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KR20160097336A - 신규 항-ｄｐｅｐ3 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

신규 항-ｄｐｅｐ3 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Publication number
KR20160097336A
KR20160097336A KR1020167018641A KR20167018641A KR20160097336A KR 20160097336 A KR20160097336 A KR 20160097336A KR 1020167018641 A KR1020167018641 A KR 1020167018641A KR 20167018641 A KR20167018641 A KR 20167018641A KR 20160097336 A KR20160097336 A KR 20160097336A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
dpep3
antibodies
heavy chain
Prior art date
Application number
KR1020167018641A
Other languages
English (en)
Inventor
로라 손더스
딥티 록캄
데이비드 류
맨디 분탄란트
Original Assignee
스템센트알엑스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 스템센트알엑스 인코포레이티드 filed Critical 스템센트알엑스 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 이의 유도체를 포함하는 신규 항-DPEP3 항체 및 항체 약물 접합체(ADC) 및 이를 사용하여 증식성 장애를 치료하는 방법이 제공되어 있다.

Description

신규 항-ＤＰＥＰ3 항체 및 이의 사용 방법{NOVEL ANTI-DPEP3 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
교차 참조된 출원
본 출원은 2013년 12월 12일자로 출원된 미국 가출원 제61/915,321호에 대한 이익을 주장하며, 이것은 전문이 본원에 참고로 인용된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이의 전문은 본원에 참고로 인용된다. 2014년 12월 11일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 sc3401pct_S69697_1050WO_SEQL_121114.txt이고, 크기는 264,346 바이트이다.
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 신규 항-DPEP3 항체 또는 이의 면역반응성 단편, 및 암 및 이의 임의의 재발 또는 전이의 치료, 진단 또는 예방을 위한 상기 신규 항-DPEP3 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함하는, 항체 약물 접합체를 포함한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 선택된 실시형태는 종양형성 세포 빈도의 감소를 포함한 암의 치료를 위한 상기 항-DPEP3 항체 또는 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다.
줄기 세포 및 기원세포(progenitor cell)의 분화 및 증식은 기관형성, 세포 수복 및 세포 교체 동안 조직 성장을 뒷받침하기 위해 협력하여 작용하는 정상적인 진행 과정이다. 시스템은 유기체의 필요에 기반하여 단지 적절한 신호만이 생성되도록 하기 위해 엄격하게 조절된다. 세포 증식 및 분화는 정상적으로는 손상되거나 죽은 세포의 교체를 위해 또는 성장을 위해 필요에 따라 일어난다. 그러나, 이러한 과정의 붕괴는 다양한 신호전달 화학물질의 부족 또는 과잉, 변경된 미세환경의 존재, 유전적 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한 여러 인자들에 의해 유발될 수 있다. 정상적인 세포 증식 및/또는 분화의 붕괴는 암과 같은 증식성 질환을 포함한 다양한 장애를 야기할 수 있다.
암에 대한 통상의 치료학적 처치는 화학요법, 방사선요법 및 면역요법을 포함한다. 종종 이러한 치치들이 효과적이지 못하며, 수술적 절제로는 실행 가능한 임상적 대안을 제공하지 못할 수 있다. 현재의 치료 표준에 있어서의 한계는 환자가 1선 치료를 받고 나서 재발한 경우에 특히 자명하다. 이러한 경우, 종종 공격적이고 불치성인 난치성 종양이 흔히 발생한다. 다수의 고형 종양에 대한 전반적인 생존률은, 적어도 부분적으로, 재발, 종양 재발 및 전이를 방지하는 기존의 요법의 실패로 인해 수년에 걸쳐 크게 변하지 않았다. 따라서, 증식성 장애를 위한 보다 표적화되고 강력한 요법을 개발하는 것이 대단히 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 해결한다.
발명의 요지
광범위한 측면에서, 본 발명은 사람 DPEP3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서, DPEP3 단백질은 종양 개시 세포상에서 발현된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 DPEP3에 결합하고, 결합에 대해 DPEP3상의 에피토프에 결합하는 항체와 경쟁한다.
본 발명의 특정한 측면에서, 본 발명의 항체는 DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 에피토프는 서열번호 3의 E217, R242, Q248, Q372, K375 및 E379로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함한다. 예를 들면, 이러한 에피토프는 (1) R242, Q248, Q372; (2) R242, Q248, K375 (3) R242, Q248, E379; (4) R242, Q372, K375; (5) R242, Q372, E379; (6) R242, K375, E379; (7) Q248, Q372, K375; (8) Q248, Q372, E379; (9) Q248, K375, E379; (10) Q372, K375, E379; (11) R242, Q248, Q372, K375; (12) R242, Q248, Q372, E379; (13) R242, Q248, K375, E379; (14) R242, Q372, K375, E379; (15) Q248, Q372, K375, E379; (16) R242, Q248, Q372, K375, E379; (17) E217, R242, Q248; (18) E217, R242, Q372; (19) E217, R242, K375; (20) E217, R242, E379; (21) E217, Q248, Q372; (22) E217, Q248, K375; (23) E217, Q248, E379; (24) E217, Q372, K375; (25) E217, K375, E379; (26) E217, Q372, E379; (27) E217, R242, Q248, Q372; (28) E217, R242, Q248, E379; (29) E217, Q248, Q372, K375; (30) E217, R242, Q372, K375; (31) E217, R242, Q248, K375; (32) E217, Q372, K375, E379; (33) E217, Q248, K375, E379, (34) E217, Q248, Q372, E379; (35) E217, R242, K375, E379; (36) E217, R242, Q372, E379; (37) E217, Q248, Q372, K375, E379; (38) E217, R242, Q372, K375, E379; (39) E217, R242, Q248, K375, E379; (40) E217, R242, Q248, Q372, E379; 또는 (41) E217, R242, Q248, Q372, K375; 또는 (42) E217, R242, Q248, Q372, K375 E379를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특정 측면에서, 본 발명의 항체는 DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 에피토프는 서열번호 3의 R46, R48, R54 및 S55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함한다. 예를 들면, 이러한 에피토프는 (1) R46, R48, R54; (2) R46, R48, S55; (3) R46, R54, S55; (4) R48, R54, S55; 또는 (5) R46, R48, R54, S55를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특정 측면에서, 본 발명의 항체는 DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 에피토프는 서열번호 3의 Q248, S380, S384 및 V386으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함한다. 예를 들면, 이러한 에피토프는 (1) S380, S384, V386; (2) S380, S384, Q248; (3) S380, V386, Q248; (4) S384, V386, Q248; 또는 (5) S380, S384, V386, Q248을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특정 측면에서, 항체는 DPEP3에 특이적으로 결합하고, 결합에 대해 서열번호 21의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 23의 중쇄 가변영역(VH); 또는 서열번호 25의 VL 및 서열번호 27의 VH; 또는 서열번호 29의 VL 및 서열번호 31의 VH; 또는 서열번호 33의 VL 및 서열번호 35의 VH; 또는 서열번호 37의 VL 및 서열번호 39의 VH; 또는 서열번호 41의 VL 및 서열번호 43의 VH; 또는 서열번호 45의 VL 및 서열번호 47의 VH; 또는 서열번호 49의 VL 및 서열번호 51의 VH; 또는 서열번호 53의 VL 및 서열번호 55의 VH; 또는 서열번호 57의 VL 및 서열번호 59의 VH; 또는 서열번호 61의 VL 및 서열번호 63의 VH; 또는 서열번호 65의 VL 및 서열번호 67의 VH; 또는 서열번호 69의 VL 및 서열번호 71의 VH; 또는 서열번호 73의 VL 및 서열번호 75의 VH; 또는 서열번호 77의 VL 및 서열번호 79의 VH; 또는 서열번호 81의 VL 및 서열번호 83의 VH; 또는 서열번호 85의 VL 및 서열번호 87의 VH; 또는 서열번호 89의 VL 및 서열번호 91의 VH; 또는 서열번호 93의 VL 및 서열번호 95의 VH; 또는 서열번호 97의 VL 및 서열번호 99의 VH; 서열번호 101의 VL 및 서열번호 103의 VH; 또는 서열번호 105의 VL 및 서열번호 107의 VH; 또는 서열번호 109의 VL 및 서열번호 111의 VH; 또는 서열번호 113의 VL 및 서열번호 115의 VH; 또는 서열번호 117의 VL 및 서열번호 119의 VH; 또는 서열번호 121의 VL 및 서열번호 123의 VH; 또는 서열번호 125의 VL 및 서열번호 127의 VH; 또는 서열번호 129의 VL 및 서열번호 131의 VH; 또는 서열번호 133의 VL 및 서열번호 135의 VH; 또는 서열번호 137의 VL 및 서열번호 139의 VH; 또는 서열번호 141의 VL 및 서열번호 143의 VH; 또는 서열번호 145의 VL 및 서열번호 147의 VH; 또는 서열번호 149의 VL 및 서열번호 151의 VH; 또는 서열번호 153의 VL 및 서열번호 155의 VH; 또는 서열번호 157의 VL 및 서열번호 159의 VH; 또는 서열번호 161의 VL 및 서열번호 163의 VH; 또는 서열번호 165의 VL 및 서열번호 167의 VH; 또는 서열번호 169의 VL 및 서열번호 171의 VH; 또는 서열번호 173의 VL 및 서열번호 175의 VH; 또는 서열번호 177의 VL 및 서열번호 179의 VH; 또는 서열번호 181의 VL 및 서열번호 183의 VH; 또는 서열번호 185의 VL 및 서열번호 187의 VH를 포함하는 항체와 경쟁한다. 본 발명의 일부 측면에서, 항체는 키메라, CDR 이식된, 사람화 또는 재조합 항체 또는 이들의 단편이다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기한 서열을 포함하는 항체는 내재화(internalizing) 항체이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 DPEP3에 결합하고 결합에 대해 서열번호 189에 제시된 바와 같은 3개의 가변 경쇄 CDR(CDRL) 및 서열번호 191에 제시된 바와 같은 3개의 가변 중쇄 CDR(CDRH); 또는 서열번호 193에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 195에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH; 또는 서열번호 197에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 199에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH; 또는 서열번호 201에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 203에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH; 또는 서열번호 205에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 207에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH; 또는 서열번호 209에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 211에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH; 또는 서열번호 213에 제시된 바와 같은 3개의 CDRL 및 서열번호 215에 제시된 바와 같은 3개의 CDRH를 포함하는 항체와 경쟁하는 사람화 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 사람화 항체는 VH 및 VL을 포함하고, 여기서 VL은 서열번호 232의 CDRL1, 서열번호 233의 CDRL2 및 서열번호 234의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 238의 CDRL1, 서열번호 239의 CDRL2 및 서열번호 240의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 244의 CDRL1, 서열번호 245의 CDRL2 및 서열번호 246의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 250의 CDRL1, 서열번호 251의 CDRL2 및 서열번호 252의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 256의 CDRL1, 서열번호 257의 CDRL2 및 서열번호 258의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 262의 CDRL1, 서열번호 263의 CDRL2 및 서열번호 264의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL은 서열번호 268의 CDRL1, 서열번호 269의 CDRL2 및 서열번호 270의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는다.
본 발명의 다른 측면에서, 사람화 항체는 VH 및 VL을 포함하고, 여기서 VH는 서열번호 235의 CDRH1, 서열번호 236의 CDRH2 및 서열번호 237의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDR(CDRH)을 갖거나; VH는 서열번호 241의 CDRH1, 서열번호 242의 CDRH2 및 서열번호 243의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH는 서열번호 247의 CDRH1, 서열번호 248의 CDRH2 및 서열번호 249의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH는 서열번호 253의 CDRH1, 서열번호 254의 CDRH2 및 서열번호 255의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH는 서열번호 259의 CDRH1, 서열번호 260의 CDRH2 및 서열번호 261의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH는 서열번호 265의 CDRH1, 서열번호 266의 CDRH2 및 서열번호 267의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH는 서열번호 271의 CDRH1, 서열번호 272의 CDRH2 및 서열번호 273의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 사람화 항체는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 232의 CDRL1, 서열번호 233의 CDRL2 및 서열번호 234의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고, VH는 서열번호 235의 CDRH1, 서열번호 236의 CDRH2 및 서열번호 237의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 238의 CDRL1, 서열번호 239의 CDRL2 및 서열번호 240의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 241의 CDRH1, 서열번호 242의 CDRH2 및 서열번호 243의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH을 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 244의 CDRL1, 서열번호 245의 CDRL2 및 서열번호 246의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 247의 CDRH1, 서열번호 248의 CDRH2 및 서열번호 249의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 250의 CDRL1, 서열번호 251의 CDRL2 및 서열번호 252의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 253의 CDRH1, 서열번호 254의 CDRH2 및 서열번호 255의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 256의 CDRL1, 서열번호 257의 CDRL2 및 서열번호 258의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 259의 CDRH1, 서열번호 260의 CDRH2 및 서열번호 261의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 262의 CDRL1, 서열번호 263의 CDRL2 및 서열번호 264의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 265의 CDRH1, 서열번호 266의 CDRH2 및 서열번호 267의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, 여기서 VL이 서열번호 268의 CDRL1, 서열번호 269의 CDRL2 및 서열번호 270의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 271의 CDRH1, 서열번호 272의 CDRH2 및 서열번호 273의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 216으로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 217로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 218로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 219로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 220으로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 221로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 222로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 223으로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 224로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 225로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 224로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 226으로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 227로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 228로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 229로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 230으로서 제시된 전체길이 중쇄를 포함하는, DPEP3에 결합하는 사람화 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항-DPEP3 항체가 페이로드(payload)에 접합되어 있는 항-DPEP3 항체 약물 접합체를 제공한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항-DPEP3 항체들 중 어느 하나의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 이러한 핵산을 함유하는 벡터 또는 이러한 핵산을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 적합한 항-DPEP3 항체 약물 접합체(ADC)는 일반적으로 식 Ab-[L-D]n을 포함하고, 여기서 Ab는 DPEP3에 결합하는 항체를 포함하고; L은 임의의 링커이고; D는 약물이고; n은 약 1 내지 약 20의 정수이다. 특히 바람직한 실시형태에서, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD)을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 항-DPEP3 ADC를 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항-DPEP3 ADC를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 난소암(예: 장액성 난소 암종(ovarian-serous carcinoma) 또는 유두상 장액성 난소 암종(ovarian-papillary serous carcinoma)) 폐암, 유방암 및 자궁내막암과 같은 암의 치료 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항-DPEP3 ADC를 투여함을 포함하고 대상체에게 적어도 하나의 추가 치료학적 모이어티를 투여함을 추가로 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 종양 개시 세포 및 종양 개시 세포 이외의 암 세포를 포함하는 종양 세포 집단을 (예를 들면, 생체내 또는 생체내에서) 항-DPEP3 ADC와 접촉시킴을 포함하며; 이에 의해 종양 개시 세포의 빈도가 감소되는, 종양 세포 집단에서 종양 개시 세포를 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에서는, 세포를 항-DPEP3 ADC와 접촉시킴을 포함하여, 세포독소를 세포로 전달하는 방법이 추가로 개시된다.
도 1a 및 1b는 SOLiD(도 1a) 또는 일루미나(Illumina) 플랫폼(도 1b)을 사용하여 분석된 선택된 환자-유래 이종이식편(PDX) 종양에서 전체 전사체 서열분석(sequencing)에 의해 측정된 DPEP3 mRNA 발현을 도시한다.
도 2a는 난소 PDX 종양 아형에서 qRT-PCR에 의해 측정된 DPEP3 mRNA 발현을 도시한다.
도 2b는 qRT-PCR 오리겐(Origene) 어레이에 의해 측정된, 다양한 종양 유형을 갖는 환자로부터의 전체 종양 표본(검은색 점) 또는 정상 조직(흰색 점)에서의 DPEP3 mRNA 발현을 도시한다.
도 3은 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) 데이터베이스로부터 유래된, 난소, 폐 및 피부 종양 및 정상 조직에서의 DPEP3의 mRNA 발현을 도시한다.
도 4는 이소타입(isotype), DPEP3에 대한 친화도 및 DPEP2와 DPEP3의 오톨로그(ortholog)에 대한 교차 반응성을 포함하는 본 발명의 항-DPEP3 항체들의 다양한 특징들을 표로 나타낸 도식이다.
도 5a 내지 5d는 마우스 및 사람화 항-DPEP3 항체들의 아미노산 및 핵산 서열을 제공한다. 도 5a 및 5b는 예시적인 뮤린(murine) 및 사람화 항-DPEP3 항체들의 경쇄(도 5a) 및 중쇄(도 5b) 가변영역의 아미노산 서열(서열번호 21 내지 215, 홀수)를 도시한다. 도 5c는 예시적인 마우스 및 사람화 항-DPEP3 항체들의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(서열번호 20 내지 214, 짝수)를 도시한다. 도 5d는 예시적인 사람화 항-DPEP3 항체들의 경쇄 및 중쇄의 전체길이 아미노산 서열을 도시한다(서열번호 216 내지 230).
도 5e 내지 5k는 뮤린 항-DPEP3 항체들, SC34.2(도 5e), SC34.11 (도 5f), SC27.14 (도 5g), SC34.25 (도 5h), SC34.28(도 5i), SC34.38 (도 5j) 및 SC34.87(도 5k)의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 주석이 달린(annotated) 아미노산 서열(카뱃(Kabat) 등에 따라 번호매겨짐)을 도시하며, 여기서 CDR은 카뱃(Kabat), 초티아(Chothia), ABM 및 콘택트(Contact)(맥캘럼(MacCallum)) 방법을 사용하여 유도된다.
도 6은 다양한 BR 및 OV PDX 종양 아집단에서의 DPEP3 단백질 발현을 도시한다.
도 7a는 유세포분석법을 사용하여, DPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포에 결합하는 수많은 항-DPEP3 항체의 능력을 도시하며, 여기서 결과는 히스토그램으로서 나타내져 있으며 검은색 실선은 이소타입-대조군(회색으로 채워짐)과 비교한 DPEP3을 과발현하는 세포에의 표시된 항체의 결합을 나타낸다.
도 7b 내지 7d는 이소타입-대조군(회색으로 채워짐)을 이용한 염색과 비교한, 특정한 항-DPEP3 항체를 이용한 유세포분석법에 의해 측정된 바와 같은 난소 종양 세포 집단의 3가지 아형에서 비-종양형성성 세포(파선)와 비교한 종양 개시 세포의 표면상의 DPEP3 단백질 발현(검은색 실선)을 도시한다.
도 8a 및 8b는 면역조직화학(도 8a) 및 제자리(in situ) 하이브리드화(도 8b)에 의해 측정된 바와 같은 고등급 장액성 난소 암종의 조직 마이크로어레이에서의 DPEP3 발현을 도시한다.
도 9는 시험관내에서 사포린 세포독소 전달을 매개함으로써 DPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포 내로 내재화하고 세포를 사멸시키는 다수의 항-DPEP3-사포린 항체 약물 접합체의 능력을 도시한다.
도 10a 및 10b는 부위 특이적 항-DPEP3 항체 약물 접합체의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석(도 10a) 및 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피(도 10b)를 도시한다.
도 11은 시험관내에서 PBD 세포독소 전달을 매개함으로써 DPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포 내로 내재화하고 세포를 사멸시키는 다수의 항-DPEP3-PBD1 항체 약물 접합체의 능력을 도시한다.
도 12는 DPEP3을 발현하지 않는 난소 종양(OV87MET)과 비교해 DPEP3을 발현하는 난소 PDX 종양(OV27MET)의 체적을 생체내에서 감소시키는 항-DPEP3-PBD1 항체 약물 접합체의 능력을 도시한다.
본 발명은 다수의 상이한 형태로 구체화될 수 있다. 본원에는 이의 원리들을 예시하는 본 발명의 비제한적이고 예시적인 실시양태들이 개시되어 있다. 본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 기재내용의 목적을 위해, 모든 식별 서열 수탁 번호는 달리 지시되지 않는 한 NCBI 참조 서열(RefSeq) 데이터베이스 및/또는 NCBI GenBank® 문서보존 서열 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
DPEP3은 놀랍게도 다수의 종양 유형의 생물학적 마커인 것으로 밝혀졌으며, 이의 연관성이 이러한 종양의 치료를 위해 활용될 수 있다. 또한 예측하지 못하게도, DPEP3이 종양형성 세포와 연합하며 이들을 억제시키거나 제거하는데 효과적으로 활용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하기에 보다 상세하게 설명되는 종양형성 세포는 여러 통상의 치료들에 대해 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 선행 기술의 교시와는 반대로, 개시된 화합물, 조성물 및 방법은 이러한 고유의 내성을 효과적으로 극복한다.
본 발명은 항-DPEP3 항체(항체 약물 접합체 포함), 및 어떠한 특정 작용 기작 또는 특이적으로 표적화된 세포 또는 분자 성분과 관계없이 각종 DPEP3-관련 암의 예후, 진단, 테라그노시스, 치료 및/또는 예방에서의 이의 용도를 제공한다.
I. DPEP3 생리학
디펩티다제 3(DPEP3; MBD3로서도 공지됨)은 다양한 디펩타이드 및 아미드-유사 연결을 함유하는 일부 항생제(예: 벡타-락탐 및 페넴)의 가수분해 대사에 관여하는 디펩티다제 단백질의 DPEP 계열로부터의 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커된 구성원 단백질이다. 마우스 DPEP3은 글루타티온 절단 생성물인 시스티닐-비스-글리신을 절단하는 것으로 나타나다(Habib et al., PMID: 12738806). 대표적인 DPEP3 단백질 오르톨로그는 사람(UniProtKB Q9H4B8.2 [서열번호 4], NP_071752.3 [서열번호 5]), 침팬지(NP_001266956), 레수스 원숭이(NP_00180985), 래트(NP_001008384, [서열번호 10]) 및 마우스(NP_082236, [서열번호 8]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
사람에서, DPEP3 유전자는 관련 유전자 DPEP2와 함께 머리-꼬리 클러스터로서 16번 염색체상에서 약 2 kBp에 걸쳐있는 10개의 엑손으로 이루어지며, 이는 단백질 수준에서 약 75% 동일성을 공유한다. DPEP3 유전자좌의 전사는 2가지 공지된 RNA 전사체, 즉 513개 아미노산 전구단백질(NP_071752.3)을 암호화하는 1.76kBp의 보다 긴 성숙 전사체(NM_022357) 및 512개 아미노산 전구단백질(NP_001123230)을 암호화하는 1.75kBp의 대안적으로 스플라이싱된 보다 짧은 성숙 전사체(NM_00129758)를 산출한다. 2개의 긴 전사체 이외에, 짧은 리더 서열을 갖고 488개 아미노산을 포함하는 DPEP3 전구단백질의 대안적 버젼이 또한 제공되었다(UniProtKB Q9H4B8.2, 서열번호 4). 보다 긴 512개 및 513개 아미노산 동종형(isoform)과 관련하여, 제안된 리더 서열은 약 60개 아미노산 잔기를 포함하는 한편, 보다 짧은 488개 아미노산 DPEP3 분자의 경우, 리더 서열은 35개 아미노산을 포함한다. 각 경우에, 전구단백질의 분비 시그널 펩타이드(60개 또는 35개 아미노산)가 제거되어 453개 아미노산의 성숙 단백질(UniProtKB Q9H4B8.2, 서열번호 3)이 제공되며, 이는 이후에 추가 프로세싱되어 최종 25개 아미노산을 제거하고 성숙 단백질을 GPI 앵커를 통해 세포 막에 연결시킨다. 성숙 DPEP3의 나머지 세포외 도메인은 428개 아미노산(서열번호 3의 A1 내지 S428)을 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, DPEP3 항원의 모든 잔기의 번호매김(예를 들면, 에피토프 구성원에 대해)은 서열번호 3에 기초할 것이다.
DPEP3 단백질은 펩티다제 M19 계열의 구성원이며, 모든 구성원은 효소적 기능을 위해 아연 보조인자를 필요로 한다. 적어도 마우스 고환 생식세포에서는, 촉매적 복합체가 디설파이드 연결된 동종이량체로서 형성된다(Yoshitake et al., 2011: PMID: 21724266). 본원에 제시된 것 이외의 사람 DPEP3 단백질의 기능 및 발현에 관해서는 제한된 정보만이 있다. 마우스 DPEP3 단백질 발현은 고환으로 제한되었고 글루타티온 절단 생성물인 시스티닐-비스-글리신을 절단하는 것으로 나타났다(Habib et al., PMID: 12738806). DPEP3과 암 간의 기능적 관계 또는 연관성에 관해 본 발명자들에게 알려진 공개된 보고서는 없었다.
II. 암 줄기 세포
최근 모델에 따르면, 종양은 비-종양형성 세포와 종양형성 세포를 포함한다. 비-종양형성 세포는 자가-재생 능력을 갖지 않으며, 면역약화된 마우스에 과잉 세포 수로 이식될 경우에도, 종양을 재현성있게 형성하지 못한다. 종양의 세포 집단의 0.1 내지 40%(보다 전형적으로 0.1 내지 10%)를 구성하는, 본원에서 "종양 개시 세포"(TIC)라고도 언급되는 종양형성 세포는 종양을 형성하는 능력을 갖는다. 종양형성 세포는 암 줄기 세포(CSC)와 상호교환 가능하게 언급되는 종양 영속화 세포(TPC) 및 종양 기원세포(TProg) 둘 다를 포함한다.
CSC는, 정상 조직에서 세포 분류계급을 뒷받침하는 정상 줄기 세포처럼, 다중계통 분화 능력을 유지하면서 무한정으로 자가-복제할 수 있다. CSC는 종양형성 자손 및 비-종양형성 자손 둘 다를 생성할 수 있고, 연속적 단리 및 면역약화된 마우스로의 적은 수의 단리된 CSC의 이식에 의해 입증되는 바와 같이 모 종양의 이종 세포 조성을 완전히 재현할 수 있다.
TProg는, CSC처럼, 1차 이식에서 종양 성장을 북돋울 수 있는 능력을 갖는다. 그러나, CSC와는 달리, 이들은 모 종양의 세포 이종성을 재현할 수 없고, TProg는 면역약화된 마우스로의 적은 수의 고도로 정제된 TProg의 연속 이식에 의해 입증되는 바와 같이 전형적으로 한정된 수의 세포 분열만을 할 수 있기 때문에 후속적인 이식에서 종양형성을 재개시하는데 있어서 덜 효율적이다. TProg는 초기 TProg 및 후기 TProg로 더욱 세분될 수 있는데, 이것은 표현형(예를 들면, 세포 표면 마커) 및 종양 세포 구조를 재현할 수 있는 이들의 상이한 능력에 의해 구분될 수 있다. 종양을 CSC와 동일한 정도로 재현할 수는 없지만, 초기 TProg는 후기 TProg보다 모 종양 특징을 재현할 수 있는 더 큰 능력을 갖는다. 상기한 차이에도 불구하고, 몇몇 TProg 집단은, 드물게는, 통상적으로 CSC에 기인하는 자가-재생 능력을 얻을 수 있고 자체로 CSC로 될 수 있는 것으로 나타났다.
CSC는 보다 높은 종양형성성을 나타내고, (i) TProg(초기 및 후기 TProg 둘 다); 및 (ii) CSC로부터 유도될 수 있고 전형적으로 종양의 대부분을 차지할 수 있는 종양-침윤 세포, 예를 들면, 섬유아세포/스트로마, 내피 및 조혈 세포와 같은 비-종양형성 세포보다 비교적 더 휴지상태이다. 종래의 요법 및 용법이, 대부분, 종양을 용적 축소시키고 급속하게 증식하는 세포를 공격하도록 설계되었다는 것을 고려해 볼 때, CSC는 더 빠르게 증식하는 TProg 및 비-종양형성 세포와 같은 다른 벌크 종양 세포 집단보다 종래의 요법 및 용법에 대해 더욱 내성이다. CSC를 종래의 치료법에 대해 비교적 화학내성이도록 만들 수 있는 다른 특징은 다제내성 운반체의 증가된 발현, 증진된 DNA 수복 기작 및 항-아폽토시스 유전자 발현이다. 표준 화학요법은 지속적인 종양 성장과 재발을 실제로 촉진시키는 CSC를 표적화하지 못하기 때문에, CSC에 있어서의 이러한 특성들이 진행 단계 신생물을 갖는 대부분의 환자를 위한 장기 이익을 보장하기 위한 표준 종양학 치료 용법의 실패에 대한 주요 원인을 구성한다.
놀랍게도, DPEP3 발현이 다양한 종양형성 세포 집단과 연관되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명은, 종양형성 세포를 표적화하는데 특히 유용할 수 있고 종양형성 세포를 침묵화, 감작화, 중화, 빈도 감소, 차단, 폐지, 간섭, 감소, 방해, 제한, 제어, 고갈, 조정, 매개, 축소, 재프로그램화, 제거, 또는 달리 저해(총칭하여, "저해")하는데 사용하여 증식성 장애(예를 들면, 암)의 치료, 관리 및/또는 예방을 촉진시킬 수 있는 항-DPEP3 항체를 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 신규 항-DPEP3 항체는 DPEP3 결정인자의 형태(예를 들면, 표현형 또는 유전자형)에 관계없이 대상체에 투여시 종양형성 세포의 빈도 또는 종양형성성을 바람직하게는 감소시키도록 선택될 수 있다. 종양형성 세포 빈도의 감소는 (i) 종양형성 세포의 억제 또는 박멸; (ii) 종양형성 세포의 성장, 확장 또는 재발의 제어; (iii) 종양형성 세포의 개시, 전파, 유지, 또는 증식의 중단; 또는 (iv) 종양형성 세포의 생존, 재생 및/또는 전이의 방해의 결과로서 일어날 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 종양형성 세포의 억제는 하나 이상의 생리학적 경로의 변화의 결과로서 일어날 수 있다. 경로의 변화는, 종양형성 세포의 억제에 의해서든, (예를 들면, 유도된 분화 또는 틈새 붕괴에 의한) 이들의 잠재성의 변경에 의해서든, 또는 달리 종양형성 세포가 종양 환경 또는 다른 세포에 영향을 미치는 능력을 방해하는 것에 의해서든지, 종양형성, 종양 유지 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 DPEP3 관련 장애의 보다 효과적인 치료를 가능하게 한다.
종양형성 세포의 빈도 감소를 평가하기 위해 사용될 수 있는 방법은 바람직하게는 시험관내 또는 생체내 한계희석 분석에 의한 세포계수 또는 면역조직화학 분석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(Dylla et al. 2008, PMID: PMC2413402 및 Hoey et al. 2009. PMID: 19664991).
시험관내 한계희석 분석은, 콜로니 형성을 조성하는 고체 배지에서 (예를 들면, 각각 처리 및 비처리 종양으로부터의) 분획된 또는 비분획된 종양 세포를 배양하고 성장하는 콜로니를 계수 및 특징 규명함으로써 수행할 수 있다. 또는, 종양 세포를 액체 배지를 함유하는 웰을 갖는 플레이트로 연속적으로 희석시킬 수 있으며, 각각의 웰은 접종 후 언제라도, 그러나 바람직하게는 접종한지 10일 이상 후 콜로니 형성에 대해 양성 또는 음성으로서 점수를 매길 수 있다.
생체내 한계희석은 비처리 대조군으로부터 또는 선택된 치료제에 노출된 종양으로부터의 종양 세포를 면역약화된 마우스에게 연속 희석으로 이식한 다음 각 마우스를 종양 형성에 대해 양성 또는 음성으로서 점수매김함으로써 수행된다. 점수매김은 이식된 종양이 검출 가능해진 후 언제라도 일어날 수 있지만, 바람직하게는 이식한지 60일 이상 후 수행될 수 있다. 종양형성 세포의 빈도를 측정하기 위한 한계희석 실험의 결과의 분석은 바람직하게는 푸아송 분포 통계(Poisson distribution statistics)를 사용하거나 종양을 생체내 생성하거나 생성하지 못하는 능력과 같은 이미 정해진 확실한 사례의 빈도를 평가함으로써 수행된다(참조: Fazekas et al., 1982, PMID: 7040548).
유세포분석법 및 면역조직화학이 또한 종양형성 세포 빈도를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 기술들 둘 다는 종양형성 세포에 대해 풍부한 것으로 알려진 당업계에서 인지된 세포 표면 단백질 또는 마커와 결합하는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용한다(제WO 2012/031280호 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 유세포분석법(예를 들면, 형광 활성화 세포 분류(FACS))이 또한 종양형성 세포를 포함한 다양한 세포 집단을 특징 규명, 단리, 정제, 풍부화 또는 분류하는데 사용될 수 있다. 유세포분석법은 세포의 혼합 집단이 현탁되어 있는 체액 스트림을 초당 수천개 이하의 입자의 물리적 및/또는 화학적 특성을 측정할 수 있는 전자 검출 장치를 통해 통과시킴으로써 종양형성 세포 수준을 측정한다. 면역조직화학은 종양형성 세포 마커에 결합하는 표지화된 항체 또는 시약으로 조직 샘플을 염색함으로써 제 자리에서(예를 들면, 조직 단편에서) 종양형성 세포를 가시화할 수 있다는 점에서 추가의 정보를 제공한다.
본 발명의 항체는, 예를 들면, 유세포분석법, 자기 활성화 세포 분류(MACS), 레이저 매개 절단 또는 FACS와 같은 방법들을 통해 종양형성 세포의 집단 또는 아집단을 동정, 특징 규명, 모니터링, 단리, 절편화 또는 풍부화하는데 사용될 수 있다. FACS가 특정 세포 표면 마커에 기초하여 99.5% 초과의 순도로 세포 아집단을 단리하는데 사용되는 신뢰성있는 방법이다. CSC를 포함한 종양형성 세포의 특징 규명 및 조작을 위한 기타의 양립할 수 있는 기술은, 예를 들면, U.S.P.N. 제12/686,359호, 제12/669,136호 및 제12/757,649호에서 볼 수 있다.
CSC 집단과 관련되고 CSC를 단리하거나 특징 규명하는데 사용되는 마커들이 하기에 열거되어 있다: ABCA1, ABCA3, ABCG2, ADAM9, ADCY9, ADORA2A, AFP, AXIN1, B7H3, BCL9, Bmi-1, BMP-4, C20orf52, C4.4A, 카복시펩티다제 M, CAV1, CAV2, CD105, CD133, CD14, CD16, CD166, CD16a, CD16b, CD2, CD20, CD24, CD29, CD3, CD31, CD324, CD325, CD34, CD38, CD44, CD45, CD46, CD49b, CD49f, CD56, CD64, CD74, CD9, CD90, CEACAM6, CELSR1, CPD, CRIM1, CX3CL1, CXCR4, DAF, 데코린, easyh1, easyh2, EDG3, eed, EGFR, ENPP1, EPCAM, EPHA1, EPHA2, FLJ10052, FLVCR, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, GD2, GJA1, GLI1, GLI2, GPNMB, GPR54, GPRC5B, IL1R1, IL1RAP, JAM3, Lgr5, Lgr6, LRP3, LY6E, MCP, mf2, mllt3, MPZL1, MUC1, MUC16, MYC, N33, Nanog, NB84, nestin, NID2, NMA, NPC1, 온코스타틴 M, OCT4, OPN3, PCDH7, PCDHA10, PCDHB2, PPAP2C, PTPN3, PTS, RARRES1, SEMA4B, SLC19A2, SLC1A1, SLC39A1, SLC4A11, SLC6A14, SLC7A8, smarcA3, smarcD3, smarcE1, smarcA5, Sox1, STAT3, STEAP, TCF4, TEM8, TGFBR3, TMEPAI, TMPRSS4, 트랜스페린 수용체, TrkA, WNT10B, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, YY1 및 β-카테닌. 문헌[예를 들면, Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 제7,632,678호 및 U.S.P.N. 제2007/0292414호, 제2008/0175870호, 제2010/0275280호, 제2010/0162416호 및 제2011/0020221호]을 참조한다.
유사하게, 특정 종양 유형의 CSC와 연관된 세포 표면 표현형의 비제한적인 예는 CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2β1 hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+ 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 CSC 표면 표현형을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Schulenburg et al., 2010, supra, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 및 U.S.P.N. 제2008/0138313호]을 참조한다. 본 발명과 관련하여 특히 관심을 끄는 것은 CD46hiCD324+ 표현형을 포함하는 CSC 제제이다.
마커 또는 마커 표현형에 적용되는 바와 같은 "양성", "낮은" 및 "음성" 발현 수준은 다음과 같이 정의된다. 음성 발현(즉, "-")을 갖는 세포는 본원에서 추가의 형광 방출 채널에서 관심 대상의 다른 단백질에 대한 칵테일 표지를 염색하는 완전 항체의 존재하에서 형광 채널에서 이소타입 대조 항체로 관찰되는 발현의 95번째 백분위수 이하를 발현하는 세포로서 정의된다. 당업계의 숙련가들은 음성 사례를 정의하기 위한 이러한 과정을 "fluorescence minus one" 또는 "FMO" 염색이라고 한다는 것을 인지할 것이다. 상기한 FMO 염색 과정을 사용하여 이소타입 대조 항체로 관찰된 발현의 95번째 백분위수 이상의 발현을 갖는 세포는 본원에서 "양성"(즉, "+")으로서 정의된다. 본원에 정의된 바와 같이, "양성"으로서 광범위하게 정의된 다양한 세포 집단이 있다. 세포는 항원의 관측된 평균 발현이 상기한 이소타입 대조 항체로의 FMO 염색을 사용하여 측정된 95번째 백분위수 초과라면 양성으로서 정의된다. 양성 세포는, 관측된 평균 발현이 FMO 염색에 의해 측정된 95th 백분위수 초과이고 95번째 백분위수의 1의 표준 편차내에 있다면, 낮은 발현을 갖는 세포(즉, "lo")라고 할 수 있다. 대안적으로, 양성 세포는, 관측된 평균 발현이 FMO 염색에 의해 측정된 95번째 백분위수 초과이고 95번째 백분위수 초과의 1보다 큰 표준 편차내에 있다면, 높은 발현을 갖는 세포(즉, "hi")라고 할 수 있다. 또다른 실시형태에서 99th 백분위수는 바람직하게는 음성 및 양성 FMO 염색 간의 구분점(demarcation point)으로서 사용될 수 있으며, 특히 바람직한 실시형태에서 백분위수는 99%보다 클 수 있다.
CD46hiCD324+ 마커 표현형 및 바로 앞에 예시된 것들은 추가의 분석을 위해 TIC 및/또는 TPC 세포 또는 세포 집단을 특징 규명, 단리, 정제 또는 풍부화하기 위해 표준 유세포분석법 분석 및 세포 분류 기술과 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체가 종양형성 세포의 빈도를 감소시키는 능력은 상기한 기술 및 마커를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, 항-DPEP3 항체는 종양형성 세포의 빈도를 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 심지어 35%까지 감소시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 종양형성 세포의 빈도의 감소는 대략 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 개시된 화합물은 종양형성 세포의 빈도를 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 심지어 95%까지 감소시킬 수 있다. 종양형성 세포의 빈도의 감소는 신생물의 종양형성성, 지속, 재발 및 공격에 있어서의 상당한 감소를 초래할 가능성 있다고 인지될 것이다.
III. 항체
A. 항체 구조
허용된 명명법 및 번호매김 방식을 포함한, 항체 및 이의 변이체 및 유도체는, 예를 들면, 문헌[Abbas et al. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6th Ed.), W.B. Saunders Company; or Murphey et al. (2011), Janeway's Immunobiology (8th Ed.), Garland Science]에 광범위하게 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "항체" 또는 "온전한 항체"는 전형적으로 공유 디설파이드 결합 및 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 Y자형 사량체 단백질을 나타낸다. 각각의 경쇄는 하나의 가변 도메인(VL)과 하나의 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH)과 불변영역을 포함하며, 이것은 IgG, IgA, 및 IgD 항체의 경우, CH1, CH2, 및 CH3으로 지칭되는 3개의 도메인을 포함한다(IgM 및 IgE는 제4 도메인, CH4를 갖는다). IgG, IgA, 및 IgD 부류에서, CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지 영역에 의해 분리되며, 상기 영역은 가변 길이(다양한 IgG 아부류에서 약 10개 내지 약 60개의 아미노산)의 프롤린 및 시스테인 풍부 단편이다. 경쇄 및 중쇄 둘 다에서의 가변 도메인은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 불변 도메인에 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개의 추가 아미노산의 "D" 영역을 갖는다. 각 부류의 항체는 쌍을 이룬 시스테인 잔기에 의해 형성된 쇄간 및 쇄내 디설파이드 결합을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 다클론성(multiclonal) 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화 및 영장류화 항체, CDR 이식 항체, 사람 항체, 재조합에 의해 생산된 항체, 인트라바디, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항-유전자형 항체, 뮤테인 및 이의 변이체를 포함한 합성 항체, 면역특이성 항체 단편, 예를 들면, Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') 단편, 단일-쇄 단편(예를 들면, ScFv 및 ScFvFc); 및 Fc 융합 및 기타의 변형을 포함한 이의 유도체, 및 결정인자와의 우선적인 연합 또는 결합을 나타내는 한, 임의의 다른 면역반응성 분자를 포함한다. 게다가, 달리 문맥상 제약에 의해 지시되지 않는 한, 상기 용어는 모든 부류의 항체(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 모든 아부류(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 추가로 포함한다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 전형적으로 각각 상응하는 소문자 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시된다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 명확히 다른 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
항체의 가변 도메인은 항체마다 아미노산 조성의 상당한 차이를 보이며, 주로 항원 인식 및 결합을 담당한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역은 온전한 IgG 항체가 2개의 결합 부위를 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다(즉, 이것은 2가이다). VH 및 VL 도메인은 골격 영역(FR)으로 공지된 4개의 덜 가변적인 영역에 의해 프레임화되고 분리된, 초가변영역 또는 더 통상적으로 상보성-결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 극단적 가변성의 영역을 포함한다. VH와 VL 영역 간의 비-공유 연합은 항체의 2개의 항원-결합 부위 중 하나를 함유하는 Fv 단편("가변 단편"에 대해)을 형성한다. 유전자 조작에 의해 수득될 수 있는 ScFv 단편(단일 쇄 가변 단편에 대해)은 펩타이드 링커에 의해 분리된, 항체의 VH 및 VL 영역인 단일 폴리펩타이드 쇄에서 연합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 각 도메인, 골격 영역 및 CDR로의 아미노산의 할당은 달리 지시되지 않는 한 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th　Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650; 또는 Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co. 또는 AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)]에 제공된 번호매김 방식 중 하나에 따를 수 있다. Abysis 웹사이트 데이터베이스(하기)로부터 입수된 카뱃, 초티아, 맥캘럼(콘택트(Contact)로도 공지되어 있음) 및 AbM에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 하기에 기재되어 있다.
Figure pct00001
항체 서열에서 가변영역 및 CDR은 당업계에서 개발된 일반적인 규칙(상기 기재된 바와 같음, 예를 들면, 카뱃의 번호매김 방식)에 따라 또는 서열을 공지된 가변영역의 데이터베이스에 대해 정렬시킴으로써 동정될 수 있다. 이들 영역을 동정하는 방법은 문헌[Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적인 데이터베이스는 "Abysis" 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs(상기 웹사이트는 영국 런던 소재의 유니버시티 컬리지 런던 생화학 및 분자 생물학부의 A. C. 마틴(Martin)에 의해 유지됨) 및 문헌(참조: Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005))에 기재된 바와 같은 VBASE2 웹사이트 www.vbase2.org에 기재되어 있고 이를 통해 접근될 수 있다. 바람직하게는 서열은 카뱃, IMGT 및 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터의 서열 데이터와 PDB로부터의 구조 데이터를 통합한 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석된다(Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 또한 웹사이트 bioinforg.uk/abs 상에서 이용가능함)). Abysis 데이터베이스 웹사이트는 본원의 교시에 따라 사용될 수 있는 CDR을 동정하기 위해 개발된 일반적인 규칙을 추가로 포함한다. 본원에 첨부된 도 5e 내지 5k는 몇몇 예시적인 중쇄 및 경쇄 가변영역의 주석달기(annotation)에 있어서 이러한 분석 결과를 도시한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 모든 CDR은 카뱃 등에 따른 Abysis 데이터베이스에 따라 유도된다.
본 발명에 논의된 중쇄 불변영역 아미노산 위치에 대해, 번호매김은 보고된 바에 의하면 최초로 서열분석된 사람 IgG1인 서열분석된 골수종 단백질 Eu의 아미노산 서열을 기재하는 문헌[Edelman et al., 1969, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85]에 처음으로 기재된 Eu 지수에 따른다. 에델만(Edelman)의 Eu 지수는 문헌[카뱃 등, 1991(상기)]에 또한 기재되어 있다. 따라서, 중쇄의 맥락에서 용어 "카뱃에 제시된 바와 같은 Eu 지수" 또는 "카뱃의 Eu 지수" 또는 "Eu 지수"는 문헌[카뱃 등, 1991(상기)]에 기재된 에델만 등의 사람 IgG1 Eu 항체를 기초로 하는 잔기 번호매김 방식을 나타낸다. 경쇄 불변영역 아미노산 서열에 사용된 번호매김 방식도 유사하게 문헌[카뱃 등, 1991]에 기재되어 있다. 본 발명에 적합한 예시적인 카파 경쇄 불변영역 아미노산 서열은 바로 하기에 제시되어 있다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1).
유사하게, 본 발명에 적합한 예시적인 IgG1 중쇄 불변영역 아미노산 서열이 바로 하기에 제시되어 있다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 2).
개시된 불변영역 서열, 또는 이의 변이체 또는 유도체는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 개시된 중쇄 및 경쇄 가변영역과 작동적으로 연합되어, 그 자체로 사용될 수 있거나 본 발명의 항-DPEP3 ADC에 혼입될 수 있는 전체길이 항체를 제공할 수 있다.
보다 일반적으로 본 발명의 항체 또는 면역글로불린은 관련 결정인자를 특이적으로 인식하거나 이와 연합하는 임의의 항체로부터 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "결정인자" 또는 "표적"은 특정 세포, 세포 집군 또는 조직과 식별가능하게 연합하거나 이들에서 또는 이들 상에서 특이적으로 발견되는 임의의 검출가능한 특징, 성질, 마커 또는 인자를 의미한다. 결정인자 또는 표적은 성질상 형태적, 기능적 또는 생화학적일 수 있으며 바람직하게는 표현형이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 결정인자는 특정 세포 유형 또는 특정 조건 하의 세포(예를 들면, 세포 주기의 특정 시점 동안 또는 특정 적소에서의 세포)에 의해 상이하게 발현된(과발현 또는 저발현된(underexpressed)) 단백질이다. 본 발명의 목적을 위해, 결정인자는 바람직하게는 이상 암 세포에서 상이하게 발현되고 DPEP3 단백질, 또는 이의 스플라이스 변이체, 동종형 상동체 또는 계열 구성원 중 어느 것, 또는 이의 특정 도메인, 영역 또는 에피토프를 포함할 수 있다. "항원", "면역원 결정인자", "항원 결정인자" 또는 "면역원"은 면역적격 동물에 도입될 때 면역 반응을 자극할 수 있고 면역 반응으로부터 생성된 항체에 의해 인식되는 임의의 단백질 또는 이의 단편, 영역 또는 도메인을 의미한다. 본원에 고려되는 DPEP3 결정인자의 존재 또는 부재는 세포, 세포 아집단 또는 조직(예를 들면, 종양, 종양형성 세포 또는 CSC)을 동정하는데 사용될 수 있다.
면역글로불린 분자에는 두 가지 유형의 디설파이드 브릿지 또는 결합이 있다: 쇄간 및 쇄내 디설파이드 결합. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 쇄간 디설파이드 결합의 위치 및 수는 면역글로불린 부류 및 종에 따라 상이하다. 본 발명이 임의의 특정 부류 또는 아부류의 항체로 제한되지는 않지만, IgG1 면역글로불린이 예시 목적으로 본 기재내용 전반에 걸쳐 사용될 것이다. 야생형 IgG1 분자에는 12개의 쇄내 디설파이드 결합(각 중쇄에 4개 및 각 경쇄에 2개) 및 4개의 쇄간 디설파이드 결합이 있다. 쇄내 디설파이드 결합은 일반적으로 다소 보호되며 쇄간 결합보다 환원에 비교적 덜 민감하다. 역으로, 쇄간 디설파이드 결합은 면역글로불린의 표면에 위치하고, 용매에 접근할 수 있으며, 통상적으로 비교적 쉽게 환원된다. 두 개의 쇄간 디설파이드 결합이 중쇄들 간에 존재하며, 하나는 각 중쇄에서 이의 각각의 경쇄까지의 결합이다. 쇄간 디설파이드 결합은 쇄 연합에 필요하지 않은 것으로 입증되었다. IgG1 힌지 영역은 쇄간 디설파이드 결합을 형성하는 중쇄에 시스테인을 함유하며, 이것은 Fab 움직임을 용이하게 하는 구조적 가요성과 함께 구조적 지지를 제공한다. 중쇄/중쇄 IgG1 쇄간 디설파이드 결합은 잔기 C226와 C229(Eu 번호매김)에 위치하는 반면 IgG1(중쇄/경쇄)의 경쇄와 중쇄 사이의 IgG1 쇄간 디설파이드 결합은 카파 또는 람다 경쇄의 C214와 중쇄의 상부 힌지 영역에서의 C220 사이에서 형성된다.
B. 항체 생성 및 생산
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 각종 방법들을 사용하여 생산될 수 있다.
1. 숙주 동물에서 폴리클로날 항체의 생성
다양한 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생산은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane (Eds.) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; and Harlow et al. (1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press] 참조). 폴리클로날 항체를 생성하기 위해, 면역적격 동물(예: 마우스, 래트, 토끼, 염소, 비-사람 영장류 등)을 항원성 단백질 또는 항원성 단백질을 포함하는 세포 또는 제제로 면역화한다. 일정 기간 후, 동물을 채혈하거나 희생시킴으로써 폴리클로날 항체-함유 혈청을 수득한다. 혈청은 동물로부터 입수된 형태로 사용될 수 있거나, 항체는 면역글로불린 분획 또는 분리된 항체 제제를 제공하도록 일부 또는 전부 정제될 수 있다.
임의의 형태의 항원, 또는 항원을 함유하는 세포 또는 제제의 어떠한 형태라도 결정인자에 대해 특이적인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 용어 "항원"은 광범위한 의미로 사용되며, 단일 에피토프, 다중 에피토프, 단일 또는 다중 도메인 또는 전체 세포외 도메인(ECD)을 포함한 선택된 표적의 임의의 면역원성 단편 또는 결정인자를 포함할 수 있다. 항원은 단리된 전체길이 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들면, 이들의 표면에서 항원의 적어도 일부를 발현하는 세포로 면역화됨), 또는 가용성 단백질(예를 들면, 단백질의 ECD 부분으로만 면역화함)일 수 있다. 항원은 유전자 변형 세포에서 생산될 수 있다. 상기한 항원 중의 어느 것은 단독으로 사용되거나, 당업계에 공지된 하나 이상의 면역원성 증진 어쥬번트와 조합하여 사용될 수 있다. 항원을 암호화하는 DNA는 게놈성이거나 비-게놈성(예를 들면, cDNA)일 수 있으며, 면역원성 반응을 발휘하기에 충분한 ECD의 적어도 일부를 암호화할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스 벡터, 예를 들면, 양이온 지질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 벡터들이 항원이 발현되는 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
선택된 실시형태에서, 본 발명은 모노클로날 항체의 사용을 고려한다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이(예를 들면, 천연 돌연변이)를 제외하고는 동일하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파아지 디스플레이 기술, 유전자도입 동물(예를 들면, 제노마우스(XenoMouse®) 또는 이의 몇몇 조합을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시형태에서 모노클로날 항체는 문헌[An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridoma 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨]에 더 상세히 기재된 바와 같은 하이브리도마 및 유전공학 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 결정인자에 특이적으로 결합하는 다수의 모노클로날 항체의 생성 후, 특히 적합한 항체는, 예를 들면, 결정인자에 대한 친화도 또는 내재화률에 기초하여, 다양한 선별 과정을 통해 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같이 생산된 모노클로날 항체는 "소스" 항체로서 사용될 수 있으며, 예를 들면, 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 세포 배양물에서의 이의 생산을 개선시키며, 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이성 작제물을 생성하는 등을 위해 추가로 변형될 수 있다. 모노클로날 항체 생산 및 선별에 대한 보다 상세한 설명은 하기 및 첨부된 실시예에 기재되어 있다.
3. 사람 항체
항체는 완전 사람 항체를 포함할 수 있다. 용어 "사람 항체"는 사람에 의해 생산되고/되거나 하기 기재된 사람 항체의 제조 기술 중 어느 것을 사용하여 제조된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체(바람직하게는 모노클로날 항체)를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 재조합 사람 항체는 파아지 디스플레이를 사용하여 제조된 재조합 조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 라이브러리는 B-세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성된, scFv 파아지 또는 효모 디스플레이 라이브러리이다.
사람 항체는 또한 사람 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉(transgenic) 동물, 예를 들면, 내인성 면역글로불린 유전자가 일부 또는 전부 불활성화되고 사람 면역글로불린 유전자가 도입된 마우스에 도입함으로써 만들어질 수 있다. 접종시, 유전자 재배열, 조립 및 완전 사람 항체 레파토리를 포함하는 모든 점에서 사람에서 관찰되는 것과 매우 유사한 사람 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들면, U.S.P.N. 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 제노마우스(XenoMouse®) 기술과 관련하여 U.S.P.N. 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 및 문헌[Lonberg and Huszar, 1995, PMID: 7494109]에 기재되어 있다. 대안적으로, 사람 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 사람 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 신생물 장애를 앓고 있는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관내에서 면역화될 수 있다). 예를 들면, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, PMID: 2051030)]; 및 U.S.P.N. 제5,750,373호를 참조한다. 마찬가지로 사람 항체와 같은 기타 모노클로날 항체도 소스 항체로서 사용할 수 있다.
4. 유도된 항체:
일단 소스 항체가 상기한 바와 같이 생성, 선택 및 단리되면, 이들은 개선된 약제학적 특징들을 갖는 항-DPEP3 항체를 제공하도록 더욱 변경될 수 있다. 바람직하게는 소스 항체는 목적하는 치료학적 특성을 갖는 유도된 항체를 제공하도록 공지된 분자 공학 기술을 사용하여 변경 또는 변경된다.
4.1 키메라 및 사람화 항체
본 발명의 선택된 실시형태는 DPEP3에 면역특이적으로 결합하는 뮤린 모노클로날 항체를 포함하며, 이것은, 본 발명의 기재내용의 목적을 위해, "소스(source)" 항체로 간주될 수 있다. 선택된 실시형태에서, 본 발명에 적합한 항체는 소스 항체의 불변영역 및/또는 항원 결합 아미노산 서열의 임의의 변형을 통해 이러한 "소스" 항체로부터 유도될 수 있다. 특정 실시형태에서 항체는 소스 항체의 선택된 아미노산이 결실, 돌연변이, 치환, 통합 또는 조합을 통해 변경되는 경우 소스 항체로부터 "유도"된다. 또다른 실시형태에서, "유도된" 항체는 소스 항체의 단편들(예를 들면, 하나 이상의 CDR 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변영역)이 수용기 항체 서열과 조합되거나 이에 삽입되어 유도체 항체(예를 들면, 키메라 또는 사람화 항체)를 제공하는 것이다. 이러한 유도된 항체는, 예를 들면, 결정인자에 대한 친화도를 개선시키거나; 항체 안정성을 개선시키거나; 세포 배양물에서의 생산 및 수율을 개선시키거나; 생체내 면역원성을 감소시키거나; 독성을 감소시키거나; 활성 잔기의 접합을 촉진시키거나; 다중특이성 항체를 생성하기 위해 하기에 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 항체는 또한 화학적 수단 또는 번역후 변형에 의한 성숙 분자의 변형(예를 들면, 글리코실화 패턴 또는 페길화)을 통해 소스 항체로부터 유도될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항체는 공유 연결된 항체의 적어도 두 가지 상이한 종 또는 부류로부터의 단백질 분절로부터 유도된 키메라 항체를 포함한다. 용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터의 항체 또는 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터의 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 작제물에 관한 것이다(U.S.P.N. 제4,816,567호; Morrison et al., 1984, PMID: 6436822). 몇몇 바람직한 실시형태에서 본 발명의 키메라 항체는 사람 경쇄 및 중쇄 불변영역에 작동적으로 연결된 선택된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변영역의 전부 또는 대부분을 포함할 수 있다. 또다른 특히 바람직한 실시형태에서, 항-DPEP3 항체는 본원에 개시된 마우스 항체로부터 "유도"될 수 있다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 키메라 항체는 "CDR 이식" 항체이며, 여기서, CDR(카뱃, 초티아, 맥캘럼 등을 사용하여 정의된 바와 같음)은 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 반면 항체의 나머지는 또다른 종으로부터 또는 또다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체로부터 유도된다. 사람에서 사용하기 위해, 하나 이상의 선택된 설치류 CDR(예를 들면, 마우스 CDR)을 사람 수용기 항체로 이식하여, 사람 항체의 천연 CDR 중 하나 이상을 대체할 수 있다. 이러한 작제물은 일반적으로 전 강도 사람 항체 기능, 예를 들면, 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 제공하지만 대상체에 의한 항체에 대한 원치않는 면역 반응을 감소시킨다는 이점을 갖는다. 특히 바람직한 실시형태에서 CDR 이식 항체는 사람 골격 서열에 삽입된 마우스로부터 수득된 하나 이상의 CDR을 포함할 것이다.
CDR-이식 항체와 유사한 것은 "사람화" 항체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "사람화" 항체는 하나 이상의 비-사람 항체(공여체 또는 소스 항체)로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들면, CDR 서열)을 포함하는 사람 항체(수용기 항체)이다. 특정 실시형태에서, "복귀 돌연변이"가 사람화 항체에 도입될 수 있으며, 여기서는 수용자 사람 항체(recipient human antibody)의 가변영역의 하나 이상의 FR에 있는 잔기들이 비-사람 종 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기에 의해 대체된다. 이러한 복귀 돌연변이는 이식된 CDR(들)의 적절한 삼차원 배열을 유지하는 것을 도움으로써 친화도와 항체 안정성을 개선시킬 수 있다. 제한 없이 마우스, 래트, 토끼 또는 비-사람 영장류를 포함하는 다양한 공여체 종으로부터의 항체가 사용될 수 있다. 더욱이, 사람화 항체는, 예를 들면, 항체 성능을 더욱 개량시키기 위해 수용자 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 새로운 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 CDR 이식 및 사람화 항체가 하기 실시예 8에 제시된 바와 같이 제공된다.
당업계에 인지된 다양한 기술들이 본 발명에 따르는 사람화 작제물을 제공하는 수용기 항체로서 사용하기 위한 사람 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 적합한 사람 생식선(germline) 서열 및 수용기 서열로서의 이들의 적합성을 결정하는 방법에 대한 편집은, 예를 들면, 문헌[Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; and Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용된다. 사람 면역글로불린 가변영역 서열의 종합적인 디렉토리(톰린슨(Tomlinson), I.A. 등(미국 캠브리지 소재의 단백질 공학 MRC 센터)에 의해 작성됨)를 제공하는 V-BASE 디렉토리(VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005)가 적합한 수용기 서열을 동정하는데 또한 사용될 수 있다. 게다가, 예를 들면, U.S.P.N. 제6,300,064호에 기재된 컨센서스 사람 골격 서열이 또한 적합한 수용기 서열인 것으로 판명될 수 있으며 본 교시에 따라 사용될 수 있다. 일반적으로, 사람 골격 수용기 서열은 소스 및 수용기 항체의 CDR 정준 구조의 분석과 함께 뮤린 소스 골격 서열과의 상동성에 기초하여 선택된다. 그 후, 유도된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 유도된 서열을 당업계에 인지된 기술을 사용하여 합성할 수 있다.
예를 들면 CDR 이식 항체 및 사람화 항체, 및 관련 방법들은 U.S.P.N. 제6,180,370호 및 제5,693,762호에 기재되어 있다. 더욱 상세한 설명을 위해, 예를 들면, 문헌[Jones et al., 1986, PMID: 3713831]; 및 U.S.P.N. 제6,982,321호와 제7,087,409호를 참조한다.
사람 수용기 가변영역에 대한 CDR 이식 또는 사람화 항체 가변영역의 서열 동일성 또는 상동성은 본원에 논의된 바와 같이 결정될 수 있으며, 자체로 측정될 경우, 바람직하게는 적어도 60% 또는 65% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환이 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 지닌 측쇄(R 그룹)를 갖는 또다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존된 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센트 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 특징에 대해 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다.
첨부된 도면 5a 및 5b에 제공된 바와 같은 주석이 달린 CDR 및 골격 서열은 전매 Abysis 데이터베이스를 사용하여 카뱃 등에 따라 정의되는 것으로 인지될 것이다. 그러나, 본원에 논의된 바와 같이 그리고 도 5e 내지 5k에 도시된 바와 같이, 당업계의 숙련가들은 초티아 등, ABM 또는 맥캘럼 등 뿐만 아니라 카뱃 등에 의해 제공된 정의에 따라 CDR을 쉽게 동정할 수 있다. 이와 같이, 상기한 시스템 중 어느 것에 따라서 유도된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-DPEP3 사람화 항체는 명백히 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
4.2 부위-특이적 항체
본 발명의 항체는 세포독소 또는 다른 항암제(하기에서 보다 상세하게 논의됨)에 대한 접합을 촉진시키기 위해 조작될 수 있다. 항체 약물 접합체(ADC) 제제가 항체 상의 세포독소의 위치 및 약물 대 항체 비(DAR) 측면에서 ADC 분자의 균일한 집단을 포함하는 것이 유리하다. 본 발명의 개시내용에 기초하여 당업계의 숙련가들은 본원에 기재된 바와 같이 부위-특이적 조작된 작제물을 용이하게 제작할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "부위-특이적 항체" 또는 "부위-특이적 작제물"은 중쇄 또는 경쇄 중의 적어도 하나의 아미노산이 결실, 변경 또는 치환(바람직하게는 다른 아미노산으로)되어 적어도 하나의 유리 시스테인을 제공하는 항체, 또는 이의 면역반응성 단편을 의미한다. 유사하게, "부위-특이적 접합물"은 부위-특이적 항체 및 비-쌍형성(unpaired) 시스테인(들)에 접합된 적어도 하나의 세포독소 또는 기타의 화합물을 포함하는 ADC를 의미한다. 특정 실시형태에서 비-쌍형성 시스테인 잔기는 비-쌍형성 쇄내 잔기를 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서 유리 시스테인 잔기는 비-쌍형성 쇄간 시스테인 잔기를 포함할 것이다. 조작된 항체는 다양한 이소타입의 것, 예를 들면, IgG, IgE, IgA 또는 IgD일 수 있으며; 이러한 부류 내에서 항체는 다양한 아부류의 것, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. IgG 작제물의 경우 항체의 경쇄는, 바람직한 실시형태에서, IgG1 중쇄에서의 C220 잔기의 결여로 인해 비-쌍형성될 수 있는 C214를 각각 함유하는 카파 또는 람다 이소타입을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서 조작된 항체는 쇄내 또는 쇄간 시스테인 잔기의 적어도 하나의 아미노산 결실 또는 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "쇄간 시스테인 잔기"는 항체의 경쇄 및 중쇄 사이 또는 항체의 두 개의 중쇄 사이의 고유 디설파이드 결합에 관련되는 시스테인 잔기를 의미하는 반면 "쇄내 시스테인 잔기"는 동일한 중쇄 또는 경쇄에서 또다른 시스테인과 자연적으로 쌍을 이룬 것이다. 하나의 실시형태에서 결실되거나 치환된 쇄간 시스테인 잔기는 경쇄와 중쇄 사이의 디설파이드 결합의 형성에 관여한다. 또다른 실시형태에서 결실되거나 치환된 시스테인 잔기는 두 개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 관여한다. 전형적인 실시형태에서, 경쇄가 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이루고 하나의 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인이 상보적 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인과 쌍을 이루는 항체의 상보적 구조로 인해, 경쇄에서 또는 중쇄에서의 단일 시스테인의 돌연변이 또는 결실은 조직된 항체에서 두 개의 비-쌍형성 시스테인 잔기를 초래한다.
몇몇 실시형태에서 쇄간 시스테인 잔기가 결실된다. 또다른 실시형태에서 쇄간 시스테인이 다른 아미노산(예를 들면, 자연 발생 아미노산)을 치환한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 중성(예를 들면, 세린, 트레오닌 또는 글리신) 또는 친수성(예를 들면, 메티오닌, 알라니, 발린, 류신 또는 이소류신) 잔기로의 쇄간 시스테인의 대체를 초래할 수 있다. 하나의 특히 바람직한 실시형태에서 쇄간 시스테인은 세린으로 대체된다.
본 발명에 의해 고려되는 몇몇 실시형태에서 결실되거나 치환된 시스테인 잔기는 경쇄(카파 또는 람다) 상에 있어서 중쇄 상에 유리 시스테인을 남긴다. 또다른 실시형태에서 결실되거나 치환된 시스테인 잔기는 중쇄 상에 있어서 경쇄 불변영역 상에 유리 시스테인을 남긴다. 조립시, 온전한 항체의 경쇄 또는 중쇄 중의 어느 것의 단일 시스테인의 결실 또는 치환이 두 개의 비-쌍형성 시스테인 잔기를 갖는 부위-특이적 항체를 초래함을 인지할 것이다.
하나의 특이적 바람직한 실시형태에서, IgG 경쇄(카파 또는 람다)의 위치 214의 시스테인(C214)이 결실되거나 치환된다. 또다른 바람직한 실시형태에서, IgG 중쇄의 위치 220의 시스테인(C220)이 결실되거나 치환된다. 추가의 실시형태에서, 중쇄의 위치 226 또는 위치 229의 시스테인이 결실되거나 치환된다. 하나의 실시형태에서, 중쇄의 C220이 세린(C220S)으로 치환되어 경쇄에 목적하는 유리 시스테인을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 경쇄의 C214가 세린(C214S)으로 치환되어 중쇄에 목적하는 유리 시스테인을 제공한다. 이러한 부위-특이적 작제물이 실시예 15에 제공되어 있다. 이러한 바람직한 작제물의 개요가 바로 하기 표 2에 나타내어져 있으며, 여기서, 모든 번호매김은 카뱃에 제시된 바와 같은 EU 지수에 따르고, WT는 변경 없는 "야생형" 또는 고유 불변영역 서열을 나타내고, 델타(D)는 아미노산 잔기의 결실을 나타낸다(예를 들면, C214Δ는 214번 위치의 시스테인이 결실되었음을 나타낸다).
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약물 부하의 한정된 부위 및 화학양론을 갖는 항체-약물 접합체를 생성하기 위한 전략은, 본원에 개시된 바와 같이, 이것이 주로 항체의 보존된 불변 도메인의 조작을 수반하기 때문에 모든 항-DPEP3 항체에도 널리 적용가능하다. 항체의 각 부류 및 아부류의 아미노산 서열 및 고유 디설파이드 브릿지가 잘 문서화되어 있기 때문에, 당업계의 숙련가들은 과도한 실험 없이 다양한 항체의 조작된 작제물을 쉽게 제작할 수 있으며, 이에 따라, 이러한 작제물은 명백히 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
4.3 불변영역 변형 및 변경된 글리코실화
본 발명의 선택된 실시형태는 또한 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 바람직한 특징들을 갖는 화합물을 초래하는 아미노산 잔기 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 제한 없이 포함하는 불변영역(즉, Fc 영역)의 치환 또는 변형을 포함할 수 있다: 변경된 약동학, 증가된 혈청 반감기, 증가된 결합 친화도, 감소된 면역원성, 증가된 생산, Fc 수용체(FcR)에 대한 변경된 Fc 리간드 결합, 증진된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC, 변경된 글리코실화 및/또는 디설파이드 결합 및 변형된 결합 특이성.
개선된 Fc 효과기 기능을 갖는 화합물은, 예를 들면, Fc 도메인과 Fc 수용체(예를 들면, FcγRI, FcγRIIA 및 B, FcγRIII 및 FcRn) 간의 상호작용에 관련된 아미노산 잔기의 변화를 통해 생성될 수 있으며, 이것은 증가된 세포독성 및/또는 변경된 약동학, 예를 들면, 증가된 혈청 반감기(예를 들면, 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)])를 야기할 수 있다.
선택된 실시형태에서, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 관여되는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형(예를 들면, 치환, 결실 또는 부가)함으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 국제 공개 제WO 97/34631호; 제WO 04/029207호; U.S.P.N. 제6,737,056호 및 U.S.P.N. 제2003/0190311호 참조). 이러한 실시형태와 관련하여, Fc 변이체는 포유동물, 바람직하게는 사람에서, 5일 초과, 10일 초과, 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기를 제공할 수 있다. 증가된 반감기는 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 이것은 따라서 항체의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나 투여되는 항체의 농도를 감소시킨다. 생체내 사람 FcRn으로의 결합 및 사람 FcRn 고친화도 결합 폴리펩타이드의 혈청 반감기는, 예를 들면, 사람 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 사람 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩타이드가 투여되는 영장류에서 검정될 수 있다. 제WO 2000/42072호는 FcRn에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체를 기재한다. 또한, 예를 들면, 문헌[Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
다른 실시형태에서, Fc 변경은 증가된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성을 야기할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, CDC는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 나타내고, ADCC는 특정 세포독성 세포(예를 들면, 자연 살해 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 FcR 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고 이어서 세포독소에 의해 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 모 항체 또는 비변형 항체 또는 고유 서열 FcR을 포함하는 항체와 비교하여 결합이 증가되거나 감소된, "변경된" FcR 결합 친화도를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 측정되는 바와 같이, 거의 평가할 수 없거나 아예 평가할 수 없는 결합, 예를 들면, 고유 서열과 비교하여 FcR에 대해 0-20% 결합을 가질 수 있다. 또다른 실시형태에서 상기 변이체는 고유 면역글로불린 Fc 도메인과 비교하여 증가된 결합을 나타낼 것이다. 이들 Fc 변이체 유형은 개시된 항체의 유효한 항-신생물 특성을 증진시키는데 유리하게 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 또다른 실시형태에서, 이러한 변경은 증가된 결합 친화도, 감소된 면역원성, 증가된 생산, 변경된 글리코실화 및/또는 디설파이드 결합(예를 들면, 접합 부위에 대한), 변형된 결합 특이성, 증가된 포식작용; 및/또는 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 야기한다.
또다른 실시형태는 하나 이상의 조작된 글리코폼, 즉, 변경된 글리코실화 패턴 또는 (예를 들면, Fc 도메인에서) 단백질에 공유적으로 부착된 변경된 탄수화물 조성을 포함하는 부위-특이적 항체를 포함한다[예를 들면, 문헌 참조: Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]. 조작된 글리코폼은, 효과기 기능의 향상 또는 감소, 표적에 대한 항체의 친화도 증가 또는 항체의 생산 촉진을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 감소된 효과기 기능을 목적으로 하는 특정 실시형태에서, 분자는 무글리코실화(aglycosylated) 형태를 발현하도록 조작될 수 있다. 하나 이상의 가변영역 골격 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있는 치환은 널리 공지되어 있다(예를 들면, U.S.P.N. 제5,714,350호 및 제6,350,861호 참조). 역으로, 하나 이상의 추가의 글리코실화 부위에서의 조작에 의해 증진된 효과기 기능 또는 개선된 결합이 Fc 함유 분자에 부여될 수 있다.
또다른 실시형태는 변경된 글리코실화 조성을 갖는 Fc 변이체, 예를 들면, 푸코실 잔기의 양이 감소된 하이포푸코실화된(hypofucosylated) 항체 또는 바이섹팅(bisecting) GlcNAc 구조가 증가된 항체를 포함한다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 조작된 글리코폼은 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 조작된 또는 여러 가지 발현 균주를 사용함으로써, 하나 이상의 효소(예를 들면, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTI11))와의 공동-발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킴으로써 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들면, WO 제2012/117002호 참조).
4.4 단편
본 발명을 실시하는데 어떠한 형태의 항체(예를 들면, 키메라, 사람화 등)가 선택되는지와는 관계없이, 이들의 면역반응성 단편이, 그 자체로 또는 항체 약물 접합체의 일부로서, 본원의 교시에 따라 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. "항체 단편"은 온전한 항체의 적어도 일부를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체 분자의 "단편"은 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 용어 "항원-결합 단편"은 선택된 항원 또는 이의 면역원 결정인자와 면역특이적으로 결합 또는 반응하거나 단편이 특이적 항원 결합을 위해 유도된 온전한 항체와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩타이드 단편을 나타낸다.
예시적인 부위-특이적 단편은 다음을 포함한다: 가변 경쇄 단편(VL), 가변 중쇄 단편(VH), scFv, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체. 또한, 활성 부위-특이적 단편은 항원/기질 또는 수용체와 상호작용하고 (아마 다소 더 낮은 효율을 나타내더라도) 온전한 항체의 경우와 유사한 방식으로 이들을 변형시키는 능력을 보유한 항체의 일부를 포함한다. 이러한 항체 단편은 하나 이상의 유리 시스테인을 포함하도록 추가로 조직될 수 있다.
또다른 실시형태에서, 항체 단편은 Fc 영역을 포함하고 온전한 항체에 존재할 경우 Fc 영역과 통상적으로 관련된 생물학적 기능, 예를 들면, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중의 적어도 하나를 보유하는 것이다. 하나의 실시형태에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 이러한 항체 단편은 상기 단편에 생체내 안정성을 제공할 수 있는 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암(arm)을 포함할 수 있다.
당업계의 숙련가들에 의해 널리 인지되는 바와 같이, 단편은 분자 공학에 의해 또는 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리(예를 들면, 파파인 또는 펩신)를 통해 또는 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다. 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명을 위해, 예를 들면, 문헌[Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참조한다.
4.5 다가 작제물
또다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 접합체는 1가 또는 다가(예를 들면, 2가, 3가 등)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합가(valency)"는 항체와 연합되는 잠재적 표적 결합 부위의 수를 나타낸다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자의 특이적 위치 또는 유전자좌와 특이적으로 결합한다. 항체가 1가인 경우, 분자의 각 결합 부위는 단일 항원 위치 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다. 항체가 하나 이상의 표적 결합 부위를 포함하는 경우(다가), 각 표적 결합 부위는 동일한 또는 상이한 분자와 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들면, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 위치에 결합할 수 있다). 예를 들면, U.S.P.N. 제2009/0130105호를 참조한다.
하나의 실시형태에서, 항체는, 문헌[Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539]에 기재된 바와 같이, 2개의 쇄가 상이한 특이성을 갖는 이중특이성 항체이다. 또다른 실시형태는 삼중특이성 항체와 같은 추가의 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 다른 더 복잡하고 적합한 다중특이성 작제물 및 이의 제작방법이 U.S.P.N. 제2009/0155255호, 뿐만 아니라 제WO 94/04690호; 문헌(참조: Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210); 및 제WO96/27011호에 기재되어 있다.
다가 항체는 목적하는 표적 분자의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있거나 표적 분자 뿐만 아니라 이종 에피토프, 예를 들면, 이종 폴리펩타이드 또는 고체 지지 물질에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태는 오직 2개의 항원과 결합하는 것이지만(즉, 이중특이성 항체), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예를 들면, 삼중특이성 항체도 본 발명에 포함된다. 이중특이성 항체는 또한 가교결합된 또는 "이종접합(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합시 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 다른 항체는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 원치않는 세포로(U.S.P.N. 제4,676,980호) 그리고 HIV 감염의 치료를 위해(WO 제91/00360호, WO 제92/200373호 및 EP 제03089호) 면역계 세포를 표적화하는 것으로 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 간편한 가교결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 더불어 U.S.P.N. 제4,676,980호에 개시되어 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 종양을 치료하기 위해 양자 면역 유전자 요법에서 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 항체(예를 들면, ScFv 단편)는 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는데 사용될 수 있다. "CA R"은 본 발명의 항-DPEP3 항체 또는 이의 면역반응성 단편(예를 들면, ScFv 단편), 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하는 ECD로 이루어진 융합 단백질이다. 하나의 실시형태에서, DPEP3을 발현하는 종양 세포를 특이적으로 표적화하도록 대상체의 면역계를 자극하기 위해, CAR을 발현하도록 유전적으로 조작된 T-세포, 자연 살해 세포 또는 수지상 세포를 암을 앓고 있는 대상체에 도입할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 본 발명의 CAR은 1차 세포질 신호전달 서열, 즉, T-세포 수용체 복합체를 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하기 위한 서열을 개시하는 세포내 도메인, 예를 들면, CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유도된 세포내 도메인을 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 2차 또는 동시자극 신호를 개시하는 세포내 도메인, 예를 들면, CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD28, CD134, CD137, ICOS, CD154, 4-1BB 및 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴저 인자 수용체(U.S.P.N. 제US/2014/0242701호 참조)로부터 유도된 세포내 도메인을 포함할 것이다.
또다른 실시형태에서, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인은 당업계의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 면역글로불린 불변 도메인 서열, 예를 들면, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 영역 중의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 융합된다.
5. 항체의 재조합 생산
항체 및 이의 단편은 항체 생산 세포 및 재조합 기술로부터 수득된 유전 물질을 사용하여 생산 또는 변형될 수 있다(예를 들면, 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.; 및 U.S.P.N. 제7,709,611호]).
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전 세포로, 세포 용해물로, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분들 또는 다른 오염물질들, 예를 들면, 다른 세포 핵산으로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 널리 공지된 다른 방법들을 포함한 표준 기술에 의해 분리되는 경우 "단리"되거나 실질적으로 순수하게 된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들면, DNA(예를 들면, 게놈 DNA, cDNA), 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA이든 간에, RNA 및 이의 인공 변이체(예를 들면, 펩타이드 핵산)일 수 있으며, 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마(예를 들면, 하기 실시예에 제시된 바와 같이 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 항체의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 cDNA가 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. (예를 들면, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우, 항체를 암호화하는 핵산이 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편은, 예를 들면, 가변영역 유전자를 전체길이 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더욱 가공될 수 있다. 이러한 가공에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 또다른 단백질을 암호화하는 또다른 DNA 단편, 예를 들면, 항체 불변영역 또는 가요성 링커에 작동적으로 연결된다. 이러한 맥락에서 사용되는 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임 내에 있도록 2개의 DNA 단편이 결합됨을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전체길이 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 사람 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들면, Kabat, et al. (1991) (상기)) 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변영역이다. 예시적인 IgG1 불변영역이 서열번호 2에 제시되어 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변영역만을 암호화하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변영역, CL을 암호화하는 또다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전체길이 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 사람 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들면, Kabat, et al. (1991)(상기)), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 불변영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 카파 불변영역이다. 이 점에 있어서 예시적인 적합한 카파 경쇄 불변영역이 서열번호 1에 제시되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드에 대해 "서열 동일성", "서열 유사성" 또는 "서열 상동성"을 나타내는 특정 폴리펩타이드(예를 들면, 항원 또는 항체)가 본원에서 고려된다. "상동성" 폴리펩타이드는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 또다른 실시형태에서 "상동성" 폴리펩타이드는 93%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 두 아미노산 서열 간의 상동성 퍼센트는 두 서열 간의 동일성 퍼센트와 같다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭들의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # ×100). 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 실시예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 삽입된 E. 마이어스 및 W. 밀러(E. Meyers and W. Miller)의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함)에서 GAP 프로그램에 삽입된 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol.　48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 추가로, 예를 들면, 관련 서열을 확인하기 위해 공용 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "문의 서열(query sequence)"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 알트슐 등(Altschul, et al. (1990)　J. Mol. Biol.　215:403-10)의 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬(gapped alignment)을 수득하기 위해, 갭 BLAST가 알트슐 등(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.　25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 또는 비-보존적 아미노산 치환에 의해 상이할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 지닌 측쇄를 갖는 또다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존된 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센트 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 특징에 대해 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 비-보존적 아미노산으로의 치환이 있는 경우에, 바람직한 실시형태에서 서열 동일성을 나타내는 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)의 목적하는 기능 또는 활성을 보유할 것이다.
본 발명의 핵산에 대해 "서열 동일성", "서열 유사성" 또는 "서열 상동성"을 나타내는 핵산이 또한 본원에서 고려된다. "상동성 서열"은 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 서열 동일성을 나타내는 핵산 분자의 서열을 의미한다. 또다른 실시형태에서, 핵산의 "상동성 서열"은 기준 핵산에 대해 93%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 제공하며, 이것은 프로모터(예를 들면, 제WO 86/05807호; 제WO 89/01036호; 및 U.S.P.N. 제5,122,464호 참조); 및 진핵 분비 경로의 다른 전사 조절성 및 프로세싱 제어 요소에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 벡터 및 숙주-발현 시스템을 갖는 숙주 세포를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주-발현 시스템"은 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드 및 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 포함한다. 이러한 숙주-발현 시스템은 재조합 박테리오파아지 DNA 또는 플라스미드 DNA로 형질전환되거나 형질감염된 미생물(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)); 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모(예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)); 또는 포유동물 세포 또는 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터(adenovirus late promoter))를 함유하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유동물 세포(예를 들면, COS, CHO-S, HEK-293T, 3T3 세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 숙주 세포는 2개의 발현 벡터, 예를 들면, 중쇄 유도된 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유도된 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있다.
포유동물 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, U.S.P.N. 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호를 참조한다. 숙주 세포는 또한 다양한 특징들(예를 들면, GnTIII 활성을 갖는 변형된 글리코폼 또는 단백질)을 갖는 항원 결합 분자를 생산할 수 있도록 조작될 수 있다.
재조합 단백질의 장기, 고-수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 따라서, 선택된 항체를 안정하게 발현하는 세포주를 당업계에 인지된 표준 기술을 사용하여 조작할 수 있으며 이것은 본 발명의 일부를 형성한다. 바이러스 기원의 복제를 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적합한 발현 조절 요소(예를 들면, 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택 가능한 마커에 의해 조절된 DNA로 형질전환될 수 있다. 특정 조건하에서 발현을 향상시키기 위한 효율적인 접근책을 제공하는 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(the GS system)을 포함한, 당업계에 널리 공지된 어떠한 선택 시스템이라도 사용될 수 있다. GS 시스템은 EP 제0 216 846호, EP 제0 256 055호, EP 제0 323 997호 및 EP 제0 338 841호 및 U.S.P.N. 제5,591,639호 및 제5,879,936호와 관련하여 전부 또는 일부 논의되어 있다. 안정한 세포주의 개발을 위한 또다른 바람직한 발현 시스템은 FreedomTM CHO-S 키트(Life Technologies)이다.
일단 본 발명의 항체가 재조합 발현 또는 개시된 다른 기술들에 의해 생산되면, 당업계에 공지된 방법을 정제 또는 단리할 수 있으며, 이것은 이의 천연 환경으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수되고 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 오염물질로부터 분리됨을 의미한다. 단리된 항체는 재조합 세포 내에 원위치에 항체를 포함한다.
이러한 단리된 제제는 당업계에 인지된 다양한 기술들, 예를 들면, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 한외여과, 및 친화력 크로마토그래피, 특히 단백질 A 또는 단백질 G 친화력 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
6. 생산후 선택
어떻게 수득되든 간에, 항체-생산 세포(예를 들면, 하이브리도마, 효모 콜로니 등)는, 예를 들면, 왕성한(robust) 성장, 높은 항체 생산 및 목적하는 항체 특성, 예를 들면, 관심 대상 항원에 대한 높은 친화도를 포함한 바람직한 특징들에 대해 선택, 클로닝 및 추가로 스크리닝될 수 있다. 하이브리도마는 세포 배양물 중에서 시험관내에서 또는 동계의 면역약화된 동물에서 생체내에서 증대될 수 있다. 하이브리도마 및/또는 콜로니를 선택, 클로닝 및 증대시키는 방법은 당업계의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 일단 목적하는 항체가 동정되면, 관련 유전 물질을 당업계에 인지된 통상의 분자 생물학 및 생화학 기술을 사용하여 단리, 조작 및 발현시킬 수 있다.
천연(naive) 라이브러리에 의해 생산된 항체(천연 또는 합성 중 하나)는 중간 정도의 친화도(약 106 내지 107M-1의 Ka)일 수 있다. 친화도를 증진시키기 위해, 항체 라이브러리(예를 들면, 오류-유발성 폴리머라제를 사용함으로써 시험관내 무작위 돌연변이를 도입함으로써)를 구성하고 이러한 2차 라이브러리로부터의 항원에 대해 높은 친화도를 갖는 항체를 (예를 들면, 파아지 또는 효모 디스플레이를 사용함으로써) 재선발함으로써 친화성 성숙을 시험관내에서 모방할 수 있다. 제WO 9607754호는 면역글로불린 경쇄의 CDR에 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법을 기재하고 있다.
파아지 또는 효모 디스플레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술을 사용하여 항체를 선택할 수 있으며, 상기 기술에서는 사람 조합 항체 또는 scFv 단편의 라이브러리를 파아지 또는 효모에서 합성하고, 라이브러리를 관심 대상 항원 또는 이의 항체-결합부로 스크리닝하고, 항원과 결합하는 파아지 또는 효모를 분리하여 이로부터 항체 또는 면역반응성 단편을 수득할 수 있다(문헌 참조: Vaughan et al., 1996, PMID: 9630891; Sheets et al., 1998, PMID: 9600934; Boder et al., 1997, PMID: 9181578; Pepper et al., 2008, PMID: 18336206). 파아지 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다. 또한 항체 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는데 사용될 수 있는 또다른 방법 및 시약들이 있다(U.S.P.N. 제5,223,409호; WO 제92/18619호, WO 제91/17271호, WO 제92/20791호, WO 제92/15679호, WO 제93/01288호, WO 제92/01047호, WO 제92/09690호; 및 Barbas et al., 1991, PMID: 1896445 참조). 이러한 기술은 유리하게는 다수의 후보 항체의 스크리닝을 가능하게 하고 (예를 들면, 재조합 셔플링에 의해) 서열의 비교적 용이한 조작을 제공할 수 있다.
IV. 항체의 특징
선택된 실시형태에서, 항체-생산 세포(예를 들면, 하이브리도마 또는 효모 콜로니)는, 예를 들면, 왕성한 성장, 높은 항체 생산 및, 하기에 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 목적하는 부위-특이적 항체 특성을 포함한 유리한 특성들에 대해 선택, 클로닝 및 추가로 스크리닝될 수 있다. 또다른 경우에 항체의 특징들은 동물의 접종을 위해 특정 항원(예를 들면, 특이적 DPEP3 동종형) 또는 표적 항원의 면역반응성 단편을 선택함으로써 부여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 선택된 항체는 친화도 또는 약동학과 같은 면역화학적 특성들을 증진시키거나 개량하기 위해 상기한 바와 같이 조작될 수 있다.
A. 중화 항체
선택된 실시형태에서 본 발명의 항체는 "길항제" 또는 "중화" 항체일 수 있으며, 이것은 항체가 결정인자와 연합할 수 있고 직접적으로 또는 결정인자와 결합 상대물, 예를 들면, 리간드 또는 수용체와의 연합을 방지함으로써 상기 결정인자의 활성을 차단 또는 억제시켜 분자의 상호작용으로부터 야기되는 생물학적 반응을 방해함을 의미한다. 중화 또는 길항제 항체는, 과량의 항체가 결정인자에 결합된 결합 상대물의 양을, 예를 들면, 표적 분자 활성에 의해 또는 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정되는 바와 같이, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상까지 감소시키는 경우, 이의 리간드 또는 기질에 대한 결정인자의 결합을 실질적으로 억제할 것이다. 변형된 활성은 당업계에 인지된 기술을 사용하여 직접 측정될 수 있거나 변경된 활성이 다운스트림(예를 들면, 종양발생 또는 세포 생존)에 미치는 영향에 의해 측정될 수 있음이 인지될 것이다.
B. 내재화 항체
발현된 DPEP3 단백질의 상당 부분이 여전히 종양형성 세포 표면과 연합하여 개시된 항체 또는 ADC의 국소화 및 내재화를 가능하게 한다는 증거가 있다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 항체는 내재화시 세포를 사멸시키는 하나 이상의 약물에 연합되거나 접합될 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 ADC는 내재화 부위-특이적 ADC를 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "내재화하는" 항체는 연합된 항원 또는 수용체에 결합시 세포에 의해 (임의의 세포독소와 함께) 흡수되는 것이다. 치료적 용도를 위해, 내재화는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체의 생체내에서 발생할 것이다. 내재화된 ADC의 수는 항원-발현 세포, 특히 항원-발현 암 줄기 세포를 사멸시키기에 충분할 수 있다. 전체적으로 세포독소 또는 ADC의 효능에 따라, 단일 항체 분자의 세포 내로의 흡수는 항체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키는데 충분하다. 예를 들면, 특정 약물들은 항체에 접합된 독소의 몇몇 분자들의 내재화가 종양 세포를 사멸시키기에 충분할 정도로 대단히 강력하다. 포유동물 세포에 결합시 항체가 내재화하는지의 여부는 하기 실시예에 기재된 것을 포함하는 당업계에 인지된 다양한 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체가 세포로 내재화하는지의 여부를 결정하는 방법은 또한 U.S.P.N. 제7,619,068호에 기재되어 있다.
C. 고갈 항체
또다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 고갈 항체이다. 용어 "고갈" 항체는 바람직하게는 세포 표면 위 또는 세포 표면 근처에 있는 항원에 결합하여 (예를 들면, CDC, ADCC에 의해 또는 세포독성제의 도입에 의해) 세포의 사멸을 유도, 촉진 또는 유발하는 항체를 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 선택된 고갈 항체는 세포독소에 접합될 것이다.
바람직하게는, 고갈 항체는 한정된 세포 집단에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 DPEP3-발현 세포를 사멸시킬 수 있을 것이다. 몇몇 실시형태에서 세포 집단은 풍부화되거나, 절개되거나, 정제되거나 단리된 종양형성 세포를 포함할 수 있고, 암 줄기 세포가 포함된다. 또다른 실시형태에서, 세포 집단은 암 줄기 세포를 포함하는 불균일 종양 추출물 또는 전체 종양 샘플을 포함할 수 있다. 표준 생화학적 기술이 본원의 교시에 따라 종양형성 세포의 고갈을 모니터링하고 정량화하는데 사용될 수 있다.
D. 결합 친화도
특정 결정인자, 예를 들면, DPEP3에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 본원에 개시되어 있다. 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수 또는 겉보기 친화도를 의미한다. 본 발명의 항체는 해리 상수 KD(koff/kon)가 ≤ 10-7M일 경우 이의 표적 항원과 면역특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 KD가 ≤ 5×10-9M일 경우 항원과 높은 친화도로, 그리고 KD가 ≤ 5×10-10M일 때 매우 높은 친화도로 특이적으로 결합한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 항체는 10-9M 이하의 KD 및 약 1×10-4/초의 오프-속도(off-rate)를 갖는다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 오프-속도는 < 1×10-5/초이다. 본 발명의 또다른 실시형태에서, 항체는 약 10-7M 내지 10-10M의 KD로 결정인자에 결합할 것이며, 또다른 실시형태에서, 항체는 2×10-10M 이하의 KD로 결합할 것이다. 본 발명의 또다른 선택된 실시형태는 10-6M 미만, 5×10-6M 미만, 10-7M 미만, 5×10-7M 미만, 10-8M 미만, 5×10-8M 미만, 10-9M 미만, 5×10-9M 미만, 10-10M 미만, 5×10-10M 미만, 10-11M 미만, 5×10-11M 미만, 10-12M 미만, 5×10-12M 미만, 10-13M 미만, 5x10-13M 미만, 10-14M 미만, 5x10-14M 미만, 10-15M 미만 또는 5×10-15M 미만의 KD(koff/kon)를 갖는 항체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 결정인자, 예를 들면, DPEP3에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 적어도 105 M-ls-l, 적어도 2x105 M-ls-l, 적어도 5x105 M-ls-l, 적어도 106 M-ls-l, 적어도 5x106 M-ls-l, 적어도 107 M-ls-l, 적어도 5x107 M-ls-l, 또는 적어도 108 M-ls-l의 결합 속도 상수 또는 k on (또는 k a ) 속도(항체 + 항원 (Ag)k on←항체-Ag)를 가질 수 있다.
또다른 실시형태에서, 결정인자, 예를 들면, DPEP3에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 l0-l s- l 미만, 5xl0-l s- l 미만, l0-2 s- l 미만, 5xl0-2 s- l 미만, l0-3 s- l 미만, 5xl0-3 s- l 미만, l0-4 s- l 미만, 5xl04 s- l 미만, l0-5 s- l 미만, 5xl0-5 s- l 미만, l0-6 s- l 미만, 5xl0-6 s- l 미만, l0-7 s- l 미만, 5xl0-7 s- l 미만, l0-8 s- l 미만, 5xl0-8 s- l 미만, l0-9 s- l 미만, 5xl0-9 s- l 미만 또는 l0-10 s- l 미만의 해리 속도 상수 또는 k off (또는 k d ) 속도(항체 + 항원 (Ag)k off←항체-Ag)를 가질 수 있다.
결합 친화도는 당업계에 공지된 다양한 기술들, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 바이오층 간섭법, 이중 편파 간섭법, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 등온 적정 열량측정법, ELISA, 분석적 초원심분리법, 및 유세포분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
E. 비닝 및 에피토프 맵핑
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비닝(binning)"은 항원 결합 특성 및 이들이 서로 경쟁하는지에 기초하여 항체를 "빈(bin)"으로 그룹화하는데 사용되는 방법을 의마한다. 빈의 초기 결정은 에피토프 맵핑 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 기술들에 의해 추가로 개량 및 확인될 수 있다. 그러나, 각 빈에 대한 항체의 경험적 할당은 개시된 항체의 치료적 잠재력을 나타낼 수 있는 정보를 제공함을 인지할 것이다.
보다 구체적으로, 당업계에 공지되고 본원의 실시예에 제시된 방법을 사용함으로써, 제1 기준 항체(또는 이의 단편)가 제2 시험 항체(즉, 동일한 빈에 있음)와 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 기준 항체는 포화 조건하에 DPEP3 항원과 연합시킨 다음, 표준 면역화학 기술을 사용하여 DPEP3에 결합하는 하나 이상의 시험 항체의 능력을 결정한다. 시험 항체가 실질적으로 기준 항-DPEP3 항체와 동시에 DPEP3에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 실질적으로 DPEP3과 동시에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩된 에피토프, 또는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 (적어도 입체구조적으로) 매우 가까운 에피토프에 결합한다. 즉, 시험 항체는 항원 결합에 대해 경쟁하며, 기준 항체와 동일한 빈에 있다.
용어 "경쟁하다" 또는 "경쟁 항체"는, 개시된 항체의 맥락에서 사용되는 경우, 시험 항체 또는 시험중인 면역기능 단편이 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된 바와 같이 항체들 간의 경쟁을 의미한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원(예를 들면, DPEP3 또는 이의 도메인 또는 단편), 비표지된 시험 항체 및 표지된 기준 항체의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재하고/하거나 먼저 결합될 수 있다. 경쟁적 결합을 측정하기 위한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명들은 본원의 실시예에 제공된다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 억제할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
반대로, 기준 항체가 결합되는 경우, 이것은 바람직하게는 후속적으로 첨가된 시험 항체(즉, DPEP3 항체)의 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 억제할 것이다. 일부 경우에, 시험 항체의 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
일반적으로 비닝 또는 경쟁적 결합은, 예를 들면, 면역검정, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 방사면역검정, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), "샌드위치" 면역검정, 면역침강 검정, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-결합 검정, 면역방사계측 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 당업계에 인지된 다양한 기술들을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 면역검정은 일상적이며 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Ausubel et al, eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]). 또한, 교차-차단 검정이 사용될 수 있다(예를 들면, 제WO 2003/48731호; 및 문헌[Harlow et al. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane]).
경쟁적 억제(및 이에 따라 "빈")을 측정하는데 사용되는 기타 기술들은, 예를 들면, BIAcoreTM 2000 시스템(GE Healthcare)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명; 예를 들면, ForteBio® Octet RED(ForteBio)를 사용하는 바이오층 간섭법; 또는, 예를 들면, FACSCanto II(BD Biosciences)를 사용하는 유세포분석법 비드 어레이 또는 멀티플렉스 LUMINEXTM 검출 검정(Luminex)을 포함한다.
Luminex는 대규모 다중화 항체 쌍형성(pairing)을 가능하게 하는 비드-기반 면역검정 플랫폼이다. 검정은 표적 항원에 대한 항체 쌍의 동시 결합 패턴을 비교한다. 쌍 중의 하나의 항체(포획 mAb)는 Luminex 비드에 결합되는데, 여기서, 각각의 포획 mAb는 상이한 색상의 비드에 결합된다. 또다른 항체(검출 mAb)는 형광 신호(예를 들면, 피코에리트린(PE))에 결합된다. 검정은 항원에 대한 항체의 동시 결합(쌍형성)을 분석하고 유사한 쌍형성 프로파일을 갖는 항체를 함께 그룹화한다. 검출 mAb와 포획 mAb의 유사한 프로파일은 두 개의 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합됨을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 쌍형성 프로파일은 시험되는 항체의 패널에 대한 임의의 특정 항체와 가장 밀접한 상관성이 있는 항체를 동정하는 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficient)를 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 시험/검출 mAb는 항체 쌍의 피어슨 상관 계수가 적어도 0.9라면 기준/포획 mAb와 동일한 빈에 있는 것으로 결정될 것이다. 또다른 실시형태에서, 피어슨 상관 계수는 적어도 0.8, 0.85, 0.87 또는 0.89이다. 추가의 실시형태에서, 피어슨 상관 계수는 적어도 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 또는 1이다. Luminex 검정으로부터 수득된 데이터를 분석하는 또다른 방법은 U.S.P.N. 제8,568,992호에 기재되어 있다. 100가지 상이한 유형의 비드(또는 그 이상)를 분석하는 Luminex의 능력은 거의 무제한적인 항원 및/또는 항체 표면을 동시에 제공하여, 바이오센서 검정에 대한 항체 에피토프 프로파일링에 있어서 개선된 처리량 및 분해능을 초래한다(참조: Miller, et al., 2011, PMID: 21223970).
"표면 플라스몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써, 실시간 특이적 상호작용을 분석할 수 있는 광학 현상을 나타낸다.
또다른 실시형태에서, 시험 항체가 기준 항체와 결합에 대해 "경쟁"하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 기술은 두 개의 표면으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기술인 "바이오-층 간섭법"이다: 바이오센서 팁 상에 고정된 단백질의 층, 및 내부 기준 층. 바이오센서 팁에 결합된 분자의 수의 임의의 변화는 실시간 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동을 야기한다. 이러한 바이오층 간섭법 검정은 다음과 같이 ForteBio® Octet RED 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 기준 항체(Ab1)를 항-마우스 포획 칩 상에 포획한 다음 고농도의 비-결합 항체를 사용하여 칩을 차단하고, 베이스라인을 수집한다. 그 후, 단량체성 재조합 표적 단백질을 특이적 항체(Ab1)에 의해 포획시키고 팁을 대조군과 동일한 항체(Ab1)를 갖는 웰에 또는 상이한 시험 항체(Ab2)를 갖는 웰에 침지시킨다. 결합 수준을 대조 Ab1과 비교함으로써 측정되는 바와 같이 추가의 결합이 일어나지 않는다면, Ab1과 Ab2는 "경쟁" 항체인 것으로 결정된다. Ab2와 추가의 결합이 관찰된다면, Ab1과 Ab2는 서로 경쟁하지 않는 것으로 결정된다. 이러한 과정은 확대하여, 독특한 빈을 나타내는 96웰 플레이트에서 항체의 전체 행을 사용하여 독특한 항체의 대형 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 기준 항체가 공통 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%까지 억제시킨다면, 시험 항체는 기준 항체와 경쟁할 것이다. 또다른 실시형태에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
일단 경쟁 항체의 그룹을 포함하는 빈이 정의되면, 빈의 항체가 결합하는 항원에 대한 특정 도메인 또는 에피토프를 결정하기 위해 추가의 특징 규명이 수행될 수 있다. 도메인-수준 에피토프 맵핑은 문헌[Cochran et al., 2004, PMID: 15099763]에 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 수행될 수 있다. 미세 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 결정인자의 에피토프를 포함하는 항원에 대한 특정 아미노산을 결정하는 과정이다. 용어 "에피토프"는 일반적인 생화학적 의미로 사용되며, 특정 항체에 의해 인지되고 특이적으로 결합될 수 있는 표적 항원의 그 부분을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 에피토프 또는 면역원 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹 또는 설포닐 그룹과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹핑을 포함하며, 특정 실시형태에서, 특정 3차원 구조적 특성들 및/또는 특정 전하 특성들을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우, 항체가 항원과 특이적으로 결합한다고 한다.
항원이 DPEP3과 같은 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 일반적으로 단백질의 삼차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산과 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다("구조 에피토프"). 이러한 구조 에피토프에서 상호작용의 지점은 서로 선형으로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 발생한다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(때로는 "선형" 또는 "연속" 에피토프라고 함)는 전형적으로 단백질 변성시에 보유되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성시 전형적으로 소실된다. 항체 에피토프는 독특한 공간 구조 내에 전형적으로 적어도 3개 아미노산, 예를 들면, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산 또는 그 이상을 포함한다. 에피토프 측정 방법 또는 "에피토프 맵핑"은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 개시된 항체에 의해 결합된 DPEP3에 대한 에피토프를 확인하기 위해 본 기재내용과 함께 사용될 수 있다.
적합한 에피토프 맵핑 기술은 알라닌 스캐닝 돌연변이, 펩타이드 블롯(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), 또는 펩타이드 절단 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 적출, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법들이 사용될 수 있다(참조: Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). 다른 적합한 방법은 본원에 첨부된 실시예 10에 나타낸 바와 같은 효모 디스플레이 방법을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)이라고도 알려져 있는 변형-보조 프로파일링(MAP)은, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 다수의 모노클로날 항체를 분류하는 방법을 제공한다(U.S.P.N. 제2004/0101920호). 이 기술은 유전적으로 동일한 항체들을 급속하게 여과시켜, 특징 규명이 유전적으로 구별되는 항체들에 대해 집중될 수 있게 한다. MAP가 본 발명의 항-DPEP3 항체를 상이한 에피토프와 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
하기 실시예 10에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 3가지의 예시적인 DPEP3 항체(SC34.2, SC34.28 및 SC34.10)는 상기한 방법들을 사용하여 결정되었다. SC34.2 항체는 E217, R242, Q248, Q372, K375 및 E379(서열번호 3에 따라서 번호매김된 잔기)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 DPEP3 아미노산 잔기를 포함하는 입체구조적 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 각각의 잔기가 에피토프를 한정하는데 있어 많든 작던 관여할 수 있지만, 항체는 온전하지 않거나 부분적으로 형성된 에피토프와 연합할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 E217, R242, Q248, Q372, K375 및 E379로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하거나 연합하는 항체 또는 상기 결합 항체와 경쟁하는 임의의 항체를 명백히 포괄한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바로 하기 표 3에 제시된 특정 잔기 조합들 중 어느 것을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체들을 포괄하며, 여기서 X는 잔기 번호매김이 서열번호 3에 따르는 임의의 천연발생 아미노산을 포함한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
SC34.10 항체는 R46, R48, R54 및 S55(서열번호 3에 따라서 번호가 매겨짐)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 DPEP3 아미노산 잔기를 포함하는 입체구조적 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 상기와 같이, 각각의 잔기는 에피토프를 한정하는데 있어 많든 작던 관여할 수 있지만, 항체는 온전하지 않거나 부분적으로 형성된 에피토프와 연합할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 R46, R48, R54 및 S55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하거나 연합하는 항체 또는 상기 결합 항체와 경쟁하는 임의의 항체를 명백히 포괄한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바로 하기 표 4에 제시된 에피토프 1 내지 5 중 어느 것에 결합하는 항체들을 포괄하며, 여기서 X는 잔기 번호매김이 서열번호 3에 따르는 임의의 천연발생 아미노산을 포함한다.
Figure pct00005
SC34.28 항체는 S380, S384, V386, Q248(서열번호 3에 따라서 번호가 매겨짐)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 DPEP3 아미노산 잔기를 포함하는 입체구조적 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 경우, (i) 사람 DPEP3 및 시노몰구스 DPEP3의 아미노산 서열; 및 (ii) 2가지 DPEP3 오르톨로그 각각에 대한 hSC34.28의 친화도 차이의 비교 연구는, V386 및 Q248이 에피토프의 부분 뿐만 아니라 통상적으로 맵핑된 잔기를 형성하였음을 나타냈다. 다시, 각각의 잔기는 에피토프를 한정하는데 있어 많든 작던 관여할 수 있지만, 항체는 온전하지 않거나 부분적으로 형성된 에피토프와 연합할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 S380, S384, V386, Q248로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하거나 연합하는 항체 또는 상기 결합 항체와 경쟁하는 임의의 항체를 명백히 포괄한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바로 하기 표 5에 제시된 에피토프 1 내지 5 중 어느 것에 결합하는 항체들을 포괄하며, 여기서 X는 잔기 번호매김이 서열번호 3에 따르는 임의의 천연발생 아미노산을 포함한다.
Figure pct00006
일단 항원에 대한 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들면, 본 발명에 기재된 기술을 사용하여 에피토프를 포함하는 펩타이드로 고정화시킴으로써 그 에피토프에 항체를 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징 규명이 특정 도메인 또는 모티프에 위치한 바람직한 에피토프에 대한 정보를 규명할 수 있다. 그 후, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는데 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 항원에 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾아내는 경쟁 연구를 수행하는 것이다. 이러한 교차-경쟁에 기초하여 항체를 비닝하기 위한 고 처리량 과정이 제WO 03/48731호에 기재되어 있다. 효소 상의 항체 경쟁 및 항원 단편 발현을 포함한 비닝 또는 도메인 수준 또는 에피토프 맵핑의 또다른 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
V. 항체 접합체
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 약제학적 활성 또는 진단 모이어티와 접합되어 항체 약물 접합체(ADC) 또는 "항체 접합체"를 형성할 수 있다. 용어 "접합체"는 광범위하게 사용되며, 연합방법과 무관하게 임의의 약제학적 활성 또는 진단 모이어티와 본 발명의 항체의 공유 또는 비-공유 연합을 의미한다. 특정 실시형태에서, 연합은 항체의 리신 또는 시스테인 잔기를 통해 수행된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 약제학적 활성 모이어티 또는 진단 모이어티는 하나 이상의 부위-특이적 유리 시스테인(들)을 통해 항체에 접합될 수 있다. 개시된 ADC는 치료적 및 진단적 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 ADC는 세포독소 또는 기타 페이로드를 표적 위치(예를 들면, 종양형성 세포 및/또는 DPEP3을 발현하는 세포)로 전달하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약물" 또는 "탄두(warhead)"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 하기에 기재된 바와 같은 항암제를 포함하여, 생물학적 활성 또는 검출 가능한 분자 또는 약물을 의미할 것이다. "페이로드"는 약물 또는 탄두를 임의의 링커 화합물과 함께 포함할 수 있다. 접합체의 "탄두"는 펩타이드, 단백질, 또는 생체내에서 활성제로 대사되는 프로드럭, 중합체, 핵산 분자, 소 분자, 결합제, 모방제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 및 방사성 동위 원소를 포함할 수 있다. 유리한 실시형태에서, 개시된 ADC는 페이로드를 방출 및 활성화하기 전에 비교적 비반응성 무독성 상태에서 결합된 페이로드를 표적 부위로 지시할 것이다. 페이로드의 이러한 표적화된 방출은 바람직하게는 (예를 들면, 항체상의 하나 이상의 시스테인을 통한) 페이로드의 안정한 접합 및 과-접합된 독성 종을 최소화하는 ADC 제제의 비교적 균일한 조성을 통해 달성된다. 일단 종양 부위에 전달되면 페이로드를 다량으로 방출하도록 디자인된 약물 링커와 커플링되어, 본 발명의 접합체는 바람직하지 않은 비-특이적 독성을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 이것은 유리하게는 비-표적화된 세포 또는 조직의 노출을 최소화하여 향상된 치료학적 지수를 제공하면서 종양 부위에서 비교적 높은 수준의 활성 세포독소를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 치료학적 모이어티(therapeutic moiety)의 페이로드(예를 들면, 세포독소)를 포함하지만, 진단제 및 생체적합성 조절물질과 같은 다른 페이로드가 개시된 접합체에 의해 제공된 표적화된 방출로부터 이익을 얻을 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 예시적인 치료 페이로드에 관한 임의의 개시내용은 달리 맥락에 의해 지시되지 않는 한 본원에 논의된 바와 같은 진단제 또는 생체적합성 조절물질을 포함하는 페이로드에도 적용가능하다. 선택된 페이로드는 항체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있으며, 적어도 부분적으로, 접합을 수행하기 위해 사용되는 방법에 따라 다양한 화학양론적 몰 비를 나타낸다. 본 발명의 접합체는 다음 식으로 나타내어질 수 있다:
Ab-[L-D]n 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 여기서,
a) Ab는 항-DPEP3 항체를 포함하고;
b) L은 임의의 링커를 포함하고;
c) D는 약물을 포함하고;
d) n은 약 1 내지 약 20의 정수이다.
당업계의 숙련가들은 상기 식에 따르는 접합체가 다수의 상이한 링커 및 약물을 사용하여 제작될 수 있으며 접합 방법은 성분의 선택에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 이와 같이, 개시된 항체의 반응성 잔기(예: 시스테인 또는 리신)와 연합하는 임의의 약물 또는 약물 링커 화합물이 본원의 교시에 적합하다. 유사하게, 항체에 선택된 약물을 부위-특이적 접합시킬 수 있는 어떠한 반응 조건이라도 본 발명의 범위내에 있다. 상기한 바에도 불구하고, 본 발명의 특히 바람직한 실시형태는 본원에 기재된 바와 같은 약한 환원제와 함께 안정화제를 사용하는 유리 시스테인으로의 약물 또는 약물 링커의 선택적 접합을 포함한다. 이러한 반응 조건은 비-특이적 접합 및 오염물질을 덜 갖고 이에 상응하여 독성을 덜 갖는 보다 균일한 제제를 제공하는 경향이 있다.
본원의 교시내용에 적합한 예시적인 페이로드가 하기에 열거되어 있다:
A. 치료제
본 발명의 항체는 치료학적 모이어티 또는 약물, 예를 들면, 세포독성제, 세포증식억제제, 혈관형성억제제, 용적축소제(debulking agent), 화학치료제, 방사선치료제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 조절물질, 암 백신, 사이토킨, 호르몬 요법, 전이억제제 및 면역요법제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항암제인 약제학적 활성 모이어티에 접합, 결합 또는 융합되거나 또는 달리 이와 연합될 수 있다.
바람직한 예시적 항암제(이의 동족체 및 유도체 포함)는 1-데하이드로테스토스테론, 안트라마이신, 악티노마이신 D, 블레오마이신, 칼리키아미신, 콜키신, 사이클로포스파미드, 사이토칼라신 B, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 디하이드록시 안트라신, 디온, 에메틴, 에피루비신, 에티듐 브로마이드, 에토포사이드, 글루코코르티코이드, 그라미시딘 D, 리도카인, 마이탄시노이드, 예를 들면, DM-1 및 DM-4(Immunogen), 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 파클리탁셀, 프로카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신, 테노포사이드, 테트라카인 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체를 포함한다.
추가의 적합한 세포독소는 돌라스타틴 및 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)(시애틀 지네틱스(Seattle Genetics))를 포함하는 오리스타틴, 아마니틴, 예를 들면, 알파-아마니틴, 베타-아마니틴, 감마-아마니틴 또는 엡실론-아마니틴(하이델베르크 파르마(Heidelberg Pharma)), DNA 작은 홈(minor groove) 결합제, 예를 들면, 듀오카마이신 유도체(신타르가(Syntarga)), 알킬화제, 예를 들면, 개질된 또는 이량체성 피롤로벤조디아제핀(PBD), 메클로르에타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스디클로로디아민 백금 (II)(DDP) 시스플라틴, 스플라이싱 억제제, 예를 들면, 메아야마이신 유사체 또는 유도체(예를 들면, U.S.P.N. 제7,825,267호에 제시된 바와 같은 FR901464), 관형 결합제, 예를 들면, 에포틸론 유사체 및 파클리탁셀 및 DNA 손상제, 예를 들면, 칼리케아미신 및 에스페라미신, 항대사물질, 예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 및 5-플루오로우라실 데카르바진, 항유사분열제, 예를 들면, 빈블라스틴 및 빈크리스틴 및 안트라사이클린, 예를 들면, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 항체는 세포독성 T-세포를 동원하도록 항-CD3 결합 분자와 연합되어 이것이 종양형성 세포를 표적화하게 할 수 있다(BiTE 기술; 참조: 예를 들면, Fuhrmann et. al. (2010) Annual Meeting of AACR Abstract No. 5625).
추가의 실시형태에서, 본 발명의 ADC는 적절한 링커를 사용하여 접합된 치료적 방사성동위원소를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에 적합할 수 있는 예시적 방사성동위원소는 요오드(131I, 125I, 123I, 121I,), 탄소(14C), 구리(62Cu, 64Cu, 67Cu), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 비스무스(212Bi, 213Bi), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br 및 211At를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 방사성핵종, 특히 60 내지 4,000keV의 에너지 범위에 있는 것들도 진단제 및 치료제로 이용가능하다.
특정한 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 ADC는 탄두로서 PBD 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체를 포함할 수 있다. PBD는 작은 홈에서 DNA에 공유 결합하여 핵산 합성을 억제함으로써 항종양 활성을 발휘하는 알킬화제이다. PBD는 최소한의 골수 고갈을 나타내면서 강력한 항종양 특성을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명에 적합한 PBD는 몇가지 유형의 링커(예를 들면, 유리 설프하이드릴 그룹을 갖는 말레이미도 모이어티를 포함하는 펩티딜 링커)를 사용하여 항체에 결합될 수 있으며, 특정 실시형태에서 이량체 형태이다(즉, PBD 이량체). 개시된 항체에 접합될 수 있는 적합한 PBD(및 임의의 링커)는, 예를 들면, U.S.P.N. 제6,362,331호, 제7,049,311호, 제7,189,710호, 제7,429,658호, 제7,407,951호, 제7,741,319호, 제7,557,099호, 제8,034,808호, 제8,163,736호, 제2011/0256157호 및 PCR 출원들, 제WO2011/130613호, 제WO2011/128650호, 제WO2011/130616호 및 제WO2014/057074호에 기재되어 있다. 본 발명에 적합한 PBD 화합물의 예는 바로 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명의 항체는 또한 생물학적 반응 조절물질에 접합될 수 있다. 예를 들면, 특히 바람직한 실시형태에서, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들면, 아브린, 리신 A, 온코나제(또는 또다른 세포독성 RNase), 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소와 같은 독소; 세포사멸제, 예를 들면, 종양 괴사 인자, 예를 들면, TNF-α 또는 TNF-β, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, AIM I(제WO 97/33899호), AIM II(제WO 97/34911호), Fas 리간드(Takahashi et al., 1994, PMID: 7826947), 및 VEGI(제WO 99/23105호), 혈전제(thrombotic agent), 혈관형성억제제, 예를 들면, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 림포카인, 예를 들면, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 또는 성장 인자, 예를 들면, 성장 호르몬(GH)을 포함할 수 있다.
B. 진단제 또는 검출제
또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체는, 예를 들면, 생물학적 분자(예를 들면, 펩타이드 또는 뉴클레오타이드), 소분자, 형광단 또는 방사성동위원소일 수 있는 진단 또는 검출 제제, 마커 또는 리포터에 접합된다. 표지된 항체는 과증식성 장애의 발생 또는 진행을 모니터링하는데 또는 개시된 항체를 포함하는 특정 요법의 효능을 결정(치료진단제(theragnostics))하거나 미래의 치료 과정을 결정하기 위한 임상적 시험 절차의 일부로서 유용할 수 있다. 이러한 마커 또는 리포터는 또한 항체 분석론(예를 들면, 에피토프 결합 또는 항체 비닝), 종양형성 세포의 분리 또는 단리, 또는 전임상 절차 또는 독성학 연구에서 사용하기 위해, 선택된 항체를 정제하는데 유용할 수 있다.
이러한 진단, 분석 및/또는 검출은, 예를 들면, 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하는 다양한 효소; 스트렙타비딘비오틴 및 아비딘/비오틴과 같지만 이에 제한되지 않는 보결 분자단(prosthetic group); 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같지만 이에 제한되지 않는 형광 물질; 루미놀과 같지만 이에 제한되지 않는 발광 물질; 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린과 같지만 이에 제한되지 않는 생물발광 물질; 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 및 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin과 같지만 이에 제한되지 않는 방사성 물질; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 비방사성(noradioactive) 상자성 금속 이온 및 특정한 방사성동위원소로 방사능표지되거나 이에 접합된 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 검출가능한 물질에 항체를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 적절한 검출 방법은 당업계에 널리 공지되며 수많은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다.
또다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 마커 서열 또는 화합물, 예를 들면, 펩타이드 또는 형광단에 융합 또는 접합시켜 정제 또는 진단 또는 분석 절차, 예를 들면, 면역조직화학, 바이오-층 간섭법, 표면 플라즈몬 공명, 유세포분석법, 경쟁적 ELISA, FACs 등을 용이하게 할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 마커는 히스티딘 태그, 예를 들면, 그 중에서도 특히, pQE 벡터(Qiagen)에 의해 제공되는 것을 포함하며, 이들 다수는 상업적으로 이용가능하다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는 인플루엔자 적혈구응집소 단백질 유래 에피토프에 상응하는 적혈구응집소 "HA" 태그(참조: Wilson et al., 1984, Cell 37:767) 및 "플래그(flag)" 태그(U.S.P.N. 제4,703,004호)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
C. 생체적합성 조절물질
선택된 실시형태에서, 본 발명의 항체는 원하는 경우 항체 특성들을 조절, 변경, 개선 또는 조정하는데 사용될 수 있는 생체적합성 조절물질과 접합될 수 있다. 예를 들면, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 융합 작제물들은 상업적으로 이용가능한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 유사한 생체적합성 중합체와 같은 비교적 고분자량 중합체 분자를 부착시킴으로써 생성될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 항체에 특정 특성들을 부여하기 위해 선택될 수 있는 다수의 상이한 분자량 및 분자 구성으로 PEG가 수득될 수 있음을 인지할 것이다 (예를 들면, 반감기가 맞춰질 수 있음). PEG는 다기능 링커의 존재 또는 부재하에, 항체 또는 항체 단편의 N-말단 또는 C-말단으로 PEG의 접합을 통해, 또는 리신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노 그룹을 통해 항체 또는 항체 단편 또는 유도체에 부착될 수 있다. 생물학적 활성이 최소한으로 손실되는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 수 있다. 접합 정도는 항체 분자에 대한 PEG 분자의 최적의 접합을 보장하도록 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해 밀접하게 모니터링될 수 있다. 미반응 PEG는, 예를 들면, 크기 배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. 유사한 방식으로, 개시된 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정하게 만들기 위해, 또는 생체내에서 더 긴 반감기를 갖게 하기 위해 알부민에 접합될 수 있다. 이 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, 제WO 93/15199호, 제WO 93/15200호 및 제WO 01/77137호; 그리고 EP 제0 413, 622호를 참조한다. 다른 생체적합성 접합체가 당업계의 숙련가들에게 자명하며, 본원의 교시에 따라 쉽게 확인될 수 있다.
D. 링커 화합물
수많은 링커 화합물이 본 발명의 항체를 관련 탄두에 접합시키는데 사용될 수 있다. 링커는 단지 항체상의 반응성 잔기(바람직하게는 시스테인 또는 리신) 및 선택된 약물 화합물과 공유 결합할 필요가 있다. 따라서, 선택된 항체 잔기와 반응하고 본 발명의 비교적 안정한 접합체(부위-특이적 또는 기타)를 제공하는데 사용될 수 있는 어떠한 링커라도 본원에 교시에 적합하다.
수많은 적합한 링커가 친핵성인 환원된 시스테인 및 리신에 유리하게 결합할 수 있다. 환원된 시스테인 및 리신을 포함하는 접합 반응은 티올-말레이미드, 티올-할로게노(아실 할라이드), 티올-엔, 티올-인, 티올-비닐설폰, 티올-바이설폰, 티올-티오설포네이트, 티올-피리딜 디설파이드 및 티올-파라플루오로 반응을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 티올-말레이미드 생체접합은 이의 신속한 반응 속도 및 약한 접합 상태로 인해 가장 널리 사용되는 접근법 중 하나이다. 이 접근법이 갖는 하나의 쟁점은 역 마이클(retro-Michael) 반응 및 혈장, 예를 들면, 사람 혈청 알부민에서 항체로부터 다른 단백질로의 말레이미도-결합된 페이로드의 손실 또는 이동 가능성이다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 선택적 환원 및 본원 실시예 14 및 16에 제시된 바와 같은 부위-특이적 항체의 사용은 접합체를 안정화시키고 이러한 바람직하지 않은 전달을 감소시키는데 사용될 수 있다. 티올-아실 할라이드 반응은 역 마이클 반응을 겪지 않을 수 있으므로 더 안정한 생체접합체를 제공한다. 그러나, 티올-할라이드 반응은 일반적으로 말레이미드-기반 접합에 비해 더 느린 반응 속도를 갖고, 따라서 목적하지 않은 약물 대 항체 비를 제공하는데 있어 효율적이지 않다. 티올-피리딜 디설파이드 반응은 또다른 대중적인 생체접합 경로이다. 피리딜 디설파이드는 유리 티올에 의해 신속한 교환을 겪게되어 혼합된 디설파이드를 초래하고 피리딘-2-티온을 방출한다. 혼합된 디설파이드는 환원적 세포 환경에서 절단되어 페이로드를 방출할 수 있다. 생체접합에서 더 많은 주목을 받은 다른 접근법은 티올-비닐설폰 및 티올-바이설폰 반응이며, 이들 각각은 본원의 교시에 적합하고 본 발명의 범위 내에 명백히 포함된다.
바람직한 실시형태에서, 적합한 링커는 세포외 환경에서 ADC에 대한 안정성을 부여하며, ADC 분자의 응집을 방지하고 ADC가 수성 매질 및 모노머 상태에서 자유롭게 용해되도록 할 것이다. 세포 내로의 수송 또는 전달 전, ADC는 바람직하게는 안정하고 온전하게 유지되며, 즉, 항체는 약물 모이어티에 결합된 채로 유지된다. 링커는 표적 세포의 외부에서 안정하지만, 세포 내부에서 몇몇 유효한 속도로 절단되거나 분해되도록 디자인된다. 따라서, 유효한 링커는: (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지하고; (ii) 접합체 또는 약물 모이어티의 세포내 전달을 가능하게 하고; (iii) 접합체가 이의 표적 부위에 전달되거나 수송될 때까지 안정하고 온전하게, 즉, 절단되거나 분해되지 않은 채로 유지되고; (iv) 약물 모이어티의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포증식억제 효과(일부 경우에 임의의 방관자 효과를 포함)를 유지할 것이다. ADC의 안정성은 표준 분석 기술, 예를 들면, HPLC/UPLC, 질량 분석법, HPLC 및 분리/분석 기술 LC/MS 및 LC/MS/MS에 의해 측정될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 항체 및 약물 모이어티의 공유 부착은 링커가 2개의 반응성 관능 그룹, 즉, 반응성 의미에서 2가를 갖는 것을 필요로 한다. 2개 이상의 기능성 또는 생물학적 활성 모이어티, 예를 들면, MMAE 및 부위-특이적 항체를 부착하는데 유용한 2가 링커 시약이 공지되어 있으며, 생성된 접합체를 제공하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명에 적합한 링커는 절단가능한 및 비-절단가능한 링커로 광범위하게 분류될 수 있다. 산-불안정한 링커, 프로테아제 절단가능한 링커 및 디설파이드 링커를 포함할 수 있는 절단가능한 링커는 표적 세포에 내재화되고 세포 내부에서 엔도솜-리소좀 경로에서 절단된다. 세포독소의 방출 및 활성화는 산-불안정한 화학 결합, 예를 들면, 하이드라존 또는 옥심의 절단을 촉진시키는 엔도솜/리소좀 산성 구획에 의존한다. 리소좀-특이적 프로테아제 절단 부위가 링커 내로 조작되면, 세포독소는 이의 세포내 표적 인근에서 방출될 것이다. 대안적으로, 혼합된 디설파이드를 함유하는 링커는 세포독성 페이로드가 세포의 환원 환경에서 선택적으로 절단되지만 혈류의 산소-풍부 환경에서는 절단되지 않기 때문에 세포내에서 방출되는 접근법을 제공한다. 대조적으로, 아미드 결합된 폴리에틸렌글리콜 또는 알킬 스페이서를 함유하는 적합한 비-절단가능한 링커는 표적 세포 내에서 ADC의 리소좀 분해 동안 독성 페이로드를 유리시킨다. 일부 측면에서, 링커의 선택은 접합체, 특정 징후 및 항체 표적에 사용되는 특정 약물에 따라 좌우될 것이다.
따라서, 본 발명의 특정 실시형태는 세포내 환경(예를 들면, 리소좀 또는 엔도솜 또는 포낭(caveolae) 내)에 존재하는 절단제에 의해 절단되는 링커를 포함한다. 상기 링커는, 예를 들면, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 디펩타이드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내에서 활성 약물을 방출시키는 것으로 공지되어 있다. 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 예시적인 펩티딜 링커는 카텝신-B가 암성 조직에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌기 때문에 Phe-Leu를 포함하는 펩타이드이다. 이러한 링커의 다른 예는, 예를 들면, U.S.P.N. 제6,214,345호에 기재되어 있다. 특정 바람직한 실시형태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커, Val-Ala 링커 또는 Phe-Lys 링커이며, 예를 들면, U.S.P.N. 제6,214,345호에 기재되어 있다. 치료제의 세포내 단백질분해 방출을 사용하는 하나의 이점은 상기 제제가 접합되는 경우 전형적으로 약독화되고 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높아진다는 점이다.
또다른 실시형태에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성이다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건하에 가수분해될 것이다. 예를 들면, 리소좀에서 가수분해되는 산-불안정한 링커(예를 들면, 하이드라존, 옥심, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다(예를 들면, U.S.P.N. 제5,122,368호; 제5,824,805호; 제5,622,929호 참조). 이러한 링커는 중성 pH 조건하에서, 예를 들면 혈중에서 비교적 안정하지만, 리소좀의 대략적 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서 불안정하다.
또다른 실시형태에서, 링커는 환원 조건하에 절단가능하다(예를 들면, 디설파이드 링커). 예를 들면, SATA(N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N-석신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)을 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하는, 다양한 디설파이드 링커가 당업계에 공지되어 있다. 또다른 특정 실시형태에서, 링커는 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304) 또는 3'-N-아미드 유사체(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다.
(U.S.P.N. 제2011/0256157호에 제시된) 특히 바람직한 실시형태에서, 적합한 펩티딜 링커는 하기를 포함할 것이다:
Figure pct00009
여기서, 별표는 약물에 대한 부착점을 나타내며, CBA는 항-DPEP3 항체이고, L1은 링커이고, A는 L1을 항체 상의 반응성 잔기에 연결시키는 연결 그룹(임의로 스페이서를 포함함)이고, L2는 공유 결합이거나 -OC(=O)-와 함께 자가-희생(self-immolative) 링커를 형성하고, L1 또는 L2는 절단가능한 링커이다.
L1은 바람직하게는 절단가능한 링커이고, 절단을 위한 링커의 활성화를 위한 유발인자(trigger)로서 지칭될 수 있다.
L1 및 L2의 성질은, 존재하는 경우, 광범위하게 다를 수 있다. 이들 그룹은 접합체가 전달되는 부위에서의 조건에 의해 좌우될 수 있는 이들의 절단 특성에 기초하여 선택된다. pH의 변화(예를 들면, 산 또는 염기 불안정), 온도에 의해 또는 조사시(예를 들면, 광불안정) 절단되는 링커가 또한 사용될 수 있지만, 효소 작용에 의해 절단되는 링커가 바람직하다. 환원 또는 산화 조건하에 절단가능한 링커도 본 발명에 사용될 수 있다.
L1은 아미노산의 인접 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 효소 절단에 대한 표적 기질일 수 있으며, 이에 의해 약물의 방출을 가능하게 한다.
하나의 실시형태에서, L1은 효소 작용에 의해 절단된다. 하나의 실시형태에서, 상기 효소는 에스테라제 또는 펩티다제이다.
하나의 실시형태에서, L1은 디펩타이드를 포함한다. 디펩타이드는 -NH-X1-X2-CO-로서 나타낼 수 있으며, 여기서 -NH- 및 -CO-는 각각 아미노산 그룹 X1 및 X2의 N- 및 C-말단을 나타낸다. 디펩타이드 내의 아미노산은 천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 링커가 카텝신 불안정한 링커인 경우, 디펩타이드는 카텝신-매개된 절단을 위한 작용 부위일 수 있다.
추가로, 각각 카복실 또는 아미노 측쇄 관능기를 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면 Glu 및 Lys의 경우, CO 및 NH가 측쇄 관능기를 나타낼 수 있다.
하나의 실시형태에서, 디펩타이드, -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-는 하기로부터 선택된다: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- 및 -Trp-Cit-(여기서, Cit는 시트룰린이다).
바람직하게는, 디펩타이드, -NH-X1-X2-CO- 중 그룹 -X1-X2-는 하기로부터 선택된다: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, 및 -Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩타이드, -NH-X1-X2-CO- 중 그룹 -X1-X2-는 -Phe-Lys- 또는 -Val-Ala-이다.
하나의 실시형태에서, L2가 존재하고 -C(=O)O-와 함께 자가-희생 링커를 형성한다. 하나의 실시형태에서, L2는 효소 활성을 위한 기질이고, 이에 의해 약물이 방출된다.
하나의 실시형태에서, L1이 효소 작용에 의해 절단되고 L2가 존재하는 경우 효소는 L1과 L2 사이의 결합을 절단한다.
L1 및 L2는, 존재하는 경우, 하기로부터 선택된 결합에 의해 연결될 수 있다: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, 및 -NHC(=O)NH-.
L2에 연결된 L1의 아미노 그룹은 아미노산의 N-말단일 수 있거나 아미노산 측쇄, 예를 들면, 리신 아미노산 측쇄의 아미노 그룹으로부터 유도될 수 있다.
L2에 연결된 L1의 카복실 그룹은 아미노산의 C-말단일 수 있거나 아미노산 측쇄, 예를 들면 글루탐산 아미노산 측쇄의 카복실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
L2에 연결된 L1의 하이드록실 그룹은 아미노산 측쇄, 예를 들면 세린 아미노산 측쇄의 하이드록실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
용어 "아미노산 측쇄"는 (i) 천연 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린; (ii) 미량 아미노산, 예를 들면, 오르니틴 및 시트룰린; (iii) 비천연 아미노산, 베타-아미노산, 천연 아미노산의 합성 유사체 및 유도체; 및 (iv) 모든 에난티오머, 부분입체이성질체, 이성체 풍부 동위원소 표지된(예를 들면, 2H, 3H, 14C, 15N), 보호된 형태, 및 이들의 라세미 혼합물에서 발견되는 그룹을 포함한다.
하나의 실시형태에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기 그룹을 형성한다:
Figure pct00010
여기서, 별표는 약물 또는 세포독성제 위치에 대한 부착점을 나타내고, 물결선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내고, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지 3이다. 페닐렌 환은 본원에 기재된 1, 2 또는 3개의 치환체로 임의로 치환된다. 하나의 실시형태에서, 페닐렌 그룹은 할로, NO2, R 또는 OR로 임의로 치환된다.
하나의 실시형태에서, Y는 NH이다.
하나의 실시형태에서, n은 0 또는 1이다. 바람직하게는, n은 0이다.
Y가 NH이고 n이 0인 경우, 자가-희생 링커는 p-아미노벤질카보닐 링커(PABC)로 지칭될 수 있다.
또다른 특히 바람직한 실시형태에서, 링커는 자가-희생 링커를 포함할 수 있고, 디펩타이드는 함께 하기 예시된 그룹 -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure pct00011
여기서, 별표는 선택된 세포독성 부분에 대한 부착점을 나타내고, 물결선은 항체에 접합될 수 있는 링커의 남아있는 부분(예를 들면, 스페이서-항체 결합 단편)에 대한 부착점을 나타낸다. 하기 도시된 선에 따라 진행되면서, 디펩타이드의 효소 절단시 자가-희생 링커는 떨어져 있는 부위가 활성화될 때 보호된 화합물(즉, 세포독소)의 새로운 방출을 가능하게 할 것이다:
Figure pct00012
여기서, L*는 이제 막 절단된 펩티딜 단위를 포함하는 링커의 남아있는 부분의 활성화된 형태이다. 약물의 새로운 방출은 목적하는 독성 활성을 유지할 것임을 보장한다.
하나의 실시형태에서, A는 공유 결합이다. 따라서, L1 및 항체는 직접 연결된다. 예를 들면, L1이 인접 아미노산 서열을 포함하는 경우, 서열의 N-말단은 항체 잔기에 직접 연결될 수 있다.
또다른 실시형태에서, A는 스페이서 그룹이다. 따라서, L1 및 항체는 간접적으로 연결된다.
L1 및 A는 하기로부터 선택된 결합에 의해 연결될 수 있다: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH- 및 -NHC(=O)NH-.
하기 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 약물 링커는 바람직하게는 유리 시스테인을 포함한 시스테인 상의 반응성 티올 친핵체에 결합될 것이다. 이러한 목적을 위해 항체의 시스테인은 DTT 또는 TCEP와 같은 다양한 환원제 또는 본원에 기재된 바와 같은 약한 환원제를 사용한 처리에 의해 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되게 할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 약물 링커는 바람직하게는 리신에 연결될 것이다.
바람직하게는, 링커는 항체 상의 친핵성 관능 그룹과의 반응을 위해 친전자성 관능 그룹을 함유한다. 항체 상의 친핵성 그룹은 (i) N-말단 아민 그룹, (ii) 측쇄 아민 그룹, 예를 들면, 리신, (iii) 측쇄 티올 그룹, 예를 들면, 시스테인 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 경우 당 하이드록실 또는 아미노 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실 그룹은 친핵성이고, (i) 말레이미드 그룹, (ii) 활성화된 디설파이드, (iii) 활성 에스테르, 예를 들면, NHS(N-하이드록시석신이미드) 에스테르, HOBt(N-하이드록시벤조트리아졸) 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (iv) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들면, 할로아세트아미드; 및 (v) 알데히드, 케톤, 카복실을 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있으며, 이의 일부가 하기와 같이 예시된다:
Figure pct00013
특히 바람직한 실시형태에서, 부위-특이적 항체와 약물-링커 모이어티 사이의 연결은 부위 특이적 항체의 유리 시스테인의 티올 잔기 및 링커에 존재하는 말단 말레이미드 그룹을 통해서이다. 이러한 실시형태에서, 항체와 약물-링커 간의 연결은 하기와 같다:
Figure pct00014
여기서, 별표는 약물-링커의 남아있는 부분에 대한 부착점을 나타내고, 물결선은 항체의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타낸다. 이러한 실시형태에서, S 원자는 바람직하게는 부위-특이적 유리 시스테인으로부터 유도된다. 다른 적합한 링커와 관련하여 결합 부분은 목적하는 접합체를 제공하도록 활성화된 잔기와 반응할 수 있는 말단 요오도아세트아미드를 포함한다. 아무튼 당업계의 숙련가들은 본 개시내용을 고려하여 각각의 개시된 약물-링커 화합물을 적합한 항-DPEP3 부위-특이적 항체와 쉽게 접합시킬 수 있다.
E. 접합
다수의 널리 공지된 상이한 반응들을 사용하여 약물 모이어티 및/또는 링커를 선택된 항체에 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 시스테인의 설프하이드릴 그룹을 이용한 다양한 반응들이 목적하는 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태는 하기 상세하게 논의된 바와 같이 하나 이상의 유리 시스테인을 포함하는 항체의 접합을 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 ADC는 선택된 항체에 존재하는 리신 잔기의 용매-노출된 아미노 그룹에 대한 약물의 접합을 통해 생성될 수 있다. 또다른 실시형태는 개시된 페이로드를 항체에 부착시키는데 사용될 수 있는 N-말단 트레오닌 및 세린 잔기의 활성화를 포함한다. 선택된 접합 방법은 바람직하게는 항체에 부착된 약물의 수를 최적화하고 비교적 높은 치료학적 지수를 제공하도록 맞추어질 것이다.
치료학적 화합물을 시스테인 잔기에 접합시키기 위한 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있으며 숙련가들에게 자명할 것이다. 염기성 조건하에서 시스테인 잔기는 탈양성자화되어, 무른 친전자체, 예를 들면, 말레이미드 및 요오도아세트아미드와 반응할 수 있는 티올레이트 친핵체를 생성할 것이다. 일반적으로 이러한 접합을 위한 시약은 시스테인의 시스테인 티올과 직접 반응하여 접합된 단백질을 형성하거나 링커-약물과 반응하여 링커-약물 중간체를 형성할 수 있다. 링커의 경우에, 다음을 포함한 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용한 몇가지 경로들이 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있다: (1) 공유 결합을 통한 단백질-링커 중간체를 형성하는, 본 발명의 단백질의 시스테인 그룹과 링커 시약과의 반응에 이은 활성화된 화합물과의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통한 약물-링커 중간체를 형성하는, 화합물의 친핵성 그룹과 링커 시약의 반응에 이은 본 발명의 단백질의 시스테인 그룹과의 반응. 상기로부터 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 이관능성 링커가 본 발명에서 유용하다. 예를 들면, 이관능성 링커는 시스테인 잔기(들)에의 공유 결합을 위한 티올 개질 그룹 및 화합물에 대한 공유 또는 비공유 결합을 위한 적어도 하나의 부착 잔기(예를 들면, 제2 티올 개질 잔기)를 포함할 수 있다.
접합 전에, 항체는 디티오트레이톨(DTT) 또는 (트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)과 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성으로 될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 추가의 친핵성 그룹이 2-이미노티올란(트라우트 시약), SATA, SATP 또는 SAT(PEG)4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시약과 리신과의 반응을 통해 항체에 도입되어, 아민을 티올로 전환시킬 수 있다.
이러한 접합과 관련하여, 시스테인 티올 또는 리신 아미노 그룹은 친핵성이며, 다음을 포함하는 링커 시약 또는 화합물-링커 중간체 또는 약물 상의 친전자성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다: (i) 활성 에스테르, 예를 들면, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들면, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 그룹; 및 (iv) 설파이드 교환을 통한, 피리딜 디설파이드를 포함한 디설파이드. 화합물 또는 링커 상의 친핵성 그룹은 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드 그룹을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 표지화 시약은 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드 석신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 설포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르, 및 포스포르아미다니트를 포함하지만, 다른 관능 그룹이 또한 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은, 예를 들면, 말레이미드, 요오도아세트이미드 또는 할로아세틸/알킬 할라이드, 아지리딘, 아크릴로일 유도체를 사용하여 시스테인의 티올과 반응시켜 화합물과 반응성인 티오에테르를 생성함을 포함한다. 활성화된 피리딜디설파이드로의 유리 티올의 디설파이드 교환이 또한 접합체를 생산하는데 유용하다(예를 들면, 5-티오-2-니트로벤조(TNB) 산의 사용). 바람직하게는, 말레이미드가 사용된다.
상기 나타낸 바와 같이, 리신이 또한 본원에 제시된 바와 같이 접합을 수행하기 위한 반응성 잔기로서 사용될 수 있다. 친핵성 잔기는 통상적으로 아민-반응성 석신이미딜에스테르를 통해 표적화된다. 탈양성자화된 리신 잔기의 최적의 수를 수득하기 위해, 수용액의 pH는 반응의 전형적인 pH가 약 8 및 9로 되도록 대략 10.5인 리신 암모늄 그룹의 pKa　미만이어야 한다. 커플링 반응을 위한 통상의 시약은 리신 아실화 기작을 통해 친핵성 리신과 반응하는 NHS-에스테르이다. 유사한 반응을 겪는 또다른 적합한 시약은 ADC를 제공하기 위해 본원 교시와 함께 또한 사용될 수 있는 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다. 일단 리신이 활성화되면, 상기한 그룹들 중 다수가 탄두를 항체에 공유 결합시키는데 사용될 수 있다.
화합물을 트레오닌 또는 세린 잔기(바람직하게는 N-말단 잔기)에 접합시키기 위한 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 카보닐 전구체가 세린 또는 트레오닌의 1,2-아미노알킬로부터 유도되고, 이것이 과옥소산염 산화에 의해 알데히드 형태로 선택적으로 및 급속하게 변환될 수 있는 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 단백질에 부착되는 화합물 중의 시스테인의 1,2-아미노티올과 알데히드의 반응은 안정한 티아졸리딘 생성물을 형성한다. 이 방법은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기에서 단백질을 표지화하는데 특히 유용하다.
특히 바람직한 실시형태에서, 반응성 티올 그룹은 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 유리 시스테인 잔기를 도입(예를 들면, 하나 이상의 유리 비-고유 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 제조)함으로써 선택된 항체(또는 이의 단편)에 도입될 수 있다. 이러한 부위-특이적 항체 또는 조직된 항체는, 적어도 부분적으로, 조작된 유리 시스테인 부위(들)의 제공 및/또는 본원에 제시된 신규한 접합 절차로 인해 증진된 안정성 및 상당한 균질성을 나타내는 접합체 제조를 가능하게 한다. 각각의 쇄내 또는 쇄간 항체 디설파이드 결합을 완전히 또는 부분적으로 감소시켜 접합 부위를 제공하는 통상적인 접합 방법과 달리(이것은 본 발명에 완전히 적합하다), 본 발명은 추가로 특정 제조된 유리 시스테인 부위의 선택적인 환원 및 약물-링커의 상기 부위로의 유도를 제공된다. 조작된 부위에 의해 촉진된 접합 특이성 및 선택적 환원은 목적하는 위치에서 높은 백분율의 부위 지향된 접합을 가능하게 한다. 유의적으로, 이들 접합 부위 중 일부, 예를 들면, 경쇄 불변영역의 말단 영역에 존재하는 것들은 전형적으로 다른 유리 시스테인과 교차(cross)-반응하는 경향이 있기 때문에 효과적으로 접합하기가 어렵다. 그러나, 분자 공학 및 수득된 유리 시스테인의 선택적 환원을 통해 원치 않은 높은-DAR 오염물질 및 비-특이적 독성을 현저히 감소시키는 효율적인 접합율이 수득될 수 있다. 보다 일반적으로, 조작된 작제물 및 선택적 환원을 포함하는 개시된 신규한 접합 방법은 개선된 약동학 및/또는 약력학을 갖고, 잠재적으로, 개선된 치료학적 지수를 갖는 ADC 제제를 제공한다.
부위-특이적 작제물이 시스테인(들)에 존재하며, 이것은 환원될 경우, 친핵성이고 상기한 바와 같은 링커 모이어티 상의 친전자성 그룹과 공유결합을 형성하도록 반응할 수 있는 티오 그룹을 포함한다. 본 발명의 바람직한 항체는 환원성 비-쌍형성 쇄간 또는 쇄내 시스테인, 즉 이러한 친핵성 그룹을 제공하는 시스테인을 가질 것이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 환원된 비-쌍형성 시스테인의 유리 설프하이드릴 그룹과 개시된 약물-링커의 말단 말레이미도 또는 할로아세트아미드 그룹의 반응은 목적하는 접합을 제공할 것이다. 이러한 경우에, 항체의 유리 시스테인은 환원제, 예를 들면, 디티오트레이톨(DTT) 또는 (트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되게 할 수 있다. 따라서 각 유리 시스테인은 이론상 반응성 티올 친핵체를 제공할 것이다. 이러한 시약이 적합하지만, 부위-특이적 항체의 접합은 당업계의 숙련가들에게 공지된 다양한 반응, 조건 및 시약을 사용하여 수행될 수 있음을 인지할 것이다.
또한, 조작된 항체의 유리 시스테인이 향상된 부위-지향된 유도된 접합 및 원치 않는 잠재적 독성 오염물질의 감소를 제공하도록 선택적으로 환원될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 보다 구체적으로 "안정화제", 예를 들면, 아르기닌은 단백질에서 분자내 및 분자간 상호작용을 조절하는 것으로 밝혀졌으며 선택된 환원제(바람직하게는 비교적 약한 환원제)와 함께 유리 시스테인을 선택적으로 환원시키고 본원에 기재된 바와 같이 부위-특이적 접합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 환원" 또는 "선택적으로 환원된"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 조작된 항체에 존재하는 고유 디설파이드 결합을 실질적으로 파괴하지 않는 유리 시스테인(들)의 환원을 의미할 것이다. 선택된 실시형태에서, 이는 특정 환원제에 의해 영향을 받을 수 있다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 조작된 작제물의 선택적 환원은 환원제(약한 환원제 포함)와 함께 안정화제의 사용을 포함할 것이다. 용어 "선택적 접합"은 본원에 기재된 바와 같이 세포독소와의 선택적으로 환원된 조작된 항체의 접합을 의미하는 것으로 인지될 것이다. 이러한 측면에서, 선택된 환원제와 함께 이러한 안정화제를 사용하는 것은 항체 중쇄 및 경쇄에 대한 접합도 및 제제의 DAR 분포에 의해 결정된 바와 같이 부위-특이적 접합의 효율을 현저하게 개선시킬 수 있다.
임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 안정화제는 정전 미세환경을 조절하고/하거나 목적하는　접합 부위에서 입체구조적 변화를 조절하여 비교적 약한 환원제(온전한 고유 디설파이드 결합을 실질적으로 환원시키지 않음)가 목적하는 유리 시스테인　부위에서 접합을 용이하게 할 수 있도록 작용할 수 있다. 이러한 제제(예를 들면, 특정 아미노산)는 (수소 결합 및 정전기 상호작용을 통해) 염 브릿지를 형성하는 것으로 공지되고 유리한 입체구조적 변화를 유발하고/하거나 불리한 단백질-단백질 상호작용을 감소시킬 수 있는 안정화 효과를 부여하도록 하는 방식으로 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있다. 게다가, 이러한 제제는 환원 후 원치 않는 분자내(및 분자간) 시스테인-시스테인 결합의 형성을 억제하여 목적하는 접합 반응을 용이하게 하도록 작용할 수 있으며, 여기서 조작된 부위-특이적 시스테인은 (바람직하게는 링커를 통해) 약물에 결합된다. 선택적 환원 조건이 온전한 고유 디설파이드 결합의 상당한 환원을 제공하지 않기 때문에, 후속적 접합 반응은 자연스럽게 유리 시스테인 상의 비교적 소수의 반응성 티올(바람직하게는 항체당 2개의 유리 티올)로 유도된다. 이에 암시된 바와 같이, 비-특이적 접합의 수준 및 본원에 기재된 바와 같이 제작된 접합 제제에서의 상응하는 불순물을 상당히 감소시킨다.
선택된 실시형태에서, 본 발명에 적합한 안정화제는 일반적으로 염기성 pKa를 갖는 적어도 하나의 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, 모이어티는 1급 아민을 포함할 것이며, 반면 다른 바람직한 실시형태에서 아민 모이어티는 2급 아민을 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 아민 모이어티는 3급 아민 또는 구아니디늄 그룹을 포함할 것이다. 다른 선택된 실시형태에서, 아민 모이어티는 아미노산을 포함할 것이며, 반면 다른 적합한 실시형태에서 아민 모이어티는 아미노산 측쇄를 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서, 아민 모이어티는 단백질생산(proteinogenic) 아미노산을 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서, 아민 모이어티는 비-단백질생산 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 적합한 안정화제는 아르기닌, 리신, 프롤린 및 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 적합한 안정화제는 염기성 pKa를 갖는 헤테로사이클을 함유하는 질소 및 구아니딘을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 적합한 안정화제는 약 7.5 초과의 pKa를 갖는 적어도 하나의 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함하고, 또다른 실시형태에서 본 아민 모이어티는 약 8.0 초과의 pKa를 가질 것이고, 또다른 실시형태에서 아민 모이어티는 약 8.5 초과의 pKa를 가질 것이고, 또다른 실시형태에서 안정화제는 약 9.0 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태는 아민 모이어티가 약 9.5 초과의 pKa를 가질 안정화제를 포함할 것이고, 반면 특정 다른 실시형태는 약 10.0 초과의 pKa를 갖는 적어도 하나의 아민 모이어티를 나타내는 안정화제를 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 안정화제는 약 10.5 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이며, 또다른 실시형태에서 안정화제는 약 11.0 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이며, 반면 또다른 실시형태에서 안정화제는 약 11.5 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서, 안정화제는 약 12.0 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이며, 반면 또다른 실시형태에서 안정화제는 약 12.5 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 포함할 것이다. 당업계의 숙련가들은 관련 pKa가 표준 기술을 사용하여 쉽게 계산되거나 측정될 수 있으며, 안정화제로서 선택된 화합물을 사용하는 적용가능성을 결정하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
개시된 안정화제는 특정 환원제와 조합될 경우 유리 부위-특이적 시스테인에 대한 접합을 표적화하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 본 발명의 목적을 위해, 적합한 환원제는 조작된 항체 고유 디설파이드 결합을 상당히 파괴하지 않으면서 접합을 위해 환원된 유리 부위-특이적 시스테인을 생성하는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 선택된 안정화제 및 환원제의 조합에 의해 제공되는 이러한 조건하에서, 활성화된 약물 링커는 대개 목적하는 유리 부위-특이적 시스테인 부위에 대한 결합으로 제한된다. 비교적 약한 환원제 또는 약한 조건을 제공하도록 비교적 낮은 농도에서 사용되는 환원제가 특히 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약한 환원제" 또는 "약한 환원 조건"은 조작된 항체에 존재하는 고유 디설파이드 결합을 실질적으로 파괴하지 않으면서 유리 시스테인 부위(들)에서 티올을 제공하는 환원제(임의로 안정화제의 존재하에)에 의해 초래되는 임의의 시약 또는 상태를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 즉, 약한 환원제 또는 환원 조건은 단백질의 고유 디설파이드 결합을 상당히 파괴하지 않으면서 (티올을 제공하는) 유리 시스테인(들)을 효과적으로 환원시킬 수 있다. 목적하는 환원 조건은 선택적 접합을 위해 적절한 환경을 확립하는 다수의 설프하이드릴계 화합물에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약한 환원제는 하나 이상의 유리 티올을 갖는 화합물을 포함할 수 있는 반면 특히 바람직한 실시형태에서 약한 환원제는 단일 유리 티올을 갖는 화합물을 포함할 것이다. 본 발명에 적합한 환원제의 비-제한적인 예는 글루타티온, n-아세틸 시스테인, 시스테인, 2-아미노에탄-1-티올 및 2-하이드록시에탄-1-티올을 포함한다.
상기 기재된 선택적 환원 과정은 유리 시스테인에 대해 표적화된 접합에 특히 효과적인 것으로 인지될 것이다. 이러한 측면에서, 부위-특이적 항체에서 목적하는 표적 부위에 대한 접합의 정도("접합 효능"으로 본원에 정의됨)는 당업계에 허용되는 다양한 기술에 의해 결정될 수 있다. 항체에 대한 약물의 부위-특이적 접합의 효율은 모든 다른 접합 부위에 비해 표적 접합 부위(본 발명에서는 경쇄의 C-말단 상의 유리 시스테인)에서의 접합 백분율을 평가함으로써 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원의 방법은 유리 시스테인을 포함하는 항체에 대한 약물의 효율적 접합을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 접합 효율은 모든 다른 접합 부위에 비해 표적 접합의 백분율에 의해 측정되는 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 그 이상이다.
접합할 수 있는 조작된 항체는 항체가 생산되거나 저장됨에 따라 차단되거나 캡핑되는 설프하이드릴 그룹을 포함하는 유리 시스테인 잔기를 함유할 수 있음을 추가로 인지할 것이다. 이러한 캡(cap)은 소분자, 단백질, 펩타이드, 이온 및 설프하이드릴 그룹과 상호작용하는 다른 물질을 포함하고, 접합체 형성을 방지하거나 억제한다. 일부 경우에, 접합되지 않은 조작된 항체는 동일한 또는 상이한 항체 상의 다른 유리 시스테인과 결합하는 유리 시스테인을 포함할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 이러한 교차-반응성은 제작 절차 동안 다양한 오염물질을 유도할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조작된 항체는 접합 반응 전에 캡핑제거(uncapping)를 필요로 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원의 항체는 캡핑제거되고 접합할 수 있는 유리 설프하이드릴 그룹을 드러낸다. 특정 실시형태에서, 본원의 항체는 천연 디설파이드 결합을 파괴하거나 재배열하지 않는 캡핑제거 반응에 적용된다. 대부분의 경우에 캡핑제거 반응은 표준 환원 반응(환원 또는 선택적 환원) 동안 일어날 것임을 인지할 것이다.
F. DAR 분포 및 정제
본 발명의 부위 특이적 항체와의 접합의 이점 중 하나는 좁은 DAR 분포를 포함하는 비교적 균질한 ADC 제제를 생성하는 능력이다. 이와 관련하여, 개시된 작제물 및/또는 선택적 접합은 약물 및 조작된 항체간의 화학양론적 비의 관점에서 샘플 내에 ADC 종의 균질성을 제공한다. 상기 간략히 논의된 바와 같이, 용어 "약물 대 항체 비" 또는 "DAR"은 약물 대 항체의 몰 비를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 접합 제제는 이의 DAR 분포에 대하여 실질적으로 균일할 수 있으며, 이것은 제제 내에서 로딩 부위에 대해(즉, 유리 시스테인 상에) 또한 균일한 특정 DAR(예를 들면, 2 또는 4의 DAR)를 갖는 부위-특이적 ADC의 우세한 종임을 의미한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 부위-특이적 항체 및/또는 환원 및 접합을 사용하여 목적하는 균질성을 달성하는 것이 가능하다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 목적하는 균질성은 선택적 환원과 함께 부위-특이적 작제물을 사용하여 달성될 수 있다. 또다른 특히 바람직한 실시형태에서, 제제는 분석용 또는 분취용 크로마토그래피 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 각각의 이들 실시형태에서, ADC 샘플의 균질성은 질량분광분석법, HPLC(예를 들면, 크기 배제 HPLC, RP-HPLC, HIC-HPLC 등) 또는 모세관 전기영동을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 분석될 수 있다.
ADC 제제의 정제와 관련하여, 목적하는 순도를 수득하기 위해 표준 약제학적 제조방법이 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 본원에 논의된 바와 같이, 액체 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 역상(RP) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 약물 로딩 값에 의해 혼합물에서 화합물을 분리할 수 있다. 일부 경우에, 이온-교환(IEC) 또는 혼합-모드 크로마토그래피(MMC)가 또한 특정 약물 로드가 실린 종들을 단리하는데 사용될 수 있다.
개시된 ADC 및 이의 제제는 항체의 배치 및, 적어도 부분적으로, 접합을 수행하는데 사용된 방법에 따라 다양한 화학양론적 몰 비로 약물 및 항체 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, ADC 당 약물 로딩은 1 내지 20개 탄두(즉, n은 1 내지 20이다)를 포함할 수 있다. 또다른 선택된 실시형태는 1 내지 15개 탄두의 약물 로딩을 갖는 ADC를 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, ADC는 1 내지 12개 탄두, 또는 보다 바람직하게는, 1 내지 10개 타두를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에서, ADC는 1 내지 8개 탄두를 포함할 것이다.
이론상 약물 로딩은 비교적 높을 수 있지만, 유리 시스테인 교차 반응성 및 탄두 소수성과 같은 실질적 한계는 응집체 및 다른 오염물질로 인해 이러한 DAR를 포함하는 균질 제제의 발생을 제한하는 경향이 있다. 즉, 보다 높은 약물 로딩, 예를 들면, >6은 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성의 손실을 유발할 수 있다. 이러한 우려를 고려하여, 본 발명에 의해 제공된 실제적 약물 로딩은 접합체당 1 내지 8개의 약물 범위일 수 있으며, 즉 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 약물이 각 항체에 공유적으로 부착된다(예를 들면, IgG1의 경우, 다른 항체는 디설파이드 결합의 수에 따라 상이한 로딩 용량을 가질 수 있다). 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 DAR는 대략 2, 4 또는 6일 것이며, 특히 바람직한 실시형태에서 DAR는 대략 2를 포함할 것이다.
본 발명에 의해 제공된 비교적 높은 수준의 균질성에도 불구하고, 개시된 조성물은 실제로 (IgG1 항체의 경우) 1 내지 8개의 광범위한 약물 화합물과 접합체의 혼합물을 포함한다. 이와 같이, 개시된 ADC 조성물은, 대부분의 구성성분 항체가 하나 이상의 약물 모이어티에 공유 연결되어 있고 (선택적 환원의 접합체 특이성에도 불구하고) 약물 모이어티가 다양한 티올 그룹에 의해 항체에 부착될 수 있는 접합체의 혼합물을 포함한다. 즉, 접합 후, 본 발명의 ADC 조성물은 (유리 시스테인 교차 반응성에 의해 주로 유도된 특정 반응 오염물과 함께) 다양한 농도에서 접합체와 상이한 약물 로드(예를 들면, IgG1 항체당 1 내지 8개의 약물)의 혼합물을 포함한다. 선택적 환원 및 제조후 정제를 사용하여, 접합체 조성물은 이들이 목적하는 단일 주요 ADC 종(예를 들면, 2의 약물 로딩을 가짐)을 주로 함유하고 다른 ADC 종(예를 들면, 1, 4, 6 등의 약물 로딩을 가짐)은 비교적 낮은 수준으로 함유하는 지점으로 유도될 수 있다. 평균 DAR 값은 전체적으로(즉, 모든 ADC 종들이 함께 취해져) 조성물에 대한 약물 로딩의 가중된 평균을 나타낸다. 이용되는 정량화 방법에 있어서의 내재하는 불확실성 및 상업적인 환경에서 비-우세 ADC 종들을 완전히 제거하는데 있어서의 어려움으로 인해, 허용되는 DAR 값 또는 사양은 종종 평균, 범위 또는 분포(즉, 2 +/- 0.5의 평균 DAR)로 나타내어진다. 바람직하게는 측정된 평균 DAR를 상기 범위(즉, 1.5 내지 2.5) 내에서 포함하는 조성물이 약제학적 환경에서 사용될 것이다.
따라서, 특정한 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 +/- 0.5의 평균 DAR를 갖는 조성물을 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.5의 평균 DAR를 포함할 것이다. 마지막으로, 선택된 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 2 +/- 0.5의 평균 DAR를 포함할 것이다. 범위 또는 편차는 특정 바람직한 실시형태에서 0.4 미만일 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 또다른 실시형태에서, 조성물은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 +/- 0.3의 평균 DAR, 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.3의 평균 DAR, 보다 더 바람직하게는 2 또는 4 +/- 0.3의 평균 DAR 또는 심지어 2 +/- 0.3의 평균 DAR를 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서, IgG1 접합체 조성물은 바람직하게는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 +/- 0.4의 평균 DAR를 갖고 비교적 낮은 수준(즉, 30% 미만)의 비-우세한 ADC 종들을 갖는 조성물을 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, ADC 조성물은 비교적 낮은 수준(< 30%)의 비-우세한 ADC 종들을 갖는 각각 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.4의 평균 DAR를 포함할 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, ADC 조성물은 비교적 낮은 수준(< 30%)의 비-우세한 ADC 종들을 갖는 2 +/- 0.4의 평균 DAR을 포함할 것이다. 또다른 실시형태에서 우세한 ADC 종들(예를 들면, 2의 DAR)은 다른 DAR 종들에 대해 측정되는 경우 65% 초과의 농도, 70% 초과의 농도, 75% 초과의 농도, 80% 초과의 농도, 85% 초과의 농도, 90% 초과의 농도, 93% 초과의 농도, 95% 초과의 농도 또는 심지어 97% 초과의 농도로 존재할 것이다.
하기 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 접합 반응으로부터의 ADC의 제제에서 항체당 약물의 분포는 통상적인 수단, 예를 들면, UV-Vis 분광광도법, 역상 HPLC, HIC, 질량 분석법, ELISA 및 전기영동에 의해 특징 규명될 수 있다. 항체당 약물의 측면에서 ADC의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. ELISA에 의해, 특정 ADC 제제에서 항체당 약물의 평균 값이 결정될 수 있다. 그러나, 항체가(antibody value)당 약물의 분포는 항체-항원 결합 및 ELISA의 검출 한계에 의해 식별할 수 없다. 또한, 항체-약물 접합체의 검출을 위한 ELISA 검정은 약물 모이어티가 어디에서 항체, 예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 단편, 또는 특정 아미노산 잔기에 부착되는지를 측정하지 못한다.
VI. 진단 및 스크리닝
A. 진단
본 발명은 증식성 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 시험관내 및 생체내 방법 및 종양형성 세포를 포함한 종양 세포를 동정하기 위해 환자로부터의 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 환자 또는 환자로부터 수득된 샘플(생체내 또는 시험관내)을 본원에 기재된 항체와 접촉시키고 샘플에서 결합된 또는 유리 표적 분자에 대한 항체의 연합 수준 또는 존재 또는 부재를 검출함을 포함하는, 암의 치료 또는 진행의 모니터링을 위해 암을 갖는 개체를 식별함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자를 포함할 것이다.
몇몇 실시형태에서, 샘플에서 항체와 특정 세포와의 연합은 샘플이 종양형성 세포를 함유하여 암을 갖는 개체가 본원에 기재된 항체로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타낼 수 있다.
샘플은 다수의 검정 예를 들면, 방사면역검정, 효소 면역검정(예를 들면, ELISA), 경쟁적-결합 검정, 형광 면역검정, 면역블롯 검정, 웨스턴 블롯 분석 및 유세포계수 검정에 의해 분석될 수 있다. 적합한 생체내 치료진단 또는 진단 검정은 당업계에 인지된 영상화 또는 모니터링 기술, 예를 들면, 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층촬영법(예를 들면, CAT 스캔), 양전자 단층촬영법(예를 들면, PET 스캔), 방사선촬영, 초음파 등을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 관련 결정인자와 연관된 증식성 장애의 검출, 진단 또는 모니터링에 사용될 수 있는 환자 샘플(예를 들면, 혈장 또는 혈액)에서의 특정 결정인자(예를 들면, DPEP3)의 수준을 검출 및 정량화하는데 사용될 수 있다. 관련된 실시형태에서, 본 발명의 항체는 생체내 또는 시험관내에서 순환 종양 세포를 검출, 모니터링 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다(제WO 2012/0128801호). 또다른 실시형태에서, 순환 종양 세포는 종양형성 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 대상체 또는 대상체 유래 샘플에서의 종양형성 세포는 베이스라인을 확립하기 위해 치료 또는 요법 전에 개시된 항체를 사용하여 평가되거나 특징 규명될 수 있다. 다른 예에서, 종양형성 세포는 치료된 대상체로부터 유래된 샘플로부터 평가될 수 있다.
B. 스크리닝
특정 실시형태에서, 항체는 결정인자와 상호작용함으로써 종양 세포의 기능 또는 활성을 변경하는 화합물 또는 제제(예를 들면, 항체 또는 ADC)를 동정하기 위해 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 종양 세포는 항체 또는 ADC와 접촉하고 있으며, 항체 또는 ADC는 진단 목적을 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적을 위해 이러한 세포를 동정하거나, 치료 효능을 결정하기 위해 이러한 세포를 모니터링하거나, 이러한 표적-발현 세포를 위해 세포 집단을 풍부화시키기 위해 특정 표적(예를 들면, DPEP3)을 발현하는 세포에 대해 종양을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또다른 실시형태에서, 방법은 종양 세포를 시험 제제 또는 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 접촉시키고 시험 제제 또는 화합물이 결정인자-관련된 종양 세포의 활성 또는 기능, 예를 들면, 세포 형태학 또는 생존력의 변화, 마커의 발현, 분화 또는 탈분화, 세포 호흡, 미토콘드리아 활성, 막 완전성(membrane integrity), 성숙, 증식, 생존력, 아폽토시스 또는 세포사를 조절하는지를 결정함을 포함한다. 직접적 상호작용의 일례는 물리적 상호작용인 반면 간접적 상호작용은, 예를 들면, 참조된 실체(예를 들면, 세포 또는 세포 배양물)에 작용하는 중간 분자에 대한 조성물의 작용을 포함한다.
스크리닝 방법은 임의로 예정된 위치, 예를 들면, 배양 접시, 튜브, 플라스크, 롤러 병 또는 플레이트 상에 위치되거나 배치된 세포의 어레이(예를 들면, 마이크로어레이)를 포함할 수 있는 고속 대량 스크리닝을 포함한다. 고속-대량 로봇식 또는 수동 취급방법은 화학적 상호작용을 탐침하고 단기간 내에 다수의 유전자의 발현 수준을 결정할 수 있다. 예를 들면, 형광단 또는 마이크로어레이를 통한 분자 신호(Mocellin and Rossi, 2007, PMID: 17265713) 및 매우 빠른 속도로 정보를 처리하는 자동화 분석(예를 들면, 문헌[Pinhasov et al., 2004, PMID: 15032660])을 이용하는 기술이 개발되었다. 스크리닝될 수 있는 라이브러리는, 예를 들면, 소분자 라이브러리, 파아지 디스플레이 라이브러리, 완전 사람 항체 효모 디스플레이 라이브러리(Adimab), siRNA 라이브러리 및 아데노바이러스 형질감염 벡터를 포함한다.
VII. 약제학적 제제 및 치료학적 용도
A. 제형 및 투여 경로
본 발명의 항체 또는 ADC는 당업계에 인지된 기술들을 사용하여 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 순수하게(neat) 또는 최소한의 추가 성분과 함께 투여될 수 있지만, 다른 실시형태들은 임의로 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하도록 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업계에 널리 공지되고 약제학적 제제에서 사용하기 위해 상업적 공급원으로부터 이용 가능할 수 있는 부형제, 비히클, 어쥬번트 및 희석제를 포함한다(예를 들면, 문헌[Gennaro (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed., Mack Publishing; Ansel et al. (2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,　7th ed.,　 Lippencott Williams and Wilkins; Kibbe et al.(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed.,　Pharmaceutical Press] 참조).
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 비교적 불활성이고 항체의 투여를 용이하게 할 수 있거나 작용 부위로의 전달을 위해 약제학적으로 최적화된 제제로의 활성 화합물의 가공을 도울 수 있는 물질을 포함한다.
이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 제형의 형태, 조도, 점도, pH, 장성, 안정성, 삼투성, 약동학, 단백질 응집 또는 용해도를 변경할 수 있는 제제를 포함하며, 완충제, 습윤제, 유화제, 희석제, 캡슐화제 및 피부 침투 증강제를 포함한다. 담체의 특정 비제한적인 예는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 아르기닌, 수크로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 소르비톨, 덱스트란, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 이들의 배합물을 포함한다. 전신 투여용 항체는 장관, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 실제로, 모든 3가지 타입의 제형이 활성 성분의 전신 투여를 달성하는데 동시에 사용될 수 있다. 부형제 뿐만 아니라 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 제형은 문헌(참조: Remington, The Science and Practice of Pharmacy (2000) 20th Ed. Mack Publishing)에 기재되어 있다.
장관 투여에 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐제, 환제, 피복 정제를 포함한 정제, 엘릭서제, 현탁액제, 시럽제 또는 흡입제 및 이의 제어방출 형태를 포함한다.
(예를 들면, 주사에 의한) 비경구 투여에 적합한 제형은 활성 성분이 용해되거나 현탁되거나 다른 방식으로 제공되어 있는(예를 들면, 리포솜 또는 다른 미세미립자로) 수성 또는 비-수성, 등장성, 피로겐-비함유, 멸균 액체(예를 들면, 용액, 현탁액)를 포함한다. 이러한 액체는 항산화제, 완충제, 방부제, 안정화제, 세균발육저지제, 현탁제, 증점제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 되게 하는 용질과 같은 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유할 수 있다. 부형제의 예는, 예를 들면, 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등을 포함한다. 이러한 제형에서 사용하기 위한 적합한 등장성의 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 염화나트륨 주사액, 링거액, 또는 락테이트화 링거 주사액을 포함한다.
비경구 투여(예를 들면, 정맥내 주사)에 적합한 제형은 약 10㎍/ml 내지 약 100mg/ml의 ADC 또는 항체 농도를 포함할 수 있다. 특정 선택된 실시형태에서, 항체 또는 ADC 농도는 20㎍/ml, 40㎍/ml, 60㎍/ml, 80㎍/ml, 100㎍/ml, 200㎍/ml, 300㎍/ml, 400㎍/ml, 500㎍/ml, 600㎍/ml, 700㎍/ml, 800㎍/ml, 900㎍/ml 또는 1mg/ml를 포함할 것이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, ADC 농도는 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 6mg/ml, 8mg/ml, 10mg/ml, 12mg/ml, 14mg/ml, 16mg/ml, 18mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 35mg/ml, 40mg/ml, 45mg/ml, 50mg/ml, 60mg/ml, 70mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml 또는 100mg/ml를 포함할 것이다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비내, 근육내, 심장내, 심실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 피내, 국소, 경피 및 경막내를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 경로에 의해, 또는 그렇지 않으면 이식 또는 흡입에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 생체내 투여될 수 있다. 본 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 연고, 용제, 좌제, 관장제, 주사액, 흡입제 및 에어로졸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 용도 및 치료 용법에 따라 선택될 수 있다.
B. 용량
특정 용량 용법, 즉, 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 개체 뿐만 아니라 약동학과 같은 경험적 고려사항(예를 들면, 반감기, 청소율(clearance rate) 등)에 따라 좌우될 것이다. 투여 빈도의 결정은 치료되는 상태 및 상태의 중증도, 치료되는 대상체의 연령 및 일반적인 건강 상태의 고려에 기초하여 담당의와 같은 당업계의 숙련가들에 의해 이루어질 수 있다. 투여 빈도는 선택된 조성물의 효능 및 용량 용법의 평가에 기초하여 치료 과정에 걸쳐 조절될 수 있다. 이러한 평가는 특정 질환, 장애 또는 병태의 마커에 기초하여 이루어질 수 있다. 개체가 암을 갖는 실시형태에서, 이들은 촉진(palpation) 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정; x선 또는 기타 영상화 기술에 의한 종양 크기의 간접적인 측정; 직접적인 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가되는 바와 같은 개선; 간접적인 종양 마커(예를 들면, 전립선암의 경우 PSA) 또는 본원에 기재된 방법에 따라 동정된 항원의 측정; 증식성 또는 종양형성 세포의 수의 감소, 이러한 신생물 세포의 감소의 유지; 신생물 세포의 증식 감소; 또는 전이의 발생 지연을 포함한다.
본 발명의 DPEP3 항체 또는 ADC는 다양한 범위에서 투여될 수 있다. 이들은 용량당 약 5㎍/체중 kg 내지 약 100mg/체중 kg; 용량당 약 50㎍/체중 kg 내지 약 5mg/체중 kg; 용량당 약 100㎍/체중 kg 내지 약 10mg/체중 kg을 포함한다. 다른 범위는 용량당 약 100㎍/체중 kg 내지 약 20mg/체중 kg, 및 용량당 약 0.5mg/체중 kg 내지 약 20mg/체중 kg을 포함한다. 특정 실시형태에서, 용량은 적어도 약 100㎍/체중 kg, 적어도 약 250㎍/체중 kg, 적어도 약 750㎍/체중 kg, 적어도 약 3mg/체중 kg, 적어도 약 5mg/체중 kg, 적어도 약 10mg/체중 kg이다.
선택된 실시형태에서, DPEP3 항체 또는 ADC는 용량당 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100㎍/체중 kg으로 (바람직하게는 정맥내로) 투여될 것이다. 또다른 실시형태는 용량당 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000㎍/체중 kg에서의 ADC의 투여를 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 개시된 접합체는 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9 또는 10mg/kg에서 투여될 것이다. 또다른 실시형태에서, 접합체는 용량당 12, 14, 16, 18 또는 20mg/체중 kg에서 투여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 접합체는 용량당 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100mg/체중 kg에서 투여될 수 있다. 본원의 교시에 의해, 당업계의 숙련가들은 전임상 동물 연구, 임상적 관찰 및 표준 의학적 및 생화학적 기술 및 측정법을 토대로 다양한 DPEP3 항체 또는 ADC에 대한 적절한 용량을 쉽게 결정할 수 있다.
또다른 용량 용법은 U.S.P.N. 제7,744,877호에 개시된 바와 같이 체표면적(BSA) 계산에서 예측될 수 있다. 널리 공지된 바와 같이, BSA는 환자의 키와 체중을 사용하여 계산되고, 대상체의 신체의 표면적에 의해 표시되는 대상체 크기의 척도를 제공한다. 특정 실시형태에서, 접합체는 1mg/m2 내지 800mg/m2, 50mg/m2 내지 500mg/m2의 용량으로 그리고 100mg/m2, 150mg/m2, 200mg/m2, 250mg/m2, 300mg/m2, 350mg/m2, 400mg/m2 또는 450mg/m2의 용량에서 투여될 수 있다. 당업계에 인지된 기술 및 경험적 기술이 적절한 용량을 결정하는데 사용될 수 있음을 또한 인지할 것이다.
항-DPEP3 항체 또는 ADC는 특정한 스케쥴로 투여될 수 있다. 일반적으로, DPEP3 접합체의 유효량이 대상체에게 1회 이상 투여된다. 보다 특히, 유효량의 ADC는 한달에 한번, 한달에 1회 초과, 또는 한달에 1회 미만으로 대상체에 투여된다. 특정 실시형태에서, 유효량의 DPEP3 항체 또는 ADC는 적어도 1개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년 또는 수년의 기간 동안을 포함하여, 다수회 투여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 개시된 항채 또는 ADC의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월) 또는 심지어 1년 또는 수년이 경과할 수 있다.
특정 바람직한 실시형태에서, 접합된 항체를 수반하는 치료 과정은 수주 또는 수개월 동안 선택된 의약품의 다중 투약를 포함할 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 항체 또는 ADC는 1일마다, 2일마다, 4일마다, 1주마다, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 1개월마다, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 1회 투여될 수 있다. 이와 관련하여 용량이 변경될 수 있거나 간격이 환자의 반응 및 임상적 실시를 토대로 조정될 수 있음을 인지할 것이다.
용량 및 용법은 또한 하나 이상의 투여(들)가 제공되는 개체에서 개시된 치료학적 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 개체는 본원에 기재된 바와 같이 생산된 치료학적 조성물의 증분식 용량으로 제공될 수 있다. 선택된 실시형태에서, 용량은 각각 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점차 증가되거나 감소되거나 약독화될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질환, 장애 또는 병태의 마커는 이전에 기재된 바와 같이 추적될 수 있다. 암의 경우, 이들은 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적 측정, x-선 또는 다른 영상화 기술에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 직접적 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 간접적 종양 마커(예를 들면, 전립선암의 경우 PSA) 또는 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 종양형성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 개선된 언어 능력, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 다른 장애; 증가된 식욕; 또는 인정된 시험에 의해 측정되는 삶의 질의 개선 또는 생존 연장을 포함한다. 용량은 개체, 신생물 병태의 유형, 신생물 병태의 단계, 신생물 병태가 개체에서 다른 부위로 전이되기 시작했는지 여부, 및 사용된 과거 및 동시 치료에 따라 달라질 것임이 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다.
C. 병용 요법
병용 요법은 암을 예방 또는 치료하고 암의 전이 또는 재발을 방지하는데 유용할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "병용 요법"은 적어도 하나의 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 적어도 하나의 치료학적 모이어티(예를 들면, 항암제)를 포함하는 병용물의 투여를 의미하며, 여기서, 상기 병용물은 바람직하게는 (i) 단독으로 사용된 항-DPEP3 항체 또는 ADC, 또는 (ii) 단독으로 사용된 치료학적 모이어티, 또는 (iii) 항-DPEP3 항체 또는 ADC의 첨가 없이 다른 치료학적 모이어티와 병용한 치료학적 모이어티의 사용에 대해 암의 치료에 있어서 치료적 상승작용을 갖거나, 측정 가능한 치료 효과를 개선시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적 상승작용"은 항-DPEP3 항체 또는 ADC와 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)의 병용물의 상가 효과보다 더 큰 치료 효과를 갖는 항-DPEP3 항체 또는 ADC와 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)의 병용물을 의미한다.
개시된 병용물의 목적하는 성과는 대조 또는 기준 측정과의 비교에 의해 정량화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "개선시키다", "증가시키다" 또는 "감소시키다"와 같은 상대적 용어는 본원에 기재된 항-DPEP3 항체 또는 ADC의 부재하에서 그러나 표준 관리 치료와 같은 또다른 치료학적 모이어티(들)의 존재하에서 본원에 기재된 치료의 개시 전에 동일한 개체에서의 측정치 또는 대조군 개체(또는 다수의 대조군 개체)에서의 측정치와 같은 대조치와 비교한 값을 나타낸다. 대표적인 대조군 개체는 치료되는 개체와 같은 동일한 형태의 암에 걸린 개체이며, 이는 치료되는 개체와 대략 동일한 연령이다(치료된 개체 및 대조군 개체에서의 질환의 단계가 비슷하도록 하게 하기 위해).
치료법에 대한 반응으로의 변화 또는 개선은 일반적으로 통계학적으로 유의적이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유의성" 또는 "유의적인"은 둘 이상의 실체 간의 비-무작위 연관이 있을 확률의 통계 분석에 관한 것이다. 관계가 "유의적인지" 또는 "유의성"이 있는지를 결정하기 위해, "p값"을 계산할 수 있다. 사용자-정의 컷-오프 포인트(cut-off point) 내에 드는 p값은 유의적인 것으로 간주된다. 0.1 이하, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만, 또는 0.001 미만의 p값은 유의적인 것으로 간주될 수 있다.
상승적 치료 효과는 단일 치료학적 모이어티 또는 항-DPEP3 항체 또는 ADC에 의해 유도된 치료 효과보다 또는 주어진 병용물의 항-DPEP3 항체 또는 ADC 또는 단일 치료학적 모이어티(들)에 의해 유도된 치료 효과의 합보다 적어도 약 2배 더 큰 효과, 또는 적어도 약 5배 더 큰, 또는 적어도 약 10배 더 큰, 또는 적어도 약 20배 더 큰, 또는 적어도 약 50배 더 큰, 또는 적어도 약 100배 더 큰 효과일 수 있다. 상승적 치료 효과는 또한 단일 치료학적 모이어티 또는 항-DPEP3 항체 또는 ADC에 의해 유도된 치료 효과 또는 주어진 병용물의 항-DPEP3 항체 또는 ADC 또는 단일 치료학적 모이어티(들)에 의해 유도된 치료 효과의 합에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 그 이상의 치료 효과의 증가로서 관찰될 수 있다. 상승 효과는 또한, 치료제가 병용하여 사용되는 경우, 치료제의 용량을 감소시킬 수 있는 효과이다.
병용 요법을 실시하는데 있어서, 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 치료학적 모이어티(들)를 대상체에게 동시에, 단일 조성물로 또는 둘 이상의 뚜렷이 다른 조성물로서 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 항-DPEP3 항체 또는 ADC로의 치료는, 예를 들면, 수 분 내지 수 주에 이르는 간격까지 치료학적 모이어티 치료를 선행하거나 후행할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 치료학적 모이어티 및 항체 또는 ADC 둘 다는 서로 약 5분 내지 약 2주 내에 투여된다. 또다른 실시형태에서, 항체와 치료학적 모이어티의 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)이 경과할 수 있다.
병용 요법은 1일 1회, 2회 또는 3회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회로 다양한 스케쥴로 병태가 치료, 완화 또는 치유될 때까지 투여될 수 있거나, 연속적으로 투여될 수 있다. 항체 및 치료학적 모이어티(들)는 격일 또는 격주로 투여될 수 있거나; 연속적인 항-DPEP3 항체 또는 ADC 치료가 제공된 다음 추가의 치료 모이어티로의 하나 이상의 치료가 이어질 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항-DPEP3 항체 또는 ADC는 짧은 치료 사이클을 위해 하나 이상의 치료학적 모이어티(들)와 병용하여 투여된다. 또다른 실시형태에서, 병용 치료는 장기 치료 사이클을 위해 투여된다. 병용 요법은 어떠한 경로를 통해서도 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항-DPEP3 항체 또는 ADC는 다양한 1선(first line) 암 치료와 병용하여 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC, 및 이포스파미드, 미토마이신 C, 빈데신, 빈블라스틴, 에토포사이드, 이로니테칸, 겜시타빈, 탁산, 비노렐빈, 메토트렉세이트 및 페메트렉시드와 같은 세포독성제 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 비노렐빈; 겜시타빈; 예를 들면, 도세탁셀 또는 파클리탁셀과 같은 탁산; 이리노티칸; 또는 페메트렉시드)의 사용을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 예를 들면, BR-ERPR, BR-ER 또는 BR-PR 암의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 "호르몬 요법"으로서 기재된 하나 이상의 치료학적 모이어티의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "호르몬 요법"은, 예를 들면, 타목시펜; 고나도트로핀 또는 황체형성호르몬 방출 호르몬(GnRH 또는 LHRH); 에베롤리무스 및 엑세메스탄; 토레미펜; 또는 아로마타제 저해제(예: 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 또는 풀베스트란트)을 지칭한다.
다른 실시형태에서, 예를 들면, BR-HER2의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 트라스투주맙 또는 아도-트라스투주맙 엠탄신 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 페르투주맙 및/또는 도세탁셀)의 사용을 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들면, 전이성 유방암의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 탁산(예: 도세탁셀 또는 파클리탁셀) 및 임의로 추가의 치료학적 모이어티(들), 예를 들면, 안트라사이클린(예: 독소루비신 또는 에피루비신) 및/또는 에리불린의 사용을 포함한다.
다른 실시형태에서, 예를 들면, 전이성 또는 재발 유방암 또는 BRCA-돌연변이 유방암의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 메게스트롤 및 임의로 추가의 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 예를 들면, BR-TNBC의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 폴리 ADP 리보스 폴리머라제(PARP) 저해제(예: BMN-673, 올라파립, 루카파립 및 벨리파립) 및 임의로 추가의 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 예를 들면, 유방암의 치료에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 사이클로포스파미드 및 임의로 추가의 치료학적 모이어티(들)(예: 독소루비신, 탁산, 에피루비신, 5-FU 및/또는 메토트렉세이트)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, EGFR-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 아파티닙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 에를로티닙 및/또는 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, EGFR-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 에를로티닙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, ALK-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 세리티닙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, ALK-양성 NSCLC의 치료를 위한 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 크리조티닙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 베바시주맙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 예를 들면 도세탁셀 또는 파클리탁셀과 같은 탁산; 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 베바시주맙 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 겜시타빈 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 유사체 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 예를 들면 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산)의 사용을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 백금계 약물(예를 들면, 카보플라틴 또는 시스플라틴) 유사체 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)(예: 예를 들면 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산 및/또는 겜시타빈 및/또는 독소루비신)의 사용을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 백금-내성 종양의 치료를 위한 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 독소루비신 및/또는 에토포사이드 및/또는 겜시타빈 및/또는 비노렐빈 및/또는 이포스파미드 및/또는 류코보린-조절된 5-플루오로우실 및/또는 베바시주맙 및/또는 타목시펜; 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 PARP 억제제 및 임의로 하나 이상의 다른 치료학적 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 베바시주맙 및 임의로 사이클로포스파미드의 사용을 포함한다.
병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 돌연변이된 또는 비정상적으로 발현된 유전자 또는 단백질(예: BRCA1)을 포함하는 종양에서 효과적인 화학치료학적 모이어티를 포함할 수 있다.
T 림프구(예: 세포독성 림프구(CTL))는 악성 종양에 대항한 숙주 방어에서 중요한 역할을 한다. CTL은 항원 제시 세포상에 종양 연관 항원의 제시에 의해 활성화된다. 능동 특이적 면역요법은 환자를 공지된 암 연관 항원으로부터 유래된 펩타이드로 백신접종하여 암에 대한 T 림프구 반응을 증강시키는데 사용될 수 있는 방법이다. 하나의 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 암 연관 항원(예: 멜라닌세포-계통 특이적 항원 티로시나제, gp100, Melan-A/MART-1 또는 gp75.)에 대한 백신을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 병용 요법은 자가 CTL 또는 자연살해세포의 시험관내 증대, 활성화 및 입양 재도입(adoptive reintroduction)과 함께 항-DPEP3 항체 또는 ADC의 투여를 포함할 수 있다. CTL 활성화는 또한 항원 제시 세포에 의한 종양 항원 제시를 증진시키는 전략에 의해서도 촉진될 수 있다. 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 수지상 세포의 동원 및 수지상 세포 교차-감작의 활성화를 촉진한다. 하나의 실시형태에서, 병용 요법은 항-DPEP3 항체 또는 ADC 및 임의로 하나 이상의 상이한 치료학적 모이어티(들)의 사용과 함께, 항원 제시 세포의 단리, 자극성 사이토킨(예: GM-CSF)에 의한 이러한 세포의 활성화, 종양-연관 항원으로의 감작 및 이어서 항원 제시 세포의 환자로의 입양 재도입을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항-DPEP3 항체 또는 ADC와 방사선요법의 병용을 제공한다. 용어 "방사선요법"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하는 임의의 기작, 예를 들면, 감마-조사, X-선, UV-조사, 마이크로파, 전자 방출 등을 의미한다. 종양 세포로의 방사성동위원소의 지시된 전달을 사용하는 병용 요법이 또한 고려되며, 본원에 개시된 항-DPEP3 항체와 병용하여 또는 이의 접합물로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선요법은 약 1 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 투여된다. 임의로, 방사선요법은 단일 용량 또는 다중 연속 용량으로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 항-DPEP3 항체 또는 ADC는 하기 기재된 항암제 중의 하나 이상과 병용하여 사용될 수 있다.
D. 항암제
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항암제" 또는 "화학요법제"는 "약제학적 활성 모이어티"로서 기재된 제제의 서브세트인 "치료학적 모이어티"의 하나의 서브세트이다. 보다 특히, "항암제"는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 제제를 의미하며, 세포독성제, 세포증식억제제, 혈관형성억제제, 디벌킹제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선치료제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 조절제, 치료 항체, 암 백신, 사이토킨, 호르몬 요법, 전이억제제 및 면역요법제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 논의된 바와 같은 선택된 실시형태에서, 이러한 항암제는 접합체를 포함할 수 있고 투여 전에 항체와 연합될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 실시형태에서, 개시된 항암제는 항체와 결합하여 본원에 개시된 바와 같은 ADC를 제공할 것이다.
용어 "세포독성제"는 항암제일 수도 있으며, 세포에 독성이고 세포의 기능을 감소 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 전형적으로, 상기 물질은 살아있는 유기체로부터 유도된 천연 분자(또는 합성적으로 제조된 천연 산물)이다. 세포독성제의 예는 세균의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(예를 들면, 디프테리아 독소, 슈도모나스 내독소 및 외독소, 포도구균 장독소 A), 진균(예를 들면, α-사르신, 레스트릭토신), 식물(예를 들면, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 포키위드 항-바이러스 단백질, 사포린, 겔로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 메리카나(Phytolacca mericana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 미테겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테센) 또는 동물, (예를 들면, 세포독성 RNase, 예를 들면 세포외 췌장 RNase; DNase I, 이의 단편 및/또는 변이체를 포함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
항암제는 암성 세포 또는 암으로 될 수 있는 세포를 저해하거나 저해하도록 디자인되거나 종양형성 자손(예를 들면, 종양형성 세포)을 생성하는 화학적 제제를 포함할 수 있다. 이러한 화학적 제제는 종종 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포내 과정으로 유도되며, 따라서 일반적으로 급속히 성장하고 분열되는 암성 세포에 대해 특히 효과적이다. 예를 들면, 빈크리스틴은 미세관을 해중합시키며, 이에 따라, 세포가 유사분열로 진입하는 것을 억제한다. 이러한 제제는 흔히 투여되며, 예를 들면, 제형 CHOP와 병용하여 흔히 가장 효과적이다. 다시, 선택된 실시형태에서, 이러한 항암제는 개시된 항체에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체와 병용하여(또는 이에 접합하여) 사용될 수 있는 항암제의 예는 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아나스트로졸, 아마니틴, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, BEZ-235, 보르테조밉, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 세리티닙, 크리조티닙, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카마이신, 엘류테로빈, 에를로티닙, 판크라티스타틴, 사르코딕티인, 스퐁기스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 엔다이인 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 색소단백질 엔다이인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칸포스파미드, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 사이클로포스파미드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 엑세메스탄, 플루오로우라실, 풀베스트란트, 게피티닙, 이다루비신, 라파티닙, 레트로졸, 로나파르닙, 마르셀로마이신, 메게스트롤 아세테이트, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 파조파닙, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, ?라마이신, 라파마이신, 로도루비신, 소라페닙, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 타목시펜, 타목시펜 시트레이트, 테모졸로미드, 테포디나, 티피파르닙, 투베르시딘, 우베니멕스, 반데타닙, 보로졸, XL-147, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 엽산 유사물질, 푸린 유사체, 안드로겐, 항-부신, 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 마이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카르바진, 폴리사카라이드 복합체, 라족산; 리족신; SF-1126, 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드; 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로란부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드; 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미놉테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸, 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; XL518, 세포 증식을 억제하는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들면, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 항체, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제 및 항-안드로겐; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 예를 들면, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체가 또한 이 정의에 포함된다.
특히 바람직한 항암제는 상업적으로 또는 임상적으로 이용가능한 화합물, 예를 들면, 에를로티닙(타르세바(TARCEVA®), 제넨테크(Genentech)/OSI Pharm.), 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE®), 사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS 번호 51-21-8), 겜시타빈(겜자르®, 릴리(Lilly)), PD-0325901(CAS 번호 391210-10-9, 화이자(Pfizer)), 시스플라틴(시스-디아민, 디클로로백금(II), CAS 번호 15663-27-1), 카보플라틴(CAS 번호 41575-94-4), 파클리탁셀(탁솔(TAXOL®), 브리스톨-마이어스 스큅 종양학(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴 소재), 트라스투주맙(허셉틴(HERCEPTIN®), 제넨테크), 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복스아미드, CAS 번호 85622-93-1, 테모다르(TEMODAR®), 테모달(TEMODAL®), 쉐링 플라우(Schering Plough)), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, 놀바덱스(NOLVADEX®), 이스투발(ISTUBAL®), 발로덱스(VALODEX®)) 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®)을 포함한다. 추가의 상업적으로 또는 임상적으로 이용가능한 항암제는 옥살리플라틴(에록사틴(ELOXATIN®), 사노피), 보르테조밉(VELCADE®, 밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.)), 수텐트(수니티닙(SUNITINIB®), SU11248, 화이자), 레트로졸(페마라(FEMARA®), 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트(글리벡(GLEEVEC®), 노바티스), XL-518(Mek 억제제, 엑셀릭시스(Exelixis), 제WO 2007/044515호), ARRY-886(Mek 억제제, AZD6244, 어레이 바이오파마(Array BioPharma), 아스트라 제네카(Astra Zeneca)), SF-1126(PI3K 억제제, 세마포레 파마슈티카스(Semafore Pharmaceuticas)), BEZ-235(PI3K 억제제, 노바티스), XL-147(PI3K 억제제, 엑셀릭시스), PTK787/ZK 222584(노바티스), 풀베스트란트(파스로덱스(FASLODEX®), 아스트라제네카), 류코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, 라파무네(RAPAMUNE®), 와이어스(Wyeth)), 라파티닙(타이케르브(TYKERB®), GSK572016, 글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파르닙(사라사르(SARASAR™), SCH 66336, 쉐링 플라우), 소라페닙(넥사바르(NEXAVAR®), BAY43-9006, 베이어 랩스(Bayer Labs)), 게피티닙(이레싸(IRESSA®), 아스트라제네카), 이리노테칸(캄프토사르(CAMPTOSAR®), CPT-11, 화이자), 티피파르닙(자르네스트라(ZARNESTRA™), 존슨 앤드 존슨(Johnson & Johnson)), 아브락산(ABRAXANE™)(크레모포르-비함유), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아메리칸 파마슈티칼스 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그 소재), 반데타닙(rINN, ZD6474, 작티마(ZACTIMA®), 아스트라제네카), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; 수겐(Sugen)), 템시롤리무스(토리셀(TORISEL®), 와이어스), 파조파닙(글락소스미스클라인), 칸포스파미드(텔사이타(TELCYTA®), 텔릭(Telik)), 티오테파 및 사이클로스포스파미드(사이톡산(CYTOXAN®), 네오사르(NEOSAR®)); 비노렐빈(나벨빈); 카페시타빈(젤로다®, Roche), 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX®) 포함; 타목시펜 시트레이트, 파레스톤(FARESTON®)(토레미핀 시트레이트) 메가세(MEGASE®)(메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN®)(엑세메스탄; 화이자), 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR®)(보로졸), 페마라(FEMARA®)(레트로졸; 노바티스) 및 아리미덱스(ARIMIDEX®)(아나스트로졸; 아스트라제네카)를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염" 또는 "염"은 분자 또는 거대분자의 유기 또는 무기 염을 의미한다. 산 부가염은 아미노 그룹과 함께 형성될 수 있다. 예시적인 염은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루콘이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1' 메틸렌 비스-(2-하이드록시 3-나프토에이트)) 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 기타 카운터이온과 같은 다른 분자의 봉입을 포함할 수 있다. 카운터이온은 모 화합물에 대한 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 게다가, 약제학적으로 허용되는 염은 이의 구조에 하나 이상의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용되는 염의 일부인 경우, 염은 다수의 카운터이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 카운터이온을 가질 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 용매화물" 또는 "용매화물"은 하나 이상의 용매 분자와 분자 또는 거대분자의 연합을 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 ADC는 현재 임상 시험 중에 있거나 상업적으로 이용가능한 다수의 항체(또는 면역치료제) 중의 어느 하나와 병용하여 사용될 수 있다. 개시된 항체는 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시주맙, 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 에크로멕시맙, 에로투주맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 파를레투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 임가투주맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 납투모맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올라파립, 오나르투주맙, 오포르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 피딜리주맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라무시루맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 셀루메티닙, 시브로투주맙, 실툭시맙, 심투주맙, 솔리토맙, 타카투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 투코투주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙, 보르세투주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 3F8, MDX-1105 및 MEDI4736 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체와 병용하여 사용될 수 있다.
다른 특히 바람직한 실시형태는 리툭시맙, 겜투주맙 오조감신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 파티투무맙, 오파투무맙, 이필리무맙 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암 요법에 대해 승인된 항체의 사용을 포함한다. 당업계의 숙련가들은 본원의 교시에 적합한 추가의 항암제를 쉽게 확인할 수 있을 것이다.
E. 방사선요법
본 발명은 또한 항체 또는 ADC와 방사선요법(즉, 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하는 임의의 기작, 예를 들면, 감마-조사, X-선, UV-조사, 마이크로파, 전자 방출 등)의 병용을 제공한다. 종양 세포로의 방사성동위원소의 지시된 전달을 사용하는 병용 요법이 또한 고려되며, 개시된 항체 또는 ADC는 표적화된 항암제 또는 기타 표적화 수단과 함께 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선요법은 약 1 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 투여된다. 방사선 요법은 두경부암을 갖는 대상체에게 약 6 내지 7주 동안 투여될 수 있다. 임의로, 방사선요법은 단일 용량 또는 다중 연속 용량으로 투여될 수 있다.
VIII. 징후
본 발명은 병원체에 의해 야기되는 신생물성, 염증성, 혈관형성성 및 면역성 장애 및 장애들을 포함한 다양한 장애의 진단, 테라그노시스, 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 항체 및 ADC의 용도를 제공한다. 특히, 치료를 위한 주요 표적은 고형 종양을 포함한 신생물 병태이지만, 혈액암도 본 발명의 범위내에 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 특정 결정인자(예를 들면, DPEP3)를 발현하는 종양 또는 종양형성 세포의 종양을 치료하는데 사용될 것이다. 바람직하게는 치료되는 "대상체" 또는 "환자"는 사람이지만, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 임의의 포유동물 종을 명백히 포함한다.
본 발명에 따르는 치료에 적용되는 신생물 병태는 양성 또는 악성; 고형 종양 또는 기타 혈액 신생물일 수 있으며; 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포종, 자율신경절 종양, 방광암(편평세포 암종 및 이행세포 암종), 포배강 장애(blastocoelic disorder), 골암(법랑질종, 동맥류 골낭종, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수 암, 뇌 전이암, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 상피 장애, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 골의 섬유형성이상, 담낭 및 담관 암, 위암, 위장, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 선 장애(glandular disorder), 두경부암, 시상하부암, 장암, 소도 세포 종양, 카포시 육종, 신장암(신아세포종, 유두상 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암종, 편평세포 암종, 거대세포 암종 등), 대식세포 장애, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 포스테리어스 후 포도막(posterious unveal) 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이성 암, 간상 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포 암, 위암, 간질성 장애, 활막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암(자궁경부의 암종, 자궁내막 암종 및 평활근종).
다른 바람직한 실시형태에서, 개시된 항체 및 ADC는 다음의 아형을 포함한 폐암을 치료하는데 특히 효과적이다: 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암(예를 들면, 편평세포 비-소세포 폐암 또는 편평세포 소세포 폐암). 선택된 실시형태에서, 항체 및 ADC는 제한병기(limited stage) 질환 또는 진행병기(extensive stage) 질환을 나타내는 환자에게 투여될 수 있다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 개시된 접합된 항체는 난치성 환자(즉, 초기 요법 과정 동안 또는 초기 요법의 완료 직후 질환이 재발한 환자); 감수성 환자(즉, 1차 요법 후 재발이 2 내지 3개월 이상 경과한 환자); 또는 백금계 제제(예를 들면, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴) 및/또는 탁산(예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 내성을 나타내는 환자에게 투여될 것이다.
특히 바람직한 실시형태에서, 개시된 항체 및 ADC는 장액성 난소 암종 및 유두상 장액성 난소 암종을 포함하는 난소암의 치료에서 효과적이다.
본 발명은 또한 양성 또는 전암성 종양을 나타내는 대상체의 방지 또는 예방 치료를 제공한다. 어떠한 특정 유형의 종양 또는 증식성 장애도 본 발명의 항체를 사용하는 치료로부터 배제되지 않는다.
IX. 제조 물품
본 발명은 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트를 포함하며, 여기서, 상기 용기는 1회 이상의 용량의 본 발명의 항체 또는 ADC를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 팩 또는 키트는 단위 용량을 함유하며, 이는, 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 ADC를 하나 이상의 추가의 제제 및 임의로, 하나 이상의 항암제의 존재 또는 부재하에 포함하는 소정량의 조성물을 의미한다.
본 발명의 키트는 일반적으로 적합한 용기에 본 발명의 항체 또는 ADC의 약제학적으로 허용되는 제형을 그리고, 동일하거나 상이한 용기에 임의로, 하나 이상의 항암제를 함유할 것이다. 키트는 또한 다른 약제학적으로 허용되는 제형 또는 장치를, 진단 또는 병용 요법을 위해 함유할 수 있다. 진단 장치 또는 기기의 예는 증식성 장애와 관련된 세포 또는 마커를 검출, 모니터링, 정량 또는 프로파일링하는데 사용될 수 있는 것들을 포함한다(이러한 마커의 전체 목록에 대해 상기 참조). 특히 바람직한 실시형태에서, 장치는 생체내 또는 시험관내에서 순환 종양 세포를 검출, 모니터링 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 제WO 2012/0128801호 참조). 또다른 바람직한 실시형태에서, 순환 종양 세포는 종양형성 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 키트는 또한 본 발명의 항체 또는 ADC를 항암제 또는 진단제와 배합하는 적합한 시약을 함유할 수 있다(예를 들면, U.S.P.N. 제7,422,739호 참조).
키트의 성분들이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 비수성일 수 있지만, 수용액이 바람직하며, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 키트 중의 제형은 또한 건조 분말(들)로서 또는 적당한 액체의 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 재구성에 사용되는 액체는 별도의 용기에 함유될 수 있다. 이러한 액체는 멸균성의 약제학적으로 허용되는 완충제(들) 또는 기타의 희석제(들), 예를 들면, 주사용 정균수, 인산염-완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함할 수 있다. 키트가 본 발명의 항체 또는 ADC를 추가의 치료제 또는 제제와 함께 포함하는 경우, 용액을 등몰량 배합으로 또는 한 성분을 다른 성분에 비해 과량으로 하여 예비-혼합할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 또는 ADC 및 임의의 항암제 또는 기타 제제는 환자에게 투여하기 전에 뚜렷이 다른 용기 내에 별도로 유지시킬 수 있다.
키트는 하나 또는 다수의 용기, 및 동봉된 조성물이 선택된 질환 상태를 진단 또는 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는, 용기(들) 내에, 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기(들)는 멸균 접근 포트를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 키트는 환자에게 항체 및 임의의 성분들을 투여하기 위한 수단, 예를 들면, 하나 이상의 바늘 또는 주사기(예비충전된 또는 텅빈), 점안기, 피펫, 또는 제형을 대상체에 주사 또는 도입할 수 있거나 신체의 질환 부위에 적용할 수 있는 기타 이러한 유사 장치를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 바이알 등을 함유하기 위한 수단, 및 목적하는 바이알 및 기타 장치가 배치되고 보유되는 취입-성형된 플라스틱 용기와 같이 상업적 판매를 위한 밀폐되어 있는 다른 성분을 포함할 것이다.
X. 기타 사항들
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업계의 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 달리 문맥에 의해 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이며 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 양쪽 종점 및 종점들 사이의 모든 점들을 포함한다. 따라서, 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점들을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 화학의 기술은 당업계에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 이러한 기술과 관련하여 본원에 사용된 명명법도 또한 당업계에 통상적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 다양한 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
XI. 참조
어구 "참고로 인용된"이 특정 참조에 관하여 사용되는지 사용되지 않는지와는 무관하게, 본원에 인용된 모든 특허들, 특허 출원들 및 공보들 및 전자적으로 이용가능한 자료(예를 들면, GenBank 및 RefSeq에서의 뉴클레오타이드 서열 제출물 및 예를 들면, SwissProt, PIR, PRF, PDB 및 GenBank와 RefSeq에서 주석이 달린 암호화 영역으로부터의 번역물에서의 아미노산 서열 제출물을 포함함)의 완전한 개시내용은 참조로 인용된다. 상기 상세한 설명 및 하기 실시예는 단지 명료한 이해를 위해 제공되었다. 이로부터 불필요하게 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 발명은 도시되고 기재된 정확한 상세 내용에 제한되지 않는다. 당업계의 숙련가들에게 명백한 변형이 청구범위에 의해 정의된 본 발명에 포함된다. 본원에 사용된 임의의 섹션 표제는 단지 구성상 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
XII. 서열목록 요약
다수의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 서열목록이 본원에 첨부되어 있다. 하기 표 6은 포함된 서열의 요약을 제공한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 표 6은 도 5a 및 5b에 기술된 예시적인 CDR과 연관된 서열번호들을 확인하는데 추가로 사용될 수 있다. 도 5a 및 5b는 각 중쇄(CDRH) 및 경쇄(CDRL) 가변영역 서열의 3개의 카뱃 CDR을 나타내고, 상기 표 3은, 선택된 사람화 항체에 있어서, 경쇄의 각 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 각 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3에 적용될 수 있는 서열번호 지정을 제공한다. 예를 들면, hSC34.2 경쇄(서열번호 189)는 도 5a에 제시된 바와 같은 CDRL1(서열번호 232)(즉, SASQGITNYLN)을 포함한다. 유사하게, hSC34.2 경쇄의 CDRL2(서열번호 233)도 도 5a에 제시된 바와 같을 수 있다(즉, YTSRLHS). 동일한 CDR 서열은 첨부된 서열목록에도 제공되어 있다.
XIII. 실시예
따라서, 상기 일반적으로 기재된 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이것은 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실시예는 하기 실험이 모든 또는 유일하게 수행된 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
PDX 종양 세포 유형은 숫자가 뒤따르는 약어로 표시되며, 이것은 특정 종양 세포주를 나타낸다. 시험된 샘플의 계대배양 횟수(passage number)는 샘플 명칭에 첨부된 p0-p#로 나타내어지며, 여기서, p0는 환자 종양으로부터 직접적으로 수득된 비계대배양 샘플을 가리키고, p#는 종양이 시험 전에 마우스로부터 계대배양된 횟수를 가리킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 종양 유형 및 아형의 약어는 다음과 같이 표 7에 나타내어져 있다:
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 1
전체 전사체 서 열분석을 사용한 차등적 DPEP3 발현의 동정
암 환자에서 존재하는 고형 종양의 세포 이질성을 특징 규명하고, 특정 표현형 마커를 사용하여 TIC의 동정을 돕고, 임상적으로 관련된 치료 표적을 확인하기 위해, 거대 PDX 종양 은행(tumor bank)을 개발하였으며 당업계에 인지된 기술을 사용하여 유지시켰다. 다수의 개별 종양 세포주를 포함하는 PDX 종양 은행은 각종 악성 고형 종양에 걸린 암 환자로부터 원래 입수된 종양 세포의 다수의 계대배양을 통해 면역약화된 마우스에서 증식시켰다. 초기 계대 PDX 종양은 이의 고유 환경에서의 종양의 대표이며 이리노테칸(즉, Camptosar®)과 같은 치료제에 반응하여, 현재의 요법에 대한 내성 및 종양 성장을 유도하는 근본적 기작에 대해서 임상적으로 관련된 통찰력을 제공한다.
PDX 종양 세포주로부터 RNA를 생성하기 위해, 종양이 800 - 2,000mm3에 도달한 후 마우스로부터 종양을 절제하고, 종양을 당업계에 인지된 효소 분해 기술을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다(예를 들면, U.S.P.N. 제2007/0292414호 참조). 해리된 선택 PDX 종양 세포 제제에서 마우스 세포를 고갈시키고, TIC 아집단의 마커인 CD46hi 및 CD324+의 발현에 기초하여 분류하였다(U.S.P.N. 2013/0260385, 2013/0061340 및 2013/0061342 참조). CD46hi/CD324+ 표현형을 갖는 사람 EpCAM(즉, TIC) 또는 CD46lo/CD324+ 표현형을 갖는 EpCAM(즉, NTG 세포)를 FACSAria 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 FACS에 의해 단리시키고 제조업자의 지침에 따라서 RLTplus RNA 용해 완충액에 용해시켰다. 그 후, 용해물을 -80℃에서 저장하고, RNA 추출을 위해 해동시켰다. 해동시, 총 RNA를 판매업자의 지침에 따라서 RNeasy 단리 키트(Qiagen, GmbH)를 사용하여 추출한 다음, Nanodrop 분광 광도계(Thermo Scientific) 및/또는 바이오분석기 2100(Agilent Technologies)를 사용하고, 다시 제조자의 프로토콜 및 권장된 기기 세팅을 사용하여 정량화하였다. 생성된 총 RNA 제제를 유전자 서열분석 및 유전자 발현 분석에 의해 평가하였다.
정량된 고품질 RNA의 전체 전사체 서열분석은 2가지 상이한 시스템을 사용하여 수행하였다. 일부 샘플을 Oligo 연결/검출(SOLiD) 4.5 또는 SOLiD 5500xl 차세대 서열분석 시스템(Life Technologies)에 의해 Applied Biosystems(ABI) 서열분석을 사용하여 수행하였다. 다른 샘플은 일루미나 HiSeq 2000 또는 2500 차세대 서열분석 시스템(일루미나)을 사용하여 분석하였다.
SOLiD 전체 전사체 분석은, 저 투입 총 RNA를 위해 디자인된 ABI로부터의 변형된 전체 전사체 프로토콜 또는 Ovation RNA-Seq 시스템 V2TM(NuGEN Technologies)을 사용하여 1ng 총 RNA 샘플로부터 생성된 cDNA를 이용하여 수행하였다. 수득된 cDNA 라이브러리를 단편화하고, 바코드 어댑터를 첨가하여 서열분석 수행 동안 상이한 샘플들로부터 단편 라이브러리를 풀링(pooling)되도록 하였다. SOLiD 플랫폼에 의해 생성된 데이터는 (공개된 사람 게놈의 NCBI 버젼 hg19.2를 사용하는 RefSeq 버젼 47에 의해 주석이 달린 바와 같은) 34,609개 유전자에 대해 맵핑되었고, 대부분의 샘플에서의 RNA 수준의 입증가능한 측정을 제공하였다. SOLiD 플랫폼으로부터의 서열분석 데이터는 명목상 유전자의 엑손 영역에 맵핑된 매트릭스 RPM(백만개당 판독) 또는 RPKM(백만개당 킬로베이스당 판독)을 사용한 전사체 발현 값으로서 나타내어지므로, 기본적인 유전자 발현 분석을 정규화하고 RPM_전사체 또는 RPKM_전사체로서 열거할 수 있다.
일루미나 전체 전사체 분석은 5ng 총 RNA와 TruSeq RNA 샘플 제조 키트 v2(일루미나)를 사용하여 생성시킨 cDNA를 이용하여 수행하였다. 수득된 cDNA를 단편화하고 바코드를 붙였다. 일루미나 플랫폼으로부터의 서열분석 데이터를 유전자의 엑손 영역에 대해 맵핑된 매트릭스 FPM(백만개당 단편) 또는 FPKM(백만개당 킬로베이스당 단편)을 사용하여 전사체 발현 값으로서 명목상으로 표현하여, 기본 유전자 발현 분석이 정규화되고 FPM_전사체 또는 FPKM_전사체로서 열거되도록 하였다.
SOLiD 전체 전사체 서열분석의 결과는 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 난소 및 췌장 조직을 포함하는 정상적인 주요 생체 장기 조직과 비교하여 BR36 및 OV106MET PDX 세포주의 TIC 종양 세포 아집단에서 상승된 DPEP3 mRNA 발현을 보여주었다(도 1a). 유사하게, 일루미나 전체 전사체 서열분석은 NTG 집단 뿐만 아니라 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 피부, 비장, 위 및 기도 조직을 포함하는 정상 조직과 비교해 OV27의 TIC 종양 세포 아집단에서 상승된 DPEP3 mRNA 발현을 보여주었다(도 1b). 유방 및 난소에서의 상승된 DPEP3 mRNA 발현의 동정은 이러한 항원이 잠재적 진단적 및/또는 면역치료적 표적으로서 추가 평가될만한 가치가 있음을 나타냈다.
실시예 2
qRT-PCR을 사용한 종양에서의 DPEP3 mRNA의 발현
종양 세포에서 DPEP39 발현을 확인하기 위해, qRT-PCR을 다양한 PDX 세포주에서 산업 표준 프로토콜에 따라서 Fluidigm BioMarkTM HD 시스템을 사용하여 실시하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 1ng의 RNA를 고성능 cDNA Archive 키트(Life Technologies)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 cDNA로 전환시켰다. 그 후, DPEP3 특이적 Taqman 검정을 사용하여 사전-증폭된 cDNA 물질을 후속적인 qRT-PCR 실험을 위해 사용하였다.
정상 조직(NormTox 또는 Norm)에서의 발현을 OV-S/PS PDX 세포주에서의 발현과 비교하였다(도 2a; 각각의 점은 각각의 개별적 조직 또는 PDX 종양 세포주의 평균적인 상대적 발현을 나타내고, 수평선은 기하평균을 나타낸다). DPEP3의 높은 발현은 하기에서 보다 상세히 논의하는 바와 같이 OV-S/PS 종양의 아집단에서 관찰되었다. DPEP3을 발현하는 정상 조직은 고환, 후근신경절, 위, 소장, 멜라닌세포, 뇌, B 세포, 지방 조직, 호중구 및 단핵구를 포함한다. "NormTox"는 항체 약물 접합체 치료제의 맥락에서 더 많은 독성 위험을 갖는 다음과 같은 기관의 정상 조직 샘플을 나타낸다: 동맥, 정맥, 후근신경절, 혈관 평활근 세포, 비장, 기도, 피부, 신장, 위, 간, 폐, 식도, 소장, 부신, 골격근, 췌장, 심장 및 결장. "Norm"으로 지정된 정상 조직의 다른 세트는 항체 약물 접합체 치료제의 맥락에서 보다 적은 위험을 갖는 다음과 같은 정상 조직 샘플을 나타낸다: 난소, 유방, 고환, 자궁, 갑상선, 말초혈 단핵세포, NK 세포, B 세포, T 세포, 단핵구, 호중구, 정상 골수, 흉선, 지방, 타액선, 뇌, 전립선 및 멜라닌세포.
1차 사람 종양 샘플 뿐만 아니라 정상 조직 샘플의 보다 큰 그룹으로 분석을 더욱 확대하기 위해, 동일한 Taqman qRT-PCR 검정을 TissueScanTM qPCR(Origene Technologies) 384-웰 어레이를 사용하여 상기한 바와 같이 실시하였다. 이러한 검정은 각 종양 유형에 대한 다수의 환자 유래 샘플과 18개의 상이한 고형 종양 유형에 걸친 유전자 발현의 비교를 가능하게 한다. 각종 전체 종양 표본에서의 DPEP3 mRNA의 발현 수준(검은색 점)을 β-액틴에 대해 정규화하고 분석된 각각의 종양 유형에 대한 정상 조직에서의 발현(백색 점)에 대해 플롯팅하였다. 증폭되지 않은 표본에는 45의 사이클 계수 값(Ct)이 할당되며, 이것은 실험 프로토콜에서 마지막 증폭 사이클을 나타낸다. 각각의 점은 단일 조직 표본을 나타내며, 기하평균 값은 검은색 선으로서 나타냈다. 매칭된 정상 조직에 상대적인 DPEP3의 과발현은 BR, EN 및 OV 종양에서 나타났다(도 2b). 부신, 자궁경부, 결장, 식도, 신장, 간, 림프절, 췌장, 전립선, 갑상선, 방광 및 자궁을 포함한 다른 정상 조직은 DPEP3의 발현이 결여되었다(데이터는 제시하지 않음).
이들 데이터는 DPEP3이 BR, EN 및 OV 종양에서 발현되고 이러한 징후들에서 항체-기반 치료의 개발을 위한 우수한 표적이 될 수 있음을 입증한다.
실시예 3
암 게놈 아틀라스로부터의 종양에서의 DPEP3 발현
DPEP3 mRNA의 과발현은 암 게놈 아틀라스(TCGA, National Cancer Institute)로서 공지된 종양 및 정상 샘플의 공개적으로 이용 가능한 대규모 데이터세트를 사용하여 다양한 종양에서 확인하였다. IlluminaHiSeq_RNASeqV2 플랫폼으로부터의 엑손 수준 3 발현 데이터는 TCGA 데이터 포털(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)로부터 다운로드하였으며, 각 유전자의 개별 엑손으로부터의 판독치를 집계하기 위해 분석하여 100만개의 맵핑된 판독치당 엑손 킬로베이스당 단일 값 판독치(RPKM)를 생성한다. 도 3은 DPEP3 발현이, TCGA의 정상 조직 샘플과 비교해, OV, SK, LU-SCC 및 LU-Ad 종양 유형의 서브세트에서 상승됨을 보여준다. 이들 데이터는, 상승된 DPEP3 mRNA가 OV, SK 및 LU 종양에서 발견될 수 있다는, 실시예 1 및 2의 전체 전사체 및 qRT-PCR 분석으로부터의 이전의 관찰결과를 확인시켜 주며, 이것은 항-DPEP3 항체가 이러한 종양들에 유용한 치료제일 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
재조합 DPEP2 및 DPEP3 단백질의 클로닝
사람 DPEP3 및 DPEP2 단백질을 암호화하는 DNA 단편
사람 DPEP3 (hDPEP3) 단백질(UniProtKB /Swiss-Prot. Q9H4B8.2)과 관련해 본 발명에서 요구되는 모든 분자성 및 세포성 물질을 생성하기 위해, 전체길이 hDPEP3 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 cDNA 클론(GenBank 수탁번호 BC037243, [서열번호 6])을 구입하였다(ThermoFisher). 상기 cDNA 클론은 성숙한 hDPEP3 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적 조작을 위해 사용되었다.
hDPEP3 단백질에 면역반응성이거나 면역특이적인 항체를 생성하기 위해, 수탁번호 NP_071752로부터의 잔기 A61 내지 S488을 포함하는 hDPEP3 단백질의 세포외 도메인(ECD)이 히스티딘 태그 또는 사람 IgG2 Fc 태그와 프레임내에서 융합된 키메라 융합 유전자를 생성시켰다. 이는 다음과 같이 수행하였다: hDPEP3 단백질의 ECD를 암호화하는 DNA 단편을 hDPEP3 cDNA 클론으로부터 PCR 증폭시키고, 표준 분자 기술을 사용하여, 프레임내에서 IgK 시그널 펩타이드 서열의 하류 및 히스티딘 태그 또는 사람 IgG2 Fc cDNA의 상류에서 CMV 구동 발현 벡터로 서브클로닝시켰다. CMV-구동 hDPEP3 발현 벡터는 HEK-293T 및/또는 CHO-S 세포에서 높은 수준의 일시적 발현을 가능케 한다. HEK-293T 세포의 현탁액 또는 부착 배양물, 또는 CHO-S 세포 현탁액을, 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민 중합체를 사용하여 hDPEP3-ECD-His 또는 hDPEP3-ECD-Fc 단백질을 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 3일 내지 5일 후, hDPEP3-ECD-His 또는 hDPEP3-ECD-Fc 단백질을 각각 AKTA 익스플로러(explorer) 및 니켈-EDTA(Qiagen) 또는 MabSelect SuRe™ 단백질 A(GE Healthcare Life Sciences) 컬럼을 사용하여 정화된 세포-상청액으로부터 정제하였다.
교차-반응성 연구를 위한 hDPEP2 단백질을 생성하기 위해, 사람 DPEP2(hDPEP2) 단백질의 대부분을 암호화하는 cDNA 클론을 오리겐(Origene)으로부터 구입하였으나, 상기 클론의 번역 산물을 hDPEP2에 대한 RefSeq 수탁번호(NP_071750, [서열번호 7])에 대해 서열 분석한 결과, RefSeq 단백질의 아미노 말단 서열의 일부분이 오리겐 클론에서 누락된 것으로 나타났다. 따라서, RefSeq 단백질 내의 서열에 상응하는 hDPEP2 ORF의 목적하는 전면 말단을 암호화하는 0.62kBp 합성 DNA를 제조하였다(GeneWiz). 시험관내 심리스 클로닝(seamless cloning) 기술(In Fusion, Clontech)을 제조업자의 지침에 따라서 사용하여 hDPEP2 RefSeq에 상응하는 단백질을 암호화하는 전체길이 ORF를 조립하였다. 이렇게 조립된 cDNA 클론은 성숙한 hDPEP2 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 작제물의 모든 후속적 조작을 위해 사용되었다.
사람 DPEP2 단백질은, 수탁번호 NP_071750로부터의 잔기 A33 내지 S463을 포함하는 hDPEP2 단백질의 ECD가 히스티딘 태그 또는 사람 IgG2 Fc 태그와 프레임내에서 융합된 키메라 융합 유전자를 상기 hDPEP3을 갖는 키메라 유전자 작제물에 대해 기술한 바와 동일한 방식으로 생성시킴으로써 제조하였다. 유사하게, 히스티딘-태그된 또는 사람 IgG2-태그된 재조합 hDPEP2를 hDPEP3에 대해 상기 기재한 방법들을 사용하여 HEK-293T 및/또는 CHO-S 세포 내에서 생산하였다.
마우스, 사람 및 시노몰구스 DPEP3 단백질을 암호화하는 DNA 단편
마우스, 래트 및 시노몰구스 DPEP3 단백질에 관한 분자성 및 세포성 물질은 다음과 같이 생성시켰다.
마우스 DPEP3 단백질(mDPEP3)의 경우에는, 마우스 RefSeq DPEP3 단백질(GenBank 수탁번호 NP_082236)과 동일한 단백질을 암호화하는 cDNA 클론(GenBank 수탁번호 BC051148, [서열번호 9])을 구입하였다(ThermoFisher). 래트 DPEP3 단백질(rDPEP3)의 경우에는, 래트 RefSeq DPEP3 단백질(GenBank 수탁번호 NP_001008384)과 동일한 단백질을 암호화하는 cDNA 클론(GenBank 수탁번호 BC085826, [서열번호 11])을 구입하였다(ThermoFisher). 시노몰구스 원숭이(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) DPEP3 단백질(cDPEP3)의 경우에는, 먼저, hDPEP3 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 NCBI의 시노몰구스 전체 게놈 샷건 콘티그 서열 데이터베이스에 대해 BLASTing하고 상기 시노몰구스 게놈 서열 내의 임의의 갭을 레수스 원숭이(마카카 물라타(Macaca mulatta)) 게놈으로부터 추론된 것들로 채워넣음으로써 시노몰구스 원숭이 DPEP3 서열을 추론하였다. 그 후, 예측된 시노몰구스 DPEP3 ORF 서열을 코돈-최적화된 DNA 단편(GeneWiz)으로서 합성하였다,
이들 DNA 클론은 히스티딘 태그 또는 사람 IgG2 Fc 태그를 갖는 마우스, 래트 또는 시노몰구스 DPEP3 ECD에 대한 키메라 융합 유전자를 생성하기 위한 다양한 PCR 반응용의 주형으로서 사용하였다. 이러한 작제물들은 hDPEP3에 대해 상기한 방법을 사용하여 HEK-293T 및/또는 CHO-S 세포에서 제조하였다.
세포주 조작
당업계에 공지된 분자생물학 기술을 사용하여, 상기 열거된 다양한 DPEP3 단백질을 과발현하는 조작된 세포주를 HEK-293T 세포주를 형질도입하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 작제하였다. 먼저, PCR을, 주형으로서 상기한 특이적 DNA 단편을 사용하여 관심대상 단백질(예를 들면, hDPEP3, mDPEP3, rDPEP3 또는 cDPEP3)을 암호화하는 DNA 단편을 증폭시키는데 사용하였다. 그 후, 개별 PCR 산물을 렌티바이러스 발현 벡터, pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP(System Biosciences)의 다중 클로닝 부위(MCS)로 서브클로닝하여, 렌티바이러스 벡터 묶음을 생성하였다. 생성된 pCDH-EF1-DPEP3-IRES-GFP 벡터 내의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열은 단일 mRNA 전사체로부터 제2 단백질의 캡-독립적 개시를 가능케 한다. IRES의 DPEP3 단백질 암호화된 상류의 고 수준 발현은 IRES 요소의 GFP 마커 단백질 암호화된 하류의 공동발현과 상관관계가 있다. 이러한 묶음의 렌티바이러스 벡터를 개개의 DPEP3 단백질을 과발현하는 분리된 안정한 HEK-293T 세포주를 생성하는데 사용하였다. DPEP3-양성 세포를 양성 GFP 시그널에 기초하여 고-발현 HEK-293T 서브클론의 FACS를 사용하여 선택하였다.
실시예 5
항-DPEP3 항체의 생성
항-DPEP3 마우스 항체를 다음과 같이 생산하였다. 6마리의 마우스(다음 스트레인의 각각 2마리: Balb/c, CD-1, FVB)를 동일 용적의 TiterMax® 어쥬반트로 유화된 10㎍ hDPEP3-His 단백질로 접종시켰다. 초기 접종 후, 마우스에게 동일 용적의 명반 어쥬번트와 CgG로 유화된 5㎍ hDPEP3-His 단백질을 4주 동안 주 2회 주사하였다.
마우스를 희생시키고, 배수 림프절(draining lymph node)(슬와, 서혜부 및 내측 장골)을 절개하고, 항체 생산 세포용 공급원으로서 사용하였다. B 세포(430×106개 세포)의 단일 세포 현탁액을 모델 BTX Hybrimmune 시스템(BTX Harvard Apparatus)을 사용하여 전기 세포 융합에 의해 1:1의 비로 비-분비성 P3x63Ag8.653 골수종 세포(ATCC #CRL-1580)와 융합시켰다. 세포를 아자세린, 15% 태아 클론 I 혈청, 10% BM 콘디메드, 1mM 비필수 아미노산, 1mM HEPES, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신 및 50μM 2-머캅토에탄올로 보충된 DMEM 배지로 이루어진 하이브리도마 선택 배지에 재현탁시키고, 4개의 T225 플라스크에서 플라스크당 100mL 선택 배지 중에서 배양하였다. 플라스크를 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 가습된 37℃ 항온배양기에서 6일 동안 놓아두었다.
융합 후, 하이브리도마 라이브러리 세포를 플라스크로부터 수집하고, 90㎕의 보충된 하이브리도마 선택 배지(상기한 바와 같음)에서 웰당 1개 세포로 (FACSAria I 세포 분류기를 사용하여) 12개 Falcon 384-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 라이브러리의 나머지는 액체 질소 중에서 보관하였다.
하이브리도마를 10일 동안 배양하고, 상청액을 다음과 같이 수행된 유세포분석법을 사용하여 hDPEP3에 특이적인 항체에 대해 스크리닝하였다. 웰당 1x105개의, hDPEP3으로 안정하게 형질도입된 HEK-293T 세포를 25㎕ 하이브리도마 상청액과 함께 30분 동안 항온배양하였다. 세포를 PBS/2% FCS로 세척한 다음, 샘플당 25㎕의, PBS/2%FCS에 1:30으로 희석된 DyeLight 649 표지된 염소-항-마우스 IgG, Fc-단편 특이적 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 15분 후, 항온처리 세포를 PBS/2%FCS로 2회 세척하고, PBS/2%FCS 중에 DAPI로 재현탁시키고, 이소타입 대조 항체로 염색된 세포의 형광도를 초과하는 형광도에 대해 유세포분석법으로 분석하였다. 남은 미사용된 하이브리도마 라이브러리 세포를 추가의 라이브러리 시험 및 스크리닝을 위해 액체 질소 중에서 동결시켰다.
hDPEP3-His 면역화 작전은 hDPEP3-발현 HEK-293T 세포의 표면에 결합하는 수많은 마우스 항체를 산출하였다.
실시예 6
항-DPEP3 항체의 특징
생성된 항-DPEP3 항체(실시예 5)를 이소타입, hDPEP3에 대한 친화도, hDPEP1, hDEP2, mDPEP3, rDPEP3 및 cDPEP3에 대한 교차 반응성, 결합의 반응속도론 및 각각의 항체가 점유하는 독특한 에피토프 빈의 확립의 측면에서 특징 규명하기 위해 다양한 방법을 사용하였다.
전형적 수의 항체의 이소타입을 제조업자의 프로토콜에 따라서 Milliplex 마우스 면역글로불린 이소타입판별 키트(Millipore)를 사용하여 결정하였다. 독특한 DPEP3-특이적 항체에 대한 결과는 도 4에서 볼 수 있다.
항-DPEP3 항체를 마우스, 래트 및 시노몰구스 DPEP3과의 교차-반응성 및 가장 가까운 DPEP3 계열 구성원인 hDPEP2에 대한 교차반응성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. ELISA는 다음과 같이 실시하였다. 플레이트를 0.2M 카보네이트-바이카보네이트 완충액(pH 9.4) 중의 0.3㎍/mL로 4℃에서 정제된 마우스, 래트 또는 시노몰구스 DPEP3-His 또는 hDPEP2-His로 밤새 코팅하였다. 단백질 용액을 제거하고, 웰을 100㎕/웰에서 1시간 동안 37℃에서 PBS(PBSA) 중의 1%(w/v) BSA로 차단시켰다. 그 후, 항-DPEP3 항체 또는 마우스 이소타입 대조 항체를 실온에서 1시간 동안 50㎕ PBSA 중의 1㎍/mL로 첨가하였다. 물로 세척한 후, PBSA 중의 1:10,000로 희석된 50㎕/웰 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체를 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 40㎕/웰의 TMB 기질 용액(Thermo Scientific)을 첨가하여 발색시켰다. 동일 용적의 0.2M H2S04를 첨가하여 기질 발색을 중단시켰다. 그 후, 샘플을 OD 450에서 분광광도계로 분석하였다. 배경값보다 1.5배 큰 OD 450을 갖는 샘플은 교차-반응성인 것으로 고려되었다. 예시적인 DPEP3-특이적 항체에 대한 교차-반응성 결과는 도 4에서 볼 수 있다.
hDPEP3-His에 대한 항체의 친화도는 다음과 같이 ForteBio RED로 생성된 반응속도론 곡선으로부터 질적으로 측정하였다. 항-DPEP3 항체를 3분의 접촉 시간 및 1000rpm의 유속에서 항-마우스 Fc 포획 바이오센서에 고정시켰다. 기준선으로부터의 포획된 항체 로딩은 0.3 내지 1단위에서 일정하였다. 항체 포획 및 30초 기준선 후에, 바이오센서를 1000 rpm의 진탕 속도에서 4분의 연합 단계에 이어서 3분의 해리 단계 동안 200nM hDPEP3-His 용액에 침지시켰다. 상기 바이오센서를 각 사이클 후에 10mM 글리신(pH 1.7)에 침지시켜 재생시켰다. 특이적 항체 반응으로부터 대조 마우스 IgG 표면 반응을 공제하여 데이터를 처리하고, 데이터를 연합 및 해리 단계까지 잘랐다. 연합 및 해리 곡선을 사용하여 선택된 항체의 친화도를 질적으로 추정하였다. 도 4는 선정된 항체들의 친화도를 도시하며, 여기서 5 nM 미만의 hDPEP3-His에 대한 추정 겉보기 친화도(KD)는 "+++"로 나타내져 있으며, 5 내지 10nM의 추정 KD는 "++"로 나타내져 있고, 10nM 초과의 KD는 "+"로 나타내져 있다. "ND"란 명칭은 추정 KD가 측정되지 않았음을 의미한다.
수많은 항-DPEP3 항체의 친화도를 BIAcore 2000 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 확인하였다. 항-마우스 항체 포획 키트를 사용하여 마우스 항-DPEP3 항체를 CM5 바이오센서 칩상에 고정시켰다. 각각의 항원 주입 사이클 전에, 0.1 내지 2㎍/mL 농도에서의 마우스 항체를 2분의 접촉 시간 및 5㎕/분의 유속에서 표면상에 포획하였다. 항체 포획 및 기준선 후, 실시예 4에서 기재한 바와 같이 생성된 단량체 hDPEP3-His 항원을 5㎕/분의 유속에서 2 내지 4분의 연합 단계에 이어서 4 내지 15분의 해리 단계 동안 다양한 농도에서 표면 위를 유동시켰다. 특이적 항체 표면 반응으로부터 대조 비-결합 항체 표면 반응을 공제하여 데이터를 처리하고, 데이터를 연합 및 해리 단계까지 잘랐다. 생성된 반응 곡선을 사용하여, 1:1 랭뮤어 결합 모델을 핏팅(fit)시키고, BiaEvaluation 소프트웨어 3.1(GE Healthcare)를 사용하여 계산된 kon 및 k0ff 반응속도 상수(데이터는 제시되지 않음)를 사용하여 겉보기 친화도를 생성시켰다. 항-사람 항체 포획 키트를 사용하여, 유사 프로토콜을 사용하여 사람화 항체(hSC34.2, hSC34.11 , hSC34.14, hSC34.25, hSC34.28, hSC34.38, hSC34.87 - 실시예 8 참조)의 친화도를 측정함으로써 hDPEP3-His, rDPEP3-His, hDPEPI-His 및 hDPEP2-단백질들과의 교차 반응성을 확인하였다. 시험된 항체들 중 어느 것도 래트DPEP3-His 또는 hDPEP1-His와 교차 반응성인 것으로 밝혀지지 않았다. BIAcore 검정으로 시험된 것들 중에서 hSC34.14만이 hDPEP2-His와 교차-반응성인 것으로 밝혀졌다.
다양한 항-DPEP3 항체들에 대해 항체 비닝을 측정하였다. 동일하거나 상이한 에피토프 빈에 결합된 경쟁 항체를 동정하기 위해 ForteBio RED를 제조업자의 지침에 따라서 사용하였다. 기준 항-DPEP3 항체(Ab1)를 항-마우스 포획 칩상에 포획시킨 다음, 고 농도의 비-결합 항체를 사용하여 상기 칩을 차단시키고 기준선을 수집하였다. 그 후, (실시예 4로부터의) 단량체성 재조합 hDPEP3-His를 특이적 항체(Ab1)에 의해 포획하고, 팁을 대조군으로서 동일한 항체(Ab1)를 갖는 웰 또는 상이한 시험 항체(Ab2)를 갖는 웰에 침지시켰다. 새로운 항체를 사용시에 추가 결합이 관찰되었다면, Ab1 및 Ab2는 상이한 빈 내에 있는 것으로 측정되었다. 결합 수준을 대조 Ab1과 비교하여 측정하였을 때 추가 결합이 발생하지 않았다면, Ab2는 동일한 빈 내에 있는 것으로 결정되었다. 이러한 과정은 독특한 빈을 대표하는 96웰 플레이트 내의 전체 한 줄의 항체를 사용하여 독특한 항체들의 거대 라이브러리를 스크리닝하기 위해 확대시킬 수 있다. 도 4에 도시된 경쟁 검정의 결과는 스크리닝된 항체들이 hDPEP3 단백질상의 적어도 4개의 빈(A 내지 D)으로 그룹화될 수 있음을 입증하고, 여기서 각 그룹 또는 빈의 구성원은 hDPEP3 단백질에의 결합에 대해 서로 경쟁한다. "빈 U"로 지정된 제5 빈은 빈 A 내지 D 내의 항체들과 경쟁하지 않는 항체들을 함유하지만, 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있다.
실시예 7
항-DPEP3 항체의 서열 분석
항-DPEP3 항체를 상기한 바와 같이 생성시킨 다음, 서열 분석하였다. 선택된 하이브리도마 세포를 Trizol® 시약(Trizol® Plus RNA Purification System, Life Technologies)에 용해시켜 RNA를 제조하였다. 104 내지 105개 세포를 1mL Trizol에 재현탁시키고, 200㎕ 클로로포름을 첨가한 후 격렬하게 진탕시켰다. 그 후, 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 수성 상을 신선한 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)로 옮기고 동일 용적의 70% 에탄올을 첨가하였다. 샘플을 RNeasy Mini 스핀 컬럼에 부하하고 2 mL 수집 튜브에 위치시키고 제조업자의 지침에 따라서 처리하였다. 총 RNA를 용출에 의해 100㎕ RNase-비함유 물을 함유하는 스핀 컬럼 막으로 직접 추출하였다. RNA 제제의 품질을 사용할 때까지 -80℃에서 저장하기 전에 1% 아가로스 겔에서 3㎕를 분별하여 측정하였다.
경쟁 마우스 VH 레퍼토리를 표적화하도록 디자인된 32개 마우스 특이적 리더 서열 프라이머를 포함하는 5' 프라이머 믹스를 모든 마우스 Ig 이소타입에 대해 특이적인 3' 마우스 Cγ 프라이머와 함께 사용하여 각 하이브리도마의 Ig 중쇄의 가변영역을 증폭시켰다. 유사하게, 카파 경쇄를 증폭시키고 서열 분석하기 위해, VK 마우스 계열 각각을 증폭시키도록 디자인된 32개의 5' VK 리더 서열을 함유하는 프라이머 믹스를 마우스 카파 불변영역에 특이적인 단일 역 프라이머와 함께 사용하였다. VH 및 VL 전사체를 다음과 같이 Qiagen One Step RT-PCR RT-PCR 키트를 사용하여 100ng 총 RNA로부터 증폭시켰다. VK 경쇄에 대해 4회, Vγ 중쇄에 대해 4회로 하여 각 하이브리도마에 대해 총 8회의 RT-PCR 반응이 수행되었다. PCR 반응 혼합물은 3㎕의 RNA, 0.5㎕의 100μM 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머(IDT에 의해 맞춤식 합성됨), 5㎕의 5x RT-PCR 완충액, 1㎕ dNTP, 역전사 효소와 DNA 폴리머라제를 함유하는 효소 믹스 1㎕ 및 0.4㎕의 리보뉴클레아제 억제제 RNasin(1단위)를 포함하였다. 열순환기(thermal cycler) 프로그램은 RT 단계 50℃에서 30분, 95℃에서 15분에 이어서 (95℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 1분)의 30회 사이클이었다. 이어서, 72℃에서 10분 동안의 최종 항온배양이 있었다.
추출된 PCR 산물을 가변영역의 증폭에 대해 상기한 바와 동일한 특이적 가변영역 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 뉴클레오타이드 서열을 IMGT 서열 분석 도구(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)를 사용하여 분석하여, 가장 높은 서열 상동성을 갖는 생식선 V, D 및 J 유전자 구성원을 동정하였다. 도 5a는 42가지의 신규 마우스 항-DPEP3 항체의 VL 쇄의 인접한 아미노산 서열(서열번호 21 내지 185, 홀수)를 도시하고, 도 5b는 동일한 42가지의 신규 마우스 항-DPEP3 항체의 VH 쇄의 인접한 아미노산 서열(서열번호 23 내지 187, 홀수)를 도시한다. 도 5a 및 5b에서 지정된 CDR 및 골격 영역은 카뱃 등(상기)에 따라 분석하였고 Abysis 데이터베이스의 전매 버젼을 사용하여 결정하였다. 종합하면, 도 5a 및 5b는 SC34.2, SC34.4, SC34.5, SC34.6(SC34.21의 복사체), SC34.7, SC34.11 , SC34.13, SC34.14, SC34.16, SC34.18, SC34.19, SC34.20, SC34.23, SC34.24, SC34.25, SC34.26, SC34.27, SC34.28, SC34.33, SC34.36, SC34.38, SC34.39, SC34.40, SC34.41(SC34.61의 복사체), SC34.46, SC34.48, SC34.49, SC34.50, SC34.53, SC34.58, SC34.63, SC34.67, SC34.71, SC34.76, SC34.78, SC34.83, SC34.86, SC34.87, SC34.89, SC34.90, SC34.91 및 SC34.95로 명명된 42가지의 마우스 항-DPEP3 항체의 주석이 달린 가변영역 서열을 제공한다. 도 5c는 도 5a 및 5b의 각 아미노산 서열에 대한 상응하는 핵산 서열(서열번호 20 내지 186, 짝수)을 도시한다.
실시예 8
키메라 및 사람화 항-DPEP3 항체의 생성
키메라 항-DPEP3 항체(뮤린 VH 및 VL 및 사람 불변영역을 포함)는 다음과 같이 당업계에 인지된 기술들을 사용하여 생성하였다. 총 RNA를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 항-DPEP3 항체-생산 하이브리도마로부터 추출하고, RNA를 PCR 증폭시켰다. 마우스 항체의 VH 및 VL 쇄의 V, D 및 J 유전자 분절에 관한 데이터를 본 발명의 항-DPEP3 항체의 핵산 서열로부터 수득하였다(핵산 서열에 대해 도 5c 참조). 항체의 VH 및 VL 쇄의 골격 서열에 특이적인 프라이머 세트를 다음의 제한 부위를 사용하여 설계하였다: VH 단편에 대해 AgeI 및 XhoI, 및 VL 단편에 대해 XmaI 및 DraIII. PCR 산물을 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제한 다음, VH 단편에 대해 제한 효소 AgeI 및 XhoI 그리고 VL 단편에 대해 XmaI 및 DraIII로 분해시켰다. VH 및 VL 분해된 PCR 산물을 정제하고, 각각 IgH 또는 IgK 발현 벡터로 연결시켰다. 연결 반응은 200U T4-DNA 리가제(New England Biolabs), 7.5㎕의 분해되고 정제된 유전자-특이적 PCR 산물 및 25ng 선형화 벡터 DNA를 합하여 총 10㎕ 용적으로 하여 수행하였다. 적격 이. 콜라이 DH10B 세균(Life Technologies)을 42℃에서 열 쇼크를 통해 3㎕ 연결 산물로 형질전환시키고, 100㎍/mL의 농도로 암피실린 플레이트에 플레이팅하였다. 증폭된 연결 산물의 정제 및 분해 후, VH 단편을 HuIgG1(pEE6.4HuIgG1)을 포함하는 pEE6.4 발현 벡터(Lonza)의 AgeI-XhoI 제한 부위에 클로닝하고, VL 단편을 사람 카파 경쇄 불변영역(pEE12.4Hu-카파)을 포함하는 pEE12.4 발현 벡터(Lonza)의 XmaI-DraIII 제한 부위에 클로닝하였다.
선택된 키메라 항체를 HEK-293T 세포를 pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터로 공동-형질감염시킴으로써 발현시켰다. 형질감염 전에 HEK-293T 세포를 10% 열 불활성화된 FCS, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 100U/mL 페니실린 G로 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 표준 조건 하에 150mm 플레이트에서 배양하였다. 일시적인 형질감염을 위해, 세포를 80% 컨플루언시(confluency)로 성장시켰다. pEE6.4HuIgG1 및 pEE12.4Hu-카파 벡터 DNA 각각 12.5㎍을 1.5mL Opti-MEM 중의 50㎕ HEK-293T 형질감염 시약에 첨가하였다. 상기 믹스를 실온에서 30분 동안 항온배양하고 세포에 첨가하였다. 상청액을 형질감염 후 3일 내지 6일에 수거하였다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 배양 상청액을 800xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해물로부터 정화시키고 4℃에서 저장하였다. 재조합 키메라 항체를 단백질 A 비이드로 정제하였다.
마우스 항-DPEP3 항체(키메라 항체를 생성하기 위해 사용된 동일한 것)를 전매 컴퓨터-보조된 CDR-이식 방법(Abysis Database, UCL Business) 및 표준 분자 조작 기술을 사용하여 다음과 같이 사람화시켰다. 가변영역의 사람 골격 영역을 골격 서열과 사람 생식선 항체 서열의 CDR 정준 구조 간, 및 골격 서열과 관련 마우스 항체의 CDR 간의 가장 높은 상동성에 기초하여 설계하였다. 분석의 목적을 위해, 각각의 CDR 도메인에 대한 아미노산의 할당은 카뱃 등의 번호매김에 따라 이루어졌다. 일단 가변영역이 선택되면, 이들을 합성 유전자 분절(Integrated DNA Technologies)로부터 생성하였다. 사람화 항체를 키메라 항체에 대해 상기한 분자 방법을 사용하여 클로닝 및 발현시켰다.
사람화 항체 hSC34.2, hSC34.11, hSC34.14, hSC34.25, hSC34.28, hSC34.38 및 hSC34.87(도 5a 및 5b; 서열번호 189 내지 215, 홀수)의 VL 및 VH 아미노산 서열은 상응하는 마우스 항체의 VL 및 VH 서열로부터 유도되었다(예를 들면, hSC34.2는 SC34.2로부터 유도되었다). 사람화 항-DPEP3 항체의 VL 및 VH의 상응하는 핵산 서열은 도 5c에 제시되어 있다(서열번호 188 내지 214, 짝수). 도 5d는 예시적인 사람화 항-DPEP3 항체 hSC34.2, hSC34.11, hSC34.14, hSC34.25, hSC34.28, hSC34.38 및 hSC34.87의 경쇄 및 중쇄의 전체길이 아미노산 서열(서열번호 216 내지 230)을 도시하는 한편, 도 5e 내지 5k는 카뱃, 초티아, ABM 및 콘택트(Contact) 방법에 의해 측정된 바와 같은 뮤린 소스 항체(즉, SC34.2, SC34.11, SC34.14, SC34.25, SC34.28, SC34.38 및 SC34.87)의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 CDR을 도시한다.
선택된 항체의 선호되는 특성을 유지하기 위해, 각각 94번 93번 위치에서 hSC34.14 및 hSC34.38의 VH 내에서 단일 골격 변형만을 수행하였다(하기 표 8 참조).
Figure pct00019
실시예 9
종양에서의 DPEP3 단백질 발현
상승된 DPEP3 mRNA 전사체 수준이 실시예 1 및 2에 기재된 각종 종양과 연관되었다는 점을 고려하여, DPEP3 단백질 발현이 PDX 종양에서도 상승되었는지 여부를 시험하기 위해 작업을 수행하였다. DPEP3 단백질 발현을 검출하고 정량화하기 위해, 전기화학발광 DPEP3 샌드위치 ELISA 검정을 MSD 디스커버리 플랫폼(Discovery Platform)(Meso Scale Discovery)을 사용하여 전개하였다.
PDX 종양을 마우스로부터 절개하고 드라이 아이스/에탄올에서 급속 냉동시켰다. 단백질 추출 완충액(Protein Extraction Buffer)(Biochain Institute)을 해동된 종양 조각에 첨가하고, 종양을 TissueLyser 시스템(Qiagen)을 사용하여 분쇄하였다. 용해물을 원심분리(20,000g, 20분, 4℃)에 의해 정화하고, 각 용해물 중의 총 단백질 농도를 바이신코닌산(bicinchoninic acid)을 사용하여 정량화하였다. 그 후, 단백질 용해물을 5mg/mL에 대해 정규화하고 검정할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 정상 조직 용해물은 상업적 공급원으로부터 구입하였다.
히스티딘 태그를 갖는 정제된 재조합 DPEP3 단백질(실시예 4로부터)을 사용하여 생성된 표준 단백질 농도 곡선으로부터의 값을 보간하여 DPEP3 단백질 농도를 용해물 샘플로부터 측정하였다. DPEP3 단백질 표준 곡선 및 단백질 정량 검정은 다음과 같이 수행하였다:
MSD 표준 플레이트를 PBS 중의 1㎍/mL에서 15㎕의 SC34.14 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, 진탕시키면서 35㎕ MSD 3% 차단제 A 용액으로 1시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 다시 PBST로 세척하였다. 10% 단백질 추출 완충액을 함유하는 MSD 1% 차단제 A 중의 10× 희석된 용해물 10㎕(또는 연속적으로 희석된 재조합 DPEP3 표준)을 또한 웰에 첨가하고 진탕하면서 2시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 다시 PBST로 세척하였다. 그 후, SC34.96 항체를 설포-태그하고, 10㎕의 태그된 SC34.96을 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 세척된 플레이트에 MSD 1% 차단 A 중의 0.5㎍/mL로 첨가하였다. 플레이트를 PBST로 세척하였다. MSD 리드 완충액 T를 계면활성제를 사용하여 수중 1×로 희석하고, 35㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 통합 소프트웨어 분석 프로그램을 사용하여 MSD Sector Imager 2400에서 판독하여, 표준 곡선으로부터의 보간을 통해 PDX 샘플 중의 DPEP3 농도를 도출하였다. 그 후, 값을 총 단백질 농도로 나누어 총 용해물 단백질 mg당 DPEP3 ng를 산출하였다. 수득된 농도는 도 6에 제시되어 있으며, 여기서 각 점은 단일 PDX 종양 주로부터 유도된 DPEP3 단백질 농도를 나타낸다. 각 점은 단일 PDX 주로부터 유도되었으나, 대부분의 경우에 동일한 PDX 주로부터의 다수의 생물학적 샘플을 시험하였고 값들의 평균을 내어 데이터 포인트를 제공하였다.
도 6은 대표적 난소 종양 샘플이 높은 DPEP3 단백질 발현을 가짐을 도시한다. OV27MET는 높은 DPEP3 발현(35ng/ml)을 나타낸 반면에, OV87MET는 DPEP3 발현을 나타내지 않았다(0ng/ml). 또한, 유방 종양의 서브세트는 중간 정도의 DPEP3 발현을 나타냈다. 정상 조직 용해물("Norm")은 DPEP3 단백질 발현을 나타내지 않았다. 이들 데이터는, 이전의 실시예에서의 DPEP3 발현에 대한 mRNA 전사 데이터와 함께, DPEP3이 치료학적 개입의 흥미 있는 표적을 제공한다는 제안을 강화한다.
실시예 10
항-DPEP3 항체의 에피토프 맵핑
에피토프 맵핑은, 이전에 기술된 효모 디스플레이 방법의 변법을 사용하여, 선택된 항-DPEP3 항체에 대해 수행하였다(Chao et al., Nat Protoc. 1 (2): 755-768, 2007).
선택된 항-DPEP3 항체의 에피토프를 동정하는 추가적 스크리닝을 위한 세포외 도메인(ECD)상의 잔기의 서브세트를 동정하는데 2가지 방법을 사용하였다. 첫번째 방법은 SWISS-MODEL을 사용한 DPEP3의 상동성 모델링 및 DPEP3의 표면 노출된 잔기를 동정하기 위한 DPEP1의 구조(단백질 데이터 뱅크(PDB): 1 ITU)를 수반하였다. 이러한 결과들에 기초하여, DPEP3상의 알라닌에 대한 개별적 돌연변이를 Quikchange 부위 특이적 돌연변이유발 키트(Agilent)를 사용하여 작제하고 효모 디스플레이 포맷으로 발현시켰다. 생성된 라이브러리를 하기 제시된 바와 같이 스크리닝하였다.
두번째 방법은 선택된 항-DPEP3 항체에의 결합의 상실에 대해 스크리닝된 DPEP3의 돌연변이체 라이브러리를 생성하는 것을 수반하였다. 간략하게 언급하면, DPEP3 돌연변이체의 라이브러리는, 클론당 1개의 아미노산 돌연변이의 표적 돌연변이유발률을 위해 뉴클레오타이드 유사 8-옥소-2'데옥시구아노신 5'-트리포스페이트 및 2'-데옥시-p-뉴클레오사이드-5'트리포스페이트(TriLink Bio)를 사용하여 오류-유발성(error prone) PCR로 생성시켰다. DPEP3 돌연변이체를 효모 디스플레이 포맷으로 형질전환시켰다. 라이브러리를 1:250 희석률의 닭 항 c-myc(Life Technologies) 및 10 또는 20nM 뮤린 또는 사람화 항 DPEP3 항체에 이어서 알렉사(Alexa) 488-접합된 염소 항-닭 항체 및 알렉사 647-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 또는 염소 항-사람 IgG 항체로 염색하였다. 야생형 DPEP3 ECD와 비교해 결합 상실을 나타낸 클론을 FACS Aria(BD Biosciences)를 사용하여 FACS에 의해 선택하였다. 선택된 클론을 재증식시키고 표적 항체에의 결합의 상실에 대해 FACS에 의해 재스크리닝하였다. Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep 키트(Zymo Research)를 사용하여 개개의 ECD 클론을 단리시키고 서열 분석하였다. 필요한 경우, 돌연변이를 Quikchange 부위 특이적 돌연변이유발 키트(Agilent)를 사용하여 단일-돌연변이체 ECD 클론으로서 또는 알라닌에 대한 점 돌연변이로서 재구성하였다.
그 후, 두 방법 모두에 의해 동정된 개개의 ECD 돌연변이체 클론을 유세포분석법에 의해 스크리닝하여, 입체구조적으로 특이적인 항체의 패널에 걸쳐서 야생형 ECD에 상대적인 결합 상실이 있었는지 여부를 결정하였다. 시스테인, 프롤린 또는 종결 코돈을 수반한 효모 라이브러리 방법으로부터의 돌연변이는 돌연변이가 미스폴딩을 야기할 가능성이 높기 때문에 자동적으로 폐기되었다. 관심대상의 항-DPEP3 항체를 100 pM 내지 33 nM 범위에서 염색시켰다는 점을 제외하고, 개개의 ECD 돌연변이체 클론 및 야생형 ECD를 상기한 바와 같은 항체로 염색하였다. 패널 전체에 걸쳐서 비교하였을 때, 관심대상의 항체 및 비-경쟁 항체 둘 다에의 결합의 상실을 초래한 임의의 점 돌연변이라는 DPEP3의 미스폴딩을 유발한다고 결론을 내렸다. 단지 관심대상의 항체에 의한 결합의 상실을 초래하지만 패널 내의 기타 항체들에 의한 결합의 상실은 초래하지 않는 임의의 점 돌연변이는 ECD의 폴딩에 영향을 주지않는다고 결론을 내렸다. 이러한 잔기들은 관심대상의 항체의 에피토프의 부분인 것으로 결론을 내렸다.
3가지 예시적인 항체에 대한 맵핑의 결과는 하기 표 9에 제시되어 있으며, 여기서 특이적 돌연변이들은 돌연변이된 DPEP3 상동체에 결합하는 대상 항체의 능력과 함께 표시되어 있다. 표 9에서, 에피토프 구성성분으로서 연루된 이러한 잔기들은 대상 돌연변이된 잔기 앞에 #로 표시되어 있다. DPEP3 미스폴딩을 초래한 것으로 확인된 돌연변이는 *로 표시되어 있고 에피토프 구성성분을 결정할 때 고려되지 않았다.
Figure pct00020
Figure pct00021
# - 에피토프 구성성분으로서 연루됨
* - 명백한 미스폴딩 돌연변이
돌연변이 상동체로부터 도출된 데이터에 기초하여, 각각의 시험된 항체들에 대한 잠재적인 에피토프 구성성분을 바로 하기 표 10에 제시한다.
Figure pct00022
실시예 11
유세포분석법에 의한 종양 집단에서의 DPEP3 표면 발현의 검출
hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포주의 표면상에서 및 다양한 PDX 종양 세포주의 표면상에서 hDPEP3 단백질의 존재를 특이적으로 검출하는 본 발명의 항-DPEP3 항체의 능력을 평가하기 위해 유세포분석법을 사용하였다.
hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 모 세포 또는 HEK-293T 세포를 수거하고 Versene(Life Technologies)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 단리시켰다. 단리된 세포를 항-DPEP3 항체와 함께 30분 동안 항온배양하고 PBS/2% FCS로 2회 세척하였다. 세포를 샘플당 50㎕의, PBS/2%FCS에 1:200 희석된 Fc 단편 특이적 2차 항체인 AlexaFluor-647 표지된 염소-항-마우스 IgG와 함께 15분 동안 항온배양하고, PBS/2% FCS로 2회 세척하고, DAPI(생존 세포를 검출하기 위해)를 사용하여 PBS/2% FCS에 재현탁시켰다. 세포를 항-DPEP3 항체와 함께 BD FACS Canto II 유세포분석기상에서 분석하였다. 도 7a는 본 발명의 다수의 예시적인 항-DPEP3 항체들이 hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포에 특이적으로 결합할 수 있었지만 모 HEK-293T 대조 세포에는 결합하지 않았음을 보여준다.
난소 종양 종양 개시 세포(TIC)를 포함하는 난소 PDX 종양 세포주에 결합하는 본 발명의 항체의 능력도 또한 유세포분석법을 사용하여 평가하였다. 난소 PDX 종양을 수거하고 당업계에 인지된 효소 조직 분해 기술을 사용하여 해리시켜 PDX 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하였다(예를 들면, U.S.P.N. 2007/0292414 참조). PDX 종양 단일 세포 현탁액을 죽은 세포를 제외시키기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)과, 마우스 세포를 동정하기 위해 항-마우스 CD45 및 H-2Kd 항체와 그리고 사람 세포를 동정하기 위해 항-사람 EPCAM 항체와 함께 항온배양하였다. 또한, TIC를 단리하기 위해 종양 세포를 항-사람 CD46 및/또는 CD324와 ESA와 함께 항온배양하였다(U.S.P.N. 2013/0260385, 2013/0061340 및 2013/0061342, 및 상기 실시예 1 참조). CD45 및 H-2Kd에 대해 양성으로 염색된 마우스 세포는 본 분석으로부터 제외시켰다. 그 후, 종양 세포를 BD FACS Canto II 유세포분석기와 항-DPEP3 항체를 사용하여 유세포분석법에 의해 분석하였다.
도 7b 내지 7d는, 항-hDPEP3 항체 SC34.53이, 일부 OV-S PDX 주(예: OV27MET, OV44)의 살아있는 사람 TIC 아집단(검은색 실선)에서 DPEP3 단백질의 발현을 검출하였고 다른 OV-S PDX 주(예: OV72MET 및 OV87MET)에서는 보다 적은 정도로 검출하였음을 보여주는 반면(도 7b), NTG 세포(CD324를 발현하지 않음, 또는 ESA)(파선)는 항-DPEP3 항체로 현저하게 적게 염색되었음을 나타냈다. 항-hDPEP3 항체 SC34.53은 또한 NTG 세포와 비교해 OV-PS(예: OV63MET, OV91MET, OV1 19MET)(도 7c) 및 OV-MMMT(예: OV124)(도 7d)에서의 살아있는 사람 TIC 아집단에서 DPEP3 단백질의 발현을 검출하였다. 염색 특이성(회색으로 채워짐)을 확인하기 위해 이소타입 대조 항체를 사용하였다. TIC 및 NTG 세포의 표면상에서 관찰된 항-DPEP3 항체의 차등적 염색을 요약한 표는 도 7b 내지 7d에 삽입물로서 도시되어 있고, 여기서 발현은 각각의 종양 세포 아집단에 대해 표시된 항-DPEP3 항체와 이소타입 대조군 간의 기하평균 형광 강도의 변화(ΔMFI)로서 열거되어 있다.
실시예 12
면역조직화학 및 제자리 하이브리드화를 사용한 종양의 표면상에서의 DPEP3 검출
종양 세포에서의 DPEP3의 발현 및 위치를 평가하기 위해 면역조직화학(IHC)을 PDX 종양 조직 절편상에서 수행하였다.
IHC-적격 항-DPEP3 항체를 동정하기 위해, IHC를 본 발명의 항-DPEP3 항체를 사용하여 HEK-293T 모 세포 펠렛 또는 DPEP3-발현 HEK-293T 세포 펠렛상에서 수행하였다. IHC는 당업계에서 표준인 바와 같이 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) HEK-293T 세포 펠렛상에서 하기 기술하는 바와 같이 수행하였다. 세포 펠렛 블록의 평평한 단면을 절단하고 유리 현미경 슬라이드상에 봉입(mount)하였다.크실렌 탈파라핀화 후, 5㎛ 절편을 99℃에서 20분 동안 항원 회수 용액(Antigen Retrieval Solution)(Dako)으로 전처리하고 75℃로 냉각시킨 다음, PBS 중의 0.3% 과산화수소에 이어서 아비딘/바이오틴 차단 용액(Avidin/Biotin Blocking Solution)(Vector Laboratories)으로 처리하였다. 그 후, FFPE 슬라이드를 PBS 완충액 중의 3% BSA 중의 10% 말 혈청으로 차단하고, 실온에서 30분 동안 3% BSA/PBS 중의 10㎍/ml로 희석된 본 발명의 1차 항-DPEP3 항체와 함께 항온배양하였다. FFPE 슬라이드를 실온에서 30분 동안 3% BSA/PBS 중에 2.5㎍/ml로 희석된 바이오틴-접합된 말 항-마우스 항체(Vector Laboratories)와 함께 배양한 다음, 스트렙타비딘-HRP(ABC Elite Kit; Vector Laboratories)에서 배양하였다. 실온에서 5분 동안 3,3'-디아미노벤지딘(Thermo Scientific)을 사용하여 전개시키고, 조직을 메이어스 헤마톡실린(IHC World)으로 대조염색하고 알코올로 세척하고 크실렌 중에 침지시켰다. 항-DPEP3 항체 SC34.58은 시험된 본 발명의 다른 항-DPEP3 항체들보다 더 효과적으로 DPEP3-과발현 HEK-293T 세포 펠렛을 특이적으로 검출할 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). DPEP3을 특이적으로 검출하는 SC34.58 항체의 능력은 경쟁 실험으로 확인하였으며, 이때 SC34.58 항체를 5× 몰비 과량의 hDPEP3-His 단백질과 혼합한 다음, DPEP3-과발현 HEK-293T FFPE 절편과 함께 항온배양하였다. 양성 염색의 부재는 hDPEP3-His 단백질이 DPEP3-과발현 HEK-293T 세포에의 항-DPEP3 SC34.58 항체의 결합을 방해하였음을 입증하였다.
도 8a는 조직 마이크로어레이(TMA)(오클라호마 대학교) 상에서 분석된 125개의 1차 환자 난소 종양 샘플에서의 hDPEP3의 발현을 도시한다. 발현은 IHC를 사용하여 항-DPEP3 SC34.58 항체로 검출하였다. 막 발현은 자동화 영상 분석 소프트웨어 패키지(Leica Biosystems)로 분석하였는데, 이는 세포 표면 염색의 강도를 정량화하고 각 강도 수준에서 염색된 종양 세포의 비율을 반영하는 최종 "H-스코어"(염색되지 않은 경우 0 및 강한 염색의 경우 3)를 제공한다. H-스코어는 다음과 같이 계산된다: (0에서 %) * 0 + (1+에서 %) * 1 + (2+에서 %) * 2 + (3+에서 %) * 3. 따라서, H-스코어는 0 내지 300에 이르는 연속 변량을 생성한다. 도 8a는 TMA상의 17%의 종양이 hDPEP3을 발현하였음을 도시한다. DPEP3 발현은 가장 높은 DPEP3 발현을 갖는 OV27MET(H-스코어=113) 및 가장 낮은 DPEP3 발현을 갖는 OV87MET(H-스코어=3)를 포함하는 수많은 PDX 종양에 대해서도 측정되었다.
DPEP3 mRNA에 대한 RNA 제자리 하이브리드화를 RNAscope® 2.0 시약 키트(Advanced Cell Diagnostics; Wang 등, 2012, PMID: 22166544)를 사용하여 실시하였다. DPEP3용으로 사용된 RNAscope 프로브는 뉴클레오타이드 187번 내지 1696번에서 디자인하였다. 각 샘플을 모든 세포의 소포체 내에 위치하는 사이클로스포린-결합 단백질인 펩티딜프로필 이소머라제 B(PPIB)에 특이적인 RNAscope 프로브를 이용하여 RNA 완전성(integrity)에 대해 품질 제어하였다. 배경 염색을 디아미노피멜레이트(dapB) RNA에 특이적인 프로브를 사용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 125개의 1차 환자 난소 종양 샘플(오클라호마 대학교)을 포함하는 TMA를 표적 올리고 프로브와 하이브리드화하기 전에 열 및 프로테아제로 전처리하였다. 그 후, 전치증폭기, 증폭기 및 HRP-표지된 올리고를 순차적으로 하이브리드화한 다음, 3,3'-디아미노벤지딘으로 발색성 침전물을 전개시켰다. 특이적 RNA 염색 시그널이 갈색의 반점으로서 동정되었다. TMA를 길스(Gill's) 헤마톡실린으로 대조염색하였다. HALOTM 영상 분석 소프트웨어(Indica Labs)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 구체적으로, 개개의 제자리 하이브리드화 점을 각 조직 마이크로어레이 중심의 종양 영역에서 계수하고, "세포당 평균 점" 스코어를 생성시켰다. 0.20 미만의 "세포당 평균 도트 스코어"를 갖는 모든 중심은 음성인 것으로 고려되었다. 도 8b는 시험된 TMA상에 나타난 40%의 종양이 hDPEP3을 발현하였음을 보여준다. 수평선은 시험된 모든 중심에 대한 평균 스코어를 나타내며, 이는 0.4였다. 도 8b의 제자리 하이브리드화 결과는 DPEP3 단백질의 발현을 검출하는 도 8a에 도시된 IHC 결과와 비교해 전체적으로 더 큰 비율의, DPEP3 유전자를 발현하는 종양을 나타낸다. 이것은 IHC 검정보다 증가된 제자리 하이브리드화 검정의 감도 때문이다.
데이터는 시험된 난소 종양의 상당 부분이 DPEP3을 발현하고 항-DPEP3 항체가 난소암에서 진단적 유용성이 있음을 입증한다.
실시예 13
항-DPEP3 항체는 시험관내 세포독성제 전달을 촉진한다
살아있는 종양 세포로의 세포독성제의 전달을 매개하기 위해 본 발명의 항-DPEP3 항체가 내재화할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 선택된 항-DPEP3 항체 및 2차 항-마우스 항체 FAB 단편에 연결된 사포린을 사용하여 시험관내 세포 사멸 검정을 수행하였다. 사포린은 리보솜을 불활성화시켜 단백질 합성을 저해하고 세포의 사멸을 초래하는 식물 독소이다. 사포린은 세포 내부에서 단지 세포독성이며, 여기서 사포린은 리보솜에 접근하지만 스스로 내재화할 수는 없다. 따라서, 이들 검정에서 사포린-매개 세포 세포독성은 마우스 항-DPEP3 항체의 결합과 내재화시에만 표적 세포내로 내재화하는 항-마우스 FAB-사포린 접합체의 능력의 지표가 된다.
hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포의 단일 세포 현탁액을 웰당 500개 세포로 BD 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 1일 후, 다양한 농도의 정제된 항-DPEP3 항체를 고정 농도의 2nM 항-마우스 IgG FAB-사포린 접합체(Advanced Targeting Systems)와 함께 배양물에 첨가하였다. DPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포를 72시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 생존가능한 세포를 제조업자의 지침에 따라서 CellTiter-Glo®(Promega)를 사용하여 계수하였다. 미처리 발광 계수(raw luminescence count)는, 오직 2차 FAB-사포린 접합체와 함께 항온배양된 세포를 함유하는 배양물을 사용하여 100% 기준 값으로서 설정하였고, 모든 다른 계수들은 기준 값의 백분율로서 계산되었다. 20 pM 농도에서의 항-DPEP3 항체의 대규모 서브세트는 hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포를 다양한 효능으로 효과적으로 사멸시킨 반면(도 9), 동일한 농도에서의 마우스 IgG1 이소타입 대조 항체(mlgG1)는 그렇지 않았다.
상기 결과들은 내재화를 매개하는 항-DPEP3 항체의 능력 및 세포독성 페이로드를 전달하는 항-DPEP3 항체의 능력을 입증하며, 이는 항-DPEP3 항체가 항체 약물 접합체에 대한 표적화 모이어티로서 치료학적 유용성을 가질 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 14
항-DPEP3 항체-약물 접합체의 제조
상기한 바와 같은 Ab-[L-D] 구조를 갖는 항-DPEP3 항체 약물 접합체(ADC)를 제조하였다. 각 ADC는 유리 설피드릴 그룹을 갖는 말단 말레이미도 모이어티 및 및 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하는 링커-약물에 공유 연결된 항-DPEP3 항체를 포함하였다. 모든 경우, 그 구조가 상기 제공되어 있는 PBD1이 사용되었다.
항-DPEP3 ADC를 다음과 같이 당업계에 인지된 기술을 사용하여 합성하고 정제하였다. 선택된 항-DPEP3 뮤린 항체(SC34.25, SC34.83, SC34.97 및 SC34.95) 및 사람화 항체(hSC34.2, hSC34.11, hSC34.14, hSC34.25, hSC34.28 및 hSC34.38)의 시스테인 결합을, 5mM EDTA를 함유한 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 20℃에서 90분 동안 항체 mol당 미리 결정된 몰의 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(TCEP)을 첨가하여 부분적으로 환원시켰다. 디메틸 아세트아미드(DMA)에 용해된 말레이미도 링커 페이로드를 3mol/mol 항-DPEP3 항체의 비로 첨가하였다. 상기 반응을 30분 동안 진행되도록 하였다. 그 후, 수중에서 제조된 10mM 스톡 용액을 사용하여, 링커-약물과 비교해 과량의 N-아세틸 시스테인(NAC)을 첨가하여 반응을 켄칭(quench)시켰다. 20분의 최소 켄칭 시간 후, 0.5M 아세트산을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정하고, 완충액을 30kDa 막을 사용하여 정용여과(diafiltration)에 의해 정용여과 완충액으로 교체한다. 그 후, 정용여과된 항-DPEP3 ADC를 수크로스 및 폴리소르베이트-20을 사용하여 표적 최적 농도로 제형화하였다. 최종 ADC "HIC 정제된 DAR=2" 제제를 RP-HPLC를 사용하여 분석하여, HC 및 LC상의 접합 비율(%) 및 DAR 분포를 측정하였다. 샘플을 또한 분석용 HIC를 사용하여 분석하여, 원치않는 DAR>2 및 DAR<2 종에 상대적인 DAR=2 종의 양을 측정하였다(실시예 16).
생성된 항-DPEP3 ADC를 SC34.25-PBD1, SC34.83-PBD1, SC34.97-PBD1, SC34.95-PBD1, hSC34.2-PBD1, hSC34.11-PBD1, hSC34.14-PBD1, hSC34.25-PBD1, hSC34.28-PBD1 및 hSC34.38-PBD1이라 명명하였다.
실시예 15
부위-특이적 항-DPEP3 항체의 생성
고유 경쇄(LC) 불변영역 및 중쇄(HC) 불변영역을 포함하는 조작된 사람 IgG1/카파 항-DPEP3 부위-특이적 항체를 작제하였으며, 여기서, LC에서 시스테인 214(C214)와 쇄간 디설파이드 결합을 형성하는 HC의 상부 힌지 영역 내의 시스테인 220(C220)은 세린(C220S)으로 치환되었다. 조립될 경우, HC와 LC는 치료제에의 접합에 적합한 2개의 유리 시스테인을 포함하는 항체를 형성한다. 달리 주지되지 않는 한, 불변영역 잔기의 모든 번호매김은 카뱃 등에 제시된 바와 같은 EU 번호매김 방식에 따른다.
조작된 항체는 다음과 같이 생성하였다. 사람화 항-DPEP3 항체 hSC34.28 HC(서열번호 207)를 암호화하는 발현 벡터를 PCR 증폭 및 부위 특이적 돌연변이유발을 위한 주형으로서 사용하였다. 부위 특이적 돌연변이유발은 제조업자의 지침에 따라서 Quick-change® 시스템(Agilent Technologies)을 사용하여 수행하였다.
hSC34.28의 돌연변이체 C220S HC를 암호화하는 벡터를 CHO-S 세포에서 hSC34.28의 고유 IgG1 카파 LC(서열번호 205)로 공동형질감염시키고 포유동물 일시 발현 시스템을 사용하여 발현시켰다. C220S 돌연변이체를 함유하는 조작된 항-DPEP3 부위-특이적 항체는 hSC34.28ss1이라 명명하였다. hSC34.28ss1 부위 특이적 항체의 전체길이 LC 및 HC의 아미노산 서열은 도 5d에 도시되어 있다(서열번호 224 및 226). LC 내의 반응성 시스테인은 HC 내의 220번 위치의 돌연변이된 잔기인 것과 마찬가지로 밑줄이 처져 있다. 조작된 항-DPEP3 항체를 SDS-PAGE에 의해 특징 규명하여 정확한 돌연변이체가 생성되었는지를 확인하였다. SDS-PAGE는 DTT(디티오트레이톨)과 같은 환원제의 존재 및 부재하에서 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터의 사전-주조 10% 트리스-글리신 미니 겔 상에서 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 콜로이드성 쿠마시 용액으로 염색하였다. 환원 조건하에서, 유리 LC 및 유리 HC에 상응하는 2개의 밴드가 관찰되었다. 이러한 패턴은 환원 조건에서 IgG 분자에 전형적이다. 비환원 조건하에서, 밴드 패턴은 고유 IgG 분자와는 상이하였으며, 이것은 HC와 LC 사이의 디설파이드 결합의 부재를 나타낸다. HC-HC 이량체에 상응하는 대략 98kD의 밴드가 관찰되었다. 또한, 유리 LC에 상응하는 희미한 밴드 및 LC-LC 이량체에 상응하는 대략 48kD의 뚜렷한 밴드가 관찰되었다. 각 LC의 C-말단 상의 유리 시스테인으로 인해 약간의 LC-LC 종의 형성이 예상된다.
실시예 16
선택적 환원 과정을 사용한 부위 특이적 항-DPEP3 항체의 접합
상기 실시예 15에 제시된 바와 같이 생성된 부위 특이적 항체 hSC34.28ss1을 유리 설피드릴 그룹을 갖는 말단 말레이미도 모이어티를 통해서 PBD1에 접합시켰다. 목적하는 생성물은, 각각의 LC 불변영역 상의 비-쌍형성 시스테인(C214)상에 최대로 접합되고 2의 DAR(DAR=2)을 갖는 ADC를 최대화하면서 2 초과(DAR>2)의 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는 ADC를 최소화시킨 ADC이다.
최종 부위-특이적 ADC의 접합의 특이성 및 균일성을 더욱 개선시키기 위해, hSC34.28ss 항체를 링커-약물과의 접합 전에 안정화제(예를 들면, L-아르기닌) 및 약한 환원제(예를 들면, 글루타티온)를 포함하는 공정에 이어서 상이한 DAR 종을 분리하는데 사용된 분취용 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 선택적으로 환원시켰다. 상기 과정은 하기에 기재된 바와 같이 수행된다.
hSC34.28ss의 제제를 1M L-아르기닌/5mM 글루타티온, 환원된 (GSH)/5mM EDTA, pH 8.0을 함유하는 완충액에서 실온에서 최소 1시간 동안 부분적으로 환원시켰다. 그 후, 모든 제제는 30kDa 막(Millipore Amicon Ultra)을 사용하여 20mM Tris/3.2mM EDTA, pH 8.2 완충액으로 완충액을 교체하여 환원 완충액을 제거하였다. 그 후, 생성된 부분적으로 환원된 제제를 말레이미드 링커를 통해 실온에서 최소 30분 동안 PBD1에 접합시켰다. 그 후, 수중에서 제조된 10mM 스톡 용액을 사용하여, 링커-약물과 비교해 과량의 NAC를 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 20분의 최소 켄칭 시간 후, 0.5M 아세트산을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정하였다. hSC34.28ss1-PBD1의 접합된 제제를 30kDa 막을 사용하여 정용여과 완충액으로 완충액을 교체하고, 전도율을 증가시키는 고 염 완충액으로 희석시켜 수지에 대한 결합을 개선시킨 다음, 부틸 HP 수지 크로마토그래피 컬럼(GE Life Sciences) 상에 부하하였다. 그 후, 감소하는 염 구배를 사용하여, 소수성에 기초하여 상이한 DAR 종을 분리하였으며, 여기서, DAR=0 종이 먼저 용출된 다음, DAR=1, DAR=2에 이어 더 높은 DAR 종이 용출되었다.
최종 항체-약물 "HIC 정제된 DAR=2" 제제를 RP-HPLC를 사용하여 HC 및 LC에 대한 접합 퍼센트 및 DAR 분포를 결정하기 위해 분석하였다. 결과는 약물의 93%가 LC에 접합되었으며 약물의 5%가 HC에 접합되었음을 보여주었다(도 10a). 샘플을 또한 분석용 HIC를 사용하여 원치않는 DAR>2 및 DAR<2 종에 상대적인 DAR=2 종의 양을 측정하였다. 결과는 샘플의 96%가 DAR=2 종이었음을 보여주었다(도 10b). 조작된 작제물 및 HIC 정제 과정과 병용된 선택적 접합 방법은 95% 초과의 DAR=2 수준 뿐만 아니라 90% 초과의 경쇄 접합 수준을 초래하였으며, 이것은 경쇄 불변영역의 C-말단상의 목적하는 유리 시스테인 잔기로 실질적으로 제한된 접합을 갖는 최종 샘플에서의 고도의 균질성을 나타낸다.
실시예 17
항-DPEP3 ADC는 시험관내 세포독성제 전달을 촉진한다
살아있는 간 종양 세포로의 세포독성제의 전달을 매개하기 위해 본 발명의 항-DPEP3 ADC가 내재화할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 시험관내 세포 사멸 검정을 항-DPEP3 ADC, hSC34.28-PBD1을 사용하여 수행하였다.
hDPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포 또는 천연(naive) HEK293T 세포의 단일 세포 현탁액을 웰당 500개 세포로 BD 조직 배양 플레이트(BD Biosciences)에 플레이팅하였다. 1일 후, 다양한 농도의 정제된 hSC34.28-PBD1를 배양물에 첨가하였다. 세포를 96시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 생존가능한 세포를 제조업자의 지침에 따라서 CellTiter-Glo®(Promega)를 사용하여 계수하였다. 미처리된 세포를 함유하는 배양물을 사용하여 미처리 발광 계수를 100% 기준 값으로서 설정하였고, 모든 다른 계수들은 기준 값의 백분율로서 계산하였다. 도 11은 DPEP3을 과발현하는 HEK-293T 세포주가 비자극 HEK-293T 세포와 비교해 hSC34.28-PBD1 ADC에 훨씬 더 민감성이었음을 보여준다.
상기 결과는 내재화 및 DPEP3을 발현하는 세포로의 세포독성 페이로드의 전달을 특이적으로 매개하는 항-DPEP3 ADC의 능력을 입증한다.
실시예 18
사람화 항-DPEP3 항체 약물 접합체는 생체내 종양 성장을 억제한다
상기 실시예 14에 기재된 바와 같이 생성된 항-DPEP3 ADC를, 면역결핍 마우스에서 난소 종양 성장을 억제하는 능력을 입증하기 위해 시험하였다.
DPEP3을 발현하는 OV-S PDX 종양 주(OV27MET) 및 낮은 수준의 DPEP3 발현을 나타내는 OV-S 종양 주(OV87MET)를 당업계에 인지된 기술들을 사용하여 암컷 NOD/SCID 마우스의 옆구리에서 피하 성장시켰다. 종양 체적 및 마우스 체중을 주 1회 또는 2회 모니터링하였다. 종양 체적이 150 내지 250mm3에 도달한 경우, 마우스를 치료군으로 무작위 할당하고, 2회 용량의 5mg/kg 시스플라틴(치료 표준), 단일 용량의 1 또는 2mg/kg hSC34.28-PBD1, 단일 용량의 2mg/kg 항-합텐 대조 사람 IgG-PBD1 또는 비히클 대조군(0.9% 염수 또는 5% 글루코스)을 복강내 주사하였다. 처리 후, 종양 체적 및 마우스 체중을 종양이 800mm3을 초과하거나 마우스가 병약해지기 시작할 때까지 모니터링하였다. hSC34.28-PBD1로 처리된 마우스는 면역결핍 종양-보유 NOD/SCID 마우스에서 전형적으로 보여지는 것을 능가하는 어떠한 유해한 건강 효과도 나타내지 않았다. 도 12는 DPEP3을 발현한 난소 PDX 종양(OV27MET)에서 항-DPEP3 ADC, hSC34.28-PBD1의 투여가 100일이 넘도록 지속되는 종양 억제를 초래한 반면, 치료 표준인 시스플라틴 및 대조 항체 IgG-PBD1의 투여는 어떠한 종양 체적 감소도 초래하지 않았음을 보여준다. 반대로, 항-DPEP3 ADC는 IHC(실시예 12), 화학발광 검정(실시예 9) 및 유세포분석법(실시예 11)에 의해 측정된 DPEP3의 발현 수준이 훨씬 낮은 난소 PDX 세포주인 OV87MET 종양에서 시스플라틴 또는 다른 대조군과 비교해 효과가 없었다.
연장된 기간 동안 생체내에서 DPEP3-발현 난소 종양 세포를 특이적으로 사멸시키고 종양 성장을 급격하게 억제하는 hSC34.28-PBD1의 능력은, 난소암 및 특히 난소암의 OV-S 아형의 치료학적 처치에 있어서의 항-DPEP3 ADC의 용도를 입증한다.
실시예 19
항-DPEP3 항체-약물 접합체에 의한 종양 개시 세포 빈도의 감소
실시예 11에서 입증되는 바와 같이, DPEP3 발현은 종양형성성 세포와 연관된다. 따라서, 항-DPEP3 ADC를 이용한 치료가, 약물 내성이며 종양 재발 및 전이를 조장하는 것으로 알려진 TIC의 빈도를 감소시킨다는 것을 입증하기 위해, 생체내 한계희석 검정(LDA)을, 예를 들면, 본질적으로 하기에 기재된 바와 같이 수행한다.
PDX 종양(예를 들면, 흑색종 또는 난소)을 면역결핍 마우스에서 피하에 성장시킨다. 종양 체적이 평균 150mm3 내지 250mm3 크기가 될 경우, 마우스를 두 그룹으로 무작위로 분리한다. 한 그룹에게는 음성 대조군으로서 약물에 접합된 사람 IgG1을 복강내 주사하고; 다른 그룹에게는 항-DPEP3 ADC(예를 들면, 실시예 14 및 16에서 제조된 바와 같음)를 복강내 주사한다. 투여한지 1주일 후, 각 그룹으로부터의 두 마리의 대표적인 마우스를 안락사시키고, 이들의 종양을 수거하고 단일-세포 현탁액으로 분산시킨다. 그 후, 각 처리군으로부터의 종양 세포를 실시예 1에 이미 기재된 바와 같이 수거하고, 풀링하고, 분해시킨다. 세포를 FITC 접합된 항-마우스 H2kD 및 항-마우스 CD45 항체로 표지하여 마우스 세포를 검출하고; EpCAM으로 표지하여 사람 세포를 검출하고; DAPI로 표지하여 사멸된 세포를 검출한다. 그 후, 생성된 현탁액을 BD FACS Canto II 유세포분석기를 사용하여 FACS에 의해 선별하고, 살아있는 사람 종양 세포를 단리하고 수집한다.
마우스의 4개의 코호트에 항-DPEP3 ADC로 처리된 종양으로부터의 1250, 375, 115 또는 35개의 선별된 살아있는 사람 세포를 주사한다. 음성 대조군으로서 마우스의 4개의 코호트에 대조군 IgG1 ADC로 처리된 종양으로부터의 1000, 300, 100 또는 30개의 선별된 살아있는 사람 세포를 이식한다. 수용자 마우스에서의 종양을 매주 측정하고, 개개의 마우스를 종양이 1500mm3에 도달하기 전에 안락사시킨다. 수용자 마우스를 양성 또는 음성 종양 성장을 갖는 것으로서 스코어를 매긴다. 양성 종양 성장은 100mm3을 초과하는 종양의 성장으로서 정의된다. 푸아송 분포 통계(L-Calc 소프트웨어, Stemcell Technologies)를 사용하여 각 집단에서 TIC의 빈도를 계산한다.
SEQUENCE LISTING <110> STEMCENTRX, INC. <120> NOVEL ANTI-DPEP3 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> sc3401.pct // S69697 1050WO <150> US 61/915,321 <151> 2013-12-12 <160> 273 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Kappa light chain (LC) constant region protein <400> 1 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> IgGI heavy chain (HC) constant region protein <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 3 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human DPEP3 isoform a mature protein (UniProtKB /Swiss-Prot. Q9H4B8.2; residues 36-488) <400> 3 Ala Glu Thr Thr Pro Gly Ala Pro Arg Ala Leu Ser Thr Leu Gly Ser 1 5 10 15 Pro Ser Leu Phe Thr Thr Pro Gly Val Pro Ser Ala Leu Thr Thr Pro 20 25 30 Gly Leu Thr Thr Pro Gly Thr Pro Lys Thr Leu Asp Leu Arg Gly Arg 35 40 45 Ala Gln Ala Leu Met Arg Ser Phe Pro Leu Val Asp Gly His Asn Asp 50 55 60 Leu Pro Gln Val Leu Arg Gln Arg Tyr Lys Asn Val Leu Gln Asp Val 65 70 75 80 Asn Leu Arg Asn Phe Ser His Gly Gln Thr Ser Leu Asp Arg Leu Arg 85 90 95 Asp Gly Leu Val Gly Ala Gln Phe Trp Ser Ala Ser Val Ser Cys Gln 100 105 110 Ser Gln Asp Gln Thr Ala Val Arg Leu Ala Leu Glu Gln Ile Asp Leu 115 120 125 Ile His Arg Met Cys Ala Ser Tyr Ser Glu Leu Glu Leu Val Thr Ser 130 135 140 Ala Glu Gly Leu Asn Ser Ser Gln Lys Leu Ala Cys Leu Ile Gly Val 145 150 155 160 Glu Gly Gly His Ser Leu Asp Ser Ser Leu Ser Val Leu Arg Ser Phe 165 170 175 Tyr Val Leu Gly Val Arg Tyr Leu Thr Leu Thr Phe Thr Cys Ser Thr 180 185 190 Pro Trp Ala Glu Ser Ser Thr Lys Phe Arg His His Met Tyr Thr Asn 195 200 205 Val Ser Gly Leu Thr Ser Phe Gly Glu Lys Val Val Glu Glu Leu Asn 210 215 220 Arg Leu Gly Met Met Ile Asp Leu Ser Tyr Ala Ser Asp Thr Leu Ile 225 230 235 240 Arg Arg Val Leu Glu Val Ser Gln Ala Pro Val Ile Phe Ser His Ser 245 250 255 Ala Ala Arg Ala Val Cys Asp Asn Leu Leu Asn Val Pro Asp Asp Ile 260 265 270 Leu Gln Leu Leu Lys Lys Asn Gly Gly Ile Val Met Val Thr Leu Ser 275 280 285 Met Gly Val Leu Gln Cys Asn Leu Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Ala 290 295 300 Asp His Phe Asp His Ile Arg Ala Val Ile Gly Ser Glu Phe Ile Gly 305 310 315 320 Ile Gly Gly Asn Tyr Asp Gly Thr Gly Arg Phe Pro Gln Gly Leu Glu 325 330 335 Asp Val Ser Thr Tyr Pro Val Leu Ile Glu Glu Leu Leu Ser Arg Ser 340 345 350 Trp Ser Glu Glu Glu Leu Gln Gly Val Leu Arg Gly Asn Leu Leu Arg 355 360 365 Val Phe Arg Gln Val Glu Lys Val Arg Glu Glu Ser Arg Ala Gln Ser 370 375 380 Pro Val Glu Ala Glu Phe Pro Tyr Gly Gln Leu Ser Thr Ser Cys His 385 390 395 400 Ser His Leu Val Pro Gln Asn Gly His Gln Ala Thr His Leu Glu Val 405 410 415 Thr Lys Gln Pro Thr Asn Arg Val Pro Trp Arg Ser Ser Asn Ala Ser 420 425 430 Pro Tyr Leu Val Pro Gly Leu Val Ala Ala Ala Thr Ile Pro Thr Phe 435 440 445 Thr Gln Trp Leu Cys 450 <210> 4 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human DPEP3 isoform a precursor (UniProtKB /Swiss-Prot. Q9H4B8.2; residues 1-488) <400> 4 Met Gln Pro Thr Gly Arg Glu Gly Ser Arg Ala Leu Ser Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gln Pro 20 25 30 Val Thr Arg Ala Glu Thr Thr Pro Gly Ala Pro Arg Ala Leu Ser Thr 35 40 45 Leu Gly Ser Pro Ser Leu Phe Thr Thr Pro Gly Val Pro Ser Ala Leu 50 55 60 Thr Thr Pro Gly Leu Thr Thr Pro Gly Thr Pro Lys Thr Leu Asp Leu 65 70 75 80 Arg Gly Arg Ala Gln Ala Leu Met Arg Ser Phe Pro Leu Val Asp Gly 85 90 95 His Asn Asp Leu Pro Gln Val Leu Arg Gln Arg Tyr Lys Asn Val Leu 100 105 110 Gln Asp Val Asn Leu Arg Asn Phe Ser His Gly Gln Thr Ser Leu Asp 115 120 125 Arg Leu Arg Asp Gly Leu Val Gly Ala Gln Phe Trp Ser Ala Ser Val 130 135 140 Ser Cys Gln Ser Gln Asp Gln Thr Ala Val Arg Leu Ala Leu Glu Gln 145 150 155 160 Ile Asp Leu Ile His Arg Met Cys Ala Ser Tyr Ser Glu Leu Glu Leu 165 170 175 Val Thr Ser Ala Glu Gly Leu Asn Ser Ser Gln Lys Leu Ala Cys Leu 180 185 190 Ile Gly Val Glu Gly Gly His Ser Leu Asp Ser Ser Leu Ser Val Leu 195 200 205 Arg Ser Phe Tyr Val Leu Gly Val Arg Tyr Leu Thr Leu Thr Phe Thr 210 215 220 Cys Ser Thr Pro Trp Ala Glu Ser Ser Thr Lys Phe Arg His His Met 225 230 235 240 Tyr Thr Asn Val Ser Gly Leu Thr Ser Phe Gly Glu Lys Val Val Glu 245 250 255 Glu Leu Asn Arg Leu Gly Met Met Ile Asp Leu Ser Tyr Ala Ser Asp 260 265 270 Thr Leu Ile Arg Arg Val Leu Glu Val Ser Gln Ala Pro Val Ile Phe 275 280 285 Ser His Ser Ala Ala Arg Ala Val Cys Asp Asn Leu Leu Asn Val Pro 290 295 300 Asp Asp Ile Leu Gln Leu Leu Lys Lys Asn Gly Gly Ile Val Met Val 305 310 315 320 Thr Leu Ser Met Gly Val Leu Gln Cys Asn Leu Leu Ala Asn Val Ser 325 330 335 Thr Val Ala Asp His Phe Asp His Ile Arg Ala Val Ile Gly Ser Glu 340 345 350 Phe Ile Gly Ile Gly Gly Asn Tyr Asp Gly Thr Gly Arg Phe Pro Gln 355 360 365 Gly Leu Glu Asp Val Ser Thr Tyr Pro Val Leu Ile Glu Glu Leu Leu 370 375 380 Ser Arg Ser Trp Ser Glu Glu Glu Leu Gln Gly Val Leu Arg Gly Asn 385 390 395 400 Leu Leu Arg Val Phe Arg Gln Val Glu Lys Val Arg Glu Glu Ser Arg 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<220> <221> misc_feature <223> Human DPEP3 cDNA clone (GenBank Accession No. BC037243) <400> 6 gtcgtcatga tccggacccc attgtcggcc tctgcccatc gcctgctcct cccaggctcc 60 cgcggccgac ccccgcgcaa catgcagccc acgggccgcg agggttcccg cgcgctcagc 120 cggcggtatc tgcggcgtct gctgctcctg ctactgctgc tgctgctgcg gcagcccgta 180 acccgcgcgg agaccacgcc gggcgccccc agagccctct ccacgctggg ctcccccagc 240 ctcttcacca cgccgggtgt ccccagcgcc ctcactaccc caggcctcac tacgccaggc 300 acccccaaaa ccctggacct tcggggtcgc gcgcaggccc tgatgcggag tttcccactc 360 gtggacggcc acaatgacct gccccaggtc ctgagacagc gttacaagaa tgtgcttcag 420 gatgttaacc tgcgaaattt cagccatggt cagaccagcc tggacaggct tagagacggc 480 ctcgtgggtg cccagttctg gtcagcctcc gtctcatgcc agtcccagga ccagactgcc 540 gtgcgcctcg ccctggagca gattgacctc attcaccgca tgtgtgcctc ctactctgaa 600 ctcgagcttg tgacctcagc tgaaggtctg aacagctctc aaaagctggc ctgcctcatt 660 ggcgtggagg gtggtcactc actggacagc agcctctctg tgctgcgcag tttctatgtg 720 ctgggggtgc gctacctgac acttaccttc acctgcagta caccatgggc agagagttcc 780 accaagttca gacaccacat gtacaccaac gtcagcggat tgacaagctt tggtgagaaa 840 gtagtagagg agttgaaccg cctgggcatg atgatagatt tgtcctatgc atcggacacc 900 ttgataagaa gggtcctgga agtgtctcag gctcctgtga tcttctccca ctcagctgcc 960 agagctgtgt gtgacaattt gttgaatgtt cccgatgata tcctgcagct tctgaagaag 1020 aacggtggca tcgtgatggt gacactgtcc atgggggtgc tgcagtgcaa cctgcttgct 1080 aacgtgtcca ctgtggcaga tcactttgac cacatcaggg cagtcattgg atctgagttc 1140 atcgggattg gtggaaatta tgacgggact ggccggttcc ctcaggggct ggaggatgtg 1200 tccacatacc cagtcctgat agaggagttg ctgagtcgta gctggagcga ggaagagctt 1260 caaggtgtcc ttcgtggaaa cctgctgcgg gtcttcagac aagtggaaaa ggtgagagag 1320 gagagcaggg cgcagagccc cgtggaggct gagtttccat atgggcaact gagcacatcc 1380 tgccactccc acctcgtgcc tcagaatgga caccaggcta ctcatctgga ggtgaccaag 1440 cagccaacca atcgggtccc ctggaggtcc tcaaatgcct ccccatacct tgttccaggc 1500 cttgtggctg ctgccaccat cccaaccttc acccagtggc tctgctgaca cagtcggtcc 1560 ccgcagaggt cactgtggca aagcctcaca aagccccctc tcctagttca ttcacaagca 1620 tatgctgaga ataaacatgt tacacatgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1724 <210> 7 <211> 486 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human DPEP2 protein (GenBank Accession No. NP_071750) <400> 7 Met Gln Pro Ser Gly Leu Glu Gly Pro Gly Thr Phe Gly Arg Trp Pro 1 5 10 15 Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Val Thr Cys 20 25 30 Ala Tyr Thr Thr Pro Gly Pro Pro Arg Ala Leu Thr Thr Leu Gly Ala 35 40 45 Pro Arg Ala His Thr Met Pro Gly Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Pro Ser Thr Gln Gly Leu Gln Glu Gln Ala Arg Ala Leu Met 65 70 75 80 Arg Asp Phe Pro Leu Val Asp Gly His Asn Asp Leu Pro Leu Val Leu 85 90 95 Arg Gln Val Tyr Gln Lys Gly Leu Gln Asp Val Asn Leu Arg Asn Phe 100 105 110 Ser Tyr Gly Gln Thr Ser Leu Asp Arg Leu Arg Asp Gly Leu Val Gly 115 120 125 Ala Gln Phe Trp Ser Ala Tyr Val Pro Cys Gln Thr Gln Asp Arg Asp 130 135 140 Ala Leu Arg Leu Thr Leu Glu Gln Ile Asp Leu Ile Arg Arg Met Cys 145 150 155 160 Ala Ser Tyr Ser Glu Leu Glu Leu Val Thr Ser Ala Lys Ala Leu Asn 165 170 175 Asp Thr Gln Lys Leu Ala Cys Leu Ile Gly Val Glu Gly Gly His Ser 180 185 190 Leu Asp Asn Ser Leu Ser Ile Leu Arg Thr Phe Tyr Met Leu Gly Val 195 200 205 Arg Tyr Leu Thr Leu Thr His Thr Cys Asn Thr Pro Trp Ala Glu Ser 210 215 220 Ser Ala Lys Gly Val His Ser Phe Tyr Asn Asn Ile Ser Gly Leu Thr 225 230 235 240 Asp Phe Gly Glu Lys Val Val Ala Glu Met Asn Arg Leu Gly Met Met 245 250 255 Val Asp Leu Ser His Val Ser Asp Ala Val Ala Arg Arg Ala Leu Glu 260 265 270 Val Ser Gln Ala Pro Val Ile Phe Ser His Ser Ala Ala Arg Gly Val 275 280 285 Cys Asn Ser Ala Arg Asn Val Pro Asp Asp Ile Leu Gln Leu Leu Lys 290 295 300 Lys Asn Gly Gly Val Val Met Val Ser Leu Ser Met Gly Val Ile Gln 305 310 315 320 Cys Asn Pro Ser Ala Asn Val Ser Thr Val Ala Asp His Phe Asp His 325 330 335 Ile Lys Ala Val Ile Gly Ser Lys Phe Ile Gly Ile Gly Gly Asp Tyr 340 345 350 Asp Gly Ala Gly Lys Phe Pro Gln Gly Leu Glu Asp Val Ser Thr Tyr 355 360 365 Pro Val Leu Ile Glu Glu Leu Leu Ser Arg Gly Trp Ser Glu Glu Glu 370 375 380 Leu Gln Gly Val Leu Arg Gly Asn Leu Leu Arg Val Phe Arg Gln Val 385 390 395 400 Glu Lys Val Gln Glu Glu Asn Lys Trp Gln Ser Pro Leu Glu Asp Lys 405 410 415 Phe Pro Asp Glu Gln Leu Ser Ser Ser Cys His Ser Asp Leu Ser Arg 420 425 430 Leu Arg Gln Arg Gln Ser Leu Thr Ser Gly Gln Glu Leu Thr Glu Ile 435 440 445 Pro Ile His Trp Thr Ala Lys Leu Pro Ala Lys Trp Ser Val Ser Glu 450 455 460 Ser Ser Pro His Met Ala Pro Val Leu Ala Val Val Ala Thr Phe Pro 465 470 475 480 Val Leu Ile Leu Trp Leu 485 <210> 8 <211> 493 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Mouse DPEP3 protein (GenBank Accession No. NP_082236) <400> 8 Met Gln Pro Ala Gly Leu Glu Gly Pro Arg Ala Leu Gly Leu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Gly His Arg Leu Ser Leu Leu Gly Val Leu Leu Leu Val Pro Ser 20 25 30 Leu Trp Val Thr Cys Thr Leu Thr Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro 35 40 45 Thr Thr Pro Glu Ala Ser Asn Ala Thr Thr Ala Pro Gly Ile Pro Asn 50 55 60 Asp Thr Ala Thr Ser Gly Val Thr Ser Asp Pro Arg Leu Arg Glu Gln 65 70 75 80 Ala Leu Ala Leu Met Arg Asp Phe Pro Leu Val Asp Gly His Asn Asp 85 90 95 Leu Pro Leu Leu Leu Arg Glu Leu Phe Gln Asn Gln Leu Gln Asp Val 100 105 110 Asn Leu Arg Asn Phe Thr Arg Gly Gln Thr Asn Leu Asp Arg Leu Arg 115 120 125 Asp Gly Leu Val Gly Ala Gln Phe Trp Ser Ala Tyr Ile Pro Cys Gln 130 135 140 Thr Gln Asp Arg Asp Ala Val Arg Leu Ala Leu Glu Gln Ile Asp Leu 145 150 155 160 Ile Arg Arg Met Cys Ser Ala Tyr Pro Glu Leu Glu Leu Val Thr Ser 165 170 175 Ala Asp Gly Leu Asn Asn Thr Gln Lys Leu Ala Cys Leu Ile Gly Val 180 185 190 Glu Gly Gly His Ser Leu Asp Thr Ser Leu Ala Val Leu Arg Ser Phe 195 200 205 Tyr Glu Leu Gly Val Arg Tyr Leu Thr Leu Thr Phe Thr Cys Ser Thr 210 215 220 Pro Trp Ala Glu Ser Ala Thr Lys Phe Arg His His Phe Tyr Thr Asn 225 230 235 240 Ile Ser Gly Leu Thr Ser Phe Gly Glu Lys Val Val Glu Glu Met Asn 245 250 255 Arg Leu Gly Met Met Ile Asp Leu Ser His Ala Ser Asp Thr Leu Val 260 265 270 Lys Gln Thr Leu Glu Val Ser Gln Ala Pro Val Ile Phe Ser His Ser 275 280 285 Ala Ala Arg Ser Val Cys Asp Asn Leu Leu Asn Ile Pro Asp Asp Ile 290 295 300 Leu Gln Leu Leu Lys Lys Asn Gly Gly Ile Val Met Val Thr Leu Ser 305 310 315 320 Met Gly Val Leu Gln Cys Ser Leu Phe Ala Asn Val Ser Thr Val Ala 325 330 335 Asp His Phe Asp His Ile Arg Thr Val Ile Gly Ser Glu Phe Ile Gly 340 345 350 Ile Gly Gly Ser Tyr Asp Gly Ser Gly Arg Phe Pro Gln Gly Leu Glu 355 360 365 Asp Val Ser Thr Tyr Pro Val Leu Ile Glu Glu Leu Leu Ser Arg Gly 370 375 380 Trp Asp Glu Arg Glu Leu Gln Gly Val Leu Arg Gly Asn Leu Leu Arg 385 390 395 400 Val Phe Arg Gln Val Glu Gln Val Arg Glu Lys Ser Leu Gly Gln Ser 405 410 415 Pro Val Glu Val Lys Phe Pro Glu Arg Gln Gln Ser Asn Thr Cys His 420 425 430 Ser His Leu Leu Pro Gln Pro Gln Glu Asp Gln His Gln Asp Thr His 435 440 445 Leu Lys Val Thr Lys Leu Pro Asn Ile Leu Gln Arg Ala Ser Lys Ala 450 455 460 Pro Pro His Pro Leu Pro Gly Leu Met Ala Thr Leu Thr Ser Leu Ala 465 470 475 480 Leu Ile Leu Trp Leu Cys Cys Ser Gly His Arg Ala Val 485 490 <210> 9 <211> 1726 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Mouse DPEP3 cDNA clone (GenBank Accession No. BC051148) <400> 9 gttgcgcagc agggtgactg gaagcccttc caagcgaggc cacgtcctag ggaccctgaa 60 tcgaaggtcc gaacccattg tcgccctctg ccctatccct gcccttctca agcgctcttg 120 tgaccaagac tgagcaccat gcagcccgcg ggtcttgagg gtccacgcgc gctcggcctg 180 cggcctctgg ggcaccggct gtccctgctg ggggtgttac ttctagttcc gtctctgtgg 240 gtaacctgca ccctgactac tccgagcccc tccagtgctc cgacaacacc ggaagcctcc 300 aatgccacga ccgctccagg cattcctaat gacacggcca cgtcaggtgt gaccagtgac 360 cctcgccttc gagagcaagc actggctctg atgcgagact tcccacttgt ggatggccac 420 aacgacctgc ctctgctctt gagagaactt ttccagaacc agctgcagga tgtgaatctg 480 cgcaatttca cccgtggcca gaccaacctg gataggctca gggacggcct tgtgggtgcc 540 cagttctggt cagcctacat cccgtgccaa acccaggacc gggatgccgt acgcctagcc 600 ctggagcaga ttgatctcat tcgtcgcatg tgctctgctt accctgagct ggagctggtg 660 acctcagctg atggtctgaa taacactcag aagctggcct gcctcattgg tgtagagggt 720 ggtcactcac tggacaccag cctcgctgtg ttgcgcagtt tctatgagct aggagtgcgc 780 tacctgactc ttaccttcac ctgcagcaca ccgtgggcag aaagcgccac aaaattcaga 840 caccatttct acaccaacat tagtgggttg acaagctttg gtgagaaagt agtggaagaa 900 atgaaccgtc tgggcatgat gatagacttg tcccacgcct cggacacctt agtgaagcag 960 accctggagg tgtctcaggc tcctgtgatc ttctcacact cggcggctag atcggtgtgt 1020 gacaatttgc tgaatattcc tgatgacata ttgcaacttc tgaagaagaa cggtggcatc 1080 gtgatggtga cactatccat gggggtgcta cagtgcagtc tgtttgctaa cgtgtccact 1140 gtagcagatc attttgacca catcaggaca gtcattggat ctgagttcat tgggatcggt 1200 ggaagctatg acgggtctgg aaggttccct cagggactgg aggatgtatc tacataccca 1260 gtgctgatag aggagttgct gagtcgcggt tgggatgaac gagagcttca aggtgtcctt 1320 cgaggaaacc tgcttcgggt cttcagacaa gtggaacagg tgagagagaa aagccttggg 1380 cagagccctg tggaggtcaa gtttccagag aggcagcaga gcaacacctg ccactcccac 1440 ctgctgcctc agcctcagga ggaccaacac caggatacac acctgaaggt gacaaagctg 1500 ccaaacatcc tccagagagc ctcaaaagcc cctccccacc ccttgccagg cctcatggct 1560 acgctcacct ccctagccct catcctttgg ctatgttgct ctggccacag ggcagtttag 1620 caaaacccac aaagttcccc tcctcattgc tgagacccca gcttatgttg agaataaata 1680 cctgaaacat cacgacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1726 <210> 10 <211> 488 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Rat DPEP3 protein (GenBank Accession No. NP_001008384) <400> 10 Met Gln Pro Thr Gly Pro Glu Gly Pro Arg Ala Leu Ser Leu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Gly His Arg Leu Ser Leu Leu Gly Val Leu Leu Ile Ile Pro Ser 20 25 30 Leu Trp Val Thr Cys Asn Gln Thr Thr Pro Ser Leu Ser Ser Ala Pro 35 40 45 Thr Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Met Thr Thr Pro Gly Ile Pro Asn 50 55 60 Asp Thr Thr Thr Ser Gly Val Thr Ser Asp Pro Arg Leu Arg Glu Gln 65 70 75 80 Ala Leu Ala Leu Met Arg Asp Phe Pro Leu Val Asp Gly His Asn Asp 85 90 95 Leu Pro Leu Leu Leu Arg Glu Leu Phe Gln Asn Lys Leu Gln Asp Val 100 105 110 Asn Leu His Asn Phe Thr Arg Gly Gln Thr Ser Leu Asp Arg Leu Arg 115 120 125 Asp Gly Leu Val Gly Ala Gln Phe Trp Ser Ala Tyr Ile Pro Cys Gln 130 135 140 Thr Gln Asp Arg Asp Ala Val Arg Val Ala Leu Glu Gln Ile Asp Leu 145 150 155 160 Ile Arg Arg Met Cys Ser Ala Tyr Pro Glu Leu Glu Leu Val Thr Ser 165 170 175 Ala Asp Gly Leu Asn Ser Thr Gln Lys Leu Ala Cys Leu Ile Gly Leu 180 185 190 Glu Gly Gly His Ser Leu Asp Thr Ser Leu Ala Val Leu Arg Ser Phe 195 200 205 Tyr Glu Leu Gly Val Arg Tyr Leu Thr Leu Thr Phe Thr Cys Ser Thr 210 215 220 Pro Trp Ala Glu Ser Ala Thr Lys Phe Arg His His Phe Tyr Thr Asn 225 230 235 240 Ile Ser Gly Leu Thr Ser Phe Gly Glu Lys Val Val Glu Glu Met Asn 245 250 255 Arg Ile Gly Met Met Ile Asp Leu Ser His Ala Ser Asp Thr Leu Val 260 265 270 Lys Gln Thr Leu Glu Ala Ser Arg Ala Pro Val Ile Phe Ser His Ser 275 280 285 Ala Ala Arg Ser Val Cys Asp Asn Leu Leu Asn Val Pro Asp Asp Ile 290 295 300 Leu Gln Leu Leu Lys Lys Asn Gly Gly Ile Val Met Val Thr Leu Ser 305 310 315 320 Met Gly Val Leu Gln Cys Ser Leu Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Ala 325 330 335 Asp His Phe Asp His Ile Arg Thr Val Ile Gly Ser Glu Phe Ile Gly 340 345 350 Ile Gly Gly Ser Tyr Asp Gly Ser Gly Arg Phe Pro Gln Gly Leu Glu 355 360 365 Asp Val Ser Thr Tyr Pro Val Leu Leu Glu Glu Leu Leu Arg Arg Gly 370 375 380 Trp Gly Glu Gln Glu Leu Gln Gly Val Leu Arg Gly Asn Leu Leu Arg 385 390 395 400 Val Phe Arg Gln Val Glu Gln Val Arg Glu Lys Ser Leu Gly Gln Ser 405 410 415 Pro Val Glu Val Val Phe Pro Glu Arg Gln Gln Ser Ser Thr Cys His 420 425 430 Ser His Leu Leu Pro Gln Ser Gln Asp Ala His Leu Lys Val Thr Lys 435 440 445 Leu Pro Ser Ser Gln Val Leu Gln Arg Ala Ser Lys Ala Pro Pro Cys 450 455 460 Pro Leu Leu Gly Leu Val Ala Ala Val Thr Ser Pro Ala Phe Thr Leu 465 470 475 480 Trp Leu Cys Cys Ser Gly His Arg 485 <210> 11 <211> 1692 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> misc_feature <223> Rat DPEP3 cDNA clone (GenBank Accession No. BC085826) <400> 11 gcccttacaa gcaaggcgac gtcctagggt accctgaatc gaaggtccga accccattgt 60 caccctctgc cctatccctg cccttctcag gcttttgtga ccaagactga gcaacatgca 120 acccacgggt cctgagggtc cacgcgcgct cagcttgagg cctctggggc accggctatc 180 cctgttgggg gtgttactta taattccgtc actatgggta acctgcaacc agactactcc 240 gagcctctcc agtgctccga cctcaccggg agcctccagt gccatgacca ctccaggcat 300 tcctaatgac acaactacgt caggcgtgac cagtgaccct cgccttcgag agcaagcact 360 ggccctgatg cgagacttcc cacttgtgga tggccacaac gacctgcctc tgctcctgag 420 agaacttttc cagaacaagc tgcaggatgt gaatctgcac aatttcaccc gtggccagac 480 cagcctggat aggctcaggg atggccttgt gggtgcccag ttctggtcag cctacatccc 540 atgccaaacc caggatcggg atgccgtgcg cgtagccctg gagcagattg acctcatccg 600 acgcatgtgt tctgcttacc cggagttgga gcttgtgacc tcagctgatg gtctgaatag 660 cactcagaag ctggcctgcc tcattggact agagggtggt cactcactgg acaccagcct 720 cgctgtgctg cgcagtttct acgagctagg agtccgctac ctgacactta ccttcacgtg 780 cagcacaccc tgggcagaaa gtgccacgaa attcagacac catttctaca ccaacatcag 840 cgggttgacg agctttggag agaaagtagt ggaagaaatg aaccgcatag gtatgatgat 900 agatttgtcc cacgcctcag acaccttagt gaagcaaacc ctggaggcgt ctcgggctcc 960 tgtgatcttc tcccattcag cggctagatc agtgtgtgac aacttgctga atgttcctga 1020 tgacatactg cagcttctga agaagaatgg tggcattgtg atggtgacac tgtccatggg 1080 ggtgctgcag tgcagtctgc ttgctaatgt gtccactgta gcagatcatt ttgaccacat 1140 caggacagtc attggatctg aattcattgg gattggtgga agctatgatg ggtctggaag 1200 gttccctcag gggctggagg atgtgtctac atacccagtg ctcttagagg agttgctgag 1260 acgaggctgg ggtgaacaag agcttcaagg tgtccttcga ggaaacctgc ttcgggtctt 1320 cagacaagtg gaacaggtga gagaaaaaag ccttgggcag agccctgtgg aggtcgtgtt 1380 cccagagagg caacagagca gcacctgcca ctcccacctg ctgcctcagt ctcaggacgc 1440 acacttgaag gtgaccaagc tgccaagtag ccaggtgctc cagagggcct ccaaagcccc 1500 gccatgcccc ttgctaggcc tcgtggctgc tgtcacctcc ccagccttca ccctttggct 1560 ttgttgctct ggccacaggt gagtttagca aaacccacac cgttcccctc ctcactgccc 1620 aggccccagc ttatgttaag aataaatacc tgaaacacca ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aa 1692 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.2 Light Chain Variable Region <400> 20 gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattacc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcacgtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaaac ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.2 Light Chain Variable Region <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Arg Thr 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 375 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.2 Heavy Chain Variable Region <400> 22 cagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaattggtt gaagcagagg 120 cctggacagg gacttgagtg gattggatgg acttatcctg gaagcggtcc tactaagtac 180 aatgggaagt tcaggggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagtctac 240 atgcagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacggggg 300 atttattact acgatggtat ctacccaaat tactttgact actggggcca aggcaccact 360 ctcacagtct cctca 375 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.2 Heavy Chain Variable Region <400> 23 Glu Val Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Gly Pro Thr Lys Tyr Asn Gly 50 55 60 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ile Tyr Pro Asn 100 105 110 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 24 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.4 Light Chain Variable Region <400> 24 ggacattgtg atgtcacagt ctccatcctc cctaactgtg tcagttggag agaaggttac 60 tatgagctgc aagtccagtc agagcctttt atatagtcgc aatcaaaaga actacttggc 120 ctggtaccag cagaaaccag ggcagtctcc taaactgctg atttactggg catccactag 180 ggactctggg gtccctgatc gcttcacagg cactggatct gggacagatt tctctctcac 240 catcagcagt gtgaaaactg aagacctggc agtttattac tgtcaccaac attataggta 300 tccgctcaca ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 340 <210> 25 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.4 Light Chain Variable Region <400> 25 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 His Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 26 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.4 Heavy Chain Variable Region <400> 26 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggcgaggc caggggcctc agtgaagctg 60 tcctgtaagg cttctggata caccttcaca agctatggta taaactgggt gaaacagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggaaa tatttactac 180 aatgagaagt ttaagggcaa ggccatactg actactgata aatcctccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactgggcc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.4 Heavy Chain Variable Region <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Ala Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 28 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.5 Light Chain Variable Region <400> 28 gacattgtga tgacacagtt tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60 atgaactgca agtccagtca gagcctttta aatagtagta atcaaaagaa ctatttggcc 120 tggttccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcttaggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatagcact 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaaattg gaaataaaa 339 <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.5 Light Chain Variable Region <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Leu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.5 Heavy Chain Variable Region <400> 30 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaattgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgagtg gattggactt atttatcctt acaatgatga tactaggtac 180 aaacagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240 atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtac aagagggtac 300 tacggtagtc cgtacttcga tgtctggggc gcagggacaa cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.5 Heavy Chain Variable Region <400> 31 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Arg Tyr Lys Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.6 Light Chain Variable Region <400> 32 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagtaggaca gaatatcact 60 atgaactgca agtccagtca gagcctttta tacaatcaaa agaactattt ggcctggtac 120 cagcagaaac caggacagtc tcctaaactt ctggtatact ttgcatccac tagggaatct 180 ggggtccctg atcgcttcgt aggcagtgga tctgggacag atttcactct taccatcagc 240 aatgtgcagg ctgaagacct ggcagattac ttctgtcagc aacattatac cactccattc 300 acgttcggct cggggacaaa attggaaatt aaa 333 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.6 Light Chain Variable Region <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Asn Ile Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Asn 20 25 30 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Val Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr 85 90 95 Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.6 Heavy Chain Variable Region <400> 34 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggaacttc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaattgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgagtg gattggactt atttatcctt acaatgatga tactaggtac 180 aaccggaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccaa cacagcctac 240 atggagctcc tcagtctgac atctgtggac tctgcagtct gttactgtgc aagagggtcc 300 tacggtagtc cattcttcga tgtctggggc gcagggacaa cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.6 Heavy Chain Variable Region <400> 35 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Cys Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Pro Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.7 Light Chain Variable Region <400> 36 gacattgtga tgtctcagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtcgct atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gaactgaaa 339 <210> 37 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.7 Light Chain Variable Region <400> 37 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 38 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.7 Heavy Chain Variable Region <400> 38 caggttcagg tgcagcagtc tggagctgaa ttggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cctctggata caccttcaca agctatggca taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa cgcttactat 180 aatgagaagt tcaaggtcaa ggccaaactg actacagaca attcctccag gacagcctac 240 atgcagctca tcaacctgac atctgaggat tctgcagtct atttctgtgc aagggtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 39 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.7 Heavy Chain Variable Region <400> 39 Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Lys Leu Thr Thr Asp Asn Ser Ser Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ile Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 40 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.11 Light Chain Variable Region <400> 40 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactcgg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaggaatc ttataatctc 300 tggactttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.11 Light Chain Variable Region <400> 41 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Glu 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.11 Heavy Chain Variable Region <400> 42 caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aactattgga tgatctgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attgatccca ccactgacta tactgcgtac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacagtg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggggg 300 aatgtggctt tggacttttg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 43 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.11 Heavy Chain Variable Region <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ile Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Val Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.13 Light Chain Variable Region <400> 44 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaggt atcaaaagaa ctatttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct agactggtga tttactgggc atctactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggta gtttattatt gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggttctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.13 Light Chain Variable Region <400> 45 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Leu Val Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 46 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.13 Heavy Chain Variable Region <400> 46 caggttcagg tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatgcta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgggaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtcgat 300 gattacggtt cctggtttcc ttattggggc caagggactc tggtcactgt gtctgca 357 <210> 47 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.13 Heavy Chain Variable Region <400> 47 Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val Asp Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.14 Light Chain Variable Region <400> 48 gacatccaga tgactcaggc tccagcctcc ctatctccat ctgtgggagc aactgtcacc 60 atcacatgtc gaacaagtga acatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcggttatt ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgtcatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctgc agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg gaaattatta ctgtcaacat cattatgata ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.14 Light Chain Variable Region <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Pro Ala Ser Leu Ser Pro Ser Val Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu His Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Gln Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.14 Heavy Chain Variable Region <400> 50 gaggtccaac tgcagcagtc tggacctgag atggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggata catattcact gactactaca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggagaga gccttgactg gattggacgt gttaatccta aaaaaggtgg tactacctac 180 aaccagaagt tcgagggcaa ggccatattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggacctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aatgggtatc 300 tactatagtt acgacgcctc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 51 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.14 Heavy Chain Variable Region <400> 51 Glu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Met Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp 20 25 30 Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Asp Trp 35 40 45 Ile Gly Arg Val Asn Pro Lys Lys Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Glu Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Met Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Asp Ala Ser Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.16 Light Chain Variable Region <400> 52 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagat atcaaaagaa ttacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactggtc atccactcgg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gattattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccactcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.16 Light Chain Variable Region <400> 53 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 54 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.16 Heavy Chain Variable Region <400> 54 caggttcagc tgcagcagtc tggaactgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctgaata caccttcaca agctatgcta taacctgggt gaggcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcccg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagactt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctcc 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 55 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.16 Heavy Chain Variable Region <400> 55 Glu Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Tyr Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Thr 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Ser Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.18 Light Chain Variable Region <400> 56 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 gtcgcctgca aggccggtca gaatgtgggt actagtgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacattctc ctaaatcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctaat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tatatcacct atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataat a 321 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.18 Light Chain Variable Region <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> SC34.18 Heavy Chain Variable Region <400> 58 caggtttctc tgaaagagtc gggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gccaacattt ggtgggatga tagtatttac 180 tataacacag ccctgaagag tcggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggtc 240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactcctg tgctcgaata 300 gaatcctact atggtaaccg ggcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 59 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.18 Heavy Chain Variable Region <400> 59 Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Ser 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Glu Ser Tyr Tyr Gly Asn Arg Ala Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 60 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.19 Light Chain Variable Region <400> 60 gacattgtga tgtcacagtc tccttccgcc ctagctgtgt cagttggaga gaagattact 60 atgagctgca agtgtagtca gagcctctta catagtcgcg atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtatcagc agaaaccagg gcagtctccc aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaacactg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaaca ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 61 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.19 Light Chain Variable Region <400> 61 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ala Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Met Ser Cys Lys Cys Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Arg Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Thr Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 62 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.19 Heavy Chain Variable Region <400> 62 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatgcta taacctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tactttcttc 180 aatgagaagt tcaagggcag ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc tagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 63 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.19 Heavy Chain Variable Region <400> 63 Gln Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Tyr Ala Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Phe Phe Asn Glu Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 64 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.20 Light Chain Variable Region <400> 64 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctaactgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtacct atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggttccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.20 Light Chain Variable Region <400> 65 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 66 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.20 Heavy Chain Variable Region <400> 66 caggttcagc tgcagcagtc tggatctgaa ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaga agctatgcta taagctgggt gaggcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg aaagtggtaa tactgactac 180 aatgcgcagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggcc tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 67 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.20 Heavy Chain Variable Region <400> 67 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Glu Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Gln Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 68 <211> 312 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.23 Light Chain Variable Region <400> 68 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60 ctaacctgca gtgccagctc gagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtccggc 120 acttctccca aactcttgat ttatagcact tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcaacactgt ggaggctgaa 240 gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttgga cgttcggtgg aggcaccaag 300 ctggaaatca aa 312 <210> 69 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.23 Light Chain Variable Region <400> 69 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Trp Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 <210> 70 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.23 Heavy Chain Variable Region <400> 70 gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctagc ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc 60 acctgttctg tcactggcga ctccatcacc agtggttcct ggaactggat ccggaaattc 120 ccagggaata aacttgagta catgggatac ataaactaca gtggtggcac ttactacaat 180 ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca ctactacctg 240 cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtggaag acgactggga 300 tcggggggct ggtttggtta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 71 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.23 Heavy Chain Variable Region <400> 71 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Ser Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Arg Arg Leu Gly Ser Gly Gly Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 72 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.24 Light Chain Variable Region <400> 72 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgaactgca agtccagtca gagcctttta tatagtagat atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 73 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.24 Light Chain Variable Region <400> 73 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 74 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.24 Heavy Chain Variable Region <400> 74 caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctgaata caccttcaca agctatgcta taacctgggt gaagcagaga 120 gctggacagg gccttgagtg gattggggag atttatcctg gaagtggtga tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 75 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.24 Heavy Chain Variable Region <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 76 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.25 Light Chain Variable Region <400> 76 gacatagtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt caggtggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaggt atcaaaagaa ctacgtggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagtagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 77 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.25 Light Chain Variable Region <400> 77 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Gly Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 78 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.25 Heavy Chain Variable Region <400> 78 caggtgcagc tgcagcagtc tggagttgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatgcta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtga aacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcatccag tacggcctac 240 atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttatgtgg aagagtcaat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 79 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.25 Heavy Chain Variable Region <400> 79 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Val Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Glu Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Gly Arg Val Asn Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 80 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.26 Light Chain Variable Region <400> 80 gatgttgtgc tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaata gaagaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcgggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tacaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gtactgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 81 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.26 Light Chain Variable Region <400> 81 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Arg Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 82 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.26 Heavy Chain Variable Region <400> 82 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgacattg 60 tcttgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tctactgggt gaagcagagg 120 cctggagaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtgg tcctaacttc 180 aatgagagat tcaagaacaa ggccacactg actgttgaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagaggcctg 300 ctctactatg attacgacag ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 83 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.26 Heavy Chain Variable Region <400> 83 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Pro Asn Phe Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 84 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.27 Light Chain Variable Region <400> 84 gacattgtga tgtctcagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtcgca atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaacagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gaactgaaa 339 <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.27 Light Chain Variable Region <400> 85 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 86 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.27 Heavy Chain Variable Region <400> 86 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaga agttatggta taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagaggtga tgtttactac 180 aatgagaatt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 87 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.27 Heavy Chain Variable Region <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.28 Light Chain Variable Region <400> 88 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaaat tccttttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggattcat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 ggtcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat aaaa 324 <210> 89 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.28 Light Chain Variable Region <400> 89 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile His Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.28 Heavy Chain Variable Region <400> 90 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagagat tcaaggacaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaagac tctgccgtct attactgtgc aagaagggcg 300 gccgcctact atagtaaccc cgagtggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 91 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.28 Heavy Chain Variable Region <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 92 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.33 Light Chain Variable Region <400> 92 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaaat tccttttact tacactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggattcat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 ggtcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat aaaa 324 <210> 93 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.33 Light Chain Variable Region <400> 93 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile His Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.33 Heavy Chain Variable Region <400> 94 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtgataa aacttactac 180 aatgagaggt tcaaggacaa ggccacattc acggcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaagac tctgccgtct attactgtac aagaagggcg 300 gccgcctact atagtaaccc cgagtggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 95 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.33 Heavy Chain Variable Region <400> 95 Glu Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Lys Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 96 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.36 Light Chain Variable Region <400> 96 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaggatattg ccacttactt ttgccagcag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.36 Light Chain Variable Region <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.36 Heavy Chain Variable Region <400> 98 caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttctccta ctagtggtag gcctaactac 180 aatgcgaagt tcaagggcaa ggccacactg actgttgaca catcctccag cacagcctac 240 gtggatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaaggggag 300 ggctactatg gtaaagcctt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360 <210> 99 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.36 Heavy Chain Variable Region <400> 99 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Ser Pro Thr Ser Gly Arg Pro Asn Tyr Asn Ala Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Glu Gly Tyr Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.38 Light Chain Variable Region <400> 100 gatgttgtgc tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaata gaagaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcgggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tacaaggtac acattttccg 300 ttcacgttcg gtactgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.38 Light Chain Variable Region <400> 101 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Arg Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 102 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.38 Heavy Chain Variable Region <400> 102 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgacattg 60 tcttgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaagcagagg 120 cctggagaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtgg tgctaacttc 180 aatgagagat tcaagaacaa ggccacactg actgttgaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct tttactgtac aagaggcctg 300 ctctactatg attacgacag ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 103 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.38 Heavy Chain Variable Region <400> 103 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Ala Asn Phe Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 104 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.39 Light Chain Variable Region <400> 104 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcaagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccaattact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatccc acctggcttc tggagtccca 180 gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccaccta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat caaa 324 <210> 105 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.39 Light Chain Variable Region <400> 105 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Gln Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 106 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.39 Heavy Chain Variable Region <400> 106 caggttcaac tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtgatag tacttacttc 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aataaggtcg 300 gccgcctact atagtaaccc cgagtggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 107 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.39 Heavy Chain Variable Region <400> 107 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Tyr Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Arg Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 108 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.40 Light Chain Variable Region <400> 108 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atgacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcaggtcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtgaatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttatggta ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 109 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.40 Light Chain Variable Region <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Val Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Gly Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.40 Heavy Chain Variable Region <400> 110 gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaaac cttctcagac tctgtccctc 60 acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggaactggat ccggaaattc 120 ccagggaata aacttgagta catggggtac ataacctaca gtggtagtac ttactacaat 180 ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact cgagacacat ccaagaacca gtattacctg 240 cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag agcgagggtt 300 tattactacg atggtagata cggccgcgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 111 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.40 Heavy Chain Variable Region <400> 111 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Gly Arg Tyr Gly Arg Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.41 Light Chain Variable Region <400> 112 gacatccaga tgattcagtc tccatcgtcc atgtttgcct ctctgggaga cagagtcagt 60 ctctcttgtc gggctagtca gggcattaga ggtaatttag actggtatca gcagaaacca 120 ggtggaacta ttaaactcct gatctactcc acatccaatt taaattctgg tgtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag cctagagtct 240 gaagattttg cagactatta ctgtctacag cgtgatgcgt atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.41 Light Chain Variable Region <400> 113 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Gly Asn 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Asp Ala Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 114 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.41 Heavy Chain Variable Region <400> 114 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcact agctatacca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccggcgaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtactg gtggtggtaa cacctactat 180 ccagacattg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggag caccctgtac 240 cttcaaatga gcagtctgag gtctgaggac tcggccatgt attactgtgc aagacgattc 300 tacgatggta gctacaacta ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 115 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.41 Heavy Chain Variable Region <400> 115 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ile Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Phe Tyr Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 116 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.46 Light Chain Variable Region <400> 116 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaat atcaaaagaa cttcctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcaatg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcagta ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccacgctg gagctgaaa 339 <210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.46 Light Chain Variable Region <400> 117 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Lys Tyr Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Asn Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 118 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.46 Heavy Chain Variable Region <400> 118 caggttcagc tgcagcagtc tggaactgaa ctggcgaggc cagggacttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaga agctatgcta taagttgggt gagacagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtgataa aacttactat 180 aatgaaagct taaagggcaa ggtcaccctg actacagaca aatgttccag cacagccaac 240 atgcagctca ccagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 119 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.46 Heavy Chain Variable Region <400> 119 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Asp Lys Thr Tyr Tyr Asn Glu Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Thr Asp Lys Cys Ser Ser Thr Ala Asn 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 120 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.48 Light Chain Variable Region <400> 120 gacatccaga tgactcaggc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gaacaagtgg acatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagttatt ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgtcatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaccag cctgcagcct 240 gaagattttg gagattatta ctgtcaacat cattatgata ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa a 321 <210> 121 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.48 Light Chain Variable Region <400> 121 Glu Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly His Ile Tyr 20 25 30 Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu 35 40 45 Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Ser Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Thr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 122 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.48 Heavy Chain Variable Region <400> 122 gaggtccagc tgcaacagtc tggacttgag atggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggata catattcact gactactaca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgactg gattggacgt gttaatccta aaaaaggtgg tactacctac 180 aaccagaagt tcgagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggacctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aatgggtatc 300 tactttagtt acgacgcctc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 123 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.48 Heavy Chain Variable Region <400> 123 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Leu Glu Met Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Lys Lys Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Gly Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 124 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.49 Light Chain Variable Region <400> 124 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga acacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatcctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccgg tcttcagact 240 gaagatattg ctacttattt ctgtcaacag tatcggagta ctccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 125 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.49 Light Chain Variable Region <400> 125 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Pro Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Gly Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 126 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.49 Heavy Chain Variable Region <400> 126 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctgggtcttc agtgaagata 60 tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactaccaca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatcctt actatggtgt tagtacctac 180 aaccagaact taaagggcac ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcggcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgt aagaagggct 300 atggattccc cccggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 127 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.49 Heavy Chain Variable Region <400> 127 Gln Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30 Tyr His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Asn 50 55 60 Leu Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Arg Ala Met Asp Ser Pro Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 128 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.50 Light Chain Variable Region <400> 128 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ttttctgtat ctctaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcgaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctatattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa a 321 <210> 129 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.50 Light Chain Variable Region <400> 129 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn 20 25 30 Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Ile 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 130 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.50 Heavy Chain Variable Region <400> 130 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaaacagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttttcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcagggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aatccgtacc 300 tatggtaact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 131 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.50 Heavy Chain Variable Region <400> 131 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Phe Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Arg Thr Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 132 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.53 Light Chain Variable Region <400> 132 gatgttgtgc tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaata gaagaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcgggaa cagattttac actgaaaatc 240 accagggtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tacaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gtactgggac caagctggag atcaaa 336 <210> 133 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.53 Light Chain Variable Region <400> 133 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Arg Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 134 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.53 Heavy Chain Variable Region <400> 134 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgacattg 60 tcttgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tctactgggt gaagcagagg 120 cctggagaag gccttgagtg gattggagag attgatccta gcaatggtgg tcctaacttc 180 aatgacagat tcaagaacaa ggccacactg actgttgaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagaggcctg 300 ctctactatg attacgacag ggggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 135 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.53 Heavy Chain Variable Region <400> 135 Glu Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asn Gly Gly Pro Asn Phe Asn Asp Arg 50 55 60 Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Arg Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 136 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.58 Light Chain Variable Region <400> 136 gacattgtga tgtctcagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtcgca atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaaca ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gaactgaga 339 <210> 137 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.58 Light Chain Variable Region <400> 137 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 His Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Arg <210> 138 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.58 Heavy Chain Variable Region <400> 138 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatggtg taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagaggtga tgtttactac 180 aatgacaatt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagtctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 139 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.58 Heavy Chain Variable Region <400> 139 Glu Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30 Tyr Gly Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Asp Asn 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 140 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.63 Light Chain Variable Region <400> 140 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaat atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaattgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtgaatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaacaata ttataggtat 300 ccgctcacgg tcggagctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 141 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.63 Light Chain Variable Region <400> 141 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Lys Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Val Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 142 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.63 Heavy Chain Variable Region <400> 142 caggttcaac tgcagcagtc tggagttgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgtaagg cttctggata caccttcaca agctatggta ttgattgggt gaaacagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag acttatcctg gaagaggtga tacttactac 180 aatgaaaact tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagccttc 240 ttacagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 143 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.63 Heavy Chain Variable Region <400> 143 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Val Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Thr Tyr Pro Gly Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 144 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.67 Light Chain Variable Region <400> 144 gacatggtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttgggga gaaggttgct 60 ctgagctgca agtccagtca gagcctttta catagtagag atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga ttcactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgctcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaatc ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.67 Light Chain Variable Region <400> 145 Asp Met Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Ala Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Arg Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ala Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 146 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.67 Heavy Chain Variable Region <400> 146 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgagactg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatggta taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggggag atttatcctg gaagtggtga cagttactac 180 aataagacgt tcaagggcaa ggccatattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac acctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc ccaggggctc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 147 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.67 Heavy Chain Variable Region <400> 147 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ser Tyr Tyr Asn Lys Thr Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 148 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.71 Light Chain Variable Region <400> 148 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaaacact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcta tgtgcaatct 240 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa catttgaatt atccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 149 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.71 Light Chain Variable Region <400> 149 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Tyr Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Leu Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 150 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.71 Heavy Chain Variable Region <400> 150 caggtttctc tgaaagagtc gggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctttgggtt ttcactgagc acttctagta tgggtgtagg gtggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcaaacattt ggtgggataa taataaatac 180 tataacgcag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggtt 240 ttcctcaaca tcgccagtgt ggacactaca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300 gaatcctact atagtaatcg ggcctggttt ccttactggg gccgagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 151 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.71 Heavy Chain Variable Region <400> 151 Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Phe Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Asn Ala Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Asn Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Glu Ser Tyr Tyr Ser Asn Arg Ala Trp Phe Pro Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 152 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.76 Light Chain Variable Region <400> 152 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gagggttacg 60 atgaactgca agtccagtca gagccttttc tatagtcgct atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 153 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.76 Light Chain Variable Region <400> 153 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 154 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.76 Heavy Chain Variable Region <400> 154 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaaga cttctgaata caccttcaca agctatgcaa taaactgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag gtttatcctg gaagtggtaa tacttattac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccatactg acgacagaca aatcctccag cacaggctac 240 atgcagctca gcaacctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacgggt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 155 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.76 Heavy Chain Variable Region <400> 155 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Glu Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Val Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 156 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.78 Light Chain Variable Region <400> 156 gacattatga tgactcagtc tccagccacg ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60 ctttcctgca gggccagcca gagtattggc gcctacttac actggtatca acaaaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaaatat gtttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240 gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagcttaa a 321 <210> 157 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.78 Light Chain Variable Region <400> 157 Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ala Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 158 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.78 Heavy Chain Variable Region <400> 158 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacgtggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcactcacc agtgattttg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataaggt acagtggtac cactagctac 180 aatccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac aactgaggac acagccacat attactgtgg ctatggtaac 300 tacgggtatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 159 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.78 Heavy Chain Variable Region <400> 159 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Arg Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 160 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.83 Light Chain Variable Region <400> 160 caaattgttc tcatccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaatgtcacc 60 atgacctgca gtgccagttc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtctggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattattg ccagcagtgg aatagttacc cacccacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <210> 161 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.83 Light Chain Variable Region <400> 161 Gln Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Asn Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 162 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.83 Heavy Chain Variable Region <400> 162 caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt cactcctgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggaaagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga tattaattat 180 aatgggaagt tcaagggcaa agccacactg actgcagaca agtcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct acttctgtgc aagaaggggc 300 ccctcctata ataattactg ttttgactat tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 163 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.83 Heavy Chain Variable Region <400> 163 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser His Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Pro Ser Tyr Asn Asn Tyr Cys Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 164 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.86 Light Chain Variable Region <400> 164 gacactgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagcggtgt cagttggaga gaaggttact 60 ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaggt atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaattgctgc tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgaccg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaaca ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 165 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.86 Light Chain Variable Region <400> 165 Asp Thr Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 166 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.86 Heavy Chain Variable Region <400> 166 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgtaagg cttctggata caccttcaca agctatacta taacctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 167 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.86 Heavy Chain Variable Region <400> 167 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 168 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.87 Light Chain Variable Region <400> 168 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctggtcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 169 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.87 Light Chain Variable Region <400> 169 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Gly Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 170 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.87 Heavy Chain Variable Region <400> 170 caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgctctgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attgatccta ggaatggtta tactgaatac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtac aagagggggg 300 aatgtggcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351 <210> 171 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.87 Heavy Chain Variable Region <400> 171 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Leu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Arg Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Gly Asn Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 172 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.89 Light Chain Variable Region <400> 172 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctaggtgtgt ccgttggaga gaaggttacg 60 ctgagctgca agtccagtca gagccttttt aataaaagag atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacgggc agtggatctg ggacagattt cattctcacc 240 atcaggagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcaccaatc ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggcgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 173 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.89 Light Chain Variable Region <400> 173 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Lys 20 25 30 Arg Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr 65 70 75 80 Ile Arg Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Ser Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 174 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.89 Heavy Chain Variable Region <400> 174 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatgcta taagctgggt gaaacagaga 120 actagacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtga tattcactac 180 agtgggaagt tcaagggcaa ggcctcactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gattacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 175 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.89 Heavy Chain Variable Region <400> 175 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Ile His Tyr Ser Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 176 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.90 Light Chain Variable Region <400> 176 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcaagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccaccta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat taaa 324 <210> 177 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.90 Light Chain Variable Region <400> 177 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Gln Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 178 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.90 Heavy Chain Variable Region <400> 178 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt tactactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtgatac cacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aataaggagg 300 gccgcctact atagtaaccc cgagtggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 179 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.90 Heavy Chain Variable Region <400> 179 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Arg Arg Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 180 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.91 Light Chain Variable Region <400> 180 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtacct atcaaaagaa ctacctggcc 120 tggttccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 181 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.91 Light Chain Variable Region <400> 181 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Tyr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 182 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.91 Heavy Chain Variable Region <400> 182 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaga agctatgcta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtga tacttactac 180 aatgagaact tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagtccat 300 gataacggtt cctggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 183 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.91 Heavy Chain Variable Region <400> 183 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Asn Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 184 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.95 Light Chain Variable Region <400> 184 gacattgtgc tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtaggg atcgaaagaa ctatttggcc 120 tggtgccaac aaaaaccagg acagtctcct aaagtgatga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgg tcggtgccgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 185 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.95 Light Chain Variable Region <400> 185 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Asp Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Val Met Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Val Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 186 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.95 Heavy Chain Variable Region <400> 186 caggttcagg tgaagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agctatgcta taaactggct gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagagct tcaaaaacaa ggccacactg accacagaca agtcctccac cacagcctac 240 atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgcgc aagagtccat 300 gattacggtt cttggtttcc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 187 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> SC34.95 Heavy Chain Variable Region <400> 187 Gln Val Gln Val Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ser Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 188 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.2 Light Chain Variable Region <400> 188 gacatccaga tgactcagtc cccatcaagc ctctccgcca gtgtaggcga tagagtgact 60 attacctgct ctgcaagcca gggcatcaca aattatctca actggtacca gcagaagccc 120 ggaaaagcac ctaaacttct catctactat acaagccggc tccacagcgg cgtgccctcc 180 cgattctctg gtagcggatc cggtacagac ttcacactca caataagctc tctccagcct 240 gaggattttg ctacctacta ttgtcagcag tactctaagc tcccctggac ttttggacag 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 189 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.2 Light Chain Variable Region <400> 189 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 190 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.2 Heavy Chain Variable Region <400> 190 gaagttcagc ttgtacagag cggcgccgag gttaagaaac caggcgaatc cttgaagatc 60 tcctgcaaag gttccggata ctcatttaca gattactata ttaactgggt cagacagatg 120 cccggcaagg gtctggagtg gatgggttgg acctatccag ggagcggtcc aacaaagtat 180 aatggcaaat ttcggggcca ggttaccata tctgccgaca agagcatctc cacagcatat 240 ctccagtgga gctctctgaa agcatccgat acagctatgt actattgcgc tcggcgcgga 300 atctattact acgacggcat ctaccccaat tattttgact actggggcca gggtaccacc 360 gtcaccgtct cgagc 375 <210> 191 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.2 Heavy Chain Variable Region <400> 191 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Gly Pro Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ile Tyr Pro Asn Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 192 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.11 Light Chain Variable Region <400> 192 gatattcaaa tgacccagtc tccttctagt ttgtccgcta gtgtgggaga ccgagtcacc 60 atcacatgta agagcagtca aagtctgctg aacagccgta ccagaaaaaa ttatcttgct 120 tggtaccagc aaaaaccagg gaaagttcca aagctgctta tctactgggc ttctacccga 180 gaatccggag tgcccagtcg gttcagtggg tccggttcag gaacagattt caccctgaca 240 atctcttcac tgcagcctga ggatgtggct acctattact gtaaggagtc ctataacctc 300 tggaccttcg gaggtggcac caaagtcgag atcaag 336 <210> 193 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.11 Light Chain Variable Region <400> 193 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Glu 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 194 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.11 Heavy Chain Variable Region <400> 194 gaagtgcagc tcgtccagag tggcgctgaa gtcaaaaagc ctggggagag tttgaagatc 60 tcctgcaaag gcagcggcta tagcttcaca aactattgga tgatttgggt ccgccagatg 120 cccggcaagg gccttgagtg gatgggatat atcgatccaa ccactgatta caccgcatat 180 aaccagaagt tcaaagacca ggtaactatc tcagccgaca aaagtataag caccgcatat 240 cttcagtggt catcactgaa agcctccgac accgctatgt actattgcgc tcgtggaggc 300 aacgtggctc tcgacttttg ggggcagggg actctggtta ccgtctcgag c 351 <210> 195 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.11 Heavy Chain Variable Region <400> 195 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ile Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asn Val Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 196 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.14 Light Chain Variable Region <400> 196 gatatccaga tgactcagtc cccctcctct ctctctgcat ctgtcgggga cagggtgact 60 attacttgcc gcacctctga gcatatctac tcttaccttg cctggtacca gcaaaagcca 120 ggaaaagctc ctaagctgtt gatttataat gcaaagacac tggccgaagg agtgccctcc 180 aggtttagcg ggtccggatc tggtacagac tttaccctca ccatcagtag cctgcaaccc 240 gaggactttg ctacttacta ctgtcaacac cactatgata ccccatacac attcggccag 300 gggacaaaac tggagattaa a 321 <210> 197 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.14 Light Chain Variable Region <400> 197 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu His Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 198 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.14 Heavy Chain Variable Region <400> 198 caggtgcagc tcgttcagag cggggccgag gtgaaaaagc ctggcgcatc tgtcaaggtc 60 tcctgtaaag ccagtggata tacattcact gactattaca tgcattgggt ccgccaggct 120 ccaggccaga ggctggagtg gatgggccgt gtcaacccaa agaaaggtgg aactacctat 180 aatcagaagt tcgaaggccg ggtcacaatc accagagaca ctagtgccag cactgcatat 240 atggaactca gtagcctccg cagtgaggat accgctgtgt actattgtgc tatgggaatt 300 tactactcct atgacgcctc ctttgattac tggggacagg gaaccactgt gactgtgtcc 360 tcc 363 <210> 199 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.14 Heavy Chain Variable Region <400> 199 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Lys Lys Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Asp Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 200 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 Light Chain Variable Region <400> 200 gatattgtga tgacacagtc tcccgatagc cttgctgtta gtctcggaga acgtgccacc 60 attaactgca agtctagtca gagtttgttg tactctcgat accagaaaaa ttatgtggca 120 tggtaccagc agaagccagg ccagccacca aaactcctga tctactgggc ctcaaccagg 180 gaaagcggag tgccagatag attcagcggc agtgggtcag gtaccgattt cactctcaca 240 atcagctcac tgcaagctga ggatgtggca gtgtattatt gtcagcagta ctatcgctat 300 cccctgacct ttggacaggg cacaaagttg gaaatcaaa 339 <210> 201 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 Light Chain Variable Region <400> 201 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Tyr Gln Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 202 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 Heavy Chain Variable Region <400> 202 caagtacagt tggtgcagag cggggctgag gtgaaaaaac ccggcgctag cgtgaaggtt 60 agctgcaaag cctccggtta cacatttaca tcctacgcca tttcttgggt gcgccaggca 120 cctggccaac ggcttgagtg gatgggcgaa atctaccctg gttccggtga gacttattac 180 aatgaaaagt tcaagggacg cgtcactatc accagggaca ccagcgcaag caccgcttat 240 atggagctgt cctctcttag atctgaagac actgctgtct actactgtgc aagggtgaac 300 gactatggat cttggttccc ttattgggga cagggcaccc tggttacagt ctcttct 357 <210> 203 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 Heavy Chain Variable Region <400> 203 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Glu Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Asn Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 204 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 Light Chain Variable Region <400> 204 gaaatagtac tgacccagag ccccgctaca ctctccttga gccctggaga gcgggcaaca 60 ctctcctgca cagcatcttc cagcgtcaat tccttttacc tgcattggta ccagcagaaa 120 cctgggctgg ctccacgact cctcatttat tctacctcta atcttgctag cgggatcccc 180 gatcggtttt caggcagtgg tagcgggacc gacttcacct tgaccatttc ccggctggag 240 cctgaggact tcgctgtata ttactgccat caataccata gatctcccta taccttcggc 300 caggggacca aactggagat taag 324 <210> 205 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 Light Chain Variable Region <400> 205 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 206 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 Heavy Chain Variable Region <400> 206 caagtgcaac tggtgcagtc cggcgctgaa gtgaaaaaac ccggatcttc tgtgaaagtg 60 agctgtaaag catccggggg cacattcagc agctactgga tcgaatgggt gcgtcaggcc 120 cccggacagg gactggaatg gatgggtgaa atcttgcctg gttccggcaa tacttactac 180 aatgagcgct tcaaggatcg agtcaccatc accgctgatg agtcaacctc aactgcttac 240 atggagctgt cttccctgcg atctgaggac acagctgtat actactgtgc tagacgggca 300 gccgcttact attctaaccc agagtggttc gcttattggg gccaaggaac cctggtcaca 360 gtgagttct 369 <210> 207 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 Heavy Chain Variable Region <400> 207 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 208 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 Light Chain Variable Region <400> 208 gacgtcgtca tgacacagtc ccccctgagc ctccctgtga ctctgggtca gccagcttcc 60 atctcttgca aatctagcca gtccctcctg tatagtaacc gtcgcaccta tctgaactgg 120 tttcagcagc gcccaggcca aagtcccagg cggctcatct acctggtgtc taagttggat 180 agtggagttc ccgataggtt tagtggatcc ggttctggca ctgatttcac actgaagatt 240 agtagggtcg aggcagaaga tgtgggagtg tattactgtg tgcaggggac acattttcct 300 tttaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaag 336 <210> 209 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 Light Chain Variable Region <400> 209 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Arg Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 210 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 Heavy Chain Variable Region <400> 210 gaggtgcagc ttgtccaatc aggggccgaa gtcaagaaac ctggagaatc tctgaagata 60 tcttgtaagg gatccggtta ttccttcact tcctattaca tgtactgggt gagacagatg 120 ccaggcaaag gcttggaatg gatgggcgag atcaacccca gcaatggtgg ggccaacttc 180 aacgagagat tcaagaacca ggttactatc tccgcagaca agagcatatc aaccgcttac 240 cttcagtggt cttcccttaa ggcatccgac accgctatgt actactgcac ccgaggcctg 300 ctttattacg attatgatag aggttttgct tactggggac agggaacatt ggtcactgtg 360 tccagt 366 <210> 211 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 Heavy Chain Variable Region <400> 211 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Ala Asn Phe Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asn Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg 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9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 CDRL3 <400> 252 Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 253 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 CDRH1 <400> 253 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 254 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 CDRH2 <400> 254 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Glu Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 255 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.25 CDRH3 <400> 255 Val Asn Asp Tyr Gly Ser Trp Phe Pro Tyr 1 5 10 <210> 256 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRL1 <400> 256 Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Phe Tyr Leu His 1 5 10 <210> 257 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRL2 <400> 257 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 258 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRL3 <400> 258 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 259 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRH1 <400> 259 Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 260 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRH2 <400> 260 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 261 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.28 and hSC34.28ss1 CDRH3 <400> 261 Arg Ala Ala Ala Tyr Tyr Ser Asn Pro Glu Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 262 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRL1 <400> 262 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Arg Arg Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 263 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRL2 <400> 263 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 264 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRL3 <400> 264 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 265 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRH1 <400> 265 Ser Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 266 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRH2 <400> 266 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Ala Asn Phe Asn Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 267 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.38 CDRH3 <400> 267 Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 268 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRL1 <400> 268 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRL2 <400> 269 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 270 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRL3 <400> 270 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Trp Thr 1 5 <210> 271 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRH1 <400> 271 Ser Tyr Trp Met Leu 1 5 <210> 272 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRH2 <400> 272 Tyr Ile Asp Pro Arg Asn Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 273 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSC34.87 CDRH3 <400> 273 Gly Gly Asn Val Ala Met Asp Tyr 1 5

Claims (38)

  1. DPEP3을 발현하는 종양 개시 세포에 결합하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 내재화 항체인, 단리된 항체.
  3. DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 에피토프가 서열번호 3의 E217, R242, Q248, Q372, K375 및 E379로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함하는, 단리된 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 에피토프가 1) R242, Q248, Q372; (2) R242, Q248, K375 (3) R242, Q248, E379; (4) R242, Q372, K375; (5) R242, Q372, E379; (6) R242, K375, E379; (7) Q248, Q372, K375; (8) Q248, Q372, E379; (9) Q248, K375, E379; (10) Q372, K375, E379; (11) R242, Q248, Q372, K375; (12) R242, Q248, Q372, E379; (13) R242, Q248, K375, E379; (14) R242, Q372, K375, E379; (15) Q248, Q372, K375, E379; (16) R242, Q248, Q372, K375, E379; (17) E217, R242, Q248; (18) E217, R242, Q372; (19) E217, R242, K375; (20) E217, R242, E379; (21) E217, Q248, Q372; (22) E217, Q248, K375; (23) E217, Q248, E379; (24) E217, Q372, K375; (25) E217, K375, E379; (26) E217, Q372, E379; (27) E217, R242, Q248, Q372; (28) E217, R242, Q248, E379; (29) E217, Q248, Q372, K375; (30) E217, R242, Q372, K375; (31) E217, R242, Q248, K375; (32) E217, Q372, K375, E379; (33) E217, Q248, K375, E379, (34) E217, Q248, Q372, E379; (35) E217, R242, K375, E379; (36) E217, R242, Q372, E379; (37) E217, Q248, Q372, K375, E379; (38) E217, R242, Q372, K375, E379; (39) E217, R242, Q248, K375, E379; (40) E217, R242, Q248, Q372, E379; 또는 (41) E217, R242, Q248, Q372, K375를 포함하는, 단리된 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 에피토프가 E217, R242, Q248, Q372, K375, E379를 포함하는, 단리된 항체.
  6. DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 에피토프가 서열번호 3의 R46, R48, R54 및 S55로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함하는, 단리된 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 에피토프가 (1) R46, R48, R54; (2) R46, R48, S55; (3) R46, R54, S55; 또는 (4) R48, R54, S55를 포함하는, 단리된 항체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 에피토프가 R46, R48, R54, S55를 포함하는, 단리된 항체.
  9. DPEP3 단백질 내의 에피토프에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 에피토프가 서열번호 3의 Q248, S380, S384 및 V386으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 3개 이상의 잔기를 포함하는 단리된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 에피토프가 (1) S380, S384, V386; (2) S380, S384, Q248; (3) S380, V386, Q248; 또는 (4) S384, V386, Q248을 포함하는, 단리된 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 에피토프가 S380, S384, V386, Q248을 포함하는, 단리된 항체.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 개시 세포에 결합하는 단리된 항체.
  13. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 내재화 항체인, 단리된 항체.
  14. DPEP3에 특이적으로 결합하고,
    서열번호 21의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 23의 중쇄 가변영역(VH); 또는
    서열번호 25의 VL 및 서열번호 27의 VH; 또는
    서열번호 29의 VL 및 서열번호 31의 VH; 또는
    서열번호 33의 VL 및 서열번호 35의 VH; 또는
    서열번호 37의 VL 및 서열번호 39의 VH; 또는
    서열번호 41의 VL 및 서열번호 43의 VH; 또는
    서열번호 45의 VL 및 서열번호 47의 VH; 또는
    서열번호 49의 VL 및 서열번호 51의 VH; 또는
    서열번호 53의 VL 및 서열번호 55의 VH; 또는
    서열번호 57의 VL 및 서열번호 59의 VH; 또는
    서열번호 61의 VL 및 서열번호 63의 VH; 또는
    서열번호 65의 VL 및 서열번호 67의 VH; 또는
    서열번호 69의 VL 및 서열번호 71의 VH; 또는
    서열번호 73의 VL 및 서열번호 75의 VH; 또는
    서열번호 77의 VL 및 서열번호 79의 VH; 또는
    서열번호 81의 VL 및 서열번호 83의 VH; 또는
    서열번호 85의 VL 및 서열번호 87의 VH; 또는
    서열번호 89의 VL 및 서열번호 91의 VH; 또는
    서열번호 93의 VL 및 서열번호 95의 VH; 또는
    서열번호 97의 VL 및 서열번호 99의 VH; 또는
    서열번호 101의 VL 및 서열번호 103의 VH; 또는
    서열번호 105의 VL 및 서열번호 107의 VH; 또는
    서열번호 109의 VL 및 서열번호 111의 VH; 또는
    서열번호 113의 VL 및 서열번호 115의 VH; 또는
    서열번호 117의 VL 및 서열번호 119의 VH; 또는
    서열번호 121의 VL 및 서열번호 123의 VH; 또는
    서열번호 125의 VL 및 서열번호 127의 VH; 또는
    서열번호 129의 VL 및 서열번호 131의 VH; 또는
    서열번호 133의 VL 및 서열번호 135의 VH; 또는
    서열번호 137의 VL 및 서열번호 139의 VH; 또는
    서열번호 141의 VL 및 서열번호 143의 VH; 또는
    서열번호 145의 VL 및 서열번호 147의 VH; 또는
    서열번호 149의 VL 및 서열번호 151의 VH; 또는
    서열번호 153의 VL 및 서열번호 155의 VH; 또는
    서열번호 157의 VL 및 서열번호 159의 VH; 또는
    서열번호 161의 VL 및 서열번호 163의 VH; 또는
    서열번호 165의 VL 및 서열번호 167의 VH; 또는
    서열번호 169의 VL 및 서열번호 171의 VH; 또는
    서열번호 173의 VL 및 서열번호 175의 VH; 또는
    서열번호 177의 VL 및 서열번호 179의 VH; 또는
    서열번호 181의 VL 및 서열번호 183의 VH; 또는
    서열번호 185의 VL 및 서열번호 187의 VH를 포함하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단리된 항체가 키메라, CDR 이식된, 사람화 또는 재조합 항체 또는 이들의 단편인, 단리된 항체.
  16. 제14항에 있어서, 내재화 항체인, 단리된 항체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 단리된 항체가 VH 및 VL을 포함하는 사람화 항체이고, 여기서 VL이 서열번호 232의 CDRL1, 서열번호 233의 CDRL2 및 서열번호 234의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 238의 CDRL1, 서열번호 239의 CDRL2 및 서열번호 240의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 244의 CDRL1, 서열번호 245의 CDRL2 및 서열번호 246의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 250의 CDRL1, 서열번호 251의 CDRL2 및 서열번호 252의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 256의 CDRL1, 서열번호 257의 CDRL2 및 서열번호 258의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 262의 CDRL1, 서열번호 263의 CDRL2 및 서열번호 264의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖거나; VL이 서열번호 268의 CDRL1, 서열번호 269의 CDRL2 및 서열번호 270의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖는, 단리된 항체.
  18. 제14항에 있어서, 상기 단리된 항체가 VL 및 VH을 포함하는 사람화 항체이며, 여기서 VH가 서열번호 235의 CDRH1, 서열번호 236의 CDRH2 및 서열번호 237의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDR(CDRH)을 갖거나; VH가 서열번호 241의 CDRH1, 서열번호 242의 CDRH2 및 서열번호 243의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH가 서열번호 247의 CDRH1, 서열번호 248의 CDRH2 및 서열번호 249의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH가 서열번호 253의 CDRH1, 서열번호 254의 CDRH2 및 서열번호 255의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH가 서열번호 259의 CDRH1, 서열번호 260의 CDRH2 및 서열번호 261의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH가 서열번호 265의 CDRH1, 서열번호 266의 CDRH2 및 서열번호 267의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖거나; VH가 서열번호 271의 CDRH1, 서열번호 272의 CDRH2 및 서열번호 273의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는, 단리된 항체.
  19. 제14항에 있어서, 상기 단리된 항체가, VL 및 VH를 포함하는 사람화 항체로서, VL이 서열번호 232의 CDRL1, 서열번호 233의 CDRL2 및 서열번호 234의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 235의 CDRH1, 서열번호 236의 CDRH2 및 서열번호 237의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 사람화 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 238의 CDRL1, 서열번호 239의 CDRL2 및 서열번호 240의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 241의 CDRH1, 서열번호 242의 CDRH2 및 서열번호 243의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH을 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 244의 CDRL1, 서열번호 245의 CDRL2 및 서열번호 246의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 247의 CDRH1, 서열번호 248의 CDRH2 및 서열번호 249의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 250의 CDRL1, 서열번호 251의 CDRL2 및 서열번호 252의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 253의 CDRH1, 서열번호 254의 CDRH2 및 서열번호 255의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 256의 CDRL1, 서열번호 257의 CDRL2 및 서열번호 258의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 259의 CDRH1, 서열번호 260의 CDRH2 및 서열번호 261의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 262의 CDRL1, 서열번호 263의 CDRL2 및 서열번호 264의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 265의 CDRH1, 서열번호 266의 CDRH2 및 서열번호 267의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체; 또는 VL 및 VH를 포함하는 항체로서, VL이 서열번호 268의 CDRL1, 서열번호 269의 CDRL2 및 서열번호 270의 CDRL3을 포함하는 3개의 CDRL을 갖고 VH가 서열번호 271의 CDRH1, 서열번호 272의 CDRH2 및 서열번호 273의 CDRH3을 포함하는 3개의 CDRH를 갖는 항체인, 단리된 항체.
  20. 서열번호 216으로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 217로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 218로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 219로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 220으로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 221로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 222로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 223으로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 224로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 225로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 224로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 226으로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 227로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 228로서 제시된 전체길이 중쇄; 또는 서열번호 229로서 제시된 전체길이 경쇄 및 서열번호 230으로서 제시된 전체길이 중쇄를 포함하는, DPEP3에 결합하는 사람화 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 페이로드(payloads)에 접합되는, 항체.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
  23. 제22항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  24. 제22항에 따른 핵산 또는 제23항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 식 Ab-[L-D]n의 ADC로서,
    a) Ab가 항-DPEP3 항체를 포함하고;
    b) L이 임의의 링커를 포함하고;
    c) D가 약물을 포함하고;
    d) n이 약 1 내지 약 20의 정수인, ADC 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
  26. 제25항에 있어서, D가 피롤로벤조디아제핀(PBD)인, ADC.
  27. 제25항에 있어서, Ab가 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체인, ADC.
  28. 세포를 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 ADC와 접촉시킴을 포함하는, 세포독소를 세포로 전달하는 방법.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 따른 약제학적 조성물을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 암의 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 암이 난소암, 폐암, 유방암 및 자궁내막암으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암이 난소암인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 암이 장액성 난소 암종(ovarian-serous carcinoma)인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 암이 유두상 장액성 난소 암종(ovarian-papillary serous carcinoma)인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료학적 모이어티(therapeutic moiety)를 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  36. 종양 개시 세포 및 종양 개시 세포 이외의 종양 세포를 포함하는 종양 세포 집단을 항-DPEP3 ADC와 접촉시키고; 이에 의해 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킴을 포함하여, 종양 세포 집단에서 종양 개시 세포를 감소시키는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 수행되는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 접촉이 시험관내에서 수행되는, 방법.
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