KR20170126867A - 암 치료를 안내하기 위한 컨텍스트 의존성 진단 검사 - Google Patents
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Abstract
본 기재내용은 다양한 암과 관련되고 BH3 프로파일링 진단법에 대한 개선을 포함하는 진단법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2015년 1월 12일자로 출원된 U.S. 가특허원 제62/102,499호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 포함된다. 본 출원은 하기 참조의 내용 전부를 참고로 포함한다: 2012년 5월 10일자로 출원된 U.S. 가특허원 제61/645,253호 및 2013년 3월 13일자로 출원된 제61/780,252호에 대한 우선권을 주장하는, 2013년 5월 10일자로 출원된 제PCT/US13/40585호.
전자 제출된 텍스트 파일의 설명
본 건과 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 카피(파일명: EUTR_017_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록된 날짜: 2016년 1월 11일, 파일 크기 4 킬로바이트).
발명의 분야
본 기재내용은 인간 샘플에서 종양을 평가하는데 유용한 방법을 제공한다.
표적화 암 치료법과 병행한 예측성 및 예후성 바이오마커의 사용이 약물 개발 시간을 단축시키고, 약물 효능을 개선시키고, 임상적 의사 결정을 참고하는데 열쇠를 쥐고 있을지 모른다. 암 치료에 진전이 있기는 하지만, 화학요법은 여전히 대체로 비효율적이고 비효과적이다. 화학요법의 일반적으로 불량한 성능에 대한 이유는 선택된 치료가 종종 환자 개개인의 질병에 부적합하다는 것이다. 치료제와 더불어 정확한 진단에 의한 맞춤의학으로 이 문제를 완화할 수 있다. 2014년 7월에, FDA는 회사가 약물 개발의 초기 단계에서 동반 진단에 대한 필요성을 확인하도록 도와주기 위해 "산업용 안내서: 시험관내 동반 진단 장치(Guidance for Industry: In Vitro Companion Diagnostic Devices)"를 발표하였다.
지금까지 임상 종양학에 부가 가치를 갖는 유용한 바이오마커는 다만 몇 안 된다. 부분적으로 이것은 인지된 마커는 종종 약물 대사에 상관 관계는 있지만 일반적이지 않다는데 기인한다. "바이오마커" 생물학이 동반 요법의 약리학과 병렬하더라도 약물이 어떻게 각 환자에서 작용할지 예측하는 것은 여전히 상당한 문제이다. 이를 능가하여, 임상 발전에 이르는 길은 검사의 가치를 알아보고 이것이 환자에게 이익을 가져올 수 있다고 믿는 의사-과학자의 참여를 필요로 한다.
항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질은 화학요법에 대한 암 세포 반응의 중추적인 유발 인자이다. 미토콘드리아 아폽토시스를 조절하는에 있어서의 이들 단백질의 기능의 측정이 치료에 대한 암 환자 반응에 대한 예측 바이오마커를 제공하는 것으로 판명되었다. 여러 화학요법들은 아폽토시스가 효과적이라는 것에 의존하며 몇몇 경우에 특정 항-아폽토시스 단백질에 의한 아폽토시스의 조절은 특정 치료법에 대한 반응성과 상관성이 있다. 이때 특정 단백질의 측정은 약물 반응에 대한 바이오마커를 제공한다. 따라서, 치료에 대한 예상되는 반응을 알아내는 바이오마커가 계속해서 수요가 많아지고 있다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 환자 암 세포의 BH3 프로파일링을 사용하여 프로-아폽토시스 단백질을 봉쇄하는 이들의 기능에서 MCL1 및 BFL1 단백질을 교란시키는 제제에 대한 반응을 측정하고, MCL1의 기능을 교란시키는 하나 이상의 암 치료에 대한 각 환자의 임상 반응 가능성을 분류하기 위해 환자의 하나 이상의 임상 특징을 예측 알고리즘에 포함시킴을 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 선택하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 환자 암 표본은 골수 천자물로부터 정제된 암 세포로 이루어진다. 암 세포를 MCL1 또는 MCL1 및 BFL1에 대해 선택적인 BH3 단독 단백질 NOXA 또는 BH3 모방체를 포함하는 펩타이드를 사용하여 측정되는 바와 같이 프로-아폽토시스 단백질 BIM, Bid, Bax 또는 Bak에 대한 MCL1, 또는 MCL1 및 BFL1 결합을 선택적으로 교란시키는 제제에 노출시킨다.
일부 측면에서, 검정에서 사용되는 NOXA 펩타이드는 AELPPEFAAQLRKIGDKVYC (서열번호 1)이다. 또 다른 측면에서, NOXA 펩타이드는 서열번호 1을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 서열번호 1은 코어 NOXA 펩타이드로서 사용되며 NOXA 펩타이드는 내인성 NOXA 단백질로부터의 측면 서열(flanking sequence)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 측면에서, NOXA 펩타이드는 MPGKKARKNAQPSPARAP[AELPPEFAAQLRKIGDKVYC]FRQKLLNLISKLFCSGT (서열번호 2)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 측면 서열은 코어, 및 기본 매개변수를 사용한 NP 066950에 대한 BLAST에 의한 척도로서 코어(즉, AEL...KLN)에 대해 동일성을 갖는 영역으로부터 뻗어나온 NOXA 펩타이드로부터의 10개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산, 30개 이하의 아미노산 또는 40개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산이 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 부가될 수 있다. 아미노산은 Genbank entry NP 066950에서 제공된 서열에 따라 번호매김되고 이로부터 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 사용되는 코어 펩타이드는 서열번호 1 펩타이드(즉, AEL... KLN)에 대해 동일성을 갖는다는 점에서 야생형 서열이다.
NOXA 서열에 대한 길이 또는 상동성에 있어서의 변화에 기반한 펩타이드 이외에, 펩타이드는 또한 벌크 유동 또는 클라트린-매개된 엔도사이토시스를 통해, 예를 들면 NOXA 서열과 TAT 서열(문헌[참조; Lin 등, "Therapeutic applications of the TAT-mediated protein transduction system for complex I deficiency and other mitochondrial diseases," Annals of the New York Academy of Sciences 1350, 17-28]에 기재된 바와 같음), 돌연변이유발 및 개선된 친화도를 위한 선택을 통해 MCL-1에 결합하기 위해 최적화된 펩타이드(문헌 참조; Dutta 등 "Determinants of BH3 binding specificity for Mcl-1 versus Bcl-xL. Journal of molecular biology" 398, 747-762 (2010)), 및 알파-나선의 안정성을 개선시키도록 화학 잔기의 첨가에 의해 변형된 펩타이드(문헌 참조; structural and functional information in Stewart 등, "The MCL-1 BH3 helix is an exclusive MCL-1 inhibitor and apoptosis sensitizer," Nature chemical biology 6, 595-601, (2010))의 융합을 통해 증가된 세포 투과를 가능케 하도록 변형될 수 있다. 또한, 제PCT/US2013/046826호(U.S. 출원 공보 제2015-0150869호로도 공개됨)에 정의된 것들과 같은 대규모 기능성 결합 스크린을 통해 확인된 NOXA 모방체 화합물이 NOXA 프라이밍 검정에서 MCL-1 의존성의 부가적 또는 대안적 마커로서 NOXA 펩타이드 대신에 사용될 수 있다. 또한, 추가의 BH3 단백질에 대한 BH3 프라이밍을 평가하는데 적합한 펩타이드가 제PCT/US2013/046826호(U.S. 출원 공보 제2015-0150869호로도 공개됨)의 표 1에 개시되어 있으며, 이것은 이들 펩타이드를 위해 참고로 포함된다.
몇몇 실시형태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 골수 천자물로부터 정제된 암 세포로 이루어진 환자 암 표본으로부터의 BH3 검정 판독치와 말초 혈액으로부터의 BH3 프로파일링 판독치를 비교한다. 상이한 판독치가 별개의 치료 옵션에 대한 반응을 예측한다. 또한, 환자 골수로부터 채취한 AML 세포에서 수행된 BH3 프로파일링은 FLAM 치료를 예측하는 것으로 나타난 반면 말초 혈액으로부터의 AML 세포에 대한 BH3 프로파일링은 그렇지 않지만 7+3 치료를 예측한다.
몇몇 실시형태에서, 및 본원에 나타낸 바와 같이, 다양한 임상 요인들이, 아폽토시스와 관련되지 않거나 관련된 것으로 알려지지 않은 것들 조차도, BH3 프로파일링의 예측력을 증가시켜, 검사를 단순히 예후적이 아니라 예측 검사로 전환시키는데 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 CDK-9 억제 화합물에 대한 백혈병 환자 반응을 예측하는 진단 검사를 제공한다. 일부 측면에서, CDK-9 억제제는 플라보피리돌(알보시딥)이다. 추가의 측면에서, CDK-9 억제제는 치료 섭생의 일부로서 하나 이상의 추가의 화합물과 공동-투여될 수 있다. 예를 들면, 섭생은 ara-C 및 미톡산트론(FLAM)과 병용한 알보시딥일 수 있다. 추가의 변수가 검정 변수의 민감도를 증가시키는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들면, 환자 세포유전학적 프로파일 또는 상태 및/또는 연령이 예측 알고리즘에 인자로 포함될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 진단 검사는 BH3 펩타이드 NOXA, 또는 MCLl/Bfl-1 선택적 BH3 모방체 화합물 EU5346(문헌[참조; D. Richard 등 Molecular Cancer Therapeutics, 2013]에서의 화합물 9)에 대한 반응으로 미토콘드리아 막 전위의 변화를 측정함을 포함하여, MCL1의 기능을 측정함을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 BH3 도메인 펩타이드를 투과된 환자 암 세포에 전달하여 프라이밍의 정도를 결정하는 단계; 면역조직화학 및/또는 형광 동소 보합법(FISH)에 의해 환자의 암 세포의 하나 이상의 임상 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암 세포 표본에 대해 BH3 프로파일을 결정하는 단계; 환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계(여기서, 하나 이상의 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택된다); 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 알보시딥 또는 FLAM 치료에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암 세포 표본에 대해 BH3 프로파일을 결정하는 단계; 환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계(여기서, 하나 이상의 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택된다); 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 알보시딥 또는 FLAM 치료, 또는 시타라빈-기반 치료 단독에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법을 제공한다. 그후, 이 판독치를 말초 혈액 표본으로부터의 BH3 프로파일 판독치와 비교한다. 구체적으로 0.1μM의 BIM BH3 펩타이드의 BH3 프로파일 판독치가 알보시딥 없는 ara-C 기반 치료를 예측하는 것으로 입증되었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수로부터 수집된 환자의 AML 암 세포 표본에 대해 BH3 프로파일을 결정하는 단계; 환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계(여기서, 하나 이상의 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택된다); 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, (인터류킨-6) IL-6 길항 치료제 또는 MCL1 선택적 BH3 모방체에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법을 제공한다. 그후, 이 판독치를 말초 혈액 표본으로부터의 BH3 프로파일 판독치와 비교한다.
본 발명의 상세는 아래 첨부된 설명에 개시되어 있다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료들이 이하에서 설명된다. 본 발명의 기타 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 청구항으로부터 자명해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구항에서, 단수형은 달리 문맥이 명백히 지시하지 않는 한 복수형을 또한 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
또한, 암 세포의 생체내 컨텍스트(in vivo context)는 MCL1 단백질이 암의 발병 및 지속에 관여하는 정도, 및 MCL1 표적화 요법의 효능에 영향을 미친다. 구체적으로, 골수의 기질에 있는 골수성 백혈병 및 골수종 세포가 말초 혈액 중에 순환하는 것들보다 생존을 위해 MCL1에 더욱 의존적이다. 게다가, 말초 혈액 샘플로부터의 BIM BH3 펩타이드가 ara-C와 안트라사이클린, 7+3에 대한 AML 환자 반응과 상관성이 있는 것으로 확립되었다. 그러나, 이러한 판독치와 말초 혈액에서 백혈병 세포로부터의 BH3 프로파일링 판독치 중 어느 것도 FLAM 또는 다른 MCL1 억제 요법에 대한 AML 환자 반응을 예측하지 못한다.
BH3 프로파일링이, 자체로, 치료법에 대한 화학민감성 또는 화학반응성의 일반적인 표시를 제공하는 것으로 알려져 있지만. 여기서, 그러나, MCL1 단백질에 중점을 둔 메카니즘에 대한 특정 상관성을 인지하는 것은 치료에 영향을 미치는 MCL1에 대한 환자 반응을 예측하기 위한 독특하게 민감한 방법을 제공한다. 이것은; 그러나, 암 세포를 골수의 기질로부터 분리하는 경우 특정 MCL1 표적화 요법에만 적용된다.
[0021] 도 1a-e는 FLAM 섭생으로 치료한 환자로부터 수득된 골수 샘플로부터의 대표적인 BH3 프로파일링 데이터를 보여준다. 도면은 AML 환자로부터의 고 대 저 프라이밍된 아세포의 패턴 차이를 보여준다. 골수에서 NOXA 프라이밍에 대한 ROC 분석에 의한 최고 통합 민감도 및 특이성으로 확인된 컷오프는 대략 10.7%이었고, 40%에서의 컷오프는 100% 양성 예측치(PPV)와 70.5% 음성 예측치(NPV)를 제공한다. 반응자(responders) 또는 무반응자(non-responders)로서의 환자의 분류를 위해 이러한 역치를 변화시키는 것은 상이한 수준의 민감도 및 특이성을 산출할 것이며, 그 역치의 선택은 조사의 성질에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, 목표가 제제에 반응할 모든 환자를 확인하는 것이라면, 거짓 양성 결과를 생성하는 희생을 치르면서 낮은 역치가 선택되거나, 또는 목표가 최고 정확도(PPV)로 양성을 확인하는 것이라면, 주어진 연구를 위해 높은 역치가 선택될 수 있다. 따라서, NOXA 프라이밍에 기반한 분류는 절대적이지 않으며, 목적하는 의료 유틸리티를 수용하도록 조절될 수 있다. 패널 a-c는 CR을 받은 고 NOXA 프라이밍을 갖는 환자를 보여주는 각각의 세포유전학적 위험 카테고리 컨텍스트(Fav-유리, adv-불리, 및 int-중간)의 예를 보여준다. 패널 d-e는 치료 실패를 겪은 저 NOXA 프라이밍을 갖는 중간 위험 및 유해 위험 환자를 보여준다.
도 2a-f는 모든 FLAM-치료된 환자 표본에서 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석에 의한 FLAM에 대한 반응과 BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. 패널 A, C, 및 E는 세포유전학적 위험 인자 및 MDS(골수이형성 증후군) 병력 임상 변수와 조합하여 BAD, BIM 100, 및 PUMA의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 보여준다. 패널 B, D, 및 F는 CR에 도달하지 못한 환자에 비해 CR에 도달한 환자에서 조합된 메트릭스(combined metrics)로부터의 각각의 환자 데이터 포인트를 예시하는 상응하는 점 도표를 보여준다.
도 3a-c는 골수-유래 FLAM 치료된 환자 표본에서의 반응과 점 블롯 상관 분석에 의한 NOXA BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. NOXA 프라이밍 단독은 골수 기질 컨텍스트 샘플에서 예측치를 보여준다. 패널 A-C는 모든 샘플(A), 및 골수(B) 또는 말초 혈액(C)로부터 채취한 샘플에서 측정된 NOXA 프라이밍을 나타내는 점 도표를 보여준다. 골수로부터 수득된 샘플은 CR과 상당한 연관성을 보여주며, 이것은 말초 혈액 기질 컨텍스트로부터 채취한 샘플에서는 보이지 않는다.
도 4a-d는 골수-유래 컨텍스쳐 FLAM 치료된 환자 표본에서 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석에 의한 반응과 NOXA BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. 도 a 및 b는 모든 샘플에서 세포유전학적 위험 인자와 MDS 병력 임상 변수와 조합하여 NOXA 펩타이드 프라이밍의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 보여준다. 도 c 및 d는 골수로부터 채취된 샘플에서는 동일하지만 말초 혈액으로부터의 샘플에서는 그렇지 않음을 보여준다. 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력의 추가는 검사의 예측력을 개선시키며, 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력을 가진 BM NOXA 프라이밍에서 AUC 값은 0.92이다.
도 5a 내지 5c는 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 프라이밍의 예를 예시한다. 도 5a는 BIM 0.1 (좌측 패널) 및 NOXA (우측 패널) 프로파일링의 예를 보여준다. 도 5b는 특정의 개별 BH3 펩타이드에 대한 혼합된 말초 및 골수 혈액 샘플에서의 검정 판독치 간의 상관성 결여를 보여준다. 도 5c는 AML 환자에 대한 말초 혈액 샘플에서의 검정 판독치 간의 상관성 결여를 보여준다.
도 6은 미치료(treatment-naive) AML 환자에서 암 치료법 간의 선택을 위해 알고리즘을 확인하는 방법을 보여준다. 상대적 BIM 0.1 및 NOXA 프로파일링을 비교함으로써, 환자는 FLAM 요법, 7+3 요법에 배정될 수 있거나, 또는 요법에 적합하지 않은 것으로 확인된다.
도 7 약리학적 제제에 대한 세포주 반응을 CTRP v2.0 약물 스크린으로부터 다운로드하였다. 총 437개 세포주를 디나시클립(CDK1, 2, 5, 및 9의 억제제) 및 알보시딥(CDK9 억제제)으로 시험하였다. 곡선하 면적 값은 수치 통합에 의해 8개 집중 지점을 사용하여 계산하였다. 이러한 제제에 대한 반응들 간의 연관성은 피어슨법을 사용하여 계산하였으며 약 0.95인 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는, 두 제제 간의 유사성으로 인해, NOXA 바이오마커가 디나시크립 뿐만 아니라 알보시딥에 대한 반응을 예측하는데 유용함을 예시한다.
도 8은 60세 이상의 환자 집단을 나타내는 AML 샘플로부터의 NOXA 판독치를 보여준다. NOXA 신호의 확산은 이러한 대표적인 집단에 걸친 신호의 광범위한 표시를 나타낸다. 데이터는 NOXA 프라이밍에 의해 결정되는 세포에서의 보다 높은 MCL-1 의존성이 저메틸화작용제(HMA)에 대한 보다 큰 민감도를 나타냄을 보여준다. 암 세포주(n = 33)를 PraediCare Dx™ 검정을 사용하여 NOXA 펩타이드와의 MCL-1 의존성에 대해 프로파일링하였다. 이러한 세포주에서 아자시티딘 및 데시타빈에 대한 반응이 암 반응 치료제 포탈(Broad Institute CTD2 public data base)로부터 수득되었으며, 세포는 반응에 대한 역치로서 데시타빈에 대해서는 40% 변위치 및 아자시티딘에 대해서는 12% 변위치를 사용하여 수득된 AUC(곡선하 면적) 값에 기초하여 저메틸화작용제(HMAs)에 대해 반응하는지로서 분류하였다. 순위합 검정 p-값을 두 그룹 간에 계산하였으며 도표에 나타내어져 있다. 함께, 이것은 NOXA 바이오마커를 통한 MCL-1 의존성이 HMA에 대한 반응을 위해 필요할 수 있음을 나타낸다.
도 9는 NOXA에 의해 프라이밍되는 것으로 나타난 세포주가 또한 PraediCare Dx™ 포맷에 따라 투과된 세포에 직접 적용된 MCL-1 선택적 BH3 모방체 화합물, EU5346(Richard et al 2013)에 반응성임을 보여준다. 프라이밍 값으로서 나타낸, 세 가지 현탁액 암 세포주에서 화합물에 대한 미토콘드리아 반응은 EU5346이 NOXA 프라이밍을 검출하기 위해 PraediCare Dx™ 검정에서 리간드로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 FLAM 섭생에 대한 AML 환자에서의 NOXA 프라이밍 간의 관계를 예시한다. 도 10a는 NOXA 프라이밍이 60세 이상의 환자 집단을 나타내는 AML 및 MDS 환자 샘플에서 나타남을 보여준다. Praedicare Dx 검정을 사용하여 평가된 바와 같은 NOXA 프라이밍. 도 10b는 NOXA 프라이밍 지수(priming index)를 보여주며, 생존 함수, S(x)가 FLAM으로 치료된 AML 환자에서 시간에 대해 플롯팅되어 있다. 생존 곡선은 40% NOXA 프라이밍을 컷오프로서 사용한다. 이 그룹에는 7명의 완전 관해(CR) 및 17명의 무반응자(NR)가 있었다. NOXA 낮은 그룹의 생존 중간값은 303일이었으며 생존 중간값은 NOXA high 그룹에서는 도달되지 않았다. 95% 이하 신뢰 구간이 NOXA 낮은의 경우 142일 이하이고 그 이상은 확인되지 않으며 NOXA high의 경우 959일 이하이며 그 이상은 확인되지 않는다. NOXA high 및 낮은 그룹 간의 생존 차이에 대한 로그-순위 검정은 0.023의 p 값을 제공한다.
도 11a 및 11b는 FLT3 돌연변이 상태에 의해 분류된 및 데시타빈에 대한 반응으로 분류된 64개 AML 환자 샘플의 미토콘드리아 프로파일링 연관성을 보여준다. 사전-치료 샘플 프라이밍은 단일 제제로서의 데시타빈에 대한 반응과 상관성이 있었다(도 11a). 데시타빈 처리에 반응한 FLT3 돌연변이 음성 환자는 반응하지 않은 환자에 비해 BH3 모방체에 대한 미토콘드리아 반응, BIM 0.1(p = 0.04)이 유의적으로 더 높았다. FLT3 돌연변이를 갖는 환자는 일반적으로 유의적으로(p = 0.02) 더 높은 BIM 0.1 프라이밍을 가졌다(도 11b).
도 12a-12d는 FLT3 돌연변이 상태, 프라이밍 및 데시타빈에 대한 반응 간의 관계의 양상을 보여준다. 도 12는 FLT3 음성 환자에서 BIM 0.1 및 HRK(각각 도 12a 및 12b)의 프라이밍을 예시하며, 여기서 우리는 보다 높은 프라이밍과 데시타빈에 대한 반응의 연관성을 알아본다. 이러한 연관성을 순위합 검정 및 t-검정으로 시험하였으며, 그 결과가 각 도표에 나타내어져 있다. 하부 패널은 BIM 0.1 (도 12c) 및 HRK (도 12d) 프라이밍과 환자의 FLT3 상태의 연관성을 보여주며, 여기서 FLT3 프라이밍은 FLT3 ITD 양성 환자에서 더 높은 것으로 보인다. 이러한 연관성을 프라이밍을 반응으로 하고 FLT3 상태를 예측변수로 하여 선형 회귀 분석으로 시험하였다. 전체 모델 p-값(f-통계량에 의해) 및 FLT3 ITD 계수 p-값(t-통계량에 의해)이 각각 아래 도표에 나타내어져 있다. 이것은 FLT3-양성 상태가 FLT3-음성 환자보다 더 높은 프라이밍과 연관됨을 시사한다.
표 1은 FLAM 환자 연구를 보여준다. 각 값에 대한 이용 가능한 데이터와 총 수에 걸친 각 컨텍스트에서 양성인 환자의 수를 갖는 전체 환자 요약이 표에 나타내어져 있다.
표 2는 FLAM 치료된 환자 요약 분석을 보여준다. 표는 수득된 모든 샘플을 열거한다. 환자를 세 가지 상이한 프로토콜(J0669, J0856, 및 J01101)에 등록시켰으며 대개 새로 진단된 AML 환자이었다. 샘플은 말초 혈액 또는 골수 천자로부터 수득하였다. 연령은 진단 시기에 계산하였다. 세포유전학적 위험 인자는 CALGB 가이드라인을 사용하여 구하였다. 세포유전학, FLT-3, 및 NPM1 돌연변이 상태, MDS 병력, 화학요법 이력, 골수 아세포 퍼센트, 백혈구(WBC) 수치, 치료, 및 반응을 모든 입수하였다. 회색으로 음영된 샘플은 BH3 프라이밍에 대해 성공적으로 검정되지 못했으며 모든 후속적인 분석으로부터 배제된다(MRD-최소 잔여 질병, TF-치료 실패, PR-부분 반응, CR - 완전 관해). 완전 반응(CR)은 다음 중의 하나 이상, 전형적으로 전부를 특징으로 한다: 5% 미만의 골수아세포와 모든 세포주의 정상적인 성숙, ANC ≥ 1000/㎕ 및 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕, 말초 혈액 중의 아세포의 부재, 골수 중의 백혈병 세포의 부재, 질병과 관련된 세포유전학의 해소, 및 이전의 골수외 질병의 해소.
표 3은 FLAM 반응과 임상 특징 연관성을 보여준다. 임상적 변수의 통계 분석을 반응에 기초하여 수행하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 검정하였다. AUC(곡선하 면적)는 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다.
표 4는 FLAM 환자 연구로부터의 BH3 프로파일링 데이터를 보여준다. BH3 프로파일링은 표 2에 열거된 모든 환자 샘플에 대해 수행하였다. 회색으로 음영된 렬은 프로세싱 동안 BH3 프로파일링의 허용 기준에 불합격한 샘플이다. 줄표(-)를 갖는 어떠한 세포도 제시된 샘플에 대한 각각의 BH3 펩타이드 검정을 수행하기에 충분한 세포를 갖지 못했다. 신호 대 잡음(signal to noise)은 CCCP JC-1 레드 MFI에 걸친 DMSO JC-1 레드 평균 형광 강도(MFI)의 척도이다. 세포 계수 및 생존률 퍼센트는 수동 세포 계수와 트리판 블루 배제에 의해 구하였다. 아세포 퍼센트는 투과된 생존 세포의 CD45-dim, CD3/CD20 음성, 및 SSC-낮은의 백분율이다. 모든 BH3 프로파일링은 아세포 게이팅된 것들에서 수행하였다.
표 5는 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성을 보여준다. BH 펩타이드의 통계 분석을 반응에 대해 수행하였으며, 이때 CR 샘플을 모든 부분 반응, 최소 잔여 질병, 및 치료 실패(NR-무반응자)와 비교하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC(곡선하 면적)은 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다.
표 6은 FLAM 연구에서 다른 임상 변수로의 BH3 펩타이드 프로파일링의 다변량 분석을 보여준다. BH3 펩타이드의 통계 분석을 반응에 대해 수행하였으며, 이때 CR 샘플을 NR 샘플과 비교하였다. 변수들의 조합을 로지스틱 회귀를 사용하여 검정하여 로지스틱 회귀 모델 하에서 계수 및 상수를 구한 다음 이들 계수 및 상수를 순위합 Mann-Whitney 검정 및 ROC 곡선 분석에 의해 검정하였다.
표 7은 골수 샘플에서 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성을 보여준다. BH3 펩타이드의 통계 분석은 5에서 수행된 바와 같이 골수로부터 수득된 샘플에서만 수행하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC(곡선하 면적)은 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다. 이 분석으로, NOXA 프라이밍이 무반응자와 비교하여 치료에 반응한 환자에서 유의적으로 더 높은 것으로 드러났다.
표 8은 골수 기질 컨텍스트로부터의 샘플에서 BH3 펩타이드의 통계 분석을 보여준다. Mann-Whitney p-값은 프라이밍 값을 사용하여 구하거나 로지스틱 회귀로부터 계산된 로그우드(log-likelihood)이었다. 로지스틱 회귀 p-값은 최종 모델 대 눌 모델(null model)의 ANOVA 분석을 통해 계산하였다. 이 분석은 BAD, BIM 100, 및 PUMA의 조합이 또한 골수 샘플 단독에서의 반응과 연관됨을 보여준다. 두 가지 NOXA 모두와 세 개의 펩타이드 판독치가 세포유전학적 위험 범주 및 MDS 병력에 부가되며 보다 높은 유의성 및 AUC 값을 초래한다.
본 기재내용은, 부분적으로, 환자 골수 기질로부터의 암 세포에서의 반응을 측정함으로써 단독으로 또는 공동-치료 섭생(e.g., FLAM)에서 CDK-9 억제제 (e.g. 알보시딥)와 같은 CDK 억제제에 대한 반응을 예측하기 위해 BH3 프로파일링 검정의 의료 유틸리티가 실현될 수 있다는 발견에 기초한다. BH3 프로파일링 측정의 민감도 및/또는 특이성은 말초 혈액 또는 말초 혈액 샘플과 골수 샘플의 조합으로부터 수집된 혈액을 능가하여 상당히 개선된다. 골수 기질 컨텍스트로부터의 샘플 만을 사용하는 경우 0.445에서 0.0007로의 p-값 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이, NOXA와 관련한 극적인 증가가 반응에 대한 신호를 생성하는 것으로 보였다. (표 6 및 7). 임상 변수, 세포유전학, 및 연령 컨텍스트가 분석에 요인으로 포함되는 경우 검정의 민감도가 0.805(AUC)에서 0.91(AUC)로 개선되었다. FLAM 치료에 대한 AML 환자의 반응을 예측하는 상이한 알고리즘이 본원에 제공된다. 하나의 측면에서, NOXA 프라이밍이 FLAM 섭생에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 단독으로 사용된다. 또 다른 측면에서, BAD + BIM 100 + PUMA 프라이밍이 FLAM 섭생에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 병용될 수 있다. 본원에 기재된 진단 접근책은 MCL1 교란 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 골수로부터의 환자의 종양 또는 암 세포 표본에서 MCL1 의존 정도를 결정하는 단계; 환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계, 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 결정하는 방법을 제공하며; 여기서, 하나 이상의 임상 인자는 임상 반응과의 연관성에 대해 MCL1 특이 BH3 프로파일링 판독치의 특이성 및/또는 민감도를 증가시키도록 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 투과된 암 세포를 NOXA BH3 도메인 펩타이드에 노출시켜 프라이밍의 정도를 결정하는 단계; 면역조직화학 및/또는 형광 동소 보합법(FISH)에 의해 환자의 암 세포의 하나 이상의 임상 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수 또는 말초 혈액으로부터 채취한 환자의 AML 암 세포 표본에 대해 BH3 프로파일을 결정하는 단계; 이러한 두 가지 암 세포 공급원으로부터의 판독치를 비교하는 단계 및 그 정보르 사용하여 FLAM 또는 시타라빈 기반 치료를 안내하는 단게를 포함하여, 시타라빈 및/또는 FLAM에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 임상적 컨텍스트는 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질병 단계 중의 하나 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성, 정상 상태 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가의 바이오마커의 측정을 추가로 포함하며, 이것은 시험에 대한 추가의 특이성 및/또는 민감도를 부가할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측함을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 임상 반응은 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/악화되지 않는 생존률이다.
특정 실시형태에서, 프라이밍은 다음의 방정식으로 정의된다:
여기서, AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하고; DMSO는 베이스라인 음성 대조군을 포함하며; CCCP(카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존)는 미토콘드리아에서 전자 전달 연쇄계에서 전자 전달체의 정상적인 활성 동안 확립된 양성자 구배의 탈커플링제로서 작용함으로써 단백질 합성의 효과기를 포함하고 베이스라인 양성 대조군을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 균일 시분해 형광(HTRF)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 시간은 약 0 내지 약 300 min 내지 약 0 내지 약 30 min의 창에 걸쳐 발생한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 형광 강도 중간값(MFI) 통계에 의한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 신호 강도는 약 5 min 내지 약 300 min에서 발생하는 단일 시점 측정치이다. 개별 펩타이드에 대해, 프라이밍은 다음과 같이 계산될 수 있다:
예시적인 임상적 결정
몇몇 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 환자의 평가에, 예를 들면, 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응을 평가하는데 유용하다. 다양한 측면에서, 본 발명은 종양 또는 혈액 암을 평가함을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 평가는 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응으로부터 선택될 수 있다.
진단은, 예를 들면, 암과 같은 가능한 질병 또는 장애를 결정하거나 확인하고자 하는 과정을 나타낸다. 예후는, 예를 들면, 암과 같은 질병 또는 장애의 개연적인 결과를 예측하는 것을 나타낸다. 완전한 예후는 종종 점진적인 쇠퇴, 간헐적 위기, 또는 갑작스럽고, 예측할 수 없는 위기와 같은 질병의 과정의 예상되는 지속, 기능 및 성상을 포함한다. 치료에 대한 반응은 치료를 받는 경우 환자의 의학적 결과의 예측이다. 치료에 대한 반응은, 비제한적인 예를 들자면, 병리적 완전 반응, 생존, 무진행 생존, 진행까지의 시간, 및 재발 확률일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료를 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 신보조 및/또는 보조 화학요법에 대한 양성 반응 또는 신보조 및/또는 보조 화학요법에 대한 무반응을 예측한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 프로-아폽토시스 제제 또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대한 양성 반응 또는 아폽토시스 효과기 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대한 무반응을 예측한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들면, 어떠한 타입의 치료가 투여되거나 보류되어야 하는지를 포함하여, 암 환자의 치료를 지시한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 단일의 단독 보조 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1차, 주요 또는 초기 치료 후 보조 요법을 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 보조 관리(adjuvant care)라고도 부르는 보조 요법(adjuvant therapy)은 1차, 주요 또는 초기 치료에 더하여 제공되는 치료이다. 비제한적인 예를 들자면, 보조 요법은 모든 검출 가능한 질병이 제거되었지만 잠재성 질병으로 인해 재발의 통계적 위험이 남아 있는 경우 수술 후 통상적으로 제공되는 추가의 치료일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자의 치료가 보조 요법을 포함하도록 지시한다. 예를 들면, 특정 치료에 반응성인 것으로 스코어링된 환자는 보조 요법과 같은 이러한 치료를 받을 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은, 비제한적인 예를 들자면, 프로-아폽토시스 방식으로 유도 및/또는 작동하는 치료 또는 그렇지 않은 치료로서 보조 요법의 정체를 지시할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료에 반응성이지 않거나 덜 반응성일 것임을 지시할 수 있으며, 따라서 이러한 환자는 보조 요법과 같은 이러한 치료를 받지 않을 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자의 개연성있는 반응에 따라 보조 요법을 제공 또는 보류함을 제공한다. 이러한 방식으로, 환자의 삶의 질 및 치료 비용이 개선될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 타입의 치료를 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자 치료를 위한 안내 검사(guiding test)이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료를 받아야 하는지의 개연성있는 반응에 대한 정보를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 높은 반응 가능성을 제공하며, 공격적인 치료를 포함한 치료를 지시할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 낮은 반응 가능성을 제공하며, 보다 나은 삶의 질을 위해 비효과적인 화학요법으로부터의 불필요한 독성을 피하기 위해 공격적인 치료를 포함한 치료의 중단, 및 완화 치료의 사용을 지시할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 특정 치료에 대한 반응 가능성을 나타낼 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 프로-아폽토시스 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하는 제제에 대해 높은 또는 낮은 반응 가능성을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, 예시적인 프로-아폽토시스 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하는 제제는 ABT-263 (Navitoclax), 오바토글락스, WEP, 보르테조밉, 및 카르필조밉을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대해 높은 또는 낮은 반응 가능성을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 예시적인 제제는 키네신 방추 단백질 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 삼산화비소(TRISENOX), MEK 억제제, 포몰리도마이드, 아자시티딘, 데시타빈, 보리노스타트, 엔티노스타트, 디나시크립, 겜투주맙, 이브루티닙을 포함한 BTK 억제제, PI3 키나제 델타 억제제, 레놀리디마이드, 안트라사이클린, 시타라빈, 멜팔람, Akt 억제제, mTOR 억제제를 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 암 치료를 위해 프로-아폽토시스 제제 또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제를 받을 것인가를 나타낼 것이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제를 받을 것인가를 나타낼 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 (제제를 포함한) 임의의 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는데 유용하다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 시타라빈 및 아자시티딘에 대한 AML 환자의 반응 가능성을 예측하고 환자의 BH3 프로파일, 연령 프로파일 및 세포유전학적 인자의 평가를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 암 치료는 본원에 기재된 방법에 기초하여 투여되거나 보류된다. 예시적인 치료는 수술적 절제, 방사선 요법(방사선증감제로서 또는 이와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 사용을 포함함), 화학요법, 약력학 요법, 표적화 요법, 면역요법, 및 지지 요법(예, 진통제, 이뇨제, 항이뇨제, 항바이러스제, 항생제, 영양 보충제, 빈혈 치료제, 혈액 응고 치료제, 골 치료제, 및 정신적 및 심리적 치료제)을 포함한다.
예시적인 치료
예시적인 실시형태에서, 본 발명은 특정 치료제에 대한 예상되는 반응률을 계산한다. 이러한 제제의 예는 항암 약물, 화학요법, 수술, 보조 요법, 및 신보조 요법 중의 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 암 치료는 BH3 모방체, 후성 개질제, 토포이소머라제 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 및 키네신-방추 단백질 안정화제 중의 하나 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 암 치료는 프로테아좀 억제제; 및/또는 세포 주기 조절의 조절인자(비제한적인 예를 들자면, 사이클린 의존성 키나제 억제제); 및/또는 세포 후성 메카닉의 조절인자(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 히스톤 데아세틸라제(HDAC) (e.g. 하나 이상의 보리노스타트 또는 엔티노스타트), 아자시티딘, 데시타빈); 및/또는 안트라사이클린 또는 안트라센디온(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 에피루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신); 및/또는 백금계 치료제(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 카보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴); 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법; BH3 모방체(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 BCL2, BCLXL, 또는 MCL1); 및 MCL1의 억제제이다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 US 특허 공보 제US 2012-0225851호 및 국제 특허 공보 제WO 2012/122370호에 기재된 것들을 제한함이 없이 포함하는 암 치료에 관한 것이며, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 CYTOXAN 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(e.g., 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리 스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(예, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TMl 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생체(예, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말 및 칼리케아미신 올레갈(문헌 참조; e.g., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 디네미신 A를 포함한 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우크라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마아신, 예를 들면, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라미신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신, 예를 들면, 미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프로린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누라존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(e.g., T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예, TAXOL 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE 크레모포르-프리, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 TAXOTERE 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; GEMZAR 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE. 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 섭생 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 섭생(FOLFOX)을 포함한 옥살리플라핀; 라파티닙(Tykerb); 세포 증식을 억제하는 PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR(e.g., 에를로티닙(Tarceva)) 및 VEGF-A의 억제제, 다코겐, 벨카드, 및 상기의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체 중의 하나 이상을 제한함이 없이 포함하는 암 치료에 관한 것이다.
예시적인 검출법
다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BH3 프로파일링의 특이성 및/또는 민감도를 증진시킬 수 있는 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 평가는 환자 반응에 대한 마커를 수반한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴(in-cell western), 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS), 또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 기타의 임의의 방법 중의 하나 이상을 사용한 측정을 포함한다. 본 발명의 방법은 항체를 종양 표본(e.g. 생검 또는 조직 또는 체액)과 접촉하여 조직 또는 체액에 특이적이고 암 상태를 나타내는 에피토프를 확인함을 포함할 수 있다.
체액 또는 조직에서 항원 상의 에피토프의 검출에 사용되는 전략에는 일반적으로 두 가지가 있다, 직접 방법 및 간접 방법. 직접 방법은 1단계 염색을 포함하며, 체액 또는 조직 샘플에서 항원과 직접 반응하는 표지된 항체(예 FITC 접합 항혈청)을 수반할 수 있다. 간접 방법은 체액 또는 조직 항원과 반응하는 비표지된 1차 항체, 및 1차 항체와 반응하는 표지된 2차 항체를 포함한다. 표지는 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예를 들면, 비오틴, 또는 효소, 예를 들면, 호스 라디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 포함할 수 있다. 이들 검정을 수행하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다[문헌 참조; e.g., Har낮은 등 (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988), Har낮은 등 (Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1999), Virella (Medical Immunology, 6th edition, Informa HealthCare, New York, 2007), and Diamandis 등 (Immunoassays, Academic Press, Inc., New York, 1996). Kits for conducting these assays are commercially available from, for example, Clontech Laboratories, LLC. (Mountain View, CA)].
다양한 실시형태에서, 항체는 전 항체 및/또는 임의의 항원 결합 단편(예, 항원-결합부) 및/또는 이들의 단일 쇄(예 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 항체, Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함한 이가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 싱글 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 등)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 다클론성 및 단클론성 항체가, 분리된 인간 또는 인간화 항체, 또는 이의 기능성 단편과 같이 유용하다.
예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한, 다양한 종의 표적에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 표준 검정법이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 역학(예, 결합 친화도)를 또한 Biacore 분석과 같이 당업계에 공지된 표준 검정법으로 평가할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 측정은 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 당업계의 숙련가는 다수의 방법들이 적절한 마커의 DNA/RNA 수준을 검출 또는 정량하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
유전자 발현은, 예를 들면, 리포터 유전자 검정, 노던 블롯, 형광 동소 보합법(FISH), 및 역전사 PCR(RT-PCR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 저-내지-중간-플렉스 기술을 사용하여 사용할 수 있다. 유전자 발현은 또한, 예를 들면, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), DNA 마이크로어레이, 틸팅 어레이, RNA-Seq/전 전사체 산탄 서열분석(WTSS), 고속처리 서열분석, 멀티플렉스 PCR, 멀티플렉스 결찰-의존 프로브 증폭(MLPA), 결찰에 의한 DNA 서열분석, 및 Luminex/XMAP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고차-플렉스 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 당업계의 숙련가는 다수의 방법들이 샘플 내의 바이오마커의 RNA 산물의 수준을 검출 또는 정량하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다; 마이크로어레이, RT-PCR(정량적 PCR 포함), 뉴클레아제 보호 검정 및 노던 블롯 분석과 같은 어레이 포함.
예시적인 암 및 환자
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 암 치료를 결정하는 방법을 제공하고/하거나 환자의 종양 또는 암 세포 표본을 포함한다. 암 또는 종양은 세포의 조절되지 않는 성장 및/또는 비정상적으로 증가된 세포 생존 및/또는 신체 장기 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 아폽토시스의 억제를 나타낸다. 암 또는 종양을 갖는 대상체는 대상체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암 세포를 갖는 대상체이다. 본 발명에는 양성 및 악성 암 뿐만 아니라 휴먼 종양 또는 미세전이가 포함된다. 원래의 위치 및 시드 중요 기관으로부터 이동된 암은 결국에는 병에 걸린 장기의 기능 악화를 통해 대상체의 사망을 초래할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 전-전이성 암, 또는 전이성 암에 적용 가능하다. 전이는 이의 초기 부위에서 신체의 다른 위치로의 암의 확산을 나타낸다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 이탈하여, 림프관 및 혈관으로 침투하고, 혈류를 통해 순환하고, 신체의 다른 데 정상 조직에서 먼 초점에서 성장(전이)한다. 전이는 국소적이거나 멀리 떨어질 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 이탈하여 혈류를 통해 이동하고 멀리 떨어진 부위에서 멈추는 종양 세포 여하에 달린 순차적인 과정이다. 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 성장하여, 생명을 위협하는 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극성 및 억제성 분자 경로 둘 다가 이러한 거동을 조절하며, 멀리 떨어진 위치에서의 종양 세포와 숙주 세포 간의 상호작용이 또한 중요하다. 전이는 종종 특정 증상의 모니터링 이외에 자기 공명 영상(MSI) 스캔, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 수치, 간 기능 연구, 흉부 X선 및 골 스캔의 단독 사용 또는 병용을 통해 검출된다.
본원에 기재된 방법은 암의 예후, 암의 진단, 암의 치료, 및/또는 증가된 세포 생존 또는 아폽토시스의 억제와 연관된 증식성 장애 및 악성 종양의 성장, 진행 및/또는 전이의 진단, 예후, 치료, 예방 또는 완화에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병, 및 맨틀 세포 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비호지킨 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈액 암이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 비소폐세포 암종, 난소 암, 및 흑색종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고형 종양이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 다음의 암 중의 하나 이상에 관한 것이다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 맹장암, 성상세포종(e.g. 소아 소뇌 또는 대뇌), 기저-세포 암종, 담도암, 방광암, 골 종양(예 골육종, 악성 섬유 조직구종), 뇌간 신경교종, 뇌암, 뇌 종양(예 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 원시 신경외배엽 종양, 시각로 및 시상하부 신경교종), 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 유암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골증식성 장애, 대장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 간외 담도암, 안암, 담낭암, 위(배) 암, 위장 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양(예 두개외, 고환외, 난소), 임신 융모성 종양, 신경교종(예 뇌간, 대뇌 성상세포종, 시각로 및 시상하부), 위유암종, 두경부암, 심장암, 간세포(간) 암, 하인두암, 시상하부 및 시각로 신경교종, 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 신장암(신장 세포 암), 후두암, 백혈병(예 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발 세포), 입술 및 구강 암, 지방육종, 간암, 폐암(예 비-소세포, 소세포), 림프종(예 AIDS-관련, 버킷, 피부 T-세포 호지킨, 비-호지킨, 일차 중추 신경계, 수모세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발성 내분비 종양형성 증후군, 다발성 골수종, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수구성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수증식성 장애, 만성, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 크롬친화성 세포종, 송과체 성상세포종 및/또는 배세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 샘종, 혈장 세포 종양형성/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종(신장암), 신우 및 요관, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(예 유잉 집단, 카포시, 연조직, 자궁), 시자리 증후군, 피부암(예 비흑색종, 흑색종, 메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부 암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, t-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 융모성 종양, 요관 및 신우 암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 및 빌름스 종양.
하나의 실시형태에서, 암은 AML이다. AML은 두번째로 흔한 백혈병이며, US에서 해마다 대략 13,000명이 새로 진단되고 9,000명이 사망한다. 승인된 치료법이 있기는 하지만, 다수의 백혈병 환자의 예후가 불량하고, 성공적인 치료 가능성이 낮다. AML에 대한 최근의 치료 기준은 안트라사이클린제(예를 들면, 다우나루비신, 이다루비신 또는 미톡산트론)와 병용한 인덕션 사이토신 아라비노사이드(ara-C)이다. 이러한 치료 섭생에는 전형적으로 고용량 시타라빈의 투여 및/또는 줄기 세포 이식이 뒤따른다. 이러한 치료는 어린 환자에서 개선된 결과를 갖는다. 급성 전골수성 백혈병의 치료에도 진전을 보였으며, 여기서는 모든-트랜스 레티노산(ATRA) 또는 삼산화비소로의 표적 치료법이 탁월한 생존률을 야기하였다. 그러나, AML 경우의 대다수를 나타내는 집단인 60세 이상의 환자는 치료상 수수께끼가 남아 있다. 환자의 65-85%가 초기에는 현행 치료에 반응하지만, 이러한 반응자의 65%는 재발을 겪으며, 다수의 환자는 질병으로 쓰러진다. 적어도 이러한 이유로, 그리고 상기한 치료가 심각한 부작용을 가질 수 있기 때문에, 본 발명의 예측 검사는 이러한 소송을 경감시키는 치료의 사용을 안내할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 올바른 환자를 올바른 치료에 매칭시킴으로써 성공적인 치료의 가능성을 개선시킨다. 또한, 치료에 대한 AML 환자 반응을 예측하는 검사가 현재는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 정의되지 않는 한, 용어 대상체는 포유동물, 예, 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 말, 암소, 염소, 양, 돼지, 또는 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이, 침팬지, 또는 비비이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환 가능하게 사용된다.
예시적인 표본
특정 실시형태에서, 표본은 암 줄기 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 표본은, 예를 들면, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 또는 난소 원발성 종양의 생검과 같은 고형 종양의 생검으로부터 유도된다.
특정 실시형태에서, 표본은, 예를 들면, 본원에 기재된 암 중의 어느 것과 같은 비-고형 종양의 생검으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 표본은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 및 비호지킨 림프종을 갖는 환자의 생검으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 표본은 고형 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD 138 항체를 갖는 생검 샘플로부터의 선택에 의해 풍부해진 다발성 골수종 세포이다. 특정 실시형태에서, 표본은 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 풍부해진 급성 골수성 백혈병 세포이다. 특정 실시형태에서, 표본은 비-B 세포 고갈에 의해 풍부해진 만성 림프성 백혈병 또는 미만성 거대 B-세포 림프종이다.
몇몇 실시형태에서, 표본은 순환 종양 세포로부터 유도된다.
BH3 프로파일링
다양한 실시형태에서, 본 발명은 BH3 프로파일링을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 적어도 두 개, 또는 세 개, 또는 네 개, 또는 다섯 개, 또는 여섯 개, 또는 일곱 개, 또는 여덟 개, 또는 아홉 개, 또는 열 개의 BH3 펩타이드를 한번에 평가하는 BH3 프로파일링을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단일 BH3 펩타이드의 평가와는 반대로, 다중펩타이드 분석을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, BH3 펩타이드의 패널을 단일 환자 표본에서 스크리닝한다.
이러한 방법에 유용한 BH3 프로파일링 및 시약은 U.S. 특허 제7,868,133호; 제8,221,966호; 및 제8,168,755호 및 US 특허 공보 제2011/0130309호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
간략하게, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이상 표현형의 결과로서, 암 세포는 아폽토시스 경로에서 기능적 차단을 발달시킨다. 이러한 차단은 암 세포가 일부 치료법에 내성이 생기게 만들며, 놀랍게도, 일부 암 세포를 다른 치료법에 민감하게 만든다. "종양유전자 중독(oncogene addiction)"의 개념은 생존을 위한 특정 유전자에 대한 암 유전자의 후전적 의존성 또는 중독을 말한다. BH3 프로파일링은 특정의 아폽토시스 조절 단백질에 대한 이러한 의존성이 주어진 암 세포에서 일어나는지를 결정하고 의존성 단백질을 확인한다. 암 세포는 아폽토시스를 겪도록 미리 설정될 수 있지만 항상 그러한 것은 아니며 이것은 이들의 달리 의도하지 않은 생존을 위한 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질 중이 어느 것 또는 전부에 의존하는 이들 세포의 기능하다. 이것은 치료에 반응하는 암 세포의 가능성에 대한 통찰력을 제공한다.
암 세포는, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, DNA 손상, 유전적 불안정, 비정상적인 성장 인자 신호전달, 및 비정상적인 또는 없어진 매트릭스 상호작용과 같은 이상을 나타내며, 이러한 것들 중의 어느 것이 전형적으로 고유 (미토콘드리아성) 아폽토시스 경로를 통해 아폽토시스를 유도할 것이다. 그러나, 암 세포는 이러한 아폽토시스 신호에 반응하기 보다는 생존한다. 종종, 이렇게 하는데 있어서, 이들 세포는 만성 아폽토시스 신호에 대한 선택된 차단에 매우 의존하게 된다. 이러한 적응은 암 세포를 위한 생존 메카니즘을 제공한다; 그러나, 이러한 적응은 또한 암 세포가 특정 아폽토시스 유도 치료법에 감수성으로 되게 할 수 있다. 고유 아폽토시스에 의해 세포가 사멸하도록 하는 결정적인 사건은 미토콘드리아 외막(MOMP)의 투과화 및 효과기 카스파제를 활성화시키는 분자의 방출이다. 다수의 경우에, MOMP는 고유 아폽토시스 경로에서의 비복귀점이다. BCL-2 계열 단백질이 MOMP의 주요 조절인자이며, 이들의 활성은 림프상 및 몇가지 고형 종양 암의 발병과 관련되며 다수의 암에서 화학요법에 대한 내성의 주요 매개체인 것으로 믿어진다.
BCL-2 단백질은 예비-생존(항-아폽토시스) 및 프로-아폽토시스 멤버 간의 분명한 단백질-단백질 상호작용에 의해 조절된다. 이러한 상호작용은 주로 BH3 (BCL-2 상동 도메인-3) 매개된 결합을 통해 일어난다. 아폽토시스-개시 신호전달은 대개 미토콘트리아의 업스트림에서 일어나며 미토콘드리아로의 짧은, BH3-only, BCL-2 패밀리 멤버의 전좌를 유발하며 미토콘드리아에서 이들은 MOMP를 활성화 또는 감작시킨다. 활성화제 BH3 온리 단백질, BIM 및 Bid는 효과기, 프로-아폽토시스 단백질 Bax 및 Bak에 결합하여 직접 활성화시키고, 또한 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질, BCL-2, MCL1, Bfl-1, BCL-w 및 BCL-xL에 결합하여 억제시킨다. 감작화제 BH3 단백질, Bad, Bik, NOXA, Hrk, Bmf, 및 Puma는 단지 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질, BCL-2, MCL1, Bfl-1, BCL-w, 및 BCL-xL에 결합하여, 이들의 항-아폽토시스 기능을 차단한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 각각의 감작화제 단백질은 독특한 특이성 프로파일을 갖는다. 예를 들면, NOXA(A 및 B)는 MCL1에 높은 친화도로 결합하고, Bad는 BCL-xL 및 BCL-2에 결합하지만 MCL1에는 약하게 결합하고, Puma는 세 가지 모든 표적에 잘 결합한다. 이들 단백질의 항-아폽토시스 기능은 활성화제 BH3 단백질 BIM 및 Bid의 격리이다. 감작화제 펩타이드에 의한 이들 활성화제의 대체가 Bax/Bak-매개된 아폽토시스를 초래한다. 이러한 상호작용은 항상성, 세포사, 아폽토시스에 대한 감작, 및 아폽토시스의 차단을 제한함이 없이 포함하는 다양한 결과를 가질 수 있다.
아폽토시스 신호전달이 차단되는 암 세포의 분명한 특징은 미토콘드리아 표면에서의 BH3 only 활성화제 단백질의 축적이며, 이러한 단백질의 결과는 항-아폽토시스 단백질에 의해 격리된다. 이러한 축적 및 이들의 효과기 표적 단백질에의 접근이 "BH3 프라이밍된" 상태에서 BCL-2 패밀리 단백질의 길항작용에 대한 증가된 민감도를 설명한다.
몇몇 실시형태에서, NOXA (A 또는 B)에 대해 높은 아폽토시스 반응을 산출하는 세포는 MCL1 프라이밍되는 반면, 펩타이드 Bad에 대한 높은 반응은 BCL-xL 또는 BCL-2가 아폽토시스 차단을 제공함을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, Puma는 pan-BCL-2 패밀리 프라이밍을 반영한다. 이러한 방식으로, MCL1 또는 BCL-xL 중의 어느 하나, 단백질 둘 다, 또는 몇몇 BCL-2 패밀리 멤버에 의존성인 세포가 쉽게 구별되어, 이에 따라 적당한 치료가 맞춰질 수 있다. 이러한 펩타이드에 대한 미토콘드리아 반응에 있어서의 차이가 MCL1 또는 BCL-xL 영향을 받은 고유 신호전달로 집중되는 경로를 통해 작동하는 것으로 알려진 치료법의 사용을 안내한다. BCL-2 억제 또는 MCL1 억제 화합물의 사용이 이러한 경우에서 지시될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 또한 MCL1 또는 BCL-xL의 전체 업스트림을 표적화하는 치료법을 지시하거나 금지한다.
BH3 프로파일링 검정은 언제 암 세포가 프라이밍된 상태로 있는지 뿐만 아니라 프라이밍이 어떠한 구성으로 발생하는지를 확인하며, 이것은 예측치를 갖는다.
예시적인 임상 인자 및 추가의 바이오마커
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 임상 인자의 평가를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 환자 반응을 평가하기 위한 BH3 프로파일링 및/또는 임상 인자의 평가를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, BH3 프로파일링 연구와 함께 환자 반응 정보를 제공하는 임상 인자는 아폽토시스와 관련되지 않을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 영향을 미치는 비-아폽토시스이다. 하나의 실시형태에서, 임상 인자는 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질병 단계 중의 하나 이상이다. 하나의 실시형태에서, 임상 인자는 표 3에 나타내어져 있다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 연령이다. 하나의 실시형태에서, 환자 연령 프로파일은 약 10세 이상, 또는 약 20세 이상, 또는 약 30세 이상, 또는 약 40세 이상, 또는 약 50세 이상, 또는 약 60세 이상, 또는 약 70세 이상, 또는 약 80세 이상으로 분류된다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 세포유전학적 상태이다. 빌름스 종양 및 망막모세포종과 같은 몇몇 암에서는, 예를 들면, 종양 억제인자와 관련된 염색체 영역이 보통 결실되거나 돌연변이되기 때문에 유전자 결실 또는 불활성화가 암 진행을 개시하는데 원인이 된다. 예를 들면, 결실, 역위, 및 전좌가 통상적으로 신경교종, 비소세포 폐암, 백혈병, 및 흑색종에서 염색체 영역 9p21에서 검출된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 염색체 변화가 종양 억제인자 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A를 불활성화시킬 수 있다. 특정 유전자의 이러한 결실과 함께 염색체의 상당 부분이 또한 소실될 수 있다. 예를 들면, 고형 종양 세포에서는 염색체 lp 및 16q가 흔히 소실된다. 유전자 중복 및 유전자 복제 수의 증가가 또한 암에 기여할 수 있으며 전사분석 또는 복제 수 변화 어레이로 검출될 수 있다. 예를 들면, 염색체 영역 12ql3-ql4는 다수의 육종에서 증폭된다. 이러한 염색체 영역이 p53으로 불리는 종양 억제인자에 결합하는 것으로 알려진 MDM2라고 불리는 결합 단백질을 암호화한다. MDM2가 증폭되는 경우, 이것은 p53가 세포 성장을 조절하지 못하도록 만들며, 이것이 종양 형성을 초래할 수 있다. 더욱이, 특정 유방암은 ERBB2 유전자의 과발현 및 복제 수 증가와 연관되며, 이것은 인간 표피 성장 인자 수용체 2를 암호화한다. 또한, 염색체 lq 및 3q과 같은 염색체 수의 증가가 또한 증가된 암 위험과 연관된다.
세포유전학적 상태는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들면, FISH, 전통적인 핵형분석, 및 가상 핵형분석(예 비교 게놈 혼합 어레이, CGH 및 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이)가 사용될 수 있다. 예를 들면, FISH가 특정 유전자좌에서의 염색체 재배열을 평가하는데 사용될 수 있으며 이러한 현상은 질환 위험 상태와 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 세포유전학적 상태는 SWOG(the Southwest Oncology Group), MRC(the Medical Research Council), 및 CALGB(the Cancer and Leukemia Group B)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분류 시스템에 의해 결정되는 바와 같이 유리하거나, 중간 정도이거나, 불리하다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 수행(performance)이다. 수행도는 임의의 시스템을 사용하여 정량될 수 있으며 환자의 수행도를 스코어링하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 측정은 종종 환자가 화학요법, 용량 조절을 받을 수 있는지를 결정하고, 완화 치료의 강도를 결정하는데 사용된다. Karnofsky 스코어 및 Zubrod 스코어를 포함한 다양한 스코어링 시스템이 있다. 병렬 스코어링 시스템은 Global Assessment of Functioning (GAF) 스코어를 포함하며, 이것은 정신과의 진단 및 통계 편람(DSM)의 다섯번째 축으로서 포함되었다. 보다 높은 수행도(예, Karnofsky 스코어링 시스템을 사용하여 적어도 80%, 또는 적어도 70%)는 질병 상태의 진행을 방지하고 화학요법 및/또는 방사선 치료를 받아들일 수 있는 환자의 능력을 증진시키기 위한 치료를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 이러한 실시형태에서, 환자는 보행 가능하며 자기를 스스로 돌볼 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 평가는 종래의 방사선요법 및/또는 화학요법을 견딜 수 있도록 낮은 수행도(예, Karnofsky 스코어링 시스템을 사용하여 50% 미만, 30% 미만, 또는 20% 미만)를 갖는 환자를 가리킨다. 이러한 실시형태에서, 환자는 대개 침대나 의자에 누워 있으며 심지어 자기를 스스로 돌볼 수도 없다.
Karnofsky 스코어는 100 내지 0에 이르며, 여기서 100은 "완벽한" 건강이고, 0은 사망이다. 스코어는 10의 간격으로 사용될 수 있다, 여기서: 100%은 정상이고, 불편이 없으며, 질환의 증상이 없고; 90%는 정상적인 활동을 할 수 있고, 질환의 징후 또는 증상이 거의 없으며, 80%는 약간의 장애, 약간의 징후 또는 증상을 갖는 정상적인 활동이고; 70%는 정상적인 활동 또는 작업을 할 수 없지만 자기를 스스로 돌볼 수 있고; 60%는 약간의 도움을 필요로 하고, 대부분의 개인적인 필요한 것들을 돌볼 수 있으며; 50%는 종종 도움을 필요로 하고, 빈번하게 의학 치료를 필요로 하며; 40%는 장애가 있고, 특별한 관리 및 도움을 필요로 하며; 30%는 심한 장애가 있고, 병원 입원을 보이지만 사망의 위험은 없으며; 20%는 중병을 앓고, 긴급하게 입원을 필요로 하며, 지지적인 조치 또는 치료를 필요로 하고; 10%는 빈사상태이고, 치명적인 질병 과정으로 급속히 진행된다.
수행도에 대한 Zubrod 스코어링 시스템은 다음을 포함한다: 0, 충분히 활동적이고, 제약 없이 모든 질환전 수행을 실행할 수 있음; 1, 신체적으로 격렬한 활동에는 제약이 있지만 보행 가능하고 가볍거나 주로 앉아서 하는 일, 예, 가벼운 집안일, 사무직은 수행할 수 있음; 2, 보행 가능하고 모두 자기 스스로 돌볼 수 있지만 깨어있는 시간의 50% 이상 어떠한 직업 활동을 수행할 수는 없음; 3, 단지 제한된 자기 돌봄은 가능하며, 깨어있는 시간의 50% 이상 침대나 의자에 누워 있음; 4, 완전 장애가 있으며, 자기 돌봄을 전혀 할 수 없고, 전적으로 침대나 의자에 누워 있음; 5, 사망.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 조직학적 서브클래스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양의 조직학적 샘플을 문헌[참조; Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10]에 따라 등급을 나누며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 성별이다. 하나의 실시형태에서, 성별은 남성이다. 또 다른 실시형태에서, 성별은 여성이다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 질병 단계이다. 비제한적인 예를 들자면, 전체 단계 그룹화를 사용하여, I기 암은 신체의 한 부분에 국한되고; II기 암은 III기 암이 그러한 것처럼 국소적으로 진행된다. 암을 II기로 명명할지 또는 III기로서 명명할지는 암의 특정 타입에 따라 좌우될 수 있다. 하나의 비제한적인 예, 호지킨병에서, II기는 횡격막의 단 한면에 병에 걸린 림프절을 나타내는 반면, III기는 횡격막의 위 및 아래에 병에 걸린 림프절을 나타낸다. 따라서, II기 및 III기에 대한 구체적인 기준은 진단에 따라 다르다. IV기 암은 흔히 다른 장기로 또는 신체 전반에 걸쳐 전이되거나 확산된다.
몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 (예 골수조혈이상의 존재 및 골수모세포 및 적혈모구의 정량을 나타내는) 혈액 질환에 대한 French-American-British(FAB) 분류 시스템이다. 하나의 실시형태에서, 급성 림프구성 백혈병에 대한 FAB는 L1-L3이거나, 급성 골수성 백혈병에 대한 것은 M0-M7이다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성, 정상 상태 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가의 바이오마커의 측정을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측함을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 임상 반응은 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/악화되지 않는 생존률이다.
연령 프로파일 및 수행도와 같은 다양한 임상 인자가 확인되었다. 유전자 MLL, AML/ETO, Flt3-ITD, NPM1 (NPMc+), CEBPα, IDH1, IDH2, RUNX1, RAS, 및 WT1에서 그리고 후성 변형 유전자 TET2 및 ASXL에서의 돌연변이 뿐만 아니라 세포 신호전달 단백질 프로파일의 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포유전학 및 분자 이벤트와 같은 다수의 진단 정적 측정이 이용되어 왔다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 안내되는 바와 같이 암에 걸릴 것 같은 환자에게 치료를 투여함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험, 암에 대한 유전적 소인(예 유전적 위험 인자), 암의 이전 에피소드(예 새로운 암 및/또는 재발), 암의 가족력, 암-유도제(예 환경적 제제)에의 노출, 및 약리유전학적 정보(치료제의 약동학적, 약력학적 또는 효능 프로파일에 대한 유전자형의 영향) 중의 하나 이상을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다.
몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 유전적 소인을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 암에 대한 유전적 소인은 당업계에 공지된 바와 같은 유전적 임상 인자이다. 이러한 임상 인자는, 예를 들자면, 적어도 결장, 자궁, 소장, 위, 요로 암의 경우 HNPCC, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암의 이전 에피소드를 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개의 암의 이전 에피스드에 시달린다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암의 가족력을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 부모 및/또는 조부모 및/또는 형제자매 및/또는 고모/삼촌 및/또는 고모할머니/종조부, 및/또는 사촌이 암에 걸렸거나 암을 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암-유도제(예 환경적 제제)에의 노출을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 예를 들면, 강한 일광에의 피부 노출은 피부암에 대한 임상 인자이다. 예를 들자면, 흡연은 폐암, 구강암, 후두암, 방광암, 신장암, 및 몇몇 기타 장기의 암에 대한 임상 인자이다.
추가로, 몇몇 실시형태에서, 다음의 임상 인자들 중의 어느 하나가 본원에 기재된 방법에서 유용할 수 있다: 성별; 유전적 위험 인자; 가족력; 개인력; 인종 및 민족; 특정 조직의 특징; 다양한 양성 병태(예 비증식성 병변); 이전의 흉부 방사선; 발암물질 노출 등.
추가로 여전히, 몇몇 실시형태에서, 다음의 임상 인자들 중의 어느 하나가 본원에 기재된 방법에서 유용할 수 있다: 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서의 세린의 인산화 중의 하나 이상.
몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 인터류킨-6을 포함하지만 이에 제한되지 않는 사이토킨의 발현 수준이다. 몇몇 실시형태에서, 인터류킨-6 수준은 좋지 못한 환자 예후 또는 좋은 환자 예후를 포함하여, MM 환자에서의 반응의 가능성과 상관성이 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 반응의 가능성은 프라이밍 퍼센트를 평가함으로써 결정된다. 특정 실시형태에서, 프라이밍은 다음의 방정식에 의해 정의된다:
여기서, AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하고; DMSO는 베이스라인 음성 대조군을 포함하며; CCCP(카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존)는 미토콘드리아에서 전자 전달 연쇄계에서 전자 전달체의 정상적인 활성 동안 확립된 양성자 구배의 탈커플링제로서 작용함으로써 단백질 합성의 효과기를 포함하고 베이스라인 양성 대조군을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 균일 시분해 형광(HTRF)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 시간은 약 0 내지 약 300 min 내지 약 0 내지 약 30 min의 창에 걸쳐 발생한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 형광 강도 중간값(MFI) 통계를 측정함으로써 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 신호 강도는 약 5 min 내지 약 300 min에서 발생하는 단일 시점 측정치이다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 BH3 프로파일링 검정 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, pS3 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 측정하고; 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘으로 AML 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시킴을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 BH3 프로파일링 검정 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, pS3 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 측정하고; 화학요법으로 MM 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시킴을 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 암은 AML 및/또는 MM이고 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나; 또는 암은 AML 및/또는 MM이고 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이거나, 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나, 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고; 암은 AML 및/또는 MM이고; 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이다.
본 발명은 또한 종양 또는 암 세포 표본의 평가를 간소화할 수 있는 키트를 제공한다. 본 발명의 전형적인 키트는, 예를 들면, BH3 펩타이드를 검출하는 하나 이상의 제제를 포함한 다양한 시약을 포함한다. 키트는 또한 다양한 검출방법에서 유용한 것들을 포함하여, 검출를 위한 하나 이상의 시약, 예를 들면, 항체를 포함할 수 있다. 키트는 벽이 있는 플레이트, 시린지 등을 포함하여, 평가에 필요한 재료를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 기재된 시약의 용도를 알려주는 라벨 또는 인쇄된 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 시험하고자 하는 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "약"은, 참고된 수치 표시와 관련하여 사용되는 경우, 참고된 수치 표시 + 또는 - 10%의 참고된 수치 표시를 의미한다. 예를 들면, 표현 "약 50"은 45 내지 55의 범위를 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함한다" 및 이의 변형은 목록에서의 항목의 설명이 이 기술의 재료, 조성물, 장치, 및 방법에서 유용할 수도 있는 다른 유사한 항목의 배제를 의도하는 것은 아니도록 비제한적인 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "can" 및 "may"와 이들의 변형은 실시형태가 특정 요소 또는 특징을 포함할 수 있거나 포함할 수 있을지 모른다는 설명이 이러한 요소 또는 특징을 함유하지 않는 당해 기술의 다른 실시형태를 배제하지 않도록 비제한적인 것으로 의도된다. 포함하는(including), 함유하는(containing), 또는 갖는(having)과 같은 용어의 동의어로서 오픈-엔드 용어 "포함하는(comprising)"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본원에서 사용되지만, 본 기술, 또는 이의 실시형태는 대안적으로, 설명된 성분"으로 이루어진" 또는 "으로 필수적으로 이루어진"과 같은 보다 제한적인 용어를 사용하여 기재될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해되는 것과 동일한 의를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: AML 환자-기반 코호트를 사용한 연구
우리는 프로토콜 NCT00795002 (J0856), NCT00407966 (J0669), 또는 NCT01349972 (J1101)에 등록된 AML 또는 MDS로 새로 진단된 환자로부터 총 63개의 말초 혈액 및 골수 샘플을 입수하였다. 환자는 FLAM: 알보시딥 (플라보피리돌), Ara-C 및 미톡산트론 (n=54) 또는 7+3 (Ara C 및 다우노루비신, n=9)으로 치료받았다. 완전한 반응, 5% 미만의 골수아세포와 모든 세포주의 정상적인 성숙, ANC ≥ 1000/㎕ 및 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕, 말초 혈액 중의 아세포의 부재, 골수 중의 백혈병 세포의 부재, 질병과 관련된 세포유전학의 해소, 및 이전의 골수외 질병의 해소를 특징으로 함. BH3 프로파일링이 완료된 후 블라인드 외부 검토에 의해 환자 연령, 세포유전학적 위험, FLT-3 돌연변이, NPM1 돌연변이, MDS/골수 장애 병력, 이전의 화학요법 이력, BM 아세포 %, 진단시 WBC 수치, 및 치료법에 대한 반응을 포함한 전반적인 환자 특징이 제공되었으며, 표 1에 요약되어 있다. 개별적인 환자 특징이 표 2에 열거되어 있다.
미토콘드리아 프로파일링
간략하게, 동결, 추출된 백혈구 샘플을 급속히 해동시키고, 세포 생존능을 트리판 블루 배제에 의해 구하였다. 세포를 FACS 완충액(lx 2% FBS를 갖는 PBS)으로 세척하고 형광 표지된 CD45, CD3, 및 CD20 단클론성 항체를 사용하여 면역표현형을 분석하였다. 그후, 세포를 교란 단계를 위해 Newmeyer 완충액(10 mM 트레할로스, 10 mM HEPES, 80 mM KC1, 20 μM EGTA, 20 μM EDTA, 5 mM 석시네이트, pH 7.4)에 재현탁시켰다. BH3 펩타이드를 Newmeyer 완충액에 희석시켜 다음의 최종 농도를 초래하는 작업 용액을 만들었다: BIM (100 μM), BIM (0.1 μM), NOXA (100 μM), Puma (10 μM), HRK (100 μM), BAD (100 μM), 및 BID (1.0 μM). DMSO 및 CCCP를 음성 및 양성 펩타이드 대조군으로서 사용하였다. 디기토닌 및 올리고마이신을 개별 FACS 튜브에 가한 다음 BH3 펩타이드를 가하였다. 그후, 세포를 FACS 튜브에 가하고, 세포 투과화, 펩타이드 또는 화합물의 전달, 및 미토콘드리아 탈분극이 일어나도록 하기 위해 실온에서 2시간 15분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, JC-1 염료를 Newmeyer 완충액 중에서 제조하고 처리된 세포에 직접 가하였다. 펩타이드 또는 화합물로 처리하지 않은 세포의 추가의 튜브를 프로피듐 요오다이드 (PI)로 염색하여 세포가 디기토닌에 의해 효과적으로 투과되도록 보장하였다. JC-1과 45분간 항온처리 후, 세포를 쓰리 레이저 BD FACSCanto II에서 분석하였다. AML 아세포를 네 개의 파라미터에 기초하여 게이팅하였다: 1) 투과화(PI 염색에 의해 측정되는 바와 같음), 2) SSC에 기반한 일중항 구분, 3) CD45 dim 및 CD3/CD20 음성, 및 4) SSC 낮은. 그후, 게이팅된 아세포 집단의 JC-1 레드 형광 중간값을 사용하여, DMSO (음성) 및 CCCP (양성) 대조군과 비교한 % 탈분극도를 계산하였다.
세포유전학적 위험 상태 결정
개별 환자 세포유전학적 위험 분류(유리, 중간, 및 불리)는 CALGB(Cancer and Leukemia Group B) 가이드라인으로부터 구하였다: 유리 = invl6, t(8:21), t(15;17) 중간 = 이배체, 불리 = -5, -7, +8, t(6;9), llq, PH1+, > 3 비관련 세포유전학적 이상 등.
통계적 분석: 각 펩타이드에 대해, 프라이밍 백분율은 완전히 비프라이밍된 기준으로서 DMSO 음성 대조군 및 100% 프라이밍된 기준으로서 CCCP에 기초하여 프라이밍을 구하는 다음의 공식을 사용하여 계산하였다:
분석을 위해, CR로 분류되지 않은 모든 환자는 무반응자로 처리하였다[최소 잔여 질병(MRD), 부분 관해(PR), 및 TF(치료 실패)]. BH3 펩타이드(및 기타 종양 특징들, 예를 들면, 세포유전학, 등)와 반응 간의 스트던트 t-검정, Mann-Whitney 순위합 비모수적 검정, 다변량 로지스틱 회귀, 및 ROC 곡선 분석은 GraphPad Prism Version 5.04 및 MedCalc Version 14.8.1을 사용하여 계산하였다.
FLAM 프로토콜에 등록된 AML 환자 샘플의 미토콘드리아 프로파일링
총 63개 환자 샘플을 제공받아 가공하였으며, 이들 샘플은 표 1 및 2에 요약되어 잇다. 전체 프로파일은 샘플 중 43개로부터 입수하였으며, 추가로 아홉개(9)는 (전체 검정을 수행하기에 불충분한 세포 수로 인해) 프로파일의 서브세트로 가공하였다. 남은 열 한개(11)의 샘플은, 불량한 신호 대 잡음비(세포는 검정 전에 이미 아폽토시스 상태였다) 또는 부적당한 세포 수로 인해, 어떠한 BE3 프로파일링을 결정하기에도 품질이 불충분하였다. 모든 후속적인 분석은 임의의 BH3 프로파일링에 대해 성공적으로 가공된 샘플(총 n=52)에 대해서만 수행하였다.
환자로부터 수득된 임상 변수를, 만약에 있다면, 이러한 인자들 중의 어떤 것이 환자가 치료법에 반응할지 하지 않을지에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 반응과 비교하였다(표 3). CR과 상당한 연관성을 갖는 것으로 밝혀진 유일한 변수는 세포유전학적 위험 인자이었으며, 여기서 불리한 분류를 갖는 것들이 반응에 덜 반응할 것 같다. WBC, MDS의 병력, 및 어떠한 프로토콜을 따를지는 모두 중요하며, 보다 높은 WBC 값 및 MDS의 병력은 치료법에 대한 반응과 연관성이 있다. 프로토콜 J0856은 J 1101(25명 중 8명)보다 더 높은 CR 비율(25명 환자 중 13명 CR)을 가졌으며, 프로토콜 J0669는 성공적으로 BH3 프로파일링된 두 명의 환자에 의해서만 나타났다. BM 아세포 퍼센트, 및 NPM/FLT-3 돌연변이 상태는 이러한 데이터세트에서 반응과 유의적인 연관성이 없었다.
모든 BH3 개별 환자 데이터가 표 4에 요약되어 있으며 아세포에서 미토콘드리아 탈분극을 유도하는 각 BH3 펩타이드의 능력(즉, "프라임")을 상세하고 있다. 반응 모두를 살펴보면, BIM 100 μM 펩타이드가 최고 탈분극 중간값(99.2% 프라이밍)을 야기하였고 NOXA는 최저 전체 탈분극(16.0% 프라이밍)을 가졌다. 그후, 단일 펩타이드 BAD 프로파일을 표 6에서 치료에 반응한 환자(CR)에서 치료에 반응하지 않은 환자(NR)와 비교하였다. 단일 펩타이드는 반응과 유의적인 연관성이 없었다; 그러나, BAD 펩타이드는 0.09의 p-값을 갖는 유의도에 근접하였을 뿐만 아니라 0.65의 AUC 값을 가졌다. 이는, 전체 환자 세트를 사용하여, 어떠한 개별 BH3 펩타이드도 FLAM 치료에 반응하는 환자를 확인하는데 충분하지 않음을 나타낸다.
BH3 펩타이드를 다른 BH3 펩타이드 프로파일 및 임상 변수와 다변량 분석으로 시험하였다(표 8). 이러한 분석 결과, BIM 100 μM + BAD + PUMA 간의 강한 유의적인 연관성이 반응과 관련하여 존재하며, p-값이 0.009이고 ROC AUC가 0.732인 것으로 드러났다(도 1). 이러한 세 가지 펩타이드를 세포유전학적 위험 카테고리와 조합하는 경우, p-값이 0.0001이 되며 AUC는 0.84이다. MDS 병력을 분석에 추가로 부가하면 추가의 유의성과 0.0001의 p-값 및 0.85의 AUC를 생성한다. 세포유전학적 위험 카테고리 만이 단지 0.60의 AUC 값을 산출한다(세포유전학적 위험 + MDS 병력은 0.72의 AUC를 제공한다). 이것은 BH3 펩타이드 프라이밍을 분석에 부가하면 FLAM에 반응하는 환자를 확인하는 능력이 크게 증가함을 나타낸다. 세포유전학적 위험 카테고리 및 MDS 병력과 함께 BH3 펩타이드 데이터를 사용한 이상적인 컷오프(Youden 지수 - 최고 특이성 + 민감도)에서, 이러한 검정은 당해 연구에서 치료에 반응하는 환자를 확인하는데 89.5% 민감하며 76% 특이적이다. 이것은 임상 정보와 함께 이러한 세 가지 펩타이드로부터의 BH3 펩타이드 프라이밍 데이터를 사용하는 것이 FLAM 섭생으로의 치료에 대한 예측치에 있어서 귀중할 수 있음을 나타낸다.
이러한 연구 과정 동안, 우리는 또한 BH3 프라이밍에서 역할을 할 수 있는 또 다른 인자를 조사하였다. 백혈병 세포의 공급원(즉, 말초 혈액 또는 골수)은 잠재적으로 세포의 상이한 집단들을 분리할 수 있기 때문에, 우리는 환자의 골수로부터 수득된 샘플에서만 분석을 수행하였다. 표 8은 골수 샘플에서만 반응하는 각각의 BH3 펩타이드의 연관성을 보여준다. 이러한 샘플 서브세트에서, NOXA 프라이밍은 치료에 반응하지 않은 환자에 비해 치료에 반응한 환자에서 유의적으로(p=0.006) 더 높으며(각각 44.5% 및 5.2%) 0.805의 AUC 값을 갖는다(도 2 및 도 3). 다른 단일 펩타이드 중 어떤 것도 골수 샘플 단독에서의 반응과 상당한 연관성을 보이지 않았다. 10.78% NOXA 프라이밍 이상의 컷오프 값에서, 시험은 92% 민감성이고 67% 특이성이다. 알고리즘에 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력을 부가하는 것은 치료에 대한 반응을 예측하는데 있어서 NOXA 프라이밍이 이러한 변수에 부가되고, 이상적인 컷오프 값에서 92%의 민감도 및 80%의 특이성과 0.92의 AUC 값을 산출함을 보여준다(표 8 및 도 3).
이 연구의 결과는 BH3 프로파일링이 FLAM 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는데 유용하다는 것을 확립시킨다. 전체 데이터세트를 살펴보면, 개별 BH3 펩타이드는 반응과 상관성이 없는 반면, 몇몇 펩타이드의 조합(BIM, BAD, 및 PUMA)은 FLAM 반응과 강한 상관성을 보였다. 이러한 몇 가지 펩타이드는 연구 내에서 골수 및 말초 혈액 샘플 둘 다에서 반응과 상관성을 보였다. 더욱이, 이러한 데이터가 공지된 환자 위험 인자에 추가되어, 우리가 세포유전학적 상태를 환자의 MDS 병력과 함께 환자 반응을 예측하는 단일 매트릭에 삽입하는 알고리즘을 확인할 수 있게 한다.
당해 연구의 또 다른 흥미로운 발견은 전체 데이터세트에서 NOXA 신호전달이 FLAM 반응과 유의적으로 연관된 것으로 밝혀지지 않았다는 것이다. 그러나, 골수 샘플 단독을 조사한 결과 반응과 매우 강한 연광성을 보였다. AML 종양 세포의 자리가 골수이기 때문에, 아세포의 표현형 마커가 골수과 비교하여 말초 혈액에서 상이할 수 있음에 따라, 골수와 비교하여 말초 혈액에서 BH3 프로파일이 상이하다는 것은 놀랍지 않다(1,2). 추가로, 골수 기질은 직접 세포 접촉을 통해 및 골수에 존재하는 가용성 인자를 통해 다양한 치료법에 대해 AML 세포에 내성을 부여하는 것으로 이전에 나타났다(3). 골수 천자가 잠재적으로 AML 아세포, 가용성 인자, 및 잠재적으로 실제 기질 세포를 수집하기 때문에, 골수에서의 BH3 프라이밍 검정이 이들의 정상적인 환경적 컨텍스트에서 백혈구 세포의 보다 직접적인 검사를 나타낼 수 있다. FLT3 키나제 억제제 단일요법을 갖는 AML에서 기능적 차이가 이전에 관찰되었으며, 여기서 순환 아세포는 치료법에 의해 말초 혈액으로부터 소거되는 반면 골수 아세포는 최소한으로 영향을 받는다(4). NOXA 판독치가 유사한 기능적 차이를 검출할 수 있으며, 여기서 NOXA으로의 프라이밍이 MCL-1 대치를 초래하고 아폽토시스를 야기하여 FLAM에 반응할 것 같은 암을 확인시켜 준다.
이 연구에서 확인된 알고리즘, NOXA 및 [BAD + BIM 100 + PUMA] 프라이밍, 둘 다는 MCL-1 프라이밍된 암 세포를 확인할 수 있다. NOXA에 대한 높은 아폽토시스 반응을 산출하는 세포를 MCL-1 프라이밍된다고 하는 반면, 펩타이드 Bad에 대한 높은 반응은 BCL-xL 또는 BCL-2가 아폽토시스 차단을 제공함을 나타낸다. PUMA가 pan-BCL-2 패밀리 프라이밍을 반영할 수 있고, [BAD + BIM 100 + PUMA] 뒤의 알고리즘이 실제로 PUMA - BAD - BIM 100이기 때문에, 사실상; 이러한 판독치 둘 다가 MCL-1의 프라이밍 상태를 효과적으로 측정할 수 있고, 궁극적으로 FLAM 섭생에 반응하는 환자는 MCL-1 의존적일 수 있다. 이 연구로부터 FLAM에 대한 반응 가능성을 결정하기 위한 한 가지 알고리즘은 가능한 반응자로서 특정 역치 이상의 환자를 확인한 다음 이러한 역치를 사용하여 시험에 대한 민감도, 특이성, 양성 예측치, 및 음성 예측치를 특성화하는 것이다. 환자 또는 샘플 특이 컨텍스트를 설명하기 위해 임상 조절 변수를 트레이닝 데이터 세트에 피팅된 로지스틱 회귀 모델의 사용을 통해 포함시킨 다음 입증할 수 있다. 그후, 이 모델을 사용하여, 확률을 로지스틱 모델을 갖는 시그모이드 함수를 사용하여 계산할 수 있다; 이러한 확률을 사용하여 특이성, 민감도, 양성 예측치, 및 음성 예측치 측면에서 이들 컷오프 값에서의 시험 특징을 확립하는 역치를 확인할 수 있다. 의사결정 분지도가 또한 사용될 수 있으며, 이는 환자 또는 샘플 특징 및 BH3 프로파일링 결과 중의 어느 것을 참작하여 반응의 가능성을 확립한다. 랜덤 포레스트, 신경망, 및 부스팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 알고리즘이 또한 환자 및 샘플 특징을 포함한 예측 알고리즘을 개발하는데 사용될 수 있다.
실시예 2: FLAM 섭생 대 전통적인 7+3 치료 전략을 구별하기 위한 알고리즘
AML 환자 골수 또는 말초 혈액에서 BIM 0.1 프라이밍은 7+3 섭생(시타라빈 + 안트라사이클린)에 대한 반응과 상관성이 있었다; 문헌 참조; Pierceall, 등 "BH3 Profiling Discriminates Response to Cytarabine-based Treatment of Acute Myelogenous Leukemia" Molecular Cancer Therapeutics. 상기 논의된 바와 같이, NOXA 골수 프라이밍은 FLAM (알보시딥, ara-C, 미톡산트론) 섭생에 대한 반응과 상관성이 있다. 우리는 어떠한 알고리즘이 FLAM 또는 7+3가 나이브 AML 환자를 치료하는데 사용되어야 하는지를 구분하는가를 조사하였다.
BIM 0.1은 0.80의 AUC 값 및 각각 64.3% 및 100%의 민감도 및 특이성으로 BM 샘플 서브세트에서 7+3에 대한 반응을 예측한다-좌측 아래. 그러나, 이러한 동일한 샘플에서 NOXA는 0.54의 AUC 값 및 42.9% 민감도와 100% 특이성으로 본질적으로 예측력을 갖지 않는다. 도 5 참조. (FLAM로 치료하는 경우 0.81의 AUC 및 92%/67% 민감도/특이성과 비교하여). 이것은 NOXA 프라이밍이, 사전치료 AML 환자로부터 채취한 골수 세포에서 검출되는 경우, FLAM에 대한 반응과는 상관성이 있지만 7+3와는 그렇지 않으며, 치료 전에 시험된 AML 환자의 말초 혈액으로부터의 BIM 0.1 판독치는 7+3에 대한 반응과는 상관성이 있지만 FLAM과는 그렇지 않음을 나타낸다.
BIM 0.1 프라이밍과 비교하여 NOXA 프라이밍의 추가의 조사 결과, 어느 하나의 제제에는 반응할 것 같지 않지만 다른 제제에는 반응할 것 같음을 나타내는 프라이밍 값을 갖는 환자의 서브클래스가 있는 것으로 드러났다. 도 6은 원래의 7+3 연구(n=23)로부터의 골수 샘플로부터의 NOXA 프라이밍 대 BIM 0.1 프라이밍을 예시한다. 도 6의 데이터는 환자의 골수 샘플에서의 NOXA 프라이밍 대 말초 혈액(PB) 샘플에서의 BIM 0.1 프라이밍을 비교함으로써 사전-치료 AML 환자에서 암 치료 전략들 간에 선택하는 방법을 제공한다. BM NOXA > 10.8% 및 BMZPB BIM 0.1 <35%이라면, 환자는 FLAM의 후보자이다. BM NOXA < 10.8% 및 BMZPB BIM 0.1 >15%이라면, 환자는 7+3 치료법의 후보자이다. BM NOXA < 10.8% 및 BM/PB BIM 0.1 > 35%인 경우 환자는 또한 7+3 치료법의 후보자이다. 마지막으로, BM NOXA < 10.8% 및 BM/PB BIM 0.1 < 15%인 경우, 환자는 FLAM 또는 7+3 치료법의 후보자가 아니다.
우리는 또한 NOXA 프라이밍 단독이 FLAM 치료에 대한 반응으로 AML 환자 생존을 예측한다는 것을 확인하였다. 도 10b. 샘플에서 컷-오프로서 40% NOXA 프라이밍을 사용하여, 40% 또는 초과의 NOXA 프라이밍을 갖는 환자는 완전한 반응 및 생존을 가질 가능성이 훨씬 더 높다. 이러한 데이터는 FLAM 치료에 대한 AML 환자 반응이 NOXA 프라이밍을 사용하여 예측될 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 3: 표적화 약물류 내에서 PraediCare Dx ™ 판독 유용성을 확인하는 NOXA
우리는 특정 미토콘드리아 판독치가 특정 치료에 대한 세포 반응과 연관성이 있음을 보여주었다. 미토콘드리아 판독치의 유용성에 있어서의 변화에 대한 세포 컨텍스트의 영향을 추가로 평가하기 위해, 우리는 배양액에서 성장시킨 암 세포에 대한 MCL-1 교란 약물의 활성을 비교하고, 환자로부터 수집된 세포에서 미토콘드리아 프로파일링 판독치의 우리의 이해와 비교하였다. 우리는 미토콘드리아 프로파일링에서 동일한 판독치와 상관성이 있는 표적 종류 내에 있는 두 개의 치료 화합물의 암 세포 반응 범위에 있어서의 중첩을 살펴보았다. 하나의 예에서 우리는 CDK9, 알보시딥 및 디나시크립에 대해 일반적인 활성을 갖는 두 개의 CDK 억제 화합물을 살펴보았다. 도 7은 NOXA 판독치가 도 7에 참조된 바와 같이 암 세포주를 가로질러 디나시크립의 경우에 이들 화합물 각각에 대한 반응을 예측하는 것으로 나타났음을 예시한다). 이러한 세포주에서 알보시딥 및 디나시크립에 대한 반응은 암 반응 치료제 포털(www .broadinstitute.org/ctrp/)로부터 수득되었으며 세포는 수득된 AUC(곡선하 면적) 값에 기초하여 이들 화합물에 반응하는 것으로 분류되었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 세포주 반응 프로파일의 중첩이 현저하며, 상관 계수는 0.95이다.
이러한 데이터는 CDK9에 대해 일반적인 활성을 갖는 다중 CDK 억제 화합물에 대한 NOXA 프라이밍 시험의 유용성을 확립한다.
실시예 4: 생체외 컨텍스트 NOXA 화합물
암 세포주로부터의 공개적으로 이용 가능한 치료 약물을 사용하여, NOXA 바이오마커가 중요할 수 있는 추가의 치료 약물류를 확인할 수 있다. 이 가능성을 조사하기 위해, 우리는 일례로서 저메틸화작용제(HMA)에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위한 NOXA 프라이밍 판독치의 유용성을 조사하였다. 우리는 NOXA 프라이밍에 의해 결정된 세포에서의 MCL-1 의존성이 이러한 HMA에 대한 더 큰 민감도를 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 암 세포주(n = 33)를 FACS BH3 프로파일링 검정(PraediCare Dx™ 검정)을 사용하여 NOXA 펩타이드와의 MCL-1 의존성에 대해 프로파일링하였다. 이러한 세포주에서 아자시티딘 및 데시타빈에 대한 반응은 암 반응 치료제 포털(www.broadinstitute.org/ctrp/)로부터 수득되었으며, 세포는 데시타빈의 경우 40% 변위치 및 아자시티딘의 경우 12% 변위치를 반응에 대한 역치로서 사용하여 수득된 AUC (곡선하 면적) 값에 의해 제제에 대한 반응에 기초하여 HMA에 반응하는 것으로 분류되었다. 순위합 검정 p-값을 두 그룹 간에 계산하였으며, 플롯 상에 나타내어져 있다. 함께, 이것은 NOXA 바이오마커를 통한 MCL-1 의존성이 HMA에 대한 반응을 위해 필요할 수 있음을 나타낸다(도 8).
실시예 5: 돌연변이 상태가 저메틸화작용제 및 기타 약물에 대해 AML 환자에서 프라이밍 상태 및 반응률에 영향을 미친다
약물 활성과 완전히 부합하고 표적 요법의 치료를 안내할 수 있는 표적 단백질에 돌연변이가 있기는 하지만, 재발 및 독성에 관한 질문 뿐만 아니라 최적의 조합 옵션이 추가의 측정을 필요로 하는지는 여전히 해답이 나와 있지 않다. 개발 동안, 표적화된 제제는 정확한(on-target) 활성에 대해 선택된다. 돌연변이 프로파일 또는 유전자 발현 패턴에 의해 직접적으로 설명될 수 없는 예기치 못한 활성도 흔히 있다.
백혈병 분야 내에서, 다음을 포함한 다양한 예후적 유전자 바이오마커가 확인되었다: 급성 골수성 백혈병(AML)의 경우 FLT3, IDH, 및 p53 돌연변이 및 만성 림프성 백혈병(CLL)의 경우 IGHV, BCL-6, BTK, 및 p53 돌연변이. 이러한 바이오마커는 대개 치료법에 대한 불량한 또는 유리한 결과와 일반적으로 연관된다. CLL 집단의 작은 부분은 제외하고도, 이러한 검사의 예측치는 추가의 만감도를 필요로 하므로, 치료법 선택을 안내하는데 사용되지 않는다. 여러 흔한 약물 및 이러한 제제에 대한 환자의 반응의 메카니즘은 흔히 암 세포가 프로-아폽토시스 신호전달에 반응하는 능력에 의존한다. 약물 반응과 연관되는 돌연변이의 맥락에서도, 반응에 관한 환자 간의 변동성이 있으므로, 암에서 아폽토시스 소인의 정도를 측정하는 것이 열쇠이다.
저메틸화작용제인 데시타빈으로 치료된 환자를 조사하였다. 이들 환자는 이전에 FLT3 이상을 포함한 몇 가지 돌연변이적 특징을 특징으로 하였다. 돌연변이 상태를 갖는 이러한 프로파일의 조사는, FLT3 돌연변이를 갖는 AML 환자가 이들의 미토콘드리아 프로파일링 수준과 무관하게 데시타빈에 무반응성인 것으로 밝혀졌기 때문에 FLT3 돌연변이 상태와 검정 판독치의 조합이 필요하다는 것을 나타내었다. 그러나, 비돌연변이된 FLT3를 갖는 환자에서, BIM (0.1) 펩타이드가 반응과 연관된 것으로 밝혀졌다(도 11a). 게다가, 데시타빈 처리한 반응한 FLT3 돌연변이 음성 환자는 반응하지 않은 환자에 비해 BH3 모방체에 대해 유의적으로 더 높은 미토콘드리아 반응을 보였다, BIM 0.1 (p = 0.04). FLT3 돌연변이를 갖는 환자는 일반적으로 유의적으로 (p = 0.02) 더 높은 BIM 0.1 프라이밍을 가졌다. 이것은 돌연변이 상태와 BH3 프로파일링으로부터의 결과의 조합이 어느 환자가 높은 정확도로 데시타빈에 잘 반응할지를 예측할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: MCL -1 의존성을 평가하기 위한 대안적인 방법
MCL-1 의존성을 추가로 조사하기 위해 우리는 암 세포에서 MCL-1 의존성을 결정하는 NOXA 판독치에 대한 대안을 제공하기 위한 특정 BH3 모방체 화합물의 유용성을 탐사하였다. 우리의 접근법은 MCL1를 선택적으로 표적화하는 막 투과성 BH3 모방체 화합물을 직접 적용하는 것이었다. 이렇게 하면 치료제의 표적 활성을 직접 관측하는 이점이 부가된다. 도 9는 NOXA에 의해 프라이밍된 세포주가 또한 PraediCare Dx™ 포맷 FACS BH3 프로파일링 검정에 따라 투과된 세포에 직접 적용된 MCL-1 선택적 BH3 모방체 화합물, EU5346에 반응성임을 보여준다,
당업계의 숙련가들은, 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 구체적으로 기재된 특정 실시형태들에 대한 수많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
참고문헌
표
표 1. 환자 요약
표 2. 환자 특징
표 3. 반응과 임상 특징 연관성
표 4. BH3 프로파일링 데이터
표 5. 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성
표 6. BH3 펩타이드 프로파일링과 기타 임상 변수의 다변량 분석
표 7. 골수 샘플에서 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성
표 8. BH3 펩타이드의 통계적 분석은 골수로부터 수득한 샘플에서만 수행하였다
도 2a-f는 모든 FLAM-치료된 환자 표본에서 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석에 의한 FLAM에 대한 반응과 BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. 패널 A, C, 및 E는 세포유전학적 위험 인자 및 MDS(골수이형성 증후군) 병력 임상 변수와 조합하여 BAD, BIM 100, 및 PUMA의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 보여준다. 패널 B, D, 및 F는 CR에 도달하지 못한 환자에 비해 CR에 도달한 환자에서 조합된 메트릭스(combined metrics)로부터의 각각의 환자 데이터 포인트를 예시하는 상응하는 점 도표를 보여준다.
도 3a-c는 골수-유래 FLAM 치료된 환자 표본에서의 반응과 점 블롯 상관 분석에 의한 NOXA BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. NOXA 프라이밍 단독은 골수 기질 컨텍스트 샘플에서 예측치를 보여준다. 패널 A-C는 모든 샘플(A), 및 골수(B) 또는 말초 혈액(C)로부터 채취한 샘플에서 측정된 NOXA 프라이밍을 나타내는 점 도표를 보여준다. 골수로부터 수득된 샘플은 CR과 상당한 연관성을 보여주며, 이것은 말초 혈액 기질 컨텍스트로부터 채취한 샘플에서는 보이지 않는다.
도 4a-d는 골수-유래 컨텍스쳐 FLAM 치료된 환자 표본에서 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석에 의한 반응과 NOXA BH3 펩타이드 연관성을 보여준다. 도 a 및 b는 모든 샘플에서 세포유전학적 위험 인자와 MDS 병력 임상 변수와 조합하여 NOXA 펩타이드 프라이밍의 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 보여준다. 도 c 및 d는 골수로부터 채취된 샘플에서는 동일하지만 말초 혈액으로부터의 샘플에서는 그렇지 않음을 보여준다. 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력의 추가는 검사의 예측력을 개선시키며, 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력을 가진 BM NOXA 프라이밍에서 AUC 값은 0.92이다.
도 5a 내지 5c는 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 프라이밍의 예를 예시한다. 도 5a는 BIM 0.1 (좌측 패널) 및 NOXA (우측 패널) 프로파일링의 예를 보여준다. 도 5b는 특정의 개별 BH3 펩타이드에 대한 혼합된 말초 및 골수 혈액 샘플에서의 검정 판독치 간의 상관성 결여를 보여준다. 도 5c는 AML 환자에 대한 말초 혈액 샘플에서의 검정 판독치 간의 상관성 결여를 보여준다.
도 6은 미치료(treatment-naive) AML 환자에서 암 치료법 간의 선택을 위해 알고리즘을 확인하는 방법을 보여준다. 상대적 BIM 0.1 및 NOXA 프로파일링을 비교함으로써, 환자는 FLAM 요법, 7+3 요법에 배정될 수 있거나, 또는 요법에 적합하지 않은 것으로 확인된다.
도 7 약리학적 제제에 대한 세포주 반응을 CTRP v2.0 약물 스크린으로부터 다운로드하였다. 총 437개 세포주를 디나시클립(CDK1, 2, 5, 및 9의 억제제) 및 알보시딥(CDK9 억제제)으로 시험하였다. 곡선하 면적 값은 수치 통합에 의해 8개 집중 지점을 사용하여 계산하였다. 이러한 제제에 대한 반응들 간의 연관성은 피어슨법을 사용하여 계산하였으며 약 0.95인 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는, 두 제제 간의 유사성으로 인해, NOXA 바이오마커가 디나시크립 뿐만 아니라 알보시딥에 대한 반응을 예측하는데 유용함을 예시한다.
도 8은 60세 이상의 환자 집단을 나타내는 AML 샘플로부터의 NOXA 판독치를 보여준다. NOXA 신호의 확산은 이러한 대표적인 집단에 걸친 신호의 광범위한 표시를 나타낸다. 데이터는 NOXA 프라이밍에 의해 결정되는 세포에서의 보다 높은 MCL-1 의존성이 저메틸화작용제(HMA)에 대한 보다 큰 민감도를 나타냄을 보여준다. 암 세포주(n = 33)를 PraediCare Dx™ 검정을 사용하여 NOXA 펩타이드와의 MCL-1 의존성에 대해 프로파일링하였다. 이러한 세포주에서 아자시티딘 및 데시타빈에 대한 반응이 암 반응 치료제 포탈(Broad Institute CTD2 public data base)로부터 수득되었으며, 세포는 반응에 대한 역치로서 데시타빈에 대해서는 40% 변위치 및 아자시티딘에 대해서는 12% 변위치를 사용하여 수득된 AUC(곡선하 면적) 값에 기초하여 저메틸화작용제(HMAs)에 대해 반응하는지로서 분류하였다. 순위합 검정 p-값을 두 그룹 간에 계산하였으며 도표에 나타내어져 있다. 함께, 이것은 NOXA 바이오마커를 통한 MCL-1 의존성이 HMA에 대한 반응을 위해 필요할 수 있음을 나타낸다.
도 9는 NOXA에 의해 프라이밍되는 것으로 나타난 세포주가 또한 PraediCare Dx™ 포맷에 따라 투과된 세포에 직접 적용된 MCL-1 선택적 BH3 모방체 화합물, EU5346(Richard et al 2013)에 반응성임을 보여준다. 프라이밍 값으로서 나타낸, 세 가지 현탁액 암 세포주에서 화합물에 대한 미토콘드리아 반응은 EU5346이 NOXA 프라이밍을 검출하기 위해 PraediCare Dx™ 검정에서 리간드로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 FLAM 섭생에 대한 AML 환자에서의 NOXA 프라이밍 간의 관계를 예시한다. 도 10a는 NOXA 프라이밍이 60세 이상의 환자 집단을 나타내는 AML 및 MDS 환자 샘플에서 나타남을 보여준다. Praedicare Dx 검정을 사용하여 평가된 바와 같은 NOXA 프라이밍. 도 10b는 NOXA 프라이밍 지수(priming index)를 보여주며, 생존 함수, S(x)가 FLAM으로 치료된 AML 환자에서 시간에 대해 플롯팅되어 있다. 생존 곡선은 40% NOXA 프라이밍을 컷오프로서 사용한다. 이 그룹에는 7명의 완전 관해(CR) 및 17명의 무반응자(NR)가 있었다. NOXA 낮은 그룹의 생존 중간값은 303일이었으며 생존 중간값은 NOXA high 그룹에서는 도달되지 않았다. 95% 이하 신뢰 구간이 NOXA 낮은의 경우 142일 이하이고 그 이상은 확인되지 않으며 NOXA high의 경우 959일 이하이며 그 이상은 확인되지 않는다. NOXA high 및 낮은 그룹 간의 생존 차이에 대한 로그-순위 검정은 0.023의 p 값을 제공한다.
도 11a 및 11b는 FLT3 돌연변이 상태에 의해 분류된 및 데시타빈에 대한 반응으로 분류된 64개 AML 환자 샘플의 미토콘드리아 프로파일링 연관성을 보여준다. 사전-치료 샘플 프라이밍은 단일 제제로서의 데시타빈에 대한 반응과 상관성이 있었다(도 11a). 데시타빈 처리에 반응한 FLT3 돌연변이 음성 환자는 반응하지 않은 환자에 비해 BH3 모방체에 대한 미토콘드리아 반응, BIM 0.1(p = 0.04)이 유의적으로 더 높았다. FLT3 돌연변이를 갖는 환자는 일반적으로 유의적으로(p = 0.02) 더 높은 BIM 0.1 프라이밍을 가졌다(도 11b).
도 12a-12d는 FLT3 돌연변이 상태, 프라이밍 및 데시타빈에 대한 반응 간의 관계의 양상을 보여준다. 도 12는 FLT3 음성 환자에서 BIM 0.1 및 HRK(각각 도 12a 및 12b)의 프라이밍을 예시하며, 여기서 우리는 보다 높은 프라이밍과 데시타빈에 대한 반응의 연관성을 알아본다. 이러한 연관성을 순위합 검정 및 t-검정으로 시험하였으며, 그 결과가 각 도표에 나타내어져 있다. 하부 패널은 BIM 0.1 (도 12c) 및 HRK (도 12d) 프라이밍과 환자의 FLT3 상태의 연관성을 보여주며, 여기서 FLT3 프라이밍은 FLT3 ITD 양성 환자에서 더 높은 것으로 보인다. 이러한 연관성을 프라이밍을 반응으로 하고 FLT3 상태를 예측변수로 하여 선형 회귀 분석으로 시험하였다. 전체 모델 p-값(f-통계량에 의해) 및 FLT3 ITD 계수 p-값(t-통계량에 의해)이 각각 아래 도표에 나타내어져 있다. 이것은 FLT3-양성 상태가 FLT3-음성 환자보다 더 높은 프라이밍과 연관됨을 시사한다.
표 1은 FLAM 환자 연구를 보여준다. 각 값에 대한 이용 가능한 데이터와 총 수에 걸친 각 컨텍스트에서 양성인 환자의 수를 갖는 전체 환자 요약이 표에 나타내어져 있다.
표 2는 FLAM 치료된 환자 요약 분석을 보여준다. 표는 수득된 모든 샘플을 열거한다. 환자를 세 가지 상이한 프로토콜(J0669, J0856, 및 J01101)에 등록시켰으며 대개 새로 진단된 AML 환자이었다. 샘플은 말초 혈액 또는 골수 천자로부터 수득하였다. 연령은 진단 시기에 계산하였다. 세포유전학적 위험 인자는 CALGB 가이드라인을 사용하여 구하였다. 세포유전학, FLT-3, 및 NPM1 돌연변이 상태, MDS 병력, 화학요법 이력, 골수 아세포 퍼센트, 백혈구(WBC) 수치, 치료, 및 반응을 모든 입수하였다. 회색으로 음영된 샘플은 BH3 프라이밍에 대해 성공적으로 검정되지 못했으며 모든 후속적인 분석으로부터 배제된다(MRD-최소 잔여 질병, TF-치료 실패, PR-부분 반응, CR - 완전 관해). 완전 반응(CR)은 다음 중의 하나 이상, 전형적으로 전부를 특징으로 한다: 5% 미만의 골수아세포와 모든 세포주의 정상적인 성숙, ANC ≥ 1000/㎕ 및 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕, 말초 혈액 중의 아세포의 부재, 골수 중의 백혈병 세포의 부재, 질병과 관련된 세포유전학의 해소, 및 이전의 골수외 질병의 해소.
표 3은 FLAM 반응과 임상 특징 연관성을 보여준다. 임상적 변수의 통계 분석을 반응에 기초하여 수행하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 검정하였다. AUC(곡선하 면적)는 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다.
표 4는 FLAM 환자 연구로부터의 BH3 프로파일링 데이터를 보여준다. BH3 프로파일링은 표 2에 열거된 모든 환자 샘플에 대해 수행하였다. 회색으로 음영된 렬은 프로세싱 동안 BH3 프로파일링의 허용 기준에 불합격한 샘플이다. 줄표(-)를 갖는 어떠한 세포도 제시된 샘플에 대한 각각의 BH3 펩타이드 검정을 수행하기에 충분한 세포를 갖지 못했다. 신호 대 잡음(signal to noise)은 CCCP JC-1 레드 MFI에 걸친 DMSO JC-1 레드 평균 형광 강도(MFI)의 척도이다. 세포 계수 및 생존률 퍼센트는 수동 세포 계수와 트리판 블루 배제에 의해 구하였다. 아세포 퍼센트는 투과된 생존 세포의 CD45-dim, CD3/CD20 음성, 및 SSC-낮은의 백분율이다. 모든 BH3 프로파일링은 아세포 게이팅된 것들에서 수행하였다.
표 5는 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성을 보여준다. BH 펩타이드의 통계 분석을 반응에 대해 수행하였으며, 이때 CR 샘플을 모든 부분 반응, 최소 잔여 질병, 및 치료 실패(NR-무반응자)와 비교하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC(곡선하 면적)은 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다.
표 6은 FLAM 연구에서 다른 임상 변수로의 BH3 펩타이드 프로파일링의 다변량 분석을 보여준다. BH3 펩타이드의 통계 분석을 반응에 대해 수행하였으며, 이때 CR 샘플을 NR 샘플과 비교하였다. 변수들의 조합을 로지스틱 회귀를 사용하여 검정하여 로지스틱 회귀 모델 하에서 계수 및 상수를 구한 다음 이들 계수 및 상수를 순위합 Mann-Whitney 검정 및 ROC 곡선 분석에 의해 검정하였다.
표 7은 골수 샘플에서 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성을 보여준다. BH3 펩타이드의 통계 분석은 5에서 수행된 바와 같이 골수로부터 수득된 샘플에서만 수행하였다. 각각의 제시된 메트릭스를 순위합 Mann-Whitney 검정에 의해 및 로지스틱 회귀 분석에 의해 유의성에 대해 시험하였다. AUC(곡선하 면적)은 ROC 곡선 분석으로부터 수득하였다. 이 분석으로, NOXA 프라이밍이 무반응자와 비교하여 치료에 반응한 환자에서 유의적으로 더 높은 것으로 드러났다.
표 8은 골수 기질 컨텍스트로부터의 샘플에서 BH3 펩타이드의 통계 분석을 보여준다. Mann-Whitney p-값은 프라이밍 값을 사용하여 구하거나 로지스틱 회귀로부터 계산된 로그우드(log-likelihood)이었다. 로지스틱 회귀 p-값은 최종 모델 대 눌 모델(null model)의 ANOVA 분석을 통해 계산하였다. 이 분석은 BAD, BIM 100, 및 PUMA의 조합이 또한 골수 샘플 단독에서의 반응과 연관됨을 보여준다. 두 가지 NOXA 모두와 세 개의 펩타이드 판독치가 세포유전학적 위험 범주 및 MDS 병력에 부가되며 보다 높은 유의성 및 AUC 값을 초래한다.
본 기재내용은, 부분적으로, 환자 골수 기질로부터의 암 세포에서의 반응을 측정함으로써 단독으로 또는 공동-치료 섭생(e.g., FLAM)에서 CDK-9 억제제 (e.g. 알보시딥)와 같은 CDK 억제제에 대한 반응을 예측하기 위해 BH3 프로파일링 검정의 의료 유틸리티가 실현될 수 있다는 발견에 기초한다. BH3 프로파일링 측정의 민감도 및/또는 특이성은 말초 혈액 또는 말초 혈액 샘플과 골수 샘플의 조합으로부터 수집된 혈액을 능가하여 상당히 개선된다. 골수 기질 컨텍스트로부터의 샘플 만을 사용하는 경우 0.445에서 0.0007로의 p-값 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이, NOXA와 관련한 극적인 증가가 반응에 대한 신호를 생성하는 것으로 보였다. (표 6 및 7). 임상 변수, 세포유전학, 및 연령 컨텍스트가 분석에 요인으로 포함되는 경우 검정의 민감도가 0.805(AUC)에서 0.91(AUC)로 개선되었다. FLAM 치료에 대한 AML 환자의 반응을 예측하는 상이한 알고리즘이 본원에 제공된다. 하나의 측면에서, NOXA 프라이밍이 FLAM 섭생에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 단독으로 사용된다. 또 다른 측면에서, BAD + BIM 100 + PUMA 프라이밍이 FLAM 섭생에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 병용될 수 있다. 본원에 기재된 진단 접근책은 MCL1 교란 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 골수로부터의 환자의 종양 또는 암 세포 표본에서 MCL1 의존 정도를 결정하는 단계; 환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계, 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 결정하는 방법을 제공하며; 여기서, 하나 이상의 임상 인자는 임상 반응과의 연관성에 대해 MCL1 특이 BH3 프로파일링 판독치의 특이성 및/또는 민감도를 증가시키도록 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 투과된 암 세포를 NOXA BH3 도메인 펩타이드에 노출시켜 프라이밍의 정도를 결정하는 단계; 면역조직화학 및/또는 형광 동소 보합법(FISH)에 의해 환자의 암 세포의 하나 이상의 임상 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및 하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자를 위한 암 치료를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 골수 또는 말초 혈액으로부터 채취한 환자의 AML 암 세포 표본에 대해 BH3 프로파일을 결정하는 단계; 이러한 두 가지 암 세포 공급원으로부터의 판독치를 비교하는 단계 및 그 정보르 사용하여 FLAM 또는 시타라빈 기반 치료를 안내하는 단게를 포함하여, 시타라빈 및/또는 FLAM에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 임상적 컨텍스트는 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질병 단계 중의 하나 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성, 정상 상태 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가의 바이오마커의 측정을 추가로 포함하며, 이것은 시험에 대한 추가의 특이성 및/또는 민감도를 부가할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측함을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 임상 반응은 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/악화되지 않는 생존률이다.
특정 실시형태에서, 프라이밍은 다음의 방정식으로 정의된다:
여기서, AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하고; DMSO는 베이스라인 음성 대조군을 포함하며; CCCP(카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존)는 미토콘드리아에서 전자 전달 연쇄계에서 전자 전달체의 정상적인 활성 동안 확립된 양성자 구배의 탈커플링제로서 작용함으로써 단백질 합성의 효과기를 포함하고 베이스라인 양성 대조군을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 균일 시분해 형광(HTRF)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 시간은 약 0 내지 약 300 min 내지 약 0 내지 약 30 min의 창에 걸쳐 발생한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 형광 강도 중간값(MFI) 통계에 의한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 신호 강도는 약 5 min 내지 약 300 min에서 발생하는 단일 시점 측정치이다. 개별 펩타이드에 대해, 프라이밍은 다음과 같이 계산될 수 있다:
예시적인 임상적 결정
몇몇 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 환자의 평가에, 예를 들면, 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응을 평가하는데 유용하다. 다양한 측면에서, 본 발명은 종양 또는 혈액 암을 평가함을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 평가는 진단, 예후, 및 치료에 대한 반응으로부터 선택될 수 있다.
진단은, 예를 들면, 암과 같은 가능한 질병 또는 장애를 결정하거나 확인하고자 하는 과정을 나타낸다. 예후는, 예를 들면, 암과 같은 질병 또는 장애의 개연적인 결과를 예측하는 것을 나타낸다. 완전한 예후는 종종 점진적인 쇠퇴, 간헐적 위기, 또는 갑작스럽고, 예측할 수 없는 위기와 같은 질병의 과정의 예상되는 지속, 기능 및 성상을 포함한다. 치료에 대한 반응은 치료를 받는 경우 환자의 의학적 결과의 예측이다. 치료에 대한 반응은, 비제한적인 예를 들자면, 병리적 완전 반응, 생존, 무진행 생존, 진행까지의 시간, 및 재발 확률일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료를 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 신보조 및/또는 보조 화학요법에 대한 양성 반응 또는 신보조 및/또는 보조 화학요법에 대한 무반응을 예측한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 프로-아폽토시스 제제 또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대한 양성 반응 또는 아폽토시스 효과기 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대한 무반응을 예측한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들면, 어떠한 타입의 치료가 투여되거나 보류되어야 하는지를 포함하여, 암 환자의 치료를 지시한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 단일의 단독 보조 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1차, 주요 또는 초기 치료 후 보조 요법을 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 보조 관리(adjuvant care)라고도 부르는 보조 요법(adjuvant therapy)은 1차, 주요 또는 초기 치료에 더하여 제공되는 치료이다. 비제한적인 예를 들자면, 보조 요법은 모든 검출 가능한 질병이 제거되었지만 잠재성 질병으로 인해 재발의 통계적 위험이 남아 있는 경우 수술 후 통상적으로 제공되는 추가의 치료일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자의 치료가 보조 요법을 포함하도록 지시한다. 예를 들면, 특정 치료에 반응성인 것으로 스코어링된 환자는 보조 요법과 같은 이러한 치료를 받을 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법은, 비제한적인 예를 들자면, 프로-아폽토시스 방식으로 유도 및/또는 작동하는 치료 또는 그렇지 않은 치료로서 보조 요법의 정체를 지시할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료에 반응성이지 않거나 덜 반응성일 것임을 지시할 수 있으며, 따라서 이러한 환자는 보조 요법과 같은 이러한 치료를 받지 않을 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자의 개연성있는 반응에 따라 보조 요법을 제공 또는 보류함을 제공한다. 이러한 방식으로, 환자의 삶의 질 및 치료 비용이 개선될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 타입의 치료를 받을 것인가에 관한 임상적 결정을 지시한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자 치료를 위한 안내 검사(guiding test)이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 특정 치료를 받아야 하는지의 개연성있는 반응에 대한 정보를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 높은 반응 가능성을 제공하며, 공격적인 치료를 포함한 치료를 지시할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 낮은 반응 가능성을 제공하며, 보다 나은 삶의 질을 위해 비효과적인 화학요법으로부터의 불필요한 독성을 피하기 위해 공격적인 치료를 포함한 치료의 중단, 및 완화 치료의 사용을 지시할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 특정 치료에 대한 반응 가능성을 나타낼 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 프로-아폽토시스 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하는 제제에 대해 높은 또는 낮은 반응 가능성을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, 예시적인 프로-아폽토시스 제제 및/또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하는 제제는 ABT-263 (Navitoclax), 오바토글락스, WEP, 보르테조밉, 및 카르필조밉을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 야기된 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제에 대해 높은 또는 낮은 반응 가능성을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 예시적인 제제는 키네신 방추 단백질 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 삼산화비소(TRISENOX), MEK 억제제, 포몰리도마이드, 아자시티딘, 데시타빈, 보리노스타트, 엔티노스타트, 디나시크립, 겜투주맙, 이브루티닙을 포함한 BTK 억제제, PI3 키나제 델타 억제제, 레놀리디마이드, 안트라사이클린, 시타라빈, 멜팔람, Akt 억제제, mTOR 억제제를 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 암 치료를 위해 프로-아폽토시스 제제 또는 아폽토시스를 통해 작동하는 제제를 받을 것인가를 나타낼 것이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 환자가 아폽토시스를 통해 작동하지 않는 제제를 받을 것인가를 나타낼 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 (제제를 포함한) 임의의 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는데 유용하다. 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 시타라빈 및 아자시티딘에 대한 AML 환자의 반응 가능성을 예측하고 환자의 BH3 프로파일, 연령 프로파일 및 세포유전학적 인자의 평가를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 암 치료는 본원에 기재된 방법에 기초하여 투여되거나 보류된다. 예시적인 치료는 수술적 절제, 방사선 요법(방사선증감제로서 또는 이와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 사용을 포함함), 화학요법, 약력학 요법, 표적화 요법, 면역요법, 및 지지 요법(예, 진통제, 이뇨제, 항이뇨제, 항바이러스제, 항생제, 영양 보충제, 빈혈 치료제, 혈액 응고 치료제, 골 치료제, 및 정신적 및 심리적 치료제)을 포함한다.
예시적인 치료
예시적인 실시형태에서, 본 발명은 특정 치료제에 대한 예상되는 반응률을 계산한다. 이러한 제제의 예는 항암 약물, 화학요법, 수술, 보조 요법, 및 신보조 요법 중의 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 암 치료는 BH3 모방체, 후성 개질제, 토포이소머라제 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 및 키네신-방추 단백질 안정화제 중의 하나 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 암 치료는 프로테아좀 억제제; 및/또는 세포 주기 조절의 조절인자(비제한적인 예를 들자면, 사이클린 의존성 키나제 억제제); 및/또는 세포 후성 메카닉의 조절인자(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 히스톤 데아세틸라제(HDAC) (e.g. 하나 이상의 보리노스타트 또는 엔티노스타트), 아자시티딘, 데시타빈); 및/또는 안트라사이클린 또는 안트라센디온(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 에피루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신); 및/또는 백금계 치료제(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 카보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴); 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법; BH3 모방체(비제한적인 예를 들자면, 하나 이상의 BCL2, BCLXL, 또는 MCL1); 및 MCL1의 억제제이다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 US 특허 공보 제US 2012-0225851호 및 국제 특허 공보 제WO 2012/122370호에 기재된 것들을 제한함이 없이 포함하는 암 치료에 관한 것이며, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 CYTOXAN 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(e.g., 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리 스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(예, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TMl 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생체(예, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말 및 칼리케아미신 올레갈(문헌 참조; e.g., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 디네미신 A를 포함한 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우크라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마아신, 예를 들면, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라미신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신, 예를 들면, 미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프로린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누라존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(e.g., T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예, TAXOL 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE 크레모포르-프리, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 TAXOTERE 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; GEMZAR 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE. 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 섭생 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 섭생(FOLFOX)을 포함한 옥살리플라핀; 라파티닙(Tykerb); 세포 증식을 억제하는 PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR(e.g., 에를로티닙(Tarceva)) 및 VEGF-A의 억제제, 다코겐, 벨카드, 및 상기의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체 중의 하나 이상을 제한함이 없이 포함하는 암 치료에 관한 것이다.
예시적인 검출법
다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BH3 프로파일링의 특이성 및/또는 민감도를 증진시킬 수 있는 단백질 및/또는 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 평가는 환자 반응에 대한 마커를 수반한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯팅, 세포내 웨스턴(in-cell western), 면역형광 염색, ELISA, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS), 또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 기타의 임의의 방법 중의 하나 이상을 사용한 측정을 포함한다. 본 발명의 방법은 항체를 종양 표본(e.g. 생검 또는 조직 또는 체액)과 접촉하여 조직 또는 체액에 특이적이고 암 상태를 나타내는 에피토프를 확인함을 포함할 수 있다.
체액 또는 조직에서 항원 상의 에피토프의 검출에 사용되는 전략에는 일반적으로 두 가지가 있다, 직접 방법 및 간접 방법. 직접 방법은 1단계 염색을 포함하며, 체액 또는 조직 샘플에서 항원과 직접 반응하는 표지된 항체(예 FITC 접합 항혈청)을 수반할 수 있다. 간접 방법은 체액 또는 조직 항원과 반응하는 비표지된 1차 항체, 및 1차 항체와 반응하는 표지된 2차 항체를 포함한다. 표지는 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예를 들면, 비오틴, 또는 효소, 예를 들면, 호스 라디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 포함할 수 있다. 이들 검정을 수행하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다[문헌 참조; e.g., Har낮은 등 (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988), Har낮은 등 (Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1999), Virella (Medical Immunology, 6th edition, Informa HealthCare, New York, 2007), and Diamandis 등 (Immunoassays, Academic Press, Inc., New York, 1996). Kits for conducting these assays are commercially available from, for example, Clontech Laboratories, LLC. (Mountain View, CA)].
다양한 실시형태에서, 항체는 전 항체 및/또는 임의의 항원 결합 단편(예, 항원-결합부) 및/또는 이들의 단일 쇄(예 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 항체, Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함한 이가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 싱글 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 등)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 다클론성 및 단클론성 항체가, 분리된 인간 또는 인간화 항체, 또는 이의 기능성 단편과 같이 유용하다.
예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한, 다양한 종의 표적에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 표준 검정법이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 역학(예, 결합 친화도)를 또한 Biacore 분석과 같이 당업계에 공지된 표준 검정법으로 평가할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 측정은 핵산의 존재, 부재, 또는 수준을 평가함을 포함한다. 당업계의 숙련가는 다수의 방법들이 적절한 마커의 DNA/RNA 수준을 검출 또는 정량하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
유전자 발현은, 예를 들면, 리포터 유전자 검정, 노던 블롯, 형광 동소 보합법(FISH), 및 역전사 PCR(RT-PCR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 저-내지-중간-플렉스 기술을 사용하여 사용할 수 있다. 유전자 발현은 또한, 예를 들면, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), DNA 마이크로어레이, 틸팅 어레이, RNA-Seq/전 전사체 산탄 서열분석(WTSS), 고속처리 서열분석, 멀티플렉스 PCR, 멀티플렉스 결찰-의존 프로브 증폭(MLPA), 결찰에 의한 DNA 서열분석, 및 Luminex/XMAP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고차-플렉스 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 당업계의 숙련가는 다수의 방법들이 샘플 내의 바이오마커의 RNA 산물의 수준을 검출 또는 정량하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다; 마이크로어레이, RT-PCR(정량적 PCR 포함), 뉴클레아제 보호 검정 및 노던 블롯 분석과 같은 어레이 포함.
예시적인 암 및 환자
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 암 치료를 결정하는 방법을 제공하고/하거나 환자의 종양 또는 암 세포 표본을 포함한다. 암 또는 종양은 세포의 조절되지 않는 성장 및/또는 비정상적으로 증가된 세포 생존 및/또는 신체 장기 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 아폽토시스의 억제를 나타낸다. 암 또는 종양을 갖는 대상체는 대상체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암 세포를 갖는 대상체이다. 본 발명에는 양성 및 악성 암 뿐만 아니라 휴먼 종양 또는 미세전이가 포함된다. 원래의 위치 및 시드 중요 기관으로부터 이동된 암은 결국에는 병에 걸린 장기의 기능 악화를 통해 대상체의 사망을 초래할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 전-전이성 암, 또는 전이성 암에 적용 가능하다. 전이는 이의 초기 부위에서 신체의 다른 위치로의 암의 확산을 나타낸다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 이탈하여, 림프관 및 혈관으로 침투하고, 혈류를 통해 순환하고, 신체의 다른 데 정상 조직에서 먼 초점에서 성장(전이)한다. 전이는 국소적이거나 멀리 떨어질 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 이탈하여 혈류를 통해 이동하고 멀리 떨어진 부위에서 멈추는 종양 세포 여하에 달린 순차적인 과정이다. 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 성장하여, 생명을 위협하는 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극성 및 억제성 분자 경로 둘 다가 이러한 거동을 조절하며, 멀리 떨어진 위치에서의 종양 세포와 숙주 세포 간의 상호작용이 또한 중요하다. 전이는 종종 특정 증상의 모니터링 이외에 자기 공명 영상(MSI) 스캔, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 수치, 간 기능 연구, 흉부 X선 및 골 스캔의 단독 사용 또는 병용을 통해 검출된다.
본원에 기재된 방법은 암의 예후, 암의 진단, 암의 치료, 및/또는 증가된 세포 생존 또는 아폽토시스의 억제와 연관된 증식성 장애 및 악성 종양의 성장, 진행 및/또는 전이의 진단, 예후, 치료, 예방 또는 완화에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병, 및 맨틀 세포 림프종 및 미만성 거대 B세포 림프종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비호지킨 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈액 암이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 비소폐세포 암종, 난소 암, 및 흑색종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고형 종양이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 다음의 암 중의 하나 이상에 관한 것이다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 맹장암, 성상세포종(e.g. 소아 소뇌 또는 대뇌), 기저-세포 암종, 담도암, 방광암, 골 종양(예 골육종, 악성 섬유 조직구종), 뇌간 신경교종, 뇌암, 뇌 종양(예 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 원시 신경외배엽 종양, 시각로 및 시상하부 신경교종), 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 유암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골증식성 장애, 대장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 간외 담도암, 안암, 담낭암, 위(배) 암, 위장 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양(예 두개외, 고환외, 난소), 임신 융모성 종양, 신경교종(예 뇌간, 대뇌 성상세포종, 시각로 및 시상하부), 위유암종, 두경부암, 심장암, 간세포(간) 암, 하인두암, 시상하부 및 시각로 신경교종, 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 신장암(신장 세포 암), 후두암, 백혈병(예 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발 세포), 입술 및 구강 암, 지방육종, 간암, 폐암(예 비-소세포, 소세포), 림프종(예 AIDS-관련, 버킷, 피부 T-세포 호지킨, 비-호지킨, 일차 중추 신경계, 수모세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발성 내분비 종양형성 증후군, 다발성 골수종, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수구성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수증식성 장애, 만성, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 크롬친화성 세포종, 송과체 성상세포종 및/또는 배세포종, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 샘종, 혈장 세포 종양형성/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종(신장암), 신우 및 요관, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(예 유잉 집단, 카포시, 연조직, 자궁), 시자리 증후군, 피부암(예 비흑색종, 흑색종, 메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부 암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, t-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 융모성 종양, 요관 및 신우 암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 및 빌름스 종양.
하나의 실시형태에서, 암은 AML이다. AML은 두번째로 흔한 백혈병이며, US에서 해마다 대략 13,000명이 새로 진단되고 9,000명이 사망한다. 승인된 치료법이 있기는 하지만, 다수의 백혈병 환자의 예후가 불량하고, 성공적인 치료 가능성이 낮다. AML에 대한 최근의 치료 기준은 안트라사이클린제(예를 들면, 다우나루비신, 이다루비신 또는 미톡산트론)와 병용한 인덕션 사이토신 아라비노사이드(ara-C)이다. 이러한 치료 섭생에는 전형적으로 고용량 시타라빈의 투여 및/또는 줄기 세포 이식이 뒤따른다. 이러한 치료는 어린 환자에서 개선된 결과를 갖는다. 급성 전골수성 백혈병의 치료에도 진전을 보였으며, 여기서는 모든-트랜스 레티노산(ATRA) 또는 삼산화비소로의 표적 치료법이 탁월한 생존률을 야기하였다. 그러나, AML 경우의 대다수를 나타내는 집단인 60세 이상의 환자는 치료상 수수께끼가 남아 있다. 환자의 65-85%가 초기에는 현행 치료에 반응하지만, 이러한 반응자의 65%는 재발을 겪으며, 다수의 환자는 질병으로 쓰러진다. 적어도 이러한 이유로, 그리고 상기한 치료가 심각한 부작용을 가질 수 있기 때문에, 본 발명의 예측 검사는 이러한 소송을 경감시키는 치료의 사용을 안내할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 올바른 환자를 올바른 치료에 매칭시킴으로써 성공적인 치료의 가능성을 개선시킨다. 또한, 치료에 대한 AML 환자 반응을 예측하는 검사가 현재는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 정의되지 않는 한, 용어 대상체는 포유동물, 예, 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니 피그, 개, 고양이, 말, 암소, 염소, 양, 돼지, 또는 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이, 침팬지, 또는 비비이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환 가능하게 사용된다.
예시적인 표본
특정 실시형태에서, 표본은 암 줄기 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 표본은, 예를 들면, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 신장암, 또는 난소 원발성 종양의 생검과 같은 고형 종양의 생검으로부터 유도된다.
특정 실시형태에서, 표본은, 예를 들면, 본원에 기재된 암 중의 어느 것과 같은 비-고형 종양의 생검으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 표본은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 및 비호지킨 림프종을 갖는 환자의 생검으로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 표본은 고형 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD 138 항체를 갖는 생검 샘플로부터의 선택에 의해 풍부해진 다발성 골수종 세포이다. 특정 실시형태에서, 표본은 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 풍부해진 급성 골수성 백혈병 세포이다. 특정 실시형태에서, 표본은 비-B 세포 고갈에 의해 풍부해진 만성 림프성 백혈병 또는 미만성 거대 B-세포 림프종이다.
몇몇 실시형태에서, 표본은 순환 종양 세포로부터 유도된다.
BH3 프로파일링
다양한 실시형태에서, 본 발명은 BH3 프로파일링을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 적어도 두 개, 또는 세 개, 또는 네 개, 또는 다섯 개, 또는 여섯 개, 또는 일곱 개, 또는 여덟 개, 또는 아홉 개, 또는 열 개의 BH3 펩타이드를 한번에 평가하는 BH3 프로파일링을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단일 BH3 펩타이드의 평가와는 반대로, 다중펩타이드 분석을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, BH3 펩타이드의 패널을 단일 환자 표본에서 스크리닝한다.
이러한 방법에 유용한 BH3 프로파일링 및 시약은 U.S. 특허 제7,868,133호; 제8,221,966호; 및 제8,168,755호 및 US 특허 공보 제2011/0130309호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
간략하게, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이상 표현형의 결과로서, 암 세포는 아폽토시스 경로에서 기능적 차단을 발달시킨다. 이러한 차단은 암 세포가 일부 치료법에 내성이 생기게 만들며, 놀랍게도, 일부 암 세포를 다른 치료법에 민감하게 만든다. "종양유전자 중독(oncogene addiction)"의 개념은 생존을 위한 특정 유전자에 대한 암 유전자의 후전적 의존성 또는 중독을 말한다. BH3 프로파일링은 특정의 아폽토시스 조절 단백질에 대한 이러한 의존성이 주어진 암 세포에서 일어나는지를 결정하고 의존성 단백질을 확인한다. 암 세포는 아폽토시스를 겪도록 미리 설정될 수 있지만 항상 그러한 것은 아니며 이것은 이들의 달리 의도하지 않은 생존을 위한 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질 중이 어느 것 또는 전부에 의존하는 이들 세포의 기능하다. 이것은 치료에 반응하는 암 세포의 가능성에 대한 통찰력을 제공한다.
암 세포는, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, DNA 손상, 유전적 불안정, 비정상적인 성장 인자 신호전달, 및 비정상적인 또는 없어진 매트릭스 상호작용과 같은 이상을 나타내며, 이러한 것들 중의 어느 것이 전형적으로 고유 (미토콘드리아성) 아폽토시스 경로를 통해 아폽토시스를 유도할 것이다. 그러나, 암 세포는 이러한 아폽토시스 신호에 반응하기 보다는 생존한다. 종종, 이렇게 하는데 있어서, 이들 세포는 만성 아폽토시스 신호에 대한 선택된 차단에 매우 의존하게 된다. 이러한 적응은 암 세포를 위한 생존 메카니즘을 제공한다; 그러나, 이러한 적응은 또한 암 세포가 특정 아폽토시스 유도 치료법에 감수성으로 되게 할 수 있다. 고유 아폽토시스에 의해 세포가 사멸하도록 하는 결정적인 사건은 미토콘드리아 외막(MOMP)의 투과화 및 효과기 카스파제를 활성화시키는 분자의 방출이다. 다수의 경우에, MOMP는 고유 아폽토시스 경로에서의 비복귀점이다. BCL-2 계열 단백질이 MOMP의 주요 조절인자이며, 이들의 활성은 림프상 및 몇가지 고형 종양 암의 발병과 관련되며 다수의 암에서 화학요법에 대한 내성의 주요 매개체인 것으로 믿어진다.
BCL-2 단백질은 예비-생존(항-아폽토시스) 및 프로-아폽토시스 멤버 간의 분명한 단백질-단백질 상호작용에 의해 조절된다. 이러한 상호작용은 주로 BH3 (BCL-2 상동 도메인-3) 매개된 결합을 통해 일어난다. 아폽토시스-개시 신호전달은 대개 미토콘트리아의 업스트림에서 일어나며 미토콘드리아로의 짧은, BH3-only, BCL-2 패밀리 멤버의 전좌를 유발하며 미토콘드리아에서 이들은 MOMP를 활성화 또는 감작시킨다. 활성화제 BH3 온리 단백질, BIM 및 Bid는 효과기, 프로-아폽토시스 단백질 Bax 및 Bak에 결합하여 직접 활성화시키고, 또한 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질, BCL-2, MCL1, Bfl-1, BCL-w 및 BCL-xL에 결합하여 억제시킨다. 감작화제 BH3 단백질, Bad, Bik, NOXA, Hrk, Bmf, 및 Puma는 단지 항-아폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질, BCL-2, MCL1, Bfl-1, BCL-w, 및 BCL-xL에 결합하여, 이들의 항-아폽토시스 기능을 차단한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 각각의 감작화제 단백질은 독특한 특이성 프로파일을 갖는다. 예를 들면, NOXA(A 및 B)는 MCL1에 높은 친화도로 결합하고, Bad는 BCL-xL 및 BCL-2에 결합하지만 MCL1에는 약하게 결합하고, Puma는 세 가지 모든 표적에 잘 결합한다. 이들 단백질의 항-아폽토시스 기능은 활성화제 BH3 단백질 BIM 및 Bid의 격리이다. 감작화제 펩타이드에 의한 이들 활성화제의 대체가 Bax/Bak-매개된 아폽토시스를 초래한다. 이러한 상호작용은 항상성, 세포사, 아폽토시스에 대한 감작, 및 아폽토시스의 차단을 제한함이 없이 포함하는 다양한 결과를 가질 수 있다.
아폽토시스 신호전달이 차단되는 암 세포의 분명한 특징은 미토콘드리아 표면에서의 BH3 only 활성화제 단백질의 축적이며, 이러한 단백질의 결과는 항-아폽토시스 단백질에 의해 격리된다. 이러한 축적 및 이들의 효과기 표적 단백질에의 접근이 "BH3 프라이밍된" 상태에서 BCL-2 패밀리 단백질의 길항작용에 대한 증가된 민감도를 설명한다.
몇몇 실시형태에서, NOXA (A 또는 B)에 대해 높은 아폽토시스 반응을 산출하는 세포는 MCL1 프라이밍되는 반면, 펩타이드 Bad에 대한 높은 반응은 BCL-xL 또는 BCL-2가 아폽토시스 차단을 제공함을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, Puma는 pan-BCL-2 패밀리 프라이밍을 반영한다. 이러한 방식으로, MCL1 또는 BCL-xL 중의 어느 하나, 단백질 둘 다, 또는 몇몇 BCL-2 패밀리 멤버에 의존성인 세포가 쉽게 구별되어, 이에 따라 적당한 치료가 맞춰질 수 있다. 이러한 펩타이드에 대한 미토콘드리아 반응에 있어서의 차이가 MCL1 또는 BCL-xL 영향을 받은 고유 신호전달로 집중되는 경로를 통해 작동하는 것으로 알려진 치료법의 사용을 안내한다. BCL-2 억제 또는 MCL1 억제 화합물의 사용이 이러한 경우에서 지시될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 또한 MCL1 또는 BCL-xL의 전체 업스트림을 표적화하는 치료법을 지시하거나 금지한다.
BH3 프로파일링 검정은 언제 암 세포가 프라이밍된 상태로 있는지 뿐만 아니라 프라이밍이 어떠한 구성으로 발생하는지를 확인하며, 이것은 예측치를 갖는다.
예시적인 임상 인자 및 추가의 바이오마커
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 임상 인자의 평가를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 환자 반응을 평가하기 위한 BH3 프로파일링 및/또는 임상 인자의 평가를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, BH3 프로파일링 연구와 함께 환자 반응 정보를 제공하는 임상 인자는 아폽토시스와 관련되지 않을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 영향을 미치는 비-아폽토시스이다. 하나의 실시형태에서, 임상 인자는 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질병 단계 중의 하나 이상이다. 하나의 실시형태에서, 임상 인자는 표 3에 나타내어져 있다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 연령이다. 하나의 실시형태에서, 환자 연령 프로파일은 약 10세 이상, 또는 약 20세 이상, 또는 약 30세 이상, 또는 약 40세 이상, 또는 약 50세 이상, 또는 약 60세 이상, 또는 약 70세 이상, 또는 약 80세 이상으로 분류된다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 세포유전학적 상태이다. 빌름스 종양 및 망막모세포종과 같은 몇몇 암에서는, 예를 들면, 종양 억제인자와 관련된 염색체 영역이 보통 결실되거나 돌연변이되기 때문에 유전자 결실 또는 불활성화가 암 진행을 개시하는데 원인이 된다. 예를 들면, 결실, 역위, 및 전좌가 통상적으로 신경교종, 비소세포 폐암, 백혈병, 및 흑색종에서 염색체 영역 9p21에서 검출된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 염색체 변화가 종양 억제인자 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A를 불활성화시킬 수 있다. 특정 유전자의 이러한 결실과 함께 염색체의 상당 부분이 또한 소실될 수 있다. 예를 들면, 고형 종양 세포에서는 염색체 lp 및 16q가 흔히 소실된다. 유전자 중복 및 유전자 복제 수의 증가가 또한 암에 기여할 수 있으며 전사분석 또는 복제 수 변화 어레이로 검출될 수 있다. 예를 들면, 염색체 영역 12ql3-ql4는 다수의 육종에서 증폭된다. 이러한 염색체 영역이 p53으로 불리는 종양 억제인자에 결합하는 것으로 알려진 MDM2라고 불리는 결합 단백질을 암호화한다. MDM2가 증폭되는 경우, 이것은 p53가 세포 성장을 조절하지 못하도록 만들며, 이것이 종양 형성을 초래할 수 있다. 더욱이, 특정 유방암은 ERBB2 유전자의 과발현 및 복제 수 증가와 연관되며, 이것은 인간 표피 성장 인자 수용체 2를 암호화한다. 또한, 염색체 lq 및 3q과 같은 염색체 수의 증가가 또한 증가된 암 위험과 연관된다.
세포유전학적 상태는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들면, FISH, 전통적인 핵형분석, 및 가상 핵형분석(예 비교 게놈 혼합 어레이, CGH 및 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이)가 사용될 수 있다. 예를 들면, FISH가 특정 유전자좌에서의 염색체 재배열을 평가하는데 사용될 수 있으며 이러한 현상은 질환 위험 상태와 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 세포유전학적 상태는 SWOG(the Southwest Oncology Group), MRC(the Medical Research Council), 및 CALGB(the Cancer and Leukemia Group B)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 분류 시스템에 의해 결정되는 바와 같이 유리하거나, 중간 정도이거나, 불리하다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 수행(performance)이다. 수행도는 임의의 시스템을 사용하여 정량될 수 있으며 환자의 수행도를 스코어링하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 측정은 종종 환자가 화학요법, 용량 조절을 받을 수 있는지를 결정하고, 완화 치료의 강도를 결정하는데 사용된다. Karnofsky 스코어 및 Zubrod 스코어를 포함한 다양한 스코어링 시스템이 있다. 병렬 스코어링 시스템은 Global Assessment of Functioning (GAF) 스코어를 포함하며, 이것은 정신과의 진단 및 통계 편람(DSM)의 다섯번째 축으로서 포함되었다. 보다 높은 수행도(예, Karnofsky 스코어링 시스템을 사용하여 적어도 80%, 또는 적어도 70%)는 질병 상태의 진행을 방지하고 화학요법 및/또는 방사선 치료를 받아들일 수 있는 환자의 능력을 증진시키기 위한 치료를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 이러한 실시형태에서, 환자는 보행 가능하며 자기를 스스로 돌볼 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 평가는 종래의 방사선요법 및/또는 화학요법을 견딜 수 있도록 낮은 수행도(예, Karnofsky 스코어링 시스템을 사용하여 50% 미만, 30% 미만, 또는 20% 미만)를 갖는 환자를 가리킨다. 이러한 실시형태에서, 환자는 대개 침대나 의자에 누워 있으며 심지어 자기를 스스로 돌볼 수도 없다.
Karnofsky 스코어는 100 내지 0에 이르며, 여기서 100은 "완벽한" 건강이고, 0은 사망이다. 스코어는 10의 간격으로 사용될 수 있다, 여기서: 100%은 정상이고, 불편이 없으며, 질환의 증상이 없고; 90%는 정상적인 활동을 할 수 있고, 질환의 징후 또는 증상이 거의 없으며, 80%는 약간의 장애, 약간의 징후 또는 증상을 갖는 정상적인 활동이고; 70%는 정상적인 활동 또는 작업을 할 수 없지만 자기를 스스로 돌볼 수 있고; 60%는 약간의 도움을 필요로 하고, 대부분의 개인적인 필요한 것들을 돌볼 수 있으며; 50%는 종종 도움을 필요로 하고, 빈번하게 의학 치료를 필요로 하며; 40%는 장애가 있고, 특별한 관리 및 도움을 필요로 하며; 30%는 심한 장애가 있고, 병원 입원을 보이지만 사망의 위험은 없으며; 20%는 중병을 앓고, 긴급하게 입원을 필요로 하며, 지지적인 조치 또는 치료를 필요로 하고; 10%는 빈사상태이고, 치명적인 질병 과정으로 급속히 진행된다.
수행도에 대한 Zubrod 스코어링 시스템은 다음을 포함한다: 0, 충분히 활동적이고, 제약 없이 모든 질환전 수행을 실행할 수 있음; 1, 신체적으로 격렬한 활동에는 제약이 있지만 보행 가능하고 가볍거나 주로 앉아서 하는 일, 예, 가벼운 집안일, 사무직은 수행할 수 있음; 2, 보행 가능하고 모두 자기 스스로 돌볼 수 있지만 깨어있는 시간의 50% 이상 어떠한 직업 활동을 수행할 수는 없음; 3, 단지 제한된 자기 돌봄은 가능하며, 깨어있는 시간의 50% 이상 침대나 의자에 누워 있음; 4, 완전 장애가 있으며, 자기 돌봄을 전혀 할 수 없고, 전적으로 침대나 의자에 누워 있음; 5, 사망.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 조직학적 서브클래스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양의 조직학적 샘플을 문헌[참조; Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10]에 따라 등급을 나누며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 성별이다. 하나의 실시형태에서, 성별은 남성이다. 또 다른 실시형태에서, 성별은 여성이다.
하나의 실시형태에서, 임상 인자는 질병 단계이다. 비제한적인 예를 들자면, 전체 단계 그룹화를 사용하여, I기 암은 신체의 한 부분에 국한되고; II기 암은 III기 암이 그러한 것처럼 국소적으로 진행된다. 암을 II기로 명명할지 또는 III기로서 명명할지는 암의 특정 타입에 따라 좌우될 수 있다. 하나의 비제한적인 예, 호지킨병에서, II기는 횡격막의 단 한면에 병에 걸린 림프절을 나타내는 반면, III기는 횡격막의 위 및 아래에 병에 걸린 림프절을 나타낸다. 따라서, II기 및 III기에 대한 구체적인 기준은 진단에 따라 다르다. IV기 암은 흔히 다른 장기로 또는 신체 전반에 걸쳐 전이되거나 확산된다.
몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 (예 골수조혈이상의 존재 및 골수모세포 및 적혈모구의 정량을 나타내는) 혈액 질환에 대한 French-American-British(FAB) 분류 시스템이다. 하나의 실시형태에서, 급성 림프구성 백혈병에 대한 FAB는 L1-L3이거나, 급성 골수성 백혈병에 대한 것은 M0-M7이다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성, 정상 상태 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가의 바이오마커의 측정을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 임상 반응을 예측함을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 임상 반응은 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/악화되지 않는 생존률이다.
연령 프로파일 및 수행도와 같은 다양한 임상 인자가 확인되었다. 유전자 MLL, AML/ETO, Flt3-ITD, NPM1 (NPMc+), CEBPα, IDH1, IDH2, RUNX1, RAS, 및 WT1에서 그리고 후성 변형 유전자 TET2 및 ASXL에서의 돌연변이 뿐만 아니라 세포 신호전달 단백질 프로파일의 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포유전학 및 분자 이벤트와 같은 다수의 진단 정적 측정이 이용되어 왔다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 안내되는 바와 같이 암에 걸릴 것 같은 환자에게 치료를 투여함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험, 암에 대한 유전적 소인(예 유전적 위험 인자), 암의 이전 에피소드(예 새로운 암 및/또는 재발), 암의 가족력, 암-유도제(예 환경적 제제)에의 노출, 및 약리유전학적 정보(치료제의 약동학적, 약력학적 또는 효능 프로파일에 대한 유전자형의 영향) 중의 하나 이상을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다.
몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 높은 위험을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암에 대한 유전적 소인을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 암에 대한 유전적 소인은 당업계에 공지된 바와 같은 유전적 임상 인자이다. 이러한 임상 인자는, 예를 들자면, 적어도 결장, 자궁, 소장, 위, 요로 암의 경우 HNPCC, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암의 이전 에피소드를 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개의 암의 이전 에피스드에 시달린다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암의 가족력을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 몇몇 실시형태에서, 부모 및/또는 조부모 및/또는 형제자매 및/또는 고모/삼촌 및/또는 고모할머니/종조부, 및/또는 사촌이 암에 걸렸거나 암을 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체가 암-유도제(예 환경적 제제)에의 노출을 특징으로 한다면 대상체는 암에 걸리기 쉽다. 예를 들면, 강한 일광에의 피부 노출은 피부암에 대한 임상 인자이다. 예를 들자면, 흡연은 폐암, 구강암, 후두암, 방광암, 신장암, 및 몇몇 기타 장기의 암에 대한 임상 인자이다.
추가로, 몇몇 실시형태에서, 다음의 임상 인자들 중의 어느 하나가 본원에 기재된 방법에서 유용할 수 있다: 성별; 유전적 위험 인자; 가족력; 개인력; 인종 및 민족; 특정 조직의 특징; 다양한 양성 병태(예 비증식성 병변); 이전의 흉부 방사선; 발암물질 노출 등.
추가로 여전히, 몇몇 실시형태에서, 다음의 임상 인자들 중의 어느 하나가 본원에 기재된 방법에서 유용할 수 있다: 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서의 세린의 인산화 중의 하나 이상.
몇몇 실시형태에서, 임상 인자는 인터류킨-6을 포함하지만 이에 제한되지 않는 사이토킨의 발현 수준이다. 몇몇 실시형태에서, 인터류킨-6 수준은 좋지 못한 환자 예후 또는 좋은 환자 예후를 포함하여, MM 환자에서의 반응의 가능성과 상관성이 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 반응의 가능성은 프라이밍 퍼센트를 평가함으로써 결정된다. 특정 실시형태에서, 프라이밍은 다음의 방정식에 의해 정의된다:
여기서, AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하고; DMSO는 베이스라인 음성 대조군을 포함하며; CCCP(카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존)는 미토콘드리아에서 전자 전달 연쇄계에서 전자 전달체의 정상적인 활성 동안 확립된 양성자 구배의 탈커플링제로서 작용함으로써 단백질 합성의 효과기를 포함하고 베이스라인 양성 대조군을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 균일 시분해 형광(HTRF)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 시간은 약 0 내지 약 300 min 내지 약 0 내지 약 30 min의 창에 걸쳐 발생한다. 몇몇 실시형태에서, 곡선하 면적은 형광 강도 중간값(MFI) 통계를 측정함으로써 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 확립된다. 몇몇 실시형태에서, 신호 강도는 약 5 min 내지 약 300 min에서 발생하는 단일 시점 측정치이다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 BH3 프로파일링 검정 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, pS3 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 측정하고; 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘으로 AML 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시킴을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 BH3 프로파일링 검정 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, pS3 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 측정하고; 화학요법으로 MM 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시킴을 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 암은 AML 및/또는 MM이고 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나; 또는 암은 AML 및/또는 MM이고 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이거나, 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이거나, 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고; 암은 AML 및/또는 MM이고; 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태이다.
본 발명은 또한 종양 또는 암 세포 표본의 평가를 간소화할 수 있는 키트를 제공한다. 본 발명의 전형적인 키트는, 예를 들면, BH3 펩타이드를 검출하는 하나 이상의 제제를 포함한 다양한 시약을 포함한다. 키트는 또한 다양한 검출방법에서 유용한 것들을 포함하여, 검출를 위한 하나 이상의 시약, 예를 들면, 항체를 포함할 수 있다. 키트는 벽이 있는 플레이트, 시린지 등을 포함하여, 평가에 필요한 재료를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 기재된 시약의 용도를 알려주는 라벨 또는 인쇄된 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 시험하고자 하는 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "약"은, 참고된 수치 표시와 관련하여 사용되는 경우, 참고된 수치 표시 + 또는 - 10%의 참고된 수치 표시를 의미한다. 예를 들면, 표현 "약 50"은 45 내지 55의 범위를 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함한다" 및 이의 변형은 목록에서의 항목의 설명이 이 기술의 재료, 조성물, 장치, 및 방법에서 유용할 수도 있는 다른 유사한 항목의 배제를 의도하는 것은 아니도록 비제한적인 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "can" 및 "may"와 이들의 변형은 실시형태가 특정 요소 또는 특징을 포함할 수 있거나 포함할 수 있을지 모른다는 설명이 이러한 요소 또는 특징을 함유하지 않는 당해 기술의 다른 실시형태를 배제하지 않도록 비제한적인 것으로 의도된다. 포함하는(including), 함유하는(containing), 또는 갖는(having)과 같은 용어의 동의어로서 오픈-엔드 용어 "포함하는(comprising)"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본원에서 사용되지만, 본 기술, 또는 이의 실시형태는 대안적으로, 설명된 성분"으로 이루어진" 또는 "으로 필수적으로 이루어진"과 같은 보다 제한적인 용어를 사용하여 기재될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해되는 것과 동일한 의를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다. 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1: AML 환자-기반 코호트를 사용한 연구
우리는 프로토콜 NCT00795002 (J0856), NCT00407966 (J0669), 또는 NCT01349972 (J1101)에 등록된 AML 또는 MDS로 새로 진단된 환자로부터 총 63개의 말초 혈액 및 골수 샘플을 입수하였다. 환자는 FLAM: 알보시딥 (플라보피리돌), Ara-C 및 미톡산트론 (n=54) 또는 7+3 (Ara C 및 다우노루비신, n=9)으로 치료받았다. 완전한 반응, 5% 미만의 골수아세포와 모든 세포주의 정상적인 성숙, ANC ≥ 1000/㎕ 및 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕, 말초 혈액 중의 아세포의 부재, 골수 중의 백혈병 세포의 부재, 질병과 관련된 세포유전학의 해소, 및 이전의 골수외 질병의 해소를 특징으로 함. BH3 프로파일링이 완료된 후 블라인드 외부 검토에 의해 환자 연령, 세포유전학적 위험, FLT-3 돌연변이, NPM1 돌연변이, MDS/골수 장애 병력, 이전의 화학요법 이력, BM 아세포 %, 진단시 WBC 수치, 및 치료법에 대한 반응을 포함한 전반적인 환자 특징이 제공되었으며, 표 1에 요약되어 있다. 개별적인 환자 특징이 표 2에 열거되어 있다.
미토콘드리아 프로파일링
간략하게, 동결, 추출된 백혈구 샘플을 급속히 해동시키고, 세포 생존능을 트리판 블루 배제에 의해 구하였다. 세포를 FACS 완충액(lx 2% FBS를 갖는 PBS)으로 세척하고 형광 표지된 CD45, CD3, 및 CD20 단클론성 항체를 사용하여 면역표현형을 분석하였다. 그후, 세포를 교란 단계를 위해 Newmeyer 완충액(10 mM 트레할로스, 10 mM HEPES, 80 mM KC1, 20 μM EGTA, 20 μM EDTA, 5 mM 석시네이트, pH 7.4)에 재현탁시켰다. BH3 펩타이드를 Newmeyer 완충액에 희석시켜 다음의 최종 농도를 초래하는 작업 용액을 만들었다: BIM (100 μM), BIM (0.1 μM), NOXA (100 μM), Puma (10 μM), HRK (100 μM), BAD (100 μM), 및 BID (1.0 μM). DMSO 및 CCCP를 음성 및 양성 펩타이드 대조군으로서 사용하였다. 디기토닌 및 올리고마이신을 개별 FACS 튜브에 가한 다음 BH3 펩타이드를 가하였다. 그후, 세포를 FACS 튜브에 가하고, 세포 투과화, 펩타이드 또는 화합물의 전달, 및 미토콘드리아 탈분극이 일어나도록 하기 위해 실온에서 2시간 15분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, JC-1 염료를 Newmeyer 완충액 중에서 제조하고 처리된 세포에 직접 가하였다. 펩타이드 또는 화합물로 처리하지 않은 세포의 추가의 튜브를 프로피듐 요오다이드 (PI)로 염색하여 세포가 디기토닌에 의해 효과적으로 투과되도록 보장하였다. JC-1과 45분간 항온처리 후, 세포를 쓰리 레이저 BD FACSCanto II에서 분석하였다. AML 아세포를 네 개의 파라미터에 기초하여 게이팅하였다: 1) 투과화(PI 염색에 의해 측정되는 바와 같음), 2) SSC에 기반한 일중항 구분, 3) CD45 dim 및 CD3/CD20 음성, 및 4) SSC 낮은. 그후, 게이팅된 아세포 집단의 JC-1 레드 형광 중간값을 사용하여, DMSO (음성) 및 CCCP (양성) 대조군과 비교한 % 탈분극도를 계산하였다.
세포유전학적 위험 상태 결정
개별 환자 세포유전학적 위험 분류(유리, 중간, 및 불리)는 CALGB(Cancer and Leukemia Group B) 가이드라인으로부터 구하였다: 유리 = invl6, t(8:21), t(15;17) 중간 = 이배체, 불리 = -5, -7, +8, t(6;9), llq, PH1+, > 3 비관련 세포유전학적 이상 등.
통계적 분석: 각 펩타이드에 대해, 프라이밍 백분율은 완전히 비프라이밍된 기준으로서 DMSO 음성 대조군 및 100% 프라이밍된 기준으로서 CCCP에 기초하여 프라이밍을 구하는 다음의 공식을 사용하여 계산하였다:
분석을 위해, CR로 분류되지 않은 모든 환자는 무반응자로 처리하였다[최소 잔여 질병(MRD), 부분 관해(PR), 및 TF(치료 실패)]. BH3 펩타이드(및 기타 종양 특징들, 예를 들면, 세포유전학, 등)와 반응 간의 스트던트 t-검정, Mann-Whitney 순위합 비모수적 검정, 다변량 로지스틱 회귀, 및 ROC 곡선 분석은 GraphPad Prism Version 5.04 및 MedCalc Version 14.8.1을 사용하여 계산하였다.
FLAM 프로토콜에 등록된 AML 환자 샘플의 미토콘드리아 프로파일링
총 63개 환자 샘플을 제공받아 가공하였으며, 이들 샘플은 표 1 및 2에 요약되어 잇다. 전체 프로파일은 샘플 중 43개로부터 입수하였으며, 추가로 아홉개(9)는 (전체 검정을 수행하기에 불충분한 세포 수로 인해) 프로파일의 서브세트로 가공하였다. 남은 열 한개(11)의 샘플은, 불량한 신호 대 잡음비(세포는 검정 전에 이미 아폽토시스 상태였다) 또는 부적당한 세포 수로 인해, 어떠한 BE3 프로파일링을 결정하기에도 품질이 불충분하였다. 모든 후속적인 분석은 임의의 BH3 프로파일링에 대해 성공적으로 가공된 샘플(총 n=52)에 대해서만 수행하였다.
환자로부터 수득된 임상 변수를, 만약에 있다면, 이러한 인자들 중의 어떤 것이 환자가 치료법에 반응할지 하지 않을지에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 반응과 비교하였다(표 3). CR과 상당한 연관성을 갖는 것으로 밝혀진 유일한 변수는 세포유전학적 위험 인자이었으며, 여기서 불리한 분류를 갖는 것들이 반응에 덜 반응할 것 같다. WBC, MDS의 병력, 및 어떠한 프로토콜을 따를지는 모두 중요하며, 보다 높은 WBC 값 및 MDS의 병력은 치료법에 대한 반응과 연관성이 있다. 프로토콜 J0856은 J 1101(25명 중 8명)보다 더 높은 CR 비율(25명 환자 중 13명 CR)을 가졌으며, 프로토콜 J0669는 성공적으로 BH3 프로파일링된 두 명의 환자에 의해서만 나타났다. BM 아세포 퍼센트, 및 NPM/FLT-3 돌연변이 상태는 이러한 데이터세트에서 반응과 유의적인 연관성이 없었다.
모든 BH3 개별 환자 데이터가 표 4에 요약되어 있으며 아세포에서 미토콘드리아 탈분극을 유도하는 각 BH3 펩타이드의 능력(즉, "프라임")을 상세하고 있다. 반응 모두를 살펴보면, BIM 100 μM 펩타이드가 최고 탈분극 중간값(99.2% 프라이밍)을 야기하였고 NOXA는 최저 전체 탈분극(16.0% 프라이밍)을 가졌다. 그후, 단일 펩타이드 BAD 프로파일을 표 6에서 치료에 반응한 환자(CR)에서 치료에 반응하지 않은 환자(NR)와 비교하였다. 단일 펩타이드는 반응과 유의적인 연관성이 없었다; 그러나, BAD 펩타이드는 0.09의 p-값을 갖는 유의도에 근접하였을 뿐만 아니라 0.65의 AUC 값을 가졌다. 이는, 전체 환자 세트를 사용하여, 어떠한 개별 BH3 펩타이드도 FLAM 치료에 반응하는 환자를 확인하는데 충분하지 않음을 나타낸다.
BH3 펩타이드를 다른 BH3 펩타이드 프로파일 및 임상 변수와 다변량 분석으로 시험하였다(표 8). 이러한 분석 결과, BIM 100 μM + BAD + PUMA 간의 강한 유의적인 연관성이 반응과 관련하여 존재하며, p-값이 0.009이고 ROC AUC가 0.732인 것으로 드러났다(도 1). 이러한 세 가지 펩타이드를 세포유전학적 위험 카테고리와 조합하는 경우, p-값이 0.0001이 되며 AUC는 0.84이다. MDS 병력을 분석에 추가로 부가하면 추가의 유의성과 0.0001의 p-값 및 0.85의 AUC를 생성한다. 세포유전학적 위험 카테고리 만이 단지 0.60의 AUC 값을 산출한다(세포유전학적 위험 + MDS 병력은 0.72의 AUC를 제공한다). 이것은 BH3 펩타이드 프라이밍을 분석에 부가하면 FLAM에 반응하는 환자를 확인하는 능력이 크게 증가함을 나타낸다. 세포유전학적 위험 카테고리 및 MDS 병력과 함께 BH3 펩타이드 데이터를 사용한 이상적인 컷오프(Youden 지수 - 최고 특이성 + 민감도)에서, 이러한 검정은 당해 연구에서 치료에 반응하는 환자를 확인하는데 89.5% 민감하며 76% 특이적이다. 이것은 임상 정보와 함께 이러한 세 가지 펩타이드로부터의 BH3 펩타이드 프라이밍 데이터를 사용하는 것이 FLAM 섭생으로의 치료에 대한 예측치에 있어서 귀중할 수 있음을 나타낸다.
이러한 연구 과정 동안, 우리는 또한 BH3 프라이밍에서 역할을 할 수 있는 또 다른 인자를 조사하였다. 백혈병 세포의 공급원(즉, 말초 혈액 또는 골수)은 잠재적으로 세포의 상이한 집단들을 분리할 수 있기 때문에, 우리는 환자의 골수로부터 수득된 샘플에서만 분석을 수행하였다. 표 8은 골수 샘플에서만 반응하는 각각의 BH3 펩타이드의 연관성을 보여준다. 이러한 샘플 서브세트에서, NOXA 프라이밍은 치료에 반응하지 않은 환자에 비해 치료에 반응한 환자에서 유의적으로(p=0.006) 더 높으며(각각 44.5% 및 5.2%) 0.805의 AUC 값을 갖는다(도 2 및 도 3). 다른 단일 펩타이드 중 어떤 것도 골수 샘플 단독에서의 반응과 상당한 연관성을 보이지 않았다. 10.78% NOXA 프라이밍 이상의 컷오프 값에서, 시험은 92% 민감성이고 67% 특이성이다. 알고리즘에 세포유전학적 위험 인자 및 MDS 병력을 부가하는 것은 치료에 대한 반응을 예측하는데 있어서 NOXA 프라이밍이 이러한 변수에 부가되고, 이상적인 컷오프 값에서 92%의 민감도 및 80%의 특이성과 0.92의 AUC 값을 산출함을 보여준다(표 8 및 도 3).
이 연구의 결과는 BH3 프로파일링이 FLAM 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는데 유용하다는 것을 확립시킨다. 전체 데이터세트를 살펴보면, 개별 BH3 펩타이드는 반응과 상관성이 없는 반면, 몇몇 펩타이드의 조합(BIM, BAD, 및 PUMA)은 FLAM 반응과 강한 상관성을 보였다. 이러한 몇 가지 펩타이드는 연구 내에서 골수 및 말초 혈액 샘플 둘 다에서 반응과 상관성을 보였다. 더욱이, 이러한 데이터가 공지된 환자 위험 인자에 추가되어, 우리가 세포유전학적 상태를 환자의 MDS 병력과 함께 환자 반응을 예측하는 단일 매트릭에 삽입하는 알고리즘을 확인할 수 있게 한다.
당해 연구의 또 다른 흥미로운 발견은 전체 데이터세트에서 NOXA 신호전달이 FLAM 반응과 유의적으로 연관된 것으로 밝혀지지 않았다는 것이다. 그러나, 골수 샘플 단독을 조사한 결과 반응과 매우 강한 연광성을 보였다. AML 종양 세포의 자리가 골수이기 때문에, 아세포의 표현형 마커가 골수과 비교하여 말초 혈액에서 상이할 수 있음에 따라, 골수와 비교하여 말초 혈액에서 BH3 프로파일이 상이하다는 것은 놀랍지 않다(1,2). 추가로, 골수 기질은 직접 세포 접촉을 통해 및 골수에 존재하는 가용성 인자를 통해 다양한 치료법에 대해 AML 세포에 내성을 부여하는 것으로 이전에 나타났다(3). 골수 천자가 잠재적으로 AML 아세포, 가용성 인자, 및 잠재적으로 실제 기질 세포를 수집하기 때문에, 골수에서의 BH3 프라이밍 검정이 이들의 정상적인 환경적 컨텍스트에서 백혈구 세포의 보다 직접적인 검사를 나타낼 수 있다. FLT3 키나제 억제제 단일요법을 갖는 AML에서 기능적 차이가 이전에 관찰되었으며, 여기서 순환 아세포는 치료법에 의해 말초 혈액으로부터 소거되는 반면 골수 아세포는 최소한으로 영향을 받는다(4). NOXA 판독치가 유사한 기능적 차이를 검출할 수 있으며, 여기서 NOXA으로의 프라이밍이 MCL-1 대치를 초래하고 아폽토시스를 야기하여 FLAM에 반응할 것 같은 암을 확인시켜 준다.
이 연구에서 확인된 알고리즘, NOXA 및 [BAD + BIM 100 + PUMA] 프라이밍, 둘 다는 MCL-1 프라이밍된 암 세포를 확인할 수 있다. NOXA에 대한 높은 아폽토시스 반응을 산출하는 세포를 MCL-1 프라이밍된다고 하는 반면, 펩타이드 Bad에 대한 높은 반응은 BCL-xL 또는 BCL-2가 아폽토시스 차단을 제공함을 나타낸다. PUMA가 pan-BCL-2 패밀리 프라이밍을 반영할 수 있고, [BAD + BIM 100 + PUMA] 뒤의 알고리즘이 실제로 PUMA - BAD - BIM 100이기 때문에, 사실상; 이러한 판독치 둘 다가 MCL-1의 프라이밍 상태를 효과적으로 측정할 수 있고, 궁극적으로 FLAM 섭생에 반응하는 환자는 MCL-1 의존적일 수 있다. 이 연구로부터 FLAM에 대한 반응 가능성을 결정하기 위한 한 가지 알고리즘은 가능한 반응자로서 특정 역치 이상의 환자를 확인한 다음 이러한 역치를 사용하여 시험에 대한 민감도, 특이성, 양성 예측치, 및 음성 예측치를 특성화하는 것이다. 환자 또는 샘플 특이 컨텍스트를 설명하기 위해 임상 조절 변수를 트레이닝 데이터 세트에 피팅된 로지스틱 회귀 모델의 사용을 통해 포함시킨 다음 입증할 수 있다. 그후, 이 모델을 사용하여, 확률을 로지스틱 모델을 갖는 시그모이드 함수를 사용하여 계산할 수 있다; 이러한 확률을 사용하여 특이성, 민감도, 양성 예측치, 및 음성 예측치 측면에서 이들 컷오프 값에서의 시험 특징을 확립하는 역치를 확인할 수 있다. 의사결정 분지도가 또한 사용될 수 있으며, 이는 환자 또는 샘플 특징 및 BH3 프로파일링 결과 중의 어느 것을 참작하여 반응의 가능성을 확립한다. 랜덤 포레스트, 신경망, 및 부스팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 알고리즘이 또한 환자 및 샘플 특징을 포함한 예측 알고리즘을 개발하는데 사용될 수 있다.
실시예 2: FLAM 섭생 대 전통적인 7+3 치료 전략을 구별하기 위한 알고리즘
AML 환자 골수 또는 말초 혈액에서 BIM 0.1 프라이밍은 7+3 섭생(시타라빈 + 안트라사이클린)에 대한 반응과 상관성이 있었다; 문헌 참조; Pierceall, 등 "BH3 Profiling Discriminates Response to Cytarabine-based Treatment of Acute Myelogenous Leukemia" Molecular Cancer Therapeutics. 상기 논의된 바와 같이, NOXA 골수 프라이밍은 FLAM (알보시딥, ara-C, 미톡산트론) 섭생에 대한 반응과 상관성이 있다. 우리는 어떠한 알고리즘이 FLAM 또는 7+3가 나이브 AML 환자를 치료하는데 사용되어야 하는지를 구분하는가를 조사하였다.
BIM 0.1은 0.80의 AUC 값 및 각각 64.3% 및 100%의 민감도 및 특이성으로 BM 샘플 서브세트에서 7+3에 대한 반응을 예측한다-좌측 아래. 그러나, 이러한 동일한 샘플에서 NOXA는 0.54의 AUC 값 및 42.9% 민감도와 100% 특이성으로 본질적으로 예측력을 갖지 않는다. 도 5 참조. (FLAM로 치료하는 경우 0.81의 AUC 및 92%/67% 민감도/특이성과 비교하여). 이것은 NOXA 프라이밍이, 사전치료 AML 환자로부터 채취한 골수 세포에서 검출되는 경우, FLAM에 대한 반응과는 상관성이 있지만 7+3와는 그렇지 않으며, 치료 전에 시험된 AML 환자의 말초 혈액으로부터의 BIM 0.1 판독치는 7+3에 대한 반응과는 상관성이 있지만 FLAM과는 그렇지 않음을 나타낸다.
BIM 0.1 프라이밍과 비교하여 NOXA 프라이밍의 추가의 조사 결과, 어느 하나의 제제에는 반응할 것 같지 않지만 다른 제제에는 반응할 것 같음을 나타내는 프라이밍 값을 갖는 환자의 서브클래스가 있는 것으로 드러났다. 도 6은 원래의 7+3 연구(n=23)로부터의 골수 샘플로부터의 NOXA 프라이밍 대 BIM 0.1 프라이밍을 예시한다. 도 6의 데이터는 환자의 골수 샘플에서의 NOXA 프라이밍 대 말초 혈액(PB) 샘플에서의 BIM 0.1 프라이밍을 비교함으로써 사전-치료 AML 환자에서 암 치료 전략들 간에 선택하는 방법을 제공한다. BM NOXA > 10.8% 및 BMZPB BIM 0.1 <35%이라면, 환자는 FLAM의 후보자이다. BM NOXA < 10.8% 및 BMZPB BIM 0.1 >15%이라면, 환자는 7+3 치료법의 후보자이다. BM NOXA < 10.8% 및 BM/PB BIM 0.1 > 35%인 경우 환자는 또한 7+3 치료법의 후보자이다. 마지막으로, BM NOXA < 10.8% 및 BM/PB BIM 0.1 < 15%인 경우, 환자는 FLAM 또는 7+3 치료법의 후보자가 아니다.
우리는 또한 NOXA 프라이밍 단독이 FLAM 치료에 대한 반응으로 AML 환자 생존을 예측한다는 것을 확인하였다. 도 10b. 샘플에서 컷-오프로서 40% NOXA 프라이밍을 사용하여, 40% 또는 초과의 NOXA 프라이밍을 갖는 환자는 완전한 반응 및 생존을 가질 가능성이 훨씬 더 높다. 이러한 데이터는 FLAM 치료에 대한 AML 환자 반응이 NOXA 프라이밍을 사용하여 예측될 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 3: 표적화 약물류 내에서 PraediCare Dx ™ 판독 유용성을 확인하는 NOXA
우리는 특정 미토콘드리아 판독치가 특정 치료에 대한 세포 반응과 연관성이 있음을 보여주었다. 미토콘드리아 판독치의 유용성에 있어서의 변화에 대한 세포 컨텍스트의 영향을 추가로 평가하기 위해, 우리는 배양액에서 성장시킨 암 세포에 대한 MCL-1 교란 약물의 활성을 비교하고, 환자로부터 수집된 세포에서 미토콘드리아 프로파일링 판독치의 우리의 이해와 비교하였다. 우리는 미토콘드리아 프로파일링에서 동일한 판독치와 상관성이 있는 표적 종류 내에 있는 두 개의 치료 화합물의 암 세포 반응 범위에 있어서의 중첩을 살펴보았다. 하나의 예에서 우리는 CDK9, 알보시딥 및 디나시크립에 대해 일반적인 활성을 갖는 두 개의 CDK 억제 화합물을 살펴보았다. 도 7은 NOXA 판독치가 도 7에 참조된 바와 같이 암 세포주를 가로질러 디나시크립의 경우에 이들 화합물 각각에 대한 반응을 예측하는 것으로 나타났음을 예시한다). 이러한 세포주에서 알보시딥 및 디나시크립에 대한 반응은 암 반응 치료제 포털(www .broadinstitute.org/ctrp/)로부터 수득되었으며 세포는 수득된 AUC(곡선하 면적) 값에 기초하여 이들 화합물에 반응하는 것으로 분류되었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 세포주 반응 프로파일의 중첩이 현저하며, 상관 계수는 0.95이다.
이러한 데이터는 CDK9에 대해 일반적인 활성을 갖는 다중 CDK 억제 화합물에 대한 NOXA 프라이밍 시험의 유용성을 확립한다.
실시예 4: 생체외 컨텍스트 NOXA 화합물
암 세포주로부터의 공개적으로 이용 가능한 치료 약물을 사용하여, NOXA 바이오마커가 중요할 수 있는 추가의 치료 약물류를 확인할 수 있다. 이 가능성을 조사하기 위해, 우리는 일례로서 저메틸화작용제(HMA)에 대한 암 세포 반응을 평가하기 위한 NOXA 프라이밍 판독치의 유용성을 조사하였다. 우리는 NOXA 프라이밍에 의해 결정된 세포에서의 MCL-1 의존성이 이러한 HMA에 대한 더 큰 민감도를 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 암 세포주(n = 33)를 FACS BH3 프로파일링 검정(PraediCare Dx™ 검정)을 사용하여 NOXA 펩타이드와의 MCL-1 의존성에 대해 프로파일링하였다. 이러한 세포주에서 아자시티딘 및 데시타빈에 대한 반응은 암 반응 치료제 포털(www.broadinstitute.org/ctrp/)로부터 수득되었으며, 세포는 데시타빈의 경우 40% 변위치 및 아자시티딘의 경우 12% 변위치를 반응에 대한 역치로서 사용하여 수득된 AUC (곡선하 면적) 값에 의해 제제에 대한 반응에 기초하여 HMA에 반응하는 것으로 분류되었다. 순위합 검정 p-값을 두 그룹 간에 계산하였으며, 플롯 상에 나타내어져 있다. 함께, 이것은 NOXA 바이오마커를 통한 MCL-1 의존성이 HMA에 대한 반응을 위해 필요할 수 있음을 나타낸다(도 8).
실시예 5: 돌연변이 상태가 저메틸화작용제 및 기타 약물에 대해 AML 환자에서 프라이밍 상태 및 반응률에 영향을 미친다
약물 활성과 완전히 부합하고 표적 요법의 치료를 안내할 수 있는 표적 단백질에 돌연변이가 있기는 하지만, 재발 및 독성에 관한 질문 뿐만 아니라 최적의 조합 옵션이 추가의 측정을 필요로 하는지는 여전히 해답이 나와 있지 않다. 개발 동안, 표적화된 제제는 정확한(on-target) 활성에 대해 선택된다. 돌연변이 프로파일 또는 유전자 발현 패턴에 의해 직접적으로 설명될 수 없는 예기치 못한 활성도 흔히 있다.
백혈병 분야 내에서, 다음을 포함한 다양한 예후적 유전자 바이오마커가 확인되었다: 급성 골수성 백혈병(AML)의 경우 FLT3, IDH, 및 p53 돌연변이 및 만성 림프성 백혈병(CLL)의 경우 IGHV, BCL-6, BTK, 및 p53 돌연변이. 이러한 바이오마커는 대개 치료법에 대한 불량한 또는 유리한 결과와 일반적으로 연관된다. CLL 집단의 작은 부분은 제외하고도, 이러한 검사의 예측치는 추가의 만감도를 필요로 하므로, 치료법 선택을 안내하는데 사용되지 않는다. 여러 흔한 약물 및 이러한 제제에 대한 환자의 반응의 메카니즘은 흔히 암 세포가 프로-아폽토시스 신호전달에 반응하는 능력에 의존한다. 약물 반응과 연관되는 돌연변이의 맥락에서도, 반응에 관한 환자 간의 변동성이 있으므로, 암에서 아폽토시스 소인의 정도를 측정하는 것이 열쇠이다.
저메틸화작용제인 데시타빈으로 치료된 환자를 조사하였다. 이들 환자는 이전에 FLT3 이상을 포함한 몇 가지 돌연변이적 특징을 특징으로 하였다. 돌연변이 상태를 갖는 이러한 프로파일의 조사는, FLT3 돌연변이를 갖는 AML 환자가 이들의 미토콘드리아 프로파일링 수준과 무관하게 데시타빈에 무반응성인 것으로 밝혀졌기 때문에 FLT3 돌연변이 상태와 검정 판독치의 조합이 필요하다는 것을 나타내었다. 그러나, 비돌연변이된 FLT3를 갖는 환자에서, BIM (0.1) 펩타이드가 반응과 연관된 것으로 밝혀졌다(도 11a). 게다가, 데시타빈 처리한 반응한 FLT3 돌연변이 음성 환자는 반응하지 않은 환자에 비해 BH3 모방체에 대해 유의적으로 더 높은 미토콘드리아 반응을 보였다, BIM 0.1 (p = 0.04). FLT3 돌연변이를 갖는 환자는 일반적으로 유의적으로 (p = 0.02) 더 높은 BIM 0.1 프라이밍을 가졌다. 이것은 돌연변이 상태와 BH3 프로파일링으로부터의 결과의 조합이 어느 환자가 높은 정확도로 데시타빈에 잘 반응할지를 예측할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: MCL -1 의존성을 평가하기 위한 대안적인 방법
MCL-1 의존성을 추가로 조사하기 위해 우리는 암 세포에서 MCL-1 의존성을 결정하는 NOXA 판독치에 대한 대안을 제공하기 위한 특정 BH3 모방체 화합물의 유용성을 탐사하였다. 우리의 접근법은 MCL1를 선택적으로 표적화하는 막 투과성 BH3 모방체 화합물을 직접 적용하는 것이었다. 이렇게 하면 치료제의 표적 활성을 직접 관측하는 이점이 부가된다. 도 9는 NOXA에 의해 프라이밍된 세포주가 또한 PraediCare Dx™ 포맷 FACS BH3 프로파일링 검정에 따라 투과된 세포에 직접 적용된 MCL-1 선택적 BH3 모방체 화합물, EU5346에 반응성임을 보여준다,
당업계의 숙련가들은, 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 구체적으로 기재된 특정 실시형태들에 대한 수많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
참고문헌
표
표 1. 환자 요약
표 2. 환자 특징
표 3. 반응과 임상 특징 연관성
표 4. BH3 프로파일링 데이터
표 5. 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성
표 6. BH3 펩타이드 프로파일링과 기타 임상 변수의 다변량 분석
표 7. 골수 샘플에서 개별 BH3 펩타이드 프로파일과 CR의 연관성
표 8. BH3 펩타이드의 통계적 분석은 골수로부터 수득한 샘플에서만 수행하였다
SEQUENCE LISTING
<110> Eutropics, Inc.
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ile Gly Asp
1 5 10 15
Lys Val Tyr Cys
20
<210> 2
<211> 55
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Gly Lys Lys Ala Arg Lys Asn Ala Gln Pro Ser Pro Ala Arg
1 5 10 15
Ala Pro Ala Glu Leu Pro Pro Glu Phe Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ile
20 25 30
Gly Asp Lys Val Tyr Cys Phe Arg Gln Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser
35 40 45
Lys Leu Phe Cys Ser Gly Thr
50 55
Claims (66)
- 환자의 골수로부터 채취한 환자의 종양 또는 암 세포 표본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 단계;
환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계(여기서, 하나 이상의 임상 인자는 임상 반응과의 연관성을 위해 BH3 프로파일의 특이성 및/또는 민감도를 증가시키도록 선택된다), 및
하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 암이 혈액 암인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 혈액 암이 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병, 및 비호지킨 림프종으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 비호지킨 림프종이 맨틀 세포 림프종 및 미만성 거대 B-세포 림프종으로부터 선택되는 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 혈액 암이 골수이형성 증후군(MDS)인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 혈액 암이 만성 림프성 백혈병(CLL)인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 판독치를 말초 혈액으로부터 채취된 환자 샘플의 BH3 프로파일링 판독치와 비교하고, 차이를 사용하여 치료를 안내하는 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 IL-6 교란제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 및 키네신-방추 단백질 안정화제 중의 하나 이상인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 프로테아좀 억제제인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 세포 주기 조절의 조절인자인 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 세포 주기 조절의 조절인자가 사이클린 의존성 키나제 억제제인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 세포 후성 메카닉의 조절인자인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 세포 후성 메카닉의 조절인자가 보리노스타트 또는 엔티노스타트 중의 하나 이상을 포함하는 히스톤 데아세틸라제(HDAC)의 억제제인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 세포 후성 메카닉의 조절인자가 아자시티딘인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 세포 후성 메카닉의 조절인자가 데시타빈인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 안트라사이클린 또는 안트라센디온인 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 안트라사이클린 또는 안트라센디온이 에피루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 다우노루비신, 및 이다루비신 중의 하나 이상인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 백금계 치료제인 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 백금계 치료제가 알보시딥인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 FLAM인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 BH3 모방체인 방법.
- 청구항 21에 있어서, 상기 BH3 모방체가 BCL2, BCLXL, 및 MCL1 중의 하나 이상인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 암 치료가 MCL1의 억제제인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BH3 프로파일링이 환자의 암 세포를 투과화시키고, 투과된 세포와 하나 이상의 BH3 도메인 펩타이드의 접촉시 미토콘드리아 막 전위의 변화를 결정하고; 미토콘드리아 막 전위의 소실과 아폽토시스-유도 화학요법제에 대한 세포의 화학민감성을 상관시킴을 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BH3 프로파일링이 펩타이드의 사용을 포함하고, 여기서 펩타이드가 BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK, 및 PUMA2A 중의 하나 이상인 방법.
- 청구항 24에 있어서, 상기 펩타이드가 0.1 μM 내지 200 μM의 농도로 사용되는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 동결된 종양 조직 표본, 배양 세포, 순환 종양 세포, 및 포르말린-고정된 파라핀-매봉 종양 조직 표본으로부터 선택되는 생검인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 인간 종양-유래 세포주인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 암 줄기 세포인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 고형 종양의 생검으로부터 유래되는 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 표본이 결장직장, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 신장, 또는 난소 원발성 종양의 생검으로부터 유래되는 방법.
- (없음)
- (없음)
- (없음)
- (없음)
- 청구항 1에 있어서, 상기 표본이 비-고형 종양의 생검으로부터 유래되는 방법.
- 청구항 36에 있어서, 상기 표본이 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백병, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 및 비호지킨 림프종을 가진 환자의 생검으로부터 유래되는 방법.
- 청구항 37에 있어서, 상기 표본이 고형 매트릭스 또는 비드에 결합된 항-CD 138 항체를 갖는 생검 샘플로부터의 선택에 의해 풍부해진 다발성 골수종 세포인 방법.
- 청구항 37에 있어서, 상기 암 세포가 CD45-지시된 항체에 결합함으로써 풍부해진 급성 골수성 백혈병인 방법.
- 청구항 37에 있어서, 상기 암 세포가 비-B 세포 고갈에 의해 풍부해진 만성 림프성 백혈병 또는 미만성 거대 B-세포 림프종인 방법.
- (없음)
- 청구항 1에 있어서, 상기 임상 인자가 연령, 세포유전학적 상태, 수행, 조직학적 서브클래스, 성별, 및 질병 단계 중의 하나 이상인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 돌연변이 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성, 정상 상태 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준으로부터 선택된 추가의 바이오마커의 측정을 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 방법이 환자에서 임상 반응을 예측함을 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 44에 있어서, 상기 임상 반응이 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년 진행/악화되지 않는 생존률인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 임상 반응의 가능성이 다음의 방정식에 의해 정의되는 방법:
여기서:
AUC는 곡선하 면적 또는 신호 강도를 포함하고;
DMSO는 베이스라인 음성 대조군을 포함하며;
CCCP(카보닐 시아나이드 m-클로로페닐 하이드라존)는 미토콘드리아에서 전자 전달 연쇄계에서 전자 전달체의 정상적인 활성 동안 확립된 양성자 구배의 탈커플링제로서 작용함으로써 단백질 합성의 효과기를 포함하고 베이스라인 양성 대조군을 포함한다. - 청구항 46에 있어서, 상기 곡선하 면적이 균일 시분해 형광(HTRF)에 의해 확립되는 방법.
- 청구항 46에 있어서, 상기 시간이 약 0 내지 약 300 min 내지 약 0 내지 약 30 min의 창에 걸쳐 발생하는 방법.
- 청구항 46에 있어서, 상기 곡선하 면적이 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 확립되는 방법.
- 청구항 46에 있어서, 상기 신호 강도가 약 5 min 내지 약 300 min에서 발생하는 단일 시점 측정치인 방법.
- 청구항 1에 있어서, BH3 프로파일, 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 결정하는 단계; 및 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘으로 AML 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시키는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, BH3 프로파일, 및 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화 상태, 및 BCL-2의 위치 70에서 세린의 인산화 중의 하나 이상을 결정하는 단계; 및 화학요법으로 MM 환자를 치료하는데 있어서의 효능과 상관시키는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암이 AML 및/또는 MM이고 임상 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암이 AML 및/또는 MM이고 암 치료가 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암 치료가 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고 임상 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암 치료가 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학요법 및/또는 아자시티딘이고; 암이 AML 및/또는 MM이고; 임상 인자가 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태인 방법.
- 환자의 투과된 암 세포를 하나 이상의 BH3 도메인 펩타이드와 접촉시키는 단계;
면역조직화학 및/또는 형광 동소 보합법(FISH)에 의해 환자의 암 세포의 하나 이상의 임상 인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 환자에 대한 암 치료를 결정하는 방법. - 환자의 AML 암 세포 표본에 대한 BH3 프로파일을 결정하는 단계;
환자의 하나 이상의 임상 인자를 결정하는 단계(여기서, 하나 이상의 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 세포유전학적 상태로부터 선택된다); 및
하나 이상의 암 치료에 대한 임상 반응의 가능성으로 환자를 분류하는 단계를 포함하여, 시타라빈 및/또는 아자시티딘에 대한 AML 환자 반응을 결정하는 방법. - 청구항 58에 있어서, 상기 BH3 프로파일을 결정하는 단계가 환자의 AML 암 세포 표본을 NOXA와 접촉시킴을 포함하는 방법.
- (a) 환자의 골수(BM) 샘플에서 NOXA 프라이밍을 결정하는 단계;
(b) 환자의 말초 혈액(PB) 샘플에서 BIM 0.1 프라이밍을 결정하는 단계;
(c) NOXA 프라이밍을 BIM 0.1 프라이밍과 비교하고, 환자를
(i) BM NOXA 프라이밍이 약 10.8% 초과이고 BM/PB BIM 0.1 프라이밍이 약 35% 미만인 경우 FLAM 후보자, 또는
(ii) BM NOXA 프라이밍이 약 10.8% 미만이고 BM/PB BIM 0.1이 약 15% 초과인 경우 7+3 후보자; 또는
(ii) BM NOXA가 약 10.8% 미만이고 BM/PB BIM 0.1이 약 35% 초과인 경우 7+3 후보자; 또는
(iv) BM NOXA 프라이밍이 10.8% 미만이고 BM/PB BIM 0.1이 약 15% 미만인 경우 다른 치료법을 위한 후보자로서 확인하는 단계를 포함하여, 사전-치료 AML 환자에서 암 치료 전략 간에 선택하는 방법. - (i) AML 환자로부터 수득된 골수 샘플에서 NOXA 프라이밍을 결정하는 단계, 및
(ii) NOXA 프라이밍이 약 11% 초과인 경우 환자가 FLAM에 대해 완전 반응을 가질 것으로 예측하는 단계를 포함하여, FLAM 섭생에 대해 완전 반응을 가질 것 같은 AML 환자를 확인하는 방법. - 청구항 61에 있어서, 상기 프라이밍이 다음의 방정식을 사용하여 계산되는 방법:
- 청구항 61에 있어서, (iii) FLAM 섭생으로 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 63에 있어서, 상기 완전 반응이 5% 미만의 골수아세포와 모든 세포주의 정상적인 성숙, ANC ≥ 1000/㎕ 및 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕, 말초 혈액 중의 아세포의 부재, 골수 중의 백혈병 세포의 부재, 질병과 관련된 세포유전학의 해소, 및 이전의 골수외 질병의 해소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 환자 반응을 포함하는 방법.
- 청구항 61에 있어서, 상기 NOXA 프라이밍이 서열번호 1을 포함하는 NOXA 펩타이드를 사용하여 결정되는 방법.
- 청구항 61에 있어서, 상기 NOXA 프라이밍이 서열번호 1로 이루어진 NOXA 펩타이드를 사용하여 결정되는 방법.
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