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KR20170117860A - 딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용하는 타가토스의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물 - Google Patents

딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용하는 타가토스의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물 Download PDF

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Publication number
KR20170117860A
KR20170117860A KR1020160135173A KR20160135173A KR20170117860A KR 20170117860 A KR20170117860 A KR 20170117860A KR 1020160135173 A KR1020160135173 A KR 1020160135173A KR 20160135173 A KR20160135173 A KR 20160135173A KR 20170117860 A KR20170117860 A KR 20170117860A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fructose
tagatose
epimerase
present
lys
Prior art date
Application number
KR1020160135173A
Other languages
English (en)
Inventor
오덕근
이선화
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Publication of KR20170117860A publication Critical patent/KR20170117860A/ko

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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Abstract

본 발명은 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 이용하는 타가토스(tagatose)의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 배지 내 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법에 효소 촉매로서 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 친환경적인 효소 촉매를 사용하여 단일 공정의 효소반응으로 타가토스의 생산이 가능하며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하므로 종래 타가토스 생산과 비교하여 높은 생산 효과를 얻을 수 있다. 또한, 저렴한 기질인 프락토스로부터 단일 공정의 효소반응으로 타가토스를 생산할 수 있어 생산 단가가 저렴하므로 비용 절감 효과를 얻을 수 있어, 비용 절감 및 고효율로 종래 타가토스 생산 공정에 비해 효과적이다.

Description

딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용하는 타가토스의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물{Method for the production of tagatoase by fructose epimerase from Dictyoglomus turgidum and composition therefor}
본 발명은 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 이용하는 타가토스(tagatose)의 생산 방법 및 그에 필요한 조성물에 관한 것이다.
타가토스(D-tagatose)는 케토헥소오스(keto-hexose)의 일종으로, 구조적으로는 프락토스(D-fructose)의 C4 에피머(epimer)이다. 타가토스는 설탕(sucrose)에 비해 92%의 당도를 나타내지만, 칼로리는 약 1.5 ㎉/g으로 설탕의 약 30%인 저칼로리 감미료로 알려져 있다.
또한, 타가토스는 체내 흡수과정 중에 거의 대사가 되지 않는 비 열량(non-caloric) 감미료로서 섭취한 양의 15 내지 20%가 체내로 흡수되는데, 이는 인간이 갖는 자체적인 소화 능력이 아닌 대장 내 미생물에 의한 분해로 인한 흡수이므로 혈당 수치에 영향을 끼치지 않는다. 이로 인해, 설탕을 타가토스로 대체하는 것은 당뇨병 환자에게 혈당 조절 효과를 기대할 수 있고, 장내 미생물에게 탄소원을 제공하여 장내 미생물의 번식을 도울 수 있어 미생물에 의한 배변활동에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 충치를 유발하지 않는 기능적 특성을 가지고 있어 어린이들이 좋아하는 초콜릿, 껌, 빵, 사탕 등에 설탕 대신 넣어 어린이들이 안심하고 섭취할 수 있게 해주는 건강 감미료인 동시에, 설탕 과잉으로 인한 질병의 예방에도 기여할 수 있는 물질로서 많은 관심을 받고 있다.
타가토스의 화학적인 특징과 관련하여, 끓는점이 134℃이며 pH 2 내지 7의 환경에서 안정하므로, 대부분의 인공 감미료와 비교하였을 때 열과 pH에 대한 안정성이 높아 잘 파괴되지 않는다. 또한 설탕과 가장 유사한 물리적, 화학적 성질을 가져, 특히 프락토스가 가열될 때 나타나는 갈색화 반응(browning reaction)의 특징을 동일하게 나타내는 케토오스(ketose)이므로 대체당으로서 중요한 특징을 가진다.
위와 같은 이유로, 타가토스는 식품 보조제 및 다이어트 감미료로서 각광받고 있어, 식품 산업 분야에서 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 점차 높아지고 있다. 그러나, 타가토스는 미생물 또는 효모에 의한 생합성 경로를 통해 합성될 수 없고 유제품 또는 일부 식물에 미량 함유되어 있어, 희소당(rare sugar)으로 분류되고 있다.
타가토스는 화학적 합성 방법으로서 알칼리용액 또는 피리딘에서 갈락토오스를 이성화하여 생산하는 방법이 있으나, 효율이 낮고 품질이 낮아 통상적으로 사용되지 않으며, 생물전환법으로서 L-아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase)를 이용하여 갈락토오스의 이성화를 통해 타가토스를 생산하는 방법이 사용되고 있으나, 갈락토오스의 수급이 불안정하고 낙농시장의 변동에 따라 공급가액의 변화폭이 크기 때문에 안정적이고 지속적인 대량 생산량 확보에 어려움이 제기되고 있다. 이 외에도, 아세토박터 서복사이단스(Acetobacter suboxydans)가 D-탈리톨(D-talitol)을 산화하여 타가토스로 전환할 수 있는 방법도 사용될 수 있으나, 탈리톨 자체도 자연에 존재하지 않아 합성 공정에서 많은 비용을 필요로 하게 된다.
따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 수급이 안정적이고 원가가 낮은 포도당이나 프락토스를 기질로 하여 효소를 이용하여 타가토스를 생산하는 방법이 활발히 연구되고 있다. 현재까지 보고된 에피머화 효소들의 반응 작용으로는 프락토스로부터 타가토스로의 전환이 거의 일어나지 않고 생산 수율이 현저히 낮아, 사업화하기에 부족함이 있다.
이에, 본 발명자들은 단일 효소반응으로 프락토스에서 타가토스를 생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 고온성균인 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum), 투르페라 라디오빅트릭스(Truepera radiovictrix), 터모아나데로박터 마트라니(Thermoanaerobacter mathranii), 코흐넬라 라에비리보시(Cohnella laeviribosi) 또는 칼디코프로박터 오시마이(Caldicoprobacter oshimai) 유래의 프락토스 에피머화효소가 pH 8.5 및 60℃ 조건에서 배지 내 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법에 효소 촉매로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2001-0080711 A1 (2001.12.18)
이에, 본 발명자들은 프락토스 에피머화효소를 이용하여 프락토스로부터 타가토스를 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 포함하는, 타가토스(tagatose) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은, 상기 프락토스 에피머화효소를 이용한 타가토스의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적으로 달성하기 위해서, 본 발명은 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 포함하는, 타가토스(tagatose) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프락토스 에피머화효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프락토스 에피머화효소는 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 프락토스 에피머화효소인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프락토스 에피머화효소는 단당류의 4번 탄소를 에피머화하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한,
i) 상기 타가토스 생산용 조성물에 단당류를 가하여 반응하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)의 반응한 반응액으로부터 타가토스를 수득하는 단계를 포함하는, 타가토스 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 단당류는 프락토스인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 단당류는 반응액 내에 10 내지 75%(w/w)로 첨가되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 반응은 pH 7.0 내지 pH 8.5에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 반응은 50 내지 70℃에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 반응은 3 내지 10 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 프락토스 에피머화효소를 이용한 타가토스의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 프락토스 에피머화효소는 pH 8.5 및 60℃ 조건에서 배지 내 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법에 효소 촉매로서 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 친환경적인 효소 촉매를 사용하여 단일 공정의 효소반응으로 타가토스의 생산이 가능하며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하므로 종래 타가토스 생산과 비교하여 높은 생산 효과를 얻을 수 있다. 또한, 저렴한 기질인 프락토스로부터 단일 공정의 효소반응으로 타가토스를 생산할 수 있어 생산 단가가 저렴하므로 비용 절감 효과를 얻을 수 있어, 비용 절감 및 고효율로 종래 타가토스 생산 공정에 비해 효과적이다.
도 1은 프락토스로부터 타가토스를 생산하기 위한, 본 방법의 생산 방법을 모식도를 나타낸다.
도 2는 고온성균인 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum), 투르페라 라디오빅트릭스(Truepera radiovictrix), 터모아나데로박터 마트라니(Thermoanaerobacter mathranii), 코흐넬라 라에비리보시(Cohnella laeviribosi) 및 칼디코프로박터 오시마이(Caldicoprobacter oshimai)의 계통수 비교를 나타낸다.
도 3은 고온성균 유래의 프락토스 에피머화효소를 대장균(E. coli)에서 대량 발현하기 위해 사용한 pET-28a(+) 벡터 시스템의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소의 금속 특이성을 나타낸다.
도 5는 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소 활성의 최적 pH를 나타낸다.
도 6은 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소를 통한 프락토스로부터 타가토스의 생산을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 타가토스는 자연계 존재하지 않는 희소당으로서 식품산업에서 효율적인 생산 방법이 요구되고 있으나, 아직까지 단일 효소반응으로 타가토스를 생산할 수 있는 방법에 대하여는 보고된 바 없다.
본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스로부터 타가토스를 생산하는 방법에 효소 촉매로서 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 친환경적인 효소 촉매를 사용하여 단일 공정의 효소반응으로 타가토스 생산이 가능하므로, 비용 절감 및 고효율로 효과적이다.
따라서, 본 발명은 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 포함하는, 타가토스(tagatose) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 “프락토스 에피머화효소”는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 로 이루어진 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열은 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 프락토스 에피머화효소인 것이 바람직하다. 본 발명에서 제공하는 프락토스 에피머화효소는 기존 서열분석을 통해 유전자 서열 및 유전자 정보가 공지되어 있으나, 기능적으로 규명되지 않았으므로 효소 활성과 관련하여는 보고된 바가 없다.
본 발명의 프락토스 에피머화효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 프락토스 에피머화효소를 수득하여 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로 수득된 프락토스 에피머화효소를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-28a(+) 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 “프락토스 에피머화효소는” 단당류의 4번 탄소를 에피머화하는 것이 바람직하며, 구체적으로 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하는 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 기존 서열분석을 통해 유전자 서열 및 유전자 정보가 공지되어 있으나 기능적으로 규명되지 않았으므로 효소 활성과 관련하여는 보고된 바가 없는 에피머화효소를 사용하기 위해, 고온성균인 딕토글로무스 투르기둠에서 에피머화효소로서 제안된 유전자를 선별하여, 유전자 재조합을 통해 대장균 BL21(DE3)에서 과발현한 다음, 분리 및 정제하여 프락토스 에피머화효소를 수득하였다.
또한, 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소의 특징을 확인하기 위해 금속 특이성 및 효소 활성에 대한 최적 pH를 확인한 결과, 코발트 또는 니켈 금속이온이 존재하는 반응 시료 내에서 효소 활성이 높은 수준으로 증가하여, 금속 이온이 존재하지 않는 배지보다 약 4 내지 5 배 높은 수준의 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였으며(도 4), pH 8.0에서 효소의 활성이 가장 높은 수준으로 나타나므로, pH 8.0이 최적 pH임으 확인하였다(도 5).
또한, 본 발명자들은 프락토스 에피머화효소를 이용한 타가토스 생산 효과를 확인하기 위해 프락토스를 기질로 하여 타가토스 생산을 확인한 결과, 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소를 첨가하여 전환 반응을 유도한 배지에서 프락토스가 타가토오스로 전환될 수 있음을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 pH 8.5 및 60℃ 조건에서 배지 내 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 프락토스 에피머화효소를 포함하는 조성물은 타가토스의 생산 공정에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한,
i) 상기 타가토스 생산용 조성물에 단당류를 가하여 반응하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)의 반응한 반응액으로부터 타가토스를 수득하는 단계를 포함하는, 타가토스 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 단계 i)의 “단당류”는, 단당류로서 당업계에 공지된 것이라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 구체적으로 희소당(rare sugar) 생산 공정에서 기질로 사용될 수 있는 단당류인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 프락토스(fructose)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 i)의 “단당류”는, 반응액 내에 10 내지 75%(w/w)의 농도로 첨가되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 i)의 “반응”은, pH 7.0 내지 pH 8.5에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 pH 8.0 내지 pH 8.5에서 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 i)의 “반응”은, 50 내지 70℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 60℃에서 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단계 i)의 “반응”은 3 내지 10 시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 구체적으로 5 내지 6 시간 동안 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 배지 내의 기질을 타가토스로 전환하기에 충분한 시간이라면 반응 시간에 크게 한정되지 않는다.
본 발명의 프락토스 에피머화효소는 배지 내 프락토스의 4번 탄소를 에피머화하여 효과적으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 본 발명의 타가토스 생산 방법은 친환경적인 효소 촉매를 사용하여 단일 공정의 효소반응으로 타가토스의 생산이 가능하며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하므로 종래 타가토스 생산과 비교하여 높은 생산 효과를 얻을 수 있다. 또한, 저렴한 기질인 프락토스로부터 단일 공정의 효소반응으로 타가토스를 생산할 수 있어 생산 단가가 저렴하므로 비용 절감 효과를 얻을 수 있어, 비용 절감 및 고효율로 종래 타가토스 생산 공정에 비해 효과적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)의 대량 발현 및 분리 정제
<1-1> 고온성균 유래의 프락토스 에피머화효소의 대량 발현
본 발명에서 프락토스를 타가토오스로 전환하는 프락토스 에피머화효소를 준비하기 위해, 고온성 균에서 헥소유로네이트 에피머화효소(hexouronate epimerase)를 암호화하는 것으로 보고된 바 있는 유전자를 선별하고, 이로부터 에피머화효소를 대량 생산하였다.
구체적으로, 고온성균인 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) DSMZ 6724에서 에피머화효소로서 제안된 유전자를 선별하고, 유전체 DNA로부터 하기 [표 1]에 기재된 프라이머 서열을 사용하여 에피머화효소 DNA를 PCR 증폭하였다. 증폭된 에피머화효소는 제한효소를 사용하여 pET-28a(+)(Novagen 사)에 삽입하여, 프락토스 에피머화효소를 발현하기 위한 pET-28a(+)/프락토스 에피머화효소 재조합 벡터로서 제작하였다. 제작된 재조합 벡터는 하기 도 3과 같이 금속이온친화도 컬럼(친화 히스트랩 에이치피 컬럼)을 이용한 정제가 용이하도록 하는 6-His Tag를 단백질의 양 말단에 발현할 수 있도록 하였고, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환한 다음, 배양 전 단계에서는 액화질소에서 동결하여 냉동보관하였다.
형질 전환된 대장균 BL21(DE3) 균은 50 ㎖ LB 액체 배지를 포함하는 250 ㎖ 플라스크에 접종하여, 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균 배양하였다. 그런 다음 상기 배양액을, 10 g/ℓ의 글리세롤, 1 g/ℓ의 펩톤, 30 g/ℓ의 효모 추출물, 0.14 g/ℓ의 비스포스페이트칼륨 및 1 g/ℓ의 일포스페이트나트륨의 조성으로 이루어진 배양액 5 ℓ를 포함하는 7 ℓ 규모의 발효조(바이오트론 사, 한국)에 첨가하여, 500 rpm의 교반 속도, 1.0 vvm의 통기량 및 37℃의 배양 온도 조건에서 본 배양하였다. 본 배양 시, 600 ㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때, 1 mM IPTG(최종 농도)를 첨가하여 프락토스 에피머화효소의 대량 생산을 유도하였다.
배양 종료 후, 배양액을 6,000×g로 4 ℃에서 30 분 동안 원심분리하여 균을 수득한 다음, 0.85% NaCl 용액에 두 번 세척하였다. 그런 다음, 1 ㎎/㎖의 라이소자임이 포함된 세포파쇄 완충용액(50 mM NaH2PO4 및 300 mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 현탁하여 얼음 안에서 30 분간 방치하고, 프렌치 프레스로 15,000 lb/in2에서 파쇄한 다음, 세포 파쇄물을 13,000×g로 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리하여 상층액을 세포 전추출물로서 수득하였다.
본 발명의 프락토스 에피머화효소를 증폭하기 위한 프라이머 서열
유래 미생물명 프라이머
방향		 서열 사용
제한효소명
Dictyoglomus turgidum 정방향 5'-CCTCCG CATATG TTAAAATTGTTAAACGAATCCT-3' NdeI
역방향 5'-TGC CTCGAG TTATTCCTCCTCGAATAAGTTCTTT -3' XhoI
(상기 서열에서, 밑줄 친 부분은 사용한 제한 효소의 절단 부위를 나타낸다.)
<1-2> 대량 발현된 프락토스 에피머화효소의 분리 정제
재조합 대장균 발현 시스템을 통해 대량 발현된 프락토스 에피머화효소는 말단에 6-HisTag을 가지고 있으므로, 이를 이용하여 프락토스 에피머화효소를 단백질 정제로 분리하였다.
구체적으로, 먼저 상기 실시예 <1-1>에서 최종 수득한 세포 전추추물을 0.45 ㎛ 여과지에 여과한 다음, HisTag 정제하기 위해 pH 8.0인 300 mM 염화나트륨(NaCl) 및 10 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 컬럼에, 상기 여과액을 로딩하여 프락토스 에피머화효소를 컬럼에 부착하였다. 그런 다음, 10 내지 200 mM 사이의 일정 기울기 농도를 포함하는 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액을 상기 컬럼에 1 ㎖/분의 속도로 흐르도록 로딩하여, 컬럼에 부착된 프락토스 에피머화효소를 용출(elution)하여 분획(fraction)으로 수득하였다.
수득한 용출 분획의 활성을 확인하여 활성이 있는 분획을 탈염 하이프렙(HiPrep 16/60) 컬럼을 이용하여 탈염하였다. pH 8.5인 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 하이프렙(HiPrep 16/60) 탈염 수지 컬럼에, 상기 활성이 있는 분획을 로딩하고, 6 ㎖/분의 속도로 컬럼을 통과하도록 하여 효소 용액을 수득하였다.
수득한 효소 용액은 최종적으로, 0.15 M 염화나트륨이 포함된 pH8.5의 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 세파크릴 에스-100 에치알 (Sephacryl S-100 HR) 컬럼에 로딩하고, 6.6 ml/min 속도로 용출된 효소 용액을 수득하고, 50 mM 트리스 완충용액에서 투석하여, 정제된 프락토스 에피머화효소를 수득하였다.
그 결과, 분자량이 53 kDa인 단량체 단백질의 프락토스 에피머화효소를 수득하였다.
프락토스 에피머화효소의 특성 확인
<2-1> 딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소의 금속 특이성 확인
종래의 기존 보고들에서는 프락토스 에피머화효소에 대한 금속 활성이 보고되지 않았으나, 본 발명에서는 본 발명의 프락토스 에피머화효소가 가지는 특징을 확인하기 위해, 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 프락토스 에피머화효소의 금속 특이성을 확인하였다.
구체적으로, 50 mM 트리스 완충용액에, 상기 <실시예 1>에서 대량 발현 후 분리 정제한 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소 1 unit/㎖ 및 50 mM 프락토스를 첨가하여 반응 시료를 준비한 후, 1 mM의 CoCl2, NiCl2, MnCl2, MgCl2, CaCl2, ZnCl2 또는 CuCl2를 각각 반응 시료에 첨가하여, pH 8.5 및 60℃ 환경에서 3 시간 동안 반응한 다음, 0.2M 염산을 첨가하여 반응을 종결하고 효소의 활성을 측정하였다. 음성 대조군으로서, 금속 대신 금속 킬레이트인 1 mM EDTA를 첨가하였고, 무처리 대조군으로는 금속 및 EDTA 중 어떤 것도 처리하지 않은 반응 시료에서 상기와 동일한 방법을 수행하여 효소의 활성을 측정하였다. 측정한 효소의 활성은 CoCl2를 처리한 반응 시료에서의 효소 활성을 기준으로 하고, 각각의 반응 시료에서의 효소 활성을 상대적인 활성(%)으로 나타내었다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소는 코발트 또는 니켈의 금속 이온이 존재하는 반응 시료 내에서 금속 이온이 존재하지 않는 경우와 비교하였을 때 현저히 높은 수준의 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 구리 이온이 존재하는 경우에는 효소 활성이 현저하게 저해되어 음성 대조군인 EDTA가 존재하는 경우와 유사한 수준의 효소 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 본 발명의 프락토스 에피머화효소는 프락토스 6-포스페이트(fructose 6-phosphate)를 기질로 할 때, 금속염 효과가 있음을 확인하였다.
<2-2> 딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소의 최적 활성 pH 확인
본 발명의 프락토스 에피머화효소가 가지는 특징을 확인하기 위해, 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소의 최적 활성 pH를 확인하였다.
구체적으로, pH 7.0, pH 7.5 또는 pH 8.0의 트리스 완충 용액을 제조하고, 각각의 완충 용액에 상기 <실시예 1>에서 대량 발현 후 분리 정제한 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소 1 unit/㎖ 및 50 mM 프락토스를 첨가하여 60℃에서 3 시간 동안 반응한 다음, 0.2M 염산을 첨가하여 반응을 종결하고 효소의 활성을 측정하였다. 측정한 효소의 활성은 pH 8.0 완충 용액에서 반응한 효소 활성을 기준으로 하고, 각각의 pH 완충 용액에서의 효소 활성을 상대적인 활성(%)으로 나타내었다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 pH 가 상승함에 따라 효소의 활성도 증가하여, pH 8.0에서 프락토스 에피머화효소의 활성이 가장 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하여, 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소 활성의 최적 pH는 pH 8.0인 것을 확인하였다(도 5).
딕토글로무스 투르기둠 유래 프락토스 에피머화효소를 이용한 타가토오스(tagatose)의 생산
본 발명의 프락토스 에피머화효소의 타가토오스로의 생산 효과를 확인하기 위해, 프락토스를 기질로 하고 프락토스 에피머화효소를 이용하여 타가토오스를 생산하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 대량 발현 후 분리 정제한 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소를 각각 포함하는 pH 8.5 50 mM 트리스 완충용액에 55 mM의 프락토스를 첨가한 다음, 50℃에서 6 시간 동안 반응하여, 프락토스로부터 타가토오스로 전환하는 반응을 유도하였다. 그런 다음, 반응 시료를 수득하고 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하여 생산된 타가토오스의 양을 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소 유래의 프락토스 에피머화효소로 전환 반응을 유도한 배지에서, 프락토스가 타가토오스로 전환될 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 딕토글로무스 투르기둠 유래의 프락토스 에피머화효소에서 유의적인 타가토오스 생산이 가능함을 확인하였다(도 3).
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Method for the production of tagatoase by fructose epimerase from thermophilic bacteria and composition therefor <130> 1061573 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 1 Met Leu Lys Leu Leu Asn Glu Ser Leu Lys Pro Leu Ser Ile Phe Ile 1 5 10 15 Tyr Ser Glu Ser Leu Arg Lys Ile Asn Asp Asp Leu Tyr Ile Phe Val 20 25 30 Ala Lys Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ile Gly Ile Val Lys Gln Asn Gln 35 40 45 Ile Leu Tyr Phe Ser Ser Pro Tyr Phe Ser Glu Asp Lys Lys Ile Glu 50 55 60 Gly Thr Asn Phe Leu Val Asn Leu Tyr Pro Leu Asn Phe Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Gln Lys Leu Lys Glu Ile Ile Pro Ile Ser Pro Lys Val Cys Asp Lys 85 90 95 Lys Ile Ser Phe Gly Thr Gly Asp Arg Leu Gly Leu Ile Thr Ser Ala 100 105 110 Gln Leu Ser Ala Leu Lys Glu Tyr Asp Leu Phe Pro Ile Leu Ala Gln 115 120 125 Gln Ser Pro Arg Glu Leu Ile Lys Thr Lys Arg Asp Phe Lys Asp Val 130 135 140 Leu Leu Lys Ser Ala Met Gly Val Leu Glu Thr Gly Tyr Thr Gly Lys 145 150 155 160 Tyr Gly Ala Asp Ala Asp His Ile Lys Asp Glu Lys Tyr Leu Met Glu 165 170 175 Ala Ile Asp Ala Gly Tyr Thr Met Tyr Thr Leu Asp Ile Ser Asp Phe 180 185 190 Ile Glu Lys Ile Lys Asp Leu Ser Glu Lys Ala Leu Lys Glu Lys Tyr 195 200 205 Glu Lys Val Ser Ser Phe Ser Lys Lys Ile Ile Asp Lys Tyr Ala Gly 210 215 220 Lys Arg Val Lys Ile Ser Asp Glu Glu Tyr Phe Glu Leu Ser Tyr Asn 225 230 235 240 Glu Leu Cys Lys Ser Ala Ile Val Tyr Glu Lys Ala Leu Ser Phe Val 245 250 255 Glu Met Val Tyr Glu Ile Leu Lys Ser Lys Leu Ser Glu Phe Asp Ile 260 265 270 Glu Val Ser Ile Asp Glu Gly Glu Arg Asp Thr Thr Pro Glu Asp His 275 280 285 Phe Phe Val Ala Gln Phe Leu His Asp Lys Gly Ile Asp Phe Lys Ser 290 295 300 Leu Ala Pro Lys Phe Pro Gly Glu Phe Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Ile 305 310 315 320 Gly Asp Ile Lys Glu Phe Glu Arg Ala Leu Lys Lys His Tyr Ala Leu 325 330 335 Thr Lys Ala Leu Glu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp 340 345 350 Lys Phe Ser Ile Tyr Lys Ile Phe Tyr Lys Ile Thr Glu Gly Asn Phe 355 360 365 His Ile Lys Thr Ser Gly Thr Ser Trp Leu Glu Ala Val Lys Val Ile 370 375 380 Ala Lys Phe Phe Pro Asp Leu Phe Val Glu Leu Tyr Gln Ile Ala Leu 385 390 395 400 Glu Asn Leu Glu Glu Ser Lys Lys Ala Tyr Lys Val Asn Ile Thr Lys 405 410 415 Glu Glu Phe Pro Lys Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Met Glu Phe Leu His 420 425 430 Lys Asp Asn Val Arg Gln Leu Phe His Ile Ser Tyr Gly Val Leu Leu 435 440 445 Asp Glu Lys Arg Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Leu Asn Gln Lys Glu Lys 450 455 460 Glu His Tyr Gln Tyr Val Ser Glu Asn Ile Lys Lys His Leu Lys Asn 465 470 475 480 Leu Phe Glu Glu Glu 485

Claims (10)

  1. 프락토스 에피머화효소(fructose epimerase)를 포함하는, 타가토스(tagatose) 생산용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프락토스 에피머화효소는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열 로 이루어진 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열은 딕토글로무스 투르기둠(Dictyoglomus turgidum) 유래의 프락토스 에피머화효소인 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 프락토스 에피머화효소는 단당류의 4번 탄소를 에피머화하는 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산용 조성물.
  5. i) 제 1항의 조성물에 단당류를 가하여 반응하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)의 반응한 반응액으로부터 타가토스를 수득하는 단계를 포함하는, 타가토스 생산 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 단당류는 프락토스인 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 단당류는 반응액 내에 10 내지 75%(w/w)로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 반응은 pH 7.0 내지 pH 8.5에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 반응은 50 내지 70℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산 방법.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 단계 i)의 반응은 3 내지 10 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 타가토스 생산 방법.
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