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KR20170001962A - 항 악성 종양제 조성물 - Google Patents

항 악성 종양제 조성물 Download PDF

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KR20170001962A
KR20170001962A KR1020147034643A KR20147034643A KR20170001962A KR 20170001962 A KR20170001962 A KR 20170001962A KR 1020147034643 A KR1020147034643 A KR 1020147034643A KR 20147034643 A KR20147034643 A KR 20147034643A KR 20170001962 A KR20170001962 A KR 20170001962A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
cells
lat1
inhibitor
cell
Prior art date
Application number
KR1020147034643A
Other languages
English (en)
Inventor
히토시 엔도
마이클 에프. 웸프
쟝-프랑소와 페이롱
나오히코 안자이
프롬스크 주타바
Original Assignee
제이 파마 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제이 파마 가부시끼가이샤 filed Critical 제이 파마 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 신규 항 악성 종양제 조성물을 제공하는 것으로서, LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물에 관한 것이다.

Description

항 악성 종양제 조성물{AN ANTICANCER AGENT COMPOSITION}
본 발명은 신규한 항 악성 종양제 조성물, 예로서, 신규한 T세포 급성 림프성 백혈병/림프종 치료용 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
암(악성 종양)의 증식을 확실하게 억제하고, 또한 부작용이 거의 없는 만족할 만한 항 악성 종양제 조성물 또는 치료법은 아직 발견되지 않아, 그 개발이 강하게 요망되고 있다.
일반적으로, 암세포는 급속하게 증식을 반복하기 때문에, 세포내 대사로 생산할 수 없는 필수 아미노산의 도입이 매우 항진되어 있다. 본 발명자들은, 많은 필수 아미노산을 포함하는 중성 분지쇄 아미노산이나 방향족 아미노산의 세포내 도입에 필요한 막 단백질인 암 특이성 L형 아미노산 트랜스포터의 분자 클로닝에 성공하고, 이것을 시스템 L아미노산 트랜스포터 1(LAT1)이라고 명명했다(Kanai Y. et al., Journal of Biological Chemistry, 273, 23629(1998)). 그리고, 본 발명자들은, LAT1 및 LAT1 유전자를 선택적으로 저해하는 약제 조성물의 연구를 행하여 왔다.
암의 종류로서는, 예를 들어 폐암, 위암, 췌장암, 식도암, 유방암, 대장암, 방광암, 전립선암, 혈액암 등을 들 수 있는데, 이하, 혈액암, 위암, 췌장암, 대장암을 예로 들어 설명한다.
혈액암(조혈기 종양)에는 백혈병, 림프종, 골수종 등이 있다.
백혈병은, 4종류(급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(Acute Lymphocytic Leukemia: ALL), 만성 림프성 백혈병)으로 분류된다. 급성 백혈병은, 종양화가 조혈 간세포 또는 조혈 전구 세포에서 일어나서, 특정한 세포만이 백혈병 세포로서 증식하는 질환이다.
림프종은, 림프 조직을 구성하는 세포에서 유래되는 종양이며, 주로 림프구의 종양화에 의해 야기되는 조혈기 종양이다. 악성 림프종은, 호지킨병과 비호지킨 림프종으로 나뉘어진다.
림프성 백혈병이나 림프종은, 림프구의 주요 구성 세포가 종양화한 것이며, B세포 종양과 T세포 종양으로 나뉘어진다. T세포 종양에는, T세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), T세포 림프 아구성 림프종(T-Lymphoblastic Lymphoma: T-LL), T세포 만성 림프성 백혈병(T-CLL), 성인 T세포 백혈병/림프종(ATL) 등이 포함된다.
림프 아구성 림프종(Lymphoblastic Lymphoma: LL)은, 일반적인 림프종과 비교하여, 보다 미숙한 분화 단계의 림프구가 암화한 것으로, 암세포의 본질은 급성 림프성 백혈병과 동일하다고 생각된다. 그로 인해, WHO 분류에서는 「전구 T 또는 B 림프 아구성 백혈병/림프종」(Precursor T-or B-Lymphoblastic Leukemia/Lymphoma)으로서, 일 군의 질환으로 분류하고 있다.
T세포 림프 아구성 림프종(T-LL) 및 T세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL)은, 흉선 세포의 형질 전환이 분화의 다양한 스테이지에서 방해되는 것으로부터 발생하는, 매우 고악성도의 질환이다(비특허문헌 1). T-ALL은, 각각 전체 성인 및 소아기 비호지킨 림프종의 약 15 및 30％에 상당한다. 최근 들어, T-ALL 환자에 있어서의 침습적인 화학 요법에 의한 치료는, 성인에 있어서 40％ 초과 및 소아 환자에 있어서 80％ 초과까지 치유율을 개선했지만(비특허문헌 2), 난치성의 재발이 모든 이용 가능한 약물 요법에서 일어나는 것이 잘 알려져 있다(비특허문헌 3). 결과적으로, 본 발명자들은, T세포 악성 질환의 원인에 관여하는 분자 메커니즘에 관한 보다 많은 지식이 이러한 치유율을 증강하기 위한 신규 치료 및/또는 병용 치료(combinational treatment)를 동정하기 위해 실로 중대하다고 생각한다.
종양화한 세포(암세포)는, 그것들이 계속적으로 증식하고, 아폽토시스에 의한 배제를 피하여, 확산되며, 또한 치료에 저항하는 것을 가능하게 하는 현저한 특성(hallmark property)(비특허문헌 4)을 나타내는 것이 잘 알려져 있다. 암세포는, 그것들의 대사가 재프로그램화되어 있으며(비특허문헌 5), 이것은, 암세포가 즉시 성장하고, 또한 활발하게 분열하기 위해서, 새로운 단백질, 지질 및 DNA를 생산하는데 필요한 영양소를 점유하도록 그것들의 능력이 증강된 특성이다. 그것들이 종양 형성성의 증식을 촉진시키고, 또한 분화를 어지럽히는, 염색체 전좌 등과 같은 다양한 유전자 장해를 포함하므로, T-ALL/T-LL 세포는 분자 레벨에서 매우 불균질하다(비특허문헌 1). 그러나, 그것들이, 포스파티딜이노시티드3-키나아제/프로테인 키나아제 B; PKB(PI3K/Akt) 경로의 공통이고 본질적인 활성화를 갖는 것으로 나타났다(비특허문헌 6). PI3K/Akt는, 인간 암에 있어서 빈번히 불활성화되는 종양 억제 유전자 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)에 의해 억압된다(비특허문헌 7). PTEN 지질 포스파타아제 활성은, 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-3인산(PIP3)을, Akt 활성화 및 하류의 증식 이벤트를 방해하는 포스파티딜이노시톨4,5-비스인산(PIP2)으로 전환함으로써, 세포 생존(즉, 성장, 증식, 세포내 수송)에 명백하게 관여하는 PI3K의 작용에 대항한다. PTEN의 비존재 하에서, Akt는 충분히 활성이며, 암성의 형질 전환을 향해 세포를 자극한다(비특허문헌 8, 9).
T-ALL/T-LL의 병인에 있어서의 분자 레벨에서의 PTEN의 관여를 조사하기 위해서, 본 발명자들은, 컨디셔널 T세포 특이적 PTEN 결실(PTENf/f x lck-Cre)을 나타내는 마우스 모델을 이용했다(비특허문헌 10). 결과로서 발생하는 자손(tPTEN-/-마우스)은, 고악성도로 침습성의 T세포성 림프종을 즉시 발병하여, 6 내지 20주일 이내에 사멸한다. tPTEN-/-림프종 형성을 지지하는 무질서한 유전자를 강조하기 위해서, SLC7A 5 유전자 상향조절을 동정한 트랜스크립톰(발현 프로파일링) 분석을 실행하였다. SLC7A 5는, 시스템 L 아미노산 트랜스포터 1(LAT1)을 코드한다. 최근 들어, 상당한 발견에 의해, 많은 암성 및/또는 증식 세포가 LAT1 발현에 강하게 관계하는 것이 실증되고 있으며(비특허문헌 11); (비특허문헌 12); (비특허문헌 13); (비특허문헌 14); (비특허문헌 15); (비특허문헌 16), LAT1의 강력하고 선택적인 저해제를 개발하기 위한 활동이 진행중이다(비특허문헌 17). 지금까지는, 4개의 LAT 단백질(즉 LAT1 내지 4)이 동정되어 있고, LAT1 및 LAT3은, 종양 세포에 있어서 가장 빈번히 과잉 발현되는 2개의 아이소폼이다(비특허문헌 18). LAT 단백질은, 글루타민과의 교환으로, 류신, 발린, 이소류신, 페닐알라닌 및 티로신 등과 같은 큰 중성 필수 아미노산(LNEAA)을 이입한다. 운반이 기능적으로 되도록, LAT1은 1회 막 관통 단백질 4F2 세포 표면 항원 중쇄(CD98hc/4F2hc; SLC3A2 유전자에 의해 코드된다)에 결합한 디술피드 결합을 필요로 한다(비특허문헌 11). 그것은 또한, β 인테그린과 상호 작용하는 것으로도 알려져 있다(비특허문헌 19). tPTEN-/- 및 T-ALL/T-LL 세포 표면에서 관찰된 LAT1 발현은, 필시, 보다 고도의 필수 아미노산 도입에 일치하고, 그것에 의해, T-ALL/T-LL 백혈병 세포의 성장 및 생존에 대한 요인이 되는 것이라 추측되었다.
따라서, 본 발명자들의 연구의 주된 목적은, 강력하고 선택적인 LAT1 저해제인 컴파운드-JP(COMPOUND-JP)를 이용함으로써, LAT1의 타겟팅에 대한 유력한 약리학적 역할(복수 가능)을 조사하기 위해서 연구를 실행한 것이었다(비특허문헌 18); (비특허문헌 17); (비특허문헌 20).
<선행기술문헌>
<비특허문헌>
Figure pct00001
Figure pct00002
따라서, 본 발명은 암(악성 종양)의 증식을 확실하게 억제하고, 또한 부작용이 거의 없는 만족할 만한 항 악성 종양제 조성물을 제공하는 것을 과제로 하고, 예로서, T-LL 및 T-ALL 환자의 치유율을 증강하기 위한 신규 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
재프로그램화된 암세포는, 그것들의 병적인 성장 및 증식 속도를 지지하기 위해 많은 영양소의 유입을 필요로 한다. 본 발명자들에 의한 예의 연구의 결과, 시스템 L 아미노산 트랜스포터 1(LAT1)을 코드하는 유전자(SLC7A5)는, pten 종양 억제 유전자를 T세포로부터 결실시킴으로써 생성되는 마우스 림프종 세포에 있어서, 및 인간 T세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL)/림프종(T-LL) 세포에서도 과잉 발현되는 것으로 나타났다. 그리고, 본 연구에서, 본 발명자들은, 어떤 종류의 LAT1 선택적 저해제{예를 들어, O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염, 이하 「컴파운드-JP」라고 한다}를 이용하였다. 컴파운드-JP는, 백혈병성 세포의 생존 능력 및 증식을 감소시켜 일과성의 자식 작용을 유발하고, 그 후 아폽토시스가 계속되며, 게다가, 컴파운드-JP는, 누드 마우스 중에 투여된 이종 이식 루시페라아제 발현 tPTEN-/- 세포의 인 비보에서의 성장을 변화시킬 수 있었다. 대조적으로, 컴파운드-JP는, 정상 마우스 흉선 세포 및 인간 말초혈 림프구에 대하여 무독이었다. 분자 레벨에서, 컴파운드-JP는, mTORC1 및 Akt의 구성적인 활성화를 저해하였다. 컴파운드-JP는, 세포사와 관련한 CHOP 전사 인자에 의해 매개되는 변성 단백질 응답(Unfolded Protein Response)(UPR)을 야기하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한, CHOP 유발 결손의 컴파운드-JP 저항성 tPTEN-/- 클론도 생성하였다. 게다가, 본 발명자들은, 컴파운드-JP가 라파마이신, 덱사메타손, 독소루비신, 벨케이드 및 L-아스파라기나아제와 상승 작용을 나타내어, 백혈병성 세포의 생존 능력을 변화시킬 수 있음을 관찰하였다. 결과는, LAT1에 의해 매개되는 필수 아미노산 유입의 타겟팅이 치명적인 T세포 악성 질환을 치료하기 위한 효율적인 광역성 보조 어프로치가 될 수 있음을 실증한다.
즉, 본 발명자들의 연구로부터 얻어진 실험 결과는, 암세포가 생존하고 증식하기 위해서, T-ALL 및 T-LL 세포 및 tPTEN-/- 마우스가 LAT1에 의해 매개되는 고레벨의 아미노산 유입에 의존하고 있다는 생각을 지지한다. 컴파운드-JP를 사용하는 LAT1의 저해는, tPTEN-/- 종양 세포의 생존을 유지하는 mTOR 경로의 구성적인 활성화에 영향을 주어, CHOP 의존성의 세포사 응답을 야기하고, 흥미 깊은 인 비트로에서의 보조제 특성을 나타냈다.
또한, 인간의 각종 암 유래 수립 배양 세포에 발현하는 중성 아미노산 트랜스포터, LAT1 및 LAT2 유전자의 정량 결과에 의하면, LAT2는 5종의 세포에만 낮은 값을 나타냈지만, 46종류의 세포 모두에 LAT1 mRNA는 발현하고 있어, LAT1은 암 타입의 트랜스포터라 할 수 있다. 한편, LAT2는 암세포에서의 발현은 제로이거나 극단적으로 낮은 값이며, 정상 타입이라고 이해할 수 있다. 그리고, 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 양쪽 세포 모두에 컴파운드-JP의 용량 의존적인 증식 활성의 저하가 명백하게 나타났다. 그 밖의 많은 LAT1 발현 암세포에서도 그것들의 LAT1 발현량에 따른 컴파운드-JP의 증식 억제 효과가 기대된다.
계속해서, 위암, 췌장암, 대장암에 대해서, 컴파운드-JP와 기타 약제의 병용 효과에 관한 본 발명자들에 의한 예의 연구의 결과를 나타낸다. 먼저, 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제(겜시타빈(Gemstabine) 및 파클리탁셀(Paclitaxel))의 병용 효과에 대해서, 병용에 의한 억제 효과는 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 소위 상가 효과를 나타냈다. 이어서, 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제(겜시타빈 및 파클리탁셀)의 병용 효과에 대해서, Panc-1 세포에서의 각 병용에 의한 억제 효과는, 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 44As3-11 세포의 경우와 마찬가지로 소위 상가 효과이었다. 계속해서, 인간 대장암 유래 HT-29 세포 파종 누드 마우스 모델에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 5-FU의 병용 효과에 대해서, 양자의 병용에 의해, 각 단독 군의 잔존 종괴 증대는 더욱 감소하였다. 이 병용 효과는 상가적이며, 양쪽 약물의 작용 기서가 상이한 것에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 병용에 의한 각 단독의 치료 효과를 더 증강할 수 있는 약효는, 임상에서의 대장암 치료에서도 충분히 기대된다. 마지막으로, 인간 대장암 유래 HT-29 세포의 동소 파종 누드 마우스 모델(SOI model)에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 CDDP의 병용에 의한 상승 효과에 대해서, 컴파운드-JP와 CDDP의 단독 투여에서는 나타나지 않았던 각 약효는, 양자의 병용으로 명백한 약효가 나타났다. 이 병용에 의한 약효는 양자의 상승 효과로 결론지어졌다.
따라서, 본 발명자들은, LAT1 저해제 및 LAT1 저해제와 기타 약제의 병용이 상기 항 악성 종양제 조성물로서 유효한 것을 알아내고, 본 발명을 완성시키기에 이른 것이다.
즉, 본 발명(1)은, LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물이다.
본 발명(2)는, 상기 항 악성 종양제 조성물이 T세포 급성 림프성 백혈병/림프종 치료용 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물인 상기 발명(1)에 기재된 조성물이다.
본 발명(3)은, 상기 LAT1 저해제가 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염인 상기 발명(1) 또는 (2)에 기재된 조성물이다.
본 발명(4)는, 상기 약제가 시스플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 겜시타빈, L-아스파라기나아제(로이나제), 파클리탁셀, 덱사메타손, 독소루비신을 비롯한 안트라사이클린계 항생 물질, 벨케이드(보르테조밉), 라파마이신, KU0063794 및 PI-103에서 선택되는 하나 이상의 약제인 상기 발명(1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 조성물이다.
본 발명(5)는, LAT1 저해제와, mTOR 저해제, PI3K 저해제 및 Akt 저해제에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물이다.
본 발명(6)은, 상기 항 악성 종양제 조성물이 T세포 급성 림프성 백혈병/림프종 치료용 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물인 상기 발명(5)에 기재된 조성물이다.
본 발명(7)은, 상기 LAT1 저해제가 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염인 상기 발명(5) 또는 (6)에 기재된 조성물이다.
본 발명(8)은 상기 약제가 라파마이신, KU0063794 및 PI-103에서 선택되는 하나 이상의 약제인 상기 발명(5) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 조성물이다.
본 발명에서, 각종 용어의 의미는 하기와 같다.
(LAT1 저해제)
「LAT1 저해제」란, 시스템 L 아미노산 트랜스포터 1(LAT1) 및 LAT1 유전자를 선택적으로 저해하는 약제인 한 특별히 한정되지 않고, 화합물 및 그의 염, 항LAT1 항체, 앱타머, 핵산 의약을 포함한다. 당해 LAT1 저해제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(알킬화약)
「알킬화약」이란, DNA를 알킬화하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 알킬화약 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 알킬화약을 의미한다. 알킬화약은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(백금 제제)
「백금 제제」란, 백금을 포함하는 항 악성 종양제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 백금 제제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 백금 제제를 의미한다. 백금 제제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(대사 길항제)
「대사 길항제」란, 암세포의 대사를 저해하고, 증식을 억제하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 대사 길항제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 대사 길항제를 의미한다. 대사 길항제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(토포이소메라아제 저해약)
「토포이소메라아제 저해약」이란, 토포이소메라아제라고 불리는 효소의 작용을 방해하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 토포이소메라아제 저해약 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 토포이소메라아제 저해약을 의미한다. 토포이소메라아제 저해약은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(미소관 중합 저해약)
「미소관 중합 저해약」이란, 미소관의 형성을 방해하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 미소관 중합 저해약 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 미소관 중합 저해약을 의미한다. 미소관 중합 저해약은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(내분비 요법제)
「내분비 요법제」란, 내분비(호르몬)의 분비 또는 작용을 억제하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 내분비 요법제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 내분비 요법제를 의미한다. 내분비 요법제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(미소관 탈중합 저해약)
「미소관 탈중합 저해약」이란, 미소관 중합을 안정화시키는 제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 미소관 탈중합 저해약 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 미소관 탈중합 저해약을 의미한다. 미소관 탈중합 저해약은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(항 종양성 항생 물질)
「항 종양성 항생 물질」이란, 항 종양제로서 기능하는, 미생물의 산생물에서 유래되는 물질이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 항 종양성 항생 물질 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 항 종양성 항생 물질을 의미한다. 항 종양성 항생 물질은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(분자 표적약)
「분자 표적약」이란, 종양 세포의 증식, 침윤, 전이 등에 관계되는 분자를 표적으로 하는 약제라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 분자 표적약을 의미한다. 당해 분자 표적약은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(항 악성 종양제)
「항 악성 종양제」란, 예를 들어 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 식물 알칼로이드(토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 미소관 탈중합 저해약 등), 내분비 요법제, 항 종양성 항생 물질, 분자 표적약, 생물학적 응답 조절제 및 그 밖의 약제 등을 들 수 있으며, 예를 들어 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 항 악성 종양제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 항 악성 종양제를 의미한다. 당해 항 악성 종양제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
「유사체」란, O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신과 구조, 기능에 있어서 실질적으로 유사한 분자를 의미한다.
(시스플라틴)
「시스플라틴」이란, 백금 제제인 시스플라틴(CDDP)을 의미하고, 시스플라틴, 및 시스플라틴과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(5-플루오로우라실(5-FU))
「5-플루오로우라실(5-FU)」이란, 대사 길항제인 5-플루오로우라실(5-FU)을 의미하고, 5-플루오로우라실(5-FU), 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(겜시타빈)
「겜시타빈」이란, 대사 길항제인 겜시타빈을 의미하고, 겜시타빈, 및 겜시타빈과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(L-아스파라기나아제(로이나제))
「L-아스파라기나아제(로이나제)」란, 항 악성 종양제인 L-아스파라기나아제(로이나제)를 의미하고, L-아스파라기나아제(로이나제), 및 L-아스파라기나아제(로이나제)와 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(파클리탁셀)
「파클리탁셀」이란, 미소관 탈중합 저해약인 파클리탁셀(탁솔)을 의미하고, 파클리탁셀, 및 파클리탁셀과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(덱사메타손)
「덱사메타손」이란, 주된 성분으로서 부신피질 스테로이드가 포함되어 있는 항 염증 작용이나 면역 제어 작용 등을 가지는 약물인 덱사메타손을 의미하고, 덱사메타손, 및 덱사메타손과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(독소루비신을 비롯한 안트라사이클린계 항생 물질)
「안트라사이클린계 항생 물질」이란, 스트렙토마이세스속 미생물에서 유래되는 항 종양성 항생 물질로서 사용되는 약제의 일 군이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 안트라사이클린계 항생 물질을 의미한다. 당해 안트라사이클린계 항생 물질은, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다. 「독소루비신」이란, 안트라사이클린계 항생 물질인 독소루비신을 의미하고, 독소루비신, 및 독소루비신과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(벨케이드(보르테조밉))
「벨케이드(보르테조밉)」란, 분자 표적약인 벨케이드(보르테조밉)를 의미하고, 벨케이드(보르테조밉), 및 벨케이드(보르테조밉)와 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(라파마이신)
「라파마이신」이란, 분자 표적약인 라파마이신을 의미하고, 라파마이신, 및 라파마이신과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(KU0063794)
「KU0063794」란, 분자 표적약인 KU0063794를 의미하고, KU0063794, 및 KU0063794와 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(PI-103)
「PI-103」이란, 분자 표적약인 PI-103을 의미하고, PI-103, 및 PI-103과 동일한 약리학적 특성을 갖는, 모든 유사체, 유도체 및 동속체를 포함한다.
(mTOR 저해제)
「mTOR 저해제」란, mTOR(mammalian target of rapamycin)을 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는, 또는 mTOR의 활성/기능을 저감 또는 저해하는 약제인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 mTOR 저해제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 mTOR 저해제를 의미한다. 당해 mTOR 저해제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(P13K 저해제)
「P13K 저해제」란, P13K(PI3 키나아제)를 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는, 또는 P13K의 활성/기능을 저감 또는 저해하는 약제인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 P13K 저해제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 P13K 저해제를 의미한다. 당해 P13K 저해제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
(Akt 저해제)
「Akt 저해제」란, Akt를 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는, 또는 Akt의 활성/기능을 저감 또는 저해하는 약제인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인된 기존의 1개 또는 복수의 임의의 Akt 저해제 또는 현재 임상 시험 또는 전 임상 시험 중이거나 또는 장래 임상 시험에서 사용되어, 당해 시험 후에 장래 정부 기관으로부터 의약품으로서의 제조 판매 승인이 될 것인 1개 또는 복수의 임의의 Akt 저해제를 의미한다. 당해 Akt 저해제는, 단독의 약제이거나 2종 이상의 약제의 병용도 포함한다.
도 1은 CD98을 발현하는 레벨이 상승하고 있는 tPTEN-/- 종양, T-ALL/T-LL 세포주 및 초대 샘플에 관한 도면이다.
도 1a는, PTEN-KO 종양(n=4) 및 정상 마우스 흉선 세포(n=3)의 사이의 유전자 발현의 히트 맵 분석을 도시한 도면이다. 배수 변화 발현값(log2)을 p값과 함께 나타낸다.
도 1b 내지 e는, 항 마우스 CD98 래트 mAb 염색, 그 후에 이어지는 2차 항 래트 FITC 항체에 의한 현색 후의 표면 CD98 레벨의 플로우 사이토메트리 분석, 특이적 MFI/비특이적 MFI의 비를 도시한 도면이다.
도 1b는, tPTEN-/- 마우스(n=5) 유래의 초대 종양 세포를 정상 WT 마우스 유래의 흉선 세포와 비교한 도면이다. P값은, 95％의 신뢰 수준에서, ANOVA를 사용하고, 그 후, 두네트(Dunnett)의 다중 비교 검정을 계속함으로써 계산하였다.
도 1c는, 정지 또는 PMA+이오노마이신 활성화(24시간) 정상 마우스 흉선 세포 및 KO99L 세포의 사이의 CD98 발현 레벨을 도시한 도면이다.
도 1d는, 초대 T-ALL 샘플(n=3), T-ALL/T-LL 인간 세포주 및 정상 정지 PBL 또는 활성화 PBL에서의 CD98 발현을 도시한 도면이다. P값은, ANOVA-두네트를 사용하여 계산하였다.
도 1e는, 정지 또는 24시간 활성화 인간 PBL 및 T-ALL 샘플 #1의 사이의 CD98 발현에 관한 Facs 프로파일을 도시한 도면이다.
도 2는, tPTEN-/- 및 T-ALL/T-LL 세포 모델에서의 LAT-1 저해의 기능적 효과에 관한 도면이다.
도 2a는, 아미노산 도입의 붕괴물(disruptor)의 존재하에서 WST-1 세포 생존 능력 어세이를 사용하는 대사 활성에 대한 분석을 도시한 도면이다. 세포를 48시간, 컴파운드-JP, BCH 또는 D-류신과 함께 인큐베이트하였다. 컴파운드-JP: 3가지의 7회의 독립된 실험의 평균+/-SEM; p값은, 양측 스튜던트의 t 시험을 사용하여 계산했다; BCH, D-Leu: 3가지의 1회의 실험.
도 2b는, 증식을, BrdU 도입 Elisa에 의해 평가한 도면이다. 데이터는, 4가지 실행한 2회의 독립된 실험의 평균으로서 나타낸다(평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험).
도 2c는, 세포를 컴파운드-JP에 의해 치료하거나 또는 치료하지 않고, 배지에 나타나는 경우, 비필수(N) 또는 필수(E) 아미노산을 보충한 도면이다. 세포 생존 능력은, 48시간 후에 측정했다(3가지의 3회의 독립된 실험의 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험).
도 2d는, 세포사를 치료 48시간 후, DAPI 염색 후에 플로우 사이토메트리에 의해 분석한 도면이다(3가지의 3회의 독립된 실험의 평균+/-SEM, 스튜던트의 t 시험).
도 2e 내지 g에서, 누드 마우스에, KO99L-LUC 세포를 피하에 접종하고, 48시간 후에 컴파운드-JP(1.5mg/마우스/일)에 의해 매일 치료하였다. 종양의 측정은 18일 후에 행하였다; 평균+/-SEM. 생체 발광은 D-루시페린의 복강내 주사 후에 바이오이미저(BioImager)로 기록하였다.
도 2e는, 종양 체적; 스튜던트의 t 시험을 도시한 도면이다.
도 2f는, 전신 마우스 이미징을 도시한 도면이다. 의사 컬러 눈금은, 어떤 기간에 걸친 상대적인 생체 발광 변화를 나타낸다(ph/s/r: 광자/초/휘도(radiance)).
도 2g는, 종양의 생체 발광 정량화를 도시한 도면이다. p값은, 양측 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험을 사용하여 계산하였다.
도 2h는, 나타내는 용량의 컴파운드-JP의 존재 하에서의 Jurkat 인간 T-ALL 세포의 세포 생존 능력의 측정을 도시한 도면이다. 컴파운드-JP는, T-ALL/T-LL 모델에 영향을 준다.
도 2i는, 동 세포 증식 능력의 측정을 도시한 도면이다(3회의 독립된 실험의 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험).
도 2j는, 인간 T-ALL 초대 샘플의 세포 생존 능력에 대한 컴파운드-JP의 효과를 도시한 도면이다(n=5; 1회의 실험, 평균+/-SEM; p값은, ANOVA, 그 후 두네트의 다중 비교 검정을 사용하여 계산했다; 95％ 신뢰 수준).
도 3은, 컴파운드-JP가 카스파아제 활성화, 아폽토시스 세포사 및 자식 작용을 유발하는 것에 관한 도면이다.
도 3a는, 이펙터에 의한 48시간의 인큐베이션 기간, 그 후에 이어지는 아넥신-V-FITC 및 DAPI에 의한 염색 후의 KO99L 세포의 대표적인 사이토메트리 플롯을 도시한 도면이다. 각각의 상태에서의 세포의 ％를 사분면 중에 나타내었다. 데이터는, 5회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 3b는, 48시간의 컴파운드-JP에 의한 KO99L 세포의 자극 후에, 미토콘드리아의 전위차를 TMRE 염색 후에 Facs에 의해 측정한 도면이다. b1, Facs 프로파일; b2, 결과의 정량화. 2회의 독립된 실험의 대표.
도 3c는, KO99L 세포에서의 카스파아제 3 활성화의 시간적 경과 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다. Cld C3=절단된 카스파아제 3(활성). 3회의 독립된 실험의 대표.
도 3d는, d1, Red-DEVD-fmk 형광 기질을 사용하는, 48시간 후의 카스파아제 3 활성화에 관한 Facs 프로파일을 도시한 도면이다. d2, 2회의 독립된 실험을 대표하는 결과의 정량화.
도 3e는, KO99L 세포에서의 카스파아제 3에 의한 PARP 절단의 시간적 경과 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다.
도 3f는, 48시간의 치료, 그 후에 이어지는 PI 염색 및 Facs 분석 후의, 초대 tPTEN-/- 주에서의 컴파운드-JP에 의한 세포사 유발을 도시한 도면이다(n=5, 평균+/-SEM, 스튜던트의 t 시험).
도 3g는, 초대 tPTEN-/- 종양 세포에서의 카스파아제 3 활성화 및 PARP 절단의 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다. 컴파운드-JP 5.0μM(J5), 10.0μM(J10); PI-10310.0μM(PI), 라파마이신(R: 10.0nM).
도 3h는, KO99L 세포에서, 컴파운드-JP(10.0μM)에 의해 유발되는 LC3 프로세싱의 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다.
도 3i는, KO99L 세포에서의, 컴파운드-JP 유발성의 LC3 프로세싱 및 JNK 활성화에 대한 카스파아제 저해의 시간적 경과 효과를 도시한 도면이다. QVD-OH는, 20.0μM로 사용한다. 웨스턴 블롯 데이터는 모두, 적어도 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 4는, LAT1 기능의 타겟팅이 mTORC1 활성화에 인 비트로 및 인 비보에서 간섭하는 것에 관한 도면이다.
도 4a는, 나타내는 용량의 컴파운드-JP에 의한 KO99L 세포에 대한 시간적 경과 실험을 도시한 도면이다. 총 세포 용해물은, 특정한 항체에 의한 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 데이터는, 적어도 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 4b는, 컴파운드-JP에 의해 치료(적색/청색의 선)(10μM)했거나 또는 미치료의 T-ALL 초대 샘플(n=2, 2가지)(흑색의 선)에서의 포스포 S6RP mAb에 의한 포스포 플로우 염색을 도시한 도면이다. 아이소타입 컨트롤은, 회색의 선으로 나타낸다(평균+/-SEM). 미치료 또는 치료 샘플의 곡선을 피크의 높이에 대하여 표준화하였다. 이벤트(104)를 각각의 샘플에 대하여 얻었다. 조건에 대하여 2가지 실행하였다.
도 4c는, 미치료 또는 컴파운드-JP에 의해 치료한 마우스(50mg/kg/일=1.5mg/마우스/일)에서의 종양 내의 괴사(HES 염색, 좌측 패널) 및 mTORC1 활성화(포스포 S6RP 레벨, 우측 패널)에 관한 면역 조직 화학적 검사 분석을 도시한 도면이다. 배율: 40×; 스케일 바 50㎛.
도 4d는, 나타나는 저해제에 의한 KO99L 세포의 자극 후의 c-myc 레벨의 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다. 컴파운드-JP(JPH)(10.0μM), 벨케이드(Vel)(15.0nM), 라파마이신(Rapa)(100nM), KU0063794(KU)(10.0μM), MK2206(MK; 5.0μM). 데이터는, 적어도 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 5는, 컴파운드-JP의 작용에 대한, 유발성의 스트레스 응답의 관여에 대한 도면이다.
도 5a는, KO99L 세포에서의, 웨스턴 블로팅에 의한 CHOP 단백질 레벨의 분석을 도시한 도면이다. 컴파운드-JP 10.0μM, L-아스파라기나아제 2.5UI/ml(L-asp), 에르위나제(Erwinase) 2.5UI/ml(Erw).
도 5b는, KO99L 세포에서의, 웨스턴 블로팅에 의한, CHOP 단백질 레벨의 분석을 도시한 도면이다. 컴파운드-JP 5.0μM(J5), 10.0μM(J10); 벨케이드 8.0nM(V8), 15.0nM(J15), 라파마이신 10.0nM(R).
도 5c는, 시그널 경로에 대한 아미노산 고갈/보완의 효과를 도시한 도면이다. 배지는, HBSS에 의해 10％까지 희석하고, 회수 및 웨스턴 블로팅 분석 전에 비필수(NEAA)(100×) 또는 필수(EAA) 아미노산(50×)을 보충하였다.
도 5d에서는, 아미노산은 컴파운드-JP(10μM)의 존재하에서 완전 배지에 추가하였다.
도 5e에서는, 세포는 컴파운드-JP(10μM)의 추가 전에 30분간, 살루브리날(salubrinal)(50μM)에 의해 치료하였다.
도 5f는, 살루브리날에 대한 컴파운드-JP 효과에 대한 반응성을 도시한 도면이다. DAPI 염색에 의해 시각화되는 세포사(데이터는, 3가지 실행한 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다; 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험). 증식은, BrdU Elisa
도 5g는, 살루브리날에 대한 컴파운드-JP 효과에 대한 반응성을 도시한 도면이다. (3가지 실행한 1회의 실험; 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험) 또는 세포 계수.
도 5h는, 살루브리날에 대한 컴파운드-JP 효과에 대한 반응성을 도시한 도면이다. (데이터는, 3가지 실행한 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다; 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험)에 의해 평가하였다.
도 6은, 컴파운드-JP에 의해 동원되는, 유발성의 스트레스 응답의 분자의 특징지음에 관한 도면이다.
도 6a 내지 c는, KO99L 세포의 컴파운드-JP(10μM)의 자극 시에 ISR 구성 성분의 시간적 경과 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다.
도 6d는, KO99L 세포의 컴파운드-JP(10μM)자극 시에 있어서의 Bcl2 패밀리 멤버의 시간적 경과 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다.
도 6e는, 컴파운드-JP 유발성의 Bcl2 패밀리 멤버에 대한 살루브리날의 효과를 도시한 도면이다. Hsp90은, 로딩 컨트롤로서 사용하였다. 데이터는 모두, 적어도 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 7은, 컴파운드-JP 저항성의 변이체의 특징지음에 관한 도면이다.
도 7a 내지 c는, 컴파운드-JP에 대하여 감수성의 KO99L 세포의 친 세포(KO99-S)를, 약제의 농도를 증가시키면서 수개월간 인큐베이트하여, 생존하는 저항성의 세포(KO99-RJ)가 얻어졌다.
도 7a는, 컴파운드-JP의 농도를 증가시키면서 배양한 48시간 후의, WST-1 어세이에 의한 세포 생존 능력의 분석을 도시한 도면이다(4가지 실행한 5회의 독립된 실험의 평균+/-SEM; 스튜던트의 t 시험).
도 7b는, 컴파운드-JP의 농도를 증가시키면서 배양한 48시간 후의 PI 염색에 의한 세포사의 분석을 도시한 도면이다(4가지 실행한 적어도 3회의 독립된 실험의 평균; 평균+/-SEM, 스튜던트의 t 시험).
도 7c는, 친 세포와 비교한, 저항성의 변이체에서의, CHOP 유발 및 S6RP 인산화의 웨스턴 블로팅 분석을 도시한 도면이다. 데이터는, 적어도 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 8은, 컴파운드-JP 및 화학 요법제의 사이의 조합 연구에 관한 도면이다.
도 8a 내지 b에서, KO99L 세포는, 라파마이신, PI-103, KU0063794, 독소루비신, 덱사메타손(DXM), 벨케이드 또는 L-아스파라기나아제(L-asp)와 조합한, 최적 이하의 농도의 컴파운드-JP와 함께 인큐베이트되었다. 생존 능력은, WST-1 어세이에 의해 48시간 후에 측정하였다. 결과는, 3회의 독립된 실험의 평균+/-s.e.m이다. P값은, ANOVA, 그 후에 이어지는 투키(Tukey)의 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 8a는, 조합 인덱스(CI)의 발현에 관한 히트 맵을 도시한 도면이다. 약제의 사이의 상승 작용은, 추-탈라레이(Chou-Talalay)법을 사용하여 분석하였다.
도 8b는, 조합 효과에 관한 아이소볼로그램을 도시한 도면이다. 우측 상단의 프레임으로 둘러싼 수는, 생세포의 ％를 나타낸다.
도 9a, b는, 본 발명에 따른 화합물의 반응 스킴을 도시한 도면이다.
도 91a는, 컴파운드-JP는, 정상 흉선 세포가 아니라, 초대 tPTEN-/-세포의 생존에 간섭하는 것을 도시한 도면이다. tPTEN KO 종양(-/-) 또는 정상 흉선 세포(+/+) 유래의 신선한 초대 세포를 세포 생존 능력에 관한 WST-1 분석 전에, 나타내는 용량의 컴파운드-JP와 함께 인큐베이트하였다.
도 91b 내지 d는, 컴파운드-JP는, 정상 인간 혈구에 대하여 독성이 아님을 도시한 도면이다.
도 91b, c는, 인간 제대혈 단핵 세포를, 살아있는 세포의 DAPI 염색 및 Facs 정량화의 48시간 전에, 나타내는 용량의 컴파운드-JP와 함께 인큐베이트하였다. 건강한 도너 유래의 정지 또는 항CD3(48시간, 1.0μg/ml) 활성화 인간 말초혈 림프구의 세포사 분석(B) 및 증식 응답(C)(n=3)을 도시한 도면이다. STS=스타우로스포린(1.0μM)은, 세포사의 적극적인 유발 인자이다.
도 91d는, 살아있는 세포의 DAPI 염색 및 Facs 정량화 후에 분석한 컴파운드-JP(48시간)의 존재 하에서의 정상 인간 제대혈 세포의 생존 능력을 도시한 도면이다.
도 92는, 시그널 전달 저해제의 효과를 도시한 도면이다. 특정한 항체에 의한 웨스턴 블로팅에 의한 분석 전의 SDS-PAGE에 의해 분리되는 총 세포 용해물을 나타냈다. 나타내는 용량의 MK2206(5μM), KU0063794(5μM), 라파마이신(10nM), 에르위나제(2.5UI/ml), L-아스파라기나아제(2.5UI/ml), 벨케이드(15nM)에 의한 KO99L 세포에 대한 시간적 경과 실험. 데이터는, 3회의 독립된 실험을 대표하는 것이다.
도 93a, b는, 조합 연구를 도시한 도면이다. KO99L tPTEN-/- 세포는, WST1 어세이를 사용하는 생존 능력 측정 전에, 나타내는 농도로 48시간, 다른 약제와 조합한 컴파운드-JP와 함께 인큐베이트하였다.
도 94는, 컴파운드-JP에 의한 LAT1 타겟팅의 분자 이벤트를 도시한 도면이다.
도 10은, 인간의 각종 암 유래 수립 배양 세포에 발현하는 중성 아미노산 트랜스포터, LAT1 및 LAT2 유전자의 정량 결과를 도시한 도면이다. 단위 RNA당의 mRNA량을 종축에, 사용한 암세포명을 횡축에, 암 종별명을 표 중에 기재하였다. 상단은 LAT1을, 하단은 LAT2를 기재하였다.
도 11은, LAT1 선택성 저해약, 컴파운드-JP의 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 억제 효과를 도시한 도면이다. 각 값은 동일 조건에서의 4가지 예의 평균값을 컴파운드-JP의 비존재에서의 활성을 100％로 한 상대값으로서 표시하였다. 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다.
도 12는, LAT1 선택성 저해약, 컴파운드-JP와 기존 약 겜시타빈(GEM)과 파클리탁셀(Pac)의 단독 및 병용 작용을 나타내는 실험 수순을 도시한 도면이다.
도 13은, 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과를 도시한 도면이다. 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 겜시타빈 및 파클리탁셀을 단독으로 2시간 작용시킨 효과는, 각 군 칼럼의 좌측의 막대 그래프의 값의 차에 상당한다. 각 실험은 동일 조건의 군을 각각 3가지 예를 측정하여, 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다.
도 14는, 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과를 도시한 도면이다. 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 겜시타빈 및 파클리탁셀을 단독으로 2시간 작용시킨 효과는, 각 군 칼럼의 좌측의 막대 그래프의 값의 차에 상당한다. 각 실험은 동일 조건의 군을 각각 3가지 예를 측정하여, 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다.
도 15는, 인간 대장암 유래 HT-29 세포 파종 누드 마우스 모델에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 5-FU의 병용 효과를 도시한 도면이다.
도 16은, 인간 대장암 유래 HT-29 세포의 동소 파종 누드 마우스 모델(SOI model)에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 CDDP의 병용에 의한 상승 효과를 도시한 도면이다. 도 16에는 각 처치 그룹에서의 종괴의 크기를 막대 그래프로 나타냈다. 그룹 1은 대조군, 2 내지 4는 컴파운드-JP를 각각 3.1, 12.5, 50mg/Kg/일 체중을 4주간 연일 복강 내 단독 투여, 그룹 5는 CDDP를 2.5mg/Kg/일, 0, 6, 13일째의 3회 복강 내 단독 투여, 그룹 6 내지 8에는 동 2 내지 4와 5의 조합에서의 병용 투여, 그룹 9는 컴파운드-JP를 300mg/Kg/일을 4주간 연일 경구 투여를 행하였다.
≪유효 성분≫
본 발명에 따른 LAT1 저해제는, 하기 화합물 1 내지 10에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염을 유효 성분으로서 포함한다.
화합물 1은,
화학식 (I):
Figure pct00003
[식 중, X는 할로겐 원자 또는 알킬기 또는 알콕실기이며,
Y는 O 또는 NH이며,
l은 0 또는 1이며,
m은 0, 1 또는 2이며,
n은 0 내지 5의 정수이며,
R1은, 수소 원자 또는 아미노 보호기이며,
R2는, 수소 원자 또는 알킬, 아르알킬 또는 아릴기이며,
R3은, (1) 할로겐 원자;
(2) 아미노 부분이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아로일아미노기;
(3) 페닐, 페녹시, 피리딜, 피리미디닐 또는 퀴놀릴로 치환된 페닐기(여기서, 해당 페닐기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자, 시아노, 히드록시, 카르복시, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐, 페닐, 디 저급 알킬아미노 또는 티오모르폴리닐로 더 치환되어 있어도 된다);
(4) 나프틸기 또는 테트라히드로나프틸기(여기서, 해당 나프틸기는, 히드록시, 저급 알콕시 또는 디 저급 알킬아미노로 치환되어 있어도 되고, 디 저급 알킬아미노는, 할로겐 원자 또는 히드록시로 더 치환되어 있어도 되고, 나프틸기가 치환되어 있지 않을 때, n은 0 또는 2이며,
나프틸기가 히드록시로 치환되어 있을 때, X는 클로르 원자이며, m은 0이 아니다);
(5) 저급 알킬, 페닐, 나프틸 또는 테트라히드로퀴놀릴로 치환된 N, O 및/또는 S 함유의, 불포화의 단환 복소환식 기(여기서, 해당 단환 복소환식 기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자, 히드록시 또는 페닐로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, m은 1 또는 2이며, l은 1임); 또는
(6) 옥소, 카르복시, 아미노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시클로알킬, 디 저급 알킬아미노, 저급 알콕시카르보닐, 디 저급 알킬카르바모일, 페닐 또는 N, O 및/또는 S 함유의, 포화 또는 불포화의 단환 복소환식 기로 치환되어 있어도 되는 N, O 및/또는 S 함유의, 불포화 또는 부분적으로 포화되어 있어도 되는 축합 복소환식 기(여기서, 해당 축합 복소환식 기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자, 히드록시, 저급 알킬, 저급 알콕시, 페닐, 디 저급 알킬아미노, 저급 알카노일옥시, 비스〔할로(저급)알킬〕아미노 또는 N-저급 알킬-N-히드록시(저급)알킬아미노로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, m은 1 또는 2임)
이다.]
로 표시되는 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 2는,
화학식 (I):
Figure pct00004
[식 중, X는 염소 또는 요오드 원자 또는 알킬 또는 알콕실기이며,
Y는 O 또는 NH이며,
l은 0 또는 1이며,
m은 0 또는 2이며,
n은 0 내지 5의 정수이며,
R1은, 수소 원자 또는 트리플루오로아세틸 또는 t-부톡시카르보닐기이며,
R2는, 수소 원자 또는 알킬기이며,
R3은, (1) 브롬 원자;
(2) 아미노 부분이 저급 알킬로 치환되어 있어도 되는 아로일아미노기;
(3) 페닐, 페녹시, 피리딜, 피리미디닐 또는 퀴놀릴기로 치환된 페닐기(여기서, 해당 페닐기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자 또는 시아노, 히드록시, 카르복시, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐, 페닐, 디 저급 알킬아미노 또는 티오모르폴리닐로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, X는 염소 원자다);
(4) 나프틸기 또는 테트라히드로나프틸기(여기서, 해당 나프틸기는, 히드록시, 디(2-히드록시에틸)아미노 또는 디(2-클로로에틸)아미노기로 치환되어 있어도 되고,
나프틸기가 치환되어 있지 않을 때, n은 0 또는 2이며,
나프틸이 히드록시로 치환되어 있을 때, X는 염소 원자이며, m은 2임); 또는,
(5) 페닐, 나프틸 또는 테트라히드로퀴놀릴로 치환된 N, O 및/또는 S 함유의, 불포화의 단환 복소환식 기(여기서, 해당 단환 복소환식 기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자 또는 히드록시 또는 페닐로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, X는 염소 원자이며, m은 2이며, l은 1임)
이다.]
로 표시되는 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 3은,
R3의(5)에서의 불포화의 단환 복소환식 기가, N 함유, N 및 O 함유 또는 N 및 S 함유의 5원환 또는 6원 복소환식 기인 화합물 2에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 4는,
R3의(5)에서의 불포화의 단환 복소환식 기가, 피리딜, 옥사졸릴 또는 티아졸릴인 화합물 2 또는 3에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 5는,
R1이 수소 원자인 화합물 2 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 6은,
R1이 트리플루오로아세틸 또는 t-부톡시카르보닐기인 화합물 2 내지 4 중 어느 하나에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 7은,
R3이, (3) 페닐, 페녹시, 피리딜, 피리미디닐 또는 퀴놀릴기로 치환된 페닐기(여기서, 해당 페닐기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자 또는 히드록시 또는 디 저급 알킬아미노기로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, X는 염소 원자다);
(4) 히드록시로 치환되어 있어도 되는 나프틸기(여기서, 나프틸이 히드록시로 치환되어 있을 때, X는 염소 원자이며, m은 2임); 또는
(5) 페닐 또는 나프틸기로 치환된 N 및 O 함유의 불포화 단환 복소환식 기(여기서, 해당 단환 복소환식 기에서의 각 치환기는, 히드록시기로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, X는 염소 원자이며, m은 2이며, l은 1임);
인, 화합물 2에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 8은,
R3이, (3) 페닐 또는 피리딜기로 치환된 페닐기(여기서, 해당 페닐기에서의 각 치환기는, 할로겐 원자 또는 디 저급 알킬아미노기로 더 치환되어 있어도 되고, 이 경우, X는 염소 원자다); 또는
(4) 히드록시기로 치환되어 있어도 되는 나프틸기(여기서, 나프틸이 히드록시로 치환되어 있을 때, X는 염소 원자이며, m은 2임)
인, 화합물 2에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 9는,
R3이, (3) 디 저급 알킬아미노기로 치환된 피리딜로 치환된 페닐기(여기서, 이 경우, X는 염소 원자다);
(4) 나프틸기(여기서, n은 0 또는 2임); 또는
(5) 나프틸기로 치환된 N 및 O 함유의 불포화 단환 복소환식 기
인, 화합물 2에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
화합물 10은,
X가 염소 또는 요오드 원자인 화합물 2 내지 9 중 어느 하나에 기재된 방향족 아미노산 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다.
또한, 본 발명에 따른 LAT1 저해제인 컴파운드-JP는, 하기식 (II)로 나타내는 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염이다. 이 화합물 11 또는 그의 약리학적으로 허용될 수 있는 염은, 본 발명에 따른 항 악성 종양제 조성물로서 특히 적합하다.
Figure pct00005
여기서, 「약리학적으로 허용될 수 있는 염」이란, 예를 들어 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등), 암모늄염, 유기 염기(트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 디시클로헥실아민, 디벤질에틸렌디아민 등)와의 염, 유기산(아세트산, 벤조산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 포름산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산 등)과의 염, 무기산(염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등)과의 염, 아미노산(아르기닌, 아스파라긴산, 글루탐산 등)과의 염을 들 수 있다.
또한, 당해 화합물 및 그의 염은, 수화물, 에탄올레이트와 같은 용매화물의 형태이어도 된다. 뿐만 아니라, 수용성을 향상시키기 위해서, 당해 화합물 또는 그의 염은, 시클로덱스트린(예를 들어, β-시클로덱스트린)의 포접체인 것이 적합하다. 여기서, 당해 화합물 또는 그의 염:시클로덱스트린(질량비)은, 적합하게는 1:10 내지 70, 보다 적합하게는 1:20 내지 50, 특히 적합하게는 1:25 내지 35이다.
본 발명에 따른 LAT1 저해제는, 항LAT1 항체를 포함한다. 항LAT1 항체는, LAT1을 특이적으로 인식할 수 있는 항체인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 항hLAT1 모노클로날 항체, 항 마우스 LAT1 모노클로날 항체, 항hLAT1 폴리클로날 항체, 항 마우스 LAT1 폴리클로날 항체를 들 수 있다.
여기서, 항LAT1 항체는, LAT1을 항원으로 하고, 당해 항원에 결합하는 한 특별히 제한은 없으며, 마우스 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 양 항체 등을 적절히 사용할 수 있다.
또한, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 이하와 같이 해서 제작할 수 있다. 즉, 원하는 항원이나 원하는 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하여, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지된 친 세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클로날의 항체 생산 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들어 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981)73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 그리고, 항LAT1 모노클로날 항체를 제작할 때에는, LAT1 또는 당해 단백질의 단편을 항원으로서 사용할 수 있고, 또한, LAT1 또는 당해 단백질의 단편을 발현하는 세포를 항원으로서 사용할 수 있다. 또한, LAT1 또는 당해 단백질의 단편은, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제2판 제1-3권 Sambrook, J.외 저, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989년]에 기재된 방법에 준하여 취득할 수 있다. 또한, LAT1 또는 당해 단백질의 단편을 발현하는 세포도, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제2판 제1-3권 Sambrook, J.외 저, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989년]에 기재된 방법에 준하여 취득할 수 있다.
폴리클로날 항체는, 항원을, 시판하고 있는 아쥬반트(예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬반트)와 함께, 동물의 피하 또는 복강 내에 2 내지 3주일 간격으로 2 내지 4회 정도 투여하고(부분 채혈한 혈청의 항체값을 공지된 항원 항체 반응에 의해 측정하여, 그 상승을 확인해 둔다), 최종 면역으로부터 약 3 내지 10일 후에 전체 혈을 채취하여 항혈청을 정제함으로써 취득할 수 있다. 항원을 투여하는 동물로서는, 래트, 마우스, 토끼, 염소, 모르모트, 햄스터 등의 포유 동물을 들 수 있다.
≪투여 방법≫
본 발명에 따른 항 악성 종양제 조성물은, 예를 들어 경구, 경피 또는 주사에 의해 투여할 수 있다.
경구 투여용의 정제, 과립 및 캡슐제는, 관용의 첨가제, 예를 들어 결합제(예를 들어 시럽, 아라비아 고무, 젤라틴, 소르비톨, 트라간트 또는 폴리비닐피롤리돈); 충전제(예를 들어 유당, 설탕, 옥수수 전분, 인산칼슘, 소르비톨 또는 글리신); 용활제(예를 들어 스테아르산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜 또는 실리카); 붕괴제(예를 들어 감자 전분) 또는 습윤제(예를 들어 라우릴황산나트륨)를 포함하고 있어도 된다. 정제, 과립 및 캡슐제는, 통상의 제제 분야에서 공지된 방법으로 피막을 형성해도 된다.
경구 투여용의 액체 제제는, 예를 들어 수성 또는 유성의 현탁액, 용액, 에멀전, 시럽 또는 엘릭시르의 형태이어도 되고, 사용 전에 물 또는 다른 적절한 용제에 용해하는 동결 건조 제제로 해도 된다. 액체 제제는 통상의 첨가제, 예를 들어 현탁화제(예를 들어 소르비톨, 시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코오스 시럽, 젤라틴 물 첨가 식용지); 유화제(예를 들어 레시틴, 소르비탄모노올레에이트 또는 아라비아 고무); 비수성 부형제(예를 들어 아몬드 유, 분획 야자나무 유 또는 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 에틸알코올과 같은 유성 에스테르); 보존제(예를 들어 메틸 또는 프로필p-히드록시벤조산염 또는 소르브산) 및 착향제 또는 착색제를 포함하고 있어도 된다.
경피 투여하는 경우, 유효 성분은 크림, 로션 또는 연고의 형태를 취하고 있어도 된다. 약제로서 사용할 수 있는 크림 또는 연고 제제는, 당해 분야에서 주지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 주사제는, 당해 화합물 또는 그의 염을 적당한 매체에 현탁 또는 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 주사제에는, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 아쥬반트 등을 포함하고 있어도 된다.
≪투여량≫
본 발명에 따른 항 악성 종양제 조성물의 투여량은, 환자의 연령, 체중, 전신적인 건강도, 성별, 투여 시간, 투여 경로, 질환의 중증도를 포함하는 다양한 요인에 따라 적절히 조정할 수 있고, 한정되지 않지만, 예를 들어 통상, 성인 1일 10 내지 5000mg 정도, 바람직하게는 100 내지 3000mg 정도를, 1 내지 5회에 나누어서 투여하는 것이 적당하다.
본 발명에 따른 LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제의 용량(질량비)에 대해서도, 환자의 연령, 체중, 전신적인 건강도, 성별, 투여 시간, 투여 경로, 질환의 중증도를 포함하는 다양한 요인에 따라 적절히 조정할 수 있고, 한정되지 않지만, 예를 들어 각각 단독 사용에 관한 성인 1일당의 통상 용량을 1로 하면, 통상, 성인 1일당, LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제의 질량비는, 0.1:1 내지 1:0.1이 적당하다.
[실시예]
이하에, 당해 화합물의 제조법을 제조예에 의해, 또한, 상기 의약 조성물로서의 작용 등을 시험예, 그 결과 및 고찰에 의해 상세하게 설명한다. 상기 시클로덱스트린 포접체의 제조예는, 제조예 32에 의해 설명한다.
≪제조예≫
(제조예 1)
1) 28％ 암모니아수(20ml)와 테트라히드로푸란(30ml)의 혼합액 내에, 빙냉 교반 하, 2-나프토일클로라이드(5.70g, 29.9mmol)의 테트라히드로푸란(60ml) 용액을 적하하여, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액으로부터 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사에 물을 첨가하여, 석출물을 여과 취출하고, 건조하여 2-카르바모일나프탈렌(2.68g, 52％)을 무색 고체로서 얻었다.
Figure pct00006
2) 2-카르바모일나프탈렌(2.64g, 15.4mmol)과 4-클로로아세토아세트산에틸(2.06g, 12.5mmol)의 혼합물을 160℃에서 1시간 교반한 후, 실온에서 아세트산에틸(200ml)로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=8 내지 4)로 정제하여, [2-(2-나프틸)-옥사졸-4-일]아세트산에틸에스테르(459mg, 13％)를 황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00007
3) 리튬알미늄하이드라이드(66mg, 1.74mmol)의 테트라히드로푸란(15ml) 현탁액에, 빙냉 교반 하에, [2-(2-나프틸)-옥사졸-4-일]아세트산에틸에스테르(434mg, 1.54mmol)의 테트라히드로푸란(20ml) 용액을 적하하고, 동일 온도에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 동일 온도에서 물(0.1ml), 15％ 수산화나트륨 수용액(0.1ml), 물(0.3ml), 황산나트륨(3g)을 순서대로 가하고, 불용물을 여과 제거하고, 여과액으로부터 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=2 내지 1)로 정제하여, 2-[2-(2-나프틸)-옥사졸-4-일]에탄올(323mg, 88％)을 담황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00008
(제조예 2)
1) 3-아미노-2-히드록시벤조산메틸에스테르염산염(2.0g, 12.0mmol), N,N'-디메틸아닐린(3.04ml, 24.0mmol) 및 테트라히드로푸란(20ml)의 혼합물에 빙냉 교반 하, 이소니코틴산클로라이드염산염(2.34g, 13.2mmol), 트리에틸아민(1.83ml, 13.2mmol) 및 테트라히드로푸란(10ml)의 혼합물을 적하하여, 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 반응액을 염화메틸렌(200ml)으로 희석하고, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(크로마토렉스(등록 상표) NH)(n-헥산/아세트산에틸=4 및 클로로포름/아세트산에틸=1)로 정제하여, 2-히드록시-3-이소니코티노일아미노벤조산메틸에스테르(2.37g, 73％)를 담황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00009
2) 2-히드록시-3-이소니코티노일아미노벤조산메틸에스테르(500mg, 1.84mmol), p-톨루엔술폰산 1수화물(349mg, 1.84mmol) 및 크실렌(20ml)의 혼합물을 14시간 가열 환류한 후, p-톨루엔술폰산 1수화물(349mg, 1.84mmol)을 추가하여, 2시간 가열 환류하였다. 반응액을 빙냉하고, 아세트산에틸, 10％ 탄산칼륨 수용액을 첨가하여 분액하고, 유기상을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 n-헥산/디이소프로필에테르(4/1) 혼합액으로 분쇄하고, 여취한 후 건조하여, [2-(4-피리딜)-벤즈옥사졸-7-일]카르복실산메틸에스테르(382mg, 82％)를 담황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00010
3) [2-(4-피리딜)-벤즈옥사졸-7-일]카르복실산메틸에스테르(360mg, 1.42mmol)의 테트라히드로푸란(15ml) 용액에 빙냉 교반 하, 리튬알미늄하이드라이드(53mg, 1.42mmol)를 10분간에 걸쳐 첨가하고, 동일 온도에서 0.5시간 교반하였다. 반응액에 동일 온도에서 10％ 함수 테트라히드로푸란(2ml), 30％ 수산화나트륨 수용액(0.5ml)을 순서대로 적하하여 실온에서 2시간 교반하였다. 발생한 불용물을 여과 제거하고, 여과액의 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아세트산에틸로 희석하고, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 결정을 n-헥산/디이소프로필에테르(1/1) 혼합액으로 분쇄하고, 여취 후 건조하여, [2-(4-피리딜)-벤즈옥사졸-7-일]메탄올(216mg, 67％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00011
(제조예 3)
1) 3-히드록시벤즈알데히드(1.72g, 14.1mmol), 4-메톡시페닐붕소산(3.16g, 20.8mmol), 분자체 4A 분말(1.95g) 및 아세트산 제2구리(2.96g, 16.3mmol)의 염화메틸렌(100ml) 현탁액에 실온에서 트리에틸아민(7.1ml, 51mmol)을 적하하고, 27.5시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸(200ml)로 희석하고, 불용물을 여과 제거하고, 아세트산에틸로 세정하였다. 여과 세정액을 10％ 염산, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=7)로 정제하여, 3-[(4-메톡시)페녹시]벤즈알데히드(596mg, 19％)를 담갈색 유상물로서 얻었다.
Figure pct00012
2) 3-[(4-메톡시)페녹시]벤즈알데히드(573mg, 2.51mmol)의 에탄올(10ml) 용액에 빙냉 교반 하, 수소화붕소나트륨(158mg, 4.18mmol)을 첨가하고, 실온에서 25분간 교반하였다. 반응액의 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 아세트산에틸로 희석하고, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/아세트산에틸=20)로 정제하여, 3-[(4-메톡시)페녹시]벤질알코올(469mg, 81％)을 무색 유상물로서 얻었다.
Figure pct00013
(제조예 4)
제조예 3에서 얻은 3-[(4-메톡시)페녹시]벤질알코올을 통상의 방법에 의해 탈메틸화하여, 3-[(4-히드록시)페녹시]벤질알코올을 담황색 유상물로서 얻었다.
Figure pct00014
(제조예 5)
2-브로모-6-메톡시나프탈렌(3.0g, 12.7mmol)의 테트라히드로푸란(45ml) 용액에, 아르곤 분위기 하 -60℃에서 n-부틸리튬의 헥산 용액(1.5M; 8.9ml, 13.4mmol)을 적하하고, 동일 온도에서 70분간 교반한 후, 트리n-부틸보레이트(5.2ml, 19.0mmol)를 첨가하여 동일 온도에서 1시간, 5℃에서 1.5시간 교반하였다. 반응액에 5℃에서 20％ 염산(13ml)을 적하한 후, 물을 첨가하고, 실온에서 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 아세트산에틸 및 디에틸에테르로 분쇄한 후, 여취 건조하여, (2-메톡시)-6-나프탈렌붕소산(1.50g, 59％)을 무색 고체로서 얻었다.
Figure pct00015
(제조예 6)
[2-(3-메톡시페닐)-벤즈옥사졸-7-일]메탄올(457mg, 1.79mmol)의 염화메틸렌(10ml) 현탁액에 -78℃에서 3브롬화붕소의 염화메틸렌 용액(1.0M; 7ml, 7mmol)을 적하하고, 동일 온도에서 1시간 교반한 후, 냉각욕을 제거하고, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응액을 빙수(50ml) 중에 붓고, 유기층을 분취한 후, 수층을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 합쳐서 건조한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 플래시 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=3 내지 1)로 정제하여, 7-브로모메틸-2-(3-히드록시페닐)-벤즈옥사졸(535mg, 98％)을 갈색 고체로서 얻었다.
Figure pct00016
(제조예 7)
5-브로모벤조[b]푸란(1.0g, 5.0mmol)의 테트라히드로푸란(10ml) 용액에, 아르곤 분위기 하에서, -60℃에서 n-부틸리튬의 헥산 용액(1.5M; 3.72ml, 5.6mmol)을 적하하고, 동일 온도에서 30분간 교반한 후, 트리메틸보레이트(0.69ml, 6.0mmol)를 첨가하여 4시간에 걸쳐 실온까지 승온시켰다. 반응액에 5℃에서 물(5ml)을 첨가하고, 테트라히드로푸란을 감압 증류 제거하고, 잔사에 1N 염산을 첨가하여 pH1로 하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 n-헥산/디에틸에테르 혼합액으로 분쇄한 후, 여과 취출하고, 건조하여, 5-벤조[b]푸란붕소산(551mg)을 담갈색 고체로서 얻었다.
(제조예 8)
1) 2-브로모벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(572mg, 2.00mmol), 피페리딘(5ml) 및 에탄올(1ml)의 혼합물을 70 내지 75℃에서 2.5시간 교반하였다. 반응액을 실온으로 하여 디에틸에테르(15ml)를 첨가해서 석출물을 여과 제거하고, 디에틸에테르로 세정하였다. 여과액과 세정액을 합쳐서 용매를 감압 증류 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름)로 정제하여, 2-피페리디노벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(526mg, 90％)를 옅은 주황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00017
2) 2-피페리디노벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(475mg, 1.64mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-피페리디노벤조티아졸-7-메탄올(375mg, 91％)을 미황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00018
(제조예 9)
1) 2-브로모벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(715mg, 2.50mmol) 및 페닐붕소산(341mg, 2.8mmol)의 탈기한 디메톡시에탄(20ml) 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(144mg, 0.125mmol), 탄산수소나트륨(630mg, 7.50mmol)의 탈기 수용액(10ml)을 순서대로 첨가해서 50℃에서 10분간 교반한 후, 실온으로 하여 요오드화 제1구리(24mg, 0.125mmol)를 첨가하여 4시간 가열 환류하였다. 디메톡시에탄을 감압 증류 제거하여 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=10)로 정제하여, 2-페닐벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(500mg, 70％)를 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00019
2) 2-페닐벤조티아졸-7-카르복실산에틸에스테르(425mg, 1.50mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-페닐벤조티아졸-7-메탄올(340mg, 94％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00020
(제조예 10)
1) 5-클로로-3-니트로살리실산메틸에스테르(2.32g, 10.0mmol)의 염화메틸렌(25ml) 용액에 빙냉 교반 하, 2,6-루티딘(1.83ml, 15.7mmol), 무수 트리플루오로메탄술폰산(3.67g, 13mmol)을 순서대로 적하하고, 빙냉에서 0.5시간 교반하였다. 반응액에 염화메틸렌(20ml)-빙수(30ml)를 첨가해서 분액하고, 수층을 염화메틸렌으로 추출하였다. 유기층을 합쳐서 수세한 후 건조하여 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=10)로 정제하여, 5-클로로-2-트리플루오로메탄술포닐옥시-3-니트로벤조산메틸에스테르(3.33g, 91％)를 담황색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00021
2) 5-클로로-2-트리플루오로메탄술포닐옥시-3-니트로벤조산메틸에스테르(820mg, 2.25mmol)의 디메틸술폭시드(5ml) 용액에, 트리에틸아민(0.33ml, 2.37mmol) 및 이소인돌린(0.27ml, 2.38mmol)을 순서대로 가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 빙냉하고 빙수(50ml)를 첨가해서 교반한 후, 석출물을 여과 취출해서 수세하여 건조하였다. 얻어진 황색 결정을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=15)로 정제하여, 5-클로로-2-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니오)-3-니트로벤조산메틸에스테르(608mg, 81％)를 황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00022
3) 5-클로로-2-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니오)-3-니트로벤조산메틸에스테르(590mg, 1.77mmol)의 메탄올(6ml)-테트라히드로푸란(9ml) 용액에, 10％ 팔라듐탄소(수분 51.7％, 190mg)를 첨가해서 수소 분위기 하에, 실온에서 24시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거하고, 여과액의 용매를 약 5ml까지 농축하고, 석출 결정을 여과 취출하였다. 여과 취출된 결정에 아세트산에틸(50ml)-물(30ml)을 첨가해서 포화 탄산수소나트륨수로 pH8 내지 9로 하여, 아세트산에틸로 추출하였다. 추출한 유기층은, 포화 식염수로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거함으로써, 1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌[1,2-a]벤즈이미다졸-7-카르복실산메틸에스테르(96mg, 20％)를 미황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00023
4) 1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌[1,2-a]벤즈이미다졸-7-카르복실산메틸에스테르(80mg, 0.30mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌[1,2-a]벤즈이미다졸-7-메탄올(67mg, crude 94％)을 담회백색 고체로서 얻었다.
Figure pct00024
(제조예 11)
1) 2-클로로니코틴산에틸에스테르(928mg, 5.00mmol)의 탈기한 1,4-디옥산(25ml) 용액에 3-비페닐페닐붕소산(1089mg, 5.50mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(578mg, 0.50mmol), 탄산칼륨(2.07g, 15.0mmol)을 순서대로 첨가해서 18시간 가열 환류하였다. 물을 첨가하고 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=5)로 정제하여, 2-(3-비페닐)니코틴산에틸에스테르(1.411g, 93％)를 무색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00025
2) 2-(3-비페닐)니코틴산에틸에스테르(1.38g, 4.55mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-(3-비페닐)피리딘-3-메탄올(1.115g, 94％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00026
(제조예 12)
1) 2-클로로니코틴산에틸에스테르(557mg, 3.0mmol)의 테트라히드로푸란(17ml) 용액에 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린(0, 49ml, 3.9mmol) 및 트리에틸아민(0.47ml, 3.34mmol)을 순서대로 가하여, 18시간 가열 환류하였다. 반응액을 실온으로 하고, 석출물을 여과 제거하여 여과액의 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 아세트산에틸에 용해하고, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하여 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(크로마토렉스(등록 상표) NH)(n-헥산/아세트산에틸=19)로 정제하여, 2-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니오)니코틴산에틸에스테르(529mg, 62％)를 무색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00027
2) 2-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니오)니코틴산에틸에스테르(511mg, 1.81mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀리니오)피리딘-3-메탄올(386mg, 89％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00028
(제조예 13)
1) 3-아미노살리실산메틸에스테르염산염 및 2-메틸티오피리미딘-5-카르복실산클로라이드염산염을 원료로 해서, 제조예 2에 준하여, 2-(2-메틸티오피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르를 미황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00029
2) 2-(2-메틸티오피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(400mg, 1.33mmol)의 테트라히드로푸란(10ml)의 현탁액에 빙냉 하 77％ 메타클로르과벤조산(476mg, 2.12mmol)을 첨가하여 15분간 교반한 후, 또한 실온에서 3시간 교반하였다. 본 반응액에 실온에서 50％ 디메틸아민 수용액을 적하하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 빙냉하고, 물(25ml)을 첨가해서 15분간 교반하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/아세트산에틸=4)로 정제하여, 2-(2-디메틸아미노피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(328mg, 83％)를 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00030
3) 2-(2-디메틸아미노피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(480mg, 1.61mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-(2-디메틸아미노피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-메탄올(234mg, 54％)을 황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00031
(제조예 14)
1) 2-(2-메틸티오피리미딘-5-일)벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(400mg, 1.33mmol)를 원료로 해서, 제조예 13의 2)에 준하여, 2-[2-[N-2-(히드록시)에틸-N-메틸]아미노피리미딘-5-일]벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(322mg, 74％)를 무색 결정으로서 합성하였다.
Figure pct00032
2) 2-[2-[N-2-(히드록시)에틸-N-메틸]아미노피리미딘-5-일]벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(300mg, 0.914mmol)의 히드록시기를 통상의 방법에 의해 테트라히드로피라닐화하여, 2-[2-[N-2-(테트라히드로피란-2-일옥시)에틸-N-메틸]아미노피리미딘-5-일]벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(286mg, 69％)를 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00033
3) 2-[2-[N-2-(테트라히드로피란-2-일 옥시)에틸-N-메틸]아미노피리미딘-5-일]벤즈옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(275mg, 0.667mmol)를 제조예 2의 3)과 마찬가지로 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 2-[2-[N-2-(테트라히드로피란-2-일 옥시)에틸-N-메틸]아미노피리미딘-5-일]벤즈옥사졸-7-메탄올(128mg, 50％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00034
(제조예 15)
1) 수소화붕소나트륨(422mg, 11.14mmol)의 테트라히드로푸란(30ml) 현탁액에, 3불화붕소에테르 착체(1.83ml, 14.86mmol)를 빙냉 교반 하에 10분간에 걸쳐 적하하고, 본 반응액에 (±)-2-페닐-1,4-벤즈옥사진-3-온-8-카르복실산(500mg, 1.86mmol)의 테트라히드로푸란(6ml) 용액을 첨가해서 동 온도에서 5분간, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응액을 빙냉하여 물(20ml)을 적하하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 중화하여 아세트산에틸로 추출하였다. 추출한 유기층은, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거함으로써, (±)-2-페닐-1,4-벤즈옥사진-8-메탄올(397mg, 89％)을 옅은 주황색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00035
2) (±)-2-페닐-1,4-벤즈옥사진-8-메탄올(600mg, 2.49mmol)의 디에틸에테르(22ml) 용액에, 빙냉 교반 하 탄산나트륨(2.90g, 27.35mmol)을 첨가한 후, 무수 트리플루오로아세트산(3.86ml, 27.35mmol)을 적하하고, 동 온도에서 15분간, 실온에서 15분간 교반하였다. 반응액을 빙냉하고 빙수 중에 부어 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물에 디이소프로필에테르를 첨가하여 분쇄하고, 여과 취출하여 건조함으로써, (±)-4-트리플루오로아세틸-8-트리플루오로아세톡시메틸-2-페닐-1,4-벤즈옥사진(973mg, 90％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00036
3) (±)-4-트리플루오로아세틸-8-트리플루오로아세톡시메틸-2-페닐-1,4-벤즈옥사진(953mg, 2.20mmol)의 메탄올(19ml) 용액에, 실온에서 글리신 완충액(pH10, 6.33ml)을 적하하고, 30분간 교반하였다. 본 반응액에 물(70ml)을 첨가해서 실온에서 20분간 교반한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 추출한 유기층은, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거함으로써, (±)-4-트리플루오로아세틸-2-페닐-1,4-벤즈옥사진-8-메탄올(793mg, 수율 정량적)을 옅은 주황색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00037
(제조예 16)
(5-메톡시-2-페닐)벤조[b]푸란-7-카르복실산을 통상의 방법에 의해 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, (5-메톡시-2-페닐)벤조[b]푸란-7-메탄올을 합성하였다.
Figure pct00038
(제조예 17)
3-히드록시메틸플라본-8-카르복실산을 통상의 방법에 의해 히드록시기를 아세틸화한 후 카르복실기를 환원하여, 3-아세톡시메틸플라본-8-메탄올을 합성하였다.
Figure pct00039
(제조예 18)
3-보로모메틸플라본-8-카르복실산에틸에스테르에 통상의 방법에 의해 디메틸아민을 반응시킨 후 환원하여, 3-디메틸아미노메틸플라본-8-메탄올을 합성하였다.
Figure pct00040
(제조예 19)
1) 제조예 17에서 합성한 3-아세톡시메틸플라본-8-메탄올의 히드록시기를 통상의 방법에 의해 메톡시메틸화해서 아세틸기를 제거한 후, 생성된 알코올을 산화하여 8-메톡시메톡시메틸플라본-3-카르복실산을 합성하였다.
Figure pct00041
2) 8-메톡시메톡시메틸플라본-3-카르복실산에 아지드화디페닐포스포릴, t-부탄올을 순서대로 반응시킨 후, 염산물-디옥산으로 가수분해하여 3-아미노플라본-8-메탄올을 합성하였다.
Figure pct00042
(제조예 20)
(5-아미노-2-페닐)벤조[b]푸란-7-카르복실산메틸에스테르를 통상의 방법에 의해 아미노기를 디메틸화한 후 에스테르기를 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, (5-디메틸아미노-2-페닐)벤조[b]푸란-7-메탄올을 합성하였다.
Figure pct00043
(제조예 21)
1) 2-아세트아미노-3-니트로벤조산메틸에스테르(1.444g, 6.06mmol) 및 6N 염산(30ml)의 혼합물을 15분간 가열 환류하였다. 반응액을 빙냉하고, 10％ 탄산칼륨 수용액으로 pH8로 해서 아세트산에틸로 추출하였다. 추출한 유기층은 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하여 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=1)로 정제하여, 2-아미노-3-니트로벤조산메틸에스테르(987mg, 83％)를 황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00044
2) 2-아미노-3-니트로벤조산메틸에스테르(980mg, 5.00mmol)의 메탄올(20ml)-테트라히드로푸란(10ml) 용액에 10％ 팔라듐탄소(수분 51.7％, 250mg)를 첨가하고, 수소 기류 하 실온에서 3시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거하고, 테트라히드로푸란으로 세정하였다. 여과액, 세정액을 합쳐서 용매를 감압 증류 제거함으로써, 2,3-디아미노벤조산메틸에스테르(814mg, 98％)를 황녹색 고체로서 얻었다.
Figure pct00045
3) 2,3-디아미노벤조산메틸에스테르(4.00g, 24.07mmol) 및 벤즈알데히드(2.56g, 24.07mmol)의 니트로벤젠(60ml) 용액을 155 내지 160℃에서 3시간 가열 교반하였다. 반응액을 실온으로 하여 그대로 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=20 및 4)로 정제하여, 2-페닐벤즈이미다졸-4-카르복실산메틸에스테르(3.89g, 64％)를 담황색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00046
4) 60％ 수소화 나트륨(32mg, 0.793mmol)을 n-헥산으로 세정한 후, 2-페닐벤즈이미다졸-4-카르복실산메틸에스테르(200mg, 0.793mmol)의 DMF(1.2ml) 용액을 실온에서 적하하여, 1.5시간 실온 교반하였다. 본 반응액에 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸클로라이드(0.15ml, 0.841mmol)를 적하하고, 실온에서 2시간 교반한 후, 빙냉하고, 물을 첨가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 추출한 유기층은 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하여 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=7 및 2.5)로 정제하여, (용출된 순서대로) 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시메틸]-2-페닐벤즈이미다졸-4 또는 7-카르복실산메틸에스테르(113mg, 37％) 및 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시메틸]-2-페닐벤즈이미다졸-4 또는 7-카르복실산메틸에스테르(133mg, 44％)를 각각 무색 유상 물질로서 얻었다. 용출된 화합물의 순서대로 물성을 나타낸다.
Figure pct00047
5) 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시메틸]-2-페닐벤즈이미다졸-4 또는 7-카르복실산메틸에스테르(120mg, 0.314mmol)(후에 용출된 화합물)를 리튬알미늄하이드라이드로 환원하여, 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시메틸]-2-페닐벤즈이미다졸-4 또는 7-메탄올(94mg, 85％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00048
(제조예 22)
제조예 19의 1)에서 얻은 8-메톡시메톡시메틸플라본-3-카르복실산을 통상의 방법에 의해 아미드화하고, 염산수-메탄올로 메톡시메틸기를 제거한 후, 염화티오닐로 처리하여 8-클로로메틸-3-디메틸카르바모일플라본을 합성하였다.
Figure pct00049
(제조예 23)
제조예 19의 1)에서 얻은 8-메톡시메톡시메틸플라본-3-카르복실산을 통상의 방법에 의해 메틸에스테르화하고, 염산수-메탄올로 메톡시메틸기를 제거한 후, 염화티오닐로 처리하여 8-클로로메틸-3-메톡시카르보닐플라본을 합성하였다.
Figure pct00050
(제조예 24)
제조예 19의 1)에서 얻은 8-메톡시메톡시메틸플라본-3-카르복실산을 통상의 방법에 의해 메톡시메틸기를 제거하고, 카르복실기를 디페닐메틸에스테르로 변환한 후, 염화티오닐로 처리하여 8-클로로메틸-3-디페닐메톡시카르보닐플라본을 합성하였다.
Figure pct00051
(제조예 25)
8-히드록시메틸-3-메틸플라본을 염화티오닐로 처리하여 8-클로로메틸-3-메틸플라본을 합성하였다.
Figure pct00052
(제조예 26)
1) 2,6-디브로모나프탈렌(2.20g, 7.70mmol)을 원료로 해서, 팔라듐 촉매를 사용하는 아미노화 반응으로 2-[비스-2-(벤질옥시)에틸]아미노-6-브로모나프탈렌(2.29g, 61％)을 황색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00053
2) 2-[비스-2-(벤질옥시)에틸]아미노-6-브로모나프탈렌(205mg, 0.42mmol)을 원료로 해서, 제조예 5에 준하여 2-[비스-2-(벤질옥시)에틸]아미노-나프탈렌-6-붕소산(124mg, 65％)을 황색 유상 물질로서 얻었다.
(제조예 27)
1) 2-아미노-5-브로모피리딘(2.0g, 11.56mmol)의 메탄올(465ml) 용액에, 실온에서 37％ 포름알데히드 수용액(13.55ml, 180.3mmol)을 적하한 후, 염화아연(3.94g, 28.90mmol) 및 시아노수소화붕소나트륨(3.63g, 57.80mmol)의 메탄올(155ml) 용액을 적하하여 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액에 5℃에서 빙수(300ml)를 첨가한 후, 메탄올을 감압 증류 제거하여 아세트산에틸-테트라히드로푸란(1/1)으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=24 및 5)로 정제하여, 5-브로모-2-디메틸아미노-피리딘(1.00g, 43％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00054
2) 5-브로모-2-디메틸아미노피리딘(402mg, 2.00mmol)을 원료로 해서, 제조예 5에 준하여 2-디메틸아미노피리딘-5-붕소산(321mg, crude 97％)을 미갈색 분말로서 얻었다.
(제조예 28)
1) 5-브로모-2-클로로피리딘(600mg, 3.12mmol) 및 티오모르폴린(1.60g, 15.59mmol)의 혼합물을 100℃에서 16시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨을 첨가하고 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=50)로 정제하여, 5-브로모-2-티오모르폴리노피리딘(465mg, 58％)을 무색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00055
2) 5-브로모-2-티오모르폴리노피리딘(706mg, 2.72mmol)의 탈기한 톨루엔(30ml)-1,4-디옥산(30ml) 용액에 실온에서 트리에틸아민(30ml), 비스(트리부틸주석)(3.05ml, 6.04mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(315mg, 0.272mmol)을 순서대로 첨가해서 탈기하여 아르곤 치환한 후, 95 내지 100℃에서 14시간 가열 교반하였다. 반응액을 실온으로 하고 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(크로마토렉스(등록 상표) NH)(n-헥산/아세트산에틸=100)로 정제하여, 5-트리-n-부틸스타닐-2-티오모르폴리노피리딘(467mg, 37％)을 무색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00056
(제조예 29)
1) 5-브로모-2-클로로피리미딘(1.79g, 10mmol)에 50％ 디메틸아민 수용액(30ml)을 첨가하고, 아르곤 분위기 하에서, 실온에서 5시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액(15ml)을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 추출층은, 포화 식염수로 세정하여 건조한 후 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 40℃에서 2시간 감압 건조하여, 5-브로모-2-디메틸아미노피리미딘(1.83g, 90％)을 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00057
2) 5-브로모-2-디메틸아미노피리미딘(1.75g, 8.66mmol)의 테트라히드로푸란(18ml) 용액에 아르곤 분위기 하, -78℃에서 n-부틸리튬(1.5M n-헥산 용액; 6.06ml, 9.09mmol)을 15분간에 걸쳐 적하하고, 동 온도에서 2시간 교반한 후, 염화트리-n-부틸주석(2.5ml)을 적하하고, 동 온도에서 0.5시간, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 10％ 불화칼륨 수용액(50ml), 아세트산에틸(50ml)을 순서대로 가하고, 실온에서 0.5시간 교반한 후, 유기층을 분취하였다. 유기층은, 물, 포화 식염수에서 순서대로 세정하고, 건조 후 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 아민 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(크로마토렉스(등록 상표) NH)(n-헥산)로 정제하여, 5-트리-n-부틸스타닐-2-디메틸아미노피리미딘(2.65g, 74％)을 무색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00058
(제조예 30)
N-t-부톡시카르보닐-3,5-디요오도-L-티로신메틸에스테르(700mg, 1.28mmol)의 탈기한 N-메틸피롤리돈(2.1ml) 용액에 아르곤 분위기 하에서, 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(37mg, 0.04mmol), 트리페닐포스핀(69mg, 0.261mmol)을 순서대로 첨가하여 50℃에서 10분간 가열 교반한 후, 실온으로 해서 요오드화 제1구리(24mg, 0.125mmol)를 첨가하였다. 반응액을 50℃에서 10분간 가열 교반한 후, 실온으로 해서 테트라메틸주석(0.39ml, 2.82mmol)을 적하하여 봉관 중 65℃에서 18시간 교반하였다. 반응액을 빙냉하고, 물(10ml), 포화 불화나트륨 수용액을 순서대로 가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 추출층은, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하여 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=5)로 정제하여, N-t-부톡시카르보닐-3,5-디메틸-L-티로신메틸에스테르(230mg, 56％)를 갈색 유상 물질로서 얻었다.
Figure pct00059
(제조예 31)
4-아미노-N-트리플루오로아세틸-L-페닐알라닌에틸에스테르(9.30g, 30.6mmol)의 디메틸포름아미드(305ml) 용액에 N-클로로숙신산이미드(9.79g, 73.32mmol)를 첨가하고, 아르곤 분위기 하, 55℃에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 빙냉 하, 아세트산에틸 및 물을 첨가하고 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 pH8로 해서, 아세트산에틸로 추출하였다. 추출층은, 물, 포화 식염수로 순서대로 세정한 후, 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(n-헥산/아세트산에틸=6)로 정제하여, 4-아미노-3,5-디클로로-N-트리플루오로아세틸-L-페닐알라닌에틸에스테르(8.49g, 74％)를 무색 결정으로서 얻었다.
Figure pct00060
(제조예 32)
도 9-1, 2의 반응 스킴에 따라, 본 발명에 따른 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신·이염산염의 β-시클로덱스트린 포접체를 제조하였다. 당해 염은, 담황색 결정 또는 결정성의 분말이며, 융점이 180 내지 200℃(분해)이었다.
1) 벤조옥사졸 유도체의 합성
(2)의 합성
3-니트로살리실산(1)(201g, 1.09mol)의 메탄올(1600ml) 용액에 실온에서 96％ 황산(60.6ml)을 적하하고, 그 후 23시간 환류하였다. 반응액을 약 1/3이 될 때까지 감압 농축한 후 빙욕에서 냉각하였다. 생성된 고체를 여취, 냉 메탄올(600ml), 냉수(600ml)로 세정하고, 감압 하 40℃에서 건조함으로써 3-니트로살리실산메틸(2)을 209.7g(97％) 황색 고체로서 얻었다.
(3)의 합성
3-니트로살리실산메틸(2)(108.2g, 0.549mol)의 THF(1140ml)/MeOH(810ml) 용액에 10％ Pd-C(15.2g)를 첨가하고, 수소 1 기압 하 실온에서 2시간 접촉 환원하였다. 촉매를 여과 분별하고, THF로 세정한 후 용매 증류 제거하였다. 잔사를 디이소프로필에테르로 세정함으로써, 3-아미노살리실산메틸(3)을 166.7g(95％) 갈색 고체로서 얻었다.
(4)의 합성
3-아미노살리실산메틸(3)(74.8g, 0.447mol)의 THF(1130ml) 용액에 5℃에서 N,N-디메틸아닐린(108.7g, 0.897mol)을 40분간 적하하였다. 반응액을 15분간 교반한 후 벤조일클로라이드(75.7g, 0.538mol)의 THF(570ml) 용액을 1시간에 걸쳐 적하하였다. 동 온도에서 1시간 교반한 후, 물(100ml)을 첨가하고, THF를 증류 제거하였다. 잔사에 물(900ml)을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 10％ 염산, 물, 포화 식염수로 세정, 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 조 결정과 아미노체(3)(90.16g)로부터 마찬가지의 조작으로 얻어진 결정을 합쳐서 아세트산에틸로부터 재결정함으로써, 3-벤조일아미노살리실산메틸(4)을 247.1g(92％) 무색 고체로서 얻었다.
(5)의 합성
3-벤조일아미노살리실산메틸(4)(83.2g, 0.296mol)의 아세트산(1480ml) 용액에 내온 15℃에서 69％ 질산(d=1.42)(95ml, 1.458mol)을 적하하였다. 반응액을 실온에서 3시간 교반한 후, 빙수(300ml)에 주입하여 10분간 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 물(3회), 에테르로 세정한 후 바람 건조함으로써, 3-벤조일아미노-5-니트로살리실산메틸(5)을 93.4g(96％) 황색 고체로서 얻었다.
(6)의 합성
3-벤조일아미노-5-니트로살리실산메틸(5)(72.2g, 0.260mol)과 PPSE의 1,2-디클로로벤젠 용액(780ml)의 혼합물을 150℃에서 4시간 교반하였다. 반응액을 빙냉하고, 석출된 결정을 여취, n-헥산, 냉 메탄올로 세정하여, 감압으로 건조함으로써, 5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(6)를 61.2g(90％) 담황색 고체로서 얻었다.
(7)의 합성
5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-카르복실산메틸에스테르(6)(59.2g, 0.198mol)의 메탄올(990ml) 현탁액에 1M 수산화나트륨 수용액(297ml, 0.297mol)을 적하하고, 그 후 실온에서 19시간 교반하였다. 빙냉 하에 10％ 염산으로 반응액을 산성으로 해서 수 분간 교반하였다. 생성된 고체를 여취, 물, 메탄올로 세정한 후 감압 건조함으로써, 5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-카르복실산(7)을 54.2g(96％) 무색 고체로서 얻었다.
(9)의 합성
5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-카르복실산(7)(26.4g, 0.0931mol)의 THF(470ml) 현탁액에 트리에틸아민(15.57ml, 0.112mol)을 첨가하여 실온에서 30분간 교반하였다. 반응액을 -10℃로 냉각하고, 클로로탄산에틸(10.68ml, 0.112mol)을 첨가해 동온에서 30분 교반하였다. 수소화붕소나트륨(8.84g, 233.7mmol)을 첨가해서 30분 교반한 후, THF/물(317ml/64ml)을 3시간에 걸쳐 -10 내지 -6℃에서 적하하였다. 반응액을 또한 2시간 교반하고, 그 후에 빙수를 주입하여, 석출된 고체를 여취, 물로 세정하였다. 5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-카르복실산(7)(14.6g)으로부터 마찬가지의 조작에 의해 얻어진 고체를 합쳐서, THF(600ml)/메탄올(600ml)에 현탁하고, 1M 수산화나트륨 수용액(115ml)을 첨가한 후 실온에서 4.5시간 교반하였다. 반응액을 빙수에 옮기고, 석출된 고체를 여과한 후 바람 건조함으로써, 7-히드록시메틸-5-니트로-2-페닐벤조옥사졸(9)을 24.4g(63％) 거의 무색의 고체로서 얻었다.
(10)의 합성
7-히드록시메틸-5-니트로-2-페닐벤조옥사졸(9)(46.2g, 0.171mol)의 THF(1150ml) 현탁액에 빙냉 하 트리에틸아민(34.9ml, 0.250mol)을 첨가하였다. 메탄술포닐클로라이드(23.1g, 0.200mol)를 적하하여, 빙냉 하에서 30분, 그 후 실온에서 3시간 교반하였다. 트리에틸아민(4.55ml, 0.033mol), 메탄술포닐클로라이드(1.29ml, 0.017mol)를 추가하여 30분 더 교반하였다. 반응액을 빙수에 주입해서 석출된 고체를 여과하였다. 얻어진 고체를 물, 디이소프로필에테르로 세정한 후 40℃에서 감압 건조함으로써, 5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-일메틸메탄술포네이트(10)를 59.1g(99％) 담황색 고체로서 얻었다.
2) 디클로로티로신 유도체의 합성
(12)의 합성
(S)-티로신메틸에스테르염산염(11)(60.15g, 0.26mol)의 아세트산(294ml) 현탁액에 실온에서 술푸릴클로라이드(52.22ml, 0.65mol)를 적하하고, 그 후 3.5시간 교반하였다. 반응액을 농축하고, 잔사를 에테르로 충분히 세정, 건조함으로써, (S)-디클로로티로신메틸에스테르염산염(12)을 72.70g(93％) 무색 고체로서 얻었다.
(13)의 합성
(S)-디클로로티로신메틸에스테르염산염(12)(72.42g, 0.24mol)의 물(1.4l) 현탁액에 빙냉 하에서 2M 탄산칼륨 수용액(120.5ml)을 적하하였다. 디-t-부틸디카르보네이트(58.1ml, 0.25mol)의 디클로로메탄(1.4l) 용액을 첨가하여 빙냉 하에서 1.5시간, 실온에서 40시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트를 사용하여 여과한 후, 여과액을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 세정, 황산나트륨 건조하고, 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 n-헥산으로 세정함으로써, (S)-N-Boc-디클로로티로신메틸에스테르(13)를 76.95g(88％) 무색 고체로서 얻었다.
3) 본 발명에 따른 화합물 염의 합성
(14)의 합성
5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-일메틸메탄술포네이트(10)(29.11g, 83.6mmol)를 THF(820ml)에 용해하고, 아세톤(820ml)을 첨가하였다. (S)-N-Boc-디클로로티로신메틸에스테르(13)(36.54g, 100mmol), 요오드화나트륨(12.53g, 83.6mmol), 탄산칼륨(17.37g, 125mmol)을 첨가하고, 실온에서 21시간 교반하였다. 반응액을 여과하고, 여과액을 약 1/2까지 농축하였다. 아세트산에틸, 물을 첨가해서 분액한 후, 유기층을 물, 5％ 티오황산나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨 건조하여 용매 증류 제거하였다. 5-니트로-2-페닐벤조옥사졸-7-일메틸메탄술포네이트(10)(30.06g), (S)-N-Boc-디클로로티로신메틸에스테르(13)(37.66g)로부터 마찬가지의 조작에 의해 얻어진 생성물을 첨가하여, 총 116.2g의 조 생성물을 디이소프로필에테르로 세정한 후 건조함으로써, 니트로체(14)를 98.43g(94％) 담황색 고체로서 얻었다.
(15)의 합성
니트로체(14)(57.04g, 92.5mmol)를 THF(1340ml)에 용해하고, 이소프로판올(1340ml)을 첨가해서 내온 60℃로 가열하였다. 5M 염화암모늄 수용액(278ml, 1.39mol), 계속해서 철분(103.32g, 1.85mol)을 가하고, 60℃에서 3시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트를 사용하여 여과하고, 여과액을 약 1/3까지 농축하였다. 셀라이트상의 불필요한 물질은 열 아세트산에틸로 3회 세정하고, 여과액과 합쳐서 물, 포화 식염수로 세정한 후 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 증류 제거하고, 얻어진 고체를 디이소프로필에테르로 세정, 건조함으로써 아미노체(15)를 53.03g(98％) 황색 고체로서 얻었다.
(16)의 합성
아미노체(15)(86.91g, 0.148mol)를 THF(1430ml)에 용해하여, 내온이 약 10℃가 되도록 빙욕으로 냉각하면서 0.5M 수산화리튬 수용액(444ml, 0.222mol)을 적하하고, 또한 빙욕 중에서 1시간 교반하였다. 반응액을 약 1/2가 될 때까지 농축하고, 물(600ml)을 첨가하고, 또한 10％ 시트르산 수용액으로 pH를 약 4로 한 후, 아세트산에틸-THF(10:1)로 추출하였다. 추출액을 물, 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨 건조, 용매 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 아세트산에틸-THF(10:1)로부터 재결정하여, 거의 무색의 고체(72.94g, 조 수율 86％)를 얻었다. 이 고체(10.03g)를 클로로포름-메탄올(10:1)로부터 재결정하여, 카르복실산(16)을 8.63g(회수율 86％) 거의 무색의 고체로서 얻었다.
(17) 본 발명에 따른 화합물 염의 합성
빙냉 하 카르복실산(16)(85.23g, 0.149mol)의 THF(750ml) 용액에 5 내지 10℃에서 4M 염화수소-디옥산(1117ml, 4.47mol)을 2시간에 걸쳐 적하하였다. 반응액을 동 온도에서 1시간 교반한 후, 서서히 승온해서 실온에서 20시간 교반하였다. 디이소프로필에테르를 첨가하여 고체를 여과 취출하고, 디이소프로필에테르로 세정하였다. 얻어진 고체를 3로트로 나누어서 에탄올(총 2300ml)에 용해하여, 불용물을 여과 분별하였다. 여과액을 실온, 감압으로 약 1000ml까지 농축하고, 얻어진 용액을 실온에서 교반하였다. 생성한 결정을 여과하고, 건조함으로써, 본 발명에 따른 화합물 염(17)을 66.11g(81％) 담황색 고체로서 얻었다.
4) 시클로덱스트린 포접체의 합성
(1) 술포부틸 에테르-β-시클로덱스트린(SBE-CD라 약기함: 상품명 캅티솔(Captisol))을 1000g 칭량하여, 세포 배양용의 무균 후드 내에서, 5L의 용기에 취하고, HPLC용 그레이드의 순수 1800ml를 가하여, 밤새 교반하여 맑은 용액을 얻었다(약 36중량％가 됨).
(2) 다음날 아침, 수조 중에서 32-36℃로 가온하여, 이 온도를 유지하고, 본 발명에 따른 화합물의 HCl염을 45.5g; 유리 염기로서 35.5g 상당에 100ml의 에탄올, 200ml의 순수, 그리고 300ml의 상기 SBE-CD 용액을 첨가하여, 화합물 용액을 얻었다. 이 용액의 pH가 3 내지 4인 것을 확인하였다.
(3) 3.4g의 가성 소다를 200ml의 순수에 용해하고, 상기 용액을 교반하면서 이 가성 소다수를 가하여, pH를 6.5로 제조하였다.
(4) 이 따뜻한 상태에서, 용액을 진공 펌프를 사용하여, 0.4㎛의 필터로 멸균 여과하였다. 여과액은 멸균 완료된 5L의 용기에 취해서, (1)에서 제조한 SBE-CD 용액으로 희석하여, 최종 용량을 2800ml로 조정하였다.
(5) 또한 5분간 교반한 후에, pH를 측정하여, 6.5인 것을 확인하였다. 멸균 분주기를 사용하여, 30ml 바이얼병에 각 15ml씩 분주하였다. 최종 화합물 농도는 10mg/ml가 되었다. 각 바이얼은 1주일에 걸쳐 동결 건조기(리오스타(Lyostar) 3, FTS 시스템즈 SP 사이언티픽(FTS Systems SP Scientific))에서 처리되었다.
(6) 동결 건조 후의 바이얼병은 고무 마개로 밀봉하고, 금속 주름 고정을 하여, 냉장고에 보존하였다.
(7) 재용액화에는 14.1ml의 주사용 증류수를 가하여 5-10분간의 볼텍스 믹서(voltex mixer)에 의해 15ml의 담황색의 용액이 되었다.
≪시험예≫
이하의 재료 및 방법에 의해 시험을 행하였다.
(Pten 결손 마우스(tPTEN-/-))
동물 실험은, 헬싱키 선언에 따라서 행하고, 또한, 프로토콜은, 시설 내의 윤리 위원회(2011 내지 73) 및 CIEPAL(NCE/2011 내지 33)에 의해 승인되었다. 마우스는, C3M의 동물 사육실 시설에서, 특정 병원체 제거 조건 하에서 유지하였다. Pten 결손 마우스(tPTEN-/-)는, 2개의 Pten flox 대립 유전자를 갖는 마우스를, 근위(近位) lck 프로모터-cre 트랜스제닉 마우스와 교잡시킴으로써 생성했다(참고문헌 53). 동물은, 앞서 기재된 바와 같이(참고문헌 53), PCR에 의해 특징지었다.
(트랜스크립톰 분석)
림프종 형성의 임상 징후가 관찰된 경우(예를 들어 털이 섬(fur ruffling), 웅크린 자세, 안면 부종, 및/또는 얕은 호흡), 마우스는, 치명적인 펜토바르비탈 주사에 의해 희생사시켰다. 종양을 해부하고, 70㎛ 세포 스트레이너(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 상에서 PBS 중에서 균질화하고, 전체 RNA를 단리하여, 앞서 기재된 바와 같이(참고문헌 54), cDNA에 전사하였다. 무관계인 4개의 종양을 분석하고, 2개의 야생형 마우스 유래의 흉선 세포도 또한 처리하였다. cDNA를, 아피메트릭스(Affymetrix) DNA칩(아피메트릭스-MoGene-1_0-st-V1)에 하이브리다이즈시켜, 유전자 발현 데이터를 표준화하고(GSE 39591), 25％의 위(僞)발견율을 사용하여, 감시 하의 (supervised)SAM(마이크로 어레이의 유의성 분석(Significance Analysis of Microarrays)) 분석을 하였다. 계속해서, 마이크로 어레이 분석에 관한 선형 모델(LIMMA)을, p값<104에서, 상이하게 발현되는 프로브를 동정하기 위해 사용하였다. 이에 의해, abs(log 배수 변화(log Fold Change))>0.5를 갖는 유전자 선택이 초래된다. 페노타입 및 아노테이트되어 있지 않은 배열의 사이에서 보다 작은 p값을 갖는 복사물을 제거한 후, 분석의 조합에 의해, 종양에 있어서, 498의 업 레귤레이트된 유전자 및 279의 다운 레귤레이트된 유전자가 동정되었다.
(세포 배양물)
무관계인 tPTEN-/- 종양으로부터 확립된 KO99L, KO1081L 및 KO631L로서 나타난 마우스 세포주 외에, 인간 Ke37, DND41, Sil-ALL, Peer, Molt-16, Jurkat(T-ALL) 및 SupT1(T-LL)을, 10 또는 20％(Sil-ALL 및 마우스 세포주) 소 태아 혈청, 및 50유닛/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신 및 1.0mM 피루브산나트륨(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)))을 보충한 RPMI 1640 배지(인비트로젠(Invitrogen))에서 증식시켰다. 세포 배양물은, 5％ CO2 하에서 37℃에서 유지하였다.
(시약)
본 연구에서 사용한 화학 화합물: 2-아미노비시클로-(2,2,1)-헵탄-2-카르복실산(BCH), 덱사메타손, 염산독소루비신, 필수 아미노산(EAA; 50×용액), 비필수 아미노산(NEAA; 100×용액), D-류신 및 보르트만닌(시그마-알드리치); KU0063794(rel-5-[2-[(2R,6S)-2,6-디메틸-4-모르폴리닐]-4-(4-모르폴리닐)피리드[2,3-d]피리미딘-7-일]-2-메톡시벤젠메탄올), PI-103 염산염(3-[4-(4-모르폴리닐피리드[3',2':4,5]플로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀염산염) 및 라파마이신(토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience)); L-아스파라기나아제, 에르위나제(등록 상표)(크리산타스파제)(유사-파마(EUSA-PHARMA)). 살루브리날(N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(퀴놀린-8-일)티오우레이도)에틸)신남아미드)(엔조 라이프 사이언스(Enzo Life Science)); Q-VD-OHP(MP 바이오메디컬즈(MPBiomedicals)).
(환자)
설명에 따른 동의는, 시설 내의 가이드 라인에 따라서 얻었다. 헤파린 처리한 혈액은, 3명의 T-ALL 환자 및 2명의 건강한 도너에서 얻었다. 환자 림프 아구는, 벤더 권장의 수순에 따라, 피콜-파크(Ficoll-Paque) PLUS 밀도 구배를 사용하여, 수집 후 24시간 이내에 단리했다(GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences)).
(세포 생존 능력, 증식 및 세포 독성 어세이)
2개의 서로 다른 분석을 사용했다: i) 96웰 플레이트 포맷에 있어서, 세포(웰당 4.0±0.1×104; 100μL)를, 이펙터와 함께 인큐베이트하고(48시간, 37℃; 실험당 n=4), 계속해서, WST-1 시약(10μL; 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))을, 96웰 플레이트의 각각의 웰에 추가해서 인큐베이트하여, 포르마잔 생성을 490nm에서 측정했다; 및 ii) 세포(웰당 2.0±0.1×104; 100μL)를, 이펙터와 함께 인큐베이트하고(48시간, 37℃; 실험당 n=4), 계속해서, 브로모데옥시우리딘 시약(10μL/웰; 로슈 다이아그노스틱스)을, 각각의 웰에 추가해서 인큐베이트하고(8시간, 37℃). 계속해서, 세포를 고정하고 변성시켜, 퍼옥시다아제(POD) 항체와 콘쥬게이트된 항BrdU와 인큐베이트했다(100μL/웰). 비색 정량 기질(TMB: 테트라메틸-벤지딘; 100μL/웰)을 추가하여, BrdU의 도입을, DNA 합성 및 증식 세포에 대응하는 광학 농도 측정(450nm)에 의해 정량화하였다.
(웨스턴 블로팅 분석)
세포 추출물을, 세포 용해 버퍼(프로테아제 저해제의 칵테일을 보충한 50mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 20mM EDTA, 100mM NaF, 10mM Na3VO4, 0.5％ 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(NP40))를 사용하여 제조하였다. SDS-PAGE에 의한 분리 및 니트로셀룰로오스에 대한 전사 후에, 이뮤노 블로팅을, 이하의 항체를 사용하여 실행했다: Akt(셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies), #9272), CHOP(#2895), 절단된 카스파아제 3(#9664), c-Myc(#9402), eIF2α(#9721), 4EBP1(#9644), LC3A/B(#12741), PARP(#9542), pJnk(T183/Y185)(#9251), pSer235-236-S6RP(#4856), pSer473-Akt(#9271), pSer65-4EBP1(#9451) 및 S6RP(#2217); Bax(시그마-알드리치, B8429); PUMA(Abcam, ab54288); Bak(밀리포어(Millipore), 06536); ATF4(산타 크루즈 바이오테크놀로지스(Santa Cruz Biotechnologies), sc200), GADD34(sc8327), Hsp60(sc-1722), Hsp90(sc-13119) 및 XBP1(sc-7160); ATF6(임제넥스(Imgenex), IMG-273).
(아넥신 V/PI 염색 어세이)
아폽토시스 평가는, 아넥신-V-FITC(인비트로젠)에 의해 포스파티딜-세린 막재 분포를 측정함으로써 실행하였다. 세포(웰당 5.0±0.1×105; 2.0mL)를, 이펙터와 함께 인큐베이트하고, 염색 용액(110μL; 아넥신-V(1/10)) 중에 재현탁하여, 암중(15분간, RT)에서 인큐베이트하였다. 세포를 PBS에 의해 세정하고, 프로피디움요오드화물 염색 용액(1.0μg/ml; 2.0mL) 중에 재현탁하여, 맥스퀀트 애널라이저(MacsQuant Analyser)(밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech))로 플로우 사이토메트리에 의해 즉시 분석하였다. 기저의 아폽토시스 및 괴사는, 컨트롤 미처리 세포에 대하여 결정하였다.
(CD98 표면 발현의 분석)
세포를 수집하여, PBS에 의해 세정하였다. 회전시킨 후에, 세포(106; PBS, EDTA 5.0mM, 0.1％ BSA 중 1.0mL)를 암중에서, 4℃에서 30분간, 래트 항CD98 항체(H202-141, 5.0μg/ml, BD 파밍겐(BDPharmingen))와 함께 인큐베이트하였다. 세포를 세정하고, 4℃에서 30분간, 염소 항 래트 알렉사플루어(AlexaFluor)(등록 상표)-4882차 항체(A11006, 2μg/ml, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 함께 인큐베이트하였다. 세포를 원심 침전하고, 2회 세정하여, 맥스퀀트 애널라이저(밀테니 바이오테크)로의 분석까지 1％ PFA에 의해 고정하였다.
(미토콘드리아막 내외 전위차의 결정)
아폽토시스의 이벤트와 관련한 미토콘드리아막 내외 전위차(ψm)의 변화를, 테트라메틸로다민에틸에스테르과염소산염 어세이(TMRE; Molecular Probes)를 사용하여 측정하였다. 마우스 또는 인간 세포(웰당 5.0±0.1×105; 2.0mL)를, 24시간까지, 다양한 농도의 컴파운드-JP에 폭로하고, 계속해서, TMRE와 함께 인큐베이트하였다(1.0μM; 30분간, 37℃). 그 후, 세포를, PBS에 의해 2회 세정하고, 계속해서, DAPI(시그마-알드리치, 1.0μg/ml)에 의해 염색하여, 맥스퀀트 애널라이저(밀테니 바이오테크)에 의해 검사하여, 데이터를, FlowJo 소프트웨어에 의해 평가하였다.
(활성 카스파아제 3 염색)
세포(웰당 1.0±0.1×106; 1.0mL)를, 카스파아제 3저해제 Qvd-OH(20μM)가 있거나 또는 없이, 다양한 컴파운드-JP 용량에 의해 자극하였다. 계속해서, 세포는, 카스파아제 3저해제 콘쥬게이트(RED-DEVD-FMK; 바이오비전(Biovision))에 의해 염색하여, 인큐베이트하였다(1.0시간, 5％ CO2에서 37℃). 세포를, 세정 버퍼에 의해 세정하고, 계속해서, 원심 분리하여(3000rpm, 5.0분간), 30분간, 아넥신 V-FITC(10μL/ml; 밀테니 바이오테크)에 의해 염색하여, DAPI(1.0μg/ml)를, 맥스퀀트 애널라이저에 의한 검사 전에 추가하였다.
(세포내 플로우 사이토메트리 분석(포스포 플로우))
세포(웰당 1.0±0.1×106; 1mL)를, 다양한 이펙터(24시간, 37℃)와 함께 인큐베이트하고, 계속해서, 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm) 버퍼(100μL, 30분간, 4℃)에 의해 투과 처리하고, 계속해서, 펌워시(PermWash)(BD 바이오사이언시즈)에 의해 세정하고, 포스포 -Ser235/236-S6RP 항체에 의해 염색했다(30분간, 4℃). 한층더 펌워시 후에, 세포를, 계속해서, 2차 항 토끼 alexaF 488(20μg/ml; 라이프 테크놀로지스)에 의해 염색했다(30분간, 4℃). 계속해서, 세포를, 펌워시 중에서 세정하고, 염색 버퍼(PBS+0.1％ 소혈청 알부민+1.0％ 파라포름알데히드) 중에 재현탁하여, 맥스퀀트 애널라이저(밀테니 바이오테크)로 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다.
(인 비보 종양 증식의 모니터링)
각각의 실험군에서의 마우스 모두에, 리포터 루시페라아제 유전자를 안정적으로 발현하는 99KOL-LUC T림프종 세포(200μL; 5.0±0.1×106)를 피하 주사하였다. 주사 2일 후에, 마우스에, 식염수(NaCl 0.9％)에 약분을 용해하여 혼합함으로써 제조한 컴파운드-JP를 복강 내 투여했다(50mg/kg/일/1주일당 5일간). 체중 및 종양 체적을 5일마다 측정하였다. 종양 체적은, 수식에 따라서 계산했다: V=(L*W2)/2(L: 길이; W: 폭). 생체 발광 이미징을 행하기 위해서, 마우스에, D-루시페린(칼리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science))의 복강 내 주사(150μL, 30mg/mL)를 받게 하고, 흡입 이소플루란(2.0％)에 의해 마취를 가했다. 생체 발광 시그널은, 고감도 냉각 CCD 카메라를 장비한 포톤 이미저(Photon imager)(바이오스페이스 랩(Biospace Lab))를 사용해서 모니터하고, 화상은 모두, D-루시페린 주사 10분 후에 수집하였다. 데이터는, 종양 영역을 덮는 주목 화상 영역(ROI)에 집중하여, 전체 광자 다발 방사(total photon flux emission)(광자/초(photons/second))를 사용해서 분석하였다.
(면역 조직 화학적 검사)
해부한 종양의 파라핀 블록 중의 절편(4㎛)을, 1차 토끼 포스포 S6RP 항체(#4858, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology))에 의해 표식하였다. 퍼옥시다아제(HRP)와 콘쥬게이트된 2차 항 토끼 항체(시그널스테인(SignalStain)(등록 상표), #8114, 셀 시그널링 테크놀로지)를, 제조업체에 의해 권장되는 바와 같이, 디아미노벤지딘(DAB)에 의한 현색 전에, 절편에 추가하였다. 괴사의 평가를 위해서, 절편을, 헤마톡실린/에오신/사프란(HES)에 의해 염색하였다. 화상을 분석하고, 괴사 면적은, 이미지 J(ImageJ) 소프트웨어(NIH)를 사용해서 정량화하였다.
(통계 분석)
인 비트로 실험에 관한 통계 분석은, 95％의 신뢰 수준에서, 양측 스튜던트의 t 시험을 사용하여 실행한, 또는 ANOVA를 사용하고, 그 후, 두네트의 다중 비교 검정을 계속함으로써 계산하였다. 조합에 대해서는, 실험군간의 유의성을 결정하기 위해서, ANOVA, 그 후에 이어지는 투키 다중 비교 검정에 의해 분석하였다. 약제간의 상승 작용은, 추-탈라레이법을 사용하여 분석하였다. 인 비보 실험에 대해서는, 통계 분석은, 양측 만-휘트니 순위합 검정을 사용하여 실행하였다. P값<0.05는, 통계적으로 유의한 것으로서 허용되었다(*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001). 분석은, 그래프패드 프리즘(GraphPAd Prism) 3.0 소프트웨어를 사용하여 실행하였다.
(인간의 각종 암 유래 수립 배양 세포에 발현하는 중성 아미노산 트랜스포터, LAT1 및 LAT2 유전자의 정량)
각 세포로부터 RNA를 추출하고, LAT1 및 LAT2 특이 프라이머를 사용하여 각 mRNA를 정량 PCR법으로 측정하였다.
(LAT1 선택성 저해약, 컴파운드-JP의 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 억제 효과)
각 암세포의 배양액 내에 컴파운드-JP의 비존재 및 서로 다른 농도의 컴파운드-JP의 존재 하에 5일간 배양을 계속하였다. 각 일의 경과에 있어서의 세포의 증식 활성을 MTT법으로 측정하였다.
(LAT1 선택성 저해약, 컴파운드-JP와 기존 약 겜시타빈(GEM)과 파클리탁셀(Pac)의 단독 및 병용 작용을 나타내는 실험 수순)
인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 2종의 암세포를 컴파운드-JP의 존재, 비존재 하에 배양하고, 2일째에 GEM 및 Pac를 첨가하여 2시간 배양 계속 후에, 배지를 교환하여, 컴파운드-JP의 존재, 비존재 하에 또한 2일간 배양을 행하였다. 마지막으로 세포를 수집하여, 세포의 생존 활성을 MTT법에 의해 정량하였다. 각 실험은 동일 조건의 군을 각각 3가지 예 측정하여, 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다.
(인간 대장암 유래 HT-29 세포 파종 누드 마우스 모델에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 5-FU의 병용 효과)
HT-29 세포를 마우스의 피하에 파종하고, 종괴의 크기가 어떤 일정한 크기 이상으로 성장한 상태에서, 컴파운드-JP 및 5-FU의 단독 및 병용에 의한 종양 덩어리의 크기의 추이를 경일적으로 측정하였다.
(인간 대장암 유래 HT-29 세포의 동소 파종 누드 마우스 모델(SOI model)에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 CDDP의 병용에 의한 상승 효과)
인간 대장암 유래 HT-29 세포에 갯반디 루시페린을 발현시켜서, 마우스의 대장벽에 이식한 메타 마우스를 만들어 냈다. 이에 의해 종괴의 크기를 발광 강도로 경일적으로 정량할 수 있다. 도 16에는 각 처치 그룹에서의 종괴의 크기를 막대 그래프로 나타냈다. 그룹 1은 대조군, 2 내지 4는 컴파운드-JP를 각각 3.1, 12.5, 50mg/Kg/일 체중을 4주간 연일 복강 내 단독 투여, 그룹 5는 CDDP를 2.5mg/Kg/일, 0, 6, 13일째의 3회 복강 내 단독 투여, 그룹 6 내지 8에는 동 2 내지 4와 5의 조합에서의 병용 투여, 그룹 9는 컴파운드-JP를 300mg/Kg/일을 4주간 연일 경구 투여를 행하였다.
≪결과≫
이상의 시험의 결과를 이하에 나타내었다.
(tPTEN-/- 종양, 인간 T-ALL/T-LL 세포주 및 초대 세포는, LAT1/CD98hc(slc7a5/slc3a2) 발현이 증강하고 있음)
마우스(tPTEN-/-)는, 고악성도로 침습성의 림프종을 발병한다. 정상 흉선 세포 및 tPTEN-/- 흉선 종양 세포의 전체적인 유전자 발현은, 전체 게놈(pan-genomic) 아피메트릭스 마우스 DNA칩을 사용하여 확립하였다. 데이터의 표준화 후에, 야생형 흉선 세포(n=3) 및 tPTEN-/- 종양 세포(n=4) 유래의 유전자 발현 프로파일(GEP)을 평가하였다. 야생형과 비교하여, tPTEN-/- 종양 세포는, 498의 업 레귤레이트된 유전자를 나타냈다. 도 1a에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은, LAT1을 코드하는 SLC7A 유전자가, 정상 세포와 비교하여, tPTEN-/-에 있어서 업 레귤레이트된 것을 관찰했다(log2: 2.44배). 대조적으로, CD98hc를 코드하는 SLC3A2의 발현은, 종양에 있어서 아주 약간 증강되었다(0.874배). 게다가, 레퍼런스로서 취급하기 위해서, 본 발명자들은 또한, 이것도 또한 tPTEN-/- 세포에서 고도로 발현된 c-myc 유전자(2.22배)의 결과도 나타내지만, 하우스키핑 유전자인 marks는, 2개의 카테고리의 사이에서 유의미하게 상이하지 않았다. 정량적 PCR 분석에 의해, 악성 세포에 있어서, SLC3A2가 아니라, LAT1 및 c-myc의 발현의 증강이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 고도의 LAT1 발현은, 2개의 초대 tPTEN-/- 종양(KO 마우스 #99, #631)에서 관찰되어, 각각 KO99L 및 KO631L로 나타나는 세포주를 확립하기 위해 사용하였다. 서론에서 앞서 논의된 바와 같이, LAT1은, 운반 활성으로 되기 위해서, 디술피드 결합에 의해 연결된 CD98hc를 필요로 한다. 그로 인해, 본 발명자들은 또한, 항CD98hc 항체를 사용하여, 플로우 사이토메트리 분석을 실행함으로써, 그 표면 발현도 분석하였다. 정상(WT) 흉선 세포와 비교하여(도 1b), 5개의 tPTEN-/- 종양은, 보다 고도의 CD98 발현을 나타냈다. 세포 활성화: (PMA+이오노마이신)은, 종양 흉선 세포에서의 17배와 비교하여, 2.8배의 발현의 증가를 초래했다(도 1d).
마찬가지로, 3개의 초대 인간 T-ALL 샘플은, 건강한 도너 유래의 정지 및 활성화 말초혈 림프구(PBL)와 비교하여, 보다 고도의 CD98 레벨을 나타냈다(도 1d 내지 e). 개략적으로 말하면, 이 결과는, CD98 발현이, 활성화 마우스 및 인간 T세포에서 증강되고, 형질 전환 림프구에 있어서, 더욱 고도의 레벨에 도달한 것을 나타낸다.
(약리학적 CD98/LAT1 타겟팅은, 인 비트로에서의 tPTEN-/- 세포 생존을 감소시킴)
본 발명자들은, 다양한 농도의 BCH, D-류신 및 컴파운드-JP의 존재 하에서, 세포 생존 능력을 조사하기 위해, KO99L로 나타나는, 확립된 tPTEN-/- 종양 세포주를 사용하였다. BCH는, 고전적인 시스템 L저해제인데, LAT1 선택성이 결여된다(비특허문헌 18). 도 2a에서 나타낸 바와 같이, BCH 및 D-류신은, 고용량 농도로 고도의 세포 생존 능력을 유지하고, 세포 생존 능력은, 각각 10.0 및 30.0mM에서 30％ 및 60％이었다; 도 2a). 대조적으로, LAT1 선택적 저해제 컴파운드-JP는, 훨씬 큰 정도까지 KO99L 세포 생존 능력에 영향을 미쳐서, 절반의 세포를 사멸시키는데 더 낮은 약제 농도를 나타내고, IC50=2.4μM이었다(도 2a). 10.0μM에서, 컴파운드-JP는, 48시간 후에 75％, 세포 주기(증식)를 감소시켰다(도 2b). 농도 의존성의 방식에서, 컴파운드-JP는, 새롭게 단리된 tPTEN-/- 종양 세포의 세포 생존 능력에 영향을 미쳤지만, 정상 마우스 흉선 세포에서 무독이었다(보충 자료 도 91a).
(컴파운드-JP는, 필수 아미노산 유입을 저해함)
LAT1이, 큰 중성 아미노산의 도입을 매개하는 것은, 충분히 확증되어 있다(참고문헌 21); (참고문헌 22). 도 2c에서 나타낸 바와 같이, 컴파운드-JP(2.5 내지 10.0μM)와의 KO99L 세포의 인큐베이트는, 세포 생존 능력의 용량 의존적인 감소를 초래하고, 이것은, 필수 아미노산(EAA)을 배양 배지에 보충함으로써 어느 정도는 역회전될 수 있었던 것에 반해, 비필수 아미노산(NEAA)은, 구출 효과를 갖고 있지 않았다. 병행하여, 도 2d에서 요약되는 바와 같이, 컴파운드-JP에 의해 유발된 세포사는, NEAA가 아니라, EAA의 추가 시에 2.5배 감소하였다. 이들 데이터는, 컴파운드-JP가, EAA의 도입을 변화시킴으로써 기능하는 것을 또한 실증한다.
(컴파운드-JP는, 인 비보에서 tPTEN-/- 종양 증식에 간섭함)
루시페라아제 발현 벡터를 안정적으로 트랜스펙트한 KO99L 세포를, 누드 마우스에 피하 주사하고, 그 후(2일째), 동물을, 컴파운드-JP(50mg/kg/일=1.5mg/마우스/일)에 의해 치료하였다. 종양 관련성의 생체 발광 및 종양 체적 데이터를 5일마다 수집하였다. 매일의 컴파운드-JP 치료는, 비히클 치료군과 비교하여, 18일째에, 평균 종양 체적을 45％(p<0.05) 감소시켰다(도 2e). 종양 발광(도 2f)도 또한, 컴파운드-JP 치료에 의해 통계적으로 유의한 감소(59％ ; p<0.05)를 나타냈다(도 2g). 종양의 면역 조직학 분석은, JPH206 치료가, 종양 내에서 괴사성의 응답을 초래한 것을 나타냈다(10.5+/-0.5％ 대 4.6+/-0.5％; 도 4c).
(컴파운드-JP는, 인간 T-ALL/T-LL 세포주 및 환자 초대 세포를 변화시킴)
본 발명자들은, 컴파운드-JP에 의한 LAT1의 타겟팅도 또한, T-ALL/T-LL 세포주 및 초대 종양 세포에 영향을 줄 수 있는지 여부를 확증하려고 시도하였다. 인간 Jurkat T-ALL주는, 컴파운드-JP가, 세포 생존(도 2h) 및 증식 (도 2i)을 변화시킬 수 있음을 실증하기 위해 이용하였다. 게다가, 4명의 다른 환자로부터 단리된 초대 T-ALL 세포도 또한, 농도 의존성의 양식에서, 컴파운드-JP 감수성(세포 생존 능력)을 나타냈다(도 2j). 크게 다르지만, 컴파운드-JP는, 정상적인 정지 또는 활성화 인간 PBL 세포에서, 세포사를 유발하지 않았다(도 91b). 또한, 세포 증식에 강하게 영향을 준, 아폽토시스 유발제인 스타우로스포린(STS: 1.0μM)과는 대조적으로, 컴파운드-JP는, PBL 세포 증식(1.0 내지 50.0μM; 도 91c)도, 정상적인 제대혈 단핵 세포(5.0 및 10.0μM; 도 91d)도 유의미하게 변화시키지 않았다. 그 알려져 있는 LAT1/LAT2 저해제 선택성과 일치하여, 이러한 실험 결과는, 컴파운드-JP가, 정상(건강, LAT2 발현) T세포와 비교하여, 백혈병성 세포(LAT1 발현)에 대해 우선적으로 작용하는 것을 실증한다.
(컴파운드-JP는, 아폽토시스 및 자식 작용을 야기함)
KO99L 세포에 대한 컴파운드-JP의 폭로는, 아폽토시스를 유발하였다. 컨트롤(컴파운드-JP 없음)과 비교하여, 48시간 후의 아넥신-V+ 및 아넥신-V+/DAPI+세포 분석(도 3a)은 각각, 10.0 및 20.0μM에서, 2.8 및 3.8배 높은 레벨의 아폽토시스를 나타냈다. 컴파운드-JP가, 아폽토시스의 세포의 양을 현저하게 감소시킨, 카스파아제 활성화를 방해하는 저해제인 QvD-OPH(20.0μM)와 동시 투여되었을 경우에, 이들 결과는, 더 확인되는 것이 되었다. 미토콘드리아 외막 투과성화(MOMP)는, 미토콘드리아막 내외 전위차(△ψm)를 왜곡시키는 초기의 아폽토시스 세포사 이벤트다(참고문헌 23). 테트라메틸로다민에틸에스테르과염소산염 염색 어세이(TMRE)를 사용하면, 컴파운드-JP(5.0 및 10.0μM)는, KO99L 세포에서 MOMP를 야기하는 것으로 나타났다(도 3b1). KO99L 세포에서 관찰된 미토콘드리아 탈분극은, 컴파운드-JP 농도 의존성인 것을 알 수 있으며(2.5 내지 20.0μM; 48시간), 시험한 가장 높은 농도에서 70％에 달했다(도 3b2). 본 발명자들은, 웨스턴 블로팅법에 의해 48시간의 기간에 걸쳐 카스파아제 3 절단을 검사함으로써, 카스파아제 활성화를 모니터했다(도 3C). 컴파운드-JP 추가(10.0μM)의 4 내지 6시간 후, 카스파아제 3 절단을 관찰할 수 있었다(도 3c, 레인 4 및 5). 48시간(레인 8)까지, 본질적으로 모든 세포 카스파아제 3이, 프로세싱되었다. 게다가, 본 발명자들은 또한, 잘 알려져 있는 카스파아제 기질인 Red-DEVD-fmk에 의해, 세포 관련성의 형광을 증가시키는, 컴파운드-JP의 능력에 대해 조사하고, 결과는, QvD-OPH(20.0μM; 도 3D1)과의 프레 인큐베이션 시에 베이스 라인으로 복귀되었다. 도 3d2에서 나타낸 바와 같이, 컴파운드-JP의 결과는, 용량 및 시간 의존적이어서, QvD-OPH와의 동시 투여에 의해 상쇄할 수 있었다(도 3d1, 2). 카스파아제 3 기질인 PARP도 또한, 컴파운드-JP(10.0μM; 24시간)의 존재 하에서, 완전히 절단되는 것이 관찰되었고, 세포의 Hsp60 레벨에서의 관찰 가능한 변동은 없었다(도 3e, 레인 4). 컴파운드-JP는 또한, 초대 tPTEN-/-세포에 대해서도 유효하고, 용량 의존적인(2.5 내지 20.0μM) 양식으로, 세포사를 유발했다(도 3f; 데이터는, 5개의 초대 tPTEN-/- 종양의 평균임). 초대 KO#732 세포(도 3g)를 사용하여, 아폽토시스를 분자적으로 확인하였다. 컴파운드-JP는, 카스파아제 3 프로세싱 및 PARP 절단을 유발했다(18.0시간; 레인 10, 11). 라파마이신은, 효과를 갖지 않았지만(레인 5, 9, 13), PI103은, 초기(2.0시간, 레인 4)의 및 효율적인 세포사 유발 인자(레인 8, 12)와 같이 생각되었다. 영양소가 부족할 때에 일어날 수 있는 보호 응답으로서, 자식 작용이, 아폽토시스 전에 일어날 수 있다. 도 3H에서 나타낸 바와 같이, 컴파운드-JP(10.0μM)의 폭로는, LC3-II의 축적을 자극했지만, LC3-II는, LC3의 자식 형태이며, 자식 작용의 제1 스텝과 관련한다(참고문헌 24). LC3-II의 축적은, 6.0시간에서 피크에 달했고(도 3h, 레인 3), 그 후, 감소했다(레인 4 내지 6). 도 3i에서 나타낸 바와 같이, QvD-OPH(20.0μM)의 존재는, 아폽토시스에 대항할 수 있고, 18.0시간까지의 동안에, LC3-II를 유지할 수 있었다(레인 7과 비교한 레인 5). 오토파고솜 형성 관련성의 Atg5 레벨은, 점차 증가하여, 6.0시간에서 최대가 되고(레인 6), 18.0시간에서 베이스 라인으로 복귀되었다(레인 7). 또한, pJNK 스트레스 경로 활성화는, 아폽토시스가 방해된 경우에 검출되었다(레인 7과 비교한 5). 전체적으로, 이 실험 결과는, 컴파운드-JP가, 최초로 자식 응답을 일으키고, 아폽토시스가 빠르게 그것에 이어진 것이라는 생각을 지지한다.
(컴파운드-JP에 의한 LAT1 저해는, mTORC1 활성화에 간섭함)
KO99L 세포에서의 pS6RP 저하에 의해 확립되는 바와 같이(도 4a), 본 발명자들은, 컴파운드-JP(10.0μM)가 빨라도 2.0시간에 mTORC1 활성화에 영향을 줄 수 있고(레인 5), 6.0시간(레인 6) 및 24시간(레인 7)동안 유지된 것을 관찰하였다. 컴파운드-JP의 mTOR 저해 효과는 또한, 2개의 초대 T-ALL 샘플에 대한 포스포 플로우 사이토메트리에 의해서도 관찰되었다(도 4b). 또한, pS6RP 염색은, 컴파운드-JP 치료 마우스 유래의 종양에서 극적으로 감소하여, 화합물의 인 비보에서의 저해 효과를 실증했다(도 4c). KO99L 세포에 있어서, 컴파운드-JP는 또한, 세린 473 인산화에 의해 측정되는 것처럼, Akt 활성화에도 간섭했다(도 4a). 대조적으로, 컴파운드-JP는, 4E-BP1 인산화에 대하여 영향을 나타내지 않고, 컴파운드-JP가, mTORC1 활성화를 부분적으로만 어지럽히는 것을 실증한다. Akt 저해제인 MK-2206(5.0μM) 및 Akt/mTOR 2중 저해제인 KU0063794(5.0μM)는, 빨라도 2.0시간에서, S6RP, 4EBP1 및 Akt 인산화를 완전히 막는 것으로 나타났다(도 92). 라파마이신(10.0nM)은 컴파운드-JP(10μM)에서 관찰된 작용과 유사했지만, 라파마이신은, mTORC2가 아니라 mTORC1 저해제이며(참고문헌 25), 이것은, 4EBP1이 아니라, S6RP 인산화를 완전히 저해했다(도 92). 라파마이신은 또한, 컴파운드-JP(도 92)와 비교하여, 보다 후의 시점에서, Akt 인산화/활성화에 영향을 주었다. LAT1이, 세포내 글루타민과의 세포외 EAA 교환체인 것이 확립되어 있으므로(참고문헌 26), 본 발명자들은, 다양한 글루타민 레벨이, 어떻게 EAA 유입 및 mTORC1 활성화에 간섭할 수 있는지에 대하여 조사하려고 시도하였다. 이 때문에, 본 발명자들은, 세포외 아스파라긴을 분해할 수 있으며, 또한 글루타미나제 활성을 갖는 2개의 효소, L-아스파라기나아제(L-Asp) 및 에르위나제(Erw)를 사용하였다. 도 S2에서 나타낸 바와 같이, L-Asp 및 Erw(2.5 유닛/ml)의 양쪽이, S6RP 인산화를 변화시켰는데, Erw가 보다 높은 글루타미나제 활성을 가지므로, 그것은 L-Asp보다 강력하였다. 컨트롤(도 92; 레인 15 내지 17)과 비교하여, Erw(레인 18 내지 20) 및 L-Asp(레인 21 내지 23)는 또한, 4EBP1 인산화도 변화시킨 것에 반해, 그것들은, Akt 인산화에 유의미하게 영향을 미치지 않았다. 프로테아솜 활성의 저해는, 아미노산 호메오스타시스를 방해하는 것으로 보고되어 있다(참고문헌 27). 본 발명자들의 모델에 있어서, 프로테아솜 저해제인 벨케이드(Vel; 도 92)는, 초기의 시점(2.0 및 6.0시간; 각각 레인 24 및 25)이 아니라, 24시간(레인 26)에서, S6RP, 4EBP1 및 Akt 인산화를 완전히 소실시켰다. 이들의 모든 실험에 있어서, S6RP, 4EBP1, Akt 및 Hsp 90의 전체 레벨은, 다양한 약제에 의해 유의미하게 변화하지 않고, 인산화에 대하여 관찰된 영향이, 단백질의 양에 있어서의 차이에 의한 것이 아니었음을 실증한다.
(LAT1 저해 및 c-myc 단백질 레벨)
c-myc 단백질은, 인간 림프종 및 tPTEN-/- 종양에서 업 레귤레이트되는 것으로 나타났다(참고문헌 28). tPTEN-/- 세포에 있어서, c-myc는, SDS-PAGE(도 4D; 레인 1 내지 4)에서 60kDa의 근처에서 3조로서 이동하는 것처럼 관찰되었다. 컴파운드-JP(10.0μM)와의 세포의 인큐베이션 시에, 전체 c-myc는, 2.0시간에서 이미 감소하여(레인 5), 24시간까지 유지되며(레인 7), 특히, c-myc의 2개의 하위의 이동 형태는, 유의미하게 감소하였다. 벨케이드와 인큐베이트했을 경우에, 유사한 관찰이 이루어졌다(8nM; 24시간; 레인 10). KU0063794(10.0μM)에 의한 Akt/mTOR 저해도 또한, 2개의 하위의 밴드에 약간 영향을 미쳤다(레인 15 내지 17). MK-2206(10.0μM) 매개성의 Akt 저해는, 24시간 이내에 3개의 c-myc 아이소폼 모두에 극적인 소실을 초래했다(레인 18 내지 20). 컴파운드-JP와 현저하게 상이하여, 라파마이신(100 nM)은 c-myc 레벨에 영향을 주지 않고(레인 12 내지 14), 결과적으로 아폽토시스 유발이 결여되었다. 이러한 다양한 실험을 통해서, Hsp90 레벨 변동은, 명확하게 관찰할 수가 없었고, 그에 의해, 다양하게 관찰된, 약제에 의해 야기된 결과가, 전체적인 세포 단백질 함유량에 있어서의 유의한 변화의 결과가 아니었다는 것을 확증하는 것을 지원한다. 또한, 본 발명자들은, 전체적인 단백질 합성에 대한 컴파운드-JP의 어떠한 간섭도 관찰하지 않았다. 정리하면, 실험 데이터는, 컴파운드-JP에 의해 초래되는 c-myc 다운 레귤레이션이, 그 항 백혈병성의 효과의 중요한 특질일지도 모른다는 생각과 일치하고 있다.
(컴파운드-JP는, 종합적 스트레스 응답(Integrated Stress Response)/변성 단백질 응답을 활성화함)
단백질 및/또는 아미노산 호메오스타시스 이상은, 자식 작용 및 세포사에 이를 수 있는 소포체/종합적 스트레스 응답(ISR)/변성 단백질 응답(UPR)을 일으키는 것으로 알려져 있다(참고문헌 29). 「C/EBP 상동 단백질」(CHOP)로서 알려져 있는 전사 인자의 발현은, ER 스트레스의 동안에 유발성으로 되어, ER 매개성의 아폽토시스에 참가한다(참고문헌 30). 무질서한 CHOP 활성은, 세포 생존 능력을 손상시키고, CHOP가 결여된 세포는, ER 스트레스의 치명적인 결정적 상태로부터 유의미하게 보호된다(참고문헌 31). KO99L 세포에 있어서 이뮤노 블로팅에 의해 평가하면, 컴파운드-JP(10.0μM)는, 2.0시간(도 5a, 레인 5)까지 CHOP 발현을 빠르게 유발하고, 이것은, 6.0시간(레인 6)에서 최대가 되어, 24시간(레인 7)에서 안정된 상태이었다. 컴파운드-JP와 비교하여 양이 적었지만, L-Asp(2.5유닛/ml)에 의한 CHOP의 유발은, 6.0시간(레인 9) 및 24시간(레인 10)에서 명확하였다. Erw(2.5유닛/ml)도 또한, 일과성의 응답을 유발하여, 이것은, 6.0시간(레인 12)에서 최대가 되고, 24시간(레인 13)까지 기본 레벨로 복귀되었다. 도 5b에서 실증되는 바와 같이, CHOP는, 명확한, 컴파운드-JP 용량 의존적인 유발을 나타내고(5.0 및 10.0μM; 각각 레인 2 및 3), CHOP 유발은 또한, 벨케이드에 의해서도(8.0 및 15.0μM; 각각 레인 7 및 8), 또한, 정도는 보다 작지만, L-Asp(2.5유닛/ml) 및 라파마이신(10.0nM), 각각 레인 4 및 9에 의해서도 강하게 유발되었다. 대조적으로, Akt 및 Akt/mTOR 저해제인 MK-2206(10.0μM; 레인 5) 및 KU0063794(10.0μM; 레인 6)는, CHOP 유발을 초래하지 않았고, 이것은, 이 경로가, PI3K/Akt/mTOR 경로에 의해 야기되지 않는 것을 시사한다.
(컴파운드-JP 유발성의 UPR은, 필수 아미노산 도입의 블록에 직접 관계함)
본 발명자들은, 이어서, tPTEN-/- 세포가, 배지 아미노산 조성의 수식에 대하여 어떻게 응답할지에 대해 조사하였다. 완전 배지를 HBSS에 의해 10배로 희석하면(도 5c; 6.0 및 24시간, 레인 4 및 5), 명확한 시간 의존적인 CHOP 유발이 관찰되었다. NEAA를 영양 결손 배지에 보충해도(도 5c; 레인 6 및 7), CHOP 유발을 수식하지 않았지만, EAA(레인 8 및 9) 또는 NEAA+EAA(레인 10 및 11)의 조합의 추가는, CHOP 출현을 방해하였다. S6RP 인산화가 CHOP 발현과 역상관인 것은 흥미로우며, 배지에의 EAA의 결핍은, mTORC1 다운 레귤레이션에 이른다. 게다가, 본 발명자들은, 컴파운드-JP 매개성의 CHOP의 유발(도 5d)이, 세포외 아미노산 함유량에 따라 조정되는 것을 관찰하였다. 실제로, EAA의 보충은, CHOP 유발을 명확하게 방해했다(레인 8 및 9). CHOP 단백질이, 6.0시간(레인 6)과 비교하여, 24시간(레인 7)에서 대부분을 검출할 수 없었으므로, NEAA는, 응답을 짧게 하고, 이에 반해, EAA+NEAA의 조합은, 중간의 응답을 나타냈다(레인 10 및 11). 이 실험 결과는, 컴파운드-JP에 의해 야기되는 스트레스 응답이, 세포외 EAA 농도를 증가시킴으로써 상쇄될 수 있음을 나타내고, 컴파운드-JP의 작용이, EAA 도입의 저해에 의한 것임을 또한 실증한다.
(컴파운드-JP 유발성의 CHOP는, 아폽토시스를 야기했다.)
컴파운드-JP(LAT1 저해)에 의해 관찰되는 ISR/UPR이, 계속되는 아폽토시스의 원인이 된 것인지 여부에 대하여 검사하기 위해서, 본 발명자들은, eIF2α 탈인산화를 방해하고, ER 스트레스에 대하여 세포 보호를 유발한 저해제로서 확립된 살루브리날 화합물을 사용했다(참고문헌 32). 도 5e에서 나타낸 바와 같이, 살루브리날(50.0μM)은 컴파운드-JP(10.0μM)에 의한 CHOP의 유발을 상쇄할 수 있었다(레인 6 및 7과 비교한 8 및 9). 게다가, 이 결과에는, 카스파아제 3 절단의 감소가 수반되었지만(중앙의 패널), Hsp60 레벨은 변함없었다(하위의 패널). 또한, 살루브리날(살루브리날)(50.0μM)은, 컴파운드-JP에 의해 유발된 세포사로부터 KO99L 세포를 구출하고(도 5f), 또한, BrdU 도입(도 5g) 또는 세포 계수(도 5h)에 의해 평가되는 세포 증식을 회복시켰다. 이 결과는, 컴파운드-JP가, 세포사 응답 동안에, CHOP 유발을 야기할 수 있음을 실증한다.
(컴파운드-JP에 의해 유발되는, UPR 경로에서의 분자 이벤트)
변성 단백질 응답(UPR)은, i) 이노시톨 요구성 효소 1α(IRE1α); ii) PKR 유사 ER 키나아제; 및 iii) 활성화 전사 인자(ATF6)((참고문헌 33)에서 개략적으로 설명됨)를 포함하는, 복수의 ER 단백질의 조화적인 활성화에 의해 특징지어진다. 활성화된 IRE1α는, chop의 발현을 유발하는 전사 인자 XBP-1의 아이소폼을 코드하는 mRNA의 비통상성의 스플라이싱을 개시한다(참고문헌 30). 활성화된 PKR 유사 ER 키나아제는, eIF2α(세린-51A)를 인산화하여, ATF4의 번역의 유발을 초래한다(참고문헌 34). ATF6은, ER 스트레스의 사이에 절단되어, 그 사이토졸 도메인[ATF6(N)]은, 핵으로 이동하여, 전사를 조절할 것이다(참고문헌 35). XBP-1, ATF4 및 ATF6은, ER 스트레스의 사이에 chop을 유발하는 것으로 알려져 있는 3개의 전사 인자다(참고문헌 30). 그로 인해, 본 발명자들은, 컴파운드-JP(10.0μM)와의 세포의 인큐베이션 후의 ATF4, ATF6 및 XBP-1의 스테이터스에 대하여 검사하였다. 본 발명자들은, ATF4(6.0시간) 및 ATF6(18.0시간)이 유발되고, 한편, 완전장 XBP1이 서서히 소실되고(도 6a; 레인 3 및 4), CHOP 및 GADD34가 동시에 발현한(도 6b; 레인 3 및 4) 것을 관찰하였다. eIF2α의 탈인산화는, GADD34 포스파타아제의 평행한 발현과 함께 24시간에서 관찰되었다(도 6c). p38 스트레스 경로는, 2.0시간에서 강하게 활성화되었다(도 6C; 레인 2).
(컴파운드-JP는, 아폽토시스 촉진성 및 항 아폽토시스성 Bcl2 패밀리 멤버를 조정함)
컴파운드-JP에 의한 아폽토시스 유발을 분자적으로 정의하기 위해서, 본 발명자들은, Bcl2 패밀리 멤버를 분석하여, 본 발명자들은, 미토콘드리아 및 ER막 레벨에서 아폽토시스의 개시를 컨트롤하는 것으로 알려져 있는 멤버를 측정하고자 시도하였다. 6.0시간부터 개시하면(도 6d), 컴파운드-JP(10.0μM)는, 4개의 아폽토시스 촉진성 멤버: Bak(도 6D; 레인 2 내지 4), Bax(레인 4), PUMA(레인 2 내지 4), 및 Bim(레인 3 및 4)의 단백질 레벨을 증가시켰다. Bax, Bak, PUMA 및 Bim의 유발은, 살루브리날에 의한 CHOP의 저해에 대하여 감수성이었지만(도 6e, 레인 3 및 4), 전체 Hsp90 단백질 레벨은, 영향을 줄 수 없었다.
(KO99RJ 세포: 컴파운드-JP 저항성의 변이체)
컴파운드-JP의 농도를 증가시키면서 KO99L 세포를 정기적으로 배양함으로써, 본 발명자들은, 컴파운드-JP의 항 증식 및 아폽토시스 효과에 저항하는, 세포의 변이체를 얻을 수 있었다. 약 4개월 후에, 본 발명자들은, 컴파운드-JP(20.0μM)의 존재 하에서 더 증식할 수 있는 KO99-RJ로서 나타나는 세포주를 얻었다. 도 7a에서 요약되는 바와 같이, 세포 생존 능력에서의 감소는, 컴파운드-JP 용량 의존적이며, 변이 세포주(즉 KO99-RJ)와 비교하여, 친 주(즉 KO99-S)에서 훨씬 유력해서, 예를 들어 40μM 컴파운드-JP에서, 세포 생존 능력은, KO99-S에 대하여 본질적으로 95 내지 100％이었던 것에 반해, KO99-RJ에서 약 40％ 감소하였다. 도 7b에서 나타낸 바와 같이, 컴파운드-JP는, KO990-S에서 농도 의존성의 세포사를 나타냈지만, KO99-RJ에서 훨씬 효율적이지 않았다. 또한, CHOP 유발의 비존재에 의해 확립된 바와 같이(도 7c), 컴파운드-JP가, KO99-RJ 세포에서, 종합적 스트레스 응답을 일으키지 않은 것을 관찰하는 것은 흥미 깊었다. 이 데이터는, 컴파운드-JP에 의해 유발되는 아폽토시스 응답을 야기하는 이 경로의 중요한 역할을 더욱 강조하는 것이다. 마지막으로, S6RP 인산화에서의 감소를 관찰할 수 없었으므로(도 7c), 컴파운드-JP는 또한, KO99-RJ에서, mTOR도 저해할 수 없고, KO99-RJ는, 친 세포와 동등한 레벨로 CD98을 발현한다.
(컴파운드-JP는, 화학 요법제 및 시그널 전달 저해제를 강화함)
도 8에서 나타낸 바와 같이, 컴파운드-JP를, 다양한 화학 요법제 또는 시그널 전달 저해제와 조합하여 시험하였다(인 비트로에서). 본 발명자들은, 백혈병 치료의 도입기의 사이에 임상적으로 사용되는 2개의 화학 요법제인 덱사메타손 및 독소루비신에 대해서 시험하였다(참고문헌 36). 이 실험에 있어서, 화합물은 모두, 최적 이하의 농도로 사용하고, 그 결과는, 보충의 자료 도 93a, b에서 나타내었다. 산출된 조합 인덱스(CI) 값은, 도 8a에서 나타내었다. 컴파운드-JP는, 라파마이신과 강하게 상승 작용을 나타내는 것처럼 생각되며, 전체적인 대사 활성/세포 생존을 감소시킨다. 상승 효과 또는 상가 효과는, 모든 화합물에서 관찰되며, 특히, 컴파운드-JP는, 덱사메타손 및 독소루비신과 상승 작용을 나타냈다. LAT1 저해제는, 벨케이드 및 L-아스파라기나아제의 효과를 강화할 수 있지만, PI103 및 KU-0063794와는 그다지 효율적이지 않은 것처럼 생각되었다. WST1로부터 도출한 아이소볼로그램는, 시험한 다양한 조합에 대한 가능성을 또한 나타낸다(도 8b). 전체적으로, 데이터는, T-ALL 세포 생존에 간섭하는 다른 분자와 조합한 경우, 컴파운드-JP가 적극적인 효과를 초래할 수 있음을 나타낸다.
(인간의 각종 암 유래 수립 배양 세포에 발현하는 중성 아미노산 트랜스포터, LAT1 및 LAT2 유전자의 정량 결과)
도 10에서, 단위 RNA당의 mRNA량을 종축에, 사용한 암세포명을 횡축에, 암 종별명을 표 중에 기재하였다. 5개의 예외를 제외하면, 46종류의 세포 모두에 LAT1 mRNA는 발현하고 있어, 암 타입의 트랜스포터라 할 수 있다. 한편, LAT2는 암세포에서의 발현은 제로이거나 극단적으로 낮은 값으로, 정상 타입이라고 이해할 수 있다.
(LAT1 선택성 저해약, 컴파운드-JP의 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 억제 효과)
도 11에서, 각 값은 동일 조건에서의 4가지 예의 평균값을 컴파운드-JP의 비존재에서의 활성을 100％로 한 상대값으로서 표시하였다. 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다. 암세포의 종류에 따른 차이는 인정되지만, 양쪽 세포 모두에 컴파운드-JP의 용량 의존적인 증식 활성의 저하가 명백하게 인정되었다.
(인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과)
인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 겜시타빈 및 파클리탁셀을 단독으로 2시간 작용시킨 효과는, 각 군 칼럼의 좌측의 막대 그래프의 값의 차에 상당한다. 각 실험은 동일 조건의 군을 각각 3가지 예 측정하고, 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다. 양자 모두 용량 의존성으로 세포의 증식 활성을 저하시켰다. 겜시타빈보다는 파클리탁셀의 억제 효과가 강력하였다. 컴파운드-JP(15μM)를 전 2일간 처치한 결과(각 군의 중앙의 막대 그래프)보다 전체 기간 존재시킨 것(각 군의 우측 막대 그래프)의 병용 효과가 보다 강력하였다. 병용에 의한 억제 효과는 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 소위 상가 효과를 나타냈다.
(인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과)
인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 겜시타빈 및 파클리탁셀을 단독으로 2시간 작용시킨 효과는, 각 군 칼럼의 좌측의 막대 그래프의 값의 차에 상당한다. 각 실험은 동일 조건의 군을 각각 3가지 예 측정하고, 평균값과 표준 오차 및 유의차 검정의 p값을 도면 중에 나타냈다. 양자 모두 용량 의존성으로 세포의 증식 활성을 저하시켰다. 겜시타빈보다는 파클리탁셀의 억제 효과가 강력하였다. 그러나, 겜시타빈의 단독 효과는 매우 작아, 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 대한 작용보다 명백하게 약한 작용이었다. 컴파운드-JP(15μM)를 전 2일간 처치한 결과(각 군의 중앙의 막대 그래프)보다 전체 기간 존재시킨 것(각 군의 우측 막대 그래프)의 병용 효과는 약간 억제가 보였지만, 그 정도는 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 비해 명백하게 낮은 억제이었다. Panc-1 세포에서의 각 병용에 의한 억제 효과는, 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 44As3-11 세포의 경우와 마찬가지로 소위 상가 효과이었다.
(인간 대장암 유래 HT-29 세포 파종 누드 마우스 모델에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 5-FU와의 병용 효과)
양쪽 약물의 단독 투여에서는 무처치의 대조군에 비해 종양의 증대는 각각 유의한 감소를 나타냈다. 양자의 병용에 의해, 각 단독 군의 잔존 종괴 증대는 또한 감소하였다. 이 병용 효과는 상가적이며, 양쪽 약물의 작용 기서가 상이한 것에 기인하는 것으로 밝혀졌다.
(인간 대장암 유래 HT-29 세포의 동소 파종 누드 마우스 모델(SOI model)에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 CDDP의 병용에 의한 상승 효과)
도 16의 그룹 8과 9에서는, 대조군에 비해 종괴의 증대는 유의미하게 저하되었다. 이 결과로부터, 컴파운드-JP와 CDDP의 단독 투여에서는 인정되지 않은 각 약효는, 양자의 병용으로 명확한 약효를 나타내었다. 이 병용에 의한 약효는 양자의 상승 효과라고 결론지어졌다.
≪고찰≫
상기의 시험 결과에 의해 이하가 명확해졌다.
본 연구는, 필수 아미노산(EAA) 트랜스포터인 LAT1/SLC7A5의 저해가, ALL/T-LL 세포 모델에서의 대사 및 생존을 변화시킬 수 있음을 실증한다. 본 발명자들은, 초대 세포 및 PTEN 종양 억제 유전자의 T림프구 특이적 불활성화 후에 얻어진 T세포성 림프종(tPTEN-/-) 마우스 모델에서 유래되는 세포주를 사용하였다. 최초로, 유전자 발현 프로파일링은, tPTEN-/- 세포가, 정지 또는 활성화 정상 T세포와 비교하여, SLC7A5 레벨이 상승하고 있는 것을 확증하였다. 종양 세포는 또한, 정상 세포와 비교하여, 그것들의 표면에 CD98을 과잉 발현하는 것도 나타났다. 이 결과는, 그것들이, LAT1/SLC7A5 레벨이 높을 뿐만 아니라, 형질 전환 세포가, 기능적 LAT1에 필요해지는, SLC3A2 유전자에 의해 코드되는 막 관통 단백질 CD98hc/4F2를 과잉 발현하는 것도 또한 검증하므로, 중요하다(비특허문헌 11). 마찬가지로, 건강한 도너에 의한 정지 및 활성화 말초혈 림프구(PBL)와 비교하여, 초대 인간 T-ALL 샘플 및 T-ALL/T-LL 세포주도 또한, CD98 레벨의 증강을 나타냈다. CD98의 발현은, 선암(참고문헌 37, 38) 또는 유방암(참고문헌 39) 등과 같은, 몇 가지의 암에서의 예후 불량과 관련하는 것처럼 생각되며, 그 발현이, 격렬한 증식 및 공격성 등과 같은 중요한 병적인 특질과 관계할 수 있음을 시사한다. 증식 속도(Ki-67)와 긍정적으로 상관하는 CD98의 고도의 발현 및 위암에서의, 보다 불량한 예후(참고문헌 40) 및 LAT1/CD98 레벨의 상승은, 원발성 종양과 비교하여, 전이성의 부위에서 관찰되었다(참고문헌 41). 정리하면, 이 데이터에 의해, 본 발명자들은 필수 아미노산 LAT1 매개성의 도입을 저해하는 중요성 및 T세포 림프 아구성 림프종/T세포 급성 림프성 백혈병 세포 증식 및 생존을 변화시키기 위한 그 능력에 대하여 조사하기로 하였다.
본 발명자들의 연구는, 최초로, 초대 tPTEN-/- 세포 및 tPTEN-/- 종양에서 유래되는 세포주에 대해 행하였다. 본 발명자들은, LAT1에 의한 중성 아미노산 이입과 경합하도록, BCH-매우 전형적인 시스템 L 저해제-및 D-류신에 대하여 시험하였다. 양쪽의 분자는, tPTEN-/- 세포의 생존에 영향을 줄 수 있었지만, 그것들은, 한정된 효율밖에 나타내지 않고, 고농도(>1.0mM)를 필요로 하며, 유사한 결과는, 헤드 경부 편평 상피 암세포주에서 보고되어 있다(참고문헌 42). 본 발명자들은, 이어서, 강력한 LAT1 선택적 저해제, 컴파운드-JP에 대하여 검사했다(참고문헌 43). 세포 배양 배지에 추가하면, 컴파운드-JP는, tPTEN-/- 세포의 생존을 유의미하게 감소시켰다(IC50=2.4μM). 게다가, 컴파운드-JP는, 세포 증식에 대하여 농도 의존성이며, 통계적으로 유의한 효과를 나타냈다. 배양 배지에 대한 EAA의 추가는, 세포 생존 능력 및 세포사를 왜곡시키 위한 컴파운드-JP의 능력을 감소시켜, 컴파운드-JP가, EAA 유입에 대하여 경합적인 프로세스에 의해 필시 작용하는 것을 나타낸다(참고문헌 21). 본 발명자들은, 이어서, 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 KO99L 세포를 누드 마우스에 주사함으로써, 인 비보 이미징 실험을 실행하였다. 컴파운드-JP는, 종양 체적에서의 유의한 감소를 초래하였다. 컴파운드-JP는, 누드 마우스에 이식된 HT-29 결장암 세포의 증식을 저하시키는 것으로 이미 보고되어 있지만(참고문헌 43), 본 연구는, 인 비트로 및 인 비보의 양쪽에서의, LAT1 저해제로서의 컴파운드-JP의 실용성을 또한 나타낸다.
한번, 본 발명자들은, 컴파운드-JP가, tPTEN-/- 세포에 대한 인 비트로 및 인 비보에서의 효과를 매개하는 것을 확증하면, 본 발명자들은, LAT1의 타겟팅이 또한, T-ALL/T-LL 세포주 및 초대 백혈병성 세포도 변화시킬 수 있는지 여부를 확증하고자 시도하였다. 최초로, 본 발명자들은, 컴파운드-JP가, 인 비트로에서의 세포 생존 및 증식에 영향을 미친 것을 나타낸, 잘 알려져 있는 인간 Jurkat T-ALL세포주를 사용하였다. 이어서, 본 발명자들은, 4개의 다양한 인간 환자 유래의 초대 T-ALL 세포를 단리하고, 그것들도 또한, 세포 생존 능력에 대하여 컴파운드-JP 용량 의존적인 효과를 나타냈다. Jurkat 세포 및 환자 유래의 세포와는 대조적으로, 컴파운드-JP는, 정상적인 정지 또는 활성화 인간 PBL 세포에 있어서, 세포사를 유발하지 않고, LAT1 선택적 저해제가, 정상(LAT2 발현) 세포와 비교하여, 백혈병(LAT1 발현)에 대해 우선적인 효과를 갖는다는 생각을 지지하였다.
분자 레벨에서, 본 발명자들은, 컴파운드-JP가, mTORC1 활성화에 부분적으로 간섭할 수 있음을 관찰하였다. 컴파운드-JP는, S6RP 인산화를 방해하지만, 4EBP1의 인산화에 영향을 주지 않았다. 컴파운드-JP에 의해 치료한 마우스의 이종 이식 tPTEN-/- 종양도 또한, 포스포 S6RP에서의 큰 저하를 나타냈다. 본 발명자들은 또한, 2개의 초대 T-ALL 샘플에 대한 포스포 플로우 사이토메트리를 사용하여, 컴파운드-JP에 의해 야기되는 이 mTOR 저해 효과를 관찰할 수도 있었다.
컴파운드-JP의 중요한 특이성은, 종합적 스트레스 응답(ISR)/변성 단백질 응답(UPR)에 있어서 CHOP 전사 인자를 유발하기 위한 그 능력이다. 소포체(ER)에서의, 잘못 절첩된 단백질의 축적 또는 AA의 부족에 의해 야기되는 이 응답은, 세포가, ER에 있어서 단백질 항상성을 회복시키는 것을 가능하게 한다(참고문헌 44). 그것들이 쇠퇴하면, 세포의 아폽토시스에 의한 배제가 개시된다. 또한, 배지에서의 AA 함유량을 변화시키면, 명확한 시간 의존성의 CHOP 유발이 초래되었다. CHOP는 또한, 벨케이드 프로테아솜 저해제에 의해서도, 강도는 보다 낮지만, 아스파라긴 및 글루타민의 레벨에 영향을 주는 L-아스파라기나아제 및 에르위나제에 의해서도, 및 라파마이신에 의해서도 강하게 유발되었다. PI3K/Akt/mTOR의 저해제는, CHOP를 유발하지 않았다. 컴파운드-JP 유발성의 CHOP는, 세포외 EAA의 추가에 의해 조정되어, 컴파운드-JP가, EAA 도입의 저해를 통해 작용하는 것을 실증하였다. 또한, eIF2α 탈인산화를 방해하고, ER 스트레스에 대하여 세포 보호를 유발하는 저해제로서 확립된 화합물인 살루브리날(참고문헌 32)은, 컴파운드-JP에 의해 야기된 CHOP 유발을 상쇄하여, KO99L 세포사를 구출하여, 세포 증식을 회복시킬 수 있었다. UPR은, ATF6, IRE-1 및 PERK에 의한 적어도 3개의 경로에 의해 야기될 수 있다(참고문헌 44). 흥미 깊은 것으로는, 컴파운드-JP는, ATF6, IRE-1 및 PERK를 통해 3개의 경로를 동원할 수 있고, 그것이, 공통된 상류의 이벤트에 간섭할 수 있음을 시사하였다.
분자적으로, 컴파운드-JP는, 4개의 아폽토시스 촉진성 Bcl-2 패밀리 멤버: UPR과 CHOP의 관여와 관련하는 Bax, Bak, Bim 및 Puma의 발현을 유발하였다. BH3만의 단백질 Puma는, ER 스트레스 유발성의 아폽토시스에 대하여 저항성을 나타내는 Puma-/- 세포에 의해, 튜니카마이신에 의해 유발된다(참고문헌 45). 또한, CHOP는, Puma 프로모터 영역 내에서 AP-1과 상호 작용하여(참고문헌 46), Bim 프로모터를 직접 조절한다(참고문헌 47). 또한, Bax 및 Bak는, IRE1α 활성화에 있어서 불가결한, IRE1α의 사이토졸 도메인과 단백질 복합체를 형성할 수 있다(참고문헌 48). Bax, Bak, Bim 및 Puma의 조정은, 필시, 미토콘드리아 및 ER 레벨에서, 아폽토시스의 유발에 관여한다. 예를 들어, 컴파운드-JP는, 카스파아제 활성화를 진행시키는, tPTEN-/- 세포에서의 용량 의존적인 미토콘드리아의 탈분극을 나타냈다. 아폽토시스는 mTORC1에 대한 컴파운드-JP의 저해 효과로부터 필시 결과적으로 발생하는 초기의 자식 응답에 이어지는 것을 알 수 있었다.
본 연구의 다른 흥미 깊은 측면은, KO99-RJ로서 나타나는, 컴파운드-JP 저항성의 세포주의 형성이었다. 컴파운드-JP는, KO99-RJ에서 세포사를 유발할 수 없었을 뿐만 아니라, CHOP 유발도 또한 관찰할 수 없어, 컴파운드-JP 유발성의 세포사에서의 CHOP의 중요성을 실증하였다. 컴파운드-JP의 작용 양식의 잠정적인 모델은, 보충 도 S4에서 나타낸다.
컴파운드-JP는, 전체적인 단백질 합성에 영향을 주지 않았지만, 컴파운드-JP는, EAA 이용 가능성에서의 감소에 대하여 c-myc를 매우 감수성으로 하는 매우 짧은 반감기(15분)를 갖는 c-myc의 발현을 변화시키고, 그 계속적인 재합성을 방해하였다. c-myc에서의 이 감소는, 림프종 세포의 증식 및 생존에 대하여 극적인 결정적 상태를 초래할 것이다. 실제로, 정상 T세포에 있어서, LAT1/SLC7A5는, T세포 항원 수용체(TCR)의 컨트롤 하에 있고, 그 유발은, 면역 응답을 적절하게 개시하는 것(mounting) 및 T세포 대사의 그 재프로그램화(reprogrammation)에 있어서 중대하다(참고문헌 28). SLC7A5에서 결손을 갖는 T세포는, TCR 트리거링 시에 mTORC1을 자극할 수 없어, 불완전한 c-myc 발현을 나타낸다. 2개의 이벤트가 조합되면, 결과적으로, 대사를 활성화하는 것도, 재프로그램화할 수도 없어, CD4+ 및 CD8+ 이펙터 세포의 분화의 결손을 초래하여, 면역 응답을 손상시켜버린다. 흥미 깊은 것으로는, 컴파운드-JP에 의한 LAT1 저해는, T세포 활성화에 간섭하는 것으로 나타났다(참고문헌 49).
LAT1 및 4F2/CD98hc는, 각각, 헤테로 2량체 CD98 복합체의 경쇄 및 중쇄이다. LAT1은, 큰 EAA를 운반하는데, CD98hc는, β 인테그린과 상호 작용한다(비특허문헌 19). 2개의 특성이 기능적으로 관계하고 있는지 여부는 아직 명확하지 않다. 배아 줄기 세포(ES 세포)에서의 CD98hc의 파괴는, 인테그린의 기능에 간섭하며, 접착이 아니라, 세포의 확산 및 이동을 파괴했다(비특허문헌 19). 경쇄가 아니라, 인테그린과 상호 작용하는 CD98hc 돌연변이체에 의한 널(null) 세포의 재구성은, 인테그린 시그널 전달을 회복시켰지만, 놀랍게도, Akt 활성화 및 아폽토시스로부터의 보호에 있어서 반드시 필요하지는 않았다(비특허문헌 19). 대조적으로, CD98hc를 과잉 발현하는 신장의 표피 세포에 있어서, LAT1 의존성의 아미노산 운반 및 인테그린 상호 작용은, 양쪽 모두 증식에 있어서 중요하다(참고문헌 50). 또한, 마우스 표피에 있어서 CD98hc의 결실은, 피부 호메오스타시스 및 창상 치유에 영향을 주고, AA 도입의 장해는, src 및 RhoA의 활성화에 대하여 네가티브하게 영향을 주는데 관여하는 것으로 나타났다(참고문헌 51). 세포의 상황 및 의존성에 의존하여, 인테그린과 상호 작용하는 기능 또는 AA 운반은, 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명자들의 모델에 있어서, 본 발명자들은, β 인테그린의 역할에 대하여 조사하지 않았지만, LAT1에 의한 EAA 유입은, 백혈병 존속에 있어서 중요한 것처럼 생각된다.
마지막으로, 본 발명자들은 또한, 다양한 화학 요법제 또는 시그널 전달 저해제와 조합한 컴파운드-JP 인 비트로 실험을 실행하여, 조합 인덱스(CI) 값을 산출하였다. 상승 효과 또는 상가 효과는, 시험한 모든 화합물에 의해 관찰되었다. 특히, 컴파운드-JP는, 라파마이신과 가장 고도의 상승 작용을 나타냈다. 2개의 약제가, 양쪽 모두 S6RP 인산화를 저해할 수 있고, 4EBP1의 인산화에 영향을 줄 수 없다고 해도, 그것들은, 그러나, 컴파운드-JP가, 증식 저지 및 아폽토시스를 유발할 수 있고, 라파마이신이, tPTEN-/- 세포에 있어서 세포 증식 억제성만인 것처럼, 서로 다른 작용 양식을 갖는다(참고문헌 52). 이것은, 컴파운드-JP가, 라파마이신과 비교하여, CHOP의 보다 강한 유발 인자이며, Akt 활성화를 저해할 수 있다는 사실에 의한 것으로 할 수 있다. 컴파운드-JP는 또한, 덱사메타손, 독소루비신 및 L-아스파라기나아제의 항 백혈병성의 효과를 강화할 수도 있다. 암세포에 대한 프로테아솜 저해제 벨케이드의 독성 작용은, 세포내 AA 풀의 고갈에 의한 것이 보고되어 있다(참고문헌 27). 이것은, 컴파운드-JP에 의해 증폭될 가능성이 높아, 세포 생존 능력에 대한, 2개의 분자의 관찰된 상가 효과를 설명할 수 있다. 본 발명자들은, 컴파운드-JP가 또한, PI3K/Akt/mTOR 경로에 작용하는 2개의 저해제, KU0063794 및 PI-103의 효과도 약간 증가시킨 것을 나타낸다.
개략적으로 말하면, 본 발명자들의 결과는, T-ALL/T-LL 암세포 상의 LAT1의 과잉 발현이, 그것들의 재프로그램화된 대사를 지지하는, 영양소의 도입 증가 및 mTORC1 및 Akt의 활성화에 대한, 암세포의 의존을 반영하는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자들의 연구는, LAT1을 통한 EAA 도입에 대한 약리학적인 간섭이, 이들의 치명적인 조혈 악성 질환을 치료하기 위한, 흥미 깊은, 전체적인 보조 치료 전략에 상당할 수 있음을 인 비트로에서 실증하고 있다.
마지막으로, 다른 암에 대한 응용에 대하여 이하에 실증한다. 각 세포로부터 RNA를 추출하고, LAT1 및 LAT2 특이 프라이머를 사용하여 각 mRNA를 정량 PCR법으로 측정하였다. 그 결과를 도 10에 도시한다. 단위 RNA당의 mRNA량을 종축에, 사용한 암세포명을 횡축에, 암 종별명을 표 중에 기재하였다. 상단은 LAT1을, 하단은 LAT2를 기재하였다. 당해 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 46종류의 세포 모두에 LAT1 mRNA는 발현하고 있어, 암 타입의 트랜스포터라 할 수 있다. 한편, LAT2는 암세포에서의 발현은 제로이거나 극단적으로 낮은 값으로, 정상 타입이라고 이해할 수 있다. 따라서, 상기 결과를 다른 암에 응용할 수 있다.
그리고, 실제로, 다른 암에 응용한 실험 결과의 고찰을 이하에 나타내었다.
먼저, 도 11에서 나타낸 바와 같이, 암세포의 종류에 따른 차이는 나타나지만, 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포와 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 양쪽 세포 모두에 컴파운드-JP의 용량 의존적인 증식 활성의 저하가 명백하게 나타났다. 도 10의 결과로부터 명백해진 바와 같이, 그 밖의 많은 LAT1 발현 암세포에서도 그것들의 LAT1 발현량에 따른 컴파운드-JP의 증식 억제 효과가 기대된다.
이어서, 도 13에서 나타낸 바와 같이, 겜시타빈 및 파클리탁셀의 양자 모두 용량 의존성으로 세포의 증식 활성을 저하시켰다. 겜시타빈보다는 파클리탁셀의 억제 효과가 강력하였다. 인간 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과에 대해서, 컴파운드-JP(15μM)를 전 2일간 처치한 결과(각 군의 중앙의 막대 그래프)보다 전체 기간 존재시킨 것(각 군의 우측 막대 그래프)의 병용 효과가 보다 강력하였다. 병용에 의한 억제 효과는 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 소위 상가 효과를 나타냈다.
계속해서, 도 14에서 나타낸 바와 같이, 겜시타빈 및 파클리탁셀의 양자 모두 용량 의존성으로 세포의 증식 활성을 저하시켰다. 겜시타빈보다는 파클리탁셀의 억제 효과가 강력하였다. 그러나, 겜시타빈의 단독 효과는 매우 작아, 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 대한 작용보다 명백하게 약한 작용이었다. 인간 췌장암 유래 Panc-1 세포의 증식에 미치는 컴파운드-JP와 기타 약제와의 병용 효과에 대해서, 컴파운드-JP(15μM)를 전 2일간 처치한 결과(각 군의 중앙의 막대 그래프)보다 전체 기간 존재시킨 것(각 군의 우측 막대 그래프)의 병용 효과는 약간 억제가 나타났지만, 그 정도는 경성 위암 유래 44As3-11 세포의 증식에 비해 명백하게 낮은 억제이었다. Panc-1 세포에 있어서의 각 병용에 의한 억제 효과는 각 단독의 작용을 가산한 결과이며, 44As3-11 세포의 경우와 마찬가지로 소위 상가 효과이었다.
또한, 도 15에서 나타낸 바와 같이, 양쪽 약물의 단독 투여에서는 무처치의 대조군에 비해 종양의 증대는 각각 유의한 감소를 나타냈다. 인간 대장암 유래 HT-29 세포 파종 누드 마우스 모델에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 5-FU의 병용 효과에 대해서, 양자의 병용에 의해, 각 단독 군의 잔존 종괴 증대는 더 감소하였다. 이 병용 효과는 상가적이며, 양쪽 약물의 작용 기서가 상이한 것에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 병용에 의한 각 단독의 치료 효과를 더 증강할 수 있는 약효는, 임상에서의 대장암 치료에서도 충분히 기대된다.
마지막으로, 인간 대장암 유래 HT-29 세포의 동소 파종 누드 마우스 모델(SOI model)에서의 종양 증식에 미치는 컴파운드-JP와 CDDP의 병용에 의한 상승 효과에 대해서, 도 16에 도시한 바와 같이, 도 16의 그룹 8과 9에서는 대조군에 비해 종괴의 증대는 유의미하게 저하되었다. 이 결과로부터, 컴파운드-JP와 CDDP의 단독 투여에서는 인정되지 않은 각 약효는, 양자의 병용으로 명확한 약효가 인정되었다. 이 병용에 의한 약효는 양자의 상승 효과라고 결론지어졌다.
이상과 같이, LAT1 저해제와 기타 약제와의 병용에 의한 상가 효과나 상승 효과가 명확해지고, 다른 암에 대해서도, 본 발명에 따른 LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물이 유효하다.
≪참고문헌≫
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064

Claims (8)

  1. LAT1 저해제와, 알킬화약, 백금 제제, 대사 길항제, 토포이소메라아제 저해약, 미소관 중합 저해약, 내분비 요법제, 미소관 탈중합 저해약, 항 종양성 항생 물질 및 분자 표적약으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항 악성 종양제 조성물이 T세포 급성 림프성 백혈병/림프종 치료용 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 LAT1 저해제가 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신, 그의 유사체 또는 그것들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제가 시스플라틴, 5-플루오로우라실(5-FU), 겜시타빈, L-아스파라기나아제(로이나제), 파클리탁셀, 덱사메타손, 독소루비신을 비롯한 안트라사이클린계 항생 물질, 벨케이드(보르테조밉), 라파마이신, KU0063794 및 PI-103에서 선택되는 하나 이상의 약제인 조성물.
  5. LAT1 저해제와, mTOR 저해제, PI3K 저해제 및 Akt 저해제에서 선택되는 하나 이상의 약제를 유효 성분으로서 포함하는 항 악성 종양제 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항 악성 종양제 조성물이 T세포 급성 림프성 백혈병/림프종 치료용 의약 조성물, 위암 치료용 의약 조성물, 췌장암 치료용 의약 조성물 또는 대장암 치료용 의약 조성물인 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 LAT1 저해제가 O-(5-아미노-2-페닐벤즈옥사졸-7-일)메틸-3,5-디클로로-L-티로신, 그의 유사체 또는 그것들의 약리학적으로 허용될 수 있는 염인 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제가 라파마이신, KU0063794 및 PI-103에서 선택되는 하나 이상의 약제인 조성물.
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