펩티드가 원래 펩티드의 CTL-유도능력을 유지하는 한, 본 발명의 펩티드의 아미노산 잔기에 추가의 아미노산 잔기(들)를 덧붙일 수 있다. 추가의 아미노산 잔기(들)은 원래 펩티드의 CTL-유도능력을 손상시키지 않는 한, 아미노산(들)의 특정 타입으로도 구성될 것이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, CTL-유도능력을 가진 펩티드를 고려한다. 이와 같은 펩티드는, 예를 들어, 약 40개의 아미노산 미만이며, 많은 경우에 약 20개의 아미노산 미만이고, 일반적으로 약 15개의 아미노산 미만이다. 그러므로, 만약 원래의 펩티드가 노나펩티드이면, 본 발명의 펩티드는 상기 펩티드에 추가의 아미노산(들)을 덧붙여 생산된 10-아미노산 길이 또는 11-40 아미노산 길이의 펩티드를 포함한다. 더 나아가, 만약 원래의 펩티드가 데카펩티드이면, 11-40 아미노산 길이의 펩티드를 포함한다. 이와 같은 펩티드는 예를 들면, 11-20 아미노산 길이의 펩티드 또는 11-15 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다. 추가의 아미노산 잔기(들)의 바람직한 예는 FOXM1의 전장 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 67, 69, 71, 73 또는 75)에서 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열에 인접한 아미노산 잔기(들)이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하며, 여기서 상기 펩티드는 FOXM1의 펩티드 단편이고 CTL-유도능력을 갖는다.
일반적으로, 특정 펩티드에서 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 펩티드의 기능에 영향을 주지 않거나, 또는 특정 경우에는 원래 펩티드의 이상적인 기능을 더 강화시키기도 한다. 실제로, 수식된 펩티드(즉, 원래 참조 서열에 비해, 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가) 아미노산 서열로 구성된 펩티드는 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 그러므로, 일 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중으로부터 선택된 아미노산 서열에서 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열을 포함하고 CTL-유도능력이 있는 펩티드일 수 있다.
당업계의 당업자는 단일 아미노산 또는 아미노산의 적은 퍼센트를 바꾸어 아미노산 서열을 개별적으로 치환해도 원래의 아미노산 측쇄(들)의 특성을 유지시키는 결과를 가져오는 경향이 있다고 인식할 수 있다. 따라서, 이는 종종 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"을 의미하고; "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"에 의한 단백질 변형은 원래의 단백질로서 유사한 기능을 갖는 변형된 단백질의 결과일 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 나타내는 보존적 치환의 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 기능적으로 닮은 아미노산 측쇄 성질의 예에는, 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) 및 하기의 기능그룹 또는 공통적인 성질을 갖는 측쇄를 포함한다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기를 함유하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 함유하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아마이드를 함유하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기를 함유하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족을 함유하는 측쇄(H, F, Y, W). 추가로, 하기의 여덟 그룹은 각각 서로에게 보존적 치환으로 당업계에서 여겨지는 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글라이신(G);
2) 아스파라긴 산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T);
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(Creighton, Proteins 1984 참조)
이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드에 포함된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들로 한정되지 않고, 그 결과적인 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 가지는 한, 비보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 변형된 펩티드는 CTL 유도 가능한, 다양성 변종(polymorphic variant), 종간 상동체(interspecies homologues), 및 FOXM1 대립 유전자로부터 유래된 펩티드를 제외하지 않는다.
펩티드가 원래 펩티드의 CTL-유도능력을 유지하는 한, 적은 수(예를 들어 1, 2 또는 몇 개) 또는 아미노산의 적은 퍼센트로 변형될 수 있다(즉 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가). 본 명세서에서, "몇 개(several)"는 5 또는 이보다 적은 수, 예를 들어, 4 또는 3 또는 이보다 적은 수의 아미노산을 의미한다. 변형된 아미노산의 퍼센트는 바람직하게는 20% 또는 미만, 더 바람직하게는 15% 또는 미만, 더욱더 바람직하게는 10% 또는 미만 또는 1 내지 5%이다.
면역치료요법의 맥락에서 사용될 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 HLA 항원과 복합체로서 세포 또는 엑소좀의 표면에 제시되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 HLA 항원에 높은 결합친화력을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 목적으로, 상기 펩티드는 개선된 결합친화력을 갖는 변형된 펩티드가 수득되도록 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가에 의해 변형될 수 있다. HLA 항원에의 결합에 의해 보여지는 펩티드의 서열의 규칙성이 이미 알려짐으로써(Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302), 그러한 규칙성에 근거하여 변형이 본 발명의 펩티드 내로 도입될 수 있다.
예를 들어, HLA 종류 I에 대한 결합친화력을 가진 펩티드에서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산 및 C-말단 아미노산은 일반적으로 HLA 종류 I에 결합하는데 관여하는 앵커 잔기들이다(Rammensee HG, et al., Immunogenetics. 1995; 41(4): 178-228). 예를 들어, HLA-A33을 위해, N-말단으로부터 두 번째 아미노산으로 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 및 발린이, C-말단 아미노산으로 아르기닌 및 리신이, HLA-A33에 대한 높은 결합친화력을 가진 앵커 잔기라는 것이 알려져 있다(Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302).
더 나이가, HLA-A33에서, N-말단으로부터 첫 번째 아미노산 잔기도 앵커 잔기로써 기능하는 것이 알려져 있고; N-말단으로부터 첫 번째 아미노산으로써 아스파라긴산 및 글루탐산이 바람직하다는 것이 알려져 있다(Falk, et al., Immunogenetics 1994, 40: 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302). 그러므로, HLA-A33 결합친화력을 유지 또는 강화시키기 위해, N-말단으로부터 첫 번째 아미노산을 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환하는 것, N-말단으로부터 두 번째 아미노산을 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환하는 것, 및/또는 C-말단 아미노산을 아르기닌 또는 리신으로 치환하는 것이 이상적이라는 가능성이 있다.
따라서, 서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중에서 선택되는 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되어 있고, N 말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환되어 있고, 및/또는 C-말단의 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환된어 있는, 아미노산 서열을 포함하는 CTL 유도능을 갖는 펩티드는 본 발명의 펩티드에 포함된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되어 있고; N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환되어 있고; 및/또는 C-말단의 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환되어 있는, 아미노산 서열로 구성된 CTL-유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다.
즉, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 대하여, 하기의 (a) 내지 (c) 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CTL-유도능력을 갖는 펩티드를 포함한다:
(a) N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환됨;
(b) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환됨;
(c) C-말단의 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환됨.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 대하여, 상기 (a) 내지 (c) 중 선택되는 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열로 구성되는, CTL-유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 치환의 수는 상기 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환이다.
또한, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 있어서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환, 및/또는 C-말단 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환된, 아미노산 서열을 포함하는 CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 있어서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환, 및/또는 C-말단 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 하기의 (a) 및 (b)로부터 선택된 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다:
(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린으로 치환됨;
(b) C-말단 아미노산이 아르기닌 또는 리신으로 치환됨.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 선택되는 아미노산 서열에 대하여, 상기 (a) 및 (b) 중 선택된 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열로 이루어진, CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 더 바람직한 실시예에서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌 또는 타이로신으로 치환된다.
HLA-A01에서, N-말단으로부터 세 번째 아미노산으로써 아스파라긴산 및 글루탐산이, C-말단 아미노산으로써 타이로신이, HLA-A01에 대해 결합친화력이 높은 앵커 잔기로 알려져 있다. 더 나아가, HLA-A01에서, N-말단으로부터 두 번째 위치에 보조 앵커 잔기가 있으며, N-말단으로부터 두 번째 아미노산으로써 트레오닌 및 세린이 바람직하다는 것이 알려져 있다(Kubo, R.T Journal of Immunology 1994, 152: 3913; Gambacorti-Passerini, C. Clinical Cancer Research 1997, 3: 675-83; Falk, K. Immunogenetics 1994, 40: 238-41).
그러므로, HLA-A01-결합친화력을 유지 또는 강화하기 위해, N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로, 및/또는 C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환되는 것이 이상적이라는 가능성이 있다. 다른 가능성은 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환되는 것이 이상적이다. 그러므로, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환되고, N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되며, 및/또는 C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 CTL 유도능력을 갖는 펩티드가 본 발명의 펩티드로 포함된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환되고, N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되며 및/또는 C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다.
즉, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택된 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a) 내지 (c)로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도능력을 갖는 펩티드를 포함한다:
(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환됨;
(b) N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환됨; 및
(c) C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환됨.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 상기 (a) 내지 (c)로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열로 구성되는, CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 치환의 갯수는 상기 (a) 내지 (c) 중으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 치환이다.
또한, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택된 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되고, 및/또는 C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택된 아미노산 서열에 N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환되고, 및/또는 C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a) 및 (b)로 부터 선택된 하나 또는 그 이상이 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도능력을 갖는 페ㅂ티드일 수 있다:
(a) N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산으로 치환됨; 및
(b) C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환됨.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열에 있어서, 상기(a) 내지 (b) 중으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열로 구성되는, CTL 유도능력을 갖는 펩티드일 수 있다.
치환(들)은 앵커 부위(들)뿐만 아니라, 펩티드의 잠재적인 T 세포 수용체(TCR)인식 부위(들)의 위치(들)에서 아미노산(들)이 도입될 것이다. 몇몇 연구는 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217)과 같은 아미노산 치환을 갖는 펩티드가 원래의 펩티드와 같거나 더 나은 활성을 가질 수도 있음을 증명하였다(Zaremba et al. Cancer Res. 1997, 57, 4570-4577; T. K. Hoffmann et al. J Immunol. 2002, 168(3): 1338-47.; S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. 2003, 52: 199-206; and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy 2004, 53, 307-14).
본 발명은 또한 하나, 본 발명의 펩티드(예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드)의 N-말단 및/또는 C-말단에, 1개, 2개 또는 복수의 아미노산을 부가할 수 있음을 도모한다. 즉, 본 발명은, 각 서열번호에 의해 참조되는 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단 중 하나, 또는 양 쪽에 1개, 2개 또는 복수개의 아미노산을 부가한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다. CTL-유도능력을 보유하는 이러한 변형 펩티드 또한 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 서열번호 2 또는 56으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개, 2개 또는 복수개의 아미노산을 부가한 펩티드는, APC(들)에 접촉시키면, APC(들)에 합병되어 프로레싱을 받아, 서열번호 2 또는 56으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드가 된다. 그 이후, 항원 제시 경로를 거쳐 APC의 세포 표면에 제시됨으로써 CTL을 유도할 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드는 N-말단 및 C-말단의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 1개, 2개 또는 복수개의 아미노산이 추가된 펩티드일 수 있다.
게다가, 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 각 서열번호에 의해 참조되는 아미노산 서열 중 1개, 2개 또는 복수개의 아미노산의 치환을 포함하고, 해당 치환 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단 중 어느 하나, 또는 양 쪽에 1개, 2개 또는 복수개의 아미노산을 부가한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 아미노산의 치환을 포함하는 경우, 바람직한 치환 부위는, 예를 들어 본 발명의 펩티드 중에 포함되어 있는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46에 의해 참조되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째, N 말단으로부터 2번째, 및 C 말단으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개일 수 있다. 또는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61에 의해 참조되는 아미노산 서열 중, N 말단에서 2번째, N 말단에서 3번째 및 C 말단에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개일 수 있다.
그러나, 펩티드의 아미노산 서열이 다른 기능을 갖는 내생의 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 일부와 동일할 때, 자가면역 장애 및/또는 특이적 물질에 대한 알러지 증상들과 같은 부작용이 유도될 것이다. 그러므로, 펩티드의 아미노산 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 유사한 상황을 피하기 위해 사용 가능한 데이터베이스를 사용하여 상동성 조사(homology search)를 수행하는 것이 바람직하다. 상동성 조사에서 대상의 펩티드와 비교하여 적게는 1 또는 2개의 아미노산 차이를 갖는 펩티드가 존재하지 않는 것이 확실해지면, 상기 대상의 펩티드는 이와 같은 부작용의 위험 없이 HLA 항원과의 결합친화력 증강 및/또는 이의 CTL-유도능력을 증강시키기 위해 변형될 수 있다
본 발명의 펩티드의 하나, 둘 또는 몇몇의 아미노산이 변형된 펩티드는 원래의 펩티드의 CTL-유도능력을 유지할 수 있을 것으로 예상된다; 그러나, 상기 변형된 펩티드의 CTL-유도능력을 증명하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, "CTL-유도능력(CTL 유도능)을 가진 펩티드"는 펩티드로 자극된 APC를 통해 CTL을 유도하는 펩티드를 의미한다. "CTL 유도(CTL induction)"는 CTL로의 분화 유도, CTL 활성의 유도, CTL 증식 유도, CTL의 세포독성 유도, CTL-매개의 표적 세포 분해 유도 및 CTL의 IFN-감마 생산의 증가 유도를 포함한다.
CTL-유도능력의 확인은, 목적의 HLA 항원을 발현하는 APC(예를 들어, B 림포싸이트, 대식세포 또는 수지상세포)을 펩티드로 자극한 후, CD8-양성 T 세포와 혼합하고, 그 후에 표적 세포에 대하여 CTL에 의한 IFN-감마 방출을 측정함으로서 수행할 수 있다. 바람직하게, APC는 인간 말초 혈액 단핵구 유래 수지상세포(mononuclear leukocyte-derived dendritic cell)를 사용할 수 있다. 반응 시스템으로서, HLA 항원을 발현하도록 만들어진 형질전환동물이 사용될 수 있다. 다른 방법으로는, 예를 들어, 표적 세포는 51Cr 또는 이와 같은 것으로 방사성-표지될 것이고, 펩티드-유도된 CTL의 세포독성은 표적 세포로부터 방출되는 방사능으로부터 계산될 것이다. 다른 방법으로는, 펩티드-자극된 APC의 존재하에서, CTL에 의해서 생산 및 방출된 IFN-감마를 측정 및 항-IFN-감마 단일클론 항체를 사용하여 배지 위에서 억제 구역(inhibition zone)을 시각화함으로써 CTL-유도능력을 평가하는 것이 가능하다.
상기 변형에 더하여, 본 발명의 펩티드는 결과물인 연결된 펩티드가 CTL-유도능력을 유지하는 한, 다른 펩티드와 연결될 수 있다. 본 발명의 펩티드와 연결되는 적절한 펩티드의 예는 다른 TAA에서 유래하는 CTL-유도 펩티드를 들 수있다. 더 나아가, 본 발명의 펩티드는 또한 서로 연결될 수 있다. 펩티드의 연결에 사용되는 적절한 링커들은 당업계에 잘 알려져 있는 링커, 예를 들어, AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(서열번호: 62)(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-15), 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-6, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-15)가 사용될 수 있다. 펩티드는 다양한 배열(예를 들면, 사슬형, 반복적 등)로 연결될 수 있으며, 셋 또는 그 이상의 펩티드도 연결될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 결과물인 연결된 펩티드가 CTL-유도능력을 유지하는 한, 다른 물질에 연결될 수 있다. 본 발명의 펩티드와 연결되는 적절한 물질의 예로는, 예를 들면, 펩티드, 지질, 당 또는 당 체인(sugar chain), 아세틸 그룹 및 자연적으로 발생하는 또는 합성의 폴리머를 포함한다. 본 발명의 펩티드는 그 들의 CTL-유도능력이 손상되지 않는 한, 당화(glycosylation), 측쇄 산화(side-chain oxidation), 인산화 등에 의해 변형될 수 있다. 추가의 기능(예를 들면, 표적기능 및 전달 기능)을 부여하기 위해 또는 펩티드를 안정화시키기 위해 이와 같은 타입의 변형이 또한 수행될 수 있다.
예를 들어, 펩티드의 생체 내의 안정성을 증가시키기 위해, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 모방물, 또는 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 도입하는 것이 알려져 있으며, 이 개념은 본 발명의 펩티드에도 적용될 것이다. 펩티드 안정성은 몇 가지 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 안정성은 펩티데이즈(peptidase)는 물론 사람 혈장 및 혈청(serum)과 같은 다양한 생물학적 배지를 사용하여 시험될 수 있다(예를 들어, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).
더 나아가, 상기에 언급한 바와 같이, 하나, 둘 또는 몇몇의 아미노산 잔기들이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 추가된 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 같거나 또는 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 스크리닝 또는 선별할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 펩티드와 같거나 또는 더 높은 활성을 가진 변형된 펩티드를 스크리닝 또는 선별하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 펩티드를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 원래의 아미노산 서열에 하나, 둘, 또는 몇몇의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열로 구성된 후보 서열을 생성하는 단계;
(b) (a)에서 생성된 후보 서열로부터, FOXM1 이외의 다른 인간의 유전자 산물과 유의적인 상동성(서열 동일성)을 갖지 않는 후보 서열을 선택하는 단계;
(c) (b)에서 선택된 후보 서열로 구성된 펩티드를 APC와 접촉시키는 단계;
(d) (c)의 APC를 CD8-양성 T 세포와 접촉시키는 단계; 및
(e) 원래의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 같거나 또는 더 높은 CTL-유도능력을 갖는 펩티드를 선별하는 단계.
본 명세서에서, 본 발명의 펩티드는 또한 "FOXM1 펩티드(들)"라고도 기재된다.
III. 본 발명의 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드를 제조하기 위하여 잘 알려진 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성이 본 발명의 펩티드 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 둘 또는 그 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 숙주 세포 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 숙주세포에서 생산된 후 또는 화학적으로 합성된 후에 생긴 합성 반응 산물로부터 분리될 수 있다. 즉 본 발명의 펩티드는 다른 숙주세포의 단백질이나 이의 단편 또는 다른 화학물질을 주로 포함하지 않도록 하기 위해 정제 또는 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 당화, 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형을 포함할 것이다. 다른 예시적인 변형은, 예를 들면, 펩티드의 혈청 내 반감기를 증가시키기 위해 사용되는 D-아미노산 또는 다른 아미노산 유사물의 합병이 포함된다.
본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열에 근거하여 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 종래의 펩티드 합성 방법의 예에는 하기를 포함하는 자료에 서술된 방법이 포함된다:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) "Peptide Synthesis" (in Japanese), Maruzen Co., 1975;
(iv) "Basics and Experiment of Peptide Synthesis" (in Japanese), Maruzen Co., 1985;
(v) "Development of Pharmaceuticals" (in Japanese), Continued Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
(vi) WO99/67288;
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-118
다른 한편으로는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 조작 방법을 사용하여 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Cu). 예를 들면, 먼저, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고(예로, 프로모터 서열에 해당하는 조절서열의 아래쪽), 적절한 숙주 세포에 형질전환시킨다. 그 후 본 발명의 펩티드가 생산되도록 상기 숙주세포를 배양한다. 또한, 본 발명의 펩티드는 시험관 내 번역 시스템을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수도 있다.
IV. 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 여기에는 자연적으로 발생하는 FOXM1 유전자(예를 들어, GenBank Accession No. NM_202003(서열번호: 52), NM_001243088(서열번호: 54), NM_001243089(서열번호: 56), NM_021953(서열번호: 58) 또는 NM202002(서열번호: 60)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것도 포함된다. 본 명세서에서 사용된 구절, "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열(conservatively modified nucleotide sequence)"은 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 의미한다. 유전자 코드(genetic code)의 변성(degeneracy) 때문에, 기능적으로 동일한 많은 수의 핵산이 어느 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 그러므로, 코돈에 의해 알라닌이 특정된 모든 위치에서 코돈은 코딩하는 폴리펩티드를 변경시키지 않고 상기에 서술된 상응하는 코돈의 어느 것으로 변형될 수 있다. 이와 같은 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variations)"라 하고, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 한 펩티드를 코딩하는 본 명세서의 모든 핵산 서열들은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 "침묵 변이"를 서술한다. 당업계의 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외하고)은 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 공개된 각 서열에 암시적으로 서술된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 이의 유도체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되며, RNA에서 T는 U로 치환된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 중간에 아미노산 서열 개입(intervening) 유무를 불문하고 본 발명의 펩티드를 포함하는 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개입 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더 나아가, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 코딩 서열에 어떤 추가의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 펩티드를 발현하기 위해 요구되는 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 또는 마커 유전자 등을 가진 발현 벡터(예를 들어, 플라즈미드)일 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 중합효소 및 엔도뉴클레이즈(endonucleases)를 사용하는 전형적인 재조합 기술을 통하여 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조될 수 있다.
재조합 기술 및 화학적 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 다른 한편으로는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참조). 다른 한편으로는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 서술된 바와 같이 고체상 기술(solid phase techniques)을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 이렇게 하여 얻은 수 있는 복수의 펩티드의 결합물은, 필요에 따라 정제되어 연결된 상태로 투여하는 것이 가능하다. 이 경우, 연결된 펩티드는 처리(processing)에 의해 항원제시가능한 펩티드를 생산하고, 각 펩티드의 CTL 유도작용이 유도된다. 따라서, 펩티드를 연결하는 경우에는, HLA 구속성(restriction)에 따라 펩티드를 조합하는 것이 바람직하다. 또는 연결부분을 절단하여 개별 펩티드의 혼합물로 투여할 수 있다.
V. 엑소좀
본 발명은 더 나아가, 엑소좀이라고 언급되는 세포내 소포체를 제공하고, 상기 소포체는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 표면에 제시한다. 엑소좀은 예를 들어, JPH11-510507 및 WO99/03499에 서술된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 또한 치료 및/또는 예방(방지)의 대상인 환자로부터 수득된 APC를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 본 발명의 펩티드와 유사한 방식으로 백신으로서 접종될 수 있다.
상기 복합체에 포함되어 있는 HLA 항원의 타입은 치료 및/또는 예방(방지)을 필요로 하는 대상의 것과 일치되어야 한다. 예를 들어, HLA-A33(예를 들면, HLA-A*33:03)은 아시아인에서 널리 일반적으로 보여지는 대립 형질이고, 이 HLA 항원 타입이 아시아인 환자의 치료에 적합하다고 간주된다. 더 나아가, HLA-A01(예를 들면, HLA-A*01:01)은 백인에 고빈도로 인정되는 HLA 대립 형질이고, 이 HLA 항원 타입이 백인 환자의 치료에 적합하다고 간주된다. 임상 실험에서는 전형적으로, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원 타입을 미리 조사하여 특이적인 HLA 항원을 위한 높은 수준의 결합친화력을 갖거나, 특이적인 HLA 항원에 의해 매개되는 항원 제시에 의해 CTL-유도능력이 있는 적절한 펩티드를 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 엑소좀은 본 발명의 펩티드와 HLA-A33 또는 HLA-A01과의 복합체를 이의 표면에 제시한다. 본 발명의 펩티드와 복합체를 형성하는 HLA가 HLA-A33일 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이며, 더 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 그의 변형 펩티드이다.
또한, 본 발명의 펩티드와 복합체를 형성하는 HLA가 HLA-A01일 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이며, 더 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이다.
VI. 항원-제시 세포(APC)
본 발명은 더 나아가, HLA 항원 및 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 이의 표면에 제시하는 APC를 제공한다. 다른 한편으로는, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 이의 표면에 갖는 APC를 제공한다. 본 발명의 APC는 분리된 APC일 수 있다. 세포(APC, CTL, 등)의 맥락에서 사용되었을 때, 용어 "분리된(isolated)"은 세포의 다른 타입으로부터 구별된 세포를 의미한다. 본 발명의 APC는 치료 및/또는 예방(방지)의 대상인 환자로부터 유래된 APC로부터 유도된 APC일 것이고, 그 자체로 또는 펩티드(들), 엑소좀(들) 또는 CTL(들)을 포함하는 다른 약물들과 병용하여 백신으로서 투여될 수 있다.
본 발명의 APC는 특정한 타입의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되도록 자신의 세포 표면상에 단백질성 항원을 제시하는 것으로 알려진 세포, 예를 들어 수지상세포(dendritic cells: DCs), 랑게르한스세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포 등이 가능하다. DC가 APC 중에서 CTL-유도능력이 가장 강력한 APC를 대표함으로써, DC는 본 발명의 APC로서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명에서, 바람직한 DC는 인간으로부터 유래된 분리된 DC이다. 더 나아가, 본 발명의 APC는 항원-제시 기능을 갖는 여러 타입의 세포 혼합물일 수도 있으며, 본 발명의 다양한 타입의 펩티드를 각각 제시하는 APC의 혼합물일 될 수도 있다.
예를 들어, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로부터 DC를 분리하고, 이어서 시험관 내에서(in vitro), 생체 밖에서(ex vivo) 또는 생체 내에서(in vivo)에서 본 발명의 펩티드로 자극함으로써 본 발명의 APC를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드가 대상에게 투여될 때, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC가 그 대상의 체내에서 유도된다. 그러므로, 본 발명의 펩티드가 대상에게 투여된 후, 본 발명의 APC는 상기 대상으로부터 수집하여 얻을 수 있다. 다른 한편으로는, 본 발명의 APC는 대상으로부터 수집된 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시켜 얻을 수 있다.
대상에서 FOXM1-발현 암 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해, 본 발명의 APC는 대상에게 단독으로 또는 본 발명의 펩티드(들), 엑소좀(들), 또는 CTL(들)을 포함하는 다른 약물들과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 밖의 투여는 하기의 단계를 포함 할 수 있다:
(a) 첫 번째 대상으로부터 APC를 수집하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 APC를 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 APC를 두 번째 대상에게 투여하는 단계.
첫 번째 대상 및 두 번째 대상은 같은 개인 또는 다른 개인일 수 있다. 첫 번째 대상 및 두 번째 대상이 다른 개인일 때, 첫 번째 대상 및 두 번째 대상의 HLA는 같은 타입인 것이 바람직하다. 상기 단계 (b)에서 얻은 APC는 암의 치료 및/또는 예방(방지)를 위한 백신일 수 있다.
상기 서술된 바와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 APC는 CTL-유도능력을 갖는다. APC(들)의 맥락에서 사용된 용어, "CTL-유도능력(CTL-유도능)"은 APC가 CD8-양성 T 세포(들)과 접촉된 곳에서 CTL(들)을 유도할 수 있는 APC의 능력을 의미한다. 더 나아가, "CTL-유도능력(CTL-유도능)"은 CTL 활성화를 유도하기 위한 APC의 능력, CTL 증식을 유도하기 위한 APC의 능력, CTL-매개된 표적 세포의 분해를 촉진하는 APC의 능력 및 CTL-매개된 IFN-감마 생산을 증가시키기 위한 APC의 능력을 포함한다. 본 발명의 APC에 의해 유도되는 CTL(들)은 FOXM1에 특이적이며, FOXM1-발현 세포에 대해 특이적인 세포독성을 보여준다.
상기-서술된 방법에 추가하여, 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 APC에 도입하여 제조할 수 있다. 도입될 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 도입 방법은, 특별히 제한 없이 예를 들면, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation) 및 칼슘포스페이트(calcium phosphate) 방법과 같이 본 기술분야에서 종래부터 실시되고 있는 다양한 방법을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72및 JP2000-509281에 서술된 바와 같은 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입함으로써, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 전사 및 번역되고, MHC 종류 I에 의해 처리되며 제시 경로를 통해 APC의 세포 표면에 본 발명의 펩티드가 제시된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드 및 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 또는 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01)의 사이에서 형성된 복합체를 이의 세포 표면에 제시한다. 본 발명의 펩티드와 복합체를 형성하는 HLA가 HLA-A33일 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이고, 더 바람직하게는 상기 펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다. 본 발명의 펩티드와 복합체를 형성하는 HLA가 HLA-A33일 때, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이고, 더 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다.
또한, 본 발명의 APC(들)는 바람직하게는 하기 (a) 또는 (b)에 서술된 단계를 포함하는 방법으로 유도되는 APC(들)이다:
(a) HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 및 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01) 중으로부터 선택된 적어도 하나의 HLA를 발현하는 APC(들)를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 또는
(b) HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 및 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01) 중으로부터 선택된 적어도 하나의 HLA를 발현하는 APC(들)에 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계.
HLA-A33-발현하는 APC(들)와 접촉되기 위한 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이며, 더 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
HLA-A01를 발현하는, APC(들)와 접촉시키는 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형 펩티드이고, 더 바람직하게는 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드이다.
또한, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 APC(들)를 유도하는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 APC(들)를 유도하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 공정을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 APC(들)를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.
VII. 세포독성 T 림포싸이트(CTL)
본 발명의 펩티드로 유도된 CTL은 인비보에서 FOXM1-발현하는 암세포를 타겟으로 하는 면역반응을 강화시키기 위해 본 발명의 펩티드와 유사한 방식으로 백신으로서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 펩티드로 유도 또는 활성화되는 CTL을 제공한다. 본 발명의 CTL은 본 발명의 펩티드를 타겟으로 하며, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체에 결합할 수 있다. 복합체에의 CTL의 결합은 CTL의 세포 표면에 제시되는 T 세포 수용체(T cell receptor (TCR))를 통해 매개된다. 본 발명의 CTL은 분리된 CTL일 수 있다. 바람직한 CTL은 인간에게서 기원한 분리된 CTL이다. 본 발명의 CTL은 각기 다른 본 발명의 펩티드를 타겟으로 하는 CTL의 혼합물일 수도 있다.
본 발명의 CTL은 (1) 본 발명의 펩티드를 대상에 투여하는 단계, (2) 상기 대상으로부터 유래된 APC 및 CD8-양성 T 세포, 또는 말초 핵 단핵세포(PBMC)를 본 발명의 펩티드와 시험관 내에서 자극하는 단계, (3) 시험관 내에서 CD8-양성 T 세포 또는 PBMC를 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소좀과 접촉시키는 단계, 또는 (4) CD8-양성 T 세포에 HLA 항원을 통해 세포 표면에 제시된 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 백터를 도입하는 단계를 통해 수득될 수 있다. 상기 단계 (2) 또는 (3)의 방법에 사용된 엑소좀 및 APC는 "V. 엑소좀" 및 "VI. 항원-제시 세포" 부분에서 서술된 방법으로 각각 제조될 수 있고, 상기 단계 (4)의 방법의 상세한 것은 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에서 서술될 것이다.
본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방(방지)를 위해 대상인 환자에게 단독으로, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드(들), APC(들), 또는 엑소좀(들)을 포함하는 다른 약물들과 병용하여 투여될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 CTL은 CTL를 투여받는 대상이 되는 환자로부터 유래된 CD8-양성 T 세포로부터 유도된 CTL일 수 있다. 본 발명의 CTL은 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 본 발명의 CTL을 유도하는데 사용된 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 특이적으로 작용한다. 표적 세포는 암세포와 같이 내인적으로 FOXM1를 발현하는 세포, 또는 FOXM1 유전자로 형질감염된 세포일 것이다. 펩티드에 의해 자극되어 이들 세포 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 세포는 본 발명의 CTL에 의한 공격의 타겟이 될 수 있다. 본 발명의 CTL의 타겟이 되는 세포는 바람직하게는 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 및 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01)의 적어도 하나에 양성인 세포이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 CTL은 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 및 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01) 중으로부터 선택된 적어도 하나의 HLA 및 FOXM1를 모두 발현하는 세포를 특이적으로 타겟한다. 본 발명에서, CTL에 의해 타겟되는 세포는 동형접합체적으로 또는 이형접합체적으로 HLA-A33 및 HLA-A01의 대립형질의 어느것을 가진 세포일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 CTL이 세포를 "타겟한다(target)"는 이의 세포 표면에 HLA 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 세포의 CTL 인식 및 세포에 대해 세포독성을 보여주는 것을 의미한다. 더 나아가, "특이적으로 타겟한다(specifically target)"는 CTL이 다른 세포에는 손상 활성을 보이지 않고 이들 세포에만 세포독성을 보여주는 것을 의미한다. CTL의 맥락에서 사용된 표현, "세포를 인식한다(recognize cell)"은 TCR을 통해 세포 표면에 제시된 HLA 및 본 발명의 펩티드의 복합체에 결합하고, 상기 세포에 대해 특이적인 세포독성을 보여주는 것을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 CTL은 바람직하게는 본 발명의 펩티드 및 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 또는 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01) 사이에 형성된 복합체에 TCR를 통해 결합할 수 있는 CTL이다.
더 나아가, 본 발명의 CTL은 바람직하게는 하기 (a) 또는 (b)에 서술된 단계를 포함하는 방법으로 유도되는 CTL이다:
(a) 시험관 내에서 CD8-양성 T 세포를 그들의 표면에 본 발명의 펩티드와 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 또는 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01)과의 복합체를 제시하는 APC 또는 엑소좀과 접촉시키는 단계; 또는
(b) CD8-양성 T 세포에 HLA-A33(좀더 바람직하게는 HLA-A*33:03) 또는 HLA-A01(좀더 바람직하게는 HLA-A*01:01)에 의해 세포 표면에 제시되는 본 발명의 펩티드와 결합할 수 있는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계. 상기 방법에 의해 유도된 CTL은, 유도에 이용된 HLA 항원과 펩티드의 복합체를 특이적으로 인식하는 TCR을 갖춘 세포이다. 따라서, TCR의 구조의 차이에 따라 반응 특이성이 상이한 다른 CTL과 구조적인 차이를 갖는 세포이다.
VIII. T 세포 수용체(TCR)
본 발명은 또한 HLA 항원에 의해 세포 표면에 제시되는 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 CD8-양성 T 세포표면상에, HLA 항원에 의해 표적 세포 표면에 제시되는 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 TCR의 발현을 통해 FOXM1-발현하는 암세포에 대한 특이성을 부여한다. 알파 체인(들) 및 베타 체인(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003))을 사용하여 본 발명의 펩티드에 의해 유도되는 CTL의 TCR 서브유닛으로서 동정될 수 있다. 예를 들어, PCR 방법은 TCR 분석을 위해 바람직하다. 이에 제한되지 않고, 분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 하기의 5'측 프라이머 및 3'측 프라이머(들)를 혼합에 의한 증폭을 위한 프라이머(들)일 것이다:
5'측 프라이머:
5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열번호: 62)
3'측 프라이머:
TCR-알파-체인 C-영역-특이적
3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열번호: 63)
TCR-베타-체인 C1-영역-특이적
3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열번호: 64) 또는
TCR-베타-체인-C2-영역-특이적
3-TR-베타-C2 프라이머(5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열번호: 65)
동정된 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성 T 세포에 도입시켜 형성된 TCR은 본 발명의 펩티드는 제시하는 표적 세포에 높은 결합친화력으로 결합할 수 있고, 생체 내 및 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적 세포를 효과적으로 죽이는 것을 매개한다.
각 TCR 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에 병합시킬 수 있다. 이들 벡터들은 당업계에 잘 알려져 있다. 이의 발현가능한 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 CD8-양성 T 세포, 예를 들어, 환자로부터 유래된 CD8-양성 T 세포에 도입될 수 있다. 본 발명은 환자 자신의 T 세포(또는 다른 대상으로부터 유래된 T 세포)의 빠른 변형에 의해 월등한 암 세포-살해 특성을 갖는 변형된 T 세포의 빠르고 쉬운 생산을 가능하게 하는 재고(off-the-shelf) 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 특이적인 TCR은, TCR이 CD8-양성 T 세포의 표면에 제시될 때, 표적 세포 표면에 제시되는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 특이적으로 인식하여 표적 세포에 대한 특이적인 세포독성을 부여할 수 있는 TCR이다. 상기-서술된 복합체의 특이적인 인식은 알려진 어느 방법으로도 확인될 수 있으며, 이의 바람직한 예에는 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 사용한 HLA 다합체(multimer) 염색분석 및 ELISPOT 어세이 방법을 포함한다. 상기-서술된 폴리뉴클레오티드가 도입된 T 세포에 의해 표적 세포의 특이적인 TCR-매개 인식 및 상기 세포 내에서의 신호전달은 ELISPOT 어세이를 수행하여 확인될 수 있다. 상기-서술된 TCR이 CD8-양성 T 세포의 표면에 제시될 때, TCR이 CD8-양성 T 세포에 대한 표적 세포-특적인 세포독성을 부여하는지 여부 또한 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다. 바람직한 방법에는, 예를 들어, 크롬(chrome) 방출 어세이 등과 같은 방법으로 표적 세포에 대한 세포독성을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명은 HLA-A33과 관련하여, 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 HLA-A33 항원에 의해 구성된 복합체에 결합하는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 CD8-양성 T 세포를 형질전환하여 제조된 CTL을 제공한다.
본 발명은 HLA-A01과 관련하여, 예를 들어, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 HLA-A01 항원에 의해 구성된 복합체에 결합하는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 CD8-양성 T 세포를 형질전환하여 제조된 CTL을 제공한다.
형질전환된 CTL은 생체 내에서 귀소(horming; 림프구의 혈액에서 림프 조직으로 이행)할 수 있으며, 잘 알려진 시험관 내 배양 방법(예를 들어, Kawakami et al., J Immunol 1989, 142:3252-61)으로 증식될 수 있다. 본 발명의 CTL은 치료 또는 예방(방지)을 필요로 하는 환자에서 그 질병의 치료 또는 예방(방지)을 위해 유용한 면역학적 조성물을 형성하기 위해 사용될 수 있다(본 명세서에 참조로 포함되어 있는 콘텐츠인 WO2006/031221 참조).
IX. 약학적 조성물
본 발명은 더 나아가 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효성분을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능 한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 APC;
(d) 본 발명의 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL .
본 발명의 약학적 조성물은 상기 서술된 유효성분(들)에 추가하여 담체(들), 부형제(들) 또는 특별히 제한없이 약학에서 일반적으로 사용되는 것을 필요에 따라 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체의 예로는 멸균수, 생리식염수, 인산버퍼, 배양액 등이 포함된다. 그러므로, 본 발명은 또한 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택된 적어도 하나의 유효성분 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능 한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 APC;
(d) 본 발명의 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL .
더 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라 안정제, 현탁제, 방부제, 계면활성제, 용해제, pH 조절제, 응집억제제 등을 포함할 수 있다.
정상 조직에 비해 암 세포에서는 FOXM1 발현이 유의적으로 상승조절 되어있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 암을 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하기 위해, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 타입의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그 대신에, 본 발명의 펩티드는 약학적 조성물로서 사용되기 위해 엑소좀 또는 APC의 표면에 제시되도록 만들어질 수 있다. 추가로, 본 발명의 펩티드 중 어느 하나를 타겟팅하는 본 발명의 CTL은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분으로서 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 서술된 유효성분의 치료적으로 효과적인 양 또는 약학적으로 효과적인 양을 포함할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 상기 용어, "백신(vaccine)"("면역학적 조성물(immunogenic composition)"로도 불림)은 동물에게 접종되었을 때 항종양 활성을 이끄는 면역반응을 유도하는 기능을 갖는 조성물을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 대상에 있어서 항종양 활성을 이끄는 면역반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, CTL 및 약학적 조성물에 의해 유도되는 면역반응은 항종양 활성으로 이끄는 면역반응이라면 특별히 제한되지는 않으며, 그 예로는 암 세포 특이적 CTL의 유도 및 암 세포 특이적 세포독성의 유도를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간인 대상 또는 환자에서 암을 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 HLA-A33 및 HLA-A01 중으로부터 선택된 적어도 하나의 HLA에 양성인 대상에게 바람직하게 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 HLA-A33 및 HLA-A01 중으로부터 선택된 적어도 하나의 HLA 및 FOXM1를 발현하는 암을 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하기 위해 바람직하게 사용될 수 있다.
다른 실시예에서는, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서 하기로부터 선택된 유효성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드가 발현 가능한 형태로 코딩된 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 하기로부터 선택된 유효성분을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드가 발현 가능한 형태로 코딩된 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효성분을 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드가 발현 가능한 형태로 코딩된 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 실시예에서는, 본 발명은 더 나아가 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 하기로부터 선택된 하나의 유효성분을 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드가 발현 가능한 형태로 코딩된 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 실시예에서는, 본 발명은 더 나아가 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 유효성분을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드가 발현 가능한 형태로 코딩된 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
본 발명에서, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A33-구속성 에피톱 펩티드로서 동정되었다. 그러므로, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 HLA 항원으로서 HLA-A33(예를 들어, HLA-A*33:03)을 갖는 대상에게 투여되기에 특히 적절하다. 동일하게 이들 펩티드의 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드), 이들 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소좀(즉, 본 발명의 APC 또는 엑소좀), 또는 이들 펩티드를 타겟하는 CTL(즉, 본 발명의 CTL)을 포함하는 약학적 조성물에도 적용된다. 즉, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 연관된 유효성분을 포함하는 약학적 조성물이 HLA-A33(즉, HLA-A33-양성 대상자)를 갖는 대상에게 투여되기에 적절하다. 더 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물이다.
마찬가지로, 본 발명에 있어서 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A01-구속성 에피톱 펩티드로서 동정되었다. 그러므로, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은, HLA 항원으로써 HLA-A01(예를 들어, HLA-A*01:01)을 갖는 대상에의 투여에 특히 적절하다. 동일하게 이들 펩티드의 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드), 이들 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소좀(즉, 본 발명의 APC 또는 엑소좀), 또는 이들 펩티드를 타겟하는 CTL(즉, 본 발명의 CTL)을 포함하는 약학적 조성물에도 적용된다. 즉, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 연관된 유효성분을 포함하는 약학적 조성물이 HLA-A01을 갖는 대상(즉, HLA-A01-양성 대상자)에게 투여되기에 적절하다. 더 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 약학적 조성물로 치료 및/또는 예방될 수 있는 암은 FOXM1을 발현하는 암이면 특별히 제한되지 않으며, 각종 암, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등을 포함한다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은, HLA-A33 및 HLA-A01 중으로부터 선택된 HLA 대립형질을 동형접합체로 또는 이형접합체로 갖는 대상에 사용하는 것이 바람직하다.
상기 서술된 유효성분에 추가하여, 본 발명의 약학적 조성물은 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 갖는 다른 펩티드(예를 들어, 다른 TAA-유래의 CTL-유도 펩티드), 다른 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포, 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드와 같은 상기 서술된 유효성분의 항-종양 효과를 억제하지 않는 한, 다른 치료학적 물질을 유효성분으로 또한 선택적으로 포함할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 항-염증 조성물, 진통제, 화학요법치료제 등을 선택적으로 포함할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물에 다른 치료학적 물질을 포함하는 것에 추가로, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 조성물과 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 및 다른 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 사용되는 약학적 조성물의 타입 및 치료될 질병은 물론, 투여 스케줄 및 루트에 의존한다.
제형 타입의 고려에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 명세서에 특별히 언급된 유효성분에 추가하여 당업계에 알려진 전통적인 다른 성분도 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 제조물 또는 키트를 제공한다. 본 발명의 제조물 또는 키트는 본 발명의 약학적 조성물을 담는 용기를 포함할 수 있다. 적절한 용기의 예는 병, 바이알, 또는 시험관을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 만들어질 것이다. 라벨이 상기 용기에 붙여질 것이고, 본 발명의 약학적 조성물이 사용될 질병 또는 질병 상태가 라벨에 서술되는데 사용되어야 한다. 상기 라벨은 또한 투여법 등의 방향을 제시할 수 있다.
본 발명의 제조물 또는 키트는 본 발명의 약학적 조성물을 담는 용기에 추가하여, 약학적으로 허용가능한 희석제를 담는 제2의 용기를 선택적으로 더 나아가 포함할 것이다. 본 발명의 제조물 또는 키트는 더 나아가 상업적 관점 및 사용자의 견해에서 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘, 주사, 사용지시서가 있는 포장 삽입물 등과 같은 다른 이상적인 재료를 포함할 것이다.
필요에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어, 금속 호일 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 투여에 대한 지침이 상기 팩 또는 디스펜서 장치에 부착될 수 있다.
(1) 펩티드(들)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 필요에 따라 전통적인 제형 방법에 의해 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라 본 발명의 펩티드에 추가하여, 담체, 부형제 및 특별한 제한 없이 약학에서 일반적으로 사용되는 것을 포함할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체의 예는 멸균수(예를 들어, 주사를 위한 물), 생리식염수, 인산버퍼, 인산버퍼화된 식염수, 트리스버퍼화된 식염수, 0.3% 글라이신, 배양액 등을 포함한다. 더 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 필요에 따라 안정제, 현탁제, 방부제, 계면활성제, 용해제, pH 조절제, 응집 억제제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 FOXM1-발현 암 세포에 대한 특이적인 면역성을 유도할 수 있으며, 그러므로 암 치료 또는 예방(방지)의 목적을 위해 적용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균수(예를 들어, 주사를 위한 물), 생리식염수, 인산버퍼, 인산버퍼화된 식염수, 트리스버퍼화된 식염수와 같은 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 수용성 담체에 용해시키고, 필요에 따라 안정제, 현탁제, 방부제, 계면활성제, 용해제, pH 조절제, 응집 억제제 등을 첨가한 뒤, 펩티드 용액을 멸균시켜 제조될 수 있다. 상기 펩티드 용액을 멸균시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 여과 멸균으로 수행된다. 여과 멸균은, 예를 들어, 구멍 직경이 0.22 μm 또는 미만인 여과 멸균 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 여과 멸균된 펩티드 용액은, 예를 들어, 대상에 주사로서 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 서술된 펩티드 용액을 동결건조하여 동결건조 제형으로 제조될 것이다. 상기 동결건조 제형은 상기에 서술된 바와 같이 제조된 펩티드 용액을 여과하여 앰플, 바이알 또는 플라스틱 용기와 같이 절적한 용기에 넣고, 이어서 동결건조하고, 압력을 회복시킨 후 세척 멸균된 고무마개와 같은 것을 갖는 용기에 봉입된다. 상기 동결건조 제형은 투여되기 전에 멸균수(예를 들어, 주사를 위한 물), 생리식염수, 인산버퍼, 인산버퍼화된 식염수, 트리스버퍼화된 식염수와 같은 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 수용성 담체에 재-용해된 후 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 예는 여과 멸균된 펩티드 용액 및 펩티드 용액의 동결건조로 얻어진 동결건조 제형과 같은 주사를 포함한다. 본 발명은 더 나아가 상기 동결건조 제형 및 재-용해 용액을 포함하는 키트를 고려한다. 본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물인 동결건조 제형을 수용하는 용기 및 이의 재-용해 용액을 수용하는 용기를 포함하는 키트를 고려한다.
본 발명의 약학적 조성물은 두 개 또는 그 이상의 타입이 본 발명의 펩티드의 조합을 포함할 수 있다. 상기 펩티드의 조합은 혼합된 펩티드의 칵테일 형태일 수 있거나, 표준기술을 사용하여 각각 서로 접합될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 화학적으로 결합되거나 하나의 융합 폴리펩티드 서열로서 발현되게 할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 투여에 의해, 상기 펩티드는 고밀도로 HLA 항원에 의해 APC에 제시되고, 이어서 본 발명의 펩티드와 HLA 항원에 사이에 형성된 복합체에 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 다른 한편으로, 대상으로부터 APC(예를 들어, DC)를 제거하고, 이어서 이의 세포 표면에 본 발명의 어느 펩티드를 제시하는 APC를 얻기 위해 본 발명의 펩티드로 자극된다. 이들 APC는 대상에서 CTL을 유도하기 위해 상기 대상에게 재-투여되며, 그 결과, FOXM1-발현 암 세포를 향한 공격성이 증가될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 세포 면역성을 효과적으로 확립하기 위해 알려진 아쥬번트(adjuvant)를 포함할 것이다. 상기 아쥬번트는 항원과 함께(또는 이어서) 투여되었을 때, 면역학적인 활성을 갖는 항원에 대해 면역반응을 증강시키는 화합물을 의미한다. 문헌, 예를 들어, Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89에 서술된 잘 알려진 아쥬번트가 사용될 수 있다. 적절한 아쥬번트의 예는 알루미늄 염(알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 옥시하이드록사이드 등), 알룸(alum), 콜레라독소, 살모넬라독소, 불완전 프라운드 아쥬번트(Incomplete Freund's adjuvant (IFA)), 완전 프라운드 아쥬번트(Complete Freund's adjuvant (CFA)), ISCOMatrix, GM-CSF 및 다른 면역자극적인 사이토카인, CpG 모티브(CpG7909 등)를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드, 수중유 에멀전(oil-in-water emulsion), 사포닌 또는 이의 유도체(QS21 등), 지질 A 또는 이의 유도체(MPL, RC529, GLA, E6020 등)와 같은 리포폴리사카라이드, 리포펩티드, 락토페린(lactoferrin), 플라겔린(flagellin), 이중-나선 RNA 또는 이의 유도체(폴리 IC 등), 박테리아 DNA, 이미다조퀴놀린(Imiquimod, R848 등), C-타입 렉틴 리간드(트레할로스-6,6'-디베헤네이트(trehalose-6,6'-dibehenate (TDB) 등), CD1d 리간드(알파-갈라토실세라마이드 등), 스쿠알렌 에멀전(MF59, AS03, AF03 등) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 아쥬번트는 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 키트에 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물과는 별도의 다른 용기에 포장될 것이다. 이와 같은 경우, 상기 아쥬번트 및 약학적 조성물은 대상에게 연속적으로, 또는 대상에게 투여되기 바로 전에 섞어서 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 아쥬번트를 포함하는 이와 같은 키트가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 약학적 조성물이 동결건조 제형일 때, 상기 키트는 더 나아가, 재-용해 용액을 포함할 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 수용하는 용기 및 아쥬번트를 저장하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 더 나아가 필요에 따라 재-용해 용액을 저장하는 용기를 포함할 수 있다.
오일 아쥬번트가 아쥬번트로서 사용될 때, 본 발명의 약학적 조성물은 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 에멀젼은, 예를 들어, 상기 서술된 바와 같이 제조된 펩티드 용액 및 오일 아쥬번트와 혼합 및 교반하여 제조될 수 있다. 상기 펩티드 용액은 동결건조 후에 재-용해된 것일 수 있다. 에멀젼은 W/O-타입 에멀전 및 O/W-타입 중 하나일 것이고, W/O-타입 에멀젼이 높은 면역 반응 증강 효과를 얻기 위해 바람직하다. IFA가 오일 아쥬번트로서 바람직하게 사용될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 에멀젼의 제조는 대상에게 투여되기 바로 직전에 수행될 수 있으며, 이와 같은 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드 용액과 오일 아쥬번트를 포함하는 키트로서 제공될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 동결건조 제형일 때, 키트는 더 나아가 재-용해 용액을 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드를 안에 갖는 리포좀 제형일 것이고, 이는 본 발명의 펩티드가 직경이 몇 마이크로미터인 비드(bead)에 결합되거나, 리피드가 펩티드에 결합된 과립 제형일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 펩티드는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 또한 투여될 수 있다. 바람직한 염의 예는 알카리 금속(리티움, 포타슘, 소듐 등)의 염, 알카리-토금속(칼슘, 마그네슘 등)의 염, 다른 금속(구리, 철, 아연, 망간 등)의 염, 유기염기염, 아민염, 유기산(아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산 및 메탄설폰산 등)의 염 및 무기산(염산, 인산, 브롬화수소산, 황산 및 질산 등)의 염을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 구절 "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 화합물의 약리학적 및 약학적 효능 및 특성을 유지하는 염을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 펩티드의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물이 또한 본 발명에 포함된다. 더 나아가, "본 발명의 펩티드(peptide of the present invention)"는 유리된 펩티드(free peptide)에 추가로 이의 약학적으로 허용가능한 염 또한 고려된다.
어떤 실시예에서는, 본 발명의 약학적 조성물은 더 나아가 CTL을 준비하기 위한 성분을 포함할 것이다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에 대해 CTL을 초회감작(priming)시킬 수 있는 물질로서 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기는 라이신 잔기의 엡실론(epsilon)- 및 알파-아미노 그룹에 붙여질 수 있고, 그 후에 본 발명의 펩티드와 연결될 수 있다. 지질화 펩티드는 마이셀(micelle) 또는 입자안에 직접적으로, 리포좀에 통합되거나, 또는 아쥬번트에 에멀전화되어 투여될 수 있다. CTL 반응을 준비하기 위한 지질의 예는, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐-세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine (P3CSS))과 같은 대장균(E. coli) 지질단백질을 이용하여 CTL을 자극할 수 있다(예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).
본 발명의 펩티드 또는 약학적 조성물의 투여를 위한 적절한 방법의 예는 경구, 피내, 피하, 근육 내, 골 내(intraosseous), 복강 및 정맥주사뿐만 아니라, 전신 투여 또는 타겟 부위 주변에의 국소 투여도 포함되나, 이에 한정하지 않는다. 바람직한 투여 방법은 겨드랑이나 사타구니와 같은 림프 노드 주변에 피하로 주사되는 것을 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 약학적 조성물이, 펩티드나 엑소솜을 유효성분으로써 포함하는 경우에는, 예를 들어 피하에의 투여가 바람직하다. 또는 APC 및 CTL을 유효성분으로 하는 조성물은, 정맥 주사 등으로 투여할 수 있다. 투여는 1회 투여되거나 또는 다회 투여에 의해 상승시켜(boosted) 수행될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 암 치료에 치료학적으로 또는 약학적으로 효과적인 양 또는 FOXM1-발현하는 암세포에 대한 면역능력(더 구체적으로, CTL)을 유도하기 위해 치료학적으로 또는 약학적으로 효과적인 양으로 대상에 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 투여량은 치료될 질병, 환자의 나이 및 몸무게, 투여방법 등에 따라 적절히 조절될 수 있다. 본 발명의 각 펩티드를 위해, 투여량은 일반적으로 0.001 mg - 1000 mg, 예를 들어, 0.01 mg - 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 30 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 10 mg, 예를 들어, 0.5 mg - 5 mg이다. 투여 간격은 며칠 내지 몇 달마다 한번일 수 있고, 예를 들어, 매주 한번의 간격일 수 있다. 당업자는 적절한 투여량(용량)을 적절하게 선택할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드의 치료학적으로 효과적인 양 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 펩티드의 치료학적으로 효과적인 양, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체 및 아주번트를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.001 mg - 1000 mg, 바람직하게는 0.01 mg - 100 mg, 더 바람직하게는 0.1 mg - 30 mg, 좀 더 바람직하게는 0.1 mg - 10 mg, 예를 들어, 0.5 mg - 5 mg의 본 발명의 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 주사일 때, 본 발명의 펩티드는 0.001 mg/ml - 1000 mg/ml, 바람직하게는 0.01 mg/ml - 100 mg/ml, 더 바람직하게는 0.1 mg/ml - 30 mg/ml, 좀 더 바람직하게는 0.1 mg/ml - 10 mg/ml, 예를 들어, 0.5 mg/ml - 5 mg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 이와 같은 경우, 예를 들어, 0.1 내지 5 ml, 바람직하게는 0.5 ml 내지 2 ml의 본 발명의 약학적 조성물이 대상에게 주사로 투여될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 암을 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발 예방의 방법을 제공하며, 여기에는 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 약학적 조성물의 치료학적으로 효과적인 양을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 서술된 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 일반적으로 0.001 mg - 1000 mg, 예를 들어, 0.01 mg - 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 30 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 10 mg, 또는, 예를 들어, 0.5 mg - 5 mg의 1회 투여량으로 대상에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 아쥬번트와 함께 대상에게 투여될 수 있다. 더 나아가, 투여 간격은 며칠에서 몇 달에 한번, 바람직하게는 며칠에서 매달에 한번, 예를 들어 매주 또는 격주마다 한번 간격일 수 있다.
(2) 유효성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 약학적 조성물은 또한 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 구절, "발현가능한 형태(in an expressible form)"은 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입시켰을 때, 본 발명의 펩티드로서 발현될 수 있음을 의미한다. 예시된 실시예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 펩티드의 발현을 위해 필요한 조절요소를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 유전체 내로 안정되게 삽입되기 위해 필요한 서열을 가질 수 있다(예를 들어, 동종의 재조합 카세트 벡터의 설명을 위해 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12를 참조하라). 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국특허 5,580,859, 5,589,466, 5,804,566, 5,739,118, 5,736,524, 5,679,647; 및 WO98/04720을 참조하라. DNA-기반의 전달 기술의 예로서 "네이키드 DNA(naked DNA)", 용이한 전달[부피백신(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개], 양이온 지질 복합체 및 입자-매개("유전자 총") 또는 압력-매개 전달(예를 들어, 미국 특허 5,922,687 참조)이 포함된다.
본 발명의 펩티드는 또한 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예에는 벡시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같이 약화된 바이러스 숙주가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 발현하기 위한 벡터로서, 벡시니아 바이러스가 사용될 수 있다. 숙주에 도입된 후, 재조합 벡시니아 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하며, 이로 인해 면역반응을 이끌어낸다. 면역화 프로토콜에서 유용한 벡시니아 벡터 및 방법이, 예를 들어, 미국특허 4,722,848에 서술되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 서술되어 있다. 치료학적인 투여 또는 면역화를 위해 유용한 다른 다양한 종류의 벡터가, 예를 들어, 아데노 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 벡터, 비독성 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등임이 명백하다. 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조하라.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 환자로의 전달은 직접적일 수 있고, 이와 같은 경우에는 환자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 잠복된 벡터에 직접적으로 노출될 수 있으며, 또는 간접적일 수도 있으며, 이와 같은 경우에는 세포가 시험관 내에서 먼저 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 잠복된 벡터로 형질전환된 다음 상기 세포가 환자에게 이식된다. 이들 두 접근은 각각 생체 내 및 생체 밖의 유전자 치료법으로서 알려져 있다.
유전자 치료 방법의 일반적인 리뷰를 위해, 예를 들어, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33:573-96; Mulligan, Science 1993, 260:926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62:191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5):155-215를 참조하라. 본 발명을 위해 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당업계에 일반적으로 알려진 방법이 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 에 서술되어 있다.
펩티드 투여와 유사하게, 폴리뉴클레오티드의 투여도 경구, 피내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 골 내(intraosseous), 및/또는 복막주사 등에 의해 수행될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드의 투여는, 전신 투여 또는 타겟 부위에 인접한 국소 투여일 수 있다. 투여는 1회 투여되거나 또는 다회 투여에 의해 상승시켜(boosted) 수행될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 FOXM1-발현 암 세포에 대한 면역능력(더 구체적으로, CTL)을 유도하기 위해 치료학적으로 또는 약학적으로 효과적인 양, 또는 암 치료에 치료학적으로 또는 약학적으로 효과적인 양으로 대상에 투여될 수 있다. 적절한 담체에서 폴리뉴클레오티드의 투여량 또는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 형질전환된 세포에서 폴리뉴클레오티드의 투여량은 치료될 질병, 환자의 나이 및 몸무게, 투여방법 등에 따라 적절히 조절될 수 있고, 이는 일반적으로 0.001 mg - 1000 mg, 예를 들어, 0.01 mg - 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 30 mg, 예를 들어, 0.1 mg - 10 mg, 또는 예를 들어, 0.5 mg - 5 mg일 것이다. 투여 간격은 며칠 내지 몇 달마다 한번일 수 있고, 예를 들어, 매주 한 번의 간격일 수 있다. 당업자는 적절한 투여량(용량)을 적절하게 선택할 수 있다.
X. 펩티드, 엑소좀 , APC 및 CTL의 사용 방법
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APC 및 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. CTL은 본 발명의 엑소좀 및 APC를 사용하여 유도될 수 있다. 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 및 APC는 그들의 CTL-유도능력을 억제하지 않는 한 다른 어떤 화합물(들)과 병행하여 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 CTL은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC 및 엑소좀의 어느 것을 포함하는 약학적 조성물을 사용하여 유도될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 사용하여 유도될 수 있다.
(1) APC의 유도 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드(들) 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 사용하여 CTL-유도능력을 갖는 APC의 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 밖, 또는 생체 내에서 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 밖에서 APC를 펩티드와 접촉시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 대상으로부터 APC를 수집하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계.
상기 서술된 APC는 세포의 특정한 타입으로 제한되지 않으며, 림프구에 의해 인식되도록 자신의 세포 표면 상에 단백질성 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는 DC, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포 등을 이용할 수 있다. DC는 APC 중에서 가장 강력한 CTL-유도능력을 갖고, 그러므로 DC 를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 어떤 펩티드도 단독으로 또는 본 발명의 다른 펩티드와 혼합하여 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 펩티드는 다른 CTL-유도 펩티드(예를 들어, 다른 TAA-유래의 CTL-유도 펩티드)와 혼합하여 사용될 수 있다.
반면에, 본 발명의 펩티드가 대상에 투여될 때, APC가 생체 내에서 펩티드와 접촉되고, 그 결과, 높은 CTL-유도능력을 갖는 APC가 상기 대상의 몸에서 유도된다. 그러므로 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드를 대상에 투여하는 단계를 포함할 것이다. 유사하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 대상에 발현가능한 형태로 투여될 때, 본 발명의 펩티드가 생체 내에서 발현되며, 발현된 펩티드가 생체 내에서 APC와 접촉하고, 그 결과, 높은 CTL-유도능력을 갖는 APC가 상기 대상의 몸에서 유도된다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 대상에 투여하는 단계를 포함할 것이다.
CTL-유도능력을 갖는 APC를 유도하기 위해, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계를 포함할 것이다. 예를 들어, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 대상으로부터 APC를 수집하는 단계: 및
(b) 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 단계 (a)의 APC에 도입하는 단계.
상기 단계 (b)는 상기 "VI. 항원-제시 세포(APC)" 부분에 서술된 바와 같이 수행될 수 있다.
그러므로, 한 실시예에서, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 APC를 유도하는 방법을 제공하며, 이는 하기 (a) 또는 (b)의 단계를 포함한다:
(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉하는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계.
더 나아가, 본 발명은 CTL-유도능력을 갖는 APC를 제조하는 방법을 제공하며, 이는 하기 (a) 또는 (b)의 단계를 포함한다:
(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉하는 단계; 또는
(b) 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하는 단계.
상기 서술된 방법은 시험관 내, 생체 밖, 또는 생체 내 중 어느 하나에서 수행될 수 있으며, 시험관 내 또는 생체 밖에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 서술된 방법에서 사용된 APC는 유도된 APC의 투여를 위해 계획된 대상으로부터 유래되거나 또는 다른 대상으로부터 유래될 것이다. 투여가 계획된 대상과 다른 대상(공여자)으로부터 유래된 APC가 사용될 때, 투여의 대상과 공여자는 반드시 동일한 HLA 타입을 가져야 한다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 펩티도로써 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드를 사용할 경우, 투여의 대상과 공여자의 HLA는, 상기 모두 HLA-A33(더 바람직하게는 HLA-A*33:03)인 것이 바람직하다. 다른 한편으로, 상기 서술된 방법에서 사용된 APC는 HLA-A33(더 바람직하게는 HLA-A*33:03)를 발현하는 APC인 것이 바람직하다.
유사하게, 본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 펩티드로써 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드가 본 발명의 펩티드로서 사용될 때, HLA는 투여의 대상과 공여자 모두에서 바람직하게는 HLA-A01(더 바람직하게는 HLA-A*01:01)이다. 다른 한편으로, 상기 서술된 방법에서 사용된 APC는 바람직하게는 HLA-A01(더 바람직하게는 HLA-A*01:01)을 발현하는 APC이다. APC는 공여자로부터 수집된 혈액으로부터 특이적인 중력 원심분리 방법 등으로 PBMC를 분리한 후 알려진 방법을 사용하여 PBMC로부터 제조될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 CTL-유도능력을 가진 APC(들)를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 CTL-유도능력을 가진 APC(들)를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조에서 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 CTL-유도능력을 가진 APC(들)를 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 APC(들)를 유도하기 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 공정을 제공하며, 여기서 상기 방법 또는 공정은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 더 나아가 CTL-유도능력을 가진 APC(들)를 유도하기 위한 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 공정을 제공하며, 상기 방법 또는 공정은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 유도된 APC는 FOXM1에 특이적인 CTL(즉, 본 발명의 CTL)을 유도할 수 있다 .
(2) CTL의 유도 방법
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 또는 APC를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인식할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)(즉, TCR 서브유닛)를 형성할 수 있는 폴리펩티드(들)를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 사용하여 CTL을 유도하는 방법를 제공한다. 바람직하게는, CTL을 유도하는 방법은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 단계를 포함한다:
(a) 그들의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드와의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포를 CD8-양성 T 세포와 접촉시키는 단계;
(b) 그들의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드와의 복합체를 제시하는 엑소좀을 CD8-양성 T 세포와 접촉시키는 단계; 및
(c) 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인식할 수 있는 TCR을 형성할 수 있는 폴리펩티드(들)를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성 T 세포에 도입하는 단계.
본 발명의 펩티드(들), 폴리뉴클레오티드(들), 엑소좀(들), 또는 APC(들)가 대상에 투여될 때, CTL이 상기 대상의 몸에서 유도되고 FOXM1-발현 암 세포를 타겟으로 하는 면역 반응 강도가 증강된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드(들), 폴리뉴클레오티드(들), APC(들), 또는 엑소좀(들)을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 것이다.
다른 한편으로는, CTL은 이를 시험관 내 또는 생체 밖에서 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함할 것이다:
(a) 대상으로부터 APC를 수집하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 APC를 CD8-양성 T 세포와 공-배양하는 단계.
유도된 CTL은 그 이후에 상기 대상에게 돌아갈 것이다.
상기 단계 (c)에서 CD8-양성 T 세포와 공-배양되는 APC는 상기 "VI. 항원-제시 세포(APC)" 부분에 서술된 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입하여 또한 제조할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 APC는 이에 한정되지 않고, 이들 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시할 수 있는 어느 APC도 사용 될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 이와 같은 APC 대신, 이의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시할 수 있는 엑소좀도 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 이의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시할 수 있는 엑소좀을 공-배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 엑소좀은 "V. 엑소좀" 부분에서 상기 서술된 방법으로 제조될 수 있다.
더 나아가, CTL은 세포 표면에 HLA 항원에 의해 제시되는 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CD8-양성 T 세포에 도입시킴으로써 유도될 수 있다. 이와 같은 형질전환은 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 상기 서술된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL을 유도하는 방법을 제공한다:
(a) 그들의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 APC를 CD8-양성 T 세포와 공-배양하는 단계;
(b) 그들의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 엑소좀을 CD8-양성 T 세포와 공-배양하는 단계; 및
(c) 세포 표면에 HLA 항원에 의해 제시되는 본 발명의 펩티드와 결합할 수 있는 TCR의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CD8-양성 T 세포에 도입하는 단계.
상기 서술된 방법은 시험관 내, 생체 밖, 또는 생체 내에서 수행될 수 있으며, 시험관 내 또는 생체 밖에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 서술된 방법에서 사용된 APC 또는 엑소좀 및 CD8-양성 T 세포는 유도된 CTL의 투여를 위해 계획된 대상으로부터 유래되거나 또는 다른 대상으로부터 유래될 것이다. 투여가 계획된 대상과 다른 대상(공여자)으로부터 유래된 APC 또는 엑소좀 및 CD8-양성 T 세포가 사용될 때, 투여의 대상과 공여자는 반드시 동일한 HLA 타입을 가져야 한다. 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드가 본 발명의 펩티드로 사용될 때, HLA는 투여의 대상과 공여자 모두에서 HLA는 바람직하게는 HLA-A33(더 바람직하게는 HLA-A*33:03)이다. 다른 한편으로, 상기 서술된 방법에서 사용된 APC 또는 엑소좀은 바람직하게는 이의 표면에 HLA-A33(더 바람직하게는 HLA-A*33:03)과 본 발명의 펩티드(서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드)의 복합체를 제시하는 APC 또는 엑소좀이다. 이와 같은 경우, 유도된 CTL 은 HLA-A33 및 본 발명의 펩티드(예를 들어, FOXM1-발현 HLA-A33-양성 세포)의 복합체를 제시하는 세포에 대해 특이적인 세포 독성을 보여준다.
다른 한편으로, 예를 들어, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드가 본 발명의 펩티드로 사용될 때, 투여의 대상과 공여자 모두에서 HLA이 바람직하게 HLA-A01(더 바람직하게는 HLA-A*01:01)이다. 다른 한편으로, 상기 서술된 방법에서 사용된 APC 또는 엑소좀은 바람직하게는 이의 표면에 HLA-A01(더 바람직하게는 HLA-A*01:01)과 본 발명의 펩티드(서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드)의 복합체를 제시하는 APC 또는 엑소좀이다. 이와 같은 경우, 유도된 CTL은 HLA-A01 및 본 발명의 펩티드(예를 들어, FOXM1-발현 HLA-A01-양성 세포)의 복합체를 제시하는 세포에 대해 특이적인 세포독성을 보여준다.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분을 포함하는, CTL을 유도하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 APC; 및
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
다른 실시예에서 본 발명은 또한 CTL을 유도하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물의 제조에서 하기로부터 선택되는 유효성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 APC; 및
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
다른 한편으로, 본 발명은 더나아가 CTL을 유도하기 위한 용도를 위해 하기로부터 선택되는 유효성분을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 APC; 및
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 CTL을 유도하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 상기 방법 또는 공정은 하기로부터 선택되는 유효성분을 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 APC; 및
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
다른 실시예에서, 본 발명은 더 나아가 CTL을 유도하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 공정를 제공하며, 상기 방법 또는 공정은 하기로부터 선택되는 유효성분을 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 APC; 및
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
XI. 면역반응의 유도 방법
본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암에 대해 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 적용가능한 암에는 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암은 HLA-A33 및 HLA-A01 중으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA를 발현하는 것이 바람직하다.
본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암 세포에 대해 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. FOXM1는 상기 서술된 다양한 타입의 암에서 과발현되는 것으로 인식되고 있다. 그러므로 FOXM1-발현 암 세포에 대해 면역반응이 유도될 때, 그 결과로서 암 세포의 증식이 억제된다. 따라서, 본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 특히, FOXM1와 HLA-A33 및 HLA-A01 중으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA를 발현하는 암 세포의 증식을 억제하는데 적절하다.
본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)의 어느 것을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 본 발명의 펩티드의 어느 것을 제시하는 APC 또는 엑소좀을 투여하는 것도 심사숙고한다. 상세한 내용은 "IX. 약학적 조성물" 부분, 특히, 백신으로서 본 발명의 펩티드의 약학적 조성물의 용도에 관하여 서술된 부분을 참조할 수 있다. 추가로, 면역반응을 유도하기 위하여 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 엑소좀 및 APC는 "V. 엑소좀", "VI. 항원-제시-세포(APC)" 및 "X. 펩티드, 엑소좀, APC 및 CTL의 사용 방법"의 항목 (1) 및 (2)에 상세하게 서술되어 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 FOXM1-발현 암에 대해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 또는 백신을 제공하며, 여기서 상기 약학적 조성물 또는 백신은 하기로부터 선택되는 유효성분을 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 또한 FOXM1-발현 암 세포에 대해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 또는 백신을 제공하며, 여기서 상기 약학적 조성물 또는 백신은 하기로부터 선택되는 유효성분을 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암 세포의 증식을 억제하기 위한 약학적 조성물 또는 백신을 제공하며, 여기서 상기 약학적 조성물 또는 백신은 하기로부터 선택되는 유효성분을 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 실시예에서는, 본 발명은 FOXM1-발현 암에 대해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 하기로부터 선택되는 유효성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 또한 FOXM1-발현 암 세포에 대해 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 하기로부터 선택되는 유효성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암 세포의 증식을 억제하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 하기로부터 선택되는 유효성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암에 대해 면역반응을 유도하는 약학적 조성물의 제조를 위한 방법 또는 공정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합 또는 제형화하는 단계를 포함한다.
다른 한편으로, 본 발명은 FOXM1-발현 암 세포의 증식을 억제하기 위한 방법 또는 암에 대해 면역반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기로부터 선택되는 유효성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 펩티드를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APC;
(d) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 본 발명의 CTL.
본 발명에 있어서, FOXM1-발현 암은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, 엑소좀 및/또는 CTL의 투여에 의해 치료될 수 있다. 다른 한편으로, FOXM1-발현 암에 대한 면역반응은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, 엑소좀 및/또는 CTL의 투여에 의해 유도될 수 있다. 이와 같은 암의 예로는, 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더 나아가, FOXM1-발현 암 세포에 대한 면역반응은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC, 엑소좀 및/또는 CTL의 투여에 의해 유도될 수 있다. 그러므로, 상기 서술된 유효성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 투여하기 전에, 치료하려는 대상의 질병 부위에서 FOXM1의 발현수준이 증가되었는지 여부를 확인하는 것이 바람직하다.
그러므로, 한 실시예에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 FOXM1-발현 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(i) 암을 지닌 대상의 질병 부위로부터 수집된 생물학적 샘플에서 FOXM1의 발현 수준을 측정하는 단계;
(ii) 상기 단계 (i)에서 측정된 FOXM1 발현 수준에 근거하여 FOXM1-발현 암을 가진 대상을 동정하는 단계; 및
(iii) 상기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분을 정상 대조군과 비교하여 FOXM1를 과잉 발현하는 암을 갖는 대상에게 투여하는 단계.
다른 한편으로, 본 발명은 더 나아가 FOXM1-발현 암을 갖는 대상에게 투여하기 위한, 상기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분을 포함하는 백신 및 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 더 나아가 상기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분으로 치료될 수 있는 대상의 동정 또는 선택 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 암을 지닌 대상의 질병 부위로부터 수집된 생물학적 샘플에서 FOXM1의 발현 수준을 측정하는 단계;
(ii) 상기 단계 (i)에서 측정된 FOXM1 발현 수준에 근거하여 FOXM1-발현 암을 가진 대상을 동정하는 단계; 및
(iii) 상기 단계 (ii)에서 동정된 대상을 상기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분으로 치료될 대상으로서 동정 또는 선택하는 단계.
상기 서술된 방법에서 FOXM1의 발현수준을 측정하기 위해 대상으로부터 수집된 생물학적 샘플은 특별히 제한되지 않으나, 생체검사(biopsy)에 의해 수집된 암 세포를 포함하는 조직 등이 바람직하게 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에서 FOXM1의 발현수준은 알려진 방법으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 프로브 또는 PCR 방법에 의해 FOXM1 유전자의 전사 산물을 탐지하는 방법(예를 들어, cDNA 마이크로어레이 방법, 노던 불럿 방법, RT-PCT 방법 등), 항체 등에 의해 FOXM1 유전자의 번역 산물을 탐지하는 방법(예를 들어, 웨스턴 불럿, 면역염색 방법 등) 등이 사용될 수 있다. 더 나아가, 생물학적 샘플은 혈액 샘플일 것이고, 이와 같은 경우, FOXM1 또는 그의 단편에 대한 항체의 혈중 수준이 측정되며, 그리고 질병 부위에서 FOXM1의 발현 수준을 혈액 수준에 근거하여 평가할 수 있다. FOXM1에 대한 항체의 혈액 수준은 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있으며, 예를 들어, FOXM1 단백질 또는 항원으로서 본 발명의 펩티드를 사용하여 효소 면역어세이(enzyme immunoassay (EIA)), 효소-연결된 면역흡수 어세이(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)), 방사성면역어세이(radioimmunoassay (RIA)) 등이 사용될 수 있다.
정상적으로, FOXM1를 발현하지 않는 조직 및 세포에서, FOXM1의 전사 산물 및 번역 산물은 거의 탐지되지 않는다. 그러므로, 대상으로부터 수집된 암 세포 또는 암 세포를 포함하는 조직 샘플에서 FOXM1의 전사 산물 및 번역 산물이 탐지되면, 상기 대상의 암은 FOXM1를 발현한다고 결정될 수 있다. FOXM1-발현 암을 갖지 않은 대상의 혈액 샘플에서는 FOXM1 또는 이의 단편에 대한 항체가 거의 탐지되지 않는다. 그러므로, 대상으로부터 수집된 혈액 샘플에서 FOXM1 또는 이의 단편에 대한 항체가 탐지되면, 상기 대상의 암은 FOXM1를 발현한다고 결정될 수 있다. 대상의 암이 FOXM1를 발현하는지 여부는 상기 대상의 비-암적인 부위로부터 수집된 같은 타입의 생물학적 재료 또는 암을 갖지 않는 대상(정상 대조군 샘플)으로부터 수집된 같은 타입의 생물학적 재료의 측정 결과를 비교하여 결정될 수 있다. 즉, 정상 대조군 샘플에서의 측정된 타겟의 수준에 비교하여(정상 대조군 수준), 테스트 대상의 생물학적 샘플에서의 수준이 증가되었을 때, 상기 대상의 암은 FOXM1를 발현하는 것으로 평가된다. 예를 들어, 탐지된 측정값의 타겟의 양이 정상 대조군 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 그 이상 증가되었을 때, 상기 대상의 암은 FOXM1를 발현하는 것으로 평가될 것이다. 탐지된 측정값의 타겟의 양이 정상 대조군 수준보다 바람직하게는 25% 또는 그 이상, 더 바람직하게는 50% 또는 그 이상 증가되는 것이 이상적이다. 더 나아가, 탐지된 FOXM1의 전사 산물 또는 번역 산물의 양은 잘 알려진 베타-액틴, 글리셀알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 또는 리보조말 단백질 P1(ribosomal protein P1)과 같은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 탐지된 양에 대하여 표준화시킴으로써 평가될 것이다.
바람직한 실시예에서, 상기 (a) 내지 (e) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분을 투여하기 전에 대상의 HLA 타입을 확인하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 연관된 유효성분이 투여될 대상을 위해서는, HLA-A33-양성 대상을 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 연관된 유효성분이 투여될 대상을 위해서는, HLA-A01-양성 대상을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드 및 HLA의 복합체를 제공한다. 상기 서술된 본 발명의 복합체는 단량체 또는 다량체일 수 있다. 본 발명의 복합체가 다량체일 때, 중합되는 수는 특별히 제한되지 않으며, 어떤 수로 중합된 다량체일 수 있다. 예로는 4량체(tetramet), 5량체(pentamer), 6량체(hexamer) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다량체는 또한 덱스트라머(dextramer)(WO2002/072631) 또는 스트렙타머(streptamer)(Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun;8(6):631-7)를 고려한다. 본 발명의 펩티드 및 HLA의 복합체는 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, Altman JD et al., Science.1996, 274(5284): 94-6; WO2002/072631; WO2009/003492; Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8(6): 631-7 등). 본 발명의 복합체는, 예를 들어, 본 발명의 펩티드에 특이적인 CTL의 정량에 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플을 본 발명의 약학적 조성물이 투여된 대상으로부터 수집하고, CD4-음성 세포가 PBMC를 분리한 후 제조되며, 형광 염료-융합된 본 발명의 복합체와 접촉시킨다. 그 후, 본 발명의 펩티드에 특이적인 CTL의 퍼센트는 유세포 분석(flow cytometry analysis)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 의한 면역 반응-유도 효과는 본 발명의 약학적 조성물의 투여 전, 동안 및/또는 후에 본 발명의 펩티드에 대한 특이적인 CTL을 측정함으로서 모니터될 수 있다.
XII. 항체
본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하고, 본 발명의 펩티드가 아닌 것에는 결합(또는 약하게 결합)하지 않는다. 다른 실시예에서, 이와 같은 항체는 HLA 분자의 맥락에서 펩티드를 인식하는 항체를 포함할 것이다. 즉, 상기 항체는 펩티드-MHC 복합체에 결합한다. 항체의 결합 특이성은 억제 어세이(inhibition assay)로 확인될 수 있다. 즉, 만약 분석될 항체 및 전장의 FOXM1 폴리펩티드 사이의 결합이 본 발명의 펩티드의 존재하에서 억제되면, 상기 항체는 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 보여진다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 질병의 진단 및 예후의 어세이뿐만 아니라, 본 발명의 약학적 조성물을 투여할 대상의 선택 및 본 발명의 약학적 조성물의 모니터링에도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 또는 이의 단편을 탐지 및/또는 정량하기 위한 다양한 면역학적 어세이를 제공한다. 이와 같은 면역학적 어세이는 방사성면역어세이(radioimmunoassay), 면역크로마토그래피(immunochromatography), 효소-연결된-면역흡착 어세이(ELISA), 효소-연결된-면역형광 어세이(enzyme-linked immunofluorescence assay)(ELIFA) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 어세이 형태의 범위 내에서 수행된다.
본 발명의 항체는 FOXM1-발현 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미징 방법(immunological imaging method)에 사용될 수 있으며, 이의 예로는 표지된 본 발명의 항체를 사용하는 방사성 신티그래프 이미징(radioactive scintigraphic imaging)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 어세이 방법은 임상적으로 발현 암의 탐지, 모니터링 및 예후에 사용된다; 이와 같은 암의 예로는 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체와 같은 어떠한 임의의 형태로 사용될 수 있으며, 더 나아가 본 발명의 펩티드를 토끼와 같은 동물에 면역성을 주어 수득된 항-혈청(anti-sera), 모든 종류의 다클론 항체 및 단일클론 항체, 인간 항체뿐만 아니라, 유전자 재조합을 통해 생성된 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함할 것이다.
항체를 얻기 위한 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드 또는 이의 단편은 화학적 합성 또는 본 명세서에서 공개된 아미노산 서열에 근거한 유전공학 기술로 얻을 수 있다.
면역성을 주는 항원으로서 사용된 펩티드는 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 펩티드의 단편일 것이다. 더 나아가, 상기 펩티드는 면역원성을 증가시키기 위해 담체에 결합 또는 융합될 것이다. 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin (KLH))은 담체로서 잘 알려져 있다. KLH를 펩티드에 결합시키기 위한 방법은 당업계에 또한 잘 알려져 있다.
어떤 포유류도 상기 서술된 항원으로 면역화될 수 있으며, 단일클론 항체를 생성할 때 세포융합에 사용되는 모세포와의 호환성을 고려하는 것이 바람직하다. 일반적으로 설치류, 토끼류 또는 영장류 목의 동물이 사용될 수 있다. 설치류 목의 동물은, 예를 들어, 생쥐(mice), 쥐(rats) 및 햄스터(hamsters)를 포함한다. 토끼류 목의 동물은, 예를 들어, 토끼를 포함한다. 영장류 목의 동물은, 예를 들어, 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey)[필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)], 붉은털 원숭이(rhesus monkeys), 망토개코 원숭이(hamadryas) 및 침팬지와 같은 협비원류 원숭이(Catarrhini monkeys)[늙은 세계 원숭이(old world monkeys)]를 포함한다.
항원으로 동물에 면역성을 주는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강 내 주사 및 피하 주사는 포유동물에 면역성을 갖게 하기 위한 표준 방법이다. 더 구체적으로는, 항원을 적절한 양의 인산 버퍼화된 생리 식염수(PBS), 생리 식염수 등에 희석 및 현탁시킨다. 필요에 따라, 항원 현탁액을 프라운드 완전 아쥬번트(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 아쥬번트의 적절한 양과 혼합하고 에멀전화한 후 포유동물에게 투여될 수 있다. 그리고 나서, 적절한 양의 프라운드 불완전 아쥬번트(Freund's incomplete adjuvant)와 혼합한 항원을 매 4 내지 21일에 몇번 투여하는 것이 바람직하다. 적절한 운반체가 면역성을 주기 위해 사용될 수 있다. 상기 면역화 후, 혈청은 원하는 항체의 양이 증가했는지에 대해 표준 방법을 사용하여 조사될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대한 다클론 항체는 면역화 후 원하는 항체의 혈청 수준이 증가되었는지 확인된 포유동물로부터 혈액을 수집하고, 어떠한 통상적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리하여 제조될 수 있다. 다클론 항체는 다클론 항체-포함 혈청이 될 것이며, 또는 다클론 항체-포함 분획이 혈청으로부터 분리될 것이다. 면역글로불린 G 또는 M은 본 발명의 펩티드에 의해서만 인식되는 분획으로부터, 예를 들어, 본 발명의 펩티드가 융합된 친화력 컬럼(affinity column)을 사용하고, 그리고 더 나아가, 상기 분획을 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼으로 정제하여 제조될 수 있다.
단일클론 항체를 제조하기 위하여, 면역화 후 원하는 항체의 혈청 수준이 증가된 것이 확인되면, 면역세포를 포유동물로부터 수집하고 세포 융합되게 한다. 세포융합에 사용되는 면역세포는 바람직하게는 지라로부터 얻을 수 있다. 상기 면역세포와 융합될 수 있는 다른 모 세포는, 예를 들어, 포유류 골수종 세포, 및 보다 바람직하게는 융합 세포의 약물 선택을 위한 성질이 획득된 골수종 세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포는 골수종 세포와 공지의 방법, 예를 들면, Milstein et al.(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 1981, 73:3-46)의 방법으로 융합될 수 있다.
세포융합으로 얻어진 하이브리도마는 HAT 배지[히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지]와 같은 표준 선택 배지에 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 전형적으로, HAT 배지에 서 원하는 하이브리도마를 제외하고 모든 다른 세포(융합되지 않은 세포)가 사멸되기에 충분한 기간(예를 들어, 며칠 내지 몇주) 동안 계속 된다. 그 후, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 표준 제한 희석을 수행하여 스크리 및 복제될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위해 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키는 상기의 방법에 추가로, EB-바이러스에 의해 감염된 림포싸이트와 같은 인간의 림포싸이트를 시험관 내에서 펩티드, 상기 펩티드를 발현하는 세포, 또는 이의 용해물로 면역화시킬 수 있다. 그 후, 면역화된 림포싸이트는 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻기 위해 U266과 같은 불멸화된 인간-유래 골수종 세포와 융합시킬 수 있다(JPS63-17688).
다음으로, 얻어진 하이브리도마를 생쥐의 복강 내로 이식하고, 그리고 복수를 추출한다. 얻어진 단일클론 항체는, 예를 들어, 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온-교환 크로마토그래피, 또는 본 발명의 펩티드가 융합된 친화력 컬럼에 의해 정제될 수 있다
다른 한편으로는, 면역화된 림포싸이트와 같은 항체-생산 면역 세포는 암 유전자에 의해 불멸화되고, 단일클론 항체의 제조를 위해 사용될 수 있다.
이와 같이 얻어진 단일클론 항체는 유전공학 기술을 사용하여 재조합적으로 또한 제조될 수 있다(예를 들어, 영국의 MacMillan Publishers LTD에서 발행된 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990) 참조). 예를 들어, 항체-코딩 DNA는 항체-생산 하이브리도마 또는 면역화된 림포싸이트와 같은 면역 세포로부터 복제되고 적절한 벡터에 삽입될 수 있으며, 그 후 이는 재조합 항체의 제조를 위해 숙주세포에 도입된다. 본 발명은 또한 상기 서술된 바와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.
더 나아가, 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드에 결합하는 한, 항체 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 항체의 항원-결합 부위(들)를 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv, 또는 H 체인 및 L 체인으로부터 유래된 Fv 단편들이 적절한 링커로 연결된 단일쇄 Fv(scFv)일 것이다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85: 5879-83). 더 구체적으로, 항체 단편은 항체를 파파인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소의 처리에 의해 생성될 수 있다. 다른 한편으로는, 항체 단편을 코딩하는 유전자를 제조하고, 발현 벡터에 삽입하며, 그리고 적절한 숙주 세포에서 발현될 것이다(예를 들어, Co et al., J Immunol 1994, 152:2968-76; Better and Horwitz, Methods Enzymol 1989, 178:476-96; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 1989, 178:497-515; Lamoyi, Methods Enzymol 1986, 121:652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol 1986, 121:663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol 1991, 9:132-7 참조).
항체는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol (PEG))과 같은 다양한 분자와 융합에 의해 변형될 것이다. 본 발명은 이와 같은 변형된 항체를 제공한다. 변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형시켜 얻을 수 있다. 이들 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.
다른 한편으로는, 본 발명의 항체는 비-인간 항체-유래 변이영역 및 인간 항체-유래 고정영역(constant region)의 키메라 항체로서, 또는 비-인간 항체-유래 상보성 결정 영역(complementarity determining region (CDR)) 및 인간 항체-유래 프레임워크 영역(framework region (FR)) 및 고정영역을 포함하는 인간화 항체로서 수득될 수 있다. 이와 같은 항체는 잘 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간화는 인간 항체 서열(들)을 상응하는 비-인간 항체 CDR 서열(들)로 치환하여 수행될 수 있다(예를 들어, Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6 참조). 그러므로, 이와 같은 인간화 항체는 온전한 인간 변이 영역보다 적은 부분이 비-인간 종에 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다.
인간 프레임워크 및 고정 영역에 추가로 인간 변이영역을 포함하는 온전한 인간 항체가 또한 사용될 수 있다. 이와 같은 항체는 당업계에 잘 알려진 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 방법은 박테리오파지에 제시된 인간 항체 단편의 재조합 라이브러리의 용도가 포함된다(예를 들어, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 1991, 227:381). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 부위를 내부 면역글로블린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되어 있는, 형질전환동물, 예를 들어 생쥐에 도입시켜 생성될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 미국특허 6,150,584, 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425 및 5,661,016에 서술되어 있다.
상기 서술된 바와 같이 얻어진 항체들은 균일하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체 분리 및 정제는 일반적인 단백질을 위해 사용되는 분리방법 및 정제방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체는 친화력 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외거르기(ultrafiltration), 염석(salting-out), 투석 (dialysis), SDS-아크릴아미이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing electrophoresis)의 용도를 적절하게 선택 및 조합하여 항체를 격리 또는 분리될 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이에 한정되지 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화력 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 전형적인 단백질 A 컬럼은, 예를 들어 하이퍼 D(hyper D), POROS 및 세파로스 F.F.(Sepharose F.F.)(Pharmacia)를 포함한다.
친화력 크로마토그래피 이외에, 전형적인 크로마토그래피는, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 크로마토그래피 과정은 HPLC 및 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 항체의 항원-결합 활성은, 예를 들어, 흡광측정, 효소-연결 면역흡착 어세이(ELISA), 효소 면역어세이(EIA), 방사성 면역어세이(RIA) 및/또는 면역형광(IF)을 사용하여 측정할 수 있다. ELISA의 경우에, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이드에 적용하고, 그리고 나서, 항체-생산 세포의 상등액 또는 정제된 항체와 같이 원하는 항체를 포함하는 샘플을 적용시킨다. 그 다음, 일차 항체를 인식하고 알카라인 포스파테이즈와 같은 효소로 표지된 2차 항체를 적용시키고 상기 플레이트를 배양한다. 그리고 세척 후, ρ-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 플레이트에 적용하고, 샘플의 항원-결합 활성을 흡광도를 측정하여 평가한다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해, C-말단 또는 N-말단 단편과 같은 펩티드 단편이 항원으로서 사용될 수 있다. 비아코아(BIAcore (Pharmacia))가 본 발명의 항체의 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 탐지 또는 측정하기 위해, 본 발명의 펩티드를 포함한다고 여겨지는 샘플에 본 발명의 항체를 노출시키고, 상기 항체와 상기 펩티드 사이에 형성된 면역복합체를 탐지 또는 측정하는것이 가능하다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 대상의 혈액 샘플(예를 들어, 혈청 샘플)에 존재하는 본 발명의 펩티드를 탐지하는데 사용될 수 있다. 다른 한편으로는, 대상의 혈액 샘플(예를 들어, 혈청 샘플)에 존재하는 본 발명의 항체는 또한 본 발명의 펩티드를 사용하여 탐지될 수 있다. 대상의 혈액샘플에 있는 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 항체의 측정 결과는 본 발명의 약학적 조성물의 투여 대상을 선별하거나, 또는 본 발명의 약학적 조성물의 효력을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 그 외, 예를 들어 백신으로서 투여된 펩티드에 대한 항체를 갖는 환자는 상기 백신에 대해 응답성이 높은 경우가 있는 것이 보고되고 있다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는, 암 환자 중에서 상기 펩티드를 포함하는 백신에 대한 응답성이 높을 것으로 예상되는 환자를 상기 펩티드에 대한 항체를 지표로 함으로써 선택하기 위한 면역어세이(immunoassay) 용 항원으로써도 이용할 수 있다.
XIII. 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터 및 상기 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유지시키기 위해, 숙주 세포에서 본 발명의 펩티드를 발현시키기 위해, 또는 유전자 치료를 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하기 위해 사용될 수 있다.
대장균이 숙주 세포이고 벡터가 대장균(예를 들어, JM109, DH5-alpha, HB101 또는 XL1-Blue)에서 대량으로 증폭 및 생산될 때, 상기 벡터는 대장균에서 증폭되기 위한 "복제 기점(replication origin)" 및 형질전환된 대장균의 선별을 위한 마커 유전자(예를 들어, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜과 같은 약물에 의해 선택될 수 있는 약물 저항성 유전자)를 가질 필요가 있다. 예를 들어, M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 추가로, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7이 클로닝뿐만 아니라 상기 벡터로서 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 펩티드의 생산을 위해 사용될 때, 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 대장균에서 발현을 위한 발현 벡터는 대장균에서 증폭을 위해 상기의 특징을 가질 필요가 있다. JM109, DH5-알파, HB101 또는 XL1-Blue와 같은 대장균이 숙주 세포로서 사용될 때, 벡터는 원하는 유전자를 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터(Ward et al., Nature 1989, 341:544-6; FASEB J 1989, 6:2422-7), araB 프로모터(Better et al., Science 1988, 240:1041-3), T7 프로모터 등을 가질 필요가 있다. 그런 관점에서, 예를 들어, GEX-5X-1(Pharmacia), "QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이와 같은 경우, 숙주는 T7 RNA 합성효소를 발현하는 BL21이 바람직하다)가 상기 벡터 대신 사용될 수 있다. 추가로, 상기 벡터는 펩티드의 분비를 위해 신호 서열(signal sequence)을 포함할 수 있다. 펩티드를 대장균의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 방향을 지시하는 전형적인 신호 서열은 pelB 신호서열이다(Lei et al., J Bacteriol 1987, 169:4379). 벡터를 타겟 숙주 세포에 도입시키기 위한 수단은, 예를 들어, 칼슘 클로라이드 방법 및 전기천공법을 포함한다.
대장균에 추가로, 예를 들어, 포유류로부터 유래된 발현 벡터[예를 들어, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 1990, 18(17):5322), pEF, pCDM8)], 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터[예를 들어, "Bac-to-BAC baculovirus expression system"(GIBCO BRL), pBacPAK8], 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터[예를 들어, "Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11, SP-Q01] 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해, 벡터는 상기 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들어, SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature 1979, 277:108), MMLV-LTR 프로모터, EF1-알파 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res 1990, 18:5322), CMV 프로모터 등, 및 형질전환체를 선별할 수 있는 바람직한 마커 유전자[예를 들어, 약물(예를 들어, 네오마이신, G418)에 의해 선별될 수 있는 약물 저항성 유전자]를 가질 필요가 있다. 이런 특징을 갖는 알려진 벡터의 예로는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.
본 발명의 실시예는 상기의 설명에 근거하여 하기에 예시된다: 그러나, 본 발명이 상기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[1] 하기 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 독성 T 세포(CTL)-유도능력을 갖는 15개 미만 아미노산의 펩티드:
(a) 서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
(b)서열번호: 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열.
[2] 하기 (i) 및 (ii)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 상기 [1]의 펩티드:
(i) 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 하기 (a) 내지 (c) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 치환(들)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:
(a) N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이, 아스파라긴산 및 글루타민산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
(b) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 및 발린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨; 및
(c) C-말단 아미노산이 아르기닌 및 리신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨.
(ii) 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 하기의 (a) ~ (c)로 구성된 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:
(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 및 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
(b) N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨; 및
(c) C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환됨.
[3] 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 상기 [1]의 펩티드.
[4] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
[5] 약학적으로 허용가능한 담체 및 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분을 포함하는 조성물:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 타겟하는 CTL.
[6] CTL(들)을 유도하기 위한 조성물이고, 성분이 하기 (a) 내지 (d)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분인, 상기 [5]의 조성물:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC); 및
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
[7] 약학적 조성물인, 상기 [5]의 조성물.
[8] (i) 암의 치료, (ii) 암의 예방(방지) 및 (iii) 암 수술 후 재발 예방(방지)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 용도를 위한 약학적 조성물인, 상기 [7]의 조성물.
[9] 암에 대해 면역반응을 유도하기 위한, 상기 [7]의 조성물.
[10] 상기 암이 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia(CML)), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 상기 [8] 또는 [9]의 조성물.
[11] HLA-A33 및 HLA-A01로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA이 양성인 대상에게 투여되기 위해 제형화된, 상기 [5] 내지 [10]의 어느 하나의 조성물.
[12] 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단계를 포함하는 CTL-유도능력을 갖는 APC(들)를 유도하는 방법:
(a) 시험관 내, 생체 밖 또는 생체 내에서 APC(들)를 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드와 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC(들)에 도입하는 단계.
[13] 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단계를 포함하는 CTL(들)을 유도하는 방법:
(a) CD8-양성 T 세포(들)를 HLA 항원 및 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 제시하는 APC(들)와 공-배양하는 단계;
(b) CD8-양성 T 세포(들)를 HLA 항원 및 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 제시하는 엑소좀(들)과 공-배양하는 단계; 및
(c) CD8-양성 T 세포(들)에 세포 표면에 HLA 항원에 의해 제시되는 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계.
[14] 이의 표면에 HLA 항원 및 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 복합체를 제시하는 APC.
[15] 상기 [12]의 방법에 의해 유도된, 상기 [14]의 APC.
[16] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[17] 상기 [13]의 방법에 의해 유도된, 상기 [16]의 CTL.
[18] 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[19] 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하는 방법:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[20] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드에 결합하는 항체.
[21] 하기의 단계를 포함하는 CTL-유도능력을 가진 펩티드의 스크리닝 방법:
(a) 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 원래의 아미노산 서열에 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산 잔기가 치환, 삭제, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열로 구성된 후보 서열을 생성하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 생성된 후보 서열중에서 FOXM1 이외의 알려진 다른 어떤 인간 유전자 산물과 유의적으로 상동성(서열 동일성)을 갖지 않는 후보 서열을 선별하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 선별된 후보 서열로 구성된 펩티드를 APC(들)와 접촉시키는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 APC(들)를 CD8-양성 T 세포(들)와 접촉시키는 단계;및
(e) 원래의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 CTL-유도능력과 동일하거나 더 높은 CTL-유도능력을 갖는 펩티드 선택하는 단계.
[22] 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 조성물의 제조에서 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유효성분의 용도:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[23] 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방을 위한 약학적 조성물의 제조에서 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분의 용도:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[24] 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분의 용도:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[25] 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발의 예방을 위한 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분의 용도:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[26] 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 FOXM1-발현 세포(들)에 대해 세포독성을 유도하는 방법:
(a) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입;
(b) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 타입;
(c) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
(d) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
(e) 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 타겟하는 CTL.
[27] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입을 포함하는 동결건조된 제형.
[28] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입을 수용성 담체에 용해시키고 여과 멸균을 수행하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 약학적 조성물.
[29] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입 및 수용성 담체를 포함하는 멸균여과된 수용성 용액.
[30] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드의 하나 또는 그 이상 타입, 수용성 담체 및 오일 아쥬번트를 포함하는 에멀젼.
[31] 상기 [5] 내지 [11]의 어느 하나의 조성물을 담고 있는 용기 및 아쥬번트를 수용하고 있는 용기를 포함하는 키트.
[32] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나의 펩티드를 포함하는 동결건조된 제형을 저장하는 용기, 아쥬번트를 저장하는 용기 및 동결건조된 제형의 재-용해 용액을 저장하는 용기를 포함하는 키트.
본 발명은 본 명세서에서 이의 특이적인 실시예를 참조로 상세히 설명된다. 그러나, 상기 설명은 실제적으로 묘사 및 설명을 위한 설명으로 이해되어야 하고, 이는 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 설명하기 위한 것이다. 일상적인 실험을 통해서, 당업계의 당업자는 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 그 안에서 다양한 변화 및 변형이 만들어질 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명은 상기 설명에 국한되지 않고, 여기에 첨부된 청구항 및 이와 등가물에 의해 정의되기 위한 의도이다.
이하, 본 발명은 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 하기 재료, 방법 및 실시예가 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 특정 실시예를 제조 및 사용하는 것을 보조하기 위해 제공되는 동안, 이는 본 발명의 관점을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 당업계의 당업자는 본 발명을 실행 또는 테스트하는데 있어서 본 명세서에서 설명된 방법 및 재료와 유사 또는 등가물을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 이전기술의 서류는 본 명세서에 참고로 삽입되었다.
실시예
재료 및 방법
세포주
HLA-A- 및 HLA-B-음성 인간 B 림프아구(human B lymphoblastoid) 세포주인 C1R 세포, 및 아프리카 녹색원숭이 신장세포주인 COS7 세포는 ATCC로부터 구입했다.
HLA -A*33:03을 정상적으로 발현하는 표적세포의 제작
HLA-A*33:03를 정상적으로 발현하는 C1R 세포(C1R-A33)는, CTL을 자극하는 세포로서 사용되었다. HLA-A*33:03 유전자를 코딩하는 cDNA를 PCR로 증폭시키고 발현 벡터에 조합하였다. HLA-A*33:03 유전자 발현 벡터를 도입한 C1R 세포를 G418(Invitrogen)을 포함하는 배지에서 2주 동안 약제선택 배양하였다. G418 내성 C1R 세포 현탁액을 희석한 후, 96-웰 플레이트의 웰에 분주하고, G418을 포함하는 배지에서 30일 동안 더 배양하였다. C1R 세포에서 HLA-A*33:03의 발현을 유동혈구 계산 분석법(flow cytometric analysis)으로 확인하였다.
FOXM1 유래 펩티드의 선택
HLA-A*33:03 분자에 결합이 기대되는 FOXM1 유래 9머(9mer) 및 10머(10mer) 펩티드를 결합 예측 서버 "NetMHC pan2.8"(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-2.8/)(Buus et al., Tissue Antigens. 2003, 62(5):378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003, 12(5):1007-17; Bioinformatics. 2004, 20(9):1388-97)를 사용하여 결정하였다.
펩티드의 합성
펩티드는, American Peptide Company (Sunnyvale, CA)에 의해 표준 고체상 합성 방법에 따라 합성되었으며, 역상 고효율 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되었다. HPLC 및 질량 분석법에 의해 각 펩티드의 품질(순도 90% 이상)은 보증되었다. 펩티드를 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해하고(최종 농도: 20 mg/ml), -80℃에 저장하였다.
시험관 내 CTL 유도
단핵구-유래 수지상세포(Monocyte-derived dendritic cell; DC)를 항원제시세포로 사용하여, 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA)상에 제시된 펩티드에 대한 특이적인 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하였다. 이미 문헌에서 보고된 바와 같이 DC는 시험관 내에서 제작했다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14):4112-8). 구체적으로, 피콜-파크 플러스 용액(Ficoll-Paque plus solution (Pharmacia))을 사용하여 건강한 지원자(HLA-A*33:03-양성)로부터 채취된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 플라스틱 조직배양 접시(Corning)에 분주하고, PBMC 중의 단핵구를 접시에 접착시켰다. 1000 IU/ml의 과립 대식세포 집락 자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor (R&D System)) 및 1000 IU/ml의 인터루킨-4(IL-4)(R&D System)의 존재하에서 7일간 배양하였다. 배양에는 5%의 비동화된 AB형 혈청(inactivated AB-type serum; ABS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)을 사용하였다. 사이토카인에 의해 단핵구로부터 분화 유도된 DC에, 20 μg/ml의 각 합성 펩티드로 자극(펄스)하였다(37℃, 3시간). 펩티드 자극은 3 μg/ml의 β2-마이크로 글로블린(beta 2-microglobulin)을 포함하는 AIM-V 배지에서 수행하였다. 펩티드 자극한 이들 DC를 X-선 조사(20 Gy)로 불활성화하고, CD8 양성 분리 키트(CD8 Positive Isolation Kit(Invitrogen))를 사용하여 양성 선별로 얻은 자가유래 CD8 양성 T 세포와 1:20의 비율로 혼합(1.5 x 104의 DC 및 3 x 105 CD8 양성 T 세포)하여, 48 웰 플레이트(Corning)에 배양하였다. 1 웰당 5%의 ABS/AIM-V 배지양은 0.5 ml로 하여, 거기에 IL-7(R&D System)을 첨가하였다(최종농도 10 ng/ml). 배양 개시로부터 2일 후, IL-2(Novartis)를 첨가하였다(최종농도 20 IU/ml). 배양 7일 및 배양 14일에, 펩티드를 펄스한 DC로 CD8 양성 T 세포를 더 자극 시켰다. DC는 상기와 같은 방법으로 매번 제조되었다. 21일째 이후(3회의 DC 자극 후), 펩티드를 펄스한 C1R-A33에 대한 IFN-γ 생산을 인간 인터페론(IFN)-γ 효소결합면역스팟(ELISPOT) 어세이로 확인하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8):498-506).
CTL의 증식 공정
Riddell et al.에 의해 보고된 것과 유사한 방법을 이용하여 CTL을 증식시켰다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). 마이토마이신 C에 의해 처리된 2 종류의 인간 B 림프아구 세포주(각 5 x 106개/배지 25 ml), 및 항 CD3 항체(최종농도: 40 ng/ml)과 함께, CTL을 5% ABS/AIM-V 배지 25 ml 중에 배양하였다. 배양을 개시한 다음날, IL-2(최종농도 120 IU/ml)를 각 배양물에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에, IL-2(최종농도: 30 IU/ml)을 포함하는 5%ABS/AIM-V 배지로 배지 교환을 수행하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1);94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 수립
시험관 내에서 CTL 유도 후, 96 웰 둥근-바닥 마이크로 플레이트(96 round-bottomed microtiter plates)(Nalge Nunc International)에 CTL을 1개/웰 또는 10개/웰이 되도록 파종하였다. 마이토마이신 C에 의해 처리된 2 종류의 인간 B 림프아구 세포주(각 1 x 104 개/웰), 항 CD3 항체(최종 농도: 30 ng/ml) 및 IL-2(최종농도: 125 IU/ml)와 함께, 총 150 μl/웰의 5%ABS/AIM-V 배지에서 CTL을 배양하였다. 10일 이후, 500 IU/ml의 IL-2를 포함하는 5%ABS/AIM-V 배지 50 μl를 상기 배양물에 첨가하였다. 14일째 이후, ELISPOT 어세이에서 펩티드 특이적인 IFN-γ 생산을 나타낸 CTL을 상기와 동일한 방법을 이용하여 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).
IFN -γ 생산의 확인
펩티드를 이용하여 유도한 CTL의 펩티드 특이적 IFN-γ 생산을 확인하기 위해, IFN-γ ELISPOT 어세이 및 IFN-γ ELISA를 실행되었다. 펩티드를 펄스한 C1R-A01(1 x 104 개/웰)을 표적세포로서 제조하였다. IFN-γ ELISPOT 어세이 및 IFN-γ ELISA는 어세이 키트 제조업자의 추천하는 설명에 따라 수행되었다.
FOXM1 및 HLA -A*33: 03를 강제 발현시킨 표적세포의 제조
FOXM1 또는 HLA-A*33:03 유전자를 코딩하는 cDNA를 PCR로 증폭하였다. PCR-증폭산물을 각각 발현 벡터에 조합하였다. 제조업자의 추천 설명에 따라, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 HLA 음성세포주인 COS7 세포에 FOXM1 유전자를 발현 벡터 및 HLA-A*33:03 유전자 발현 벡터 중 어느 하나 또는 모두에 도입하였다. 유전자도입 다음날, COS7 세포를 베르센(versene (Invitrogen))을 사용하여 박리 및 회수하고, IFN-γ 생산 확인을 위한 표적 세포(5 x 104 개/웰)로서 사용되었다.
결과
FOXM1에서 유래하는 HLA -A*33:03-결합 펩티드의 예측
표 1a 및 1b는, 각각 "NetMHC pan2.8"에 의해 HLA-A*33:03에 결합이 예측된 FOXM1 유래 9mer 펩타이드 및 10mer 펩타이드를 결합친화성이 높은 순으로 보여준다. HLA-A*33:03에 결합능을 가질 가능성이 있는 총 47종의 펩타이드를 에피토프 펩타이드 후보로 하였다.
[표 1a]
FOXM1으로부터 유래된 HLA-A33 결합 9머 펩티드
Figure pct00001
개시위치는 FOXM1의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호를 나타낸다.
분리상수[Kd(nM)]는 "NetMHC2.8"로부터 도출한 것이다.
[표 1b]
FOXM1으로부터 유래된 HLA-A33 결합 10머 펩티드
Figure pct00002
개시위치는 FOXM1의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호를 나타낸다.
분리상수[Kd(nM)]는 "NetMHC2.8"로부터 도출한 것이다.
HLA -A*33:03 구속성의 FOXM1 유래 예측 펩티드에 의한 CTL의 유도
FOXM1 유래 펩타이드 특이적 CTL을 "재료 및 방법"에 기재한 프로토콜에 따라 유도했다. ELISPOT 어세이에 의해 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산을 확인하였다(도 1).
FOXM1-A33-9-180(서열번호: 1)을 이용한 웰 번호 #6 (a), FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)을 이용한 웰 번호 #3 (b), FOXM1-A33-9-693(서열번호: 3)을 이용한 웰 번호 #4 (c), FOXM1-A33-9-516(서열번호: 6)을 이용한 웰 번호 #3 (d), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)을 이용한 웰 번호 #5 (e), FOXM1-A33-9-289(서열번호: 11)를 이용한 웰 번호 #6 (f), FOXM1-A33-9-228(서열번호: 12)를 이용한 웰 번호 #6 (g), FOXM1-A33-9-502(서열번호: 17)를 이용한 웰 번호 #4 (h), FOXM1-A33-9-321(서열번호: 18)를 이용한 웰 번호 #2 (i), FOXM1-A33-9-341(서열번호: 20)를 이용한 웰 번호 #6 (j), FOXM1-A33-10-514(서열번호: 22)를 이용한 웰 번호 #8 (k), FOXM1-A33-10-179(서열번호: 24)를 이용한 웰 번호 #6 (l), FOXM1-A33-10-501(서열번호: 26)를 이용한 웰 번호 #5 (m), FOXM1-A33-10-124(서열번호: 32)를 이용한 웰 번호 #5 (n), FOXM1-A33-10-595(서열번호: 33)를 이용한 웰 번호 #3 (o), FOXM1-A33-10-546(서열번호: 36)를 이용한 웰 번호 #5 (p), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39)를 이용한 웰 번호 #6 (q), FOXM1-A33-10-607(서열번호: 41)를 이용한 웰 번호 #3 (r), FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42)를 이용한 웰 번호 #2 (s), FOXM1-A33-10-4(서열번호: 45)를 이용한 웰 번호 #6 (t) 및 FOXM1-A33-10-388(서열번호: 46)를 이용한 웰 번호 #5 (u)에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ의 생산이 확인되었다. 한편, 표 1a 및 표 1b에 나타난 다른 펩티드에 대한 특이적인 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다. 예를 들어, FOXM1-A33-10-288(서열번호: 25)에 대한 특이적인 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다(v). 어떤 펩타이드도 HLA-A*03:03에 결합할 가능성이 있었지만, 결과적으로 21종의 펩타이드를 CTL 유도능을 갖는 펩티드로 선택했다.
HLA -A*33:03 구속성 FOXM1 유래 펩타이드 특이적인 CTL 세포주 및 CTL 클론의 수립
IFN-γ ELISPOT 분석에서 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)을 이용한 웰 번호 #3 (a), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)을 이용한 웰 번호 #5 (b), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39)를 이용한 웰 번호 #6 (c), 및 FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42)를 이용한 웰 번호 #2 (d)에서 세포를 증식시키고, CTL 세포주를 수립했다. ELISA에 의한 IFN-γ 측정 결과 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)을 이용한 웰 번호 #3 (a), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)을 이용한 웰 번호 #5 (b), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39)를 이용한 웰 번호 #6 (c) 및 FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42)를 펄스한 표적 세포(C1R-A33)에 대한 CTL 세포주의 IFN-γ 생산이 확인되었다(도 2). 또한 상기의 "재료 및 방법" 섹션에 설명된 대로 한계 희석법에 의해 CTL 클론을 수립했다. ELISA에 의한 IFN-γ 측정 결과, FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)(a) 및 FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7)(b)로 자극한 CTL 클론은, 각각 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산을 보였다(도 3).
FOXM1 및 HLA -A*33: 03를 발현하는 표적 세포에 대한 IFN -γ 생산
FOXM1 및 HLA-A*33:03을 발현하는 표적 세포에 대한 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2) 특이적 CTL 클론의 IFN-γ 생산을 검증했다. FOXM1 및 HLA-A*33:03 모두를 발현시킨 COS7 세포를 표적 세포로 제조하였다. FOXM1 또는 HLA-A*33:03의 어느 한쪽을 발현시킨 COS7 세포를 음성 대조군 세포로 제조하였다. FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2) 특이적 CTL 클론은 FOXM1 및 HLA-A*33:03 모두를 발현하는 COS7 세포에 대한 IFN-γ 생산을 보였다(도 4). 반면 음성 대조군 세포에 대한 유의한 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다. 이로부터 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)이 항원 처리에 의해 발생하는 펩타이드이며 또한 HLA-A*33:03 분자와 함께 세포 표면에 제시되어 CTL에 의해 인식되는 것이 명확하게 입증되었다. 이 결과는 FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2)이 암세포에서 FOXM1의 발현이 항진하고 있는 환자를 대상으로 한 암 백신으로 유용하다는 것을 암시하고 있는 것이다.
항원 펩티드의 상동성 분석
FOXM1-A33-9-180(서열번호: 1), FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2), FOXM1-A33-9-693(서열번호: 3), FOXM1-A33-9-516(서열번호: 6), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7), FOXM1-A33-9-289(서열번호: 11), FOXM1-A33-9-228(서열번호: 12), FOXM1- A33-9-502(서열번호: 17), FOXM1-A33-9-321(서열번호: 18), FOXM1-A33-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A33-10-514(서열번호: 22), FOXM1-A33-10-179(서열번호: 24), FOXM1-A33-10-501(서열번호: 26), FOXM1-A33-10-124(서열번호: 32), FOXM1-A33- 10-595(서열번호: 33), FOXM1-A33-10-546(서열번호: 36), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39), FOXM1-A33-10-607(서열번호: 41), FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42), FOXM1-A33-10-4(서열번호: 45) 및 FOXM1-A33-10-388(서열번호: 46)은, 펩타이드 특이적인 IFN -γ 생산을 나타내는 CTL을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 그래서 FOXM1-A33-9-180(서열번호: 1), FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2), FOXM1-A33-9-693(서열번호: 3), FOXM1-A33-9- 516(서열번호: 6), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7), FOXM1-A33-9-289(서열번호: 11), FOXM1-A33-9-228(서열번호: 12), FOXM1-A33-9-502(서열번호: 17), FOXM1-A33-9-321(서열번호: 18), FOXM1-A33-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A33-10-514(서열번호: 22), FOXM1-A33-10-179(서열번호: 24), FOXM1-A33-10-501(서열번호: 26), FOXM1-A33-10-124(서열번호: 32), FOXM1- A33-10-595(서열번호: 33), FOXM1-A33-10-546(서열번호: 36), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39), FOXM1-A33-10-607(서열번호: 41), FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42), FOXM1-A33-10-4(서열번호: 45) 및 FOXM1-A33-10-388(서열번호: 46)의 서열이 FOXM1 만에서만 유래하는지 확인하기 위해 BLAST 알고리즘(blast.ncbi.nlm.nih.g ov / Blast.cgi)을 이용하여 펩티드 서열의 상동성 분석을 실시했다. 그 결과, FOXM1-A33-9-180(서열번호: 1), FOXM1-A33-9-308(서열번호: 2), FOXM1-A33-9-693(서열번호: 3), FOXM1-A33-9 -516(서열번호: 6), FOXM1-A33-9-146(서열번호: 7), FOXM1-A33-9-289(서열번호: 11), FOXM1-A33-9-228(서열번호: 12), FOXM1-A33-9-502(서열번호: 17), FOXM1-A33-9-321(서열번호: 18), FOXM1-A33-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A33-10-514(서열번호: 22), FOXM1-A33-10-179(서열번호: 24), FOXM1-A33-10-501(서열번호: 26), FOXM1-A33-10-124(서열번호: 32), FOXM1 -A33-10-595(서열번호: 33), FOXM1-A33-10-546(서열번호: 36), FOXM1-A33-10-391(서열번호: 39), FOXM1-A33-10-607 (서열번호 : 41), FOXM1-A33-10-265(서열번호: 42), FOXM1-A33-10-4(서열번호: 45) 및 FOXM1-A33-10-388(서열번호: 46)의 서열은 FOXM1에서만 확인되었다. 따라서 본 발명자들은 아는 한에서는 이들 펩티드는 FOXM1 특유의 것이며, 인간 면역 체계를 감작하는 것이 이미 알려진 것과 같이 FOXM1 이외의 분자에 대한 의도하지 않은 면역 반응을 일으킬 가능성은 거의 없다고 생각된다. 결론적으로, FOXM1 유래의 신규 HLA-A*33:03 구속성 에피토프 펩타이드가 동정되었다. 또한 FOXM1 유래의 에피토프 펩티드는 암 면역 치료에 적용될 수 있는 것이 나타났다.
재료 및 방법
세포주
HLA-A- 및 HLA-B-음성 인간 B 림프아세포성 세포주인 C1R 세포 및 아프리카 녹색원숭이 신장세포주인 COS7 세포는 ATCC로부터 구입했다.
HLA -A*01:01을 정상적으로 발현하는 표적세포의 제작
HLA-A*01:01을 정상적으로 발현하는 C1R 세포(C1R-A01)는 CTL을 자극하는 세포로 사용되었다. HLA-A*01:01 유전자를 코딩하는 cDNA를 PCR로 증폭하여 발현 벡터에 조합하였다. HLA-A*01:01 유전자 발현벡터를 도입한 C1R 세포를 G418(Invitrogen)를 포함하는 배지에서 2주간 약제선택 배양하였다. G418 내성 C1R 세포 현탁액을 희석한 후 96 웰 플레이트에 뿌리고 G418을 포함하는 배지에서 추가로 30일간 선택배양하였다. C1R 세포에서 HLA-A*01:01의 발현을 유동 세포 계측법 분석에서 확인했다.
FOXM1 유래 펩티드의 선택
HLA-A*01:01에 결합이 기대되는 FOXM1 유래 9머 및 10머 펩티드를 결합 예측 서버 "NetMHC 3.4"(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.4/)(Buus S et al., Tissue Antigens 2003, 62(5):378-84; Nielsen M et al., Protein Sci 2003, 12(5):1007-17; Nielsen M et al., Bioinformatics 2004, 20 (9):1388-97)을 사용하여 결정했다.
펩티드의 합성
펩티드는 American Peptide Company (Sunnyvale, CA)으로부터 고체상 합성 방법에 따라 합성되었으며, 역상 고효율 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되었다. HPLC 및 질량 분석법에 의해 상기 펩티드의 품질(순도 90% 이상)이 보증되었다. 펩티드를 20 mg/ml으로 디메틸설폭사이드에 용해하고(최종농도: 20 mg/ml), -80℃에 저장하였다.
시험관 내에서의 CTL 유도
단핵구-유래 수지상세포(DC)를 항원제시세포로 사용하여, 인간 백혈구 항원(HLA)에 제시된 펩티드에 대한 특이적인 세포독성 T 림포싸이트(CTL)을 유도하였다. 이미 문헌에서 보고된 바와 같이, DC는 시험관 내에서 생성되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63(14):4112-8). 구체적으로, 건강한 지원자(HLA-A*01:01-양성)로부터 채취한 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 플라스틱 조직배양 접시(Corning)에 파종하여, PBMC 중 단핵구를 접시에 부착시켰다. 1000 IU/ml의 과립 대식세포 집락 자극인자(R&D System) 및 1000 IU/ml의 인터루킨-4(R&D System)의 존재하에 7일간 배양하였다. 배지에는 5%의 비동화된 AB형 혈청(ABS)를 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)을 이용하였다. 사이토카인으로 단핵구로부터 분화유도된 DC에 20 μg/ml의 각 합성 펩티드로 자극하였다(37℃, 3시간). 펩티드 펄스는, 3 μg/ml 베타 2-마이크로글로불린을 포함하는 AIM-V 배지에서 수행하였다. 펩티드를 펄스한 이들 DC를 X-선 조사(20 Gy)로 불활성화하고, CD8 양성 분리 키트(Invitrogen)를 사용하여 얻어진 자가유래 CD8 양성 T 세포와 1:20의 비율로 혼합(1.5 x 104개의 DC 및 3 x 105개의 CD8 양성 T 세포)하여, 48-웰 플레이트(Corning)에 배양하였다. 1 웰당 5%ABS/AIM-V 배지량은 0.5 ml로 하여, 거기에 IL-7(R&D System)을 첨가하였다(최종농도 10 ng/ml). 배양 개시로부터 2일 후, IL-2(Novartis)를 첨가하였다(최종농도: 20 IU/ml). 배양 7일째 및 배양 14일째에, 펩티드를 펄스한 DC로 CD8 양성 T 세포를 더 자극시켰다. DC는 상기와 같은 방법으로 매번 제조되었다. 21일째 이후(3회의 DC 자극 후), 펩티드를 펄스한 C1R-A01에 대한 IFN-γ 생산을 효소결합면역스팟(ELISPOT) 어세이로 확인하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8):498-506).
CTL의 증식 공정
Riddell et al.에 의해 보고된 것과 유사한 방법을 이용하여 CTL을 증식시켰다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23). 마이토마이신 C에 의해 처리된 2종류의 인간 B 림프아구 세포주(각 5 x 106개/배지 25 ml) 및 항 CD3 항체(최종농도: 40 ng/ml)와 함께 CTL을 5%ABS/AIM-V(AIM-V/5%AS) 배지 25 ml에서 배양하였다. 배양을 시작한 다음날, IL-2(최종농도: 120 IU/ml)를 상기 배양물에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에, IL-2(최종농도: 30 IU/ml)를 포함하는 5%ABS/AIM-V 배지로 배지교환을 수행하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1);94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 수립
시험관 내에서의 CTL 유도 후, 96 웰 둥근-바닥 마이크로플레이트(Nalge Nunc International)에 1개/웰 또는 10개/웰이 되도록 파종하였다. 마이토마이신 C에 의해 처리된 2종류의 인간 B 림프아구 세포주(각 1 x 104개/웰), 항 CD2 항체(최종농도: 30 ng/ml) 및 IL-2(최종농도: 125 IU/ml)와 함께, 총 150 μl/웰의 5%ABS/AIM-V 배지에서 CTL을 배양하였다. 10일 후, 500 IU/ml의 IL-2를 포함하는 5%ABS/AIM-V 배지 50 μl를 상기 배양물에 첨가하였다. 14일째 이후, ELISPOT 어세이에서 펩티드 특이적인 IFN-γ 생산을 나타낸 CTL을 상기와 동일한 방법을 이용하여 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506).
IFN -γ 생산의 확인
펩티드를 이용하여 유도한 CTL의 펩티드 특이적 IFN-γ 생산을 확인하기 위해, IFN-감마 ELISPOT 어세이 및 IFN-감마 ELISA가 수행되었다. 펩티드를 펄스한 C1R-A01(1 x 104개/웰)을 표적세포로서 제조하였다. IFN-감마 ELISPOT 어세이 및 IFN-감마 ELISA는 어세이 키트 제조업자의 추천하는 설명서에 따라 수행되었다.
FOXM1 및 HLA -A*01:01을 강제로 발현하는 표적 세포의 제조
FOXM1 또는 HLA-A*01:01 유전자를 코딩하는 cDNA를 PCR로 증폭하였다. PCR-증폭된 산물을 각각 발현 벡터에 조합하였다. HLA 음성 세포주인 COS7 세포에 FOXM1 유전자 발현 벡터 및 HLA-A*01:01 유전자 발현 벡터 중 어느 하나 또는 모두를, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사가 추천하는 프로토콜에 따라 도입하였다. 유전자 도입 다음날, COS7 세포를 베르센(Invitrogen)을 사용하여 박리 및 회수하여, IFN-γ 생산 확인을 위한 표적세포(5 x 104개/웰)로써 사용하였다.
결과
FOXM1에서 유래하는 HLA -A*01:01 결합 펩티드의 선택
표 2a 및 2b는 각각 "NetMHC 3.4"에 의해 HLA-A*01:01에 결합한다고 예측된 FOXM1 유래 9머 및 10머 펩티드를 결합친화력이 높은 순으로 나타낸다. HLA-A*01:01에의 결합 능력을 갖을 가능성이 있는 총 16종의 펩티드를, 에피톱 펩티 후보로 하였다.
[표 2a]
FOXM1으로부터 유래된, HLA-A01에의 결합이 예측된 9머 펩티드
Figure pct00003
개시위치는 FOXM1의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호를 나타낸다.
분리상수[Kd(nM)]는 "NetMHC3.4"로부터 도출된다.
[표 2b]
FOXM1으로부터 유래된, HLA-A01에의 결합이 예측된 10머 펩티드
Figure pct00004
개시위치는 FOXM1의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호를 나타낸다.
분리상수[Kd(nM)]는 "NetMHC3.4"로부터 도출된다.
HLA -A*01:01 구속성의 FOXM1 유래 펩티드에 의한 CTL의 유도
FOXM1 유래 펩티드 특이적 CTL은 "재료 및 방법"에 서술된 프로토콜에 따라 유도되었다. ELISPOT 어세이로 펩티드 특이적인 IFN-감마 생산을 확인했다(도 5). FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48)를 이용한 웰 번호 #3 (a), FOXM1-A01-9-539(서열번호: 49)를 이용한 웰 번호 #3 (b), FOXM1-A01-9-631(서열번호: 50)를 이용한 웰 번호 #3 (c), FOXM1-A01-9-231(서열번호: 52)를 이용한 웰 번호 #2 (d), FOXM1-A01-9-663(서열번호: 53)를 이용한 웰 번호 #2 (e), FOXM1-A01-9-494(서열번호: 55)를 이용한 웰 번호 #5 (f), FOXM1-A01-9-341(서열번호: 20)를 이용한 웰 번호 #2 (g), FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)를 이용한 웰 번호 #1 (h), FOXM1-A01-10-263(서열번호: 57)를 이용한 웰 번호 #2 (i), FOXM1-A01-10-308(서열번호: 58)를 이용한 웰 번호 #4 (j), FOXM1-A01-10-232(서열번호: 59)를 이용한 웰 번호 #6 (k), FOXM1-A01-10-663(서열번호: 60)를 이용한 웰 번호 #6 (l) 및 FOXM1-A01-10-341(서열번호: 61)를 이용한 웰 번호 #6 (m)에서 펩타이드 특이적인 IFN-γ의 생산이 확인되었다. 한편, 표 1a 및 표 1b에 도시된 다른 펩티드에 대한 특이적인 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다. 예를 들어, FOXM1-A01-10-265(서열번호: 42)에 대한 특이적인 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다(n). 어떤 펩타이드도 HLA-A*01:01에 결합할 가능성이 있지만, 결과적으로 13종의 펩타이드를 CTL 유도능을 갖는 펩티드로 선택했다.
HLA -A*01:01 구속성 FOXM1 유래 펩타이드 특이적인 CTL 세포주 및 CTL 클론의 수립
IFN-γ ELISPOT 분석에서 FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)에 대한 특이적인 IFN-γ 생산을 나타낸 웰 번호 #1 세포를 증식시키고, CTL 세포주를 수립했다. ELISA에 의한 IFN-γ 측정 결과, FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)를 펄스한 표적 세포(C1R-A01)에 대한 CTL 세포주의 IFN-γ 생산이 확인되었다(도 6). 또한 한계 희석법에 의해 CTL 클론을 수립했다. ELISA에 의한 IFN-γ 측정 결과, FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48)(a) 및 FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)(b)로 자극한 CTL 클론은 각각 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산을 나타내었다(도 7).
FOXM1 및 HLA -A*01:01을 발현하는 표적 세포에 대한 IFN -γ 생산
FOXM1 및 HLA-A*01:01을 발현하는 표적 세포에 대한 FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56) 특이적 CTL 클론의 IFN-γ 생산을 검증했다. FOXM1 및 HLA-A*01:01 모두를 발현시킨 COS7 세포를 표적 세포로 제조하였다. FOXM1 또는 HLA-A*01:01의 어느 한쪽을 발현시킨 COS7 세포를 음성 대조군 세포로 제조하였다. FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56) 특이적 CTL 클론은, FOXM1 및 HLA-A*01:01 모두를 발현하는 COS7 세포에 대한 IFN-γ 생산을 나타내었다(도 8). 한편, 음성 대조군 세포에 대한 유의적인 IFN-γ 생산은 확인되지 않았다. 이것으로부터 FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)가 항원 처리에 의해 발생하는 펩타이드이며, 또한 HLA-A*01:01 분자와 함께 세포 표면에 제시되어 CTL에 의해 인식되는 것이 명확하게 입증되었다. 이 결과는 FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56)가 암 세포에서 FOXM1의 발현이 항진하고 있는 환자를 대상으로 한 암 백신으로 유용하다는 것을 암시하는 것이다.
항원 펩티드의 상동성 분석
FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48), FOXM1-A01-9-539(서열번호: 49), FOXM1-A01-9-631(서열번호: 50), FOXM1-A01-9-231(서열번호: 52), FOXM1-A01-9-663(서열번호: 53), FOXM1-A01-9-494(서열번호: 55), FOXM1-A01-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56), FOXM1-A01-10-263(서열번호: 57), FOXM1-A01-10-308(서열번호: 58), FOXM1-A01-10-232(서열번호: 59), FOXM1-A01-10-663(서열번호: 60) 및 FOXM1-A01-10-341(서열번호: 61)은 펩타이드 특이적인 IFN-γ 생산을 나타내는 CTL을 유도할 수 있는 것이 확인되었다. 여기서 FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48), FOXM1-A01-9-539(서열번호: 49), FOXM1-A01-9-631(서열번호: 50), FOXM1-A01-9- 231(서열번호: 52), FOXM1-A01-9-663(서열번호: 53), FOXM1-A01-9-494(서열번호: 55), FOXM1-A01-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56), FOXM1-A01-10-263(서열번호: 57), FOXM1-A01-10-308(서열번호: 58), FOXM1-A01-10-232(서열번호: 59), FOXM1-A01-10-663(서열번호: 60) 및 FOXM1-A01-10-341(서열번호: 61)의 서열이 FOXM1 만에서 유래하는지 확인하기 위해 BLAST 알고리즘(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 펩티드 서열의 상동성 분석을 실시했다. 그 결과, FOXM1-A01-9-233(서열번호: 48), FOXM1-A01-9-539(서열번호: 49), FOXM1-A01-9-631(서열번호: 50), FOXM1-A01-9 -231(서열번호: 52), FOXM1-A01-9-663(서열번호: 53), FOXM1-A01-9-494(서열번호: 55), FOXM1-A01-9-341(서열번호: 20), FOXM1-A01-10-566(서열번호: 56), FOXM1-A01-10-263(서열번호: 57), FOXM1-A01-10-308(서열번호: 58), FOXM1-A01-10-232(서열번호: 59), FOXM1-A01-10-663(서열번호: 60) 및 FOXM1-A01-10-341(서열번호: 61)의 서열은 FOXM1에서만 확인되었다. 따라서 본 발명자들이 아는 한에서는, 펩티드는 FOXM1 특유의 것이며, 인간 면역 체계를 감작하는 것이 이미 알려진 바와 같이 FOXM1 이외의 분자에 대한 의도하지 않은 면역 반응을 일으킬 가능성은 거의 없다고 생각된다. 결론적으로, FOXM1 유래의 신규 HLA-A*01:01 구속성 에피토프 펩타이드가 확인되었다. 또한 FOXM1 유래의 에피토프 펩티드는 암 면역 치료에 적용될 수 있는 것으로 나타났다.
에멀젼 제형의 제조
펩티드를 주사 용매 또는 멸균 생리식염수에 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml이 되도록 용해시키고, 주사기에 모았다. 이는 연결장치를 통해 동등한 양의 주사 용매 또는 멸균 생리식염수에 있는 IFA로 채워진 주사기에 연결되고, 두 연결된 주사기의 주사기 플런저(syringe plungers)로 교대로 누름으로써 혼합시켰다. 몇 분 동안 혼합한 후, 에멀젼의 완성은 방울 테스트(drop test)의 방법으로 평가했다. 방울 테스트 방법은 물에 혼합된 샘플의 한 방울을 떨어뜨림으로써 수행될 수 있다. 상기 에멀젼은 물에 떨어진 샘플 방울이 물에서 바로 확산되지 않을 때 완성되었다고 평가될 수 있으며; 상기 에멀젼은 샘플 방울이 물에 떨어지자마자 바로 확산되면 미완성되었다고 평가될 수 있다. 에멀젼이 미완성이라고 평가될 때, 혼합이 에멀젼을 완성하기 위해 더 수행된다. 완성된 에멀젼은 피하주사에 의해 암 환자에게 투여될 수 있다. 투여될 수 있는 암 환자는 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등으로부터 영향을 받고 있는 환자로부터 선택될 수 있다.
동결건조 제형의 제조
펩티드는 주사 용매에 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml이 되도록 용해시키고 여과하여 멸균시켰다. 이를 멸균된 바이알에 채우고, 멸균된 고무마개로 뚜겅을 반쯤 닫았다. 상기 바이알이 동결건조된 후, 뚜껑을 완전히 닫고 동결건조 제형으로 제조하기 위해 알루미늄 뚜껑을 닫고 봉입하였다. 사용할 때는, 주사 용매 또는 멸균 생리식염수가 동결건조된 파우더를 재-현탁시키기 위한 바이알 내로 주입된다. 바이알 내의 재-현탁 용액은 주사기를 사용하여 모으고, 상기 주사기는 모아진 재-현탁된 용액과 동등한 양의 IFA로 채워진 주사기가 연결된 연결장치에 연결된다. 이들 재-현탁된 용액 및 IFA는 연결된 두 주사기의 주사기 플런저를 교대로 눌러서 혼합시킨다. 몇 분 동안 혼합한 후, 몇 분 동안 혼합한 후, 에멀젼의 완성은 방울 테스트의 방법으로 평가했다. 완성된 에멀젼은 피하주사에 의해 암 환자에게 투여될 수 있다. 투여될 수 있는 암 환자는 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암 등으로부터 영향을 받고 있는 환자로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 강력하고 특이적인 항-종양 면역반응을 유도하고, 따라서 다양한 종류의 암 타입에 적용가능한 FOXM1 유래 신규한 HLA-A33-구속성 및 HLA-A01-구속성 에피톱 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드, 조성물, APC 및 CTL은 FOXM1를 발현하는 암, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암에 대한 펩티드 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명이 본 명세서에서 그의 구체적인 실시예와 함께 상세히 기술되는 동안, 상술한 기술이 예시적 설명적 특징이었고, 본 발명 및 바람직한 실시예를 예시하려는 의도를 가지고 있다는 것이 이해되어야 한다. 일반적인 실험방법을 통해 당업자는 본 발명의 뜻과 범위, 첨부된 청구항에 의해 정의된 경계 및 한계 내에서 용이하게 다양한 변화 및 변형이 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE,INC. <120> FOXM1 PEPTIDES AND VACCINES COMPRISING THE SAME <130> 2018FPI-02-018 <150> JP 2015-200221 <151> 2015-10-08 <150> PCT/JP 2016/079717 <151> 2016-10-06 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from FOXM1 <400> 1 Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from FOXM1 <400> 2 Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from FOXM1 <400> 3 Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from FOXM1 <400> 4 Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from FOXM1 <400> 5 Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide 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ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180 cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240 cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act 292 Met Lys Thr 1 agc ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct 340 Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro 5 10 15 gtt caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc 388 Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser 20 25 30 35 cct gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca 436 Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala 40 45 50 gag tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac 484 Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His 55 60 65 ccc acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat 532 Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn 70 75 80 att cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc 580 Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly 85 90 95 agt agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca 628 Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro 100 105 110 115 act cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc 676 Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala 120 125 130 aaa agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct 724 Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala 135 140 145 agg gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa 772 Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys 150 155 160 cgg gag acc tgt gca gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat 820 Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn 165 170 175 agc cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg 868 Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu 180 185 190 195 ggc tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac 916 Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His 200 205 210 ctg gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg 964 Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala 215 220 225 tcc tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc 1012 Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala 230 235 240 atg ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg 1060 Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu 245 250 255 aaa gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac 1108 Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His 260 265 270 275 att gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg 1156 Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu 280 285 290 cac gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc 1204 His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe 295 300 305 tgg acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg 1252 Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val 310 315 320 ttt aag cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc 1300 Phe Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr 325 330 335 atc aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg 1348 Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu 340 345 350 355 cta cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac 1396 Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn 360 365 370 cag tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg 1444 Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala 375 380 385 gct tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc 1492 Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg 390 395 400 att gcc ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct 1540 Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser 405 410 415 tct gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt 1588 Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe 420 425 430 435 tct cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct 1636 Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro 440 445 450 ggg gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct 1684 Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro 455 460 465 ccc ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca 1732 Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser 470 475 480 tct cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag 1780 Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys 485 490 495 aag tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg 1828 Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met 500 505 510 515 ctt gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg 1876 Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg 520 525 530 aaa cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc 1924 Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe 535 540 545 tca gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca 1972 Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro 550 555 560 gca gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg 2020 Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val 565 570 575 gga gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc 2068 Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser 580 585 590 595 acc ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc 2116 Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu 600 605 610 acg ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc 2164 Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr 615 620 625 tcc cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat 2212 Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp 630 635 640 ctc agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa 2260 Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln 645 650 655 agg ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc 2308 Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly 660 665 670 675 aac tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag 2356 Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu 680 685 690 cca cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg 2404 Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu 695 700 705 gtc ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc 2452 Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile 710 715 720 agc ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac 2500 Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn 725 730 735 tgg tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt 2550 Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln *** 740 745 gctcaagctg tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg 2610 aggacagcag gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa 2670 gtagcagtca caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct 2730 ctgctgtccc tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt 2790 aggaaccccc cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt 2850 gcagggtggt ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa 2910 gcttatttcc ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt 2970 ttcaattgac ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg 3030 gtttcttcca ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt 3090 ggatctgctt gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca 3150 gctttcctgc aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa 3210 tttggggtgg gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt 3270 agatgtttct ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca 3330 ggtggaggct tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc 3390 tcagctttgc 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cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180 cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240 cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act 292 Met Lys Thr 1 agc ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct 340 Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro 5 10 15 gtt caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc 388 Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser 20 25 30 35 cct gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca 436 Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala 40 45 50 gag tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac 484 Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His 55 60 65 ccc acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat 532 Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn 70 75 80 att cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc 580 Ile His Ser Ile 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Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu 200 205 210 gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc 964 Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser 215 220 225 tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg 1012 Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met 230 235 240 ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa 1060 Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys 245 250 255 gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att 1108 Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile 260 265 270 275 gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac 1156 Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His 280 285 290 gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg 1204 Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp 295 300 305 acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag 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ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt 1588 Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe 420 425 430 435 tct cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct 1636 Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro 440 445 450 ggg gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct 1684 Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro 455 460 465 ccc ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca 1732 Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser 470 475 480 tct cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag 1780 Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys 485 490 495 aag tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg 1828 Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met 500 505 510 515 ctt gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg 1876 Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg 520 525 530 aaa cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc 1924 Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe 535 540 545 tca gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca 1972 Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro 550 555 560 gca gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg 2020 Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val 565 570 575 gga gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc 2068 Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser 580 585 590 595 acc ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc 2116 Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu 600 605 610 acg ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc 2164 Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr 615 620 625 tcc cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat 2212 Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp 630 635 640 ctc agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa 2260 Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln 645 650 655 agg ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc 2308 Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly 660 665 670 675 aac tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag 2356 Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu 680 685 690 cca cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg 2404 Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu 695 700 705 gtc ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc 2452 Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile 710 715 720 agc ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac 2500 Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn 725 730 735 tgg tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agccctgccc ttgcccctgt 2550 Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln *** 740 745 gctcaagctg tccaccatcc cgggcactcc aaggctcagt gcaccccaag cctctgagtg 2610 aggacagcag gcagggactg ttctgctcct catagctccc tgctgcctga ttatgcaaaa 2670 gtagcagtca caccctagcc actgctggga ccttgtgttc cccaagagta tctgattcct 2730 ctgctgtccc tgccaggagc tgaagggtgg gaacaacaaa ggcaatggtg aaaagagatt 2790 aggaaccccc cagcctgttt ccattctctg cccagcagtc tcttaccttc cctgatcttt 2850 gcagggtggt ccgtgtaaat agtataaatt ctccaaatta tcctctaatt ataaatgtaa 2910 gcttatttcc ttagatcatt atccagagac tgccagaagg tgggtaggat gacctggggt 2970 ttcaattgac ttctgttcct tgcttttagt tttgatagaa gggaagacct gcagtgcacg 3030 gtttcttcca ggctgaggta cctggatctt gggttcttca ctgcagggac ccagacaagt 3090 ggatctgctt gccagagtcc tttttgcccc tccctgccac ctccccgtgt ttccaagtca 3150 gctttcctgc aagaagaaat cctggttaaa aaagtctttt gtattgggtc aggagttgaa 3210 tttggggtgg gaggatggat gcaactgaag cagagtgtgg gtgcccagat gtgcgctatt 3270 agatgtttct ctgataatgt ccccaatcat accagggaga ctggcattga cgagaactca 3330 ggtggaggct tgagaaggcc gaaagggccc ctgacctgcc tggcttcctt agcttgcccc 3390 tcagctttgc aaagagccac cctaggcccc agctgaccgc atgggtgtga gccagcttga 3450 gaacactaac tactcaataa aagcgaaggt ggacatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3506 <210> 69 <211> 748 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile 165 170 175 Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp 180 185 190 Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn 195 200 205 Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro 210 215 220 Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr 225 230 235 240 Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met 245 250 255 Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe 260 265 270 Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu 275 280 285 Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val 290 295 300 Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp 305 310 315 320 Gln Val Phe Lys Gln Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg 325 330 335 Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met 340 345 350 Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe 355 360 365 Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu 370 375 380 Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys 385 390 395 400 Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala 405 410 415 Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly 420 425 430 Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu 435 440 445 Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val 450 455 460 Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys 465 470 475 480 Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro 485 490 495 Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val 500 505 510 Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg 515 520 525 Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu 530 535 540 Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu 545 550 555 560 Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser 565 570 575 Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro 580 585 590 Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser 595 600 605 Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro 610 615 620 Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly 625 630 635 640 Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu 645 650 655 Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val 660 665 670 Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly 675 680 685 Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr 690 695 700 Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu 705 710 715 720 Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp 725 730 735 Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln 740 745 <210> 70 <211> 3503 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (284)..(2527) <400> 70 tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60 gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120 ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180 cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240 cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act 292 Met Lys Thr 1 agc ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct 340 Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro 5 10 15 gtt caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc 388 Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser 20 25 30 35 cct gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca 436 Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala 40 45 50 gag tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac 484 Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His 55 60 65 ccc acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat 532 Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn 70 75 80 att cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc 580 Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly 85 90 95 agt agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca 628 Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro 100 105 110 115 act cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc 676 Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala 120 125 130 aaa agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct 724 Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala 135 140 145 agg gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa 772 Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys 150 155 160 cgg gag acc tgt gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat agc 820 Arg Glu Thr Cys Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn Ser 165 170 175 cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg ggc 868 Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu Gly 180 185 190 195 tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac ctg 916 Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His Leu 200 205 210 gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg tcc 964 Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala Ser 215 220 225 tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc atg 1012 Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala Met 230 235 240 ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg aaa 1060 Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu Lys 245 250 255 gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac att 1108 Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His Ile 260 265 270 275 gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg cac 1156 Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His 280 285 290 gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc tgg 1204 Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe Trp 295 300 305 acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg ttt 1252 Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val Phe 310 315 320 aag cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc 1300 Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile 325 330 335 aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta 1348 Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu 340 345 350 355 cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag 1396 Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln 360 365 370 tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct 1444 Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala 375 380 385 tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att 1492 Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile 390 395 400 gcc ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct 1540 Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser 405 410 415 gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct 1588 Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser 420 425 430 435 cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg 1636 Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly 440 445 450 gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc 1684 Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro 455 460 465 ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct 1732 Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser 470 475 480 cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag 1780 His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys 485 490 495 tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg ctt 1828 Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu 500 505 510 515 gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa 1876 Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys 520 525 530 cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca 1924 Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser 535 540 545 gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca gca 1972 Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala 550 555 560 gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga 2020 Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly 565 570 575 gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc acc 2068 Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr 580 585 590 595 ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg 2116 Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr 600 605 610 ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc 2164 Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser 615 620 625 cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat ctc 2212 Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu 630 635 640 agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa agg 2260 Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg 645 650 655 ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac 2308 Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn 660 665 670 675 tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca 2356 Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro 680 685 690 cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg gtc 2404 Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val 695 700 705 ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc 2452 Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser 710 715 720 ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg 2500 Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp 725 730 735 tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agc cctgcccttg cccctgtgct 2550 Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln *** 740 745 caagctgtcc accatcccgg gcactccaag gctcagtgca ccccaagcct ctgagtgagg 2610 acagcaggca gggactgttc tgctcctcat agctccctgc tgcctgatta tgcaaaagta 2670 gcagtcacac cctagccact gctgggacct tgtgttcccc aagagtatct gattcctctg 2730 ctgtccctgc caggagctga agggtgggaa caacaaaggc aatggtgaaa agagattagg 2790 aaccccccag cctgtttcca ttctctgccc agcagtctct taccttccct gatctttgca 2850 gggtggtccg tgtaaatagt ataaattctc caaattatcc tctaattata aatgtaagct 2910 tatttcctta gatcattatc cagagactgc cagaaggtgg gtaggatgac ctggggtttc 2970 aattgacttc tgttccttgc ttttagtttt gatagaaggg aagacctgca gtgcacggtt 3030 tcttccaggc tgaggtacct ggatcttggg ttcttcactg cagggaccca gacaagtgga 3090 tctgcttgcc agagtccttt ttgcccctcc ctgccacctc cccgtgtttc caagtcagct 3150 ttcctgcaag aagaaatcct ggttaaaaaa gtcttttgta ttgggtcagg agttgaattt 3210 ggggtgggag gatggatgca actgaagcag agtgtgggtg cccagatgtg cgctattaga 3270 tgtttctctg ataatgtccc caatcatacc agggagactg gcattgacga gaactcaggt 3330 ggaggcttga gaaggccgaa agggcccctg acctgcctgg cttccttagc ttgcccctca 3390 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Ile 580 585 590 Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp 595 600 605 Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val 610 615 620 Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu 625 630 635 640 Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser 645 650 655 Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro 660 665 670 Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser 675 680 685 Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu 690 695 700 Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu 705 710 715 720 Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn 725 730 735 Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln 740 745 <210> 72 <211> 3551 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (284)..(2575) <400> 72 tttcaaacag cggaacaaac tgaaagctcc ggtgccagac cccacccccg gccccggccc 60 gggaccccct cccctcccgg gatcccccgg ggttcccacc ccgcccgcac cgccggggac 120 ccggccggtc cggcgcgagc ccccgtccgg ggccctggct cggcccccag gttggaggag 180 cccggagccc gccttcggag ctacggccta acggcggcgg cgactgcagt ctggagggtc 240 cacacttgtg attctcaatg gagagtgaaa acgcagattc ata atg aaa act 292 Met Lys Thr 1 agc ccc cgt cgg cca ctg att ctc aaa aga cgg agg ctg ccc ctt cct 340 Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu Pro Leu Pro 5 10 15 gtt caa aat gcc cca agt gaa aca tca gag gag gaa cct aag aga tcc 388 Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro Lys Arg Ser 20 25 30 35 cct gcc caa cag gag tct aat caa gca gag gcc tcc aag gaa gtg gca 436 Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val Ala 40 45 50 gag tcc aac tct tgc aag ttt cca gct ggg atc aag att att aac cac 484 Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile Ile Asn His 55 60 65 ccc acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat 532 Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn 70 75 80 att cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc 580 Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly 85 90 95 agt agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca 628 Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro 100 105 110 115 act cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc 676 Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala 120 125 130 aaa agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct 724 Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala 135 140 145 agg gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa 772 Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys 150 155 160 cgg gag acc tgt gca gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat 820 Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn 165 170 175 agc cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg 868 Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu 180 185 190 195 ggc tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac 916 Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His 200 205 210 ctg gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg 964 Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala 215 220 225 tcc tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc 1012 Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala 230 235 240 atg ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg 1060 Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu 245 250 255 aaa gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac 1108 Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His 260 265 270 275 att gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg 1156 Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu 280 285 290 cac gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc 1204 His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe 295 300 305 tgg acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg 1252 Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val 310 315 320 ttt aag cca ctg gac cca ggg tct cca caa ttg ccc gag cac ttg gaa 1300 Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu His Leu Glu 325 330 335 tca cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc 1348 Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile 340 345 350 355 aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta 1396 Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu 360 365 370 cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag 1444 Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln 375 380 385 tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct 1492 Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala 390 395 400 tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att 1540 Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile 405 410 415 gcc ccc aag gtg ctg cta gct gag gag ggg ata gct cct ctt tct tct 1588 Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser 420 425 430 435 gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg ttt gga gaa ggg ttt tct 1636 Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser 440 445 450 cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag gaa gaa atc cag cct ggg 1684 Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly 455 460 465 gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc aaa gtg gag agc cct ccc 1732 Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro 470 475 480 ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct ttc aaa gag gaa tca tct 1780 Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser 485 490 495 cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc acc cca aga ccc aag aag 1828 His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys 500 505 510 515 tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg tgt gtc tcg gaa atg ctt 1876 Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu 520 525 530 gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg agc cgg tct cgg agg aaa 1924 Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys 535 540 545 cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag ccg gag ctg ctc ttc tca 1972 Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser 550 555 560 gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca gag ctc ccg ttc cca gca 2020 Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala 565 570 575 gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc tac tcc cag gaa gtg gga 2068 Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly 580 585 590 595 gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg ctg ccc atc tcc tcc acc 2116 Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr 600 605 610 ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct gaa tcc tgg agg ctc acg 2164 Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr 615 620 625 ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc agc cca gta caa acc tcc 2212 Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser 630 635 640 cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc ctg ggg ctg atg gat ctc 2260 Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu 645 650 655 agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc ctt gaa tca ccg caa agg 2308 Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg 660 665 670 675 ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc tcc gtc ccc ttt ggc aac 2356 Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn 680 685 690 tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag cca ggc tcc ccg gag cca 2404 Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro 695 700 705 cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct ctg aca gaa ggc ctg gtc 2452 Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val 710 715 720 ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag atc ctg ctg gac atc agc 2500 Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser 725 730 735 ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc cct gac aac atc aac tgg 2548 Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp 740 745 750 755 tcc cag ttt att cct gag cta cag tag agccc tgcccttgcc cctgtgctca 2600 Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln *** 760 agctgtccac catcccgggc actccaaggc tcagtgcacc ccaagcctct gagtgaggac 2660 agcaggcagg gactgttctg ctcctcatag ctccctgctg cctgattatg caaaagtagc 2720 agtcacaccc tagccactgc tgggaccttg tgttccccaa gagtatctga ttcctctgct 2780 gtccctgcca ggagctgaag ggtgggaaca acaaaggcaa tggtgaaaag agattaggaa 2840 ccccccagcc tgtttccatt ctctgcccag cagtctctta ccttccctga tctttgcagg 2900 gtggtccgtg taaatagtat aaattctcca aattatcctc taattataaa tgtaagctta 2960 tttccttaga tcattatcca gagactgcca gaaggtgggt aggatgacct ggggtttcaa 3020 ttgacttctg ttccttgctt ttagttttga tagaagggaa gacctgcagt gcacggtttc 3080 ttccaggctg aggtacctgg atcttgggtt cttcactgca gggacccaga caagtggatc 3140 tgcttgccag agtccttttt gcccctccct gccacctccc cgtgtttcca agtcagcttt 3200 cctgcaagaa gaaatcctgg ttaaaaaagt cttttgtatt gggtcaggag ttgaatttgg 3260 ggtgggagga tggatgcaac tgaagcagag tgtgggtgcc cagatgtgcg ctattagatg 3320 tttctctgat aatgtcccca atcataccag ggagactggc attgacgaga actcaggtgg 3380 aggcttgaga aggccgaaag ggcccctgac ctgcctggct tccttagctt gcccctcagc 3440 tttgcaaaga gccaccctag gccccagctg accgcatggg tgtgagccag cttgagaaca 3500 ctaactactc aataaaagcg aaggtggaca tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3551 <210> 73 <211> 763 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 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560 Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro 565 570 575 Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln 580 585 590 Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile 595 600 605 Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp 610 615 620 Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val 625 630 635 640 Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu 645 650 655 Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser 660 665 670 Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro 675 680 685 Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser 690 695 700 Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu 705 710 715 720 Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu 725 730 735 Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn 740 745 750 Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln 755 760 <210> 74 <211> 3665 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acc atg ccc aac acg caa gta gtg gcc atc ccc aac aat gct aat 532 Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn Asn Ala Asn 70 75 80 att cac agc atc atc aca gca ctg act gcc aag gga aaa gag agt ggc 580 Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys Glu Ser Gly 85 90 95 agt agt ggg ccc aac aaa ttc atc ctc atc agc tgt ggg gga gcc cca 628 Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro 100 105 110 115 act cag cct cca gga ctc cgg cct caa acc caa acc agc tat gat gcc 676 Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser Tyr Asp Ala 120 125 130 aaa agg aca gaa gtg acc ctg gag acc ttg gga cca aaa cct gca gct 724 Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys Pro Ala Ala 135 140 145 agg gat gtg aat ctt cct aga cca cct gga gcc ctt tgc gag cag aaa 772 Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys Glu Gln Lys 150 155 160 cgg gag acc tgt gca gat ggt gag gca gca ggc tgc act atc aac aat 820 Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr Ile Asn Asn 165 170 175 agc cta tcc aac atc cag tgg ctt cga aag atg agt tct gat gga ctg 868 Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser Asp Gly Leu 180 185 190 195 ggc tcc cgc agc atc aag caa gag atg gag gaa aag gag aat tgt cac 916 Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu Asn Cys His 200 205 210 ctg gag cag cga cag gtt aag gtt gag gag cct tcg aga cca tca gcg 964 Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg Pro Ser Ala 215 220 225 tcc tgg cag aac tct gtg tct gag cgg cca ccc tac tct tac atg gcc 1012 Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser Tyr Met Ala 230 235 240 atg ata caa ttc gcc atc aac agc act gag agg aag cgc atg act ttg 1060 Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg Met Thr Leu 245 250 255 aaa gac atc tat acg tgg att gag gac cac ttt ccc tac ttt aag cac 1108 Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr Phe Lys His 260 265 270 275 att gcc aag cca ggc tgg aag aac tcc atc cgc cac aac ctt tcc ctg 1156 Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu 280 285 290 cac gac atg ttt gtc cgg gag acg tct gcc aat ggc aag gtc tcc ttc 1204 His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys Val Ser Phe 295 300 305 tgg acc att cac ccc agt gcc aac cgc tac ttg aca ttg gac cag gtg 1252 Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu Asp Gln Val 310 315 320 ttt aag cca ctg gac cca ggg tct cca caa ttg ccc gag cac ttg gaa 1300 Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu His Leu Glu 325 330 335 tca cag cag aaa cga ccg aat cca gag ctc cgc cgg aac atg acc atc 1348 Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn Met Thr Ile 340 345 350 355 aaa acc gaa ctc ccc ctg ggc gca cgg cgg aag atg aag cca ctg cta 1396 Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys Pro Leu Leu 360 365 370 cca cgg gtc agc tca tac ctg gta cct atc cag ttc ccg gtg aac cag 1444 Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln 375 380 385 tca ctg gtg ttg cag ccc tcg gtg aag gtg cca ttg ccc ctg gcg gct 1492 Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro Leu Ala Ala 390 395 400 tcc ctc atg agc tca gag ctt gcc cgc cat agc aag cga gtc cgc att 1540 Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg Val Arg Ile 405 410 415 gcc ccc aag gtt ttt ggg gaa cag gtg gtg ttt ggt tac atg agt aag 1588 Ala Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr Met Ser Lys 420 425 430 435 ttc ttt agt ggc gat ctg cga gat ttt ggt aca ccc atc acc agc ttg 1636 Phe Phe Ser Gly Asp Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile Thr Ser Leu 440 445 450 ttt aat ttt atc ttt ctt tgt tta tca gtg ctg cta gct gag gag ggg 1684 Phe Asn Phe Ile Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly 455 460 465 ata gct cct ctt tct tct gca gga cca ggg aaa gag gag aaa ctc ctg 1732 Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu 470 475 480 ttt gga gaa ggg ttt tct cct ttg ctt cca gtt cag act atc aag gag 1780 Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu 485 490 495 gaa gaa atc cag cct ggg gag gaa atg cca cac tta gcg aga ccc atc 1828 Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile 500 505 510 515 aaa gtg gag agc cct ccc ttg gaa gag tgg ccc tcc ccg gcc cca tct 1876 Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser 520 525 530 ttc aaa gag gaa tca tct cac tcc tgg gag gat tcg tcc caa tct ccc 1924 Phe Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro 535 540 545 acc cca aga ccc aag aag tcc tac agt ggg ctt agg tcc cca acc cgg 1972 Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg 550 555 560 tgt gtc tcg gaa atg ctt gtg att caa cac agg gag agg agg gag agg 2020 Cys Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg 565 570 575 agc cgg tct cgg agg aaa cag cat cta ctg cct ccc tgt gtg gat gag 2068 Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu 580 585 590 595 ccg gag ctg ctc ttc tca gag ggg ccc agt act tcc cgc tgg gcc gca 2116 Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala 600 605 610 gag ctc ccg ttc cca gca gac tcc tct gac cct gcc tcc cag ctc agc 2164 Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser 615 620 625 tac tcc cag gaa gtg gga gga cct ttt aag aca ccc att aag gaa acg 2212 Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr 630 635 640 ctg ccc atc tcc tcc acc ccg agc aaa tct gtc ctc ccc aga acc cct 2260 Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro 645 650 655 gaa tcc tgg agg ctc acg ccc cca gcc aaa gta ggg gga ctg gat ttc 2308 Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe 660 665 670 675 agc cca gta caa acc tcc cag ggt gcc tct gac ccc ttg cct gac ccc 2356 Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro 680 685 690 ctg ggg ctg atg gat ctc agc acc act ccc ttg caa agt gct ccc ccc 2404 Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro 695 700 705 ctt gaa tca ccg caa agg ctc ctc agt tca gaa ccc tta gac ctc atc 2452 Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile 710 715 720 tcc gtc ccc ttt ggc aac tct tct ccc tca gat ata gac gtc ccc aag 2500 Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys 725 730 735 cca ggc tcc ccg gag cca cag gtt tct ggc ctt gca gcc aat cgt tct 2548 Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser 740 745 750 755 ctg aca gaa ggc ctg gtc ctg gac aca atg aat gac agc ctc agc aag 2596 Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys 760 765 770 atc ctg ctg gac atc agc ttt cct ggc ctg gac gag gac cca ctg ggc 2644 Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly 775 780 785 cct gac aac atc aac tgg tcc cag ttt att cct gag cta cag tag a 2690 Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln *** 790 795 800 gccctgccct tgcccctgtg ctcaagctgt ccaccatccc gggcactcca aggctcagtg 2750 caccccaagc ctctgagtga ggacagcagg cagggactgt tctgctcctc atagctccct 2810 gctgcctgat tatgcaaaag tagcagtcac accctagcca ctgctgggac cttgtgttcc 2870 ccaagagtat ctgattcctc tgctgtccct gccaggagct gaagggtggg aacaacaaag 2930 gcaatggtga aaagagatta 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Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr 165 170 175 Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser 180 185 190 Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu 195 200 205 Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg 210 215 220 Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser 225 230 235 240 Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg 245 250 255 Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr 260 265 270 Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn 275 280 285 Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys 290 295 300 Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu 305 310 315 320 Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu 325 330 335 His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn 340 345 350 Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys 355 360 365 Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro 370 375 380 Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg 405 410 415 Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr 420 425 430 Met Ser Lys Phe Phe Ser Gly Asp Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile 435 440 445 Thr Ser Leu Phe Asn Phe Ile Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala 450 455 460 Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu 465 470 475 480 Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr 485 490 495 Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala 500 505 510 Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro 515 520 525 Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser 530 535 540 Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser 545 550 555 560 Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg 565 570 575 Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys 580 585 590 Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg 595 600 605 Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser 610 615 620 Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile 625 630 635 640 Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro 645 650 655 Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly 660 665 670 Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu 675 680 685 Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser 690 695 700 Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu 705 710 715 720 Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp 725 730 735 Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala 740 745 750 Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser 755 760 765 Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp 770 775 780 Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu 785 790 795 800 Gln <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a linker peptide <400> 76 Asn Lys Arg Lys 1

Claims (23)

  1. 하기 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 세포 독성 T 세포(CTL) 유도능력을 갖는 15개 미만 아미노산의 펩티드:
    (a) 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
    (b)서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 (i) 내지 (ii)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 펩티드:
    (i) 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이 아스파라긴산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
    (b) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 알라닌, 이소류신, 류신 및 발린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
    (c) C-말단의 아미노산이 아르기닌 및 리신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
    (ii) 서열번호 48, 49, 50, 52, 53, 55, 20, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:
    (a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 트레오닌 및 세린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨;
    (b) N-말단으로부터 세 번째 아미노산이 아스파라긴산 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환됨; 및
    (c) C-말단 아미노산이 타이로신으로 치환됨.
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 펩티드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물:
    (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수 종류의 펩티드;
    (b) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 하나 또는 복수 종류의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
    (d) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
    (e) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 타겟하는 CTL.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 성분이 하기 (a) 내지 (d)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분이고, CTL(들)을 유도하기 위한, 조성물:
    (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수 종류의 펩티드;
    (b) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 하나 또는 복수 종류의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC); 및
    (d) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀.
  7. 제 5항에 있어서, 약학적 조성물인, 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, (i) 암의 치료, (ii) 암의 예방 및 (iii) 암 수술 후 재발 예방으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 용도를 위한, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 암에 대해 면역반응을 유도하기 위한, 조성물.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 자궁암, 담관세포암, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 식도암, 위암, 미만성위암, 간암, 비-소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 소세포폐암(SCLC), 연조직종양 및 고환암으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  11. 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-A33 및 HLA-A01로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA이 양성인 대상에게 투여되기 위해 제형화된, 조성물.
  12. 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단계를 포함하는 CTL-유도능력을 갖는 APC(들)를 유도하는 방법:
    (a) 시험관 내, 생체 밖 또는 생체 내에서 APC(들)를 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 APC(들)에 도입하는 단계.
  13. 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단계를 포함하는 CTL(들)을 유도하는 방법:
    (a) CD8-양성 T 세포(들)를, HLA 항원 및 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 제시하는 APC(들)와 공-배양하는 단계;
    (b) CD8-양성 T 세포(들)를, HLA 항원 및 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 세포 표면에 제시하는 엑소좀(들)과 공-배양하는 단계; 및
    (c) 세포 표면에 HLA 항원에 의해 제시되는 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR)의 각 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성 T 세포(들)에 도입하는 단계..
  14. HLA 항원 및 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 APC.
  15. 제 14항에 있어서, 제 12항의 방법에 의해 유도된, APC.
  16. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 타겟하는 CTL.
  17. 제 16항에 있어서, 제 13항의 방법으로 유도되는 CTL.
  18. 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법:
    (a) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수 종류의 펩티드;
    (b) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 하나 또는 복수 종류의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
    (d) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
    (e) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 타겟하는 CTL.
  19. 하기 (a) 내지 (e)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 예방하는 방법:
    (a) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 하나 또는 복수 종류의 펩티드;
    (b) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드(들)를 발현가능한 형태로 코딩하는 하나 또는 복수 종류의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 항원-제시 세포(APC);
    (d) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 세포 표면에 제시하는 엑소좀; 및
    (e) 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 타겟하는 CTL.
  20. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 결합하는 항체.
  21. 하기의 단계를 포함하는 CTL-유도능력을 가진 펩티드의 스크리닝 방법:
    (a) 서열번호 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 32, 33, 36, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 및 61로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 원래의 아미노산 서열에 대하여, 하나, 둘, 또는 몇 개의 아미노산 잔기가 치환, 삭제, 삽입 및/또는 추가된 아미노산 서열로 구성된 후보 서열을 생성하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 후보 서열 중에서 FOXM1 이외의 알려진 다른 어떤 인간 유전자 산물과 유의적으로 상동성(서열 동일성)을 갖지 않는 후보 서열을 선별하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 선별된 후보 서열로 구성된 펩티드를 APC(들)와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 APC(들)를 CD8-양성 T 세포(들)와 접촉시키는 단계; 및
    (e) 원래의 아미노산 서열로 구성된 펩티드의 CTL-유도능력과 동일하거나 더 높은 CTL-유도능력을 갖는 펩티드 선택하는 단계.
  22. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 하나 또는 복수 종류의 펩티드, 수용성 담체 및 오일 아쥬번트를 포함하는 에멀젼.
  23. 제 5항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 수용하고 있는 용기 및 아쥬반트를 수용하고 있는 용기를 포함하는 키트.
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