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KR20180002600A - Flt3 단백질에 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트(adc) - Google Patents

Flt3 단백질에 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트(adc) Download PDF

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KR20180002600A
KR20180002600A KR1020177026310A KR20177026310A KR20180002600A KR 20180002600 A KR20180002600 A KR 20180002600A KR 1020177026310 A KR1020177026310 A KR 1020177026310A KR 20177026310 A KR20177026310 A KR 20177026310A KR 20180002600 A KR20180002600 A KR 20180002600A
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amino acid
acid sequence
flt3
methyl
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KR1020177026310A
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English (en)
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난디니 루드라-강굴리
크리스틴 로웨
파이살 하야트 말릭
문성주
조쉬 스나이더
헥터 아비나
사이러스 비라타
리닛 카포
가오 리우
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어젠시스 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

FLT3 단백질에 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트(Antibody Drug Conjugates: ADC's) 및 이의 유도체가 본 발명에 기술된다. FLT3은 정상 성인 조직(들)에서 분명하고 제한된 발현 패턴을 보여주고, 표 Ⅰ에 열거된 암에서 비정상적으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 ADC's는 암의 치료를 위한 치료적 조성물을 제공한다.

Description

FLT3 단백질에 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 9일 제출된 미국 가특허출원 62/130,476호에 기초한 우선권 주장 출원이다. 상기 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조로 통합되었다.
ASCII 텍스트 파일로 서열목록의 제출
본 출원에 첨부되는 ASCII 텍스트 파일 형태의 서열목록은 그 내용 전체가 본 발명에 참조로 통합되었다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF) (파일명: 511582009240SeqList.txt, 기록일: 2016년 3월 7일: 44,847 bytes).
연방정부 지원에 의한 연구로 수행된 발명에 대한 권리의 진술
해당 없음
기술분야
본 발명은 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 FLT3이라 불리는 단백질에 결합하는 그의 항체 약물 콘쥬게이트 (antibody drug conjugates: ADCs)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 FLT3을 발현하는 암의 치료에 유용한 예후, 예방 및 치료 방법, 및 조성물에 관한 것이다.
2013년도에는 1,660,290명의 남성과 여성 (남성 854,790명 및 여성 805,500명)이 부위를 막론한 암 진단을 받고, 그 중 580,350명의 남성과 여성이 사망한 것으로 예측되고 있다. 2006년-2010년 동안, 부위를 불문한 모든 진단된 암 환자의 중앙 연령은 66세였다. 연령-조정된 발병률은 연간 100,000명의 남성과 여성 중 463.0명이었다. 이러한 비율은 18 SEER 지역구 (geographical areas)에서 2006-2010년에 진단된 사례에 기반한 것이다 (N.B. SEER = Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, NCI). 2006년-2010년에, 부위를 불문한 암으로 인한 사망의 중앙 연령은 72세였다. 연령-조정된 사망률은 100,000명의 남성과 여성 중 176.4 명이었다. 이러한 비율은 미국에서 2006년-2010년에 사망한 환자들에 기반한 것이다. 2003년-2009년에 18 SEER 지역구로부터의 전체 5년 상대 생존율은 65.8%였다.
백혈병 (leukemias)은 골수와 같은 혈액-생성 조직에서 시작하여 비정상적으로 많은 수의 혈액 세포가 생성되어 혈류에 유입되는 암이다. 주요 백혈병은 급성 림프모구 백혈병 (Acute Lymphoblastic Leukemias: ALL), 급성 골수성 백혈병 (Acute Myeloid Leukemias: AML), 만성 림프성 백혈병 (Chronic Lymphocytic Leukemias: CLL), 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myelogenous Leukemias: CML) 및 털세포 백혈병 (Hairy Cell Leukemias: HCL)으로 이루어진다.
이들 백혈병을 그룹화한 결과, 48,610명의 남성과 여성 (남성 27,880명, 여성 20,730명)이 2013년에 이와 관련하여 진단받았고, 23,720명의 남성과 여성이 백혈병으로 사망할 것으로 추정된다. 2006-2010년에, 백혈병 진단에 대한 중앙 연령은 66세였다. 연령-조정된 발병률은 연간 100,000명의 남성 및 여성에 대해 12.8명이었다. 이러한 비율은 18 SEER 지역구에서 2006-2010년에 진단된 사례에 기반한다. 2006년-2010년에, 백혈병으로 인한 사망의 중앙 연령은 75세였다. 연령-조정된 사망률은 100,000명의 남성과 여성 중 7.1명이었다. 이러한 비율은 미국에서 2006년-2010년에 사망한 환자들에 기반한 것이다. 2003년-2009년에 18 SEER 지역구로부터의 전체 5년 상대 생존율은 56.0%였다.
CLL은 성인에서 두 번째로 흔한 유형의 백혈병이며, 대개 서서히 악화된다. 이 질병은 중장년층 이상에서 흔히 발병하며, 아동에게서는 드물게 나타난다. 조기 CLL 환자들은 증상이 나타나거나 이 질환이 급속히 진행되지 않는 한 화학요법 치료를 받지 않는다. 화학요법의 조기 개시는 CLL에서 별다른 장점이 없는 것으로 나타났고, 심지어 사망율을 증가시킬 수 있다. CLL에서 화학요법이 개시되면, 뉴클레오시드 유사체인 플루다라빈 (fludarabine)이 가장 흔하게 사용되는 제1선의 치료법이다. 조합 요법은 몇몇 임상시험에서 응답율을 향상시킨 것으로 나타났으며, 이에는 다음이 포함된다: 플루다라빈, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 및 리툭시맙 (rituximab) (FCR); 펜토스타틴 (Pentostatin), 시클로포스파미드, 및 리툭시맙 (PCR); 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 미톡산트론 (mitoxantrone) (FCM); 시클로포스파미드, 빈크리스틴 (vincristine), 및 프레드니손 (prednisone) (CVP); 시클로포스파미드, 독소루비신 (doxorubicin), 빈크리스틴 (vincristine), 및 프레드니손 (CHOP). 2013년에 15,680명의 남성과 여성 (남성 9,720명 및 여성 5,960)이 만성 림프구성 백혈병으로 진단되어 이 중 4,580명의 남성과 여성이 사망할 것으로 추정된다. 2006-2010년에, 만성 림프구성 백혈병으로 진단된 환자의 중앙 연령은 71세였다. 연령-조정된 발병율은 연간 남녀 100,000명 당 4.3명이었다. 이러한 데이터는 2006-2010년에 18 SEER 지역구에서 진단된 사례에 기반한 것이다. 2006-2010년에, 만성 림프구성 백혈병으로 사망한 사람들의 중앙 연령은 79세였다. 연령-조정된 사망율은 연간 남녀 100,000명 당 1.4명이었다. 이러한 비율은 미국에서 2006-2010년에 사망한 환자들에 기반한 것이다. 2003-2009년에 18 SEER 지역구에서의 전체 5년 상대 생존율은 79.2%였다.
급성 골수성 백혈병 (AML)은 성인들에 있어서 급성 백혈병 중 가장 흔한 유형이다. AML의 현행 치료법은 완전 완화 (complete remission: CR)가 달성되도록 충분히 공격적이어야 하며, 이는 일부 완화는 실질적으로 생존율에 아무런 장점을 제공하지 않기 때문이다. 성인 AML에 있어서 완화율은 연령에 반비례하며, 60세 미만에서는 65% 이상의 완화율이 기대된다. 데이터는 일단 완화가 이루어지면, 완화 기간은 고령자일수록 더 짧을 수 있음을 시사한다. 전구세포 항원 CD34 및/또는 P-당단백질 (MDR1 유전자 산물)을 발현하는 환자들은 더 좋지 않은 결과를 나타냈다. 세포유전학 분석은 완화 유도 및 완화후 요법 양자 모두의 결과를 예측해 주는, 이용가능한 가장 강력한 예후 정보를 제공한다. 좋은 예후를 가리키는 세포유전학적 이상 (abnormalities)에는 t(8; 21), inv(16) 또는 t(16;16), 및 t(15;17)를 포함한다. 정상 세포유전학은 평균-위험의 AML을 예고한다. 5번 또는 7번 염색체의 일염색체 (monosomies) 또는 롱 암 (long arms)의 결실; 3번, t(6; 9), t(9; 22) 염색체의 전위 또는 역전; 또는 11q23 염색체의 비정상으로 특징지어지는 AML 환자들은 특히 화학요법의 예후가 좋지 않다. 2013년에 14,590명의 남성과 여성 (남성 7,820명 및 여성 6,770명)이 급성 골수성 백혈병으로 진단되어 이 중 10,370명의 남성과 여성이 사망할 것으로 추정된다. 2006-2010년에, 급성 골수성 백혈병으로 진단받은 사람들의 중앙 연령은 67세였다. 연령-조정된 발병율은 연간 남녀 100,000명 당 3.7명이었다. 이러한 비율은 2006-2010년에 18 SEER 지역구에서 진단된 사례에 기반한 것이다. 2006-2010년에, 급성 골수성 백혈병으로 사망한 사람들의 중앙 연령은 72세였다. 연령-조정된 사망율은 연간 남녀 100,000명 당 2.8명이었다. 상기 비율은 미국에서 2006-2010년에 사망한 사람들의 사례에 기반한 것이다. 2003-2009년에 18 SEER 지역구에서의 전체 5년 상대 생존율은 24.2%였다. 여기서, 모든 일반적인 암 정보의 출처는 NCI 웹사이트 (www.cancer.gov)였으며, 모든 통계는: Howlader N., et. al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute, Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/ (2012년 11월 SEER 데이터 제출, 2013년 SEER 웹사이트에 포스팅됨)에서 얻은 NCHS 사망율 통계 및 SEER 발병률에 기초하였다.
급성 림프모구 백혈병 ("ALL")은 림프구 분화를 차단하고 비정상적인 세포 증식과 생존을 유도하는 유전자 변형으로 인해 발생하는 B/T-전구물-단계 림프구 세포 악성 종양을 나타낸다. 과거 수십 년 동안 유년기 ALL 치료에 현저한 진보가 이루어졌고, 현재 5년 생존율이 90%에 이르고 있다. 그러나 아동의 최대 20%는 치료후 치료 또는 재발에 불응할 것이고, 이러한 환자들의 무사고 생존율은 여전히 낮다. 현대 화학요법에서 상당한 진전이 있은 후에도 높은 재발률을 보이는 ALL 성인 환자를 치료하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 최근 수십 년 동안, 화학요법의 강화 및 최적화, 줄기세포 이식의 위험-적응된 사용, 단일클론 항체를 포함한 개인화 및 표적화된 치료법을 중심으로 한 ALL 치료 결과의 빠른 향상이 이루어졌다. 차세대 시퀀싱 (next-generation sequencing)을 사용하여, 정상적인 림프구 형성에 영향을 미치는 추가적 돌연변이와 협동 돌연변이의 중요성뿐만 아니라 후생적인 변형이 평가되고 있다. 상기 방법으로 얻은 데이터는 개별 환자의 예후 평가에 도움이 되고, 중요하게는 돌연변이 이상에 적합한 표적 치료를 통합하는데도 도움이 될 것이다.
또한, 모노클로날 항체(mAbs) (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975))의 치료적 사용이 실현되고 있다. 모노클로날 항체는 이제 장기이식, 암, 감염성 질환, 심혈관계 질환 및 염증을 치료하는데 승인되었다. 이소타입 (isotypes)이 다르면 이펙터 (effector) 기능이 상이하다. 이러한 기능상의 차이점이 다양한 면역글로불린 이소타입의 다른 3차원 구조에 반영된다 (P.M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).
마우스들은 면역화시키는데 간편하고 대부분의 인간 항원을 외래물질로서 인식하기 때문에, 치료 잠재능이 있는 인간 표적에 대한 mAbs는 일반적으로 쥣과 기원인 것이 많다. 그러나, 쥣과 mAbs (murine mAbs)는 사람을 치료하는데 근본적인 단점이 있다. 즉 이들 mAbs는 인간 항체에 비해 인간 체내에서 순환 반감기가 더 짧기 때문에 더 자주 투여하여야만 한다. 보다 중요한 것은, 쥣과 항체를 반복적으로 인간 면역계에 투여할 경우, 마우스 단백질을 외래물질로서 인식하여 인간 면역계가 응답하기 때문에 인간 항-마우스 항체 (human anti-mouse antibody: HAMA) 반응이 일어나게 된다는 것이다. 이러한 HAMA 반응은 알레르기 반응을 일으켜서 상기 시스템으로부터 쥣과 항체가 급속히 제거됨에 따라 쥣과 항체를 이용한 치료가 쓸모 없게 될 수 있다. 이러한 부작용을 방지하기 위해서, 마우스 내에 인간 면역계를 구축하려는 시도가 행해져 왔다.
최초의 시도는 인간 서열을 갖는 항체로 항원에 반응할 수 있는 유전자이식 마우스 (transgenic mice)를 만들고자 한 것이었지만 (Bruggemann et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989) 참조), 이용가능한 클로닝 비히클 (cloning vehicles)에 의해 안정하게 유지될 수 있는 DNA의 양이 한정적이라는 제약이 있었다. 이스트 (yeast)의 인공 염색체 (yeast artificial chromosome: YAC) 클로닝 벡터를 사용함으로써 인간의 Ig 위치를 유전자이식 포유동물의 생식세포 단편으로 도입할 수 있었다. 인간의 게놈 및 인간 불변 영역에서 발견되는 것과 동일한 간격으로 배열된 인간의 V, D 및 J 영역의 대부분이 YAC를 이용하여 마우스에 도입되었다. 이러한 유전자이식 마우스 균주 중 1종은 XenoMouse® 마우스로 알려져 있으며, 이는 Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA) (이전, Abgenix, Inc.)로부터 상업적으로 이용가능하다.
이에 더해, 항체들은 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH 세그먼트) 및/또는 캅파 경쇄 (VK 및 JK) 위치의 내인성 마우스 가변 세그먼트를 포함하는 게놈 서열이, 전부 또는 부분적으로, 인간 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH) 및/또는 캅파 경쇄 (VK 및 JK) 위치의 재배열되지 않은 생식세포주 가변 세그먼트를 포함하는 인간 게놈 서열에 의해 치환된 VelocImmune 유전자이식 마우스를 이용하여 제조될 수 있다 (Regeneron, Tarrytown, NY). 예컨대, 미국특허 제6,586,251호, 제6,596,541호, 제7,105,348호, 제6,528,313호, 제6,638,768호, 및 제6,528,314호 참조.
본 발명은, FLT3 단백질 및 FLT3 단백질의 폴리펩티드 단편에 결합하는, 항체, 항원-결합 단편, 및 이의 항체 약물 콘쥬게이트 (ADC)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료제와 콘쥬게이트된 완전 인간 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 도 2A 및/또는 도 2B의 전체 핵산 서열이 인코팅되지 않고, 및/또는 도 3A 및/또는 도 3B의 전체 아미노산 서열이 제조되지 않는다는 조건이다. 특정 구현예에서, 도 2A 및/또는 도 2B의 전체 핵산 서열이 인코딩되지 않고, 및/또는 도 3A 및/또는 도 3B의 전체 아미노산 서열이 제조되고, 이들 중 하나는 개별 인간 단위 투여 형태이다.
본 발명은 또한 표 Ⅰ에 열거된 조직의 암 (예컨대, AML, ALL, B-세포 림프모구 백혈병 및 전구체 B-세포 림프모구 백혈병 포함)과 같이, FLT3을 발현하는 암을 치료하기 위한, 항체 약물 콘쥬게이트와 같은 다양한 면역원성 또는 치료적 조성물, 및 전략을 제공한다.
도 1. FLT3의 cDNA 및 아미노산 서열을 도 1에 개시하였다. 개시 (start) 메티오닌에 밑줄이 그어져 있다. 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 정지 코돈을 포함한 핵산 67-3048로부터 연장된다.
도 2A. CHv62.21 중쇄의 cDNA 및 아미노산 서열. 이중-밑줄은 중쇄 가변 부위이고, 밑줄은 중쇄 인간 IgGl 불변 부위이다.
도 2B. CHv62.21 경쇄 및 CHv62.21pAF 경쇄의 cDNA 및 아미노산 서열. 이중-밑줄은 경쇄 가변 부위이고, 밑줄은 인간 카파 불변 부위이다.
도 2C. 비-천연 아미노산의 삽입으로 변형된 CHv62.21 중쇄의 cDNA 및 아미노산 서열. X로 표시된 부분은 핵산 잔기 371에서 상기 비-천연 아미노산 (non-natural amino acid: "nnAA") 파라-아세틸페닐알라닌 (para-acetylphenylalanine: pAF)의 삽입에 대한 앰버 코돈 (amber codon)의 위치이다. 이중-밑줄은 중쇄 가변 부위이고, 밑줄은 중쇄 인간 IgG1 불변 부위이다.
도 3A. CHv62.21 중쇄의 아미노산 서열. 이중-밑줄은 중쇄 가변 부위이고, 밑줄은 인간 IgGl 불변 부위이다.
도 3B. CHv62.21 경쇄 및 CHv62.21pAF 경쇄의 아미노산 서열. 이중-밑줄은 경쇄 가변 부위이고, 밑줄은 인간 카파 불변 부위이다.
도 3C. CHv62.21 중쇄의 아미노산 서열. X로 표시된 아미노산 위치 124는 상기 비-천연 아미노산 ("nnAA") 파라-아세틸페닐알라닌 (pAF)의 삽입에 대한 앰버 코돈의 위치이다. 이중-밑줄은 중쇄 가변 부위이고, 밑줄은 인간 IgG1 불변 부위이다.
도 4A. 인간 Ig 생식세포주에 대한 CHv62.21 중쇄의 정렬.
도 4B. 인간 Ig 생식세포주에 대한 CHv62.21 경쇄의 정렬.
도 5. CB17/SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 (myelomonocytic leukemia cell line) MV4-11의 피하 수립된 이종이식 모델 (subcutaneously established xenograft model)에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 효능 및 투여량 적정 연구.
도 6. CB17/SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11의 피하 수립된 이종이식 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) 및 CHv62.21pAF (AGS62P) (네이키드 항체 (naked antibody))의 효능 연구.
도 7. CHv62.21 및 CHv62.21pAF는 인 비트로 (in vitro) EOL-1, SEM 및 Raji에서 항체 의존성 세포독성 활성 (Antibody Dependent Cytotoxicity Activity: ADCC)을 매개하지 않는다 (도에서 좌측에서 우측으로). 분석 세부사항: 1) E:T = 100:1; 2) 항체 농도 = 2.5μg/mL; 3) 배양시간: 4H; 4) 아이소타입 대조군 mAb & ADC: AGS91.1-L363-pAF, AGS91.88-pAF-AGSL-0182-30; 5) 양성 대조군: 리툭시맙 타겟 Raji 세포.
도 8. CHv62.21은 비-리간드 차단 활성 (Non-Ligand Blocking Activity)을 보였다. 리간드 결합 분석에서 CHv62.21와 비교되는, FLT3 리간드 차단제 (ligand blocker) Mab (lb37.1)은, CHv62.21 Mab이 비 리간드 차단제임을, 확인하였다.
도 9. CHv62.21은 FL 매개 세포 증식을 방해하지 않는다.
도 10. 1 b37.1 FLT3 리간드 차단 Mab의 세포독성 활성이 FL의 존재 하에 감소된다. 도 10(A). RS-4-11 세포에서 인간 FLT3 리간드 (human FLT3 ligand: hFL)를 갖는 것과 갖지 않는 v62-lb21.1-AGL-0129-08의 인-비트로 세포독성의 평가. 도 10(B). RS-4-11 세포에서 인간 FLT3 리간드 (hFL)를 갖는 것과 갖지 않는 v62-lb37.1-AGL-0129-08의 인-비트로 세포독성의 평가.
도 11. FLT3 리간드는 MOLM-13 세포에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30 매개된 세포독성을 방해하지 않는다. 도 11(A). MOLM-13 세포에서 인간 FLT3 리간드의 존재 하에 비오티닐화된 (biotinylated) CHv62.21pAF 및 v62-lb37.1의 결합의 평가. 도 11(B). MOLM-13 세포에서 인간 FLT3 리간드를 갖는 것과 갖지 않는 CHv62.21pAF- AGL-0182-30의 인-비트로 세포독성의 평가.
도 12. CHv62.21pAF- AGL-0182-30의 인 비트로 안정성. 도 12(A). 인간 혈청에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 안정성의 평가. 도 12(B). 인간 혈청에서 CHv62-AGL-0301-20의 안정성의 평가.
도 13. 다중 투여량 요법 (multiple dose regime)을 사용하여, CB17/SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11의 피하 수립된 이종이식 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) 및 CHv62.21pAF (네이키드 항체)의 효능 연구.
도 14. 피하 수립된 SEM-xcl 이종이식 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 효능.
섹션의 개요
I.) 정의
Ⅱ.) FLT3 항체
Ⅲ.) 항체 약물 콘쥬게이트 개관
Ⅲ(A). 메이탄시노이드 (Maytansinoids)
Ⅲ(B). 아우리스타틴 (Auristatins) 및 돌로스타틴 (dolostatins)
Ⅲ(C). 칼리케아미신 (Calicheamicin)
Ⅲ(D). 기타 세포독성제 (Cytotoxic Agents)
Ⅳ.) FLT3에 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트
V.) 링커 유닛 (Linker Units)
Ⅵ.) 스트레처 유닛 (Stretcher Unit)
Ⅶ.) 아미노산 유닛
Ⅷ.) 스페이서 유닛 (Spacer Unit)
Ⅸ.) 약물 유닛 (Drug Unit)
Ⅹ.) 약물 로딩
XI.) ADC의 세포독성 효과의 결정 방법
XⅡ.) FLT3을 발현하는 암(들)의 치료
XⅢ.) 항체-기반 요법을 위한 타겟으로서의 FLT3
XⅣ.) FLT3 ADC 칵테일 (Cocktails)
XV.) 조합 치료법
XⅥ.) 키트/제조물품성
I.) 정의:
달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술, 설명, 및 과학적 용어 및 술어의 모든 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자들에게 널리 이해되는 의미로 사용된 것이다. 일부 경우에 있어서, 흔히 이해되는 의미를 갖는 용어들을 명확성 및/또는 참조 용이성을 위해 정의하였으며, 이러한 본원에서 정의가 이 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적으로 다른 의미를 갖는 것으로 파악되어야만 하는 것은 아니다. 본원에서 서술되거나 또는 참조된 많은 기술과 공정들은 당업자들에 의해 이용되는 통상적인 방법론을 이용하여 잘 이해되고 널리 사용되는 것들로서, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에 개시된 내용을 예로 들 수 있다. 적절한 경우, 상업적으로 이용가능한 키트와 시약의 사용을 포함하는 공정들 역시 달리 언급하지 않는 한 제조자가 정의한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행될 수 있다.
상표명이 본원에서 사용되는 경우, 해당 상표명은 달리 언급하지 않는 한, 그 제품의 제형 (formulation), 제네릭 약물 (generic drug), 및 해당 상표명 제품의 약학적 성분(들)을 지칭하는 것일 수 있다.
"진행된 암 (advanced cancer)", "국소적으로 진행된 암 (locally advanced cancer)", "진행된 질병 (advanced disease)" 및 "국소적으로 진행된 질병 (locally advanced disease)"이라는 용어는 적절한 조직 캡슐을 통해 확산되는 암을 의미하며, 미국 비뇨기학 협회 (American Urological Association: AUA) 시스템의 경우 단계 C 질병, 휘트모어-제윗 시스템 (Whitmore-Jewett system)의 단계 C1-C2 질병, 및 TNM (종양, 결절 (node), 전이) 시스템의 단계 T3 - T4 및 N+ 질병을 포함하여 의미하는 것이다. 일반적으로, 국소적으로 질병이 진행된 환자에 있어서는 외과수술은 권장되지 않으며, 이 환자들은 임상적으로 국소화된 (장기-국한된) 암에 걸린 환자에 비해 실제로 치료 결과가 좋지 못하다.
용어 "알킬 (alkyl)"은, 단독으로든 또는 다른 기의 일부로서든, 정상, 2차, 3차 또는 고리형 탄소 원자를 포함하는 포화된 C1-C12 탄화수소를 나타낸다. 특별한 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4의 탄소 원자를 갖는 것이다. 알킬기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 메틸 (Me), 에틸 (Et), n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸 (tBu), n-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 및 n-헥실, 이소헥실을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬기는 정상, 2차, 또는 3차 탄소 원자를 가지며, 또한 고리형 탄소 원자를 갖지 않는다.
용어 "알케닐 (alkenyl)"은, 단독으로든 또는 다른 기의 일부로서든, 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 정상, 2차, 3차 또는 고리형 탄소 원자를 포함하는 C2-C12 탄화수소를 나타낸다. 특별한 알케닐기는 2 내지 8개의 탄소 원자, 2 내지 6개의 탄소 원자, 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것이다. 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만: 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH2=CH2), 시클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알케닐기는 정상, 2차, 또는 3차 탄소 원자를 가지며, 또한 고리형 탄소 원자를 갖지 않는다.
용어 "알키닐 (alkynyl)"은, 단독으로든 또는 다른 기의 일부로서든, 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 정상, 2차, 3차 또는 고리형 탄소 원자를 포함하는 C2-C12 탄화수소를 나타낸다. 특별한 알키닐기는 2 내지 8개의 탄소 원자, 2 내지 6개의 탄소 원자, 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것이다. 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만: 에티닐 (-C≡CH) 및 2-프로피닐 (-CH2C≡CH)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알키닐기는 정상, 2차, 또는 3차 탄소 원자를 가지며, 또한 고리형 탄소 원자를 갖지 않는다.
용어 "알콕시 (alkoxy)"는 -O-알킬기를 나타내고, 여기서 O는 상기 분자의 나머지에 부착되는 위치이고, 알킬기는 상기에 정의된 바와 같다.
용어 "헤테로시클로알킬 (heterocycloalkyl)"은 포화 또는 일부 포화되고, 탄소 원자로부터 선택된 고리 구조 당 3 내지 12개의 고리 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 3개 미만의 헤테로원자를 갖는 모노시클릭 (monocyclic), 또는 융합된 (fused), 연결된 (bridged), 또는 스피로 (spiro) 폴리시클릭 (polycyclic) 고리 구조를 나타낸다. 특별한 헤테로시클로알킬기는 고리 구조 당 3 내지 12개의 고리 원자, 또는 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는 것이다. 상기 고리 구조는 탄소 또는 황 고리 멤버 상에 2개 미만의 옥소기를 선택적으로 포함할 수 있다. 예시되는 것이 적절하게 결합된 모이어티 (moieties)의 형태로 하기를 포함한다:
Figure pct00001
용어 "헤테로아릴 (heteroaryl)"은 헤테로사이클 당 3 내지 12개의 고리 원자를 갖는 모노시클릭, 융합된 비시클릭 (fused bicyclic), 또는 융합된 폴리시클릭 (fused polycyclic) 방향족 헤테로사이클 (aromatic heterocycle)을 나타낸다 (고리 구조는 탄소 원자로부터 선택되는 고리 원자, 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 4개 미만 헤테로원자를 가짐). 특별한 헤테로아릴기는 고리 구조 당 3 내지 8개의 고리 원자, 또는 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는 것이다. 헤테로아릴기의 예시되는 예는 하기의 것을 적절하게 결합된 모이어티의 형태로 포함한다:
Figure pct00002
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클 (heterocycle)", "헤테로시클릭 (heterocyclic)", 또는 "헤테로시클릴 (heterocyclyl)"은 상기에 정의된 바와 같이 "헤테로시클로알킬 (heterocycloalkyl)" 및 "헤테로아릴 (heteroaryl)" 모이어티를 포함한다.
당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 열거되거나 또는 예시된 헤테로 시클릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클로알킬기의 종은 포괄적인 것이 아니며, 상기 정의된 용어의 범위 안에서 부가적인 종이 선택될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
용어 "할로겐 (halogen)"은 염소 (chlorine), 불소 (fluorine), 브롬 (bromine), 또는 요오드 (iodine)를 나타낸다. 용어 "할로 (halo)"는 클로로 (chloro), 플루오로 (fluoro), 브로모 (bromo), 또는 아이오도 (iodo)를 나타낸다.
용어 "치환된 (substituted)"은 특정 기 또는 모이어티가 하나 이상의 치환기를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "비치환된 (unsubstituted)"은 상기 특정 기가 치환기를 포함하지 않는 것을 의미한다. 용어 "선택적으로 치환된 (optionally substituted)"은 특정 기가 하나 이상의 치환기에 의해서 치환되지 않거나 또는 치환된 것을 의미한다. 여기서 용어 "치환된 (substituted)"이 구조적 시스템을 서술하기 위해서 사용되고, 상기 치환은 상기 시스템에서 임의의 원자가-허용된 위치 (valency-allowed position)에서 생성되는 것을 의미한다.
본원에서 제공된 임의의 구조식 (formula)은 구조식으로 표시되는 구조 뿐만 아니라 특정 변형 또는 형태를 갖는 화합물을 나타내는 것이다. 특히, 본원에서 제공된 임의의 화학식의 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으므로, 다른 거울상이성질체 형태로 존재할 수 있다. 일반식의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 입체이성질체, 및 그 혼합물은 화학식의 범위 내에 있는 것으로 고려되었다. 그러므로, 본원에서 제공된 임의의 화학식은 라세미체 (racemate), 하나 이상의 거울상이성질체 형태 (enantiomeric forms), 하나 이상의 부분입체이성질체 형태 (diastereomeric forms), 하나 이상의 회전장애이성질체 형태 (atropisomeric forms), 및 그 혼합물을 나타내는 것이다. 또한, 특정 구조는 기하학적 이성질체 (즉, cis 및 trans 이성질체), 호변체 (tautomers), 또는 회전장애이성질체 (atropisomers)로 존재할 수 있다. 또한, 본원에서 제공된 임의의 화학식은 상기 화합물의 수화물 (hydrates), 용매화물 (solvates), 및 비정질 (amorphous) 및 다형 (polymorphic) 형태, 그 혼합물 중 어느 하나를 나타내는 것이고, 상기 형태가 명시적으로 열거되지 않았다. 일부 구현예에서, 상기 용매는 물이고, 상기 용매화물은 수화물이다.
본원에서 제공된 임의의 화학식은 또한 상기 화합물의 표지되지 않은 (unlabeled) 형태뿐만 아니라 동위원소 표지된 (isotopically labeled) 형태를 나타내는 것이다. 동위원소 표지된 화합물은 본원에서 제공된 화학식에 의해서 표시되는 구조를 갖지만, 하나 이상의 원자가 선택된 원자량 또는 원자 번호를 갖는 원자에 의해서 대체된다. 본원에 개시된 화합물로 포함될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소, 염소, 및 요오드, 가령 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 31P, 32P, 35S, 18F, 36C1, 및 125I를 각각 포함한다. 상기 동위원소 표지된 화합물이 약물 또는 기질 조직 분포 분석을 포함하는, 대사 연구 (metabolic studies) (바람직하게는 14C에 의한), 반응 키네틱 연구 (reaction kinetic studies) (예를 들면, 2H 또는 3H에 의한), 검출 또는 촬상 기술 (detection or imaging techniques) [가령 양전자 방출 촬영 (positron emission tomography: PET) 또는 단일-광자 단층 촬영 (single-photon emission computed tomography: SPECT)] 또는 환자의 방사능 치료 (radioactive treatment)에 유용하다. 특히, 18F 또는 11C 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에서 특히 바람직하다. 또한, 더 무거운 동위원소 가령 듀테리움 (deuterium) (즉, 2H)에 의한 치환은 더 좋은 대사 안정성으로부터 기인된 특별한 치료적 이점을 제공할 수 있고, 예를 들면 인 비보 (in vivo) 반감기가 증가되거나, 또는 용량 요건 (dosage requirements)이 감소된다. 본원에서 동위원소 표지된 화합물 및 그 전구약물 (prodrugs)은 일반적으로 반응식에서 개시된 과정을 수행함으로써 제조될 수 있거나, 또는 하기에 개시된 실시예 및 제조에서, 용이하게 이용가능한 동위원소 표지된 시약을 비-동위원소 표지된 시약으로 대체시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에서 제공된 임의의 화학식을 나타내는 경우, 특정 변수에 대한 가능한 종류의 목록으로부터 특정 모이어티의 선택은 다른 곳에 나타나는 변수에 대한 종의 동일한 선택을 정의하려는 것이 아니다. 다른 말로, 변수가 한번 이상 나타나면, 지정된 목록에 있는 종의 선택은, 달리 명시되지 않는 한, 화학식의 다른 곳에서 동일한 변수에 대한 종의 선택과는 무관하다.
본원에서 치환기의 부류에 적용될 때, j> i 인 "Ci -j"라는 명명법은 본원에 개시된 조성물, 용도 또는 방법의 어느 것의 구현예를 나타내는 것을 의미하고, i와 j를 포함하는 i로부터 j까지의 탄소 멤버의 수의 각각 및 모두는 독립적으로 실현된다. 예로서, 용어 C1-3은 하나의 탄소 멤버 (C1)를 갖는 구현예, 둘의 탄소 멤버 (C2)를 갖는 구현예, 및 세개의 탄소 멤버 (C3)를 갖는 구현예를 독립적으로 나타낸다.
용어 Cn _m 알킬은, 직쇄형 또는 분지쇄형이고, 상기 사슬내 탄소 멤버의 전체 수 N는 n ≤≤ N ≤ m을 만족하고, 여기서 m > n인, 지방족 사슬 (aliphatic chain)을 나타낸다.
본원에 열겨된 화합물 명이 AutoNOM™ 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 화학 구조와 그 구조에 대해 열거된 명칭 사이에 차이가 있다면, 상기 구조가 우선한다.
지정 (assignments) 및 명명법에 관한 전술한 해석상의 고려 사항에 따르면, 세트에 대한 명시적인 참조는, 화학적으로 의미가 있고, 달리 명시되지 않는 한, 상기 세트의 구현예에 대한 독립적인 언급을 의미하고, 상기 세트의 하위세트의 가능한 구현예는 명시적으로 언급된 것으로 이해된다.
"고유 글리코실화 패턴을 변경 (Altering the native glycosylation pattern)"은 본원에서 목적 상, 고유(native) 서열 FLT3에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 삭제하고 (기초 글리코실화 부위를 제거하거나 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 제거하는 것에 의함) 및/또는 고유 서열 FLT3에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미하는 것이며, 여기서, "천연 글리코실화 패턴"은 FLT-3 서열, 세포 유형, 및 사용된 성장 조건의 특병한 조합으로부터 기인하는 천연 번역후 글리코실화 패턴을 나타낸다. 또한, 상기 표현은 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 특성과 비율의 변화를 포함하는, 천연 단백질의 글리코실화에서 질적인 변화 (qualitative changes)를 포함한다.
용어 "유사체 (analog)"는 다른 분자와 구조적으로 유사하거나 또는 유사하거나 또는 상응하는 부분을 공유하는 분자를 나타낸다 (예컨대, FLT3-관련된 단백질). 예를 들면, FLT3 단백질의 유사체는 FLT3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.
용어 "항체 (antibody)"는 명백히 달리 지시하지 않는 한, 최광의로 사용된다. 그러므로, "항체"는 자연발생적인 것일 수도 있거나 또는 통상의 하이브리도마 기술 또는 유전자이식 마우스 기술에 의해 생산되는 모노클로날 항체와 같이 인공적인 것일 수도 있다. FLT3 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체뿐만 아니라 이들 항체의 항원결합 도메인 및/또는 1개 이상의 상보성 결정 부위를 포함하는 단편도 포괄한다. 본원에서 사용되는, 용어 "항체"는 FLT3에 특이적으로 결합하고 및/또는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 모든 형태의 항체 또는 그 단편을 가리키며, 특히 FLT3에 특이적으로 결합하고 및/또는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예컨대 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 모두 포괄한다. 임의의 특이적 항체를 본원에서 제공되는 방법과 조성물에 사용할 수 있다. 그러므로, 일 구현예에서, 용어 "항체"는 경쇄 면역글로불린 분자로부터의 적어도 하나의 가변 영역 및 중쇄 분자로부터의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하며, 조합시 상기 표적 항원에 대하여 특이적 결합 부위를 형성하는 것인 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 예를 들면, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 본 발명의 방법과 조성물에서 유용한 항체는 세포 배양, 파지, 또는 예컨대 소, 토끼, 염소, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지 및 유인원을 포함하는 여러가지 동물 (그러나 이에 한정되지 않음)에서 생산될 수 있다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 포유동물의 항체이다. 파지 기술을 이용하여 초기 항체를 분리하거나 또는 변형된 특이성 또는 결합 특성을 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 기술은 당 기술 분야에 잘 알려져 있으며 널리 사용되고 있다. 일 구현예에서, 상기 항체는 당 기술 분야에 알려진 재조합 수단에 의해 생성된다. 예를 들면, 재조합 항체는 숙주 세포를, 그 항체를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 하나 이상의 벡터를 사용하여 적어도 하나의 VL 및 적어도 하나의 VH 영역을 발현하는 DNA 서열을 숙주 세포내로 형질감염시킬 수 있다. 항체 생성 및 제조의 재조합 수단에 관한 서술은 Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); 및 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, most recent edition)를 포함한다. 본 발명의 항체는 목적하는 기능을 매개하는데 있어서 항체의 효능을 증강시키기 위한 재조합 수단에 의해 변형될 수 있다. 그러므로, 재조합 수단을 이용하여 치환시킴으로써 항체가 변형될 수 있는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 통상적으로, 상기 치환은 보존적 치환이다. 예를 들어, 상기 항체의 불변 영역 중의 적어도 하나의 아미노산을 다른 잔기로 대체시킬 수 있다. 예컨대, 미국특허 제5,624,821호, 미국특허 제6,194,551호, 출원번호 WO 9958572; 및 Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993) 참조. 아미노산의 변형에는 아미노산의 결실, 부가 및 치환을 포함한다. 일부 사례에서, 이러한 변화는 바람직하지 못한 활성, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)을 감소시키기 위하여 만들어진다. 흔히, 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 공유 또는 비공유 결합시킴으로써 항체가 표지될 수 있다. 광범위한 종류의 표지와 콘쥬게이션 기술이 알려져 있고, 과학 및 특허문헌 모두에서 광범위하게 보고되었다. 이들 항체들은 정상적 또는 결함있는 FLT3에 대한 결합 여부를 스크리닝하는데 이용가능하다. 예컨대, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996) 참조. 목적하는 생물학적 활성을 갖는 적합한 항체들을 비제한적인 예로서 다음의 인 비트로 분석: 증식, 이주, 부착, 소프트 한천 성장, 혈관생성, 세포-세포 커뮤니케이션, 세포자멸사, 운반, 신호 형질도입 및, 다음의 인 비보 분석, 가령 종양 성장 억제 등을 사용하여 동정될 수 있다. 본원에 제공되는 항체들은 또한 진단 용도로도 유용할 수 있다. 포획 항원 또는 비-중화 (non-neutralizing) 항체로서, 이들을 항원의 생물학적 활성 또는 수용체-결합을 억제함이 없이, 그 특이 항원에 결합하는 능력이 있는지에 대해 스크리닝할 수 있다. 중화 항체로서, 항체는 경쟁적 결합 분석에서 유용할 수 있다. 이들은 또한 FLT3 또는 그의 수용체를 정량화하는데 사용될 수도 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "항원 결합 단편 (antigen-binding fragment)" 또는 "항체 단편 (antibody fragment)" (또는 간단히 "항체 부분 (antibody portion)")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 FLT3 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다 (예컨대, FLT3 및 변이체; 도 1 참조). 항체의 항원-결합 기능은 전장 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 의해 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(a single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 부위 (complementarity determining region: CDR)를 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 서로 다른 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 이용함으로써, VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루고 있는 단일 단백질 사슬이 되도록 해주는 합성 링커에 의해 이들을 서로 결합시킬 수 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예컨대, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다. 이들 항체 단편들은 당업자에게 잘 알려진 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 상기 단편이 본래 항체와 마찬가지로 동일한 방식으로 그의 유용성 여부에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는, 용어 "Fc"는 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 영역을 나타낸다.
본원에서 사용되는, 임의 형태의 "항원 (antigen)"이 FLT3에 대해 특이적인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 유도 항원 (eliciting antigen)은 단일 에피토프, 다중 에피토프, 또는 전체 단백질 단독 또는 당 기술 분야에 알려져 있는 하나 이상의 면역원성 증강 작용제와 조합 형태일 수 있다. 유도 항원은 분리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질 (예컨대, 항원의 적어도 일부분으로 세포를 형질감시켜 면역화시킴), 또는 가용성 단백질 (예컨대, 상기 단백질의 세포외 도메인 부분만으로 면역화시킴)일 수 있다. 상기 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생성될 수 있다. 항원을 인코딩하는 DNA는 게놈성 또는 비게놈성 (예컨대, cDNA)일 수 있으며, 세포외 도메인의 적어도 일부를 인코딩한다. 본원에서 사용되는, 항원과 관련하여 "부분 (portion)"이라는 용어는 관심 대상 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위한, 최소 갯수의 아미노산 또는 핵산을 의미한다. 관심 대상 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전적 벡터가 사용될 수 있으며, 여기에는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 비-바이러스성 벡터, 예컨대 양이온성 지질이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 본원에서 방법 및 조성물의 항체는 관심 대상인 FLT3의 세포외 도메인의 적어도 일부분에 특이적으로 결합하는 것이다.
본원에서 제공되는 항체 또는 항원 결합 단편은 "생물활성 물질 (bioactive agent)"로 이루어지거나 또는 그 일부일 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "생물활성 물질 (bioactive agent)"은 항원에 결합하고 및/또는 목적하는 생물학적 효과를 증강 또는 매개하여 세포-사멸 독소를 증강시키는 합성 또는 천연 화합물을 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명에서 유용한 결합 단편은 생물학적 활성 단편이다. 본원에서 사용되는, 용어 "생물학적 활성인 (biologically active)"은 목적하는 항원 에피토프에 결합하여 직접 또는 간접적으로 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 가리킨다. 직접 효과는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 성장 신호의 변조, 자극, 및/또는 억제, 항-세포자멸사 신호의 변조, 자극 및/또는 억제, 세포자멸사 또는 네크로시스 신호의 변조, 자극 및/또는 억제, ADCC 캐스케이드의 변조, 자극 및/또는 억제, 및 CDC 캐스케이드의 변조, 자극 및/또는 억제를 포함한다.
상기 항원 결합 단백질의 결합 친화력은 결합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd)에 의해 결정된다 (KD = Kd/Ka). 결합 친화력은 예를 들어 단백질-A 코팅된 센서 표면에 시험 항체를 포획하고, FLT3를 상기 표면 위로 흘려줌으로써, BIACORE로 측정될 수 있다. 대안으로, 상기 결합 친화력은 시험 항체 수용체가 단백질-A로 코팅된 바늘에 포획되고, 상기 표면 위로 FLT3을 흘림으로써 예를 들어 FORTEBIO에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 결합 친화력을 측정하기 위해 당 업계에 알려져 있는 다른 적합한 분석을 확인할 수 있다.
본원에서 사용되는, 항원 결합과 관련하여 용어 "특이적으로 결합하는 (specifically binds)" 단백질은, 상기 항원 결합 단백질이 FLT3뿐만 아니라 FLT3 내의 이산 도메인 (discrete domain), 또는 이산 아미노산 서열 (discrete amino acid sequence)과 다른 (예를 들어 비-관련성) 단백질에 결합하지 않거나 중요하지 않은 결합을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 항체 또는 그의 결합 단편이 또한 밀접하게 관련된 분자와 교차-반응성일 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 본원에 개시된 항체 및 이의 단편뿐만 아니라 이들을 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트는 밀접하게 관련된 분자에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 50, 100 또는 1000배 더 큰 친화도로 FLT3에 특이적으로 결합될 수 있다.
FLT3에, 본원에 개시된 임의의 항체, 예를 들면, 임의의 형태, 예컨대, 항체 약물 콘쥬게이트의 결합이 FLT3에 대한 FL 결합의 일부 또는 전부를 차단할 것으로 기대될 수 있다. 그러나, 본원에서 FLT3에 대한 FL 결합을 실질적으로 저해하지 않는 항-FLT3 항체가 있다. 결합을 "실질적으로 저해"하기 위해서, 최소한의 변화 이상으로 검출가능한 양의 결합 감소가 기대되며; 무작위적인 단백질 단백질 상호 작용 또는 비특이적 항체-항원 상호작용에서 예상되는 것과 같은 최소한의 결합 양에 상응하는 작은 결합 변화는 포함되지 않는다. 항체가 다른 분자의 표적 항원에 대한 결합을 실질적으로 저해하는지 여부를 측정하는 것은 당 업계에 알려져 있는 방법에 의한 생물물리학적 측정 또는 기능적 측정을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 두 단백질의 상호 작용은 물리적 결합 분석 (예를 들면, 하기 실시예 14 참조)에서 직접 측정되거나 또는 수용체를 통한 신호 전달과 같은 단백질 상호 작용 또는 세포의 성장 또는 성장 억제와 같은 후속하는 세포성 효과의 다운스트림 효과를 측정하는 기능적 분석을 통해 간접적으로 측정될 수 있다. 그러므로, FLT3에 대한 FL의 결합을 실질적으로 저해하지 않는 본원에 개시된 항-FLT3 항체는 FLT3으로 FL 결합에서 상당한 감소를 일으키지 않고, FLT3을 통한 FL 결합의 신호가 검출 가능하다.
"이중특이적 (bispecific)" 항체도 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하다. 본원에서 사용되는, 용어 "이중특이적 항체 (bispecific antibody)"는 항체, 통상적으로 적어도 2개의 상이한 항원 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 나타낸다. 일 구현예에서, 상기 에피토프는 동일 항원으로부터 유래한 것이다. 다른 구현예에서, 상기 에피토프는 다른 두가지 항원으로부터 유래한다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 공동발현시킴으로써 이중특이적 항체가 재조합적으로 생성될 수 있다. 예컨대, Milstein et al., Nature 305:537-39 (1983) 참조. 대안으로서, 이중특이적 항체가 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대, Brennan, et al., Science 229:81 (1985) 참조. 이중특이적 항체에는 이중특이적 항체 단편을 포함한다. 예컨대, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994) 참조.
본원에서 개시된 모노클로날 항체는 특히 "키메라 (chimeric)" 항체를 포함하고, 상기 항체에서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하거나, 또는 특정 종으로부터 유래되는 항체에서 해당하는 서열과 동일 또는 상동인 반면, 상기 사슬(들)의 나머지는, 표적 항원에 특이적으로 결합하고 및/또는 소망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종 또는 다른 항체 유형 또는 하위 유형 및 그러한 항체의 단편으로부터 유도된 항체 중의 상응하는 서열과 동일 또는 상동적인 것이다 (미국특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
본원에서 사용되는, 용어 "암 (cancer)", "신생물 (neoplasm)" 및 "종양 (tumor)"은 상호교환 가능하게 사용되고, 단일 또는 복수 형태로, 숙주 생물체에 병리학적으로 만드는 악성 형질전환을 거친 세포를 나타낸다. 1차 암 세포 (즉, 악성 형질전환의 부위 근처에서 수득된 세포)는 잘-수립된 기술, 특히 조직 검사에 의해 비-암성 세포와 용이하게 구분될 수 있다. 본원에서 사용되는, 암 세포의 정의는 1차 암세포뿐만 아니라 암 세포 선조 (cancer cell ancestor)로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 상기는 전이 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 인 비트로 배양 및 세포주를 포함한다. 통상적으로 고형 종양 (solid tumor)으로 나타나는 암의 유형을 언급할 때, "임상적으로 검출가능한 (clinically detectable)" 종양은 종양 질량을 기준으로 탐지할 수 있는 종양이며; 예컨대 CAT 스캔, MR 영상, X-선, 초음파 또는 촉진 (palpation)과 같은 절차에 의해 검출될 수 있고 및/또는 환자로부터 얻을 수 있는 시료에서 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 검출 가능하다. 종양은 조혈 종양 (hematopoietic tumor), 예를 들어 혈액 종양 또는 액체 종양을 의미하는 종양 일 수 있다. 상기 종양에 기초한 임상적 상태의 특정 예는 만성 골수성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병과 같은 백혈병; 다발성 골수종과 같은 골수종; 림프종 등을 포함한다.
용어 "치료제 (therapeutic agent)"는 치료 이득을 제공하고 및/또는 본원에서 정의된 바와 같은 치료적 효과가 있는 모든 작용제를 나타낸다. 치료제는, 예를 들면, 질병, 장애 또는 상태의 진행을 역전, 개선, 완화, 억제 또는 제한하거나, 또는 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 질병 가령 암의 하나 이상의 증상에 영향을 주거나 또는 이를 개선시킬 수 있다. 이러한 작용제는 세포독성 (cytotoxic) 또는 세포증식억제 (cytostatic)일 수 있다. 상기 용어에는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 정의된 바와 같은, 화학치료제 (chemotherapeutic agents), 항-신생물 작용제 (anti-neoplastic agents) 및 "약물 단위 (Drug Unit)" 작용제를 포함한다.
용어 "항-신생물 작용제 (anti-neoplastic agent)"는 신생물 또는 암의 치료에서, 치료 이득을 제공하고 및/또는 본원에서 정의된 바와 같은 치료적 효과가 있는 모든 작용제를 나타낸다.
본원에 개시되는 항체 약물 콘쥬게이트 및 그 약학적 조성물 중 어느 것을 사용하는 일부 구현예에서, 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트 및 그 약학적 조성물은 전암 (precancer) 또는 적어도 하나의 전-신생물 세포를 치료하는데 효과적이고, 예를 들어 암성 세포로의 악성 전이를 방지하는데 효과적이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 항-신생물 작용제는 또한 전암 또는 적어도 하나의 전-신생물 세포를 치료하는데 효과적이고, 예를 들면 암성 세포로의 악성 전이를 방지하는데 효과적이다.
용어 "화학치료제 (Chemotherapeutic Agent)"는 종양 성장을 억제하는데 효과적인 모든 화합물을 나타낸다. 화학치료제의 비-제한적인 예로는 알킬화제; 예를 들면, 니트로젠 머스타드 (nitrogen mustards), 에틸렌이민 화합물 및 알킬 술포네이트; 항대사물질 (antimetabolites), 예를 들면, 폴산 (folic acid), 퓨린 또는 피리미딘 길항제; 유사분열 저해제 (mitotic inhibitors), 예를 들면, 항-투불린 (anti-tubulin) 작용제 가령 일일초알칼로이드 (vinca alkaloids), 아우리스타틴 (auristatins) 및 포도필로 독소 (podophyllo toxin)의 유도체; 세포독성 항생제; DNA 발현 또는 복제를 손상 또는 방해하는 화합물, 예를 들면 DNA MGB (minor groove binders); 및 성장 인자 수용체 길항제를 포함한다. 또한, 화학치료제는 세포독성제 (본원에서 정의된 바와 같음), 항체, 생물학적 분자 및 소 분자 (small molecules)를 포함한다.
용어 "화합물 (compound)"은 화학적 화합물 자체를 가리키거나 이를 포함하는 것은 물론, 명시적으로든 묵시적으로든, 해당 문장이 명백히 다음의 것들을 배제하고 있지 않는 한 하기를 포함한다: 폴리모르픽 형태를 포함하여, 상기 화합물의 비정질 및 결정 형태, 여기서 이들은 혼합물 또는 분리물의 일부를 형성할 수 있고; 본원에서 제공되는 구조에서 보여지는 일반적인 형태인, 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태; 광학이성질체 및 호변이성질체와 같은 화합물의 이성질체, 여기서 광학 이성질체는 거울상이성질체와 부분입체이성질체, 키랄 이성질체와 비-키랄 이성질체를 포함하며, 상기 광학이성질체는 분리된 광학 이성질체 뿐만 아니라 라세미 혼합물과 비-라세미 혼합물을 포함하는 광학 이성질체들의 혼합물도 포함하고; 여기서 이성질체는 1종 이상의 다른 이성질체와 혼합물 형태일 수도 있고, 분리된 형태일 수도 있고; 화합물의 동위원소, 예를 들어 듀테리움- 및 트리티움 (tritium)-함유 화합물과 방사능동위원소를 포함하는 화합물을 포함하고, 여기서 치료적- 및 진단적-효과가 있는 방사능동위원소가 포함되고; 다이머, 트리머 등을 포함하는 멀티머 형태의 화합물; 바람직하게 약학적 허용가능한 염과 같은 화합물의 염, 여기에는 산 부가 염과 염기 부가 염이 포함되며, 유기 카운터이온과 무기 카운터이온을 갖는 염이 포함되고, 그 화합물이 둘 이상의 카운터이온과 연관이 있을 경우, 이들 둘 이상의 카운터이온이 동일 또는 상이할 수 있는 것인 쯔비터이온 형태도 포함하고; 및 예컨대 반용매화물 (hemisolvates), 일용매화물 (monosolvates), 이용매화물 (disolvates) 등과 같은, 화합물의 용매화물. 여기에는 유기 용매화물 및 무기 용매화물이 포함되고, 상기 무기 용매화물에는 수화물이 포함되고; 화합물이 2개 이상의 용매 분자와 회합될 경우, 이들 둘 이상의 용매 분자는 동일 또는 상이할 수 있다. 몇가지 경우에서, 본원에서 본 발명의 화합물을 나타내는 참조는 형태들 중 하나 이상, 예컨대, 염 및/또는 용매화물에 대한 명백한 참조를 포함할 것이고; 그러나 상기 참조는 강조하기 위한 것이고, 상기에서 나열된 다른 형태가 배제되는 것은 아니다.
용어 "상보성 결정 부위 (complementarity determining region)" 및 "CDR"은 항체 가변 부위들 내에서 항원 특이성과 결합 친화력을 부여하는, 아미노산의 비-인접 서열들을 나타내는 것으로 당 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 부위에는 세 개의 CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 있고, 각 경쇄 가변 부위에도 세 개의 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열은 바운더리는 여러 가지 공지 방법에 따라 용이하게 결정될 수 있고, 이러한 방법의 예로는 Kabat et al., (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 번호(numbering) 방법), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 ("Chothia" 번호(numbering) 방법), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,"J . Mol . Biol . 262, 732-745." ("Contact" 번호(numbering) 방법), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,"DevComp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" 번호(numbering) 방법), 및 Honegger A 및 Plueckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,"J MolBiol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (AHo 번호(numbering) 방법)을 포함한다.
주어진 CDR의 바운더리는 식별을 위해 사용된 방법에 따라 가변될 수 있다. 예를 들면, Kabat 방법은 구조적 정렬을 기반으로 하고, Chothia 방법은 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat와 Chothia 방법에 대한 번호(numbering)는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하고, 여기서 삽입은 삽입 문자, 예를 들면 "30a"에 의해 조정되고, 일부 항체에 결실이 나타난다. 상기 두 가지 방법은 서로 다른 위치에 특정 삽입 및 결실 ("indels")을 배치하여, 차동 번호를 유도한다. 접촉 체계는 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하고, 많은 측면에서 Chothia 번호 방식과 유사하다. 하기 표 V는 Kabat, Chothia, 및 Contact 방법에 의해 확인된 바와 같은 각각 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 위치를 수록하였다. CDR-H1에 있어서, 잔기 넘버링은 Kabat 및 Chothia 번호 방법 두 가지 모두를 사용하여 수록되었다.
그러므로, 달리 명시하지 않는 한, 주어진 항체 또는 그 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 부위"이라는 용어는 예컨대 항체 또는 그 영역의 가변 부위 뿐만 아니라 개별 CDRs (예컨대 CDR-H1, CDR-H2)은 전술한 공지 방식법에 정의된 바와 같은 상보적 결정 부위 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 몇몇 경우에서, 특정 CDR 또는 CDRs의 확인을 위한 방법은 Kabat, Chothia, 또는 Contact 방법에 의해 정의되는 CDR과 같이 명시된다. 다른 경우에, CDR의 특정 아미노산 서열이 제공된다. 예를 들면, 표 Ⅴ 참조.
본원에서 사용되는, "보존적 치환 (conservative substitution)"이라는 용어는 당업자에게 잘 알려진 아미노산 및/또는 아미노산 서열의 치환을 나타내고, 일반적으로 수득된 분자의 생물학적 활성이 일반적으로 변경되지 않는 치환을 나타낸다. 당업자라면, 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식할 것이다 (예컨대, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987) 참조). 이러한 예시되는 치환은 표 II 및 표 III(a-b)에 제시된 바에 따라 수행되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이러한 변경에는 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L)으로 다른 소수성 아미노산을 치환하는 것; 글루탐산 (E)를 아스파르트산(D)으로 치환하는 것 또는 그의 역; 아스파라긴 (N)을 글루타민 (Q)으로 치환하는 것 또는 그의 역; 트레오닌 (T)을 세린 (S)으로 치환하는 것 또는 그의 역이 포함된다. 기타의 치환이 또한 특정 아미노산의 환경 및 단백질의 3차원 구조에서의 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들면, 글리신 (G)과 알라닌 (A)은 종종 호환가능하며, 알라닌 (A)와 발린 (V)도 그러하다. 비교적 소수성인 메티오닌 (M)은 종종 류신 및 이소류신과 호환될 수 있으며, 때로는 발린과 호환되기도 한다. 리신 (K)과 아르기닌 (R)은 아미노산 잔기의 유의적 특성이 그의 전하에 기인하고 이들 두 아미노산 잔기의 pK를 달리하는 것이 유의하지 않은 부위에서 종종 상호교환가능하다. 다른 변경들도 특히 환경에서 "보존적"으로 고려될 수 있다 (예컨대, 본원에서 표 III(a); "Biochemistry" 2nd ED. pages 13-15, Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6 참조). 다른 치환이 또한 허용가능하며, 실험적으로 결정되거나 또는 공지의 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
용어 "세포독성제 (cytotoxic agent)"는 세포의 발현 활성, 세포의 기능을 저해 또는 방지하고 및/또는 세포의 파괴를 일으키는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사능 동위원소, 화학치료제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소와 같은 독소, 및 그 단편 및/또는 변이체를 포괄한다. 세포독성제의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아우리스타틴 (예컨대, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, MMAE 및 MMA), 아우로마이신, 메이탄시노이드, 리신 (ricin), 리신 A-사슬, 콤브레스타틴, 듀오카르마이신, 돌라스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 시스플라틴, cc1065, 에티디움 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, α-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 큐리신, 크로틴, 칼리케아미신, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 저해제, 및 글루코코르티코이드 및 기타 화학치료제 뿐만 아니라, 방사능동위원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32 및 Lu177를 포함하는 Lu의 방사능동위원소, 및 AGD-0182로 언급되는 본 발명의 독소를 포함한다.
본 발명의 항체를 포함하는 항체는 전술한 세포독성제 및 전구-약물을 그 활성 형태로 전환시킬 수 있는 항-암 전구-약물 활성 효소에 콘쥬게이트될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "디아바디 (diabodies)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일 사슬 상에서 두개의 도메인 사이에 쌍을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들로 하여금 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 하여, 두개의 항원-결합 부위를 형성한다. 디아바디는 예컨대 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)에 보다 상세히 서술되어 있다.
용어 "결실 (deplete)"은 FLT3-발현 세포 상에서의 FLT3 결합 작용제의 효과와 관련하여, FLT3-발현 세포의 수가 감소되거나 또는 이의 제거를 나타낸다.
본 발명의 목적을 위하여, FLT3, a.k.a., Flk2 (태아 간 키나아제 2)로도 알려져 있는 Fms 유사 티로신 키나제 3 수용체, STK1 (줄기 세포 티로신 키나아제 1) 및 CD135은 타입 III 수용체 티로신 키나제 (receptor tyrosine kinases: RTK)의 멤버이다. 인간 FLT3은 993개의 아미노산의 RTK를 인코딩하고, 이는 5개의 면역 글로불린-유사 세포외 도메인 및 키나제-삽입 도메인에 의해 연결된 2개의 세포내 티로신 키나아제 도메인 (tyrosine kinase domains: TKD)을 갖는 멤브레인-결합된 수용체를 포함한다 (Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). 인간 FLT3 유전자 (유전자 ID 번호: 2322 (National Center for Biotechnology Information))는 염색체 13q12에 위치하고, 마우스 FLT3와 85%의 아미노산 서열 상 동성을 공유한다 (Rosnet O et al; Oncogene 8: 173- 179 (1993)). FLT3은 정상 골수성 및 림프구 전구 세포에서 발현되고, 또한 AML 환자의 70-90%의 백혈병 세포에 의해 발현되고 (Carow, C.E et al; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet O et al; Leukemia 10:238-248 (1996)), 또한 ALL에서 발현된다.
용어 "유전자 산물 (gene product)"은 펩타이드/단백질 또는 mRNA을 나타내기 위해서 본원에서 사용된다. 예를 들면, "본 발명의 유전자 산물 (gene product of the invention)"은 때로 본원에서 "암의 아미노산 서열 (cancer amino acid sequence)", "암 단백질 (cancer protein)", "표 I에 열거된 암 단백질 (protein of a cancer listed in Table I)", "암의 mRNA (cancer mRNA)" " 표 I에 열거된 암의 mRNA (mRNA of a cancer listed in Table I)" 등을 나타낸다. 일 구현예에서, 상기 암 단백질은 도 1의 핵산에 의해 인코딩된다. 암 단백질은 단편이거나, 또는 대안으로서 도 1의 핵산에 의해 인코딩된 전장 단백질일 수 있다. 일 구현예에서, 암의 아미노산 서열이 서열 동일성 또는 유사성을 결정하는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 상기 서열들은 도 1의 핵산에 의해 인코딩된 단백질의 자연 발생적인 대립형질 변이체이다. 또 다른 구현예에서, 상기 서열은 본원에서 더 서술되는 서열 변이체이다.
"헤테로콘쥬게이트 (Heteroconjugate)" 항체는 본 발명의 방법과 조성물에서 유용하다. 본원에서 사용되는, 용어 "헤테로콘쥬게이트 항체 (heteroconjugate antibody)"는 2개의 공유적으로 결합된 항체들을 나타낸다. 이러한 항체들은 가교제를 사용하는 것을 포함하여, 합성 단백질 화학 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 미국특허 제4,676,980호 참조.
용어 "호몰로그 (homolog)"는 다른 분자에게 상동성을 나타내는 분자, 예컨대, 대응하는 위치에서 동일 또는 유사한 화학적 잔기의 서열을 갖는 분자를 나타낸다.
용어 "동일 (identical)" 또는 "서열 동일성 (sequence identity)"은 최적으로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결실과 비교될 때 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.
2개의 서열 간의 "퍼센트 동일성(percent identity)"은, 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 상기 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100)이고, 이는 상기 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 상기 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기에 서술되는 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 Meyers, et al., Comput. Appi. Biosci., 4: 11-17 (1988)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 (gap length penalty) 12 및 갭 패널티 (gap penalty) 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되었다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성이 Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램으로 통합되었다.
예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 100% 동일한 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있거나, 또는 참조 서열과 비교하여 뉴클레오티드 변형의 특정 정수까지 포함할 수 있고, 예컨대 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일하다. 이러한 변경은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 전이 및 전환을 포함하는 치환, 또는 결실로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에 발생될 수 있다. 뉴클레오티드 변경의 수가, 본원에 개시된 참조 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 전체 수를 (100으로 나눠진) 각 퍼센트 동일성의 수치 퍼센트로 곱하고, 상기 참조 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수로부터의 값을 뺌으로써 결정되거나, 또는 n.sub.n.ltoreq.x.sub.n-(x.sub.ny)으로 결정되고, 여기서 n.sub.n은 뉴클레오타이드 변경의 수이고, x.sub.n은 본원에서 개시되는 참조 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수이고 (예시되는 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 "서열목록"에서 핵산 서열 참조), y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 75%에 대해 0.75, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 98%에 대해 0.98, 99 %에 대해 0.99 또는 100%에 대해 1.00이고, 곱셈 연산자에 대한 기호이고, 또한 x.sub.n 및 y의 임의의 비-정수 합이 x.sub.n로부터 이를 빼기 전에 가장 가까운 정수로 내림된다.
유사하게, 폴리펩티드 서열은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 참조 서열과 동일할 수 있고 (예시되는 참조 폴리펩티드 서열에 대한 "서열 목록"에서 아미노산 서열 참조), 즉 100 % 동일하거나, 또는 % 동일성이 100 % 미만, 가령, 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일하도록 참조 서열과 비교하여 아미노산 변경의 특정 정수까지 포함할 수 있다. 그러한 변경은 보존적 및 비-보존적 치환 또는 삽입을 포함하는 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 상기 참조 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치에서 발생할 수 있거나 또는 참조 서열의 아미노산들 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 주어진 % 동일성에 대한 아미노산 변경의 수는 폴리펩티드 참조 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열에서 총 아미노산 수를 각각의 퍼센트 동일성(100으로 나눔)의 수치 퍼센트에 곱한 다음 그 값을 본원에 개시된 폴리펩티드 참조 서열 (예를 들면, 서열번호: 1-21 참조)에서 아미노산의 전체 수로부터 뺌으로써 결정될 수 있고, 또는 n.sub.a.ltoreq.x.sub.a-(x.sub.ay)에 의해 결정될 수 있고, 여기서 n.sub.a는 아미노산 변경의 수이고, x.sub.a은 참조 폴리펩티드 jduf에서 아미노산의 전체 수이고, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 75%에 대해 0.75, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 98%에 대해 0.98, 99 %에 대해 0.99 또는 100%에 대해 1.00이고, 곱셈 연산자에 대한 기호이고, 또한 x.sub.a 및 y의 임의의 비-정수 합이 x.sub.a로부터 이를 빼기 전에 가장 가까운 정수로 내림된다.
퍼센트 동일성은 서열의 길이에 대해 결정될 수 있다. 본원에서 정의되는 용어 "75% 이상의 동일 (over 75% identical)"은, 상기 범위를 가지면서, 75%, 80%, 85%, 95% 및 99% 이상의 동일성 뿐만 아니라 모든 불연속 값 및 불연속적인 하위 범위를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 "인간 항체 (human antibody)"이다. 본원에서 사용되는, 용어 "인간 항체 (human antibody)"는 경쇄 서열과 중쇄 서열의 전체 서열들이, 상보성 결정 부위 (CDRs)를 비롯하여, 모두 인간 유전자로부터 기원한 항체를 나타낸다. 일 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 트리오마 기술 (trioma technique), 인간 B-세포 기술 (예컨대, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), EBV 형질전환 기술 (예컨대, Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 77-96 (1985) 참조), 또는 파지 디스플레이 (예컨대, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991) 참조)를 사용하여 제조된다. 특정 구현예에서, 인간 항체는 유전자이식 마우스에서 생성된다. 이러한 부분 내지 전체의 인간 항체의 제조 기술은 당분야에 알려져 있고, 이러한 기술이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에 따르면, 전체 인간 항체 서열이 인간의 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 유전자이식 마우스에서 생성된다. 인간 항체를 생산하는 유전자이식 마우스의 제조에 관한 예시적인 설명은 WO 02/43478 및 미국특허 제6,657,103호 (Abgenix) 및 그의 관련 출원에서 찾아볼 수 있다. 소망되는 항체를 생산하는 유전자이식 마우스로부터 얻은 B 세포를 융합시켜 항체의 연속 제조를 위한 하이브리도마 세포주를 만든다. 예컨대, 미국특허 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 및 제5,545,806호; 및 Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998) 참조.
본원에서 사용되는, 용어 "인간화 항체 (humanized antibody)"는 인간 항체 뿐만 아니라 비-인간 (예컨대, 쥣과 (murine)) 항체로부터의 서열도 포함하는 항체의 형태를 나타낸다. 이러한 항체들은 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열 (minimal sequence)을 포함하는 키메라 항체들이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 일반적으로 두개의 가변 도메인을 함유하며, 여기서 초가변 (hypervariable) 루프의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비인간 면역글로불린의 그것에 대응하고, FR 영역의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 면역글로불린 서열의 그것에 대응한다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 부위 (Fc), 일반적으로는 인간의 면역글로불린의 불변 부위를 적어도 일부 포함할 것이다. 예컨대, Cabilly 미국특허 제4,816,567호; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; 및 ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996) 참조.
본원에서 사용되는 용어 "저해하다 (inhibit)" 또는 "저해 (inhibition of)"는 측정가능한 양으로 감소시키거나 또는 전적으로 방지시키는 것을 의미한다.
표현 "단리된 (isolated)" 또는 "생물학적으로 순수한 (biologically pure)"은 천연 상태라면 보통 그 물질과 함께 발견되는 성분들이 그 물질에 실질적으로 또는 기본적으로 없는 것을 나타낸다. 그러므로, 본 발명에 따라 단리된 펩티드는 바람직하게는 그의 인 시투 (in situ) 환경에서 일반적으로 연관되는 물질을 포함하지 않는다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드가 FLT3 유전자 이외의 유전자에 대응하거나 또는 이에 상보적이거나, 또는 FLT3 유전자 산물 또는 그 단편 이외의 폴리펩티드를 인코딩하는 오염된 폴리뉴클레오티드로부터 실질적으로 분리되었을 때 이를 "단리된"이라 한다. 당업자라면 단리된 FLT3 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위한 핵산 분리 공정을 용이하게 사용할 수 있다. 예를 들면, FLT3 단백질을 그 단백질과 보통 연관된 세포 성분으로부터 제거하는데 물리적, 기계적, 화학적 방법이 사용된 경우 그 단백질은 "단리되었다"라고 한다. 당업자라면 단리된 FLT3 단백질을 수득하는 표준 정제 방법을 용이하게 사용할 수 있다. 대안으로서, 단리된 단백질이 화학적 수단에 의해 제조될 수 있다.
적절한 "표지 (label)"는 방사성핵종 (radionuclides), 효소, 기질, 코팩터 (cofactors), 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자기 입자 등을 포함한다. 상기 표지의 사용을 교시하는 특허로는 미국특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 본원에서 제공되는 항체들은 형광체의 항원-결합 성분으로서 사용될 수도 있다. 예컨대, Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003) 참조.
용어 "포유동물 (mammal)"은 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말 및 사람을 포함하는, 포유동물로 분류되는 생물체를 나타낸다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 포유동물은 마우스이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 포유동물은 인간이다.
용어 "전이 암 (metastatic cancer)" 및 "전이 질병 (metastatic disease)"은 지역 임파절이나 또는 원위부까지 확산된 암을 의미하며, AUA 시스템의 단계 D 질병 및 TNM 시스템의 TxNxM+ 단계를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 (modified)"은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 변화의 존재를 나타낸다. 그러한 변화 또는 변형은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 합성후 변형 (post synthesis modifications)에 의해, 또는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 동시-번역 (co-translation) 또는 번역후 변형 (post-translational modifications)에 의해 수득 될 수있다.
본원에서 사용되는 용어 "조절제 (modulator)" 또는 "시험 화합물 (test compound)" 또는 "약물 후보 (drug candidate)" 또는 문법상 등가물 (grammatical equivalents)"은 암 표현형, 암 서열, 예컨대 핵산 또는 단백질 서열의 발현, 또는 암 서열의 효과 (예컨대, 신호전달, 유전자 발현, 단백질 상호반응 등)를 직접 또는 간접적으로 변경시키는 능력에 대해 시험될, 예컨대 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 나타내는 임의의 분자를 나타낸다. 일 양상에서, 조절제는 본 발명의 암 단백질의 효능을 중화시킬 것이다. "중화 (neutralize)"라 함은 단백질의 활성이 저해 또는 차단되면서 결과적으로 상기 세포에 그러한 효과를 미치는 것을 의미한다. 다른 양태에서, 조절제는 상기 단백질의 수준을 정상화시킴으로써, 본 발명의, 유전자 및 그에 대응하는 단백질의 효과를 중화시킬 것이다. 바람직한 구현예에서, 조절제는 본원에서 제공된 발현 프로파일, 또는 발현 프로파일 핵산 또는 단백질 또는 하류의 이펙터 경로를 변경시킨다. 일 구현예에서, 상기 조절제는 암의 표현형, 예컨대, 정상 조직 핑거프린트를 억제한다. 다른 구현예에서, 조절제는 암 표현형을 유도하였다. 일반적으로, 다수의 분석 혼합물이 작용제의 농도를 달리하며 실시되어 여러가지 농도에 대한 상이한 응답을 수득한다. 통상적으로, 상기 농도들 중 한가지는 제로 농도 또는 검출 수준 미만, 즉, 음성 대조군으로 제공한다.
조절제, 약물 후보 또는 시험 화합물은 통상적으로 유기 분자, 바람직하게는, 분자량이 100 달톤보다 크고 약 2,500 달톤 미만인 소형 유기 화합물인 경우가 많지만, 광범위한 화학물질을 포괄한다. 바람직한 소형 분자는 분자량이 2000 달톤 미만, 또는 1500 달톤 미만 또는 1000 달톤 미만 또는 500 달톤 미만이다. 후보 작용제는 단백질과 구조적으로 상호작용하는데 필요한 작용기, 특히 수소 결합, 및 통상적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는, 적어도 두 개의 작용성 화학기를 포함한다. 후보 물질은 종종 고리형 탄소 또는 헤테로시클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함하여 이들은 하나 이상의 전술한 작용기로 치환된다. 조절제는 또한 펩티드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 그 유도체, 구조적 유사체 또는 조합체와 같은 바이오분자도 포함한다. 특히 바람직한 것은 펩티드이다. 조절제의 한 부류는 예를 들면 약 5 내지 35개 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 약 20개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 15개의 아미노산의 펩티드이다. 바람직하게는, 암 조절 단백질이 가용성인 것이 좋고, 비-막통과 (non-transmembrane) 영역을 가지며 및/또는, 가용성을 돕기 위한 N-말단에 Cys를 포함한다. 일 구현예에서, 커플링을 돕기 위해, 시스테인에 대해 상기 단편의 C-말단은 유리산 (free acid)으로, N-말단은 유리 아민 (free amine)으로 유지된다. 일 구현예에서, 본 발명의 암 단백질은 본원에서 토의된 면역원성 작용제에 콘쥬게이트된다. 일 구현예에서, 암 단백질이 BSA에 콘쥬게이트된다. 예컨대, 바람직한 길이의 본 발명의 펩티드는 서로 링크되거나 또는 다른 아미노산에 링크되어 보다 긴 펩티드/단백질을 형성할 수 있다. 상기 조절 펩티드는 전술한 바와 같은 자연 발생 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "편향된 (biased)" 랜덤 펩티드의 분해물일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 펩티드/단백질-기반 조절제는 본원에서 정의된 바와 같은 항체, 및 그 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체 (monoclonal antibody)"는 실질적으로 균일한 항체들의 집단, 즉, 그 집단을 포함하는 개별 항체들이, 소량으로 존재하는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 서로 동일한 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 나타낸다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 고도로 특이적이면서 그것에 지향되어 있다. 대조적으로, 종래 (폴리클로날) 항체 제재는 통상적으로 상이한 에피토프에 지향된 (또는 그에 특이적인) 항체를 복수 개 포함한다. 일 구현예에서, 상기 폴리클로날 항체는, 복수 개의 항원 에피토프를 포함하는, 단일 항원 내에서 상이한 에피토프 특이성, 친화도, 또는 결합활성을 갖는 모노클로날 항체들을 복수개 포함한다. 변형제 "모노클로날"은 그 항체의 특성이 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어졌음을 의미하며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산할 것이 요구되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)에 의해 서술된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면 Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)에 서술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 이들 모노클로날 항체들은 대개 ELISA로 측정시 대개 적어도 약 1 μM, 더욱 일반적으로는 적어도 약 300 nM, 통상적으로는 적어도 약 30 nM, 바람직하게는 적어도 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3 nM의 Kd로 결합할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체 (monoclonal antibody)"는 실질적으로 균일한 항체들의 집단, 즉, 그 집단을 포함하는 개별 항체들이, 소량으로 존재하는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 서로 동일한 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 나타낸다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 고도로 특이적이면서 그것에 지향되어 있다. 대조적으로, 종래 (폴리클로날) 항체 제재는 통상적으로 상이한 에피토프에 지향된 (또는 그에 특이적인) 항체를 복수 개 포함한다. 일 구현예에서, 상기 폴리클로날 항체는, 복수 개의 항원 에피토프를 포함하는, 단일 항원 내에서 상이한 에피토프 특이성, 친화도, 또는 결합활성을 갖는 모노클로날 항체들을 복수개 포함한다. 변형제 "모노클로날"은 그 항체의 특성이 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어졌음을 의미하며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산할 것이 요구되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)에 의해 서술된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면 Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)에 서술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 이들 모노클로날 항체들은 대개 ELISA로 측정시 대개 적어도 약 1 μM, 더욱 일반적으로는 적어도 약 300 nM, 통상적으로는 적어도 약 30 nM, 바람직하게는 적어도 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3 nM의 Kd로 결합할 것이다.
"비-천연 아미노산 (non-natural amino acid)" 또는 달리 "nnAA"로 표기된 아미노산은 20개의 일반적인 아미노산 또는 피로리신 (pyrolysine) 또는 셀레노시스테인 (selenocysteine) 중 하나가 아닌 아미노산을 나타낸다. nnAA라는 용어와 동의어로 사용되는 다른 용어는 "비-자연 인코딩된 아미노산 (non-naturall encoded amino acid)", "비자연 아미노산 (unnatural amino acid)", "비-자연 발생 아미노산 (non-naturally occurring amino acid)"이다. 또한, 용어 nnAA는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 자연 발생적이지 않고, 합성으로 수득되거나, 또는 비-천연 아미노산의 변형에 의해 수득될 수 있는 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 목적을 위해, 파라-아세틸페닐알라닌은 nnAA로 간주된다.
용어 "파라-아세틸페닐알라닌 (para-acetylphenylalanine)" 또는 "pAF"는 하기 화학 구조로 표시되는 3-(4-아세틸페닐)-2-아미노프로판산을 의미한다:
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"약학적 부형제 (pharmaceutical excipient)"는 아쥬반트 (adjuvant), 담체, pH-조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제, 방부제 등과 같은 물질을 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 (Pharmaceutically acceptable)"은 비독성, 불활성 및/또는 사람이나 다른 포유동물과 생리적으로 혼용가능한 조성물을 나타낸다.
용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 길이가 적어도 10개의 염기 또는 염기쌍인, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이러한 뉴클레오티드 중 어느 한 종류의 변형체인 뉴클레오디드의 폴리머 형태를 의미하고, 또한 DNA 및/또는 RNA의 단일 및 이중가닥 형태를 포함하는 것을 의미한다. 당 기술 분야에서, 상기 용어는 "올리고뉴클레오티드"와 종종 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 도 1에 도시된 바와 같이, 티미딘 (T)이 우라실 (U)일 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고; 이러한 정의는 DNA와 RNA의 화학적 구조 간의 차이에 기인하는 것으로, 특히 RNA의 4개의 주요 염기 중 하나가 티미딘 (T) 대신 우라실 (U)인 관찰에 관한 것이다.
용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 적어도 약 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산을 갖는 폴리머를 의미한다. 명세서 전체를 통해, 표준 3 문자 (표 Ⅲ 참조) 또는 1 문자가 아미노산을 지칭하기 위해 사용된다. 당 업계에서, 상기 용어는 종종 "펩티드" 또는 "단백질"과 상호교환적으로 사용된다.
"재조합 (recombinant)" DNA 또는 RNA 분자는 인 비보 (in vivo) 분자 조작된 DNA 또는 RNA 분자이다.
본원에서 사용되는, 용어 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단일 사슬" 항체는 항체의 VH 와 VL 도메인을 포함하는 항체의 단편을 나타내고, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, 상기 Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH 와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. sFv에 대한 검토를 위해서, Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조.
본원에서 사용되는, 용어 "특정 (specific)", "특이적 결합 (specifically binds)" 및 "결합이 특이적인 (binds specifically)"은 표적 항원 에피토프에 대해 선택적으로 항체 결합하는 것을 나타낸다. 항체들의 결합 특이성은 주어진 조건 하에서 적절한 항원에 대한 결합과, 무관한 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합을 비교함으로써 시험될 수 있다. 항체가 무관한 항원 또는 항원 혼합물보다 적어도 2, 5, 7배, 바람직하게는 10배 더 많이 적절한 항원에 결합한다면, 이는 특이적인 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 특정 항체는 FLT3 항원에만 결합하고, 무관한 항원에는 결합하지 않는다. 다른 구현예에서, 특정 항체는 FLT3 항원과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 상동성으로 인간 FLT3 항원에 결합하지만, 비-인간 FLT3 항원에는 결합하지 않는다. 다른 구현예에서, 특정 항체는 상기 FLT3 항원의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성으로 인간 FLT3 항원에 결합하지만, 비-인간 FLT3 항원에는 결합하지 않는다. 다른 구현예에서, 특정 항체는 인간 FLT3 항원에 결합하고, 쥣과 FLT3 항원에 결합하지만, 인간 항원에 대한 결합도가 더 높다. 다른 구현예에서, 특정 항원은 인간 FLT3 항원과 결합하고, 영장류 FLT3 항원과 결합하지만, 인간 항원에 대한 결합도가 더 높다. 다른 구체예에서, 특정 항원은 인간 FLT3 항원에 결합하고, 비인간 FLT3 항원에도 결합하지만, 인간 항원 또는 그 조합에 대한 결합도가 더 높다.
본원에서 사용되는 "치료하기 위한 (to treat)" 또는 "치료적 (therapeutic)" 및 그와 문법적으로 관련된 용어들은 생존의 연장, 사망률의 저하와 같은 임의의 질병의 결과의 개선, 및/또는 대체 치료 양상의 부산물인 부작용의 감소를 나타내고; 당 업계에서 이미 인정되는 바와 같이, 질병의 완전한 근절이 바람직하기는 하지만, 치료 행위의 요건은 아니다.
용어 "변이체 (variant)"는 특정하게 개시된 단백질 (예컨대, 도 1에 도시한 FLT3 단백질)의 해당 위치에 하나 이상의 다른 아미노산 잔기를 갖는 단백질과 같이 서술된 타입 또는 표준으로부터의 변형을 나타내는 분자를 나타낸다. 유사체는 변이체 단백질의 일 예이다. 스플라이스 이소폼 (splice isoforms)과 단일 뉴클레오티드 다형 (single nucleotides polymorphisms: SNP)은 변이체의 또 다른 예이다.
본 발명의 "FLT3 단백질" 및/또는 "FLT3 관련 단백질"은 본원에서 특정하게 확인된 것 (도 1 참조)뿐만 아니라, 본원에서 개략적으로 설명되는 방법을 따라 과도한 실험 없이 또는 당 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있는 방법으로 분리/제조 및 특징지어질 수 있는 대립형질 변이체, 보존적 치환 변이체, 유사체 및 상동체를 포함한다. FLT3 단백질의 융합 단백질과 이종 폴리펩티드 뿐만 아니라, 다른 FLT3 단백질 또는 그 단편의 일부와 조합된 융합 단백질도 또한 포함된다. 그와 같은 FLT3 단백질은 총괄해서 FLT3-관련 단백질, 본 발명의 단백질 또는 FLT3이라 한다. 용어 "FLT3-관련 단백질"은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 25개 이상의 아미노산, 또는 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 991, 992, 또는 993개 이상의 아미노산의 폴리펩티드 단편 또는 FLT3의 단백질 서열을 나타낸다.
Ⅱ.) FLT3 항체
본 발명의 또다른 양상은 FLT3-관련 단백질 (도 1 참조)에 결합하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서 FLT3-관련 단백질에 결합하는 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 FLT3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 FLT3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 다른FLT3-관련 단백질에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 예컨대, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 FLT3 단백질에 결합하는 항체는 FLT3 변이체 및 그의 상동체(homolog) 또는 유사체(analog)와 같은 FLT3-관련 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명의 FLT3 항체는 암 (예를 들면 표 I 참조)의 예후 분석, 화상화 및 진단, 및 치료 방법론에서 특히 유용하다. 일 구현예에서 암의 검출에 사용하기 위한 본원에 개시된 FLT3 결합 분석법은 면역분석법이다. 마찬가지로, 이러한 항체는 예를 들어 치료재와 함께, ADC에서, 급성골수성 백혈병 ("AML") 및 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 다른 암에서 FLT3이 이들 다른 암에서도 발현 또는 과발현되는 한 이들 다른 암의 치료 및/또는 예후에서 유용하다. 더욱이 세포 내에서 발현된 항체 (예를 들면 단일 사슬 항체)는 진행성 또는 전이성 AML 또는 ALL 암 또는 다른 진행성 또는 전이성 암과 같이 FLT3의 발현이 관련된 암의 치료에 치료적으로 유용하다.
항체, 구체적으로 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 항체는 FLT3-관련 단백질, 펩티드 또는 단편을 이용하여 적절한 포유동물 숙주를 면역화함으로써 분리된 또는 면역 콘쥬게이트된 형태로 제조될 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, 및 Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). 또한 FLT3 GST-융합 단백질과 같은 FLT3의 융합 단백질도 역시 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 도 1의 아미노산 서열 모두 또는 대부분을 포함하는 GST 융합 단백질이 생산된 후, 적절한 항체를 생산하기 위한 면역원으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, FLT3-관련 단백질이 합성되고 면역원으로 사용된다.
또한, 당업계에 알려진 naked DNA 면역화 기술이 인코딩된 면역원에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 (정제된 FLT3-관련 단백질 또는 FLT3 발현 세포를 사용하거나 사용하지 않고) 사용된다 (Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648 참조).
도 1에 나타낸 바와 같이 FLT3 단백질의 아미노산 서열은 항체를 생산하기 위해 FLT3 단백질의 특정 부위를 선택하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들면 FLT3 아미노산 서열의 소수성 및 친수성 분석이 FLT3 구조에서 친수성 부위를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 다른 부위 및 영역(domain) 뿐 아니라 면역 구조를 나타내는 FLT3 단백질의 부위는 Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz 또는 Jameson-Wolf 분석 등의 당업계에 공지된 다양한 다른 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 친수성 프로파일은 Hopp, T.P. 및 Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 소수성 프로파일은 Kyte, J. 및 Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 퍼센트(%) 어세서블 잔기 (Percent (%) Accessible Residues ) 프로파일은 Janin J., 1979, Nature 277:491-492의 방법을 사용하여 만들 수 있다. 평균 유연성 프로파일은 Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255의 방법으로 만들 수 있다. β 턴 프로파일은 Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.의 방법을 사용하여 만들 수 있다. 따라서, 이들 중 어떤 프로그램 또는 방법에 의해 동정된 각각의 부위도 본 발명의 범위 내에 포함된다. FLT3 항체의 제조를 위한 바람직한 방법은 본원에서 실시예에 의해 제시된다. 면역원으로서 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. BSA, KLH 또는 다른 캐리어 단백질 등의 캐리어와 단백질의 면역성 콘쥬게이트를 제조하는 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 환경에서는 예를 들면 카보디이미드 시약을 사용하는 직접 콘쥬게이션이 효과적이고, 다른 경우에는 Pierce Chemical Co., Rockford, IL 사에 의해 공급되는 것과 같은 결합제의 사용이 효과적이다. FLT3 면역원의 투여는 당업계에서 이해되는 바와 같이 적절한 시간 간격을 두고, 적절한 보조제와 함께 주사에 의해 수행된다. 면역화 스케쥴 동안, 항체 형성의 적절성을 결정하기 위해 항체의 역가가 취해질 수 있다.
FLT3 모노클로날 항체는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면 일반적으로 알려진 바와 같이, 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화된 세포주는 Kohler와 Milstein 의 표준 하이브리도마 기술 또는 항체 생성 B세포를 불멸화하는 변형에 의해 제조된다. 원하는 항체를 분비하는 불멸화된 세포주는 항원으로 FLT3-관련 단백질을 사용하는 면역분석법에 의해 스크리닝된다. 적절한 불멸화된 세포 배양이 동정되면, 그 세포는 확장될 수 있고, 항체는 인 비보 배양에서 또는 복수액으로부터 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편은 또한 재조합 방법에 의해 생산될 수 있다. FLT3 단백질의 원하는 부위에 특이적으로 결합하는 부위는 또한 복수의 종 기원의 키메라 또는 상보성 결정 부위(CDR)가 이식된 항체의 문맥에서 생산될 수 있다. 인간화 또는 인간 FLT3 항체는 생산되고 바람직하게 치료적 문맥에서 사용될 수 있다. 대응하는 인간 항체 서열에 대해 하나 이상의 비인간 항체 CDR을 치환함으로써 쥣과 및 다른 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다(예를 들면 Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536 참조). 또한, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 및 Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296 참조.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH 단편) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 위치에 내인성 마우스 가변 단편을 산생하는 게놈 서열이 전체로 또는 부분적으로 인간 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 위치의 재배열되지 않은 생식세포계열 가변 단편을 산생하는 인간 게놈 서열에 의해 치환된 VelocImmune 형질전환 마우스를 이용하여 제조될 수 있다 (Regeneron, Tarrytown, NY). 예컨대, 미국특허 Nos. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, 6,528,313, 6,638,768, 및 6,528,314 참조.
또한, 본 발명의 인간 항체는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마)와 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니 좌위(miniloci)를 함유하는 HuMAb 마우스 (Medarex, Inc.)를, 내인성 뮤 및 카파 사슬 좌위를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들면, Lonberg, 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859 참조).
또다른 구현예에서, 본 발명의 완전 인간 항체는 인간 중쇄 이식유전자와 인간 경쇄 이식염색체를 운반하는 마우스와 같은, 인간 면역글로불린 서열을 이식유전자와 이식염색체 상에 운반하는 마우스를 사용하여 만들어질 수 있다. 그와 같은 마우스는, 여기서 "KM 마우스"로 지칭되며, Tomizuka 등 (2000) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 97:722-727 및 PCT Publication WO 02/43478 to Tomizuka, 등에 설명되어 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자의 스크리닝 라이브러리를 위한 파지 디스플레이법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 인간 항체를 분리하기 위한 파지 디스플레이법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면 Ladner 등의 미국특허 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; Dower 등의 미국특허 5427,908 및 5,580,717; McCafferty 등의 미국특허 5,969,108 및 6,172,197;및 Griffiths 등의 미국특허 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 참조.
발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 항체 반응이 면역화될 때 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 그 안으로 재구성되는 SCID 마우스를 이용하여 제조될 수 있다. 그와 같은 마우스는 예를 들면 Wilson 등의 미국특허 5,476,996 및 5,698,767에서 설명된다.
이에 더해, 본 발명의 인간 항체는 항체 생산이 불활성화되고 인간 중쇄 및 경쇄 좌위가 조작된, Xenomouse(Amgen Fremont, Inc., 공식적으로는 Abgenix, Inc.)라 칭해지는 형질전환 마우스를 이용하는 기술에 의해 만들 수 있다. 인간 항체를 생산하는 형질전환 마우스들의 제조에 관한 설명예를 미국특허 6,657,103에서 찾아볼 수 있다. 또한, 미국특허 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 및 5,545,806; 및 Mendez, et. al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002)참조.
상기 생산하는 방법 중 임의의 것은 FLT3, 또는 호몰로그 또는 단편 또는 FLT3에 대해 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 9, 98, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 특정 능력을 갖는 항체를 야기한다. 항체, 이의 결합 단편, 및 FLT에 대해 동일한 것을 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트의 결합 친화력(KD)은 1 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하일 수 있다. 대안적으로, KD는 5 내지 10 nM 일 수 있고; 또는 1 내지 2 nM이다. KD는 1 마이크로 몰 내지 500 마이크로 몰 또는 500 마이크로 몰 내지 1 nM 일 수 있다.
항원 결합 단백질의 결합 친화력은 결합 상수(Ka) 및 해리 상수(Kd)에 의해 결정된다(KD=Kd/Ka). 결합 친화력은 BIACORE에 의하여, 예를 들어, 단백질-A 코팅된 센서 표면 상에 시험 항원을 포획하고 이 표면 상에 FLT3을 유동시킴으로써 측정될 수 있다. 대안적으로, 결합 친화력은 FORTEBIO에 의하여, 예를 들어, 시험 항체 수용체가 단백질-A 코티된 바늘에 포획되고 이러한 표면 위로 유동시킴으로써 측정할 수 있다. 당업자는 결합 친화력을 측정하기 위해서 당업계에 공지된 적절한 다른 분석법을 확인할 수 있다.
항원 결합, 단백질에 관하여 본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합"은 FLT3뿐만 아니라 FLT3 내에서의 구별되는 영역, 또는 구별되는 아미노산 서열에 다른(예를 들어, 관련 없는) 단백질에 대해 결합하지 않거나 유의적이지 않은 결합으로 결합하는 것을 의미한다. 그러나, 이 용어는 항체 또는 이의 결합 단편이 밀접하게 연관된 분자와 교차 반응성일 수 있다는 사실을 배제하는 것은 아니다. 항체 및 이의 단편과 본원에 기술된 이들을 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트는 밀접하게 연관된 분자에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 50, 100, 또는 1000-배 이상의 친화력으로 FLT3에 결합할 수 있다.
바람직한 구현예에서 본 발명의 FLT3 MAbs는 ATCC (American Type Culture Collection) 기탁번호 PTA-121831 (도 3A 및/또는 3B 참조)로 기탁된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생산되는 CHv62.21로 지정되는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위, 또는 CHv62.21의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 아미노산 서열에 대한 상동체인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 FLT3 MAb의 바람직한 기능성을 유지한다. CHv62.21의 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 1번째 잔기(E) 내지 123번째 잔기(S) 잔기의 범위인 아미노산 서열로 구성되고, CHv62.21의 경쇄 가변 부위는 서열번호 10의 1번째 잔기(D) 내지 108번째 잔기(R) 잔기의 범위인 아미노산 서열로 구성된다. CHv62.21의 중쇄 가변 부위의 CDR1-3(Kabat)은 각각 서열번호 9의 31-35, 50-65, 및 95-102의 범위인 아미노산 서열로 구성되고, CHv62.21의 경쇄 가변 부위의 CDR1-3(Kabat 또는 Chothia)은 각각 서열번호 10의 24-34, 50-56, 및 89-97의 범위인 아미노산 서열로 구성된다(도 4 및 표 Ⅴ 참조). 본 발명의 항체의 불변 부위로서, 불변 부위의 임의의 서브 클래스가 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 중쇄 불변 부위로서 인간 IgG1 불변 부위 및 경쇄 불변 부위로서 Ig 카파 불변 부위가 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하고, 여기서:
(a) 중쇄 가변 부위는 도 3A 및/또는 3B에 도시된 중쇄 가변 부위 아미노산 서열과 적어도 80% 상동인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 부위는 도 3A 및/또는 3B에 도시된 경쇄 가변 부위 아미노산 서열과 적어도 80% 상동인 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 도 3A 및/또는 3B에 도시된 VH 및 VL 서열과 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동일 수 있다. 본원의 개시는 또한 3A 및/또는 도 3B에 도시된 a 또는 b를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 뿐만 아니라 이들과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동인 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 제공한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 인간화 중쇄 가변 부위 및 인간화 경쇄 가변 부위를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 여기서:
(a) 중쇄 가변 부위는 도 3A 및/또는 3B에 도시된 중쇄 가변 부위 상보성 결정 부분(CDR)의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 부위는 도 3A 및/또는 3B에 도시된 경쇄 가변 부위 CDR의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
본 발명의 조작 항체는 VH 및/또는 VL 내에서 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 항체를 포함한다 (예를 들면, 항체의 특성을 개선하기 위해). 전형적으로 그와 같은 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소하기 위해 행해진다. 예들 들면, 그에 대한 하나의 접근은, 하나 또는 그 이상의 프레임워크 잔기를 해당 생식세포계열 서열로 "복귀 돌연변이" (backmutate) 하는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이된 항체는, 항체가 유래된 생식세포계열 서열과는 다른 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 그와 같은 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래한 생식세포계열 서열과 비교함으로써 동정될 수 있다. 프레임워크 잔기 서열을 그들의 생식세포계열 배열로 되돌리기 위해서, 체세포 돌연변이는 예를 들면, 위치 지정 돌연변이 생성 또는 PCR 매개 돌연변이 생성(예를 들면, 류신에서 메티오닌으로 복귀 돌연변이)에 의해 생식세포계열 서열로 복귀 돌연변이 될 수 있다. 이와 같은 "복귀 돌연변이된" 항체는 또한 본 발명에 포함되도록 의도된다.
프레임워크 변형의 또 다른 형태는 프레임워크 부위 내에서 또는 하나 또는 그 이상의 CDR 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T-세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것과 관련된다. 이 접근은 또한 "면역제거"라고 지칭되며, Carr et al.에 의한 미국특허 공개 2003/0153043에 보다 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 부위 내에서 행해지는 변형에 대해 추가로 또는 선택적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존성 세포 독성 등의 항체의 하나 이상의 기능특성을 변형시키기 위해 Fc 영역 내에서의 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 FLT3 MAb는 화학적으로 변형되거나(예를 들면, 하나 이상의 화학부분이 항체에 결합될 수 있다) 그 글리코실화 또는 MAb의 하나 이상의 기능 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 구현예 각각은 이하에서 보다 더 상세하게 설명된다.
일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은(hinge region) 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경, 즉 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근은 Bodmer et al. 등에 의한 미국특허 5,677,425에서 더 상세하게 설명된다. CH1의 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수는 예를 들면 경쇄 또는 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 FLT3 MAb의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 FLT3 MAb의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc -힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역으로 도입되어 항체는 천연 Fc-힌지 도메인(domain) SpA 결합에 대해 결합하는 손상된 스타필로코실 단백질 A (Staphylococcyl protein A) (SpA)를 갖는다. 이 접근은 Ward et al.에 의한 미국특허 6,165,745에 더 상세하게 설명된다.
다른 구현예에서, FLT3 MAb는 생물학적 반감기가 증가하도록 변형된다. 이에 대해 다양한 접근이 가능하다. 예를 들면, 돌연변이는 Ward의 미국특허 6,277,375 에서 설명된 바와 같이 도입될 수 있다. 대안적으로, 반감기를 증가시키기 위해, Presta et al. 에 의한 미국특허 5,869,046 및 6,121,022에 설명된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프에서 취해진 에피토프와 결합하는 샐비지 수용체를 함유하도록 항체는 CH1 또는 CL 부위 내에서 변경될 수 있다.
또다른 구현예에서, Fc 영역은 FLT3 MAb의 이펙터(effector) 기능(들)을 변경시키도록 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들면, 아미노산 특정 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화성을 갖지만 모항체의 항원 결합 능력은 유지하도록 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화성이 변경될 수 있는 이펙터 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분이 될 수 있다. 이 접근은 Winter et al.에 의한 미국특허 5,624,821 및 5,648,260에 더 상세하게 설명된다.
또다른 구현예에서, 중쇄는 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 Ambrx(La Jolla, CA)에 의해 개발된 ReCODE 기술을 통해 비-천연 아미노산으로 대체됨으로써 변경될 수 있다. 비-천연 아미노산의 일 예는 파라-아세틸페닐알라닌이다.
FLT3-관련 단백질과 FLT3 항체의 반응성은 적절한 FLT3-관련 단백질, FLT3- 발현 세포 또는 그의 추출물을 이용한 웨스턴 블랏, 면역침강, ELISA 및 FACS 분석을 포함하는 공지의 다수의 방법에 의해 확립될 수 있다. FLT3 항체 또는 그의 단편은 검출가능한 마커로 표지되거나 두번째 분자와 콘쥬게이트될 수 있다. 적절한 검출가능한 마커는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 두 개 이상의 FLT3 에피토프에 대해 특이적인 이중 특이성 항체는 당업계에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 호모다이머 항체 역시 업계에 알려진 가교 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들면, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 CHv62.21로 표시되는 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체이다. CHv62.21의 중쇄는 서열번호 9의 1번째 잔기 (E) 내지 453번째 잔기 (K)의 범위인 아미노산 서열로 구성되고 CHv62.21의 경쇄는 서열번호 10 서열의 1번째 잔기 (D) 내지 214번째 잔기 (C)의 범위인 아미노산 서열로 구성된다. 상기 서열은 도 2A 및/또는 2B 및 도 3A 및/또는 3B에 도시되어 있다. 바람직한 구현예에서, CHv62.21은 비-천연 아미노산("nnAA")으로 변형되고 세포독성제에 콘쥬게이트된다. 일 구현예에서, nnAA는 pAF이다. 바람직한 구현예에서, 세포독성제는 nnAA에 특이적으로 콘쥬게이트 된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 9의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포;
(b) 서열번호 9의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포; 및
(c) 서열번호 9의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 항체를 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포;
(b) 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포; 및
(c) 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
CHv62.21로 표시된 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 2014년 12월 9일자로(Federal Express 통해) 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549의 American Type Culture Collection(ATCC)에 보내서 수탁번호 PTA- 121831를 부여받았다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 또 다른 구현예에서, FLT3에 결합하는 MAbs, 이 경우 MAb CHv62.21는 기술분야에 알려진 번역후 변형을 수행할 수도 있다. 번역후 변형의 비제한적인 예로는 화학적 변형, 예컨대 이황화 결합, 올리고당, N-말단 피로글루타메이트 변형, C-말단 리신 프로세싱, 탈아미드화, 이성질체화, 산화, 무효소 당화(glycation), 펩티드 결합 절단, 비환원성 가교, 트렁케이션 및 기타 공지의 것들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 문헌[Liu, et. al., Heterogeneity of Monoclonal Antibodies, J. Pharma. Sci. vol. 97, no. 7, pp. 2426-2447 (July 2008)] 참조. 기타 변형 유형은 비공유성 상호반응, 입체배열상의 이질성 및 응집(aggregation)을 포함한다. Id.
또 다른 구현예에서, CHv62.21 MAb는 잔기 1의 N-말단 중쇄 글루타민이 피로-글루타메이트로 고리화된 것을 포함한다. 통상의 기술자라면 이러한 고리화가 자연발생적으로 일어남을 이해 및 인식할 것이다. 문헌 [Dick, et. al., Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides, Biotechnology 및 Bioengineering, vol. 97, no. 3, pp 544-553 (June 15, 2007)] 참조.
부가적으로 또는 대안적으로, CHv62.21 MAb의 아미노산은 추가적인 번역후 변형, 예컨대 탈아미드화, 이성질체화, 무효소 당화 및/또는 산화 (그러나 이에 한정되지 않음)을 수행할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편은 글리코실화, 예컨대 기술분야에 공지인 N-연결 또는 O-연결된 글리코실화를 비롯한 추가적인 번역후 변형을 수행할 수도 있다. 전술한 바와 같이, 변화는 이러한 변경을 배제 또는 최소화하거나 또는 이러한 프로세싱이 이로운 환경에서 이를 용이하게 하도록 하는 프로세싱 조건 (예컨대 배양의 변화, 정제 및/또는 보관 조건) 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있다. 또한, 이러한 제조는 두 가지 이상의 프로세싱 관련 변형(들)의 변이를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 예컨대 폴리펩티드는 C-말단 리신의 일부, 대부분 또는 실제로 모두가 제거되었을 수 있고 및/또는 N-말단 아미노산의 일부, 대부분 또는 실제로 모두가 피로글루탐산으로 전환될 수 있다 (예컨대, 도 2A 및/또는 2B 또는 도 3A 및/또는 3B에 도시된 또는 컨센서스 서열 또는 항원-결합 단편들의 폴리펩티드). 완충 조성물 및 온도 변경과 같은 프로세스 조건은 이러한 변형에 어느 정도 유의적인 효과를 미칠 수 있다.
추가적인 구현예에서, CHv62.21 MAb는 서열번호 9의 잔기 453에서 C-말단 중쇄 리신의 트렁케이션을 포함한다.
추가적인 구현예에서, CHv62.21 MAb는 잔기 303에서 중쇄 아스파라긴에 글리코실화(들)의 부가를 포함하는데, 여기에는 G0 (아시알로-, 아갈락토, 아푸코실화 바이-안테나리 복합체형 N-글리칸; G0F (아시알로-, 아갈락토, 코어-푸코실화 바이-안테나리 복합체형 N-글리칸); 만노스-5 (N-연결된 올리고만노스-5); G1F(아시알로-, 모노갈락토, 코어-푸코실화 바이-안테나리 복합체형 N-글리칸); G2 (아시알로-, 바이갈락토, 아푸코실화 바이-안테나리 복합체형 N-글리칸); G2F (아시알로-. 바이갈락토, 코어-푸코실화 바이-안테나리 복합체형 N-글리칸); A1 (모노시알릴화, 바이안테나리 N-연결된 올리고당, Neu5Acid); 및/또는 A2 (디시알릴화, 바이안테나리 N-연결된 올리고당 Neu5Acid)이 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
또다른 구현예에서 부가적으로 또는 대안적으로, CHv62.21 MAb는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 세린 잔기에 무효소당화(glycation)(들)의 부가를 포함한다. 일반적으로 무효소당화는 리신 측쇄의 아민기 또는 N-말단 일차 아민과 환원당 사이의 비효소 반응으로부터 초래된다. 통상의 기술자라면 무효소당화가 리신 잔기의 측쇄 또는 N-말단 일차 아미노산기 상의 양전하를 차단하여, 항체를 보다 산성으로 만들것임을 이해 및 인식할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 공지기술에 의해 검정가능하며 (예컨대 질량 분광학) 본원에 개시된 서열과 동일할수도 (도 2A 및/또는 2B 및 도 3A 및/또는 3B 참조) 또는 번역후 변형 프로세싱의 결과로 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기에서 차이가 날 수도 있다. 비제한적인 예로서, 실제로 균질한 폴리펩티드의 일부 또는 전부에서 경쇄 또는 중쇄의 C-말단 아미노산이 단백질 가수분해 프로세싱 또는 기타 배양시 일어나는 프로세싱에 의해 제거될 수 있다. 마찬가지로, N-말단 아미노산이 부재할 수 있으며, 예컨대, 한개(1), 두개 (2), 세개 (3), 네개(4), 또는 다섯개(5)의 N-말단 아미노산이 부재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, CHv62.21 MAb의 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열 및 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1(E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb의 중쇄는 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 범위인 아미노산 서열, 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb 또는 이의 항원-결합 단편은 숙주 세포에서의 발현에 의해 수득된 단백질의 재조합-생산 혼합물로, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열 및 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb는 숙주 세포에서의 발현에 의해 수득된 단백질의 재조합-생산 혼합물로, 여기서 항체의 중쇄는 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 범위인 아미노산 서열, 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열, 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열, 및 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서 CHv62.21 MAb는 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열에서 1번째 E가 피로-글루타메이트로 전환된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb는서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb는는 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열에서 1번째 E가 피로-글루타메이트로 전환되고 C-말단 잔기 453번째 K가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21 MAb는 서열번호 9의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열에서 C-말단 잔기 453번째 K가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
본 발명의 추가적인 바람직한 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb, 및 구체적으로, CHv62.21로 지칭된 MAb는 중쇄에서 비-천연 아미노산("nnAA")으로 변형된다. 바람직한 구현예에서, 앰버 코돈(amber codon)은 파라-아세틸페닐알라닌으로 지칭된 nnAA의 삽입을 위해 서열번호 11의 아미노산 위치 124에 위치한다(도 3C). 변형된 CHv62.21는 본 발명의 목적에서 CHv62.21pAF로 지칭된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, CHv62.21pAF는 하기를 포함한다:
서열번호 11의 1번째 잔기(E) 내지 123번째 잔기(S) 잔기의 범위인 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 부위, 서열번호 10의 1번째 잔기(D) 내지 108번째 잔기(R) 잔기의 범위인 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 부위. 중쇄 가변 부위의 CDR1-3(Kabat)은 각각 서열번호 11의 31-35, 50-65, 및 95-102의 범위인 아미노산 서열로 구성되고, 경쇄 가변 부위의 CDR1-3(Kabat 또는 Chothia)은 각각 서열번호 10의 24-34, 50-56, 및 89-97의 범위인 아미노산 서열로 구성된다(도 3B, 도 3C 및 표 Ⅴ 참조).
서열번호 11의 잔기 124에 삽입된 파라-아세틸페닐알라닌의 nnAA를 갖는 서열번호 11의 1번째 잔기 (E) 내지 453번째 잔기 (K)의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 잔기 (D) 내지 214번째 잔기 (C)의 범위인 아미노산 서열로 구성된 CHv62.21의 경쇄.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 11의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포;
(b) 서열번호 11의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포; 및
(c) 서열번호 11의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 항체를 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(c) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 FLT3 MAb는 항체를 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(c) 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(d) 1번째 E가 피로글루타메이트로 변환된 서열번호 11의 1번째 E 내지 452번째 G의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb의 중쇄 가변 부위는 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb의 중쇄는 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 범위인 아미노산 서열, 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열, 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열, 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb 또는 이의 항원-결합 단편은 숙주 세포에서의 발현에 의해 수득된 단백질의 재조합-생산 혼합물로, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 부위는 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 123 (S)의 범위인 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb는 숙주 세포에서의 발현에 의해 수득된 단백질의 재조합-생산 혼합물로, 여기서 중쇄는 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 범위인 아미노산 서열, 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열, 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열, 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K)의 아미노산 서열에서 N-말단 잔기 1 (E)가 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄에서 1번째 E가 피로-글루타메이트로 변형된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄에서 1번째 E가 피로-글루타메이트로 변형되고 C-말단 잔기 453번째 K가 제거된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
또다른 구현예에서, CHv62.21pAF MAb는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄에서 C-말단 잔기 453번째 K가 제거된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
CHv62.21pAF로 지칭된 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 2014년 12월 9일자로(Federal Express 통해) 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549의 American Type Culture Collection(ATCC)에 보내서 수탁번호 PTA-121836을 부여받았다.
Ⅲ.) 일반적인 항체-약물 콘쥬게이트
다른 양상에서, 본 발명은 치료제에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 제공한다. 치료제는 세포독성제, 세포정지제, 화학치료제, 약물, 성장억제제, 독소 (예를들면 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성화된 독소 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 콘쥬게이트)일 수 있다. 다른 양상에서, 본 발명은 추가적으로 ADC의 사용방법을 제공한다. 일의 관점에서, ADC는 독소제 또는 검출가능제에 공유적으로 부착되거나 옥심 결합을 통해 부착된 상기 FLT3 MAb 중 임의의 것을 포함한다.
세포독성제 또는 세포정지제, 즉 암의 치료에서 종양세포를 죽이거나 저해하는 약물 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 및 Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev.26:151-172; 미국특허 4,975,278)의 국소 전달을 위한 항체-약물 콘쥬게이트의 사용은, 약물 모이어티의 종양에 대한 타켓화된 전달과 세포 내 축적을 가능하게 하여, 이들 비콘쥬게이트 약제의 시스템 투여로 인해 제거해야 할 종양 세포 뿐 아니라 정상 세포에 대해서도 수용불가능한 독성 수준을 초래할 수 있다(Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) Monoclonal Antibodies '84 에서 "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," : Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 따라서 최소 독성을 갖는 최대 효과가 추구된다. 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체는 모두 이들 전략에서 유리한 것으로 보고되고 있다. (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신(Rowland et al., (1986) supra)을 포함한다. 항체-독소 콘쥬게이트에 사용되는 독소는 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신 (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)와 칼리아미신 (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)과 같은 소분자 독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 저해를 포함하는 매커니즘에 의해 그들의 세포독성 및 세포정지 효과를 나타낼 수 있다. 일부 세포독소제는 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 콘쥬게이트될 때 비활성화되거나 활성이 작아지는 경향을 보인다.
추가적으로, 항-인간 FLT3 항체는 골수성 백혈병의 잠재적인 치료제로 일찍이 평가되어 왔다. 예를 들어, FLT3의 항체인 IMC-EB 10은 Imclone에 의해 개발되었다. 이 항체는 하류 키나제(MAPK, Akt 및 Stat5)의 FLT3 매개된 활성을 저해하는 리간드 차단제이다. 또한 항체는 인 비트로에서 백혈병 세포의 증식을 저해할 수 있고; 항체 의존성 세포성 독성(ADCC)를 통해 활동할 수 있는 것으로 알려져 있다. EB10은 단독으로 및 메토트렉세이트와 조합하여 치료되는 경우 백혈병 이종 이식편의 생존 연장을 유발한다(WO2009/155015 및 US2011/0008355 참조). 이 항체는 또한 인간 임상 실험(NCT00887926)에서 평가되었으나, 효능 부족으로 종료되었다. 또한 MMAF에 콘쥬게이트된 EB10이 ImClone에 의해 개발되었다(Proc Amer Assoc Cancer Res, Volume 46, 2005 참조).
FLT3에 대해 개발된 작동성 항체가 원시 조혈세포의 증식 및/또는 분화를 향상시킬 수 있음이 당업계에 공지되어 있다(WO 95/27062 참조).
생물학 외에도, 많은 소분자 저해제가 개발되었고 인간 임상 시험에서 시험되었다. 이러한 저해제의 대부분은 FLT3 및 다른 키나제를 타겟으로 하므로 FLT3 키나제 자체에는 특이적이지 않다. 많은 경우에, 이러한 저해제는 FLT3-ITD 및 아마도 FLT-TKD를 타겟으로 한다. 따라서, 어떠한 것도 야생형 FLT3 단독을 타겟으로 할 수 없다. 인간 임상 시험에 진입한 것으로 공지된 소분자 저해제는 다음과 같다:
미도스타우린 또는 PKC-412 (Novartis), 퀴자티닙 또는 AC220 (Ambit), 넥사바 (Onyx/Bayer), AZD1152 또는 바라세르팁 (Astrazeneca), 크레놀리닙 (Arog), 플렉시콘 (Daichii Sankyo), 및 ASP2215 (Astellas).
또한, 이황화 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 huC242 항체를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트인, 칸투주맙 메탄신 (Cantuzumab mertansine, Immunogen, Inc.)은 CanAg을 발현하는, 결장, 췌장, 위장 및 기타와 같은 암의 치료에 대한 2상 시험에 진입하였다.
또한, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)은 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 항전립성 특이 멤브레인 항원 (PSMA) 모노클로날 항체를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트로서, 전립선암의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다.
마지막으로, 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE), 도라스탄틴의 합성 유사체는 (암종에서 루이스 Y에 특이적) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 와 (혈액 종양에서 CD30에 특이적) cAC10에 콘쥬게이트된다. (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784).
MMAE에 콘쥬게이트된 CD30 MAb는 현재 ADCETRIS (Seattle Genetics, Bothell, WA)로서 상업적으로 이용가능하다. ADCETRIS (브렌툭시맙 베도틴)은 다음의 3 성분으로 이루어진 CD-30에 대한 항체 약물 콘쥬게이트이다: 1) 인간 CD30에 특이적인, cAC10이라 명명된 키메라 IgG1 항체, 2) 미세관 파괴제 MMAE, 및 3) MMAE를 caC10에 공유적으로 결합시키는 프로테아제-절단가능한 링커. ADCENTRIS 처방 정보 참조.
또한, ADC의 제조에 유용한 화학치료제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료제가 본원에 기술된다. 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (녹농균에서 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, α -사르신, 유동 (Aleurites fordii) 단백질, 디안신 (dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 솝워트 (sapaonaria officinalis) 저해제, 게로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)을 포함하는 효소적으로 활성인 독소와 그 단편이 이용될 수 있다. 예를 들면 1993년 10월 28일 발행된 WO 93/21232를 참조. 방사성 콘쥬게이트된 항체의 제조를 위해 다양한 방사성 핵종이 이용가능하다. 예시는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체와 세포독성제의 콘쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2- 피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (디메틸 아디피미데이트 HCl 등), 활성 에스테르 (디숙신이미딜 수베레이트 등), 알데히드 (글루타르알데히드 등), 비스-아지도 화합물 (비스(p-아지도벤조일)헥산디아민 등), 비스-디아조늄 유도체(비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민 등), 디이소시아네이트 (톨루엔 2,6-디이소시아네이트 등) 및 bis-활성 불소 화합물 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 등)과 같은 다양한 이기능성 단백질 결합제를 이용하여 만들어진다. 예를 들면, 리신 이뮤노톡신은 Vitetta et al (1987) Science, 238:1098에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14- 표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 핵종과 항체의 컨쥬게이션용 킬레이트제의 일예이다(WO94/11026).
항체와 하나 또는 그 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테킨 및 CC1065 및 독소 활성을 가지는 이들 독소의 유도체들의 콘쥬게이트도 역시 본원에 고려된다.
Ⅲ(A). 메이탄시노이드 (Maytansinoids)
메이탄시노이드 약물 모이어티로 사용하기에 적절한 메이탄신 화합물이 이 기술 분야에 공지되어 있고, 공지의 방법에 따라 천연 자원으로부터 분리되고, 유전자 공학 기법을 이용하여 제조될 수 있으며 (Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973 참조), 또는 공지의 방법에 따라 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 합성 제조될 수 있다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 고리, 예컨대 C-19-데클로로 (US 4256746) (안사미톡신 P2의 리튬 알루미늄 하이드리드 환원에 의하여 제조); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국특허번호 4,361,650 및 4,307,016) (스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 이용하여 탈메틸화에 의하여 제조 또는 LAH를 이용하여 탈클로로화에 의하여 제조); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실록시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국특허 4,294,757) (아실 클로라이드를 이용하여 아실화에 의하여 제조)를 가지는 것들 및 기타 위치가 변형된 것들을 포함한다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는, 예컨대 C-9-SH (미국특허 4,424,219) (H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의하여 제조); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(US 4331598); C-14-히드록시메틸또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (US 4450254) (노카르디아로부터 제조); C-15-히드록시/아실옥시 (US 4,364,866) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 변환에 의하여 제조); C-15-메톡시 (미국특허 4,313,946 및 4,315,929) (트레위아 누들플로라로부터 단리); C-18-N-데메틸 (미국특허 4,362,663 및 4,322,348) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의하여 제조); 및 4,5-데옥시 US 4,371,533) (메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의하여 제조)도 역시 포함한다.
메이탄시노이드를 함유하는 ADC, 이를 제조하는 방법 및 그들의 치료적 용도가 예컨대, 미국특허 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제6,441,163호 및 유럽 특허 EP 제0 425 235호 B1에 개시되어 있고, 이들 개시 사항이 본 명세서에 참조로 명확히 포함된다. 문헌 [Liu 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]은 인간의 대장암에 대한 모노클로날 항체 C242와 연결된 DM1으로 지정된 메이탄시노이드를 포함하는 ADC를 개시하고 있다. 콘쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대하여 크게 세포 독성이 있는 것으로 밝혀졌고 인 비보 종양 생장 실험에 있어서도 항암 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al, Cancer Research 52:127-131 (1992)]는 메
이탄시노이드가 인간 결장암 세포주의 항원에 결합하는 쥣과 항체 A7 또는 HER-2/neu 암유전자에 결합하는 또다른 쥣과 모노클로날 항체 TA.1에 이황화기 링커를 통하여 콘쥬게이트된 ADC를 기술한다. TA.1-메이탄시노이드 콘쥬게이트의 세포 독성을, 각 세포가 3 x 105의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에서 인 비트로 시험하였다. 약물 콘쥬게이트는 자유 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포 독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있었다. A7-메이탄시노이드 콘쥬게이트는 마우스에서 낮은 수준의 전신 세포 독성을 나타내었다.
Ⅲ(B). 아우리스타틴 및 돌로스타틴
일부 구현예에서, ADC는 돌로스타틴 또는 돌로스타틴의 펩티드 유사체 및 유도체인 아우리스타틴과 콘쥬게이트된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국특허 제5,635,483호; 제5,780,588호). 돌로스타틴 및 아우리스타틴은 미소세관 역학, GTP 가수분해 및 핵과 세포의 분열을 방해하는 것으로 알려져 있고 (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), 항암 활성 (미국특허 제5,663,149호) 및 항진균 활성(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 알려져 있다. 돌로스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통하여 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적 아우리스타틴의 구현예는 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함하고, "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004" 및 미국 공개 특허 제2005/0238649호에 개시되어 있고, 이들 기재는 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
통상적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편간의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예컨대 펩티드 화학 분야에 공지된 액체 상 합성법 (E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides" volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌로스타틴 약물 모이어티는 미국특허 제5635483호; 미국특허 제5780588호; [Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al Synthesis, 1996, 719-725]; [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]; 및 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]의 방법에 따라 제조될 수 있다.
Ⅲ(C). 칼리케아미신 (Calicheamicin)
또 다른 구현예에 있어서, ADC는 1개 이상의 칼리케아미신 분자와 콘쥬게이트된 본 발명의 항체를 포함한다. 항생제의 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 농도 아래에서도 이중 가닥 DNA 단절을 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 콘쥬게이트를 제조하기 위하여는, U.S. 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (모두 아메리칸 사이아나미드 컴퍼니의 특허)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체들은 γ1 I,α2 I,α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1 (Hinman et al, Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al, Cancer Research 58:2925-2928(1998) 및 전술한 아메리칸 사이아나미드의 U.S. 특허)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체가 콘쥬게이트될 수 있는 또 다른 항암 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA 모두는 세포 내 작용 위치에서 작용하며 쉽게 원형질막을 통과하지 못한다. 그러므로, 이들 제제의 항체 매개 인입을 통한 세포로의 흡수는 이들의 세포 독성 효과를 크게 증진시킨다.
Ⅲ(D). 기타 세포독성제
본 발명의 항체와 콘쥬게이트될 수 있는 다른 항암제는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, U.S. 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 개시되어 총괄적으로 LL-E33288 복합체로 알려진 제제들의 패밀리 및 에스페라마이신 (U.S. 특허 제5,877,296호)를 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그들의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (녹농균에서 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, α -사르신, 유동 (Aleurites fordii) 단백질, 디안신 (dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 솝워트 (sapaonaria officinalis) 저해제, 게로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)을 포함하는 효소적으로 활성인 독소와 그 단편이 이용될 수 있다. 예를 들면 WO 93/21232(1993년 10월 28일 발행)를 참조.
본 발명은 항체와 핵산 분해 활성을 가지는 화합물 (예컨대, 리보뉴클레아제 또는 데옥시리보뉴클레아제; DNase 등의 DNA 엔도뉴클레아제) 간에 형성된 ADC도 역시 고려한다.
종양의 선택적인 제거를 위하여, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사능 콘쥬게이트된 항체를 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 콘쥬게이트를 검출용으로 사용한다면, 학술용 방사성 원자를 포함할 수 있으며, 예컨대 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기공명 (NMR) 이미징 (자기공명 이미징으로도 알려져 있다, MRI)용 스핀 표지, 예컨대 이오딘-123, 이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 또는 기타 표지가 공지의 방법으로 콘쥬게이트에 포함될 수 있다. 예컨대, 적절한 아미노산 전구체를 포함하여 사용하는, 예컨대 수소 대신 불소-19를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의하여 펩티드를 생합성하거나 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내 시스테인 잔기를 통하여 부착될 수 있다. 이트리움-90은 리신 잔기를 통하여 부착될 수 있다. IODOGEN q방법 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57]이 이오딘-123을 포함시키는 데 사용될 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) ]에 다른 방법들이 자세히 개시되어 있다.
IV.) FLT3에 결합하는 항체-약물 콘쥬게이트 화합물
본 발명은 특히 치료제의 타겟된 전달을 위한 항체-약물 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명자들은 항체-약물 콘쥬게이트 화합물이 FLT3을 발현하는 세포에 대하여 강력한 세포 독성 및/또는 세포정지 활성을 가진다는 것을 발견하였다.
상기 항체 약물 콘쥬게이트는 FL이 FLT3에 결합하는 것을 차단하지 않으므로, 항체가 결합한 경우에도 FL이 FLT3를 통해 신호전달할 수 있다. 이러한 항체는 FL의 존재 하에서 감소되지 않은 세포 독성 활성을 나타낸다(FLT3에 대한 FL 결합을 차단하는 항-FLT3 항체 약물 콘쥬게이트는 FL의 존재 하에서 감소된 세포 독성을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 항-FLT3 약물 콘쥬게이트는 FLT3에 대한 FL의 결합을 실질적으로 저해하지 않는 것으로 본원에 기술된다.
항체-약물 콘쥬게이트 화합물은 하나 이상의 약물 유닛과 공유 결합으로 연결된 항체
유닛을 포함한다. 약물 유닛은 항체 유닛에 직접적으로 또는 링커 유닛(-LU-)을 통하여 공유적으로 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 약물 콘쥬게이트 화합물은 하기 구조식 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 갖는다:
L - (LU-D)P (I)
여기서:
L은 항체 유닛, 예를 들어, CHv62.21 또는 CHv62.21pAF와 같은 본 발명의 FLT3 MAb이고,
(LU-D)는 링커 유닛-약물 유닛 모이어티이고, 여기서:
LU-는 링커 유닛이고,
-D는 타겟 세포에 대해 세포정지 또는 세포 독성 활성을 갖는 약물 유닛이고;
p는 1 내지 20 범위이다.
일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구현예에서, p는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지4 또는 2 내지 3의 범위이다. 일부 구현예에서, p는 2 또는 4이다. 일부 구현예에서, p는 정수이다. 다른 구현예에서 p는 약물 대 항체 비율의 평균으로 측정되고 정수이거나 또는 비-정수일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 약물 콘쥬게이트 화합물은 하기 구조식 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 갖는다:
L - (Aa-Ww-Yy-D)p (Ⅱ)
여기서:
L은 항체 유닛, 예를 들어, CHv62.21 또는 CHv62.21pAF와 같은 FLT3 MAb이고;
-Aa-Ww-Yy-는 링커 유닛(LU)이고, 여기서:
-A-는 스트레처 유닛(Stretcher unit),
a는 0 또는 1 또는 2 또는 3,
-W-는 각각 독립적으로 아미노산 유닛,
w는 0 내지 12 범위의 정수,
-Y-는 자기 희생적 스페이서 유닛(self-immolative spacer unit),
y는 0, 1 또는 2이고;
-D는 타겟 세포에 대해 세포정지 또는 세포 독성 활성을 갖는 약물 유닛이고;
p는 1 내지 20인 정수이다.
일부 구현예에서, a는 0 또는 1, w는 0 또는 1, 및 y는 0, 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, a는 0 또는 1, w는 0 또는 1, 및 y는 0 또는 1이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구현예에서, p는 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3의 범위이다. 다른 구현예에서, p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, p는 2 또는 4이다. 일부 구현예에서, w가 0이 아닌 경우, y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, w가 1 내지 12인 경우, y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, w는 2 내지 12이고 y는 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, a는 1이고 w 및 y는 0이다.
다수의 항체를 포함하는 조성물용으로, 약물량 (drug loading)은 p, 항체당 평균 약물 분자수로 나타낸다. 약물량은 항체당 1 내지 20 약물 (drugs, (D))의 범위이다. 콘쥬게이션 반응의 제조에 있어서 항체당 평균 약물 수는 질량 분광법, ELISA 분석법 및 HPLC 등의 종래 수단에 의하여 파악될 수 있다. p에 관하여도 항체-약물 콘쥬게이트의 정량적 분포 역시 결정할 수 있다. 몇 가지 예로서, 다른 약물량을 가지는 항체-약물 콘쥬게이트로부터 특정 p값을 가지는 균질 항체-약물 콘쥬게이트를 단리, 정제 및 특징화하는 것은 역상 HPLC 또는 전기 영동 방법으로 이루어질 수 있다. 예시적인 구현예에 있어서, p는 2 내지 8이다.
항체-약물 콘쥬게이트 화합물의 생성은 숙련된 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 간단히, 항체-약물 콘쥬게이트 화합물은 항체 유닛으로서 본 발명의 FLT3 MAb, 약물 및 선택적으로 약물에 연결되는 링커 및 결합제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 전술된 CHv62.21로 지정된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는 FLT3 MAb이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 전술된 CHv62.21pAF로 지정된 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 FLT3 MAb이다(구조식 (I) 참조).
다양한 많은 반응을, 약물 및/또는 링커와 결합제의 공유적 결합에 이용할 수 있다. 이것은 종종 결합제의 아미노산 잔기의 반응에 의하여 이루어질 수 있으며, 예컨대 항체 분자, 예컨대 리신의 아민기, 글루탐산 및 아스파르트산의 자유 카르복실산기, 시스테인의 술프히드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티 등이다. 공유 결합에 가장 흔하게 사용되는 불특정 방법 중 하나는 화합물의 카르복시기 (또는 아미노기)를 항체의 아미노기 (또는 카르복시기)와 연결시키는 카르보디이미드 반응이다. 더욱이, 이기능성 제제들, 예컨대 디알데히드 또는 이미도에스테르는 화합물의 아미노기와 항체 분자의 아미노기를 연결시키는 데 사용된다. 쉬프 (Schiff) 염기 반응도 역시 약물과 결합제의 부착에 이용된다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 함유하는 약물의 과요오드산염 산화를 수반하고, 그러므로 알데히드를 형성하여 결합제와 뒤이어 반응하게 된다. 결합은 결합제의 아미노기를 가지는 쉬프 베이스의 형성을 통하여 일어난다. 이소티아사이아네이트도 역시 약물과 결합제의 공유적 결합을 위한 커플링제로 사용될 수 있다. 기타의 방법들이 본 발명의 범위 내에서 당업자에게 알려져 있다.
특정 구현예에서, 링커의 전구체인 중간생성물은 적절한 조건 하에서 약물과 반응한다. 특정 구현예에서, 반응기는 약물 및/또는 중간생성물 상에서 사용된다. 그 후 약물과 중간생성물 사이의 반응 산물, 또는 유도된 약물은 적절한 조건 하에서 FLT3 MAb와 반응한다.
V.) 링커 유닛
전형적으로, 항체-약물 콘쥬게이트 화합물은 약물 유닛과 항체 유닛 사이에 링커 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 세포 내 조건 하에서는 절단될 수 있어서, 링커의 절단에 의하여 세포 내 환경에서 항체로부터 약물 유닛을 방출한다. 또 다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단될 수 없고 약물은, 예컨대 항체 분해에 의하여 방출된다.
일부 구현예에서, 링커는 세포 내 환경 (예컨대, 리소좀 또는 엔도좀 또는 포낭)에 존재하는 절단제(cleaving agent)에 의하여 절단될 수 있다. 링커는, 펩티다제 또는 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 내 프로테아제 효소에 의해서 절단되는 펩티딜 링커이다. 링커는 또한 세포 외 환경 내 (예컨대, 세포 막 또는 조직 공간 부근 내) 존재하는 절단제에 의해서 절단될 수 있다. 링커는 예를 들어, 세포외 펩티다제 또는 카텝신 패밀리 효소 또는 매트릭스 메탈로프로테나제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 2 이상의 아미노산 길이 또는 3 이상의 아미노산 길이이다. 바람직한 구현예에서, 펩티딜 링커는 1 이상의 아미노-옥시산 유닛(Ambrx, Inc., La Jolla, CA)을 함유한다. 절단제는 당업계에 공지된 약물을 포함할 수 있다(예컨대 Dubowchik and Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123 및 미국특허: 6,214,345호 참조). 치료제의 세포 내 단백질 가수분해적 방출의 하나의 이익은 약물이 콘쥬게이트되는 경우 전형적으로 약화되고 콘쥬게이트의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
다른 구현예에서, 절단 가능한 링커는 pH-반응성이다, 즉, 특정 pH 값에서 가수분해에 반응성이다. 전형적으로 pH-반응성 링커는 산성 조건 하에서 가수분해될 수 있다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산-불안정 링커(예를 들면, 옥심, 히드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니트 아미드, 오르토에테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm.Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661. 참조) 그러한 링커들은 혈액과 같은 중성 pH 조건 하에서 상대적으로 안정하지만, 리소좀의 근사 pH인 pH 5.5 미만 또는 5.0에서는 불안정하거나 덜 안정하다. 일부 구현예에서, 가수분해가능한 링커는 티오에테르 링커 (예를 들어, 아실히드라존 결합을 통해 치료제에 결합된 티오에테르)이다 (예를 들어, 미국특허 5,622,929 참조).
또다른 구현예에서, 링커는 당업계에 알려진 환원 조건 하에서 절단가능하다 (예를 들어, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987 참조. 또한 미국특허 4,880,935. 참조). 링커는 또한 세포 내적 (또는 세포 외적)에서 발견되는 환원 조건 하에서 절단될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 특정 링커 N-O 결합은 형식적으로 감소되고 붕괴되어 링커의 절단을 야기한다.
또다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단가능하지 않고 약물은 항원 분해에 의해서 방출된다(본원에 이의 전체로서 그리고 모든 목적을 위하여 참조로 포함된 PCT 특허 W02012/166560 (Ambrx, Inc.) 참조).
다른, 비-상호배타적인 구현예에서, 링커는 당업계에 공지된 바와 같이 내재화를 촉진한다.
본 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 종류의 예시적인 링커들이 WO 2004/010957, 미국특허 2006/0074008, 미국특허 20050238649, 및 미국특허 2006/0024317에 기술되어 있다(이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 LU는 AGL로 지칭되고 보통 2-(아미노옥시)아세트산 또는 C2H5N03로 알려져 있다.
VI.) 스트레처 유닛(The Stretcher unit)
스트레처 유닛(A)이 존재하는 경우 항체 유닛이 존재하는 경우, 아미노산 유닛(-W-)에, 존재하는 경우, 스페이서 유닛(-Y-)에; 또는 약물 유닛(-D)에 결합할 수 있다. FLT3 MAb에 존재할 수 있는 유용한 작용기 (예컨대, CHv62.21 또는 CHv62.2lpAF)의 비제한적인 예로는 천연의 것이거나 또는 화학 합성된 것이거나, 케토, 알데히드, 술프히드릴, 아미노, 히드록실, 탄수화물의 아노머형 히드록시기 및 카르복실을 포함할 수 있다. 적절한 작용기는 케토, 알데히드, 술프히드릴, 및 아미노이다. 일 예에서, 케토기는 본 발명의 Mab에 포함된 비-천연 아미노산(nnAA) 상에 있다. 추가적인 예에서, 알데히드기는 본 발명의 Mab에 포함된 nnAA 상에 있다. 또다른 예에서, 술프히드릴기는 FLT3 MAb의 분자내 이황화 결합을 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 술프히드릴기는 FLT3 MAb의 리신 부분의 아미노기를 2-이미노티올란(Traut 시약) 또는 다른 술프히드릴 발생 시약과 반응시킴으로써 만들 수 있다. 특정 구현예에서, FLT3 MAb는 재조합 항체이며 하나 이상의 리신을 보유하기 위해 조작될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 재조합 FLT3 MAb는 부가적인 술프히드릴기를 보유하기 위해, (예컨대 부가적인 시스테인) 조작될 수 있다.
일 구현예에서, 스트레처 유닛은 항체 유닛의 카토기와 옥심 결합을 형성한다. 케토기는 Mab 내에 포함된 nnAA 상에 존재한다.
모든 예시적인 구현예로부터 굳이 명시되지 않은 경우에도, 항체 하나에 1 내지 20개의 약물 모이어티가 결합될 수 있는 것으로 이해된다 (p=1-20).
아미노산 유닛
아미노산 유닛 (-W-)은, 존재하는 경우, 스페이서 유닛이 존재하는 경우 스트레처 유닛을 스페이서 유닛에 결합시키고, 스페이서 유닛이 부존재하는 경우 스트레처 유닛을 약물 모이어티에 결합시키고, 스트레처 유닛 및 스페이서 유닛이 부존재하는 경우 항체 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다.
Ww-는, 예를 들어, 모노펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 유닛일 수 있다. 각각의 -W- 유닛은 독립적으로 하기에 대괄호 안에 표시된 구조식을 갖지며, w는 0 내지 12 범위의 정수이다:
Figure pct00004
, 또는
Figure pct00005
여기서 R19는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-히드록시벤질, -CH20H, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2 , 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 참조를 위하여, 본원에 참조로서 완전히 포함된, US2014/0072586 & W02012/047724 참조.
특정 구현예에서, 아미노산 유닛은 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 아미노산은 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 유닛은 함 또는 종양-관련 프로테아제를 포함하는 하나 또는 그 이상의 효소에 의해서 효소적으로 절단되어 약물 유닛 (-D)을 해방시킬 수 있고, 이는 일 구현예에서 인 비보에서 방출시에 양성자화되어 약물 (D)을 제공한다.
아미노산 유닛의 일 태양에서, 아미노산 유닛은 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit)이다. 또다른 태양에서, 아미노산 유닛은 페닐알라닌-리신(즉, fk)이다. 아미노산 유닛의 또다른 태양에서, 아미노산 유닛은 N-메틸발린-시트룰린이다.
VII.) 스페이서 유닛(The Spacer Unit)
스페이서 유닛 (-Y-)은, 존재할 경우, 아미노산 유닛이 존재하는 경우 아미노산 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다. 대안적으로, 스페이서 유닛은 아미노산 유닛이 부존재하는 경우 스트레처 유닛을 약물 유닛에 결합시킨다. 스페이서 유닛은 또한 아미노산 유닛 및 스트레처 유닛이 부존재하는 경우 약물 유닛을 항체 유닛에 결합시킨다. 스페이서 유닛의 일반적인 두 가지 유형은: 비 자기-희생적(non self-immolative) 또는 자기-희생적(self-immolative)이다. 본 발명의 가능한 스페이서의 예는 당업계에 알려져있다. Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872 및 Nature Biotechnology 21(7):778- 784) 참조.
비 자기-희생적 스페이서의 다른 예는, 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(Hay et al., 1999, Bioorg . M ed. Chem . Lett . 9:2237) 및 올소 또는 파라-아미노벤질아세탈과 같은 PAB 군과 전자적으로 유사한 방향족 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드(Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), 적절하게 치환된 비사이클로[2.2.1] 및 비사이클로[2.2.2] 고리 시스템(Storm et al., 1972, J. Amer . Chem . Soc . 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(Amsberry et al., 1990, J. Org . Chem. 55:5867)와 같은 아미드 결합 가수분해시 고리화를 거치는 스페이서를 사용할 수 있다. 글리신의 a-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거(Kingsbury et al., 1984, J. M ed. Chem . 27: 1447) 또한 자기-희생적 스페이서의 예이다.
VIII.) 약물 유닛
약물 유닛 (D)은 임의의 치료제일 수 있다. 예를 들어, 약물 유닛은 세포독성제, 세포정지제 또는 면역조절제(예를 들어, 면역억제제) 또는 화학치료제일 수 있다. D는 (존재하는 경우) 스페이서 유닛, (존재하는 경우) 아미노산 유닛, (존재하는 경우) 스트레처 유닛 또는 항체 유닛과 결합을 형성할 수 있는 원자를 갖는 약물 유닛(모이어티)이다. 일부 구현예에서, 약물 유닛 D는 (사용되는 경우) 스페이서 유닛과 결합을 형성할 수 있는 질소 원자이다. 본 발명에서 사용된 용어 "약물 유닛"과 "약물 모이어티"이라는 용어는 동의어이며 호환적으로 사용된다.
세포독성제 또는 면역조절제의 유용한 부류는, 예를 들어, 항튜뷸린제, DNA 마이너 그루브 바인더, DNA 복제 억제제 및 알킬화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물은 아우리스타틴 E(당업계에서는 돌로스타틴-10의 유도체라고도 알려져있다)와 같은 아우리스타틴 또는 그의 유도체이다. 다른 전형적인 아우리스타틴은 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조가 본원에 전체로서 및 모든 목적을 위해 참조로 포함된 미국특허 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; 및 4,486,414에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 약물 유닛은 칼리키아미신(calicheamicin), 캄토테신(camptothecin), 마이타시노이드(maytansinoid), 또는 안트라사이클린(anthracycline)이다. 일부 구현예에서, 약물은 탁산(taxane), 토포이소머라제 저해제, 일일초알칼로이드(vinca alkaloid) 등이다.
일부 전형적인 구현예에서, 적절한 세포독성제는 예를 들어, DNA 마이너 그루브 바인더(예를 들어, 에네디인(enediynes) 및 렉시트롭신(lexitropsins), CBI 화합물; 또한 미국특허 6,130,237 참조), 듀오카마이신, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 퓨로마이신, 및 일일초알칼로이드를 포함한다. 다른 세포독성제는, 예를 들어, CC-1065, SN-38, 포토테칸, 포르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노포르폴리노-독소루비신, 에키노마이신. 콤브레타스타틴, 네트롭신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 디스코덜모라이드(discodermolide), 엘루테로빈(eleutherobin), 및 미톡산트론을 포함한다.
일부 구현예에서, 약물은 항튜뷸린제이다. 항튜뷸린제의 예는, 아우리스타틴, 탁산(예를 들어, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik) 및 일일초알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈)을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포독성제는 항튜뷸린제의 또다른 군인 마이탄시노이드(maytansinoid)이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마이탄시노이드는 마이탄신 또는 DM-1(ImmunoGen, Inc.; 또한 Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131 참조)이다.
특정 구현예에서, 세포독성제 또는 세포정지제는 돌로스타틴이다. 특정 구현예에서, 세포독성제 또는 세포정지제는 아우리스타틴 유형이다.
추가적인 구현예에서, 약물 유닛은 새로운 돌라프로인(dolaproine)-돌라이소류신(dolaisoleuine) 펩티드 유사체이다. 따라서, 본원은 구조식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00006
여기서
R 1 및 R2 는 각각 독립적으로 -H 또는 알킬;
X는 -O-, -NRz-, -S-, 또는 부존재이다;
여기서 Rz는 -H 또는 알킬;
R3 은
Figure pct00007
의 기이고;
여기서 R 15 및 R 16 은 각각 독립적으로 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, 알킬, 알케닐, 알키닐, - 알킬-OH, -알킬-NH2, -알킬-SH, 또는 -알킬-N3;
R4는
Figure pct00008
의 기이고;
여기서 R 17 및 R 18 은 각각 독립적으로 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, -C02H, 알킬, 알케닐, 알키닐, -알킬-OH, -알킬-NH2, -알킬-SH, -알킬-N3 또는 -알킬-C02H,
R5는 sec-부틸 또는 이소부틸;
R6은 -H 또는 알킬;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 -H, 알킬, -CO2Ra, CONRbRc, 치환 또는 비치환 페닐, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클고리이고;
여기서 Ra는 -H 또는 알킬;
Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;
R9는 -H 또는 알킬; 또는 R9는 R4 및 이들이 결합된 원자와 함께 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬고리를 형성하고;
R10은 -H 또는 알킬;
R11은 -H 또는 알킬;
R12는 -H 또는 알킬;
R13은 -H 또는 알킬; 및
R14는 -H, -OH 또는 알킬;
X가 부존재하고 R15, R16, R17 및 R18이 각각 메틸인 경우, R8은 치환 또는 비치환 페닐, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클고리이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 -H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6 알킬이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 -H 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 알킬이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 모두 메틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 모두 -H이다.
일부 구현예에서, X는 부존재이다. 다른 구현예에서, X는 -O-이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 알킬이고, X가 부존재이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2가 모두 메틸이고, X가 부존재이다. 다른 구현예에서, R1 및 R2가 모두 -H이고, X가 -O-이다. 일부 구현예에서, X가 -NRZ,이고, 여기서 RZ가 -H 또는 알킬이다. 일부 구현예에서, RZ가 -H이다. 일부 구현예에서, X가 RZ가 알킬, 예를 들어 C1- 6 알킬 또는 메틸이다.
특정 구현예에서, R3은
Figure pct00009
이고, 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, 알킬, 알케닐, 알키닐, -알킬-OH, -알킬--NH2, -알킬-SH, 또는 -알킬-N3이다. 또다른 구현예에서, R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, 알킬, -(CH2)0-6C=CH, -(CH2)0- 6CH=CH2, -(CH2)0- 6OH, -(CH2)0- 6NH2, -(CH2)0- 6SH, 또는 -(CH2)0- 6N3이다. 일부 구현예에서, R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 알킬이다. 일부 구현예에서, R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, R15는 -OH이고 R16은 수소이다. 일부 구현예에서, R15는 -OH이고 R16은 메틸이다.
특정 구현예에서, R3은 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태(stereochemical configuration)이다. 다른 구현예에서, R3은 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다. 특정 구현예에서, R3기 자체는 하나 또는 그 이상의 카이랄 중심을 함유하고, 이들 입체중심은 각각 독립적으로 R 또는 S 형태이다.
특정 구현예에서, R4는
Figure pct00010
이고, 여기서 R17 및 R18은 각각 독립적으로 여기서 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, -CO2H, 알킬, 알케닐, 알키닐, -알킬-OH, -알킬-NH2, -알킬-SH, -알킬-N3 또는 -알킬-CO2H.이다. 다른 구현예에서, R4는
Figure pct00011
이고, 여기서 R17은 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, -CO2H, 알킬, 알케닐, 알키닐, -알킬-OH, -알킬-NH 2, -알킬-SH, -알킬-N3 또는 -알킬- CO2H이고, R18은 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, -C02H, 알케닐, 알키닐, -알킬-OH, -알킬-NH2, -알킬-SH, -알킬-N3 또는 -알킬-CO2H이다. 또다른 구현예에서, R17 및 R18은 각각 독립적으로 H, 알킬, -(CH2)0- - 6C:=CH, -(CH2)0- 6CH=CH2, -(CH2)0- 6OH, -(CH2)0- 6NH2, -(CH2)0- 6SH, 또는 -(CH2)0- 6N3. 일부 구현예에서, R 17 및 R 18 은 각각 독립적으로 -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, -CO2H, 알킬, -알킬-NH2, 또는 -알킬-N3이다. 일부 구현예에서, R 17 및 R 18 은 각각 독립적으로 -H, -OH, -NH2, -SH, - N3, -CO2H, 메틸, -CH2NH2, 또는 -CH2N3이다.
특정 구현예에서, R4는 R9 및 이들이 결합된 원자와 함께 치환 또는 비치환 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬고리를 형성한다. 특정 구현예에서, R4는 R9 및 이들이 결합된 원자와 함께 5- 내지 7-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 이는 -OH, -NH2, -SH, 및 -N3으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클로알킬 고리는 피롤리딘 고리이고, 이는 -OH, -NH2, -SH, 및 -N3으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다.
특정 구현예에서, R4는 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태(stereochemical configuration)이다. 다른 구현예에서, R4는 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다. 특정 구현예에서, R4기 자체는 하나 또는 그 이상의 카이랄 중심을 함유하고, 이들 입체중심은 각각 독립적으로 R 또는 S 형태이다.
특정 구현예에서, R5는 sec-부틸이다. 다른 구현예에서, R5는 이소부틸이다. 특정 구현예에서, R5는 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태(stereochemical configuration)이다. 다른 구현예에서, R5는 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다. 일부 구현예에서, R5기 내의 카이랄 중심은 R 형태이고, 다른 구현예에서, 중심은 S 형태이다.
특정 구현예에서, R6은 -H이다. 다른 구현예에서, R6은 알킬, 예를 들어 C1- 8 알킬, C1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다.
일부 구현예에서, R7 및 R8은 각각 독립적으로 -H, 알킬, -C02Ra 또는 -CONRbRc이고; 여기서 Ra 는 -H 또는 알킬, 예를 들어 C 1- 6알킬 또는 메틸; 및 Rb 및 Rc 는 각각 독립적으로 -H 또는 알킬, 예를 들어 C 1- 6알킬 또는 메틸이다.
특정 구현예에서, R7 및 R8은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 페닐 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 고리이고, 여기서 페닐 또는 헤테로사이클릭 고리는 할로, 옥소, 히드록시, 아미노, 알킬, 및 알콕시로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기로 치환될 수 있다. 특정 다른 구현예에서, R7은 비치환된 3- 내지 8-환 헤테로사이클릭 고리이다. 특정 다른 구현예에서, R7은 치환된 3- 내지 8-환 헤테로사이클릭 고리이다. 특정 다른 구현예에서, R8은 선택적으로 할로로 치환된 페닐이다.
특정 구현예에서, R7은 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태이다. 다른 구현예에서, R7은 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다.
특정 구현예에서, R8은 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태이다. 다른 구현예에서, R8은 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다.
일부 구현예에서, R7은 -C02Ra -CONRbRc; 테트라졸릴 또는 티아졸릴이고, 여기서 Ra 는 -H 또는 알킬, 예를 들어, C 1- 6알킬 또는 메틸이고; Rb 및 Rc 는 각각 독립적으로 -H 또는 알킬, 예를 들어 C 1- 6알킬 또는 메틸이고; R8 은 선택적으로 할로로 치환된 페닐이다.
일부 구현예에서, R9는 -H이다. 다른 구현예에서, R9는 알킬, 예를 들어 C 1- 8알킬, C 1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R9는 -H 또는 메틸이다. 다른 구현예에서, R9는 메틸이다.
다른 구현예에서, R10은 -H이다. 다른 구현예에서, R10은 알킬, 예를 들어 C 1-8알킬, C 1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R10은 -H 또는 메틸이다. 다른 구현예에서, R10은 메틸이다.
다른 구현예에서, R11은 -H이다. 다른 구현예에서, R11은 알킬, 예를 들어 C 1-8알킬, C 1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R11은 -H 또는 메틸이다. 다른 구현예에서, R11은 메틸이다.
다른 구현예에서, R12는 -H이다. 다른 구현예에서, R12는 알킬, 예를 들어 C 1-8알킬, C 1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R12는 -H 또는 메틸이다. 다른 구현예에서, R12는 메틸이다.
다른 구현예에서, R13은 -H이다. 다른 구현예에서, R13은 알킬, 예를 들어 C 1-8알킬, C 1- 4알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R13은 -H 또는 메틸이다. 다른 구현예에서, R13은 메틸이다.
다른 구현예에서, R14는 -H이다. 다른 구현예에서, R14는 알킬, 예를 들어 C 1-6알킬, 메틸, 또는 에틸이다. 다른 구현예에서, R14는 -OH이다.
특정 구현예에서, R14는 분자의 나머지에 대하여 R 입체화학적 형태이다. 다른 구현예에서, R14는 분자의 나머지에 대하여 S 입체화학적 형태이다.
일부 구현예에서, R7은 -C02Ra이고, 여기서 Ra는 -H 또는 알킬, 예를 들어 C1-6알킬 또는 메틸; R8은 페닐이고; R14는 -H이다. 일부 구현예에서, R7은 -CONRbRc이고, 여기서 Rb 및 RC은 각각 독립적으로 -H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸; R8은 페닐이고; R 14은 -H이다. 일부 구현예에서, R7은 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸; R8은 페닐이고; R 14는 -OH이다. 일부 구현예에서, R7는 메틸, R8은 페닐, 및 R 14는 -OH이다. 일부 구현예에서, R7 및 R14는 모두 -H이고, R8은 피기디닐, 피페리디닐, 비치환 페닐, 또는 할로, 예를 들어 플루오로, 클로로 또는 브로모로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R7은 -C02Ra이고, 여기서 Ra는 -H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸; R8은-H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸이고; R14는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬, 메틸 또는 에틸이다. 일부 구현예에서, R7은 -C02Ra이고, 여기서 Ra는 -H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸; R8은-H 또는 알킬, 예를 들어 C1- 6알킬 또는 메틸이고; R14는 -OH이다.
특정 구현예에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 C1- 6알킬;
X는 -O- 또는 부존재;
R3은
Figure pct00012
이고; 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 C1- 6알킬;
R4는
Figure pct00013
이고; 여기서 R17은 OH, -NH2, -SH, -N3, -CO2H, -C 1- 6알킬-NH2, 알키닐, 알케닐, 또는 C1- 6알킬-N3이고; R18은 -H 또는 C1- 6알킬;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -H, C 1- 6알킬, -CO2Ra, -CONRbRc, 테트라졸릴 또는 티아졸릴; 여기서 Ra은 -H 또는 C 1 _ 6알킬이고; Rb 및 Rc은 각각 -H 또는 C1-6알킬l;
R8은 -H, C 1_ 6알킬, 치환 또는 비치환 페닐 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 고리; R9는 -H;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 C 1_ 6알킬이고; R14는 -H, C 1_ 6알킬 또는 -OH이다.
특정 구현예에서,
R 1 및 R2은 각각 독립적으로 -H 또는 메틸;
X 는 -O- 또는 부존재;
R3은
Figure pct00014
이고, 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 메틸;
R4는
Figure pct00015
이고 여기서 R17은 -OH, -NH2, -SH, -N3, -CO2H, 아미노메틸, 알키닐, 알케닐, 또는 아지도메틸이고; R18은-H 또는 메틸l;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -H, 메틸, -CO2Ra, 또는 -CONRbRc이고; 여기서 Ra은 -H 또는 메틸이고; Rb 및 Rc은 각각 -H 또는 메틸;
R8은 -H, 메틸, 에틸, 피리디닐, 피페리디닐, 비치환 페닐, 할로로 치환된 페닐;
R9는 -H-;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 메틸이고;
R14는 -H, 메틸 또는 -OH이다.
특정 구현예에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 C1- 6알킬;
X 는 부존재;
R3은
Figure pct00016
이고; 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 C1- 6알킬;
R4는
Figure pct00017
이고; 여기서 R17은 -N3, 및 R18은 -H 또는 메틸;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -H, C1- 6알킬, -CO2Ra, -CONRbRc, 테트라졸릴 또는 티아졸릴; 여기서 Ra는 -H 또는 C1- 6알킬이고; Rb 및 Rc는 각각 -H 또는 C 1- 6알킬;
R8은 -H, C1- 6알킬, 치환 또는 비치환 페닐 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 고리;
R9는 -H;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 C1- 6알킬이고;
R14는 -H, C1- 6알킬 또는 -OH이다.
특정 구현예에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 C1- 6알킬;
X는 -O-;
R3은
Figure pct00018
이고 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 -H, -OH, 또는 C1- 6알킬;
R4는
Figure pct00019
이고; 여기서 R17은 -N3, 및 R18은 -H 또는 메틸;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -H, C1- 6알킬, -CO2Ra, -CONRbRc, 테트라졸릴 또는 티아졸릴; 여기서 Ra는 -H 또는 C1- 6알킬이고; Rb 및 Rc는 각각 -H 또는 C 1- 6알킬;
R8은 -H, C1- 6알킬, 치환 또는 비치환 페닐 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 고리;
R9는 -H;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 C1- 6알킬이고;
R14는 -H, C1- 6알킬 또는 -OH이다.
구조식 (I)의 일부 구현예에서, 여기서,
R1 및 R2는 각각 메틸;
R3은 구조식:
Figure pct00020
의 기;
여기서 R15 및 R16은 각각 메틸;
R4는 구조식:
Figure pct00021
의 기;
여기서 R17은 -N3, -NH2, -OH, -SH이고 R18은 -H 또는 메틸;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -C02Ra 또는 CONRbRc이고,
여기서 Ra는 -H 또는 C1- 6알킬;
Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 H 또는 C1- 6알킬;
R8은 페닐;
R9은 -H;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 메틸이고;
R14는 -H이다.
구조식 (I)의 일부 구현예에서, 여기서,
R1 및 R2는 각각 -H;
X는 -O-;
R3은 구조식:
Figure pct00022
의 기;
여기서 R15 및 R16은 각각 메틸;
R4는 구조식:
Figure pct00023
의 기;
여기서 R17은 -N3이고 R18은 -H 또는 메틸;
R5는 sec-부틸;
R6은 -H;
R7은 -C02Ra 또는 CONRbRc,
여기서 Ra는 -H 또는 C1- 6알킬;
Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 H 또는 C1- 6알킬;
R8은 페닐;
R9은 -H;
R10, R11, R12, 및 R13은 각각 독립적으로 메틸이고;
R14는 -H이다.
본원에서 제공된 임의의 다양한 기의 정의는 본원에서 제공된 임의의 다른 다양한 기의 정의와 조합하여 사용될 수 있으므로, 화학적으로 실현가능한 경우, 본원에 제공된 다양한 기의 모든 가능한 조합 및 치환이 고려될 수 있음이 이해된다.
특정 구현예에서, 구조식 (I)의 화합물은 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)- l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-3-히드록시-N-메틸프로판이미도)-3-메톡시-5-메틸펩타노일)피롤리딘피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판이미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)- l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-2-(디메틸아미노)-N-((S)-3-히드록시-l-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드;
(2S,3R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S)-2-(디메틸아미노)-N-((2S)-3-히드록시-l-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((2S)-2-((1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피페리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드;
(2S,3R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((2S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피페리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디 메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3- 메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸프로판아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3- 메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-N-((S)-3-아미노-l-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)- l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄아미드;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸프로판아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3- 메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-2-((S)-2-(아미노옥시)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸부탄아미드;
((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시프로판아미도)-N,3-디메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2- 메틸프로파노일)-L-페닐알라닌;
((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시부탄이미도)-N,3-디메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌;
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익애씨드;
(S)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1- 메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((2S,3R)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시부탄이미도)-N,3-디메틸부탄아미드;
(S)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시프로판아미도)-N,3-디메틸부탄아미드;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-메르캅토-N-메틸프로판아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-메르캅토-N-메틸프로판아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익애씨드;
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-메틸프로판아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익애씨드;
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2- 메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익애씨드;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시프로판아미도)-N,3-디메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(디메틸아미노)-3-히드록시부탄이미도)-N,3-디메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트;
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노익애씨드;
(2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(펜에틸아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-l-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-l-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(펜에틸아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-l-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-l-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-l-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아미노-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아미노-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(S)-4-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(펜에틸아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(S)-4-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-l-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(S)-4-아미노-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((lR,2R)-3-((4-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(S)-4-아미노-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-클로로펜에틸)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸펜트-4-인아미노)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-((2-(피리딘-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-(tert-부틸아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3- 메톡시-2-메틸프로파노일)-L-발리네이트;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-6-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸헥산아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,4S)-4-아지도-l-(디메틸-L-발릴)-N-메틸피롤리딘-2-카르복스아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일-L-페닐알라닌에이트;
(S)-3-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-4-(((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-3-(((S)-l-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)(메틸)아미노)-4-옥소부타노익애씨드;
(2S,3R)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-3-히드록시-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-l-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(디메틸아미노 )-3-메틸부탄이미도)-N,3-디메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-세린에이트;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-이소류신에이트;
(2S,3S)-3-아미노-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아미노-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-(tert-부틸아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄아미드;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)프로판아미드)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3- 메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
메틸 ((2R,3R)-3-((S)-l-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸햅타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄아미드;
((2S,3S)-3-아지도-N-((3R,4S,5S)-l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-l-(tert-부틸아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄아미드;
tert-부틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸햅타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌;
tert -부틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
(2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-l-(1H-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R )-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-l-(lH-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄이미도)부탄아미드;
(2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-l-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-l-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드;
tert -부틸 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-메틸부탄이미도)-3-메톡시-5-메틸햅타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로파노일)-L-페닐알라닌에이트;
(2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-l-(lH-테트라졸-5-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드; 및 (2S,3S)-3-아미노-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄이미도)-N-((3R,4S,5S)-3-메톡시-1-((S)-2-((1R,2R)-l-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-(((S)-2-페닐-l-(티아졸-2-일)에틸)아미노)프로필)피롤리딘-l-일)-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N-메틸부탄아미드; 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한 본원은 구조식 (I)의 화합물, 바람직하게는 상기 기술된 것들 및 본원에 예시된 구체적 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 이러한 염을 포함하는 약학적 조성물, 및 이러한 염을 사용하는 방법을 제공한다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 본원에 기재된 화합물의 유리 산 또는 염기의 염을 의미할 것으로 의도되고, 이는 개체에 투여하기 위해 비-독성, 생물학적으로 허용할 수 있거나, 그렇지 않으면 생물학적으로 적합하다. 일반적으로, S.M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," Pharm . Sci . 1977, 66, 1-19 참조. 바람직한 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 유효하고 과도한 독성, 자극, 또는 알러지 반응 없이 개체의 조직과 접촉하기에 적절한 것이다. 본원에 기술된 화합물은 충분히 산성인 기, 충분히 염기성인 기, 또는 작용기의 두 유형을 포함할 수 있고, 따라서 많은 무기 또는 유기 염, 및 무기 또는 유기 산과 반응하여 약학적으로 허용가능한 염을 형성한다. 약학적으로 허용가능한 염의 예는 산 부가 염 예컨대 설페이트, 피로설페이트, 비설페이트, 설파이트, 비설파이트, 포스페이트, 모노히드로겐-포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로리드, 브로미드, 아이오디드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수버레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 메틸풀소네이트, 프로필술포네이트, 베실레이트, 자일렌술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 테트라에이트, 및 만델레이트 및 무기염 예컨대 소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등 또는 유기염 예컨대 메틸아민, 에틸아민, 에타놀아민, 리신, 오미틴 등과의 염, 다양한 아미노산 또는 아미노산 유도체 예컨대 아세틸루신 등과의 염, 암모늄 염 등을 포함한다.
치료 목적을 위해, 본원에 기술된 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 추가적으로 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 비-독성인 물질이고 그렇지 않으면 개체에 투여하기에 생물학적으로 적절하다. 이러한 부형제는 제형화 및 본원에 기술된 화합물의 투여를 가능하게 하고 활성 성분과 양립할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 예는 안정화제, 윤활제, 계면활성제, 희석제, 항산화제, 결합제, 착색제, 유화제, 또는 맛-변형제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 살균 조성물이다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 적합한 약학적 용매 또는 담체와 함께 용액, 유제, 현탁액, 또는 분산액으로 제형화될 수 있고, 또는 환제, 정제, 로젠지제, 좌약, 재구성을 위한 파우더로 제형화될 수 있고, 또는 다양한 투여 형태의 제조로 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라서 고체 담체와 함께 캡슐로 제형화될 수 있다. 국소 적용의 경우, 본원에 기술된 화합물은 바람직하게 크림 또는 연고 또는 국소 투여에 적절한 유사한 비히클로서 제형화된다. 본원에 기술된 약학적 조성물 및 화합물은 적절한 전달 경로, 예를 들어 경구, 비강, 비경구, 직장, 국서, 안구 또는 흡입에 의해 본 발명의 방법으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 치료적 이익을 만드는 목적을 위해 개체에 본원에 기술된 화합물의 투여를 지칭하는 것을 의도한다. 치료는 질병, 장애 또는 병태, 또는 암의 하나 이상의 증상의 역전, 개선, 경감, 진행을 억제 또는 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 용어 "개체"는 이러한 치료가 필요한 포유동물 환자, 예컨대 인간을 지칭한다.
본원에 제공된 치료 방법에서, "유효량"은 이러한 치료가 필요한 개체에서 요구되는 치료적 이익을 가져오기에 일반적으로 충분한 양 또는 용량을 의미한다. 또한, 용어 "치료적 유효량"은 그러한 양을 받지 않은 해당 개체와 비교하여, 질병, 장애, 또는 부작용의 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질병 또는 장애의 진행 속도의 감소를 야기하지만 이로 제한되지 않는 임의의 양을 의미한다. 또한 용어는 정상 생리적 기능을 향상시키기 위한 유효량뿐만 아니라 개체, 예컨대 인간에서 생리적 기능을 야기하기 위한 유효량의 범위 이내를 포함하고, 이는 제2 약제의 치료적 효과를 향상 또는 증진시킨다. 본원에 기술된 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 유효량, 또는 용량은, 일상적 인자, 예를 들어 투여의 방식 또는 경로 또는 약물 전달, 약물의 약동학, 감염의 중증도 및 과정, 개체의 건강 상태, 병태, 및 체중, 및 치료 의사의 판단을 고려하여 모델링, 용량 증가 또는 임상 시험과 같은 정해진 방법에 의하여 확인될 수 있다. 본원에 기술된 항체 약물 콘쥬게이트에 대한 예시적 용량은 1일당 개체의 체중 kg 당 활성 화합물 약 1 μg 내지 2 mg, 바람직하게는 약 0.05 내지 100 mg/kg/일, 또는 약 1 내지 35 mg/kg/일, 또는 약 0.1 내지 10 mg/kg/일의 범위이다. 총 용량은 단일 또는 분할 추여 단위(예를 들어, BID, TID, QID)로 주어질 수 있다.
본원에 기술된 화합물은 약학적 조성물 또는 암의 치료에서 추가적 활성 성분과 조합하한 방법에 사용될 수 있다. 추가적 활성 성분은 본원에 기술된 화합불과 분리되어 투여될 수 있고 또는 본원에 제공된 약학적 조성물에서 본원에 기술된 화합물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 추가적 활성 성분은 벨케이드, 리툭시맙, 메토트렉세이트, 헤르셉틴, 빈크리스틴, 프레드니손, 이리노테칸 등, 또는 이들의 조합과 같으나 이에 제한되지 않는 암과 관련된 또다른 타겟에 대항하는 활성인 것을 포함하는, 암을 치료하는데 효과적인 것으로 공지되거나 발견된 것이다. 이러한 조합은 효능을 증가시키기 위하여, 하나 또는 그 이상의 부작용을 감소시키기 위하여, 또는 개시된 화합물의 필요한 용량을 감소시키기 위하여 역할을 할 수 있다.
구조식 (I)의 화합물은 이제 하기 그들의 일반적 제조를 위한 합성 도식 및 이후의 특정 실시예를 예시하기 위한 참조문헌에 의해서 기술된다. 통상의 기술자는 본원의 다양한 화합물을 얻기 위해, 궁극적으로 원하는 치환기가 원하는 생성물을 수득하기에 적절하게 보호되거나 보호되지 않은 반응 도식을 통해 수행될 수 있도록 시작 물질이 적절하게 선택될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 궁극적으로 원하는 치환기 대신에, 반응 도식을 통해 수행될 수 있고 원하는 치환기로 치환될 수 있는 적절한 기를 채용하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 당업자는 보호기가 특정 작용기(아미노, 카르복시, 또는 곁사슬 기)를 반응 환경으로부터 보호하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이고, 이로써 기는 적합한 경우 표준 조건 하에서 제거된다. 도식 A에 설명된 각각의 반응은 바람직하게 약 상온의 온도 내지 사용된 유기 용매의 환류 온도에서 수행된다. 다르게 특정되지 않는 한, 변수는 구조식 (I)에 상기 정의된 바와 같다.
Figure pct00024
도식 A을 참고하면, 구조식 (I)의 화합물의 제조가 (A)로 표지된 돌아이소루인(dolaisoleuine: Dil)의 보호된 산 형태에서 시작한다(Pettit et al. (1994) J. Org. Chem . 59: 1796-1800 참조). 화합물 (A)는 tert-부틸 에스테르 보호기로 서술되지만, 당업자는 적절한 대체를 선택할 수 있다. PG가 Boc(t-부톡시카르보닐) 또는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기와 같은 적절한 아미노 보호기인 경우, 질소-보호된 발린 또는 이소류신 변이체 (B)의 커플링은 표준 펩티드 커플링 조건 하에서 영향을 받는다. 예를 들어, 반응은 디에틸 시아노포스포네이트(DEPC), PyBrOP, PyBOP, BOP, 디이소프로필카르보디이미드(DIC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로리드(EDCI), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자-벤조트리아졸(HOAt), HBTU(O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), HATU (0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-l,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 등, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 수행된다. 결과물 디펩티드 (C) 상의 아미노 보호기는 적절한 조건 하에서 탈보호에 의해 제거된다. 예를 들어, PG가 Boc 기인 경우, 화합물 (C)는 트리플로오로아세트산으로 처리되어 유리 아민 (D)를 형성한다. PG가 Fmoc 기인 경우, 화합물 (C)는 피페리딘 또는 디에틸아민으로 처리되어 화합물 (D)를 수득한다. 화합물 (D)는 이후, 필요한 경우 보호된 형채로, 상기 기술된 바와 같은 펩티드 커플링 조건 하에서, 아미노산 유도체 (D)에 커플링되어 트리펩티드 (F)를 생성한다. 산으로의 처리는 카르복시 보호기를 제거하여 유리 산 (G)를 제공한다.
Figure pct00025
도식 B를 참고하면, (H)로 지정된 아미노-보호된 돌아프로인(dolaproine: Dap)(Pettit et al. (1994) J. Org . Chem . 59:6287-629 참조)이 상기 기술된 바와 같은 펩티드 커플링 조건 하에서 (당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조된) 아민 (J)과 커플링된다. 결과물 디펩티드 (K)는 도식 A에서 논의된 바와 같이 탈보호되어 화합물 (L)을 제공한다.
Figure pct00026
도식 C를 참고하면, 산 (G) 및 아민 (L)이 상기 논의된 바와 같은 펩티드 커플링 조건 하에서 커플링되어 구조식 (I)의 화합물을 제공한다. 반응의 결과가 구조식 (I)의 보호된 형태인 경우, 적절한 탈보호 조건을 사용하여 타겟 화합물을 제공할 수 있다.
또한 본원은 유효량의 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본원은 유효량의 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이러한 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암으로 고통받거나 암으로 진단받은 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본원은 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 이러한 치료가 필요한 개체에서 암을 치료하기 위한 용도를 제공한다.
또한 본원은 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 이러한 치료가 필요한 개체에서 암을 치료하기 위한 약의 제조에서의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 이러한 치료가 필요한 개체에서 암을 치료하기 위한 용도인 키트, 및 사용을 위한 지침을 제공한다.
또한 본 발명은 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 이러한 치료가 필요한 개체에서 암을 치료하기 위한 용도인 제조물품성(article of manufacture)을 제공한다.
또한 본 발명은 구조식 (I)의 화합물이 항체에 콘쥬게이트된 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)를 제공한다.
구조식 (I)을 사용하는 예시적 ADC는 하기의 구조를 갖고 여기서 “L” 또는 “mAb-s”는 본원에서 설명된 CHv62.21로 지정된 FLT3 Mab를 나타낸다.
또한, 구조식 (I)을 사용하는 추가적인 예시적 ADC는 하기의 구조를 갖고 여기서 “L” 또는 “mAb-s-“는 본원에서 설명된 CHv62.21로 지정된 FLT3 Mab를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 구조식 (I)의 화합물은 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)- l-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-l-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸­l-옥소헵텐-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드로 나타낸 화합물을 포함하는 약물 유닛을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 구조식 (I)의 화합물은 하기의 구조식 (II)와 같이 설명된 화합물을 포함하는 약물 유닛을 포함한다.
Figure pct00027
IX.) 약물 로딩
약물 로딩은 p로 나타내어지고 이는 분자 중 항체 당 약물 모이어티의 평균 개수이다. 약물 로딩은 항체 당 1 내지 20 약물 모이어티 (D) 범위일 수 있다. 본 발명의 ADC는 1 내지 20의 약물 모이어티 범위와 콘쥬게이트된 항체의 모집을 포함한다. 콘쥬게이션 반응으로부터의 ADC 제조에 있어서, 항체당 약물 모이어티의 평균 개수는 질량 분광 및 ELISA 분석과 같은 관행적 수단에 의해 특성화될 수 있다. p 의 관점에서 ADC의 정량적 분배 또한 결정될 수 있다. 몇몇 예에서, 다른 약물이 로딩된 ADC로부터 p가 특정 값인 균일성 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 전기영동과 같은 수단에 의하여 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서, p는 항체 상의 부착 부위의 개수에 의해 제한될 수 있다. 예컨대, 그 부착이 시스테인 티올인 경우, 항체는 단 하나 또는 수개의 시스테인 티올기를 가질 수 있으며, 또는 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 단 하나 또는 수개의 티올기를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 높은 약물 로딩, 예를 들어 p >5는 응집, 비용해성, 독성 또는 특정 항체-약물 콘쥬게이트의 세포 내 투과성의 상실을 야기할 수 있다. 특정 구현예에서 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.1 내지 약 3.9; 약 3.2 내지 약 3.8; 약 3.2 내지 약 3.7; 약 3.2 내지 약 3.6; 약 3.3 내지 약 3.8; 또는 약 3.3 내지 약 3.7의 범위이다. 실제로, 특정 ADC에 대하여 항체 당 최적의 약물 모이어티 비율은 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있다고 나타났다.
특정 구현예에서, 콘쥬게이션 반응 동안에 이론적 최대치보다 적은 약물 모이어티가 항체에 콘쥬게이트된다. 항체는 아래에서 논의할 바와 같이 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약과 반응하지 않는, 예컨대 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로 항체는 약물 모이어티와 결합할 수 있는 다수의 자유롭고 반응성인 시스테인 티올기를 포함하지 않는다; 실제로 항체 내 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 결합으로서 존재한다. 특정 구현예에서 반응성인 시스테인 티올기를 발생시키기 위하여, 부분적 또는 전체적 환원 조건하에서 DTT(dithiothreitol) 또는 TCEP(tricarbonylethylphosphine)와 같은 환원제로 항체를 환원시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 리신 또는 시스테인 같은 반응성인 친핵성기를 노출시키기 위하여 항체를 변성 조건하에 둔다.
ADC의 로딩(약물/항체 비율)은 상이한 방식으로 조절될 수 있는데, 예컨대, (i) 항체와 비교하여 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약의 몰적 과잉을 제한, (ii) 콘쥬게이션 반응 시간 또는 온도를 제한, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건을 일부 또는 제한, (iv) 재조합 기술에 의해 항체의 아미노산 서열을 설계하여, 링커-약물 부착의 개수 및/또는 위치 조절을 위하여, 시스테인 잔기의 개수 및 위치가 변형되도록 (WO2006/034488(전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨) 및 본원에 기술된 바에 따라 제조된 thioMab 또는 thioFab과 같이)함으로써 조절될 수 있다.
일 이상의 친핵성 기가 약물 모이어티 시약 이후의 약물-링커 중간생성물 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 생성된 산물은 항체에 부착된 하나 또는 그 이상의 약물 모이어티 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물인 것으로 이해된다. 항체 당 평균 약물 수는 이중 ELISA 항체 분석법에 의하여 혼합물로부터 계산될 수 있는데, 이는 항체에 대하여 특이적이고 약물에 대하여 특이적이다. 개개의 ADC 분자는 질량 분석법에 의하여 혼합물 중에서 동정될수 있으며, HPLC, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 분리될 수 있다(예컨대, Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an antiCD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004 참조). 특정 구현예에서 단일 로딩 값을 갖는 균일한 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의하여 콘쥬게이션 혼합물로부터 분리될 수 있다.
X.) ADC의 세포독성 효과의 결정 방법
약물 또는 항체-약물 콘쥬게이트가 세포에 세포정지성 및/또는 세포독성 효능을 행사하는지 여부를 결정하는 방법이 알려져있다. 일반적으로, 항체 약물 콘쥬게이트의 세포독성 또는 세포정지 활성은 항체 약물 콘쥬게이트의 타겟 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에 노출시키고; 약 6시간 내지 약 5일까지의 기간 동안 세포를 배양하고: 그리고 세포 생존능력을 측정함에 의하여 측정될 수 있다. 생존력(증식), 세포독성, 및 항체 약물 콘쥬게이트의 세포자멸사 유도(카스파제 활성화)를 측정하기 위하여 세포-기반 인 비트로 분석법이 사용될 수 있다.
항체 약물 콘쥬게이트가 세포정지 효능을 행사하는지 여부를 결정하기 위하여, 티미딘 혼입 분석법이 사용될 수 있다. 예컨대, 타겟 항원을 96 웰 플레이트의 5,000 셀/웰의 밀도로 발현하는 암세포를 72시간의 동안 배양하고 72시간 중 마지막 8시간 동안 0.5 μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 배양 세포 속으로의 3H-티미딘의 혼입은 항체 약물 콘쥬게이트의 존재 또는 부존재 중에 측정된다.
세포독성 측정을 위하여, 네크로시스 또는 세포자멸사(프로그램된 세포 사멸)을 측정할 수 있다. 네크로시스는 전형적으로 세포막의 증가된 투과성, 세포의 팽창 및 세포막의 파열을 수반한다. 세포자멸사는 전형적으로 막 수포화, 세포질의 응축 및 내인성 엔도뉴클레아제의 활성화에 의해 특징지어진다. 암세포에 대한 이러한 영향 중 어느 하나의 결정은 항체 약물 콘쥬게이트가 암 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.
세포 생존율은 중성 레드, 트리판 블루 또는 ALAMARTM 블루(예컨대 Page et al., 1993, Intl . J. Oncology 3:473-476 참조)와 같은 염료의 세포 내 섭취를 결정하여 측정될 수 있다. 그러한 분석에 있어서, 세포를 염료를 포함한 배지에서 배양하고, 세포를 세척하고, 그리고 염료의 세포적 섭취를 반영하는 남아있는 염료를 분광학적으로 측정한다. 단백질-결합 염료 설포호다민 B(SRB) 또한 세포독성을 측정하기 위하여 사용될 수 있다(Skehan et al., 1990, J. Natl . Cancer Inst . 82:1107-12).
대안적으로, 죽은 세포가 아닌 살아있는 세포의 측정에 의한 포유동물 세포의 생존 및 증식에 대한 정량적 색도 분석법에서, MTT와 같은 테트라졸리움 염이 사용될 수 있다(예컨대, Mosmann, 1983, J. Immunol . Methods 65:55-63 참조).
세포자멸사(apoptosis)는 예컨대, DNA 분절화를 측정하여 정량화될 수 있다. DNA 분절화를 정량적으로 인 비트로 측정하기 위한 상업적인 광도 측정법이 이용가능하다. TUNEL (분절화된 DNA 중의 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 측정) 및 ELISA-기반 분석법을 포함하는 이와 같은 분석법의 예시가 Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37(Roche Molecular Biochemicals)에 기술되어 있다.
세포자멸사는 또한 세포 중의 형태학상의 변화를 측정하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 네크로시스와 같이, 원형질막의 온전성의 상실은 특정 염료(예컨대, 아크리딘 오렌지 또는 에티디움 브로미드와 같은 형광 염료)의 섭취를 측정하여 결정될 수 있다. 세포자멸사 세포 개수의 측정 방법은 Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)에 기술되었다. 세포는 또한 DNA 염료(예를 들어 아크리딘 오렌지, 에티디움 브로미드 또는 프로피디움 요오드)로 표지될 수 있고, 세포는 염색질 응축 및 핵막 내부를 따라 생기는 가장자리화에 대해 관찰된다. 세포자멸사를 결정하기 위하여 측정되는 다른 형태적 변화는 예컨대, 세포질 응축, 증가된 막 수포화 및 세포 수축을 포함한다.
세포자멸성 세포의 존재는 배양물의 부착된 구획 및 "부유하는" 구획 둘 모두에서 측정될 수 있다. 예를 들어 두 구획은 상등액 제거, 부착된 세포의 트립신처리, 표본의 조합 및 뒤이은 원심 분리 세척 단계(예를 들어, 2000 rpm에서 10분) 및 세포자멸사 측정(예를 들어, DNA 단편을 측정함에 의하여)에 의하여 수집될 수 있다(예컨대, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16 참조).
인 비보에서, FLT3 치료용 조성물의 효과는 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어 이종개체 암 모델을 사용할 수 있는데, 여기에서 암 이식체 또는 변통된 이종이식편 조직은 누드 또는 SCID 마우스와 같이 면역을 저하시킨 동물로 도입된다(Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). 예를 들어 PCT 특허출원 WO98/16628 및 미국특허 제6,107,540호는 일차 종양의 발전, 미소전이 및 후기 단계 질병의 특징인 조골세포 전이 형성을 재현할 수 있는 능력이 있는 다양한 인간 전립선 암 이종이식편 모델을 기술한다. 종양 형성의 저해, 종양의 퇴행 또는 전이 등을 측정하는 분석법을 사용하여 효능을 예측할 수 있다.
세포자멸사 촉진을 평가하는 인 비보 분석법은 치료용 조성물을 평가하는데에 있어 유용하다. 일 구현예에서 치료용 조성물로 처리된 종양 포함 마우스로부터 유래한 이종이식편체는 세포자멸사성 병소의 존재를 위해 시험되고, 처리되지 않은 대조군 이종이식-포함 마우스와 비교될 수 있다. 처리된 마우스의 종양 내 세포자멸사성 병소가 발견되는 범위는 조성물의 치료적 효능에 대한 지시를 제공한다.
상기 방법의 실행에 사용된 치료적 조성물은 원하는 전달 방법을 위해 적합한 담체를 포함하는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 치료적 조성물과 조합되었을 때 치료적 조성물의 항-종양 기능을 보유하고, 환자의 면역 시스템에 일반적으로 비 반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예를 들면, 멸균 포스페이트 완충 식염수 용액, 제균수 등과 같은 수많은 표준 약학적 담체 중 어느 하나를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다(일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980 참조).
치료적 제형은 용해되고, 종양 부위로 치료적 조성물을 전달할 수 있는 그 임의의 경로를 통해서 투여될 수 있다. 잠재적으로 효과적인 투여 경로는 정맥 내, 비경구적, 복막 내, 근육 내, 종양 내, 피부 내, 기관 내, 오르토토픽(orthotopic) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 정맥 내 주입을 위한 바람직한 제형은 보존된 제균수, 멸균 비보존수 중의 치료적 조성물, 및/또는 0.9%의 주입용 살균 염화나트륨 USP를 함유하는 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 백 중에 희석된 치료적 조성물을 포함한다. 치료적 단백질 조제물은 냉동 건조되어 멸균 파우더로서 바람직하게는 진공하에서 보관될 수 있고, 그 다음 주입에 앞서 제균수(예컨대, 벤질 알코올 보존제를 포함하는) 또는 살균수 중으로 재용해시킬 수 있다.
상기 방법을 이용한 암 치료용 복용 및 투여 프로토콜은 방법 및 타겟 암에 따라 변동될 것이고, 당업계에서 고려되는 수 개의 다른 인자에 일반적으로 의존적할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 CHv62.21 MAb 또는 CHv62.21pAF MAb의 변형으로 인해 본 발명의 ADC를 1종 이상 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 CHv62.21 MAb가 중쇄 C-말단 리신을 결여한 항체, N-말단 번역후 변형을 갖는 항체, 중쇄 C-말단 리신을 결실한 항체, N-말단 번역후 변형을 갖는 항체, 중쇄 C-말단 리신을 결실한 그리고 N-말단 번역후 변형을 갖는 항체, 및/또는 중쇄 C-말단 리신을 갖고 N-말단 번역후 변형은 갖지 않는 항체인, 본 발명의 ADC를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은, ADC의 CHv62.21 MAb가 하기의 1) 내지 4)의 군으로부터 선택되는 것인, 본 발명의 ADC를 2종 이상 포함하는 약학적 조성물을 포함한다:
1) 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb;
2) 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb;
3) 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb; 및
4) 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb 및 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb 및 서열번호 9의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21 MAb를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 ADC의 CHv62.21pAF MAb가 하기의 1) 내지 4)의 군으로부터 선택되는 것인, 본 발명의 ADC를 2종 이상 포함하는 약학적 조성물을 포함한다:
1) 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb;
2) 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb;
3) 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 443 (T)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb; 및
4) 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 443 (T)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 C-말단 잔기 443 (T)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb 및 서열번호 11의 잔기 1 (E) 내지 잔기 453 (K) 범위인 아미노산 서열로서 N-말단 잔기 1 (E)이 피로글루탐산으로 전환되고 C-말단 잔기 453 (K)가 제거된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 잔기 1 (D) 내지 잔기 214 (C) 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 CHv62.21pAF MAb를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
XI.) FLT3을 발현하는 암(들)의 치료
제한된 조직 또는 세포의 세트 내에서 정상적으로 발현되지만, 또한 표 I에 열거한 것과 같은 암 내에서도 발현하는 단백질로서 FLT3을 동정함은, 그와 같은 암의 치료에 대한 수개의 치료적 접근법을 열었다.
그 중에서도 특기할 만한 것은 타겟화된 항종양 치료법은 타겟 단백질이 정상 조직 또는 세포에서, 심지어는 필수적 정상 기관 조직에서 발현하는 경우에도 효과적이다. 필수적 기관은 심장 또는 결장과 같이 생명 유지에 필수적인 것 중 하나이다. 비 필수적 기관은 제거되어도 개인이 여전히 생존할 수 있는 것이다. 비 필수적 기관의 예는 난소, 유방 및 전립선이다.
정상 조직 중, 심지어 필수적 정상 조직 내에서의 타겟 단백질의 발현은, 그 단백질이 또한 과발현되는 특정 종양에 대한 치료법으로서 그 단백질에 대한 타겟 물질의 유용성을 결핍시키지 않는다. 예를 들어 필수적 기관 내의 발현은 그 자체로 불이익이지 않다. 또한 전립선 및 난소와 같이 제거가능한 것으로 여겨지는 기관은 죽음에 영향을 미치지 않고 제거될 수 있다. 마지막으로, 몇몇 필수적 기관들은 면역 특권 (immunoprivilege) 때문에 정상 기관 발현에 의하여 영향받지 않는다. 면역 특권화된 기관이란 혈액-기관 장벽에 의하여 혈액으로부터 보호되어 면역 치료법에 접근할 수 없는 기관이다. 면역 특권화된 기관의 예로는 뇌 및 정소가 있다.
따라서, FLT3 단백질의 활성을 저해하는 치료적 접근법은 FLT3을 발현하는 암으로 고통받는 환자(예를 들어, 표 Ⅰ에 열거된 암)에게 유용하다. 이러한 치료적 접근법은 일반적으로 3개의 유형으로 분류된다. 첫 번째 유형은 종양 세포 성장의 억제 또는 지연 또는 그것의 사멸을 유도하는 종양 세포 성장과 관련되어, FLT3의 기능을 조절한다. 두 번째 유형은 FLT3 단백질의 그 결합 파트너 또는 다른 단백질과의 결합 또는 연합 저해를 위한 다양한 방법을 포함한다. 세 번째 유형은 FLT3 유전자의 전사 또는 FLT3 mRNA 번역 저해를 위한 다양한 방법을 포함한다.
따라서, 암 환자는 FLT3 발현의 존재 또는 수준을 측정, 바람직하게는 암조직의 면역조직화학 분석법, 정량적인 FLT3 이미지화, 또는 FLT3 발현의 존재 및 정도를 신뢰할 수 있게 지시하는 다른 기술을 사용할 수 있다. 종양 생검 또는 수술적 표본에 대한 면역조직화학적 분석법이 이 목적을 위하여 바람직하다. 종양 조직의 면역조직화학적 분석을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
XⅢ.) 항체-기반 요법을 위한 타겟으로서의 FLT3
FLT3은 항체-기반 치료적 전략을 위한 매력적인 타겟이다. 수개의 항체 전략이 세포 외 및 세포 내 분자 모두의 타겟팅에 대하여 당업계에 알려져 있다(예컨대 인트라바디의 사용뿐만 아니라, 보체 및 ADCC 매개성 사멸 참조). FLT3가 대응 정상 세포와 관련 있는 다양한 계통의 암세포에 의해 발현되기 때문에, FLT3-면역활성
조성물의 시스템적 투여가 준비되고, 비-타겟 기관 및 조직에 면역활성 조성물이 결합함에 의해 야기되는 독성, 비-특이적 및/또는 비-타겟적인 효과 없이 우수한 민감성을 나타낸다. FLT3의 도메인과 특이적으로 반응하는 항체는 FLT3-발현 암을 시스템적으로 치료하는데에 유용한데, 바람직하게는 콘쥬게이트가 독소 또는 치료제와 함께인 것인 항체 약물 콘쥬게이트(즉, ADC)로서 유용하다.
당업계의 숙련된 자들은, 도 1에 나타낸 바와 같은 FLT3 서열의 면역원성 부위와 같은 면역원성 분자를 특이적으로 표적화 및 결합하는데에 항체가 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 또한, 통상의 기술자는 항체를 세포독성제에 콘쥬게이트 시키는 것이 통상적이라는 것을 이해한다(예컨대 Slevers et al. Blood 93:11 3678-3684 (June 1, 1999) 참조). 세포독성 및/또는 치료적 물질이, 세포가 발현하는 분자(예컨대, FLT3)에 특이적인 항체와 그들을 콘쥬게이트 시킴에 의한 것과 같이, 세포에 직접적으로 전달될 때, 세포독성제는 그것의 알려진 생물학적 효과(즉, 세포독성)를 그 세포에 발휘할 수 있다.
항체-세포독성제 콘쥬게이트를 사용하는 방법 및 다양한 종류의 조성물이 당업계에 알려져 있다. 암의 문맥에서, 전형적인 방법은 세포 표면 상에서 발현되거나, 결합에 접근성이 있거나, 또는 지역화된 항원(예컨대, FLT3)에 결합하는 타겟된 물질(예컨대, FLT3 MAb, 바람직하게는 CHv62.21 또는 CHv62.21pAF)와 결합된 선택된 세포독성제 및/또는 치료제를 포함하는 콘쥬게이트의 생물학적 유효량을 종양을 가진 포유동물에게 투여하는 것을 수반한다. 전형적인 구현예는 세포독성제 및/또는 치료제를 FLT3을 발현하는 세포에 전달하는 방법인데, 이는 세포독성제를 면역특이적으로 FLT3 에피토프에 결합하는 항체에 콘쥬게이트시키는 것, 및 세포를 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)에 노출시키는 것을 포함한다. 또 다른 예시적 구현예는 전이된 암으로부터 고통받는 것으로 의심되는 개인을 치료하는 방법인데, 이는 세포독성제 및/또는 치료적제에 콘쥬게이트된 항체의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 상기 개인에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다.
대장암(Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), 복합 골수종(Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), 위암(Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), B-세포 림프종(Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), 백혈병(Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), 결장직장암(Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) 및 유방암(Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 유형의 암 치료에 성공적으로 적용되어 온 다양한 접근법에 따라서, FLT3 항체를 이용한 암 면역요법을 행할 수 있다. 몇몇 치료적 접근은 Y91 또는 I131를 항-CD20 항체(예컨대, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. 또는 BexxarTM, Coulter Pharmaceuticals)에 각각 콘쥬게이션하는 것과 같은, 네이키드 항체를 독소 또는 방사능 동위원소에 콘쥬게이션 시키는 것을 수반하는 반면에, 다른 접근법들은 파클리탁셀(Genentech, Inc.)과 함께 헤르셉틴TM(trastuzu MAb)과 같은 다른 치료제와 항체를 공동-투여하는 것을 수반한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 세포독제, 상기 바람직하게는 MMAE(Seattle Genetics)로 지명된 아우라스타틴(aurastatin) 유도체에 콘쥬게이트될 수 있다.
비록 FLT3 항체 치료법이 모든 단계의 암에 유용하다고 하더라도, 항체 치료법은 발전된 암 또는 전이성 암에 특히 적합할 수 있다. 본 발명의 항체 치료법에 의한 치료는 화학적 치료를 한 차례 이상 받아온 환자에게 지정된다. 또는, 본 발명의 항체 치료법은 화학치료적 치료법을 받아오지 않은 환자를 위하여 화학치료적 또는 방사능 처방과 함께 조합된다. 또한, 항체 치료법은 특히 화학치료제의 독성에 매우 잘 순응하지 못하는 환자에 대하여, 부수하는 화학요법의 감소된 투여량의 사용을 가능하게 할 수 있다. Fan et al.(Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett et al.(International J. of Onco.9:217-224, 1996), 및 Hancock et al.( Cancer Res. 51:4575-4580, 1991)은 다양한 항체를 화학치료제들과 함께 사용하는 것을 기술한다.
표 I에 기재된 암을 치료하는 FLT3 모노클로날 항체에는 종양에 대해 잠재적 면역 반응을 개시하는 것 및 직접적으로 세포독성인 것들을 포함한다. 이러한 관점에서, FLT3 모노클로날 항체(MAb)는 보체-매개된 메커니즘 또는 항체-의존적 세포 독성(ADCC) 메커니즘에 의하여 종양 세포 용해를 유도할 수 있는데, 두 메커니즘 모두 보체 단백질의 이펙터 세포 Fc 수용체 위치와의 상호작용을 위하여 면역글로불린 분자의 완전한 Fc 부분을 필요로 한다. 또한, 종양 성장에 대한 직접적인 생물학적 효과를 행사하는 FLT3 MAb는 FLT3을 발현하는 암을 치료하는데 유용하다. 세포 독성 MAb가 직접적으로 작용하는 메커니즘은 세포 성장의 저제, 세포 분화의 조절, 종양 신생 인자 프로파일의 조절 및 세포자멸사 유도를 포함한다. 특정 FLT3 MAb가 항-종양 효과를 행사하는 메커니즘(들)은, 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, ADCC 및 보체-매개된 세포 용해 등과 같은 세포 사멸을 평가할 수 있는 수개의 인 비트로 분석법을 사용하여 평가된다.
따라서, 본 발명의 치료적 방법에 사용되는 바람직한 모노클로날 항체에는 완전 인간 및 높은 결합력으로 타겟 FLT3 항원에 특이적으로 결합하는 것이다.
XIV.)FLT3 ADC 칵테일
본 발명의 치료적 방법은 상이한 MAb(즉, FLT3 MAb 또는 다른 단백질에 결합하는 Mab)의 조합 또는 칵테일뿐만 아니라, 단일 FLT3 ADC의 투여를 의도한다. 이와 같은 MAb 칵테일은 상이한 에피토프를 타겟화, 상이한 반응기 메커니즘을 개척 또는 세포독성 MAb를 면역 반응기 기능성에 의존하는 MAb와 직접적으로 결합시키는 MAb들을 포함하는 만큼 특정한 이점을 가질 수 있다. 이와 같은 조합된 MAb들은 상승 효과적인 치료 효능을 나타낼 수 있다. 또한 FLT3 MAb는 다양한 화학치료제 또는 생물학적 약제, 안드로겐-차단제, 면역 조절제(예컨대, IL-2, GM-CSF), 수술 또는 방사능을 포함하며 이에 제한되지 않는 다른 치료적 형태와 함께 부수적으로 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, FLT3 MAb는 콘쥬게이트된 형태로 투여된다.
FLT3 ADC 제형은 항체를 종양 세포에 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해서 투여된다. 투여의 경로는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 종양 내, 피부 내 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료는 일반적으로 정맥 내 주입(IV)과 같이 허용가능한 투여 경로를 경유하여, 전형적으로 0.1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 mg/kg 체중을 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여량으로 FLT3 ADC 조제물을 반복적으로 투여하는 것을 수반한다. 일반적으로 주당 10-1000 mg MAb 범위의 투여량이 효과적이고 잘 수용된다.
전이성 유방암 치료에서 헤르셉틴® (트라스트주맙)을 이용한 임상적 경험에 기초한, MAb 조제물의 초기 투여량 약 4 mg/kg 환자 체중 IV와 이후의 주당 투여량 약 2 mg/kg IV 은 허용가능한 투여 계획을 나타낸다. 바람직하게는, 초기 로딩 용량은 90분 또는 더 긴 주입으로 투여된다. 주기적인 유지 용량은 초기 용량이 잘 수용되는 것을 조건으로, 30분 또는 더 긴 주입으로 투여된다. 당업계의 숙련된 자들에 의해 고려되듯이, 다양한 인자가 특정 경우에 있어 이상적인 투여 계획에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 인자는 특정 환자의 건강 상태뿐만 아니라, 예를 들면 사용된 MAb의 결합 친화력 및 반감기, 환자 중의 FLT3 발현 정도, 순환성 쉐드(shed) FLT3 항원의 정도, 목적하는 정상 상태 항체 농도 수준, 처리의 빈도 및 본 발명의 치료 방법과 조합하여 사용되는 화학적 치료제 또는 다른 약제의 영향을 포함한다.
선택적으로, 가장 효과적인 투여 요법 등의 결정을 돕기 위하여, 환자는 주어진 시료 내 FLT3의 수준(예컨대, 순환하는 FLT3 항원 및/또는 FLT3 발현 세포의 수준)을 평가받을 수 있다. 이와 같은 평가는 치료 전체를 통해 모니터링 목적으로 또한 사용되며, 다른 변수(예를 들면, 방광암 치료에 있어 소변 세포학 및/또는 면역Cyt 레벨, 또는 유사하게, 전립선 암 치료에 있어서 혈장 PSA 수준)의 평가와 조합하여 치료적 성공을 평가하는데에 유용하다.
본 발명의 목적은 FLT3 ADC을 제공하는것이고, 이는 FLT3을 발현하는 종양 세포의 성장을 저해 또는 지연시킨다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 FLT3 ADC을 사용하여, 특히 다른 약제 또는 면역학적으로 활성인 치료법과 조합한 이러한 FLT3 ADC를 사용하여, 혈관신생 및 다른 생물학적 기능을 억제한 결과 포유동물, 바람직하게는 인간 내의 종양 성장을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
XV.) 조합 치료법 (Combination Therapy)
일 구현예에서, 인간 종양을 포함하는 종양을 화학치료제 또는 방사능 또는 이들의 조합과 콘쥬게이션시킨 FLT3 ADC으로 처리하는 경우 상승 효과가 있다. 다시 말해, FLT3 ADC에 의한 종양 성장의 억제는 화학치료제 또는 방사능 또는 이들의 조합과 결합시키는 경우 기대보다 더 많이 향상된다. 상승효과는 예를 들어, 오직 FLT3 ADC만의 처리로부터 기대되는 것 또는 FLT3 ADC 및 화학치료제 또는 방사능을 이용한 치료의 합산 효과로부터 기대되는 것보다, 조합된 치료에 의한 종양 성장의 더 큰 억제에 의해 나타날 수 있다. 바람직하게, 상승효과는 암의 감쇠에 의하여 나타내어지는데, 여기에서 감쇠는 FLT3 ADC로부터, 또는 FLT3 ADC 및 화학치료제 또는 방사능의 추가적 조합을 사용한 치료로부터는 기대할 수 없는 것이다.
FLT3 ADC 및 화학치료 또는 방사능 또는 양자의 조합을 사용하여 종양 세포 성장을 저해하는 방법은, 화학치료 또는 방사능 치료를 시작하기 전, 중간 또는 이후 또는 이들의 임의의 조합(즉, 화학치료 및/또는 방사능 치료를 시작하기 전 및 중간, 전 및 이후, 중간 및 이후, 또는 전, 중간 및 이후)에 FLT3 ADC를 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, FLT3 ADC는 전형적으로 1 및 60일 사이에, 바람직하게는 3 및 40일 사이에, 보다 바람직하게는, 5 및 12일 사이에, 방사능 치료 및/또는 화학적 치료를 시작하기에 앞서 투여된다. 그러나, 치료 프로토콜 및 특정 환자의 요구에 의존하여, 방법은 가장 효과적인 치료를 제공하고, 환자의 수명을 최대로 연장할 수 있는 방식으로 수행된다.
화학치료제의 투여는 비경구 및 경구적 경로를 전체적으로 포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일 구현예에서, FLT3 ADC 및 화학치료제는 분리된 분자로서 투여된다. 화학치료제 또는 화학치료법의 특정한 예로는 시스플라틴(cisplatin), 다카바진(dacarbazine, DTIC), 닥티노마이신(dactinomycin), 메클
로레타민(mechlorethamine, nitrogen mustard), 스트렙토조신(streptozocin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 카무스틴(carmustine, BCNU), 로무스틴(lomustine, CCNU), 독소루비신(doxorubicin, adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 프로카바진(procarbazine), 미토마이신(mitomycin), 시타라빈(cytarabine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 블레오마이신(bleomycin), 파클리탁셀(paclitaxel, taxol), 도세탁셀(docetaxel, taxotere), 알데스루킨(aldesleukin), 아스파라기나제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 다카바진(dacarbazine), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이포스파미드(ifosfamide), 인터페론 α (interferon alpha), 루프로리드(leuprolide), 메게스트롤(megestrol), 멜팔란(melphalan), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플리카마이신(plicamycin), 미토탄(mitotane), 페가스파가제(pegaspargase), 펜토스타틴(pentistatin), 피포브로만(pipobroman), 플리카마이신(plicamycin), 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 테니포시드(teniposide), 테스토락톤(testolactone), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 우라실 머스타드(uracil mustard), 비노렐빈(vinorelbine), 젬시타빈(gemcitabine), 클로람부실(chlorambucil), 탁솔(taxol) 및 이들의 조합을 포함한다.
FLT3 ADC와 조합하여 사용되는 방사능의 기원은 치료되어지는 환자의 외부 또는 내부일 수 있다. 기원이 환자의 외부인 경우, 치료는 외부 빔 방사 요법(EBRT)으로 알려져있다. 방사능의 기원이 환자 내부인 경우, 치료는 방사선 물질 주입 치료법(brachytherapy, BT)이라고 불리운다.
상기 기술된 치료적 요법은 추가적인 암 치료제 및/또는 요법과 추가적으로 조합될 수 있는데, 예를 들면 추가적인 화학치료법, 암 백신, 신호 전달 억제제, 비정상적 세포 성장 또는 암 치료에 유용한 약물, 항체(예컨대, WO/2005/092380에 기술되어 있는 항-CTLA-4 항체(Pfizer)) 또는 IGF-1R 및 사이토카인에의 결합에 의하여 종양 성장을 저해하는 다른 리간드일 수 있다.
포유동물이 추가적인 화학치료법을 받는 경우, 상기에서 기술한 화학적 치료 제들이 사용될 수 있다. 추가적으로, 성장 인자 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬 치료법, 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERMs), 혈관신생 억제제 및 항-안드로겐이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-호르몬, 예컨대 놀바덱스(Nolvadex, tamoxifen)과 같은 항-에스트로겐 또는 카소덱스(Casodex, 4'-시아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-히드록시-2-메틸-3-'-(트리플루오로메틸)프로피온아닐리드)와 같은 항-안드로겐이 사용될 수 있다.
상기 치료적 접근법들은 다양한 범위의 수술적, 화학치료, 또는 방사능 치료 요법 중의 어느 하나와 조합될 수 있다. 본 발명의 치료적 접근법은 화학치료법(또는 다른 치료법)의 감소된 용량의 사용 및/또는 덜 빈번한 투여를 가능하게 하는데, 이는 모든 환자, 특히 화학치료제의 독성에 잘 순응하지 않는 자들에게 이점이다.
XVI.) 키트/제조물품성
본원에 기술된 실험실적, 예후적, 예방적, 진단적 및 치료적 응용에 사용되기 위하여, 키트는 본 발명의 범위에 속한다. 이와 같은 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 일 이상의 컨테이너를 수용하기 위하여 구획된 캐리어, 패키지 또는 컨테이너를 포함하는데, 각각의 컨테이너(들)는 본원에 기술된 사용과 같은 사용을 위한 지침을 포함하는 표지 또는 삽입물과 함께, 방법에 사용되기 위한 분리된 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 컨테이너(들)는 탐지가능하게 표지된 또는 표지될 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 키트는 약물 유닛을 포함하는 컨테이너를 포함할 수 있다. 키트는 도 2A, 2B 및/또는 2C, 또는 도 3A, 3B 및/또는 3C의 아미노산 서열 또는 이의 유사체, 또는 그와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상기에서 기술된 컨테이너와, 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지; 캐리어, 패키지, 내용물 및/또는 사용을 위한 지침을 갖는 바이알 및/또는 튜브 라벨, 및 사용을 위한 지침을 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 물질을 포함하는, 그와 결합할 수 있는 일 이상의 다른 컨테이너를 포함할 수 있다.
라벨은, 조성물이 특정 치료 또는 예후적, 예방적, 진단적 또는 실험실적 적용과 같은 비치료적 적용에 사용됨을 나타내기 위하여 컨테이너 상에 또는 그와 함께 존재할 수 있으며, 또한 본원에 기술된 바와 같은 인 비보 또는 인 비트로 사용을 위한 지시를 표시할 수 있다. 지시 및 또는 다른 정보 또한 키트 상에 또는 그와 함께 포함되는 삽입물(들) 또는 라벨(들) 상에 포함될 수 있다. 라벨은 컨테이너 상에 또는 그와 결합되어 있을 수 있다. 라벨은 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 글자가 컨테이너 자체로 몰딩되거나 또는 새겨진 경우 컨테이너 상에 있을 수 있다; 라벨은 그것이 예컨대 패키지 삽입물과 같은, 컨테이너를 또한 보유할 수 있는 저장소 또는 캐리어 내부에 존재하는 경우에, 컨테이너와 결합될 수 있다. 라벨은 조성물이 표 I에 나타난 조직의 암과 같은 상태의 진단, 치료, 예방 또는 예후를 위하여 사용된다는 것을 지시할 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조물품성"은 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 항체(들) 또는 항체 약물 콘쥬게이트(ADCs) 와 같은 조성물, 예컨대, 표 I에 나타난 것과 같은 조직의 암의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조물품성(들)을 제공한다. 제조물품성은 전형적으로 한개의 컨테이너 및 적어도 하나의 라벨을 포함한다. 적절한 컨테이너는 예컨대, 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 컨테이너는 유리, 금속 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 아미노산 서열(들), 소분자(들), 핵산 서열(들), 세포 집단(들) 및/또는 항체(들)를 보유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 컨테이너는 세포 및 조직 중의 FLT3의 단백질 발현을 평가하는데 사용하기 위한, 또는 관련된 실험실적, 예후적, 진단적, 예방적 및 치료적 목적을 위한 항체, 그의 결합 단편 또는 특이적 결합 단백질을 포함한다: 시약 및 다른 조성물 또는 이러한 목적을 위한 도구가 포함될 수 있는 것처럼, 그와 같은 사용을 위한 지시 및/또는 지침서가 상기 컨테이너 상에 또는 그와 함께 포함될 수 있다.
대안적으로, 컨테이너는 상태의 치료, 진단, 예후 및 예방에 효과적인 조성물을 보유할 수 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의하여 관통될 수 있는 마개를 가지는 정맥 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내 활성 물질은 FLT3에 특이적으로 결합할 능력이 있는 항체 또는 FLT3에 특이적으로 결합하는 항체 약물 콘쥬게이트일 수 있다.
제조물품성은 인산-완충 식염수, 링거 용액 및/또는 덱스트로스 용액과 같이 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 콘테이너를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 교반기, 바늘, 시린지, 및/또는 사용을 위한 지시 및/또는 지침서가 있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 추가적 구현예는 하기 항목에 기술된 구현예를 포함한다:
항목 1은 항체의 구현예로, 여기서 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함한다. 대안적 구현예에서, 항체는 표 Ⅴ에 나타낸 바와 같은 Chothia 방법에 의해 결정된 CDR을 포함한다. 또다른 대안적 구현예에서, 항체는 표 Ⅴ에 나타낸 바와 같은 Contact 방법에 의해서 결정된 CDR을 포함한다.
항목 2는 추가적 구현예로, 여기서 항체는 항목 1에 따른 항체이고, 여기서 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위를 포함하고 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 포함한다.
항목 3은 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 항체이고, 여기서 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위 및 ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 포함한다; 또는 여기서 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-121836으로 기탁된 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위 및 ATCC 수탁번호 PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 포함한다.
항목 4는 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 항체로, 여기서 항체는 IgG 아형인 Fc 부위를 포함한다.
항목 5는 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목에 따른 항체이고, 여기서 Fc 부위는 중쇄의 아미노산 위치 124에서 비-천연 아미노산의 치환을 포함하고, 여기서 비-천연 아미노산은 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)이다.
항목 6은 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 항체로, 여기서 항체는 서열번호 11의 아미노산 번호 1번째 E 내지 452번째 G의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 및 서열번호 10의 아미노산 번호 1 내지 452의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 항목 6의 대안적 구현예에서,항체는 항목 1 또는 항목 2에 따른 항체이고, 여기서 항체는 서열번호 11의 아미노산 번호 1 내지 452의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
항목 7은 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 항체이고, 여기서 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 항목 7의 대안적 구현예에서, 항체는 항목 1 또는 항목 2에 따른 항체이고, 여기서 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
항목 8은 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 임의의 항체이고, 여기서 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 항목 8의 대안적 구현예에서, 항체는 항목 5에 따른 항체이고, 여기서 항체는 PTA-121831로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, PTA-121831로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
항목 9는 추가적 구현예로, 여기서 항체는 상기 항목 중 임의의 항체이고, 여기서 항체는 PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 항목 9의 대안적인 구현예에서 항체는 항목 1 내지 5 중 어느 하나의 항체이고, 여기서 항체는 PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
항목 10은 추가적 구현예이고 여기서 항체는 상기 항목 중 하나에 따른 항체이고, 여기서 중쇄 가변 부위 또는 중쇄의 1번째 E가 피로글루타메이트로 치환된다.
항목 11은 추가적 구현예로 여기서 항체는 항목 1-5 중 임의의 것에 따른 항체로 여기서 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 452번째 G의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 부위 또는 중쇄의 1번째 E가 피로글루타메이트로 변형된 것이고, 여기서 항체가 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 항목 11의 대안적인 구현예는 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 항체이고, 여기서 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 452번째 G의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 부위 또는 중쇄의 1번째 E는 피로글루타메이트로 변형되고, 여기서 항체는 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.
항목 12는 상기 항목 중 어느 하나에 따른 항체의 CDR을 포함하는 항원 결합 단편인 추가적 구현예이고, 여기서 항원-결합 단편은 FLT-3에 결합한다.
항목 13은 상기 항목에 따른 항원-결합 단편인 추가적 구현예이고, 여기서 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 단리된 VH, 및 단리된 VL로 구성된 군으로부터 선택된다.
항목 14는 항목 12 또는 항목 13에 따른 항원-결합 단편을 포함하는 항체이다.
항목 15는 항목 1 내지 10 또는 14중 임의의 것에 따른 항체와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 항체인 추가적 구현예이고, 여기서 항체는 상기 항목 중 임의의 것에 따른 항체의 CDR을 포함한다.
항목 16은 항목 15의 항체에 대응하는 바와 동일한 친화력을 갖는 FLT3에 결합하지만, FLT3에 결합하는 FL을 실질적으로 저해하는 항목 15에 따른 항체인 추가적 구현예이다.
항목 17은 항목 1 내지 10 또는 14 중 어느 하나에 따른 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산인 추가적 구현예이다.
항목 18은 항목 12 또는 13의 항체 또는 단편을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산인 추가적 구현예이다.
항목 19는 대응하는 항목의 핵산과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 항목 17 또는 18의 핵산의 추가적 구현예이다.
항목 20은 항목 17 또는 항목 18 또는 항목 19에 따른 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산을 포함하는 한 kEh는 그 이상의 발현 벡터인 추가적 구현예이다. 항목 20의 일 구현예에서, 상기 항목 중 임의의 항체의 중쇄 및 경쇄를 발현하는 하나의 발현 벡터가 존재한다. 추가적 구현예에서, 항목 20의 발현 벡터는 두 개의 프로모터를 포함한다. 항목 20의 상이한 구현예에서, 중쇄를 발현하는 하나, 및 경쇄를 발현하는 나머지 하나인, 두 개의 발현 벡터가 존재한다. 추가적 구현예에서, 항목 20의 각각의 발현 벡터는 동일한 프로모터를 포함한다. 또다른 구현예에서, 항목 20의 각각의 발현 벡터는 상이한 프로모터를 포함한다.
항목 21은 상기 항목, 항목 20에 따른 하나 또는 그 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포인 추가적 구현예이다.
항목 22는 상기 항목, 항목 21의 재조합 숙주 세포의 배양에 의해 생산된 항체인 추가적 구현예이다.
항목 23은 상기 항목, 항목 22의 항체, 및 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이다.
항목 24는 FLT3에 결합하는 항체 및 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트인 구현예이고, 여기서 항체 약물 콘쥬게이트는 FLT3이 FLT3 리간드(FL)에 결합하는 것을 실질적으로 저해한다.
항목 25는 항목 23 또는 항목 24의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 항체 및 치료제를 연결하는 링커를 추가적으로 포함한다.
항목 26은 추가적 구현예이고, 항목 25의 항체 약물 콘쥬게이트이며, 여기서 링커는 비-절단 링커이다.
항목 27은 항목 26의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 링커는 2-(아미노옥시)아세트산이다.
항목 28은 항목 23 내지 27 중 어느 하나의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 치료제는 세포독성제 또는 세포정제제이다.
항목 29는 항목 23 내지 28 중 어느 하나의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 치료제는 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드이다.
항목 30은 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 항체 약물 콘쥬게이트는 항목 23 내지 29 중어느 하나이고, 여기서 항체 약물 콘쥬게이트는 하기 구조식을 갖는다:
항체-(링커-치료제)p,
여기서 링커는 2-(아미노옥시)아세트산이고, 여기서 치료제는 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드이고 여기서 p는 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
항목 31은 항목 30의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 p는 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
항목 32는 항목 31의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 p는 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5로 구성된 군으로부터 선택된다.
항목 33은 항목 32의 항체 약물 콘쥬게이트인 추가적 구현예이고, 여기서 p는 1.8, 1.9, 및 2로 구성된 군으로부터 선택된다.
항목 34는 약학적 조성물인 추가적 구현예이고, 여기서 약학적 조성물은 항목 23 내지 33의 임의의 항체 약물 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물이다.
항목 35는 치료 용도인, 항목 24의 약학적 조성물인 추가적 구현예이다.
항목 36은 약학적 조성물인 추가적 구현예이고, 여기서 약학적 조성물은 상기 항목, 항목 35에 따르고, 여기서 치료에서의 용도는 암의 치료이다.
항목 37은 약학적 조성물의 추가적 구현예이고, 여기서 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 항-신생물 작용제와 조합된, 항목 34 내지 36 중 어느 하나이다.
항목 38은 개체에서 암을 치료하는 방법인 추가적 구현예이고, 여기서 개체에서 암을 치료하는 방법은 상기 개체에 항목 23 내지 33의 임의의 것에 따른 항체 약물 콘쥬게이트 또는 이의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 항목 37의 또다른 구현예는 개체에서 암을 치료하는 방법인 구현예이고, 여기서 개체에서 암을 치료하는 방법은 항목 33 내지 37 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
항목 39는 항목 33 내지 37 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물, 또는 항목 38에 따른 방법인 추가적 구현예이고, 여기서 암은 비-암성 세포와 비교하여 증가된 수준으로 FLT3을 발현하는 하나 또는 그 이상의 세포를 포함한다.
실시예
본 발명의 다양한 양상은 하기에 기술될 수개의 실시예의 방법에 의해 추가적으로 설명되고 묘사되는데, 이들은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다.
실시예 1
FLT3 항원
Flk2(fetal liver kinase 2), STKl(stem cell tyrosine kinase 1) 및 CD135로도 공지된, Fms 유사 티로신 키나제 3 수용체, FLT3은 유형 Ⅲ 수용체 티로신 키나제(RTK)의 구성원이다. 인간 FLT3은 993 아미노산 길이인 RTK를 인코딩하고, 이는 5개의 면역글로불린-유사 세포외 도메인 및 두 개의 세포내 티로신 키나제 도메인(TKD)와 함께 막-결합 수용체를 포함한다(Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650- 665(2003). 인간 FLT3 유전자는(유전자 ID No.: 2322 (National Center for Biotechnology Information))염색체 13q12 상에 위치하고 마우스 FLT3과 85% 아미노산 서열 유사성을 공유한다(Rosnet O et al; Oncogene 8:173-179 (1993)). FLT3은 정상 골수성 및 림프성 전구 세포에서 및 70%-90%의 AML 환자의 백혈병 세포에 의해서 발현된다(Carow, C.E et al; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet O et al; Leukemia 10:238-248 (1996) 및 모두에서). FLT3은 조혈 세포의 증식, 분화 및 세포자멸사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 많은 조혈 세포가 FLT3 리간드(FLT3L)를 생산하고, 이는 수용체 이합체화 및 활성화를 촉진함으로써 PI3키나제 및 MAPK 경로를 통한 신호전달 카스캐이드를 유도한다(Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650-665(2003)). 대략, 30%의 AML 환자가 좋지 않은 질병 결과와 연관된 구성요소인 수용체의 활성 및 하류의 신호전달 카스캐이드를 유도하는 FLT3 내부-탠덤 중복(internal-tandem duplication: ITD) 돌연변이를 보유한다(Gunawardane R N et al; Mom Cancer Ther 12:438-447 (2013)). FLT3 항원의 예시적 구현예를 위하여, 도 1을 참고한다.
실시예 2
FLT3 모노클로날 항체( MAb )의 생성
일 구현예에서, FLT3에 대한 치료적 모노클로날 항체("MAbs")는 세포 상에 발현되는 FLT3에 결합할 FLT3에 특이적인 에피토프와 반응하는 것을 포함한다. 이러한 MAbs의 생성을 위한 면역원들의 예로는 세포외 도메인 또는 전체 FLT3 단백질 서열, 기능성 모티프를 함유할 것으로 예측되는 영역 및 FLT3 단백질 서열, 기능성 모티프를 함유할 것으로 예상되는 부위, 및 아미노산의 컴퓨터 분석에 의해 항원성일 것으로 예상되는 FLT3의 부위를 인코딩하거나 함유하는 것으로 설계된 것들일 수 있다. 면역원은 (FLT3를 내인적으로 발현하거나 FLT3를 발현하도록 조작된) 펩티드, 재조합 단백질 및 세포를 포함한다.
유전자 조적된 마우스가 완전 인간 가변 부위와 마우스 불변 부위를 갖는 항체를 제조하는 VelocImmune® 기술 (Regeneron, Tarrytown, NY)을 이용하여 FLT3에 대한 MAbs를 생성하였다. VelocImmune® 마우스를 재조합 인간 FLT3 단백질로 면역화한 후 v62-1b21(AGS62.21로도 알려짐)로 표시되는 MAb를 생성하였다. FLT3 MAb, v62-1b21은 Flt3 단백질 및 Flt3 발현 세포(재조합 및 내인성)에 특이적으로 결합한다.
선별 후, v62-1b21(하이브리도마 세포주에 의해 자연적으로 생산됨)을 Ambrx (La Jolla, CA)에 의해 개발된 ReCODE 기술에 따라 (실시예 4 - 재조합 DNA 방법을 이용한 인간 CHv62.21pAF의 발현 참조), Veloclmmune® 항체(실시예 3- 재조합 DNA 방법을 이용한 CHv62.21 발현 참조) 유래인 인간 가변 서열을 결합함으로써 그러나 비-천연 아미노산을 중쇄 상의 위치 124에 포함하는 인간 불변 부위를 갖는 CHO 발현된 완전 인간 천연 항체로 전환하였다.
하이브리도마 세포를 생산하는 v62- lb21로부터 mRNA를 분리한 후 v62- lb21에 대한 DNA에 대한 서열을 결정하였다. 항-Flt3, v62- lb21 중쇄 및 경쇄 가변 핵산 서열을 하기 프로토콜을 이용하여 하이브리도마 세포로부터 유도하였다. v62- lb21을 분비하는 하이브리도마 세포를 Trizol 시약(Life Technologies, Gibco BRL)으로 용해하였다. 총 RNA를 정제하고 1번째 가닥 cDNA를 총 RNA와 올리고 (dT)12-16 프라이밍으로부터 Gibco-BRL Superscript Pre-amplification system을 사용하여 생성하였다. 이후 인간 면역글로불린 가변 중쇄 프라이머, 및 인간 면역글로불린 가변 경쇄 프라이머를 사용하여 1번째 가닥 cDNA를 증폭하였다. PCR 산물을 서열분석하고 가변 중쇄 및 경쇄 부위를 결정하였다.
가변 중쇄 및 경쇄 부위의 핵산 및 아미노산 서열을 도 2A 및/또는 2B 및 도 3A 및/또는 3B에 나열하였다. 인간 Ig 생식세포주에 대한 CHv62.21 MAb의 정렬을 도 4A-4B에 나타내었다.
실시예 3
재조합 DNA 방법을 이용한 CHv62 .21의 발현
형질감염된 세포에서 CHv62.21 MAb를 재조합적으로 발현하기 위해서, v62.21 하이브리도마 MAb 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 IgG1 및 인간 경쇄 Igκ 불변 부위 각각의 상류에 클로닝하였다. 완전한 CHv62.21 MAb 인간 중쇄 및 경쇄 카세트를 클로닝 벡터 내의 CMV 프로모터/인핸서의 하류에 클로닝하였다. Lonza GS system (Lonza, Basel, Switzerland)에서 안정한 발현을 위하여 재조합 CHv62.21 MAb 발현 컨스트럭트(construct)를 CHO 세포로 형질감염시켰다. 재조합 CHO 세포로부터 분비되는 CHv62.21 MAb를 정제하고 유세포분석에 의해 세포 표면 FLT3에 대한 결합을 측정하였다. 결과는 CHO 세포에서 발현된 재조합 CHv62.21 항체가 세포 표면 상의 FLT3에 결합함을 나타낸다.
CHv62 .21로 지정된 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 2014년 12월 09일에 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549의 ATCC(American Type Culture Collection)에 보내어(Federal Express를 통해) 수탁번호 PTA- 121831를 부여받았다.
가변 중쇄 및 경쇄 부위의 핵산 및 아미노산 서열을 도 2A 및/또는 2B 및 도 3A 및/또는 3B에 나열하였다.
실험적 분석법의 결과로서, 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 프로테아제 절단, LCMS 분석법 등)을 사용한, CHO 세포에서 유래한 CHv62.21 MAb의 아미노산 변형(들)은, 대부분의 정제된 CHv62.21 MAb에서 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실이 발생하였고 중쇄의 N 말단에서 피로글루타민화(pyroglutamylation) 및 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실이 일부의 정제된 CHv62.21 MAb에서 발생하였음을 나타내었다.
실시예 4
재조합 DNA 방법을 이용한 인간 CHv62 . 21pAF의 발현
형질감염된 세포에서 CHv62.21pAF를 재조합적으로 발현하기 위해서, v62- lb21 하이브리도마 MAb 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 IgG1 및 인간 경쇄 Igκ 불변 부위 각각의 상류에 클로닝하였다. 완전한 CHv62.21 MAb 인간 중쇄 및 경쇄 카세트를 클로닝 벡터 내의 CMV 프로모터/인핸서의 하류에 클로닝하였다. 이후 재조합 CHv62.21 MAb 발현 컨스트럭트를 CHO pAFsup l-4E2 세포(Ambrx, La Jolla, CA)로 형질감염시키고, 이는 앰버 억제자 tRNA 및 pAF-특이적 아미노아실 tRNA 신타제를, 안정한 클론의 생성을 위하여 안정하게 발현한다. pAF를 MAb로 포함시킴으로써 안정한 클론은 CHv62.21pAF를 생산한다. 안정한 클론이 유전자 증폭되게 한 후 서브클로닝 하였다. 안정한 서브클론으로부터 분비되는 CHv62.21pAF를 정제하고 유세포분석에 의하여 세포 표면 FLT3에 대한 발현을 평가하였다. 결과는 CHO 세포에서 발현되는 재조합 CHv62.21pAF 항체가 세포 표면 상의 FLT3에 발현함을 나타낸다.
CHv62.21pAF로 지정된 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 2014년 12월 09일에 미국 버지니아 20108 마나사스 사서함 1549의 ATCC(American Type Culture Collection)에 보내어(Federal Express를 통해) 수탁번호 PTA-121836을 부여받았다.
가변 중쇄 및 경쇄 부위의 핵산 및 아미노산 서열을 도 2C 및/또는 2B 및 도 3C 및/또는 3B에 나열하였다.
실험적 분석법의 결과로서, 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 프로테아제 절단, LCMS 분석법 등)을 사용한, CHO 세포에서 유래한 CHv62.21pAF MAb의 아미노산 변형(들)은, 대부분의 정제된 CHv62.21pAF MAb에서 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실이 발생하였고 중쇄의 N 말단에서 피로글루타민화(pyroglutamylation) 및 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실이 일부의 정제된 CHv62.21pAF MAb에서 발생하였음을 나타내었다.
실시예 5
링커 유닛 AGL의 생성
바람직한 구현예에서, AGL로 표시되는 본 발명의 링커 유닛은 본 발명의 FLT3 MAb, 바람직하게는 CHv62.21pAF를 본 발명의 약물 유닛, 바람직하게는 2-(아미노옥시)아세트산(Chem-Impex International, Inc., Wood Dale, IL)으로 보통 알려진 AGD-0182와 연결하기 위해 사용된다.
추가적 구현예에서, 본 발명의 AGL 링커 유닛은 하기의 구조식을 갖는다:
Figure pct00028
실시예 6
AGD -0182 약물 유닛의 생성 및 합성
구조식 (II)로 기재된 약물 유닛은 하기의 과정을 사용하여 생산된다. 우선, CH2Cl2 (20.0 mL) 중 Boc-Dap-OH 디사이클로헥실아민 (10.0 g, 21.3 mmol) 및 H-Phe NH2 HCl 염 (6.42 g, 32.0 mmol)의 교반된 23℃의 현탁액에 DIEA (11.0 g, 14.9 mL, 85.3 mmol)을 첨가한 후, DEPC (5.19 g, 4.80 mL, 0.032 mol)를 첨가하였다. 10 시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응물을 H2O (25 mL x 2), 이어서 염수 (25 mL x 2)로 세척하였다. 유기 분획을 황산 마그네슘 패드상에서 건조시키고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 오렌지색 오일을 용리액으로서 CH2Cl2 중의 2 내지 10 % 메탄올을 사용하여 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔 40 ㎛, 60Å, 크기)로 정제 하였다. 총 7.25 g의 Boc-Dap-Phe-NH2 (16.7 mmol, 78 %)를 황색 오일로서 수득 하였다. LCMS RT = 1.28 분 (방법 B); ESI-MS m / z 434.19 [M + H]+.
두 번째로, CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc-Dap-Phe-NH2 (7.25 g, 16.7 mmol)의 교반 된 23℃의 현탁액에 TFA (10 mL)를 첨가하였다. 5 시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 휘발성 유기물을 진공하에 증발시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제없이 사용하였다. 총 6.00g의 H-Dap-Phe-NH2를 오렌지색 고체로서 수득하였다 (13.4mmol, 80 %). LCMS RT = 0.691 분 (방법 B); ESI-MS m / z 334.17 [M + H]+.
이어서, DMF (10 mL) 용액 중 Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA 염 (456 mg, 0.586 mmol) 및 H-Dap-Phe-NH2 TFA 염 (457 mg, 1.02 mmol)에 DIEA (0.350 g, 0.500 mL, 2.74 mmol)를 첨가 한 다음 HATU (0.520 g, 1.37 mmol)를 첨가하였다. 10 시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응물을 용리액으로 서 0.1 % 수성 포름산 중 10 % 내지 90 % MeCN을 사용하여 Phenomenex Gemini NX-C18 10μ l10Å 컬럼 (150 x 30mm)으로 예비 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 총 526 mg의 Fmoc MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2를 포름산 염 (0.513 mmol, 75 %)으로 수득하였다. LCMS RT = 1.81 분 (방법 B); ESI-MS m/z 980.39 [M+H]+.
마지막으로, 아세토니트릴 (10 mL) 중 Fmoc-MeVal-Abu 3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (525 mg, 0.513 mmol)의 교반된 23℃ 용액에 피페리 딘 (5 mL)을 첨가하였다. 2 시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응 용액에 헥산 (15 mL x 3)을 첨가 하였다. 아세토니트릴 층을 진공에서 농축시켰다. 조 오일을 0.1 % 수성 TFA 중 5% 내지 95% MeCN을 용리액으로 사용하여 Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å 컬럼 (150 x 30mm)으로 예비 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 총 354 mg의 표제 화합물을 TFA 염으로서 수득하였다 (0.406 mmol, 79 %). LCMS RT = 1.15분 (방법 B); ESI-MS m/z 758.24 [M+H]+;HRMS m/z 758.4915 [C38H63N9O7+H]+.
상기 기술된 합성은 하기 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드로 지정된 약물 유닛을 생산하였고, 이는 구조식 (II)로 개시된다:
Figure pct00029
실시예 7
약물 링커 AGL 및 AGD -0182 약물 유닛의 합성
AGL 링커 유닛 및 AGD-0182 약물 유닛의 합성은 하기 방법으로 완결된다.
방법 A는 하기의 과정 및 프로토콜을 사용하여 기술된다:
0-0.50 분 : 등용매(isocratic) 80 물/10 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산; 0.50-3.50 분 : 선형 구배 80 물/10 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산 내지 0 물/90 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산; 3.50-3.99 분 등용매 0 물/90 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산; 3.99-4.00 분 선형 구배 0 물/90 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산 내지 80 물/10 아세토니트릴/물 중 10% 포름산.
방법 B는 하기의 과정 및 프로토콜을 사용하여 기술된다:
0-0.50 분 : 등용매 85 물/5 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산; 0.50-1.60 분 : 선형 구배 85 물/5 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산 내지 0 물/98 아세토니트릴/2 물 중 1% 포름산; 1.60-1.80 분 등용매 0 물/98 아세토니트릴/2 물 중 1% 포름산; 1.80-1.90 분 선형 구배 0 물/98 아세토니트릴/2 물 중 1% 포름산 내지 85 물/5 아세토니트릴/10 물 중 1% 포름산; 1.90-2.00 분 등용매 85 물/5 아세토니트릴/10 물 중 1 % 포름산.
상기 방법을 사용하여, 하기와 같이 합성하였다:
CH2Cl2 (20.0 mL) 중 Boc-Dap-OH 디사이클로헥실아민 (10.0 g, 21.3 mmol) 및 H-Phe-NH2 HCl 염 (6.42 g, 32.0 mmol)의 교반된 23℃의 현탁액에 DIEA (11.0 g, 14.9 mL, 85.3 mmol)를 첨가 한후, DEPC (5.19 g, 4.80 mL, 0.032 mol)를 첨가하였다. 10시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응물을 H2O (25 mL x 2), 이어서 염수 (25 mL x 2)로 세척하였다. 유기 분획을 황산 마그네슘 패드상에서 건조시키고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 오렌지색 오일을 용리액으로서 CH2Cl2 중의 2% 내지 10% 메탄올을 사용하여 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔 40 ㎛, 60Å, 크기)에 의해 정제하였다. 총 7.25 g의 Boc-Dap-Phe-NH2 (16.7 mmol, 78 %)를 황색 오일로 수득하였다. LCMS RT =1.28분 (방법 B); ESI-MS m/z 434.19 [M+H]+.
CH2Cl2 (10 mL) 중 Boc-Dap-Phe-NH2 (7.25 g, 16.7 mmol)의 교반된 23℃의 현탁액에 TFA (10 mL)를 첨가하였다. 5시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 휘발성 유기물을 진공하에 증발시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. 총 6.00g의 H-Dap-Phe-NH2를 오렌지색 고체로 수득하였다 (13.4mmol, 80 %). LCMS RT = 0.691분 (방법 B); ESI-MS m/z 334.17[M+H]+.
DMF (10 mL) 중 Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA 염 (456 mg, 0.586 mmol) 및 H-Dap-Phe-NH2 TFA 염 (457 mg, 1.02 mmol)의 교반된 23℃에 DIEA (0.350 g, 0.500 mL, 2.74 mmol)를 첨가 한 다음 HATU (0.520 g, 1.37 mmol)를 첨가하였다. 10시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응물을 0.1% 수성 포름산 중 10% 내지 90% MeCN을 용리액으로 사용하여 Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å 컬럼 (150 x 30mm)으로 예비 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 총 5c-MeVal Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2를 포름산 염으로서 수득하였다 (0.513 mmol, 75 %). LCMS RT = 1.81분 (방법 B); ESI-MS m/z 980.39[M+H]+.
아세토니트릴 (10 mL) 중 Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (525 mg, 0.513 mmol)의 교반된 23℃ 용액에 피페리딘 (5 mL)을 첨가하였다. 2시간 후, LCMS에 의한 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 조 반응 용액에 헥산 (15 mL x 3)을 첨가하였다. 아세토니트릴 층을 진공에서 농축시켰다. 조 오일을 용리제로서 1.1 % 수성 TFA 중 5% 내지 95% MeCN을 사용하는 Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å 컬럼 (150 x 30mm)으로 예비 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 총 354 mg의 결과물 화합물 (MeVal-Abu(3-N3)Dil-Dap-Phe-NH2)을 TFA 염 (0.406 mmol, 79 %)으로 수득하였다. LCMS RT = 1.15분 (방법 B); ESI-MS m/z 758.24[M+H]+; HRMS m/z 758.4915[C38H63N9O7+H]+.
DMF (7.0 mL) 및 DCM (15.0 mL) 중 MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2.0 g, 2.64 mmol) 및 Boc-Aoa(0.53 g, 2.77 mmol)의 교반된 23℃ 용액에 HATU (1.05 g, 2.77 mmol)를 첨가한 후, DIPEA (0.51 mL, 2.92 mmol)를 첨가 하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켜 조 DMF 용액을 수득하고 이를 150 mL의 EtOAc로 추가로 희석시켰다. 조 반응 혼합물을 100 mL의 Sat로 세척 하였다. NaHCO3,이어서 100 mL의 염수로 세척하였다. 유기 분획을 황산 마그네슘 패드상에서 건조시키고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 조 Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2를 용리액으로서 CH2Cl2 중의 2% 내지 10%메탄올을 사용하여 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔 40 ㎛, 60Å, 크기)에 의해 정제하였다. 총 2.13g의 Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2.29mmol, 87 %)를 베이지 색 고체로 수득하였다. LCMS RT = 1.46분 (방법 A); ESI-MS m/z 931.46[M+H]+.
디옥산 (15.0 mL) 중 Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2.1 g, 2.26 mmol)의 교반된 23℃ 용액에 디옥산 중 4 M HCl mL, 40.0 mmol)을 첨가하였다. 0.5시간 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 조 연한-황색 오일을 수득하였다. 조 연한-황색 오일을 6 mL의 메탄올에 용해시키고, 150 ml의 EtOAc 용액을 격렬하게 교반하면서 천천히 첨가하였다. 용액으로부터 백색 침전물을 얻었다. 백색 침전물을 여과하여 수집하고, 상등액을 고체로 농축시켰다. 백색 침전물과 농축 상등액을 0.001M 염산 중 5% 내지 95% MeCN을 용리액으로서 사용하는 Phenomenex Gemini 10μ, C18 110Å 컬럼 (150 x 30mm)으로 예비 RP-HPLC에 의해 여러 번 정제 하였다.
결과인 생성물 분획을 합치고, 농축시키고, 진공하에 18 시간 동안 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 총 1.31 g의 AGL -0182-30·HCl (1.51 mmol, 67 %)을 수득하였다. LCMS RT = 1.16분 (방법 A); ESI-MS m/z 831.27[M+H]+. (일반적으로 표 Ⅳ 참조).
바람직한 구현예에서, AGL-0182-30는 하기의 구조식을 갖는다:
Figure pct00030
실시예 8
CHv62 . 21pAF MAb의 학체 약물 콘쥬게이션
하기 프로토콜을 사용하여, CHv62.21pAF Mab를 본원에 기술된 알콕시아민 링커를 사용하여 AGL-0182-30으로 지정된 돌아이소루인(dolaisoleuine)-돌아프로인(dolaporine)을 함유하는 펩티드에 콘쥬게이션시켜 CHv62.21pAF-AGL-0182-30로 지정된 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)를 제조하였다.
AGL-0182-30 약물 링커의 합성은 "약물 링커 AGL 및 AGD-0182 약물 유닛"이라는 제목의 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 달성하였다.
다음으로, cHv62.21pAF­ AGL-0182-30로 지정된 본 발명의 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)를 하기의 프로토콜을 사용하여 제조하였다.
간략히, 4.0의 최종 pH에서 500 mM NaCl을 함유하는 50 mM 시트르산 완충액 중에 제형화된 17.17 mg/mL 농도의 CHv62.21pAF Mab 215.5 mL를 4.0의 최종 pH에서 500 mM NaCl을 함유하는 50 mM 시트르산 완충액 9.7 mL, 9.1 mL의 1.35 M 아세틱 히드라지드 (물에 용해됨), DMSO 7.26 mL, 및 AGL-0182-30 (DMSO에 용해됨)의 50 mM 용액 5.08 mL를 첨가하였다. 콘쥬게이션은 28℃에서 16-24 시간 동안 진행될 수있다. 과량의 AGL-0182-30 및 기타 소분자 반응 성분을 5% 트레할로오스를 함유하는 20 mM 히스티딘 pH 6.0의 12 다이아볼륨으로 한외여과/정용여과하여 제거하였다.
결과물인 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)를 CHv62.21pAF-AGL-0182-30로 지정하고 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00031
여기서 Mab는 CHv62.21pAF이고 p는 1.8 내지 2.0이다. 질량 분석기 분석법에 의해 본 실시예에 기술된 항체 약물 콘쥬게이트의 평균 p 값은 약 1.9이다. 본 발명의 일 구현예에서, p 값은 1.5 내지 2.5 이다.
본 발명의 결과물 ADC는 ADC의 항체 성분으로 nnAA를 포함함으로써 약물 링커가 옥심을 통해 콘쥬게이트되고 표 Ⅰ에 기술된 암의 치료적 치료를 위하여 사용된다.
실시예 9
CHv62 .21 MAb의 특징화
FLT3에 결합하는 MAbs를 "FLT3 모노클로날 항체(MAbs)의 생성"이라는 제목의 실시예에 기술된 과정을 이용하여 생산하고 공지기술의 분석법들을 조합하여 이를 스크리닝, 동정 및 특징화하였다.
A. FACS 결합
인 비트로에서 증식시킨 AML 및 B-ALL 세포주 (표 7 참조)에 대한 결합에 대해 CHv62.21을 검사하였다. 간략히, CHv62.21 및 아이소타입 매칭된 대조군 항체를 NHS LC 비오틴을 이용하여 비오티닐화시켰다. 인 비트로에서, 모든 실험에서 대수적으로 증식하는 암 세포주들을 이용하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확 및 세척하였다. 세포를 Fc 차단하여 비-특이적 결합을 감소시켰다. 항체를 10㎍/mL 최종 농도로 희석하고 4℃ 에서 1시간 동안 세포와 함께 공동-인큐베이션시켰다. 인큐베이션 종기에, 세포들을 세척하고 2차 검출 스트렙트아비딘-PE 항체와 함께 최종 1:200 (1.25㎍/mL) 희석 비율로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미-결합 2차 항체를 세척한 후, 세포를 FACS에 의해 분석하고 기하학적 평균 형광을 결정하고 기록하였다. 형광 비율은 다음과 같이 계산하였다: 기하 평균 cHv62.21/기하 평균 아이소타입 대조군=MFR, 아이소타입 대조군을 상회하는 배(fold) 발현의 측정.
기하 평균값 및 평균 형광 비 (Mean Florescence ratios: MFR) 값을 구하고 (표 Ⅵ) 히스토그램을 나타내었다 (표 Ⅶ). 그 결과 CHv62.21이 AML 및 B-ALL을 발현하는 몇몇 인간 암 세포주에 결합하는 것으로 나타났다.
B. ADCC 활성
CHv62.21 및 CHv62.21pAF를 인 비트로에서 ADCC 활성에 대해 시험하였다. 간단히 말하면, 네이키드 및 ADC 항-FLT3 모노클로날 항체, CHv62.21 및 CHv62.21pAF를 이펙터(effector) 세포, 정상 인간 PBMC의 존재하에 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, G 1780)를 이용하여 타겟 세포주 EOL-1 및 SEM을 사용하여, 항체 의존성 세포독성 활성 (antibody dependent cytotoxicity activity: ADCC)을 매개하는 그들의 능력에 대해 시험 하였다.
분석을 수행하기 1 일 전에, 이펙터 세포, 정상 인간 PBMC (Hemacare, Donor ID : 1888)의 바이알 3 개를 해동하고, 세척하고, 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 내 T-175 세포 배양 플라스크에 플레이팅 하고 37℃ 5% CO2 배양기에 밤새 보관 하였다. 다음날, PBMC를 0.25% 트립신-EDTA (Gibco)를 사용하여 배양 플라스크로부터 수확하고, 세척하고 분석 완충액 (RPMI1640 + 0.1%FBS)에서 1.0e6 세포/웰의 농도로 접종하였다. 양성 대조군 세포주인 Raji와 함께 타겟 세포 SEM 및 EOL-1을 수확하고, 세척하고, 분석 완충액을 사용하여 2.0e5 세포/웰의 농도로 접종하였다.
시험 시료를 각각 분석 완충액 중 2.5ug/mL의 최종 농도로 희석하였다. 균등 부피의 타겟 세포, 시험 시료 및 이펙터 세포를 96- 웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 3번 첨가하였다. 플레이트를 부드럽게 원심 분리하고 가습된 37℃ 배양기에서 4 시간 동안 배양했다. 4 시간 동안 배양 한 후, 분석 플레이트를 원심 분리하고 50μl 부피의 상등액을 수확하고 새로운 96- 웰 플레이트로 옮겼다. 상등액 중의 락테이트 디히드로게나제의 활성은 비색 LDH 검출 키트; 490 nm에서 흡광도를 측정하는 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)를 사용하여 결정하였다.
데이터는 먼저 실험(Experimental), 이펙터 자발적(Effector spontaneous), 타겟 자발적(Target Spontaneous) 및 타겟 최대(Target maximum) 웰의 모든 흡광도 값에서 배지 배경 웰(Culture Medium Background well)의 흡광도 값의 평균을 뺀 값으로 분석하였다. 다음으로 보정된 흡광도 판독 값의 평균을 정규화하고 ADCC 활성을 하기 식을 사용하여 계산 하였다:
Figure pct00032
도 7의 결과는 CHv62.21 및 CHv62.2lpAF MAbs가 ADCC 활성을 나타내지 않음을 나타내었다. 그러나, 양성 대조군, 리툭시맙은 Raji 세포주에서 ADCC 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.
실시예 10
인 비보에서 CHv62 . 21pAF - AGL -0182-30은 종양의 성장을 저해한다
종양 세포에서의 FLT3의 발현은 정상 세포에서의 제한적인 발현과 함께 FLT3을 항체 치료 및 ADC 치료를 위한 좋은 타겟으로 만들었다. 따라서, 인간 ALL, AML, and E-LL 암 이종이식 마우스 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 치료적 효능을 평가하였다.
종양 성장 및 전이 형성에 대한 항체 약물 콘쥬게이트의 효능을 마우스 암 이종이식 모델 (예를 들어 피하 및 정상위치)에서 연구하였다.
피하(s.c.) 종양은 수컷 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에서 Matrigel (Collaborative Research)로 1:1 희석하여 혼합된 5 x 104-106 암세포를 주사하여 생성하였다. 종양 형성에 대한 ADC 효능을 시험하기 위해, 즉, ADC 주사는 종양 세포 주사와 같은 날에 시작하였다. 대조군으로서, 마우스에게 정제된 인간 IgG 또는 PBS; 또는 인간 세포에서 발현되지 않는 무관한 항원을 인식하는 정제된 MAb를 주사하였다. 예비 연구에서 대조군 IgG와 PBS 사이에는 종양 성장에 차이가 없었다. 종양 크기는 caliper 측정에 의해 결정되며, 종양 부피는 폭2 x 길이/2로 계산되며, 여기서 폭은 가장 작은 치수이고 길이는 가장 큰 치수이다. 직경 1.5cm 이상의 피하 종양을 갖는 마우스를 희생하였다.
이종 이식 암 모델의 장점은 신혈관화(neovascularization) 및 혈관 신생을 연구하는 능력이다. 종양 성장은 부분적으로 새로운 혈관 발달에 의존한다. 모세 혈관 시스템과 혈액 네트워크의 발달이 숙주 기원이지만, 신생 혈관의 개시 및 구조는 이종 이식 종양에 의해 조절된다(Davidoff et al., Clin Cancer Res. (2001) 7:2870; Solesvik et al., Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20:1295). 신생 혈관 형성에 대한 항체 및 소분자의 효과는 종양 조직 및 그 주변 미세 환경의 IHC 분석에 의해 당 업계에 공지된 과정에 따라 연구하였다.
CHv62.21pAF-AGL-0182-30 ADC는 MV4-11로 지정된 피하로 확립된 암 이종 이식편 암세포주(들)에서의 형성을 억제한다. 이러한 결과는 암 및 바람직하게는 표 Ⅰ 에 기술된 암의 국소 및 진행 단계에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 유용성을 나타내었다.
FLT3 ADCs :
모노클로날 항체는 "FLT3 모노클로날 항체 (MAbs)의 생성"이라는 제목의 실시예에 기술된 바와 같이 FLT3에 대하여 생성된다. 또한, MAb는 CHv62.2lpAF-AGL-0182-30을 형성하기 위한 "CHv62.21pAF MAb의 항체 약물 콘쥬게이션"이라는 제목의 실시예에 기술된 바와 같이 독소에 콘쥬게이션된다. CHV62.2lpAF 및 CHv62.2lpAF-AGL-0182-30은 FACS 및 FLT3에 결합하는 그의 능력을 결정하기 위한 당 업계에 공지 된 다른 방법으로 특징화된다.
세포주 및 이종 이식:
세포는 당 업계에 공지된 바와 같이, L- 글루타민 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 유지된다. MV4-11 이종 이식은 SCID 마우스에서 연속 증식에 의해 유지된다.
CB17/ SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11의 피하수립된 이종이식 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30의 효능 및 용량 적정.
이 실험에서, 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11 세포(마우스 당 3.0x106 세포)를 개별 SCID 마우스의 측면에 주입하고 종양 성장을 허용하도록 하였다. 평균 종양 부피가 미리 결정된 크기 (200 mm3)에 도달했을 때, 연구 디렉터 소프트웨어 (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)를 사용하여 유사한 종양 크기 및 유사성을 갖는 치료군 및 대조군으로 종양 크기를 매칭하고 무작위로 분류하였다. 모든 연구 마우스에게 약물 투여 일 이전 오후에 복막 주사에 의해 20 mg/kg로 Fc 차단제 (mLYS-1c1.h-hIgG1)를 프리-로드(pre-load) 하였다.
CHV62.21pAF-AGL-0182-30을 정맥 내 주사에 의한 단일 볼러스로서 3가지 상이한 투여 수준 (0.5, 1.0 및 2.0mg/kg)으로 투여하였다. 20mM 히스티딘 / 5% 트레 할로스, pH 6.0 및 91.1-AGL-0182-30을 각각 비히클 및 ADC 대조군으로 사용하였다. 모든 시약을 각 투여 직전에 얻은 각 동물의 개별 체중에 기초하여 투여하였다. 각 군의 종양 성장은 연구가 끝날 때까지 caliper 측정을 사용하여 매주 2 회 모니터링하였다. Kruskal-Wallis 검사를 사용하여 동물 희생 전 마지막 날의 종양 부피 데이터에 대한 통계 분석을 수행하였다. 실험적 오류율을 보호하기 위해 Tukey의 테스트 절차 (2면)를 사용하여 쌍으로 비교하였다.
이 연구는 CHv62.2lpAF-AGL-0182-30의 효능을 평가하고 CB17/SCID 마우스에 피하 수립된 MV4-11 인간 B 골수단핵구 백혈병 이종이식 모델에서 ADC 대조군(91.1-AGL-0182-30)과 비교했다. CHV62.21pAF-AGL-0182-30을 정맥 내 (i.v.) 볼 러스 주사에 의한 단일 투여량으로서 3가지 상이한 투여량 수준 (0.5, 1.0 및 2.0mg /kg)으로 투여하였다. 91.1-AGL-0182-30에는 ADC 대조군으로서 i.v.로 2 mg/kg을 투여하였다. 그리고 20mM 히스티딘/5% 트레할로스, pH 6.0을 비히클 대조군으로 사용하였다.
결과는 비히클 및 ACD 대조군의 치료 사이에 통계적으로 차이가 없음을 보여 주었다 (p> 0.9999). 2.0 mg/kg에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30은 투여 개시 시점의 종양 크기와 비교하여 종양을 100 % (p <0.0001) 통계적으로 유의하게 억제시켰다. 비히클 대조군에 비해, 1.0mg/kg에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30은 78.1 %까지 종양 성장을 통계적으로 유의하게 억제하였다 (p <0.0001). CHv62.21pAF-AGL-0182-30은 0.5 mg/kg (p = 0.5344)의 투여량에서 이 모델에서 효력을 나타내지 않았다(도 5).
CB17 SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11의 피하수립된 이종이식 모델에서 CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC) 및 CHv62 . 21pAF(네이키드 항체)의 효능.
또 다른 실험에서, 인간 B 골수단핵구 백혈병 MV4-11 세포(마우스 당 3.0x106 세포)를 각각의 SCID 마우의 측면에 주입하고 종양 성장을 허용하였다. 평균 종양 부피가 미리 결정된 크기 (200 mm3)에 도달했을 때, 연구 디렉터 소프트웨어 (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)를 사용하여 동물을 종양 크기 매칭하고 유사한 평균 종양 크기 및 유사성을 갖는 치료 및 대조군으로 무작위 분류하였다. 모든 연구 마우스에게 약물 투여 일 전의 오후에 복막 주사에 의해 20 mg/kg의 Fc 차단제 (mLYS-1c3.1-hIgG1)로 프리-로드 하였다. CHV62.21pAF-AGL-0182-30 및 ADC 대조군 (91.1-AGL-0182-30)을 정맥 주사에 의한 단일 볼러스로서 1 mg/kg으로 투여하였다. AGS62P (a.k.a.CHv62.21pAF) 및 네이키드 항체 대조군 (91.1-pAF)을 정맥 주사에 의한 단일 볼러스로서 2mg/kg으로 투여 하였다. 모든 시약은 각 투여 직전에 얻은 각 동물의 개별 체중에 기초하여 투여 하였다. 각 군의 종양 성장을 연구가 끝날 때까지 caliper 측정을 사용하여 매주 2 회 모니터링하였다. Kruskal-Wallis 검사를 사용하여 동물 희생 전 마지막 날의 종양 부피 데이터에 대한 통계 분석을 수행하였다. 실험적 오류율을 보호하기 위해 Tukey의 테스트 절차 (2면)를 사용하여 쌍으로 비교하였다.
이 연구는 CHv62.2lpAF-AGL-0182-30(ADC) 및 CHv62.2lpAF(네이키드 항체)의 효능을 평가했다.
결과는 ADC 대조군(91.1-AGL-0182.30)과 비교하여, 1.0 mg/kg에서의 정맥 주사에 의한 단일 투여량으로서의 CHv62.21pAF-AGL-0182-30은 종양 성장을 통계적으로 유의하게 51.4 % 억제한다는 것을 보여준다 (p = 0.0010 ). 네이키드 항체 대조군(91.1-pAF)과 비교하여, 2.0 mg/kg에서의 정맥 주사에 의한 단일 투여량으로서 CHv62.21pAF는 통계적으로 차이가 없었다 (p = 0.6570). 또한 결과는 1.1 mg/kg에서의 CHv62.21pAF-AGL-0182-30이 2.0 mg/kg에서의 CHv62.21pAF (p = 0.0134)와 비교하여 54.3 %으로 종양 성장을 통계적으로 유의하게 억제함을 확인하였다(도 6).
CB17 SCID 마우스에 이식된 인간 B 골수단핵구 백혈병 세포주 MV4-11의 피하 수립된 이종이식 모델에서 CHv62 . 21pAF - AGL -0182-30( ADC ) 및 CHv62 . 21pAF ( 네이키드 항체)의 효능.
또 다른 실험에서, 인간 B 골수단핵구 백혈병 MV4-11 세포(마우스 당 3.0x106 세포)를 각각의 SCID 마우의 측면에 주입하고 종양 성장을 허용하였다. 평균 종양 부피가 미리 결정된 크기 (200 mm3)에 도달했을 때, 연구 디렉터 소프트웨어 (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)를 사용하여 동물을 종양 크기 매칭하고 유사한 평균 종양 크기 및 유사성을 갖는 치료 및 대조군으로 무작위 분류하였다. 모든 연구 마우스에게 약물 투여 일 전의 오후에 복막 주사에 의해 20 mg/kg의 Fc 차단제 (mLYS-1c3.1-hIgG1)로 프리-로드 하였다. CHV62.21pAF-AGL-0182-30 및 ADC 대조군 (91.1-AGL-0182-30)을 정맥 주사에 의해 2 mg/kg QW로 2주 동안 투여하였다. AGS62P (a.k.a.CHv62.21pAF) 및 네이키드 항체 대조군 (91.1-pAF)을 정맥 주사에 의해 2mg/kg QW로 1주 동안 투여 하였다. 모든 시약은 각 투여 직전에 얻은 각 동물의 개별 체중에 기초하여 투여 하였다. 각 군의 종양 성장을 연구가 끝날 때까지 caliper 측정을 사용하여 매주 2 회 모니터링하였다. Kruskal-Wallis 검사를 사용하여 동물 희생 전 마지막 날의 종양 부피 데이터에 대한 통계 분석을 수행하였다. 실험적 오류율을 보호하기 위해 Tukey의 테스트 절차 (2면)를 사용하여 쌍으로 비교하였다.
이 연구는 2 주간에 걸쳐 다중 투여군을 사용하여 CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) 및 Chv62.21pAF (네이키드 항체)의 효능을 평가했다.
결과는 ADC 대조군 (91.1-AGL-0182.30)과 비교하여, 정맥 주사에 의한 다중 투여으로서의 2.0 mg/kg에서의 CHv62.21pAF-AGL-0182-30이 17일차에 100 % 종양 억제와 함께 종양 성장을 통계적으로 유의하게 억제하였음을 나타낸다 (p = 0.0001). 네이키드 항체 대조군 (91.1-pAF)과 비교하여, 정맥 주사에 의한 다중 투여로서 2.0 mg/kg에서의 CHv62.21pAF는 통계적으로 차이가 없다(도 13).
CB17 SCID 마우스에서 피하 수립된 SEM - xcl 이종이식 모델에서 CHv62 . 2lpAF -AGL-0182-30의 효능.
또 다른 실험에서, 인간 급성 림프모구 백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia) SEM-xcl 세포(마우스 당 1.0x106 세포)를 각각의 SCID 마우의 측면에 주입하고 종양 성장을 허용하였다. 평균 종양 부피가 미리 결정된 크기 (200 mm3)에 도달했을 때, 연구 디렉터 소프트웨어 (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)를 사용하여 동물을 종양 크기 매칭하고 유사한 평균 종양 크기 및 유사성을 갖는 치료 및 대조군으로 무작위 분류하였다.
CHV62.2lpAF-AGL-0182-30을 정맥 내 주사에 의해 0 일차에 단일 볼러스 투여로서 5.0mg/kg, 2.0mg/kg 또는 1.0mg/kg으로 투여하였다. 대조군 ADC, AGS91.l-pAF-AGL-0182-30을 동일한 경로 및 투여 스케줄을 사용하여 5.0 mg/kg으로 투여하였다. 20 mM 히스티딘/ 5% 트레할로스, pH 5.2를 비히클로 사용하였다. 모든 시약을 각 투여 직전에 얻은 각 동물의 개별 체중에 기초하여 투여하였다. 각 군의 종양 성장은 연구가 끝날 때까지 caliper 측정을 사용하여 매주 2 회 모니터링하였다. Kruskal-Wallis 검사를 사용하여 동물 희생 전 마지막 날의 종양 부피 데이터에 대한 통계 분석을 수행하였다. 실험적 오류율을 보호하기 위해 Tukey의 테스트 절차 (2면)를 사용하여 쌍으로 비교하였다.
결과는 대조군 ADC, AGS91.l-pAF-AGL-0182, 또는 히비클 대조군과 비교했을 때 세 가지 투여량 수준 (5.0, 2.0 및 1.0mg/kg)에서 CHv62.2lpAF-AGL-0182-30의 강력한 항종양 활성 증명을 나타내었다. (p <0.0001), 일반적으로 75 % 이상의 종양 성장 억제를 초래하였다. 또한, 5.0 mg/kg을 투여한 경우, CHV62.2lpAF-AGL-0182-30은 초기 시작 종양 부피와 비교하여 종양을 57.3 %만큼 유의하게 역제하였다. 5.0 mg/kg과 2.0 mg/kg 또는 1.0 mg/kg 사이의에서 통계적으로 유의한 효능의 차이가 관찰되었다(도 14).
결론
요약하면,도 5, 도 6, 도 13 및 도 14는 FLT3에 결합하는 대조군 ADC 및 네이키드 항체와 비교할 때 CHV62.2lpAF AGL-0182-30이라는 제목의 FLT3 ADC가 FLT3를 발현하는 종양 세포의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 보여준다. 따라서, CHv62.2lpAF-AGL-0182-30은 표 Ⅰ에 기술된 암을 치료하고 관리하기 위한 치료 목적으로 사용될 수 있다.
실시예 11
FLT3 ADC의 사용을 통한 인간 암종의 치료 및 진단을 위한 인간 임상 시험
FLT3 ADC는 FLT3에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따라 사용하고, 특정암, 바람직하게는 표 I에 나열된 것들의 치료에 사용된다. 이러한 각각의 지침과 관련하여 두 가지 임상적 접근법이 성공적으로 추구된다.
I.) 보조 요법(Adjunctive therapy): 보조 요법에서, 환자는 화학적 요법 또는 항-종양성 약제 및/또는 방사능 요법 또는 이들의 결합과 조합하여 FLT3 ADC으로 처리된다. 표 I에 열거된 것과 같은 1차 암 타겟을 FLT3 ADC을 표준 제1선 및 제2선 치료법에 부가하는 것에 의하여 표준 프로토콜하에서 처리하였다. 하기 실시예에서 검토된 바와 같이, 프로토콜 디자인은 비제한적인 예로서, 표준 화학요법 및 다른 생물학적 약제의 일반적 투여량을 감소시키는 능력뿐만 아니라, 1차 암 또는 전이성 병변의 암 질량 감소, 증가된 자유 생존 발전, 전체적 생존, 환자 건강의 개선, 질병 안정화를 목적으로 한다. 이러한 투여량의 감소에 의해 화학요법 또는 생물학적 약제의 투여-관련 독성을 감소시킴에 의하여 추가된 및/또는 연장된 요법이 가능해진다. FLT3 ADC는 화학치료적 또는 항-종양성 약제와 조합하여 수개의 보조적 임상 시험에서 활용된다.
Ⅱ.) 단일 요법(Monotherapy): 암의 단일 치료법에서 FLT3 ADC의 사용과 관련하여, 화학치료적 또는 항-종양성 약제 없이 FLT3 ADC를 환자에게 투여한다. 일 구현예에서 단일 요법은 광범위한 전이성 질병을 가진 말기-단계 환자에게 임상적으로 수행된다. 하기 실시예에서 검토된 바와 같이, 프로토콜 디자인은 비제한적인 예로서, 표준 화학요법 및 다른 생물학적 약제의 일반적 투여량을 감소시키는 능력뿐만 아니라, 일차 또는 전이성 병변의 암 질량 감소, 증가된 자유 생존 발전, 전체적 생존, 환자 건강의 개선, 질병 안정화를 목적으로 한다.
투여량
투여 요법은 최적화된 목적하는 반응을 제공하기 위하여 조절될 수 있다. 예를 들어 단일의 볼루스(bolus)를 투여할 수도 있고, 수개의 분할된 투여량을 시간에 걸쳐 투여할 수도 있고, 또는 치료적 상황의 위급함에 의해 지시되는 바에 따라 비례하여 투여량을 감소 또는 증가시킬 수도 있다. 투여의 용이함 및 투여량의 일정함을 위하여 비경구적 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것은 특히 유익하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태란 치료하고자 하는 포유동물 개체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다; 각각의 단위는 목적하는 치료적 효과를 발생시키기 위하여 계산된, 활성 화합물의 미리 정해진 양을 요구되는 약제적 담체와 함께 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태의 설명 (a) 항체 및/또는 ADC의 특유한 성질 및 달성하고자 하는 특정 치료적 또는 예방적 효과, 및 (b) 개인에 있어 민감성의 치료를 위한 상기 활성 화합물을 조합하는 기술 분야의 고유한 제한에 의해 지시되고, 직접적으로 의존한다.
본 발명에 따라 조합하여 투여되는 FLT3 ADC의 치료적 유효량의 예시적이고, 제한되지 않은 범위는 약 0.5 내지 약 10 mg/kg, 약 1 내지 약 5 mg/kg, 적어도 1 mg/kg, 적어도 2 mg/kg, 적어도 3 mg/kg, 또는 적어도 4 mg/kg이다. 다른 예시적이고 제한되지 않은 범위는 예컨대 약 0.5 내지 약 5 mg/kg, 또는 예컨대 약 0.8 내지 약 5 mg/kg, 또는 예컨대 약 1 내지 약 7.5mg/kg이다. 본 발명의 높은 투여량의 구현예는 10 mg/kg 초과의 투여량과 관련된다. 투여량 값은 완화시키고자 하는 상태의 종류 및 심각성에 따라 변할 수 있으며, 단일 또는 다수의 투여량을 포함할 수 있음을 주목할 것이다. 추가적으로 특정 개체에 대하여 특정한 투여량 요법은 개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하고, 본원에서 기술된 투여량 범위는 오직 예시적인 것이며, 청구된 조성물의 범위 또는 활용을 제한하고자 하는 의도가 아니라는 것이 이해될 것이다.
임상 개발 계획(Clinical Development Plan: CDP )
CDP는 보조 요법 또는 단독 요법과 관련한 FLT3 ADC의 처리를 따르고 발전시킨다. 시험은 우선 안정성을 입증하고, 이어서 반복된 투여량의 효과를 확증한다. 시험은 표준 요법과 FLT3 ADC이 결합된, 오픈 라벨 비교 표준 화학요법이다. 평가될 바와 같이, 환자의 등록과 관련하여 활용될 수 있는 하나의 비제한적 표준은 생검에 의하여 결정되는 환자 종양 중의 FLT3 발현이다.
임의의 단백질 또는 항체 융합-기반 치료법처럼, 안전성 문제는 주로 (i) 사이토카인 방출 신드롬, 즉 저혈압, 열, 경련, 오한, (ⅱ) 물질에 대한 항원성 반응의 발전(즉, 항체 요법에 대하여 환자에 의한 인간 항체의 발전, 또는 HAMA 반응) 및 (ⅲ) FLT3을 발현하는 정상 세포에 대한 독성과 관련된다. 이러한 안전성 문제 각각을 모니터하기 위하여 표준 테스트 및 추적 검사가 활용된다. FLT3 ADCs는 인간 투여에 대하여 안전한 것으로 발견된다.
실시예 12
정상 및 암 환자 유래 시료에서 FLT3 단백질의 검출
항-FLT3 항체를 사용한 암에서 FLT3 단백질의 검출은 골수에서 급성 림프성 백혈병(AML)을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터의 PBMC 시료에서 평가되었다.
A. FACS 결합 물질 및 방법
본 실험에서, 시료를 CD45, CD33, CD34, CD3, CD20, CD38 및 항-Flt3-비오틴 또는 아이소타입-비오틴 mAbs 중 하나의 칵테일과 배양하였다. 비오티닐화된 mAbs의 검출을 위한 이차 검출은 Streptavidin-PE이다. FMO(Fluorescence minus one) 대조군 칵테일을 Streptavidin-PE (SAv-PE) 검출 시약과 준비하고 세포 집단 게이팅에 사용하였다. LSRII 유세포 계측기(BD Biosciences)를 데이터 획득에 사용하였다.
림프구를 CD45+ 집단 상에 게이팅하고 이로부터 4가지 구별되는 집단인 CD33+/3-/20- (골수모세포), CD33+/3-/34+/38- (줄기 세포), CD33-/3+(T 림프구) 및 CD33-/20+ (B 림프구)를 정의하였다. FlowJo 소프트웨어 버젼 9.5.4(Tri Star, Ashland, OR)를 이용하여 분석을 실시하였다. 형광 값을 기하 평균(MFI)로 기록하였다.
B. 결과
AML 환자 시료에 대하여 표Ⅷ에 제시한 결과는 항-FLT3 MAb가 시험된 모든 시료의 골수, LSC, T 및 B 세포 집단에 결합함을 나타내었다.
뿐만 아니라, 표 Ⅷ에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 시료에 있어서 MFIR 분포도가 골수, 줄기세포 및 B 세포 집단에서는 보통의 변이성(variability)을 나타내는 반면, T 세포는 MFIR에서 낮은 변이성을 나타낸다. AML에서, 골수모세포에 대한 평균 MFIR은 약 963.1인 반면, 줄기세포에 대한 평균 MFIR은 318.2이었으며, T 세포에 대한 평균 MFIR은 9.842였으며, B 세포에 대한 평균 MFIR은 72.60이었다.골수에서 종상 시료에 대한 평균 MFIR은 642.4, 줄기 세포에 대해서는 68.29, T-세포에 대해서는 11.66, B-세포에 대해서는 13.73이었다.
표 Ⅷ에 기재된 결과의 전체는 본 발명의 CHv62.21 MAb 및 Chv62.21pAF MAb와 같은 항-FLT3 MAb가 AML에서 과발현된 FLT3 단백질을 검출 할 수 있음을 보여준다.
실시예 13
인 비트로 CHv62 . 21pAF 및 CHv62 . 21pAF - AGL -0182-30에 의해 매개된 세포독성
FLT3 항체(CHv62.21pAF) 및 FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL- 0182-30)의 FLT3 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 인간 백혈명 MV-4-11 및 MOLM-13 세포주에서 평가하였고, 이는 내인성으로 FLT3를 발현하고 인간 백혈별 세포주, Karpas299는 FLT3을 발현하지 않는다.
간략히, MV-4-11, MOLM-13 및 Karpas299 세포를 96 웰 플레이트 상에 각각 1500 세포, 2000 세포 및 3000 세포/웰의 밀도로 50㎕의 완전한 배양액에 접종하고 조직 배양 배양기 37도; 5 % CO2에 두었다. 다음날, 세포를 비특이적 결합을 감소시키기 위해 웰당 25 ㎕의 부피로 Fc 차단시키고, AGD-0182에 접합된 아소타입 대조군 항체인 cHv62.21pAF-AGL-0182-30의 4x 스톡 용액 (91.lpAF-AGL-0182-30), cHv62.21pAF 및 아이소타입 대조군 항체 (91.lpAF)를 완전한 배지에서 제조하고 25㎕의 ADC 및 항체의 연속 희석액을 적절한 웰에 첨가하였다. 세포를 cHv62.21pAF-AGL-0182-30, 91.lpAF-AGL-0182-30, cHv62.21pAF, 및 91.1pAF로 조직 배양기내 37℃; 5 % CO2에서 5 일 동안 처리하였다. 배양이 끝나면 20㎕의 Presto Blue를 각 웰에 넣고 2 시간 동안 배양했다. 540 흥분 및 590 방출 파장을 사용하는 BioTek Synergy H4 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독 하였다.
표 Ⅸ의 결과는 항-FLT3 ADC (CHv62.21pAF-AGL-0182-30)가 FLT3 발현 MOLM-13 및 MV-4-11 세포주의 세포 독성을 선택적으로 유도 할 수있는 반면, FLT3 비 발현 Karpas299 세포주의 세포 독성을 유도하지 않음을 나타낸다. 항-FLT3 항체 (CHv62.21pAF)는 MOLM-13 및 MV-4-11 세포주에서 세포 독성을 유도하지 않는다. 따라서, 이들 데이터는 FLT3 MAb CHv62.21pAF 단독으로는 세포의 세포 독성을 유도하지 않는다는 것을 입증한다. 오히려 FLT3 ADC CHV62.21pAF-AGL-0182-30 단독이 FLT3 발현 MOLM-13 및 MV-4-11 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있지만, 비-FLT3 발현 Karpas299 세포에는 효과가 없다.
실시예 14
선행 기술 FLT3 MAbs보다 우수한 CHv62 . 21pAF의 이점
본 발명의 CHv62.21pAF MAb는 FLT3에 결합하는 다른 MAb에 비해 몇 가지 장점을 나타낸다. 특히, 본 발명의 ADC의 치료 유용성에 비추어 볼 때 그러하다. 예를 들어, 선행 기술은 AML 환자가 화학 요법으로 치료 된 후에 혈장 FLT3 리간드 ( "FL")의 발현이 증가한다는 것을 교시한다. Takashi, et. al., Blood vol. 117(12) (March 2011) 참조. 또한, 증가된 FL은 FLT 저해제의 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 모노메틸 아우리스타틴 F (EB10-MMAF)와 콘쥬게이트된 Id. EB 10 이 항-인간 FLT3 항체를 포함하는 ADC로서 보고되었다. (Proc Amer Assoc Cancer Res, Volume 46, 2005 참조). EB10은 FL을 차단하는 것으로 나타낫다. 미국 특허 제 8,071,099 호 (Imclone) 참조. 따라서, 본 발명의 목적은 FLT3 항원에 결합하지만 FL에 결합하지 않는 MAb를 설계하는 것이다.
한 실험에서, 본 발명의 CHv62.21 MAb는 FL을 차단하지 않는 것으로 확인되었다. 간략하게, 재조합 인간 FLT3-Fc는 R 및 D Systems로부터 구입하였다. 이 단백질은 Luminex가 제공한 절차에 따라 표준 sulfo-NHS/EDC 화학을 사용하여 활성화 된 Luminex 마이크로스피어(microspheres)의 표면에 고정화하였다. 여러 다른 단백질과 함께 His-태그된 단백질 버전을 Luminex 마이크로스피어에 콘쥬게이트시키고 이 과정에서 대조군으로 사용하였다.
또한, FLT3 리간드는 또한 R 및 D Systems로부터 구입하였다. 제조사의 추천에 따라 Thermo Scientific EZ-Link Sulfa-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Formula를 사용하여 리간드를 비오티닐화하였다. 단백질을 Sulfo NHS-LC-Biotin과 2 시간 동안 반응시킨 후, 비 결합된 비오틴을 DPBS에 대한 투석으로 제거 하였다.
PBS, 2 % BSA, 0.05 % 트윈 (Tween) 20 및 0.1 % 소듐 아자이드를 함유하는 완충액 내에서 부드러운 교반하에 RT에서 120 분 동안 배양하여 제조된 다양한 농도의 비오티닐화된 리간드와 마이크로스피어를 반응시킴으로써 마이크로스피어의 표면 상에 고정된 FLT3의 능력을 평가 하였다. 배양 종료시, 마이크로스피어를 흡인하고 세척 하였다. Streptavidin-R-Phycoerythrin (Moss, Inc.)을 사용하여 고정화된 수용체에 결합된 비오티닐화된된 FLT3 리간드를 검출하였다. 마이크로스피어와 관련된 형광을 루미넥스 (Luminex) 기기로 측정하였다. 이 측정은 5 ng/mL 농도의 비오티닐화된 FLT3 리간드가 견고한 신호를 생성하기에 충분하지만 마이크로스피어와 관련된 FLT3를 포화시키지 않음을 나타냅니다.
마지막으로, 잠재적으로 리간드를 차단하는 FLT3 항체의 능력을 평가하기 위해, 10 μg/mL에서 연구중인 다양한 항체와 함께 5 ng/mL의 비오니틸화된 FLT3 리간드를 함유하는 혼합물을 제조 하였다. 이들 혼합물을 마이크로스피어 상에 고정화된 FLT3에 적용하고 60분 동안 배양하였다. 배양 종료시, 마이크로스피어를 흡인하고 세척 하였다. Streptavidin-R-Phycoerythrin (Moss, Inc.)을 사용하여 고정화 된 수용체에 결합된 비오티닐화된 FLT3 리간드를 검출하였다. 마이크로스피어와 관련된 형광을 루미넥스 (Luminex) 기기로 측정하였다. 리간드를 차단하는 능력을 갖는 항체를 MFI (중간 형광 강도)의 감소에 의해 관찰하였다.
도 8의 결과는 FLT3 MAb CHv62.21이 비 FL 차단제이고 v62-lb37.1 (표 Ⅹ)로 표시되는 다른 FLT3 Mab이 EB10으로 표시되는 종래 기술의 FLT3 MAb와 유사한 FL 차단제임을 확인하였다 (미국특허 제 8,071,099 호 참조).
인간 FLT3 리간드의 효과를 매개하는 FLT3 항체 (CHv62.21 및 v62-lb37.1)의 능력을 FLT3을 내인성으로 발현하는 인간 백혈병 EOL-1 세포주를 사용하여 평가하였다. 아이소타입 대조군 항체 (mLys-1c3.1) 또한 사용하엿다. EOL-1 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2000 세포의 밀도로 50㎕의 완전한 배지에 접종하고 37℃; 5 % CO2에서 조직 배양 배양기에 두었다. 다음날, 세포를 50, 10 또는 5 ng/mL의 인간 FLT3 리간드 (25 μl의 완전 배지에서) 및 10, 1, 0.1 및 0 μg/ml의 시험 항체 (25 μl의 배지에서)로 처리하였다. 배지 단독을 처리하지 않은 대조군으로 사용 하였다. 세포를 37℃; 5 % CO2의 조직 배양기에서 5 일간 처리 하였다. 배양 기간이 끝날 때 100㎕의 Cell Titer Glo를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30 분 동안 흔들어 주면서 배양하였다. 플레이트를 Luminescence를 사용하는 BioTek Synergy H4 플레이트 판독기를 사용하여 판독하고 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프로 나타냈다.
도 9의 결과는 v62-lb37.1이 FLT3 리간드 존재하에 고농도에서 성장을 억제하지만 CHv62.21은 성장에 어떠한 영향도 미치지 않음을 보여준다. 인간 FLT3 리간드 단독으로는 EOL-1 세포주의 성장에는 영향을 미치지 않는다.
암 치료를 위한 화학 요법 후에 혈장 중의 FL 농도가 증가한다는 교시에 기초하여 (Takashi et. al., supra 참조), 본 발명의 FLT3 MAb가 FL을 차단하지 않을 때 이점이 존재하는 것으로 나타났다. 이 점을 확인하기 위해, 리간드를 차단하는 MAb의 세포독성 활성이 FL의 존재 하에서 감소되는 반면, 리간드를 차단하지 않는 MAb의 세포독성 활성은 FL의 존재 하에서 감소되지 않는 것으로 나타났다.
인간 FLT3 리간드 (hFL)의 부재 및 존재 하에서 FLT3 의존성 세포독성을 매개하는 FLT3 ADC (cHv62.21pAF-AGL-0182-30 및 v62-1b21.1-AGL-0129-08)의 능력을 FLT3을 내인성으로 발현하는 인간 백혈병 RS-4-11 세포주를 사용하여 평가하였다.
간략히, RS-4-11 세포를 96 웰 플레이트에 3000 세포/웰의 밀도로 50 μl의 완전 배지에 접종하고 37℃; 5 % CO2의 조직 배양기에 두었다. 다음날, ADC는 10 μg/mL에서 완전 배지에서 제조되었고 총 9 포인트로 1:5로 연속적 희석하였다. 25 μl의 ADC의 연속 희석액을 인간 FLT3 리간드(100 ng/mL가 웰 당 25 μl 첨가됨)가 있거나 없는 적절한 웰에 첨가하였다. 세포를 인간 FLT3 리간드가 있거나 없는 v62-lb21.1-AGL-0129-08 (표 ⅩⅠ, W02015/183978, Agensys, Inc. 참조) 및 v62-lb37.1-AGL-0129-08로 37℃; 5 % CO2의 조직 배양기에서 5 일 동안 처리하였다. 배양 기간이 끝나면 20 μl의 Presto Blue를 각 웰에 첨가하고 2 시간 동안 배양했다. 540 흥분 및 590 방출 파장을 사용하는 BioTek Synergy H4 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 판독하고 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프로 나타내었다.
도 10 (A) 및 10 (B)의 결과는 항-FLT3 ADC (v62-1b21.1-AGL-0129-08 및 v62-lb37.1-AGL-0129-08)가 FLT3 발현 RS-4-11 세포주의 세포독성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 항-FLT3 ADC, v62-1b21.1-AGL-0129-08은 인간 FLT3 리간드의 존재 및 부재 하에서 유사한 수준의 세포독성을 갖는다. 그러나, 항-FLT3 ADC, v62-lb37.1-AGL-0129-08의 세포 독성 활성은 리간드 없는 ADC 처리와 비교하여 인간 FLT3 리간드의 존재 하에서 감소된다.
또다른 실험에서, 항-FLT3 항체, CHv62.21 및 v62-lb37.1의 인간 백혈병 MOLM-13 세포주의 표면 상에 발현된 FLT3에 결합하는 능력을 인간 FLT3 리간드 (hFL)의 존재 하에서 평가하였다. 아이소타입 대조군 항체 AGS91.1-pAF를 음성 대조군으로 사용하였다.
간략하게, MOLM-13 세포를 둥근 바닥 96 웰 플레이트 상에 50,000 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 플레이트를 150 μl/웰의 PBS로 1 회 세척하였다. 비특이적 결합을 줄이기 위해 FACS 완충액 (PBS + 2 % FBS + 0.1 % 소듐 아자 이드)에서 웰 당 50 μl의 부피로 세포를 Fc 차단하였다(20 μl/mL). 세포를 4℃에서 15 분 동안 배양했다. 인간 FLT3 리간드를 100 ng/mL로 적절한 웰에 첨가하고 플레이트를 가로 질러 총 11 포인트에 대해 1:2로 연속 희석하였다. 세포는 비오티닐화된 FLT3 항체를 첨가하기 전에 4℃에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 비오티닐화된 항-FLT3 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 10 μg/mL 및 1 μg/mL에서 FACS 완충액 내에 제조하고 25 μl를 웰에 첨가하고 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2 회 세척하고 Streptavidin-PE (Jackson 면역)를 웰 당 100 μl씩 첨가하고 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2 회 세척하고 Attune Cytometer (Life technologies)에서 판독하고 FlowJo (Tree Star) 소프트웨어로 분석하였다.
도 11 (A)의 결과는 인간 FLT3 리간드가 MILM-13 세포에 결합하는 항-FLT3 항체, AGS62P를 간섭하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, 인간 FLT3 리간드는 MOLM-13 세포에 대한 항-FLT3 항체, cHv62-lb37.1의 결합을 용량 의존적 방식으로 방해한다.
마지막으로, FLT3 ADC, AGS62P1의 인간 FLT3 리간드 (hFL)의 부재 및 존재 하에서 FLT3 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 FLT3를 내인성으로 발현하는 인간 백혈병 MOLM-13 세포주를 사용하여 평가하였다. 아이소타입 대조군 ADC, AGS91.1.88-pAF AGL-0182-30을 음성 대조군으로 사용하였다.
간략히, MOLM-13 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2000 세포의 밀도로 50 μl의 완전한 배지에 접종하고 37℃; 5 % CO2에서 조직 배양 배양기에 두었다. 다음날, 비특이적 결합을 감소시키기 위해 웰 당 25 μl의 부피로 세포를 Fc 차단시켰다. ADC는 10 μg/mL의 최종 농도에 대해 완전한 배지에서 준비되었고 총 9 포인트에 대해 1:5로 연속적으로 희석되었다. ADC의 연속 희석 12.5 μl를 인간 FLT3 리간드가 포함되거나 포함되지 않은 적절한 웰에 첨가 하였다 (100 ng/mL가 웰 당 12.5 μl가 첨가됨). 세포를 37℃; 5 % CO2의 조직 배양기에서 5 일 동안 인간 FLT3 리간드와 함께 또는 없이 AGS62P1 및 AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30으로 처리하였다. 배양 기간의 종기에, 20 μl의 Presto Blue를 각 웰에 첨가하고 2 시간 동안 배양했다. 540 흥분 및 590 방출 파장을 사용하는 BioTek Synergy H4 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 판독하고 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 그래프로 나타내었다.
도 11 (B)의 결과는 인간 FLT3 리간드가 MOLM-13 세포에서 항-FLT3 ADC (CHV62.21pAF-AGL-0182-30) 매개된 세포 독성을 간섭하지 않는다는 것을 보여준다.
따라서, FLT3 MAb는 치료적 측면에서 사용될 수 있지만, 모든 FLT3 MAb가 동일하지는 않다. 도 8-11의 결과는 FL에 결합하지 않는 FLT3 MAb가 FL에 결합하는 것으로 보이는 FLT3 MAb보다 현저한 이점을 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명의 ADC의 치료적 유용성에 비추어 볼 때, 결과는 CHv62.21pAF-AGL-0182-30과 같은 비리간드 차단제 FLT3 Mab을 포함하는 ADC가 FL 존재 하에서 리간드 차단제 FLT3 Mabs 를 포함하는 ADC와 비교하여 항 종양 효과를 유지한다는 것을 보여준다. 당업계의 통상의 기술자는 FL의 존재가 화학치료적 처리 이후를 증가시키는 것으로 공지됨을 이해한다. 또한, FL의 증가된 존재가 FLT3 저해제의 활성을 감소시키는 것으로 나타남이 공지되었다. 따라서 도 8-11의 결과는 비-리간드 차단제 FLT3 Mab를 포함하는 ADC가 암 환자에서 리간드 차단제 FLT3 Mab를 포함하는 ADC와 비교하는 경우 더 나은 치료적 지표 및 항-종양 효과를 가지는 것을 제시한다.
실시예 15
CHv62 . 21pAF - AGL -0182-30의 안정성 시험
FLT3 ADC CHV62.21pAF-AGL-0182-30 및 AGL-0301-20으로 명명된 다른 세포 독성 화합물 (Agensys, W02014/043403 참조)을 사용하는 또다른 FLT3 ADC의 안정성을 인 비트로에서 평가하였다. 이 실험에서, 인간 혈청 (Millipore)을 최종 농도 50 mM에서 각 ADC 0.4 mg/mL와 인산염 pH 7.3으로 스파이크시키고 37℃의 가습 된 배양기에서 배양했다. 100 μL 분취액을 수집하고 5 분, 3 시간, 25.25 시간, 51.25 시간 및 171.2 시간에 -80 ℃에서 동결시켰다. 모든 시료를 수집 한 후 ELISA를 수행하여 각 ADC의 항체 및 약물 구성을 정량화하였다.
결과는 CHV62.21pAF-AGL-0182-30 약물 항체 결합이 실험 도 12 (A)의 시간 경과에 걸쳐 안정하다는 것을 보여준다. 그러나, 도 12 (B)는 v62-lb21-AGL-0301-20에 대한 약물 항체 결합이 불안정하여, 실험의 시간 경과에 따라 유의한 탈-콘쥬게이션을 일으킨다는 것을 보여준다.
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본 발명은 본원에 개시된 구현예에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 이들은 본 발명의 개별적인 양상의 단일 예로서 의도되며, 기능적으로 등가인 것은 모두 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 기술된 것들 이외에, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 전술한 설명 및 교시로부터 당업자에게 명백할 것이며, 유사하게 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 변형 또는 다른 구현예는 본 발명의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시 될 수 있다.
표 Ⅰ: 악성인 경우 FLT3을 발현하는 조직/세포
급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia: "AML");
급성 림프모구 백혈병(Acute Lymphoblastic Leukemia: "ALL")
B-세포 림프성 백혈병;
전구 B-세포 림프성 백혈병.
표 Ⅱ: 아미노산 약자
Figure pct00033
표 Ⅲ: 아미노산 치환 매트릭스
GCG 소프트웨어 9.0 BLOSUM62로부터 채택된 아미노산 치환 매트릭스 (블록 치환 매트릭스). 값이 높을수록 관련 천연 단백질에서 치환이 더 많이 발견된다.
Figure pct00034
표 Ⅳ. AGL-0182-30의 합성을 위한 일반적인 방법
Figure pct00035
표 Ⅴ . Kabat, Chothia 및 Conatact 스킴에 의해 각각 동정된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 위치. CDR-H1에서, 잔기 번호는 Kabat 및 Chothia 번호 스킴을 사용하여 나열된다.
Figure pct00036
표 Ⅵ . FACS 분석법에서 기하 평균 값 및 평균 형광 비율(MFR) 값의 표
Figure pct00037
표 Ⅶ. 세포주 당 FACS 결합의 결과를 나타내는 히스토그램
Figure pct00038
표 Ⅷ. 1차 AML 및 정상 시료에서 FLT3 발현
Figure pct00039
Figure pct00040
표 Ⅸ. MOLM-13, MV-4-11 & Karpas299 세포 상 cHv62.21pAF-AGL-0182-30 및 cHv62.21pAF의 인 비트로 세포독성의 평가
Figure pct00041
Figure pct00042
표 Ⅹ. v62-1b37.1의 항체 서열
Figure pct00043
표 ⅩⅠ. AGL-0129-08의 화학적 구조
0129-08은 (S)-메틸 2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-아지도-2-((S)-2-(디메틸아미노)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵타노일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로파노에이트를 의미한다.
Figure pct00044
SEQUENCE LISTING <110> Agensys, Inc. <120> ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADC) THAT BIND TO FLT3 PROTEINS <130> 511582009200 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/130,476 <151> 2015-03-09 <160> 34 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3307 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human FLT3 <400> 1 gttttacacg aggcggcatc gcagggctgg gccggcgcgg cctggggacc ccgggctccg 60 gaggccatgc cggcgttggc gcgcgacggc ggccagctgc cgctgctcgt tgttttttct 120 gcaatgatat ttgggactat tacaaatcaa gatctgcctg tgatcaagtg tgttttaatc 180 aatcataaga acaatgattc atcagtgggg aagtcatcat catatcccat ggtatcagaa 240 tccccggaag acctcgggtg tgcgttgaga ccccagagct cagggacagt gtacgaagct 300 gccgctgtgg aagtggatgt atctgcttcc atcacactgc aagtgctggt cgatgcccca 360 gggaacattt cctgtctctg ggtctttaag cacagctccc tgaattgcca gccacatttt 420 gatttacaaa acagaggagt tgtttccatg gtcattttga aaatgacaga aacccaagct 480 ggagaatacc tactttttat tcagagtgaa gctaccaatt acacaatatt gtttacagtg 540 agtataagaa ataccctgct ttacacatta agaagacctt actttagaaa aatggaaaac 600 caggacgccc tggtctgcat atctgagagc gttccagagc cgatcgtgga atgggtgctt 660 tgcgattcac agggggaaag ctgtaaagaa gaaagtccag ctgttgttaa aaaggaggaa 720 aaagtgcttc atgaattatt tgggatggac ataaggtgct gtgccagaaa tgaactgggc 780 agggaatgca ccaggctgtt cacaatagat ctaaatcaaa ctcctcagac cacattgcca 840 caattatttc ttaaagtagg ggaaccctta tggataaggt gcaaagctgt tcatgtgaac 900 catggattcg ggctcacctg ggaattagaa aacaaagcac tcgaggaggg caactacttt 960 gagatgagta cctattcaac aaacagaact atgatacgga ttctgtttgc ttttgtatca 1020 tcagtggcaa gaaacgacac cggatactac acttgttcct cttcaaagca tcccagtcaa 1080 tcagctttgg ttaccatcgt agaaaaggga tttataaatg ctaccaattc aagtgaagat 1140 tatgaaattg accaatatga agagttttgt ttttctgtca ggtttaaagc ctacccacaa 1200 atcagatgta cgtggacctt ctctcgaaaa tcatttcctt gtgagcaaaa gggtcttgat 1260 aacggataca gcatatccaa gttttgcaat cataagcacc agccaggaga atatatattc 1320 catgcagaaa atgatgatgc ccaatttacc aaaatgttca cgctgaatat aagaaggaaa 1380 cctcaagtgc tcgcagaagc atcggcaagt caggcgtcct gtttctcgga tggataccca 1440 ttaccatctt ggacctggaa gaagtgttca gacaagtctc ccaactgcac agaagagatc 1500 acagaaggag tctggaatag aaaggctaac agaaaagtgt ttggacagtg ggtgtcgagc 1560 agtactctaa acatgagtga agccataaaa gggttcctgg tcaagtgctg tgcatacaat 1620 tcccttggca catcttgtga gacgatcctt ttaaactctc caggcccctt ccctttcatc 1680 caagacaaca tctcattcta tgcaacaatt ggtgtttgtc tcctcttcat tgtcgtttta 1740 accctgctaa tttgtcacaa gtacaaaaag caatttaggt atgaaagcca gctacagatg 1800 gtacaggtga ccggctcctc agataatgag tacttctacg ttgatttcag agaatatgaa 1860 tatgatctca aatgggagtt tccaagagaa aatttagagt ttgggaaggt actaggatca 1920 ggtgcttttg gaaaagtgat gaacgcaaca gcttatggaa ttagcaaaac aggagtctca 1980 atccaggttg ccgtcaaaat gctgaaagaa aaagcagaca gctctgaaag agaggcactc 2040 atgtcagaac tcaagatgat gacccagctg ggaagccacg agaatattgt gaacctgctg 2100 ggggcgtgca cactgtcagg accaatttac ttgatttttg aatactgttg ctatggtgat 2160 cttctcaact atctaagaag taaaagagaa aaatttcaca ggacttggac agagattttc 2220 aaggaacaca atttcagttt ttaccccact ttccaatcac atccaaattc cagcatgcct 2280 ggttcaagag aagttcagat acacccggac tcggatcaaa tctcagggct tcatgggaat 2340 tcatttcact ctgaagatga aattgaatat gaaaaccaaa aaaggctgga agaagaggag 2400 gacttgaatg tgcttacatt tgaagatctt ctttgctttg catatcaagt tgccaaagga 2460 atggaatttc tggaatttaa gtcgtgtgtt cacagagacc tggccgccag gaacgtgctt 2520 gtcacccacg ggaaagtggt gaagatatgt gactttggat tggctcgaga tatcatgagt 2580 gattccaact atgttgtcag gggcaatgcc cgtctgcctg taaaatggat ggcccccgaa 2640 agcctgtttg aaggcatcta caccattaag agtgatgtct ggtcatatgg aatattactg 2700 tgggaaatct tctcacttgg tgtgaatcct taccctggca ttccggttga tgctaacttc 2760 tacaaactga ttcaaaatgg atttaaaatg gatcagccat tttatgctac agaagaaata 2820 tacattataa tgcaatcctg ctgggctttt gactcaagga aacggccatc cttccctaat 2880 ttgacttcgt ttttaggatg tcagctggca gatgcagaag aagcgatgta tcagaatgtg 2940 gatggccgtg tttcggaatg tcctcacacc taccaaaaca ggcgaccttt cagcagagag 3000 atggatttgg ggctactctc tccgcaggct caggtcgaag attcgtagag gaacaattta 3060 gttttaagga cttcatccct ccacctatcc ctaacaggct gtagattacc aaaacaagat 3120 taatttcatc actaaaagaa aatctattat caactgctgc ttcaccagac ttttctctag 3180 aagctgtctg cgtttactct tgttttcaaa gggacttttg taaaatcaaa tcatcctgtc 3240 acaaggcagg aggagctgat aatgaacttt attggagcat tgatctgcat ccaaggcctt 3300 ctcaggc 3307 <210> 2 <211> 993 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human FLT3 <400> 2 Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val 20 25 30 Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly 35 40 45 Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly 50 55 60 Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala 65 70 75 80 Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp 85 90 95 Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu 100 105 110 Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met 115 120 125 Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe 130 135 140 Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile 145 150 155 160 Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met 165 170 175 Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro 180 185 190 Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu 195 200 205 Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu 210 215 220 Phe Gly Met Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu 225 230 235 240 Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr 245 250 255 Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys 260 265 270 Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu 275 280 285 Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser 290 295 300 Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val 305 310 315 320 Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro 325 330 335 Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala 340 345 350 Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys 355 360 365 Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr 370 375 380 Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly 385 390 395 400 Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr 405 410 415 Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr 420 425 430 Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser 435 440 445 Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp 450 455 460 Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu 465 470 475 480 Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val 485 490 495 Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val 500 505 510 Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu 515 520 525 Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe 530 535 540 Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu 545 550 555 560 Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu 565 570 575 Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val 580 585 590 Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu 595 600 605 Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val 610 615 620 Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln 625 630 635 640 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu 645 650 655 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu 660 665 670 Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr 675 680 685 Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg 690 695 700 Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu 705 710 715 720 His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser 725 730 735 Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile 740 745 750 Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr 755 760 765 Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr 770 775 780 Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu 785 790 795 800 Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 805 810 815 Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu 820 825 830 Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala 835 840 845 Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile 850 855 860 Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu 865 870 875 880 Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala 885 890 895 Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe 900 905 910 Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe 915 920 925 Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly 930 935 940 Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly 945 950 955 960 Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser 965 970 975 Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp 980 985 990 Ser <210> 3 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <400> 3 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ggctatagca taaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcatcc attagtagta gtagtaatta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaggg 300 tttatagctg gaactacttt tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttcag catccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 1362 <210> 4 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 5 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 light chain <400> 5 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatggtt tcccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 light chain <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <400> 7 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ggctatagca taaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcatcc attagtagta gtagtaatta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaggg 300 tttatagctg gaactacttt tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttcat agtccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 1362 <210> 8 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <220> <221> VARIANT <222> 124 <223> Xaa = para-acetylphenylalanine (pAF) <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Xaa Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 9 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CHv62.21 light chain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 453 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CHv62.21 heavy chain <220> <221> VARIANT <222> 124 <223> Xaa = para-acetylphenylalanine (pAF) <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Xaa Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 12 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> v62-1b37.1 heavy chain <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Thr Tyr Gly Pro Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> v62-1b37.1 light chain <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Gly Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ser Gly Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Ser Ser Ser Asn 1 5 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Homo saiens <400> 33 Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp 1 5 10 15

Claims (33)

  1. 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDRH1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 CDRH2, 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDRH3, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDRL1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CDRL2, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 서열번호 11의 1번째 E 내지 123번째 S의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 108번째 R의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 포함하는 것인 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 부위 및 ATCC 수탁번호 PTA-121831로 기탁된 CHO에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 부위를 포함하는 것인 항체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG 아형인 Fc 부위를 포함하는 것인 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 부위가 중쇄의 아미노산 위치 124에서 비-천연 아미노산의 치환을 포함하고, 상기 비-천연 아미노산이 파라-아세틸페닐알라닌(pAF)인 것인 항체.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체가 서열번호 11의 아미노산 번호 1번째 E 내지 452번째 G의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체가 서열번호 11의 1번째 E 내지 453번째 K의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 항체가 ATCC 수탁번호 PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄의 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, ATCC 수탁번호 PTA-121836으로 기탁된 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 경쇄의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 부위 또는 중쇄의 1번째 E가 피로글루타메이트(pyroglutamate)로 치환된 것인 항체.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 서열번호 11의 1번째 E 내지 452번째 G의 범위인 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄 가변 부위 또는 중쇄의 1번째 E가 피로글루타메이트로 변형된 것이고, 상기 항체가 서열번호 10의 1번째 D 내지 214번째 C의 범위인 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 항체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 따른 항체의 CDR을 포함하는 항원-결합 단편으로, 상기 항원-결합 단편이 FLT-3에 결합하는 것인, 항원-결합 단편.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 단리된 VH, 및 단리된 VL로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항원-결합 단편.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산.
  14. 청구항 13에 따른 하나 또는 그 이상의 단리된 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터.
  15. 청구항 14에 따른 하나 또는 그 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  16. 청구항 15에 따른 재조합 숙주 세포의 배양에 의해 생산된 항체 또는 항원-결합 단편.
  17. 청구항 16에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 및 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트(antibody drug conjugate).
  18. FLT-3에 결합하지만 FLT3 리간드(FL)에 대한 FLT3의 결합을 실질적으로 저해하지 않는 항체 또는 항원-결합 단편 및 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트.
  19. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 및 치료제를 포함하는 항체 약물 콘쥬게이트.
  20. 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항원-결합 단편과 상기 치료제를 연결하는 링커를 더 포함하는 것인 항체 약물 콘쥬게이트.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 링커는 비-절단 링커 (non-cleavable linker)인 항체 약물 콘쥬게이트.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 링커가 2-(아미노옥시)아세트산인 항체 약물 콘쥬게이트.
  23. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드인 항체 약물 콘쥬게이트.
  24. 청구항 17 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 약물 콘쥬게이트가 하기 구조식을 갖는 것인 항체:
    항체-(링커-치료제)p,
    여기서 상기 링커는 2-(아미노옥시)아세트산이고, 상기 치료제는 (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-아미노-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-3-아지도-N-메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드이고 상기 p가 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 p가 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체 약물 콘쥬게이트.
  26. 치료적 유효량의 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 콘쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 치료 용도인 것인 약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 치료 용도가 암의 치료인 것인 약학적 조성물.
  29. 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 항-신생물 작용제 (anti-neoplastic agents)를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  30. 청구항 26 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 비-암성 세포와 비교하여 증가된 수준으로 FLT3을 발현하는 하나 또는 그 이상의 세포를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  31. 청구항 26 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia: AML), 급성 림프모구 백혈병 (Acute Lymphoblastic Leukemia: ALL), B-세포 림프성 백혈병(B-cell Lymphoblastic Leukemia), 및 전구 B-세포 림프성 백혈병(Precursor B-cell Lymphoblastic Leukemia)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  32. 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 따른 항체 약물 콘쥬게이트 또는 청구항 26 내지 30 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia: AML), 급성 림프모구 백혈병 (Acute Lymphoblastic Leukemia: ALL), B-세포 림프성 백혈병(B-cell Lymphoblastic Leukemia), 및 전구 B-세포 림프성 백혈병(Precursor B-cell Lymphoblastic Leukemia)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암을 치료하는 방법.
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