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KR20160145610A - 생물학적 분자들의 정화 방법 및 장치 - Google Patents

생물학적 분자들의 정화 방법 및 장치 Download PDF

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Publication number
KR20160145610A
KR20160145610A KR1020167029554A KR20167029554A KR20160145610A KR 20160145610 A KR20160145610 A KR 20160145610A KR 1020167029554 A KR1020167029554 A KR 1020167029554A KR 20167029554 A KR20167029554 A KR 20167029554A KR 20160145610 A KR20160145610 A KR 20160145610A
Authority
KR
South Korea
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filter
cells
buffer
pumped
biological molecules
Prior art date
Application number
KR1020167029554A
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English (en)
Inventor
베른트 팔틴
크리스챤 도러
Original Assignee
로베르트 보쉬 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로베르트 보쉬 게엠베하 filed Critical 로베르트 보쉬 게엠베하
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Abstract

생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들의 정화를 위한 방법 및 장치의 경우 적어도 하나의 필터(50)가 사용된다. 공정 제어를 위해 필요한 액체들 중 적어도 일부는 필터(50)를 경유하여 회로(51) 내로 펌핑된다. 이 경우, 먼저, 생물 세포들을 포함하는 액체가 필터(50)를 경유하여 펌핑된다. 필터 상에 잔류되는 세포들은 파쇄된다. 필터 상에 생물학적 분자들의 결합을 위해, 결합 완충액이 필터(50)를 경유하여 회로(51) 내로 펌핑된다. 그리고 필터 상에 결합된 생물학적 분자들의 세척을 위한 세척 완충액이 필터(50)를 경유하여 펌핑되며, 그럼으로써 필터 상에 결합된 생물학적 분자들은 추가 사용을 위해 제공될 수 있다.

Description

생물학적 분자들의 정화 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR PURIFYING BIOLOGICAL MOLECULES}
본 발명은 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들의 정화를 위한 방법 및 장치에 관한 것이며, 상기 방법의 경우 적어도 하나의 필터가 사용된다.
생물학적 분자들 및 특히 핵산들 또는 단백질들의 정화를 위해 다수의 다양한 방법이 존재한다. 일반적으로 생물학적 분자들은 세포 물질로부터, 다시 말하면 원핵 세포들 또는 진핵 세포들로부터 수득된다. 세포 내 물질이 계속하여 처리될 수 있기 전에, 일반적으로 세포들 자체를 파쇄(disruption)할 필요가 있다. 이런 세포 파쇄(cell disruption)는 일반적으로 세포 용해(cell lysis)라고도 한다. 세포 잔해들(cell debris)의 분리 후에, 예컨대 핵산들, 단백질들 또는 펩타이드들은 계속해서 정화되고, 처리되며, 분석될 수 있다. 하기에서 단백질이 언급되면, 이는 펩타이드도 의미한다. 예컨대 특정한 핵산을 검출할 수 있도록 하기 위해, 정화된 핵산들은 PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소 연쇄 반응)로 선택적으로 증폭될 수 있으며, 그럼으로써 특정한 핵산 시퀀스가 검출될 수 있게 된다.
세포들의 파쇄는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 세포들의 효소 파쇄가 보급되어 있으며, 이 경우 예컨대 프로테이나아제 K 또는 리소자임 효소들을 이용한 처리가 실시된다. 시료의 가열 및/또는 동결에 의한 열적 세포 파쇄, 또는 화학 시약들을 이용한 세포 파쇄도 가능하다. 또한, 세포 파쇄는 기계적으로, 예컨대 초음파 처리에 의해 수행될 수도 있다. 예컨대 핵산들의 추가 정화를 위한 통상적인 방법에 따르면, 세포 파쇄에 의해 생긴 이른바 용해물(lysate)은 결합 완충액과 혼합되어 고정 매트릭스, 예컨대 실리카 필터 또는 실리카 멤브레인과 접촉된다. 이 경우, 핵산들은 필터 상에 흡착되고 그런 다음 세척 완충액으로 세척되고 그런 후에 고정 매트릭스로부터 용리되어 계속하여 사용될 수 있다. 다양한, 구입 가능한 키트들 및 실험실 장비들은 상기 원리에 따라서 기능한다.
보통은, 추가 처리 전에 세포 물질을 농축시키거나, 또는 세포들을 축적하는 것이 요구된다. 이를 위해, 예컨대 세포들을 포함한 시료의 원심 분리가 실시될 수 있다. 독일 공개 공보 DE 10 2005 009 479 A1은, 세포들이 여과에 의해 축적되는 방법을 개시하고 있다. 상기 필터 멤브레인 방법에 의해, 예컨대 Dufour, Alfred P. 등의 간행물(응용 및 환경 미생물, 1981년05월, 1152~1158쪽)에 개시된 것처럼, 축적된 세포들, 예컨대 박테리아들을 정량화할 수도 있다.
독일 공개 공보 DE 10 2010 030 962 A1은, 마이크로 어레이(micro array) 내에서 핵산들의 혼성화(hybridization)를 위한 방법을 개시하고 있으며, 이 방법의 경우 시료가 먼저 변성 유닛(denaturation unit)에 의해, 그리고 그런 다음 고정된 프로브들을 구비한 마이크로 어레이를 포함하는 별도의 반응 영역을 통해 펌핑된다. 이 경우, 펌핑 섹션은 회로로서 형성될 수 있다.
독일 공개 공보 DE 10 2010 043 015 A1은, 핵산들이 필터 상에서 증폭되게, 다시 말하면 배가되게 하는 방법을 개시하고 있다. 사전에, 필터 상에서 핵산들을 포함하는 세포들의 농축 및 용해가 수행될 수 있다.
본 발명의 과제는, 종래 기술의 문제를 해결하면서 자동화 방식으로 실행될 수 있는, 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들, 또는 기타 생물학적 분자들을 농축하고 정화하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해, 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들 또는 기타 생물학적 분자들은 농축되고 정화될 수 있다. 정화는 원칙상 매트릭스 상에, 특히 멤브레인 상에 생물학적 분자들의 불특정 흡착에 의해 수행된다. 하기에서는 일반적으로 필터가 다루어지며, 상기 필터는 특히 멤브레인의 형태인, 또는 예컨대 베드(bed)의 형태인 매트릭스를 의미한다. 본 발명의 핵심은, 공정 제어를 위해 필요한 액체들 중 적어도 일부가 회로 내에서 필터를 경유하여 펌핑된다는 것이다. 본 발명에 따른 방법의 단계들은 상세하게는 먼저 필터를 경유하여 생물 세포들을 포함한 액체, 다시 말하면 시료액을 펌핑하는 것을 포함한다. "생물 세포들"이란 표현은 일반적으로 예컨대 핵산들 또는 단백질들과 같은 생물학적 분자들이 처리되거나 정화되어야 하는 세포들을 의미한다. 이는, 예컨대 박테리아들 또는 균류들과 같은 병원성 미생물들일 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 인간 세포들 또는 기타 세포들에 대해서도 적합하며, 일반적으로 원핵 또는 진핵 세포들로부터 단백질들 또는 핵산들의 정화를 위해 사용될 수 있다. "시료액"이란 표현은 일반적으로 상응하는 세포들, 예컨대 세포 현탁액 또는 환자 시료, 예컨대 혈액, 세척액, 소변, 체액, 가래 또는 세척된 표본(swab)을 포함하는 액체를 의미한다. 적용에 따라서, 시료의 체적은 서로 상이할 수 있으며, 예컨대 수 ㎕ 내지 10㎖일 수 있다. 시료 제공 후에, 필터 상에 잔류된 세포들은 파쇄되며, 세포 파쇄를 위해 원칙상 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 세포 용해물 내에 함유된 생물학적 분자들은 결합 완충액에 의해 필터 상에 결합되고, 결합 완충액은 회로 내에서 필터를 경유하여 펌핑된다. 필터 상에 결합된 생물학적 분자들은 후속 단계에서 필터를 경유하여 펌핑되는 세척 완충액으로 세척된다. 그런 다음, 결과적으로, 정화될 생물학적 분자들은 가역적으로 고정된 형태로 필터 상에 위치한다. 추가적인 처리 또는 분석을 위해, 결합된 생물학적 분자들은 통상의 방식으로 필터로부터 용리될 수 있거나, 또는 가역적으로 고정된 생물학적 분자들을 포함한 필터가 그 자체로서 직접적으로 계속하여 사용된다.
종래 공지된 방법에서, 시료로부터 세포들의 축적은 원심 분리에 의해 수행된다. 그러나 미세 유체 시스템 내에서 상기 방법의 구현과 그에 따른 경제적인 자동화는 불가능하다. 또한, 시료로부터 세포들의 축적은 필터를 통한 세척에 의해 수행되고 그런 다음 용해는 필터 상으로 용해 완충액을 공급하는 것에 의해 이루어지는 방법들 역시도 공지되어 있다. 그러나 이런 방법들은 미세 유체 시스템 내로 통합하는 경우 필터 상에서 용해 완충액의 정확한 포지셔닝이 어렵고 큰 비용과 결부된다는 단점을 제공한다. 상기 포지셔닝은 수동으로 수행되어야 하거나, 또는 예컨대 카메라들 또는 광 배리어들이 요구된다. 또한, 필터 상으로 용해 완충액을 공급할 때 필터로부터 세포들 및 이미 유리된 핵산들이 밀어내져서, 추가 정화를 위해 더 이상 제공될 수 없기 때문에 정화의 효율이 떨어질 위험도 존재한다. 또한, 상기 방법들의 경우, 필터 상에서 용해 시약들, 예컨대 효소들의 확산이 어려워지고, 이는, 특히 용해가 어려운 세포들, 예컨대 균류들의 경우, 용해의 유효성을 저하시킨다. 본 발명은 상기 문제들을 해결함으로써 자동화된 미세 유체 시스템[랩-온-칩 시스템(Lap-on-Chip-System)]에서 상기 방법의 간단한 실현을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 정화 방법의 특별한 유효성은, 특히 필터 상에 생물학적 분자들의 결합 과정 동안 액체들의 원형 가이드에 의해, 물질들이 수회 필터를 통해 세척됨으로써 달성된다. 원형 유체 경로 내에서 액체들의 상기 가이드에 의해, 필터 재료는 수회 액체들과 접촉된다. 이 경우, 멤브레인의 최대 결합 용량이 완전하게 사용되는 포화 평형이 나타난다. 종래 방법의 경우, 관계하는 분자들의 일부만이 실제로 흡착되는 경우가 종종 있다. 본 발명에 따른 방법의 경우, 원형 유체 가이드에 의해, 예컨대 세포 파쇄 동안 유리된 모든 핵산이 결합 단계 중에 효과적으로 필터를 경유하여 펌핑되는 것이 보장된다. 어느 정도까지는 핵산은 전혀 소실되지 않으며, 그럼으로써 수율은 높아진다. 그 밖에도, 회로형 펌핑에 의해, 시약들, 다시 말하면 예컨대 결합 완충액 및 세포 용해물의 최적의 혼합이 일어나는 것이 보장된다. 시약들의 혼합은 특히 미세 유체 시스템들에서 종종 문제를 나타낸다. 본 발명에 따라 제공되는 원형의 유체 가이드에 의해 다양한 시약들 및 완충액의 적합한 혼합이 달성되며, 그럼으로써 본 발명에 따른 방법은 특히 바람직한 방식으로 미세 유체 시스템 내부에서의 실현을 위해 적합하다. 이와 무관하게, 특히 미세 유체 시스템 내에서 혼합 효율성은, 미세 유체 시스템 내에서의 추가 조치들에 의해서도, 특히 공지된 혼합기 구조들 또는 혼합 챔버들에 의해서도 증가될 수 있다.
제 1 단계에서, 생물 세포들의 축적이 수행되며, 이때 시료액이 필터를 경유하여 펌핑된다면, 세포들은 크기별 배제 방법(size exclusion method)에 따라 및/또는 정전기적 상호작용들에 의해 필터 상에 잔류된다. 시료액이 필터를 경유하여 더 많이 펌핑될수록, 축적되는 세포들의 개수는 더 많아진다. 본 발명에 따른 장치의 치수에 따라서, 상기 공지된 필터의 지름은 상이할 수 있으며, 예컨대 1 내지 25㎜이다. 필터로는, 예컨대 섬유 필터, 직포 필터(cloth filter) 및/또는 특히 실리카로 이루어진 멤브레인 필터가 적합하다. 또한, 예컨대 실리카 입자들로 이루어진 입자 베드들(particle bed), 특히 미세입자 베드들도 적합하다. 재료들의 다공 지름은 바람직하게는 100㎛ 미만이다.
필터 상에 시료액을 제공할 때, 시료는 원형으로 수회 필터를 경유하여 펌핑될 수 있다. 이는, 필터를 최초 통과할 때 잔류되지 않았던 세포들도 필터를 다시 통과할 때 잔류된다는 장점을 갖는다. 정전기력도 작용하고 실리카 필터 내에서 다공들의 크기 분포는 일반적으로 균일하지 않는 것으로 가정되기 때문에, 세포들이 최초 통과 동안 잔류되지 않을 수 있다. 그 밖에도, 세포들이 시스템의 "막다른 위치들(blind end)" 내에 걸릴 수 있으며, 그럼으로써 시료 제공 시 원형 가이드에 의해 유효성이 높아질 수 있다.
세포들의 파쇄는 다양한 방식으로, 예컨대 기계적으로, 또는 열에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 예컨대 비교적 적은 장치 비용으로 실시될 수 있는 초음파 처리가 제공될 수 있다. 이 경우, 용해 또는 세포 파쇄를 위해 추가적인 시약들은 필요하지 않다. 초음파가 필터 내로 직접적으로 유입될 수 있다. 이를 위해, 예컨대 상응하는 필터 챔버의 벽부는 멤브레인으로서 실현될 수 있고, 이 멤브레인 내로 초음파가 혼(horn)에 의해 주입된다. 초음파 처리 동안, 필터 챔버는 액체 또는 완충액 또는 물로 충전되어 있어야 한다. 초음파 처리의 결과로, 필터 재료는 부분적으로 분해될 수 있다. 그 결과, 한편으로 필터 내에 축적된 세포들이 적어도 부분적으로 유리되어 초음파를 통한 용해 작용에 제공될 수 있다. 다른 한편으로는, 이 경우 생긴 입자들이 추가적인 분쇄 작용을 일으킬 수 있고 그 때문에 세포 파쇄를 더 보조할 수 있으며, 입자들은 공정 처리의 추가 진행 동안 필터의 손상되지 않은 영역들에 의해 다시 포집된다.
특히 바람직한 경우는 효소들 또는 기타 용해용 시약들, 예컨대 화학 시약들을 사용하는 세포 파쇄이다. 용해용 시약들을 이용한 상기 세포 파쇄의 경우, 특히 바람직하게는 마찬가지로 액체들의 회로 가이드(circuit guide)가 제공될 수 있다. 이를 위해, 적합한 용해 완충액이 원형 유체 경로 내로 공급되고, 회로 내에서 필터를 경유하여 펌핑된다. 이 경우 특히, 시료가 필터를 경유하여 펌핑되었던 방향으로 펌핑이 수행된다. 그 결과, 필터 상으로 용해 완충액을 처음 공급할 때 세포들 또는 이미 유리된 핵산들의 손실이 발생하는 것이 방지된다. 또한, 경우에 따라 필터 상에 도달한 기포들은 추가 진행 중에 다시 상기 필터로부터 제거된다. 종래 공지된 방법들의 경우, 상기 유형의 기포들은 필터 상에 잔존하면서 국소적으로 용해를 저지한다. 또한, 세포들 상으로 용해 완충액이 연속적으로 접근함으로써, 필터 상에서 용해 시약들의 결핍이 방지되며, 그에 따라 필터 상에서 세포들의 특히 효과적이면서도 완전한 용해가 달성된다. 놀랍게도, 용해를 위해 효소들의 사용 시, 효소들의 활성도는 끊임없는 펌핑과 이때 생기는 전단력에 의해 저하되지 않으며, 그럼으로써 효소 용해도 전술한 개요에 따라서 바람직하게 실시될 수 있는 것으로 나타났다. 생물 세포들 및 사용되는 시약들의 유형에 따라 용해는 예컨대 2분 내지 30분의 시간을 요구할 수 있다. 용해 완충액은, 세포 파쇄를 위해 또는 목표 세포들(target cell)의 용해를 위해 적합한 완충액을 의미한다. 완충액은 예컨대 리소자임 및/또는 프로테이나아제와 같은 예컨대 공지된 용해 효소들을 함유할 수 있다. 대안으로서 또는 추가로, 카오트로픽 염들, 세제들 및/또는 예컨대 NaOH와 같은 염기성 성분들이 함유될 수 있다. 또한, 완충액 물질들(예: Tris-HCl), 누클레아제 억제제(예: EDTA 또는 EGTA) 및/또는 환원제(예: β-메르캅토에탄올)도 함유될 수 있다.
후속 결합 단계에서, 결합 완충액은 원형 유체 경로 내로 공급되고 회로 내에서 펌핑된다. 이때 결합 완충액은 용해물과 혼합되고 예컨대 핵산들은 이때 설정되는 조건들하에서 필터 상에 결합된다.
결합 단계 전에, 특히 핵산들의 정화 동안 추가의 변성 단계가 실시될 수 있다. 이를 위해 적합한 완충액은 특히 카오트로픽 시약들, 예컨대 GIT(구아니디늄 이소티오시아네이트)를 함유할 수 있다. 상기 유형의 시약들에 의해, 용해물 내에 함유된 단백질들은 어느 정도까지 "염화"되며, 그럼으로써 단백질들은 상대적으로 더 용이하게 세척된다. 변성 완충액은 바람직하게는, 변성 단계의 유효성을 더 높이기 위해, 마찬가지로 회로 내에서 펌핑된다.
결합 단계 전에, 추가 온침 단계(digestion step)가 특히 핵산들의 정화 동안 실시될 수 있다. 적합한 온침 완충액은 예컨대 용해 단계에서 유리된 단백질들의 온침을 실현하는 다양한 효소들, 특히 프로테이나아제들을 포함할 수 있다. 그 결과, 핵산 정화의 유효성 및 수득된 핵산들의 순도가 더 개선될 수 있다. 이런 단계를 위해, 적합한 온침 완충액은 경로 내로 공급되어 바람직한 방식으로 마찬가지로 회로 내에서 펌핑된다. 여기서도 놀랍게도, 온침을 위해 사용되는 효소의 활성도는 끊임없는 핌펑과 이때 생기는 전단력에 의해 저하되지 않는 것으로 나타났다.
필터 상에 생물학적 분자들의 결합 후에, 1회 또는 수회의 세척 단계가 수행되며, 세척 완충액은 필터를 경유하여 안내된다. 적합한 세척 완충액들의 조성은, 상기 단계에서 예컨대 핵산들이 필터 상에 결합된 상태로 유지되는 한편, 다른 분자들, 특히 단백질들은 흡착되지 않고 제거되도록 선택된다. 세척 완충액으로서는 예컨대 알코올을 함유한 세척 완충액, 예컨대 70% EtOH가 사용될 수 있다.
많은 적용을 위해 바람직하게는 필터가 세척 완충액을 이용한 처리 후에 건조된다. 이는 예컨대 필터를 통해 공기 또는 질소를 안내하는 것에 의해 수행될 수 있다. 그런 다음 필터로부터 흡착된 목표 분자들의 용리가 수행될 수 있으며, 이를 위해 물 또는 적합한 용리 완충액이 사용될 수 있다. 또한, 필터는 그것에 흡착된 목표 분자들과 함께 그 자체로서 추가로 이용될 수도 있다. 예컨대 필터 상에 가역적으로 고정된 핵산들을 이용한 PCR은, 종래 기술에 공지된 것처럼 실시될 수 있다.
특정한 시료들의 사용 시, 필터 상으로 공급하기 전에 시료를 전처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대 혈액의 여과 시, 필터가 혈액 세포들로 막힘으로써 추가 여과가 불가능하게 되는 문제가 있을 수 있다.
이를 위해, 먼저 혈액 세포들을 선택적으로 용해하는 점이 바람직한 것으로 나타났다. 여기서 "선택적으로 용해한다는 것"은, 인간 세포들이라고도 하는 혈액 세포들이 파쇄되는 한편, 시료 내에 포함된 다른 세포들, 특히 병원균들은 온전한 상태로 유지되게 하는 것을 의미한다. 이는, 예컨대 카오트로픽 시약들 또는 세제들을 이용한 시료의 처리를 통해, 또는 삼투압 충격에 의해 수행될 수 있으며, 그리고 필터의 막힘이 방지된다는 장점을 갖는다. 상업상 구입 가능한 키트(Molzym MolYsis Complete5)는 상기 유형의 선택적 용해의 경우 DNase를 이용하여 유리된 인간 핵산들의 온침을 추가로 실시한다. 상기 온침은 본 발명에 따른 방법에 통합될 수 있으며, 시료의 여과성이 더욱 개선되고 인간 핵산 배경은 부분적으로 시료로부터 제거된다는 장점을 갖는다. 예컨대 시료는 먼저 카오트로픽 완충액과 혼합되고, 후속해서 DNase로 예컨대 10분의 시간 동안 배양된 후, 시료가 필터 상에 제공된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 단계들 중 하나 또는 다수의 단계는 적어도 부분적으로 열 공급 하에 수행될 수 있다. 특히 세포 파쇄 및/또는 추가적인 온침 단계를 위해, 및/또는 필터의 건조를 위해, 온도를 높이는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대 효소에 의한 세포 파쇄를 위해 사용되는 효소들은 높아진 최적 온도를 가질 수 있으며, 그럼으로써 예컨대 35℃ 내지 60℃, 특히 35℃ 내지 45℃의 온도로 온도의 상승 시, 세포들의 용해는 상대적으로 더 신속하면서도 더 효과적으로 진행될 수 있다. 상응하는 것이 온침 또는 변성 단계에도 적용된다. 필터의 건조도 온도의 상승에 의해, 예컨대 40° 내지 60°의 온도로의 온도 상승에 의해 촉진될 수 있다. 일반적으로 열 공급을 위해 특히 필터가 직접적으로, 예컨대 공지된 펠티어 소자, 또는 필터를 포함하는 유닛과 접촉되는 필름 히터에 의해 가열될 수 있다. 그 밖에도, 온도 조절되는 액체들을 이용하여 처리할 수도 있으며, 예컨대 사용되는 액체들을 위한 예비 저장 용기 및/또는 라인 시스템을 적어도 부분적으로 가열할 수 있다. 적용에 따라, 냉각, 또는 일반적으로는 온도 조절도 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시형태에서, 펌핑 방향은 단계들 중 하나 또는 다수의 단계에서 1회 또는 수회 역전될 수 있다. 그 결과, 특히 필터의 메워짐 또는 필터의 막힘이 방지될 수 있거나, 또는 경우에 따라 이전 상태로 복귀될 수 있다. 또한, 회로 내에 있는 액체들의 혼합도 개선될 수 있고 경우에 따라 침전된 고체들이 다시 용해될 수 있다. 필터 상에서 목표 분자들의 성공적인 결합 후에 펌핑 방향의 역전에 의해, 일반적으로 필터로부터 목표 분자들의 분리는 발생하지 않는데, 그 이유는 필터 상에서 분자들의 흡착은 펌핑 방향과 무관하기 때문이다. 펌핑 방향의 역전은 특히 결합 단계 동안 및/또는 세척 단계 동안 및/또는 용리 단계 동안 수행되는 것이 바람직하다. 시료 제공 동안 또는 필터 상에 세포들의 축적 동안, 세포들로 필터의 막힘과 그에 따른 메워짐을 방지하거나, 또는 경우에 따라 이전 상태로 복귀시키기 위해, 펌핑 방향을 반복해서 단시간 역전하는 것이 바람직할 수 있다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법이 미세 유체 장치 내에서 실시된다. 일반적으로 미세 유체 장치들은, 그들이 자동화된 공정들을 위해 특히 적합하다는 장점을 갖는다. 자동화에 의해, 분석의 지속 시간 및 비용과 오염 위험이 감소한다. 또한, 자동화된 시스템은 반드시 전문 직원에 의해 조작되지 않아도 되는데, 그 이유는 조작이 일반적으로 간단히 학습될 수 있기 때문이다. 미세 유체 장치와 상호작용하는 본 발명에 따른 방법은, 액체들의 원형 가이드에 의해 액체들의 특히 적합한 혼합이 달성된다는 특별한 장점을 제공한다. 그러므로, 보통은, 혼합을 위한 교반기와 같은 추가 구조들 및 액티브 컴포넌트들이 생략될 수 있다. 그러나 그럼에도 불구하고, 혼합 효율성을 더 높이기 위해, 상응하는 장치 내에 추가의 공지된 혼합기 구조들 또는 혼합 챔버들이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들의 정화를 실시하기 위한 장치를 포함한다. 본원의 장치는 액체들을 펌핑하기 위한 적어도 하나의 펌프를 포함한다. 그 밖에도, 본원의 장치는 적어도 하나의 필터의 고정을 위한 적어도 하나의 유닛을 포함한다. 본원의 장치로 실시 가능한 세척 프로토콜은, 세척할 생물학적 분자들이 필터 상에 흡착될 수 있다는 것을 기반으로 한다. 본 발명에 따라서, 본원의 장치는 필터를 경유한 액체들의 원형 펌핑을 위한 라인 시스템을 포함한다. 본원의 장치에 의해 특히 전술한 본 발명에 따른 방법이 바람직하게 실시될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 중요한 관점은, 필터를 경유한 액체들의 원형 펌핑에 의해 세척 방법의 효율성이 훨씬 개선될 수 있다는 것이다.
필터의 고정을 위한 유닛은 특히 필터 재료의 수용을 위한 필터 챔버이다. "필터 챔버"라는 표현은 특히 필터를 포함하는 유체 중공 챔버를 의미한다. 필터 챔버는 예컨대 튜브로서 형성될 수 있거나, 또는 특히 바람직한 방식으로 미세 유체 요소로서 형성될 수 있다. 필터 챔버는 바람직하게는 다층형 구성을 갖는다. 이 경우, 예컨대 2개 또는 그 이상의 구조화된 플레이트, 특히 폴리머 플레이트가 제공될 수 있다. 플레이트들 중 하나의 플레이트 내에는 평평한 공동부가 제공될 수 있고, 이 공동부 내로는 필터, 예컨대 멤브레인, 또는 또 다른 필터 재료, 예컨대 미세입자 베드가 삽입될 수 있다. 이 경우, 특히 필터 지름이 비교적 큰 경우(> 3㎜), 필터의 휨 또는 처짐을 방지하기 위해, 지지 구조, 예컨대 다공성 폴리머 지지체[프릿(frit)]에 의해 필터를 지지하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 액체들을 통과시키기 위해, 하나 또는 복수의 유입 및 유출 채널이 제공된다. 또한, 두 플레이트 사이에 추가 멤브레인이 삽입될 수 있고, 이 멤브레인에 의해 필터 챔버의 추가 기능들, 예컨대 멤브레인 밸브들 및/또는 멤브레인 펌프의 공압식 작동이 실현될 수 있다. 바람직하게는 커버 필름들 또는 커버 멤브레인들 또는 기타 폴리머층들이 시스템의 측면 외부 폐쇄부들로서 제공된다. 그 밖에도, 커버 필름은 초음파의 주입을 위해 사용될 수 있다. 특히 세포 용해 동안 초음파 처리를 위해 설계된 장치의 실시예들에서, 필터 챔버는 초음파를 유입시키기 위한 확장부를 포함할 수 있다. 이 경우, 예컨대 원형이거나 부분 원형일 수 있는 확장부는 바람직하게는 특히 커버 멤브레인으로 폐쇄될 수 있는 바깥쪽으로 향하는 관통구로서 실현된다. 그 밖에도, 필터 챔버의 상기 확장부는 시스템을 위한 환기 기능을 담당할 수 있으며, 확장부 내로 통해 있는 환기 채널들이 제공될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 장치는 적어도 하나의 환기식 용기(ventilated vessel)를 포함하고, 이 용기를 통해 액체들이 시스템 내로 유입될 수 있다. 특히 상향 환기식 용기는 필터를 경유하여 액체들을 원형 펌핑하기 위해 유체 경로 내에 또는 라인 시스템 내에 장착될 수 있다. 환기식 용기의 장착은, 결과적으로 회로 내에 있는 액체들의 증가하는 체적이 수용되어 회로 내 압력이 일정하게 유지될 수 있고, 이로 인해 미세 유체 실현이 특히 바람직한 방식으로 가능해진다는 장점을 갖는다. 액체들은 예컨대 수동으로, 특히 피펫을 통해, 또는 시스템 내에 통합된 제 2 펌프를 이용한 펌핑에 의해 용기 내로 유입될 수 있다. 또한, 환기식 용기는, 유체 경로 내에 도달한 기포들이 용기 내에서 상향 상승하고 그렇게 시스템을 벗어날 수 있다는 장점을 갖는다. 따라서 기포들이 회로 내에 잔존하면서 기포 형성을 야기하는 것은 방지된다. 상기 용기는 예컨대 튜브, 챔버로서, 또는 예컨대 100㎕ 내지 10㎖의 체적을 갖는 기타 유체 요소로서 실현될 수 있다. 그 밖에도, 특히 바람직하게는 특히 시약들을 위한 변위 챔버들로서 사용될 수 있는 복수의 환기식 용기가 시스템 내에 제공될 수 있다.
펌프는 예컨대 연동 펌프이거나, 또는 마이크로 멤브레인 펌프일 수 있다. 특히 바람직하게 펌프는 필터의 다소 바로 상류에 또는 하류에 연결되며, 그럼으로써 액체들은 매우 높은 초과 압력 또는 부압 상태로 필터를 경유하여 펌핑될 수 있다. 이 경우, 적합한 방식으로, 펌프와 필터 사이의 덕트는 비교적 짧다. 또한, 바람직하게는 시료액들을 위한 유입 채널은 펌프 또는 필터의 다소 바로 상류에 연결된다. 이는, 완충 용액들을 위한 다른 변위 용기들이 시료액에 의해 오염되지 않는다는 장점을 갖는다. 또한, 다양한 액체들을 위한 복수의 유입 채널들이 제공될 수도 있다.
특히 바람직하게는, 본원의 장치의 하나 또는 복수의 부재가 가열될 수 있다. 예컨대 펌프 및/또는 라인 시스템, 또는 그 부분들 및/또는 필터 및/또는 경우에 따라서는 액체들의 예비 저장 또는 유입을 위해 제공되는 용기가 가열될 수 있다. 이런 방식으로 개별적인 단계들은 온도 조절되면서 실시될 수 있다. 예컨대 용해 단계는, 용해 완충액이 예열되고 및/또는 필터 자체가 가열됨으로써, 상승된 온도에서 실시될 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 장치는 미세 유체 시스템으로서 형성된다. 미세 유체 구현예에서 본 발명에 따른 장치의 장점들과 관련해서는 앞에서 이미 언급한 장점들이 참조된다. 본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 따른 장치는 예컨대 특별한 장점으로 분자 진단학에서 및/또는 예컨대 랩-온-칩 시스템에서 구현될 수 있다.
본 발명의 추가 특징들 및 장점들은 도면들과 관련한 실시예들의 하기 설명에 제시된다. 이 경우, 개별 특징들은 각각 단독으로 또는 서로 조합되어 실현될 수 있다.
도 1은 원형 유체 가이드의 원리를 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한 장치의 예시적인 실시형태의 컴포넌트들을 도시한 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한 장치의 추가의 예시적인 실시형태를 도시한 개략도이다.
도 4는 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한 장치의 추가의 예시적인 실시형태를 도시한 개략도이다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한 장치의 추가의 예시적인 실시형태를 도시한 개략도이다.
도 6은 본 발명에 따른 장치의 구성부품으로서의 다층형 필터 챔버를 도시한 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 미세 유체 장치를 도시한 평면도이다.
도 8은 도 7의 미세 유체 장치의 다층형 구성을 도시한 측면도이다.
도 9는 도 7의 미세 유체 장치를 도시한 사시도이다.
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 미세 유체 장치의 예시적인 필터 챔버를 측면도(도 10) 및 평면도(도 11)로 각각 도시한 상세도이다.
도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 미세 유체 장치의 추가의 예시적인 필터 챔버를 측면도(도 12) 및 평면도(도 13)로 각각 도시한 상세도이다.
도 1의 개략도에는, 필터(10)를 경유하여 연장되는 원형 유체 경로(11)의 원리가 도시되어 있다. 유체 연결부들(11) 내의 액체는 펌프(12)에 의해 이동된다. 유체 연결부들(11)은 예컨대 호스들 또는 채널들로 형성될 수 있다. 펌프(12)는 액체 펌프, 예컨대 연동 펌프 또는 멤브레인 펌프이다. 본원의 장치의 미세 유체 구현예의 경우, 통합 가능한 통상적인 미세 유체 펌프들이 사용될 수 있다. 여기에 도시된 필터(10)는 필터 챔버의 형태로 실현된다. 하기에서 설명되는 필터는 많은 경우에서 필터 챔버와 동의어로 간주된다. 필터 챔버는 미세 유체 컴포넌트로서 형성될 수 있다. 필터(10)에서 유입 및 유출의 유형은 경우에 따라 정확하게 설정될 수 있다. 필터 챔버 자체는 예컨대 복수의 구조화된 폴리머층으로 이루어진 다층형 구성으로 실현될 수 있다. 이런 구조에 의해 특히 경제적인 제조가 가능하다. 펌프(12)가 호스들을 통해 필터 챔버(10)의 유입구 및 유출구와 연결된다면, 유체 경로 내로의 공급은 예컨대 호스 연결부의 개방 및 피펫팅에 의해 수행될 수 있다.
도 2에는, 본원의 방법의 실시를 위한 장치의 개략적 구성에 대한 바람직한 변형예가 도시되어 있다. 필터 또는 필터 챔버(20) 및 펌프(22) 및 유체 연결부들(21) 외에도, 상향 환기식 용기(24)가 유체 경로 내에 통합된다. 상기 용기(24)를 통해 액체들은 원형 유체 경로 내로 유입될 수 있다. 필요한 용액들 또는 완충액들은 예컨대 용기(24) 내로 피펫팅 될 수 있다. 그 결과, 바람직한 방식으로, 공정 동안 완충액 또는 기타 용액들이 유체 경로 내로 공급될 수 있다. 그 밖에도, 상기 구현예는, 유체 경로 내에 도달한 기포들이 용기(24) 내에서 상향으로 상승함으로써 시스템을 벗어날 수 있다는 장점을 제공한다. 구성의 각각의 구현예에 따라, 용기(24)의 체적은 상응하게, 예컨대 100㎕ 내지 10㎖로 선택될 수 있다. 용기(24)는 예컨대 튜브로서 또는 미세 유체 요소로서 실현될 수 있다. 바람직한 방식으로, 시스템의 유출 채널은 용기(24)의 하면 상에 위치한다. 이 경우, "하면"은, 중력과 관련하여 가장 낮은 위치에 위치하는 용기의 부분을 의미한다. 이는, 액체들이 용기로부터 완전히 제거될 수 있다는 장점을 갖는다. 이 경우, 바람직하게는, 용기(24)가 하부 방향으로 갈수록 가늘어지도록 형성된다.
도 3에는, 본원의 방법의 실시를 위한 장치의 추가 변형예가 도시되어 있다. 이 구현예는 특히 미세 유체 시스템으로서 적합하다. 일반적으로, 미세 유체 시스템은, 구성의 불용체적(dead volume)이 매우 작게 유지될 수 있고 거품 형성의 위험은 적다는 장점을 갖는다. 유체 연결부들(31) 내에서 원형 유체 가이드는 펌프(32)에 의해 활성화된다. 펌프의 상류에는 필터 챔버(30)가 위치한다. 또한, 개구부 또는 배기 채널(35)을 통해 배기될 수 있는 용기(34)가 제공된다. 개구부 또는 배기 채널(35)은 바람직한 방식으로 중력과 관련하여 상부에 위치하는 용기의 상단부 상에 위치한다. 그 결과, 시약들의 의도하지 않은 배출은 방지될 수 있다. 용기(34)의 상류에는 유입 채널(36)이 제공되며, 이 유입 채널(36)은 용기(34) 내로 직접 통해 있을 수 있다. 또한, 복수의 유입 채널(36)도 제공될 수 있다. 펌프의 하류에는 유출 채널(37)이 위치한다. 액체들의 유동은, 시스템 내 다양한 위치들에 배치되어 통합된 밸브들(38)에 의해 제어된다. 상기 밸브들은 예컨대 회전형 밸브들 또는 멤브레인 밸브들일 수 있다.
상기 장치의 사용 동안, 본 발명에 따른 방법은 하기와 같은 방식으로 실시될 수 있다. 시료, 다시 말해 생물 세포들을 포함한 액체는 유입 채널(36)을 경유하여, 또는 개구부(35)를 통과하는 유입(예: 피펫팅)을 통해 용기(34) 내로 유입된다. 용기(34)는 예컨대 미세 유체 캐비티로서 실현될 수 있다. 이 경우, 용기(34) 내에 포함된 공기는 개구부 또는 배기 채널(35)을 통해 방출되며, 그럼으로써 용기(34)는 배기된다. 그런 다음, 펌프(32)는 필터(30)를 경유하여 유출 채널(37)의 방향으로 시료를 펌핑한다. 이때 배기 채널(35)은 폐쇄될 수 있으며, 그럼으로써 펌프(32)는 유입 채널(36)을 통해 직접적으로 시료를 흡입할 수 있다. 시료 내에 함유된 세포들은 필터(30) 상에 포집 또는 축적된다. 그런 다음, 세포들은, 예컨대 적합한 용해 완충액으로 처리됨으로써 파쇄된다. 용해 완충액은 예컨대 유입 채널(36)을 경유하여 먼저 용기(34) 내로 유입된다. 그런 다음, 용해 완충액은 필터(30)를 경유하여 펌프(32)에 의해 회로 내의 원형 유체 경로(31)를 통해 펌핑된다. 그 대안으로, 세포 파쇄는 다른 방식으로도, 예컨대 초음파로도 수행될 수 있다. 이런 경우에, 필터(30)는 그에 상응하게 초음파로 조사된다. 그런 다음, 목표 분자들이 필터(30) 상에 흡착되는 결합 단계가 수행된다. 이를 위해, 적합한 결합 완충액이 용기(34) 내로 유입되어 회로(31)에서 펌핑된다. 후속 세척 단계를 위해, 먼저 세척 완충액이 용기(34) 내로 유입되며, 필터(30)를 경유하여 펌프(32)에 의해 유출 채널(37)의 방향으로 펌핑된다. 필터(30)의 건조가 제공된다면, 예컨대 공기 또는 질소가 유입 채널(36)로부터 필터(30)를 경유하여 유출 채널(37)의 방향으로 펌핑된다. 또한, 건조를 위해 펌프(32)를 사용할 수도 있다. 최종적으로, 용리 단계가 수행되며, 적합한 용리 완충액은 용기(34) 내로 유입되어 필터(30)를 경유하여 펌프(32)에 의해 유출 채널의 방향으로 펌핑된다.
일반적으로, 용기(34) 내로 시료 및 완충액의 유입은 예컨대 추가 펌프에 의해, 또는 수동으로 피펫팅 등에 의해 수행될 수 있다. 이를 위해, 재폐쇄 가능한 개구부가 용기(34) 내에 제공될 수 있다.
도 4에는, 시스템의 추가 변형예가 도시되어 있으며, 용기(34)에 추가해서, 하나 또는 복수의 추가 용기(44), 예컨대 예비 저장 용기들이 제공된다. 상기 용기들(44)은 개구부 또는 배기 채널(45)을 구비한다. 용기(44)의 내용물은 추가 밸브(48)를 통해 나머지 라인 시스템 내로 유입될 수 있다. 그 밖의 점에서 시스템은 도 3에 도시된 장치에 실질적으로 상응한다. 그러므로 상응하는 부재들에는 동일한 도면부호들이 부여된다. 용기(34)와 추가 용기(44)로부터의 공급 라인 사이에는 추가 밸브(49)가 제공된다. 용기 또는 용기들(44) 내에는 다양한 완충액들, 예컨대 용해 완충액, 온침 완충액, 변성 완충액, 결합 완충액, 세척 완충액 또는 용리 완충액이 예비 저장될 수 있다. 이 변형예는, 완충액이 더 이상 개별적으로 용기(34) 내로 유입되지 않아도 되기 때문에, 자동 실시가 간소화된다는 장점을 갖는다. 본원의 방법은, 특히 시료가 수동으로 용기(34) 내로 유입되고 그런 후에 필터(30)가 상기 시료를 공급받게 되도록 실행될 수 있다. 후속하는 공정 단계들에서 요구되는 다양한 완충액들은 자동화 방식으로 용기 또는 용기들(44)로부터 유입될 수 있다.
도 5에는, 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한, 예컨대 미세 유체 시스템 내에서 실현될 수 있는 장치에 대한 추가의 바람직한 예시가 도시되어 있다. 상기 시스템의 경우, 펌프(52)는 필터 챔버(50)의 상류에 배치된다. 이는, 액체들이 매우 높은 압력으로 필터(50)를 경유하여 펌핑될 수 있다는 장점을 갖는다. 이를 위해, 특히 바람직하게는 펌프(52)와 필터(50) 사이의 덕트 또는 호스가 비교적 짧다. 유입 채널(56)은 펌프(52)의 바로 상류에 연결되어 있다. 이는, 유입 채널(56)로부터 필터(50)를 경유하여 펌핑되는 액체들, 특히 세포 물질을 포함한 시료가 예비 저장 용기(54)를 통과하지 않음으로써 오염이 방지된다는 장점을 갖는다. 바람직하게, 시스템은 부분적으로 또는 섹션별로 가열될 수 있으며, 예컨대 필터(50) 및/또는 펌프(52) 및/또는 용기(54)가 가열될 수 있다. 가열은 바람직하게는 용해 단계 동안 수행될 수 있으며, 그럼으로써 세포 파쇄는 더 효율적으로 진행될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 용해 효소들에 대해 예컨대 섭씨 35℃ 내지 55℃의 온도 범위 내일 수 있는, 예컨대 45℃일 수 있는 최적의 온도가 설정될 수 있다. 용해 단계 동안 공정 제어는 바람직하게는 다른 전술한 실시예들과 유사하게 원형 유체 경로(51)를 통해 원형 형태로 수행된다. 변형예로서, 요구되는 시약들이 시스템 내로 펌핑될 수 있게 하는 추가 유입 채널들이 제공될 수 있다. 용기 또는 용기들(54)은 예컨대 2㎖의 체적을 가지며, 필터는 예컨대 2 내지 10㎜의 지름을 갖는다.
유체 흐름의 제어는 밸브들(58)에 의해 수행된다. 액체들은 유출 채널(57)을 경유하여 시스템을 벗어날 수 있다.
본 발명에 따른 미세 유체 시스템 내에서 세포들의 축적 및 용해와 DNA 세척을 위한 실험 실시는 예컨대 하기와 같은 방식으로 실시될 수 있다. 1㎖의 생리 식염수 내에 105의 포도상구균을 함유한 용액이 유입 채널(56)을 경유한 펌핑에 의해 또는 피펫팅에 의해 시스템 내 용기(54) 내로 유입되며, 그리고 펌프(52)에 의해 필터(50)를 경유하여 펌핑된다. 용해를 위해, 100㎕의 용해 완충액이 용기(54) 내로 피펫팅 되며, 그리고 45℃로 온도 조절과 동시에 펌프(52)에 의해 10분 동안 필터(50) 및 회로 내 채널 시스템(51)을 경유하여 펌핑된다. 그런 다음, 연속해서 온침 완충액 및 결합 완충액이 용기(54) 내로 피펫팅 되어 마찬가지로 순환된다. 이는, 시약들의 매우 양호한 혼합이 수행되고 핵산들은 필터(50) 상에 효과적으로 결합된다는 장점을 갖는다. 그런 다음, 필터(50)는, 세척 완충액이 용기 내로 피펫팅 되어 필터(50)를 경유하여 유출 채널(57) 내로 펌핑됨으로써 세척된다. 결합된 DNA는, 물이 용기(54) 내로 피펫팅 되어 필터(50)를 경유하여 유출 채널(57) 내로 펌핑됨으로써, 물로 용리된다. 용리액은 포집된다. 이와 병행하여, 기준액이 하기와 같이 처리된다. 1㎖의 생리적 식염수 내에 105의 포도상구균을 함유한 용액이 13000g에서 원심 분리에 의해 축적되고 상청액(supernatant)은 피펫팅에 의해 배출된다. 그리고 100㎕의 용해 완충액이 피펫팅에 의해 첨가되어 혼합되고 45℃에서 10분 동안 배양된다. 발생한 용해물은 연속적으로 온침 완충액 및 결합 완충액과 혼합되어 통상의 칼럼(column) 상에 제공된다. 그런 다음, 칼럼은 세척 완충액으로 세척되며, DNA가 100㎕의 물로 용리된다. 시료들의 분석은 정량적인 PCR에 의해 수행된다. 실험 결과들에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 의해, 기준액의 경우에서와 유사한 결과들이 달성될 수 있으며, 본 발명에 따른 방법의 경우, 간단한 자동화의 가능성에 의해 상당한 노동력 절감이 달성될 수 있다.
도 6에는, 다층 구성을 기반으로 하는 예시적인 미세 유체 필터 챔버(60)를 절단한 단면도가 도시되어 있다. 2개의 구조화된 폴리머 플레이트(61), 이들 사이에 위치하는 폴리머 멤브레인(62) 및 바깥쪽에 놓인 커버 필름들(63)이 다층 구성을 형성한다. 필터(64)는 폴리머 플레이트들(61) 중 하나의 폴리머 플레이트의 함몰부 내에 삽입된다. 액체 공급 및 액체 배출은 유입 채널(65) 및 유출 채널(66)을 통해 수행된다. 필터(64)의 상류에 연결된 멤브레인(62)은 추가의 기능들, 예컨대 밸브 기능을 수행할 수 있다. 이런 구성은 특히 미세 유체 구현예들에 적합하다.
도 7 내지 도 9에는, 본 발명에 따른 방법의 실시를 위한 미세 유체 시스템(70)의 예시적인 실시예가 각각 도시되어 있다. 도 7에는, 앞에서 바라본 평면도가 도시되어 있고, 도 8에는 측면도가 도시되어 있으며, 도 9에는 앞에서 바라본 사시도가 도시되어 있다. 미세 유체 시스템은 2개의 구조화된 폴리머 플레이트(750 및 760)(도 8)와, 우측 및 좌측에 배치된 커버 필름들, 또는 구조들을 덮기 위한 다른 폴리머층들(미도시)로 이루어진 다층 구성으로서 실현된다. 시스템은, 펌프(702)와, 환기 개구부(724)를 구비한 용기(704)와, 필터 유닛(710)과, 복수의 밸브(708, 718, 728)를 포함한다. 유체 가이드는 화살표 방향(도 7, 도 9)으로 수행되며, 흐름 방향은 역전될 수도 있다. 필터 유닛(710)은 폴리머 플레이트(750) 내의 함몰부(713)(필터 챔버), 필터의 기계적 지지를 위한 프릿(711), 및 실질적인 필터(712)에 의해 형성된다(도 8). 시스템의 외면 상에서는 채널들(701)이 연장되며, 이 채널들은 커버 필름들 또는 추가 폴리머층들(미도시)에 의해 덮인다. 밸브들(708, 718, 728)은 미세 유체 멤브레인 밸브들로서 실현된다. 펌프(702)는, 하나의 펌프 챔버와 하나의 유입 밸브(708)와 2개의 유출 밸브(718, 728)를 구비한 미세 유체 멤브레인 펌프로서 실현되며, 필터 유닛(710)의 하류에 위치한다. 유출 밸브들(718, 728)은 T자형 교차부를 형성하며, 회로(701)(밸브 728)와 유출 채널(707)(밸브 718) 간의 유체 경로의 전환을 허용한다. 폴리머 플레이트들(750 및 760) 사이에는, 밸브들 및 펌프의 공압식 작동을 위해 사용되는 미도시한 폴리머 멤브레인이 위치한다. 용기(704)는, 최소의 액체량도 용기의 최하위 위치에서 포집되어 이 최하위 위치로부터 채널 시스템(701) 내로 유입될 수 있도록 형성된다. 이를 위해, 용기(704)는 하부 방향으로 갈수록 가늘어지는 테이퍼부를 포함한다.
도시된 시스템(700)은 상대적으로 더 대형인 미세 유체 시스템에서 추가 기능들, 예컨대 추가 펌프들 및 혼합 챔버들, 시약들의 예비 저장을 위한 챔버들, 생물학적 분자들의 추가 처리를 위한, 예컨대 PCR를 이용하여 예컨대 수득된 핵산들의 증폭을 위한 챔버들, 및 생물학적 분자들, 예컨대 핵산들의 검출을 위한 컴포넌트들을 포함하는 부분일 수 있다.
미세 유체 장치(700)의 사용 동안, 본 발명에 따른 방법은 하기와 같이 실시될 수 있다. 먼저, 시료가 환기식 용기(704) 내로, 예컨대 피펫팅 및 펌핑에 의해 유입되고, 그런 다음 하부로부터 필터 유닛(710)을 경유하여 유출 채널(707) 내로 펌핑된다. 그런 다음, 용해 완충액이 환기식 용기(704) 내로 유입되고 용해 동안 펌프(702)에 의해 필터 유닛(710)을 경유하여 순환된다. 대안으로서, 용해 완충액은, 필터 챔버(713)를 액체로 확실하게 충전하기 위해, 단지 잠깐 동안만 순환될 수 있으며, 그런 다음 예컨대 열 또는 초음파가 필터(712) 상에 인가된다. 그런 다음, 결합 완충액이 환기식 용기(704) 내로 제공되고 필터 유닛(710)을 경유하여 펌프(702)에 의해 순환된다. 이 경우, 용해물과 결합 완충액의 혼합이 이루어지고 핵산들은 (정화할 분자들에 대한 예로서) 필터(712) 상에 결합된다. 이어서 혼합물은 유출 채널(707) 내로 펌핑된다. 그런 다음, 세척 완충액이 환기식 용기(704) 내로 유입되어 필터 유닛(710)을 경유하여 유출 채널(707) 내로 펌핑된다. 끝으로 용리 완충액이 환기식 용기(704) 내로 유입되어 필터 유닛(710)을 경유하여 유출 채널(707) 내로 펌핑된다. 대안으로서, 용리 완충액은 유출 채널(707)을 통해 흡입되어 반대 방향으로 필터 유닛(710)을 경유하여 환기식 용기(704) 내로 펌핑될 수 있다.
상기 방법의 한 변형예에서, 먼저 시료 내에 존재하는 인간 세포들이 선택적으로 용해될 수 있다. 본원의 방법의 추가 변형예에서, 용해 후에 단백질들의 온침이 실행될 수 있다. 본원의 방법의 추가 변형예에서, DNA를 결합하기 전에, 변성 단계가 실시될 수 있다. 본원의 방법의 추가 변형예에서, 필터는 용리 전에 건조될 수 있다. 본원의 방법의 추가 변형예에서, 펌핑 방향은 중간에 잠깐 동안, 예컨대 5 내지 60s 동안 역전될 수 있다.
도 10 및 도 11에는, 미세 유체 장치들을 위한 필터 챔버(813)의 예시적인 실시형태가 각각 측면도 및 평면도로 도시되어 있다. 도 10에는, 2개의 폴리머 플레이트(850 및 860)로 이루어진 다층형 구성이 나타난다. 폴리머 플레이트(850) 내의 원형 함몰부(814)는 블라인드 홀로서 필터 멤브레인 또는 필터 재료 베드 및 경우에 따라 프릿을 삽입하도록 제공된다. 삽입할 필터의 바로 상부에는 원형 확장부(815)가 제공된다. 다른 폴리머 플레이트(860) 내에는 원형 관통구(816)가 제공되며, 이 관통구는 조립된 상태에서 커버 멤브레인(미도시)에 의해 덮인다. 채널(817)을 통해 액체들의 공급 또는 배출이 수행될 수 있다. 원형 관통구(816)는 예컨대 5 내지 50㎜의 지름을 가질 수 있으며, 필터에 대해 대략 동심으로 배치될 수 있지만, (특히 중력 방향과 관련하여 상향으로) 예컨대 필터와 원형 영역의 반경들의 차만큼 변위될 수 있다. 관통구(816) 및 확장부(815)를 통해서는, 소노트로드(sonotrode)에 의해 초음파가 필터 챔버(813)의 내부 안쪽으로 유입될 수 있으며, 그럼으로써 초음파 용해가 실시될 수 있게 된다. 이 변형예는, 특히 효율적인 초음파 용해가 가능하다는 장점을 갖는다. 대안으로서, 초음파의 유입을 위해 제공되는 영역은 유사한 치수들을 가지면서 타원형이거나, 정방형이거나, 또는 길쭉할 수 있다. 또한, 이 변형예는, 필터 챔버(813)의 확장부(815)가 동시에 기능을 충족할 수 있고, 확장부 내에서 기포들이 상부 방향으로 상승하고 그에 따라 액체 회로로부터 제거되며, 그리고 처리 동안 커지는 액체 체적이 수용되고 그에 따라 경우에 따라 시스템의 다른 용기를 대체할 수 있다는 장점을 갖는다. 이를 목적으로, 추가 배기 채널(819)이 제공될 수 있다. 이 경우, 확장부가 예컨대 500㎕ 내지 5㎖의 체적을 갖는 것이 바람직하다. 이를 위해, 추가 확장부(818)가 제공될 수 있다. 여기서 필터로서는 예컨대 실리카 멤브레인이 사용될 수 있으며, 미세입자들의 베드들도 사용될 수 있다. 한 변형예에서, 필터 또는 미세입자들의 베드는 확장부(815) 및 관통구(816) 안쪽으로 연장되며, 그럼으로써 상기 측에서 커버 멤브레인과 접촉한다. 이는, 커버 멤브레인 내로 초음파의 주입 시 필터 또는 미세입자들의 베드가 특히 효율적으로 진동됨으로써 상대적으로 더 높은 수율로 축적된 세포들의 용해가 일어날 수 있다는 장점을 갖는다.
도 12 및 도 13에는, 필터 챔버(813)와 유사하게, 필터 또는 필터 재료 베드 및 경우에 따른 프릿의 수용을 위한 폴리머 플레이트(950) 내에 블라인드 홀 형태의 함몰부(914)를 포함하는 필터 챔버(913)에 대한 추가 실시형태가 각각 도시되어 있다. 채널(919)을 통해 액체 공급 또는 배출이 수행될 수 있다. 폴리머 플레이트(950) 내에는 블라인드 홀(914)의 부분 원형의 확장부(915)가 제공된다. 다른 폴리머 플레이트(960)는 상기 영역들에 관통구(916)를 포함하고, 이 관통구는 조립된 상태에서 블라인드 홀(914)과 확장부(915) 사이의 연결부를 형성하며 커버 멤브레인(미도시)에 의해 덮인다. 확장부(915) 및 관통구(916)는 실시형태(813)와 유사하게 마찬가지로 초음파의 주입을 위해 적합하다.
10: 필터, 필터 챔버
11: 원형 유체 경로, 회로
12: 펌프
20: 필터, 필터 챔버
21: 유체 연결부, 회로
22: 펌프
24: 환기식 용기
30: 필터
31: 유체 연결부, 회로,
32: 펌프
34: 용기
35: 배기 채널, 개구부
36: 유입 채널
37: 유출 채널
44: 용기
50: 필터, 필터 챔버
51: 원형 유체 경로, 회로
52: 펌프
54: 예비 저장 용기
56: 유입 채널
57: 유출 채널
60: 미세 유체 필터 챔버
61: 폴리머 플레이트
62: 폴리머 멤브레인
63: 커버 필름
64: 필터
65: 유입 채널
66: 유출 채널
700: 미세 유체 시스템
701: 채널, 회로
702: 펌프
704: 용기
708: 밸브, 유입 밸브
710: 필터 유닛
711: 프릿(frit)
713: 함몰부, 필터 챔버
718: 밸브, 유출 밸브
724: 환기 개구부
728: 밸브, 유출 밸브
750, 760: 폴리머 플레이트
813: 필터 챔버
814: 함몰부
815: 확장부
816: 원형 관통구
818: 추가 확장부
819: 배기 채널
850, 860: 폴리머 플레이트
913: 필터 챔버
914: 함몰부, 블라인드 홀
915: 확장부
916: 관통구
950, 960: 폴리머 플레이트

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 사용해서 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들을 정화하기 위한 방법에 있어서,
    공정 제어를 위해 요구되는 액체들 중 적어도 일부는 회로(11; 21; 31; 51; 701) 내에서 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 경유하여 펌핑되며, 적어도
    - 생물 세포를 포함하는 액체가 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 경유하여 펌핑되는 단계,
    - 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710) 상에 잔류되는 세포들이 파쇄되는 단계,
    - 상기 필터 상에 생물학적 분자의 결합을 위한 결합 완충액이 상기 회로(11; 21; 31; 51; 701) 내에서 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 경유하여 펌핑되는 단계,
    - 상기 필터 상에 결합된 생물학적 분자들의 세척을 위한 세척 완충액이 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 경유하여 펌핑되는 단계가
    실시되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포들의 파쇄를 위해, 용해 완충액이 상기 회로(11; 21; 31; 51; 701) 내에서 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)를 경유하여 펌핑되거나, 또는 상기 세포들이 기계적으로, 특히 초음파 처리에 의해 파쇄되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 결합 완충액을 이용한 처리 전에 변성 단계가 실시되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 완충액을 이용한 처리 전에 추가의 온침 단계가 실시되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충액을 이용한 처리 후에 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)는 건조되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터를 경유하여 생물 세포들을 포함한 액체를 펌핑하기 전에 상기 액체의 전처리가 수행되며, 바람직하게는 상기 액체 내에 존재하는 인간 세포들이 선택적으로 용해되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계들 중 적어도 일부 단계, 특히 세포 파쇄 및/또는 경우에 따라 실행되는 온침 단계 및/또는 경우에 따라 제공되는 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)의 건조는 열 공급 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계들 중 하나 또는 다수의 단계에서 펌핑 방향은 1회 또는 수회 역전되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 미세 유체 장치(700) 내에서 실시되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 방법.
  10. 액체들을 펌핑하기 위한 적어도 하나의 펌프(12; 22; 32; 52; 702)와, 적어도 하나의 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710)의 고정을 위한 적어도 하나의 유닛을 포함하는, 생물학적 분자들, 특히 핵산들 또는 단백질들의 정화를 실시하기 위한 장치에 있어서,
    상기 장치는 필터를 경유하여 액체들을 원형으로 펌핑하기 위한 라인 시스템(11; 21; 31; 51; 701)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 장치.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 필터(64; 712)의 고정을 위한 유닛은, 바람직하게는 다층형 구성을 갖는 필터 챔버(60; 713; 813; 913)이며, 상기 필터 챔버(60; 713; 813; 913)는 특히 필터 멤브레인(64) 또는 또 다른 필터 재료, 특히 입자 베드를 삽입하도록 설계되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 필터 챔버(813; 913)는 초음파의 주입을 위한 확장부(815; 915)를 포함하며, 바람직하게는 상기 확장부는 커버 멤브레인으로 폐쇄되는 관통구(816; 916)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 장치.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 시스템 내로 액체들을 유입하기 위한 적어도 하나의 환기식 용기(24; 34; 44; 704)를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 장치.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터(10; 20; 30; 50; 64; 710) 및/또는 상기 펌프(12; 22; 32; 52; 702) 및/또는 경우에 따라 제공되는 상기 용기(24; 34; 44; 704) 및/또는 상기 라인 시스템(11; 21; 31; 51; 701)은 가열될 수 있는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 장치.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 미세 유체 시스템(700)으로서 형성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 분자들의 정화 실행 장치.
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