KR20160045145A - 망막 조직 및 망막 관련 세포의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기를 포함하는 망막 선구 세포의 제조 방법을 제공한다:
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정, 및
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정을 포함하는, 망막 선구 세포의 제조 방법.
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정, 및
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정을 포함하는, 망막 선구 세포의 제조 방법.
Description
본 발명은 망막 조직, 및 망막 선구 세포 및 망막층-특이적 신경세포 등의 망막 관련 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포로부터 3차원의 망막 조직을 제조하는 방법으로서, 균일한 다능성 줄기세포의 응집체를 무혈청 배지에서 형성시켜, 이것을 기저막 제조물의 존재 하에 부유 배양한 후, 기관 배양 배지에서 부유 배양함으로써, 다층의 망막 조직을 얻는 방법 (비특허문헌 1 및 특허문헌 1), 및 균일한 다능성 줄기 세포의 응집체를 Wnt 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지에서 형성시켜, 이것을 기저막 제조물의 존재 하에 부유 배양한 후, 혈청-함유 배지에서 부유 배양함으로써, 다층의 망막 조직을 얻는 방법 (비특허문헌 2 및 특허문헌 2)이 나타나 있다.
[문헌 목록]
특허문헌
특허문헌 1 : 국제 공개 제 2011/055855 호
특허문헌 2 : 국제 공개 제 2013/077425 호
비특허문헌
비특허문헌 1 : Nature, 472, 51-56 (2011)
비특허문헌 2 : Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012)
다능성 줄기 세포로부터 망막 조직을 제조하는 방법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명은, 망막 조직, 그리고 망막 선구 세포 및 망막층-특이적 신경 세포등의 망막 관련 세포를 다능성 줄기 세포로부터 제조하는 방법 등을 제공한다.
즉, 본 발명은,
[1]
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정, 및
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정을 포함하는, 망막 선구 세포의 제조 방법 (이하, 본 발명의 제조 방법 1 로 지시되기도 함);
[2]
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 수득하는 제 3 공정을 포함하는, 망막 조직의 제조 방법 (이하, 본 발명의 제조 방법 2 로 지시되기도 함);
[3]
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포가 출현할 때까지 부유 배양해, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 수득하는 제 3 공정을 포함하는, 망막층-특이적 신경세포의 제조 방법 (이하, 본 발명의 제조 방법 3으로 적는 일도 있다.);
[4] 상기 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법;
[5] 상기 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법;
[6] 상기 공정 (1) 및 공정 (2) 이, 혈청 대체물 존재하에서 행해지는 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 방법;
[7] 부유 배양이, 기저막 제조물 부재 하에서 행해지는 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 방법;
[8] 상기 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 단백질인 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 방법;
[9] 상기 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이, 공정 (1) 의 부유 배양 개시부터 1 일째부터 15 일째까지의 사이에 배지에 첨가되는 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 방법;
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 포함하는, 독성 또는 약효 평가용 시약;
[11] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포에 피검물질을 접촉시켜, 그 물질이 그 세포 또는 그 조직에 미치는 영향을 조사하는 것을 포함하는, 그 물질의 독성 또는 약효 평가 방법;
[12] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 포함하는, 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료제;
[13] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는, 유효량의 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를, 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료 방법; 및
[14] 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료에서 사용되기 위한, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포;
등을 제공한다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 고효율로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 기저막 제조물을 배지에 첨가하는 일 없이, 즉 기저막 제조물 부재하에 응집체를 부유 배양해, 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 얻을 수 있기 때문에, 얻어진 세포 또는 조직이 이종 유래 성분으로의 오염 리스크가 저감된다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가나 이식 치료 등을 목적으로 해, 망막 조직, 또는 망막 선구 세포 혹은 망막층-특이적 신경세포 등의 망막 관련 세포를 효율적으로 제공하는 것이 가능해진다.
도 1 은, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하지 않고 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 (knock-in) 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명 시야 이미지 (A) 와 형광 이미지 (B), 부유 배양 개시 3 일째에 BMP2 가 100 ng/ml 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명 시야 이미지 (C) 과 형광 이미지 (D), 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명 시야 이미지 (E) 과 형광 이미지 (F), 부유 배양 개시 3 일째에 BMP7 가 100 ng/ml 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명 시야 이미지 (G) 와 형광 이미지 (H), 및 부유 배양 개시 3 일째에 GDF7 가 100 ng/ml 이 되도록 보충된 배지에서 dRAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 18 일째의 명 시야 이미지 (I) 과 형광 이미지 (J) 을 나타낸다.
도 2 는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하지 않고 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (A), 형광 이미지 (B) 및 FACS 막대그래프 (C), 부유 배양 개시 (0 일째) 와 동시에, BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (D), 형광 이미지 (E) 및 FACS 막대그래프 (F), 부유 배양 개시 1 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (G), 형광 이미지 (H) 및 FACS 막대그래프 (I), 부유 배양 개시 2 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (J), 형광 이미지 (K) 및 FACS 막대그래프 (L), 및 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (M), 형광 이미지 (N) 및 FACS 막대그래프 (O) 이다.
도 3 은, BMP4 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하지 않고 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (A) 와 형광 이미지 (B), 부유 배양 개시 6 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (C) 과 형광 이미지 (D), 부유 배양 개시 9 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX:: GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (E)과 형광 이미지 (F), 부유 배양 개시 12 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (G) 와 형광 이미지 (H), 및 부유 배양 개시 15 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 dRAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (I) 와 형광 이미지 (J) 를 나타낸다.
도 4 는 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 26 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, GFP 형광 이미지 (A), 항-Chx10 항체를 사용한 형광 면역 염색 이미지 (B) 및 Hoechst (호크스트) 염색 이미지 (C) 을 나타낸다.
도 5 는 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 117 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, 항-레코베린 (Recoverin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (A), 항-Nrl 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (B), 항-RXR-감마 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (C), 항-Chx10 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (D), 항-칼레티닌 (Calretinin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (E), 및, 항-칼빈딘 (Calbindin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (F) 를 나타낸다.
도 6 은, 부유 배양 개시 6 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 50 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, 항-Chx10 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (A), 항Pax6 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (B), 항-Crx 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (C), 및, 항-Brn3b 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (D) 를 나타낸다.
도 2 는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하지 않고 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (A), 형광 이미지 (B) 및 FACS 막대그래프 (C), 부유 배양 개시 (0 일째) 와 동시에, BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (D), 형광 이미지 (E) 및 FACS 막대그래프 (F), 부유 배양 개시 1 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (G), 형광 이미지 (H) 및 FACS 막대그래프 (I), 부유 배양 개시 2 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (J), 형광 이미지 (K) 및 FACS 막대그래프 (L), 및 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 26 일째의 명 시야 이미지 (M), 형광 이미지 (N) 및 FACS 막대그래프 (O) 이다.
도 3 은, BMP4 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하지 않고 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (A) 와 형광 이미지 (B), 부유 배양 개시 6 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (C) 과 형광 이미지 (D), 부유 배양 개시 9 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX:: GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (E)과 형광 이미지 (F), 부유 배양 개시 12 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (G) 와 형광 이미지 (H), 및 부유 배양 개시 15 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 dRAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 부유 배양 개시 24 일째의 명 시야 이미지 (I) 와 형광 이미지 (J) 를 나타낸다.
도 4 는 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 26 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, GFP 형광 이미지 (A), 항-Chx10 항체를 사용한 형광 면역 염색 이미지 (B) 및 Hoechst (호크스트) 염색 이미지 (C) 을 나타낸다.
도 5 는 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 117 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, 항-레코베린 (Recoverin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (A), 항-Nrl 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (B), 항-RXR-감마 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (C), 항-Chx10 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (D), 항-칼레티닌 (Calretinin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (E), 및, 항-칼빈딘 (Calbindin) 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (F) 를 나타낸다.
도 6 은, 부유 배양 개시 6 일째에 BMP4 가 1.5 nM 이 되도록 보충된 배지에서 부유 배양 개시 50 일째까지 부유 배양한 RAX::GFP 노크-인 인간 배아 줄기 세포 유래 응집체의 동결 절편의, 항-Chx10 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (A), 항Pax6 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (B), 항-Crx 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (C), 및, 항-Brn3b 항체를 사용한 면역 염색 이미지 (D) 를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(들)에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서의 "벡터"란, 목적의 폴리뉴클레오티드 서열을 목적의 세포로 이입시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 이와 같은 벡터로서는, 예를 들어, 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충 세포, 동물 개체 또는 식물 개체 등의 숙주 세포에 있어서 자율 복제가 가능한 벡터, 숙주 세포의 염색체 중에 혼입될 수 있는 벡터, 및 폴리뉴클레오티드의 전사에 적절한 위치에 프로모터를 함유하고 있는 벡터 등을 들 수가 있다.
이와 같은 벡터 가운데, 클로닝에 적절한 벡터를 "클로닝 벡터"라고 때때로 지시된다. 클로닝 벡터로서는, 통상, 제한 효소 부위를 복수 포함하는 다양한 클로닝 부위를 포함하는 벡터를 들 수가 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning (3rd edition)" by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)) 에 기재된 벡터를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "벡터"는, "발현 벡터"및 "리포터 벡터"도 포함한다. "발현 벡터"에는, 구조 유전자 및 그 발현을 조절하는 프로모터에 가세해, 여러 가지의 조절 요소가 숙주 세포 안에서 작동할 수 있는 상태로 연결될 수 있다. "리포터 벡터"에는, 리포터 유전자 및 그 발현을 조절하는 프로모터에 가세해, 여러 가지의 조절 요소가 숙주 세포 안에서 작동할 수 있는 상태로 연결될 수 있다. "조절 요소"로서는, 예를 들어, 터미네이터, 및 인핸서를 들 수가 있다. "발현 벡터"및 "리포터 벡터"에는, 추가로 약제 내성 유전자와 같은 선택 마커 유전자가 포함될 수 있다.
"클로닝 벡터"로서는, 예를 들어, (a) 게놈 라이브러리의 구축을 위한, 파아지 벡터인 lambda FIX 벡터, (b) cDNA 라이브러리의 구축을 위한 파아지 벡터인 lambda ZAP 벡터 및 (c) 게놈 DNA를 클로닝 하기 위한, pBluescript II SK＋/-, pGEM, 및 pCR2.1 벡터 등의 플라스미드 벡터를 들 수 있다. "발현 벡터"로서는, 예를 들어, pSV2/neo 벡터, pcDNA 벡터, pUC18 벡터, pUC19 벡터, pRc/RSV 벡터, pLenti6/V5-Dest 벡터, pAd/CMV/V5-DEST 벡터, pDON-AI-2/neo 벡터, 및 pMEI-5/neo 벡터 등의 플라스미드 벡터를 들 수 있다. "리포터 벡터"로서는, 예를 들어, pGL2 벡터, pGL3 벡터, pGL4.10 벡터, pGL4.11 벡터, pGL4.12 벡터, pGL4.70 벡터, pGL4.71 벡터, pGL4.72 벡터, pSLG 벡터, pSLO 벡터, pSLR 벡터, pEGFP 벡터, pAcGFP 벡터, 및 pDsRed 벡터를 들 수 있다. 이와 같은 벡터는, 전술한 Molecular Cloning 문헌을 참고로 해 적절히 이용될 수 있다.
핵산 분자를 세포 내에 도입하는 기술로서는, 예를 들어, 형질 전환, 형질 도입, 트랜스펙션 등을 들 수 있다. 이와 같은 도입 기술로서는, 예를 들어, Ausubel F.A. ed. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J. et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Ed. and 3rd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook J. et al (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 또는 별책 실험 의학 "transgene % expression analysis experiment method" YODOSHA CO., LTD., 1997; 등에 기재되는 방법을 구체적으로 들 수 있다. 유전자가 세포 내에 도입된 것을 확인하는 기술로서는, 예를 들어, 노던 블롯 분석 또는 웨스턴 블롯 분석을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "부유 배양"이란, 세포 또는 세포 덩어리를 세포 배양기 (vessel) 재료 등에 접착시키지 않는 조건으로 배양하는 것을 말한다.
부유 배양을 실시할 때에 사용되는 세포 배양기는, "부유 배양"이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 당업자이면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 이와 같은 배양기로서는, 예를 들어, 플라스크, 조직배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포아 (micropore), 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 또는 롤러 보틀을 들 수 있다. 이들의 배양기는, 부유 배양을 가능하게 하는 위해, 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이, 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리) 되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 제조할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지,αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, Ham 배지, RPMI 1640 배지, Fischer 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "무혈청 배지"란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 을 함유하는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청이 그 안에 함유되어 있지 않는 한 무혈청 배지인 것으로 고려된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3＇티올글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 된다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KnockoutTM Serum Replacement (Invitrogen 사제： 이하, KSR 라고 지시되기도 함), 화학적 정의된 농축액 (Gibco 사제), GlutamaxTM (Gibco 사제)를 들 수 있다.
부유 배양으로 사용하는 무혈청 배지는, 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수 있다.
제조의 번잡함을 회피하기 위해서, 이러한 무혈청 배지로서 시판되는 KSR 를 적당량 (예를 들어, 약 1% 로부터 약 20%) 보충한 무혈청 배지 (예를 들어, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR 및 450μM 1-모노티오글리세롤을 첨가한 배지) 를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "혈청-함유 배지"란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 당해 배지는, 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "기저막 제조물"이란, 그 위에 기저막을 형성할 수 있는 원하는 세포를 파종해 배양했을 경우에, 표피 세포의 것과 유사한 세포 형태, 분화, 성장, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 여기서, "기저막 구성 성분"이란, 동물의 조직에 있어서, 표피 세포층과 사이질 세포 층 등과의 사이에 존재하는 얇은 막 형태를 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 제조물은, 예를 들어 기저막을 통해 지지체 상에 접착하고 있는 기저막 형성 가능 세포를, 그 세포의 지질 용해 가능 용액이나 알칼리 용액 등을 사용하여 제거하는 것으로 제조할 수 있다. 바람직한 기저막 제조물의 예는, 기저막 성분으로서 시판되고 있는 제품 (예를 들어, MatrigelTM Beckton Dickinson 사제：이하, Matrigel 이라고 지칭되기도 함) 이나, 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어, 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 엔타크틴 등) 를 포함한다.
MatrigelTM 는, Engelbreth Holm Swarm (EHS) 마우스 육종으로부터 유래된 기저막 추출의 제품이다. MatrigelTM 의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 및 엔타크틴이다. 이들에 가세해 TGF-β, 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 EHS 종양이 자연스럽게 생성되는 성장 인자가 포함된다. MatrigelTM 의 "성장 인자 저감 제품" 은, 통상적인 MatrigelTM 보다 증식 인자의 농도가 낮고, 그 표준적인 농도는 EGF가 ＜0.5 ng/ml, NGF가 ＜0.2 ng/ml, PDGF가 ＜5 pg/ml, IGF-1 이 5 ng/ml, TGF-β가 1.7 ng/ml 이다.
본 발명에 있어서, "물질 X 를 포함하는 배지"란, 외인성(exogeneous)의 물질 X 가 보충된 배지 또는 외인성의 물질 X 를 함유하는 배지를 의미하고, "물질 X를 포함하지 않는 배지" 란, 외인성의 물질 X 가 보충되어 있지 않은 배지 또는 외인성의 물질 X 를 함유하지 않는 배지를 의미한다. 여기서, "외인성의 물질 X"란, 그 배지로 배양되는 세포 또는 조직에 있어 외래의 물질 X 를 의미하고, 그 세포 또는 조직에 의해 생성된 내재성 (endogenous) 의 물질 X 는 이것에 포함되지 않는다.
예를 들어, "BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지" 란, 외인성의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충된 배지 또는 외인성의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하는 배지이다. "소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 배지" 란, 외인성의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되어 있지 않은 배지 또는 외인성의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지이다.
본 발명에 있어서의 "영장류"란, 영장류에 속하는 포유 동물을 의미한다. 영장류로서는, 여우원숭이 (lemur), 로리스원숭이 (loris) 및 트바이 (Tsubai) 등의 원원아목과 원숭이, 및 직비원류, 예컨대 원숭이, 유인원, 및 인간을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "줄기 세포"란, 세포 분열을 거쳐도 동일한 분화능을 유지하는 세포로, 조직이 손상되었을 때에 그 조직의 재생에 기여할 수 있다. 여기서, 줄기 세포로서는, 배아 줄기 세포 (이하, ES 세포라고 지칭되는 일도 있음) 혹은 조직 줄기 세포 (조직성 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 불림), 또는 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포：induced pluripotent stem cell)를 들 수 있다. 상기의 줄기 세포 유래의 조직 세포가 조직을 재생할 수 있다는 점에서 알 수 있듯이, 상기 줄기 세포는 생체에 가까운 정상적인 세포로 분화할 수 있는 것이 알려져 있다.
줄기 세포는, 소정의 기관으로부터 입수할 수 있거나, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, Kyoto University's Institute for Frontier Medical Sciences 로부터 입수 가능하다. 모두 마우스 배아 줄기 세포인, EB5 세포는 RIKEN 으로부터, D3 세포주는 ATCC 로부터 입수 가능하다.
줄기 세포는, 자체 공지된 방법에 의해 배양 유지될 수 있다. 예를 들어, 인간 줄기 세포는, KnockoutTM Serum Replacement (Invitrogen) 가 보충된 배지에서 배양함으로써 유지할 수 있다. 마우스 줄기 세포는, 소 태아 혈청 (FCS) 및 Leukemia Inhibitory Factor (LIF) 를 첨가하고 피더 세포 (feeder cell) 부재 하에 배양함으로써 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "다능성 줄기 세포"란, 시험관 내 (in vitro) 에 있어서 배양하는 것이 가능해, 또한, 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 세포 (3 배엽(밖배엽, 중배엽, 내배엽) 유래의 조직) 로 분화할 수 있는 능력 (다능성 (pluripotency)) 을 갖는 줄기 세포를 지칭하며, 배아 줄기 세포 (ES세포) 도 "다능성 줄기 세포"에 포함된다. "다능성 줄기 세포"는, 수정란, 클론배, 생식 줄기 세포 및 조직내 줄기 세포로부터 얻어진다. 체세포에 여러 종류의 유전자를 도입함으로써, 배아 줄기 세포를 닮은 분화 다능성을 인공적으로 갖게 한 세포 (인공 다능성 줄기 세포라고도 불린다)도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 다능성 줄기 세포는, 자체 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 제작 방법의 예로서는, [Cell, 2007, 131(5) pp. 861-872] 및 [Cell, 2006, 126(4) pp. 663-676] 에 기재된 방법이 포함된다.
본 발명에 있어서의 "배아 줄기 세포 (ES 세포)"란, 자기 복제 능력 및 다분화능 (특히 "다능성") 을 갖는 줄기 세포로 지칭되며, 이는 초기 배아에서 유래하는 다능성 줄기 세포이다. 배아 줄기 세포는, 1981 년에 처음으로 수립되어 1989년 이후 녹아웃 마우스 생산에 응용되어 왔다. 1998 년에는 인간 배아 줄기 세포가 수립 되었고, 재생 의학에도 이용되고 있다.
본 발명에 있어서의 "인공 다능성 줄기 세포"란, 섬유아세포 등의 분화한 세포를, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc 등의 여러 종류의 유전자의 발현에 의해 직접 재프로그래밍 (reprogramming) 함으로써 다분화능을 갖도록 유도된 세포를 지칭하며, 이는 Yamanaka et al. 에 의해 2006 년에 마우스 세포에서 수립되었다 (Cell. 2006, 126(4), pp. 663-676). 2007년에 유도된 다능성 줄기 세포는 인간 섬유아세포에서도 수립되어 배아 줄기 세포와 마찬가지로 다분화능을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5) pp. 861-872; Science, 2007, 318(5858) pp. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp. 101-106).
유전자 개질된 다능성 줄기 세포는, 예를 들어, 상동성 재조합 기술을 사용하는 것에 따라 제작할 수 있다. 개질되는 염색체 상의 유전자의 예는 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자, 신경계 세포의 장애에 근거하는 질환 관련 유전자 등이 포함된다. 염색체 상의 표적 유전자는, [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Bio Manual series 8, gene targeting, Production of mutant mouse by using ES cells, YODOSHA CO., LTD. (1995)] 등에 기재된 방법에 의해 개질될 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 개질하는 표적 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자, 질환 관련 유전자 등)의 게놈 유전자를 단리 해, 단리된 게놈 유전자를 사용하여 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터를 제작한다. 제작된 표적 벡터를 줄기 세포에 도입해, 표적 유전자와 표적 벡터 사이에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 염색체 상의 유전자가 개질된 줄기 세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 단리 하는 방법으로서는, [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 등에 기재된 공지된 방법이 들 수 있다. 나아가, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사제), Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH 사제)등을 사용하는 것에 따라, 표적 유전자의 게놈 유전자를 단리 할 수도 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은, [Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Bio Manual series 8, gene targeting, Production of mutant mouse by using ES cells, YODOSHA CO., LTD. (1995)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 표적 벡터는, 대체물 형태 및 삽입 유형 중 임의의 것일 수 있고, 선별 방법으로서는, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 또는 폴리 A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다.
선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화 방법, PCR법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "응집체"란, 배지 안에 분산하고 있던 세포가 집합해 형성한 덩어리를 말한다. 본 발명에 있어서의 "응집체"에는, 부유 배양 개시시에 분산하고 있던 세포가 형성한 응집체와 부유 배양 개시시에 이미 형성되고 있던 응집체가 포함된다.
"응집체를 형성시킨다"란, 세포를 집합시켜 세포의 응집체를 형성시키고 부유 배양할 때에, "일정수의 분산한 세포를 신속히 응집"시킴으로써 질적으로 균일한 세포의 응집체를 형성시키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서는, 다능성 줄기 세포를 신속히 집합시켜 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키면, 형성된 응집체로부터 분화 유도되는 세포에 있어서 표피-유사 구조가 양호한 재현성으로 형성될 수 있다.
응집체를 형성시키는 실험적인 조작으로서는, 예를 들어, 작은 웰을 갖는 플레이트 (96 웰 플레이트), 마이크로포어 등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 원심하는 것으로 세포를 응집시키는 방법을 들 수 있다.
다능성 줄기 세포의 응집체가 형성된 일이나, 응집체를 형성하는 각 세포에 있어서 표피-유사 구조가 형성된 것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체 간의 재현성 등에 기초를 두어 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 "조직"이란, 형태나 성질이 상이한 하나 초과의 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치된 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 지칭한다.
본 발명에 있어서의 "망막 조직"이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 이들의 선구 세포, 또는 망막 선구 세포 등의 세포가, 적어도 2 종 이상의 종류, 층상에서 입체적으로 배열된 망막 조직을 의미한다. 각각의 세포에 있어, 어느 세포가 어느 망막 층을 구성하는 세포인지에 대해서는 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 혹은 그 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "망막층"이란, 망막을 구성하는 각층을 의미한다. 구체적인 예에는, 망막 색소 표피층, 시세포층, 외부 경계막, 외부 과립 층, 외부 망상층, 내부 과립 층, 내부 망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내부 경계막을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "망막층-특이적 신경세포"란, 망막층을 구성하는 세포 로서 망막층에 특이적인 신경 세포를 의미한다. 망막층-특이적 신경세포로서는, 쌍극세포, 마디 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 시세포, 색소 표피 세포, 간체 세포 및 뿔꼴 세포를 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "망막 선구 세포"란, 시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 및 망막 색소 표피 세포 중 임의의 성숙 망막 세포로 분화할 수 있는 선구 세포를 말한다.
시세포 선구 세포, 수평 세포 선구 세포, 쌍극 선구 세포, 아마크린 세포 선구 세포, 망막절 세포 선구 세포, 망막 색소 표피 선구 세포란, 각각, 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 망막 색소 표피 세포로 분화되도록 결정된 선구 세포를 말한다.
망막 세포 마커로서는, 망막 선구 세포에서 발현하는 Rax 및 PAX6, 시상하부 뉴런의 선구 세포에서는 발현하지만 망막 선구 세포에서는 발현하지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경 표피로 발현해 망막에서는 발현하지 않는 Sox1, 시세포의 선구 세포로 발현하는 Crx 등을 들 수 있다. 망막층-특이적 신경세포의 마커로서는, 쌍극 세포에서 발현하는 Chx10 및 L7, 망막절 세포에서 발현하는 Tuj1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌, 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘, 시세포에서 발현하는 로돕신 (Rhodopsin) 및 레코베린, 색소 표피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 간체 세포에서 발현하는 Nrl, 뿔꼴 세포에서 발현하는 Rxr-gamma 등을 들 수 있다.
본 발명 제조 방법 1 은, 하기 공정 (1) 및 (2) 을 포함하는 망막 선구 세포의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정, 및
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정.
다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 공정 (1) 에 대해 설명한다.
공정 (1) 에 있어서 사용되는 무혈청 배지는, 상기 서술한 바와 같은 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 저해 물질 중 어느 것도 보충되지 않은 무혈청 배지를 사용할 수 있다. 제조의 번잡함을 회피하려면, 예를 들어, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 보충한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12의 1：1의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적 정의된 농축액 (Chemically Defined Lipid Concentrate) 이 첨가된 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR 의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
공정 (1) 에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
공정 (1) 에 있어서의 다능성 줄기 세포의 농도는, 다능성 줄기 세포의 응집체를 보다 균일하게 효율적으로 형성시키도록 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어 96 웰 마이크로웰 플레이트를 사용하여 인간 ES 세포를 부유 배양하는 경우, 웰 당 약 1×103 내지 약 5×105 세포, 바람직하게는 약 3×103 내지 약 5×104 세포, 보다 바람직하게는 약 5×103 내지 약 3×104 세포, 가장 바람직하게는 약 1.2×104 세포가 되도록 제조한 액체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치해 응집체를 형성시킨다.
응집체를 형성시키기 위해 필요한 부유 배양의 시간은, 세포를 균일하게 응집시키도록, 사용하는 다능성 줄기 세포에 의해 적절히 결정될 수 있다. 균일한 응집체를 형성하기 위해서는 할 수 있는 한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES 세포의 경우에는, 바람직하게는 약 24 시간 이내, 보다 바람직하게는 약 12 시간 이내에 응집체를 형성시킨다. 이 응집체 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 용구, 원심 조건 등을 조정함으로써 적절히 조절하는 것이 가능하다.
다능성 줄기 세포의 응집체가 형성되는지 여부는 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체 간의 재현성 등에 기초를 두어 판단하는 것이 가능하다.
공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 공정 (2) 에 대해 설명한다.
공정 (2) 에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충된 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지이며, 기저막 제조물을 첨가할 필요는 없다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 서술한 바와 같은 한 특별히 한정되지 않는다. 제조의 번잡함을 회피하려면, 예를 들어, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 보충한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1：1 의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적 정의된 농축액이 첨가된 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR 의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
공정 (2) 에서 사용되는 무혈청 배지는 공정 (1) 에서 사용한 무혈청 배지가 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 이상 당해 배지를 그대로 사용할 수도 있거나, 또는 새로운 무혈청 배지로 대체될 수도 있다. 공정 (1) 에서 사용한, BMP 시그널 전달 경로 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지를 그대로 공정 (2) 에 사용하는 경우, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하기만 하면 된다.
소닉 헤지호그 (이하, Shh 로 지시되기도 함) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, 또는 SAG 등을 들 수 있다.
"소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질"을 포함하지 않는 배지에는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 선구 세포 및 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지도 포함된다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP 에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강 할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체, BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R&D Systems 로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 로부터 입수 가능하다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도면 된다. 예를 들어 BMP4 의 경우에는, 약 0.01 nM 내지 약 1 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 로부터 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1.5 nM 의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (1) 의 부유 배양 개시부터 약 24시간 후 이후에 첨가되고 있으면 되고, 부유 배양 개시 후 며칠 이내 (예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 후 1 일째부터 15 일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1 일째부터 9 일째까지의 사이, 가장 바람직하게는 3 일째에 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되어 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포에 대한 분화 유도가 개시된 후는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가할 필요는 없고, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지를 사용하여 배지 교환을 실시하게 되고, 이로써, 배지에 걸리는 경비를 억제할 수 있다. 망막세포로의 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어, 당해 세포에 있어서의 Rax 유전자의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. GFP 등의 형광 리포터 단백질 유전자가 Rax 유전자 자리에 노크-인된 다능성 줄기 세포를 사용하여 공정 (1) 에 의해 형성된 응집체를, 망막세포에 대한 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 부유 배양해, 발현한 형광 리포터 단백질로부터 방출된 형광을 검출함으로써, 망막세포로의 분화 유도가 개시되었던 시기를 확인할 수도 있다. 공정 (2) 의 실시양태의 하나는, 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, Rax 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하고 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 공정이다.
공정 (2) 에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃으로부터 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻을 수 있었던 것은, 예를 들어, 망막 선구 세포의 마커인 Rax 또는 PAX6 를 발현하는 세포가 응집체에 포함되어 있는 것을 검출함으로써 확인할 수 있다.
얻어진 망막 선구 세포를 포함하는 수득된 응집체는, 그대로 독성 또는 약효 평가용 시약으로서 사용해도 된다. 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 해, 얻어진 세포를 FACS 를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막 선구 세포를 얻는 일도 가능하다.
본 발명 제조 방법 2 는, 하기 공정 (1), (2) 및 (3) 을 포함하는 망막 조직의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 얻는 제 3 공정.
본 발명 제조 방법 2 의 공정 (1) 및 공정 (2) 은, 본 발명 제조 방법 1 의 공정 (1) 및 공정 (2) 와 마찬가지로 실시할 수 있다.
공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 얻는 공정 (3) 에 대해 설명한다.
공정 (3) 에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 임의의 것이 보충되지 않은 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지이다.
"소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함되지 않는" 배지에는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 임의의 것도 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지도 포함된다.
"소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 보충되어 있지 않는" 배지에는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 모두가 실질적으로 보충되어 있지 않은 배지, 예를 들어, 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 배지도 포함된다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 제조의 번잡함을 회피하려면, 예를 들어, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1：1 의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적 정의된 농축액을 첨가한 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR 의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질이란, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강 할 수 있는 물질이다. Wnt 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Wnt 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, 켄파울론) 등을 들 수 있다.
공정 (3) 에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O2 농도는, 약 18% 이상, 예를 들어 약 20% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 60%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 약 50% 이다.
공정 (3) 의 배양 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 48 시간 이상이며, 바람직하게는 7 일 이상이다.
이와 같이 하여 부유 배양된 응집체에 있어서, 망막 조직은 응집체의 표면을 덮도록 존재한다. 부유 배양 종료 후, 응집체를 파라포름알데히드 용액 등의 고정액을 사용하여 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 층 구조를 갖는 망막 조직이 형성되어 있는 일을 면역 염색법 등에 의해 확인하면 된다. 망막 조직의 각층은 상이한 망막 선구 세포 (시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포) 로 이루어지므로, 이들의 세포에 발현하고 있는 마커에 대한 항체를 사용하여, 면역 염색법에 의해, 층 구조가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
응집체의 표면에 존재하는 망막 조직을 핀셋 등을 사용하여, 응집체로부터 물리적으로 자르는 일도 가능하다. 이 경우, 각 응집체의 표면에는, 망막 조직 이외의 신경 조직이 형성되는 경우도 있기 때문에, 응집체로부터 자른 신경 조직의 일부를 잘라내, 후술의 면역 염색법 등에 의해 확인함으로써, 그 조직이 망막 조직인 것을 확인할 수 있다.
망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체에서는, 예를 들어, 응집체 동결 절편의 면역 염색 이미지에 있어서, RAX 양성의 조직이 관찰되고, 그 외측에 RAX 음성의 조직이 관찰되지 않는다.
본 발명 제조 방법 2 에 의해, 인간 다능성 줄기 세포로부터 고효율로 망막 조직을 얻을 수 있다. 본 발명 제조 방법 2 에 의해 얻어지는 망막 조직에는, 망막층 각각에 특이적인 뉴런이 포함되는 것으로부터, 시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 신경절 세포 또는 이들의 선구 세포 등 망막 조직을 구성하는 세포를 입수할 수도 있다. 얻어진 망막 조직으로부터 입수한 세포가 어느 세포인지에 대해서는 자체 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체는, 그대로 독성 또는 약효 평가용 시약으로서 사용해도 된다. 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 해, 얻어진 세포를 FACS 를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막 조직 구성 세포를 얻는 일도 가능하다.
본 발명 제조 방법 3 은, 하기 공정 (1), (2) 및 (3) 을 포함하는 망막층-특이적 신경 세포의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포가 출현할 때까지 부유 배양해, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 얻는 제 3 공정.
본 발명 제조 방법 3 의 공정 (1) 및 공정 (2) 은, 본 발명 제조 방법 1 의 공정 (1) 및 공정 (2) 와 마찬가지로 실시할 수 있다.
공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포가 출현할 때까지 부유 배양해, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 얻는 공정 (3) 에 대해 설명한다.
공정 (3) 에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 보충되어 있지 않은 무혈청 배지 또는 혈청 배지이다.
"소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는" 배지에는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 조직 및 망막층-특이적 신경세포에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지도 포함된다.
"소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 보충되어 있지 않는" 배지에는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 실질적으로 보충되어 있지 않은 배지, 예를 들어, 망막 조직 및 망막층-특이적 신경세포에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질이 보충되어 있지 않은 배지도 포함된다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물 (supplement), 100μM 타우린, 및 500 nM 레티노산을 첨가한 혈청-함유 배지, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12의 1：1 의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적 정의된 농축액을 첨가한 배지) 등을 들 수 있다.
공정 (3) 에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O2 농도는, 약 18% 이상, 예를 들어 약 20% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 60%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 약 50% 이다.
공정 (3) 의 배양 시간은, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포에 따라 달라지고, 예를 들어 약 7 일간 내지 약 200 일이다.
이와 같이 하여 부유 배양된 응집체에 있어서, 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직은 응집체의 표면을 덮도록 존재한다. 망막 조직의 확인은, 부유 배양 종료후, 응집체를 파라포름알데히드 용액 등의 고정액을 사용하여 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 층 구조를 갖는 망막 조직이 형성되어 있는 일을 면역 염색법 등에 의해 확인하면 된다. 망막 조직의 각층은 상이한 망막 선구 세포 (시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포) 로 이루어지므로, 이들의 세포에 발현하고 있는 마커에 대한 항체를 사용하여, 면역 염색법에 의해, 층 구조가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.
망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체에서는, 예를 들어, 응집체 동결 절편의 면역 염색 이미지에 있어서, RAX 양성의 조직이 관찰되고 그 외측에 RAX 음성의 조직이 관찰되지 않는다.
본 발명 제조 방법 3 에 의해 얻어지는 망막 조직에는, 망막층의 각각에 특이적인 뉴런이 포함되는 것으로부터, 시세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 신경절 세포 등의 망막층-특이적 신경세포를 입수하는 것이 가능하다. 얻어진 망막 조직으로부터 입수한 세포가 어느 세포인지에 대해서는, 자체 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 망막층-특이적 신경 세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체는, 그대로 독성 또는 약효 평가용 시약으로서 사용해도 된다. 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 해, 얻어진 세포를 FACS 를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막층-특이적 신경세포를 얻는 일도 가능하다.
얻어진 망막층-특이적 신경세포는, 그대로, 혹은 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 한 후, 접착 조건 하에서 한층 더 배양할 수도 있다. 접착 배양하는 경우, 세포 접착성의 배양기, 예를 들어 세포외 매트릭스 등 (예를 들어, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴) 에 의해 코팅 처리된 배양기를 사용하는 것이 바람직하다. 접착 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 배양 조건은, 적절히 결정할 수 있다. 이 때, 이미 알려진 분화 유도 물질이나 신경 영양 인자의 존재하에서 배양 해도 된다. 이와 같은 분화 유도 물질, 신경 영양 인자로서는, 예를 들어, NGF (Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 552 (1994)), 레티노산 (Dev. Biol., 168, 342 (1995); J. Neurosci., 16, 1056 (1996)), BMP 저해 인자 (Nature, 376, 333-336 (1995)), IGF (Genes&Development, 15, 3023-8 (2003)), BDNF, NT3, NT4 등을 들 수 있다.
제조된 망막 조직이나 망막층-특이적 신경세포는, 세포 마커의 발현의 유무등을 지표로서 이용하거나, 또는 필요에 따라 그것들을 조합함으로써 확인할 수 있다. 세포의 형태를 관찰함으로써, 얻어진 망막층-특이적 신경세포를 동정할 수도 있다. 이와 같은 마커 발현 패턴이나 세포의 형태에 근거해, 원하는 특정의 세포를 단리할 수도 있다.
본 발명 제조 방법 1 내지 3 에 의해 제조된 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포는, 망막 조직 또는 망막 관련 세포의 장애에 근거하는 질환의 치료약의 스크리닝, 그 밖의 원인에 의한 세포 손상 상태에 있어서의 치료약에 대해 세포 치료용 이식용 재료 또는 질환 연구 재료, 신약 개발 재료로서 이용 가능하다. 또, 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가에 있어서도, 광 독성 등의 독성 연구, 독성 시험 등에 활용 가능하다.
망막 조직 또는 망막 관련 세포의 장애에 근거하는 질환으로서는, 예를 들어, 유기 수은 중독, 클로로퀸 망막증, 망막 색소 변성증, 연령 관련 황반 변성증, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생아 망막증 등을 들 수 있다.
본 발명 제조 방법 1 내지 3 에 의해 제조된 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포는, 세포 손상 상태에 있어서, 당해 세포나, 장애를 받은 조직 자체를 보충하는 (예를 들어, 이식 수술에 사용하는) 데 사용하는 이식용 망막으로서 사용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1： 망막 선구 세포를 포함하는 응집체의 제조예
RAX::GFP 노크-인 인간 ES세포 (KhES-1 유래; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686" 에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF 를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES세포를 비(非)세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5%CO2 로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 최종농도 1.5 nM의 인간 재조합체 BMP4 (R&D), 최종 농도 100 ng/ml 의 BMP2 (R&D), 최종 농도 100 ng/ml 의 BMP7 (R&D), 및 최종 농도 100 ng/ml 의 GDF7 (R&D) 중 임의의 것을 첨가해 부유 배양했다. 상기 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 모두 첨가하고 있지 않는 조건에서도 동일하게 배양했다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 모두 보충되어 있지 않는 상기 배지로 3 일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 형광 현미경 관찰을 실시했다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 조건으로 배양했을 경우에서는 망막 선구 세포가 유도된 것을 나타내는 GFP 발현 세포가 거의 발견되지 않았다 (도 1 A, B). 이와 반대로, BMP2 (도 1C, D), BMP4 (도 1E, F), BMP7 (도 1G, H) 및 GDF7 (도 1I, J) 중 임의의 것을 첨가해 배양한 조건에서는 GFP 발현 세포가 분명하게 증가했다.
실시예 2： 망막 조직의 제조예 1
RAX::GFP 노크-인 인간 ES세포 (KhES-1 유래; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.)의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시와 동시, 부유 배양 개시 1 일째, 부유 배양 개시 2 일째, 부유 배양 개시 3 일째 중 임의의 시점에서 최종 농도 1.5 nM의 인간 재조합체 BMP4 (R&D) 를 첨가해 부유 배양했다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 조건에서도 동일하게 배양했다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되지 않는 상기 배지로 3 일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18 일째에 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 응집체를 옮겨, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액을 첨가한 무혈청 배지에서 계속 부유 배양을 실시했다. 부유 배양 개시 26 일째에 형광 현미경에 의한 관찰 및 FACS 에 의한 GFP 양성 세포의 측정을 실시했다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 조건 (도 2A, B, C) 및 부유 배양 개시와 동시에 BMP4를 첨가한 조건 (도 2D, E, F) 에서는 망막 선구 세포가 유도된 것을 나타내는 GFP 발현 세포가 발견되지 않았다. 반대로, 부유 배양 개시 1 일째 (도 2 G, H, I), 부유 배양 개시 2 일째 (도 2 J, K, L), 부유 배양 개시 3 일째 (도 2 M, N, O) 중 임의의 시점에서 BMP4 를 첨가한 조건에서는, GFP 발현 세포가 분명하게 증가했다. 어느 조건에 있어서도, 형성된 RAX :: GFP 양성의 조직의 외측에 RAX :: GFP 음성의 조직은 관찰되지 않았다. FACS 에 의한 측정의 결과에서는, 부유 배양 개시 3 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서는 85% 이상의 세포가 GFP 양성이었다 (도 2 O). 이상의 결과로부터, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체의 제조에는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 부유 배양 개시 1 일째 이후, 바람직하게는 3 일째에 첨가하는 것이 유효하다는 것이 나타났다.
실시예 3：망막 조직의 제조예 2
RAX:: GFP 노크-인 인간 ES세포 (KhES-1 유래; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.)의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5%CO2 에서 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1： 1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 6 일째, 부유 배양 개시 9 일째, 부유 배양 개시 12 일째, 부유 배양 개시 15 일째 중 임의의 시점에서 최종 농도 1.5 nM 의 인간 재조합체 BMP4 (R&D) 를 첨가해 부유 배양했다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 조건에서도 동일하게 배양했다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되지 않은 상기 배지로 3 일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18 일째에, 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 응집체를 옮겨, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노 티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액을 첨가한 무혈청 배지로 부유 배양을 계속 실시했다. 부유 배양 개시 24 일째에, 형광 현미경 관찰을 실시했다.
그 결과, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 조건에서는 망막 선구 세포가 유도된 것을 나타내는 GFP 발현 세포가 발견되지 않았다 (도 3 A, B). 그것과 비교해, 부유 배양 개시 6 일째 (도 3 C, D), 부유 배양 개시 9 일째 (도 3 E, F), 부유 배양 개시 12 일째 (도 3 G, H) 중 임의의 시점에서 BMP4를 첨가한 조건에서는 분명하게 GFP 발현 세포가 증가했다. 부유 배양 개시 15 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서도 GFP 발현 세포가 유도되었지만, 효율은 낮았다 (도 3 I, J). 어느 조건에 있어서도, 형성된 RAX：：GFP 양성의 조직의 외측에 RAX :: GFP 음성의 조직은 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체의 제조에는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 부유 배양 개시 15일에 또는 그 이전에 첨가하는 것이 유효하다라고 하는 것이 나타났다.
실시예 4：망막 조직의 제조예 3
실시예 1 으로 얻어진 GFP 발현 세포를 포함하는 응집체를, 부유 배양 개시 18 일째에 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 옮겨, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액을 첨가한 무혈청 배지로 부유 배양을 계속 실시했다. 부유 배양 개시 26 일째에 응집체를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 면역 염색법에 의해 조직 구조를 확인했다.
부유 배양 개시 26 일째에 있어서, 전층이 RAX:: GFP 양성이며, 외층이 망막 줄기 세포 마커인 Chx10 에 대해 양성이었다 (도 4 A, B, C). RAX：: GFP 양성의 표피의 외측에는 비신경 외배엽 등의 어떠한 조직도 존재하지 않았다. 본 발명의 제조 방법에 의해, 인간 ES 세포로부터 고효율로 망막 조직이 제조 가능한 것이 밝혀졌다.
실시예 5: 망막층-특이적 신경세포의 제조예
RAX::GFP 노크-인 인간 ES세포 (KhES-1 유래; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF 를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3 일째에 최종 농도 1.5 nM 의 인간 재조합체 BMP4 (R&D) 를 첨가했다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되어 있지 않는 상기 배지로 3 일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18 일째에 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 응집체를 옮겨, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물, 100μM 타우린, 500 nM 레티노산을 첨가한 배지를 사용하여 부유 배양을 계속 했다. 부유 배양 개시 18 일째 이후의 배양은 40% O2 하에서 실시했다. 부유 배양 개시 117 일째에 응집체를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 면역 염색법에 의해 조직 구조를 확인했다. 부유 배양 개시 117 일째에 있어서, 전층이 RAX:: GFP 양성이며, 시세포 마커인 레코베린에 대해 양성인 세포가 존재했다 (도 5 A). 게다가, 망막 조직 외층에, 간체 시세포 마커인 Nrl 에 대해 양성인 세포 (도 5 B) 와 뿔꼴 시세포 마커인 RXR-gamma 에 대해 양성인 세포 (도 5 C) 가 존재해, 간체, 뿔꼴 시세포로의 분화가 생기고 있는 것이 시사되었다. 나아가, 망막 선구 세포 및 쌍극세포의 마커인 Chx10 에 대해 양성인 세포 (도 5 D), 아마크린 세포 마커인 칼레티닌에 대해 양성인 세포 (도 5 E), 및 수평 세포 마커인 칼빈딘에 대해 양성인 세포 (도 5 F) 가 존재하고 있었다. 이 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해, 각종의 분화한 망막층-특이적 신경세포로 구성되는 망막 조직을, 인간 ES 세포로부터 고효율로 제조 가능하다는 점이 밝혀졌다.
실시예 6： 망막층-특이적-신경세포의 제조예
RAX:: GFP 노크-인 인간 ES세포 (KhES-1 유래; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785) 를, "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1x 비필수 아미노산, 8 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5%CO2 로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지로서, F-12배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3 일째에, 상기 무혈청 배지를 50μl 더했다 (합계 150μl). 부유 배양 개시 6 일째에 최종 농도 1.5 nM 의 인간 재조합체 BMP4 (R&D) 를 첨가했다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 보충되어 있지 않는 상기 배지로 3 일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18 일째에 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 응집체를 옮겨, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물, 100μM 타우린, 500 nM 레티노산을 첨가한 배지를 사용하여 부유 배양을 계속 했다. 부유 배양 개시 18 일째 이후의 배양은 40% O2 하에서 실시했다. 부유 배양 개시 50 일째에 응집체를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 면역 염색법에 의해 조직 구조를 확인했다. 부유 배양 개시 50 일째에 있어서, 전층이 RAX:: GFP 양성이며, 망막 선구 세포 및 쌍극세포의 마커인 Chx10 에 대해 양성인 세포 (도 6 A), 및 신경절 세포 및 신경세포의 마커인 Pax6 에 대해 양성인 세포 (도 6 B) 가 존재하였고, 이는 다층의 망막 신경 조직이 형성되어 있음을 시사했다. 나아가, 시세포 마커인 Crx 에 대해 양성인 세포 (도 6 C), 및, 신경절 세포의 마커인 Brn3b 에 대해 양성인 세포 (도 6 D) 가 존재했다. 이 결과로부터, 본 발명 제조 방법에 의해, 각종의 분화한 망막층-특이적 신경세포로 구성되는 망막 조직을, 인간 ES 세포로부터 고효율로 제조 가능하다는 점이 밝혀졌다.
실시예 7： 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 로부터의 망막 선구 세포를 포함하는 응집체, 망막 조직, 및 망막층-특이적 신경세포의 제조예
인간 iPS 세포주 201B7 (RIKEN BioResource center 또는 iPS Academia Japan Inc.로부터 입수 가능) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법에 따라 배양한다. 배지로서, DMEM/F12 배지 (Sigma) 에 20% KSR (KnockoutTM SerumReplacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용한다. 배양된 상기 iPS 세포를, TrypLE Express (Invitrogen) 를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) 의 1 웰 당 1.2×104 세포가 되도록 100μl 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5% CO2 로 부유 배양한다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1x 화학적 정의된 농축액, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용한다. 부유 배양 개시 1 일째부터 15 일째 사이에서 어느 시점 때, 최종 농도 1.5 nM의 인간 재조합체 BMP4 (R&D), 최종 농도 100 ng/ml의 BMP2 (R&D), 최종 농도 100 ng/ml의 BMP7 (R&D), 및 최종 농도 100 ng/ml의 GDF7 (R&D) 중 임의의 것을 첨가해 부유 배양을 실시한다. 웰 내의 배양 배지액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 중 임의의 것이 보충되어 있지 않는 상기 배지로 3 일 간격으로 교환한다. 부유 배양 개시 18 일째에 응집체를 일부 회수해, 4% 파라 포름알데히드로 고정 처리를 실시해 동결 절편을 제작한 후, 면역 염색법에 의해 망막 선구 세포 마커 (Rax, Chx10) 의 발현을 확인한다. 나머지의 응집체를 96 웰 플레이트로부터 부유 배양용 디쉬로 옮겨, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물, 100μM 타우린, 500 nM 레티노산을 첨가한 무혈청 배지를 사용하여 부유 배양을 계속 한다. 부유 배양 개시 18 일째 이후의 배양은 40% O2 하에서 실시한다. 부유 배양 개시 117 일째에 응집체를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정해, 동결 절편을 제작한 후, 면역 염색법에 의해 조직 구조와 망막층-특이적 신경세포의 마커 (Nrl, RXR-gamma, 레코베린, Chx10, 칼레티닌, 칼빈딘) 의 발현을 확인한다.
이와 같이 하여, 망막 선구 세포, 나아가서는, 각종의 분화한 망막층-특이적 신경세포로 구성되는 망막 조직을, 인간 iPS 세포로부터 제조 가능하다.
본 출원은, 2013년 8월 23 일자로 일본에 출원된 일본 특허 출원 2013-173285 을 기초로 하고 있고, 그 내용 모두는 본원에 포함된다.
산업상의 이용 가능성
본 발명의 제조 방법에 의하면, 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 고효율로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 기저막 제조물을 배지에 첨가하는 일 없이 응집체를 부유 배양해, 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 얻는 것이 가능하므로, 얻어진 세포 또는 조직에 대한 이종 유래 성분의 혼입의 리스크가 저감된다. 본 발명의 제조 방법은, 화학 물질 등의 독성 또는 약효 평가나 세포 치료 등을 목적으로 해, 망막 조직을 구성하는 세포군 (예, 시세포, 시신경 등) 을 효율적으로 제조하는 것이나, 조직 구조를 갖는 망막 조직을 사용한 독성 또는 약효 평가 및 망막 조직 이식 치료용 이식 재료에 대한 응용을 목적으로 해, 시험이나 치료에 사용하기 위한 "조직 재료"가 되는 망막 조직을 효율적으로 제조하므로, 매우 유용하다.
Claims (14)
- (1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정, 및
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정을 포함하는, 망막 선구 세포의 제조 방법. - (1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 수득하는 제 3 공정을 포함하는, 망막 조직의 제조 방법. - (1) 다능성 줄기 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2) 에서 형성된 응집체를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 작용 물질 중 어느 것도 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포가 출현할 때까지 부유 배양해, 목적으로 하는 망막층-특이적 신경세포를 함유하는 망막 조직을 포함하고 헤드부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체를 수득하는 제 3 공정을 포함하는, 망막층-특이적 신경세포의 제조 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1) 및 공정 (2) 이 혈청 대체물 존재 하에서 행해지는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 부유 배양이 기저막 제조물 부재 하에서 행해지는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 단백질인 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 공정 (1) 의 부유 배양 개시부터 제 1 일 내지 제 15 일 사이에 배지에 첨가되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 포함하는, 독성 또는 약효 평가용 시약.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포에 피검 물질을 접촉시켜, 상기 물질이 상기 세포 또는 상기 조직에 미치는 영향을 조사하는 것을 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를 포함하는, 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료제.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는, 유효량의 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포를, 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료 방법.
- 망막 조직의 장애에 근거하는 질환의 치료에 있어서 사용되기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 망막 선구 세포, 망막 조직 또는 망막층-특이적 신경세포.
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