KR20180042412A - 항-lag-3 항체 - Google Patents
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Abstract
림프구-활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 특히, LAG-3 작용제인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 기술된다. 상기 항체는 LAG-3에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제한다. 상기 항체는 약제로서, 특히 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 활성화와 관련된 질환, 예컨대 염증성 및 자가면역 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 림프구-활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 특히 LAG-3의 작용제인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이고, 특히, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 활성화와 관련된 질환, 특히 염증성 및 자가면역 장애의 치료를 위한 약제로서 항체 또는 단편의 용도에 관한 것이다.
림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3)은 4개의 세포외 Ig 슈퍼 패밀리 도메인을 갖는 CD4 동족(homolog) 유형 I 막 단백질이다. CD4와 유사하게, LAG-3은 T 세포의 표면에서 올리고머화되고 항원 제시 세포 (APC) 상에서 MHC 클래스 II 분자에 결합하지만 CD4보다 유의하게 높은 친화도를 갖는다. LAG-3은 활성화된 CD4-양성 및 CD8-양성 T 림프구에서 발현되며, 여기서, 이는 세포 표면에서 CD3-TCR 복합체와 결합하여 신호 전달을 음성적으로 조절한다. 결과적으로, 이는 T 세포 증식, 기능 및 항상성을 음성적으로 조절한다. 특이적 TCR에 의해 MHC 클래스 II-펩티드 복합체의 인식이 발생할 때, 세포 내 신호는 TCR을 통해 T 세포 및 MHC 클래스 II 분자를 통해 APC로 도입된다. T 세포로의 LAG-3 신호전달의 음성적인 조절 역할은 1차 CD4 및 CD8 인간 T-세포 반응에서 작동한다 (Maηon-Lema
tre, et al., Immunology. 2005 Jun; 115(2): 170-178).
LAG-3은 또한 LAG-3의 가용성 형태 (sLAG-3)로 번역되는 대안적인 스플라이스 변이체를 암호화한다. 가용성 분자로서, LAG-3은 MHC 클래스 II 신호전달을 통해 항원-제시 세포 (APC)를 활성화시켜 생체 내 항원-특이적 T-세포 반응을 증가시킨다 (Triebel, Trends Immunol., 2003, 24: 619-622).
인간 및 쥐 LAG-3 단백질의 아미노산 서열이 Huard et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997)의 도 1에 제공되어 있다. 인간 LAG-3 단백질의 서열이 아래 도 1에서 반복된다 (서열번호 27). 인간 LAG-3의 4개의 세포 외 Ig 슈퍼 패밀리 도메인 (D1, D2, D3, 및 D4)의 아미노산 서열은 다음의 아미노산 잔기에 있다: 1-149 (D1) (서열번호 28); 150-239 (D2) (서열번호 29); 240-330 (D3) (서열번호 39); 및 331-412 (D4) (서열번호 51).
Baixeras, et al. (J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337)은 인간 LAG-3 단백질에 대한 마우스 단클론 항체 (이소형 IgG1)인 17B4의 생산을 기술한다. 이러한 항체는 인간 LAG-3의 제1 N-말단 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라(extra)-루프를 인식한다. 17B4는 LAG-3/MHC 클래스 상호작용을 억제하고, LAG-3 신호전달 작용제로서 T 세포 증식을 증가시킨다 (Huard at al, Eur J Immunol. 1996;26:1180-6). 17B4 mAb는 2차 가교제의 부재 하에 T 세포로 세포 내 유리 칼슘 상승을 유도할 수 없는 이의 능력에 의해 결정된 바와 같이, 작용제 활성이 없다 (Hannier et al, J Immunol. 1998;161:4058-65.).
CD8-양성 및 CD4-양성 T 세포의 활성화 및/또는 효과기 기능을 조절할 수 있는 제제가 매우 바람직하다. 특히, 많은 자가면역 장애가 자가반응성 T 세포 및 자가항체가 연관되어 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 면역계의 병원균에 대한 방어 능력을 손상시키지 않으면서 자가반응성 림프구를 억제하거나 제거할 수 있는 제제가 필요하다.
Poirier et al (Clinical and Experimental Immunology, 2011, 164: 265-274)은 세포독성 LAG-3 키메라 항체 (키메라 A9H12)의 평가를 기술한다. 생체 내에서, 항체는 림프절에서 LAG-3+-활성화된 T 세포를 고갈시키고, 개코원숭이에서 투베르쿨린-유도된 지연된 유형의 과민성 (DTH) 모델에서 피부 염증을 감소시키는데 효능을 보였다. 활성화된 T 세포를 특이적으로 고갈시키는 항체는 자가면역 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 유망한 치료 전략을 제시한다.
대안적인 전략으로서, 본 출원인은 LAG-3 작용제가 T 세포를 고갈시키지 않고 T 세포 증식 및/또는 기능을 음성적으로 조절할 것이며, 이러한 작용제는 또한 염증성 또는 자가면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있음을 인지하였다.
본 출원인은 단클론 항-LAG-3 작용성 항체를 생산할 수 있었다. 이러한 항체는 CD4-양성 및 CD-8 양성 T 세포의 항원-유도된 증식을 억제한다. 이러한 항체, 및 이의 항원-결합 단편은 면역 장애, 특히 염증성 및 자가면역 장애를 비롯하여 T-세포 매개된 면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 특히, 항체는 단클론 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본원에 사용된 용어 "LAG-3"은 림프구 활성화 유전자-3을 지칭한다. 용어 "LAG-3"은 변이체, 이소형, 동족체, 오솔로그 및 파라로그를 포함한다. 예컨대, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우에, 인간 이외의 종으로부터의 LAG-3 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는 인간 LAG-3 단백질에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있거나, 특정 다른 종의 LAG-3와 교차반응 할 수 있지만 모든 다른 종의 LAG-3와 교차반응하지는 않는다 (예컨대, 원숭이 LAG-3과 교차반응하지만 마우스 LAG-3과는 교차반응하지 않는다). 용어 "인간 LAG-3"은 인간 서열 LAG-3, 예컨대 유전자은행 기탁 번호 NP 002277 (서열번호 38)을 갖는 인간 LAG-3의 완전한 아미노산 서열, 또는 도 1 (서열번호 27)에 주어진 인간 LAG-3 단백질의 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "마우스 LAG-3"은 마우스 서열 LAG-3, 예컨대 유전자은행 기탁 번호 NP_032505를 갖는 마우스 LAG-3의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. LAG-3은 또한 당업계에서, 예컨대 CD223으로 공지되어 있다. 인간 LAG-3 서열은, 예컨대 보존된 돌연변이 또는 보존되지 않은 영역에서의 돌연변이를 가짐으로써 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3과 다를 수 있고, LAG-3은 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다. 예컨대, 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 본 개시의 항체에 의해 특이적으로 결합된 LAG-3의 세포외 도메인에 에피토프를 갖는 것이거나, 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것이다.
용어 "원숭이 LAG-3"은 시노몰구스 원숭이 LAG-3 및 붉은털 원숭이 (rhesus monkey) LAG-3을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 구세계(Old World) 및 신세계(New World) 원숭이에 의해 발현되는 LAG-3 단백질을 포함하도록 의도된다. 원숭이 LAG-3에 대한 대표적인 아미노산 서열은 붉은털 원숭이 LAG-3 아미노산 서열이며, 이는 또한 유전자은행 기탁 번호 XM_001108923으로 기탁되어 있다. 원숭이 LAG-3에 대한 또 다른 대표적인 아미노산 서열은 US 2011/0150892 A1에 기술된 클론 pa23-5의 대안적인 붉은털 원숭이 서열이다. 이러한 대안적인 붉은털 원숭이 서열은, 유전자은행에 기탁된 서열에 비해, 419번 위치에서 단일 아미노산 차이를 나타낸다.
특정 인간 LAG-3 서열은 일반적으로 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 인간 LAG-3과 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고, 다른 종 (예컨대 쥐)의 LAG-3 아미노산 서열과 비교했을 때 아미노산 서열을 인간으로 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에서, 인간 LAG-3은 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 LAG-3에 대한 아미노산 서열에서 적어도 95%, 또는 심지어는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 LAG-3 서열은 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 LAG-3 서열보다 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 구현예에서, 인간 LAG-3은 유전자은행 기탁 번호 NP_002277의 LAG-3 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 퍼센트 동일성은 본원에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제한다.
본 발명의 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 단리된 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
용어 "작용성"은 본원에서 용어 "작용제"와 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 따라, LAG-3에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식, 및/또는 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식, 및 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 억제한다. 특정 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식보다 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 더 억제한다.
도 21은 고갈 항-LAG-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체와 본 발명의 항체 (즉, 작용성 항-LAG-3 항체, 및 LAG-3에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제하는 항체)의 사이의 차이를 설명한다.
고갈 항-LAG-3 항체는 세포 표면 상에 발현된 LAG-3에 결합하여 활성화된 T 세포 고갈을 야기한다. 고갈은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)에 의해, 또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 발생할 수 있다. ADCC에서, 고갈 항체의 Fc 영역은 자연 살해자 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체 (FcγRs)에 결합하여 표적화된 세포의 용해를 유도한다. CDC에서, 고갈 항체의 Fc 영역은 보체의 C1q 성분에 결합하고, 표적화된 세포는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발시킴으로써 사멸된다. 따라서, 고갈 항-LAG-3 항체는 T 세포-매개된 면역 반응을 억제한다. 고갈 항-LAG-3 항체의 효과는 오래 지속되고 , 이들이 활성화된 T 세포의 파괴를 야기하기 때문에 비가역적인 것으로 평가될 것이다. 이러한 항체는, 예컨대 염증성 및 자가면역 장애의 치료, 및 이식 거부 예방에 유용하다.
길항제 항-LAG-3 항체는 활성화된 T 세포의 표면 상에서 LAG-3와 결합하고, LAG-3과 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상의 MHC 클래스 II 분자의 상호작용을 방지한다. 이는 APC가 활성화된 T 세포 상의 LAG-3에 결합할 때 발생하는 신호 전달의 음성적인 조절을 차단한다. 결과적으로, 길항제 항-LAG-3 항체는 LAG-3에 의해 정상적으로 매개되는 T 세포 증식, 기능 및 항상성의 음성적인 조절을 방지한다. 이러한 항체는, 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 항체는 활성화된 T 세포의 표면 상에서 LAG-3에 결합하고, LAG-3의 작용을 통해 신호 전달을 음성적으로 조절하여, T 세포 증식 및/또는 활성화의 음성적인 조절을 야기한다. 따라서, 본 발명의 항체는 T 세포-매개된 면역 반응을, 특히 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 및/또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제함으로써 억제한다. 이러한 항체의 효과는 가역적이고, 활성화된 T 세포의 파괴를 일으키지 않으므로 고갈 항-LAG-3 항체의 효과보다 덜 지속적일 수 있다. 본 발명의 항체의 효과적인 시간의 길이는 항체의 혈장 반감기에 의존할 것임을 이해할 것이다.
항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식의 억제는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 적절한 방법의 예시는, 동일한 이소형의 음성 대조군 항체의 존재 하에 상응하는 증식과 비교하여, 항체 또는 단편의 존재 하에 항원성 펩티드에 의해 유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 측정하는 것이다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는, 예컨대 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플 중에 존재할 수 있다. 세포의 증식은 CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 같은 임의의 적절한 항원성 펩티드에 의해 유도될 수 있다. 세포의 증식은 예컨대 형광성 세포 염색 염료, 예컨대 카복시플루오레신 숙신이미딜 에스터 (CFSE)로 세포를 표지함으로써 측정될 수 있다. 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식의 억제를 측정하는 방법의 예시가 하기 실시예 10에 보다 상세하게 기술되어 있다.
항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식의 억제 퍼센트는 다음의 합으로서 계산된, 증식 지수 (PI)의 억제 퍼센트로서 결정될 수 있다: 하기 실시예 10에 보다 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 각각의 분열 피크(FACS에 의해 평가됨) 하의 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 퍼센트에 분열 수를 곱한 것.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 시에 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식에 비해, 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%까지 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 시에 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식에 비해, 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%까지 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 시에 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식, 및 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식에 비해, 각각 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식, 및 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 각각 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%까지 억제한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 시에 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식에 비해 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식을 적어도 20%까지 억제하고, 항체 또는 단편의 부재 시에 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식에 비해 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 적어도 30%까지 억제한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편에 의한 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식의 억제는, 동일한 이소형 또는 이의 단편의 음성 대조군 항체의 존재 하에 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식과 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편이 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식을 억제하는 것보다 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 억제한다.
일부 구현예에 따르면, 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식의 억제는 LAG-3에 의존적이고 IL-2에 독립적이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식 및 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제한다.
특히, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, LAG-3에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, LAG-3에 결합하여 항원-유도된 CD4+ T 세포 활성화 및 항원-유도된 CD8+ T 세포 활성화를 억제한다.
CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화의 억제는 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 적절한 방법의 예는, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화 마커 발현, 또는 T 세포 활성화 마커 분비 상에서, 항체 또는 단편의 효과를 측정하는 것이다. 예컨대, CD8+ T 세포 활성화는, 동일한 이소형의 음성 대조군 항체의 존재 하에 상응하는 CD25 발현과 비교하여, 항체 또는 단편의 존재 하에 항원성 펩티드에 의해 유도된 CD8+ T 세포 상에서, 활성화 마커로서 CD25의 발현을 결정함으로써 측정될 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화는, 동일한 이소형의 음성 대조군 항체의 존재 하에 상응하는 분비와 비교하여, 항체 또는 단편의 존재 하에 항원성 펩티드에 의해 유도된 T 세포의 세포 상등액 중의 IFN-γ의 분비를 측정함으로써 측정될 수 있다. T 세포는, 예컨대 건강한 공여자로부터 수득된 PBMC의 샘플 중에 존재할 수 있다. 세포 활성화는 임의의 적절한 항원성 펩티드, 예컨대 CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀에 의해 유도될 수 있다. T 세포 활성화 마커 분비의 측정에 의한 항원-유도된 T 세포 활성화의 억제를 측정하기 위한 방법의 예시가 하기 실시예 15에 보다 상세하게 기술되어 있다. CD8+ T 세포 활성화 마커 발현의 측정에 의한 항원-유도된 CD8+ T 세포 활성화의 억제를 측정하기 위한 방법의 예시가 하기 실시예 16에 보다 상세하게 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 시의 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화에 비해, 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%까지 억제한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편에 의한 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화의 억제는, 동일한 이소형 또는 이의 단편의 음성 대조군 항체의 존재 하의 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화와 비교될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 억제한다.
IMP321 (이하 "LAG-3Ig"로도 지칭됨)은 재조합 가용성 인간 LAG-3Ig 융합 단백질이다. 융합 단백질은 인간 IgG1 Fc에 융합된 인간 LAG-3의 세포외 도메인을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 200-kDa 이량체로서 수득된다. IMP321의 서열은 미국특허출원 제2011/0008331호의 서열번호 17에 제공되어 있다.
IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합은, 예컨대 하기 실시예 8에 기술되어 있는 바와 같이, IMP321-표지 접합체 (예컨대 IMP321-Alex 488 접합체)의 Raji 세포 (이들은 MHC 클래스 II-양성 B 세포임)로의 결합을 측정함으로써 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하의 IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합과 비교하여, IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하의 IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합과 비교하여, IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 적어도 30%까지 억제하며, 여기서, 항체 또는 단편 대 IMP321의 농도의 비율은 0.1:1이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하의 IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합과 비교하여, IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 적어도 80%까지 억제하며, 여기서, 항체 또는 단편 대 IMP321의 농도의 비율은 0.3:1 또는 1:1이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, IMP321-유도된 단핵구 활성화를 억제한다.
IMP321은 인간 단핵구 세포주 THP-1의 세포를 활성화시킬 수 있다. THP-1 세포의 활성화는 THP-1 세포에 의한 케모카인 리간드 4 (CCL4, 또한, 대식세포 염증성 단백질 -1β, MIP-1β로도 공지됨)의 분비 수준에 의해 결정될 수 있다. 혼합물을 THP-1 세포와 인큐베이션 하기 전에 본 발명의 항체 또는 단편을 IMP321과 사전 인큐베이션하는 것이, 항체 또는 단편이 IMP321-유도된 단핵구 활성화를 억제하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. IMP321-유도된 단핵구 활성화의 억제를 결정하기 위한 방법이 하기 실시예 9에 보다 상세하게 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하에 IMP321-유도된 단핵구 활성화의 양과 비교하여, IMP321-유도된 단핵구를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하에 IMP321-유도된 단핵구 활성화의 양과 비교하여, IMP321-유도된 단핵구 활성화를 적어도 70%까지 억제하며, 여기서, 항체 또는 단편 대 IMP321의 농도의 비율은 1:1이다.
Huard et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997)은 LAG-3 단백질 상의 MHC 클래스 II 결합 부위의 특징을 기술한다. MHC 클래스 II 단백질 결합에 필수적인 다수의 잔기는 LAG-3 D1 도메인 내의 큰 30개의 아미노산 엑스트라-루프 구조의 기저에 모여있다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 엑스트라-루프 구조의 아미노산 서열은 GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (서열번호 40)이며, 도 1에 밑줄친 서열이다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, LAG-3 상의 MHC 클래스 II 결합 부위와 중첩된 인간 LAG-3의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 인간 LAG-3의 제1 N-말단 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라-루프와 중첩된 에피토프에 결합할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 인간 LAG-3의 제1 N-말단 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라-루프 서열 (서열번호 40)에 결합하지 않는다.
본 발명의 항체는 생체 내에서 LAG-3의 MHC 클래스 II 분자로의 결합을 억제할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 MHC 클래스 II-활성화 신호를 항원-제시 세포 (APC)로 길항할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 LAG-3-유도된 APC 활성화, 예컨대 수지상 세포 활성화, 예컨대 LAG-3-유도된 단핵구 또는 대식세포 활성화를 억제할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하에 LAG-3의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합과 비교하여, LAG-3의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편의 부재 하에 LAG-3-유도된 APC 활성화의 양과 비교하여, LAG-3-유도된 APC 활성화를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 억제한다.
본 발명의 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 영역의 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 영역의 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 또한 제공된다.
항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 1, 2, 및 3의 CDR일 수 있고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 4, 5 및 6의 CDR일 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열번호 1, 2, 및 3을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 아미노산 서열번호 4, 5, 및 6을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 서열번호 1, 2, 및 3의 CDR은 VH 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 4, 5, 및 6의 CDR은 VL 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 아미노산 서열 서열번호 1을 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열번호 2를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열번호 3을 갖는 CDR-H3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 4를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 서열번호 6을 갖는 CDR-L3을 포함한다.
항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 21, 22, 및 23의 CDR일 수 있고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 24, 25, 및 26의 CDR일 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 21, 22, 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 24, 25, 및 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 서열번호 21, 22, 및 23의 CDR은 VH 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 24, 25, 및 26의 CDR은 VL 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은, 아미노산 서열 서열번호 21을 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열번호 22를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열번호 23을 갖는 CDR-H3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 24를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열번호 25를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 서열번호 26을 갖는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 1, 2, 3, 21, 22, 및 23의 CDR로부터 선택되고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 4, 5, 6, 24, 25, 및 26의 CDR로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하며, 여기서, VH CDR1은 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR2는 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR3은 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서:
VH CDR1은 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2는 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1은 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR2는 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1은 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2는 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하고, 여기서, VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서:
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 다음을 포함하는 항체 VH 영역: 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 다음을 포함하는 항체 VL 영역: 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열번호 6 및 26로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 VL 영역을 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 본원의 실시예 1, 2, 및 3에 기술된 마우스 단클론 항-LAG-3 항체 13E2의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열(13E2 VH 아미노산 서열: 서열번호 7; 13E2 VL 아미노산 서열: 서열번호 8)과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한, 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역 및/또는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, LAG-3에 대한 결합이 아미노산 서열 서열변호 7을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, LAG-3에 대한 결합이 마우스 단클론 항-LAG-3 항체 13E2와 경쟁하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
본 발명의 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 영역의 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 영역의 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 11, 12, 및 13의 CDR일 수 있고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 14, 15, 및 16의 CDR일 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 14, 15, 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 서열번호 11, 12, 및 13의 CDR은 VH 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 14, 15, 및 16의 CDR은 VL 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 항체, 또는 이의 단편은, 아미노산 서열 서열번호 11을 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열번호 12를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열번호 13을 갖는 CDR-H3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 14를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열번호 15를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 서열번호 16을 갖는 CDR-L3을 포함한다.
항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 31, 32, 및 33의 CDR일 수 있고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 34, 35, 및 36의 CDR일 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 34, 35, 및 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 서열번호 31, 32, 및 33의 CDR은 VH 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있고, 아미노산 서열 서열번호 34, 35, 및 36의 CDR은 VL 영역에서 임의의 순서로 존재할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 항체, 또는 이의 단편은, 아미노산 서열 서열번호 31을 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열번호 32를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열번호 33을 갖는 CDR-H3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 34를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열번호 35를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 서열번호 36을 갖는 CDR-L3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 11, 12, 13, 31, 32, 및 33의 CDR로부터 선택되고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 14, 15, 16, 34, 35, 및 36의 CDR로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하고, 여기서, VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서:
VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR2는 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하며, 여기서, VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR3은 서열번호 16 및 36으부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서:
VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 16 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 16 및 36로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 16 및 36로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 다음을 포함하는 항체 VH 영역: 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 다음을 포함하는 항체 VL 영역: 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 VL 영역을 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 본원의 실시예 4, 5 및 6에 기술된 바와 같은 마우스 단클론 항-LAG-3 항체 34F4의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열(34F4 VH 아미노산 서열: 서열번호 17; 34F4 VL 아미노산 서열: 서열번호 18)과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역 및 항체 VL 영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, LAG-3에 대한 결합이 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, LAG-3에 대한 결합이 마우스 단클론 항-LAG-3 항체 34F4과 경쟁하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이는 하나 이상의 보존적 변형, 예컨대 최대 5개의 보존적 변형에 의해 항체 13E2 또는 34F4의 것과는 상이하다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다. 예컨대, 다음을 참조한다: Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 및 Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해, 예컨대 부위-지시된 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예컨대 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (에컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기술된 기능성 분석법을 사용하여 보유된 기능 (즉, 전술된 기능)에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 항체는, 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 13E2 또는 34F4의 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 모두의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예컨대 하나 이상의 CDR 영역 내의, 및/또는 하나 이상의 골격(framework) 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는, 예컨대 항체의 효과기 기능을 변경시키기 위해 불변 영역 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 이식이 항체의 가변 영역을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별적인 항체 사이에서 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 골격 서열 상에 이식된 특이적인 자연 발생적인 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특이적인 자연 발생적인 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예컨대, 다음을 참조한다: Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; 미국특허 5,225,539; 5,530,101; 5,585, 089; 5,693,762 및 6,180,370).
또한, 본 발명에 따르면, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8(즉, 13E2의 CDR)을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 이러한 항체는 단클론 항체 13E2의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들은 상이한 골격 서열을 함유할 수 있다.
유사하게, 또한, 본 발명에 따르면, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18 (즉, 34F4의 CDR)의 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 이러한 항체는 단클론 항체 34F4의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들은 상이한 골격 서열을 함유할 수 있다.
이러한 골격 서열은 공개 DNA 데이터베이스 또는 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 문헌으로부터 수득될 수 있다. 예컨대, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 (다음의 인터넷에서 이용가능함 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), 및 Kabat et al. (1991), cited supra; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836에서 확인할 수 있으며, 이들 각각의 내용은 참조로써 본원에 명백하게 포함되어 있다. 또 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 유전자은행 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예컨대, HCo7 HuMAb 마우스 에서 발견되는 다음의 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 유전자은행 접근 번호 1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 3-33 (NG_0010109 & NT_024637) 및 3-7 (NG_0010109 & NT_024637)에서 이용가능하다. 또 다른 예로서, HCol2 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음의 중쇄 생식계열 서열은 첨부의 유전자은행 접근 번호 1-69 (NG_0010109, NT_024637 & BC070333), 5-51 (NG_0010109 & NT_024637), 4-34 (NG_0010109 & NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678)에서 이용가능하다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지된 Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), 전술됨)라고 지칭되는 서열 유사도 검색 방법 중 하나를 사용하여 컴파일된 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교된다.
본 발명의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 골격 서열은 13E2 또는 34F4 항체의 골격 서열과 구조적으로 유사한 것들이다.
단클론 항체 13E2의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 유의한 정렬을 나타내는 서열은 다음의 생식계열 유전자를 포함한다: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
단클론 항체 13E2의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 유의한 정렬을 나타내는 서열은 다음의 생식계열 유전자를 포함한다: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
단클론 항체 34F4의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 유의한 정렬을 나타내는 서열은 다음의 생식계열 유전자를 포함한다: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
단클론 항체 34F4의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 유의한 정렬을 나타내는 서열은 다음의 생식계열 유전자를 포함한다: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
본 발명의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 중쇄 골격 서열은 생식계열 V 유전자 IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, 또는 IGHV8-12*01, 특히 IGHV8-8*01에 의해 암호화된 골격 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. 본 발명의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 경쇄 골격 서열은 생식계열 V 유전자 IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, 또는 IGKV6-23*01, 특히 IGKV6-17*01에 의해 암호화된 골격 서열과 구조적으로 유사한 것들이다.
VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 골격 서열로부터 유래된 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 골격 영역 상에 이식될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 골격 영역 상에 이식될 수 있다. 예컨대, 특정 경우에서, 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 향상시키기 위해 골격 영역 내의 잔기를 돌연변이 시키는 것이 유리한 것으로 확인되었다 (예컨대, 미국특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
가변 영역 변형의 또 다른 유형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심있는 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예컨대, 친화도)을 개선하는 것이다. 부위-지시된 돌연변이 유발 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이를 도입하고 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심있는 다른 기능적인 특성이 본원에 기술되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관 내 또는 생체 내 분석법에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형 (상술된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가, 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 잔기가 변형된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 잔기가 총 모든 6개의 CDR 영역에서 변경된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 항체 VH 영역: 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 다음을 포함하는 항체 VL 영역: 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 서열번호 6 및 26로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 또는
CDR 서열 내에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 잔기가 아미노산 치환, 부가, 또는 결실에 의해 변형된 이의 변이체.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 항체 VH 영역: 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 13 및 33로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 다음을 포함하는 항체 VL 영역: 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 16 및 36로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 또는
CDR 서열 내에 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 잔기가 아미노산 치환, 부가, 또는 결실에 의해 변경된 이의 변이체.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-LAG-3 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역: (a) 서열번호 1, 또는 서열번호 1에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호 2, 또는 서열번호 2에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역, 및 (c) 서열번호 3, 또는 서열번호 3에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역, 및/또는 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역: (a) 서열번호 4, 서열번호 4에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (b) 서열번호 5, 또는 서열번호 5에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 6, 또는 서열번호 6에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
추가의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-LAG-3 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역: (a) 서열번호 11, 또는 서열번호 11에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호 12, 또는 서열번호 12에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역; 및/또는 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역: (a) 서열번호 14, 또는 서열번호 14에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (b) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 16, 또는 서열번호 16에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-LAG-3 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역: (a) 서열번호 21, 또는서열번호 21에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호 22, 또는서열번호 22에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; 및/또는 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역: (a) 서열번호 24, 또는 서열번호 24에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (b) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 26, 또는 서열번호 26에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
추가의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-LAG-3 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역: (a) 서열번호 31, 또는 서열번호 31에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호 32, 또는 서열번호 32에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 33, 또는 서열번호 33에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; 및/또는 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역: (a) 서열번호 34, 또는 서열번호 34에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (b) 서열번호 35, 또는 서열번호 35에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 36, 또는 서열번호 36에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체는, 예컨대 항체의 특성을 개선하기 위해, VH 및/또는 VL 내의 골격 잔기에 대한 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 골격 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예컨대, 하나의 접근법은 하나 이상의 골격잔기를 상응하는 생식계열 서열에 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과 상이한 골격 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체가 유래된 생식계열 서열과 항체 골격 서열을 비교함으로써 식별될 수 있다.
골격 변형의 또 다른 유형은 골격 영역 내의, 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고 미국 공개특허 20030153043에 보다 상세하게 기술되어 있다.
골격 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에 또는 이에 대안적으로, 본 발명의 항체는 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적인 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적인 세포의 세포독성을 변경하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예컨대, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 변형되어 이의 글리코실화를 변경시키고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적인 특성을 변경시킬 수 있다. 이러한 구현예 각각은 아래에 보다 상세하게 기술되어 있다. Fc 영역에서 잔기의 번호매김은 Kabat의 EU 색인이다.
일 구현예에서, CF11의 힌지 영역은, 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예컨대 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 추가로 미국특허 5,677,425에 기술되어 있다. CF11의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기 수는, 예컨대 경쇄 및 중쇄의 조립이 용이하도록, 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이 된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 스타필로코실(Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합을 손상시키도록 Fc-힌지 단편의 CF12-CF13 도메인 인터페이스 영역에 하나 이상의 돌연변이가 도입된다. 이러한 접근법은 또한 미국특허 6,165,745에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. IgG 클래스는 가장 안정하고 20일의 혈청 반감기를 갖는 반면, IgM 및 IgA는 5 내지 8일동안만 지속된다 (Brekke & Sandlie, 2003, Nature Reviews Drug Discovery 2, 52-62). 다양한 접근법이 가능하다. 예컨대, 하나 이상의 다음의 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F, 미국특허 6,277,375에 기술되어 있음. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 미국특허 5,869,046 및 6,121,022에 기술된 바와 같이, 항체는 CF11 또는 CL 영역 내에서 변경되어 IgG의 Fc 영역의 CF12 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 구조 수용체 결합 에피토프를 함유할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, ADCC 또는 CDC의 결과로 고갈 T 세포 없이 항체 또는 단편이 T 세포 증식을 음성적으로 조절하고/하거나 기능하는데 사용될 수 있도록 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)이 결여되어야 한다.
ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 면역 효과기 세포, 예컨대 자연 살해자 및 대식세포의 표면 상에서 Fc 수용체 (FcγRs)에 결합하여 표적화된 세포의 용해를 야기한다. CDC에서, Fc 영역은 보체의 C1q 성분에 결합하고, 표적화된 세포는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발하여 살해된다. 항체의 ADCC 및 CDC 활성은 이의 이소형에 의존한다. IgM 및 IgG 모두는 보체 고정을 매개할 수 있는 반면, IgG만이 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 촉진시킬 수 있다. IgG 이소형은 상이한 수준의 CDC 및 ADCC를 나타낸다:
IgG:
CDC (hIgG3>hIgG1>hIgG2>hIgG4; mIgG2a>mIgG1);
ADCC (hIgG1=hIgG3>hIgG2≥=IgG4; mIgG2a>mIgG1)
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체 또는 단편이 ADCC 및 CDC 활성을 갖지 않도록 하기 위해 마우스 IgG1, 또는 인간 IgG4 Fc 부분을 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 ADCC 및 CDC 활성은 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. CDC 및 ADCC 활성의 적절한 분석법의 예가 WO 2008/132601 및 아래에 기술되어 있다.
CDC 활성을 나타내는 항-LAG-3 항체는 이의 이소형 대조군에 비해, 보체의 존재 하에 지속적으로 LAG-3+ 세포를 사멸시킬 것이다.
CDC 시험에서, 항-LAG-3 항체를 평가하기 위해 사용된 표적 세포는 LAG-3-형질감염된 세포주, 또는 LAG-3의 발현을 유도하기 위해 활성화된 1차 T 세포일 수 있다. 예컨대, CDC 시험에 대한 하나의 가능한 분석법에서, 표적 세포는 wt CHO 세포와 비교되는 LAG-3+ CHO 세포이다. 둘 모두의 세포 유형 (즉, LAG-3을 발현하는 세포, 및 LAG-3을 발현하지 않는 동등한 세포)은 항-LAG-3 시험 항체, 또는 이의 이소형-매칭된 음성 대조군 항체, 및 활성 보체를 함유하는 토끼 혈청과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 된다. 세포 생존력은 이어서, 7-아미노-액티노마이신 D (7-AAD)을 사용하여 평가되며, 이는 이의 막 온전성(membranous integrity)을 상실한 형광 염료 표지 세포이며, 이는 사멸 후에 신속하게 나타나는 현상이다. 7-AAD-양성 CHO 세포 (즉 사멸된 표적 세포)의 퍼센트는 유동 세포 계측법 분석에 의해 결정된다. CDC 활성을 나타내는 항체는 보체의 존재 하에 LAG-3+ 세포 (예컨대, LAG-3+ CHO 세포)만을 사멸시킬 것이다. 항-LAG-3 Ab는 낮은 항체 농도에서 CDC를 활성화시키기 위한 항체의 효능을 결정하기 위해 측정될 수 있다.
CDC 분석은 또한 초항원 SEB로 자극된 PBMC 상에서 수행될 수 있다. 시험 항체의 세포독성은 활성화된 (즉, CD25+/LAG-3+ 세포) 및 비-활성화된 (즉, CD25-/LAG-3- 세포) CD4+ 헬퍼 T 및 CD8+ 세포독성 T 세포 둘 모두에서 분석된다. 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포만이 CDC를 나타내는 항체에 의해 특이적으로 사멸된다.
ADCC 시험에서, PMBC는 효과기 세포로서 기능하기 위해 IL-2로 1일 동안 자극되고 LAG-3 발현 세포 (예컨대, LAG-3+ CHO 세포)는 표적 세포로서 기능하기 위해 필수 염료인 CFSE 로 표지된다. 항-LAG-3 항체의 존재 하에, 효과기 세포 (PBMC)가, 이소형-매칭된 음성 대조군 항체에 비해, LAG-3-발현 세포 (예컨대, LAG-3+ CHO 세포)의 유의한 퍼센트를 사멸시킬 수 있는 경우, 시험 항체는 ADCC를 나타낸다. 이러한 효과는 효과기 세포의 수와 함께 증가해야 한다. 시험 항체는 저농도의 항체에서 ADCC를 유도하기 위한 항체 효능을 결정하기 위해 적정될 수 있다.
시험 항-LAG-3 항체는, 전술한 임의의 분석법에서 이소형-매칭된 음성 대조군 항체와 비교하여, 2배 이하의 LAG-3+ 세포를 사멸시키는 경우 CDC 또는 ADCC를 나타내지 않는 것으로 간주될 수 있다.
표적 세포의 사멸은 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 자연 살해 (NK) 세포 하위집단을 효과기 세포로 사용하는 고전적인 ADCC 생물분석에서 사용된다. 그러나, 이러한 세포는 반응이 다양할 수 있고, 배경 판독 값이 높아질 수 있다. Promega로부터 이용가능한 ADCC 리포터 생물분석법은 ADCC 경로 활성화의 초기 시점에서 다른 판독값을 사용한다: 효과기 세포에서 NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 경로를 통한 유전자 전사의 활성화. 또한, ADCC Reporter Bioassay는 FcγRIIIa 수용체, V158 (고친화도) 변이체, 및 효과기 세포로서 반딧불 루시퍼라제 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 세포를 사용한다. ADCC에서 항체 생물학적 활성은 NFAT 경로 활성화의 결과로서 생성된 루시퍼라제를 통해 정량화된다; 효과기 세포에서 루시퍼라제 활성은 발광 판독값으로 정량화된다. 이러한 분석법을 사용하면, 신호가 높고 분석 배경이 낮다. 우수한 분석 반응은 올바른 표면 항원, 올바른 특이적 항체, 및 FcγRIIIa를 발현하는 효과기 세포를 가진 표적 세포가 존재할 때에만 수득된다. 이들 중 임의의 하나가 없는 경우, 반응은 없다.
ADCC 리포터 생물분석법을 사용하여 항체의 ADCC 활성을 평가할 때, 시험된 항체는 생물발광에서 측정된 증가가 이의 이소형-매칭된 음성 대조군 항체의 2배 미만인 경우 ADCC를 나타내지 않는 것으로 간주될 수 있다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 Fab 팔 교환을 없애기 위한 S228P 돌연변이를 갖는 돌연변이 인간 IgG4 Fc 서열을 포함한다 (중쇄 서열 13E2IgG4mut를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대한 도 20(A)에 나타난 바와 같음).
다른 구현예에서, Fc 영역은 야생형 인간 Ig 카파 (IgK) 쇄 C 부분 (13E2IgK)을 포함한다 (경쇄 서열 13E2IgK를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대한 도 20(B)에 나타난 바와 같음).
전술된 인간 IgG4 Fc 돌연변이에 대해 사용된 Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 Kabat에서와 같이 Eu 지수의 표준 번호매김이다 (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991)).
또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예컨대, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여되어 있다). 글리코실화는, 예컨대 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예컨대 항체 서열 내의 하나 이상의 비글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에 글리코실화를 제거한 결과로서 이루어질 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 예컨대 미국특허 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.
본 개시에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는, 예컨대 항체의 생물학적 (예컨대, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 또는 이의 단편은 전형적으로, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 예컨대 PEG의 반응성 에스터 또는 알데히드 유도체와 반응한다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자와의 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예컨대, EP 0 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
본 발명의 항체는 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은, 항체 또는 임의의 이소형의 면역글로불린, 항원으로의 특이적인 결합을 보유하는 항체의 단편을 포함하며, 비제한적으로 Fab, Fv, scFv, 및 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일-쇄 항체 (scAb), 단일 도메인 항체 (dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, 이중 특이적 항체, 다중 특이적 항체, 및 항체 및 비-항체 단백질의 항원-결합 (본원에서 항원 결합으로도 지칭됨) 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 또한, Fab', Fv, F(ab')2, 및 또는 항원에 대한 특이적 결합을 보유하는 다른 항체 단편, 및 단클론 항체도 이러한 용어에 포함된다. 항체는 1가 또는 2가일 수 있다. 항체는 Ig 단량체일 수 있으며, 이는 다음의 4개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 "Y-모양의" 분자이다: 이황화 결합으로 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄. 항체는 예컨대 방사성동위원소, 검출가능한 생성물을 생성하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 항체는 다른 모이어티, 예컨대 특정 결합 쌍 구성원, 예컨대 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성원) 등과 추가로 접합될 수 있다. 항체는 또한, 비제한적으로 폴리스티렌 플레이트 또는 비드 등을 포함하여, 고체 지지체에 결합될 수 있다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체 부분, 예컨대 손상되지 않은 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 도메인 항체 (dAb; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 용이하게 결정화 하는 능력을 나타내는 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. 파파인 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단하고 비공유결합된 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄-가변 도메인의 이량체로 이루어진다. VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의하기 위해 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하는 것이 본 구성에 있다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도 일지라도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖는다.
"Fab" 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서 몇몇의 잔기가 추가됨으로써 Fab' 단편과는 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 지칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하는 카파 및 람다라고 불리는 2개의 명확한 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이러한 부류의 몇몇은 추가로 하위 부류 (이소형)로, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 나누어질 수 있다. 하위 부류는 추가로, 예컨대 IgG2a 및 IgG2b의 유형으로 나누어질 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 반면, 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 sFv가 항원 결합의 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 한다. sFv의 검토에 대해, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이러한 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 강제로 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예컨대 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448에 보다 충분히 기술되어 있다.
본원에 사용된 "단클론 항체"는 동일한 세포 군에 의해 생성된 항체이며, 이들 모두는 반복적 세포 복제에 의해 단일 세포로부터 생성되었다. 즉, 세포의 클론은 단일 항체 종만 생산한다. 단클론 항체는 하이브리도마 생산 기술을 사용하여 생산될 수 있지만, 당업계에 공지된 다른 생산 방법이 또한 사용될 수 있다 (예컨대, 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된 항체).
본원에 사용된 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. CDR은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)에 의해; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (본원에서 또한 Kabat 1991로도 지칭됨); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) (본원에서 또한 Chothia 1987로도 지칭됨)에 의해; 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)에 의해 기술되어 있다. 추가의 시스템은 국제 ImMunoGeneTics (IMGT) 번호매김 시스템이다 (Lefranc et al., 핵산s Research 27:209-212 (1999)). 정의는 서로 비교되는 경우 아미노산 잔기의 중첩 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식된 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 하나의 정의의 적용이 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 언급된 문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 비교로서 하기 표 1에 기술되어 있다. 실시예 2의 표 4, 및 실시예 5의 표 9에 열거된 CDR은 Lefranc 1999, 및 Kabat 1991에 따라 정의되어 있다.
| CDR 정의 | ||||
| Kabat 1 | Chothia 2 | MacCallum 3 | Lefranc 4 | |
| VH CDR-1 | 31-35 | 26-32 | 30-35 | 27-38 |
| VH CDR-2 | 50-65 | 53-55 | 47-58 | 56-65 |
| VH CDR-3 | 95-102 | 96-101 | 93-101 | 105-117 |
| VL CDR-1 | 24-34 | 26-32 | 30-36 | 27-38 |
| VL CDR-2 | 50-56 | 50-52 | 46-55 | 56-65 |
| VL CDR-3 | 89-97 | 91-96 | 89-96 | 105-117 |
1
잔기 번호매김은 상기 Kabat et al의 명명법을 따른다.
2
잔기 번호매김은 상기 Chothia et al의 명명법을 따른다.
3
잔기 번호매김은 상기 MacCallum et al의 명명법을 따른다.
4
잔기 번호매김은 상기 Lefranc et al의 명명법을 따른다.
본원에 사용된 용어 "CDR-L1", "CDR-L2", 및 "CDR-L3"은 각각 경쇄 가변 영역의 제1, 제2, 및 제3 CDR을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "CDR-H1", "CDR-H2", 및 "CDR-H3"은 각각 중쇄 가변 영역의 제1, 제2, 및 제3 CDR을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "CDR-1", "CDR-2", 및 "CDR-3"은 각각 쇄의 가변 영역 중 하나의 제1, 제2, 및 제3 CDR을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 2가지 제제 (예컨대, 항체 및 항원)의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하고, 해리 상수 (KD)로 표현된다. 친화도는, 관련되지 않은 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도에 비해 적어도 1-배 초과, 적어도 2-배 초과, 적어도 3-배 초과, 적어도 4-배 초과, 적어도 5-배 초과, 적어도 6-배 초과, 적어도 7-배 초과, 적어도 8-배 초과, 적어도 9-배 초과, 적어도 10-배 초과, 적어도 20-배 초과, 적어도 30-배 초과, 적어도 40-배 초과, 적어도 50-배 초과, 적어도 60-배 초과, 적어도 70-배 초과, 적어도 80-배 초과, 적어도 90-배 초과, 적어도 100-배 초과, 또는 적어도 1,000-배 초과, 또는 그 이상일 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화도는, 예컨대 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 또는 그 이상일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "결합활성"은 희석 후 2개 이상의 제제의 복합체의 해리에 대한 내성을 지칭한다. 용어 "면역반응성" 및 "바람직하게는 결합한다"는 본원에서 항체 및/또는 항원-결합 단편과 상호교환적으로 사용된다.
용어 "결합"은, 예컨대, 공유적, 정전기적, 소수성 및 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용, 예컨대 염 다리 (salt bridge) 및 물 다리 (water bridge)와 같은 상호작용으로 인한 2개의 분자 사이의 직접적인 결합을 지칭한다. 본 발명의 항체는 LAG-3 단백질, 특히 인간 LAG-3 단백질 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. "특이적 결합"은 적어도 약 5x 10-7 M 이상, 예컨대, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M 이상의 친화도를 갖는 결합을 지칭한다. "비-특이적인 결합"은 약 10-7 M 미만의 친화도를 갖는 결합, 예컨대 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 등의 친화도를 갖는 결합을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 LAG-3 단백질 (및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 LAG-3 단백질)에 결합하지만 비-LAG-3 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다. 바람직하게는, 항체는 인간 LAG-3 단백질에 "높은 친화도"로, 즉, 1x10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 1x10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5x10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 1x10-9 M 이하의 KD로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"라는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 높은 친화도로 결합하지 않음을 의미하며, 즉, 단백질 또는 세포에 1x10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1x10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1x10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1x10-2 M 이상의 KD로 결합함을 의미한다
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원의 결합 속도를 지칭하도록 의도되며, 여기서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "Kdis" 또는 "Kd,"는 특정 항체-항원의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하도록 의도되며, 이는 Kd 대 Ka. (즉, Kd/Ka)의 비율로부터 수득되고 몰 농도 (M)로서 표현된다.
IgG 항체에 대한 "고친화도"라는 용어는 표적 항원에 대해 1x10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5x10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는1x10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5x10-9 M 이하 및 보다 더 바람직하게는 1x10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형의 경우 변할 수 있다. 예컨대, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4 (Baixeras, et al., J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337)보다 높은 친화도로 (즉, 보다 낮은 해리 상수로) 인간 LAG-3 단백질에 결합한다. 하기 실시예 7은 17B4 항체의 인간 LAG-3Ig 단백질로의 결합의 Biacore 분석의 결과를 기술한다. 이러한 결과는 인간 LAG-3Ig에 대한 17B4의 해리 상수가 3.69 nM라는 것을 보여준다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 예컨대 Biacore 분석에 의해 결정된 바와 같이, 3.69 nM 미만의 해리 상수 (KD)를 갖는 인간 LAG-3 단백질 (또는 인간 LAG-3Ig 단백질)에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 3.5 nM 이하, 2.5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 인간 LAG-3 단백질 (또는 이의 유도체, 예컨대 인간 LAG-3Ig 단백질)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체는 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 20 pM 이하, 10 pM 이하, 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 5 pM 이하, 4 pM 이하, 3 pM 이하, 2 pM 이하, 또는 1 pM 이하의 KD로 인간 LAG-3 단백질에 결합한다.
하기 실시예 20은 키메라 13E2 IgG4 항체 (하기됨), 및 인간화된 13E2 IgG4 (하기됨)의 인간 LAG-3Ig 단백질로의 결합의 Biacore 분석의 결과를 기술한다. 이러한 결과는 인간 LAG-3Ig에 대한 키메라 13E2 IgG4 항체의 해리 상수가 21.9 pM이고, 인간 LAG-3Ig에 대한 인간화된 13E2 IgG4의 해리 상수가 22.8 pM이었음을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 예컨대 Biacore 분석에 의해 결정된 바와 같이, 100pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 또는 25 pM 이하의 해리 상수 (KD)로 인간 LAG-3 단백질 (또는 인간 LAG-3Ig 단백질)에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 친화도는, 인간 LAG-3 단백질에 대한 17B4의 친화도에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 높을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 인간 LAG-3 단백질에 대한 17B4의 친화도의 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 또는 3.5배일 수 있다.
인간 LAG-3 단백질에 대한 항체의 친화도는 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 적절하게는 예컨대 Biacore 시스템 (Murphy et al, Using Biacore to measure the binding kinetics of an antibody-antigen interaction; Curr Protoc Protein Sci. 2006 Sep;Chapter 19:Unit 19.14)과 같은 바이오 센서 세스템 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, Biacore 분석은 본 발명의 항체와 인간 LAG-3 단백질 사이의 해리 상수를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
인간 LAG-3으로의 결합은 당업계에 또한 널리 정립된 하나 이상의 다른 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예컨대, 항체는 유동 세포 계측 분석법에 의해 시험될 수 있으며, 여기서, 항체는 인간 LAG-3을 발현하는 세포주, 예컨대 이의 세포 표면에서 인간 LAG-3을 발현하도록 형질감염된 CHO 세포와 반응한다. 유동 세포 계측 분석법에서 사용하기 위한 다른 적절한 세포는 SEB-자극된 PBMC, 또는 항-CD3-자극된 CD4+ 활성화된 T 세포를 포함하며, 이들은 천연 LAG0-3을 발현한다. 또 다른 적절한 결합 분석법은 예컨대 재조합 LAG-3 단백질을 사용하는 ELISA 분석법을 포함한다.
본 발명의 항체는 단리된 항체이다. "단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다음과 같이 정제될 수 있다: (1) 로우리 방법에 의해 측정된 바와 같이 항체의 중량을 기준으로 90% 초과, 95% 초과까지, 또는 98% 초과, 예컨대 중량을 기준으로 99% 초과까지; (2) 방적 컵 시퀀서(spinning cup sequenator)의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 균질화 까지. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에 제자리 (in situ) 항체를 포함한다. 일부의 예에서, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 특히, 인간화된 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된 경쇄 골격 영역 및/또는 인간화된 중쇄 골격 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화된 항체"는 상이한 기원의 면역글로불린의 부분을 포함하는 면역글로불린을 지칭하며, 여기서, 적어도 하나의 부분은 인간 기원의 아미노산 서열을 포함한다. 예컨대, 인간화된 항체는 마우스와 같은 필수 특이성이 있는 비인간 기원의 면역글로불린으로부터 유도되고, 인간 기원 (예컨대, 면역글로불린)의 면역글로불린 서열로부터 유도되고, 통상적인 기술 (예컨대 합성)에 의해 화학적으로 함께 결합되거나 유전적인 조작 기법을 사용하여 인접한 폴리펩티드로서 발현된 부분을 포함할 수 있다 (예컨대, 키메라 항체의 단백질 부분을 암호화하는 DNA는 인접한 폴리펩티드 쇄를 생산하기 위해 발현될 수 있다). 인간화된 면역글로불린의 또 다른 예는 비인간 기원의 항체로부터 유도된 CDR 및 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유도된 골격 영역 (예컨대, 골격 변화를 갖거나 갖지않는 CDR-이식된 항체)을 포함하는 하나 이상의 면역글로불린 쇄를 함유하는 면역글로불린이다. 키메라 또는 CDR-이식된 단일 쇄 항체는 또한 인간화된 면역글로불린이라는 용어에 포함된다. 예컨대 Cabilly et al., 미국특허 4,816,567; Cabilly et al., 유럽특허 0,125,023 B1; Boss et al., 미국특허 4,816,397; Boss et al., 유럽특허 0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., 유럽특허 0,194,276 B1; Winter, 미국특허 5,225,539; Winter, 유럽특허 0,239,400 B1; Padlan, E. A. et al., 유럽 특허 출원 0,519,596 A1을 참조한다. 또한, 단일 쇄 항체에 대하여, Ladner et al., 미국특허 4,946,778; Huston, 미국특허 5,476,786; 및 Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988))을 참조한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유도되고, 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유도되는 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유도되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유도되는 항체를 지칭하도록 의도된다. 가변 영역 아미노산 서열은 그것이 유도된 종의 가변 영역 아미노산 서열 (예컨대, 마우스 서열)과 동일할 수 있거나, 가변 영역 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 키메라 항체의 가변 영역 아미노산 서열은, 이것이 유도된 종으로부터의 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가)를 포함할 수 있다.
유사하게, 불변 영역 아미노산 서열은, 이것이 유도된 종으로부터의 불변 영역 아미노산 서열(예컨대, 인간 서열)과 동일할 수 있거나, 불변 영역 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 키메라 항체의 불변 영역 아미노산 서열은, 이것이 유도된 종의 불변 영역 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가)를 포함할 수 있다.
예컨대, 전술된 바와 같이, 키메라 항체의 Fc 힌지 영역의 아미노산 서열은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이 될 수 있거나, Fc 영역의 아미노산 서열은 키메라 항체의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 키메라 항체의 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역 서열은 마우스 항체를 포함하거나 이로부터 유도되고, 중쇄 불변 영역 서열은 IgG4 Fc 서열을 포함하거나 이로부터 유도된다. 다른 구현예에서, 경쇄 가변 영역 서열은 마우스 항체를 포함하거나 이로부터 유도되고, 경쇄 불변 영역 서열은 인간 Ig 카파 (IgK) 쇄 C 서열을 포함하거나 이로부터 유도된다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 Fab 팔 교환을 없애기 위해 S228P 돌연변이를 갖는 돌연변이 인간 IgG4 Fc 서열을 포함한다 (중쇄 서열 13E2IgG4mut를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대해 도 20(A)에 나타나 있음).
다른 구현예에서, Fc 영역은 야생형 인간 Ig 카파 (IgK) 쇄 C 부분 (13E2IgK)을 포함한다(경쇄 서열 13E2IgK를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대해 도 20(B)에 나타나 있음).
전술된 인간 IgG4 Fc 돌연변이에서 사용된 Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 Kabat에서와 같이 Eu 지수의 표준 번호매김이다 (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991)).
인간화된 항체는 목적하는 인간화된 쇄를 암호화하는 유전자 (예컨대, cDNA)를 제조하기 위해 합성 및/또는 재조합 핵산을 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, 인간화된 가변 영역을 암호화하는 핵산 (예컨대, DNA) 서열은 인간 또는 인간화된 쇄를 암호화하는 DNA 서열, 예컨대 이전의 인간화된 가변 영역으로부터의 DNA 주형을 변경하기 위한 PCR 돌연변이유발 방법을 사용하여 구축될 수 있다 (예컨대, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); 및 Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991) 참조). 이들 또는 다른 적절한 방법을 사용하여, 변이체가 또한 용이하게 생산될 수 있다. 예컨대, 클로닝된 가변 영역은 돌연변이화되고, 목적하는 특이성을 갖는 변이체를 암호화하는 서열이 선택될 수 있다 (예컨대, 파지 라이브러리로부터; 예컨대, Krebber et al., 미국특허 5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, Apr. 1, 1993에 공개됨) 참조).
항체 가변 영역을 지칭하는데 사용되는 경우 본원에 사용된 용어 "골격"은 항체의 가변 영역 내의 CDR 영역 외부의 모든 아미노산 잔기를 의미하도록 의도된다. 가변 영역 골격은 일반적으로 길이가 약 100 내지 120개 아미노산인 비연속적인 아미노산 서열이지만, CDR 외부의 이러한 아미노산만을 지칭하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "골격 영역"은 CDR에 의해 분리되는 골격의 각각의 도메인을 의미하도록 의도된다.
골격 영역의 인간화는 인간에서 인간-항-마우스 항체(HAMA) 반응을 유도하는 항체의 위험을 감소시킨다. 당업계에 공지된 면역 반응을 측정하는 방법이 임상 시험 중에 특정 환자에서 HAMA 반응을 모니터링하기 위해 수행될 수 있다. 인간화된 항체가 투여된 환자는 치료의 투여 시작 및 전반에 걸쳐 면역원성 평가를 받을 수 있다. HAMA 반응은, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 기술 (BIACORE) 및/또는 고상 효소-결합 면역흡착검정 (ELISA) 분석을 포함하여, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 환자로부터의 혈청 상에서 인간화된 치료제에 대해 항체를 검출함으로써 측정된다. 다수의 경우에서, 본 발명의 인간화된 항체는 인간 대상에서 HAMA 반응을 실질적으로 유도하지 않는다.
인간 가변 영역 골격 잔기로부터의 특정 아미노산은 CDR 형태 및/또는 결합 항원에 대한 이들의 가능한 영향에 기초하여 치환을 위해 선택된다. 인간 가변 골격 영역을 갖는 쥐의 CDR 영역의 부자연스러운 병치(juxtaposition)는 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 정정되지 않는 한, 결합 친화도의 손실을 야기하는 부자연스러운 형태 제한을 야기할 수 있다.
치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 컴퓨터 모델링에 의해 결정될 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미를 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 쇄 또는 이의 도메인에 대한 해결된 구조로부터 출발하여 생성된다. 모델링될 쇄는 해결된 3차원 구조의 쇄 또는 도메인을 아미노산 서열 유사성에 대해 비교되고, 가장큰 서열 유사성을 나타내는 쇄 또는 도메인은 분자 모델 구축을 위한 출발 시점으로 선택된다. 적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 쇄 또는 도메인이 모델링을 위해 선택되며, 예컨대 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 서열 동일성 또는 그 이상을 공유하는 것들이 모델링을 위해 선택된다. 해결된 출발 구조는 모델화된 면역글로불린 쇄 또는 도메인, 및 출발 구조에 있는 것들의 실제 아미노산 사이의 차이를 허용하도록 변형된다. 이어서, 변형된 구조는 복합 면역글로불린으로 조립된다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화와 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 있고 결합 길이 및 각도가 화학적으로 허용되는 범위 내에 있음을 확인함으로써 정제된다.
CDR 및 골격 영역은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)에 의해 정의될 수 있다. 다른 구조적인 정의가 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); 및 J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (collectively referred to as "Chothia")에 의해 제안되어 왔다. 상기 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 골격 잔기가 상기 Chothia에 의해 정의된 바와 같은 구조적 루프 잔기를 구성하는 경우, 마우스 항체에 존재하는 아미노산이 인간화된 항체로 치환하기 위해 선택될 수 있다. "CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화된 면역글로불린 쇄의 1차 서열에서 하나 이상의 CDR에 바로 인접한 위치, 예컨대 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR, 또는 Chothia (예컨대, Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987) 참조)에 의해 정의된 바와 같은 CDR에 바로 인접한 위치를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산은 특히 CDR 내의 아미노산과 상호작용하고, 수용체로부터 선택된 경우, 공여자 CDR을 변형시키고 친화성을 감소시키는 경향이 있다. 또한, 인접한 아미노산은 항원과 직접 상호작용 할 수 있으며 (Amit et al., Science, 233:747 (1986)), 공여자로부터 이러한 아미노산을 선택하는 것은 본래의 항체에서 친화도를 제공하는 모든 항원 접촉을 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, CDR 및 골격 영역은 MacCallum et al., 또는 Lefranc et al. (상기됨 -표 1 참조)에 의해 정의된 것일 수 있다.
일부의 경우에서, 인간화된 VH 골격 또는 VL 골격은 공통의(consensus) 인간화된 골격이다. 공통의 인간화된 골격은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 단편은 하나 이상의 인간화된 골격 영역 (FR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 항-LAG-3 항체는, 인간화된 1, 2, 3 또는 4개의 쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다: 인간화된 경쇄 FR1; 본원에 정의된 바와 같은 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 본원에 정의된 바와 같은 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 본원에 정의된 바와 같은 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4. 일부 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화되 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 1을 포함하는 CDR-1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 2를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 5를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 6을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 24, 서열번호 25, 및 서열번호 26이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 24를 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 25를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 26을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 4 및 24 (CDR-L1); 서열번호 5 및 25 (CDR-L2); 및 서열번호 6 및 26 (CDR-L3)으로부터 선택된다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 각각의 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 11을 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 12를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 13을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 각각의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 15를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하는 CDR-L3; 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 34를 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 35를 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 36을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 14 및 34 (CDR-L1); 서열번호 15 및 35 (CDR-L2); 및 서열번호 16 및 36 (CDR-L3)으로부터 선택된다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 경쇄 FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 인간화된 경쇄 FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 인간화된 경쇄 FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및 인간화된 경쇄 FR4.
일부 구현예에서, 대상 항-LAG-3 항체는 인간화된 1, 2, 3, 또는 4개의 중쇄 FR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: 인간화된 중쇄 FR1; 본원에 기술된 바와 같은 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 본원에 기술된 바와 같은 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 본원에 기술된 바와 같은 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
일부 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 5를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 6을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 1을 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 2를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 21을 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 22를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 23을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 21 (CDR-H1); 서열번호 2 및 22 (CDR-H2); 및 서열번호 3 및 23 (CDR-H3)로부터 선택된다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 15를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 11을 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 12를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 13을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 33이다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 아미노산 서열 서열번호 31을 포함하는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 아미노산 서열 서열번호 32를 포함하는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 아미노산 서열 서열번호 33을 포함하는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
다른 구현예에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 11 및 31 (CDR-H1); 서열번호 12 및 32 (CDR-H2); 및 서열번호 13 및 33 (CDR-H3)으로부터 선택된다.
예컨대, 대상 항체는 N-말단에서 C-말단 순서로 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다: 인간화된 중쇄 FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 CDR-H1; 인간화된 중쇄 FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 CDR-H2; 인간화된 중쇄 FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 CDR-H3; 및 인간화된 중쇄 FR4.
적절한 인간화된 골격 서열의 예는 다음을 포함한다:
VH 변이체 1 (VH
1
)
VH1 FR1: QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFS (서열번호 52);
VH1 FR2: WIRQPPGKALEWLA (서열번호 53);
VH1 FR3: RLTISKDTSKSQVILNMTNMDPVDTATYYC (서열번호 54); 및
VH1 FR4: WGQGTTVTVSS (서열번호 55);
VH 변이체 2 (VH
2
)
VH2 FR1: QITLKESGPALVKPTQTLTLTCSFS (서열번호 56);
VH2 FR2: WIRQPPGKALEWLA (서열번호 57);
VH2 FR3: RLTISKDTSKNQVVLTMANMDPVDTATYYC (서열번호 58);
VH2 FR4: WGQGTTVTVSS (서열번호 59);
VH 변이체 3 (VH
3
)
VH3 FR1: QITLKETGPTLVKPTQTLTLTCTFS (서열번호 60);
VH3 FR2: WIRQPPGKALEWVT (서열번호 61);
VH3 FR3: RVTIRKDTSKNQVALTMTNMDPLDTGTYYC (서열번호 62);
VH3 FR4: WGQGTLVTVSS (서열번호 63);
VH 변이체 4 (VH
4
)
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (서열번호 64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (서열번호 65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (서열번호 66);
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (서열번호 67);
VL 변이체 1 (VL
1
)
VL1 FR1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (서열번호 68);
VL1 FR2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열번호 69);
VL1 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (서열번호 70); 및
VL1 FR4: FGQGTKLEIK (서열번호 71)
VL 변이체 2 (VL
2
)
VL2 FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호 72);
VL2 FR2: WYQQKPGQAPKLLIF (서열번호 73);
VL2 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTLSSLQPEDFATYYC (서열번호 74); 및
VL2 FR4: FGQGTKVEIK (서열번호 75)
VL 변이체 3 (VL
3
)
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (서열번호 76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (서열번호 77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호 78); 및
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (서열번호 79)
VL 변이체 4 (VL
4
)
VL4 FR1: EIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (서열번호 80);
VL4 FR2: WYQQKAGQSPKLLIY (서열번호 81);
VL4 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQAEDVAVYYC (서열번호 82); 및
VL4 FR4: FGGGTKVEIK (서열번호 83)
인간화된 VH 변이체 1 내지 4, 및 VL 변이체 1 내지 4의 서열이 도 22의 본래의 마우스 항체 13E2의 상응하는 서열과 정렬되어 도시되어 있다. CDR 서열은 회색으로 강조되어 있다. 본래의 마우스 서열과 비교하여, 변이체의 인간화된 골격 서열의 변화는 밑줄 및 굵게 표시되어 있다. 각각의 변이체의 인간화된 서열에서의 변화된 잔기가 또한 실시예 18의 표 26 (중쇄 서열) 및 27 (경쇄 서열)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명 (또는 이의 항원-결합 단편)의 인간화된 항체는 표 26에서 VH1, VH2, VH3, 또는 VH4에 대해 나타낸 임의의 아미노산 치환을 포함하는 인간화된 중쇄 및/또는 표 27에서 VL1, VL2, VL3, 또는 VL4에 대해 나타낸 임의의 아미노산 치환을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (특히, 본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은, 임의의 상기 인간화된 골격 서열 (서열번호 52-83), 또는 상기 인간화된 골격 서열 (서열번호 52-83)의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인간화된 중쇄 골격 영역은 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: 임의의 서열번호 52, 53, 54, 또는 55; 임의의 서열번호 56, 57, 58, 또는 59; 임의의 서열번호 60, 61, 62, 또는 63; 또는 임의의 서열번호 64, 65, 66, 또는 67.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (특히, 본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 52의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 53의 VH FR2; 서열번호 54의 VH FR3; 및 서열번호 55의 VH FR4;
서열번호 56의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 57의 VH FR2; 서열번호 58의 VH FR3; 및 서열번호 59의 VH FR4;
서열번호 60의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 61의 VH FR2; 서열번호 62의 VH FR3; 및 서열번호 63의 VH FR4; 또는
서열번호 64의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 65의 VH FR2; 서열번호 66의 VH FR3; 및 서열번호 67의 VH FR4.
대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 인간화된 경쇄 골격 영역은 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: 임의의 서열번호 68, 69, 70, 또는 71; 임의의 서열번호 72, 73, 74, 또는 75; 임의의 서열번호 76, 77, 78, 또는 79; 또는 임의의 서열번호 80, 81, 82, 또는 83.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (특히, 본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 68의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 69의 VL FR2; 서열번호 70의 VL FR3; 및 서열번호 71의 VL FR4;
서열번호 72의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 73의 VL FR2; 서열번호 74의 VL FR3; 및 서열번호 75의 VL FR4;
서열번호 76의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 77의 VL FR2; 서열번호 78의 VL FR3; 및 서열번호 79의 VL FR4; 또는
서열번호 80의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 81의 VL FR2; 서열번호 82의 VL FR3; 및 서열번호 83의 VL FR4.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (특히, 본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 임의의 다음의 인간화된 골격 서열의 조합을 포함할 수 있다:
VH1 FR1-FR4; 및
VL1 FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; 및
VL2 FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; 및
VL3 FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; 및
VL4 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; 및
VL1 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; 및
VL2 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; 및
VL3 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; 및
VL4 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; 및
VL1 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; 및
VL2 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; 및
VL3 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; 및
VL4 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; 및
VL1 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; 및
VL2 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; 및
VL3 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; 및
VL4 FR1-FR4.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 (특히, 본 발명의 인간화된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)은 다음의 인간화된 골격 서열을 포함한다:
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (서열번호 64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (서열번호 65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (서열번호 66); 및
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (서열번호 67); 및
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (서열번호 76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (서열번호 77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호 78); 및
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (서열번호 79)
특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 다음을 포함하는 항체 VH 영역을 포함한다:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4; 또는
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4.
특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항체 VL 영역을 포함한다:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4; 또는
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4.
특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
추가의 특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄, 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 다음을 포함하는 항체 VH 영역을 포함한다:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4;
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4; 또는
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4.
대안적으로 또는 추가적으로, 특정 구현예에서, 본 발명의 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항체 VL 영역을 포함한다:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4;
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4; 또는
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. 일부의 경우에서, 대상 항체는 면역글로불린의 불변 영역(예컨대, Fc 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은, 존재하는 경우, 인간 Fc 영역이다. 불변 영역이 존재하는 경우, 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 모두 포함할 수 있다. 적절한 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함한다.
적절한 중쇄 Fc 영역의 예는 인간 이소형 IgG4 Fc이다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 대상 항체 (예컨대, 대상 인간화된 항체)는 하나 이상의 클래스 또는 이소형으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 항체는, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 테트라머로서 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단일 쇄 항체로서 분리되고, 발현될 수 있다.
일부의 경우에서, 중쇄 영역은 이소형 IgG4의 것일 수 있다. 이러한 구현예의 일부에서, 힌지 영역은 S241P 치환을 포함한다. 예컨대, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105를 참조한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 힌지 영역은 L236E (또는 L235E, EU 번호매김을 사용함; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication No. 91-3242) 치환을 포함한다. 예컨대, Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925; 및 Klechevsky et al. (2010) Blood 116:1685를 참조한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 힌지 영역은 S241P 치환 및 L236E 치환을 포함한다.
불변 영역 아미노산 서열은 그것이 유도된(예컨대, 인간 서열) 종의 불변 영역 아미노산 서열과 동일할 수 있거나, 불변 영역 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체의 불변 영역 아미노산 서열은 이것이 유도된 종의 불변 영역 아미노산 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 결실, 치환, 또는 부가)를 포함할 수 있다.
예컨대, 전술된 바와 같이, 본 발명의 항체의 Fc 힌지 영역의 아미노산 서열은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있거나, Fc 영역의 아미노산 서열은 항체의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있다.
항체, 또는 단편이 ADCC 또는 CDC의 결과로서 T 세포의 고갈 없이 T 세포 증식 및/또는 기능을 음성적으로 조절하는데 사용될 수 있도록 본 발명의 항체, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC) 결여되어 있다는 것이 보장되어야 한다.
예컨대, 일부 구현예에서, Fc 영역은 야생형 인간 IgG4 Fc 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 Fab 팔 교환을 없애기 위해 S228P 돌연변이를 갖는 돌연변이 인간 IgG4 Fc 서열 (중쇄 서열 13E2IgG4mut를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대한 도 20(a)에 도시된 바와 같음)을 포함한다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 야생형 인간 Ig 카파 (IgK) 쇄 C 부분 (13E2IgK) (경쇄 서열 13E2IgK를 포함하는 키메라 항체 Chim13E2IgG4에 대한 도 20(b)에 나타난 바와 같음)을 포함한다.
전술된 인간 IgG4 Fc 돌연변이에 대해 사용된 Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991))에서와 같이 EU 색인의 표준 번호매김이다.
대상 항체는 카복실 말단에 유리 티올 (-SH) 기를 포함할 수 있으며, 여기서, 유리 티올 기는 항체를 제2 폴리펩티드 (예컨대 또 다른 항체, 대상 항체 포함), 스캐폴드, 담체 등에 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 하나 이상의 비-자연발생적인 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연발생적으로 암호화된 아미노산은 카보닐 기, 아세틸 기, 아미녹시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카바지드 기, 아자이드 기, 또는 알킨 기를 포함한다. 예컨대, 적절한 비-자연발생적인 아미노산에 대해 미국특허 7,632,924를 참조한다. 비-자연발생적인 아미노산의 포함은 중합체, 제2 폴리펩티드, 스캐폴드 등으로의 결합을 제공할 수 있다. 예컨대, 수용성 중합체에 연결된 대상 항체는 카보닐 기를 포함하는 수용성 중합체 (예컨대, PEG)를 항체와 반응시켜 제조될 수 있으며, 여기서, 상기 항체는 아미녹시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카바지드 기를 포함하는 비-자연발생적으로 암호화된 아미노산을 포함한다. 또 다른 예시로서, 수용성 중합체에 연결된 대상 항체는 알킨-함유 아미노산을 포함하는 대상 항체를 아자이드 모이어티를 포함하는 수용성 중합체 (예컨대, PEG)와 반응시켜 제조될 수 있다; 일부 구현예에서, 아자이드 또는 알킨 기는 아미드 연결을 통해 PEG 분자에 연결된다. "비-자연발생적으로 암호화된 아미노산"은 20개의 통상의 아미노산 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. "비-자연발생적으로 암호화된 아미노산"이라는 용어와 동의어로 사용될 수 있는 또 다른 용어는 "비-자연적인 아미노산", "비자연적인 아미노산", "비-자연적으로-발생적인 아미노산" 및 이들의 다양한 하이픈 및 하이픈이 없는 버전이다. 용어 "비-자연적으로 암호화된 아미노산"은 또한 비제한적으로 자연적으로 암호화된 아미노산 (비제한적으로, 20개의 공통의 아미노산, 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함함)의 변형 (예컨대, 번역 후 변형)에 의해 발생하지만 번역 복합체에 의해 그들 스스로가 성장하는 폴리펩티드 쇄에 자연적으로 혼입되지 않는 아미노산을 비제한적으로 포함한다. 이러한 비-자연적으로-발생하는 아미노산의 예는, 비제한적으로 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상 항체 중합체 (예컨대, 폴리펩티드 외의 중합체)에 연결된다 (예컨대, 공유적으로 연결됨). 적절한 중합체는, 예컨대 생체호환적인 중합체, 및 수용성 생체호환적인 중합체를 포함한다. 적절한 중합체는 합성 중합체 및 자연-발생적인 중합체를 포함한다. 적절한 중합체는, 예컨대 치환되거나 비치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지 또는 비분지 폴리사카라이드, 예컨대 동종- 또는 이종-폴리사카라이드를 포함한다. 적절한 중합체는, 예컨대, 에틸렌 비닐 알코올 공중합체 (통상적으로 일반 명칭 EVOH로 또는 상표명 EVAL로 공지됨); 폴리부틸메트아크릴레이트; 폴리(히드록시발레레이트); 폴리(L-락트산); 폴리카프로락톤; 폴리(락티드-코-글리콜리드); 폴리(히드록시부티레이트); 폴리(히드록시부티레이트-코-발레레이트); 폴리디옥사논; 폴리오르도에스터; 폴리안히드리드; 폴리(글리콜산); 폴리(D,L-락트산); 폴리(글리콜산-코-트리메틸렌 카보네이트); 폴리포스포에스터; 폴리포스포에스터 우레탄; 폴리(아미노산); 시아노아크릴레이트; 폴리(트리메틸렌 카보네이트); 폴리(이미노카보네이트); 코폴리(에터-에스터) (예컨대, 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(락트산) (PEO/PLA) 공-중합체); 폴리알킬렌 옥살레이트; 폴리포스파젠; 생체분자, 예컨대 피브린, 피브리노겐, 셀룰로스, 전분, 콜라겐 및 히알루론산; 폴리우레탄; 실리콘; 폴리에스터; 폴리올레핀; 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체; 아크릴 중합체 및 공중합체; 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 예컨대 폴리비닐 클로라이드; 폴리비닐 에터, 예컨대 폴리비닐 메틸 에터; 폴리비닐리덴 할라이드, 예컨대 폴리비닐리덴 플루오리드 및 폴리비닐리덴 클로라이드; 폴리아크릴로니트릴; 폴리비닐 케톤; 폴리비닐 방향족, 예컨대 폴리스티렌; 폴리비닐 에스터, 예컨대 폴리비닐 아세테이트; 비닐 단량체 서로와 올레핀의 공중합체, 예컨대 에틸렌-메틸 메트아크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, ABS 수지, 및 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체; 폴리아미드, 예컨대 Nylon 66 및 폴리카프로락탐; 알키드 수지; 폴리카보네이트; 폴리옥시메틸렌; 폴리이미드; 폴리에터; 에폭시 수지; 폴리우레탄; 레이온; 레이온-트리아세테이트; 셀룰로스; 셀룰로스 아세테이트; 셀룰로스 부티레이트; 셀룰로스 아세테이트 부티레이트; 셀로판; 셀룰로스 니트레이트; 셀룰로스 프로피오네이트; 셀룰로스 에터; 무정형 테플론; 폴리(에틸렌 글리콜); 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다.
적절한 합성 중합체는 비치환된 및 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올), 및 이들의 유도체, 예컨대, 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜), 및 이들의 유도체를 포함한다. 적절한 자연-발생적인 중합체는, 예컨대, 알부민, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐, 및 이들의 유도체를 포함한다.
적절한 중합체는 500 Da 내지 50,000 Da, 예컨대, 5,000 Da 내지 40,000 Da, 또는 25,000 내지 40,000 Da 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 대상 항체가 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체를 포함하는 경우, PEG 또는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체는 약 0.5 킬로달톤 (kDa) 내지 1 kDa, 약 1 kDa 내지 5 kDa, 5 kDa 내지 10 kDa, 10 kDa 내지 25 kDa, 25 kDa 내지 40 kDa, 또는 40 kDa 내지 60 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 대상 항체는 비-펩티드 합성 중합체에 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 대상 항체는 PEG 중합체에 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 대상의 scFv 다량체는 PEG 중합체에 공유적으로 연결된다. 예컨대 Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Methods 310:100을 참조한다. 단백질의 페길화에 적절한 방법 및 시약이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국특허 5,849,860에서 확인할 수 있다. 단백질 접합에 적절한 PEG는 일반적으로 실온에서 수용성이고, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지며, 여기서, R은 수소 또는 보호 기 예컨대 알킬 또는 알카놀 기 이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다. R이 보호 기인 경우, 이는 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 갖는다.
일부 구현예에서, 대상 항체에 접합된 PEG는 선형이다. 일부 구현예에서, 대상 항체에 접합된 PEG는 분지형이다. 분지형 EPG는 유도체, 예컨대 미국특허 5,643,575에 기술된 것들, "star-PEG's" 및 다중-팔 PEG's 예컨대 Shearwater Polymers, Inc. 카달로그 "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998."에 기술된 것들이다. Star PEG가 예컨대 미국특허 6,046,305를 포함하여 당업계에 기술되어 있다.
대상 항체는 글리코실화될 수 있으며, 예컨대, 대상 항체는 공유 결합된 탄수화물 또는 폴리사카라이드 모이어티를 포함할 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-결합이거나 O-결합이다. N-결합은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에서 이러한 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신이 또한 사용될 수 있다.
항체에 글리코실화 부위를 추가하는 것은 아미노산 서열이 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열을 함유하도록 변경함으로써 편리하게 수행된다 (N-결합된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체의 서열에 하나 이항의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나 치환함으로써 이루어질 수 있다 (O-결합된 글리코실화 부위의 경우). 유사하게, 글리코실화 부위의 제거는 항체의 본래의 글리코실화 부위 내에서 아미노산 변경에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 "방사선 불투과성" 표지, 예를 들어, 예컨대 x-선을 사용하여 용이하게 시각화될 수 있는 표지를 포함할 것이다. 방사선 불투과성 물질이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 가장 통상적인 방사선 불투과성 물질은 요오드화물, 브롬화물, 또는 바륨 염을 포함한다. 다른 방사선 불투과성 물질이 또한 공지되어 있으며, 비제한적으로 유기 비스무스 유도체 (예컨대, 미국특허 5,939,045 참조), 방사선 불투과성 다중우레탄 (미국특허 5,346,981 참조), 유기비스무스 복합물 (예컨대, 미국특허 5,256,334 참조), 방사선 불투과성 바륨 다량체 복합체 (예컨대, 미국특허 4,866,132 참조) 등을 포함한다.
대상 항체는, 예컨대 글루타르알데히드, 동종이기능성 가교결합제, 또는 이종이기능성 가교 결합제를 사용하여 제2 모이어티 (예컨대, 지질, 대상 항체 이외의 폴리펩티드, 합성 중합체, 탄수화물 등)에 공유결합될 수 있다. 글루타르알데히드는 이의 아미노 모이어티를 통해 폴리펩티드를 가교결합한다. 동종이기능성 가교 결합제 (예컨대, 동종이기능성 이미도에스터, 동종이기능성 N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 에스터, 또는 동종이기능성 설피드릴 반응성 가교 결합제)는 2개 이상의 동일한 반응성 모이어티를 함유하며, 가교 결합제가 결합될 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 용액에 첨가되는 일단계 반응에서 사용될 수 있다. 동종이기능성 NHS 에스터 및 이미도 에스터는 폴리펩테드를 함유하는 아민을 가교결합한다. 온화한 알칼리성 pH에서, 이미도 에스터는 1차 아민과만 반응하여 이미도아미드를 형성하며, 가교결합된 폴리펩티드의 전체적인 전하는 영향을 받지 않는다. 동종이기능성 설피드릴 반응성 가교결합제는 비스말레이미드헥산 (BHM), 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠 (DFDNB), 및 1,4-다이-(3',2'-피리딜다이티오) 프로피노아미도 부탄 (DPDPB)을 포함한다.
이종이기능성 가교결합제는 2개 이상의 상이한 반응성 모이어티 (예컨대, 아민 반응성 모이어티 및 설피드릴-반응성 모이어티)를 포함하며, 아민 또는 설피드릴 반응성 모이어티를 통해 폴리펩티드 중 하나와 가교결합되고, 이어서 비-반응된 모이어티를 통해 다른 폴리펩티드와 반응한다. 다중 이종이기능성 할로아세틸 가교결합제가 이용가능하며, 예컨대 피리딜 다이설파이드 가교결합제이다. 카보다이이미드는 카복실을 아민에 결합시키기 위한 이종이기능성 가교결합 시약의 전형적인 예시이며, 이는 아미드 결합을 생성한다.
대상 항체는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 적절한 지지체가 당업계에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도 상업적으로 이용가능한 컬럼 물질, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 자성 비드, 콜로이드 금속 입자, 유리 및/또는 실리콘 칩 및 계면, 니트로셀룰로스 스트립, 나일론 막, 시트, 듀라사이트, 반응 트레이의 웰 (예컨대, 다중-웰 플레이트), 플라스틱 튜브 등을 포함한다. 고체 지지체는, 예컨대 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 또는 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네티트를 포함하여, 임의의 다양한 물질을 포함할 수 있다. 고체 지지체 위로 대상 항체를 고정시키기 위한 적절한 방법이 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로, 이온, 소수성, 공유적 상호작용 등을 포함한다. 고체 지지체는 예컨대 수용액 중에서 가용성 또는 비가용성일 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 고체 지지체는 일반적으로 수용액 중에 비가용성이다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 검출가능한 표지를 포함할 것이다. 적절한 검출가능한 표지는 분광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함한다. 적절한 표지는, 비제한적으로 자성 비드 (예컨대 DynabeadsTM), 형광 염료 (예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질, 적색 형광단백질, 황색 형광 단백질, 등), 방사성표지 (예컨대, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소 (예컨대, 홍당무 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 루시퍼라제, 및 효소-결합 면역흡착검정 (ELISA))에 통상적으로 사용된 다른 것들, 및 비색 표지 예컨대 콜로이드 금 또는 색유리 또는 플라스틱 (예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 조영제 또는 방사성 동위원소를 포함하며, 여기서, 상기 조영제 또는 방사성 동위원소는 이미지화, 예컨대 인간에서 수행되는 이미지화 절차에서의 사용에 적절한 것이다. 표지의 비제한적인 예는 방사성 동위원소 예컨대 1231I (요오딘), 18F (플루오린), 99Tc (테크네튬), 111In (인듐), 및 67Ga (갈륨), 및 조영제 예컨대 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘, 및 철을 포함한다. 방사성 Gd 동위원소 (153Gd)가 또한 이용가능하며, 비-인간 포유류에서의 이미지화 절차에 적절하다.
대상 항체는 표준 기법을 사용하여 표지될 수 있다. 예컨대, 대상 항체는 클로라민 T 또는 1,3,4,6-테트라클로로-3α,6α-다이페닐글리코우릴을 사용하여 요오드화될 수 있다. 플루오르화를 위해, 플루오린이 플루오리드 이온 치환 반응에 의해 합성 동안 대상 항체에 첨가된다. 이러한 방사성 동위원소를 갖는 단백질 합성의 검토를 위해 Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) 및 Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999)를 참조한다. 대상 항체는 또한 표준 기법을 통해 조영제로 표지될 수 있다. 예컨대, 대상 항체는 저분자 Gd 킬레이트 예컨대 Gd 다이에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (GdDTPA) 또는 Gd 테트라아자사이클로도데칸테트라아세틱 (GdDOTA)을 항체에 접합시킴으로써 Gd로 표지될 수 있다. Caravan et al., Chem. Rev. 99:2293-2352 (1999) 및 Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985)를 참조한다. 대상 항체는, 예컨대 폴리리신-Gd 킬레이트를 항체에 접합시킴으로써 Gd로 표지될 수 있다. 예컨대, Curtet et al., Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998)을 참조한다. 대안적으로, 대상 항체는 Gd 킬레이터 지질을 포함하는 상자성(paramagnetic) 중합화된 리포좀을 아비딘 및 비오티닐화된 항체와 인큐베이션함으로서 Gd로 표지될 수 있다. 예컨대, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998)을 참조한다.
대상 항체에 결합될 수 있는 적절한 형광 단백질은, 비제한적으로 Aequoria victoria로부터의 녹색 형광 단백질 또는 돌연변이 또는, 이의 유도체, 예컨대 미국특허 6,066,476; 6,020,192; 5,985,577; 5,976,796; 5,968,750; 5,968,738; 5,958,713; 5,919,445; 5,874,304에 기술된 것들; 예컨대, 향상된 GFP, 대부분이 예컨대 Clontech, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 GFP; 적색 형광 단백질; 황색 형광 단백질; Anthozoan 종으로부터의 임의의 다양한 형광 또는 착색된 단백질, 예컨대 예컨대, Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973에 기술된 것들, 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 치료제에 접합된다. 본원에 개시된 임의의 대상 항체는 항체-제제 접합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 제제는 경쇄의 N 말단, 경쇄의 C 말단, 중쇄의 N 말단, 또는 중쇄의 C 말단에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항체의 힌지 또는 항체 상의 하나 이상의 다른 부위에 부착된다. 단일 쇄 항체의 경우, 상기 제제는 단일 쇄 항체의 N 또는 C 말단에 부착될 수 있다. 상기 제제는 직접 또는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 링커를 통해 항체에 접합될 수 있다. 링커는 절단가능하거나 절단이 불가능할 수 있다. 이러한 치료제 (예컨대, 치료 용도)의 예가 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 융합 파트너, 예컨대, 리간드; 에피토프 태그; 펩티드; 항체 외의 단백질 등에 결합될 것이다 (예컨대 공유결합 또는 비공유결합). 적절한 융합 파트너는 생체 내에서 향상된 안정성을 제공하고 (예컨대, 향상된 혈청 반감기); 정제 용이성, 예컨대, (His)n, 예컨대, 6His, 등을 제공하고; 세포로부터 융합 단백질의 분비를 제공하고; 에피토프 태그, 예컨대, GST, 헤마글루티닌 (HA, 예컨대, YPYDVPDYA; 서열번호 41), FLAG (예컨대, DYKDDDDK; 서열번호 42), c-myc (예컨대, EQKLISEEDL; 서열번호 43), 등을 제공하고; 검출가능한 신호, 예컨대 검출가능한 생성물 (예컨대, β-갈락토시다제, 루시퍼라제), 또는 그 자체가 검출가능한 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질, 적색 형광단백질, 황색 형광 단백질, 등을 생성하는 효소를 제공하고; 다량체화, 예컨대 도메인, 예컨대 면역글로불린의 Fc 부분의 다량체화; 등을 제공하는 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다.
융합은 또한, 결합 파트너와 상호작용할 수 있는 펩티드 서열을 포함하여, 친화도 도메인을 포함할 수 있고, 예컨대 식별 또는 정제에 유용한, 고체 지지체 상에 고정된 것들을 포함할 수 있다. 단백질에 융합되는 경우, 히스티딘과 같은 연속적인 단일 아미노산은 니켈 세파로스와 같은 수지 컬럼에 고친화도 결합에 의해 융합 단백질의 일단계 정제에 사용될 수 있다. 예시적인 친화도 도메인은 His5 (HHHHH) (서열번호 44), HisX6 (HHHHHH) (서열번호 45), c-myc (EQKLISEEDL) (서열번호 46), Flag (DYKDDDDK) (서열번호 42), 스트렙태그 (WSHPQFEK) (서열번호 47), 헤마글루티닌, 예컨대, HA 태그 (YPYDVPDYA; 서열번호 41), 글루타티논-S-트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 셀룰로스 결합 도메인, RYIRS (서열번호 48), Phe-His-His-Thr (서열번호 49), 키틴 결합 도메인, S-펩티드, T7 펩티드, SH2 도메인, C-말단 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열번호 50), 금속 결합 도메인, 예컨대, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인 예컨대 칼슘-결합 단백질로부터의 것, 예컨대, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시네우린 B, 미오신 경쇄, 레코베린, S-모듈린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프레퀘닌, 칼트락틴, 칼페인 큰-하위단위, S100 단백질, 파브알부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K, 및 칼레티닌, 인테인스, 비오틴, 스트렙타비딘, MyoD, 류신 지퍼 서열, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 경우, 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 최적화로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결실과 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 정도를 나타낸다.
두 서열 사이의 동일성 퍼센트는, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/총 위치의 수 x 100), 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려한다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트 결정은 하기 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
질의 핵산 서열과 대상 핵산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 퍼센트로 표현되는 "동일성" 값이며, 이는 대상 핵산 서열이 쌍을 짓는 BLASTN 정렬이 수행된 후 질의 핵산 서열과의 100% 질의 커버리지를 갖는 경우 BLASTN 알고리즘에 의해 계산된다. 질의 핵산 서열과 대상 핵산 서열 사이의 이러한 쌍을 짓는 BLASTN 정렬은 낮은 복합성 영역에 대한 필터가 턴 오프된 국립 생명공학 센터의 웹사이트에서 이용가능한 BLASTN 알고리즘의 디폴트 설정을 사용하여 수행된다. 중요하게, 질의 핵산 서열은 본원의 하나 이상의 청구상에서 확인된 핵산 서열에 의해 기술될 수 있다. 질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 퍼센트로 표현된 ”동일성” 값이며, 이는 쌍을 짓는 BLASTP 정렬이 수행된 후 대상 아미노산 서열이 질의 아미노산 서열에 의해 100% 질의 커버리지를 갖는 경우 BLASTP 알고리즘에 의해 계산된다.
질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 이러한 쌍을 짓는 BLASTP 알고리즘은 낮은 복합성 영역에 대한 필터가 턴 오프된 국립 생명공학 센터의 웹사이트에서 이용가능한 BLASTP 알고리즘의 디폴트 설정을 사용하여 수행된다. 중요하게도, 질의 아미노산 서열은 본원의 하나 이상의 청구상에서 확인된 아미노산 서열에 의해 기술될 수 있다.
대상 항체의 생산 방법
대상 항체는 임의의 공지된 방법, 예컨대 단백질 합성을 위한 통상적인 합성 방법; 재조합 DNA 방법; 등에 의해 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 항체는 재조합 생산 및 화학적 합성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 생산된다.
대상 항체가 단일 쇄 폴리펩티드인 경우, 이는 표준 화학 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 합성은 액상 또는 고상을 통해 수행될 수 있다. 서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후 서열 중의 나머지 아미노산의 순차적인 첨가가 이어지는 고상 폴리펩티드 합성 (SPPS)이 대항 항체의 화학적인 합성을 위한 적절한 방법의 예시이다. 다양한 형태의 SPPS, 예컨대 Fmoc 및 Boc가 대상 항체를 합성하는데 이용될 수 있다. 고상 합성에 대한 기술이 Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); 및 Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 and Camarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8에 의해 기술되어 있다. 요컨대, 작은 불용성, 다공성 비드는 펩티드 쇄가 구축된 기능성 단위로 처리된다. 커플링/탈보호 사이클을 반복한 후, 부착된 고상의 유리 N-말단 아민이 단일 N-보호된 아미노산 단위에 커플링된다. 이어서, 단위가 탈보호되어, 새로운 N-말단 아민이 드러나서 추가의 아미노산이 부착될 수 있다. 펩티드는 고상에 고정된 채로 유지되고 절단되기 전에 여과 공정을 거친다.
표준 재조합 방법이 대상 항체의 생산에 사용될 수 있다. 예컨대, 선택적으로 불변 영역에 연결된, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산이 발현 벡터 내에 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호화하는 DNA 분절이 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하도록 발현 벡터의 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 조절 서열은, 비제한적으로, 프로모터 (예컨대, 자연적으로 결합되거나 이종성인 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 억제 요소, 및 전사 종결 서열을 포함한다. 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포(예컨대, COS 또는 CHO 세포)를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템일 수 있다. 벡터가 적절한 숙주 내에 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현, 및 항체 수집 및 정제에 적절한 조건 하에 유지된다.
암호의 축중(degeneracy)으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 원하는 핵산 서열은 새로운 새로운 고상 DNA 합성에 의해 또는 이전에 제조된 다양한 원하는 폴리뉴클레오티드의 중합효소 쇄 반응 (PCR) 돌연변이 유발에 의해 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발은 표적 폴리펩티드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체의 제조에 적절한 방법의 예이다. Adelman et al., DNA 2:183 (1983)을 참조한다. 요컨대, 표적 폴리펩티드 DNA는 단일-가닥 DNA 주형에 대해 원하는 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 혼성화함으로써 변경된다. 혼성화 후에, DNA 중합효소는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼입시키는 주형의 전체의 제2 상보성 가닥을 합성하고, 표적 폴리펩티드 DNA에서의 선택된 변경을 암호화하기 위해 사용된다.
적절한 발현 벡터는 전형적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는, 원하는 DNA 서열로 형질전환된 이러한 세포를 검출할 수 있도록 선별 마커 (예컨대, 암피실린-저항성, 하이그로마이신-저항성, 테트라사이클린 저항성, 카나마이신 저항성 또는 네오마이신 저항성)를 함유한다.
에세케리아 콜리(Escherichia coli)는 대상 항체-암호화 폴리뉴클레오티드를 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 원핵 숙주 세포의 예이다. 사용에 적절한 다른 미생물 숙주는 바실러스, 예컨대 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 및 다른 장내 세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 호환가능한 발현 조절 서열 (예컨대, 복제 원점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 작동 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
효모와 같은 다른 미생물이 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스 (Saccharomyces) (예컨대, S. 세레비지아(cerevisiae)) 및 피키아(Pichia)가, 원하는 바와 같은 발현 조절 서열 (예컨대, 프로모터), 복제 원점, 종결 서열 등을 갖는 적절한 벡터를 갖는, 적절한 효모 숙주 세포의 예이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 글리콜 분해 효소를 포함한다. 다른 것들 중에서, 유도성 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나아제, 이소시토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물 이외에, 포유류 세포 (예컨대, 시험관 내 세포 배양에서 성장한 포유류 세포)가 또한 본 발명의 항-LAG-3 항체의 발현 및 생산에 사용될 수 있다 (예컨대, 대상 항-LAG-3 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드). Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)를 참조한다. 적절한 포유류 숙주 세포는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 및 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이러한 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 원점, 프로모터, 및 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필수 처리 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 적절한 발현 조절 서열의 예는 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 프로모터이다. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)를 참조한다. 다른 방법에서, 본 발명의 항체는 마우스에서 생산될 수 있다 (예컨대, Laffleur et al "Production of human or humanized antibodies in mice*j Methods Mol Biol. 2012;901:149-59를 참조한다).
합성되면 (화학적으로 또는 재조합적으로), 전체의 항체, 이의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 대상 항체의 다른 형태 (예컨대, scFv 등)는, 암모늄 설페이트 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정제, 겔 전기영동 등을 포함하여, 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)를 참조). 대상 항체는 실질적으로 순수, 예컨대, 적어도 약 80% 내지 85% 순수, 적어도 약 85% 내지 90% 순수, 적어도 약 90% 내지 95% 순수, 또는 98% 내지 99%, 또는 그 이상 순수할 수 있으며, 예컨대 세포 파편, 대상 항체 이외의 거대 분자 등과 같은 오염물질이 없을 수 있다.
핵산 분자, 발현 벡터, 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 7 또는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열이 동일한 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 7 또는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 8 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열이 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항- LAG-3 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 8 또는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3 각각의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 14, 서열번호 15, 및 서열번호 16의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 24, 서열번호 25, 및 서열번호 26의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 33의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 각각 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 대상 항-LAG-3 항체를 암호화한다.
대상 항체를 암호화하는 핵산 분자는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 의도된 표적 세포 (예컨대 암호화된 항체를 합성하기 위해 유전적으로 변형된 세포)에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능케 하는 프로모터 및 인핸서에 작동적으로 연결될 수 있다.
적절한 프로모터 및 인핸서가 당업계에 공지되어 있다. 원핵 숙주 세포에서 사용하기에 적절한 프로모터는, 비제한적으로 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터; T3 프로모터; T5 프로모터; 람다 P 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예컨대, lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터, 등; gpt 프로모터; araBAD 프로모터; 생체 내 조절된 프로모터, 예컨대 ssaG 프로모터 또는 관련 프로모터 (예컨대, 미국 특허 공개 20040131637 참조), pagC 프로모터 (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), nirB 프로모터 (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), 등 (예컨대, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; 및 Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892 참조); sigma70 프로모터, 예컨대, 공통의 sigma70 프로모터 (예컨대, 유전자은행 접근 번호. AX798980, AX798961, 및 AX798183 참조); 고정상 프로모터, 예컨대, dps 프로모터, spv 프로모터, 등; 병원성 유전자균 SPI-2로부터 유도된 프로모터 (예컨대, WO96/17951 참조); actA 프로모터 (예컨대, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096 참조); rpsM 프로모터 (예컨대, Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367 참조); tet 프로모터 (예컨대, Hillen,W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162 참조); SP6 프로모터 (예컨대, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035 참조); 등을 포함한다. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)와 같은 원핵생물에서 사용하기에 적절한 강력한 프로모터는, 비제한적으로 Trc, Tac, T5, T7, 및 P람다를 포함한다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 비제한적인 예는 락토스 프로모터 오퍼레이터 (락토스와 접촉 시 LacI 억제제 단백질이 형태를 변화시킴으로써 LacI 억제제 단백질이 오퍼레이터에 결합하는 것을 방지함), 트립토판 프로모터 오퍼레이터 (트립토판과 복합체를 형성할 때, TrpR 억제제 단백질은 오퍼레이터와 결합하는 구조를 가지며; 트립토판이 없는 경우, TrpR 억제제 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 구조를 가짐), 및 tac 프로모터 오퍼레이터 (예컨대, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 참조)를 포함한다.
일부 구현예에서, 예컨대, 효모 세포에서의 발현을 위해, 절절한 프로모터는 구성적인 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1 (예컨대, 예컨대 피키아(Pichia)에서 사용하는 경우)이다.
진핵세포에서 발현하기 위해, 적절한 프로모터는 비제한적으로 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스의 긴 말단 반복에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 다양한 당업계에 공지된 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 이내에 널리 있다.
대상 항체를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 본 발명은 클로닝 벡터 내에 대상 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한, 암호화된 항체의 발현을 보장하기 위해 발현 벡터에서 적절한 조절 서열에 작동적으로 연결된 대상 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 분자를 제공한다. 대상 항체가 2개의 별개의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 동일하거나 별개의 벡터 내에 클로닝되어 하나 이상의 재조합 분자를 형성할 수 있다. 재조합 분자는 선별 마커, 복제 기원, 및 재조합 분자의 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다.
다수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며; 다수가 대상 재조합 분자를 생성하기 위해 상업적으로 이용가능하다. 다음의 벡터가 예시로 제공된다. 박테리아: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, 캘리포니아, 미국); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia, 웁살라, 스웨덴). Eukaryotic: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치하는 편리한 제한효소 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동하는 선별 마커가 존재할 수 있다. 적절한 발현 벡터는, 비제한적으로 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터의 예는, 비제한적으로 다음에 기초한 바이러스 벡터를 포함한다: 우두 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스 (예컨대, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li 및 Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-관련 바이러스 (예컨대, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617 참조); SV40; 단순 헤르페스 바이러스; 레트로바이러스 벡터 (예컨대, 쥐 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (예컨대, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999 참조), 골수증식성 육종 바이러스, 및 포유류 종양 바이러스로부터 유래된 벡터); 등
전술한 바와 같이, 대상 핵산 분자는 본 발명의 항-LAG-3 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 핵산 분자는 대상 13E2 또는 34F4 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 핵산 분자는 대상 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 CDR-암호화 서열은 FR-암호화 뉴클레오티드 서열과 함께 산재되어 있다. 일부 구현예에서, FR-암호화 뉴클레오티드 서열은 인간 FR-암호화 뉴클레오티드 서열이다.
숙주 세포
본 발명은 대상 핵산 분자로 유전적으로 변형된 단리된 유전적으로 변형된 숙주 세포 (예컨대, 시험관 내 세포)를 제공한다. 일부 구현예에서, 대상의 단리된 유전적으로 변형된 숙주 세포는 대상 항체를 생산할 수 있다. 이러한 세포는 재조합 세포로 지칭된다. 재조합 세포는 대상 항체를 암호화하는 재조합 분자를 포함한다.
적절한 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유류 세포, 곤충 숙주 세포, 효모 세포; 및 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포를 포함한다. 대상 핵산의 숙주 세포로의 도입은, 예컨대 칼슘 포스페이트 침전법, DEAE 덱스트란 매개된 형질감염, 리포좀-매개된 형질감염, 전기천공법, 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
적절한 포유류 세포는 1차 세포 및 불멸화된 세포주를 포함한다. 적절한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류 (예컨대, 마우스, 랫트) 세포주 등을 포함한다. 적절한 포유류 세포주는 비제한적으로 HeLa 세포 (예컨대, 미국 유형 배양 수집 (American Type Culture Collection) (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예컨대, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예컨대, ATCC No. CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포 (예컨대, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예컨대, ATCC No. CCL10), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포, 등을 포함한다. 일부의 경우에서, 세포는 HEK 세포이다. 일부의 경우에서, 세포는 CHO 세포, 예컨대, CHO-K1 세포 (ATCC No. CCL-61), CHO-M 세포, CHO-DG44 세포 (ATCC No. PTA-3356), 등이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 COS 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 293 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
적절한 효모 세포는, 비제한적으로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라메(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 오푼티에 (Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살리크타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르컴(Pichia guercuum), 피키아 피페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리엄 럭노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종 (Fusarium sp.), 푸사리움 그라미늄(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa), 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii), 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 피키아(Pichia)이다.
적절한 원핵 세포는, 비제한적으로 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli), 바실러스(Bacillus) (예컨대, B. 섭틸러스(subtilis)), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 등 중 임의의 다양한 실험실 균주를 포함한다. 예컨대, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; 미국특허 6,447,784; 및 Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302를 참조한다. 전형적으로, 실험실 균주는 비-병원성인 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리아 콜리(Escherichia coli)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)이다.
조성물
본 발명은 대상 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 대상 항체 조성물은, 대상 항체 외에, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 염, 예컨대, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, 등; 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제, 트리스 완충제, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산) (HEPES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 (MES), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 소듐 염 (MES), 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), N-트리스[히드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산 (TAPS), 등; 가용화제; 세제(detergent), 예컨대, 비-이온성 세제 예컨대 Tween-20, 등; 프로테아제 억제제; 글리세롤 등.
약학 조성물
본 발명은 대상 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함하는, 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본원에서 제형으로도 지칭되는 약학 조성물은 유효량의 대상 항체를 포함한다. "유효량"은 원하는 결과, 예컨대 면역 장애와 관련된 이상 증상의 감소, 면역 장애의 증상의 개선, 면역 장애의 진행 둔화 등을 생성하기에 충분한 투여량을 의미한다. 일반적으로, 원하는 결과는 대조군과 비교하여, 적어도 면역 장애의 증상의 감소이다.
제형
본 발명의 방법에서, 대상 항체는 원하는 치료 효과 또는 진단 효과를 생성할 수 있는 임의의 편리한 수단을 사용하여 숙주에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 제제는 치료학적 투여를 위한 다양한 제형에 혼입될 수 있다. 보다 특히, 대상 항체는 적절한, 약학적으로 허용되는 담체, 약학적으로 허용되는 희석제, 또는 다른 약학적으로 허용되는 부형제와의 조합에 의해 약학 조성물로 제형화될 수 있고, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사액, 흡입 또는 에어로졸로 제제에 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 대상 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
약학 투여 형태에서, 대상 항체는 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있거나, 이들은 또한 단독으로 또는 다른 약학적으로 활성인 화합물과의 적절히 결합 및 조합으로 투여될 수 있다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
경구 제제의 경우, 대상 항체는 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조하기 위해 단독으로, 또는 예컨대 통상적인 첨가제, 예컨대 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 결합제, 예컨대 결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 소듐 카복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트; 및 원하는 경우, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향미제와 함께 적절한 첨가제와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
대상 항체는 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 프로필렌 글리콜, 합성 지방족 산 글리세리드, 주사가능한 유기 에스터 (예컨대, 에틸 올리에이트), 고급 지방족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스터; 및 원하는 경우, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 함께 항체를 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제제로 제형화될 수 있다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락티드화된 링거 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대, 링거 덱스트로스를 기초로 한 것) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 약학 제제는, 약학 조성물의 의도된 용도에 따라, 추가 제제 예컨대 도파민 또는 정신약물학적 약물을 포함할 수 있다.
대상 항체를 포함하는 약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 대상 항체를, 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 다른 부형제, 안정화제, 계면활성제, 완충제 및/또는 긴장성 제제와 혼합함으로써 제조된다. 허용되는 담체, 다른 부형제 및/또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제 예컨대 아스코르브산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌 및 시트르산; 보존제 (예컨대 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 또는 이들의 조합); 아미노산 예컨대 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린 및 이들의 조합; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 젤라틴 또는 혈청 알부민; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 트레할로스, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프럭토스, 소르보스, 라피노스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴라민산; 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 Tween, Brij Pluronics, Triton-X, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
약학 조성물은 액체 형태, 동결건조된 형태 또는 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있으며, 여기서, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액으로 재구성되어야 한다. 동결건조된 조성물을 재구성하기 위한 표준 절차는 일정량의 순수한 물 (전형적으로 동결건조 동안 제거된 부피와 동등함)을 첨가하는 것이다. 그러나, 항균제를 포함하는 용액이 비경구 투여용 약학 조성물의 생산에 사용될 수 있다; 또한 Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54를 참조한다.
대상 약학 조성물 중의 예시적인 항체 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 또는 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 150 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 범위일 수 있다.
항체의 수성 제형은 pH-완충된 용액, 예컨대 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0의 범위, 또는 다르게는 약 5.5에서 제조될 수 있다. 이러한 범위 이내의 pH에 적절한 완충제의 예는, 포스페이트-, 히스티딘-, 시트레이트-, 숙시네이트-, 아세테이트-완충제 및 다른 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는, 예컨대 완충제 및 제제의 원하는 긴장도에 따라 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM일 수 있다.
긴장제가 제형의 긴장도를 조절하기 위해 항체 제형 중에 포함될 수 있다. 예시적인 긴장제는 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 글리세린 및 아미노산, 당, 및 이들의 조합의 군으로부터의 임의의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 수헝 제형은 등장 용액이지만, 고장 용액 또는 저장 용액이 적절할 수 있다. 용어 "등장"은 생리학적 염 용액 또는 혈청과 같이, 그것이 비교되는 일부 다른 용액과 동일한 긴장도를 갖는 용액을 지칭한다. 긴장제는 약 5 mM 내지 약 350 mM의 양, 예컨대, 100 mM 내지 350 nM의 양으로 사용될 수 있다.
계면활성제가 또한 제형화된 항체의 응집을 감소시키고/시키거나 제형 중의 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡수를 감소시키기 위해 항체 제형에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스터 (Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 (Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에터(Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Poloxamer, Pluronic), 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 적절한 폴리옥시에틸렌솔비탄-지방산 에스터의 예는 폴리 솔베이트 20, (상표 Tween 20TM으로 판매됨), 및 폴리솔베이트 80 (상표 Tween 80TM으로 판매됨)이다. 적절한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체의 예는 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188TM의 명칭으로 판매되는 것들이다. 적절한 폴리옥시에틸렌 알킬 에터의 예는 상표명 BrijTM으로 판매되는 것들이다. 계면활성제의 예시적인 농도는 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 범위일 수 있다.
동결건조 보호제가 또한 동결건조 공정 동안 불안정화 조건에 대해 불안정한 활성 성분 (예컨대, 단백질)을 보호하기 위해 첨가될 수 있다. 예컨대, 공지된 동결건조 보호제는 당 (글루코스 및 수크로스 포함); 폴리올 (만니톨, 솔비톨 및 글리세롤 포함); 및 아미노산 (알라닌, 글리신 및 글루탐산 포함)을 포함한다. 동결건조 보호제는 약 10 mM 내지 500 nM의 양으로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 제형은 대상 항체, 및 하나 이상의 상기 확인된 제제 (예컨대, 계면활성제, 완충제, 안정화제, 긴장제)를 포함하며, 하나 이상의 보존제, 예컨대 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 및 이들의 조합을 본질적으로 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 보존제는 예컨대 약 0.001 내지 약 2% (w/v)의 범위의 농도로 제형 중에 포함된다.
예컨대, 대상 제형은 비경구 투여에 적절한 액체 또는 동결건조화된 제형일 수 있으며, 다음을 포함할 수 있다: 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 대상 항체; 약 0.001 % 내지 약 1 %의 적어도 하나의 계면활성제; 약 1 mM 내지 약 100 mM의 완충제; 선택적으로 약 10 mM 내지 약 500 mM의 안정화제; 및 약 5 mM 내지 약 305 mM의 긴장제; 그리고 약 4.0 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.
또 다른 예시로서, 대상 비경구 제형은 다음을 포함하는 액체 또는 동결건조된 제형이다: 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다.
또 다른 예시로서, 대상 비경구 제형은 다음을 포함하는 동결건조된 제형이다: 1) 15 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 2) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 3) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 4) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스; 및 pH 5.5를 갖는다; 또는 5) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다.
또 다른 예시로서, 대상 비경구 제형은 다음을 포함하는 액체 제형이다: 1) 7.5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 120 mM L-히스티딘; 및 250 125 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 2) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 3) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 수크로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 4) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 125 mM 트레할로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 5) 37.5 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-히스티딘; 및 125 mM 트레할로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 6) 5 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 7) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 만니톨; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 8) 75 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L 히스티딘; 및 140 mM 소듐 클로라이드; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 9) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 트레할로스; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 10) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 250 mM 만니톨; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 11) 150 mg/mL의 대상 항체; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 140 mM 소듐 클로라이드; 그리고 pH 5.5를 갖는다; 또는 12) 10 mg/mL의 대상 항체; 0.01% Tween 20 w/v; 20 mM L-히스티딘; 및 40 mM 소듐 클로라이드; 그리고 pH 5.5를 갖는다.
대상 항체는 흡입을 통해 투여되기 위해 에어로졸 제형으로 사용될 수 있다. 대상 항체는 다이클로로다이플루오로메탄, 프로판, 니트로겐 등과 같이 가압된 허용가능한 추진체로 제형화될 수 있다. 에어로졸 제형 예컨대 비강 스프레이 제형은 보존제 및 등장제와 함께 활성제의 정제된 수성 또는 다른 용액을 포함한다. 이러한 제형은 비강 점막과 호환될 수 있는 pH 및 등장성 상태로 조정된다.
또한, 대상 항체는 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합함으로써 좌제로 제조될 수 있다. 대상 항체는 좌제를 통해 직장으로 투여될 수 있다. 좌제는 비히클, 예컨대 코코아 버터, 카르보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있으며, 이는 체온에서는 녹지만 실온에서는 고형화된다.
경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여량 형태, 예컨대 시럽, 엘릭서, 및 좌제가 제공될 수 있으며, 여기서, 각각의 투여량 단위, 예컨대 티스푼, 스푼, 정제, 또는 좌제는 소정량의 조성물을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥 투여를 위한 단위 투여량 형태는 멸균수, 정상 식염수 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체 중의 용액으로서 조성물 중에 대상 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단위 투여량 형태"는 인간 및 동물 대상에 대한 단위 투여로서 적절한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 소정량의 본 발명의 항-LAG-3 항체를 함유하고, 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 결합하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된다. 대상 항체를 위한 상세 사항은 사용된 특정 항체 및 달성되어야할 효과, 및 숙주에서 각각의 항체와 관련된 약물동력학에 따라 달라질 수 있다.
다른 투여 방식도 또한 본 발명의 방법을 사용하여 발견될 것이다. 예컨대, 대상 항체는 좌제, 및 일부의 경우에서, 에어로졸 및 비강 내 조성물로 제형화될 수 있다. 좌제의 경우, 비히클 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 또는 트리글리세리드를 포함할 것이다. 이러한 좌제는 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10% (w/w), 예컨대, 약 1% 내지 약 2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
비강 내 제형은 통상적으로 코 점막에서 자극을 유발하지도 않고 섬모질 기능을 심각하게 방해하지 않는 비히클을 포함할 것이다. 희석제, 예컨대 물, 수성 식염수 또는 다른 공지된 물질이 사용될 수 있다. 비강 제제는 또한 보존제, 예컨대 클로로부탄올 및 벤즈알모늄 클로라이드를 비제한적으로 함유할 수 있다. 계면활성제가 코 점막에 의한 대상 항체의 흡수를 향상시키기 위해 존재할 수 있다.
대상 항체는 주사가능한 제형으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 주사 가능한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 주사 전의 액체 비히클 중의 용액, 또는 현탁액에 적절한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화되거나 리포좀 비히클에 캡슐화된 항체일 수 있다.
적절한 부형제 비히클은, 예컨대 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합이다. 또한, 원하는 경우, 비히클은 소량의 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법이 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다. 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985를 참조한다. 임의의 경우, 투여될 조성물 또는 제형은 치료되는 대상에서 원하는 상태를 달성하기에 적절한 양의 대상 항체를 함유할 것이다.
약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 비히클, 어쥬번트, 담체 또는 희석제는 대중이 용이하게 이용할 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 긴장 조절제, 안정화제, 습윤제 등은 대중이 용이하게 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 조절된 방출 제형으로 제형화된다. 서방성 제제는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예는 매트릭스가 성형된 형태, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐인 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스터, L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 히드로겔, 폴리락티드, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 서방성 제제 중에 포함된 항체의 면역원성에 있어서 가능한 생물학적 활성의 손실 가능성 및 변화 가능성은 적절한 첨가제를 사용함으로써, 수분 함량을 조절함으로써, 그리고 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 방지할 수 있다.
본 발명의 범위 내의 조절된 방출은 다수의 연장된 방출 투여 형태 중 임의의 하나를 의미하는 것으로 간주될 수 있다. 다음의 용어는 본 발명의 목적을 위해 제어된 방출과 실질적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다: 연속 방출(continuous release), 제어 방출(controlled release), 지연 방출(delayed release), 데포(depot), 연장 방출(extended release), 점진 방출(gradual release), 즉시 방출(immediate release), 장기간 방출(long-term release), 프로그램화된 방출(programmned release), 연장 방출(prolonged release), 서방 방출(proportionate release), 지연 방출(protracted release), 저장(repository), 후퇴(retard), 느린 방출(slow release), 간격 방출(spaced release), 지속 방출(sustained release), 타임 코트(time coat), 시간 방출(timed release), 지연 작용(delayed action), 연장 작용(extended action), 계층화된 시간 작용(layered-time action), 장기 작용(long acting), 연장된 작용(prolonged action), 반복된 작용(repeated action), 느린 작용(slowing acting), 지속 작용(sustained action), 및 지속 작용 약제. 이러한 용어의 추가의 논의를 Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.)에서 확인할 수 있다.
다양한 제어 방출 기술은 매우 광범위한 약물 투여 형태를 포함한다. 제어 방출 기술은, 비제한적으로 물리적 시스템 및 화학적 시스템을 포함한다.
물리적 시스템은 비제한적으로 속도-조절 멤브레인, 예컨대 마이크로캡슐화, 매크로캡슐화, 및 멤브레인 시스템이 장작된 저장조(reservoir) 시스템; 속도 조절 멤브레인이 없는 저장조 시스템, 예컨대 중공 섬유, 초 미세다공성 셀룰로스 트리아세테이트, 및 다공성 종합체성 기질 및 포말, 예컨대 비다공성, 중합체성, 또는 탄성중합체성 매트릭스 (예컨대, 비침식성, 침식성, 환경 제제 침투, 및 분해성)에 물리적으로 용해된 시스템; 및, 비-다공성, 중합체성, 또는 탄성중합체성 매트릭스 (예컨대, 비침식성, 침식성, 환경 제제 침투 및 분해성) 중에 물리적으로 분포된 물질; 적층된 구조, 예컨대 외부 제어 층과 화학적으로 유사하거나 비유사한 저장조 층; 및 다른 물리적인 방법, 예컨대 삼투압 펌프, 또는 이온 교환 수지 상으로의 흡착을 포함한다.
화학적 시스템은, 비제한적으로 중합체 매트릭스의 화학적 침식 (예컨대, 비균질 또는 균질 침식), 또는 중합체 매트릭스의 생물학적 침식 (예컨대, 비균질 또는 균질)을 포함한다. 제어 방출을 위한 시스템의 카테고리에 대한 추가의 논의를 Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.)에서 확인할 수 있다.
경구 투여를 위해 개발된 다양한 제어 방출 약물 형태가 존재한다. 이들은, 비제한적으로 삼투압-제어된 위장 전달 시스템; 유체역학적 압력-제어된 위장 전달 시스템; 미세다공성 막 투과-제어된 위장 전달 시스템을 포함하는 막 투과-제어된 위장 전달 시스템; 위액-저항성 장 표적화된 제어된-방출 위장 전달 장치; 겔 확산-제어된 위장 전달 시스템; 및 양이온 및 음이온 약물을 포함하는 이온-교환-제어된 위장 전달 시스템을 포함한다. 제어된 방출 약물 전달 시스템에 관한 추가의 정보를 Yie W. Chien, Novel Drug Delivery 시스템s, 1992 (Marcel Dekker, Inc.)에서 확인할 수 있다.
투여량(Dosages)
적절한 투여량은 다양한 임상적 인자에 기초하여 주치의 또는 다른 자격이 있는 의료인에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 환자의 성별, 시간, 및 투여 경로, 일반적인 건강, 및 현재 투여중인 다른 약물을 포함하여, 다수의 요인에 따라 달라진다. 대상 항체는 투여량 당 1 ng/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 예컨대 0.001 내지 10, 0.01 내지 10, 0.1 내지 10, 1 내지 10, 0.001 내지 1, 0.01 내지 1, 0.1 내지 1, 0.05 내지 5, 0.05 내지 0.5, 또는 0.5 내지 5 mg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있다. 그러나, 특히 전술된 인자를 고려하여, 이러한 예시적인 범위 미만 또는 초과의 투여량이 고려될 수 있다. 요법이 연속적인 주입인 경우, 이는 분 당 1 ㎍ 내지 10 mg/kg 체중의 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상 항-LAG-3 항체의 투여량은 0.001 ㎍ 내지 100mg, 예컨대 0.001 ㎍ 내지 10mg, 0.001 ㎍ 내지 1mg, 0.001 ㎍ 내지 0.1mg, 0.01 ㎍ 내지 10mg, 0.1 ㎍ 내지 10mg, 0.1 ㎍ 내지 1mg, 또는 0.1 ㎍ 내지 0.1 mg, 또는 0.01 내지 100 mg, 0.01 내지 10 mg, 0.01 내지 1 mg, 0.01 내지 0.1 mg, 0.1 내지 100 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 1 mg의 범위이다.
일부 구현예에서, 투여량은, 예컨대 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 5 mg/kg (예컨대, 0.02 내지 5 mg/kg, 0.25 내지 5 mg/kg, 0.5 내지 5 mg/kg, 0.75 내지 5 mg/kg, 1 내지 5 mg/kg, 2 내지 5 mg/kg, 등) 체중의 범위일 수 있다. 예컨대 투여량은 0.1, 1, 또는 10 mg/kg 체중, 또는 0.01-10 mg/kg의 범위, 또는 적어도 0.1 mg/kg일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체, 또는 이의 단편은 최대 0.5 mg/kg 체중, 예컨대 0.0001 내지 0.5 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.5 mg/kg, 0.1 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 내지 0.1 mg/kg, 0.001 내지 0.1 mg/kg, 0.01 내지 0.1 mg/kg 체중의 범위이다.
일부 구현예에서, 대상 항-LAG-3 항체는 약 0.001 ㎍/ml 내지 약 1 mg/ml, 예컨대 0.0001 ㎍/ml 내지 1 ㎍/ml, 0.001 ㎍/ml 내지 1 ㎍/ml, 0.001 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml, 0.01 내지 1, 또는 0.01 내지 0.1 ㎍/ml, 또는 약 0.005 ㎍/ml 내지 약 1 ㎍/ml, 또는 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 1 ㎍/ml, 또는 약 1 ㎍/ml 내지 약 2.5 ㎍/ml, 약 2.5 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml, 약 5 ㎍/ml 내지 약 7.5 ㎍/ml, 약 7.5 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml, 약 10 ㎍/ml 내지 약 25 ㎍/ml, 약 25 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml 내지 약 250 ㎍/ml, 약 250 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, 약 500 ㎍/ml 내지 약 750 ㎍/ml, 또는 약 750 ㎍/ml 내지 약 1000 ㎍/ml의 최대 혈청 농도를 제공하는 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항-LAG-3 항체는 1 mg/ml 초과, 예컨대, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 최대 혈청 농도 제공하는 양으로 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-LAG-3 항체, 또는 이의 단편은 최대 1 ㎍/ml, 예컨대 0.0001 ㎍/ml 내지 1 ㎍/ml, 0.001 ㎍/ml 내지 1 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 1 ㎍/ml, 0.1 내지 1 ㎍/ml, 0.0001 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml, 0.001 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml, 또는 0.01 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml의 범위의 최대 혈청 농도를 제공하는 양으로 투여된다. 적절하게는, 이러한 투여는 피하 주사에 의한 것이다.
개인은 매일, 격일, 매주 또는 경험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 이러한 투여량이 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 장기간, 예컨대 적어도 6개월에 걸쳐 다수의 투여량으로 투여되는 것을 수반한다. 추가의 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.
예시적인 투여 스케쥴은 연속적인 날에서 0.01 내지 1 mg/kg, 0.01 내지 0.1 mg/kg, 0.1 내지 1 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일에서 0.02 내지 20 mg/kg, 예컨대 0.2 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 20 mg/kg, 또는 매주 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 1 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 또는 60 mg/kg을 포함한다. 몇몇 방법에서, 상이한 결합 특성을 갖는 둘 이상의 단클론 항체가 동시에 투여되며, 이러한 경우에, 투여된 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 있다. 진행 상황이 정기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다.
대상에서 LAG-3을 발현하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 수는 상대적으로 적다. 본 발명의 항체 (특히, 적어도 2주의 혈청 반감기를 갖고 심각한 CDC 및 ADCC 활성이 결여된 본 발명의 항체, 예컨대 인간 IgG 이소형 항체 (이는 CDC 및 ADCC 활성이 결여되어 있음), 또는 CDC 및 ADCC 활성을 감소시키거나 없애기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체)의 단일 투여가 적어도 몇 주 동안 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식을 억제하는데 효과적일 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 관점에서, 적절한 치료 요법은 본 발명의 항체 (예컨대 0.01 내지 1 mg/kg의 항체)를 4, 6, 8, 또는 10주마다 1회, 또는 2개월 또는 3개월마다 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료는 적어도 6개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년, 또는 그 이상 동안의 기간에 걸쳐, 예컨대 투여에 의해 치료되는 질병의 과정 전반에 걸쳐, 또는 대상의 수명 전반에 걸쳐 제공될 수 있다.
당업자는 투여량 수준 및 투여 스케쥴이 특정 항체의 기능, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 대상의 감수성에 따라 다양할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투여량 및 투여 스케쥴이 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
투여 경로
대상 항체는 생체 내 및 생체 외 방법, 및 전신 및 국소 투여 경로를 포함하여, 약물 전달에 적절한 임의의 이용가능한 방법 및 경로를 사용하여 대상에 투여된다.
통상적이고 약학적으로 허용되는 투여 경로는, 비강 내, 근육 내, 기관 내, 척추강 내, 두개 내, 피하, 피내, 국소, 정맥 내, 복강 내, 동맥 내 (예컨대, 목동맥(carotid artery)을 통해), 척추 또는 뇌 전달, 직장, 코, 경구, 및 다른 장내 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 조절될 수 있으며, 필요한 경우, 항체 및/또는 원하는 효과에 따라 조정될 수 있다. 대상 항체 조성물은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 경구로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 흡기 경로를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 비강 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 두개 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 정맥 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 대상 항체 조성물은 척추강 내로 투여된다.
본 발명의 항체는, 임의의 이용가능한 통상적인 방법, 및 전신 또는 국소 경로를 포함하여, 통상적인 약물 전달에 적절한 경로를 사용하여 숙주에 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의해 고려되는 투여 경로는, 비제한적으로, 장내, 비경구, 또는 흡입 경로를 포함한다.
흡입 경로 외의 비경구 투여 경로는, 비제한적으로 국소, 경피, 피하, 근육 내, 안구 내, 피막 내, 척추 내, 흉골 내, 척추강 내, 및 정맥 내 경로, 즉, 소화관을 통한 것을 제외한 임의의 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 대상 항체의 효과적인 전신 또는 국소 전달을 수행하도록 수행될 수 있다. 전신 전달이 바람직한 경우, 투여는 전형적으로 약학 제제의 침습적 또는 전신적으로 흡수된 국소 또는 점막 투여를 수반한다.
대상 항체는 또한 장내 투여에 의해 대상에 전달될 수 있다. 장내 투여 경로는, 비제한적으로 경구 및 직장 (예컨대, 좌제를 사용하여) 전달을 포함한다.
"치료"는 숙주를 괴롭히는 병리학적 상태와 관련된 증상의 적어도 개선을 의미하며, 여기서, 개선은 적어도 파라미터, 예컨대 치료되는 병리학적 상태, 예컨대 면역 장애와 관련된 증상의 크기의 감소를 적어도 지칭하는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병리학적 상태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 저해되며, 예컨대 발생이 방지되거나, 중단되거나, 예컨대 종결되어 숙주가 더 이상 병리학적 상태로부터 고통받지 않거나 적어도 병리학적 상태를 특징으로 하는 증상으로부터 고통받지 않는 상황을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상 항체는 예컨대 뇌동맥 내의 부위 또는 뇌 조직에 직접 주사 및/또는 전달에 의해 투여된다. 대상 항체는 또한 표적 부위에 직접 투여될 수 있으며, 예컨대 유전자 총(biolistic) 전달에 의해 표적 부위에 전달될 수 있다.
다양한 숙주 (여기서, 용어 "숙주"는 본원에서 "대상", "개인", 및 "환자"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다)는 대상 방법에 따라 치료될 수 있다. 일반적으로 이러한 숙주는 "포유동물" 또는 "포유류"이며, 여기서, 이러한 용어는 육식 동물 (예컨대, 고양이), 초식 동물 (예컨대, 소, 말, 양), 잡식 동물(예컨대, 개, 염소 및 돼지), 설치류 (예컨대, 마우스, 기니피그, 및 랫트), 및 영장류 (예컨대 인간, 침팬지, 및 원숭이)를 포함하여 포유 동물의 분류에 속하는 유기체를 설명하기 위해 광범위하게 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주는 보체 시스템을 갖고 있는 대상, 예컨대 포유류, 어류 또는 무척추동물이다. 일부 구현예에서, 숙주는 보체 시스템-함유 포유류, 어류, 또는 무척추동물 동반 동물, 농경 동물, 작업 동물, 동물원 동물, 또는 실험실 동물이다. 일부 구현예에서, 숙주는 인간이다.
이러한 양태는 대상에 투여하기 위한 대상 항-LAG-3 항체를 포함하는 조성물을 함유하기에 적절한 용기를 포함하는 조성물을 포함한다. 예컨대, 대상 항체는 약학 조성물을 함유하기에 적절한 용기 내에 배치될 수 있다. 용기는, 예컨대 병 (예컨대, 캡과 같은 폐쇄 장치를 포함함), 블리스터 팩 (예컨대, 이는 블리스터 당 하나 이상의 투여량의 인클로저를 제공할 수 있음), 바이알, 가요성 포장 (예컨대, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백), 앰플 (용액 중의 단일 투여량을 위한 것임), 점적기, 주사기, 박막, 튜브 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대 멸균 용기는 대상 약학 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 병 또는 주사기이다. 일부 구현예에서, 용기는 병이다. 일부 구현예에서, 용기는 주사기이다.
대상 항체의 단위 투여량을 갖는 키트가, 예컨대 경구 또는 주사가능한 투여량으로 제공된다. 이러한 키트에는, 단위 투여량을 함유하는 용기 이외에, 관심있는 병리학적 상태의 치료에 항체의 사용 및 부수적인 이점을 설명하는 정보 패키지 인서트(insert)가 있다. 바람직한 화합물 및 단위 투여량은 상기 본원에 기술된 것들이다.
치료 방법
본 발명에 따르면, 약제로서 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 항체, 단편, 또는 조성물은 대상에서 LAG-3의 효과를 증가시키기는 것이 바람직한 임의의 치료에서 사용될 수 있다.
용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함하지만, 포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하다.
항체, 단편, 또는 조성물은 T 세포 증식 및/또는 기능을 음성적으로 조절하는 것이 바람직한 임의의 치료에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 대상에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 또는 활성과 관련된 장애, 또는 대상에서 LAG-3의 감소된 발현 및/또는 활성과 관련된 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물이 또한 제공된다.
본 발명에 따르면, 대상에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 또는 활성과 관련된 장애, 또는 대상에서 LAG-3의 감소된 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물이 또한 제공된다.
본 발명에 따르면, 대상에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 또는 활성과 관련된 장애, 또는 대상에서 LAG-3의 감소된 발현 및/또는 활성과 관련된 장애의 치료 방법이 추가로 제공되며, 이는 유효량의 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 또는 활성과 관련된 장애는 면역 장애, 특히 T-세포-매개된 면역 장애, 예컨대 염증성 질환, 또는 자가면역 장애일 수 있다.
항체, 단편, 또는 조성물은 염증 과정을 감소시키거나 염증 과정을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, T 세포 증식 또는 활성화, 특히 부적절한 염증 면역 반응에 관여하는 T 세포 증식 또는 활성화의 생체 내 감소가 제공되며, 예컨대 이러한 반응의 근방/위치로 모집된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 T 세포 증식 또는 활성화의 감소는 치료 전 또는 치료가 없는 것과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 그 이상의 퍼센트의 감소일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물로의 치료는 환자의 일반적인 수준의 T 세포 (비활성화된 T 세포)의 감소 없이, T 세포 증식 또는 활성화의 감소를 가능케 할 수 있다. 이는 부작용을 줄일 수 있고, 환자에서 T 세포 고갈을 예방할 수 있다.
면역 장애는, 예컨대 감염 (바이러스, 박테리아, 진균 및 기생), 감염과 관련된 독소 충격, 패혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 만성 소화 장애증(coeliac disease), 담낭 질환, 모소낭 질환(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 제1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증, 루프스 (예컨대 전신성 루푸스 에리테마토우시스) 및 길랑-바레 증후군, 아토피 피부염, 자가면역 간염, 섬유성 폐렴, 그레이브스 병, IgA 신장병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르 병, 천포창, 일차성 담즙성, 간경화증, 유육종증, 피부경화증, 베게너 육아종중, 다른 자가면역 질환, 췌장염, 외상 (수술), 이식편대 숙주병, 이식 거부, 심장 질환 예컨대 허혈성 질환 예컨대 심근경색증 및 죽상동맥경화증, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 위산 감소증, 또는 태아-모성 내성의 결핍과 관련된 불임으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체, 단편, 또는 조성물은 임의의 치료에서 사용될 수 있으며, 여기서 LAG-3의 MHC 클래스 II 분자로의 결합을 억제하거나, MHC 클래스 II-활성화 신호를 항원-제시 세포 (APC)에 길항하거나, LAG-3-유도된 APC 활성화를 억제하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따르면, 대상에서 APC 활성화와 관련된 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, 대상에서 APC 활성화와 관련된 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물의 사용이 제공된다.
본 발명에 따르면, 대상에서 APC 활성화와 관련된 장애의 치료 방법이 추가로 제공되며, 이는 유효량의 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하기", "치료하다" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질병 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방일 수 있고/있거나, 질병 및/또는 질병에서 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유류, 특히 인간,에서 질환의 임의의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질환에 걸리기 쉽지만 아직 진단되지 않은 대상에서 질병이 발병되는 것을 방지; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 이의 발달을 억제하는 것; 및 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉,질병의 퇴행을 야기하는 것.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "개인", "대상", "숙주", 및 "환자"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함하지만, 포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하다.
"치료 유효량" 또는 "유효량"은 질환을 치료하기 위해 포유류 또는 다른 대상에 투여되는 경우, 질환에 대한 이러한 치료를 수행하기에 충분한 항-LAG-3 항체의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 항-LAG-3 항체, 질환 및 이의 중증도 및 ㅊ;료될 대상의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본원에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 본원에 참조로써 포함된다.
본 발명의 구현예가 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 이제 기술된다:
도 1은 성숙한 인간 LAG-3 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 27)을 나타낸다. 4개의 세포외 Ig 슈퍼패밀리 도메인은 아미노산 잔기: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); 및 331-412 (D4)에 있다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 엑스트라-루프 구조의 아미노산 서열은 굵은 글씨로 밑줄 표시되어 있다 (서열번호 40);
도 2는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 3은 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 13E2의 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 4는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 5는 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 13E2의 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 6은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 7은 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 34F4의 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 8은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 9는 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 34F4의 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 10은 단클론 항체 13E2의 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-D-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 11은 단클론 항체 13E2의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 12는 단클론 항체 34F4의 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-D-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 13은 단클론 항체 34F4의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 14는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4에 대한 LAG-3-형질감염된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대한 결합 결과를 나타낸다;
도 15는 건강한 공여자(공여자 1)로부터의 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4의 CD4+ 및 CD8+ 1차 세포 (SEB-자극된 PBMC)로의 결합 결과를 나타낸다;
도 16a는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4에 의한 IMP321 (LAG-3Ig, 1μg/ml)의 MHC 클래스 II-양성 B 세포로의 결합 억제 결과를 나타낸다. 도 16b는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4의 존재 하에, IMP321 (20ng/ml)에 의한 THP-1 세포의 활성화 억제 결과를 나타낸다;
도 17 (A)는 mIgG1, 17B4 ,13E2 또는 34F4의 존재 하에 1명의 공여자의 CD8+ T 세포의 CMV-유도된 증식 프로파일, 및 유동 세포 계측법 및 실시예 10에 기술된 분석법에서 사용된 게이팅(gating) 전략에 의해 분석한 것을 나타낸다. 도 17 (B)는 동일한 공여자에 대해 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 항체 13E2, 34F4, 및 17B4에 의한 CD8+ T 세포 증식의 억제에 대한 분석 결과를 나타낸다. 기준선 증식이 또한 나타나 있다 (자극되지 않음);
도 18은 몇몇 상이한 공여자에서, 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 항체 13E2 또는 34F4에 의한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식의 억제에 대한 분석 결과를 나타낸다;
도 19는 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4의 CD8+ T 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다;
도 20은 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (도면에서, 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 중쇄 아미노산 서열은 13E2IgG4mut로 지칭됨), 및 키메라 13E2-인간 IgK 항체의 경쇄 아미노산 서열 (도면에서, 키메라 13E2-인간 IgK 경쇄 아미노산 서열은 13E2IgK로 지칭됨)을 나타낸다;
도 21은 고갈, 길항제, 및 작용제 항-LAG-3 항체의 T 세포에 대한 상이한 영향을 나타낸다;
도 22는 본래의 마우스 단클론 항체 13E2 (각각 13E2 VH 및 13E2 VL)의 상응하는 서열과 함께, 인간화된 VH 변이체 1-4 (VH1, VH2, VH3, 및 VH4)의 가변 영역의 정렬, 및 인간화된 VL 변이체 1-4 (VL1, VL2, VL3, 및 VL4)의 가변 영역의 정렬을 나타낸다. CDR 서열은 회색으로 강조하였다. 본래의 마우스 서열과 비교하여, 변이체의 인간화된 골격 서열에서의 변화를 밑줄 표시 및 굵은 글씨로 나타냈다;
도 23은 항체 Chim13E2IgG4의 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 중쇄 아미노산 서열 (13E2IgG4mut)과 정렬된 인간화된 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (IMP761)의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다. VH 영역을 굵은 글씨로 나타냈고, Fc 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgG4mut 서열의 상응 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄의 밑줄로 나타냈다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다;
도 24는 항체 Chim13E2IgG4의 키메라 13E2-인간 IgK 경쇄 아미노산 서열 (13E2IgK)과 정렬된 인간화된 13E2-인간 IgK 항체 (IMP761)의 경쇄 아미노산 서열을 나타낸다. VL 영역은 굵은 글씨로 나타내고, IgK 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgK 서열의 상응 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄 밑줄로 나타냈다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다;
도 25는 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (Chim13E2IgG4) 및 IMP761의 CHO-LAG-3+ 세포로의 결합을 시험하기 위한 분석 결과를 나타낸다;
도 26은 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 (a) 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식; 및 (b) CD8+ T 세포 내의 CD25 발현에 대한 영향을 시험하기 위한 분석 결과를 나타낸다;
도 27은 이소형-매칭된 대조군에 비해, (a) CD8+ T-세포 증식의 억제 퍼센트; 및 CD8+ T 세포 내에서 CD25 발현의 억제 퍼센트의 플롯으로서 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식에 대한 영향, 및 CD25 발현을 나타낸다;
도 28은 상이한 농도의 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식에 대한 영향을 나타낸다;
도 29는 Promega로부터 이용가능한 ADCC 리포터 생물분석을 사용하여, IMP761이 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 ADCC 분석법의 결과 (a); 및 효과기 세포로서 IL-2-자극된 PBMC를 사용한 ADCC 분석법 - 그 결과를 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 퍼센트로서 플롯팅함 (b); 또는 PBMC 집단 중의 LAG-3+ CD4+ 및 LAG-3+ CD8+ T 세포 (c)를 나타낸다;
도 30은 IMP761이 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 토끼 보체를 사용한 CDC 분석법의 결과를 나타낸다 - 그 결과를 PBMC 집단 중의, (a) CD4+ 및 CD8+ T 세포; 또는 (b) LAG-3+ CD4+ 및 LAG-3+ CD8+ T 세포의 퍼센트로서 플롯팅함; 및
도 31은 3일 동안 항체와 함께 항원-자극된 PBMC를 배양한 후에 IMP761가 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위한 분석법 결과를 나타낸다. 결과를 다음과 같이 나타냈다: (a) PBMC 집단 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 퍼센트; 및 (b) CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 중의 LAG-3+ 세포의 퍼센트.
도 1은 성숙한 인간 LAG-3 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 27)을 나타낸다. 4개의 세포외 Ig 슈퍼패밀리 도메인은 아미노산 잔기: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); 및 331-412 (D4)에 있다. 인간 LAG-3 단백질의 D1 도메인의 엑스트라-루프 구조의 아미노산 서열은 굵은 글씨로 밑줄 표시되어 있다 (서열번호 40);
도 2는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 3은 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 13E2의 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 4는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 5는 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 13E2의 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 6은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 7은 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 34F4의 VH 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 8은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도시적 표현을 나타낸다;
도 9는 암호화 핵산 서열과 정렬된 단클론 항체 34F4의 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다;
도 10은 단클론 항체 13E2의 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-D-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 11은 단클론 항체 13E2의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 12는 단클론 항체 34F4의 VH 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-D-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 13은 단클론 항체 34F4의 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 상부 V-J 생식계열 BLAST 정렬을 나타낸다;
도 14는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4에 대한 LAG-3-형질감염된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대한 결합 결과를 나타낸다;
도 15는 건강한 공여자(공여자 1)로부터의 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4의 CD4+ 및 CD8+ 1차 세포 (SEB-자극된 PBMC)로의 결합 결과를 나타낸다;
도 16a는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4에 의한 IMP321 (LAG-3Ig, 1μg/ml)의 MHC 클래스 II-양성 B 세포로의 결합 억제 결과를 나타낸다. 도 16b는 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4, 및 길항성 항-LAG-3 단클론 항체 17B4의 존재 하에, IMP321 (20ng/ml)에 의한 THP-1 세포의 활성화 억제 결과를 나타낸다;
도 17 (A)는 mIgG1, 17B4 ,13E2 또는 34F4의 존재 하에 1명의 공여자의 CD8+ T 세포의 CMV-유도된 증식 프로파일, 및 유동 세포 계측법 및 실시예 10에 기술된 분석법에서 사용된 게이팅(gating) 전략에 의해 분석한 것을 나타낸다. 도 17 (B)는 동일한 공여자에 대해 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 항체 13E2, 34F4, 및 17B4에 의한 CD8+ T 세포 증식의 억제에 대한 분석 결과를 나타낸다. 기준선 증식이 또한 나타나 있다 (자극되지 않음);
도 18은 몇몇 상이한 공여자에서, 이소형 대조군 항체 (mIgG1)에 비해, 항체 13E2 또는 34F4에 의한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식의 억제에 대한 분석 결과를 나타낸다;
도 19는 상이한 농도의 작용성 항-LAG-3 단클론 항체 13E2 및 34F4의 CD8+ T 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다;
도 20은 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (도면에서, 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 중쇄 아미노산 서열은 13E2IgG4mut로 지칭됨), 및 키메라 13E2-인간 IgK 항체의 경쇄 아미노산 서열 (도면에서, 키메라 13E2-인간 IgK 경쇄 아미노산 서열은 13E2IgK로 지칭됨)을 나타낸다;
도 21은 고갈, 길항제, 및 작용제 항-LAG-3 항체의 T 세포에 대한 상이한 영향을 나타낸다;
도 22는 본래의 마우스 단클론 항체 13E2 (각각 13E2 VH 및 13E2 VL)의 상응하는 서열과 함께, 인간화된 VH 변이체 1-4 (VH1, VH2, VH3, 및 VH4)의 가변 영역의 정렬, 및 인간화된 VL 변이체 1-4 (VL1, VL2, VL3, 및 VL4)의 가변 영역의 정렬을 나타낸다. CDR 서열은 회색으로 강조하였다. 본래의 마우스 서열과 비교하여, 변이체의 인간화된 골격 서열에서의 변화를 밑줄 표시 및 굵은 글씨로 나타냈다;
도 23은 항체 Chim13E2IgG4의 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 중쇄 아미노산 서열 (13E2IgG4mut)과 정렬된 인간화된 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (IMP761)의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다. VH 영역을 굵은 글씨로 나타냈고, Fc 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgG4mut 서열의 상응 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄의 밑줄로 나타냈다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다;
도 24는 항체 Chim13E2IgG4의 키메라 13E2-인간 IgK 경쇄 아미노산 서열 (13E2IgK)과 정렬된 인간화된 13E2-인간 IgK 항체 (IMP761)의 경쇄 아미노산 서열을 나타낸다. VL 영역은 굵은 글씨로 나타내고, IgK 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgK 서열의 상응 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄 밑줄로 나타냈다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다;
도 25는 키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 항체 (Chim13E2IgG4) 및 IMP761의 CHO-LAG-3+ 세포로의 결합을 시험하기 위한 분석 결과를 나타낸다;
도 26은 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 (a) 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식; 및 (b) CD8+ T 세포 내의 CD25 발현에 대한 영향을 시험하기 위한 분석 결과를 나타낸다;
도 27은 이소형-매칭된 대조군에 비해, (a) CD8+ T-세포 증식의 억제 퍼센트; 및 CD8+ T 세포 내에서 CD25 발현의 억제 퍼센트의 플롯으로서 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식에 대한 영향, 및 CD25 발현을 나타낸다;
도 28은 상이한 농도의 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식에 대한 영향을 나타낸다;
도 29는 Promega로부터 이용가능한 ADCC 리포터 생물분석을 사용하여, IMP761이 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 ADCC 분석법의 결과 (a); 및 효과기 세포로서 IL-2-자극된 PBMC를 사용한 ADCC 분석법 - 그 결과를 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 퍼센트로서 플롯팅함 (b); 또는 PBMC 집단 중의 LAG-3+ CD4+ 및 LAG-3+ CD8+ T 세포 (c)를 나타낸다;
도 30은 IMP761이 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 토끼 보체를 사용한 CDC 분석법의 결과를 나타낸다 - 그 결과를 PBMC 집단 중의, (a) CD4+ 및 CD8+ T 세포; 또는 (b) LAG-3+ CD4+ 및 LAG-3+ CD8+ T 세포의 퍼센트로서 플롯팅함; 및
도 31은 3일 동안 항체와 함께 항원-자극된 PBMC를 배양한 후에 IMP761가 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위한 분석법 결과를 나타낸다. 결과를 다음과 같이 나타냈다: (a) PBMC 집단 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 퍼센트; 및 (b) CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 중의 LAG-3+ 세포의 퍼센트.
실시예
1
13E2 항-LAG-3 단클론 항체의 생산
항-LAG-3 항체를 생산하기 위해, 15마리의 Balb/c 마우스 (이하 마우스 1-15번으로 지칭됨)를 하기 면역화 프로토콜에 따라 면역화하였다.
13마리의 마우스를 100 ㎍의 IMP321 (LAG-3Ig), 임상 등급 롯트 (lot) S017/LC1/041011 (이하 "LC1"로 지칭됨)로 피하 (s.c.) 주사하여 각각 면역화시켰다: 0일차, 15일차, 30일차, 50일차, 67일차 및 108일차에 3 회 (마우스 12번); 4 회 (마우스 9번); 5 회 (마우스 5 및 14번); 또는 6 회 (마우스 3, 및 11번). 병행하여, 대조군으로 사용한 2마리의 마우스 (마우스 6번 및 마우스 7번)를 0일차에 완전 프로인트 항원보강제 (CFA) 중의 10 ㎍의 LC1로 면역화시키고, 15일차, 30일차, 50일차, 67일차, 및 108일차에 동일한 투여량의 불완전 프로인트 항원보강제 (IFA) 중의 항원으로 면역화시켰다.
6차 면역화 후 12일차에, 마우스 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13 및 15번의 혈청을 채취하고 (마우스 5, 9, 12 및 14번은 이미 희생됨), 코팅된 항원으로서 LAG-3 D1-D4, 기준으로서 정제된 항-LAG-3 17B4 쥐 단클론 항체, 및 표지된 2차 항체로서 염소 항-마우스 Ig-HRP를 사용하여 효소-결합 면역흡착검정 (ELISA) 중에서 분석하여 혈정 중에 존재하는 항-LAG-3 항체의 농도를 결정하였다. 그 결과를 아래 표 2에 나타냈다:
| 마우스 번호 | [항-LAG-3 Ab] ㎍/ml |
| 1 | 1049 |
| 2 | 281 |
| 3 | 423 |
| 4 | 193 |
| 6 | 131 |
| 7 | 394 |
| 8 | 242 |
| 10 | 275 |
| 11 | 506 |
| 13 | 188 |
| 15 | 848 |
6번의 면역화 후에, 이러한 마우스가 어쥬번트로서 CFA 또는 IFA의 부재 하에 IMP321로 면역화되더라도, 몇몇 마우스 (마우스 3번 포함)로부터의 혈청은 2마리 양성 대조군 마우스 (마우스 6 및 7번)로부터의 혈청보다 놀랍게도 더 좋은 결과를 보였다. IFA에서 LAG-3-발현 CHO 세포를 사용하는 다른 실험과 비교하여, 이러한 비전통적인 기법 (즉, 어쥬번트로서 CFA 또는 IFA의 사용 없이 PBS 중의 IMP321로 면역화)은 또한 우수한 결과를 나타냈다 (데이터는 나타내지 않음). 이론에 구애되지 않고, 이는 IMP321 그 자체가 어쥬번트이기 때문에, 즉, 이것이 수지상 세포의 활성화 및 성숙을 직접적으로 유발할 수 있기 때문일 수 있는 것으로 믿어진다.
동일한 혈청 샘플을 Raji B 세포 상에서 발현된 이의 리간드인 MHC 클래스 II에 대한 IMP321의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. 10㎍/ml의 Alexa-Fluor488-접합된 IMP321 용액 10 마이크로리터를 각각의 마우스로부터 수집된 혈청 또는 나이브 혈청 5㎕를 사용하거나 사용하지 않고 4℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션 하였다. 이어서, Raji 세포를 50㎕의 최종 부피에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 세포-결합된 형광을 유동 세포 계측법에 의해 분석하였다.
마우스 3번을, 이 마우스로부터의 혈청이 D1-D4 혈청 ELISA 분석에서 높은 역가 (423㎍/ml)를 나타내었고 (표 1), IMP321의 MHC 클래스 II+ Raji B 세포와의 결합 억제에 대해 강력한 능력을 나타냈기 때문에 선택하였다.
6번째 면역화 후 12일차에, 마우스 3번에 10㎍의 D1-D4 LAG-3 (Fc 꼬리가 없음) 재조합 단백질 (CHO 세포에서 생산하고 정제함)로 정맥 내 (i.v.) 부스트하였다. i.v. 부스트 주사 후 3일차에, 마우스 3번을 희생시키고 비장을 제거하였다. 완전 무혈청 DMEM을 함유하는 페트리 디시에서 비장 조각을 5ml 주사기 고무 플런저를 사용하여 압착하여 추출하였다. 비장세포 및 Sp2/0 골수종 세포 (RPMI 1640 + 10% FCS + 2mM 글루타민 + 0.5% P/S 중에서 배양함)를 무혈청 배지 중에서 세척하였다. 2개의 세포 유형을 5:1 비율의 비장세포:골수종 중에서 함께 혼합한 다음, 원심분리하여 펠릿화하였다. 융합제 (PEG-1500, PBS 중의 폴리에틸렌 글리콜 용액 50% w/v, Roche 10783641001, 108 세포 당 1 ml)를 37℃에서 미리 가온하고 세포 펠릿에 점적하여 첨가하였다. 세포를 매우 부드럽게 재현탁하고, 90초 후에 부피룰 두 배로 희석하였다. 세포를 규칙적인 간격으로 약 5분에 걸쳐 1 내지 15의 최종 희석까지 추가로 희석하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고 10% FBS를 함유하는 배지 중에 재현탁하고 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 (10,000 세포/웰)를 이어서 10 %의 Ultralow Ig FBS (Gibco 16250), 2% HAT (Gibco 21060)를 함유하고 10% BM Condimed H1 (융합 후 및 클로닝 동안 B-세포 하이브리도마의 성장을 지지하기 위해 배양 배지에 보충됨, Roche 11088947001)로 보충된 완전 RPMI 중의 46개의 96-웰 플레이트에 플레이팅 하고, 스크리닝때 까지 배양하였다.
막(membrane)-발현된 LAG-3과 함께, CHO 세포를 사용하여 세포계수법에 의해 스크리닝을 수행하여 FITC-접합된 염소-항 마우스 Ig에 의해 밝혀진 성장하는 하이브리도마의 상등액 중에 존재하는 항체의 결합 능력을 분석하였다 양성 하이브리도마를 확장하고 CHO LAG-3+ 세포, 및 야생형 CHO 세포 상에서 재스크니링 하였다. 이러한 융합으로부터, 총 632개 웰을 LAG-3 발현 CHO 세포 상에서 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다 (14% 수율). 13E2를 포함하여, 4개의 하이브리도마 클론이 항-LGA-3 항체를 안정하게 발현하는 것으로 확인되었다. 이어서, 하이브리도마를 제한 희석에의해 서브클로닝하였다.
| 융합 | N°5 |
| 비장세포 (백만) | 33 |
| 융합 특성 | BM condimed H1, 10,000 세포/웰 |
| 시작한 웰 개수 | 4416 |
| 스크리닝된 분열 세포를 갖는 웰 수 | 632 |
| 회수 | 14% |
| 안정한 항 LAG-3 하이브리도마의 수 | 4 |
실시예
2
항체 13E2의 가변 영역의 아미노산 서열
V
H
아미노산 서열:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLS TSGMG LGWIRQPSGKGLEWLTH IWWDDIK RYNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCAR IVEGSYSSSYFDV WGAGTTVTVSS (서열번호 7).
서열번호 7은 항체 13E2의 중쇄 가변 (VH) 도메인의 아미노산 서열이다. IMGT 번호매김 시스템 (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999))에 의해 결정된, 상보성 결정 영역 (CDR)을 밑줄로 표시하였다. Kabat 번호매김 시스템에 의해 결정된 CDR을 굵은 글씨로 나타냈다.
도 2는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도해적 표현을 나타낸다. 음영이 있는 원 (잔기 번호 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100)은 대부분의 항체에서 소수성인 부위에서 골격 1-3의 소수성 (비극성) 잔기이다. 사각형은 각각의 CDR의 시작과 끝 부분에서 중요한 잔기이다. 골격 중의 아미노산 잔기 번호 23, 41, 89, 104, 118은 구조적으로 보존된 아미노산이다;
V
L
아미노산 서열:
DIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKAS QDVIFD VAWYQQKPGQSPKLLIY SAS SRVSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QQHYSTPYT FGGGTTLEIK (서열번호 8)
서열번호 8은 항체 13E2의 경쇄 가변 (VL) 도메인의 아미노산 서열이다. IMGT 번호매김 시스템 (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999))에 의해 결정된 상보성 결정 영역 (CDR)을 밑줄로 표시하였다. Kabat 번호매김 시스템에 의해 결정된 CDR을 굵은 글씨로 나타냈다.
| 13E2 VH 및 VL CDR 서열 | |||
| 항체 | CDR-1 | CDR-2 | CDR-3 |
| 13E2 VH (IMGT 번호매김) |
GFSLSTSGMG (서열번호 1) |
IWWDDIK (서열번호 2) |
ARIVEGSYSSSYFDV (서열번호 3) |
| 13E2 VL (IMGT 번호매김) |
QDVIFD (서열번호 4) |
SAS (서열번호 5) |
QQHYSTPYT (서열번호 6) |
| 13E2 VH (Kabat 번호매김) |
TSGMGLG (서열번호 21) |
HIWWDDIKRYNPDLRS (서열번호 22) |
IVEGSYSSSYFDV (서열번호 23) |
| 13E2 VL (Kabat 번호매김) |
KASQDVIFDVA (서열번호 24) |
SASSRVS (서열번호 25) |
QQHYSTPYT (서열번호 26) |
도 4는 단클론 항체 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도해적 표현을 나타낸다. 음영이 있는 원 (잔기 번호 4, 11, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101)은 대부분의 항체에서 소수성인 부위에서 골격 1-3의 소수성 (비극성) 잔기이다. 사각형은 각각의 CDR의 시작과 끝 부분에서 중요한 잔기이다. 골격 중의 아미노산 잔기 번호 23, 41, 89, 104, 118은 구조적으로 보존된 아미노산이다.
실시예 3
항체 13E2의 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열
단클론 항체 13E2의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 도 3, 및 아래에 나타냈다:
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTCTAGGCTGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATATCAAGCGCTATAACCCAGACCTGAGGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGATTTTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATATTACTGTGCTCGAATAGTGGAGGGTTCATACAGTAGTAGTTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG (서열번호: 9)
핵산 BLAST 정렬은 단클론 항체 13E2의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 다음의 생식계열 유전자의 서열과 유의한 동일성을 가짐을 보여준다: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
도 10은 13E2 항체의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 이의 상부 생식계열 유전자 매치의 정렬을 나타낸다. 도 10은 13E2 VH 영역 (이는 중쇄 골격 영역 FR1, FR2, 및 FR3을 포함함)의 뉴클레오티드 1-301을 포함하는 부분이 V 유전자 IGHV8-8*01의 핵산 서열과 92.7% 핵산 서열 동일성을 가짐을 보여준다.
| 13E2 VH와 IGHV8-8*01 간의 정렬 요약 | |||||
| 길이 | 매치 | 비매치 | 갭 | 동일성(%) | |
| FR1-IMGT | 75 | 75 | 0 | 0 | 100 |
| CDR1-IMGT | 30 | 29 | 1 | 0 | 96.7 |
| FR2-IMGT | 51 | 48 | 3 | 0 | 94.1 |
| CDR2-IMGT | 21 | 18 | 3 | 0 | 85.7 |
| FR3-IMGT | 114 | 99 | 15 | 0 | 86.8 |
| CDR3-IMGT (생식계열) | 10 | 10 | 0 | 0 | 100 |
| 합계 | 301 | 279 | 22 | 0 | 92.7 |
단클론 항체 13E2의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 도 5 및 아래에 나타냈다:
GACATTGTGATGACCCAGCCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGAAGACAGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTCCCGGGTCAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGTAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACACTATAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCACGCTGGAAATAAAAC (서열번호 10).
핵산 BLAST 정렬은 단클론 항체 13E2의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 다음의 생식계열 유전자의 서열과 유의한 동일성을 가짐을 보여준다: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
도 11은 13E2 항체의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 이의 상부 생식계열 유전자 매치의 정렬을 나타낸다. 도 11은 13E2 VL 영역 (이는 경쇄 골격 영역 FR1, FR2, 및 FR3을 포함함)의 뉴클레오티드 1-284를 포함하는 부분이 V 유전자 IGKV6-17*01의 핵산 서열과 94.7% 핵산 서열 동일성을 가짐을 보여준다.
| 13E2 VL과 IGKV6-17*01 간의 정렬 요약 | |||||
| 길이 | 매치 | 비매치 | 갭 | 동일성(%) | |
| FR1-IMGT | 78 | 74 | 4 | 0 | 94.9 |
| CDR1-IMGT | 18 | 14 | 4 | 0 | 77.8 |
| FR2-IMGT | 51 | 50 | 1 | 0 | 98 |
| CDR2-IMGT | 9 | 9 | 0 | 0 | 100 |
| FR3-IMGT | 108 | 103 | 5 | 0 | 95.4 |
| CDR3-IMGT (생식계열) | 20 | 19 | 1 | 0 | 95 |
| 합계 | 284 | 269 | 15 | 0 | 94.7 |
실시예 4
34F4 항-LAG-3 단클론 항체의 생산
4 마리의 Balb/c 마우스 (이하 마우스 1-4번으로 지칭됨)를 0일차, 14일차, 28일차, 43일차, 및 70일차에 100 ㎍의 IMP321 (LAG-3Ig), 임상적 등급 롯트 S017/LC1/041011 (이하 "LC1"로 지칭됨)의 s.c. 주사로 4회 (마우스 2 및 4번), 또는 5회 (마우스 1 및 3번) 각각 면역화하였다. 추가의 Balb/c 마우스 (이하 마우스 5번으로 지칭됨)를 D1-D4 LAG-3의 3회의 s.c. 주사로 면역화하였다.
3번째 주사 후 2주차에, 각각의 마우스로부터의 혈청을 ELISA 분석 (실시예 1에 기술됨)에서 항-LAG-3 항체 함량에 대해 시험하였다. 결과를 하기 표 7에 나타냈다:
| 마우스 번호 | [항-LAG-3 Ab] ㎍/ml |
| 1 | 31 |
| 2 | 10 |
| 3 | 13 |
| 4 | 28 |
| 5 | 10 |
Raji B 세포에 대한 IMP321의 결합을 억제하는 각각의 마우스로부터의 혈청의 능력을 FACS 분석 (실시예 1에 기술됨)에 의해 결정하였다.
표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 항체 역가는 모든 마우스에서 낮았다. 3회 면역화 후 혈청 중 어느 것도 IMP321의 MHC 클래스 II+ Raji B 세포로의 결합을 억제하지 못했다. 다른 출혈을 혈청 역가 및 억제 용량을 시험하기 위해 수행하지 않았다. 면역화 과정을 계속하였고, 5회의 LC1 s.c. 주사를 받은 마우스 3번은 92일차에 10 ㎍의 D1-D4 LAG-3 i.v.로 부스팅하였다.
i.v. 부스트 주사 후 3일차에, 실시예 1에 기술된 동일한 절차에 따라 마우스 3번으로부터의 7300만개의 비장 세포를 1500만개의 Sp2/0 골수종 세포와 융합하였다. 40개의 96-웰 플레이트의 웰에 웰 당 약 25,500개 세포로 씨딩하고, 이어서 10% BM Condimed H1을 포함하는 배양 배지를 보충하여 배양하였다. 2256개 웰을 LAG-3 발현 CHO 세포 상에서 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다 (59%의 수율). 34F4를 포함하여, 2개의 안정한 항-LAG-3 하이브리도마를 선택하였다 (하기 표 8 참조).
| 융합 | N°17 |
| 비장세포 (백만) | 73 |
| 융합 특성 | BM condimed H1, 25,000 세포/웰 |
| 시작한 웰 개수 | 3840 |
| 스크리닝된 분열 세포를 갖는 웰 개수 | 2256 |
| 회수 | 59% |
| 안정한 항 LAG-3 하이브리도마의 수 | 2 |
실시예 5
항체 34F4의 가변 영역의 아미노산 서열
V
H
아미노산 서열:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLN TSGMG VGWIRQPSGKGLEWLTH IWWDDVK RYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTATYYCAR IEGDTYYDYYFDY WGQGVTLTVSS (서열번호 17)
서열번호 17은 항체 34F4의 중쇄 가변 (VH) 도메인의 아미노산 서열이다. IMGT 번호매김 시스템 (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999))에 의해 결정된, 상보성 결정 영역 (CDR)을 밑줄로 표시하였다. Kabat 번호매김 시스템에 의해 결정된 CDR을 굵은 글씨로 나타냈다.
도 6은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VH CDR 루프의 도해적 표현을 나타낸다. 음영이 있는 원 (잔기 번호 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100)은 대부분의 항체에서 소수성인 부위에서 골격 1-3의 소수성 (비극성) 잔기이다. 사각형은 각각의 CDR의 시작과 끝 부분에서 중요한 잔기이다. 골격 중의 아미노산 잔기 번호 23, 41, 89, 104, 118은 구조적으로 보존된 아미노산이다;
V
L
아미노산 서열:
DIVMTQSHKLMSTSVGDGLSITCKAS QDVSIA VVWYQQKPGQSPKLLIY SAS FRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QQHYSIPWT FGGGTKLEIK (서열번호 18)
서열번호 18은 항체 34F4의 경쇄 가변 (VL) 도메인의 아미노산 서열이다. IMGT 번호매김 시스템 (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999))에 의해 결정된, 상보성 결정 영역 (CDR)을 밑줄로 표시하였다. Kabat 번호매김 시스템에 의해 결정된 CDR을 굵은 글씨로 나타냈다.
| 34F4 VH 및 VL CDR 서열 | |||
| 항체 | CDR-1 | CDR-2 | CDR-3 |
| 34F4 VH (IMGT 번호매김) |
GFSLNTSGMG (서열번호 11) |
IWWDDVK (서열번호 12) |
ARIEGDTYYDYYFDY (서열번호 13) |
| 34F4 VL (IMGT 번호매김) |
QDVSIA (서열번호 14) |
SAS (서열번호 15) |
QQHYSIPWT (서열번호 16) |
| 34F4 VH (Kabat 번호매김) |
TSGMGVG (서열번호 31) |
HIWWDDVKRYNPALKS (서열번호 32) |
IEGDTYYDYYFDY (서열번호 33) |
| 34F4 VL (Kabat 번호매김) |
KASQDVSIAVV (서열번호 34) |
SASFRYT (서열번호 35) |
QQHYSIPWT (서열번호 36) |
도 8은 단클론 항체 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003))의 VL CDR 루프의 도해적 표현을 나타낸다. 음영이 있는 원 (잔기 번호 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100)은 대부분의 항체에서 소수성인 부위에서 골격 1-3의 소수성 (비극성) 잔기이다. 사각형은 각각의 CDR의 시작과 끝 부분에서 중요한 잔기이다. 골격 중의 아미노산 잔기 번호 23, 41, 89, 104, 118은 구조적으로 보존된 아미노산이다;
실시예 6
항체 34F4의 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열
단클론 항체 34F4의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 도 7 및 아래에 나타냈다:
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATGTCAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAATAGAGGGGGATACTTACTACGACTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCGTCACTCTCACAGTCTCCTCAG (서열번호 19)
핵산 BLAST 정렬은 단클론 항체 34F4의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 다음의 생식계열 유전자의 서열과 유의한 동일성을 가짐을 보여준다: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
도 12는 34F4 항체의 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 이의 상부 생식계열 유전자 매치와의 정렬을 보여준다. 도 12는 34F4 VH 영역 (이는 중쇄 골격 영역 FR1, FR2, 및 FR3을 포함함)의 뉴클레오티드 1-301을 포함하는 부분이 V 유전자 IGHV8-8*01의 핵산 서열과 94.4% 핵산 서열 동일성을 가짐을 보여준다.
| 34F4 VH과 IGHV8-8*01간의 정렬 요약 | |||||
| 길이 | 매치 | 비매치 | 갭 | 동일성(%) | |
| FR1-IMGT | 75 | 75 | 0 | 0 | 100 |
| CDR1-IMGT | 30 | 28 | 2 | 0 | 93.3 |
| FR2-IMGT | 51 | 49 | 2 | 0 | 96.1 |
| CDR2-IMGT | 21 | 19 | 2 | 0 | 90.5 |
| FR3-IMGT | 114 | 103 | 11 | 0 | 90.4 |
| CDR3-IMGT (생식계열) | 10 | 10 | 0 | 0 | 100 |
| 합계 | 301 | 284 | 17 | 0 | 94.4 |
단클론 항체 34F4의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 도 9 및 아래에 나타냈다:
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAACTCATGTCCACATCAGTTGGAGACGGGCTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGCATTGCTGTAGTCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTGCTGATTTACTCGGCATCCTTCCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC (서열번호 20)
핵산 BLAST 정렬은 단클론 항체 34F4의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 다음의 생식계열 유전자의 서열과 유의한 동일성을 가짐을 보여준다: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
도 13은 34F4 항체의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 이의 상부 생식계열 유전자 매치의 정렬을 보여준다. 도 13은 34F4 VL 영역 (이는 경쇄 골격 영역 FR1, FR2, 및 FR3을 포함함)의 뉴클레오티드 1-284를 포함하는 부분이 V 유전자 IGKV6-17*01의 핵산 서열과 94.7% 핵산 서열 동일성을 가짐을 보여준다.
| 34F4 VL과 IGKV6-17*01간의 정렬 요약 | |||||
| 길이 | 매치 | 비매치 | 갭 | 동일성(%) | |
| FR1-IMGT | 78 | 74 | 4 | 0 | 94.9 |
| CDR1-IMGT | 18 | 16 | 2 | 0 | 88.9 |
| FR2-IMGT | 51 | 49 | 2 | 0 | 96.1 |
| CDR2-IMGT | 9 | 9 | 0 | 0 | 100 |
| FR3-IMGT | 108 | 107 | 1 | 0 | 99.1 |
| CDR3-IMGT (생식계열) | 20 | 19 | 1 | 0 | 95 |
| 합계 | 284 | 274 | 10 | 0 | 96.5 |
실시예 7
17B4
길항제
단클론
항체과
비교한, 작용제
13E2
및 34F4
단클론
항체의 LAG-3
+
형질감염된, 그리고 1차 세포로의 결합
건강한 공여자로부터의 LAG-3+-형질감염된 CHO 세포, 또는 SEB-자극된 PBMC를 항-LAG-3 단클론 항체, 또는 이소형 대조군 (mIgG1)과 함께 4℃에서 PBS, BSA 0.5%, 아자이드 0.1% 중에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 세척하고, 세포-결합된 항체를 FITC-접합된 염소 F(ab')2-항-마우스 Ig (H+L) (Coulter)로 확인하였다. 2차 항체를 세척해내고, CHO 세포를 유동 세포 계측법에 의해 직접 분석하였다. PBMC를 CD4-PE-Cy7 및 CD8-APC-Cy7을 사용하여 표현형화하였다.
CHO LAG-3
+
세포로의 결합
결과를 항체 농도의 함수로서 인간 LAG-3-암호화 플라스미드로 형질감염된 CHO 세포의 형광 강도 평균(MFI)으로서 나타냈다. 결과를 아래 표 12 및 도 14에 나타냈다.
| CHO LAG3+로의 결합 | ||||
| ng/ml | mIgG1 | 17B4 | 13E2 | 34F4 |
| 10000 | 440 | 6087 | 6578 | 6618 |
| 2000 | 251 | 5477 | 6904 | 6411 |
| 500 | 168 | 4759 | 6069 | 4988 |
| 100 | nd | 3170 | 4583 | 3653 |
| 20 | nd | 1378 | 2475 | 1763 |
| 6 | nd | 549 | 925 | 693 |
| 1 | nd | 247 | 379 | 329 |
| 0.4 | nd | 179 | 222 | 222 |
| 0 | 156 | 156 | 156 | 156 |
nd = 측정되지 않음
표 12의 결과에 기초하여, 각각의 항체의 LAG-3-발현 CHO 세포로의 결합에 대한 EC50 값은 17B4: 0.7nM; 13E2: 0.3nM; 34F4: 0.5nM이다.
각각의 항체의 LAG-3 발현 CHO 세포에 대한 결합을 위한 4개의 독립적인 실험(데이터는 나타내지 않음)에서의 평균 EC50 값은 17B4: 0.8 nM; 13E2: 0.2 nM; 34F4: 0.2 nM이다.
4개의 독립적인 실험에서, 34F4 EC50 값의 평균은 17B4 EC50 값의 평균의 2.7배이다.
4개의 독립적인 실험에서, 34F4 EC50 값의 평균은 17B4 EC50 값의 평균의 1.6배이다.
SEB-자극된 PBMC에 대한 결합
결과를 항체 농도의 함수로서 3일 동안 0.5 ㎍/ml SEB로 자극된 공여자 (공여자 1)의 PBMC로부터의 CD4+ 또는 CD8+ 세포 상에서의 형광 강도의 평균으로 나타냈다. 공여자 1의 경우, CD4+ 및 CD8+ 세포로의 결합에 대한 결과를 아래 표 13, 및 도 15에 나타냈다.
| CD4 및 CD8에 대한 결합 (공여자 1) | |||||||||
| CD4 | CD8 | ||||||||
| 항체 ng/ml | mIgG1 | 17B4 | 13E2 | 34F4 | ng/ml | mIgG1 | 17B4 | 13E2 | 34F4 |
| 10000 | 116 | 1598 | 1947 | 1787 | 10000 | 140 | 5142 | 5107 | 4719 |
| 2326 | 113 | 1944 | 1869 | 1662 | 2326 | 137 | 4826 | 4850 | 4455 |
| 541 | 116 | 1746 | 1601 | 1590 | 541 | 120 | 4092 | 4359 | 3867 |
| 126 | 109 | 1239 | 1491 | 1384 | 126 | 115 | 2837 | 3677 | 3302 |
| 29 | 108 | 675 | 1160 | 1139 | 29 | 110 | 1397 | 2432 | 2332 |
| 7 | 110 | 324 | 600 | 621 | 7 | 114 | 606 | 1131 | 1183 |
| 1.6 | 127 | 192 | 272 | 282 | 1.6 | 116 | 309 | 458 | 446 |
| 0.4 | 106 | 143 | 165 | 169 | 0.4 | 112 | 195 | 232 | 288 |
| 0 | 106 | 106 | 106 | 106 | 0 | 112 | 112 | 112 | 112 |
표 13에 주어진 결과에 기초하여, 각각의 항체의 CD4+ 세포로의 결합에 대한 EC50 값은 17B4: 0.5 nM; 13E2: 0.1 nM; 34F4: 0.1 nM이다.
각각의 항체의 CD4+ 세포로의 결합에 대한 3개의 공여자(데이터는 나타내지 않음)로부터의 평균 EC50 값은 17B4: 0.8 nM; 13E2: 0.2 nM; 34F4: 0.2 nM이다.
3명의 공여자로부터의 13E2 및 34F4 CD4+ EC50 값의 평균은 17B4 EC50 값의 평균의 3.8배이다.
표 13에 주어진 결과에 기초하여, 각각의 항체의 CD8+ 세포로의 결합에 대한 EC50 값은 17B4: 0.7 nM; 13E2: 0.3 nM; 34F4: 0.2 nM이다.
각각의 항체의 CD8+ 세포에 대한 결합에 대한 3명의 공여자(데이터는 나타내지 않음)로부터의 평균 EC50 값은 17B4: 1 nM; 13E2: 0.4 nM; 34F4: 0.5 nM이다.
3명의 공여자로부터의 13E2 및 34F4 CD8+ EC50 값의 평균은 17B4 EC50 값의 평균의 2.5배이다.
결과는 13E2 및 34F4 단클론 항체 각각이 LAG-3+ 발현 CHO 세포, 및 CD4+-T 세포 및 CD8+-T 세포에 17B4보다 높은 친화도로 결합한다는 것을 보여준다.
러닝(running) 완충제 중의 칩 및 17B4 항체 상의 LAG-3Ig를 사용한 Biacore 분석은 다음과 같은 결과를 나타냈다:
ka (1/Ms)
1.09 x 106
kd (1/s)
1.32 x 10-4
KD (M)
1.21 x 10-10
러닝(running) 완충제 중의 칩 및 LAG-3Ig 상의 17B4 항체를 사용한 Biacore 분석은 다음과 같은 결과를 나타냈다:
ka (1/Ms)
2.22 x 105
kd (1/s)
8.18 x 10-4
KA (1/M)
2.71 x 108
KD (M)
3.69 x 10-9
실시예 8
13E2 및 34F4에 의한 IMP321 (LAG-3Ig)의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합 억제
IMP321 접합체 (LAG-3Ig-Alexa 488)의 MHC 클래스 II-양성 B 세포 (Raji 세포)로의 결합을 항-LAG-3 단클론 항체 (13E2, 34F4, 또는 17B4), 또는 이소형 대조군 (mIgG1)과 함께 접합체 (4 ℃에서 1 μg/ml)를 사전 인큐베이션 한 후에 측정하였다. 세포-결합된 형광 분석을 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 수행하였다.
항체 농도의 함수로서 세포-결합된 LAG-3Ig에 상응하는 평균 형광 강도 (MFI)를 아래 표 14 및 도 16A에 나타냈다.
| sLAG-3Ig-Alexa 488의 MFI | |||||
| 항체 (ng/ml) | mIgG1 | 17B4 | 13E2 | 34F4 | Ab:IMP321-Alexa의 비율 (1㎍/ml) |
| 11000 | 328 | -11 | -2 | -7 | 10:1 |
| 3300 | 359 | 13 | 20 | 18 | 3:1 |
| 990 | 361 | 35 | 37 | 35 | 1:1 |
| 297 | 373 | 73 | 51 | 46 | 0.3:1 |
| 89 | 324 | 214 | 179 | 185 | 0.1:1 |
| 27 | 254 | 260 | 207 | 258 | 0.03:1 |
| 0 | 284 | 284 | 284 | 284 | |
결과는 IMP321의 Raji 세포로의 결합이 LAG-3-특이적 단클론 항체 각각과 사전 인큐베이션함으로써 억제된다는 것을 보여준다.
실시예 9
13E2 및 34F4에 의한 IMP321 (LAG-3Ig)-유도된 단핵구 활성화의 억제
혼합물을 THP-1 세포와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하기 전에, IMP321 (20ng/ml)을 항-LAG-3 단클론 항체 13E2, 34F4, 또는 17B4, 또는 이소형 대조군 (mIgG1)과 함께 37℃에서 5분 동안 사전 인큐베이션 하였다. THP-1 세포에 의한 CCL4 분비량을 단핵구 활성화 수준을 결정하기 위해 사용하였다.
Ab 농도의 함수로서의 CCL4 농도 (pg/ml로 표현됨)를 아래 표 15 및 도 16B에 나타냈다.
| THP-1 단핵구 세포 상등액 중의 판독 [CCL4] (pg/ml) | |||||
| 항체 (ng/ml) | mIgG1 | 17B4 | 13E2 | 34F4 | Ab:IMP321 비율 (20ng/ml) |
| 20000 | 2901 | 860 | 97 | 130 | 1000:1 |
| 2000 | 2261 | 947 | 77 | 111 | 100:1 |
| 200 | 2222 | 860 | 94 | 135 | 10:1 |
| 20 | 2145 | 1548 | 224 | 338 | 1:1 |
| 2 | 2052 | 1963 | 1661 | 1798 | 0.10:1 |
| 0 | 2112 | 2112 | 2112 | 2112 | |
결과는 IMP321-유도된 단핵구 활성화가 IMP321과 길항제 항-LAG-3 단클론 항체 17B4의 사전 인큐베이션에 의해 억제되고, 또한 작용제 단클론 항체 13E2와 34F4의 사전 인큐베이션에 의해 억제된다는 것을 보여준다.
이러한 결과 및 실시예 8의 결과로부터, 길항제 17B4 단클론 항체와 마찬가지로, 작용제 단클론 항체 13E2 및 34F4가 LAG-3의 MHC 클래스 II 결합 부위와 상호작용하거나 근접하여 있다고 결정하였으며, 이는 LAG-3Ig (IMP321)의 결합 및 활성화를 차단하는 능력에 의해 나타난다.
실시예 10
17B4에 비교한 13E2 및 34F4에 의한 T 세포 증식 억제
3명의 건강한 공여자 (0.2x106세포/웰, 완전 RPMI + 10% FBS 중의 1x106/ml로)로부터의 PBMC를 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터 (CFSE)로 표지하고 단클론 항 LAG-3 항체, 13E2, 34F4, 17B4, 또는 이소형 대조군(mIgG1)의 존재 하에 CMV pp35 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다 (최상-최적 투여량, 공여자 #1 및 #2의 경우 300 ng/ml, 공여자 #3의 경우 100 ng/ml).
T 세포 반응을 5일차에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 CFSE-기반 증식을 측정함으로써 조사하였다. 각각의 상이한 항체, 및 게이팅 전략의 존재 하에 공여자 #1의 CD8+ T 세포의 FACS 프로파일을 도 17 (A)에 나타냈다. 도 17 (B)는 동일한 공여자에 대한 세포 분열의 함수로서의 각각의 분열 피크 하에 CD8+ T 세포의 퍼센트를 나타낸다. 3명의 공여자에 대한 결과를 아래 표 16에 나타냈다. 항원성 펩티드가 없는 (자극되지 않음) 기준 증식을 또한 측정하였다 (도 17 (A)의 가장 아래 패널 및 표 16 참조). 공여자 #1의 CD4+ T 세포는 어떠한 CMV-특이적 증식을 나타내지 않았으며, 따라서 이러한 집단에 대한 결과를 포함시키지 않았다.
| 각각의 분열 피크 하의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 퍼센트 | |||||||
| 분열 수 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 공여자 #1 CD8 + | |||||||
| mIgG1 | 0.68 | 0.54 | 1.28 | 2.20 | 1.50 | 1.22 | 0.78 |
| 17B4 | 0.84 | 1.02 | 1.81 | 2.82 | 2.22 | 2.10 | 1.51 |
| 13E2 | 1.02 | 0.41 | 0.61 | 0.67 | 0.39 | 0.36 | 0.31 |
| 34F4 | 1.16 | 0.68 | 1.32 | 1.22 | 0.66 | 0.52 | 0.27 |
| 자극되지 않음 | 1.77 | 0.36 | 0.33 | 0.52 | 0.38 | 0.13 | 0.04 |
| 공여자 #2 CD4 + | |||||||
| mIgG1 | 1.90 | 2.26 | 2.67 | 1.84 | 0.78 | 0.20 | 0.18 |
| 17B4 | 1.87 | 2.44 | 2.47 | 1.72 | 0.69 | 0.17 | 0.14 |
| 13E2 | 1.72 | 1.89 | 2.04 | 1.35 | 0.64 | 0.21 | 0.16 |
| 34F4 | 1.61 | 1.88 | 2.01 | 1.34 | 0.60 | 0.16 | 0.15 |
| 자극되지 않음 | 1.34 | 1.14 | 1.48 | 0.81 | 0.41 | 0.17 | 0.12 |
| 공여자 #2 CD8 + | |||||||
| mIgG1 | 1.24 | 1.72 | 2.54 | 3.37 | 1.28 | 0.37 | 0.24 |
| 17B4 | 1.24 | 1.79 | 2.57 | 3.30 | 1.13 | 0.37 | 0.17 |
| 13E2 | 1.27 | 1.35 | 1.83 | 2.14 | 0.75 | 0.22 | 0.14 |
| 34F4 | 1.25 | 1.47 | 1.95 | 2.17 | 0.86 | 0.25 | 0.23 |
| 자극되지 않음 | 0.77 | 0.92 | 1.03 | 1.22 | 0.33 | 0.22 | 0.10 |
| 공여자 #3 CD4 + | |||||||
| mIgG1 | 2.93 | 2.85 | 4.32 | 8.18 | 5.03 | 2.1 | |
| 17B4 | 2.95 | 2.8 | 4.51 | 9.9 | 6.71 | 2.81 | |
| 13E2 | 3.42 | 2.62 | 3.01 | 4.66 | 2.53 | 1.07 | |
| 자극되지 않음 | 2.77 | 2.07 | 2.79 | 3.71 | 1.71 | 0.5 | |
| 공여자 #3 CD8 + | |||||||
| mIgG1 | 4.62 | 1.3 | 1.41 | 4.26 | 4.64 | 2.6 | |
| 17B4 | 4.74 | 1.63 | 1.56 | 4.24 | 4.56 | 2.67 | |
| 13E2 | 5.1 | 1.56 | 1.24 | 2.81 | 1.9 | 0.97 | |
| 자극되지 않음 | 4.04 | 0.44 | 0.37 | 0.38 | 0.11 | 0.07 | |
증식 지수 (PI) (각 분열 피크 하의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 퍼센트에 분열 수를 곱한 값의 합으로 계산됨)을 표 17에 제공하였다. 이러한 지수는 몇몇 차례의 분열을 겪은 세포에 대한 퍼센트를 강조한다. 표 17은 또한 PI 값에 기초한 이소형 대조군 (mIgG1)에 비해 각각의 항체에 대한 억제 퍼센트를 기록한다.
| 17B4에 비해, 항체 13E2 및 34F4의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식에 대한 영향 | |||||
| 공여자 번호 | 항체 |
PI
(CD4) |
억제%
(CD4) |
PI
(CD8) |
억제%
(CD8) |
| 1 | mIgG1 | 34.64 | |||
| 17B4 | 53.80 | -55 | |||
| 13E2 | 12.60 | 64 | |||
| 34F4 | 19.65 | 43 | |||
| 자극되지 않음 | 8.54 | ||||
| 2 | mIgG1 | 28.16 | 36.09 | ||
| 17B4 | 26.52 | 6 | 34.77 | 4 | |
| 13E2 | 22.59 | 20 | 24.09 | 33 | |
| 34F4 | 21.76 | 23 | 26.13 | 28 | |
| 자극되지 않음 | 15.20 | 14.25 | |||
| 3 | mIgG1 | 92.06 | 67.29 | ||
| 17B4 | 112.09 | -22 | 68.46 | -2 | |
| 13E2 | 55.40 | 40 | 38.50 | 43 | |
| 자극되지 않음 | 41.67 | 8.52 | |||
결과는 단클론 항체 13E2 및 34F4가 항원성 펩티드에 의해 유도된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 지속적으로 억제하는 반면, 단클론 항체 17B4는 시험된 농도에서 약간의 양성 효과를 갖는 경향을 보여준다.
실시예 11
13E2 및 34F4에 의한 T 세포 증식 억제
12명의 건강한 공여자로부터의 PBMC (0.2x106세포/웰, 완전 RPMI+10%FBS 중에서 1x106/ml로)를 CFSE로 표지하고, 단클론 항-LAG-3 항체 13E2, 34F4, 또는 이소형 대조군 (mIgG1)의 존재 하에 CMV pp35 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다.
T 세포 반응을 5일차에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 CFSE-기반 증식을 측정함으로써 조사하였다. 도 17 (A)에 설명된 게이팅 전략을 사용하여, 각각의 분열 피크 하의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 퍼센트를 세포 분열의 함수로서 계산하였다. 항원성 펩티드가 없는 (자극되지 않음) 기준 증식을 또한 측정하였다. 공여자 #1, #5, 및 #12의 CD4+ T 세포는 어떠한 CMV-특이적 증식을 나타내지 않았으며, 따라서 이러한 샘플에 대한 결과를 포함시키지 않았다.
각각의 공여자에 대한 증식 지수 (PI) (각 분열 피크 하의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 퍼센트에 분열 수를 곱한 값의 합으로 계산됨)를 표 18에 제공하였고, 그 결과를 표 18에 플롯팅하였다. 표 18은 또한 PI 값에 기초한 이소형 대조군 (mIgG1)에 비해 각각의 항체에 대한 억제 퍼센트를 기록한다.
| 항체 13E2 및 34F4의 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증식에 대한 영향 | |||||
|
공여자
번호 |
항체 | PI (CD4) | 억제 % (CD4) | PI (CD8) | 억제 % (CD8) |
| 1 | mIgG1 | 34.64 | |||
| 13E2 | 12.60 | 64 | |||
| 34F4 | 19.65 | 43 | |||
| 자극되지 않음 | 8.54 | ||||
| 2 | mIgG1 | 28.16 | 36.09 | ||
| 13E2 | 22.59 | 20 | 24.09 | 33 | |
| 34F4 | 21.76 | 23 | 26.13 | 28 | |
| 자극되지 않음 | 15.20 | 14.25 | |||
| 3 | mIgG1 | 92.06 | 67.29 | ||
| 13E2 | 55.40 | 40 | 38.50 | 43 | |
| 자극되지 않음 | 41.67 | 8.52 | |||
| 4 | mIgG1 | 10.10 | 43.05 | ||
| 13E2 | 8.83 | 13 | 19.27 | 55 | |
| 34F4 | 9.39 | 7 | 19.32 | 55 | |
| 자극되지 않음 | 6.14 | 3.26 | |||
| 5 | mIgG1 | 11.01 | |||
| 13E2 | 7.00 | 36 | |||
| 34F4 | 6.71 | 39 | |||
| 자극되지 않음 | 3.08 | ||||
| 6 | mIgG1 | 14.56 | 78.19 | ||
| 13E2 | 6.30 | 57 | 15.56 | 80 | |
| 34F4 | 6.14 | 58 | 17.01 | 78 | |
| 7 | mIgG1 | 36.25 | 31.62 | ||
| 13E2 | 18.90 | 48 | 12.95 | 59 | |
| 34F4 | 32.00 | 12 | 21.99 | 30 | |
| 자극되지 않음 | 29.59 | 15.53 | |||
| 8 | mIgG1 | 6.20 | 10.96 | ||
| 13E2 | 4.32 | 30 | 6.77 | 38 | |
| 자극되지 않음 | 2.60 | 4.48 | |||
| 9 | mIgG1 | 7.60 | 10.44 | ||
| 13E2 | 4.63 | 39 | 6.57 | 37 | |
| 자극되지 않음 | 1.28 | 1.57 | |||
| 10 | mIgG1 | 15.80 | 75.10 | ||
| 34F4 | 11.70 | 26 | 25.50 | 66 | |
| 자극되지 않음 | 17.00 | 6.60 | |||
| 11 | mIgG1 | 15.19 | 19.14 | ||
| 13E2 | 5.51 | 64 | 12.77 | 33 | |
| 34F4 | 4.96 | 67 | 1.73 | 91 | |
| 12 | mIgG1 | 20.69 | |||
| 13E2 | 10.71 | 48 | |||
| 자극되지 않음 | 10.71 | ||||
공여자 # 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9: 300ng/ml; 공여자 # 3: 100ng/ml ; 공여자 # 10, 11, 12: 1000ng/ml
이러한 결과로부터의 평균 값을 표 19에 기재하였다.
| 항체 13E2 및 34F4의 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증식 (공여자 평균)에 대한 영향 | ||||
| 억제 퍼센트 평균 | 13E2로 시험된 11개 공여자의 평균 | 34F4로 시험된 8개 공여자의 평균 | 둘 모두의 항체로 시험된 7개 공여자의 평균 | |
| 13E2 | 34F4 | |||
| CD4 | 39$ | 36% | 40$ | 33$ |
| CD8 | 48% | 55% | 52% | 52% |
결과는 단클론 항-LAG-3 항체 13E2 및 34F4가 항원성 펩티드에 의해 유도된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 각각의 항체의 억제 효과가 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 경우보다 CD8+ T 세포의 경우에 보다 더 강조될 수 있다는 것을 시사한다. 시험된 대부분의 공여자에서, 13E2 및 34F4 항체의 효과는 매우 유사하였으며, 따라서 항체는 동등한 활성을 갖는 것으로 보인다.
실시예 12
CD8
+
T 세포 증식에 대한 작용제 항체의 투여량-반응
CFSE-표지된 PBMC를, 전술된 바와 같이, 다양한 농도의 작용제 항-LAG-3 단클론 항체 13E2, 34F4, 또는 이소형 대조군 (mIgG1)의 존재 하에 CMV 펩티드에 의해 자극하였다.
T 세포 반응을 5일차에 CD8+ T 세포의 CFSE-기반 증식을 측정함으로써 조사하였다. 증식 지수 (각 분열 피크 하의 CD8+ T 세포의 퍼센트에 분열 수를 곱한 값의 합으로 계산됨)을 표 20에 제공하였다.
| 13E2 및 34F4 항체의 CD8 + T 세포 증식에 대한 영향 | |
| 항체 (30ng/ml) | 증식 지수 |
| mIgG1 | 69.9 |
| 13E2 | 26.2 |
| 34F4 | 16.4 |
| 없음 | 95.3 |
아래 표 21은 항체 농도의 함수로서 CD8+ T 세포 증식 지수를 기록한다. 표 21의 결과를 도 19에 플롯팅하였다.
| 상이한 농도의 항체의 CD8+ T 세포 증식에 대한 영향 | |||
| 항체 농도 (ng/ml) | CD8+ T 세포 증식 지수 | ||
| mIgG1 | 13E2 | 34F4 | |
| 3000 | 82.9 | 17.6 | 14.9 |
| 952 | 72.9 | 13.7 | 10.5 |
| 302 | 69.9 | 16.4 | 26.2 |
| 96 | 65.3 | 19.6 | 13.7 |
| 30 | 87.4 | 14.4 | 22.8 |
| 10 | 78.2 | 50.4 | 46.2 |
| 3 | 77.8 | 59.2 | 66.6 |
| 0 | 95.3 | 95.3 | 95.3 |
결과는 저용량의 단클론 항-LAG-3 항체 13E2, 또는 34F4가 CD8+ T 세포 증식을 최대로 억제한다는 것을 나타낸다. 결과는 또한 항체의 효과가 매우 유사하다는 것을 보여준다.
실시예 13
34F4에 의한 CD8
+
T 세포 증식 억제는 IMP321과 함께 사전 인큐베이션 함으로써 역전됨
2명의 공여자로부터의 CFSE-표지된 PBMC를, 전술된 바와 같이, 다양한 농도의 34F4 항체의 존재 하에 CMV 펩티드에 의해 자극하였다. 10배 초과의 IMP321로 중화시킨 후 1㎍/ml 투여량의 34F4를 또한 평가하였다.
T 세포 반응을 5일차에 CD8+ T 세포의 CFSE-기반 증식을 측정함으로써 조사하였다. CD8+ T 세포 증식 억제 퍼센트를 IMP321과 함께 또는 IMP321 없이 대조군과 비교하여, 34F4 항체, 또는 34F4 항체 및 IMP321 (LAG-3Ig)의 존재 하에 관찰된 분열 세포의 퍼센트에 기초하여 계산하였다.
결과를 아래 표 22에 나타냈다.
| 34F4 항체에 의한 IMP321의 CD8 + T 세포 증식 억제에 대한 영향 | ||||||
| 인큐베이션 조건 | 항체 농도 | 항체 농도 | ||||
| 1000ng/ml | 100ng/ml | 10ng/ml | 1000ng/ml | 100ng/ml | 10ng/ml | |
| 34F4 | 64% | 68% | 44% | 65% | 35% | 41% |
| 34F4 + IMP321 | 0% | nd | nd | 41% | nd | nd |
결과는 34F4 항체를 IMP321와 함께 사전 인큐베이션 하는 것이 34F4 항체의 CD8+ T 세포 증식에 대한 억제 효과를 역전시킨다는 것을 보여준다. 이는 34F4에 의해 매개된 CD8+ T 세포 증식의 억제가 34F4 항체의 LAG-3에 대한 결합에 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 14
13E2 및 34F4에 의한 CD8
+
T 세포 증식 억제는 IL-2에 의해 역전되지 않음
CFSE-표지된 PBMC를, 전술된 바와 같이 IL-2와 함께 또는 IL-2 없이, 13E2 또는 34F4 항체의 존재 하에 CMV 펩티드에 의해 자극하였다.
T 세포 반응을 5일차에 CD8+ T 세포의 CFSE-기반 증식을 측정함으로써 조사하였다. CD8+ T 세포의 증식 억제 퍼센트를, IL-2와 함께 또는 IL-2 없이 이소형 대조군과 비교하여, IL-2와 함께 또는 IL-2 없이 13E2 또는 34F4 항체의 존재 하에 관찰된 분열 세포의 퍼센트에 기초하여 계산하였다.
결과를 아래 표 23에 나타냈다.
| 13E2 및 34F4 항체에 의한 IL-2의 CD8 + T 세포 증식 억제에 대한 영향 | ||
| 항체 | CD8 + T 세포 증식 억제 퍼센트 | |
| IL-2 부재 | IL-2 존재 | |
| 13E2 | 38% | 44% |
| 34F4 | 59% | 64% |
결과는 외인성 IL-2의 첨가가 13E2 또는 34F4 항체의 CD8+ T 세포 증식에 대한 억제 효과를 극복할 수 없음을 보여준다. 이러한 결과로부터 항체 13E2 및 34F4는 CD8+ T 세포에서 각각 신호 1 (CMV 항원에 대한 반응, T-세포 수용체 의존 경로)을 직접적으로 저해하지만, 신호 2 (IL-2에 대한 반응, CD4 세포로부터의 도움)를 직접적으로 저해하지는 못한다는 결론을 내린다.
실시예 15
13E2의 T 세포 활성화 마커 분비에 대한 영향
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 림프구 (T 세포, B 세포, 및 NK 세포), 단핵구, 및 수지상 세포를 포함한다. IFN-γ는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ 기억 및 효과기 T 세포에 의해, 그리고 활성화 시 NK 세포에 의해 우세하게 분비된다. 시험관 내에서 특이적 항원으로 재-자극한 후, IFN-γ의 분비가 유도된다.
4명의 건강한 공여자 (0.2x106세포/웰, 완전 RPMI+10%FBS 중의 1x106/ml로)로부터의 PBMC를 CFSE로 표지하고, 단클론 항-LAG-3 항체 13E2 또는 이소형 대조군 (mIgG1)의 존재 하에 CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다. T 세포 반응을 2일차에 세포 상등액 중의 IFN-γ의 방출을 측정함으로써 조사하였다. IFN-γ의 농도, 및 13E2에 의한 IFN-γ 분비 억제 퍼센트를 아래 표 24에 나타냈다.
| 공여자 |
작용제/
대조군 |
[IFN] (pg/ml) |
| 공여자 1 | mIgG1 | 297 |
| 13E2 | 226 | |
| 억제 % | 24% | |
| 공여자 2 | mIgG1 | 1043 |
| 13E2 | 255 | |
| 억제 % | 76% | |
| 공여자 3 | mIgG1 | 499 |
| 13E2 | 91 | |
| 억제 % | 82% | |
| 공여자 4 | mIgG1 | 1151 |
| 13E2 | 75 | |
| 억제 % | 93% |
결과는 단클론 항체 13E2가 시험된 각각의 공여자에서 IFN-γ의 분비를 억제한다는 것을 보여준다. 이는 단클론 항체 13E2가 T 세포 활성화를 억제한다는 증거를 제공한다.
실시예 16
13E2 및 34F4의 T 세포 활성화 마커 발현에 대한 영향
4명의 건강한 공여자 (0.2x106 세포/웰, 완전 RPMI+10%FBS 중의 1x106/ml로)로부터의 PBMC를 CFSE로 표지하고, 단클론 항-LAG-3 항체 13E2 또는 34F4, 또는 이소형 대조군 (mIgG1)의 존재 하에 CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다.
T 세포 반응을 5일차에 CD8+ T 세포 상에서 활성화 마커로서 CD25의 발현을 측정함으로써 조사하였다. CD8+ T 세포 발현 CD 25의 퍼센트, 및 13E2 또는 34F4에 의한 CD25 발현 억제 퍼센트를 아래 표 25에 나타냈다.
| 공여자 | 작용제/ 대조군 |
CD8+ T 세포 중의 CD25+ % |
| 공여자 1 | mIgG1 | 3,5 |
| 13E2 | 1,2 | |
| 억제 % | 66% | |
| 공여자 2 | mIgG1 | 6,6 |
| 13E2 | 5 | |
| 억제 % | 24% | |
| 공여자 3 | mIgG1 | 27,5 |
| 34F4 | 8,8 | |
| 억제 % | 68% | |
| 공여자 4 | mIgG1 | 9,2 |
| 34F4 | 7,0 | |
| 억제 % | 24% |
결과는 각각의 단클론 항체, 13E2 및 34F4가 CD8+ T 세포 상에서 CD25의 발현을 유의하게 억제한다는 것을 보여준다. 이는 각각의 항체가 CD8+ T 세포의 활성화를 억제한다는 증거를 제공한다.
실시예 17
키메라 13E2-인간 항체 서열
13E2 중쇄 및 경쇄의 쥐 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 인간 IgG4 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 암호화하는 서열과 융합하였다. 이러한 합성 키메라 서열을 발현 벡터에 서브클로닝 하고, 현탁액 중에서 성장시킨 CHO 세포에서 발현시켰다.
키메라 13E2-인간 IgG4 Fc 항체의 중쇄 아미노산 서열을 아래 및 도 20 (A)에 나타냈다. 항체는 마우스 단클론 항체 13E2의 VH 도메인, 및 S228P 돌연변이 (Fab 팔 교환을 없애기 위함) (13E2IgG4mut)를 갖는 인간 IgG4 Fc 부분을 포함한다. 도면에서, VH 영역을 굵은 글씨로 나타냈고, Fc 영역을 강조하여 나타냈다.
13E2IgG4mut
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCARIVEGSYSSSYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 30)
키메라 13E2-인간 IgK 항체의 경쇄 아미노산 서열을 아래, 및 도 20 (B)에 나타냈다. 항체는 단클론 항체 13E2의 VL 도메인, 및 야생형 인간 Ig 카파 (IgK) 쇄 C 부분 (13E2IgK)을 포함한다. 도면에서, VL 영역은 굵은 글씨로 나타냈고, IgK 영역은 강조하여 나타냈다.
13E2IgK
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKASQDVIFDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRVSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGGGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 37)
키메라 13E2-인간 항체 (Chim13E2IgG4로 지칭됨)는 키메라 중쇄 및 경쇄인 13E2IgG4mut; 및 13E2IgK를 포함한다.
실시예 18
인간화된 13E2 단클론 항체 (IMP761) 서열
최적의 CDR-루프 형태를 유지하기 위해, 13E2의 인간화된 버전을 수득하기 위해, 결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별을 사용하여 쥐 13E2로부터의 CDR을 인간 골격으로 이식하였다. 이러한 합성 키메라 서열을 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, 현탁액 중에서 성장시킨 CHO 세포 중에서 발현시켰다.
인간화된 13E2 단클론 항체 (IMP761로 지칭됨)의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 아래 나타냈다. 가변 도메인을 굵은 글씨로 나타냈고, CDR 서열을 밑줄로 표시하였다.
IMP761 중쇄의 아미노산 서열
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS GFSLSTSGMGLG WIRQPPGKTLEWLT HIWWDDIKRYNPDLRS RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC ARIVEGSYSSSYFDV WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 84)
상기 서열(IMP761 중쇄)과 실시예 17의 키메라 중쇄 서열인 13E2IgG4mut의 정렬을 도 23에 나타냈다. 도면에서, VH 영역을 굵은 글씨로 나타냈고, Fc 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgG4mut 서열의 상응하는 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄 밑줄로 표시하였다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다. 인간화된 서열에서 변화된 잔기를 또한 아래 표 26에 나타냈다 (VH 변이체 4, VH4, 및 본래의 13E2 중쇄 서열의 3개의 다른 인간화된 변이체 중의 변화된 잔기: VH 변이체 1, 2, 및 3, VH1, VH2, 및 VH3).
| 중쇄 잔기 번호 | 13E2 마우스 중쇄 잔기 | 인간화된 잔기 | |||
| VH 1 | VH 2 | VH 3 | VH 4 (IMP761) | ||
| 21 | V | I | I | I | |
| 26 | S | T | |||
| 29 | G | A | A | T | T |
| 30 | I | L | L | L | L |
| 31 | L | V | V | V | V |
| 32 | Q | K | K | K | K |
| 34 | S | T | T | T | T |
| 38 | S | T | T | T | T |
| 42 | S | T | T | T | |
| 62 | S | P | P | P | P |
| 65 | G | A | A | A | T |
| 69 | L | V | |||
| 70 | T | A | A | ||
| 88 | L | V | |||
| 89 | T | S | |||
| 91 | S | R | T | ||
| 96 | S | K | K | K | K |
| 97 | S | N | N | N | |
| 99 | I | V | V | V | V |
| 100 | F | I | V | A | V |
| 102 | K | N | T | T | T |
| 103 | I | M | M | M | M |
| 104 | A | T | T | T | |
| 105 | S | N | N | N | N |
| 106 | V | M | M | M | M |
| 108 | T | P | P | P | P |
| 109 | A | V | V | L | L |
| 112 | A | G | G | ||
| 134 | A | Q | Q | Q | Q |
| 137 | T | L | L | ||
인간화된 항체 (항체 IMP761)의 중쇄 골격 서열:
VH FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (서열번호 64);
VH FR2: WIRQPPGKTLEWLT (서열번호 65);
VH FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (서열번호 66); 및
VH FR4: WGQGTLVTVSS (서열번호 67).
IMP761 경쇄의 아미노산 서열
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC KASQDVIFDVA WYQQRPGQAPKLLIY SASSRVS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYSTPYT FGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 85)
상기 서열 (IMP761 경쇄)과 실시예17의 키메라 경쇄 서열인 13E2IgK의 정렬을 도 24에 나타냈다. 도면에서, VL 영역은 굵은 글씨로 나타냈고, IgK 영역을 강조하여 나타냈다. 키메라 13E2IgK 서열의 상응 잔기와 상이한 인간화된 IMP761 서열의 아미노산 잔기를 한줄 밑줄로 나타냈다. CDR 서열 (결합된 IMGT/Kabat CDR 서열 식별에 기초함)을 이중 밑줄로 나타냈다. 인간화된 서열의 변화된 잔기를 아래 표 27에 나타냈다 (VL 변이체 3, VH3, 및 본래의 13E2 경쇄 서열의 3개의 다른 인간화된 변이체 중의 변화된 잔기: VL 변이체 1, 2, 및 4, VL1, VL2, 및 VL4).
|
경쇄
잔기
번호 |
13E2 마우스 경쇄 잔기 | 인간화된 잔기 | |||
| VL 1 | VL 2 | VL 3 (IMP761) | VL 4 | ||
| 21 | D | E | |||
| 23 | V | Q | |||
| 24 | M | L | |||
| 27 | P | S | S | T | S |
| 28 | H | P | P | P | P |
| 29 | K | D | S | S | D |
| 30 | F | S | S | S | S |
| 31 | M | L | L | L | L |
| 32 | S | A | A | ||
| 33 | T | V | A | A | V |
| 35 | V | L | L | ||
| 36 | E | G | G | G | G |
| 37 | D | E | E | ||
| 39 | V | A | A | ||
| 59 | K | R | |||
| 60 | P | A | |||
| 63 | S | P | A | A | |
| 69 | Y | F | |||
| 80 | D | S | S | ||
| 83 | T | S | S | S | S |
| 93 | F | L | L | L | L |
| 96 | S | D | |||
| 98 | V | L | L | L | L |
| 100 | A | P | P | ||
| 103 | L | V | F | F | V |
| 105 | V | T | T | ||
| 120 | G | Q | Q | Q | |
| 123 | T | K | K | R | K |
| 124 | L | V | V | ||
| 125 | E | D | |||
인간화된 항체 (항체 IMP761)의 경쇄 골격 서열:
VL FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (서열번호 64);
VL FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (서열번호 65);
VL FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호 66); 및
VL FR4: FGQGTRLDIK (서열번호 67)
실시예 19
키메라 13E2-인간 항체 (Chim13E2IgG4) 및 인간화된 13E2 항체 (IMP761)의 CHO-LAG-3
+
세포로의 결합
이들 표면 상의 CHO 세포 발현 LAG-3 (PBS 중의 0.05 x 106 세포/웰, 0.5% BSA, 0.1% 아자이드)을 상이한 농도의 실시예 17에 기술된 키메라 중쇄 및 경쇄(중쇄: 13E2IgG4mut; 경쇄: 13E2IgK)를 포함하는 키메라 13E2-인간 항체 (Chim13E2IgG4로 지칭됨), IMP761, 또는 인간 IgG4 (이소형-매칭된 음성 대조군으로서)와 함께 인큐베이션 하였다. 2차 항체 염소 항-인간 IgG-FITC를 사용하여 CHO-LAG-3+ 세포의 표면 상의 항체의 존재를 검출하였다. FITC 평균 형광 강도 (IMF)를 유동 세포 계측법에 의한 분석 후에 측정하였다.
결과를 아래 표 28 및 도 25에 나타냈다.
| MFI FITC CHO 세포 | |||
| ng/ml | Chim13E2IgG4 | IMP761 | huIgG4 |
| 6000 | 2039 | 2086 | 71 |
| 1905 | 2024 | 1989 | 77 |
| 605 | 1874 | 1821 | 46 |
| 192 | 1580 | 1429 | 59 |
| 61 | 1058 | 898 | 69 |
| 20 | 593 | 460 | 49 |
| 6 | 279 | 234 | 37 |
| 0 | 35 | 35 | 35 |
결과는 인간화된 단클론 항체 IMP761이 이의 표면 상에서 CHO 세포 발현 LAG-3을 발현하는 CHO 세포에 키메라 항체와 매우 유사한 방식으로 결합한다는 것을 보여준다.
실시예 20
키메라 13E2-인간 항체 (Chim13E2IgG4) 및 인간화된 13E2 항체 (IMP761)의 인간 LAG-3Ig 단백질에 대한 결합 친화도
C1 센서 칩에 공유결합로 고정되어 있는, 키메라 항체 Chim13E2IgG4 (실시예 17에 기술된 키메라 중쇄 13E2IgG4mut, 및 키메라 경쇄 13E2IgK를 포함함), 또는 실시예 18에 기술된 인간화된 13E2 항체 (IMP761)를 사용하여 BiacoreTM 표면 플라즈몬 공명 분석을 수행하였다. 코팅을 13±1 RU에 도달하도록 10 mM 소듐 아세테이트, pH 5.0 중에서 수행하였다. 이어서 재조합 인간 LAG-3Ig 단백질 (IMP321)을, 25℃에서 분석 완충제 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween 20) 중에서, 매 사이클 마다 재생하면서, 0.078 - 2.5nM 범위의 6개의 상이한 농도에서 포획된 항체에 통과시켰다. BiacoreTM T200에서 분석을 수행하였고, 키네틱 글로벌 피트 (Langmuir 1:1) 모델을 사용하여 데이터를 맞추었다. 동역학 파라미터를 표 29에 기록하였고 3회 수행 평균을 나타낸다.
| 항체 | ka (M -1 s -1 ) | kd (s -1 ) | KD (pM) |
| Chim13E2IgG4 | 2.9 ± 0.2 Х 107 | 6.4 ± 0.6 Х 10-4 | 21.9 ± 0.1 |
| IMP761 | 2.9 ± 0.2 Х 107 | 6.6 ± 0.6 Х 10-4 | 22.8 ± 0.9 |
결과는 인간화된 단클론 항체 IMP761이 키메라 항체와 같이 인간 LAG-3Ig 단백질에 대해 동일한 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 두 항체는 모두 LAG-3에 대해 13E2-유도된 항체의 고친화도를 설명하는 매우 신속한 결합을 나타낸다.
실시예 21
항원 자극에 의해 유도된 CD8
+
T 세포 증식 및 CD25 발현에 대한 인간화된 13E2 항체 (IMP761)의 영향
건강한 공여자 (완전 RPMI +10% FBS 중의 0.2 x 106 세포/웰)로부터의 CFSE-표지된 PBMC를 3회 중복으로 300 ng/ml 인간 IgG4 (이소형 대조군), Chim13E2IgG4 또는 IMP761과 함께 CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다. T 세포 반응을 증식을 측정함으로써 평가하였고, 증식 지수 (각각의 분열 피크 하의 CD8+ T 세포의 퍼센트 합에 분열 수를 곱한 값으로 계산됨), 및 5일차에 유동 세포 계측법에 의해 CD25 발현을 사용하여 평가하였다. 이소형-매칭된 음성 대조군(huIgG4)과 비교하여, 각각의 항체에 대한 억제 퍼센트를 증식 지수 값, 또는 CD8+ T 세포 집단 내의 CD25+ T 세포 퍼센트에 기초하여 계산하였다.
결과를 아래 표 30 및 표 31, 및 도 26 및 도 27에 나타냈다.
| 증식 지수 | |||
| PI (CD8) | 억제 % | ||
| 공여자 1 | huIgG4 | 8.3 | |
| Chim13E2IgG4 | 3.6 | 56.6 | |
| IMP761 | 3.9 | 53.0 | |
| 공여자 2 | huIgG4 | 29.4 | |
| Chim13E2IgG4 | 17.7 | 39.8 | |
| IMP761 | 10.9 | 62.9 | |
| 공여자 3 | huIgG4 | 3.7 | |
| Chim13E2IgG4 | 0.8 | 78.4 | |
| IMP761 | 1.4 | 62.2 | |
| 공여자 4 | huIgG4 | 9.7 | |
| Chim13E2IgG4 | 4.5 | 53.6 | |
| IMP761 | 3.6 | 62.9 | |
| 평균 | huIgG4 | 12.8 | |
| Chim13E2IgG4 | 6.7 | 57.1 | |
| IMP761 | 5.0 | 60.2 | |
| CD8+ T 세포 중의 CD25 발현 | |||
| %CD25 | 억제 % | ||
| 공여자 1 | huIgG4 | 3.3 | |
| Chim13E2IgG4 | 1.7 | 48.5 | |
| IMP761 | 2.1 | 36.4 | |
| 공여자 2 | huIgG4 | 15.1 | |
| Chim13E2IgG4 | 9.6 | 36.4 | |
| IMP761 | 6.9 | 54.3 | |
| 공여자 3 | huIgG4 | 3.3 | |
| Chim13E2IgG4 | 1.3 | 60.6 | |
| IMP761 | 2.2 | 33.3 | |
| 공여자 4 | huIgG4 | 5.1 | |
| Chim13E2IgG4 | 2.8 | 45.1 | |
| IMP761 | 2.3 | 54.9 | |
| 평균 | huIgG4 | 6.7 | |
| Chim13E2IgG4 | 3.9 | 47.7 | |
| IMP761 | 3.4 | 44.7 | |
결과는 인간화된 단클론 항체 IMP761이 키메라 항체 Chim13E2IgG4와 같이, 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식, 및 CD25+ 발현 억제에 대해 유사한 영향을 갖는다는 것을 보여준다. 두 항체 모두는, 평균적으로 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식의 약 60% 억제, 및 CD8+ T 세포 집단 내의 CD25+ T 세포의 약 45% 억제를 야기하였다.
실시예 22
CD8
+
T 세포 반응에 대한 상이한 투여량의 키메라 13E2-인간 항체 (Chim13E2IgG4) 및 인간화된 13E2 항체 (IMP761)의 영향
건강한 공여자 (완전 RPMI +10% FBS 중의 0.2 x 106 세포/웰)로부터의 CFSE-표지된 PBMC를 3회 중복으로, 상이한 투여량의 Chim13E2IgG4, IMP761, 또는 인간 IgG4 (이소형-매칭된 음성 대조군)와 함께, CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 인큐베이션 하였다. T 세포 반응을 5일차에 유동 세포 계측법에 의해 증식 (CFSE 희석)을 측정함으로써 평가하였다. 각각의 분열 수에 대한 CD8+ T 세포의 퍼센트를 사용된 상이한 항체 투여량에 대해 계산하였다.
결과를 아래 표 32 및 도 28에 나타냈다.
| 항체 농도 (ng/ml) |
항체 | 세포 분열 | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 이상 | ||
| 10 | huIgG4 | 2.3 | 5.1 | 5.9 | 3.7 | 1.6 | 0.5 | 0.3 |
| Chim13E2IgG4 | 1.9 | 4 | 4.4 | 2.6 | 1.1 | 0.4 | 0.1 | |
| IMP761 | 2.2 | 2.6 | 3.5 | 2.1 | 0.9 | 0.3 | 0 | |
| 30 | huIgG4 | 2.1 | 4.9 | 5.4 | 2.4 | 1.2 | 0.3 | 0.2 |
| Chim13E2IgG4 | 2.1 | 3.4 | 3.4 | 2 | 0.9 | 0.2 | 0.1 | |
| IMP761 | 1.5 | 2.3 | 2.5 | 1.5 | 0.7 | 0.1 | 0 | |
| 100 | huIgG4 | 1.9 | 4.3 | 4.4 | 2 | 0.6 | 0.3 | 0 |
| Chim13E2IgG4 | 1.2 | 1.4 | 1.9 | 0.9 | 0.6 | 0.2 | 0 | |
| IMP761 | 1.4 | 1.6 | 1.7 | 0.9 | 0.3 | 0.1 | 0 | |
| 300 | huIgG4 | 2.9 | 5.5 | 5.8 | 2.4 | 1.1 | 0.2 | 0.1 |
| Chim13E2IgG4 | 1.5 | 2.1 | 2.4 | 1.5 | 0.7 | 0.1 | 0.1 | |
| IMP761 | 1.4 | 1.9 | 2.1 | 1.2 | 0.6 | 0.2 | 0.1 | |
| 자극 없음 | 1.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0 | 0 | |
결과는 IMP761 및 Chim13E2IgG4의 항원-유도된 CD8+ T-세포 증식에 대한 억제 효과가 투여량 의존적임을 보여준다. 특히, 각각의 항체의 억제 효과는 투여량이 10 ng/ml에서 100 ng/ml 항체로 증가할 수록 증가한다. 300 ng/ml 항체에서, 억제 효과는 100 ng/ml 항체에서의 억제 효과와 유사하였다. IMP761의 억제 효과는 시험된 모든 투여량에서 Chim13E2IgG4의 억제 효과와 유사하였다.
실시예 23
인간화된 13E2 항체 (IMP761)는 LAG-3-발현 세포에 대한 세포독성 활성을 갖지 않음
몇몇 유형의 분석법을 사용하여 인간화된 13E2 항체 (IMP761)가 LAG-3-발현 세포에 대해 세포독성 활성을 갖지 않는다는 것을 확인하였다.
(1) ADCC 리포터 생물분석 (Promega, G7015)
본 분석법에서, 1차 공여자 PBMC 또는 NK 세포를, 인간 FcγRIIIa (고친화도 V158 수용체) 및 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 유도하는 NFAT-반응 요소를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포로 대체하였다. 시험 항체가 ADCC 활성을 갖는 경우, 이는 표적 세포 및 JurkaT 세포의 FcγRIIIa 수용체에 함께 결합할 것이다. FcγRIIIa 수용체 하류의 신호전달 경로의 결과적인 활성화는 NFAT 경로 활성화를 야기하여 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 유도한다. 루시퍼라제 활성은 발광 판독에 의해 정량화된다.
LAG-3-형질감염된 CHO 및 Jurkat 세포, 및 LAG-3 (PBMC의 55%가 LAG-3+이었음)의 발현을 야기하기 위해 2일 동안 SEB로 자극한 PBMC를 표적 세포로 사용하여, 이소형-매칭된 음성 대조군 항체인 hIgG4 (BioRad의 재조합 mAb)에 비해, IMP761의 ADCC 활성을 분석하였다. 분석 키트에서 함께 제공된 항-CD20 항체 및 Raji 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 항-CD20 항체를 또한 SEB-자극된 PBMC 상에서 시험하였다. 제조사의 지침에 따라, 12,500개의 표적 세포와 함께 75,000개의 효과기 세포를 사용하여 분석을 수행하였다. 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션 한 후, 제조사의 지침에 따라, PerkinElmer EnVision 2103 광도계(luminometer)를 사용하여 발광을 측정하기 위해, Bio-Glo 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하였다 (0.5 초/웰의 통합 시간(integration time)).
결과를 아래 표 33 및 도 29(a)에 나타냈다. 결과는 시험 항체(제조사가 권장하는 최대 농도 3 ㎍/ml)의 존재 하에 수득된 RLU를 항체 없이 수득된 RLU로 나누어 계산한, 상대 발광 단위 (RLU)의 배수 변화로서 나타냈다.
| 표적 세포 | RLU의 배수 변화 | ||
| 항-CD20 | hIgG4 | IMP761 | |
| Raji | 36,8 | ||
| CHO-LAG3+ | 1,4 | 1,1 | |
| Jurkat WT | 2,3 | 0,9 | |
| Jurkat-LAG3+ | 2,5 | 1,2 | |
| LAG3+ PBMCs | 5,0 | 1,9 | 1,3 |
결과는 IMP761 항체에 대한 RLU의 배수 변화가, 표적 세포가 LAG-3을 발현하는지 유무와 관계 없이, 각각의 상이한 시험된 표적 세포에 대해 약 1배였음을 나타낸다. 이소형-매칭된 음성 대조군 항체인 hIgG4에 대해 수득된 RLU의 배수 변화는 다소 높았으며, 상이한 표적 세포에 대해 1.4- 내지 2.5-배의 범위였다. 양성 대조군 항-CD20 항체는 Raji 세포 (B 세포주)에 대해, 그리고 적은 퍼센트의 B 세포를 함유하는 SEB-자극된 PBMC에 대해 유의한 ADCC 활성을 나타냈다.
이러한 결과는 IMP761 항체가 LAG-3-발현 세포에 대해 어떠한 ADCC 활성도 갖지 않는다는 결론을 얻었다.
(2) 통상적인 ADCC 분석법
본 분석법은, T 세포 상에서 LAG-3이 발현되도록 2일 동안 SEB로 자극한 100 IU/ml의 IL-2 (Roche) 및 CFSE-표지된 PBMC와 함께, X-Vivo 10 배지 (Lonza)에서 1일 동안 자극한 PBMC를 사용한다. 본 분석법을 50:1 효과기:표적 비율의 X-Vivo 10 배지에서, 고용량 (3 ㎍/ml) IMP761 또는 이소형-매칭된 음성 대조군 항체인 hIgG4와 함께 수행하였다. 4시간 후에, 세포 혼합물을 수확하고, 형광색소-접합된 항체를 사용하여 CD4, CD8, CD25 및 LAG-3에 대해 염색하였다. 이어서, 각각의 혈액 세포 집단에서의 세포 생존력을, 이의 막의 완전성을 잃은 세포를 표지하는 형광 염료인 7-아미노-액티노마이신 D (7-AAD) 염색에서 양성으로 나타난(이는 세포 사멸 후 신속하게 나타나는 현상이다) 세포의 배제 후에 유동 세포 계측법에 의해 평가하였다.
결과를 표 34 및 도 29 (b) 및 (c)에 나타냈다. 결과는 PBMC 집단 중의 살아있는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 퍼센트 (b), 및 PBMC 집단 중의 살아있는 LAG-3+CD4+ 또는 LAG-3+CD8+ 세포의 퍼센트 (c)로서 나타냈다.
| PBMC 집단 중의 살아있는 CD8 + 또는 CD4 + 세포 % | PBMC 집단 중의 살아있는 LAG-3 + CD8 + 또는 LAG-3 + CD4 + 세포 % | |||||
| Ab 없음 | hIgG4 | IMP761 | Ab 없음 | hIgG4 | IMP761 | |
| CD8 + 세포 | 24.9 | 23.9 | 22.9 | 10.5 | 8.4 | 13.9 |
| CD4 + 세포 | 43.3 | 41.0 | 44.1 | 14.0 | 9.0 | 17.1 |
결과는 IMP761 항체가 PBMC 집단 중의 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 퍼센트, 또는 PBMC 집단 중의 LAG-3+CD8+ 세포독성 T 세포, 또는 LAG-3+CD4+ 헬퍼 T 세포의 퍼센트를 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다. 이소형-매칭된 음성 대조군 항체인 hIgG4는 PBMC 집단 중의 T 세포, 특히 LAG-3을 발현하는 활성화된 T 세포의 생존력의 약간의 감소를 야기한다.
이러한 결과는 IMP761 항체가 LAG-3-발현 T 세포에 대해 어떠한 ADCC 활성을 갖지 않는다는 결론을 얻었다.
(3) CDC 분석법
CDC 시험에서, 표적 세포로 사용한 SEB-자극된 세포를, 3 ㎍/ml의 IMP761, 이소형-매칭된 음성 대조군 항체인 hIgG4, CDC-양성 항-CD3 대조군 항체 (클론 MEM-57, Cerdalane), 또는 이소형-매칭된 음성 대조군 마우스 항체인 mIgG2a와 함께 PBS, 0.5 % BSA 중에서 45분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 부착되지 않은 항체를 세척해내고, 세포를 37℃에서 1시간 동안 RPMI 배지 중의 3배 부피에 의해 희석된 토끼 보체와 함께 인큐베이션 하였다. 세포를 형광색소-접합된 항체를 사용하여 CD4, CD8, CD25 및 LAG-3에 대해 염색하였다. 이어서, 각각의 혈액 세포 집단에서의 세포 생존력을, 7-AAD에 의해 표지된 세포의 배체 후에 유동 세포 계측법에 의해 평가하였다.
결과를 표 35 및 도 30에 나타냈다. 결과를 PBMC 집단 중의 살아있는 CD4+ 또는 CD8+의 퍼센트 (a), 또는 PBMC 집단 중의 살아있는 LAG-3+CD4+ 또는 LAG-3+CD8+ 세포 퍼센트 (b)로 나타냈다.
| PBMC 집단 중의 살아있는 CD8 + 또는 CD4 + 세포 % | PMBC 집단 중의 살아있는 LAG3 + CD8 + 또는 LAG-3 + CD4 + 세포 % | |||||||
| hIgG4 | IMP761 | mIgG2a | CD3 | hIgG4 | IMP761 | mIgG2a | CD3 | |
| CD8 + 세포 | 13.0 | 13.4 | 13.7 | 9.3 | 10.0 | 10.5 | 8.6 | 5.9 |
| CD4 + 세포 | 35.8 | 36.6 | 32.9 | 26.9 | 13.3 | 13.9 | 12.1 | 8.9 |
결과는 IMP761 항체가 PBMC 집단 중의 CD8+ or CD4+ T 세포 퍼센트, 또는 PBMC 집단 중의 LAG-3+CD8+ 세포독성 T 세포, 또는 LAG-3+CD4+ 헬퍼 T 세포의 퍼센트를 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. 예상한 바와 같이, 항-CD3 양성 대조군 항체는 PBMC 집단 중의 T 세포, 및 LAG-3을 발현하는 활성화된 T 세포의 감소를 야기하지 않았다.
이러한 결과는 IMP761 항체가 LAG-3-발현 T 세포에 대해 어떠한 CDC 활성도 갖지 않는다는 결론을 얻었다.
(4) T 세포 증식 분석법에서 세포독성의 평가
IMP761 항체는 상기 (1)-(3)에서 기술된 임의의 단기 세포독성 분석법에서 세포독성 활성을 나타내지 않았다. LAG-3-발현 T 세포에 대한 IMP761의 세포독성을 또한 수 일 동안 항원-자극된 PBMC를 배양한 후에 평가하였다. 이전의 실시예에서 기술된 증식 분석법과 유사한 방식으로, 건강한 공여자 (완전 RPMI +10% FBS 중의 0.2 x 106 세포/웰)로부터의 PBMC를 300 ng/ml의 IMP761, 또는 인간 IgG4 (이소형-매칭된 음성 대조군으로서)의 존재 하에, CMV pp35의 서열을 커버하는 펩티드 풀과 함께 3회 중복으로 인큐베이션 하였다. 3일 후에, 살아있는 림프구 중에서 게이팅된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 퍼센트, 및 이러한 T 세포 서브세트에서의 LAG-3+ 세포의 퍼센트를 유동 세포 계측법으로 측정하였다.
이러한 결과를 표 36 및 도 31에 나타냈다.
| 림프구 중의 살아있는 CD8+ 또는 CD4+ % |
CD8+ 또는 CD4+ 림프구 중의 살아있는
LAG3+ % |
|||||||
| 공여자 1 | 공여자 2 | 공여자 1 | 공여자 2 | |||||
| hIgG4 | IMP761 | hIgG4 | IMP761 | hIgG4 | IMP761 | hIgG4 | IMP761 | |
| CD8+ 세포 | 13.9 | 13.9 | 36.3 | 36.2 | 3.2 | 3.8 | 0.9 | 1.2 |
| CD4+ 세포 | 35.8 | 36.6 | 35.3 | 35.3 | 2.6 | 3.4 | 2.5 | 2.8 |
결과는 IMP761 항체가 림프구 집단 중의 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 퍼센트, 또는 림프구 집단 중의 LAG-3+CD8+ 세포독성 T 세포, 또는 LAG-3+CD4+ 헬퍼 T 세포의 퍼센트를 감소시키지 않음을 보여준다.
이러한 결과는 IMP761 항체가 이러한 증식 분석법에서 LAG-3-발현 T 세포에 대해 어떠한 세포독성 활성을 나타내지 않는다는 결론을 얻었다.
본 실시예에 제시된 결과로부터 IMP761 항체는 세포독성 활성을 갖지 않기 때문에 본 항체에 의한 항원-유도된 T 세포 증식 및 활성화의 억제는 활성화된 T 세포 T 세포에 대한 임의의 세포독성 활성에 기인한 것이 아니라는 결론을 얻었다.
SEQUENCE LISTING
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<120> Anti-LAG-3 Antibodies
<130> P/73968.WO01
<150> GB 1515572.4
<151> 2015-09-02
<150> GB 1612437.2
<151> 2016-07-18
<160> 85
<170> PatentIn version 3.5
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acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtctagg ctggattcgt 120
cagccatcag ggaagggtct ggagtggctg acacacattt ggtgggatga tatcaagcgc 180
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ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catattactg tgctcgaata 300
gtggagggtt catacagtag tagttacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360
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gggaccacgc tggaaataaa ac 322
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65 70 75 80
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atcacctgca aggccagtca ggatgtgagc attgctgtag tctggtatca acagaaacca 120
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Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
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Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
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Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
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Pro Glu Pro Glu Gln Leu
500
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<213> Homo sapiens
<400> 28
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Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
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Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
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Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
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Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
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Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
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<213> Homo sapiens
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<213> Artificial
<220>
<223> VH domain of mouse monoclonal antibody 13E2, and a human IgG4 Fc
portion with an S228P mutation
<400> 30
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Val
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<210> 35
<211> 7
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Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 37
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> VL domain of monoclonal antibody 13E2, and a wild-type human Ig
kappa (IgK) chain C portion
<400> 37
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<213> Homo sapiens
<400> 38
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165 170 175
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Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val
35 40 45
Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln
50 55 60
Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
85 90
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr
20 25 30
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Hemagglutinin epitope tag
<400> 41
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FLAG epitope tag
<400> 42
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc epitope tag
<400> 43
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> His5 affinity domain
<400> 44
His His His His His
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HisX6 affinity domain
<400> 45
His His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> c-myc affinity domain
<400> 46
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> StrepTag affinity domain
<400> 47
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 48
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 49
Phe His His Thr
1
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Affinity domain
<400> 50
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
1 5 10 15
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
20 25 30
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
50 55 60
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
65 70 75 80
Pro Gly
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 52
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 53
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 54
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ile Leu Asn
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 56
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser
20 25
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 57
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 58
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 59
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 60
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Thr Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 61
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 62
Arg Val Thr Ile Arg Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 64
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 64
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser
20 25
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 65
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 66
Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 67
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 69
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 70
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 71
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 73
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 74
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 75
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 76
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 77
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 78
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 78
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 79
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
1 5 10
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 81
Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 82
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Humanized framework sequence
<400> 83
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Heavy chain amino acid sequences of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 84
Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Thr Leu Glu Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340 345 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210> 85
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Light chain amino acid sequence of humanized 13E2 monoclonal
antibody
<400> 85
Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ile Phe Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
Claims (123)
- 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 또는 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 항원-유도된 CD4+ 및 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 억제하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원-유도된 CD4+ T 세포 증식에 비해 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식을 더욱 억제하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-유도된 CD8+ T 세포 증식의 억제가 LAG-3 의존적이고, IL-2 독립적인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식, 및 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하여 항원-유도된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 억제하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체 17B4에 비해 LAG-3에 높은 친화도로 결합하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3 또는 IMP321의 MHC 클래스 II-양성 세포로의 결합을 억제하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3-유도된 항원-제시 세포 (APC) 활성화, 또는 IMP321-유도된 단핵구 활성화를 억제하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3의 MHC 클래스 II 결합 부위와 중첩되는 LAG-3의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 영역의 1, 2, 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제11항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 1, 2, 3, 21, 22, 및 23의 CDR로부터 선택되고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 4, 5, 6, 24, 25, 및 26의 CDR로부터 선택되는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서, 상기 VH CDR1은 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR2는 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VH CDR3은 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제13항에 있어서,
VH CDR1이 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2가 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1이 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3가 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR2가 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3가 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VH CDR1이 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2가 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, CDR3가 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서, VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, VL CDR3은 서열번호 6 및 26로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제15항에 있어서,
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
VL CDR1은 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2는 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3은 서열번호 6 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, VH CDR1이 서열번호 1 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR2가 서열번호 2 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VH CDR3가 서열번호 3 및 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나; VL CDR1이 서열번호 4 및 24로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR2가 서열번호 5 및 25로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, VL CDR3가 서열번호 6 및 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 1, 2, 및 3의 CDR이고, 항체 VL 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 4, 5, 및 6의 CDR인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 21, 22, 및 23의 CDR이고, 항체 VL 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 24, 25, 및 26의 CDR인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1, 2, 및 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 4, 5, 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 21, 22, 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 서열을 갖는 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 24, 25, 및 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 갖는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 구성을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 1, 또는 서열번호 1에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역;
(b) 서열번호 2, 또는 서열번호 2에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 3, 또는 서열번호 3에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; 및/또는
하기 구성을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역;
(b) 서열번호 5, 또는 서열번호 5에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 6, 또는 서열번호 6에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역;을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 구성을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 21, 또는 서열번호 21에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역;
(b) 서열번호 22, 또는 서열번호 22에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; 및/또는
하기 구성을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 24, 또는 서열번호 24에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역;
(b) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 26, 또는 서열번호 26에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역;을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7 또는 아미노산 서열 서열번호 7과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8 또는 아미노산 서열 서열번호 8과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제24항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 8과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제24항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제24항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 8과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제24항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 VH 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 VL 영역의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제29항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 11, 12, 13, 31, 32, 및 33의 CDR로부터 선택되고, 항체 VL 영역의 CDR은 아미노산 서열 서열번호 14, 15, 16, 34, 35, 및 36의 CDR로부터 선택되는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하며, 상기 VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제31항에 있어서,
상기 VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VH CDR1은 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR2는 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR3은 서열번호 13 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하며, 상기 VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 상기 VL CDR3은 서열번호 16 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제33항에 있어서,
상기 VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR3은 서열번호 16 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR3은 서열번호 16 및 36로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나;
상기 VL CDR1은 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR2는 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR3은 서열번호 16 및 36로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH CDR1이 서열번호 11 및 31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR2가 서열번호 12 및 32로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH CDR3가 서열번호 13 및 33로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고/갖거나; 상기 VL CDR1이 서열번호 14 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR2가 서열번호 15 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 VL CDR3가 서열번호 16 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 11, 12, 및 13의 CDR이고, 항체 VL 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 14, 15, 및 16의 CDR인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 31, 32, 및 33의 CDR이고, 항체 VL 영역의 CDR이 아미노산 서열 서열번호 34, 35, 및 36의 CDR인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11, 12, 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 기진 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 14, 15, 및 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 가진 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 가진 항체 VH 영역, 및/또는 서열번호 34, 35, 및 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR을 가진 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 구성을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 11, 또는 서열번호 11에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역;
(b) 서열번호 12, 또는 서열번호 12에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역; 및/또는
하기 구성을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 14, 또는 서열번호 14에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 VL CDR1 영역;
(b) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 VL CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 16, 또는 서열번호 16에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 VL CDR3 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 구성을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 31, 또는 서열번호 31에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역;
(b) 서열번호 32, 또는 서열번호 32에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 33, 또는 서열번호 33에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역; 및/또는
하기 구성을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(a) 서열번호 34, 또는 서열번호 34에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역;
(b) 서열번호 35, 또는 서열번호 35에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및
(c) 서열번호 36, 또는 서열번호 36에 비해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17 또는 아미노산 서열 서열번호 17과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 18 또는 아미노산 서열 서열번호 18과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제42항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 18과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제42항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제42항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 18과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제42항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하는 항체 VH 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 단클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 경쇄 골격 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제48항에 있어서, 인간화된 경쇄 골격 영역이 표 27에서 VL1, VL2, VL3, 또는 VL4로 표시된 임의의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 인간화된 경쇄 골격 영역이 임의의 서열번호 68 내지 83의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제50항에 있어서, 하기 구성을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 69의 VL FR2; 서열번호 70의 VL FR3; 및 서열번호 71의 VL FR4;
서열번호 72의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 73의 VL FR2; 서열번호 74의 VL FR3 ; 및 서열번호 75의 VL FR4;
서열번호 76의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 77의 VL FR2; 서열번호 78의 VL FR3; 및 서열번호 79의 VL FR4; 또는
서열번호 80의 VL 골격 영역 1 (VL FR1); 서열번호 81의 VL FR2; 서열번호 82의 VL FR3; 및 서열번호 83의 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14 및 34로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16 및 36으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VL 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4. - 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 중쇄 골격 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제76항에 있어서, 인간화된 중쇄 골격 영역이 표 26에서 VH1, VH2, VH3, 또는 VH4로 표현된 임의의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 인간화된 중쇄 골격 영역이 임의의 서열번호 52 내지 67의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제78항에 있어서, 하기 구성을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 53의 VH FR2; 서열번호 54의 VH FR3; 및 서열번호 55의 VH FR4;
서열번호 56의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 57의 VH FR2; 서열번호 58의 VH FR3; 및 서열번호 59의 VH FR4;
서열번호 60의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 61의 VH FR2; 서열번호 62의 VH FR3; 및 서열번호 63의 VH FR4; 또는
서열번호 64의 VH 골격 영역 1 (VH FR1); 서열번호 65의 VH FR2; 서열번호 66의 VH FR3; 및 서열번호 67의 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11 및 31로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12 및 32로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13 및 33으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 항체 VH 영역을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4. - 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1 및 21로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 2 및 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3 및 23으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4를 포함하는, 항체 VH 영역; 및
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4 및 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5 및 25로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6 및 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4를 포함하는, 항체 VL 영역. - 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4를 포함하는, 항체 VH 영역; 및
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4를 포함하는, 항체 VL 영역. - 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구성을 포함하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH FR1; 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH FR2; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH FR3; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3; 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 VH FR4를 포함하는, 항체 VH 영역; 및
서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 VL FR1; 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 VL FR2; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VL FR3; 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VL FR4를 포함하는, 항체 VL 영역. - 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 분자, 또는 이의 항원-결합 단편인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제107항에 있어서, 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 따른 항체의 가변 영역 아미노산 서열 및 인간 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)이 결핍된, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 예컨대, Biacore 분석에 의한 측정시, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM, 또는 25 pM 이하의 해리 상수 (KD)로 인간 LAG-3 단백질 (또는 인간 LAG-3Ig 단백질)에 결합하는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 작용성 항-LAG-3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LAG-3 단백질의 제1 N-말단 D1 도메인의 30개 아미노산 엑스트라-루프 서열 (서열번호 40)에 결합하지 않는, 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제112항에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
- 서열번호 9, 10, 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9, 10, 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
- 제113항 또는 제114항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
- 제113항 또는 제114항의 핵산, 또는 제115항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
- 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물. - 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제117항에 따른 약학 조성물.
- T 세포-매개된 면역 장애의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제117항에 따른 약학 조성물.
- T 세포-매개된 면역 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제117항에 따른 약학 조성물의 용도.
- T 세포-매개된 면역 장애의 치료 방법으로서,
제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른, 유효량의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제117항에 따른 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법. - 제119항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제120항에 따른 용도, 또는 제121항에 따른 방법으로서, 여기서, T-세포-매개된 면역 장애는 염증성 질환, 또는 자가면역 장애임.
- 제119항에 따른 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 제120항에 따른 용도, 또는 제121항에 따른 방법으로서, 여기서, T-세포-매개된 면역 장애는 예컨대 감염 (바이러스, 박테리아, 진균 및 기생), 감염과 관련된 독소 충격, 패혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 만성 소화 장애증(coeliac disease), 담낭 질환, 모소낭 질환(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 제1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증, 루프스 (예컨대 전신성 루푸스 에리테마토우시스) 및 길랑-바레 증후군, 아토피 피부염, 자가면역 간염, 섬유성 폐렴, 그레이브스 병, IgA 신장병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르 병, 천포창, 일차성 담즙성, 간경화증, 유육종증, 피부경화증, 베게너 육아종중, 다른 자가면역 질환, 췌장염, 외상 (수술), 이식편대 숙주병, 이식 거부, 심장 질환 예컨대 허혈성 질환 예컨대 심근경색증 및 죽상동맥경화증, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 위산 감소증, 또는 태아-모성 내성의 결핍과 관련된 불임으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
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