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KR20170122654A - 형광 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents

형광 화합물 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20170122654A
KR20170122654A KR1020170047199A KR20170047199A KR20170122654A KR 20170122654 A KR20170122654 A KR 20170122654A KR 1020170047199 A KR1020170047199 A KR 1020170047199A KR 20170047199 A KR20170047199 A KR 20170047199A KR 20170122654 A KR20170122654 A KR 20170122654A
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장수정
김기원
신경림
이봉규
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(주)바이오액츠
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Abstract

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00181

상기 [화학식 1]에서, X, Y, R1, R2, R3 및 n는 각각 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

형광 화합물 및 이의 제조방법{Fluorescence Compounds and Preparation Method Therof}
본 발명은 형광 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기를 포함하는 시아닌계 형광 화합물 및 이의 응용에 관한 것이다.
생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.
바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.
주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flowcytometer), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(qualitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.
일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.
상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.
바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.
이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.
특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점 외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.
그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVD±R 등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 480~500 nm 및 540~560 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다.
상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.
본 발명의 목적은 광학 및 pH 안정성 우수하고, 좁은 흡수 및 발광 파장의 범위를 가지면서도 600 내지 800 nm의 형광 영역에서 형광 강도가 더욱 향상되어 조영제 조성물로 이용할 수 있고, 특히 시아누릭 클로라이드 치환기를 도입하여 형광을 증진시킬 수 있는 형광 화합물, 상기 화합물의 제조방법 또는 상기 화합물의 응용을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물 및 이의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 [화학식 1]에서,
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
Figure pat00002
중에서 선택되며,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00003
중에서 선택되고,
R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00004
중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
Z1 및 Z2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0-6알킬아미닐기 및 아미노C0-6알킬 중에서 선택되는 치환기로 치환되고,
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, R1 및 R2 중 적어도 하나는
Figure pat00005
일 수 있고,
R3 및 R4 중 적어도 하나는 (CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00006
중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광화합물을 표지대상 물질에 표지하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형광 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 pH 안정성이 향상되었으며, 특히 시아누릭 클로라이드 치환기를 도입하여 종래 구조에 비하여 낮은 농도에서도 형광 강도가 향상되었으므로 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기 도입에 따른 광학성능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기 도입에 따른 광학성능을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 화합물을 생체분자에 표지하여 광학 성능 향상을 확인한 결과이다.
도 4는 화합물 20 및 대조형광염료의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 화합물 18 및 대조형광염료의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 화합물 20과 대조형광염료의 상대양자효율을 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 18과 대조형광염료의 상대양자효율을 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 화합물 18과 대조형광염료의 단백질 반응물(Conjugates) 간 형광강도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 FOBI를 활용한 형광강도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 화합물 20과 대조형광염료의 염료 반응량에 따른 표지율(D/P ratio)을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 화합물 20 및 대조형광염료의 단백질에 대한 표지시 염료 반응량에 따른 형광강도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 FOBI 레드 채널(Red channel)에서 이미징한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 화합물 20 및 대조형광염료의 표지율에 따른 형광강도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00007
상기 [화학식 1]에서,
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
Figure pat00008
중에서 선택되며,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00009
중에서 선택되고,
R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00010
중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
Z1 및 Z2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0 - 10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0 - 6알킬아미닐기 및 아미노C0 - 6알킬 중에서 선택되는 치환기로 치환되고,
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, R1 및 R2 중 적어도 하나는
Figure pat00011
일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, R3 및 R4 중 적어도 하나는 (CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00012
일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
Figure pat00013
중에서 선택되며,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00014
중에서 선택되고,
R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00015
중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
Z1 및 Z2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H 또는 N-숙신이미딜기이고,
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
p는 3 내지 7 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 4 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 R1 및 R2 중 적어도 하나는
Figure pat00016
이며,
R3 및 R4 중 적어도 하나는 -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00017
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 화합물 1 내지 화합물 20 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 두 개의 인돌 화합물을 분자 내 연속적인 이중결합을 가지는 불포화 탄화수소가 연결하고 있는 구조로, 탄소수(A)에 따라 CyA로 표기될 수 있다. 하기 화합물들에서는 Cy3, Cy5 및 Cy9 계열의 화합물만을 예시하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 Cy7, Cy11 및 Cy13 계열의 화합물을 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 q가 0 또는 3인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 q가 1 내지 6인 화합물을 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 r이 1 또는 5인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 r이 2 내지 10인 화합물도 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 p가 4, 6 또는 9인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 p가 1 내지 10인 화합물도 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 q 가 3인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 q가 1 내지 6인 화합물을 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 r 이 5인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 r이 2 내지 10인 화합물도 용이하게 합성하였다.
또한, 하기 화합물들에서는 상기 [화학식 1]의 정의에서 p 가 5인 화합물만을 예시하였으나 이에 제한되는 것은 아니며, 하기의 제조방법을 이용하여 p가 1 내지 10인 화합물도 용이하게 합성하였다.
화합물 1:
Figure pat00018
화합물 2:
Figure pat00019
화합물 3:
Figure pat00020
화합물 4:
Figure pat00021
화합물 5:
Figure pat00022
화합물 6:
Figure pat00023
화합물 7:
Figure pat00024
화합물 8:
Figure pat00025
화합물 9:
Figure pat00026
화합물 10:
Figure pat00027
화합물 11:
Figure pat00028
화합물 12:
Figure pat00029
화합물 13:
Figure pat00030
화합물 14:
Figure pat00031
화합물 15:
Figure pat00032
화합물 16:
Figure pat00033
화합물 17:
Figure pat00034
화합물 18:
Figure pat00035
화합물 19:
Figure pat00036
화합물 20:
Figure pat00037
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물은 종래의 시아닌계열 염료 화합물에 비하여 낮은 농도 처리에도 향상된 강도의 형광을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물은 근적외 영역인 500 내지 700 nm의 좁은 영역의 파장을 흡수하며, 600 내지 800 nm의 파장에서 향상된 강도의 형광을 나타낸다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물은 섬유, 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물과 같은 표지대상 물질에 표지될 수 있다.
상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표지대상 물질은 물리적 또는 화학적으로 개질되지 않은 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 물리적 또는 화학적으로 개질시킨 것일 수도 있다. 상기 물리적 또는 화학적 개질은 실험자의 요구에 따른 개질일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물이 용이하게 표지되도록 개질한것 일 수 있다.
본 발명에 따르면, 표지대상 물질에 표지하기 위하여 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 정의 R1 또는 R2의 -(CH2)mCOOH 또는
Figure pat00038
말단의 -COOH의 수소원자는 비치환하거나 또는 표지대상 물질 구조에 존재하는 기능기와 결합될 수 있는 치환기로 개질된 것도 상기 [화학식 1]의 범위에 포함된다. 상기 기능기와 결합될 수 있는 치환기는 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0 - 10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0 - 6알킬아미닐기 및 아미노C0 - 6알킬 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 상기 [화학식 1]의 화합물이 상기 예시된 치환기들로 치환되면, 섬유, 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물과 같은 표지대상 물질에 표지시키는데 좀더 용이할 수 있다. 상기 표지대상 물질에 존재하는 기능기들은 아민기, 수산화기 또는 티올기일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물을 표지하는 방법으로는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 [화학식 1]의 화합물과 상기 생체 분자, 나노입자 또는 유기화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.
생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 [화학식 2]의 화합물로부터 제조할 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00039
[화학식 1]
Figure pat00040
상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
Figure pat00041
중에서 선택되며,
R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00042
중에서 선택되고,
R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
Figure pat00043
중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
R5 및 R6은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
Figure pat00044
중에서 선택되며,
R7 및 R8은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, -(CH2)mCOOH 및
Figure pat00045
중에서 선택되며,
n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q는 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 반응은 수용액 상에서 수행될 수 있으며, 반응성을 향상시키기 위하여 탄산수소나트륨과 같은 염기를 더 첨가하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 [화학식 2]의 화합물은 하기 [화학식 3]을 시아누릭클로라이드와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00046
상기 [화학식 3]에서, X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
Figure pat00047
중에서 선택되며,
R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬 및
Figure pat00048
중에서 선택된다.
본 발명에 따른 상기 반응은 저온의 물 또는 유기용매 하에서 수행하는 것이 바람직하며, 반응시 탄산수소나트륨과 같은 염기를 첨가하여 수행할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 [화학식 3]의 화합물은 각각 하기 [화학식 4]의 화합물을 아민C0 - 6알킬아미닐기로 치환시켜 제조될 수 있다.
[화학식 4]
Figure pat00049
상기 [화학식 4]에서,X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R13 및 R14는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
Figure pat00050
중에서 선택되며,
R15 및 R16은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬 및
Figure pat00051
중에서 선택된다.
상기 아민C0 - 5알킬아미닐기에서 탄소수가 0인 아민C0알킬아미닐은 히드라지닐(-NHNH2)을 의미한다. 상기 아민C0 - 5알킬아미닐기로 치환하는 방법은 통상의 아민C0 - 5알킬아미닐기 치환방법을 이용할 수 있다.
예를 들어, 히드라지닐기를 도입하는 경우에는 상기 [화학식 4]를 휘니그 베이스 존재하의 유기용매 상에서 DSC(N,N'-디숙신이미딜 카보네이트)를 첨가하여 반응시킨 다음, 터셔리-부틸 카바제이트와 반응시킨 다음, 터셔리부톡시 카보닐 그룹을 제거하여 제조될 수 있다.
한편, 아민C0 - 5알킬아미닐를 도입하는 경우에는 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오보레이트와 같이, 한쪽 아민이 보호기로 보호된 아민알킬아미닐 전구체를 사용하여 반응에 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 상기 [화학식 4]의 화합물은 하기 [화학식 5]의 화합물을 하기 [화학식 6]의 화합물과 무수아세트산을 포함하는 용매 하에서 환류시켜 제조될 수 있다.
[화학식 5]
Figure pat00052
[화학식 6]
Figure pat00053
상기 [화학식 5] 또는 [화학식 6]에서,
X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
R13 및 R14는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
Figure pat00054
중에서 선택되며,
R15 및 R16은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬 및
Figure pat00055
중에서 선택된다.
상기 반응은 반응성 향상을 위해 무수아세트산에 트리에틸아민과 같은 베이스 및 유기용매를 더 첨가하여 반응시키거나 또는 무수아세트산에 피리딘을 더 첨가하여 반응을 수행할 수도 있다.
본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물을 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물은 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기가 시아닌 발색단에 치환된 구조로, 종래의 시아닌 염료에 비하여 파장 범위가 좁으면서도 낮은 농도에서 높은 형광 강도를 나타내면서, 세포 독성이 없다. 본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 500 내지 700 nm의 좁은 영역의 파장을 효과적으로 흡수하면서, 600 내지 800 nm의 좁은 파장 영역에서 현저히 향상된 형광강도를 나타내므로, 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 생체 내 영상화용 조영제로 유용하게 적용할 수 있다.
본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물과 표지대상 물질을 결합시키는 단계를 포함하는 화합물 표지방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 표지 대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자 또는 유기화합물 중에서 선택될 수 있으며, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]의 화합물은 단백질과 [화학식 1]의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.
따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 [화학식 1]의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.
한편, 생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 수용성 조건에서 높은 안정성을 가져 장시간 보관이 용이할 뿐 아니라, 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.
이하, 본 발명의 이해를 독기 위하여 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
합성된 화합물들의 분석을 위하여 FT-NMR 분광 분석은 Bruker사의 Avance 300 또는 500을 사용하였고, LC/MS는 Agilent사의 LC/MSD (G-1956B)을 사용하여 측정하였다.
합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Agilent사의 Cary 8454 UV-VIS를 사용하여 측정하였고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 측정하였다.
화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였다. TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) (PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO4 발색제를 사용하여 확인하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 기기인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18 (40 내지 63 m, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다.
제조예 1
Figure pat00056
1 단계
p-히드라지노벤젠설폰산(p-hydrazinobenzenesulfonic acid) (10 g, 53 mmol, 1 eq, Aldrich)과 3-메틸-2-부탄온(3-methyl-2-butanone) (17.18 mL, 160 mmol, 3.02 eq, TCI)에 아세트산 30 mL에 가한 후, 4 시간 동안 가열 환류하며 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 3회 세정한 후 감압 건조시켰다(11.34 g, 89%).
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
2 단계
수산화칼륨(1.427 g, 25.4 mmol, 1.2 eq)을 프로판올 35 mL에 용해시키고, 1 단계에서 얻은 화합물(5.073 g, 21.2 mmol, 1 eq)을 메탄올 35 mL에 용해시켜 가한 후, 상온에서 24 시간 교반 후, 여과하여 목적하는 화합물을 얻었다(5.35 g, 90%).
Rf = 0.68 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.60 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.32 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 7.99 Hz), 2.08 (s, 3H), 1.06 (s, 6H)
제조예 2.
Figure pat00057
제조예 1의 화합물(2.774 g, 10 mmol, 1 eq)과 6-브로모-n-헥사노익산(6-bromo-n-hexanoic acid) (2.34 g, 12 mmol, 1.2 eq, Aldrich)을 15 mL의 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene)에 용해시켜 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 가한 다음 여과하고 감압 건조하여 목적하는 화합물을 얻었다(2.653 g, 75%).
Rf = 0.08 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (400 MHz, D2O) :δ 8.00 (s, 1H), 7.90 (d, 1H, J = 8.86 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.43 Hz), 4.37 (t, 2H, J = 7.46 Hz), 2.25 (t, 2H, J = 7.01 Hz), 1.85 (m, 2H), 1.57-1.26 (m, 13H)
LC/MS, 계산치 C17H23NO5S 353.43, 측정치 354.18
제조예 3
Figure pat00058
제조예 1의 화합물(1.66 g, 6 mmol, 1 eq)과 8-브로모-옥타노익산(8-bromooctanoic acid) (1.34 g, 6 mmol, 1 eq, Aldrich)을 30 mL의 1,2-디클로로벤젠(1,2-dichlorobenzene)과 12시간 동안 가열 환류시켰다. 상온 냉각 후 용매를 제거하고, 이소프로필알콜(isopropyl alcohol)을 가하고, 여과하여 감압 건조시켜 목적하는 화합물을 얻었다(1.85 g, 81%).
Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)
실시예 1. 화합물 1의 제조
실시예 1.1
Figure pat00059
제조예 1의 화합물(20 g, 72.1 mmol, 1 eq)에 에틸 아이오다이드(ethyl iodide) (110 mL, 1,375 mmol, 19 eq, TCI)를 가한 후 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후, 잔여 에틸 아이오다이드를 제거하고, 50 mL의 아세톤으로 3회 세정한 다음 여과하고, 40℃에서 감압 건조시켜 목적하는 화합물을 얻었다(18.37 g, 95%).
Rf = 0.18 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (400 MHz, D2O) : δ 7.99 (s, 1H), 7.88 (d, 1H, J = 8.23 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 8.46 Hz), 4.43 (m, 2H), 1.52-1.40 (m, 12H)
LC/MS, 계산치 C13H17NO3S 267.34, 측정치 268.16
실시예 1.2
Figure pat00060
실시예 1.1의 화합물(16 g, 59.8 mmol, 1 eq)과 N,N'-디페닐포름아미딘(N,N'-Diphenylformamidine) (13.2 g, 67.3 mmol, 1.125 eq, TCI)를 40 mL의 아세트산과 40 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고, 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고 용매를 제거한 후, 에틸아세테이트를 가하여 고체를 생성시켰다. 다음으로 여과한 후 감압건조하여 목적하는 화합물을 얻었다(12.97 g, 57%).
Rf = 0.25 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 7.85 (s, 1H), 7.70 (dd, 1H, J = 1.35 Hz, 1.32 Hz), 7.53-7.45 (m, 7H), 7.29 (dd, 1H, J = 1.92 Hz, 6.66 Hz), 4.13 (m, 2H), 1.70 (s, 6H), 1.32 (t, 3H, J = 7.05 Hz)
LC/MS, 계산치 C20H22N2O3S 370.47, 측정치 370.98
실시예 1.3
Figure pat00061
실시예 1.2의 화합물(1.01 g, 2.429 mmol, 1 eq)과 제조예 2의 화합물(0.86 g, 2.429 mmol, 1 eq)을 5 mL의 무수 아세트산과 5 mL의 피리딘(Pyridine) 혼합 용액에 넣은 후 110℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 첨가하여 결정화시킨 다음 여과하고 감압 건조하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(0.37 g, 24%).
Rf = 0.70 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 8.38 (t, 1H, J = 13.5 Hz), 7.78 (s, 2H), 7.73 (t, 2H, J = 7.42 Hz), 7.23 (dd, 2H, J = 5.25 Hz, 7.97 Hz), 6.24 (dd, 2H, J = 4.79 Hz, 4.56 Hz), 3.97 (m, 4H), 2.23 (t, 2H, J = 7.26 Hz), 1.73-1.20 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C31H38N2O8S2 630.77, 측정치 631.31
λabs(물) : 549 nm, λfl(물) : 573 nm
실시예 1.4
Figure pat00062
실시예 1.3의 화합물(963 mg, 1.53 mmol, 1eq)을 DMF(디메틸포름아미드) 80 mL에 용해시키고 40℃로 승온하였다. 휘니그 베이스 2.7 mL를 가하고 DSC(1.17 g, 4.58 mmol, 3 eq, Aldrich)를 반응액에 투입하였다. 1시간 동안 교반하고, 에틸아세테이트를 가하여 적갈색의 고체를 얻고, 에틸아세테이트, 에테르(ether)로 여러 번 세척하여 여과하였다. 세척된 고체를 DMF 70 mL에 녹이고 터셔리-부틸 카바제이트(tert-butyl carbazate) (303 mg, 2.29 mmol, 1.5 eq, TCI)를 투입한 후 휘니그 베이스 2.7 mL 를 가하여 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 에틸아세테이트를 가하여 적갈색의 고체를 얻고, 여과 및 감압 건조한 다음, 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(407 mg, 35.8 %).
Rf = 0.65 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 1.5
Figure pat00063
실시예 1.4의 화합물(400 mg, 0.54 mmol, 1 eq)에 클로로포름 5 mL, TFA 12 mL 및 물 5 mL를 투입하였다. 상온에서 12시간 교반한 후 반응 혼합액을 감압증류하여 적갈색의 고체를 얻었다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(130 mg, 37.3 %).
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 1.6
Figure pat00064
시아누릭 클로라이드(Cyanuric chloride) (17 mg, 0.093 mmol, 1 eq, Aldrich)을 물 10 mL에 투입하여 0℃로 냉각한 후 30분간 교반하였다. 온도를 유지하며 실시예 1.5의 화합물(60 mg, 0.093 mmol, 1 eq)을 첨가하여 10분간 교반하였다. 다음으로 반응 혼합액에 탄산수소나트륨 15 mg를 첨가한 후 온도를 0℃로 유지하며 2시간 동안 반응하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(34 mg, 46.1 %).
Rf = 0.6 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 1.7. 화합물 1의 합성
Figure pat00065
실시예 1.6의 화합물(50 mg, 0.063 mmol, 1 eq)을 물 3 mL 에 완용시킨 후 글리신(14 mg, 0.189 mmol, 3 eq)을 첨가하여 10분간 교반한 다음, 탄산수소나트륨 15 mg을 첨가하여 12시간 동안 교반하였다. 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물 1을 얻었다(32 mg, 61 %).
Rf = 0.5 (Silicagel, 아세토니트릴/물 9:1 v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C36H43ClN8O9S2 831.36, 측정치 831.12
이하, 실시예 2 내지 10에서는 별도의 기재가 없는 한, 실시예 1과 동일 또는 유사한 방법으로 목적하는 화합물을 합성하였다.
실시예 2. 화합물 2의 제조
실시예 2.1
Figure pat00066
제조예 1의 화합물에 메틸아이오다이드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1와 동일한 방법으로 목적하는 화합물을 합성하였다(13.45 g, 82%).
Rf = 0.13 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
실시예 2.2
Figure pat00067
실시예 1.1의 화합물 대신에 실시예 2.1의 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2와 동일한 방법으로 목적하는 화합물을 합성하였다(6.48 g, 52%).
Rf = 0.33 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
실시예 2.3
Figure pat00068
(0.94 g, 27%)
Rf = 0.80 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, D2O) : δ 7.95 (m, 1H), 7.84-7.62 (m, 4H), 7.46 (d, 2H, J = 7.89 Hz), 6.51 (d, 2H, J = 8.22 Hz), 4.41 (t, 2H, J = 8.07 Hz), 3.56 (s, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.70-1.24 (m, 18H)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C30H36N2O8S2 616.75, 측정치 617.53
λabs (물) : 546 nm, λfl (물) : 570 nm
실시예 2.4
Figure pat00069
(820 mg, 51.9 %)
Rf = 0.7 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 2.5
Figure pat00070
(450 mg, 65.2 %)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 2.6
Figure pat00071
(183 mg, 33.0%)
Rf = 0.6 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 2.7. 화합물 2의 합성
Figure pat00072
(41 mg, 39.1%)
Rf = 0.4 (Silicagel, 아세토니트릴/물 9:1 v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C35H41ClN8O9S2 817.33, 측정치 817.02
실시예 3. 화합물 3의 제조
실시예 3.1
Figure pat00073
(19.81 g, 98%)
Rf = 0.45 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
실시예 3.2
Figure pat00074
(10.28 g, 85%)
Rf = 0.10 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
실시예 3.3
Figure pat00075
(3.06 g, 20.6%)
Rf = 0.49 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8.34 (t, 1H, J = 13.2 Hz), 7.78 (s, 2H), 7.65 (d, 2H, J = 8.04 Hz), 7.39 (m, 2H), 6.56 (dd, 2H, J = 13.16 Hz, 13.44 Hz), 4.10 (m, 4H), 1.88 (t, 2H, J = 6.88 Hz), 1.77-1.38 (m, 21H), 0.96 (t, 3H, J = 7.24 Hz)
LC/MS, 계산치 C32H40N2O8S2 644.8, 측정치 643.29
λabs (물) : 550 nm, λfl (물) : 574 nm
실시예 3.4
Figure pat00076
(625 mg, 39.8%)
Rf = 0.65 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 3.5
Figure pat00077
(373 mg, 70.4 %)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 3.6
Figure pat00078
(300 mg, 70.0%)
Rf = 0.7 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 3.7. 화합물 3의 합성
Figure pat00079
(61 mg, 38.8%)
Rf = 0.6 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C37H45ClN8O9S2 845.38, 측정치 845.48
실시예 4. 화합물 4의 제조
실시예 4.1
Figure pat00080
실시예 2.2의 화합물과 제조예 3의 화합물을 사용하여 실시예 1.3의 방법으로 목적하는 화합물을 얻었다(0.85 g, 22%).
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)
실시예 4.2
Figure pat00081
(655 mg, 37.1 %)
Rf = 0.65 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 4.3
Figure pat00082
(470 mg, 86.0 %)
Rf = 0.6 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 4.4
Figure pat00083
(242 mg, 45.9 %)
Rf = 0.65 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 4.5
Figure pat00084
(52 mg, 33.1%)
Rf = 0.45 (Silicagel, 아세토니트릴/물 9:1 v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C37H45ClN8O9S2 845.38, 측정치 845.52
실시예 5. 화합물 5의 제조
실시예 5.1
Figure pat00085
(0.31 g, 25%)
Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)
LC/MS, 계산치 C33H42N2O8S2 658.83, 측정치 656.9
실시예 5.2
Figure pat00086
(603 mg, 38.7 %)
Rf = 0.60 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 5.3
Figure pat00087
(396 mg, 75.8%)
Rf = 0.45 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 5.4
Figure pat00088
(155 mg, 33.4%)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 5.5
Figure pat00089
(23 mg, 21.9%)
Rf = 0.45 (Silicagel, 아세토니트릴/물 9:1 v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C38H47ClN8O9S2 859.41, 측정치 859.57
실시예 6. 화합물 6의 제조
실시예 6.1
Figure pat00090
(2.09 g, 31%)
Rf = 0.52 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)
LC/MS, 계산치 C34H44N2O8S2 672.85, 측정치 671.04
실시예 6.2
Figure pat00091
(510 mg, 40.1 %)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 6.3
Figure pat00092
(126 mg, 73.0 %)
Rf = 0.45 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 6.4
Figure pat00093
(88mg, 36.2%)
Rf = 0.50 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 6.5
Figure pat00094
(36mg, 41.5%)
Rf = 0.45 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 7. 화합물 7의 제조
실시예 7.1
Figure pat00095
실시예 1.1의 화합물(2.2 g, 8.23 mmol, 1 eq)과 말론알데히드 디아닐리드 하이드로클로라이드(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride) (2.55 g, 9.88 mmol, 1.2 eq, TCI)를 10 mL의 아세트산과 10 mL의 무수 아세트산 혼합 용액에 넣고 4 시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시키고, 반응액을 제거한 후 에틸아세테이트로 고체를 생성시켜 여과하고 감압 건조하여 목적하는 화합물을 얻었다(3.47 g, 96%).
Rf = 0.20 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)
실시예 7.2
Figure pat00096
실시예 7.1의 화합물(6.40 g, 14.6 mmol, 1 eq)과 제조예 2의 화합물(5.12 g, 14.6 mmol, 1 eq)을 80 mL의 피리딘에 넣은 후 60℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각시키고, 에틸아세테이트를 가하여 청색의 고체를 생성시킨 후, 여과하고 감압 건조시켰다. 25% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(2.09 g, 22%).
Rf = 0.58 (RP-C18, 아세토니트릴/물 3:7 v/v)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 8.34 (t, 2H, J = 13.2 Hz), 7.80 (s, 2H), 7.63 (d, 2H, J = 8.16 Hz), 7.30 (dd, 2H, J = 2.80 Hz, 2.76 Hz), 6.58 (t, 1H, J = 12.2 Hz), 6.30 (dd, 2H, J = 8.64 Hz, 8.56 Hz), 4.13-4.06 (m, 4H), 1.98 (t, 2H, J = 6.84 Hz), 1.72-1.18 (m, 21H)
LC/MS, 계산치 C33H39N2O8S2- 655.22, 측정치 655.24
λabs (물) : 647 nm, λfl (물) : 678 nm
실시예 7.3
Figure pat00097
(200 mg, 28.4%)
Rf = 0.7 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 7.4
Figure pat00098
(150 mg, 86%)
Rf = 0.56 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 12:1 v/v)
실시예 7.5
Figure pat00099
(15 mg, 61.5%)
Rf = 0.59 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 7.6
Figure pat00100
(10 mg, 63.7%)
Rf = 0.1 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 12:1 v/v)
실시예 8. 화합물 8의 제조
실시예 8.1
Figure pat00101
(0.52 g, 6.75%)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 8.2
Figure pat00102
(250 mg, 30.5%)
Rf = 0.65 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 8.3
Figure pat00103
(150 mg, 68.6%)
Rf = 0.65 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 8:1 v/v)
실시예 8.4
Figure pat00104
(200 mg, 59.2%)
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 8.5
Figure pat00105
(25 mg, 20.6%)
Rf = 0.475 (Silicagel, 아세토니트릴/물 = 12:1 v/v)
실시예 9. 화합물 9의 제조
실시예 9.1
Figure pat00106
에틸 2-메틸 아세토아세테이트(Ethyl 2-Methyl Acetoacetate) (29.2 ml, 0.203 mol, 1eq)와 21% 나트륨 이소라이드 용액(21% Sodium Ethoride Solution) (64 ml, 0.816 mol, 4 eq), 에틸 6-프로모헥사노에이트(Ethyl 6-Bromohexanoate) (34ml, 0.192 mol, 1 eq), 에탄올(Ethanol) (200 ml)을 첨가한 뒤 120℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 그 후 용매를 1M 염산을 이용하여 pH를 중성으로 중화시킨 뒤 클로로포름과 증류수를 이용하여 추출하였다. 추출한 용매를 감압 건조시킨 뒤 정상 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(36.8g, 63.4%).
Rf = 0.34 (Silicagel, 헥산/에틸아세테이트 = 10:1 v/v)
실시예 9.2
Figure pat00107
실시예 9.1의 화합물(13.7 g, 0.0486 mol, 1 eq)에 수산화나트륨(6.2 g, 0.170 mol, 3.5 eq), 메탄올(Methanol) (47.2 ml), 증류수(15.6 ml)를 첨가한 뒤 50℃에서 12시간 동안 환류시켰다. 그 후 용매를 감압 건조한 뒤 1M 염산을 이용하여 pH를 1로 맞춘 뒤 에틸아세테이트를 이용하여 추출 후 감압건조 하여 목적하는 화합물을 얻었다. (8.17g, 90.7%)
Rf = 0.05 (Silicagel, 헥산/에틸아세테이트 = 10:1 v/v)
실시예 9.3
Figure pat00108
실시예 9.2의 화합물(8.165 g, 0.0438 mol, 1 eq)에 p-하이드라지노벤젠설포닉 산(p-Hydrazinobenzensulfonic Acid Hemihydrate) (8.25 g, 0.0438 mol, 1 eq), 아세트산를 첨가한 뒤 120℃에서 5시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후 감압건조한 뒤 정상 크로마토그래피법을 이용하여 정제하였다(12.6g, 84.8%).
Rf = 0.51 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 9.4
Figure pat00109
실시예 9.3의 화합물(12.57 g, 0.037 mol, 1 eq)에 아세트산 나트륨(4.16 g, 0.061 mol, 1.65 eq), 1,3-프로판설톤(1,3-Propane Sultone) (21.3 ml, 0.243 mol, 6.57 eq), 아세토니트릴(24.8 ml)을 첨가한 뒤 110℃에서 5시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후 감압건조 한 뒤 역상 크로마토그래피법을 이용하여 정제하였다. (12 g, 70.6%)
Rf = 0.3 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 9.5
Figure pat00110
제조예 1의 화합물(50 g, 0.18 mol, 1 eq)에 소듐아세테이트(Sodium Acetate) (17.87 g, 0.216 mol, 1.2 eq), 1,3-프로판설톤(1,3-Propane Sultone) (70.5 ml, 0.8 mol, 4.5 eq), 아세토니트릴(42 ml)을 첨가하였다. 그 뒤 110℃에서 12시간 동안 환류시킨 뒤 에틸아세테이트를 이용하여 결정화시키고, 여과하여 감압 건조하였다(61 g, 94%).
Rf = 0.3 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 9.6
Figure pat00111
실시예 9.5의 화합물(60 g, 0.166 mol, 1 eq)에 말론알데히드 디아닐리드 하이드로클로라이드(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride) (42.9 g, 0.166 mol, 1 eq), 트리에틸아민(Triethylamine) (2.3 ml, 0.016 mol, 0.1 eq), 아세트산(551 ml)을 첨가한 뒤 140℃에서 환류시켰다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트를 이용하여 결정화시키고, 여과 및 감압 건조한 다음, 정상 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 정제하였다(7.5 g, 8.5%).
Rf = 0.55 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
실시예 9.7
Figure pat00112
실시예 9.4의 화합물(6.5 g, 0.014 mol, 1 eq)과 실시예 9.6의 화합물(7.5 g, 0.014 mol, 1 eq)을 트리에틸아민(16.6 ml, 0.12 mol, 8.5 eq)과 무수 아세트산 (7.3 ml), DMF (75ml) 혼합용액에 첨가한 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 에틸아세테이트로 결정화시킨 뒤, 여과 및 감압 건조하고 정상 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 정제하였다(250 mg, 2%).
Rf = 0.4 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C36H44N2Na2O14S4 902.98, 측정치 901
실시예 9.8
Figure pat00113
실시예 9.7의 화합물(100 mg, 0.1165 mmol, 1 eq)과 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플로오로보레이트(TSTU; N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate) (77 mL, 0.2563 mmol, 2.2 eq), 트리에틸아민(125 , 0.897 mmol, 7.7 eq)을 DMF 10 mL에 가한 후, 40분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 고체 입자를 여과하여 에틸아세테이트로 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 건조된 화합물과 1,3-다이아미노프로판(1,3-Diaminopropane) (9.72 , 0.1165 mmol, 1 eq)을 DMF 10 mL에 용해시킨 후, 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 생성된 고체 입자를 여과하였다. 에틸아세테이트로 3회 세정한 후 감압 건조시켰다. 그 후 10% 아세토니트릴 조건으로 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(91 mg, 86%).
Rf = 0.34 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C39H54N4NaO13S4 937.11, 측정치 934.8
실시예 9.9
Figure pat00114
시아누릭 클로라이드(55 mg, 0.2996 mmol, 3 eq)을 증류수 5 ml와 얼음 10 g에 넣은 후 0℃에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 실시예 9.8의 화합물(91 mg, 0.0999 mmol, 1eq)과 탄산수소나트륨 5 mg를 첨가하여 온도를 0℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 동결건조한 다음 20% 아세토니트릴 전개액 조건으로 RP-C18 역상 크로마토그래피를 진행하여 목적하는 화합물을 얻었다(14 mg, 13%).
Rf = 0.49 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C42H52Cl2N7O13S4 1062.07, 측정치 1061.4
실시예 9.10
Figure pat00115
실시예 9.9의 화합물(7 mg, 0.0066 mmol, 1 eq), 글리신(1.5 mg, 0.0198 mmol, 3 eq), 탄산수소나트륨(1 mg, 0.0132 mmol, 2 eq)을 증류수 500㎕에 용해한 후, 12시간 동안 상온에서 반응하였다. 반응 종료 후, 동결건조한 뒤, 10% 아세토니트릴 전개액 조건으로 역상 크로마토그래피를 진행하여 화합물 9를 얻었다(1 mg, 14%).
Rf =0.31 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
LC/MS, 계산치 C44H54ClN8Na3O15S4 1167.63, 측정치 1167.2
실시예 10. 화합물 10의 제조
Figure pat00116
실시예 9.9의 화합물(15 mg, 0.014 mmol, 1 eq)와 6-아미노헥사노익산(6-Aminohexanoic acid) (9.27 mg, 0.0707 mmol, 5 eq), 탄산수소나트륨(4.7 mg, 0.056 mmol, 4 eq)을 증류수 2 mL에 용해시킨 다음, 12시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응종료 후, 동결건조 하고, 10% 아세토니트릴 전개액 조건으로 역상 크로마토그래피를 진행하여 화합물 10을 얻었다(1.8 mg, 11%).
Rf = 0.48 (Silicagel, 이소부탄올/n-프로판올/에틸아세테이트/물 2:4:1:3 v/v/v/v)
MALDI-TOF M/S, 계산치 C48H65ClN8O15S4 1157.79, 측정치 1157.4
실시예 11. 화합물 11의 제조
Figure pat00117
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 11을 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C45H67ClN8O9S2 999.68, 측정치 998.4
실시예 12. 화합물 12의 제조
Figure pat00118
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 12를 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C41H53ClN8O9S2 901.49, 측정치 900.3
실시예 13. 화합물 13의 제조
Figure pat00119
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 13을 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C43H51ClN8O9S2 923.50, 측정치 922.3
실시예 14. 화합물 14의 제조
Figure pat00120
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 14를 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C43H54ClN8O15S4 1086.65, 측정치 1085.2
실시예 15. 화합물 15의 제조
Figure pat00121
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 15를 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C51H63ClN14O15S3 1279.23, 측정치 1277.3
실시예 16. 화합물 16의 제조
Figure pat00122
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 16을 얻었다.
MALDI-TOF M/S, 계산치 C39H47ClN8O9S2 871.42, 측정치 870.2
실시예 17. 화합물 17의 제조
실시예 17. 1
Figure pat00123
상기 실시예들과 유사한 방법으로 목적하는 화합물을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C34H44N2O14S4 832.98, 측정치 831.1
실시예 17.
Figure pat00124
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 17을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C38H47N3O16S4 930.05, 측정치 929.8
실시예 18. 화합물 18의 제조실시예 18.1
실시예 18.1
Figure pat00125
상기 실시예들과 유사한 방법으로 목적하는 화합물을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C46H63ClN8O15S4 1130.3, 측정치 1131.5
실시예 18.2
Figure pat00126
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 18을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C50H66ClN9O17S4 1228.82, 측정치 1226.3
실시예 19. 화합물 19의 제조
실시예 19.1
Figure pat00127
상기 실시예들과 유사한 방법으로 목적하는 화합물을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C36H46N2O14S4 859.02, 측정치 858.3
실시예 19.2
Figure pat00128
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 19를 얻었다.
LC/MS, 계산치 C40H49N3O16S4 956.09, 측정치 954.3
실시예 20. 화합물 20의 제조
실시예 20.1
Figure pat00129
상기 실시예들과 유사한 방법으로 목적하는 화합물을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C48H65ClN8O15S4 1157.79, 측정치 1156.0
실시예 20.2
Figure pat00130
상기 실시예들과 유사한 방법으로 화합물 20을 얻었다.
LC/MS, 계산치 C52H68ClN9O17S4 1253.33, 측정치 1253.3
비교예 1.
Figure pat00131
실시예 7.5의 화합물(50 mg, 0.061 mmol, 1 eq)을 물 3 mL 에 완용시킨 후 실시예 7.4의 화합물(82 mg, 0.122 mmol, 2 eq)을 첨가하여 10분간 교반한 후 탄산수소나트륨 15 mg을 추가하고 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 15% 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다(37 mg, 42 %).
Rf = 0.6 (Silicagel, 아세토니트릴/물 9:1 v/v)
시험예 1.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 시아닌 구조의 카르복시알킬 잔기에 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기를 도입함으로써 종래의 시아닌 구조의 화합물에 비하여 형광 강도가 크게 향상되었다.
본 발명의 [화학식 1]에 따라 시아누릭 클로라이드에 아미노알킬카르복시산이 결합된 치환기가 도입된 화합물을 합성하고 이들의 광학적 성능을 비교하였다. 아미노알킬카르복시산으로 글리신(Glycine)을 합성에 이용하여 본 발명에 따른 화합물 1(실시예 1.7)을 합성하였으며, 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기가 도입되지 않은 화합물(실시예 1.3)과 광학성능을 비교하였다.
동일한 농도에서 실시예 1.7 및 실시예 1.3의 화합물의 흡수파장 및 강도를 각각 측정하여 하기 도 1a에 나타내었다. 흡수파장 강도는 실시예 1.3의 화합물이 다소 높은 경향을 나타내었다. 정확한 형광파장 강도를 비교하기 위하여 동일한 흡수 강도를 가지도록 실시예 1.7 및 실시예 1.3의 화합물의 농도를 보정한 후, 형광파장 및 강도를 측정하여 하기 도 1b에 나타내었다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기가 도입된 시아닌계 화합물(실시예 1.7)은 알킬카르복시아미노 시아누릭 클로라이드 치환기가 도입되지 않은 시아닌계 화합물(실시예 1.3)에 비하여 형광파장의 강도가 2배 가까이 현저하게 증가된 것을 확인하였다.
시험예 2.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물이 생체분자에 표지 가능하게 개질하였을 때의 광학적 성능 변화를 확인하기 위하여 화합물 9.7 및 화합물 10에 N-succinimidyl기를 도입하여 상기 실시예에 제시된 방법으로 각각 화합물 19 및 화합물 20을 합성하였으며, 동일한 흡광파장 강도에서 형광 특성을 비교하였다.
동일 흡광 파장 및 강도에서 형광특성 비교
상온에서 화합물 19 및 화합물 20을 각각 PBS 5 mL에 10 mg/ml의 농도로 5 을 첨가하여 시료를 제조하였다. 다음으로 각각의 시료 2 mL에 PBS 1 mL씩 추가한 뒤 흡광파장에 따른 강도를 측정하였다. 상기 얻은 데이터로부터 화합물 19와 화합물 20의 흡광 강도가(Abs at 650 nm)이 동일하도록 시료의 농도를 조절한 뒤, 여러 번 희석하여 Perkin Elmer, Plate reader로 형광값을 측정하였으며, 3회 측정하여 평균을 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 표 1은 화합물 19의 농도에 따른 형광강도이며, 표 2는 화합물 20의 농도에 따른 형광강도 결과이다.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물 20은 화합물 19에 비하여 형광강도가 현저히 상승되는 것을 확인하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 농도의 증가에 따라 형광 강도의 차이는 더욱 크게 벌어졌으며, 7 M 농도에서는 약 40 % 가량이 증가된 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해, 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 생체분자 표지를 위한 개질에 의해서도 현저하게 향상된 형광성이 유지되는 것을 증명하였다.
농도(nM) 평균 형광강도(at 665 nm) 스탠다드
6280 308345.7 6239.5
3140 240494.7 5760.9
1570 160778.3 2481.3
785 91308.7 1273.9
393 48611.7 1555.6
196 24679.7 11.5
98 12523.0 205.9
49 6483.7 129.6
25 3336.7 49.6
12 1673.0 34.8
6 810.7 48.2
3 412.0 11.2
농도(nM) 평균 형광강도(at 665 nm) 스탠다드
6280 418428.3 10381.1
3140 321865.0 7104.5
1570 209850.3 6726.9
785 118049.0 4875.9
393 59756.7 2979.6
196 29396.3 1713.1
98 13859.7 1097.1
49 6693.3 443.8
25 2994.3 278.8
12 1454.7 137.8
6 721.3 78.8
3 313.3 64.1
시험예 3.
본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물을 인-비트로 상에서 생체분자에 표지하여 형광 특성을 평가하였다.
산도 9.0의 0.1 M 인산염-탄산염 완충용액에 쥐의 면역세포에서 추출한 단클론성항체 면역글로불린 G를 2 mg/mL의 농도로 용해하여 튜브에 100㎕씩 분주하여 6개의 샘플을 준비하였다. 화합물 19와 화합물 20을 각각 디메틸포름아미드에 용해하여 10 mg/mL의 농도로 준비하고, 상기 6개의 샘플 튜브에 화합물 19와 화합물 20을 각각 2.0, 2.5 및 3.0 L 씩 첨가하여 상온에서 60 분간 교반하여 표지시켰다.
표지 반응이 완료된 각 항체 용액을 덱스트란 컬럼으로 정제하고 동일한 항체 농도로 맞춘 후, 각 표지 항체 용액별 형광 스펙트럼의 측정하여 형광염료 첨가량에 따른 형광강도 변화를 비교하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, 화합물 20을 면역글로불린 G에 표지했을 경우 화합물 19 보다 평균 32 % 가량 형광 강도가 증가함을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 [화학식 1]의 화합물은 생체 분자에 표지하여도 종래 구조에 비하여 형광강도가 현저히 향상시킬 수 있다.
시험예 4. 화합물의 광학특성 평가
(1) 형광강도 비교 - 650 파장 염료
화합물 20과 대조형광염료(Alexa Fluor 647 NHS ester)의 형광강도를 비교하였다. 2 종의 형광염료에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하고, 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다. 이후 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline(이하 1X PBS)을 이용하여 19.5 nM의 농도로 희석하고 Excitation 650 nm 설정 하에 형광을 측정하였다. 측정은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다. 도 4는 화합물 20 및 대조형광염료의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이며, 본 분석으로 화합물 20의 형광강도가 상대적으로 강함을 확인하였다.
(2) 형광강도 비교 - 552 파장 염료
화합물 18과 대조형광염료(Alexa Fluor 555 NHS ester)의 형광강도를 비교하였다. 2 종의 형광염료에 DMF를 넣어 Stock solution을 제조하였고, 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다. 이후 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline(이하 1X PBS)을 이용하여 19.5 nM의 농도로 희석하고 Excitation 552 nm 설정 하에 형광을 측정하였다. 측정은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다. 도 5는 화합물 18 및 대조형광염료의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이며, 본 분석으로 화합물 18의 형광강도가 상대적으로 강함을 확인하였다.
(3) 650 화합물의 상대양자효율( Relative quantum yield ) 측정
Rhodamine 6G (TCI)를 기준으로, 화합물 20과 대조형광염료(Alexa Fluor 647 NHS ester)의 상대양자효율을 측정하였다. 2 개의 형광염료와 Rhodamine 6G에 DMF를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조한다. 이후 pH 7.4 1X PBS을 이용하여 10 uM의 농도로 희석한 후 흡광 및 형광을 측정하였다. 10 uM 농도로부터 1/2 dilution을 시행하여 1/512x 농도 샘플까지 총 10 회씩 흡형광을 측정하였다. 아래의식 1에 측정값을 대입하여 상대양자효율을 분석하였고, 하기 표 3 및 도 6과 같은 결과를 얻었다. 화합물 20의 상대양자효율이 대조형광염료보다 더 높았다.
[식 1]
Figure pat00132
화합물 20 Alexa 647 NHS ester
상대양자효율 (%) 11.70 7.79
(4) 552 화합물의 상대양자효율( Relative quantum yield ) 측정
Rhodamine 6G (TCI)를 기준으로, 화합물 18과 대조형광염료(Alexa Fluor 555 NHS ester)의 상대양자효율을 측정하였다. 2 개의 형광염료와 Rhodamine 6G에 DMF를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조하였다. 이후 pH 7.4 1X PBS을 이용하여 10 uM의 농도로 희석한 후 흡광 및 형광을 측정하였다. 10 uM 농도로부터 1/2 dilution을 시행하여 1/512x 농도 샘플까지 총 10 회씩 흡형광을 측정하였다. 식 1의 공식에 측정값을 대입하여 상대양자효율을 분석하였다. 아래의 표 4 및 도 7은 각 염료의 상대양자효율을 나타낸 것이다. Rhodamine 6G 대비, 화합물 18의 상대양자효율이 상대적으로 더 높았다.
화합물 18 Alexa 555 NHS ester
상대양자효율 (%) 13.33 5.64
시험예 5 : 단백질에 라벨링 ( labeling ) 후 성능 비교
(1) 552 파장 염료의 단백질 반응물( Conjugates ) 간 형광강도 비교
화합물 18과 대조형광염료(Alexa Fluor 555 NHS ester)를 항체(PierceTM Gt anti-Ms IgG H+L Secondary Ab, 10 mg/mL, Thermo)에 표지하여, 해당 반응물의 형광강도를 비교하였다. 화합물 18과 및 대조형광염료는 모두 DMF에 녹여 10 mg/mL로 Stock solution을 만들어 사용하였다. 항체 0.5 mg에 샘플 1 및 2는 염료 반응 비 각 25 molar를 적용하여 반응시켰고, 샘플 3은 대조형광염료 기준 동일 무게 비율을 적용하였을 시 결과를 부가적으로 확인하기 위해 화합물 18을 0.083 mg 반응시켰다. 실험 조건을 아래의 표 5에 정리하였으며, 결과를 도 8에 나타내었다.
샘플번호 품명 분자량 (g/mol) 염료사용량 (uL) D/P ratio
1 화합물 18 1227.30 10.96 8.42
2 Alexa 555 NHS ester 929.18 8.30 8.71
3 화합물 18 1227.30 8.30 7.12
항체 최종 반응 농도는 2 mg/mL로 설정하였고, 반응 버퍼는 최종 pH 8.3-8.5 정도가 되도록 10 mM Phosphate buffered saline (이하 1X PBS) 및 pH 9.4 1M Sodium carbonate-Bicarbonate buffer (이하 1 M CBC)를 섞어 제조하였다. 1~3 샘플을 상온/ 암실/ 교반 환경에서 1시간 반응시키고, Sephadex G-25 레진(GE Healthcare)이 채워 진 컬럼 관 정제를 통해 반응물을 분리해 내었다. 레진은 1X PBS로 미리 Buffer equilibrium(buffer change)시켜 사용한다. 280/552 nm 파장에서 각 반응물의 흡광도 분석(Cary 8454 UV-Vis spectrophotometer, Agilent)을 통해 Dye/Protein ratio (D/P ratio)를 우선 확인하였고, 이후 반응물(Conjugates)들의 형광을 측정(LS 55 Fluorescence spectrometer, PerkinElmer)하여 형광강도를 비교하였다. 형광 측정은 10 uL씩의 반응물에 3 mL의 1X PBS를 섞어 희석 후 Excitation 552 nm 설정 하에 진행하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 염료 사용량에 관계없이 화합물 18의 Ab conjugates 형광강도가 더 센 것을 알 수 있었다.
도 9는 FOBI (Fluorescence In Vivo Imaging System, neoscience)를 활용한 형광강도 분석 결과이며 여기에서도 같은 결과를 확인할 수 있었다. 첫 번째 행은 희석하지 않은 Original conjugate 샘플을, 두 번째 행은 1X PBS로 1/2 Dilution한 샘플을 Well 당 100 uL 주입한 후 Light source Green channel 적용 하에 분석하였다.
(2) 650 파장 염료의 반응량 별 표지율
화합물 20과 대조형광염료(Alexa Fluor 647 NHS ester)를 무게비율 별로 항체(PierceTM Gt anti-Rb IgG H+L Secondary Ab, 10 mg/mL, Thermo) 0.5 mg에 표지하여 염료 반응량에 따른 표지율 (D/P ratio)을 비교한 결과를 도 10에 나타내었다. 참고로, 화합물 20의 분자량은 1254.7 g/mole, 대조형광염료의 분자량은 956.1 g/mole이다. 염료 반응량을 0.01, 0.03, 0.05, 0.10, 0.14 mg으로 설계한 것 이외에는 시험예 5-(1)의 표지 방법과 모두 동일하게 진행하였다. 표지 및 정제를 통해 분리해 낸 각 반응물들에 대해 280/650 nm 파장에서 흡광도 분석을 진행하였고, 보편적으로 알려진 수식을 통해 표지율을 계산하였다. 화합물 20 및 대조형광염료의 몰흡광계수는 239,000 /cmM (In PBS), 단백질 몰흡광계수는 203,000 /cmM, 보정계수(Correction factor, CF280)는 0.03을 적용하였다. 표 6에 그 결과를 나타내었고, 화합물 20과 대조형광염료 모두 반응량이 늘어날수록 표지율도 지속적으로 증가함을 알 수 있다. 몰비가 적용되지 않은 상황에서, 염료를 0.10 mg (환산 시 약 25 molar) 이상 반응하였을 때 화합물 20의 표지율이 대조형광염료의 표지율보다 높아지기 시작하였다. 또한, 상술한 바와 같이 화합물 20의 분자량은 1254.7 g/mole로 대조형광염료의 분자량 956.1 g/mole에 비하여 30% 이상 크기 때문에, 화합물 20과 대조형광염료를 동일 중량 사용하였으나 본 발명의 화합물 20이 대조형광염료에 비하여 상대적으로 적은 몰수로 투입되었다. 따라서, 적은 몰수로 투입된 화합물 20의 표지율이 대조형광염료와 동등하거나 그 이상의 효과를 나타내었으므로 그 효과는 동등한 정도를 넘어서는 수준으로 판단된다.
Product Protein (Final conc. 2 mg/mL) Dye (10 mg/mL) D/P ratio
화합물 20 Ab 0.5 mg 0.14 mg (14 uL) 10.13
0.10 mg (10 uL) 7.40
0.05 mg (5 uL) 4.45
0.03 mg (3 uL) 3.01
0.01 mg (1 uL) 1.04
Alexa Fluor 647 NHS ester Ab 0.5 mg 0.14 mg (14 uL) 9.76
0.10 mg (10 uL) 7.27
0.05 mg (5 uL) 5.37
0.03 mg (3 uL) 3.42
0.01 mg (1 uL) 1.35
(3) 650 파장 염료의 반응량 별 형광강도
시험예 5-(2)에서 추출한 반응물(Conjugates)을 활용하여, 화합물 20 및 대조형광염료의 단백질에 대한 표지시 염료 반응량에 따른 형광강도를 비교해 도 11에 나타내었고, 그 이미징 결과를 도 12에 나타내었다. 96 well black plate의 첫 행에 [IgG-화합물 20] 반응물을, 두 번째 행에 [IgG-대조형광염료]의 반응물을 각 1/10로 희석하여 염료 반응량 순으로 주입하였고, 네 번째 행에는 Blank로 1X PBS를 넣어주었다. 모든 분석 시료는 well 당 100 uL를 주입하였고, 단백질 농도는 오차를 무시할 수 있을 정도로 서로 동일했다. 이후 FOBI Red channel에서 이미징을 진행했고, 보다 정확한 수치상의 비교를 위하여 Multilabel plate reader (Enspire 2300, PerkinElmer) 분석을 시행하였다. Ex. 650/ Em. 665 nm, Number of flashes 200 외 적합한 설정 하에 측정하였다. 염료 반응량 0.03, 0.05, 0.10 mg 구간에서 비교적 강한 형광이 관찰되며, 염료 0.10 mg (10mg/mL) 반응 시까지 화합물 20 반응물의 형광 세기가 더 센 것으로 나타났다. 최대 형광강도는 항체 0.5 mg에 화합물 20을 0.1 mg 반응한 조건에서 확인되었고, 화합물 20을 0.03 mg만을 반응시킨 조건에서도 최대치와 비슷한 정도의 형광을 발할 수 있는 것으로 측정되어 화합물 20의 성능이 대조형광염료에 비해 뛰어나며, 보다 적은 양을 활용하여 biomolecule에 표지 시에도 더 높은 형광을 띨 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 염료 반응량 별 형광강도 유지 경향에 있어서도 대조형광염료 반응물의 경우 0.05 mg 이후 세기가 감소됨에 반해 화합물 20은 0.10 mg 까지도 지속적으로 증가함에 따라 그 우월성을 증명할 수 있었다.
(4) 650 파장 염료의 표지율에 따른 형광강도
시험예 5-(2) 및 5-(3)의 결과를 토대로 화합물 20 및 대조형광염료의 표지율에 따른 형광강도를 도 13에 나타내었다. 앞선 결과에서 화합물 20의 분자량이 더 큼에도 불구하고 같은 무게 비율로 단백질과 반응을 진행하였을 시 대조형광염료와 비슷한 수준의 표지율을 보였고, 반응량이 적을 때 즉, 낮은 표지율에서도 대조형광염료보다 더 센 형광강도에 도달함을 알 수 있었다. 도 13을 통해서는 단백질에 표지한 화합물 20] 및 대조형광염료의 자가소광(Auto -quenching)이 본 발명의 화합물 20에서 더 늦게 나타남을 알 수 있다. 대조형광염료의 경우 6 내외의 비교적 저 표지율 상태일 때부터 소광이 진행되었다.

Claims (15)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 형광 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00133

    상기 [화학식 1]에서,
    X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
    R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
    Figure pat00134
    중에서 선택되며,
    R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00135
    중에서 선택되고,
    R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00136
    중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
    Z1 및 Z2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, N-숙신이미딜기, 히드라지닐기, N-히드록시숙신이미딜기, N-히드로숙신이미딜옥시기, 설포숙신이미딜옥시기, 4-설포-2,3,4,5-테트라플루오로페닐기, 말레인이미드C0-10알킬아미닐기, 비닐설포닐기, 비닐설포닐C0-6알킬아미닐기 및 아미노C0-6알킬 중에서 선택되는 치환기로 치환되고,
    n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
    p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    q는 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
    r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
    p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2 중 적어도 하나는
    Figure pat00137
    인 것을 특징으로 하는 형광화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R3 및 R4 중 적어도 하나는 (CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00138
    중에서 선택된 어느 하나인 특징으로 하는 형광화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
    Figure pat00139
    중에서 선택되며,
    R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00140
    중에서 선택되고,
    R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00141
    중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
    Z1 및 Z2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H 또는 N-숙신이미딜기이고,
    n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    m은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    p는 3 내지 7 중 하나의 정수이고,
    q는 0 내지 4 중 하나의 정수이고,
    r은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
    p＇은 3 내지 7 중 하나의 정수이고,
    q＇은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    r＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이다.
  5. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2 중 적어도 하나는
    Figure pat00142
    이며,
    R3 및 R4 중 적어도 하나는 -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00143
    인 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물은 하기 화합물 1 내지 화합물 20 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 화합물:
    화합물 1:
    Figure pat00144

    화합물 2:
    Figure pat00145

    화합물 3:
    Figure pat00146

    화합물 4:
    Figure pat00147

    화합물 5:
    Figure pat00148

    화합물 6:
    Figure pat00149

    화합물 7:
    Figure pat00150

    화합물 8:
    Figure pat00151

    화합물 9:
    Figure pat00152

    화합물 10:
    Figure pat00153

    화합물 11:
    Figure pat00154

    화합물 12:
    Figure pat00155

    화합물 13:
    Figure pat00156

    화합물 14:
    Figure pat00157

    화합물 15:
    Figure pat00158

    화합물 16:
    Figure pat00159

    화합물 17:
    Figure pat00160

    화합물 18:
    Figure pat00161

    화합물 19:
    Figure pat00162

    화합물 20:
    Figure pat00163
  7. 제1항에 있어서,
    섬유, 생체분자, 나노입자 및 유기화합물 중에서 선택되는 표지대상 물질에 표지되는 것을 특징으로 하는 형광화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 화합물.
  9. 하기 [화학식 2]의 화합물로부터 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 제조하는 형광 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure pat00164

    [화학식 1]
    Figure pat00165

    상기 [화학식 1] 또는 [화학식 2]에서,
    X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
    R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
    Figure pat00166
    중에서 선택되며,
    R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00167
    중에서 선택되고,
    R3 및 R4는 동시에 -(CH2)mCOOZ1 및
    Figure pat00168
    중에서 선택된 어느 하나는 아니고,
    R5 및 R6은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H, 및
    Figure pat00169
    중에서 선택되며,
    R7 및 R8은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, -(CH2)mCOOH 및
    Figure pat00170
    중에서 선택되며,
    n은 1 내지 6 중 하나의 정수이고,
    m은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
    p는 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    q는 0 내지 6 중 하나의 정수이고,
    r은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    m＇은 1 내지 7 중 하나의 정수이고,
    p＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    q＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이고,
    r＇은 1 내지 10 중 하나의 정수이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 [화학식 2]의 화합물은 하기 [화학식 3]을 시아누릭클로라이드와 반응시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 형광 화합물의 제조방법:
    [화학식 3]
    Figure pat00171

    상기 [화학식 3]에서,
    X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
    R9 및 R10은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
    Figure pat00172
    중에서 선택되며,
    R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬 및
    Figure pat00173
    중에서 선택된다.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 [화학식 3]의 화합물은 각각 하기 [화학식 4]의 화합물을 아민C0-6알킬아미닐기로 치환시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 형광 화합물의 제조방법:
    [화학식 4]
    Figure pat00174

    상기 [화학식 4]에서,
    X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
    R13 및 R14는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1-7알킬, C8-18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
    Figure pat00175
    중에서 선택되며,
    R15 및 R16은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬 및
    Figure pat00176
    중에서 선택된다.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 [화학식 4]의 화합물은 하기 [화학식 5]의 화합물을 하기 [화학식 6]의 화합물과 무수아세트산을 포함하는 용매 하에서 환류시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 형광 화합물의 제조방법:
    [화학식 5]
    Figure pat00177

    [화학식 6]
    Figure pat00178

    상기 [화학식 5] 또는 [화학식 6]에서,
    X 및 Y는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, -SO3 - 및 -SO3H 중에서 선택되며,
    R13 및 R14는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬, C8 - 18알킬, -(CH2)mSO3 -, -(CH2)mSO3H 및
    Figure pat00179
    중에서 선택되며,
    R15 및 R16은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 C1 - 7알킬 및
    Figure pat00180
    중에서 선택된다.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 유효성분으로 포함하는 조영제 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 형광 화합물을 표지대상 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 화합물 표지 방법으로서,
    상기 표지대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자 및 유기화합물 중에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 표지대상 물질은 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 1개의 기능기를 포함하며,
    상기 기능기에 상기 제1항의 형광 화합물이 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물 표지 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 화합물 표지 방법.
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