KR20170006968A - 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체를 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체 (안토시아닌-AuNP)는 상대적으로 적은 양으로도 안토시아닌을 단독으로 투여하는 것에 비하여 뇌에서 아밀로이드 베타의 수준을 감소시키고, 뉴런의 수를 증가시키므로, 상기 결합체를 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 우수한 효과를 가진다.

Description

안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체를 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing and treating neurodegenerative diseases comprising gold nanoparticles and anthocyanins conjugates}

본 발명은 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.

알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease, AD)은 점진적인 기억력 장애, 인지력 결손 등을 초래하는 질병으로, 일단 발병하면 계속 진행되고 근본적인 치료법이 없으며 연령대별 정상군에 비해 평균 기대수명이 단축되는 질환으로 알려져 있다. 상기 질환에서는 뇌 전체에 걸쳐 아밀로이드 베타 (amyloid beta, Aβ) 펩타이드가 침착되어 신경퇴화, 시냅스 장애, 염증 및 활성산소종 생산과 같은 특이적인 병리가 나타난다.

한편, 뇌혈관장벽 (blood-brain barrier, BBB)은 뇌에 존재하는 모세관 벽 (capillary wall)으로, 뇌 실질을 전신 순환으로부터 분리하는 물리적 및 기능적 장애물로 작용함으로써 순환 독소로부터 뇌를 효과적으로 보호하는 역할을 한다. 그러나, 하전된 분자 및 크기가 700 달톤을 초과하는 분자는 대부분 뇌혈관장벽을 통과할 수 없기 때문에 알츠하이머 질환과 같은 뇌 질환의 약리학적 치료에 있어서 장애가 된다. 이러한 문제를 해결하고자, 뇌로 약물 전달을 조절하고 표적화하며, 지속적으로 효과적인 처리를 하기 위한 다양한 약물 전달 전략이 시도되어 왔으나 현재까지 뚜렷한 해결 방안은 마련되지 않았다.

안토시아닌은 과일, 꽃, 식물의 잎 등에서 찾아볼 수 있는 플라보노이드 (flavonoid) 계열의 폴리페놀 (polyphenol)로서, 기억력 및 인지능력에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 (B. Shukitt-Hale etc., Nutr. Neurosci. 12, 135-140 (2009)), 알츠하이머 동물 모델에서도 그 효과가 확인된바 있다 (P.H. Shih, J. Nutr. Biochem. 21, 598-605 (2010)).

이에, 본 발명자들은 뇌혈관장벽을 통과할 수 있는 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 생분해성, 생체적합성 및 약물 탑재 수용력이 높은 금 나노입자 (Gold nanoparticle, AuNP)와 안토시아닌 (anthocyanin)을 결합시켜 안토시아닌-AuNP 결합체를 제조하였고, 상기 결합체가 아밀로이드 베타에 의해 유발될 수 있는 퇴행성 뇌질환 치료에 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "안토시아닌 (anthocyanin)"은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체 (glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속 이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소를 의미한다. 최근에는 안토시아닌이 다양한 생리활성을 가지고 있음이 알려져 있으며, 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이성 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관 보호기능 및 항궤양기능 등이 규명되었다.

상기 안토시아닌은 식물로부터 분리 추출된 것 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 식물은 안토시아닌을 생성하는 식물이라면 모두 포함되며, 예를 들어 흑미 (black rice), 검은콩 (black bean), 블랙커런트 (black currant), 초크베리 (chokeberry), 블랙 초크베리 (black chokeberry), 크랜베리 (cranberry), 오디, 체리, 산딸기, 블루베리, 블랙베리, 가지, 아사이 (acai), 머루 또는 포도일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 검정콩 껍질을 1 % HCl-MeOH 용매조건에서 추출하고 상기 추출물을 Ambrite XAD 7 등과 같은 양이온 교환수지를 이용하여 비이온성 화합물로부터 안토시아닌 성분이 포함된 양이온성 화합물을 수득하였다. 그 다음, 비이온성 수용성 및 비극성 물질을 제거하기 위하여 1 % HCl-MeOH 조건에서 용리하여 안토시아닌 성분을 포함한 이온성 물질을 분리하였다. 그 다음, 상기 화합물을 1% Hcl-MeOH/물 혼합 용매 조건에서 Sephadex LH20을 충진제로 하여 크기배제 크로마토그래피 수행 후, 역상 흡착제인 C18 Sep Pak을 이용하여 안토시아닌계 화합물을 정제하였다.

상기 안토시아닌계 화합물은 예컨대, 델피니딘-3-글루코사이드 (delphinidine 3-0-glucoside), 시아니딘-3-글루코사이드 (cyanidine 3-0-glucoside) 및 폐튜니딘-3-글루코사이드 (petunidin 3-0-glucoside)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 델피니딘-3-글루코사이드 (delphinidine 3-0-glucoside), 시아니딘-3-글루코사이드 (cyanidine 3-0-glucoside) 및 폐튜니딘-3-글루코사이드 (petunidin 3-0-glucoside)의 각각의 화학식은 하기와 같다.

[화학식 1]

본 발명에서, 용어 "금 나노입자"는 금 원자로 이루어진 입자로서, 본 명세서에서는 AuNP로도 명명된다. 상기 금 나노입자는 입자의 직경이, 0.1-100 nm, 구체적으로는 1-50 nm인 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 금 나노입자의 크기는 다양한 조건에 따라 변화될 수 있으며, 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

상기 금 나노입자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 결합체가 투여된 생체 내에서 체류시간을 증진시키기 위해 페길화 (PEGylation) 된 것일 수 있다. 페길화된 금 나노입자는 본 명세서에서 PEG-AuNP로 명명된다.

본 발명의 용어 "페길화 (PEGylation)"는 상기 금 나노입자에 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써, 상기 결합체의 혈중 체류시간을 향상시키는 가공방법을 의미한다. 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜로 금 나노입자를 페길화하는 것에 의해, 나노입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 생체 내의 대식세포 (macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과 (stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서, 상기 페길화에 의하여 상기 결합체의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 금 나노입자가 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용되기에 적합한 안전성을 가지는지를 확인하기 위하여, PEG-AuNP를 세포에 처리하고 MTT 분석 및 ApoTox-Glo^TM Triplex 분석을 수행한 결과, 처리된 모든 농도 (0.5 % 내지 10 %)에서 세포 독성을 띄지 않는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2).

본 발명에서, 용어 "안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체"는 안토시아닌과 금 나노입자가 결합된 형태를 의미하는 것으로, 상기 결합은 금 나노입자와 안토시아닌 간에 물리적, 또는 화학적 결합을 모두 포함할 뿐만 아니라 금 나노입자 내부에 안토시아닌이 캡슐화되는 것까지 포함하는 개념이다. 이때, 상기 설명한 바와 같이 금 나노입자는 페길화된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 페길화된 금 나노입자 (PEG-AuNP)와 안토시아닌을 결합하여, 안토시아닌 및 페길화된 금 나노입자의 결합체 (이하, "안토시아닌-PEG-AuNP"로 명명함)를 제조하였다. 구체적으로 안토시아닌을 에탄올에 용해시킨 후, 상기 용액을 PEG-AuNP와 혼합하고 원심분리하는 과정을 수 회 반복한 뒤 건조시켜 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 제조하였다 (도 3).

본 발명에서 용어, "퇴행성 뇌질환"이란, 뇌와 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 용어를 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 상기 퇴행성 뇌질환은 아밀로이드 베타 펩타이드-유도 산화적 스트레스에 의한 뇌 세포 손상이 유발되는 질환일 수 있고, 더욱 구체적으로는 치매, 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 파킨슨씨병, 헌팅턴병, 피크병 또는 크로이츠펠트-야콥병일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 알츠하이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "알츠하이머"란, 퇴행성 뇌질환으로 노인에게 주로 나타나는 치매의 주요 원인 중 하나이며, 노화의 과정 속에서 뇌조직이 기능을 잃으면서 점차 정신 기능이 쇠퇴하는 병이다. 상기 질병으로 인해 기억력과 정서면에서 심각한 장애가 발생한다. 알츠하이머와 치매를 동일시하는 경우가 있으나 치매는 알츠하이머병에 의해서만 생기는 것이 아니라 고혈압, 당뇨병, 심장질환 등과 같은 성인병이 원인이 되어 발생한다. 알츠하이머 모델의 신경세포 미토콘드리아에서는 아밀로이드 베타가 축적됨이 발견되었고, 미토콘드리아에서 활성산소의 생성이 증가되면서 산화에 의한 손상이 유발되며, 이러한 산화에 의한 손상이 알츠하이머의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 퇴행성 뇌질환 의심 개체에 투여하여 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 퇴행성 뇌질환 발병 개체에 투여하여 상기 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 퇴행성 뇌질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 퇴행성 뇌질환 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 안토시아닌-AuNP 결합체는 상기 퇴행성 뇌질환을 앓고 있거나 또는 퇴행성 뇌질환이 발병 가능성이 있는 환자에 투여되었을 때, 뇌에서 아밀로이드 베타 (amyloid beta, Aβ) 수준을 감소시키거나 뉴런의 수를 증가시킴으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Aβ_{1 -42}를 처리한 알츠하이머 질환 모델 마우스에 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 처리하여 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 더욱 구체적으로, 상기 마우스에 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 처리한 경우, Y-미로 테스트를 통해 공간 작업 기억 능력이 향상되었고 (도 4), Aβ_{1 -42} 처리에 의해 증가된 Aβ, BACE-1 및 인산화된 타우 단백질의 수준을 현저하게 감소시키는 것을 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다 (도 5).

특히, Aβ 수준의 감소 효과는 안토시아닌을 단독으로 처리한 경우에 비하여 상기 결합체를 처리했을 때 더욱 현저하게 나타났으며, 이러한 양상은 해마의 CA1, CA3, DG 영역 및 피질에서 Aβ에 대한 면역 형광 분석에서도 동일하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 6 및 7).

나아가, 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 Aβ_{1 -42} 처리에 의해 유도된 시냅스 기능 장애를 회복시키며 (도 8 및 도 9), 비정상적인 PI-3K/Akt/p-GSK-3β 신호전달 경로를 회복시키고 (도 10), 신경 퇴화를 막는 효과가 있음을 확인하였다 (도 11 및 도 12).

이를 종합하면, 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 Aβ_{1 -42} 처리로 유도한 알츠하이머 모델 마우스에서 우수한 치료 효능을 보이고, 이는 안토시아닌을 단독으로 처리한 경우에 비하여 더 적은 양을 투여한 것임에도 불구하고, 안토시아닌 단독 처리보다 현저한 효과임을 확인하였다. 이에, 본 발명의 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체, 및 퇴행성 뇌질환에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

상기 안토시아닌은 흑미 (black rice), 검은콩 (black bean), 블랙커런트 (black currant), 초크베리 (chokeberry), 블랙 초크베리 (black chokeberry), 크랜베리 (cranberry), 오디, 체리, 산딸기, 블루베리, 블랙베리, 가지, 아사이 (acai), 머루 또는 포도 등의 식물에서 추출 가능한 천연 물질로서 오랫동안 사용되어 안정성이 입증되었다. 또한, 상기 금 나노입자는 본 발명의 구체적인 일 실시예를 통해 세포 독성이 없음을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 따라서 본 발명의 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체는 상식할 수 있으면서도 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.

건강기능식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품 (food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

이때, 상기 건강기능식품에 포함되는 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강기능식품의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

상기 건강기능식품은 본 발명의 약학적 조성물과 유사하게, 퇴행성 뇌질환을 앓고 있거나 또는 퇴행성 뇌질환이 발병 가능성이 있는 환자가 섭취하였을 때, 뇌에서 아밀로이드 베타 (amyloid beta, Aβ) 수준을 감소시키거나 뉴런의 수를 증가시킴으로써 퇴행성 뇌질환을 예방하거나 또는 개선시킬 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 안토시아닌 및 금 나노입자의 결합체 (안토시아닌-AuNP)는 상대적으로 적은 양으로도 안토시아닌을 단독으로 투여하는 것에 비하여 뇌에서 아밀로이드 베타의 수준을 감소시키고, 뉴런의 수를 증가시키므로, 상기 결합체를 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 우수한 효과를 가진다.

도 1은 PEG-AuNP를 농도별 (0.5 %, 1 %, 5 %, 및 10 %)로 처리하여 MTT 분석을 수행한 도이다.
도 2는 Apo-Tox Glo^TM Triplex 분석을 수행한 도이다. PEG-AuNP를 농도별 (0.5 %, 1 %, 5 %, 및 10 %)로 처리하여 HT22의 세포 생존율, 세포 독성 및 세포 예정사를 확인하였다. n = 3.
도 3은 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 확인한 도이다. (A 및 B) 나노입자의 형태는 투과형 전자 현미경(TEM, Tecnai-12, 120 kV)을 이용하여 관찰하였다. (C) TEM 분석으로 뇌 조직에서 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 확인한 것이다.
도 4는 Aβ_{1 -42}를 처리한 마우스에 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 투여하고 Y-미로 테스트를 수행하여 자발 교대 (spontaneous alteration) 수준을 확인한 도이다. Aβ_{1 -42}를 마우스에 처리하거나 처리하지 않고 7 일 동안 유지하였다. Aβ_{1 -42} 처리 7 일 후, 안토시아닌과 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 마우스에 14 일 동안 투여하였다. Y-미로 테스트를 통해 각각의 그룹에 대해 8 분 동안 자발 교대 행동 백분율을 측정하였다. n=15. * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성= P<0.05.
도 5는 Aβ_{1 - 42}처리 마우스에서 Aβ, BACE-1 및 과인산화된 타우 단백질 수준에 대한 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체의 효과를 확인한 도이다. 마우스의 해마에서 Aβ, BACE-1 및 p-Tau (Ser413)의 웨스턴블랏 결과를 나타낸다. 밴드는 Sigma Gel software를 이용해 정량하였고, 그래프로 나타내었다. β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용하였다. 밀도 값은 대조군의 발현 수준을 기준으로 하여 각각 표시된 단백질에 대한 상대적인 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다 (n = 10 마우스/그룹). * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성 = P<0.05.
도 6은 Aβ_{1 - 42}처리 마우스와 Aβ_{1 -42} 및 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체 처리 마우스의 해마에서 면역 반응성을 보기 위해 Aβ의 면역 형광을 확인한 도이다. 10 x 배율. 스케일바 = 100 ㎛. * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성 = P<0.05.
도 7은 Aβ_{1 - 42}처리 마우스와 Aβ_{1 -42} 및 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체 처리 마우스의 피질에서 면역 반응성을 보기 위해 Aβ의 면역 형광을 확인한 도이다. 10 x 배율. 스케일바 = 100 ㎛. * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성 = P<0.05.
도 8은 마우스 해마에서 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체 처리에 따른 시냅토파이신 (synaptophysin), SNAP23, PSD95, p-GluR1 (Ser845), p-CREB (Ser133)의 발현 수준을 확인한 도이다. 밴드는 Sigma Gel software를 이용하여 정량하였고, 이를 그래프로 나타내었다. β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었다. 밀도 값은 대조군의 발현 수준을 기준으로 하여 각각 표시된 단백질에 대한 상대적인 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다 (n = 10 마우스/그룹). * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성 = P<0.05.
도 9는 해마의 CA1, CA3, DG 영역에서 PSD95와 SNAP23의 면역 형광 반응성을 확인한 도이다. 40 x 배율. 스케일바 = 100 ㎛. * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성 = P<0.05.
도 10은 마우스 해마에서 p-PI3K, p-Akt (Ser473), p-GSK3β (Ser9)의 발현 수준을 확인한 도이다. 밴드는 Sigma Gel software를 이용하여 정량하였고, 이를 그래프로 나타내었다. β-액틴은 로딩 컨트롤로 사용되었다. 밀도 값은 대조군의 발현 수준을 기준으로 하여 각각 표시된 단백질에 대한 상대적인 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다 (n = 10 마우스/그룹). * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성= P<0.05.
도 11은 마우스 해마에서 케스파제-9, 케스파제-3 및 분할된 PARP-1의 발현 수준을 확인한 도이다. 밴드는 Sigma Gel software를 이용하여 정량하였고, 이를 그래프로 나타내었다. β-Actin은 로딩 컨트롤로 사용되었다. 밀도 값은 대조군의 발현 수준을 기준으로 하여 각각 표시된 해마 단백질에 대한 상대적인 값을 평균 ± SEM으로 나타내었다 (n = 10 마우스/그룹). * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성= P<0.05.
도 12는 Aβ_{1 -42} 처리 그룹의 해마 DG, CA3, CA1 영역에서 Nissl을 염색한 사진이다. 스케일바 = 200 ㎛. * 대조군과의 유의한 차이; # Aβ_{1 -42} 처리 마우스와의 유의한 차이, 유의성= P<0.05.
도 13은 Aβ_{1 -42} 마우스 모델에 대한 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체의 효과를 개략적으로 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 시약

β-아밀로이드_{1 -42} 및 Aβ_{42 -1} 펩타이드는 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 5 nm의 페길화된 금 나노입자(PEG-AuNP) 수성 현탁액은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 응집을 막기 위해 상기 AuNP를 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 2. 안토시아닌의 추출

검정콩 껍질을 1 % HCl-MeOH 용매조건에서 추출물한 후 상기 추출물을 Ambrite XAD 7 등과 같은 양이온 교환수지를 이용하여 비이온성 화합물로부터 본 발명의 조성물인 안토시아닌 성분이 포함된 양이온성 화합물을 수득한 후 비이온성 수용성 및 비극성 물질을 제거하기 위하여 1 % HCl-MeOH 조건에서 용리하여 안토시아닌 성분을 포함한 이온성 물질을 분리하였다. 두 번째 단계에서 상기 화합물을 1 % Hcl-MeOH/물 혼합 용매 조건에서 Sephadex LH20을 충진제로 하여 크기배제 크로마토그래피 수행 후, 역상 흡착제인 C18 Sep Pak을 이용하여 델피니딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 폐튜니딘-3-글루코사이드를 포함하는 안토시아닌계 화합물을 분리하였다.

실시예 3. MTT 분석

PEG-AuNP의 세포 독성을 평가하기 위해, 다양한 농도의 PEG-AuNP에 대한 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 각 웰 당 200 ㎕ DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 1 x 10⁵ 개의 HT22 해마 뉴런 세포를 접종하였다. 48 시간 동안 배양 후, 상기 세포에 각각 0.1 %, 0.5 %, 5 %, 및 10 %의 PEG-AuNP를 처리하고, 12 시간 동안 배양하였다. 그 다음, PBS (phosphate buffered saline)에 5 mg/㎖의 농도로 용해된 MTT를 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음, DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해된 포르마잔 (formazan)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 셰이커에서 10 분 내지 20 분 동안 교반시켰다. 그 다음, 스캐닝 마이크로플레이트 리더 (scanning microplate reader)를 이용하여 550 내지 570 nm (L1)와 620 내지 650 nm (L2)에서 흡광도를 측정하였다. 상기 L2 흡광도는 세포 찌꺼기와 웰의 결함을 측정하는 것이다. 각 웰의 흡광도를 보정하고 (A = L1 - L2), 세포의 생존율 (%)은 (처리군 웰의 보정된 흡광도/대조군 웰의 보정된 흡광도) X 100으로 계산하였다.

실시예 4. ApoTox - Glo ^TM Triplex 분석

세포 독성, 생존율, 및 카스파제^{3 /7} (caspase^{3 / 7})의 활성을 측정하기 위해 ApoTox-Glo^TM Triplex 분석을 수행하였다.

1 % 페니실린/스트렙토마이신 및 10 % FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 200 ㎕ DMEM에 마우스 해마 뉴런 (HT22) 세포 (2 x 10⁴ 개)를 96-웰 플레이트에 접종하고, 5 % CO₂, 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 48 시간 후, 다양한 농도 (0.5 %, 1 %, 5 %, 및 10 %)의 PEG-AuNP를 세포에 처리하였다.

분석을 위해 GF-AFC 및 bis-Aaf-R110 기질을 포함하는 생존성/세포 독성 시약 20 ㎕를 웰에 첨가고, 30 초 동안 500 rpm으로 오비탈 쉐이킹 (orbital shaking)을 이용하여 혼합한 뒤, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 생존성 측정을 위해 400 nm/505 nm의 파장, 세포 독성을 측정하기 위해 485 nm/520 nm의 파장에서 형광을 측정하였다. GF-AFC (glycyl-phenylalnyl-aminofluorocoumarin) 기질은 살아있는 세포에 들어가서 프로테아제 (protease)에 의해 분해되는 동안 AFC를 방출하므로 이를 이용하여 살아있는 세포의 활성을 측정하였다. bis-AAF-R110 (bis-alanylalanyl-phenylalanyl-rhodamine 110)은 살아있는 세포 보다 죽은 세포의 프로테아제에 의해 분해되고 R110을 방출하므로, 이를 이용하여 죽은 세포로부터 방출되는 프로테아제를 측정하였다.

그 다음, 케스파제^{3 /7} 활성을 측정하기 위해 테트라펩타이드 (tetrapeptide) 서열 DEVD로 이루어진 루미노제닉 (luminogenic) 케스파제^{3 /7} 기질을 사용하였다. 모든 웰에 caspase-Glo 시약을 100 ㎕ 첨가하였고, 30 초 동안 500 rpm의 오비탈 쉐이킹을 이용하여 혼합하였다. 그 다음, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션한 뒤, 케스파제^3/7 활성을 감지하기 위해 발광을 측정하였다.

실시예 5. 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 제조 및 특성 분석

5 nm 금 나노입자 수용액은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 상기 금 나노입자를 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 코팅하였다. AuNP의 응집을 막기 위해 4 ℃에서 보관하였다.

PEG-AuNP와 안토시아닌 결합체의 구체적인 제조방법은 다음과 같다. 안토시아닌 13 mg을 15 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후, 상기 용액을 PEG-AuNP 결합체 40 ㎖와 혼합하고 60 에서 3 시간 동안 교반하였다. 그 다음, 상온에서 용액을 식히고, 부착되지 않은 안토시아닌을 제거하기 위해 4000 rpm에서 원심 분리하였다. 상기 과정은 세 번 반복하였다. 그 다음, 진공상태에서 회전 증발기를 이용하여 용액을 증발시켰다. 투과전자현미경 (TEM, Tecnai-12, 120 kV)을 이용하여 나노입자의 형태를 관찰하고, 나노입자 내부에 캡슐화된 안토시아닌을 확인하였다.

실시예 6. 실험동물 및 약물 처리

Samtako Bio(한국)에서 8 내지 10 주령 (평균 무게 25 g) 수컷 마우스 C57BL/6N을 구입하였고, 23 ℃, 10 % 습도, 12 시간/12 시간의 명/암 사이클을 갖는 환경에서 사육하였다. 마우스가 물과 사료를 자유롭게 이용할 수 있도록 하였다.

마우스는 다음과 같이 다섯 그룹으로 나누었다 (그룹 당 n = 15). (1) 0.9 % 식염수를 처리 (대조군) (C), (2) 베타-아밀로이드 (β-amyloid, Aβ) 처리, (3) 베타-아밀로이드 및 PEG-AuNP (Aβ + AuNP 100 ㎕) 처리, (4) 베타-아밀로이드 및 안토시아닌 (Aβ + Anth 12 mg/kg/일) 처리, (5) Aβ + AuNP (100 ㎕) + 안토시아닌 (6 mg/kg/일) 처리.

약물 처리 과정은 다음과 같다. 멸균된 식염수에 Aβ_{1 -42} 펩타이드 원액 (1 mg/㎖)을 준비하였다. 펩타이드 응집체를 만들기 위해 37 ℃에서 4 일 동안 인큐베이션하였다. 응집된 Aβ_{1 -42} 펩타이드 또는 대조군 (0.9 % NaCl, 3 ㎕/5 분/마우스)을 Hamilton 마이크로주사기 (microsyringe)를 이용하여 뇌혈관 내 (intracerebroventricular, i.c.v.)로 투여하였다. 체중 100 g 당 0.05 ㎖ 럼푼 (rompun)과 체중 100 g 당 0.1 ㎖ 졸리틸 (zoliti)을 조합하여 마취 시켰고, 브레그마 (bregma)에 대한 steriotaxic 좌표에서 (전후 (anterioposterior, AP) 0.2 mm, 좌우 (mediolateral, ML) = 1 mm, 등배 (dorsoventral, DV) = 2.4 mm)로 Hamilton 미량주사기로 뇌실 내 (i.c.v)에 주입하였다. 이 과정 중에, 마취가 타우 과인산화를 일으킬 수 있는 저체온증을 야기하기 때문에 동물들의 체온을 조절하였다.

AuNP 현탁액은 Aβ_{1 -42} 주사 후 7 일 후 0.90 mg/kg 몸무게 농도로 꼬리 혈관을 통해 정맥 주사하였다. 근긴장의 이완을 위해 아이소플루레인 (isoflurane)을 이용하여 마우스를 흡입마취 시켰다. 그 후, AuNP (100 ㎕) 현탁액을 1 ㎖ 인슐린 주사기를 이용하여 천천히 주사하였다. 또한, Aβ_{1 -42} 주사 7 일 후, 안토시아닌 12mg/kg/일과 안토시아닌-PEG-AuNP 6mg/kg/일을 각각 14 일 동안 주사하였다. 행동분석이 완료되었을 때에 생화학적 및 면역 조직 화학적 분석을 위해 동물을 희생시켰다.

실시예 7. 행동학적 분석 (Y-미로 테스트에서 자발적 행동 변화)

Y-미로 장치를 이용하여 마우스의 행동학적 테스트를 수행하였다 (n = 15/그룹). 미로는 검은 색상의 페인트가 칠해진 나무로 만들었다. 미로의 각 팔 (arm)은 길이 50 cm, 높이 20 cm, 폭 10 cm이다. Y-미로 기구 가운데에 각 마우스를 두었고, 8 분의 시간 동안 3 번씩 미로를 자유롭게 움직이도록 하였다. Y-미로 장치의 팔에 진입하는 것을 육안으로 관찰하였고, 삼 반복 세트에서 마우스가 세 개의 팔에 연속적으로 들어가는 것을 자발적 행동 변경 (spontaneous alteration)으로 정의하였다. 변경 행동 (%)는 [성공적인 삼 반복 세트(세 개의 다른 팔로 연속적으로 들어가는 것)/(총 팔 진입횟수-2)]x100으로 평가하였다.

실시예 8. 웨스턴블랏 분석

단백질의 발현 수준은 웨스턴블랏 분석을 이용하여 측정하였다. 행동학적 분석 이후에 마우스를 희생시켰다. 뇌를 빠르게 꺼내어 해마 부분을 절개하고, 드라이아이스로 냉각시켰다. 해마를 프로테아제 저해제가 첨가된 0.2 M PBS에서 분쇄하였다. 분쇄액의 단백질 농도를 측정하기 위해, Bio-Rad 단백질 분석 키트 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 사용하였다.

동량의 단백질 (15-30 ㎍)을 동일한 실험 조건 하에서 4-12 % Bolt^TM 미니 젤과 MES SDS 러닝 버퍼 1 x (Novex, Life Technologies)를 사용하여 전기영동 하였다. 넓은 범위의 분자량 (10-245kDa)을 다룰 수 있는 prestained protein ladders(GangNam stain^TM interon Biotechnology)를 이용하여 분자량의 대조군으로 사용하였다. 멤브레인을 블록킹하고 비특이적 결합을 줄이기 위해 5 % 탈지유를 사용하였다. 그 다음, 상기 멤브레인을 4 ℃에서 일차 항체 (1 : 1000 희석)로 밤새 인큐베이션하였다. 단백질을 검출하기 위해 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 이차 항체를 사용하였고, ECL 감지 시약을 이용하여 단백질을 탐지하였다. X-ray 필름을 스캔 하여, 컴퓨터 기반 sigma gel 프로그램 버전 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용한 덴시토메트리 (densitometry)를 통해 필름에 현상된 밴드의 광학적 밀도를 분석하였다. 사용된 항체는 다음과 같다: 항-BACE-1, 항-Aβ, 항-p-Tau (Ser413), 항-PARP-1, 항-SNAP23, 항-PSD95, 항-Caspase-3, 항-p-GSK3β (Ser9), 항-p- GluR1 (Ser845), 항-β-Actin (이상 Santa Cruz Biotechnology), 항-p-CREB (Ser133), 항-시냅토파이신 (synaptophysin), 항-p-PI3K, 항-pAkt (Ser473), 케스파제-9 (Cell Signalling).

실시예 9. 조직 회수 및 샘플 제조

행동학적 분석 후에 대조군, Aβ 처리군, Aβ 및 안토시아닌 처리군, 및 Aβ 및 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체 처리군의 마우스 뇌 절편을 분석하였다. 경심관류로 (transcardially) 1 X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 관류시킨 후, 4 % 차가운 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 관류시켰다. 그 다음, 4 % 파라포름알데히드로 밤새 뇌를 고정하였고, 20 % 수크로스 용액에 옮겨 72 시간 동안 두었다. 뇌를 얼리기 위해 O.C.T (A.O, USA) 컴파운드 용액으로 옮긴 다음, CM 3050C 저온유지장치 (cryostate) (Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 관상면 14-μm 두께로 절단하였다. 상기 절편을 양전하 슬라이드 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 해동-고정하였다.

실시예 10. 면역 형광 분석

0.01 M PBS로 조직이 올려진 슬라이드를 10 분씩 두 번 세척했다. 그 다음, 표준 염소/소 혈청 및 0.3 % 트리톤 X-100이 PBS에 녹아있는 블로킹 용액에 90 분 동안 슬라이드를 담궜다. 일차 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사의 마우스 단일클론항체 Aβ 및 SNAP23, cell signaling 사의 토끼 다중클론항체 PSD95)를 PBS에 1: 100으로 희석하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음, 1 : 50으로 PBS에 희석한 FITC와 TRITC가 표지된 이차 항체 (Santa Cruz Biotechnology)에 슬라이드를 상온에서 2 시간 동안 둔 뒤, PBS를 이용하여 상기 슬라이드를 5 분씩 두 번 세척하였다. 이중 면역 형광을 위해, 상기 슬라이드를 또 다른 일차 항체로 밤새 인큐베이션하고, 앞의 과정과 동일하게 이차 항체 인큐베이션 및 세척 과정을 반복하였다. 슬라이드는 항-fade 시약 (Molecular Probe, Eugene, OR, USA)으로 마운팅하였다. 이중 면역형광 및 단일 면역형광의 염색 패턴은 공초점 레이저 현미경 (Flouview FV 1000; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

실시예 11. Nissl 염색

조직학적 검사와 뉴런의 손실을 측정하기 위해 Nissl 염색을 수행하였다. 0.01 M PBS에서 14-㎛ 절편 슬라이드를 15 분씩 두 번 세척하고, 0.5 % 크레실 바이올렛 (cresyl violet) 용액 (몇 방울의 빙초산을 포함)으로 10 내지 15 분 동안 염색하였다. 그 다음, 증류수로 상기 절편을 세척하고, 70 %, 95 %, 및 100 %로 점점 에탄올 농도를 증가시키며 탈수시킨 뒤, 자일렌 (xylene)에 두고, 마운팅 용액을 이용하여 커버슬립을 덮었다. 컴퓨터 이미지 분석을 이용하여 해마의 피질, CA1 및 CA3 영역에 있는 세포의 수를 세었다.

실험예 1. 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 생체 외 ( in vitro ) 세포독성

금 나노입자의 세포 독성을 평가하기 위해, 불멸화된 해마 뉴런 HT22 세포주에서 MTT 및 ApoTox-Glo^TM Triplex Assay (Promega)를 수행하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해 0.5 %, 1 %, 5 %, 및 10 % 농도의 PEG-AuNP의 세포 독성을 각각 평가하였다. MTT 분석 결과, 모든 농도에서 세포 생존율에 유의적인 차이가 없었고, PEG-AuNP가 독성을 갖지 않는다는 것을 알 수 있었다 (도 1).

다음으로, 뉴런 HT22 세포에서 세포 생존율, 세포 독성, 및 세포사멸 (세포사멸 마커 케스파제 ^3/7를 이용)을 분석하기 위해 ApoTox-Glo^TM Triplex Assay를 수행하였다. 상기 MTT 분석 결과와 유사하게, ApoTox-Glo^TM Triplex Assay의 결과에서도 PEG-AuNP의 모든 농도 (0.5 %, 1 %, 5 %, 및 10 %)에서 세포 생존율, 세포 독성, 및 세포 사멸은 유의적인 차이가 없었다 (도 2). 상기 결과를 통해 PEG-AuNP는 세포에 독성을 띄지 않는다는 것을 확인하였다.

실험예 2. 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 특성 분석

안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 제조하기 위해, 뇌혈관장벽을 통해 균일한 크기로 분포할 수 있도록 구형 금 나노입자를 선택했고, 응집을 막기 위해 PEG로 코팅하였다.

TEM으로 상기 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 관찰한 결과, 안토시아닌을 포함하는 PEG-AuNP의 유체 역학적 지름은 약 20 nm이고, 규칙적인 모양과 유사한 크기 분포를 가지는 것을 확인하였다 (도 3의 A 및 B). 나아가, 마우스의 해마 조직에서 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 관찰하였다 (도 3의 C).

실험예 3. Aβ _{1 -42} -유도 기억력 장애에 대한 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 효과

Aβ_{1 -42} 주입을 통해 유도된 기억력 장애 마우스 모델에서 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체의 효과를 평가하기 위해, Y-미로 테스트를 이용하여 세 개의 팔 (arm)로 연속하여 들어가는 횟수를 관찰하였고, 마우스의 자발적 행동 변화 (n = 15/group)를 계산하였다.

공간 작업 기억 (spatial working memory) 기능을 나타내는 자발적 행동 변화 비율 (%)은 공간 작업 단기 기억의 형태이다. Aβ_{1 -42}를 투여한 후, 자발적 행동 변화 비율은 대조군에 비해 Aβ_{1 -42} 처리 마우스에서 유의적으로 감소하였는데, 이는 Aβ_1-42에 의해 기억 장애가 유도된 것을 의미한다. 안토시아닌 (12 mg/kg/일) 및 안토시아닌-PEG-AuNP (6 mg/kg/일)의 처리는 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에 비해 자발적 행동 변화를 유의적으로 증가시켰으며, 특히 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 처리한 경우에는 안토시아닌을 단독으로 투여한 경우보다 더 낮은 투여량에도 불구하고 자발적 행동 변화 비율이 가장 크게 증가하였다 (도 4).

실험예 4. 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 Aβ , BACE -1 및 인산화 타우 단백질 수준 감소 효과 확인

응집된 Aβ 펩타이드는 알츠하이머 질환의 핵심적이고 중요한 특징 중 하나이다. 뇌에 Aβ_{1 -42} 주입 후, 웨스턴블랏 분석을 이용하여 뇌에서 Aβ 발현 수준을 분석하였다.

그 결과, Aβ_{1 -42} 처리 마우스는 대조군에 비해 증가한 Aβ 수준을 보였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)은 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에 비해 Aβ의 수준을 유의적으로 감소시켰다. 특히, 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 처리한 경우에는 안토시아닌을 단독으로 처리한 경우보다 더 낮은 투여량에도 불구하고 Aβ의 수준이 가장 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

또한, 면역 형광 분석을 통해 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스의 해마 CA1, CA3, DG 영역에서 Aβ 면역형광 반응성이 향상된 것을 확인하였다. 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에 비해 해마의 CA1, CA3, DG 영역과 피질에서 Aβ 면역형광 반응성을 유의적으로 감소시켰으며, 특히 피질에서는 상기 웨스턴블랏 결과와 마찬가지로 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체를 처리한 경우 안토시아닌을 단독으로 처리한 것 보다 더 낮은 투여량에도 불구하고 Aβ가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).

한편, Aβ_{1 -42}는 BACE-1의 발현 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 웨스턴블랏 결과에서도 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 BACE-1의 발현이 증가하였다. 그러나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에 비해 BACE-1의 발현 수준을 유의적으로 감소시켰다 (도 5).

나아가, Aβ의 증가는 타우 단백질의 과인산화를 활성화시키는 것으로 알려져 있는데, 이를 평가하기 위해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 Ser413이 인산화된 타우 단백질의 웨스턴블랏을 수행하였다. 그 결과, Aβ_{1 -42} 주입은 대조군에 비해 타우 단백질 Ser413의 인산화를 증가시켰다. 하지만, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)를 처리한 마우스는 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에 비해 타우 단백질의 Ser413 인산화 수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

상기 결과를 종합하면, 안토시아닌 또는 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 Aβ_{1 -42} 처리에 의한 Aβ, BACE-1, 및 인산화 타우 단백질 (Ser413)의 수준을 현저히 감소시키며, 특히 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 안토시아닌을 단독으로 처리한 것 보다도 더 낮은 투여량에도 불구하고 Aβ의 수준을 상당히 감소시켰다.

실험예 5. 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 Aβ _{1 -42} 에 의해 유도된 시냅스 기능장애 감소 효과 확인

Aβ는 시냅스 기능장애를 유도하므로, Aβ에 의해 유도된 시냅스 결손에 대한 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 효과를 확인하기 위해, 마우스의 해마에서 시냅스이전 시냅토파이신(pre-synaptic synaptophysin), 시냅스이후 시냅토소말 연관 단백질-23 (post-synaptic synaptosomal associated protein, SNAP-23), 시냅스이후 밀도 단백질 (postsynaptic density protein, PSD95) 및 AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionic acid) 수용체 (AMPAR) 단백질의 발현 수준을 분석하였다.

웨스턴블랏 분석 결과, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 시냅토파이신의 발현 수준이 감소하였다. 그러나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 Aβ_{1 -42}의 영향을 극복하고, 시냅토파이신 발현 수준을 유의적으로 향상시켰다(도 8).

유사하게, Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 PSD95와 SNAP23의 발현 수준이 대조군에 비해 감소하였으나, 안토시아닌과 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 PSD95와 SNAP-23의 발현 수준을 유의적으로 증가시켰다(도 8).

나아가, 면역 형광 분석을 이용하여 해마의 CA1, CA3, DG 부분에서의 SNAP-23과 PSD95의 발현을 조사하였다. Aβ_{1 -42}의 처리는 해마의 CA1, CA3, DG 부분에서 두 단백질의 발현을 모두 감소시켰으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)는 SNAP-23과 PSD95의 발현 수준을 유의적으로 증가시켰다(도 9).

한편, Aβ_{1 -42}에 의해 유도된 시냅스 손상은 AMPAR을 감소시키고, AMPA 수용체 (GluR1)의 Ser845잔기에서 인산화는 시냅스이후 글루타메이트 (glutamate) 수용체의 트래피킹(trafficking) 시스템을 조절하는데 중요한 역할을 하므로, Ser845가 인산화된 GluR1의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 Ser845가 인산화된 GluR1이 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)는 Ser845가 인산화된 GluR1의 발현 수준을 유의적으로 향상시켰다 (도 8).

또한, p-CREB (phosphorylated cAMP response element binding protein)은 메모리 기능과 시냅스형성에 관련된 중요한 전사인자로, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 p-CREB(Ser 133)이 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 p-CREB (Ser133)의 발현 수준을 유의적으로 향상시켰으며, 특히 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 더 낮은 투여량에도 불구하고 안토시아닌 단독 처리에 비하여 pCREB (Ser133)의 발현 수준을 더욱 증가시켰다 (도 8).

실험예 6. Aβ _{1 -42} 에 의해 유도된 비정상적인 PI-3K/ Akt /p- GSK - 3β 신호전달경로를 복구하는 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체 효과 확인

비정상적인 PI-3K/Akt/GSK3β 신호전달경로가 타우 단백질의 과인산화 및 신경 퇴화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, 본 발명자들은 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 타우 인산화와 관련하여 상기 PI-3K/Akt/GSK3β 신호전달경로에 대한 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체의 효과를 조사하였다.

그 결과, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 인산화된 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소 (phosphatidylinositol 3-kinase, p-PI3K)가 유의적으로 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)는 p-PI3K의 수준을 유의적으로 증가시켰다 (도 10).

이와 유사하게, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 Akt (protein kinase B로도 명명됨)의 Ser473의 인산화가 상당히 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)을 처리한 경우 Aβ 영향을 극복하고, p-Akt-Ser473의 인산화를 현저하게 증가시켰다 (도 10).

상기와 같이 Akt의 Ser473 잔기가 인산화되어 Akt가 활성화되면 GSK3β의 Ser9이 인산화되어 GSK3β의 활성이 감소하는 것으로 알려져 있다. 상기 p-Akt 결과와 비슷하게, GSK3β Ser9의 인산화는 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)를 처리한 경우 GSK3β Ser9의 인산화가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 10).

실험예 7. Aβ _{1 -42} 에 의한 신경 퇴화에 대한 안토시아닌-PEG- AuNP 결합체의 효과

신경 퇴화와 관련하여 Aβ_{1 -42}에 의한 세포 사멸이 중요한 역할을 하는데, PI-3K/Akt 경로가 활성화되면 세포사멸 마커(marker)를 막음으로써 Aβ에 의해 유도된 신경 퇴화를 막는 것으로 알려져 있다. 세포사멸 케스케이드 (cascade) 단백질의 발현을 조사하고자, 세포사멸에서 중요한 역할을 하는 케스파제-9 및 케스파제-3에 대한 웨스턴블랏 분석을 수행하였다.

그 결과, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 케스파제-9과 케스파제-3의 발현이 모두 증가하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일) 모두 Aβ_{1 -42}-처리 마우스에서 케스파제-9 및 케스파제-3의 수준을 유의적으로 감소시켰다 (도 11).

한편, Aβ 펩타이드는 DNA 손상을 야기하는 PARP-1의 과활성을 유도하여 결과적으로 해마의 신경 퇴화를 초래하는 것으로 알려져 있어, 웨스턴블랏으로 PARP-1의 발현을 조사하였다. 그 결과, Aβ_{1 -42}를 처리한 마우스의 해마에서 분할된 PARP-1이 증가하는 것을 확인하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 Aβ_{1 -42}만 처리한 그룹에 비해 해마에서 PARP-1 수준을 유의적으로 감소시켰다 (도 11). 이러한 결과는 안토시아닌 및 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체가 Aβ_{1 -42}에 의해 유도되는 세포 사멸 및 신경 퇴화를 회복시키는 효과가 있다는 것을 의미한다.

나아가, Aβ_{1 -42}-처리 마우스의 해마에서 안토시아닌과 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체의 보호 효과를 평가하기 위해 nissl 염색을 수행하였다.

그 결과, 대조군에 비해 Aβ_{1 -42}만 처리한 마우스에서 DG, CA3, CA1 영역의 뉴런의 수가 유의적으로 감소하였으나, 안토시아닌 (12mg/kg/일)과 안토시아닌-PEG-AuNP (6mg/kg/일)의 처리는 뉴런의 수를 유의하게 증가시켰으며, 특히 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 뉴런의 수를 대조군과 유사한 수준까지 증가시켜 더 낮은 투여량에도 불구하고 안토시아닌을 단독으로 처리한 경우보다 현저한 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 12).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체는 세포 독성을 띄지 않으며, Aβ로 유도된 마우스 알츠하이머 질환 모델에서 Aβ의 축적을 감소시키고 관련 신호전달 경로를 조절함으로써 신경 퇴화를 막고 기억력 장애를 향상시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 13). 이러한 결과는 안토시아닌을 단독으로 처리한 경우 보다 더 낮은 투여량에도 불구하고 현저한 것으로, 본원발명의 안토시아닌-PEG-AuNP 결합체가 알츠하이머 등 신경퇴화 관련 질환에 우수한 효과가 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 페길화 (PEGylation) 된 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 안토시아닌은 흑미 (black rice), 검은콩 (black bean), 블랙커런트 (black currant), 초크베리 (chokeberry), 블랙 초크베리 (black chokeberry), 크랜베리 (cranberry), 오디, 체리, 산딸기, 블루베리, 블랙베리, 가지, 아사이 (acai), 머루 또는 포도로부터 추출한 것인, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 파킨슨씨병, 헌팅턴병, 피크병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 조성물.
   
5. 안토시아닌 (anthocyanin) 및 금 나노입자 (gold nanoparticle)의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 금 나노입자는 페길화 (PEGylation) 된 것인, 건강기능식품.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 파킨슨씨병, 헌팅턴병, 피크병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 건강기능식품.
   

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