KR20160099223A

KR20160099223A - 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20160099223A
Application number: KR1020150021378A
Authority: KR
Inventors: 한태욱; 바레이트 아비히지트
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 우진 비앤지 주식회사
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2016-08-22
Also published as: WO2016129724A1

Abstract

본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 유래 재조합 단백질과 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 포함하는 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 백신보다 우수한 방어효과를 나타내게 하므로, 본 발명의 백신 조성물은 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지유행성폐렴을 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신 및 이의 제조방법{Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine and preparation method}

본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 유래 재조합 단백질과 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 포함하는 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

돼지 마이코플라스마성 폐렴의 원인균인 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)는 돼지호흡기복합증후군(PRDC, Porcine respiratory disease complex) 및 돼지유행성폐렴(EP, enzootic pneumonia)과 관련된 호흡기병원체이며, 호흡기 섬모세포에 집락화를 시작으로 감염을 일으킨다. 이 병원체는 외부로부터 방어 역할을 하는 점액 섬모 기관을 파괴하며, 기도에 급성염증을 일으킨다. 만성감염의 경우 폐 병변의 확대를 통해 다른 세균에 의한 이차감염에 더욱 노출되게 만든다. 이로 인하여 돼지의 생산성이 감소하게 되고 양돈산업에 큰 경제적 손실을 초래한다(Maes, et al., 2008). 현재 감염을 막기 위해 전 세계적으로 공급되고 있는 상용 백신은 불활화 형태의 백신이며, 전형적인 전세포(whole cell) 박테린과 면역보강제(adjuvant)로 구성되어 있다. 이러한 상용 백신의 접종에 따라 돼지의 생산성이 증가하였고, 폐 병변으로의 확대는 감소되었지만(Maes, et al., 2008), 자연 감염에 대한 방어효능은 여전히 효과적이지 못하다(Thacker, et al., 1998, Sibila, et al., 2007, Maes, et al., 2008). 뿐만 아니라, 종래의 상용 백신은 자연 감염균의 전파 및 호흡기 섬모 집락화를 예방할 수 없다(Maes, et al., 2008). 따라서 이러한 문제점을 해결할 수 있는 효과적인 백신 개발의 필요성이 중요하게 인식되고 있다.

M. hyopneumoniae의 감염은 병원체가 호흡기 상피세포의 섬모에 부착하면서 개시된다. 부착소 P97은 M. hyopneumoniae의 막 표면 단백질로 면역원성이 높은 항원으로 알려져 있다(Klinkert, et al., 1985, Zhang, et al., 1995, Minion, et al., 2000). P97의 C말단에는 반복되는 구간으로 구성된 R1과 R2 부위가 존재하며, 그 중 R1 부위는 섬모의 부착부위에 결합한다(AAKPV/E) (Minion, et al., 2000). 결합된 M. hyopneumoniae는 성장에 필요한 아미노산을 숙주로부터 얻을 수 있으며, 상처난 조직에 침입하기 위하여 숙주의 분자들을 다양하게 배열한다(Raymond, et al., 2014). 한편, 숙주는 항체를 생산하여 돼지 섬모에 M. hyopneumoniae가 부착(Zhang, et al., 1995)하는 것을 방해하거나 부착된 병원체의 성장을 저해할 수 있다(Okamba, et al., 2010). 그러나, 선행 연구에 따르면 기존의 상용 백신은 P97의 중요 항원에 대한 항체를 유도할 수 없는 것으로 보고된 바 있다(Conceicao, et al., 2006, Okamba, et al., 2010).

이에 본 발명자들은 돼지에서 자연 감염을 통해 발병하는 M. hyopneumoniae를 예방하기 위해 백신을 개발하던 중 M. hyopneumoniae 박테린과 재조합 P97 단백질이 혼합된 백신이 기존의 상용 백신에 비해 뛰어난 면역반응을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국공개특허 2012-0117098

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 제공한다. 본 발명의 재조합 단백질은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae)로부터 유래한 P97 단백질의 단편을 포함한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단편은 P97의 C말단에 반복되는 구간으로 구성된 R1과 R2 부위를 포함한다(이를 recombinant P97이란 의미에서 rP97라 명명함).

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린(bacterin) 및 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 P97 단백질 (rP97)을 포함하는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 마이코플라스마 하이오뉴모니애로부터 유래한 P97 단백질의 단편을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린은 불활화(inactivated)되어야 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 감염에 의해 발생하는 질병 예방용 백신 조성물이다. 본 발명의 일실시예에 있어서 상기 질병은 돼지유행성폐렴일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법은, 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 균주를 불활화시킨 후 농축시키는 단계 및 상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애를 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질과 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질은, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 숙주를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있으며, 상기 숙주는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 재조합 단백질이 포함된 숙주의 배양액으로부터 분리된 용균액(lysate)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용균액의 농도는 0.3 mg/ml일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 2.5x10⁸CCU(Colour-changing units)/ml의 농도로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애와 재조합 단백질의 혼합 과정에 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체가 함께 혼합될 수 있다.

본 발명의 재조합 단백질(rP97)과 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 혼합하여 제조한 백신을 돼지에 접종하여 면역반응을 평가한 결과 본 발명의 재조합 단백질이 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 기존 백신보다 우수한 방어효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 재조합 단백질을 이용한 백신 조성물은 마이코플라스마 하이오뉴모니애의 감염에 의해 발생하는 질병, 특히 돼지유행성폐렴을 효과적으로 예방할 수 있다.

도 1은 백신접종 후 0일부터 63일까지 얻은 혈청을 이용하여 M. hyopneumoniae 특이적인 항체가를 IDEXX M. hyo. ELISA로 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean S.D.로 나타내었으며, 백신군과 PBS군의 유의적 차이는 *(P < 0.05)과 **(P < 0.01)로 표시하였다.
도 2는 백신접종 후 0일로부터 63일까지 얻은 혈청을 이용하여 rP97 특이적인 항체가를 indirect ELISA로 평가한 결과이다. 모든 실험 데이터는 mean S.D.로 나타내었으며, Mycoflex백신군과 PBS군의 유의적 차이는 ***(P < 0.001)로 표시하였다.

백신 접종은 M. hyopneumoniae를 예방하기 위한 매우 중요한 수단이다. M. hyopneumoniae 백신에 의해 유도된 체액성 면역은 돼지에서 발생하는 폐렴과 폐렴병변의 발생을 방어한다고 보고된 바 있다(Lam & Switzer, 1971, Thacker, et al., 2000). 따라서 본 발명자들은 rP97 재조합 단백질(서열번호 1)과 용균액을 혼합한 세균 백신에 대한 면역원성을 조사하였다. 그 결과(도 1 참조), 본 발명의 백신 접종 후 42일에 양성 혈청반응을 보여 체액성 면역반응이 생성되었음을 알 수 있었다. 반면에 상용백신에 의해 면역화된 돼지에서는 접종 후 21일까지 음성 혈청반응을 보였으며, 이전에 보고된 문헌과 유사한 결과를 나타냈다(Kim, et al., 2011). 또한 접종 후 63일에 L2군이 상용백신과 동일한 항체가를 나타난 것을 제외하고 백신접종군이 더 높은 항체가를 보였다. 접종 전구간에서 두 백신 접종군의 M. hyopneumoniae 특이적인 항체가에 대한 차이는 항원으로 사용된 균주의 다양성에 의해 영향을 받을 수 있다(Thacker, et al., 1998).

또한, 본 발명자들은 다양한 백신에 의해 유도되는 rP97-특이적인 면역반응을 측정하였다. M. hyopneumoniae P97은 면역화된 돼지에서 초기 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다(Klinkert, et al., 1985, Zhang, et al., 1995, Raymond, et al., 2014). 또한 이 단일항원을 사용하였을 경우 폐병변을 60-90% 감소시키며(Okamba, et al., 2010, Lee, et al., 2014), 폐에서의 염증과 호흡기 내 M. hyopneumoniae 감염수준을 낮출 수 있다(Okamba, et al., 2010). 그럼에도 불구하고 본 발명의 일실시예에서 상용 백신에 의해 면역화된 돼지는 rP97-특이적인 항체가를 유도하지 못하였다(도 2). 이 같은 결과는 기존의 상용 백신이 rP97-특이적인 항체가를 생성하기에는 역부족이라는 이전의 보고와 유사한 결과를 보여준다. 반면에 본 발명의 백신과 재조합 단백질이 포함된 용해물은 상당한 수준의 rP97-특이적인 면역반응을 나타냈다. 이는 초기 감염과 부착에 관여하는 P97이 백신의 효능을 향상시켰기 때문인 것으로 사료된다.

이러한 결과를 종합하면 본 발명의 백신은 높은 수준의 M. hyopneumoniae 특이적 면역반응을 유도하며, 특히 rP97-특이적인 체액성 면역반응은 상용 백신에 비해 상당히 높게 나타나는 것으로 볼 수 있다.

따라서 본 발명은 M. hyopneumoniae의 rP97 단백질을 포함하는 M. hyopneumoniae 박테린(bacterin) 백신 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.

특히 본 발명에서는 하기 일실시예의 실험을 통해 재조합 rP97 단백질 용균액, 즉 rP97 단백질을 발현하는 세포용해물 단독과 M. hyopneumoniae 박테린(bacterin) 단독 및 rP97 단백질을 발현하는 세포용해물과 M. hyopneumoniae 박테린(bacterin)을 함유한 혼합물을 대상으로 백신 효능을 분석한 결과, rP97 단백질을 발현하는 세포용해물 단독과 M. hyopneumoniae 박테린(bacterin) 단독에 의해서도 백신 효능이 유도되었으나 이들을 혼합하여 사용한 경우 백신 효능이 월등히 우수한 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 박테린 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 박테린은 마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 균주룰 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 본원발명에서 분리 및 동정한 마이코플라스마 하이오뉴모니애 균주 Mhp 23-9 및 Mhp 7-25을 사용할 수 있다. 이는 다른 마이코플라스마 하이오뉴모니애 균주의 경우 항체 생성능이 그리 뛰어나지 않으나, Mhp 23-9 및 Mhp 7-25은 항체 생성능이 훨씬 우수하여 우수한 백신제조가 가능하기 때문이다.

본 명세서에 사용된 "박테린"은 특정 보조제와 배합되어 동물에게 투여되는 경우 질환 또는 감염을 예방하는 보호 면역을 유도할 수 있는 세균 잔해물 또는 배양물을 의미하며, 상기 "보조제"는 면역원성을 증진시키고 박테린의 효능을 증진시키는 물질을 의미한다. M. hyopneumoniae 박테린은 본 발명의 백신 조성물에 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 면역을 제공할 수 있는 양("면역량")으로 포함될 수 있으며, 상기 "면역량"은 투여되는 동물의 종, 나이, 크기, 건강 상태, 이전의 백신 투여 경험 등에 의해 결정될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 상기 재조합 단백질은, M. hyopneumoniae P97 유전자의 C-terminal 부위에 존재하는 두 개의 반복되는 지역인 R1 과 R2이 있는데, 숙주의 섬모에 부착하는 지역은 R1이다. 따라서 본 연구에서는 M. hyopneumoniae의 초기감염을 방어하기 위해 주요 부착인자인 P97단백질의 주요 모티프인 R1과 R2에 아주번트(adjuvant) 효과를 높이기 위해 대장균독서인 Labile toxin B서브유니트 (LTB)를 퓨전(fusion)시켜 재조합 단백질을 제조한 것으로, 본 발명에서 제조한 재조합 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질이다.

본 발명의 백신 조성물은 상기 박테린의 면역원성을 증진시켜 최소한의 투여로도 보호 면역을 유도할 수 있는 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 '약제학적 또는 수의학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 동물에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 담체로는 식염수, 인산염 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함하는 수성 매질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 보조제 혼합물은 면역 반응을 증진시키고 대사가 가능한 오일을 포함한다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 백신은 수중유 에멀젼 형태로서 불활성화된 마이코플라스마 하이오뉴모니애, 대사 가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 함유할 수 있다. 백신의 투여량은 투여 경로, 동물의 연령, 성별, 체중 및 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 rP97 재조합 단백질의 제조와 같이 본 발명에 특이적인 방법을 제외하고는 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 유기체는 완전 배지와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있고, 유기체의 증식은 색 변화 단위(CCU)를 측정하는 것과 같은 표준 기술로 모니터하고 충분히 높은 역가가 성취된 경우 수거될 수 있다. 스톡은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상적인 방법에 의해 추가로 농축되거나 동결건조시킬 수 있다.

본 발명의 rP97 재조합 단백질은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주를 형질전환시키는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코돈 서열이 숙주세포의 발현에 적합한 코돈으로 변형된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균, 효모 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포의 발현에 적합한 조절 서열(예컨대, 프로모터, 오퍼레이터, 폴리아데닐레이트, 리보좀 결합 서열 등)과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포에서 복제될 수 있도록 하는 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험재료 및 방법

<1-1> 박테린의 준비

M. hyopneumoniae 균주는 국내의 양돈농가에서 분리하였으며, 분리된 균주 중 M. hyopneumoniae 균주인 Mhp 23-9와 Mhp 7-25를 Friis 배지를 사용하여 5% CO₂, 37℃의 조건에서 3주간 배양하였다. 배양된 균액은 pH 를 약 7.8까지 높여 불활화시켰다. Binary ethyleneimine (BEI) (U.S. Pat. No. 5,565,205)와 같은 불활화 시약을 이용하여 균의 불활화를 진행하였다(Petersen & Dayalu, 1996).BEI는 배양액에 2-bromoethylaminehydrobromide (BEA) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 제조하였다. 그 뒤, BEI는 중화시약인 sodium thiosulfate (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 중화시켰다. 불활화된 배양액 일부를 새 배지에 첨가하여 37℃에서 배양하였으며, 적어도 일주일 이상 배양하여 불활화가 잘 되었는지 확인하였다. 불활화된 배양액은 여과(filtration)나 원심분리법으로 농축하였다.

여기서 M. hyopneumoniae 균주 중, Mhp 23-9을 사용하여 제조한 박테린은 "L1"으로 명명하였고, Mhp 7-25을 사용하여 제조한 박테린은 "L2"로 명명하였다.

<1-2> rP97 단백질의 생산

rP97 단백질은 pET 발현 시스템을 이용하여 제작하였다(Barate, et al., 2014). 발현을 위해서, E. coli BL21 competent cell에 발현 플라스미드를 전기천공법을 이용해 삽입시키고, 100 μg/mL 암피실린(ampicillin)이 첨가된 1 L의 Luria-Bertani(LB) 배지에서 균배양하였다. 그 후, 단백질 발현을 위해 1 mM의 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 세 시간 동안 유도한 다음, sonication 시키고, 원심분리하여 재조합 단백질이 포함된 용균액을 얻었다. 여기서 본 발명에 따른 재조합 rP97 단백질의 제조과정을 보다 구체적으로 설명하면, 국내분리주인 M. hyopneumoniae 23-9와 7-25 균주를 대상으로 Genomic DNA Extraction Mini kit(RBC Biosciences)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 장독성원소 대장균의 유전체 DNA는 boiling 방법으로 추출하였다. E.coli heat-labile enterotoxin subunit B 유전자(eltb)와 P97 유전자 C-말단 반복 서열(R1과 R1R2), 그리고 LTB와 융합된 P97 유전자(ltbR1과 ltbR1R2)는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되었다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 4개의 염기서열(CACC)이 포함된 LTBF와 R1F 프라이머를 사용하여 증폭한 PCR 산물을 pENTR/SD 벡터(Gateway system, Invitrogen) 내로 삽입하였다. 그 다음 BamHI 제한효소가 포함된 LTBR과 R1F 프라이머를 사용하여 ltb와 R1을 융합하였다. 각각의 유전자(R1, R1R2, ltbR1 및 ltbR1R2)는 제조사의 방법에 따라 pENTR/SD와 pDEST-42 vector(Gateway system, Invitrogen)내로 삽입하였고, 각 재조합 단백질을 발현하기 위해 전기천공법을 사용하여 E. coli BL21-competent cell 내로 형질전환 후에 100 μg/mL의 ampicillin이 함유된 1L LuriaBertani(LB) medium에서 배양하였다. 배양액은 최종농도 1 mM이 되도록 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 3시간동안 단백질 발현을 유도하였다. 발현된 단백질은 HisPur Ni-NTA affinity chromatography(Thermo Scientific)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였고, 제조된 본 발명의 재조합 단백질 rP97의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재하였으며, 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 염기서열은 서열번호 2에 기재하였다.

[표 1]

<1-3> 백신의 제조 방법

농축된 M. hyopneumoniae을 부형제와 무균적으로 혼합하고, 표 2와 같이 sterile container에서 희석해준 후 30분 이상 혼합하였다.

[표 2]

<1-4> 동물실험 방법

백신후보주의 면역원성을 측정하기 위해 M. hyopneumoniae-free인 3주령의 돼지를 사용하였다. 실험에 사용된 모든 돼지는 임상증상, 폐렴병변 유무, 기타 혈청학적 검사를 ELISA kit(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 사용하여 M. hyopneumoniae 감염 여부를 일정시간 간격으로 확인하였다. 모든 돼지는 각 군당 5마리씩 준비하였으며, 실험군은 실시예 <1-1>의 방법으로 불활화시킨 박테린 L1(Mhp 23-9) 및 L2(Mhp 7-25)에 rP97 단백질 0.3 mg/ml과 Montanide Gel, Carbopol을 상기 표 2와 같은 비율로 혼합하여 제조한 백신 L1 및 L2를 각각 2 ml 접종하였다. 또한 PEP 상용화 백신군은 Mycoflex (Boehringer Ingelheim Animal Health, St. Joseph, MO, USA)을 1 ml 접종하였으며, rlysate 군은 실시예 <1-2>에서 제조된 rP97 재조합 단백질이 포함된 용균액을 2 ml 접종하였다. 대조군은 PBS만을 2 ml 접종하였으며, 총 5개 군을 대상으로 실험을 수행하였다. 모든 군은 최초접종 후 21일 뒤에 추가 접종하였다. 혈청 샘플은 최초 백신접종 후 0, 21, 42, 63일차에 분리하여 실험에 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 각 실험군의 사항은 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

<1-5> Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

M. hyopneumoniae 특이적인 항체가는 IDEXX M. hyo. ELISA(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA)를 이용하여 측정하였다. rP97에 대한 특이적인 항체가는 발현 및 정제된 P97Rec를 항원으로 사용하였고, 96-well Maxi-Sorp microtiter plates (NUNC, Thermo Scientific, Penfield, NY, USA)에 rP97(0.5 μg/well)을 코팅하고 4℃에서 16시간 동안 보관하였다. Plate를 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS(PBST)를 사용하여 세척 후, 5% non-fat milk가 포함된 PBS(PBSM)로 blocking하였다. PBST로 세 번 세척 후, 100 μl의 혈청(1:100 PBSM)을 plate에 첨가하였다. PBST로 세 번 세척 후, plate에 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated rabbit anti-porcine IgG(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 후 incubation하였다. PBST로 세척 후, o-phenylenediamine(OPD) substrate(SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 반응시켰다.

<1-6> 통계분석

통계적 분석은 GraphPad Prism 5 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였다. 각 그룹간 혈청 내 항체가에 대한 차이는 Bonferroni post-test가 결합된 Two-way ANOVA를 사용하였으며, 유의적인 차이는 P < 0.05로 표시하였다.

<실시예 2>

M. hyopneumoniae 특이적인 면역원성 평가

다양한 백신 후보군에 의해 유도된 M. hyopneumoniae 특이적인 혈청학적 항체 수준은 도 1과 같다. 접종하기 전 모든 돼지는 혈청학적으로 음성을 확인한 후 실험을 진행하였다. 그 결과 PBS군은 접종 전 구간에서 음성을 나타냈다. 반면에, L1과 L2 백신을 접종한 군은 42일부터 실험종료일까지 양성을 보였다. 또한 백신 접종군은 실험 전 구간에 걸쳐 상용백신군보다 높은 항체 수준을 보였으며, L2 백신군은 접종 후 63일에 상용백신군과 유사한 수준을 나타냈다. L1과 L2 백신군은 접종 후 42일과 63일에 가장 높은 수준의 항체를 유도하였으며, PBS군과 비교하였을 때 통계적으로 높은 유의적인 값을 보였다.

<실시예 3>

rP97-특이적인 면역반응의 평가

rP97-특이적인 면역반응을 평가하기 위해, 백신접종된 돼지의 혈청을 이용하여 indirect ELISA를 실시하였다(도 2). L1, L2, rLysate군들에 대한 rP97-특이적인 항체 수준은 계속 증가하여 접종 후 42일에 가장 높은 값을 나타냈다. 특히, 접종 후 42일과 63일에 L1, L2, rLysate군들은 대조군에 비해 상당히 높은 수준의 항체가를 보였지만(P < 0.001), 세 접종군들 사이의 유의적인 차이는 없었다. 접종 후 42일에 L1, L2, rLysate군들은 대조군에 비해 각각 19, 20, 16배 높은 수준의 항체가를 나타냈다. 한편 대조군과 상용백신군은 rP97-특이적인 면역반응을 보이지 않았다. 또한, 이러한 결과는 부착단백질인 P97에 대한 항체가 수준이 기존 상용화된 백신은 거의 없는데 반해 본 발명에서 제조된 백신은 rP97에 대한 높은 항체가를 나타냈다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 종래 상용 백신에 비해 더 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4>

돼지에서의 박테린 유효능 평가

백신의 유효능을 평가하기 위해 마이코플라즈마가 상재해 있는 농장을 대상으로 균분리, 마이코플라즈마 특이적 PCR 및 ELISA 항체가를 조사하여 마이코플라즈마가 순환되고 있는 농장을 확인하였다. 본 발명에서 제조한 상기 백신 중 L1(Mhp 23-9)을 1주와 4주령에 접종한 후 3주동안 임상증상(기침, 우울, 비즙의 분비유무)을 관찰하였고, 3주 후에 각 군에서 임의로 선발한 5두씩 도태하여 폐장의 육안병변지수를 산출하였다. 폐의 육안 병변을 이용한 평가방법은 호흡기 질병에 대한 폐의 육안 병변을 분석하는 것으로 전체 폐장을 100으로 하여 각각의 엽마다 부피를 근거로 각각의 점수를 배분한 후 각각의 폐장에 대한 육안 병변 여부를 분석하였다. 다음의 표 4에서와 같이 백신을 접종하지 않은 대조군은 기침, 우울, 비강삼출물의 분비 등이 높은 양성율로 관찰되었으나 백신을 접종한 시험군은 거의 임상증상이 관찰되지 않았다. 육안적 폐병변지수도 백신을 접종하지 않은 대조군과 백신을 접종한 시험군 사이에 유의적인 차이가 나타났다. 따라서 본 발명에서 제조된 백신은 마이코플라즈마균이 상재된 농장에 접종 시 호흡기 증상의 완화 및 폐병변을 감소시키는 것으로 관찰되었다.

[표 4]

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kangwon National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine and preparation method <130> PN1412-397 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rP97 amino acid sequence <400> 1 Met Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr 1 5 10 15 Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr 35 40 45 Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys 50 55 60 Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu 65 70 75 80 Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Ile Ser Met Gly Ile Pro Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu 100 105 110 Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile 115 120 125 Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala 130 135 140 Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala 145 150 155 160 Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys 165 170 175 Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr 180 185 190 Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro 195 200 205 Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser 210 215 220 Leu Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser 225 230 235 240 Glu Tyr Glu Glu Gln Lys Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu 245 250 255 Asn Leu Gln Tyr Gln Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Glu Gln Tyr 260 265 270 Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Pro Asn Gln Gly 275 280 285 Lys Lys Gly Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala 290 295 300 Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys 305 310 315 320 Ala Glu Gly Ala Ser Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Lys Gly Gly Arg 325 330 335 Ala Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Ile Asn Ser Lys Leu Glu 340 345 350 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr 355 360 365 Gly His His His His His His 370 375 <210> 2 <211> 1128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rP97 polynucleotide sequence <400> 2 atggctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 60 ataaatgaca aaatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 120 attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 180 tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcgcata tctgaccgag 240 accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 300 agtatgggga tccctacaaa agaaggtaaa agagaagaag tagataaaaa agttaaagaa 360 ttagataata aaataaaagg tatattacct cagcccccag cagctaaacc agaagcagca 420 aaaccagtag cagctaaacc tgaagcagca aaaccagtag cggctaaacc tgaagcagca 480 aaacctgaag cagcaaaacc agtagcggct aaacctgaag cagcaaaacc agtagcagct 540 aaacctgaag cagcaaaacc agttgctact aatactaata ctggcttttc acttacaaat 600 aaaccaaaag aagactattt cccaatggct tttagttata aattagaata tactgacgaa 660 aataaattaa gcctaaaaac accggaaatt aatgtatttt tagaactagt tcatcaaagc 720 gagtatgaag aacaaaaaat aataaaggaa ctagataaaa ctgttttaaa tcttcaatat 780 caattccagg aagtcaaggt aactagtgaa caatatcaga aacttagcca cccaatgatg 840 accgagggat ctcctaatca aggtaaaaaa ggagaaggaa ctcctaacca aggcaaaaaa 900 gccgaaggcg ctcctaacca aggcaaaaaa gccgaaggcg cacctagtca agggaaaaaa 960 gcagagggtg cttctaatca acaaagccca actaccaagg gtgggcgcgc cgacccagct 1020 ttcttgtaca aagtggtgat caattcgaag cttgaaggta agcctatccc taaccctctc 1080 ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattga 1128

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 돼지 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방을 위한 백신 제조용 재조합 단백질.
제1항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 박테린 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 포함하는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물.
제4항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 마이코플라스마 하이오뉴모니애로부터 유래한 P97 단백질의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제4항에 있어서,
상기 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린은 불활화된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제4항에 있어서,
상기 백신 조성물은 돼지유행성폐렴을 예방하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
마이코플라스마 하이오뉴모니애(M. hyopneumoniae) 균주를 불활화시킨 후 농축시키는 단계 및 상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애에 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 혼합하는 단계를 포함하는 마이코플라스마 하이오뉴모니애 감염 예방용 백신 조성물의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질은,
상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
상기 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계;
상기 형질전환된 숙주를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
상기 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애는 2.5x10⁸CCU(Colour-changing units)/ml의 농도로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 농축된 마이코플라스마 하이오뉴모니애와 재조합 단백질의 혼합 과정에 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 부형제를 첨가하여 함께 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.