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KR20170038462A - 유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물 - Google Patents

유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물 Download PDF

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KR20170038462A
KR20170038462A KR1020150137862A KR20150137862A KR20170038462A KR 20170038462 A KR20170038462 A KR 20170038462A KR 1020150137862 A KR1020150137862 A KR 1020150137862A KR 20150137862 A KR20150137862 A KR 20150137862A KR 20170038462 A KR20170038462 A KR 20170038462A
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lactic acid
extracellular
acid bacteria
spp
hair
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신승현
이현기
조은경
이태룡
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(주)아모레퍼시픽
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Abstract

본 명세서에는 유산균 유래의 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물 및 상기 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법이 개시된다. 상기 조성물은 두피에서 모발이 탈락되는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 현상을 예방하고 방지하는 효과가 있다. 또한, 상기 조성물은 새로운 모발을 생성하는 발모 기능, 또는 상기 발모를 촉진시키는 기능뿐만 아니라 모발 주기의 성장기에서 퇴행기로의 지연을 촉진하고 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 기능을 구현하는 효과가 있다.

Description

유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물{COMPOSITION COMPRISING LACTIC ACID BACTERIA DERIVED EXTRACELLULAR VESICLES FOR PREVENTING HAIR LOSS OR PROMOTING HAIR GROWTH}
본 명세서에는 유산균 유래의 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물 및 상기 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법이 개시된다.
대부분의 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포외 소낭(extracellular vesicle)를 분비할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 세포외 소낭은 혈액, 소변, 타액 및 세포 배양액을 포함하는 모든 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견된다(Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res 2014;114:345-53)(Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis. Adv Drug Deliv Rev 2013;65:398-401).
세포외 소낭은 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 ㎛의 크기를 갖는 막 구조 소낭체로서, 그 크기와 구성에서 이질성이 있고, 엑소좀(exosome, 약 30~100 nm), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle, 약 100~1,000 nm), 마이크로입자(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body, 약 1~5 ㎛) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다.
상기 세포외 소낭의 상이한 유형은 이의 기원, 직경, 자당(sucrose)에서의 밀도, 형상, 침강 속도, 지질 조성물, 단백질 마커 또는 분비 방식(즉, 신호(유도성)에 의한 것인지 자발적(구성적)인 것인지) 등에 기초하여 구별된다. 예컨대, 마이크로소낭은 약 100 내지 1,000 nm의 불규칙한 형상을 갖는 막 소낭으로써 원형질막 바깥쪽을 향하여 출아(원형질막에서 기원)되며, 인테그린, 셀렉틴, CD40 리간드 등을 포함하는 표지자(marker), 포스파티딜세린을 포함하는 인지질을 갖는 것으로 알려져 있다. 한편, 엑소좀은 약 30 내지 100 nm(<200 nm)의 컵 형상을 갖는 가장 작은 막 소낭으로써 후기 엔도좀의 안쪽에서 출아(엔도좀에서 기원)되며, 일반적으로 CD63, CD9의 테트라스파닌, TSG101, ESCRT을 포함하는 마커, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 세라마이드, 포스파티딜세린을 포함하는 지질을 갖는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 세포외 소낭은 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영하며, 어떤 세포에서 분비되었는가에 따라 다양한 생물학적 활성을 나타내고, 세포들 사이에 유전 물질과 단백질을 옮기면서 세포 간 상호작용(cell-to-cell communication)에 중요한 역할을 한다.
원핵세포 또는 진핵세포 또한 세포외 소낭을 분비하는 것으로 알려져 있다(Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., & Biancone, L. (2010). Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney international, 78(9), 838-848, Bang, Claudia, and Thomas Thum. "Exosomes: New players in cell-cell communication." The international journal of biochemistry & cell biology 44.11 (2012): 2060-2064. Kim, D. K., Lee, J., Simpson, R. J., Lotvall, J., & Gho, Y. S. (2015, April), EVpedia: A community web resource for prokaryotic and eukaryotic extracellular vesicles research. In Seminars in cell & developmental biology(Vol. 40, pp. 4-7). Academic Press, Kim, J. H., Lee, J., Park, J., & Gho, Y. S. (2015, April). Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. In Seminars in cell & developmental biology (Vol. 40, pp. 97-104). Academic Press). 한편, 인체에 유익한 대표적인 미생물인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하는 균으로서, 당으로부터 유기산을 만드는 발효 과정을 거쳐 발효유, 치즈, 버터와 같은 발효 식품을 제조하는 데에 사용되고 있으나, 이로부터 유래한 세포외 소낭 자체의 특정 용도에 대해서는 연구가 아직까지는 미흡한 실정이다.
한국 공개특허문헌 제10-2011-0025603호
일 측면에서, 본 명세서는 유산균에서 유래한 복합 생리 활성 물질인 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 상기 유산균 유래의 세포외 소낭을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에 개시된 기술은 유산균 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 상기 유산균은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 페디오코카스(Pediococcus spp.) 및 락토코커스(Lactococcus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 유산균은 락토바실러스(Latobacillus spp.) 속 균주를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 락토바실러스 사케이(L. sakei)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 유산균 배양액에서 분리된 것일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 엑소좀 유사 소낭(exosome-like vesicle)일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 유산균 배양액의 100,000 ×g 이상의 초원심분리에서 침강하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 유효성분은 모유두 세포(dermal papilla cells, DPCs)를 활성화하여 모발 성장을 유도하는 것일 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 유산균 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 제조하는 방법으로, (1) 유산균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (2) 상기 수득된 상등액을 여과하는 단계; 및 (3) 상기 수득된 여과물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계;를 포함하는 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법을 제공한다.
일 측면에서, 상기 (1) 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 ×g에서 실시할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 (3) 단계에서 초원심분리는 100,000 ×g 이상에서 실시할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 (3) 단계 후, (4) 상기 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 유산균에서 유래한 복합 생리 활성 물질인 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
상기 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물은 두피에서 모발이 탈락되는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 현상을 예방하고 방지하는 효과가 있다.
상기 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물은 새로운 모발을 생성하는 발모 기능, 또는 상기 발모를 촉진시키는 기능뿐만 아니라 모발 주기의 성장기에서 퇴행기로의 지연을 촉진하고 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 기능을 구현하는 효과가 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 유산균 유래의 세포외 소낭을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 명세서의 일 실시예에서 유산균으로부터 세포외 소낭을 분리하는 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 2는 본 명세서의 일 실시예에서 분리된 유산균 유래의 세포외 소낭의 크기를 측정한 결과이다.
도 3은 본 명세서의 일 시험예에서 유산균 유래의 세포외 소낭을 모낭 모유두세포에 저농도 범위(0.1~20 μg/ml)로 처리하였을 때의 모낭 세포 증식 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 b는 본 명세서의 일 시험예에서 유산균 유래의 세포외 소낭을 모낭 모유두세포에 고농도 범위(10~100 μg/ml)로 처리하였을 때의 모낭 세포 증식 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 명세서의 일 시험예에서 유산균 유래의 세포외 소낭을 모낭 기관배양(hair follicle organ culture)에 처리하였을 때의 모발 성장 길이 증가(hair shaft elongation)를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 명세서의 일 시험예에서 유산균 유래의 세포외 소낭을 모낭 기관배양(hair follicle organ culture)에 처리하였을 때의 모발 성장 길이 증가(hair shaft elongation)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서는 유산균 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물을 제공한다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 세포외 소낭은 엑소좀 유사 소낭(exosome-like vesicle)일 수 있다.
모발 주기는 성장기, 퇴행기, 휴지기로 알려져 있는 3개의 주요 단계들로 나눌 수 있다. 성장기에는 세포의 빠른 증식과 함께 피부 안으로 깊이 모낭이 성장하면서 모발 형성이 이루어진다. 다음 현상은 퇴행기인데 이것은 세포 분열의 중단이 두드러지는 과도기이며, 이 과정에서 모낭은 점차 퇴행하고 육모가 중단된다. 다음 현상인 휴지기에서 퇴행 모낭은 조밀하게 찬 모유두(dermal papilla) 세포를 갖는 배(germ)를 포함한다. 휴지기에서 새로운 성장기 현상의 개시는 상기 배에서 빠른 세포의 증식, 모유두의 팽창 및 기저막 요소의 합성에 의해 유도된다. 일반적으로 "육모"는 성장기에서 이루어지며, 휴지기에서 성장기로의 유도 및 성장기에서 퇴행기로의 지연에 의하여 촉진된다.
본 명세서에서 "탈모"는 두피로부터 모발이 탈락되는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 현상을 의미하며, "탈모 방지"라 함은 상술한 바와 같은 탈모 현상을 예방하고 억제하는 것을 의미하고, "육모 촉진"이라 함은 새로운 모발을 생성하는 발모 기능, 또는 발모를 촉진시키는 기능뿐만 아니라 성장기에서 퇴행기로의 지연을 촉진하고 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 기능을 의미한다.
본 명세서에서 "세포외 소낭"은 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 베지클(vesicles)을 의미하는 것으로서, 막 구조 소낭체로 내부와 외부가 구분되며, 세균의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid) 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세균보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포외 소낭은 다른 세포에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포외 전달체로 작용한다.
본 명세서에서 "엑소좀 유사 소낭"은 나노 크기의 세포외 소낭을 의미하는 것으로서, 나노 크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노 크기의 소낭 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소낭을 모두 포함하는 최광의 개념이다.
본 명세서에서 유산균은 분리 균주 또는 시판 중인 다양한 유산균을 제한 없이 사용 가능하다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 유산균은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 페디오코카스(Pediococcus spp.) 및 락토코커스(Lactococcus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 유산균은 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 롱굼(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 플랜타럼(L. plantarum), 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 스트렙토코커스 썰모필러스(S. thermophilus), 스트렙토코커스 패시움(S. faecium), 스트렙토코커스 패칼리스(S. faecalis), 류코노스톡 메센테로이데스(L. mesenteroides), 페디오코커스 세레비지애(P. cerevisiae) 및 락토코거스 락티스(L. lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 세포외 소낭은 유산균 배양액에서 분리된 것일 수 있다. 분리된 세포외 소낭은 전체적으로 또는 부분적으로 본래 존재하는 조직 또는 세포로부터 물리적으로 분리될 수 있다.
일 측면에서, 상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 20 nm 이상, 30 nm 이상, 40 nm 이상, 50 nm 이상, 60 nm 이상, 70 nm 이상, 80 nm 이상, 90 nm 이상 또는 100 nm 이상이면서, 또한 500 nm 이하, 450 nm 이하, 400 nm 이하, 350 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 200 nm 이하, 150 nm 이하 또는 100 nm 이하의 직경을 갖는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 유산균 배양액의 100,000 ×g 이상, 구체적으로 100,000 내지 200,000 ×g, 또는 100,000 내지 150,000 ×g, 또는 150,000 내지 200,000 ×g의 초원심분리에서 침강하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 세포외 소낭은 예컨대, 표적 세포에서 원하는 기능을 효율적으로 수행할 수 있도록 막 성분이 화학적 또는 물리적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 세포외 소낭의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH2)를 이용하여 화학적인 방법으로 변형되거나, 세포외 소낭에 표적유도 물질, 세포막융합 물질, 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시켜 막 성분이 화학적으로 변형된 것일 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 세포외 소낭은 원심분리(centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation), 분별 원심분리(Differential Centrifugation), 등밀도 원심분리(Equilibrium Density Centrifugation), 밀도 구배(density gradient), 여과(filtration), 투석(dialysis) 및 자유 유동 전기이동(free-flow electrophoresis)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있으나, 세포외 소낭의 분리방법이 이에 제한되는 것은 아니다.
밀도 구배는 밀도가 다른 물질을 구분할 때 가장 많이 사용되는 방법으로서, 이 방법의 구체적인 예로는 피콜(ficoll), 글리세롤(glycerol), 수크로즈(sucrose), 염화세슘(cesium chloride), 이오딕사놀(iodixanol) 등의 밀도 기울기 분리 재료를 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 측면에서, 밀도 구배는 초원심분리 등과 함께 사용될 수 있다. 다른 측면에서, 세포외 소낭을 선별하기 위해 겔 여과(gel filtration) 또는 한외여과(ultrafiltration)를 사용할 수 있다. 또 다른 측면에서, 크기가 작은 분자을 제거하기 위해 여과 대신 투석을 사용할 수 있다. 또 다른 측면에서, 자유 유동 전기이동을 사용할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 세포외 소낭은 (1) 유산균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; (2) 상기 수득된 상등액을 여과하는 단계; 및 (3) 상기 수득된 여과물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계;를 포함하여 유효한 활성을 나타내는 유산균 유래의 세포외 소낭을 제조할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 (1) 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 ×g, 또는 1,500 내지 20,000 ×g, 또는 1,500 내지 15,000 ×g, 또는 1,500 내지 10,000 ×g에서 30 내지 60분 동안 실시할 수 있다. 이때, 상기 원심분리는 속도 또는 시간을 변화시켜 단계적으로 실시할 수도 있다. 예컨대, 1,500 내지 2,000 ×g에서 저속으로 원심분리하여 배양액으로부터 유산균 균주를 분리 및 제거하고 세포와 상등배양액을 분리한 후, 10,000 내지 20,000 ×g에서 고속으로 원심분리하여 추가적으로 세포 또는 세포 관련 잔해 및 잔여물 등을 제거할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 (2) 단계에서 여과는 0.3 내지 0.5 ㎛ 크기의 필터로 여과할 수 있다. 상기 여과 공정을 통해 원심분리된 배양액의 순도를 높일 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 (3) 단계에서 초원심분리는 100,000 ×g 이상, 구체적으로 100,000 내지 200,000 ×g, 또는 100,000 내지 150,000 ×g, 또는 150,000 내지 200,000 ×g에서 1 내지 5 시간 동안 실시할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 (3) 단계 후, (4) 상기 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 조성물은 동결건조된 제형일 수 있다. 상기 조성물은 즉시 사용 가능하도록(ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장용기에 담긴 동결건조된 제형일 수 있다.
본 명세서는 또한 유산균 유래의 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하고 동결건조된 제형을 갖는 조성물; 및 멸균수 또는 정제수를 포함하는 탈모 방지용 키트 또는 육모 촉진용 키트를 제공한다. 상기 키트는 즉시 사용 가능하도록(ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장용기에 담긴 키트일 수 있다.
예시적인 일 구현 예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 유산균 유래의 세포외 소낭 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유효성분의 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일 측면에서 상기 조성물 1 ㎍/kg 내지 200 mg/kg, 다른 일 측면에서 50 ㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 약학 조성물은 피부 외용제일 수 있으며, 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭으로서 다양한 제형의 의약품이 여기에 포함될 수 있다.
예시적인 일 구현 예에 따르면, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에는 유산균 유래의 세포외 소낭 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
예시적인 일 구현 예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.
상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다.
상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 다른 측면에서 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 다양할 수 있으나, 본 명세서에 개시된 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 명세서는 또한 탈모 방지 또는 육모 촉진에 유효한 양의 유산균 유래의 세포외 소낭을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 탈모 방지 방법 또는 육모 촉진 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유산균 유래 세포외 소낭의 분리
본 실시예에서는 유산균으로 락토바실러스 속 균주를 사용하여 이로부터 엑소좀 유사 소낭을 포함하는 세포외 소낭을 분리하였다. 락토바실러스 속 균주로는 락토바실러스 루테리(L. reuteri, KCTC 3594), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus, KCTC 5033), 락토바실러스 사케이(L. sakei, KCTC 3603)를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에서 구입하여 이용하였다.
(단계 1) 배양된 락토바실러스 속 균주의 배양액을 4 ℃에서 1,800 ×g으로 20분 동안 원심분리하여 배양액으로부터 락토바실러스 속 균주를 분리 및 제거하였다. 즉, 저속의 원심분리 공정을 통해 세포와 상등배양액을 분리하였다.
(단계 2) 상기 단계 1에서 원심분리된 배양액을 고속원심분리기를 이용하여 4 ℃에서 10,000 ×g으로 20분 동안 원심분리하여 추가적으로 세포 또는 세포 관련 잔해 및 잔여물 등을 제거하였다.
(단계 3) 상기 단계 2에서 원심분리된 배양액을 0.45 ㎛ 바틀 탑 필터를 통해 여과함으로써 배양액의 순도를 증가시켰다.
(단계 4) 상기 단계 3에서 여과한 배양액을 4 ℃에서 150,000 ×g으로 3 시간 동안 초고속원심분리하여 엑소좀 유사 소낭을 분리하였다.
(단계 5) 상기 단계 4에서 초고속원심분리 후 상등액을 제거하고 남은 엑소좀 유사 소낭 펠릿(pellet)을 완충용액(HEPES 버퍼)에 재현탁시켰다.
(단계 6) 상기 단계 5에서 완충용액에 재현탁시킨 엑소좀 유사 소낭을 -70℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
시험예 1. 유산균 유래 세포외 소낭의 크기 측정
상기 실시예 1에서 수득한 락토바실러스 속 균주로부터 분리한 엑소좀 유사 소낭을 Dynamic light scattering 방법을 통해서 그 크기를 분석하여 도 2에 나타내었다.
그 결과, 락토바실러스 속 균주로부터 분리한 엑소좀 유사 소낭은 평균 직경이 20 내지 300 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 확인하였다.
시험예 2. 모낭 세포 증식 효과
상기 실시예 1에서 분리한 락토바실러스 속 균주로부터 배출된 엑소좀 유사 소낭을 모낭 모유두세포(primary human dermal papilla cell, hDPC)에 다양한 농도로 처리하여 유산균 유래의 세포외 소낭의 모낭 세포 증식 효과를 확인하였다.
구체적으로, 모낭 모유두세포(hDPCs(passage 6, 7)를 96-well plate에서 2×104 cells/well 씩 24시간 동안 배양(5% CO2, 37℃)한 후, 락토바실러스 속 균주 유래 엑소좀 유사 소낭을 농도별(0.1~100 μg/ml)로 처리하였다. 이후, 48시간 동안 배양하고 배양 배지를 교체한 후 MTT assay(100 μg/well, 570 nm 흡광도 측정)를 통해 증식 효과를 평가하였다.
도 3은 엑소좀 유사 소낭을 저농도 범위(0.1~20 μg/ml)로 처리하였을 때 모낭 세포 증식 결과를 나타내며, 도 4는 엑소좀 유사 소낭을 고농도 범위(10~100 μg/ml)로 처리하였을 때 모낭 세포 증식 결과를 나타낸다. 도 3 및 4에서 세로축은 모낭 세포 증식 결과(음성 대조군(control, CTL)에 대한 %)를 나타내며, 5% FBS 양성 대조군을 이용하여 비교하였다. 그 결과, 모낭 모유두세포에 락토바실러스 속 유래의 엑소좀 유사 소낭을 처리할 경우 모낭 세포 증식 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
시험예 3. 모발 성장 길이 증가 효과
상기 실시예 1에서 분리한 락토바실러스 속 균주로부터 배출된 엑소좀 유사 소낭을 모낭 기관배양(hair follicle organ culture)에 다양한 농도로 처리하여 유산균 유래의 세포외 소낭의 모발 성장 길이 증가(hair shaft elongation) 효과를 확인하였다.
구체적으로, 모낭(45세 및 63세 남성)을 분리하여 시험군 당 12개씩 2회 반복하여 시험하였으며, 락토바실러스 속 균주 유래 엑소좀 유사 소낭을 농도별(10~20 μg/ml)로 처리하여 배양하였다. 배양배지는 L-글루타민(2 mM), 인슐린(10 ㎕/ml), 항생제(1%), 훈기존(0.1%), (-)히드로코르티손(10 ng/ml)을 포함하는 William's E media를 이용하였고, 3일마다 배지를 교환하여 모발 길이를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 탈모 방지 및 육모 촉진에 효능이 있는 MNX(minoxidil)을 이용하였다.
유산균 유래의 세포외 소낭을 모낭 기관배양(hair follicle organ culture)에 처리하였을 때의 모발 성장 길이 증가 효과는 도 5 및 6에 나타내었다. 그 결과, 도 5 및 6에서 보는 바와 같이 락토바실러스 속 유래의 엑소좀 유사 소낭 처리에 따라 모발 길이가 성장하는 것을 알 수 있었다.
본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 연질캅셀제
실시예 1의 유산균 유래 엑소좀 유사 소낭 50mg, L-카르니틴 80~140mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1캡슐 당 400mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.
[제형예 2] 정제
실시예 1의 유산균 유래 엑소좀 유사 소낭 50mg, 갈락토올리고당 200mg, 유당 60mg 및 맥아당 140mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하여 정제를 제조하였다.
[제형예 3] 과립제
실시예 1의 유산균 유래 엑소좀 유사 소낭 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조하였다.
[제형예 4] 드링크제
실시예 1의 유산균 유래 엑소좀 유사 소낭 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5초간 살균하여 드링크제 음료를 제조하였다.
[ 제형예 5] 연고
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.
표 1.
Figure pat00001
[ 제형예 6] 미용액형 제제
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 미용액형 제제를 제조하였다.
표 2.
Figure pat00002
[ 제형예 7] 샴푸
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 샴푸를 제조하였다.
표 3.
Figure pat00003
[ 제형예 8] 린스
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 린스를 제조하였다.
표 4.
Figure pat00004
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 유산균 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유산균은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 페디오코카스(Pediococcus spp.) 및 락토코커스(Lactococcus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Latobacillus spp.) 속 균주를 포함하는, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 락토바실러스 사케이(L. sakei)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세포외 소낭은 유산균 배양액에서 분리된 것인, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 세포외 소낭은 엑소좀 유사 소낭(exosome-like vesicle)인, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것인, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포외 소낭은 유산균 배양액의 100,000 ×g 이상의 초원심분리에서 침강하는 것인, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 유효성분은 모유두 세포(dermal papilla cells, DPCs)를 활성화하여 모발 성장을 유도하는 것인, 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 유산균 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicle)을 제조하는 방법으로,
    (1) 유산균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    (2) 상기 수득된 상등액을 여과하는 단계; 및
    (3) 상기 수득된 여과물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계;를 포함하는 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 ×g에서 실시하는, 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 초원심분리는 100,000 ×g 이상에서 실시하는, 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 (3) 단계 후,
    (4) 상기 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함하는, 유산균 유래의 세포외 소낭의 제조방법.
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