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KR20160121510A - 유전자 발현 제어를 위한 인공 매치형 miRNA 및 그 용도 - Google Patents

유전자 발현 제어를 위한 인공 매치형 miRNA 및 그 용도 Download PDF

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KR20160121510A
KR20160121510A KR1020167020185A KR20167020185A KR20160121510A KR 20160121510 A KR20160121510 A KR 20160121510A KR 1020167020185 A KR1020167020185 A KR 1020167020185A KR 20167020185 A KR20167020185 A KR 20167020185A KR 20160121510 A KR20160121510 A KR 20160121510A
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신이치로 오노
에리코 아오키
야스히코 요시다
시오리 카토
타다아키 오기
Original Assignee
가부시키가이샤 보낙
도쿄 메디컬 유니버시티
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Abstract

본 발명은, miRNA 를 이용한 새로운 인공 매치형 miRNA 를 제공한다.
X 영역과 Y 영역을 갖는 단일 가닥 핵산으로, 상기 X 영역의 3' 말단과 상기 Y 영역의 5' 말단이 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역을 통해서 연결되고, 상기 X 영역은 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함하고, 상기 Y 영역은 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함하는 단일 가닥 핵산을, 인공 매치형 miRNA 로 한다. 이 인공 매치형 miRNA 에 의하면, 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

Description

유전자 발현 제어를 위한 인공 매치형 miRNA 및 그 용도{ARTIFICIAL MATCH-TYPE MIRNA FOR CONTROLLING GENE EXPRESSION AND USE THEREFOR}
본 발명은 유전자 발현을 억제하는 인공 매치형 miRNA 및 그 용도에 관한 것이다.
마이크로 RNA (miRNA) 는 유전자의 발현을 억제하는 핵산 분자로서 알려져 있고, 예를 들어, 다음과 같은 생성 프로세스를 거쳐, 유전자가 코드하는 단백질의 전사를 억제하는 것으로 보고되어 있다. 즉, 먼저 핵 내에 있어서, 5' 말단에 캡 구조, 3' 말단에 폴리 (A) 를 갖는 miRNA 전사 산물 (Pri-miRNA) 이 생성된다. 상기 Pri-miRNA 는, RNase (Drosha) 에 의해 절단되어, miRNA 전구체 (Pre-miRNA) 가 생성된다. 상기 Pre-miRNA 는, 루프 영역과 스템 영역을 갖는 헤어핀 구조를 취한다. 이 Pre-miRNA 는 핵 외로 이동한 후, 세포질의 RNase (Dicer) 에 의해 분해되어, 3' 말단에 1∼4 염기의 오버행을 갖는, 이중 가닥의 miRNA (성숙 miRNA) 가 잘려진다. 이 이중 가닥의 miRNA 중 일방의 가닥은 가이드 가닥이라고 불리우고, 타방의 가닥은 패신저 가닥이라고 불리우며, 상기 가이드 가닥이 RNA induced Silencing Complex (RISC) 와 유사한 복합체에 결합한다. 이 miRNA/RISC 복합체가 특정 mRNA 의 3' 비번역 영역 (3' UTR) 에 결합함으로써, 상기 mRNA 로부터의 단백질의 번역이 억제된다.
miRNA 는, 분화, 세포 증식, 아폽토시스 등의 생명 현상이나 바이러스 감염증, 암 등의 많은 질환에 깊게 관계하고 있음이 밝혀지고 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 이점에서, 특히 의료 분야에 있어서의 응용이 기대되고 있다.
특허문헌 1 : WO2010/056737 A2
비특허문헌 1 : Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60 비특허문헌 2 : Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
상기 miRNA 를 응용하는 데 있어서는, 예를 들어, 이중 가닥의 성숙 miRNA 를 사용하는 방법 등이 있다. 그러나 이 방법은, 사용에 앞서 2 개의 단일 가닥 핵산 분자를 어닐링할 필요가 있고, 또한 이중 가닥을 인식하는 TLR3 등에 의해서 자기 면역을 발생할 가능성이 있다.
그래서 본 발명은, miRNA 를 이용한 새로운 인공 매치형 miRNA 의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는,
X 영역과 Y 영역을 갖는 단일 가닥 핵산으로,
상기 X 영역의 3' 말단과 상기 Y 영역의 5' 말단이 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역을 통해서 연결되고,
상기 X 영역은, 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함하고,
상기 Y 영역은, 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물로서, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 억제 방법은 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 질환의 치료 방법은, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상기 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 가이드 가닥 배열이, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 용이하게 저비용으로 합성할 수 있으며, 또한 상기 유전자가 코드하는 단백질의 번역의 억제가 가능하다.
도 1 은, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 2 는, 본 발명의 실시예 1 에 있어서의 웰 당 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 3 은, 본 발명의 실시예 1 에 있어서의 세포 증식의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 4 는, 본 발명의 실시예 1 에 있어서의 아폽토시스의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5 는, 본 발명의 실시예 1 에 있어서의 AXL mRNA 양 및 MET mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 6 은, 본 발명의 실시예 2 에 있어서의 AXL mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 7 은, 본 발명의 실시예 2 에 있어서의 MET mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 8 은, 본 발명의 실시예 3 에 있어서의 AXL mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 9 는, 본 발명의 실시예 3 에 있어서의 MET mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 10 은, 본 발명의 실시예 4 에 있어서의 HMGA2 mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 11 은, 본 발명의 실시예 5 에 있어서의 COLA1 mRNA 양의 상대값을 나타내는 그래프이다.
본 명세서에서 사용하는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 의미로 사용할 수 있다.
(1) 인공 매치형 miRNA
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 전술한 바와 같이,
X 영역과 Y 영역을 갖는 단일 가닥 핵산으로,
상기 X 영역의 3' 말단과 상기 Y 영역의 5' 말단이 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역을 통해서 연결되고,
상기 X 영역은 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함하고,
상기 Y 영역은 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 발현 억제란, 예를 들어, 상기 표적 유전자의 번역의 억제, 즉 상기 표적 유전자가 코드하는 단백질의 번역의 억제를 의미하고, 보다 상세하게는, 상기 표적 유전자의 mRNA 로부터의 상기 단백질의 번역의 억제를 의미한다. 상기 표적 유전자의 발현 억제는, 예를 들어, 상기 표적 유전자로부터의 전사 산물의 생성량 감소, 상기 전사 산물의 활성 감소, 상기 표적 유전자로부터의 번역 산물의 생성량 감소, 또는 상기 번역 산물의 활성 감소 등에 의해서 확인할 수 있다. 상기 단백질은, 예를 들어, 성숙 단백질, 또는 프로세싱 혹은 번역 후 수식을 받기 전의 전구체 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는 단일 가닥의 핵산 분자이기 때문에, 예를 들어, 성숙 miRNA 와 같이 2 개의 단일 가닥을 어닐링할 필요도 없고, 저렴하게 제조할 수 있다. 그리고, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는 단일 가닥의 핵산 분자이기 때문에, 예를 들어, 자기 면역에 관여하는 TLR3, RIG-I, MDA5 등에 인식되는 것도 회피할 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 X 영역 및 상기 Y 영역의 배치 관계의 개략을, 도 1 에 나타낸다. 또, 도 1 은 개략으로서, 예를 들어, 각 영역의 길이, 형상 등은 제한되지 않는다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 5' 측에 상기 X 영역이 배치되고, 3' 측에 상기 Y 영역이 배치되고, 상기 X 영역의 3' 말단과 상기 Y 영역의 5' 말단이 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역 (도면에 있어서 「P」로 나타낸다) 을 통해서 연결되어 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 Y 영역은, 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함하기 때문에, 상기 X 영역과 상기 Y 영역은, 예를 들어, 분자 내 어닐링한다. 분자 내 어닐링이란, 예를 들어 자기(自己)어닐링이라고도 한다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 상기 분자 내 어닐링한 영역에 있어서, 이중 가닥이 형성된다고도 한다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 그 5' 말단과 3' 말단이 미연결인, 선상 (線狀) 단일 가닥 핵산 분자라고 할 수도 있다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어, 양 말단의 미결합의 유지를 위해, 5' 말단이 비인산기인 것이 바람직하다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 X 영역은 전술한 바와 같이, 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함한다. 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열은, 예를 들어, 각종 데이터 베이스에 등록되어 있다 (예를 들어, http://www.mirbase.org/ 등). 따라서, 예를 들어 이들 공지된 성숙 miRNA 의 정보에 기초하여, 상기 X 영역을 설정할 수 있다. 상기 성숙 miRNA 의 가이드 가닥이란, RNA-induced silencing Complex (RISC) 의 Argonaute (Ago) 단백질에 도입되어, 타깃의 mRNA 에 결합하는 사슬이다.
상기 X 영역은, 예를 들어, 상기 가이드 가닥 배열만으로 이루어져도 되고, 추가로 부가 배열을 가져도 된다. 후자의 경우, 상기 X 영역은, 예를 들어, 상기 가이드 가닥 배열과 상기 부가 배열로 이루어지고, 상기 부가 배열은, 예를 들어, 상기 가이드 가닥 배열의 3' 말단에 연결되어 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 Y 영역은, 상기 X 영역과 상기 Y 영역을 얼라인먼트했을 때, 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함한다. 상기 Y 영역은, 예를 들어, 상기 X 영역과 완전히 상보적인 배열만으로 이루어져 있어도 되고, 상기 상보적인 배열 외에, 추가로 오버행을 가져도 된다. 즉, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어, 상기 Y 영역과 상기 X 영역을 얼라인먼트했을 때에, 상기 Y 영역이 3' 말단에 오버행을 가져도 된다. 여기서, 상기 Y 영역의 오버행이란, 예를 들어, 상기 Y 영역과 상기 X 영역을 얼라인먼트한 경우에, 상기 Y 영역이 상기 X 영역보다 과잉으로 갖는 말단의 염기이다. 오버행의 길이 (O) 는, 예를 들어 하기 식으로 나타낼 수 있다.
오버행의 길이 (O) = [Y 영역의 전체 길이의 염기수 (Y)] － [X 영역의 전체 길이의 염기수 (X)]
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 각 영역의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 이하에 조건을 예시하지만, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 이들 기재에는 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 염기의 수치 범위는, 그 범위에 속하는 양의 정수를 모두 개시하는 것으로, 예를 들어 「1∼4 염기」라는 기재는, 「1, 2, 3, 4 염기」의 모든 개시를 의미한다 (이하, 동일).
상기 X 영역에 있어서, 상기 가이드 가닥 배열의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 보고되어 있는 성숙 miRNA 에 있어서의 가이드 가닥 배열의 길이를 예시할 수 있다. 구체예로서, 하한이, 예를 들어, 19 염기 길이, 20 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 25 염기 길이, 24 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어, 19∼25 염기 길이, 20∼24 염기 길이이다.
상기 X 영역에 있어서의 상기 부가 배열의 길이는 특별히 제한되지 않고, 하한이, 예를 들어, 0 염기 길이, 1 염기 길이, 2 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 5 염기 길이, 4 염기 길이, 3 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어 0∼5 염기 길이, 1∼5 염기 길이, 1∼4 염기 길이, 2∼3 염기 길이, 3∼5 염기 길이이다.
상기 X 영역의 길이는 특별히 제한되지 않고, 하한이, 예를 들어, 19 염기 길이, 21 염기 길이, 23 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 30 염기 길이, 28 염기 길이, 26 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어, 19∼30 염기 길이, 21∼28 염기 길이, 23∼26 염기 길이이다.
상기 Y 영역에 있어서의 상기 오버행의 길이는 특별히 제한되지 않고, 하한이, 예를 들어, 0 염기 길이, 1 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 4 염기 길이, 3 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어, 0∼4 염기 길이, 1∼3 염기 길이, 2 염기 길이이다.
상기 오버행의 배열은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 3' 측에서부터, UU, CU, GC, UA, AA, CC, UG, CG, AU, TT 등을 예시할 수 있다. 상기 오버행은, 예를 들어 TT 로 함으로써, RNA 분해 효소에 대한 내성을 부가할 수 있다.
상기 Y 영역의 길이는 특별히 제한되지 않고, 하한이, 예를 들어, 19 염기 길이, 21 염기 길이, 23 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 32 염기 길이, 30 염기 길이, 28 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어, 19∼32 염기 길이, 21∼30 염기 길이, 23∼28 염기 길이이다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 전체 길이 (T) 는 특별히 제한되지 않고, 하한이, 예를 들어, 38 염기 길이, 42 염기 길이, 46 염기 길이이고, 상한이, 예를 들어, 62 염기 길이, 58 염기 길이, 54 염기 길이이고, 범위가, 예를 들어, 38∼62 염기 길이, 42∼58 염기 길이, 46∼54 염기 길이이다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 성숙 miRNA 의 종류는 특별히 제한되지 않고, 표적으로 하는 유전자의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
상기 성숙 miRNA 로는, 예를 들어, hsa-miR-34a (배열 번호 1), hsa-let-7a (배열 번호 2), hsa-let-7f (배열 번호 3), hsa-miR-150 (배열 번호 4), hsa-miR-29b (배열 번호 5) 등의 성숙 miRNA 를 들 수 있다.
hsa-miR-34a (배열 번호 1)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
hsa-let-7a (배열 번호 2)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
hsa-let-7f (배열 번호 3)
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
hsa-miR-150 (배열 번호 4)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
hsa-miR-29b (배열 번호 5)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
여기서, 각 배열 번호로 나타내는 뉴클레오티드 배열은, 가이드 가닥 배열을 나타낸다.
miR-34a 의 가이드 가닥은, 예를 들어, AXL, MET, CDK4, CDK6, SIRT1, CCND1, SIRT1, BCL-2 등을 타깃으로 하고, 이들 표적 유전자의 발현 억제에 의해, 예를 들어, 폐암, 대장암, 위암, 간암, 유방암 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
let-7a 의 가이드 가닥은, 예를 들어, HMGA2 (high mobility group AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 등을 타깃으로 하고, 이러한 표적 유전자들의 발현 억제에 의해, 예를 들어, 폐암, 대장암, 위암, 간암, 유방암 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
let-7f 의 가이드 가닥은, 예를 들어, HMGA2 (high mobility group AT-hook 2), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 등을 타깃으로 하고, 이러한 표적 유전자들의 발현 억제에 의해, 예를 들어, 폐암, 대장암, 위암, 간암, 유방암 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
miR-150 의 가이드 가닥은, 예를 들어, COL1A1, COL4A4, SMAD2, SP1 등을 타깃으로 하고, 이러한 표적 유전자들의 발현 억제에 의해, 예를 들어, 폐섬유증, 간섬유증 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
miR-29b 의 가이드 가닥은, 예를 들어, COL1A1, MCL1, DNMT3A, DNMT3B, TCL1A, TGFb3 등을 타깃으로 하고, 이러한 표적 유전자들의 발현 억제에 의해, 예를 들어, 폐암, 대장암, 위암, 간암, 유방암, 폐섬유증, 간섬유증 등의 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 구성 단위는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 뉴클레오티드 잔기를 들 수 있다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 들 수 있다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 잔기가 바람직하다. 상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 수식되어 있지 않은 비수식 뉴클레오티드 잔기 및 수식된 수식 뉴클레오티드 잔기를 들 수 있다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어, 상기 수식 뉴클레오티드 잔기를 포함함으로써, 뉴클레아제 내성을 향상시키고, 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어 상기 뉴클레오티드 잔기 외에, 또한 비뉴클레오티드 잔기를 포함해도 된다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기 외에 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 「1 개 또는 수 개」이고, 구체적으로는, 예를 들어 1∼5 개, 바람직하게는 1∼4 개, 보다 바람직하게는 1∼3 개, 가장 바람직하게는 1 또는 2 개이다. 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기에 대한 상기 수식 리보뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 리보오스 잔기가 데옥시리보오스 잔기로 치환된 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기여도 된다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 가, 예를 들어, 상기 비수식 리보뉴클레오티드 잔기 외에 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 경우, 상기 데옥시리보뉴클레오티드 잔기의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 「1 또는 수 개」이고, 구체적으로는, 예를 들어, 1∼5 개, 바람직하게는 1∼4 개, 보다 바람직하게는 1∼3 개, 가장 바람직하게는 1 또는 2 개이다.
상기 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 구성 요소로서 당, 염기 및 인산을 포함한다. 상기 리보뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 당으로서 리보오스 잔기를 갖고, 염기로서 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 U (우라실) 을 갖고, 상기 데옥시리보오스 잔기는, 예를 들어, 당으로서 데옥시리보오스 잔기를 갖고, 염기로서, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T) 을 갖는다.
상기 비수식 뉴클레오티드 잔기는, 상기 각 구성 요소가, 예를 들어, 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하고, 구체적으로는, 예를 들어, 인체에 있어서 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하다.
상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 상기 미수식 뉴클레오티드 잔기의 구성 요소 중 어느 것이 수식되어도 된다. 상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 천연에 존재하는 뉴클레오티드 잔기, 인공적으로 수식한 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다.
상기 수식 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 상기 미수식 뉴클레오티드의 대체물의 잔기여도 된다. 상기 대체물은, 예를 들어, 인공 핵산 모노머 잔기를 들 수 있다. 구체예로서, 예를 들어, PNA (펩티드핵산), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다.
상기 뉴클레오티드 잔기에 있어서, 상기 염기는 특별히 제한되지 않는다. 상기 염기는, 예를 들어 천연의 염기여도 되고, 비천연의 염기여도 된다. 상기 염기는, 예를 들어 천연 유래여도 되고, 합성품이어도 된다. 상기 염기는, 예를 들어, 일반적인 염기, 그 수식 아날로그 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역은, 아미노산 잔기, 폴리아민 잔기, 및 폴리카르복실산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 링커 영역은, 아미노산 잔기, 폴리아민 잔기, 및 폴리카르복실산 잔기 이외의 잔기를 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다. 예를 들어, 상기 링커 영역은, 폴리카르복실산 잔기, 테레프탈산 잔기 또는 아미노산 잔기 중 어느 것을 포함하는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 「폴리아민」은, 아미노기를 복수 (2 개, 또는 3 개 이상) 포함하는 임의의 화합물을 말한다. 상기 「아미노기」는 -NH2 기로 한정되지 않고, 이미노기 (-NH-) 도 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 폴리아민은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 1,4-디아미노벤젠, 1,3-디아미노벤젠, 1,2-디아미노벤젠 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리카르복실산」은, 카르복시기를 복수 (2 개, 또는 3 개 이상) 포함하는 임의의 화합물을 말한다. 본 발명에 있어서, 상기 폴리카르복실산은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 1,4-디카르복시벤젠 (테레프탈산), 1,3-디카르복시벤젠 (이소프탈산), 1,2-디카르복시벤젠 (프탈산) 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「아미노산」은, 후술하는 바와 같이, 분자 중에 아미노기 및 카르복시기를 각각 1 개 이상 포함하는 임의의 유기 화합물을 말한다. 상기 「아미노기」는, -NH2 기로 한정되지 않고, 이미노기 (-NH-) 도 포함한다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 아미노산 잔기는, 복수의 아미노산 잔기가 연결된 것이어도 된다. 또, 본 발명에 있어서, 복수의 아미노산 잔기가 연결된 아미노산 잔기란, 예를 들어, 펩티드 구조를 포함하는 잔기를 말한다. 보다 구체적으로는, 상기 복수의 아미노산 잔기가 연결된 아미노산 잔기는, 예를 들어, 후술하는 화학식 (I) 의 아미노산 잔기에 있어서, 후술하는 화학식 (Ia) 가 펩티드 (예를 들어, 글리신 이량체 또는 글리신 삼량체 등) 인 아미노산 잔기를 말한다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 아미노산 잔기는, 글리신 잔기, 테레프탈산아미드 잔기, 프롤린 잔기 또는 리신 잔기여도 된다. 또, 상기 아미노산 잔기는, 수식 아미노산 잔기 또는 아미노산의 유도체여도 된다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 링커 영역은, 예를 들어 하기 화학식 (I-0) 으로 나타낸다.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 화학식 (I-0) 중,
Q11 및 Q12 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2 (메틸렌기), NH (이미노기), C=O (카르보닐기), C=S (티오카르보닐기), C=NH (이미노메틸렌기), O, 또는 S 이고,
Q1 및 Q2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2 (메틸렌기), NH (이미노기), C=O (카르보닐기), C=S (티오카르보닐기), C=NH (이미노메틸렌기), O, 또는 S 이고,
Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이고 ;
L1 은, n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
단, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
L2 는, m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
단, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고 ;
m 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
n 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
상기 X 영역 및 상기 Y 영역은 각각, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 링커 잔기에 결합하고,
여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I-0) 이고,
A 는 임의의 원자단이다.
상기 X 영역 및 상기 Y 영역과, -OR1- 및 -OR2- 와의 결합의 조합은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 이하의 어느 것의 조건을 들 수 있다.
조건 (1)
상기 X 영역은 -OR2- 를 통해서, 상기 Y 영역은 -OR1- 을 통해서, 상기 식 (I) 의 구조와 결합한다.
조건 (2)
상기 X 영역은 -OR1- 을 통해서, 상기 Y 영역은 -OR2- 를 통해서, 상기 식 (I) 의 구조와 결합한다.
상기 화학식 (I-0) 에 있어서, 예를 들어, Q11 이 C=O (카르보닐기) 이고, Q1 이 NH (이미노기) 여도 된다. 또, 예를 들어, Q11 이 NH (이미노기) 이고, Q1 이 C=O (카르보닐기) 여도 된다. 또 예를 들어, Q12 가 C=O (카르보닐기) 이고, Q2 가 NH (이미노기) 여도 된다. 또, 예를 들어, Q12 가 NH (이미노기) 이고, Q2 가 C=O (카르보닐기) 여도 된다.
상기 화학식 (I-0) 중, Q11 및 Q12 는, 예를 들어, 각각 카르보닐기여도 된다. 이 경우에 있어서, Q1 및 Q2 가 각각 이미노기인 것이 바람직하다. 또한, 이 경우에 있어서, 하기 화학식 (Iα) 의 구조가 하기 화학식 (Iα2) 로 나타내는 것이 보다 바람직하다.
[화학식 2]
Figure pct00002
상기 화학식 (Iα2) 중,
R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다. R100 에 있어서의 상기 임의의 치환기로는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에 있어서 예시하는 후술하는 치환기를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 또한, 상기 화학식 (Iα2) 의 구조가 하기 화학식 (Iα3) 으로 나타내는 것이 더욱 바람직하다.
[화학식 3]
Figure pct00003
또, Q11 및 Q12 가 카르보닐기이고, 또한 Q1 및 Q2 가 이미노기인 경우, 상기 화학식 (I-0) 의 링커 잔기는 카르복실산아미드 잔기라고 할 수도 있지만, 카르복실산 잔기라고 할 수도 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 있어서의 「TPA」 구조는, 테레프탈산아미드 잔기라고 할 수도 있지만, 상기 화학식 (Iα3) 으로 나타내는 테레프탈산의 잔기라고 할 수도 있다.
상기 화학식 (I-0) 중, Q11 및 Q12 가 각각 이미노기여도 된다. 이 경우에 있어서, Q1 및 Q2 가 각각 카르보닐기인 것이 바람직하다. 또한, 이 경우에 있어서, 하기 화학식 (Iβ) 의 구조가, 하기 화학식 (Iβ2) 로 나타내는 것이 보다 바람직하다.
[화학식 4]
Figure pct00004
상기 화학식 (Iβ2) 중,
R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다. 구체적으로는, 예를 들어, 상기 화학식 (Iα2) 중의 R100 과 동일하다. 또한, 상기 화학식 (Iβ2) 의 구조가, 하기 화학식 (Iβ3) 으로 나타내는 것이 더욱 바람직하다.
[화학식 5]
Figure pct00005
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 링커 잔기가 아미노산 잔기인 경우, 상기 아미노산 잔기는, 예를 들어, 하기 화학식 (I) 로 나타낸다. 또, 하기 화학식 (I) 의 구조는, 상기 화학식 (I-0) 으로 나타내는 구조의 일례이다.
[화학식 6]
Figure pct00006
상기 식 (I) 중, 예를 들어, X1, X2, Y1, Y2, L1 및 L2 는 상기와 동일하다.
상기 microRNA 의 배열에 대한 상보적 배열은, 각각 -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 아미노산 잔기에 결합하고,
여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I) 이고,
A 는 임의의 원자단이고, 단, 하기 화학식 (Ia) 는 아미노산 또는 펩티드이다.
[화학식 7]
Figure pct00007
상기 화학식 (I), (Iα) 또는 (Ia) 중의 원자단 A 는, 예를 들어, 사슬식 원자단, 지환식 원자단, 방향족성 원자단, 헤테로 방향족성 원자단, 및 헤테로 지환식 원자단으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하고 있거나 포함하고 있지 않아도 된다. 상기 사슬식 원자단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 상기 지환식 원자단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬 등을 들 수 있다. 상기 방향족성 원자단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 축환계 아릴, 축환계 아릴알킬, 축환계 알킬아릴 등을 들 수 있다. 상기 헤테로 방향족성 원자단은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 축환계 헤테로아릴, 축환계 헤테로아릴알킬, 축환계 알킬헤테로아릴 등을 들 수 있다. 또한, 상기 화학식 (I), (Iα) 또는 (Ia) 중의 원자단 A 에 있어서, 상기 각 원자단은, 추가로 치환기 또는 보호기를 갖거나 갖고 있지 않아도 된다. 상기 치환기 또는 보호기는, 복수인 경우에는 동일하거나 상이해도 된다. 상기 치환기로는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에서 예시한 치환기를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에서 예시한 보호기와 동일하다.
본 발명에 있어서 「아미노산」은, 전술한 바와 같이, 분자 중에 아미노기 및 카르복시기를 각각 1 개 이상 포함하는 임의의 유기 화합물을 말한다. 상기 「아미노기」는, -NH2 기로 한정되지 않고, 이미노기 (-NH-) 도 포함한다. 예를 들어, 프롤린, 히드록시프롤린 등은, 분자 중에 -NH2 기를 포함하지 않고 이미노기 (-NH-) 를 포함하지만, 본 발명에 있어서의 「아미노산」의 정의에 포함된다. 본 발명에 있어서 상기 「아미노산」은, 후술하는 바와 같이, 천연 아미노산이어도 되고, 인공 아미노산이어도 된다. 예를 들어, 후술하는 화학식 (Ia2) 또는 (Ia3) 으로 나타내는 화합물도, 분자 중에 아미노기 및 카르복시기를 포함하기 때문에, 본 발명에 있어서의 「아미노산」의 정의에 포함된다. 따라서, 예를 들어 상기 화학식 (I) 에 있어서, 원자단 A 가 후술하는 화학식 (A2) 또는 화학식 (A2a) 로 나타내어지는 구조는, 본 발명에 있어서의 「아미노산 잔기」의 정의에 포함된다. 또한, 예를 들어, 후술하는 실시예에 있어서의 「TPA」 구조도, 본 발명에 있어서의 「아미노산 잔기」의 정의에 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서 「펩티드」는, 2 분자 이상의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 결합한 구조의 유기 화합물을 말한다. 상기 펩티드결합은 산 아미드 구조여도 되고, 산 이미드 구조여도 된다. 또한, 상기 화학식 (Ia) 로 나타내는 아미노산 또는 펩티드 분자 중에 아미노기가 복수 존재하는 경우에는, 상기 화학식 (Ia) 중에 명시하고 있는 아미노기는, 어느 아미노기여도 상관없다. 또, 상기 화학식 (Ia) 로 나타내는 아미노산 또는 펩티드 분자 중에 카르복시기가 복수 존재하는 경우에는, 상기 화학식 (Ia) 중에 명시하고 있는 카르복시기는, 어느 카르복시기여도 상관없다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 상기 아미노산 잔기에 있어서, 상기 아미노산은 예를 들어, 전술한 바와 같이 천연 아미노산이어도 되고, 인공 아미노산이어도 된다. 또, 본 발명에 있어서 「천연 아미노산」은, 천연에 존재하는 구조의 아미노산 또는 그 광학 이성체를 말한다. 상기 천연 아미노산의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 천연으로부터 추출해도 되고, 합성해도 된다. 또, 본 발명에 있어서 「인공 아미노산」은, 천연에 존재하지 않는 구조의 아미노산을 말한다. 즉, 상기 인공 아미노산은 아미노산 즉 아미노기를 포함하는 카르복실산 유도체 (분자 중에 아미노기 및 카르복시기를 각각 1 개 이상 포함하는 유기 화합물) 로서, 천연에 존재하지 않는 구조의 카르복실산 유도체를 말한다. 상기 인공 아미노산은, 예를 들어, 헤테로환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 상기 아미노산은, 예를 들어, 단백질을 구성하는 아미노산이어도 된다. 상기 아미노산은, 예를 들어, 글리신, α-알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 히드록시리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 프롤린, 4-히드록시프롤린, 트립토판, β-알라닌, 1-아미노-2-카르복시시클로펜탄, 아미노벤조산, 아미노피리딘카르복실산 및 하기 화학식 (Ia2) 로 나타내는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류여도 되고, 추가로 치환기 또는 보호기를 갖거나 갖고 있지 않아도 된다. 상기 치환기로는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에서 예시한 치환기를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에서 예시한 보호기와 동일하다. 또한, 상기 화학식 (Ia) 의 펩티드가 아닌 아미노산에, 광학 이성체, 기하 이성체, 입체 이성체 등의 이성체가 존재하는 경우에는, 어느 이성체여도 상관없다.
[화학식 8]
Figure pct00008
상기 화학식 (Ia2) 중,
R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다. R100 에 있어서의 상기 임의의 치환기로는, 예를 들어, 상기 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에서 예시한 치환기를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 또한, 상기 화학식 (Ia2) 의 구조는, 예를 들어, 하기 화학식 (Ia3) 이어도 된다.
[화학식 9]
Figure pct00009
또, 상기 화학식 (Ia) 의 구조가 상기 화학식 (Ia2) 인 경우, 상기 화학식 (I) 중의 원자단 A 의 구조는, 하기 화학식 (A2) 로 나타낸다. 하기 화학식 (A2) 중의 R100 은, 상기 화학식 (Ia2) 중의 R100 과 동일하다. 또한, 상기 화학식 (Ia) 의 구조가 상기 화학식 (Ia3) 인 경우, 상기 화학식 (I) 중의 원자단 A 의 구조는, 하기 화학식 (A2a) 로 나타낸다.
[화학식 10]
Figure pct00010
상기 화학식 (I) 의 구조는, 예를 들어, 하기 화학식 (I-1)∼(I-7) 을 예시할 수 있고, 하기 화학식 (I-1)∼(I-7) 에 있어서, n 및 m 은 상기 화학식 (I) 과 동일하다.
[화학식 11]
Figure pct00011
상기 화학식 (I-1)∼(I-7) 에 있어서, n 및 m 은 특별히 제한되지 않고, 전술한 바와 같다. 구체예로서, 상기 화학식 (I-1) 에 있어서 n=11 및 m=12, 또는, n=5 및 m=4 와, 상기 화학식 (I-4) 에 있어서 n=5 및 m=4 와, 상기 화학식 (I-6) 에 있어서 n=4 및 m=4 와, 상기 화학식 (1-7) 에 있어서 n=5 및 m=4 를 들 수 있다. 그 구조를, 하기 화학식 (I-1a), (I-1b) (I-4a), (I-6a) 및 (I-7a) 에 나타낸다.
[화학식 12]
Figure pct00012
또는, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 있어서, 상기 링커 영역은, 예를 들어, 하기 식 (II) 로 나타낸다.
[화학식 13]
Figure pct00013
상기 식 (II) 중, 예를 들어,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH 이고 ;
Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이고 ;
R3 은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6 에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고,
L1 은, n 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
단, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
L2 는, m 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
단, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고 ;
l 은 1 또는 2 이고 ;
m 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
n 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
환 A 는, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1 개의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 되고,
상기 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 되고,
상기 X 영역 및 상기 Y 영역은 각각, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 비뉴클레오티드 구조에 결합하고,
여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (II) 이다.
상기 식 (II) 중, X1 및 X2 는, 예를 들어 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH 이다. 상기 식 (II) 중에 있어, “X1 이 H2 이다”란, X1 이, X1 의 결합하는 탄소 원자와 함께 CH2 (메틸렌기) 를 형성하는 것을 의미한다. X2 에 대해서도 동일하다.
상기 식 (II) 중, Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이다.
상기 식 (II) 중, 환 A 에 있어서, l 은 1 또는 2 이다. l=1 인 경우, 환 A 는 5 원환이고, 예를 들어, 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들어, 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있고, 이들의 2 가의 구조를 예시할 수 있다. l=2 인 경우, 환 A 는 6 원환이고, 예를 들어 상기 피페리딘 골격이다. 환 A 는, 환 A 상의 C-2 이외의 1 개의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 된다. 또한, 환 A 는, 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 된다. 환 A 는, 예를 들어, L 형 및 D 형 중 어느 것이어도 된다.
상기 식 (II) 중, R3 은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6 에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이다. R 3이 상기 치환기인 경우, 치환기 R3 은, 1 이거나 복수여도 되고, 존재하지 않아도 되며, 복수인 경우, 동일하거나 상이해도 된다.
치환기 R3 은, 예를 들어, 할로겐, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4 또는 옥소기 (=O) 등이다.
R4 및 R5 는, 예를 들어 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고, 동일하거나 상이해도 된다. 상기 치환기는, 예를 들어, 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 이하, 동일하다. 치환기 R3 은, 이들 열거하는 치환기여도 된다.
상기 보호기는, 예를 들어, 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이고, 공지된 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기는, 예를 들어, 문헌 (J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973) 의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, tert-부틸디메틸실릴기 (TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기 (ACE), 트리이소프로필실릴옥시메틸기 (TOM), 1-(2-시아노에톡시)에틸기 (CEE), 2-시아노에톡시메틸기 (CEM) 및 톨릴술포닐에톡시메틸기 (TEM), 디메톡시트리틸기 (DMTr) 등을 들 수 있다. R3 이 OR4 인 경우, 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, TBDMS 기, ACE 기, TOM 기, CEE기, CEM 기 및 TEM 기 등을 들 수 있다. 이밖에도, 실릴 함유기도 들 수 있다. 이하, 동일하다.
상기 식 (II) 중, L1 은, n 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들어, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되어도 되고, 치환되어 있지 않아도 된다. 또는, L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 1 개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이어도 된다. 상기 폴리에테르 사슬은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜이다. 또, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 요컨대, 예를 들어, Y1 이 O 인 경우, 그 산소 원자와 L1 의 산소 원자는 인접하지 않고, OR1 의 산소 원자와 L1 의 산소 원자는 인접하지 않는다.
상기 식 (II) 중, L2 는, m 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이다. 상기 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들어, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되어도 되고, 치환되어 있지 않아도 된다. 또는, L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 1 개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이어도 된다. 또, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다. 요컨대, 예를 들어, Y2 가 O 인 경우, 그 산소 원자와 L2 의 산소 원자는 인접하지 않고, OR2 의 산소 원자와 L2 의 산소 원자는 인접하지 않는다.
L1 의 n 및 L2 의 m 은 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은 예를 들어 0 이고, 상한도 특별히 제한되지 않는다. n 및 m 은, 예를 들어, 상기 비뉴클레오티드 구조의 원하는 길이에 따라서 적절히 설정할 수 있다. n 및 m 은, 예를 들어, 제조 비용 및 수율 등의 면에서 각각 0∼30 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0∼20 이고, 더욱 바람직하게는 0∼15 이다. n 과 m 은 동일해도 되고 (n=m), 상이해도 된다. n＋m 은, 예를 들어 0∼30 이고, 바람직하게는 0∼20 이고, 보다 바람직하게는 0∼15 이다.
Ra, Rb, Rc 및 Rd 는, 예를 들어 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이다. 상기 치환기 및 상기 보호기는, 예를 들어 전술한 것과 동일하다.
상기 식 (II) 에 있어서, 수소 원자는, 예를 들어 각각 독립적으로, Cl, Br, F 및 I 등의 할로겐으로 치환되어도 된다.
상기 X 영역 및 상기 Y 영역은, 예를 들어, 각각 -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 비뉴클레오티드 구조에 결합한다. 여기서, R1 및 R2 는, 존재하거나 존재하지 않아도 된다. R1 및 R2가 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 식 (II) 의 구조이다. R1 및/또는 R2가 상기 뉴클레오티드 잔기인 경우, 상기 비뉴클레오티드 구조는, 예를 들어, 뉴클레오티드 잔기 R1 및/또는 R2 를 제외한 상기 식 (II) 의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기와, 상기 뉴클레오티드 잔기로 형성된다. R1 및/또는 R2 가 상기 식 (II) 의 구조인 경우, 상기 비뉴클레오티드 구조는, 예를 들어, 상기 식 (II) 의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기가 2 개 이상 연결된 구조가 된다. 상기 식 (II) 의 구조는, 예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개 포함해도 된다. 이와 같이, 상기 구조를 복수 포함하는 경우, 상기 (II) 의 구조는, 예를 들어 직접 연결되어도 되고, 상기 뉴클레오티드 잔기를 통해서 결합해도 된다. 한편, R1 및 R2 가 존재하지 않는 경우, 상기 비뉴클레오티드 구조는, 예를 들어 상기 식 (II) 의 구조로 이루어지는 상기 비뉴클레오티드 잔기만으로 형성된다.
상기 X 영역 및 상기 Y 영역과 -OR1- 및 -OR2- 와의 결합의 조합은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 이하의 어느 것의 조건을 들 수 있다.
조건 (1)
상기 X 영역은 -OR2- 를 통해서, 상기 Y 영역은 -OR1- 를 통해서, 상기 식 (II) 의 구조와 결합한다.
조건 (2)
상기 X 영역은 -OR1- 를 통해서, 상기 Y 영역은 -OR2- 를 통해서, 상기 식 (II) 의 구조와 결합한다.
상기 식 (II) 의 구조는, 예를 들어, 하기 식 (II-1)∼식 (II-9) 를 예시할 수 있고, 하기 식에 있어서, n 및 m 은 상기 식 (II) 와 동일하다. 하기 식에 있어서, q 는 0∼10 의 정수이다.
[화학식 14]
Figure pct00014
상기 식 (II-1)∼(II-9) 에 있어서, n, m 및 q 는 특별히 제한되지 않고, 전술한 바와 같다. 구체예로서, 상기 식 (II-1) 에 있어서 n=8, 상기 (II-2) 에 있어서 n=3, 상기 식 (II-3) 에 있어서 n=4 또는 8, 상기 (II-4) 에 있어서 n=7 또는 8, 상기 식 (II-5) 에 있어서 n=3 및 m=4, 상기 (II-6) 에 있어서 n=8 및 m=4, 상기 식 (II-7) 에 있어서 n=8 및 m=4, 상기 (II-8) 에 있어서, n=5 및 m=4, 상기 식 (II-9) 에 있어서 q=1 및 m=4 를 들 수 있다. 상기 식 (II-4) 의 일례 (n=8) 를 하기 식 (II-4a) 에, 상기 식 (II-8) 의 일례 (n=5, m=4) 를 하기 식 (II-8a) 에 나타낸다.
[화학식 15]
Figure pct00015
본 발명에 있어서 「알킬」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분지상의 알킬기를 포함한다. 상기 알킬의 탄소수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 1∼30 이고, 바람직하게는 1∼6 이고, 보다 바람직하게는 1∼4 이다. 상기 알킬기는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「알케닐」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분지상의 알케닐을 포함한다. 상기 알케닐은, 상기 알킬에 있어서, 1 개 또는 복수의 이중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알케닐의 탄소수는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 알킬과 동일하고, 바람직하게는 2∼8 이다. 상기 알케닐은, 예를 들어, 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐, 3-메틸-2-부테닐 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「알키닐」은, 예를 들어, 직쇄상 또는 분지상의 알키닐을 포함한다. 상기 알키닐은, 상기 알킬에 있어서, 1 개 또는 복수의 삼중 결합을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 알키닐의 탄소수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상기 알킬과 동일하며, 바람직하게는 2∼8 이다. 상기 알키닐은, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, 부티닐 등을 들 수 있다. 상기 알키닐은, 예를 들어, 추가로 1 개 또는 복수의 이중 결합을 가져도 된다.
본 발명에 있어서 「아릴」은, 예를 들어, 단환 방향족 탄화수소기 및 다환 방향족 탄화수소기를 포함한다. 상기 단환 방향족 탄화수소기는, 예를 들어, 페닐 등을 들 수 있다. 상기 다환 방향족 탄화수소기는, 예를 들어, 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴, 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트릴, 2-페난트릴, 3-페난트릴, 4-페난트릴, 9-페난트릴 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 페닐, 1-나프틸 및 2-나프틸 등의 나프틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「헤테로아릴」은, 예를 들어, 단환 방향족 복소환식기 및 축합 방향족 복소환식기를 포함한다. 상기 헤테로아릴은, 예를 들어, 푸릴 (예 : 2-푸릴, 3-푸릴), 티에닐 (예 : 2-티에닐, 3-티에닐), 피롤릴 (예 : 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴), 이미다졸릴 (예 : 1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴), 피라졸릴 (예 : 1-피라졸릴, 3-피라졸릴, 4-피라졸릴), 트리아졸릴 (예 : 1,2,4-트리아졸-1-일, 1,2,4-트리아졸-3-일, 1,2,4-트리아졸-4-일), 테트라졸릴 (예 : 1-테트라졸릴, 2-테트라졸릴, 5-테트라졸릴), 옥사졸릴 (예 : 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴), 이속사졸릴 (예 : 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴), 티아졸릴 (예 : 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴), 티아디아졸릴, 이소티아졸릴 (예 : 3-이소티아졸릴, 4-이소티아졸릴, 5-이소티아졸릴), 피리딜 (예 : 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜), 피리다지닐 (예 : 3-피리다지닐, 4-피리다지닐), 피리미디닐 (예 : 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐), 푸라자닐 (예 : 3-푸라자닐), 피라지닐 (예 : 2-피라지닐), 옥사디아졸릴 (예 : 1,3,4-옥사디아졸-2-일), 벤조푸릴 (예 : 2-벤조[b]푸릴, 3-벤조[b]푸릴, 4-벤조[b]푸릴, 5-벤조[b]푸릴, 6-벤조[b]푸릴, 7-벤조[b]푸릴), 벤조티에닐 (예 : 2-벤조[b]티에닐, 3-벤조[b]티에닐, 4-벤조[b]티에닐, 5-벤조[b]티에닐, 6-벤조[b]티에닐, 7-벤조[b]티에닐), 벤즈이미다졸릴 (예 : 1-벤즈이미다졸릴, 2-벤즈이미다졸릴, 4-벤즈이미다졸릴, 5-벤즈이미다졸릴), 디벤조푸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 퀴녹살리닐 (예 : 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 6-퀴녹살리닐), 신놀리닐 (예 : 3-신놀리닐, 4-신놀리닐, 5-신놀리닐, 6-신놀리닐, 7-신놀리닐, 8-신놀리닐), 퀴나졸리닐 (예 : 2-퀴나졸리닐, 4-퀴나졸리닐, 5-퀴나졸리닐, 6-퀴나졸리닐, 7-퀴나졸리닐, 8-퀴나졸리닐), 퀴놀릴 (예 : 2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴), 프탈라지닐 (예 : 1-프탈라지닐, 5-프탈라지닐, 6-프탈라지닐), 이소퀴놀릴 (예 : 1-이소퀴놀릴, 3-이소퀴놀릴, 4-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 6-이소퀴놀릴, 7-이소퀴놀릴, 8-이소퀴놀릴), 푸릴, 프테리디닐 (예 : 2-프테리디닐, 4-프테리디닐, 6-프테리디닐, 7-프테리디닐), 카르바졸릴, 페난트리디닐, 아크리디닐 (예 : 1-아크리디닐, 2-아크리디닐, 3-아크리디닐, 4-아크리디닐, 9-아크리디닐), 인돌릴 (예 : 1-인돌릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴), 이소인돌릴, 페나지닐 (예 : 1-페나지닐, 2-페나지닐) 또는 페노티아지닐 (예 : 1-페노티아지닐, 2-페노티아지닐, 3-페노티아지닐, 4-페노티아지닐) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「시클로알킬」은, 예를 들어, 환상 포화 탄화수소기이고, 탄소수는, 예를 들어 3∼15 이다. 상기 시클로알킬은, 예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 가교 환식 탄화수소기, 스피로탄화수소기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 가교 환식 탄화수소기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「가교 환식 탄화수소기」는, 예를 들어, 비시클로[2.1.0]펜틸, 비시클로[2.2.1]헵틸, 비시클로[2.2.2]옥틸 및 비시클로[3.2.1]옥틸, 트리시클로[2.2.1.0]헵틸, 비시클로[3.3.1]노난, 1-아다만틸, 2-아다만틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「스피로탄화수소기」는, 예를 들어, 스피로[3.4]옥틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「시클로알케닐」은, 예를 들어, 환상의 불포화 지방족 탄화수소기를 포함하고, 탄소수는, 예를 들어 3∼7 개이다. 상기 시클로알케닐은, 예를 들어, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등이다. 상기 시클로알케닐은, 예를 들어 고리 중에 불포화 결합을 갖는 가교 환식 탄화수소기 및 스피로탄화수소기도 포함한다.
본 발명에 있어서 「아릴알킬」은, 예를 들어, 벤질, 2-페네틸, 및 나프탈레닐메틸 등을 들 수 있고, 「시클로알킬알킬」 또는 「시클릴알킬」은, 예를 들어, 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸 등을 들 수 있고, 「히드록시알킬」은, 예를 들어, 히드록시메틸 및 2-히드록시에틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「알콕시」는, 예를 들어 상기 알킬-O- 기를 포함하고, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 n-부톡시 등을 들 수 있으며, 「알콕시알킬」은, 예를 들어 메톡시메틸 등을 들 수 있고, 「아미노알킬」은, 예를 들어 2-아미노에틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「헤테로시클릴」은, 예를 들어, 1-피롤리닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, 3-피롤리디닐, 피롤리디논, 1-이미다졸리닐, 2-이미다졸리닐, 4-이미다졸리닐, 1-이미다졸리디닐, 2-이미다졸리디닐, 4-이미다졸리디닐, 이미다졸리디논, 1-피라졸리닐, 3-피라졸리닐, 4-피라졸리닐, 1-피라졸리디닐, 3-피라졸리디닐, 4-피라졸리디닐, 피페리디논, 피페리디노, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-피페리디닐, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 피페라지논, 2-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 모르폴리노, 테트라히드로피라닐, 및 테트라히드로푸라닐 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「헤테로시클릴알킬」은, 예를 들어, 피페리디닐메틸, 피페라지닐메틸 등을 들 수 있고, 「헤테로시클릴알케닐」은, 예를 들어 2-피페리디닐에테닐 등을 들 수 있고, 「헤테로아릴알킬」은, 예를 들어, 피리딜메틸 및 퀴놀린-3-일메틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「실릴」은, 화학식 R3Si- 로 나타내는 기를 포함하고, R 은 독립적으로, 상기 알킬, 아릴 및 시클로알킬로부터 선택할 수 있으며, 예를 들어, 트리메틸실릴기, tert-부틸디메틸실릴기 등을 들 수 있고, 「실릴옥시」는, 예를 들어 트리메틸실릴옥시기 등을 들 수 있고, 「실릴옥시알킬」은, 예를 들어 트리메틸실릴옥시메틸 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「알킬렌」은, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 및 프로필렌 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 전술한 각종 기는 치환되어도 된다. 상기 치환기는, 예를 들어, 히드록시, 카르복시, 술포, 할로겐, 할로겐화알킬 (할로알킬, 예 : CF3, CH2CF3, CH2CCl3), 니트로, 니트로소, 시아노, 알킬 (예 : 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸), 알케닐 (예 : 비닐), 알키닐 (예 : 에티닐), 시클로알킬 (예 : 시클로프로필, 아다만틸), 시클로알킬알킬 (예 : 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸), 시클로알케닐 (예 : 시클로프로페닐), 시클릴알킬, 히드록시알킬 (예 : 히드록시메틸, 히드록시에틸), 알콕시알킬 (예 : 메톡시메틸, 에톡시메틸, 에톡시에틸), 아릴 (예 : 페닐, 나프틸), 아릴알킬 (예 : 벤질, 페네틸), 알킬아릴 (예, p-메틸페닐), 헤테로아릴 (예 : 피리딜, 푸릴), 헤테로아릴알킬 (예 : 피리딜메틸), 헤테로시클릴 (예 : 피페리딜), 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬 (예 : 모르폴릴메틸), 알콕시 (예 : 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시), 할로겐화알콕시 (예 : OCF3), 알케닐옥시 (예 : 비닐옥시, 알릴옥시), 아릴옥시 (예 : 페닐옥시), 알킬옥시카르보닐 (예 : 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐), 아릴알킬옥시 (예 : 벤질옥시), 아미노 [알킬아미노 (예 : 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노), 아실아미노 (예 : 아세틸아미노, 벤조일아미노), 아릴알킬아미노 (예 : 벤질아미노, 트리틸아미노), 히드록시아미노], 아미노알킬 (예 : 아미노메틸), 알킬아미노알킬 (예 : 디에틸아미노메틸), 카르바모일, 술파모일, 옥소, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어 표지 물질을 포함하고, 상기 표지 물질로 표지화되어도 된다. 상기 표지 물질은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 형광 물질, 색소, 동위체 등을 들 수 있다. 상기 표지 물질은, 예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 색소, Cy5 색소 등의 형광단을 들 수 있고, 상기 색소는, 예를 들어 Alexa488 등의 Alexa 색소 등을 들 수 있다. 상기 동위체는, 예를 들어, 안정 동위체 및 방사성 동위체를 들 수 있고, 바람직하게는 안정 동위체이다. 또한, 상기 안정 동위체는, 예를 들어 표지한 화합물의 물성을 변화시키지 않고, 트레이서로서의 성질도 우수하다. 상기 안정 동위체는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S 및 36S 를 들 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 전술한 바와 같이, 상기 표적 유전자의 발현 억제를 할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어, 유전자가 원인이 되는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 가, 예를 들어, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 갖는 경우, 예를 들어, 상기 표적 유전자의 발현 억제에 의해 상기 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서 「치료」는, 예를 들어, 상기 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선의 의미를 포함하며, 어느 것이어도 된다. 상기 질환은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 목적하는 질환에 따라서 상기 발현 억제 배열을 적절히 설정할 수 있다. 상기 질환으로는, 예를 들어, 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 식도암, 전립선암, 담낭암, 자궁체암, 자궁경부암, 난소암, 골육종, 백혈병 등의 암, 폐섬유증, 간섬유증 등의 질환을 들 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 사용 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 표적 유전자를 갖는 투여 대상에 상기 인공 매치형 miRNA 를 투여하면 된다.
상기 투여 대상은, 예를 들어, 세포, 조직 또는 기관을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예를 들어, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물을 들 수 있다. 상기 투여는, 예를 들어, in vivo 거나 in vitro 여도 된다. 상기 세포는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, COS 세포 등의 각종 배양 세포, ES 세포, 조혈 줄기 세포 등의 줄기 세포, 초대 배양 세포 등의 생체로부터 단리한 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 상기 표적 유전자는 특별히 제한되지 않고, 원하는 유전자를 설정할 수 있다. 그리고, 전술한 바와 같이 상기 표적 유전자의 종류에 따라서 상기 성숙 miRNA 를 선택하면 된다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 사용에 관해서는, 후술하는 본 발명의 조성물, 발현 억제 방법 및 치료 방법 등의 기재를 참조할 수 있다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 점에서, 예를 들어, 의약품, 진단약 및 농약, 그리고 농학, 의학, 생명과학 등의 연구 툴로서 유용하다.
본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 합성 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지된 핵산의 제조 방법을 채용할 수 있다. 상기 합성 방법은, 예를 들어, 유전자 공학적 수법에 의한 합성법, 화학 합성법 등을 들 수 있다. 유전자 공학적 수법은, 예를 들어, 인비트로 전사 합성법, 벡터를 사용하는 방법, PCR 카세트에 의한 방법을 들 수 있다. 상기 벡터는 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 등의 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 상기 화학 합성법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 포스포라미다이트법 및 H-포스포네이트법 등을 들 수 있다. 상기 화학 합성법은, 예를 들어 시판되는 자동 핵산 합성기를 사용할 수 있다. 상기 화학 합성법은, 일반적으로, 아미다이트가 사용된다. 상기 아미다이트는 특별히 제한되지 않고, 시판되는 아미다이트로서, 예를 들어, RNA Phosphoramidites (2'-O-TBDMSi, 상품명, 삼천리 제약), ACE 아미다이트 및 TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 등을 들 수 있다.
(2) 조성물
본 발명의 발현 억제용 조성물은, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것이 특징이고, 그 밖의 구성은 하등 제한되지 않는다. 본 발명의 발현 억제용 조성물은, 예를 들어, 발현 억제용 시약이라고 할 수도 있다.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 상기 표적 유전자가 존재하는 대상에 투여함으로써, 상기 표적 유전자의 발현 억제를 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은, 전술한 바와 같이 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것이 특징이고, 그 밖의 구성은 하등 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어 의약품이라고 할 수도 있다.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 유전자가 원인이 되는 질환의 환자에게 투여함으로써 상기 유전자의 발현을 억제하여, 상기 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서 「치료」는, 전술한 바와 같이, 예를 들어 상기 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선의 의미를 포함하고, 어느 것이어도 된다.
본 발명에 있어서, 치료의 대상이 되는 질환은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 유전자의 발현이 원인이 되는 질환을 들 수 있다. 상기 질환의 종류에 따라서, 그 질환의 원인이 되는 유전자를 상기 표적 유전자에 설정하고, 또한, 상기 표적 유전자에 따라서 상기 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 선택하면 된다.
본 발명의 발현 억제용 조성물 및 약학적 조성물 (이하, 조성물이라고 한다) 은, 그 사용 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 상기 표적 유전자를 갖는 투여 대상에 상기 인공 매치형 miRNA 를 투여하면 된다.
상기 투여 대상은, 예를 들어, 세포, 조직 또는 기관을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예를 들어, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물을 들 수 있다. 상기 투여는, 예를 들어, in vivo 거나 in vitro 여도 된다. 상기 세포는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, COS 세포 등의 각종 배양 세포, ES 세포, 조혈 줄기 세포 등의 줄기 세포, 초대 배양 세포 등의 생체로부터 단리한 세포 등을 들 수 있다.
상기 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 투여 대상에 따라서 적절히 결정할 수 있다. 상기 투여 대상이 배양 세포인 경우, 예를 들어, 트랜스펙션 시약을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 만을 포함해도 되고, 추가로 그 밖의 첨가물을 포함해도 된다. 상기 첨가물은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 약학적으로 허용된 첨가물이 바람직하다. 상기 첨가물의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 투여 대상의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 인공 매치형 miRNA 는, 예를 들어 상기 첨가물과 복합체를 형성해도 된다. 상기 첨가물은, 예를 들어 복합화제라고 할 수도 있다. 상기 복합체 형성에 의해, 예를 들어, 상기 인공 매치형 miRNA 를 효율적으로 딜리버리할 수 있다.
상기 복합화제는 특별히 제한되지 않고, 폴리머, 시클로덱스트린, 아다만틴 등을 들 수 있다. 상기 시클로덱스트린은, 예를 들어, 선상 시클로덱스트린 코폴리머, 선상 산화 시클로덱스트린 코폴리머 등을 들 수 있다.
상기 첨가제는 이 밖에, 예를 들어 담체, 표적 세포에 대한 결합 물질, 축합제, 융합제, 부형제 등을 들 수 있다.
(3) 발현 억제 방법
본 발명의 발현 억제 방법은, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 발현 억제 방법은, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 사용하는 것이 특징이고, 그 밖의 공정 및 조건은 하등 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 억제 방법에 있어서, 상기 표적 유전자의 발현 억제의 메커니즘은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 성숙 miRNA 에 의한 발현 억제를 들 수 있다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예를 들어, 상기 표적 유전자가 존재하는 대상에 상기 인공 매치형 miRNA 를 투여하는 공정을 포함한다. 상기 투여 공정에 의해, 예를 들어, 상기 투여 대상에 상기 인공 매치형 miRNA 를 접촉시킨다. 상기 투여 대상은, 예를 들어, 세포, 조직 또는 기관을 들 수 있다. 상기 투여 대상은, 예를 들어, 인간, 인간을 제외한 비인간 포유류 등의 비인간 동물을 들 수 있다. 상기 투여는, 예를 들어, in vivo 거나 in vitro 여도 된다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예를 들어, 상기 인공 매치형 miRNA 를 단독으로 투여해도 되고, 상기 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 상기 본 발명의 조성물을 투여해도 된다. 상기 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 투여 대상의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
(4) 치료 방법
본 발명의 질환의 치료 방법은, 전술한 바와 같이 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상기 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 가이드 가닥 배열이, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 치료 방법은, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 사용하는 것이 특징으로서, 그 밖의 공정 및 조건은 하등 제한되지 않는다.
본 발명의 치료 방법은, 예를 들어, 상기 본 발명의 발현 억제 방법 등을 원용할 수 있다. 상기 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 경구 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 된다.
(5) 인공 매치형 miRNA 의 사용
본 발명의 사용은, 상기 표적 유전자의 발현 억제를 위한, 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 의 사용이다.
본 발명의 단일 가닥 핵산은, 질환의 치료에 사용하기 위한 단일 가닥 핵산으로서, 상기 단일 가닥 핵산은 상기 본 발명의 인공 매치형 miRNA 이고, 상기 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 가이드 가닥 배열이, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열인 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예 등에 의해 본 발명을 자세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
(실시예 1)
성숙 miR-34a 의 가이드 가닥에 기초하여, 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 합성하고, H1299 세포의 증식 억제를 확인하였다.
(1) miRNA 의 합성
포지티브 컨트롤의 miRNA 로서, 이하에 나타내는 가이드 가닥 (배열 번호 1) 및 패신저 가닥 (배열 번호 6) 으로 이루어지는 인간 성숙 miR-34a 를 합성하였다. 또한, 네거티브 컨트롤로서, 상기 가이드 가닥의 염기 조성을 스크램블로 한 가이드 가닥 스크램블 (배열 번호 7) 과 그에 대한 패신저 가닥 (배열 번호 8) 으로 이루어지는 성숙 miR-34a 스크램블을 합성하였다.
실시예의 인공 매치형 miRNA 로서, 상기 가이드 가닥 (배열 번호 1) 과 부가 배열로 이루어지는 X 영역과, 상기 X 영역에 완전히 상보적인 배열과 오버행으로 이루어지는 Y 영역이, 하기 식의 프롤린 유도체의 비뉴클레오티드 구조 (배열에 있어서 [P] 로 나타낸다) 를 통해서 연결되어 있는 매치형 miR-34a 를 합성하였다. 하기 배열에 있어서, 하선부가 상기 가이드 가닥에 대응한다. 상기 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 비뉴클레오티드 구조는 하기 식으로 나타내고, 상기 매치형 miRNA 의 합성에 있어서, L-프롤린디아미드아미다이트 (WO2012/017919 참조) 를 사용함으로써 도입하였다. 또한, 인공 매치형 miRNA 에 대한 네거티브 컨트롤로서, 상기 가이드 가닥의 염기 조성을 스크램블로 한 가이드 가닥과 그것에 대응하는 패신저 가닥으로 이루어지는 매치형 miR-34a 스크램블을 합성하였다.
[화학식 16]
Figure pct00016
이들 miRNA 의 배열 및 구조를 이하에 나타낸다. 하기에 있어서, 하선부로 나타내는 배열이 가이드 가닥에 상당한다.
성숙 miR-34a
가이드 가닥 (배열 번호 1)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3'
패신저 가닥 (배열 번호 6)
5'-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3'
성숙 miR-34a 스크램블
가이드 가닥 (배열 번호 7)
5'-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3'
패신저 가닥 (배열 번호 8)
5'-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3'
매치형 miR-34a (배열 번호 9)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCAUA-3'
매치형 miR-34a 스크램블 (배열 번호 10)
5'-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGUCC-[P]-GGACAACCGACCCGAUAACGAUACAUA-3'
[화학식 17]
Figure pct00017
(2) 폐암 유래 세포에 대한 인공 매치형 miRNA 의 영향
상기 인공 매치형 miRNA 를 인간 비소세포성 폐암 세포주 (NCI-H1299) 에 도입하여, 상기 세포에 대한 영향을 확인하였다.
(2-1) 트랜스펙션
상기 miRNA 를 주사용 증류수 (오오츠카 제약, 이하 동일) 로 용해하여, 100μ㏖/ℓ의 miRNA 용액을 조제하였다. 배지는 10％ FBS 를 함유하는 RPMI-1640 (Invitrogen) 을 사용하고, 배양 조건은 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
먼저, 세포를 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을 24웰 플레이트에, 500㎕ 씩, 1×104 세포/웰이 되도록 분주(分注)하였다. 그리고, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, 상기 miRNA 를 트랜스펙션 시약 RNAi MAX Transfection Reagent (상품명, Life Technologies 사) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션은, 상기 웰 당 조성을 아래와 같이 설정하였다. 하기 조성에 있어서, (B) 는 Opti-MEM (상품명, Invitrogen) 이고, (C) 는 상기 RNA 용액이고, 양자를 합하여 49㎕ 첨가하였다. 또, 상기 웰에 있어서, 상기 miRNA 의 최종 농도는 100n㏖/ℓ로 하였다. 트랜스펙션 후, 상기 웰 중의 세포를 3일간 배양하였다. 그리고, 상기 3일간의 배양 후, 배양 세포에 관해서 이하에 나타내는 확인을 실시하였다.
Figure pct00018
(2-2) 세포수의 카운트
배양 후의 배양 세포에 대해서, 웰 당 세포수를 카운트하였다. 이 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 는, 웰 당 세포수를 나타내는 그래프이다. 도 2 에 있어서, 「Normal」은 미처리 세포, 「Mock」는 트랜스펙션 시약만을 도입한 세포, 「Scramble」는 네거티브 컨트롤의 miR-34a 스크램블, 「miR-34a」는 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-34a, 「Scramble match」는 네거티브 컨트롤의 매치형 miR-34a 스크램블, 「miR-34a match」는 실시예의 매치형 miR-34a 의 결과를 나타낸다 (이하, 동일). 도 2 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 miR-34a 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-34a 와 같은 정도로 세포수를 감소시킬 수 있었다.
(2-3) MTT 어세이
배양 후의 배양 세포에 대해서, 시판되는 시약 키트 (상품명 Cell Count Reagent SF, 나카라이 테스크사) 를 사용해서 MTT 어세이를 실시하여, 세포 증식을 평가하였다. 세포 증식의 평가는, Normal (무처치) 의 결과를 1 로 하고, 상대값에 의해 나타내었다. 이 결과를 도 3 에 나타낸다. 도 3 은, 세포 증식의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 3 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 miR-34a 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-34a 와 같은 정도로 세포수를 감소시킬 수 있었다.
(2-4) 아폽토시스
배양 후의 배양 세포에 대해서, 시판되는 시약 키트 (상품명 Annexin V : PE Apoptosis Detection Kit, BD Biosciences 사) 를 사용하여 아폽토시스의 검출을 실시하였다. 이 결과를, 도 4 에 나타낸다. 도 4 는, 조기 아폽토시스 (％) 와 후기 아폽토시스 (％) 를 나타내는 그래프이다. 도 4 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 miR-34a 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-34a 와 같은 정도로 아폽토시스를 항진할 수 있었다.
(2-5) mRNA 의 발현 억제
배양 후의 배양 세포에 대해서, ISOGEN reagent (상품명, 닛폰 진) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 RNA 를 회수하였다.
다음으로, 역전사 효소 (상품명 M-MLV reverse transcriptase, Invitrogen) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 상기 RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 그리고, 합성한 상기 cDNA 를 주형으로 해서 정량 PCR 을 실시하여, AXL cDNA 의 양 및 MET cDNA 의 양을 측정하였다. 또한, GAPDH cDNA 를 내부 컨트롤로 하여, 그 cDNA 의 양을 아울러 측정하였다.
상기 정량 PCR 은, 시약으로서, FastStart Universal SYBR Green Master (상품명, Roche), 서모사이클러로서 MX3000P (상품명, Stratagene), 해석 기기로서 MxPro (상품명, Stratagene) 를 사용했다 (이하, 동일). 상기 AXL cDNA, 상기 MET cDNA 및 상기 GAPDH cDNA 의 증폭에는, 각각 하기 프라이머 세트를 사용하였다. 반응액의 전량은 25㎕ 로 하여, 각각 3 회 측정하였다.
AXL 프라이머 세트
5'-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3' (배열 번호 11)
5'-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3' (배열 번호 12)
MET 프라이머 세트
5'-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3' (배열 번호 13)
5'-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3' (배열 번호 14)
GAPDH 프라이머 세트
5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3' (배열 번호 15)
5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3' (배열 번호 16)
그리고, miRNA 미첨가의 컨트롤에 있어서의 AXL mRNA 또는 MET mRNA 를 1 로 한 경우에 있어서의, 각 트랜스펙션 세포에서의 AXL mRNA 및 MET mRNA 의 상대값을 산출하였다. 이들의 결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5(A) 는 AXL mRNA 의 결과, 도 5(B) 는 MET mRNA 의 결과이다.
도 5 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 miR-34a 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-34a 와 같은 정도로 AXL mRNA 의 양 및 MET mRNA 의 양이 감소하였다. 이 때문에, 상기 인공 매치형 miRNA 에 의해, AXL mRNA 및 MET mRNA 가 각각 코드하는 단백질의 전사도 억제되어 있다고 말할 수 있다.
이들 결과로부터, 실시예의 매치형 miR-34a 는 AXL mRNA 및 MET mRNA 등의 발현을 억제하여, H1299 세포의 증식 억제 및 아폽토시스의 항진을 가능하게 하는 것을 알 수 있었다.
상기 인공 매치형 miRNA 는, 이중 가닥의 성숙 miR-34a 와는 달리 단일 가닥의 핵산 분자이기 때문에, 사용시에 각 단일 가닥을 어닐링할 필요가 없고, 또한, 자연 면역에 관여하는 TLR3 등에 인식되는 것도 회피할 수 있다.
(실시예 2)
실시예 1 의 매치형 miR-34a 에 대해서, X 영역의 부가 배열 및 Y 영역의 오버행의 단축화를 실시하였다.
(1) miRNA 의 합성
이하에 나타내는 바와 같이, 매치형 miR-34a 는, X 영역의 3' 측에 사각으로 둘러싼 3 염기 길이의 부가 배열 (J) 을 갖고, Y 영역의 5' 측에 사각으로 둘러싼 2 염기 길이의 오버행 (O) 을 갖고 있다. 그래서, 상기 부가 배열을 3' 측에서부터 1 염기씩 결실시키고 또한 그것에 대응하는 Y 영역측의 배열을 5' 측에서부터 1 염기씩 결실시킨 분자, 오버행을 3' 측에서부터 1 염기씩 결실시킨 분자, 및, 상기 부가 배열과 오버행을 1 염기씩 결실시킨 분자를 합성하고, 상기 실시예 1 과 동일하게 하여 AXL mRNA 및 MET mRNA 의 발현 억제를 확인하였다. 하기 배열에 있어서, [P] 의 5' 측 영역이 X 영역이고, 상기 X 영역에 있어서 하선부는 상기 가이드 가닥 배열이고, 그 외의 것이 상기 부가 배열이고, [P] 의 3' 측 영역이 Y 영역이고, 상기 Y 영역에 있어서 사각으로 둘러싼 영역이 오버행이다.
[화학식 18]
Figure pct00019
[화학식 19]
Figure pct00020
이들 결과를 도 6 및 도 7 에 나타낸다. 도 6 은 AXL mRNA 의 결과이고, 도 7 은 MET mRNA 의 결과이다. 도 6 및 도 7 에 나타내는 바와 같이, 상기 X 영역에 있어서의 부가 배열 및 상기 Y 영역에 있어서의 오버행을 단축시켜도 발현 억제의 효과는 유지되었다.
(실시예 3)
매치형 miR-34a 에 대해서, 링커의 비뉴클레오티드 구조의 개변 및 X 영역의 부가 배열의 증감을 실시하여, AXL mRNA 및 MET RNA 의 발현 억제 효과를 조사하였다.
(1) miRNA 의 합성
이하에 나타내는 바와 같이, 실시예 1 의 매치형 miR-34a 로부터, 오버행 부분의 염기 배열을 개변한 매치형 miR-34a (PH-0039) 를 합성하였다. 그리고, PH-0039 의 부가 배열 및 그것에 대응하는 Y 영역측의 배열을 결실시킨 분자 (PH-0037), 부가 배열 및 그것에 대응하는 Y 영역측의 배열을 5 염기 길이로 연장한 분자 (PH-0093) 를 합성하였다.
또한, PH-0037, PH-0039 및 PH-0093 의 링커 영역을, 하기 식의 테레프탈산 유도체의 비뉴클레오티드 구조 (배열에 있어서 [TP] 로 나타낸다) 로 각각 치환한 분자 (XH-0016, XH-0025 및 XH-0027) 를 합성하였다. 그 비뉴클레오티드 구조는, 테레프탈산아미다이트 (WO2013/133221 참조) 를 사용함으로써 도입하였다.
[화학식 20]
Figure pct00021
또한, PH-0037 및 PH-0039 의 링커 영역을, 하기 식의 글리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조 (배열에 있어서 [Gly] 로 나타낸다) 로 각각 치환한 분자 (XH-0012 및 XH-0028),
[화학식 21]
Figure pct00022
PH-0037 및 PH-0039 의 링커 영역을, 하기 식의 글리실글리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조 (배열에 있어서 [GlyGly] 로 나타낸다) 로 각각 치환한 분자 (XH-0014 및 XH-0029),
[화학식 22]
Figure pct00023
상기 화학식 (G2) 중의 GlyGly 는 하기 화학식 (GlyGly) 로 나타내는 원자단이고, 단, 하기 화학식 (GlyGly) 중의 말단의 카르보닐 탄소는 상기 화학식 (G2) 중의 N 원자에 결합하고 있고, 하기 화학식 (GlyGly) 중의 말단의 질소 원자는 상기 화학식 (G2) 의 카르보닐 탄소에 결합하고 있다.
[화학식 23]
Figure pct00024
그리고, PH-0037 및 PH-0039 의 링커 영역을, 하기 식의 리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조 (배열에 있어서 [K] 로 나타낸다) 로 각각 치환한 분자 (KH-0007 및 KH-0011) 를 합성하였다.
[화학식 24]
Figure pct00025
상기 글리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조는 글리신아미드아미다이트 (WO2013/103146 참조) 를, 상기 글리실글리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조는 글리실글리신아미드아미다이트 (WO2013/133221 참조) 를, 리신 유도체의 비뉴클레오티드 구조는 L-리신아미드아미다이트 (WO2013/103146 참조) 를 각각 사용함으로써 도입하였다.
[화학식 25]
Figure pct00026
하기 배열에 있어서, 각 링커의 5' 측 영역이 X 영역이고, 상기 X 영역에 있어서, 하선부는 상기 가이드 가닥 배열이고, 그 외의 것이 상기 부가 배열이고, 각 링커의 3' 측 영역이 Y 영역이다.
PH-0037 (배열 번호 28)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
PH-0039 (배열 번호 29)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
PH-0093 (배열 번호 30)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0016 (배열 번호 28)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0025 (배열 번호 29)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0027 (배열 번호 30)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[TP]-CCGGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0012 (배열 번호 28)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0028 (배열 번호 29)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[Gly]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0014 (배열 번호 28)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
XH-0029 (배열 번호 29)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[GlyGly]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
KH-0007 (배열 번호 28)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
KH-0011 (배열 번호 29)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[K]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
또한, 네거티브 컨트롤로서, 핵산 데이터 베이스 상에서 등록되어 있는 모든 배열에 상보성을 갖지 않은 배열로 이루어지는 가이드 가닥과 그것에 대응하는 패신저 가닥으로 이루어지는 매치형 miRNA (PH-0000) 를 합성하였다.
PH-0000 (배열 번호 31)
5'-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-[P]-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3'
포지티브 컨트롤로서, 성숙 miR-34a 의 가이드 가닥과 패신저 가닥을 천연형 pre-miRNA 의 루프 부분으로 이은 분자 (NM-0004) 및 성숙 miRNA 의 가이드 가닥과 그것에 완전 상보적인 배열을 어닐링시킨 이중 가닥 매치형 RNA (NI-0209) 를 합성하였다.
[화학식 26]
Figure pct00027
NM-0004 (배열 번호 32)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3'
NI-0209
가이드 가닥 (배열 번호 1)/패신저 가닥 (배열 번호 33)
5'-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3'/5'-AACCAGCUAAGACACUGCCACU-3'
(2) AXL 유전자의 발현량의 측정
상기 각 RNA 를 4μ㏖/ℓ 가 되도록 주사용 증류수 (오오츠카 제약) 에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는 H1299 세포 (ATCC) 를 사용하였다. 배지는 10％ FBS 를 함유하는 RPMI Medium 1640 (Life Technologies) 를 사용하였다. 배양 조건은 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
먼저, 세포를 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을 24웰 플레이트에, 400㎕ 씩, 4×104 세포/웰이 되도록 분주하였다. 그리고, 상기 miRNA 를 트랜스펙션 시약 Lipofectamine RNA iMAX (Life Technologies) 를 사용하여, 상기 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라서 트랜스펙션하였다. 구체적으로는, 상기 웰 당 조성을 아래와 같이 설정하고, 트랜스펙션을 실시하였다. 하기 조성에 있어서, (B) 는 Opti-MEM (Life Technologies), (C) 는 0.4μ㏖/ℓ 및 2μ㏖/ℓ 상기 RNA 용액이고, 양자를 합하여 98.5㎕ 첨가하였다. 또, 상기 웰에 있어서, 상기 RNA 의 최종 농도는 2n㏖/ℓ 로 하였다.
Figure pct00028
트랜스펙션 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, RNeasy Mini Kit (Qiagen, 네덜란드) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 RNA 를 회수하였다. 다음으로, 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트 (Roche) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 상기 RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 그리고, 이하에 나타내는 바와 같이, 합성한 상기 cDNA 를 주형으로 해서 PCR 을 실시하여, AXL 및 MET 유전자의 발현량 및 내부 표준인 GAPDH 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 AXL 및 MET 유전자의 발현량은, 상기 GAPDH 유전자의 발현량에 의해 보정하였다.
상기 PCR 은, 시약으로서 LightCycler 480 SYBR Green I Master (상품명, Roche), 기기로서 LightCycler 480 Instrument II (상품명, Roche) 를 사용하였다 (이하, 동일). 상기 AXL, MET 및 GAPDH 유전자의 증폭에는, 각각 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
AXL 유전자용 PCR 프라이머 세트
(배열 번호 11) 5'-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3'
(배열 번호 12) 5'-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3'
MET 유전자용 PCR 프라이머 세트
(배열 번호 13) 5'-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3'
(배열 번호 14) 5'-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3'
GAPDH 유전자용 프라이머 세트
(배열 번호 15) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(배열 번호 16) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
또, 컨트롤 1 로서, 상기 배양액에 상기 (B) 액 100㎕ 만을 첨가한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (-). 또한, 컨트롤 2 로서, 트랜스펙션에 있어서, 상기 RNA 용액을 미첨가로 하고, 상기 (A) 1.5㎕ 와 상기 (B) 를 합계 100㎕ 첨가한 것 외에는 동일하게 하여 처리한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (mock).
보정 후의 AXL 및 MET 유전자의 발현량에 관해서, 컨트롤 (mock) 의 세포에 있어서의 발현량을 1 로 하여, 각 RNA 를 도입한 세포에서의 발현량의 상대값을 구했다.
(3) 결과
도 6 및 7 에 나타내는 바와 같이, 링커 영역의 비뉴클레오티드 구조를 개변하여도, 또한, X 영역의 부가 배열을 결실 또는 연장하여도, AXL mRNA 및 MET RNA 의 발현 억제 효과는 유지되었다.
(실시예 4)
성숙 let-7a 의 가이드 가닥에 기초하여, 각종 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 합성하여, 표적 유전자인 HMGA2 mRNA 의 발현 억제 효과를 조사하였다.
(1) miRNA 의 합성
포지티브 컨트롤로서, 성숙 let-7a 의 가이드 가닥 (배열 번호 2) 과 패신저 가닥 (배열 번호 34) 을 천연형 pre-let-7a 의 루프 부분으로 이은 분자 (NM-0003) 및 성숙 let-7a 의 가이드 가닥과 그것에 완전 상보적인 배열을 어닐링시킨 이중 가닥 매치형 RNA (NI-0207) 를 합성하였다.
[화학식 26]
Figure pct00029
하기 배열에 있어서, 하선부는 상기 가이드 가닥 배열을 나타낸다.
NM-0003 (배열 번호 35)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3'
NI-0207
가이드 가닥 (배열 번호 2)/패신저 가닥 (배열 번호 34)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'/5'-CUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
이하에 나타내는 바와 같이, 성숙 let-7a 의 가이드 가닥 배열 및 그 3' 측의 부가 배열 (0, 3 또는 5 염기 길이) 로 이루어지는 X 영역과, 그 X 영역에 완전 상보적이며, 또한 5' 측에 2 염기 길이의 오버행을 갖는 Y 영역 사이에, 실시예 3 과 동일하게, 프롤린 유도체 ([P]), 테레프탈산 유도체 ([TP]), 글리신 유도체 ([Gly]), 글리실글리신 유도체 ([GlyGly]) 및 리신 유도체 ([K]) 의 링커를 도입한, 각종 인공 매치형 let-7a 를 합성하였다.
[화학식 27]
Figure pct00030
하기 배열에 있어서, 각 링커의 5' 측 영역이 X 영역이고, 상기 X 영역에 있어서 하선부는 상기 가이드 가닥 배열이고, 그 외의 것이 상기 부가 배열이고, 각 링커의 3' 측 영역이 Y 영역이다.
PH-0013 (배열 번호 36)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
PH-0015 (배열 번호 37)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
PH-0094 (배열 번호 38)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[P]-CCGGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0010 (배열 번호 36)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0030 (배열 번호 37)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[TP]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0031 (배열 번호 38)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0008 (배열 번호 36)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0032 (배열 번호 37)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[Gly]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0009 (배열 번호 36)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
XH-0033 (배열 번호 37)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[GlyGly]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
KH-0005 (배열 번호 36)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
KH-0012 (배열 번호 37)
5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[K]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3'
또한, 네거티브 컨트롤로서, 실시예 3 에서 합성한 PH-0000 을 사용하였다.
(2) HMGA2 유전자의 발현량의 측정
상기 각 RNA 를, 0.4μ㏖/ℓ 가 되도록 주사용 증류수 (오오츠카 제약) 에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는, A549 세포 (DS 파머 바이오 메디컬) 를 사용하였다. 배지는 10％ FBS 를 함유하는 DMEM (Life Technologies) 를 사용하였다. 배양 조건은 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
먼저, 세포를 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을 24웰 플레이트에, 400㎕ 씩, 4×104 세포/웰이 되도록 분주하였다. 그리고, 상기 RNA 를 트랜스펙션 시약 Lipofectamine RNA iMAX (Life Technologies) 를 사용하여, 상기 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라서 트랜스펙션하였다. 구체적으로는, 상기 웰 당 조성을 아래와 같이 설정하고, 트랜스펙션을 실시하였다. 하기 조성에 있어서, (B) 는 Opti-MEM (Life Technologies), (C) 는 0.1μ㏖/ℓ 및 0.2μ㏖/ℓ 상기 RNA 용액이고, 양자를 합하여 98.5㎕ 첨가하였다. 또, 상기 웰에 있어서, 상기 RNA 의 최종 농도는 0.2n㏖/ℓ 로 하였다.
Figure pct00031
트랜스펙션 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, RNeasy Mini Kit (Qiagen, 네덜란드) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 RNA 를 회수하였다. 다음으로, 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트 (Roche) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 상기 RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 그리고, 이하에 나타내는 바와 같이, 합성한 상기 cDNA 를 주형으로 해서 PCR 을 실시하여, HMGA2 유전자의 발현량 및 내부 표준인 GAPDH 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 HMGA2 유전자의 발현량은, 상기 GAPDH 유전자의 발현량에 의해 보정하였다.
상기 PCR 은, 시약으로서 LightCycler 480 SYBR Green I Master (상품명, Roche), 기기로서 LightCycler 480 Instrument II (상품명, Roche) 를 사용하였다 (이하, 동일). 상기 HMGA2 유전자 및 GAPDH 유전자의 증폭에는, 각각 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
HMGA2 유전자용 PCR 프라이머 세트
(배열 번호 39) 5'-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3'
(배열 번호 40) 5'-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3'
GAPDH 유전자용 프라이머 세트
(배열 번호 15) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(배열 번호 16) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
또, 컨트롤 1 로서, 상기 배양액에 상기 (B) 액 100㎕ 만을 첨가한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (-). 또한, 컨트롤 2 로서, 트랜스펙션에 있어서, 상기 RNA 용액을 미첨가로 하고, 상기 (A) 1.5㎕ 와 상기 (B) 를 합계 100㎕ 첨가한 것 외에는 동일하게 하여 처리한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (mock).
보정 후의 HMGA2 유전자의 발현량에 관해서, 컨트롤 (mock) 의 세포에 있어서의 발현량을 1 로 하여, 각 RNA 를 도입한 세포에서의 발현량의 상대값을 구했다.
(3) 결과
도 10 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 let-7a 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 let-7a 나 이중 가닥 매치형 let-7a 와 같은 정도 또는 그 이상으로, HMGA2 mRNA 의 발현을 억제하였다. 또한, 링커 영역의 비뉴클레오티드 구조나, X 영역의 부가 배열의 염기 길이를 개변하여도, HMGA2 mRNA 의 발현 억제 효과는 유지되었다.
(실시예 5)
성숙 miR-29b 의 가이드 가닥에 기초하여, 각종 본 발명의 인공 매치형 miRNA 를 합성하여, 표적 유전자인 COLA1 mRNA 의 발현 억제 효과를 조사하였다.
(1) miRNA 의 합성
포지티브 컨트롤로서, 성숙 miR-29b 의 가이드 가닥 (배열 번호 5) 과 패신저 가닥 (배열 번호 41) 을 천연형 pre-miR-29b 의 루프 부분으로 이은 분자 (NM-0005) 및 성숙 miR-29b 의 가이드 가닥과 그것에 완전 상보적인 배열을 어닐링시킨 이중 가닥 매치형 RNA (NI-0211) 를 합성하였다.
[화학식 28]
Figure pct00032
하기 배열에 있어서, 하선부는 상기 가이드 가닥 배열을 나타낸다.
NM-0005 (배열 번호 42)
5'-GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGAUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
NI-0211
패신저 가닥 (배열 번호 41)/가이드 가닥 (배열 번호 5)
5'-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'/5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'
이하에 나타내는 바와 같이, 성숙 miR-29b 의 가이드 가닥 배열 및 그 3' 측의 부가 배열 (0, 3 또는 5 염기 길이) 로 이루어지는 X 영역과, 그 X 영역에 완전 상보적이고, 또한 5' 측에 2 염기 길이의 오버행을 갖는 Y 영역 사이에, 실시예 3 과 동일하게, 프롤린 유도체 ([P]), 테레프탈산 유도체 ([TP]), 글리신 유도체 ([Gly]), 글리실글리신 유도체 ([GlyGly]) 및 리신 유도체 ([K]) 의 링커를 도입한, 각종 인공 매치형 miR-29b 를 합성하였다.
[화학식 29]
Figure pct00033
하기 배열에 있어서, 각 링커의 5' 측 영역이 X 영역이고, 상기 X 영역에 있어서 하선부는 상기 가이드 가닥 배열이고, 그 외의 것이 상기 부가 배열이고, 각 링커의 3' 측 영역이 Y 영역이다.
PH-0071 (배열 번호 43)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[P]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
PH-0073 (배열 번호 44)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[P]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
PH-0095 (배열 번호 45)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCCGG-[P]-CCGGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA3'
XH-0034 (배열 번호 43)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[TP]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
XH-0035 (배열 번호 44)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[TP]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
XH-0036 (배열 번호 45)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA3'
XH-0037 (배열 번호 43)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[Gly]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
XH-0038 (배열 번호 44)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[Gly]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
XH-0039 (배열 번호 43)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[GlyGly]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
XH-0040 (배열 번호 44)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[GlyGly]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
KH-0013 (배열 번호 43)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[K]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
KH-0014 (배열 번호 44)
5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[K]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'
또한, 네거티브 컨트롤로서, 실시예 3 에서 합성한 PH-0000 을 사용하였다.
(2) COL1A1 유전자의 발현량의 측정
상기 각 RNA 를 1μ㏖/ℓ 가 되도록 주사용 증류수 (오오츠카 제약) 에 용해하여, RNA 용액을 조제하였다.
세포는, A549 세포 (DS 파머 바이오 메디컬) 를 사용하였다. 배지는 10％ FBS 를 함유하는 DMEM (Life Technologies) 를 사용하였다. 배양 조건은 37℃, 5％ CO2 하로 하였다.
먼저, 세포를 상기 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을 24웰 플레이트에, 400㎕ 씩, 4×104 세포/웰이 되도록 분주하였다. 그리고, 상기 RNA 를 트랜스펙션 시약 Lipofectamine RNA iMAX (Life Technologies) 를 사용하여, 상기 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라서 트랜스펙션하였다. 구체적으로는, 상기 웰 당 조성을 아래와 같이 설정하고, 트랜스펙션을 실시하였다. 하기 조성에 있어서, (B) 는 Opti-MEM (Life Technologies), (C) 는 0.4μ㏖/ℓ 및 2μ㏖/ℓ 상기 RNA 용액이고, 양자를 합하여 98.5㎕ 첨가하였다. 또, 상기 웰에 있어서, 상기 RNA 의 최종 농도는 0.5n㏖/ℓ 로 하였다.
Figure pct00034
트랜스펙션 후, 상기 웰 중의 세포를 24시간 배양한 후, RNeasy Mini Kit (Qiagen, 네덜란드) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 RNA 를 회수하였다. 다음으로, 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트 (Roche) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 상기 RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 그리고, 이하에 나타내는 바와 같이, 합성한 상기 cDNA 를 주형으로 해서 PCR 을 실시하여, COL1A1 유전자의 발현량 및 내부 표준인 GAPDH 유전자의 발현량을 측정하였다. 상기 COL1A1 유전자의 발현량은, 상기 GAPDH 유전자의 발현량에 의해 보정하였다.
상기 PCR 은, 시약으로서 LightCycler 480 SYBR Green I Master (상품명, Roche), 기기로서 LightCycler 480 Instrument II (상품명, Roche) 를 사용하였다 (이하, 동일). 상기 COL1A1 유전자 및 GAPDH 유전자의 증폭에는, 각각 이하의 프라이머 세트를 사용하였다.
COL1A1 유전자용 PCR 프라이머 세트
(배열 번호 46) 5'-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3'
(배열 번호 47) 5'-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3'
GAPDH 유전자용 프라이머 세트
(배열 번호 15) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(배열 번호 16) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
또, 컨트롤 1 로서, 상기 배양액에 상기 (B) 액 100㎕ 만을 첨가한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (-). 또한, 컨트롤 2 로서, 트랜스펙션에 있어서, 상기 RNA 용액을 미첨가로 하고, 상기 (A) 1.5㎕ 와 상기 (B) 를 합계 100㎕ 첨가한 것 외에는 동일하게 하여 처리한 세포에 대해서도 유전자 발현량을 측정하였다 (mock).
보정 후의 COL1A1 유전자의 발현량에 관해서, 컨트롤 (mock) 의 세포에 있어서의 발현량을 1 로 하여, 각 RNA 를 도입한 세포에서의 발현량의 상대값을 구했다.
(3) 결과
도 11 에 나타내는 바와 같이, 실시예의 매치형 miR-29b 는, 포지티브 컨트롤의 성숙 miR-29b 나 이중 가닥 매치형 miR-29b 와 같은 정도 또는 그 이상으로 COLA1 mRNA 의 발현을 억제하였다. 또한, 링커 영역의 비뉴클레오티드 구조나, X 영역의 부가 배열의 염기 길이를 개변하여도 COLA1 mRNA 의 발현 억제 효과는 유지되었다.
이상, 실시형태를 참조하여 본원 발명을 설명하였지만, 본원 발명은 상기 실시형태에 한정되는 것이 아니다. 본원 발명의 구성이나 상세에는, 본원 발명의 범위 내에서 당업자가 이해할 수 있는 다양한 변경을 할 수 있다. 여기서 서술된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함한 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용됨으로써 그 전부가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 편입되는 것이다.
본 출원은, 2013년 12월 27일자로 일본에 출원된 특원 2013-273033호를 기초로 하고 있고, 여기서 언급함으로써 그 내용은 모두 본 명세서에 포함된다.
산업상 이용가능성
본 발명의 인공 매치형 miRNA 에 의하면, 용이하게 저비용으로 합성할 수 있고, 또한, 상기 유전자가 코드하는 단백질의 번역의 억제가 가능하다. 본 발명의 인공 매치형 miRNA 는, 전술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 점에서, 예를 들어, 의약품, 진단약 및 농약, 그리고 농학, 의학, 생명과학 등의 연구 툴로서 유용하다.

Claims (51)

  1. X 영역과 Y 영역을 갖는 단일 가닥 핵산으로,
    상기 X 영역의 3' 말단과 상기 Y 영역의 5' 말단이 비뉴클레오티드 구조의 링커 영역을 통해서 연결되고,
    상기 X 영역은 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함하고,
    상기 Y 영역은 상기 X 영역과 완전히 상보의 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공 매치형 miRNA.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Y 영역과 상기 X 영역을 얼라인먼트했을 때에, 상기 Y 영역이 3' 말단에 오버행을 갖는 인공 매치형 miRNA.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 오버행이 0∼4 염기 길이인 인공 매치형 miRNA.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X 영역이 상기 가이드 가닥 배열과 부가 배열로 이루어지고, 상기 부가 배열이 상기 가이드 가닥 배열의 3' 말단에 연결되어 있는 인공 매치형 miRNA.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 X 영역에 있어서의 상기 부가 배열의 길이가 0∼5 염기 길이인 인공 매치형 miRNA.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X 영역의 길이가 19∼33 염기 길이인 인공 매치형 miRNA.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y 영역의 길이가 21∼35 염기 길이인 인공 매치형 miRNA.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 길이가 40∼68 염기 길이인 인공 매치형 miRNA.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 영역이, 아미노산 잔기, 폴리아민 잔기 및 폴리카르복실산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 인공 매치형 miRNA.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 링커 영역이 폴리카르복실산 잔기를 포함하는 인공 매치형 miRNA.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 폴리카르복실산 잔기가 테레프탈산 잔기인 인공 매치형 miRNA.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 링커 영역이 아미노산 잔기를 포함하는 인공 매치형 miRNA.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가, 글리신 잔기, 테레프탈산아미드 잔기, 프롤린 잔기 또는 리신 잔기인 인공 매치형 miRNA.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기가 복수의 아미노산 잔기가 연결된 것인 인공 매치형 miRNA.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 복수의 아미노산 잔기가 연결된 것이 글리신 이량체 또는 삼량체의 잔기인 인공 매치형 miRNA.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 잔기가 하기 화학식 (I-0) 으로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 1]
    Figure pct00035

    상기 화학식 (I-0) 중,
    Q11 및 Q12 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2 (메틸렌기), NH (이미노기), C=O (카르보닐기), C=S (티오카르보닐기), C=NH (이미노메틸렌기), O, 또는 S 이고,
    Q1 및 Q2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2 (메틸렌기), NH (이미노기), C=O (카르보닐기), C=S (티오카르보닐기), C=NH (이미노메틸렌기), O, 또는 S 이고,
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이고 ;
    L1 은, n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    L2 는, m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고 ;
    m 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    n 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    상기 X 영역 및 상기 Y 영역은 각각, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 링커 잔기에 결합하고,
    여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I-0) 이고,
    A 는 임의의 원자단이다.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 화학식 (I-0) 중, Q11 및 Q12 가 각각 카르보닐기인 인공 매치형 miRNA.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 화학식 (I-0) 중, Q1 및 Q2 가 각각 이미노기인 인공 매치형 miRNA.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 하기 화학식 (Iα) 의 구조가 하기 화학식 (Iα2) 로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 2]
    Figure pct00036

    상기 화학식 (Iα2) 중,
    R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 화학식 (Iα2) 의 구조가 하기 화학식 (Iα3) 으로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 3]
    Figure pct00037
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 화학식 (I-0) 중, Q11 및 Q12 가 각각 이미노기인 인공 매치형 miRNA.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 화학식 (I-0) 중, Q1 및 Q2 가 각각 카르보닐기인 인공 매치형 miRNA.
  23. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 하기 화학식 (Iβ) 의 구조가 하기 화학식 (Iβ2) 로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 4]
    Figure pct00038

    상기 화학식 (Iβ2) 중,
    R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 화학식 (Iβ2) 의 구조가 하기 화학식 (Iβ3) 으로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 5]
    Figure pct00039
  25. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 영역이 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 아미노산 잔기가 하기 화학식 (I) 로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 6]
    Figure pct00040

    상기 화학식 (I) 중,
    X1 및 X2 는 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH 이고 ;
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이고 ;
    L1 은, n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    L2 는, m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고 ;
    m 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    n 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    상기 X 영역 및 상기 Y 영역은 각각, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 아미노산 잔기에 결합하고,
    여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로, 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I) 이고,
    A 는 임의의 원자단이고, 단, 하기 화학식 (Ia) 은 아미노산 또는 펩티드이다.
    [화학식 7]
    Figure pct00041
  26. 제 1 항 내지 제 3 항, 제 6 항 내지 제 10 항 및 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기에 있어서의 상기 아미노산이 천연 아미노산 및 인공 아미노산의 적어도 일방인 인공 매치형 miRNA.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 천연 아미노산이 단백질을 구성하는 아미노산인 인공 매치형 miRNA.
  28. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 12 항 내지 제 15 항, 제 25 항 및 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기에 있어서의 상기 아미노산이, 글리신, α-알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 히드록시리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 프롤린, 4-히드록시프롤린, 트립토판, β-알라닌, 1-아미노-2-카르복시시클로펜탄, 아미노벤조산, 아미노피리딘카르복실산 및 하기 화학식 (Ia2) 로 나타내는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종류이고, 상기 아미노산은, 또한 치환기 또는 보호기를 갖고 있거나, 갖고 있지 않아도 되는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 8]
    Figure pct00042

    상기 화학식 (Ia2) 중,
    R100 은 임의의 치환기이고, 존재하거나 존재하지 않아도 되며, 존재하는 경우에는, 1 개이거나 복수여도 되고, 복수인 경우에는, 서로 동일하거나 상이해도 된다.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 화학식 (Ia2) 의 구조가, 하기 화학식 (Ia3) 으로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 9]
    Figure pct00043
  30. 제 16 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 화학식 (I-0) 또는 (I) 의 구조가 하기 화학식 (I-1)∼(I-7) 이고, 하기 화학식 (I-1)∼(I-7) 에 있어서, n 은 0∼30 의 정수, m 은 0∼30 의 정수인 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 10]
    Figure pct00044
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 화학식 (I-1) 에 있어서, n=11 및 m=12, 또는 n=5 및 m=4 인 인공 매치형 miRNA.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 화학식 (I-4) 에 있어서, n=5 및 m=4 인 인공 매치형 miRNA.
  33. 제 30 항에 있어서, 상기 화학식 (I-6) 에 있어서, n=4 및 m=4 인 인공 매치형 miRNA.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 화학식 (I-7) 에 있어서, n=5 및 m=4 인 인공 매치형 miRNA.
  35. 제 1 항 내지 제 9 항, 제 12 항 및 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 영역의 비뉴클레오티드 구조가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 인공 매치형 miRNA.
  36. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비뉴클레오티드 구조가 하기 식 (II) 로 나타내는 인공 매치형 miRNA.
    [화학식 11]
    Figure pct00045

    상기 식 중,
    X1 및 X2 는 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH 이고 ;
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S 이고 ;
    R3 은, 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6 에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이고 ;
    L1 은, n 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L1 은, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y1 이 NH, O 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    L2 는, m 개의 원자로 이루어지는 알킬렌 사슬이고, 여기서, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는, OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH 또는 SRc 로 치환되거나 치환되어 있지 않아도 되며, 또는,
    L2 는, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y2 가 NH, O 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않으며 ;
    Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이고 ;
    l 은 1 또는 2 이고 ;
    m 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    n 은 0∼30 의 범위의 정수이고 ;
    환 A 는, 상기 환 A 상의 C-2 이외의 1 개의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황으로 치환되어도 되고,
    상기 환 A 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 되고,
    상기 X 영역 및 상기 Y 영역은 각각, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해서 상기 비뉴클레오티드 구조에 결합하고,
    여기서, R1 및 R2 는 존재하거나 존재하지 않아도 되고, 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상기 구조 (I) 이다.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X 영역은, hsa-miR-34, hsa-miR-29 및 hsa-let-7 로 이루어지는 군에서 선택되는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열을 포함하는 인공 매치형 miRNA.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 성숙 miRNA 가 hsa-miR-34a 인 인공 매치형 miRNA.
  39. 제 38 항에 있어서, 뉴클레오티드 배열이 배열 번호 9 및 17∼28 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 배열인 인공 매치형 miRNA.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 성숙 miRNA 가 hsa-let-7a 인 인공 매치형 miRNA.
  41. 제 40 항에 있어서, 뉴클레오티드 배열이 배열 번호 36∼38 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 배열인 인공 매치형 miRNA.
  42. 제 37 항에 있어서, 상기 성숙 miRNA 가 hsa-miR-29b 인 인공 매치형 miRNA.
  43. 제 42 항에 있어서, 뉴클레오티드 배열이 배열 번호 43∼45 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 배열인 인공 매치형 miRNA.
  44. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서, 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 억제용 조성물.
  45. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 인공 매치형 miRNA 를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  46. 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 인공 매치형 miRNA 를 사용하는 것을 특징으로 하는 발현 억제 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 인공 매치형 miRNA 를 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 공정을 포함하는 발현 억제 방법.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 상기 인공 매치형 miRNA 를 in vivo 또는 in vitro 로 투여하는 발현 억제 방법.
  49. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 상기 인공 매치형 miRNA 를 비인간 동물에게 투여하는 발현 억제 방법.
  50. 질환의 치료 방법으로서, 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 인공 매치형 miRNA 를 환자에게 투여하는 공정을 포함하고,
    상기 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 가이드 가닥 배열이, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  51. 질환의 치료에 사용하기 위한 단일 가닥 핵산으로서,
    상기 단일 가닥 핵산은, 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 인공 매치형 miRNA 이고,
    상기 인공 매치형 miRNA 에 있어서의 상기 가이드 가닥 배열이, 상기 질환에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 성숙 miRNA 의 가이드 가닥 배열인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 핵산.
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WO (1) WO2015099187A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013180038A1 (ja) 2012-05-26 2013-12-05 株式会社ボナック デリバリー機能を有する遺伝子発現制御用の一本鎖核酸分子
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
US10934542B2 (en) 2013-12-27 2021-03-02 Bonac Corporation Artificial match-type miRNA for controlling gene expression and use therefor
RU2740032C2 (ru) * 2014-12-27 2020-12-30 Бонак Корпорейшн ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ В ПРИРОДЕ миРНК ДЛЯ КОНТРОЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ES2926369T3 (es) 2015-03-27 2022-10-25 Bonac Corp Molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene función de suministro y capacidad de control de la expresión génica
WO2016167366A1 (ja) * 2015-04-17 2016-10-20 国立大学法人 東京大学 眼疾患治療剤
WO2017073767A1 (ja) * 2015-10-30 2017-05-04 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子を安定に含有する組成物
TW202334427A (zh) 2016-01-26 2023-09-01 日商日產化學工業股份有限公司 單股寡核苷酸
CA3013179A1 (en) * 2016-01-30 2017-08-03 Bonac Corporation Artificial single guide rna and use thereof
EP3584319A4 (en) * 2017-02-06 2021-04-14 Nissan Chemical Corporation SINGLE-STRAND OLIGONUCLEOTIDE
WO2018155487A1 (ja) * 2017-02-21 2018-08-30 株式会社ボナック 核酸含有ｄｐｉ用粉末製剤及びその用途
TWI830718B (zh) * 2018-02-09 2024-02-01 日商住友化學股份有限公司 核酸分子之製造方法
WO2019182037A1 (ja) 2018-03-20 2019-09-26 国立大学法人東京工業大学 毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチド

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056737A2 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells
WO2011008730A2 (en) * 2009-07-13 2011-01-20 Somagenics Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US20120035246A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2012074038A1 (ja) * 2010-12-02 2012-06-07 第一三共株式会社 修飾１本鎖ポリヌクレオチド

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE873543C (de) 1942-10-28 1953-04-16 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von hydroxyl- bzw. sulfhydryl-gruppenhaltigen Dicarbaminsaeureestern
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4550163A (en) 1979-02-05 1985-10-29 Abbott Laboratories Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates
US20030232355A1 (en) 1992-05-22 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded peptide nucleic acids
US5631148A (en) 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
GB9621367D0 (en) 1996-10-14 1996-12-04 Isis Innovation Chiral peptide nucleic acids
US6197557B1 (en) 1997-03-05 2001-03-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
EP1013770A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Université Louis Pasteur de Strasbourg Non-viral transfection vector
FR2790757B1 (fr) 1999-03-09 2003-08-01 Bioalliance Pharma Oligonucleotides contenant une sequence antisens stabilises par une structure secondaire et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6852334B1 (en) 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
EP1748078B1 (en) 2001-03-09 2011-01-19 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions of combination oligomers
EP1627061B1 (en) 2001-05-18 2009-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US20050233455A1 (en) 2001-10-29 2005-10-20 Damha Masad J Acyclic linker-containing oligonucleotides and uses thereof
AU2003219900A1 (en) 2002-02-22 2003-09-09 James R. Eshleman Antigene locks and therapeutic uses thereof
EP1495141A4 (en) 2002-03-20 2006-03-22 Massachusetts Inst Technology HIV THERAPEUTIC
BRPI0313202A8 (pt) 2002-08-05 2016-08-16 Atugen Ag Formas adicionais para interferir com as moléculas de rna
AU2003256857A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Dharmacon, Inc. Short interfering rnas having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop
US6936651B2 (en) 2002-12-17 2005-08-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compatibility improvement in crystalline thermoplastics with mineral fillers
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
EP1641942A2 (en) 2003-06-12 2006-04-05 Applera Corporation Combinatorial nucleobase oligomers comprising universal base analogues and methods for making and using same
WO2005047505A2 (en) 2003-08-07 2005-05-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products for expression of micro rnas
US7595301B2 (en) 2003-09-30 2009-09-29 Anges Mg, Inc. Staple type oligonucleotide and drug comprising the same
WO2005035550A2 (en) 2003-10-14 2005-04-21 Kernel Biopharma Inc. Dual phase-pna conjugates for the delivery of pna through the blood brain barrier
US20050209141A1 (en) 2003-10-17 2005-09-22 Silver Randi B Mast cell-derived renin
AU2005327517B2 (en) 2004-06-30 2011-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
CA2578064C (en) 2004-08-23 2015-10-13 Sylentis S.A.U. Treatment of eye disorders characterized by an elevated intraocular pressure by sirnas
EP1783137A4 (en) 2004-08-26 2014-10-22 Nippon Shinyaku Co Ltd GALACTOSIS DERIVATIVE, DRUG VECTOR AND THERAPEUTIC PREPARATION
EP2287301A3 (en) 2004-08-31 2011-11-02 Sylentis S.A.U. Methods and compositions to inhibit P2X7 receptor expression
CN101076592B (zh) 2004-10-12 2013-08-21 洛克菲勒大学 微小rna
ES2507544T3 (es) 2004-11-12 2014-10-15 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
BRPI0519690A2 (pt) 2004-12-30 2009-03-03 Todd M Hauser composiÇÕes e mÉtodos para modular a expressço de genes usando oligonucleotÍdeos autoprotegidos
ATE455784T1 (de) 2006-03-01 2010-02-15 Nippon Shinyaku Co Ltd Galactosederivat, arzneimittelträger und medizinische zusammensetzung
US9045754B2 (en) 2006-05-05 2015-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Short antisense compounds with gapmer configuration
EP2194128B1 (en) * 2006-05-11 2012-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
CA2653941C (en) 2006-05-31 2013-01-08 The Regents Of The University Of California Substituted amino purine derivatives and uses thereof
EP1890152A1 (en) 2006-08-14 2008-02-20 Charite Universitätsmedizin-Berlin Determination of renin/prorenin receptor activity
JP2008220366A (ja) 2007-02-16 2008-09-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 修飾型ｐｎａ／ｒｎａ複合体
JP5145557B2 (ja) 2007-03-01 2013-02-20 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 マイクロｒｎａを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物
EP2129680B1 (en) 2007-03-21 2015-05-06 Brookhaven Science Associates, LLC Combined hairpin-antisense compositions and methods for modulating expression
CN101121934B (zh) 2007-04-11 2011-12-07 哈尔滨医科大学 多靶点miRNA反义核苷酸的制备方法
US8258286B2 (en) 2007-04-26 2012-09-04 University Of Iowa Research Foundation Reduction of off-target RNA interference toxicity
EP2152722B1 (en) * 2007-05-03 2016-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising mir34 therapeutic agents for treating cancer
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
US20090123501A1 (en) 2007-05-17 2009-05-14 Baylor College Of Medicine Inhibition of the sh2-domain containing protein tyr-phosphatase, shp-1, to enhance vaccines
US8841267B2 (en) 2007-05-23 2014-09-23 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Micro-RNA scaffolds, non-naturally occurring micro-RNAs, and methods for optimizing non-naturally occurring micro-RNAs
EP2171089B1 (en) 2007-06-25 2014-01-22 Universität Duisburg-Essen Screening-method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders
WO2009029690A1 (en) * 2007-08-27 2009-03-05 Boston Biomedical, Inc. Composition of asymmetric rna duplex as microrna mimetic or inhibitor
US8283331B2 (en) 2007-10-09 2012-10-09 Children's Medical Center Corporation Methods to regulate miRNA processing by targeting Lin-28
AU2008309520A1 (en) 2007-10-12 2009-04-16 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin Method for opening tight junctions
TW200927177A (en) 2007-10-24 2009-07-01 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect
AR069328A1 (es) 2007-11-15 2010-01-13 Alcon Mfg Ltd Liberacion de rna interferente corto o sirna, intermediada por receptor de lipoproteina de baja densidad
WO2009074076A1 (fr) 2007-11-29 2009-06-18 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Molécule complexe interférant avec l'expression de gènes cibles, et ses méthodes de préparation
EP2229186A2 (en) 2007-12-04 2010-09-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
US20110159586A1 (en) 2007-12-07 2011-06-30 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression using asymmetrically-active precursor polynucleotides
EP2256191A4 (en) 2008-02-15 2011-07-06 Riken SINGLE-STRANDED CYCLIC NUCLEIC ACID COMPLEX AND METHOD FOR PRODUCING SAME
CA2719963A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Double-stranded lipid-modified rna having high rna interference effect
US20110172295A1 (en) 2008-04-11 2011-07-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE REGULATION OF microRNA PROCESSING
WO2009143619A1 (en) 2008-05-27 2009-12-03 Chum Methods of treating or preventing obesity and obesity-related hypertension
JP5794559B2 (ja) 2008-11-19 2015-10-14 国立大学法人岐阜大学 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用
US8426581B2 (en) 2009-03-27 2013-04-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of the FCεR1α gene
ES2804764T3 (es) 2009-06-01 2021-02-09 Halo Bio Rnai Therapeutics Inc Polinucleótidos para la interferencia de ARN multivalente, composiciones y métodos de uso de los mismos
JP2012533587A (ja) 2009-07-22 2012-12-27 セニックス バイオサイエンス ゲーエムベーハー 自然に存在する細胞内輸送経路を介して化合物を送達するための送達システム及びコンジュゲート
WO2011028550A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Segmented micro rna mimetics
US20110052666A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Medtronic, Inc. Compositions, Methods, and Systems for SIRNA Delivery
JP2012503494A (ja) 2009-11-06 2012-02-09 チュン−アン ユニバーシティ インダストリー−アカデミー コーオペレイション ファンデイション ナノ粒子を含む遺伝子運搬体
EP2512449B1 (en) 2009-12-18 2019-08-07 The University of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
US8933046B2 (en) 2009-12-23 2015-01-13 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Influenza targets
US20110200582A1 (en) 2009-12-23 2011-08-18 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
WO2011119887A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in dermal and fibrotic indications
CN101845071B (zh) 2010-03-25 2012-02-01 北京欧凯纳斯科技有限公司 一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用
JP5555940B2 (ja) 2010-04-14 2014-07-23 国立大学法人佐賀大学 増殖糖尿病網膜症の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法
JP5892608B2 (ja) 2010-04-19 2016-03-23 国立研究開発法人理化学研究所 機能性核酸の安定化法
EP3502254B1 (en) 2010-04-23 2024-11-06 Cold Spring Harbor Laboratory Novel structurally designed shrnas
SG196779A1 (en) 2010-07-08 2014-02-13 Bonac Corp Single-strand nucleic acid molecule for controlling gene expression
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
US8618073B2 (en) * 2010-07-22 2013-12-31 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of miR-29 for cell protection
CN103052711B (zh) * 2010-08-03 2016-08-03 株式会社博纳克 具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子
US20130253168A1 (en) 2010-08-31 2013-09-26 Steven L. Colletti Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
CN102559666B (zh) 2010-12-18 2013-12-25 中国科学院上海生命科学研究院 抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途
RU2615117C2 (ru) 2011-02-03 2017-04-04 Мирна Терапетикс, Инк. ДВУХЦЕПОЧЕЧНАЯ МОЛЕКУЛА РНК ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КЛЕТКИ АКТИВНОСТЬЮ miR-34a
CN102784398B (zh) 2011-05-16 2014-06-18 南京大学 内皮抑素作为递送系统和化学合成的rna干扰分子组成的组合物及应用
JP6011945B2 (ja) 2011-05-20 2016-10-25 公一 中城 マイクロｒｎａ又はその発現系を含む組成物
EP2527440A1 (en) 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia
JP2013055913A (ja) 2011-09-09 2013-03-28 Bonac Corp 遺伝子発現制御のための一本鎖ｒｎａ分子
WO2013077446A1 (ja) 2011-11-26 2013-05-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
US9528111B2 (en) 2012-01-07 2016-12-27 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having amino acid backbone
JP2013153736A (ja) * 2012-01-07 2013-08-15 Bonac Corp ペプチド骨格を有する一本鎖核酸分子
ES2765819T3 (es) 2012-03-04 2020-06-11 Bonac Corp Inhibidor de micro-ARN
AR090905A1 (es) 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
WO2013180038A1 (ja) 2012-05-26 2013-12-05 株式会社ボナック デリバリー機能を有する遺伝子発現制御用の一本鎖核酸分子
JP6510485B2 (ja) 2013-03-15 2019-05-08 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション Ｐｒｍｔ５インヒビターおよびそれらの使用方法
SG11201510565TA (en) 2013-05-22 2016-01-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
WO2015093495A1 (ja) 2013-12-16 2015-06-25 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
JP6492014B2 (ja) 2013-12-27 2019-03-27 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途
US10934542B2 (en) 2013-12-27 2021-03-02 Bonac Corporation Artificial match-type miRNA for controlling gene expression and use therefor
US10119140B2 (en) 2014-04-18 2018-11-06 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Methods for enhancing or decreasing the levels of MIR124 and MIR29 in subjects with muscular dystrophy
RU2740032C2 (ru) 2014-12-27 2020-12-30 Бонак Корпорейшн ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ В ПРИРОДЕ миРНК ДЛЯ КОНТРОЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ES2926369T3 (es) 2015-03-27 2022-10-25 Bonac Corp Molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene función de suministro y capacidad de control de la expresión génica
CA3009769C (en) 2015-12-29 2021-01-12 National University Corporation Hokkaido University Single-stranded nucleic acid molecule inhibiting expression of prorenin gene or prorenin receptor gene, and use thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056737A2 (en) 2008-11-11 2010-05-20 Mirna Therapeutics, Inc. Methods and compositions involving mirnas in cancer stem cells
WO2011008730A2 (en) * 2009-07-13 2011-01-20 Somagenics Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US20120035246A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2012074038A1 (ja) * 2010-12-02 2012-06-07 第一三共株式会社 修飾１本鎖ポリヌクレオチド
EP2647713A1 (en) * 2010-12-02 2013-10-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Modified single-strand polynucleotide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1 : Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
비특허문헌 2 : Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187

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