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KR20160125965A - 신규 인간 tlr2 및 인간 tlr4에 결합하는 이중 특이적 항체 - Google Patents

신규 인간 tlr2 및 인간 tlr4에 결합하는 이중 특이적 항체 Download PDF

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KR20160125965A
KR20160125965A KR1020167022970A KR20167022970A KR20160125965A KR 20160125965 A KR20160125965 A KR 20160125965A KR 1020167022970 A KR1020167022970 A KR 1020167022970A KR 20167022970 A KR20167022970 A KR 20167022970A KR 20160125965 A KR20160125965 A KR 20160125965A
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KR
South Korea
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amino acid
antibody
human
seq
acid sequence
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KR1020167022970A
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사토시 다케우치
마사히토 사토
조타로우 스즈키
신지 소가
준 다카사키
고지 아요야마
치에 오쿠야마
Original Assignee
아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

(과제) 인간 TLR2 및 인간 TLR4의 양쪽에 작용하여, 인간 TLR2 및 인간 TLR4를 통한 면역 염증 작용을 저해함으로써 면역 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 이중 특이적 항체를 제공하는 것에 있다.
(해결 수단) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 대한 이중 특이적 항체를 제공한다.

Description

신규 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체{NOVEL BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO HUMAN TLR2 AND HUMAN TLR4}
본 발명은, 신규인 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에 관한 것이다.
Toll양 수용체 2(Toll-Like Receptor 2; TLR2) 및 Toll양 수용체 4(Toll-Like Receptor 4; TLR4)는, 매크로파지 및 호중구 등의 면역 담당 세포, 혈관 내피 세포, 뇨세관 상피 세포 등의 신 고유 세포를 포함하는 광범위한 세포 및 조직에 발현되는 1회 막관통형의 단백질이다(Folia Biol(Praha)., 2005, Vol.51, No.6, p.188-197). TLR2는 TLR1 또는 TLR6과 복합체를 형성하고, 펩티드글리칸이나 리포 단백질 등의 세균 성분과 반응한다. 한편, TLR4는, 미엘로이드계 분화 인자 2(MD2) 단백질이나 CD14 단백질 등과 복합체를 형성하고, 리포폴리사카라이드(LPS)를 대표로 하는 리포 다당 등의 세균 성분과 반응한다. 또한, 이들 수용체는 내재성의 조직 상해 인자인 데미지 관련 분자 패턴(DAMPs)에 결합함으로써 활성화되고, 세포 내에 시그널을 전달한다. TLR2 및 TLR4의 활성화는, 예컨대 전사 인자인 핵 내 인자 κB(NF-κB)의 활성화를 통해, 종양 괴사 인자 α(TNFα)나 인터류킨 6(IL-6) 등의 염증성의 시토킨의 발현을 유도하고, 염증 응답을 야기한다(Nat. Immunol., 2010, Vol.11, No.5, p.373-384).
이러한 TLR2 및 TLR4를 통한 각종 세포의 활성화는, 면역 염증성 질환, 예컨대, 패혈증, 급성 신장해, 만성 신장병, 급성 호흡 촉박 증후군, 강피증, 급성 췌염, 만성 폐색성 폐질환 등의 질환에 관여하는 것이 알려져 있다.
패혈증과의 관련으로는, 패혈증 모델인 살모넬라균 감염 모델에 있어서 TLR2의 유전적 결손 동물(녹아웃 마우스)이 생존율 개선을 나타내고, 대장균 감염 모델에 있어서 TLR4 녹아웃 마우스가 생존율 개선을 나타내고, 또한, 각 모델에 있어서 TLR2 및 TLR4의 더블 녹아웃 마우스가 TLR2 또는 TLR4의 단독 녹아웃 마우스와 비교하여 생존율이 대폭 개선되는 것이 보고되어 있다(J. Exp. Med., 2008, Vol.205, p.1747-1754). 또한, 상기 2개의 모델에 있어서 항TLR2 항체(T2.5) 또는 항TLR4 항체(1A6)의 단독 투여에서는 생존율은 개선되지 않는 반면, 양항체의 병용 투여에 의해 생존율이 개선되는 것이 보고되어 있다(J. Exp. Med., 2008, Vol.205, p.1747-1754).
급성 췌염과의 관련으로는, 타우로콜산 유발 췌염 모델에 있어서 TLR4의 녹아웃 마우스가 혈중 아밀라아제, 췌장 미엘로퍼옥시다아제, 및 췌장 조직 상해를 저하하는 것이 보고되어 있다(Inflamm. Res., 2011, Vol.60, p.1093-1098). 또한, 세룰레인 유발 췌염 모델에서는, 췌장에 있어서, TLR2 및 TLR4의 발현량 상승이 보고되어 있다(Pancreas, 2013, Vol.42, p.114-122).
인간 TLR2에 결합하는 항체로는, 마우스 모노클로날 항체 T2.5(특허문헌 1), 마우스 모노클로날 항체 11G7(특허문헌 2), 및 T2.5의 인간화 모노클로날 항체 OPN305(특허문헌 3)가 보고되어 있다. 이들 중, 11G7은 TLR2/TLR1 시그널은 저해하지만, TLR2/TLR6 시그널은 저해하지 않는 반면, OPN305는 양시그널 모두 저해하는 것이 보고되어 있다. 구체적으로는, OPN305는 인간 단구계 세포 THP-1 세포를 이용한 실험에 있어서, Pam3CSK4(TLR2/TLR1 아고니스트) 자극 및 FSL-1(TLR2/TLR6 아고니스트) 자극의 양쪽에 대하여 중화 활성을 갖고, 또한 Pam3CSK4 투여에 의해 유발되는 마우스 혈중 염증성 시토킨 농도 상승을 억제하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 3).
인간 TLR4에 결합하는 항체로는, 마우스 모노클로날 항체 HTA125(비특허문헌 1), 마우스 모노클로날 항체 18H10, 16G7, 15C1 및 7E3(특허문헌 4), 15C1의 인간화 모노클로날 항체 hu15C1(특허문헌 5), 및, hu15C1의 상보성 결정 영역으로의 랜덤 변이에 의해 발견된 인간화 모노클로날 항체 1A6 및 1E11.C2E3 등(특허문헌 6)이 보고되어 있다. 이들 중, 마우스 모노클로날 항체에 관해서는, 15C1이 인간 혈액을 이용한 실험 결과로부터 중화 활성이 가장 높은 것이 개시되어 있고(특허문헌 4), 15C1의 인간화 모노클로날 항체 hu15C1이 동일한 인간 혈액을 이용한 실험에 의해 중화 활성을 갖는 것이 확인되어 있다(특허문헌 5). 또한 인간화 모노클로날 항체 1E11.C2E3은 hu15C1보다 인간 혈액을 이용한 실험에 있어서 우수한 중화 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(특허문헌 6).
또한, 인간 혈액을 이용한 가열 처리의 대장균, 슈도모나스(Pseudomonas) 및 클렙시엘라(Klebsiella) 자극에 대한 IL-6 산생 평가계에 있어서, 항인간 TLR2 항체(T2.5)는 IL-6 산생을 약하게 저해하고, 항인간 TLR4 항체(15C1)는 IL-6 산생을 약 50％ 저해하는 정도인 반면, 양항체의 병용 첨가에 의해 IL-6 산생이 거의 완전히 저해되는 것이 보고되어 있다(특허문헌 7).
그러나, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체는 지금까지 보고되어 있지 않다.
특허문헌 1: 국제 공개 제2005/028509호 특허문헌 2: 국제 공개 제2005/019431호 특허문헌 3: 국제 공개 제2011/003925호 특허문헌 4: 국제 공개 제2005/065015호 특허문헌 5: 국제 공개 제2007/110678호 특허문헌 6: 국제 공개 제2013/149111호 특허문헌 7: 국제 공개 제2006/077471호
비특허문헌 1: 「The Journal of Experimental Medicine」, (미국), 1999, Vol.189, No.11, p.1777-1782
본 발명의 과제는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4의 양쪽에 결합하여, 인간 TLR2 및 인간 TLR4를 통한 면역 염증 작용을 저해함으로써 면역 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 이중 특이적 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, 1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역; 및 2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 제작하고(실시예 1∼8), 상기 이중 특이적 항체가, TLR2 및 TLR4에 반응하는 임상 분리주 유래의 녹농균 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO-1의 가열 처리 사균체(이후 사균이라고 함)에 의해 유도되는 염증성 시토킨인 TNFα 산생을 저해하는 것(실시예 10)을 발견했다. 이러한 결과, 상기 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 제공하고, 본 발명을 완성했다. 또한, 임상 분리주 유래의 대장균 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 21006의 사균에 의해 유도되는 TNFα 산생도 상기 이중 특이적 항체가 저해하는 것(실시예 11)을 발견했다.
즉, 본 발명은, 의학상 또는 산업상 유용한 물질 또는 방법으로서 이하의 발명을 포함하는 것이다.
[1] 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
(1) 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체로서,
1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 및
2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역,
을 포함하는, 이중 특이적 항체; 또는
(2) (1)의 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체인, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
[2] 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, [1]에 기재된 이중 특이적 항체.
(1) 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하는 이중 특이적 항체로서,
상기 항인간 TLR2 항체는 IgG 항체이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트는 단일쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv)이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중 특이적 항체; 또는
(2) (1)의 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체인, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
[3] [2]에 기재된 이중 특이적 항체로서, 상기 이중 특이적 항체는, 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하고,
상기 항인간 TLR2 항체는 IgG 항체이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트는 scFv이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는,
이중 특이적 항체.
[4] 번역 후 수식이, 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역 아미노 말단(N 말단)의 피로글루타밀화, 항인간 TLR2 항체의 중쇄 카르복시 말단(C 말단)의 리신 결실, 및/또는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인, [2]에 기재된 이중 특이적 항체.
[5] 항인간 TLR2 항체가 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는, [2]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[6] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A의 아미노산 변이 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [5]에 기재된 이중 특이적 항체.
[7] 항인간 TLR2 항체가 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [2]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[8] 항인간 TLR2 항체가 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역 및 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [2]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[9] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A의 아미노산 변이 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [8]에 기재된 이중 특이적 항체.
[10] 항인간 TLR2 항체가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [2] 또는 [3]에 기재된 이중 특이적 항체.
[11] 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 중쇄 가변 영역의 C 말단에 경쇄 가변 영역의 N 말단이 링커를 통해 연결된 구조를 갖는 scFv인, [2]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[12] 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인, [2]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[13] 항인간 TLR2 항체가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인, [2] 또는 [3]에 기재된 이중 특이적 항체.
[14] 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는, [2]∼[13] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[15] 항인간 TLR2 항체의 중쇄와 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 연결하는 링커가 GS 링커로 이루어지는, [14]에 기재된 이중 특이적 항체.
[16] GS 링커가 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는, [15]에 기재된 이중 특이적 항체.
[17] 항인간 TLR2 항체가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv이고, 상기 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는, [2] 또는 [3]에 기재된 이중 특이적 항체.
[18] 항인간 TLR2 항체의 중쇄와 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 연결하는 링커가 GS 링커로 이루어지는, [17]에 기재된 이중 특이적 항체.
[19] GS 링커가 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는, [18]에 기재된 이중 특이적 항체.
[20] [17]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체.
[21] [1]에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및/또는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[22] [17]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[23] 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 상기 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는, [22]에 기재된 폴리뉴클레오티드.
[24] [17]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[25] [21]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[26] [22], [23], 및/또는 [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[27] 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [25]에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(d) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
[28] 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [26]에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(a) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드와 [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[29] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포, 및, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
[30] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법.
(a) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드와 [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [22] 또는 [23]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, [24]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[31] [29]에 기재된 방법으로 생산된 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
[32] [30]에 기재된 방법으로 생산된 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
[33] [1]∼[20], [31] 및 [32] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물.
[34] 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [33]에 기재된 의약 조성물.
[35] 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인, [34]에 기재된 의약 조성물.
[36] [1]∼[20], [31] 및 [32] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 면역 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
[37] 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인, [36]에 기재된 예방 또는 치료하는 방법.
[38] 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [1]∼[20], [31] 및 [32] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체.
[39] 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인, [38]에 기재된 이중 특이적 항체.
[40] 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의 [1]∼[20], [31] 및 [32] 중 어느 하나에 기재된 이중 특이적 항체의 용도.
[41] 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인, [40]에 기재된 이중 특이적 항체의 용도.
[42] 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
(1) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트; 또는
(2) (1)의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[43] 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, [42]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[44] 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트인, [42]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[45] 번역 후 수식이 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단의 리신 결실인, [42] 또는 [44]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[46] 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는, [42]∼[45] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[47] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A의 아미노산 변이 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [46]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[48] 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [42]∼[45] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[49] 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역 및 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는, [42]∼[44] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[50] 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A, 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인, [49]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[51] 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [42] 또는 [43]에 기재된 항인간 TLR2 항체.
[52] 단일쇄 가변 영역 프래그먼트, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, [42]∼[50] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 프래그먼트.
[53] [51]에 기재된 항인간 TLR2 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인, 항인간 TLR2 항체.
[54] 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단의 리신 결실인, [53]에 기재된 항인간 TLR2 항체.
[55] 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 449까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [42] 또는 [44]에 기재된 항인간 TLR2 항체.
[56] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 생산하는 방법.
(a) [43]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [43]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [43]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[57] 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 항인간 TLR2 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 TLR2 항체를 생산하는 방법.
(a) [51]에 기재된 항인간 TLR2 항체의 중쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [51]에 기재된 항인간 TLR2 항체의 중쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [51]에 기재된 항인간 TLR2 항체의 중쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 상기 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[58] [56]에 기재된 방법으로 생산된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[59] [57]에 기재된 방법으로 생산된 항인간 TLR2 항체.
[60] [42]∼[55], [58], 및 [59] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물.
[61] [43]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, [44]에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[62] [51]에 기재된 항인간 TLR2 항체, [55]에 기재된 항인간 TLR2 항체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[63] 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [60]∼[62] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[64] [42]∼[55], [58], 및 [59] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[65] 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [42]∼[55], [58], 및 [59] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트.
[66] 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의 [42]∼[55], [58], 및 [59] 중 어느 하나에 기재된 항인간 TLR2 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 용도.
상기 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체 및 항인간 TLR2 항체 및 그 항원 결합 프래그먼트에는, 다른 펩티드 및 단백질과의 융합 항체나, 수식제를 결합시킨 수식 항체도 포함된다.
본 발명의 이중 특이적 항체는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4의 기능 저해에 의해, 강력한 항면역 염증 작용을 갖는 것으로, 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
도 1은, IgG 항체인 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 scFv의 N 말단이 링커를 통해 연결된, 본 발명의 이중 특이적 항체의 구조의 일례를 나타낸다.
도 2는, THP1-xBlue 세포에의 Pam2CSK4(TLR2/6 아고니스트) 유발 알칼리포스파타아제(AP) 산생에 대한, 각 항인간 TLR2 항체의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은, 정상 인간 말초혈 단핵구에의 대장균 사균 유발 TNFα 산생에 대한, 각 이중 특이적 항체의 억제 효과를 나타낸다.
이하에, 본 발명에 관해서 상술한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만∼7만의 중쇄와 2만∼3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε라고 불린다. 또한 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, L 형과 K 형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만∼19만이다. 2종의 경쇄는, 어떤 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 되어 있다.
쇄 내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개가 있고, 아미노산 100∼110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프 간에 유사하여, 구조 단위 혹은 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이더라도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리고 있으며, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 가변 영역으로부터 C 말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 혹은 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있다(각 도메인은, 각각, CH1, CH2, CH3 혹은 CL로 표시된다).
항체의 항원 결정 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 의하고 있다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합이라는 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느쪽의 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것이 알려져 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 중쇄, 경쇄 각각 N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부른다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리며, 비교적 일정하다.
항체의 VH 및 VL을 포함하는 각종 항체 프래그먼트도 항원 결합 활성을 갖고, 이러한 대표적인 항체 프래그먼트로서, 단일쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab, Fab', F(ab')2를 들 수 있다. Fab는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab'는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이고, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄 사이 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab')2 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄 사이 S-S 결합으로 결합한 2가의 항체 프래그먼트이다. scFv는, 링커(예컨대, 펩티드 링커)로 연결된 VH와 VL로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다.
이중 특이적 항체는, 2개의 상이한 항원을 인식하고, 각각의 항원에 결합하는 2개의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다. 이중 특이적 항체에는 여러가지 포맷(구조)이 보고되어 있다(Expert Rev. Clin. Pharmacol., 2010, Vol.3, No.4, p.491-508). 예컨대, 한쪽의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 N 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 C 말단이 각각 연결된, 4가의 이중 특이적 항체, 각 항체의 중쇄 및 경쇄를 knobs-into-holes 기술에 의해 CH3을 통해 접합한, 2가의 이중 특이적 항체, 및, 한쪽의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 scFv의 C 말단이 연결된, 혹은, 한쪽의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 scFv의 N 말단이 연결된, 4가의 이중 특이적 항체(Nature Biotech., 1997, Vol.15, p.159-163) 등이 보고되어 있다.
<본 발명의 이중 특이적 항체>
본 명세서 중에서 「인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체」란, 인간 TLR2에 대한 결합 활성 및 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 갖는 이중 특이적 항체를 의미하며, 구체적으로는, 본 발명의 이중 특이적 항체에는, 이하의 특징을 갖는 이중 특이적 항체가 포함된다:
인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체로서,
1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역; 및
2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 이중 특이적 항체.
본 명세서 중에서 「항인간 TLR2 항체」란, 인간 TLR2에 결합하는 항체를 의미하며, 「항인간 TLR4 항체」란, 인간 TLR4에 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 이중 특이적 항체는, 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체의 각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 가지면 되고, 예컨대, 항인간 TLR2 항체 또는 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 갖는 항인간 TLR2 항체 프래그먼트와, 항인간 TLR4 항체 또는 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 갖는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하는, 임의의 이중 특이적 항체의 구조를 가질 수 있다. 이러한 구조로는, 예컨대, 한쪽의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 N 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 C 말단이 각각 연결된 이중 특이적 항체(DVD-Ig), 각 항체의 중쇄 및 경쇄를 knobs-into-holes 기술에 의해 CH3을 통해 접합한 이중 특이적 항체, 및 한쪽의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 scFv의 C 말단이 연결된, 혹은, 한쪽의 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에 링커를 통해 다른 한쪽의 항체의 scFv의 N 말단이 연결된 4가의 이중 특이적 항체 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 항체는, 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하고, 상기 항인간 TLR2 항체가 IgG 항체이며, 또한, 상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가 scFv인, 4가의 이중 특이적 항체이다. 이하, 상기 구조의 4가의 이중 특이적 항체를, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)라고도 칭한다.
본 발명의 이중 특이적 항체가 IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 경우, 항인간 TLR2 항체의 정상 영역으로는, 어떠한 서브클래스의 정상 영역(예컨대, 중쇄로서 Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4, 경쇄로서 Igλ 또는 Igκ의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있지만, 중쇄 정상 영역으로는, 인간 Igγ1 정상 영역이 바람직하고, 경쇄 정상 영역으로는, 인간 Igκ 정상 영역이 바람직하다.
항인간 TLR2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 이용하는 인간 Igγ1 정상 영역으로는, 예컨대, 서열 번호 8의 아미노산 번호 121부터 450으로 이루어지는 아미노산 서열을 들 수 있다.
항인간 TLR2 항체의 중쇄 정상 영역으로서 인간 Igγ1 정상 영역을 이용하는 경우, 항체의 항체 의존 세포 상해 활성이나 보체 의존 상해 활성을 저하시키기 위해 L234A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 234위의 류신의 알라닌에 의한 치환), L235A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 235위의 류신의 알라닌에 의한 치환) 등의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ1 정상 영역을 이용할 수도 있다(Mol. Immunol., 1992, Vol.29, No.5, p.633-639). 또한, 체내 동태의 관점에서, 혈액중으로부터 항체를 신속하게 소실시키기 위해 I253A(Kabat 등의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 253위의 이소류신의 알라닌에 의한 치환) 등의 아미노산 변이를 도입한 인간 Igγ1 정상 영역을 이용할 수도 있다(J. Immunol., 1997, Vol.158, p.2211-2217). 본 명세서 중에서 사용되는 항체의 정상 영역에 있어서의 아미노산 변이 도입에 관한 잔기 번호에 관해서는, EU 인덱스(Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda)에 따른다.
바람직하게는, 항인간 TLR2 항체의 중쇄 정상 영역은, L234A 및 L235A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역 또는 L234A, L235A, 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역이다. 보다 바람직하게는, 항인간 TLR2 항체의 중쇄 정상 영역은, L234A, L235A, 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역이고, 이러한 인간 Igγ1 정상 영역으로는, 예컨대, 서열 번호 4의 아미노산 번호 121부터 450으로 이루어지는 아미노산 서열을 들 수 있다.
항인간 TLR2 항체의 경쇄 정상 영역으로서 이용하는 인간 Igκ 정상 영역으로는, 예컨대, 서열 번호 6의 아미노산 번호 114부터 219로 이루어지는 아미노산 서열을 들 수 있다.
바람직하게는, 항인간 TLR2 항체는, 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역 및 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는 항인간 TLR2 항체이고, 보다 바람직하게는, 상기 인간 Igγ1 정상 영역이, L234A, L235A, 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역이다.
예컨대, 항인간 TLR2 항체로는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 TLR2 항체를 들 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 항체가 IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 경우, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트는, 중쇄 가변 영역의 C 말단에 경쇄 가변 영역의 N 말단이 링커를 통해 연결된 구조(중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역)를 갖는 scFv, 및 경쇄 가변 영역의 C 말단에 중쇄 가변 영역의 N 말단이 링커를 통해 연결된 구조(경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역)를 갖는 scFv의 어느 것이어도 좋고, 바람직하게는, 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역의 구조를 갖는 scFv이다. scFv 중의 「링커」는, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하는 임의의 길이의 펩티드(펩티드 링커)이고, 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 15∼50개의 아미노산을 갖는 펩티드이다. 바람직한 펩티드 링커로는, 아미노산 서열 GlyGlyGlyGlySer((Gly)4Ser로도 표시함)을 포함하는 펩티드 링커(본 명세서 중 「GS 링커」라고 칭함)이고, 바람직하게는 복수의, 보다 바람직하게는 3∼5개의 (Gly)4Ser을 포함한다.
예컨대, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트로는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 들 수 있다.
일실시형태에 있어서, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체로는, 항인간 TLR2 항체가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인, 이중 특이적 항체이다.
바람직하게는, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체에 있어서, 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있다. 이러한 이중 특이적 항체의 구조를 도 1에 나타낸다.
항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단을 연결하는 링커는, 양쪽을 연결하는 임의의 길이의 펩티드(펩티드 링커)이고, 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 15∼50개의 아미노산을 갖는 펩티드이다. 바람직한 펩티드 링커로는, GS 링커이고, 바람직하게는 복수의, 보다 바람직하게는 5∼10개의 (Gly)4Ser을 포함한다. 이러한 링커로는, 서열 번호 9에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 링커를 들 수 있다.
일실시형태에 있어서, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체로는, 항인간 TLR2 항체가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv이고, 상기 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는, 이중 특이적 항체이다. 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 융합체를, 「항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체」라고도 칭한다. 바람직하게는, 상기 이중 특이적 항체에 있어서, 상기 항인간 TLR2 항체의 중쇄와 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 연결하는 링커가 GS 링커이고, 보다 바람직하게는, 상기 GS 링커가 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진다. 이러한 본 발명의 이중 특이적 항체로는, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 포함하는, 이중 특이적 항체를 들 수 있다.
일반적으로, 항체는, 세포에서 발현시킨 경우, 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식 등을 들 수 있고, 여러가지 항체에 있어서, 중쇄 C 말단의 리신이 결실되는 것이나 중쇄 N 말단의 글루타민의 대부분이 피로글루탐산으로의 수식을 받는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol.97, p.2426-p2447).
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는, 번역 후 수식을 받은 이중 특이적 항체도 포함된다. 예컨대, 완전 길이의 중쇄를 갖는 이중 특이적 항체뿐만 아니라, C 말단의 리신을 결여하는 중쇄를 갖는 이중 특이적 항체도 포함된다. 또한, N 말단의 글루타민 또는 글루탐산이 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 받은 이중 특이적 항체도 포함된다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화 또는 C 말단측 리신 결실에 의한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아니라는 점도 상기 분야에서 알려져 있다(Analytical Biochemistry, Vol.348, 2006, p.24-39).
일실시형태에 있어서, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에는, 이하에 기재된 이중 특이적 항체도 포함된다.
서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
본 발명은, 이하의 특징을 갖는 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체도 포함한다.
인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체로서,
1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 99부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 24부터 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 55부터 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 94부터 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역; 및
2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 521부터 525까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 540부터 556까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 589부터 598까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 648부터 658까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 674부터 680까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 713부터 721까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 이중 특이적 항체.
본 발명의 이중 특이적 항체의 활성을 평가하는 방법으로서, 인간 TLR2 및/또는 인간 TLR4에 대한 결합 활성이나 중화 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다.
인간 TLR2 또는 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 갖는지의 여부는, 해당 분야에서 공지된 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 이러한 측정 방법으로서, 예컨대, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 해석, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA) 등의 방법을 들 수 있다. 예컨대, 인간 TLR2에 대한 결합 활성에 관해서 SPR 해석을 행하는 경우, Biacore T200(GE 헬스케어사)을 이용할 수 있고, 이 경우, 인간 TLR2 단백질(R&D systems사)을 센서칩의 표면에 고상화하고, 피험 항체를 유로에 첨가하여, 피험 항체와 인간 TLR2 단백질의 해리 상수(KD)를 해석함으로써, 피험 항체의 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 평가할 수 있다. 구체적인 평가 방법으로는, 예컨대, 하기 실시예 5에 기재된 바와 같은 방법을 이용할 수 있다. 다른 예로서, 인간 TLR4에 대한 결합 활성에 관해서 ELISA를 이용하여 평가하는 경우, 인간 TLR4 및 MD2 복합체(이하, 인간 TLR4/MD2라고 칭함) 단백질을 ELISA용 플레이트에 고정화하고, 이것에 대하여 피험 항체를 첨가하여 반응시킨 후, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 등의 효소로 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예컨대, HRP 표지의 경우, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB; MOS사)) 등을 이용한 활성 측정에 의해 2차 항체의 결합을 동정함으로써, 피험 항체의 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 평가할 수 있다. 구체적인 평가 방법으로는, 예컨대, 하기 실시예 9에 기재된 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
인간 TLR2에 대한 항체의 중화 활성이란, 인간 TLR2에 대한 결합에 의해 인간 TLR2를 통해 초래되는 임의의 생물 활성을 저해하는 활성을 의미하며, 이들 중 하나 또는 복수의 생물 활성을 지표로 평가할 수 있다. 예컨대, 이러한 인간 TLR2에 대한 중화 활성으로는, 인간 단구계 세포 THP1-xBlue 세포에 있어서의 Pam2CSK4 유발성의 AP 산생을 저해하는 활성을 들 수 있고, 활성의 구체적인 평가 방법으로는, 예컨대, 하기 실시예 6에 기재된 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
인간 TLR4에 대한 중화 활성이란, 인간 TLR4에 대한 결합에 의해 인간 TLR4를 통해 초래되는 임의의 생물 활성을 저해하는 활성을 의미하며, 이들 중 하나 또는 복수의 생물 활성을 지표로 평가할 수 있다. 예컨대, 이러한 인간 TLR4에 대한 중화 활성으로는, 인간 단구계 세포주인 U937 세포에 있어서의 LPS 유발성의 IL-6 산생을 저해하는 활성을 들 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 항체는, 인간 TLR2와 인간 TLR4에 대한 중화 활성을 갖는다. 인간 TLR2와 인간 TLR4에 대한 중화 활성을 갖는다란, 인간 TLR2에 대한 중화 활성과 인간 TLR4에 대한 중화 활성의 양쪽을 갖는 것을 의미한다. 인간 TLR2와 인간 TLR4에 대한 중화 활성을 갖는지의 여부는, 상기 인간 TLR2 또는 인간 TLR4에 대한 중화 활성의 평가 방법을 각각 이용하여 평가해도 좋고, 인간 TLR2와 인간 TLR4의 양쪽을 발현하는 세포를 이용하여 인간 TLR2와 인간 TLR4를 통한 상기 세포의 하나 또는 복수의 생물 활성을 저해하는 활성을 평가해도 좋다. 후자의 평가 방법의 예로는, 예컨대, 인간 TLR2 및 인간 TLR4를 발현하는 인간 말초혈 단핵구 세포에 있어서의 패혈증의 원인균인 녹농균 슈도모나스 에루지노사 PAO-1(예컨대, ATCC:BAA-47) 유발성의 TNFα 산생을 저해하는 활성을 들 수 있다. 이러한 활성을 갖는 항체는, 인간 TLR2와 인간 TLR4에 대한 중화 활성을 갖는 항체인 것으로 판단할 수 있다. 구체적인 평가 방법으로는, 예컨대, 하기 실시예 10에 기재된 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체는, 본 명세서에 개시된, 본 발명의 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보에 기초하여, 해당 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 후술하는 <본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이중 특이적 항체>에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체는, 필요에 의해 더욱 정제된 후, 통상법에 따라 제제화되어, 면역 염증성 질환, 예컨대, 패혈증, 급성 신장해, 만성 신장병, 급성 호흡 촉박 증후군, 강피증, 급성 췌염, 만성 폐색성 폐질환 등의 인간 TLR2 및 인간 TLR4가 병태 형성에 관여하는 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
<본 발명의 폴리뉴클레오티드>
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역(서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어짐)을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역(서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어짐)을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역(서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어짐)을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역(서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어짐)을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 3의 염기 번호 1부터 360까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 5의 염기 번호 1부터 339까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 3의 염기 번호 1471부터 1827까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 3의 염기 번호 1873부터 2196까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
바람직한 본 발명의 폴리뉴클레오티드로는, 예컨대, 본 발명의 이중 특이적 항체가 IgG(TLR2)-scFv(TLR4)를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 상기 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 상기 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.
일실시형태에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있고, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄의 폴리뉴클레오티드로는, 서열 번호 5의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그 염기 서열에 기초하여, 해당 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예컨대, 해당 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로는, WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러가지 방법이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 일단 취득하면, 이 폴리뉴클레오티드의 소정의 부위에 변이를 도입함으로써, 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드를 취득하는 것도 가능하다. 이러한 변이 도입 방법으로는, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit., 1987, John Wiley & Sons Section 8.1-8.5) 등의 당업자에게 공지된 여러가지 방법이 사용될 수 있다.
<본 발명의 발현 벡터>
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로서, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 생산에 사용될 수 있는 벡터가 포함된다. 해당 분야에서 여러가지 포맷의 이중 특이적 항체 및 그 생산 방법이 공지되어 있으며, 본 발명의 발현 벡터는, 이들 생산 방법에 따라, 발현시키는 이중 특이적 항체의 포맷에 따라 당업자에게 용이하게 구축될 수 있다.
예컨대, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하기 위해 사용되는 발현 벡터로는, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터가 바람직하다.
보다 바람직하게는, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하기 위해 사용되는 발현 벡터는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터이다.
더욱 바람직하게는, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하기 위해 사용되는 발현 벡터는, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터이다.
폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 이용하는 발현 벡터로는, 진핵 세포(예컨대, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵 세포(예컨대, 대장균)의 각종 숙주 세포 중에서, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 이들 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는, pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다. 또한, AG-γ1이나 AG-κ(예컨대, WO94/20632를 참조) 등의 미리 인간 Ig 정상 영역 유전자를 갖는 발현 벡터에 가변 영역 유전자 단편을 도입하여 항체 유전자를 발현할 수도 있다.
숙주 세포로서 동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 이중 특이적 항체 또는 그 중쇄 가변 영역 혹은 경쇄 가변 영역을 코드하는 유전자의 5' 측 및 3' 측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 혹은 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 좋다. 한편, 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예컨대, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 좋다.
본 발명의 발현 벡터는, 폴리뉴클레오티드에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터로는, 예컨대, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor; 연장 인자) 1α 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 숙주 세포가 대장균(예컨대, 에셰리키아속균)인 경우, 예컨대, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 효모 중에서의 발현용 프로모터로는, 예컨대, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
<본 발명의 형질 전환된 숙주 세포>
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환되어 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하기 위해 사용되는, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 상기 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(d) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(d) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(c) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(d) 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
바람직하게는, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포로는, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포, 및, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포를 들 수 있다.
본 발명의 IgG(TLR2)-scFv(TLR4)를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)를 발현시키는 공정을 포함하고 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 상기 방법에서 사용되는 바람직한 숙주 세포로는, 전술한 바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환하는 숙주 세포로는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 상기 발현 벡터로 형질 전환되어, 항체를 발현할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 본 발명의 기술 분야에서 통상 사용되는 천연 세포 혹은 인공적으로 수립된 세포 등 여러가지 세포(예컨대, 동물 세포(예컨대, CHO-K1SV 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf9), 대장균(에셰리키아속균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있고, 바람직하게는, CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포, NS0 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.
<본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이중 특이적 항체>
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하고 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 상기 방법에서 사용되는 바람직한 숙주 세포로는, 전술한 바람직한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
일실시형태에 있어서, IgG(TLR2)-scFv(TLR4)인 본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포, 및, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포, 및, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법이 포함된다.
(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포, 및, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
형질 전환된 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, 배지의 pH, 및 배양 시간은, 적절하게 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로는, 예컨대, 약 5∼20％의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1959, Vol.130, No.3373, p.432-7), DMEM 배지(Virology, 1959, Vol.8, p.396), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol.199, p.519), 199 배지(Exp. Biol. Med., 1950, Vol.73, p.1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼72시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로는, 예컨대, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol.82, p.8404) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하고, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로는, 예컨대, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는, 예컨대, 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로는, 예컨대, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프·리쿼, 펩톤, 카제인, 미트 엑기스, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예컨대, 무기염(예컨대, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류 등), 항생 물질(예컨대, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등)을 포함하고 있어도 좋다. 배지의 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 바람직한 배지로는, 예컨대, LB 배지, M9 배지(Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.3, A2.2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 14∼39℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로는, 예컨대, Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, Vol.77, p.4505) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술한 바와 같은 배양에 의해, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법은, 전술한 바와 같은 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정에 더하여, 나아가서는, 상기 형질 전환된 숙주 세포로부터 본 발명의 이중 특이적 항체를 회수, 바람직하게는 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로는, 예컨대, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과 등, 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실 아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 배양 상청 중에 축적된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예컨대, 프로테인 A 또는 프로테인 G 칼럼을 이용한 각종 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
<본 발명의 의약 조성물>
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 해당 분야에서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로는, 예컨대, 주사제, 점적 용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 또한, 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수 종의 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 포함할 수 있다. 예컨대, 번역 후 수식을 받고 있지 않은 항체, 및, 상기 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
일실시형태에 있어서, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재된 의약 조성물도 포함된다.
1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 및
2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체, 및,
상기 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체인, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체
를 함유하는 의약 조성물.
본 발명의 의약 조성물에는, 중쇄 C 말단 리신을 결실한 이중 특이적 항체, N 말단 번역 후 수식을 받은 이중 특이적 항체, 중쇄 C 말단 리신을 결실하고 N 말단 번역 후 수식을 받은 이중 특이적 항체 및/또는 중쇄 C 말단 리신을 갖고 N 말단 번역 후 수식을 받고 있지 않은 이중 특이적 항체를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
일실시형태에 있어서, 하기 (1) 및 (2)의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
(1) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
(2) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
또 하나의 실시형태에 있어서, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재된 의약 조성물도 포함된다.
서열 번호 4에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체 및 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 포함하는 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
상기 제제화에 있어서의 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예컨대, 0.001 mg/kg∼100 mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 인간 TLR2 및 인간 TLR4가 병태 형성에 관여하는 면역 염증성 질환, 예컨대, 패혈증, 급성 신장해, 만성 신장병, 급성 호흡 촉박 증후군, 강피증, 급성 췌염, 만성 폐색성 폐질환 등의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 포함하는, 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 상기 이중 특이적 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 면역 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 이중 특이적 항체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의, 본 발명의 이중 특이적 항체의 용도가 포함된다.
<본 발명의 항인간 TLR2 항체 및 그것을 함유하는 의약 조성물>
본 발명은, 서열 번호 8의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 99부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및, 서열 번호 6의 아미노산 번호 24부터 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 55부터 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 94부터 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 포함한다.
또한, 본 발명은, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 및, 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트도 포함한다. 번역 후 수식의 예로서, 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단의 리신 결실을 들 수 있다. 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트에 있어서 바람직한 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역은, 전술한 <본 발명의 이중 특이적 항체>에 있어서의 항인간 TLR2 항체에 관해서 기재한 것과 동일하다.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 TLR2 항체는, 하기의 특징을 갖는 항인간 TLR2 항체이다.
서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 TLR2 항체.
또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 TLR2 항체는, 하기의 특징을 갖는 항인간 TLR2 항체이다.
서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 449까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 TLR2 항체.
본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 전술한 본 발명의 이중 특이적 항체에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 전술한 <본 발명의 발현 벡터>, <본 발명의 형질 전환된 숙주 세포> 및 <본 발명의 이중 특이적 항체를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이중 특이적 항체>의 기재를 참조하여, 당업자에게 용이하게 생산될 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물도 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 해당 분야에서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로는, 예컨대, 주사제, 점적 용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수 종의 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 포함할 수 있다. 예컨대, 번역 후 수식을 받고 있지 않은 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 및, 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
일실시형태에 있어서, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기에 기재된 의약 조성물도 포함된다.
서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트, 및, 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트인, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물.
일실시형태에 있어서, 항인간 TLR2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기 (1)부터 (4)까지의 인간 TLR2에 결합하는 항체를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
(1) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 449까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 TLR2 항체.
(2) 서열 번호 8에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 및 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 TLR2 항체.
(3) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 449까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 및 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 TLR2 항체.
(4) 서열 번호 8에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 6에 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 TLR2 항체.
또 하나의 실시형태에 있어서, 항인간 TLR2 항체를 함유하는 본 발명의 의약 조성물에는, 하기의 인간 TLR2에 결합하는 항체를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 TLR2 항체, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 449까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 TLR2 항체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
상기 제제화에 있어서의 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예컨대, 0.001 mg/kg∼100 mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 필요에 의해 더욱 정제된 후, 통상법에 따라 제제화되어, 패혈증, 암 등의 인간 TLR2가 병태 형성에 관여하는 질환의 치료에 이용할 수 있다.
<융합 항체 및 수식 항체>
당업자라면, 해당 분야에서 공지된 방법을 이용하여, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를, 다른 펩티드 또는 단백질을 융합한 융합 항체로서 제작하는 것이나, 수식제를 결합시킨 수식 항체로서 제작하는 것도 가능하다. 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체, 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트에는, 이러한 융합체나 수식체의 형태의 항체 또는 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체가 융합 항체로서 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 갖고 있거나, 혹은 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가 융합 항체로서 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 갖고 있는 한, 융합에 이용되는 다른 펩티드 또는 단백질은 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩티드, 인공 헬릭스 모티브 펩티드, 말토오스 결합 단백질, 글루타치온 S 트랜스페라아제, 각종 독소, 기타 다량체화를 촉진할 수 있는 펩티드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체가 융합 항체로서 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 대한 결합 활성을 갖고 있거나, 혹은 본 발명의 항인간 TLR2 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트가 수식 항체로서 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 갖고 있는 한, 수식에 이용되는 수식제는 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 폴리에틸렌글리콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에 관해서 더욱 이해를 얻기 위해 참조하는 특정한 실시예를 이곳에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
시판되는 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 관해서는, 특별히 언급이 없는 한 첨부의 프로토콜에 따라 실험을 행했다. 또한, 편의상, 농도 mol/L를 M으로서 표시한다. 예컨대, 1 M 수산화나트륨 수용액은 1 mol/L의 수산화나트륨 수용액인 것을 의미한다.
(실시예 1: 항인간 TLR2 항체 산생 하이브리도마의 제작)
인간 모노클로날 항체 개발 기술 「벨록이뮨」(VelocImmune antibody technology; Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항인간 TLR2 항체를 제작했다. 벨록이뮨 마우스에, 면역 반응을 야기하는 아쥬반트와 함께, 인간 TLR2 단백질(R&D systems사, 2616-TR-050)을 면역했다. 통상법에 따라, 면역한 마우스의 비장이나 림프절 등을 적출하여 림프구를 수집하고, 이것을 마우스 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC:CRL-1581)과 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작했다. 모노클론화를 행하고 무혈청 배지인 CD 하이브리도마 미디움(라이프 테크놀로지즈사)에서 배양했다. 얻어진 배양 상청으로부터 프로테인 G 칼럼(GE 헬스케어사)을 이용하여 항체를 정제했다. 벨록이뮨 기술에서는, 내인성의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 대응하는 인간 가변 영역으로 치환된 트랜스제닉 마우스를 이용하기 때문에, 얻어진 항체는, 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체(키메라 항체라고도 칭함)이다.
(실시예 2: 항인간 TLR2 항체의 중화 활성 평가)
실시예 1에서 동정한 항인간 TLR2 항체의 중화 활성을 평가하기 위해, 인간 TLR2를 내재적으로 발현하는 인간 단구계 세포인 THP1-xBlue 세포를 이용하여, TLR2/6 아고니스트인 Pam2CSK4 유발 알칼리포스파타아제(AP) 산생 저해 분석을 실시했다.
그 결과, 31-5F5-2F3이라고 명명한 항인간 TLR2 항체(키메라 항체)가 AP 산생을 저해하고, 인간 TLR2에 대한 중화 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(실시예 3: 항인간 TLR2 항체의 서열 결정 및 개변체 제작)
항인간 TLR2 항체 31-5F5-2F3을 산생하는 하이브리도마로부터 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드하는 유전자의 서열을 해석하고, 서열 결정을 행했다.
항체의 서열 결정 후, 항체의 물성 및 안정성 향상을 위해, 31-5F5-2F3의 중쇄 및 경쇄의 FR을 다른 인간 항체의 FR과 치환하고, 항인간 TLR2 항체 31-5F5-2F3.m1을 제작했다.
(실시예 4: 완전 인간형 항인간 TLR2 항체의 제작)
실시예 3에서 제작한 항체는, 가변 영역이 인간 유래이고, 정상 영역이 마우스 유래인 항체이다. 그래서, 포유 세포 발현용 벡터 GS 벡터(Lonza사)를 이용하여, 중쇄 및 경쇄의 양유전자를 포함하는 발현 벡터를 구축하고, 완전 인간형 항체를 제작했다. 구체적으로는, 31-5F5-2F3.m1의 항체의 중쇄 가변 영역 유전자의 5' 측에 시그널 서열(Nigel Whittle 등, Protein Engineering, 1987, Vol.1, No.6, p.499-505.)을 코드하는 유전자를, 그리고 3' 측에 인간 Igγ1 정상 영역 유전자(서열 번호 7의 염기 번호 361부터 1350까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결시키고, 이 중쇄 유전자를 GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 또한 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 측에 시그널 서열(Nigel Whittle 등, 전술)을 코드하는 유전자를, 그리고 3' 측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자(서열 번호 5의 염기 번호 340부터 657까지의 염기 서열로 이루어짐)를 각각 연결시키고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4에 삽입했다.
pEE6.4에 삽입한 항체의 중쇄 유전자 서열, pEE12.4에 삽입한 항체의 경쇄 유전자 서열을 시퀀서로 해석하고, 그 결과 얻어진 아미노산 서열로부터, Kabat 등의 데이터베이스(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office)를 참조하여 CDR 서열을 결정했다.
제작한 31-5F5-2F3.m1의 완전 인간형 항체(완전 인간형 31-5F5-2F3.m1)의 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 7에, 그것에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 8에, 상기 항체의 경쇄의 염기 서열을 서열 번호 5에, 그것에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 6에 각각 나타낸다.
서열 번호 8로 표시되는 중쇄의 가변 영역은, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 8의 아미노산 번호 31부터 35, 50부터 66, 99부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열 번호 6으로 표시되는 경쇄의 가변 영역은, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 6의 아미노산 번호 24부터 39, 55부터 61, 94부터 102까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
항체의 중쇄와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 GS 벡터를 이용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항체 발현을 행했다. 일과성 발현에 관해서는, FreeStyle 293 발현 배지(라이프 테크놀로지즈사)에서 약 100만 세포/mL로 배양된 FreeStyle 293 세포(라이프 테크놀로지즈사)에 대하여, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양발현 벡터를 유전자 도입 시약 293 펙틴(라이프 테크놀로지즈사)을 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 또는, Expi293 발현 배지(라이프 테크놀로지즈사)에서 약 300만 세포/mL로 배양된 Expi293 세포(라이프 테크놀로지즈사)에 대하여, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양발현 벡터를 유전자 도입 시약 Expi Fectamine 293(라이프 테크놀로지즈사)을 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 또는, CD-CHO 배지(라이프 테크놀로지즈사)에서 약 1000만 세포/mL로 배양된 CHO-K1SV 세포(Lonza사)에 대하여, 전술한 중쇄 및 경쇄의 양발현 벡터를 일렉트로포레이션법을 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양했다. 배양 상청을 프로테인 A 또는 프로테인 G 칼럼(모두 GE 헬스케어사)을 이용하여 정제하여, 완전 인간형 항체의 정제 항체를 얻었다. 항상적 발현에 관해서는, 항체의 중쇄와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 GS 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, 라이게이션용 키트 Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE사) 또는 라이게이션 시약 Ligation-high(TOYOBO사)를 이용하여 라이게이션을 행하고, 중쇄와 경쇄의 양유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축했다. 이 발현 벡터는, 완전 길이의 중쇄 및 경쇄와 글루타민 합성 효소를 코드하고 있고, CHO-K1SV 세포에 대한 트랜스펙션에 의해 항체를 발현시켰다. 배양 상청을 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼으로 정제하여, 완전 인간형 항체의 정제 항체를 얻었다.
(실시예 5: 완전 인간형 항인간 TLR2 항체의 결합 활성 평가)
실시예 4에서 제작한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 평가하기 위해, SPR 해석을 실시했다.
SPR 해석에 있어서는, Biacore T200(GE 헬스케어사)을 이용했다. CM5 센서칩(GE 헬스케어사, BR-1005-30)에 His Capture Kit(GE 헬스케어사, 28-9950-56)와 Amine Coupling Kit(GE 헬스케어사, BR-1000-50)를 이용하여 Anti-His IgG(His Capture Kit 부속)를 고정했다. 유로 No.1을 레퍼런스로 하고, 이 유로에는 인간 TLR2 단백질을 결합시키지 않고, 그 밖의 유로(No.2, No.3, No.4) 각각에, HBS-EP+ 버퍼(GE 헬스케어사, BR-1006-69)로 0.66 μg/mL로 희석한 인간 TLR2 단백질(R&D systems사, 2616-TR-050)을 유속 5 μL/분으로 2분간 첨가하고 고상화시켰다. 그 후, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1을 HBS-EP+ 버퍼로 200 nM로 희석한 용액을, 유속 50 μL/분으로 2분간 첨가하고, 완전 인간형 항체와 인간 TLR2의 결합을 측정했다. 다음으로, HBS-EP+ 버퍼를 유속 50 μL/분으로 5분간 첨가하고, 완전 인간형 항체와 인간 TLR2의 해리를 측정했다. Bivalent analyte model, Rmax를 Fit local로 해석하고, 결합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)를 산출하고, kd를 ka로 나눔으로써 결합 해리 상수(KD)를 산출했다.
그 결과, KD는 88.5 pM이고, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1이 인간 TLR2에 대한 결합 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(실시예 6: 완전 인간형 항인간 TLR2 항체의 중화 활성 평가)
실시예 4에서 제작한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 인간 TLR2에 대한 중화 활성을 평가하기 위해, THP1-xBlue 세포를 이용하여, Pam2CSK4 유발 AP 산생 저해 분석을 실시했다. THP1-xBlue 세포(Invivogen사, thpx-sp)를, 5×104 세포/웰이 되도록, 96웰 플레이트(벡톤 디킨슨사)에 75 μL/웰로 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지즈사) 하에서 파종했다. 세포 파종 후 즉시, 855 nM부터 2.19 pM의 범위에서 9단계로 RPMI1640 배지로 희석한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1을 25 μL 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 30분간 배양했다. 또한, RPMI1640 배지로 희석한 Pam2CSK4(Invivogen사, tlrl-pm2s; 최종 농도 100 ng/mL)를 25 μL 첨가했다. 컨트롤로서, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰, Pam2CSK4 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 각각 준비했다. 하룻밤 37℃, 5％ CO2 조건하에서 배양한 후, 배양 상청을 회수하여, 배양 상청에 포함되는 AP 농도를 시판되는 Quanti-Blue(Invivogen사)를 이용하여 측정했다. 또한 항체의 Pam2CSK4 유발 AP 산생에 대한 IC50 값을 산출했다. IC50 값 산출에 있어서는, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 0％ 억제 컨트롤로 하고, Pam2CSK4 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 100％ 억제 컨트롤로서 설정했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 적용에 의해, IC50 값을 산출했다.
그 결과, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1은 AP 산생을 저해하고, IC50 값은 97.7 pM이었다. 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1이 인간 TLR2에 대한 중화 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(실시예 7: 완전 인간형 항인간 TLR2 항체의 중화 활성 평가(2))
실시예 4에서 제작한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 인간 TLR2에 대한 중화 활성을 평가하기 위해, THP1-xBlue 세포를 이용하여, Pam2CSK4 유발 AP 산생 저해 분석을 실시했다. 비교 항체로서, 항인간 TLR2 항체인, T2.5(특허문헌 1) 및 OPN305(특허문헌 3)를 사용했다.
실시예 6과 동일한 실험을, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1(855 nM부터 2.19 pM의 범위에서 9단계 RPMI1640 배지 희석), T2.5(833 nM부터 2.13 pM의 범위에서 9단계 RPMI1640 배지 희석), 및 OPN305(861 nM부터 2.20 pM의 범위에서 9단계 RPMI1640 배지 희석)의 3종류의 항체에 대하여 실시하고, 4 파라미터 로지스틱 곡선 적용에 의해, IC50 값을 산출했다.
그 결과, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1은 Pam2CSK4 유발에 의한 AP 산생을 완전히 저해하고, IC50 값은 130 pM이었다. 한편, T2.5 및 OPN305의 Pam2CSK4 유발에 의한 AP 산생 저해는 부분적이었다(도 2).
(실시예 8: 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 제작)
항인간 TLR2 항체(IgG 항체)와 항인간 TLR4 항체 단일쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv)를 포함하는, 2종의 항인간 TLR2 및 항인간 TLR4 이중 특이적 항체를 제작했다. 본 실시예에서 제작한 이중 특이적 항체는, 전술한 IgG(TLR2)-scFv(TLR4)형의 이중 특이적 항체이고, 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 scFv의 N 말단이 링커를 통해 연결된 구조를 갖는다(도 1).
실시예 4에서 제작한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 중쇄 유전자의 3' 말단에 GS 링커(서열 번호 9)를 코드하는 유전자를 PCR 법을 이용하여 연결하고, 또한 상기 GS 링커를 코드하는 유전자의 3' 말단에 항인간 TLR4 항체 scFv를 코드하는 유전자를 PCR 법을 이용하여 연결하여, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 중쇄의 C 말단과 항인간 TLR4 항체 scFv의 N 말단을 상기 GS 링커로 연결한, 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를 코드하는 유전자를 제작했다. 이 유전자에 코드되는 상기 융합체에 포함되는 항인간 TLR4 항체 scFv는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역의 C 말단에 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역의 N 말단이 GS 링커(서열 번호 10)를 통해 연결된 구조를 갖는다. 제작한 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체를, ICU-1-Igγ1 중쇄라고 칭한다. ICU-1-Igγ1 중쇄 유전자의 5' 측에 시그널 서열(Nigel Whittle 등, 전술)을 코드하는 유전자를 연결시키고, pEE6.4 벡터에 삽입했다.
또한, ICU-1-Igγ1 중쇄의 인간 Igγ1 중쇄 정상 영역에 L234A, L235A, 및 I253A의 아미노산 변이를 도입한 개변형의 ICU-1-Igγ1 중쇄(ICU-1-Igγ1-LAsh 중쇄라고 칭함)의 유전자를 제작하고, 상기 유전자를 pEE6.4 벡터에 삽입했다.
ICU-1-Igγ1 중쇄 유전자 또는 ICU-1-Igγ1-LAsh 중쇄 유전자가 삽입된 pEE6.4 벡터와, 실시예 4에서 제작한 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 경쇄 유전자가 삽입된 pEE12.4를 조합하고, 실시예 4에 기재된 항체의 발현 및 정제법과 동일한 방법을 이용하여, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 2종 제작했다.
ICU-1-Igγ1 중쇄와 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 경쇄를 포함하는 이중 특이적 항체를 완전 인간형 ICU-1-Igγ1이라고 칭하고, ICU-1-Igγ1-LAsh 중쇄와 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 경쇄를 포함하는 이중 특이적 항체를 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh라고 칭한다.
완전 인간형 ICU-1-Igγ1의 ICU-1-Igγ1 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에 각각 나타낸다. 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh의 ICU-1-Igγ1-LAsh 중쇄의 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다.
서열 번호 2로 표시되는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체에 포함되는 항인간 TLR2 항체 중쇄는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열 번호 4로 표시되는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체에 포함되는 항인간 TLR2 항체 중쇄는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열 번호 2 및 서열 번호 4로 표시되는 상기 2개의 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체에 포함되는 항인간 TLR2 항체 중쇄의 가변 영역은 공통으로, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 31부터 35, 50부터 66, 99부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열 번호 2 및 서열 번호 4로 표시되는 상기 2개의 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체에 포함되는 항인간 TLR4 항체 scFv는 공통으로, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 항인간 TLR4 항체 scFv를 구성하는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 521부터 525, 540부터 556, 589부터 598까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 항인간 TLR4 항체 scFv를 구성하는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 648부터 658, 674부터 680, 713부터 721까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh의 경쇄의 염기 서열은 공통으로, 그 염기 서열을 서열 번호 5에, 그것에 의해 코드되는 아미노산 서열을 서열 번호 6에 각각 나타낸다. 서열 번호 6으로 표시되는 항인간 TLR2 항체 경쇄의 가변 영역은, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 6의 아미노산 번호 24부터 39, 55부터 61, 94부터 102까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
(실시예 9: 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 결합 활성 평가)
실시예 8에서 제작한 2종의 이중 특이적 항체의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 대한 각각의 결합 활성을 평가하기 위해, 인간 TLR2 단백질 및 인간 TLR4/MD2 단백질을 이용하여, ELISA를 행했다. 막시소프 384웰 플레이트 클리어(서모피셔 사이언티픽사)에, PBS(라이프 테크놀로지즈사, 10010-023)로 10 μg/mL의 농도로 희석한 인간 TLR2 단백질(R&D systems사, 2616-TR-050)을 15 μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 고상화했다. 동일하게 인간 TLR4/MD2 단백질(R&D systems사, 3146-TM/CF)을 10 μg/mL로 15 μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 고상화했다. 1시간 후에 세정액(0.05％ Tween-20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS))으로 3회 웰을 세정하고, Blocking One(나카라이테스크사, 03953-95)을 100 μL/웰 첨가하고 실온에서 1시간 블로킹을 행했다. 다시 세정액으로 3회 세정하고, 실시예 8에서 제작한 2종의 이중 특이적 항체를 인간 TLR2 단백질을 고상화한 웰, 인간 TLR4/MD2 단백질을 고상화한 웰 각각에 대하여 15 μL/웰 첨가했다. 이들 항체의 희석은 PBS 및 Blocking One을 등량 혼합한 반응 완충액을 이용하여 행하고, 75.0 nM부터 4.47 fM까지 13단계로 희석했다. 실온에서 1시간 정치한 후에, 세정액으로 3회 세정을 행했다. 인간 IgG-중쇄 및 경쇄 교차-흡착된 항체(BETHYL사, A80-219P)를 4000배로 반응 완충액으로 희석한 것을 15 μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 세정액으로 3회 세정하고, TMB PEROXIDASE SUBSTRATE ELISA(MOSS사, #TMBE-500)를 15 μL/웰 첨가했다. 인간 TLR2 단백질을 고상화한 웰은 15분 후에 1 M 황산(와코쥰야쿠 공업사, 198-09595)을 15 μL/웰 첨가하고 반응을 정지했다. 인간 TLR4/MD2 단백질을 고상화한 웰은 5분 후에 1 M 황산을 15 μL/웰 첨가하고 반응을 정지했다. Safire2(TECAN사)로 흡광도 450 nm를 측정하고, 인간 TLR2 단백질 및 인간 TLR4/MD2 단백질에 대한 각 항체의 EC50 값을 각각 산출했다. EC50 값 산출에 있어서는, 종축을 측정치, 횡축을 항체 농도치로 그린 그래프 상의 시그모이드 곡선의 형상으로부터, 항체 농도의 상승에 따라 측정치가 수속치에 도달한 것으로 판단할 수 있는 각 항체의 측정치의 최대치를 100％, 항체 농도의 하강에 따라 측정치가 수속치에 도달한 것으로 판단할 수 있는 각 항체의 측정치의 최소치를 0％로 설정했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 적용에 의해 산출한 EC50 값을 다음에 나타낸다(표 1, 표 2).
표 1: 인간 TLR2 단백질에 대한 결합 활성
Figure pct00001
표 2: 인간 TLR4/MD2 단백질에 대한 결합 활성
Figure pct00002
그 결과, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh는, 인간 TLR2 단백질 및 인간 TLR4/MD2 단백질의 양쪽에 결합하는 것이 분명해졌다.
(실시예 10: 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체의 정상 인간 말초혈 단핵구 녹농균 사균 유발 TNFα 산생 저해 분석)
실시예 8에서 제작한 이중 특이적 항체의 중화 활성을 평가하기 위해, 인간 TLR2 및 인간 TLR4/MD2를 내재적으로 발현하는 인간 말초혈 단핵구를 이용하여, 녹농균 사균 유발 TNFα 산생 저해 분석을 실시했다. 녹농균 슈도모나스 에루지노사는 패혈증의 원인균의 하나로서, 인간 말초혈 단핵구 상의 TLR2와 TLR4를 자극하여 TNFα를 산생하는 것이 알려져 있다(Scand. J. Immunol., 2008, Vol.67, No.2, p.193-203).
정상 인간 말초혈 단핵구(Lonza사, CC-2702)를 384웰 플레이트(눈크사)에 1.875×104 세포/웰이 되도록, 종농도 10∼30％로 적절하게 조제한 인간 혈청(Lonza사, 14-490E)을 포함하는 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여 30 μL/웰로 파종했다. 그 후 즉시 375 nM부터 7.680 fM의 범위에서 12단계로 RPMI1640 배지로 희석한 정제 항체 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 또는 500 nM부터 10.24 fM의 범위에서 13단계로 RPMI1640 배지로 희석한 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh를 10 μL 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 조건하에서 30분간 배양했다. 또한, 임상 분리주의 녹농균 슈도모나스 에루지노사 PAO-1의 가열 처리 사균을 RPMI1640 배지로 희석하고, 종농도 1×106 CFU(colony forming unit; 콜로니 형성 단위)/mL가 되도록 10 μL 첨가했다. 컨트롤로서, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰, 녹농균 사균 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 각각 준비했다. 37℃, 5％ CO2 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 배양 상청을 회수하여, 배양 상청에 포함되는 TNFα 농도를 시판되는 AlphaLISA TNFα 키트(퍼킨엘머사, AL208C)를 이용하여 측정했다. 또한 각 항체의 녹농균 사균 유발 TNFα 산생에 대한 IC50 값을 산출했다. IC50 값 산출에 있어서는, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 0％ 억제 컨트롤로 하고, 녹농균 사균 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 100％ 억제 컨트롤로서 설정했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 적용에 의해 산출한 IC50 값을 다음에 나타낸다(표 3).
표 3: 정상 인간 말초혈 단핵구 녹농균 사균 유발 TNFα 산생 저해 활성
Figure pct00003
그 결과, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh는 TNFα 산생을 저해하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 대한 중화 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(실시예 11: 정상 인간 말초혈 단핵구 대장균 사균 유발 TNFα 산생 저해 분석)
정상 인간 말초혈 단핵구(Lonza사, CC-2702)를 384웰 플레이트(눈크사)에 1×104 세포/웰이 되도록, 종농도 10％로 적절하게 조제한 인간 혈청(Lonza사, 14-490E)을 포함하는 RPMI1640 배지(라이프 테크놀로지즈사)를 이용하여 30 μL/웰로 파종했다. 그 후 즉시 2.500 μM부터 20.00 fM의 범위에서 12단계로 RPMI1640 배지로 희석한 정제 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 또는 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh를 10 μL 첨가했다. 또한 비교 항체로서 7.758 μM부터 52.96 fM의 범위에서 13단계로 RPMI1640 배지로 희석한 정제 항인간 TLR4 항체 1E11.C2E3(특허문헌 6) 및 항인간 TLR2 항체 OPN305(특허문헌 3)의 혼합 용액 10 μL를 첨가했다. 그 후 37℃, 5％ CO2 조건하에서 30분간 배양했다. 또한, 임상 분리주의 대장균 에셰리키아 콜라이(21006)의 가열 처리 사균을 RPMI1640 배지로 희석하고, 종농도 1×106 CFU/mL가 되도록 10 μL 첨가했다. 컨트롤로서, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰, 대장균 사균 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 각각 준비했다. 37℃, 5％ CO2 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 배양 상청을 회수하여, 배양 상청에 포함되는 TNFα 농도를 시판되는 AlphaLISA TNFα 키트(퍼킨엘머사)를 이용하여 측정했다. 또한 각 항체의 대장균 사균 유발 TNFα 산생에 대한 IC50 값을 산출했다. IC50 값 산출에 있어서는, 항체 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 0％ 억제 컨트롤로 하고, 대장균 사균 대신에 RPMI1640 배지를 첨가한 웰을 100％ 억제 컨트롤로서 설정했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 적용에 의해 산출한 IC50 값을 다음에 나타낸다(표 4, 도 3).
표 4: 정상 인간 말초혈 단핵구 대장균 사균 유발 TNFα 산생 저해 활성
Figure pct00004
그 결과, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh는 1E11.C2E3 및 OPN305의 병용보다 약 10배의 효력(potency)의 TNFα 산생 저해 활성을 갖고 있는 것이 분명해졌다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4를 통한 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포, 및 이중 특이적 항체를 생산하는 방법은, 상기 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 데에 유용하다.
서열표 프리텍스트
이하의 서열표의 숫자 색인 <223>에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열표의 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열은, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1의 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체의 염기 서열이고, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 1에 의해 코드되는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열은, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh의 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체의 염기 서열이고, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 3에 의해 코드되는 항인간 TLR2 항체 중쇄-항인간 TLR4 항체 scFv 융합체의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열은, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh의 항인간 TLR2 항체 경쇄, 및 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 경쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 5에 의해 코드되는 항인간 TLR2 항체 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 7로 표시되는 염기 서열은, 완전 인간형 31-5F5-2F3.m1의 중쇄의 염기 서열이고, 서열표의 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 7에 의해 코드되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 9로 표시되는 아미노산 서열은, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh에 포함되는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 정상 영역의 C 말단과 항인간 TLR4 항체 scFv의 N 말단을 연결하는 GS 링커의 아미노산 서열이다. 서열표의 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열은, 완전 인간형 ICU-1-Igγ1 및 완전 인간형 ICU-1-Igγ1-LAsh에 포함되는 항인간 TLR4 항체 scFv 중의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하는 GS 링커의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Novel anti-human TLR2 / human TLR4 bispecific antibody <130> A15004A00 <150> JP2014-038438 <151> 2014-02-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-human TLR2 heavy chain_anti-human TLR4 scFv fusion peptide of bispecific antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(2199) <400> 1 gag gta cag ttg gtg gag agt gga ggc ggg ctg gtc caa cct ggt ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 agt ctt cgc ctt tct tgt gca gcc tct ggg ttt acc ttc tca aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 gcc atg tcc tgg gtg cgt cag gct ccc ggc aaa gga ctg gaa tgg gtt 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc gcc att tat gga cgg ggc ggt tac aca aac tac gca gat tcc gtc 192 Ala Ala Ile Tyr Gly Arg Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag gga agg ttc aca atc agc cga gac aat tcc aag aac acc ctc tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aat agc ctg aga gcc gag gac act gct gtg tac tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aaa gaa ggc ggt ggc tac agg gac tat ttt gat tat tgg ggc cag 336 Ala Lys Glu Gly Gly Gly Tyr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg acc ttg gtc acc gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc 384 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg ccc 576 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 720 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 768 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 816 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 864 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 912 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 960 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 1008 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1056 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1104 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1152 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1200 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1248 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1296 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1344 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 ggt aaa gga ggt ggc gga tcc ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt ggg 1392 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 tcc gga ggc ggt ggc tct ggg ggt ggc gga tct ggc gga ggc ggt tcc 1440 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 ggt ggg ggc ggc agt gga ggt ggc gga tct gaa gtg cag ctg gtg gag 1488 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 485 490 495 tct ggg gga ggc ctg gtg cag cct ggc gag tcc ctg aga ctg tcc tgt 1536 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys 500 505 510 gca gcc tct gga ttc acc ttt gat act tat gcc atg cac tgg gtc cgg 1584 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg 515 520 525 cag gct cca ggg aag tgc ctg gag tgg gtc gcc ggt att agt tgg aat 1632 Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Trp Asn 530 535 540 agt ggt aac atc ggc tat gcc gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc 1680 Ser Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 545 550 555 560 tcc aga gac aac tcc aag aac acc ctg tac ctg cag atg aac agt ctg 1728 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 565 570 575 aga gcc gag gac acc gcc gtg tat tac tgt gca aaa gac tgg gat aac 1776 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Trp Asp Asn 580 585 590 tgg aac ctg ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc 1824 Trp Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 595 600 605 tca gga ggc ggt ggt agc ggt ggg ggt ggc tct ggc gga ggt ggc tcc 1872 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 610 615 620 gac atc cag atg acc cag tct cct tcc tcc ctg tct gca tct gtg gga 1920 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 625 630 635 640 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt agc tgg 1968 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 645 650 655 ctg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctg ctg atc 2016 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 660 665 670 tat aag gcc tct agt ctg gaa agt ggg gtc cca tcc agg ttc agc ggc 2064 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 675 680 685 agt gga tct ggg aca gac ttc act ctg acc atc agc agc ctg cag cct 2112 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 690 695 700 gag gat ttt gca act tat tac tgc cag cag tat agt agt tat tcc tgg 2160 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Trp 705 710 715 720 acc ttc ggc tgc ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt tga 2199 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 725 730 <210> 2 <211> 732 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-human TLR2 heavy chain_anti-human TLR4 scFv fusion peptide of bispecific antibody <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Tyr Gly Arg Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Gly Gly Tyr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 485 490 495 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys 500 505 510 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg 515 520 525 Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Trp Asn 530 535 540 Ser Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 545 550 555 560 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 565 570 575 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Trp Asp Asn 580 585 590 Trp Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 595 600 605 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 610 615 620 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 625 630 635 640 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 645 650 655 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 660 665 670 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 675 680 685 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 690 695 700 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Trp 705 710 715 720 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 725 730 <210> 3 <211> 2199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-human TLR2 heavy chain_anti-human TLR4 scFv fusion peptide of bispecific antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(2199) <400> 3 gag gta cag ttg gtg gag agt gga ggc ggg ctg gtc caa cct ggt ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 agt ctt cgc ctt tct tgt gca gcc tct ggg ttt acc ttc tca aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 gcc atg tcc tgg gtg cgt cag gct ccc ggc aaa gga ctg gaa tgg gtt 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc gcc att tat gga cgg ggc ggt tac aca aac tac gca gat tcc gtc 192 Ala Ala Ile Tyr Gly Arg Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag gga agg ttc aca atc agc cga gac aat tcc aag aac acc ctc tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aat agc ctg aga gcc gag gac act gct gtg tac tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aaa gaa ggc ggt ggc tac agg gac tat ttt gat tat tgg ggc cag 336 Ala Lys Glu Gly Gly Gly Tyr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg acc ttg gtc acc gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc 384 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc 432 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 480 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc 528 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg ccc 576 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag 624 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 672 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gct ggg gga 720 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 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Claims (42)

  1. 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체:
    (1) 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체로서,
    1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 및
    2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 이중 특이적 항체; 또는
    (2) (1)의 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체인, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 이하의 (1) 또는 (2)로부터 선택되는 이중 특이적 항체:
    (1) 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하는 이중 특이적 항체로서,
    상기 항인간 TLR2 항체는 IgG 항체이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트는 단일쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv)이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중 특이적 항체; 또는
    (2) (1)의 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체인, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이중 특이적 항체는 항인간 TLR2 항체 및 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 포함하고,
    상기 항인간 TLR2 항체는 IgG 항체이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트는 scFv이며, 또한, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중 특이적 항체.
  4. 제2항에 있어서, 번역 후 수식이 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역 아미노 말단(N 말단)의 피로글루타밀화, 항인간 TLR2 항체의 중쇄 카르복시 말단(C 말단)의 리신 결실, 및/또는 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인 이중 특이적 항체.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함하는 이중 특이적 항체.
  6. 제5항에 있어서, 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A의 아미노산 변이 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인 이중 특이적 항체.
  7. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는 이중 특이적 항체.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역 및 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함하는 이중 특이적 항체.
  9. 제8항에 있어서, 인간 Igγ1 정상 영역이 L234A 및 L235A의 아미노산 변이 또는 L234A, L235A 및 I253A의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역인 이중 특이적 항체.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 이중 특이적 항체.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가 중쇄 가변 영역의 C 말단에 경쇄 가변 영역의 N 말단이 링커를 통해 연결된 구조를 갖는 scFv인 이중 특이적 항체.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인 이중 특이적 항체.
  13. 제2항 또는 제3항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv인 이중 특이적 항체.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 이중 특이적 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항인간 TLR2 항체의 중쇄와 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 연결하는 링커가 GS 링커로 이루어지는 이중 특이적 항체.
  16. 제15항에 있어서, GS 링커가 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 이중 특이적 항체.
  17. 제2항 또는 제3항에 있어서, 항인간 TLR2 항체가 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 450까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하고, 항인간 TLR4 항체 프래그먼트가 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 scFv이고, 상기 항인간 TLR2 항체의 각 중쇄의 C 말단에 상기 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 이중 특이적 항체.
  18. 제17항에 있어서, 항인간 TLR2 항체의 중쇄와 항인간 TLR4 항체 프래그먼트를 연결하는 링커가 GS 링커로 이루어지는 이중 특이적 항체.
  19. 제18항에 있어서, GS 링커가 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 이중 특이적 항체.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 이중 특이적 항체.
  21. 제1항에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역, 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및/또는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 중쇄의 C 말단에 항인간 TLR4 항체 프래그먼트의 N 말단이 링커를 통해 연결되어 있는 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 상기 융합체를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체의 항인간 TLR2 항체의 경쇄를 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  25. 제21항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  26. 제22항, 제23항, 및/또는 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  27. 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제25항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
    (a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (d) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  28. 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 제25항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포:
    (a) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드와 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (d) 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  29. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법:
    (a) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 120까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 4의 아미노산 번호 491부터 609까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 625부터 732까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 113까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  30. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하고, 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체를 생산하는 방법:
    (a) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드와 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제22항 또는 제23항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 제24항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  31. 제29항에 기재된 방법으로 생산된 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
  32. 제30항에 기재된 방법으로 생산된 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체.
  33. 제1항 내지 제20항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 의약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물인 의약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인 의약 조성물.
  36. 제1항 내지 제20항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 면역 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인 예방 또는 치료하는 방법.
  38. 제1항 내지 제20항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 이중 특이적 항체.
  39. 제38항에 있어서, 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인 이중 특이적 항체.
  40. 면역 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 제조에 있어서의 제1항 내지 제20항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이적 항체의 용도.
  41. 제40항에 있어서, 면역 염증성 질환이 패혈증 또는 급성 췌염인 이중 특이적 항체의 용도.
  42. 인간 TLR2 및 인간 TLR4에 결합하는 이중 특이적 항체로서,
    1) 서열 번호 4의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 99부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 24부터 39까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 55부터 61까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 94부터 102까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR2 항체의 경쇄 가변 영역; 및
    2) 서열 번호 4의 아미노산 번호 521부터 525까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 540부터 556까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 589부터 598까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR4 항체의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 648부터 658까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 674부터 680까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 713부터 721까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항인간 TLR4 항체의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 이중 특이적 항체.
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