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KR20160045096A - 치료적 목적을 위한 조작된 영장류 ｌ-메티오니나제 - Google Patents

치료적 목적을 위한 조작된 영장류 ｌ-메티오니나제 Download PDF

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KR20160045096A
KR20160045096A KR1020167007045A KR20167007045A KR20160045096A KR 20160045096 A KR20160045096 A KR 20160045096A KR 1020167007045 A KR1020167007045 A KR 1020167007045A KR 20167007045 A KR20167007045 A KR 20167007045A KR 20160045096 A KR20160045096 A KR 20160045096A
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에버렛 스톤
웨이-쳉 루
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

메티오닌-γ-분해효소 효소 활성을 갖는 향상된 단백질의 유전자조작에 관련되는 방법 및 조성물이 기재된다. 예를 들면, 특정 측면에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고 메티오닌을 분해할 수 있는 변형된 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)가 개시될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 특정 측면은 개시된 단백질 또는 핵산을 사용하는 메티오닌 고갈로 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

치료적 목적을 위한 조작된 영장류 Ｌ-메티오니나제{ENGINEERED PRIMATE L-METHIONINASE FOR THERAPEUTIC PURPOSES}
본원은 2013년 8월 29일에 출원된 미국 가출원 제61/871,768호의 우선권 이점을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 편입된다.
본 발명은 미국 국립 보건원의 지원으로 과제 번호 R01 CA154754하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의약 및 생물학 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 향상된 인간 메티오닌-γ-분해효소(hMGL) 에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
필수아미노산인 L-메티오닌에 대한 요구는 암성 조직에서 예상외로 높다. 메티오닌의 고갈은 비-암성 조직에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 다양한 종양 유형을 사멸시키는데 효과적인 것으로 제시되어 왔다. 메티오닌 고갈은 아미노산을 가수분해하는 효소의 작용을 통해 영향을 받을 수 있다. 인간 메티오닌 고갈 효소는 이전에 존재하지 않는 한편, 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ) 기원의 박테리아 효소인 메티오닌-γ-분해효소는 병상에서 치료적으로 효과적인 것으로 제시되어 왔고, 임상 시험에서 평가되었다. 그러나, 박테리아 단백질인 메티오닌-γ-분해효소는 고도로 면역원성이고, 특이적 항체의 형성을 유도하여 역반응 및 활성 감소를 초래한다. 메티오닌-γ-분해효소는 또한 시험관내 및 생체내에서 단지 약 2시간의 매우 짧은 반감기를 갖기 때문에 전신 고갈을 달성하기 위해서는 매우 빈번하고 비현실적으로 높은 투여를 필요로 한다.
전신 메티오닌 고갈은 많은 연구의 대상이고, 무엇보다도 전이성 유방암, 전립선, 신경교세포종 및 췌장 암종과 같은 암을 치료하는 잠재성을 갖는다. 비록 이러한 치료적 접근법에 대해 많은 관심이 존재하지만, 박테리아 유도 메티오닌-γ-분해효소는 화학치료제로서의 이의 사용에 대한 열정이 크게 약화될 만큼 심각한 단점(상기 논의된 바와 같이, 면역원성 및 혈청에서의 빠른 탈활성화)을 갖는다.
이전에, 조작된 인간 메티오닌-γ-분해효소(hMGL-NLV)는 인간 효소 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)에 3개의 중요 아미노산 치환을 도입함으로써 생성되었다: E59N, R119L, E339V. 참조: 미국 특허 제8,709,407호, 이는 본원에 참고로 편입된다. 본질적으로 L-메티오닌에 대한 촉매적 활성을 전혀 나타내지 않는 원상태 CGL과 달리, E59N, R119L, E339V 변이체 효소(hMGL-NLV)는 생체내 및 시험관내에서 강력한 L-메티오닌 분해 활성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 치료 효과가 효소의 낮은 투여 및/또는 덜 빈번한 투여로 달성될 수 있도록 높은 촉매적 활성을 갖는 인간 L-메티오닌 분해 효소를 개발할 필요성이 존재한다.
발명의 요약
hMGL-NLV보다 높은 촉매적 활성을 갖는 인간 메티오닌-γ-분해효소(hMGL) 돌연변이체가 본원에서 제공된다. 바람직한 향상된 hMGL 단백질은 6 내지 10배 더 높은 활성을 나타낸다. 높은 촉매적 활성에 기인하여, 제공된 hMGL 단백질은 메티오닌 고갈에 대한 높은 치료적 효력을나타낼 수 있고, 따라서 저농도의 치료제가 환자의 투여에 필요할 수 있다. 이 효소는 잔기 E59, R119 또는 E339를 포함하는 위치에서 인간 효소 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)에 아미노산 치환을 도입함으로써 조작되었다. 하나의 특별한 구현예에서, hCGL에서 E59, R119 및 E339의 바람직한 치환은 각각 L-아스파라긴 (위치 59에서), L-류신(위치 119에서) 및 L-발린(위치 339에서)을 포함한다. 본 발명은 hMGL-NLV 변이체에 대하여 높은 촉매적 활성을 나타내는 물질의 조성물을 개시한다. 이들은 hMGL-NLV 변이체와 비교하여 L-메티오닌-γ-분해효소 활성을 부여하는데 중요한 것으로 동정된 E59, R119 또는 E339 위치 중의 적어도 두 개에 치환을 함유한다. 이들 변이체의 높은 촉매적 활성은, 저농도의 치료제가 환자의 투여에 필요할 수 있기 때문에, 중요하다.
추가의 아미노산 치환을 갖는 변이체는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 3, hCGL-E59N-S63L-L91M-R119L-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-1); 서열식별번호: 4, hCGL-E59I-S63L-L91M-R119L-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-2); 서열식별번호: 5, hCGL-E59N-S63L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-3); 및 서열식별번호: 6, hCGL-E59I-S63L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-4).
본 발명의 특정 측면은 암 치료에 적합할 수 있는 메티오닌-γ-분해효소(MGL) 활성을 갖는 인간 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 낮은 면역원성, 향상된 혈청 안정성 및 향상된 촉매적 활성을 갖는 향상된 효소를 제공함으로써 당해 기술 분야의 주요 결핍을 해결한다. 따라서, 제1 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드 (즉, 효소), 특히 MGL에 관련된 영장류 효소로부터 유도된 메티오닌-분해 활성을 갖는 효소 변이체가 제공된다. 예를 들면, 신규한 효소 변이체는 서열식별번호로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다: 3-6. 특히, 변이체는 인간 효소, 예를 들면, 인간 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)로부터 유도될 수 있다. 특정 측면에서, 메티오닌을 분해할 수 있는 변형된 인간 CGL을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 생리적 조건하에 메티오닌을 분해할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M-1s-1 또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위의 메티오닌에 대한 촉매적 활성(kcat/KM)을 가질 수 있다. 추가의 측면에서, 폴리펩타이드는 최대 kcat/KM 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 M-1s-1 또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위의 L-호모시스틴에 대한 촉매적 활성을 나타낼 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 변형된 폴리펩타이드는 비변형된 폴리펩타이드 (예를 들면, 원상태 폴리펩타이드) 또는 본원에 개시된 임의의 폴리펩타이드 서열과 비교하여 특정 백분율의 동일성을 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 예를 들면, 비변형된 폴리펩타이드는 원상태 영장류 시스타티오나제(즉, 시스타티오닌-γ-분해효소)의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400개 잔기 (또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있다. 동일성 비율은 변형된 폴리펩타이드의 비변형된 부분(즉, 아미노산 위치 59, 63, 91, 119, 268, 311, 339 및/또는 353에서 임의의 치환을 제외한 변형된 폴리펩타이드의 서열)과 원상태 폴리펩타이드 사이에 약, 최대 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 이들 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)일 수 있다. 또한 상기 논의된 동일성 비율은 폴리펩타이드의 비변형된 영역과 비교하여 폴리펩타이드의 변형된 특정 영역에 관한 것일 수 있음이 고려된다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터의 비변형 또는 돌연변이시스타티오나제의 비변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위의 아미노산 서열에 대한 시스타티오나제의 변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성을 기준으로 특성화될 수 있는 시스타티오나제의 변형 또는 돌연변이 기질 인식 부위를 함유할 수 있다. 예를 들면, 비변형된 시스타티오나제와 적어도 90% 동일성을 갖는 것으로 특성화된 변형 또는 돌연변이 인간 폴리펩타이드는, 그 변형 또는 돌연변이 인간 폴리펩타이드 중의 아미노산의 적어도 90%가 비변형된 폴리펩타이드 중의 아미노산과 동일하다는 것을 의미한다.
이와 같은 비변형된 폴리펩타이드는 원상태 시스타티오나제, 특히 인간 동형체 또는 다른 영장류동형체일 수 있다. 예를 들면, 원상태 인간 시스타티오나제는 서열식별번호의 서열을 가질 수 있다: 1. 다른 원상태 영장류 시스타티오나제의 비제한적인 예는 퐁고 아벨리이( Pongo abelii ) 시스타티오나제(유전자은행 ID를 포함한다: NP_001124635.1; 서열식별번호: 7), 마카카 파스시컬라리스( Macaca fascicularis) 시스타티오나제(유전자은행 ID: AAW71993.1; 서열식별변호: 8), 팬 트로글로다이테스(Pan troglodytes) 시스타티오나제(유전자은행 ID: XP_513486.2; 서열식별번호: 9), 및 팬 패니스쿠스(Pan paniscus ) 시스타티오나제(유전자은행 ID: XP_003830652.1; 서열식별번호: 10). 예시적인 원상태 폴리펩타이드는 서열식별번호와 약, 최대 또는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 (또는 이 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)을 갖는 서열을 포함한다: 1 또는 7 내지 10 또는 이의 단편. 예를 들면, 원상태 폴리펩타이드는 서열식별변호의 서열의 적어도 또는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 415개의 잔기 (또는 이 수치 내에서 유도가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있다: 1 또는 7 내지 10.
일부 구현예에서, 원상태 CGL은 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단과 같은 하나 이상의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형은 원상태 효소의 기질 인식 부위에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 원상태 CGL은 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 치환의 수는 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상일 수 있다. 추가의 구현예에서, 원상태 CGL은 기질 인식 부위 또는 기질 특이성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 위치에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 변형된 폴리펩타이드는 서열식별번호의 E59, S63, L91, R119, K268, T311, E339 및/또는 I353에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다: 1 또는 영장류 CGL의 59, 63, 91, 119, 268, 311, 339 및/또는 353의 아미노산 위치. 예를 들면, 영장류는 인간, 퐁고 아벨리이, 마카카 파스시컬라리스, 팬트로글로다이테 또는 팬 패니스쿠스일 수 있다.
특정 구현예에서, 아미노산 위치 59, 63, 91, 119, 268, 311, 339 및/또는 353에서의 치환은 아스파르트산(N), 발린(V), 류신(L), 메티오닌(M), 아르기닌(R), 글리신(G), 알라닌(A) 또는 세린(S)이다. 특정 구현예에서, 변형은 E59N, E59I, S63L, L91M, R119L, R119A, K268R, T311G, E339V 및 I353S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환이다. 추가의 구현예에서, 치환은 S63L, L91M, K268R, T311G, E339V 및 I353S 치환을 포함할 수 있다. 또 추가의 구현예에서, 치환은 E59N 또는 E59I 및 R119L 또는 R119A의 추가의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 원상태 CGL은 인간 CGL일 수 있다. 특정 구현예에서, 치환은 인간 CGL의 E59N, S63L, L91M, R119L, K268R, T311G, I353S 및 E339V의 조합(예를 들면, 서열식별번호의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드이다: 3, 이의 단편 또는 상동체), 인간 CGL의 E59I, S63L, L91M, R119L, K268R, T311G, I353S, E339V의 조합(예를 들면, 서열식별번호의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드: 4, 이의 단편 또는 상동체), 인간 CGL의 E59N, S63L, L91M, R119A, K268R, T311G, I353S 및 E339V의 조합(예를 들면, 서열식별번호의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드: 5, 이의 단편 또는 상동체), 또는 인간 CGL의 E59I, S63L, L91M, R119A, K268R, T311G, I353S 및 E339V의 조합(예를 들면, 서열식별번호의 아미노산 서열을 갖는 변형된 폴리펩타이드: 6, 이의 단편 또는 상동체). 추가의 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드는 퐁고 아벨리이 CGL-NLMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호일 수 있다: 11), 퐁고 아벨리이 CGL-ILMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 12), 퐁고 아벨리이 CGL-NLMARGSV 돌연변이체(서열식별변호: 13), 퐁고 아벨리이 CGL-ILMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 14), 마카카 파스시컬라리스CGL-NLMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 15), 마카카 파스시컬라리스CGL-ILMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 16), 마카카 파스시컬라리스CGL-NLMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 17), 마카카 파스시컬라리스CGL-ILMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 18), 팬 트로 글로다이테스 CGL-NLMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 19), 팬 트로글로다이테스 CGL-ILMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 20), 팬 트로글로다이테스 CGL-NLMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 21), 팬 트로글로다이테스 CGL-ILMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 22), 팬 패니스쿠스 CGL-NLMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 23), 팬 패니스쿠스 CGL-ILMLRGSV 돌연변이체(서열식별번호: 24), 팬 패니스쿠스 CGL-NLMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 25), 또는 팬 패니스쿠스 CGL-ILMARGSV 돌연변이체(서열식별번호: 26).
일부 측면에서, 본 발명은 또한 이종성 아미노산 서열에 연결된 변형된 CGL을 포함하는 폴리펩타이드를 고려한다. 예를 들면, 변형된 CGL은 융합 단백질로서 이종성 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 CGL은 생체내 반감기를 증가시키기 위한 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 펩타이드 또는 XTEN 폴리펩타이드와 같은 아미노산 서열에 연결될 수 있다.
혈청 안정성을 증가시키기 위해, 변형된 CGL은 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 라이신 또는 시스테인과 같은 특정 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결될 수 있다. 치료적 투여를 위해, 변형된 CGL을 포함하는 이러한 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체에 분산될 수 있다.
일부 측면에서, 이러한 변형된 CGL을 코딩하는 핵산이 고려된다. 일부 구현예에서, 핵산은 박테리아에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 특정 구현예에서, 박테리아는 이. 콜라이(E. coli )이다. 다른 측면에서, 진균(예를 들면, 효모), 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 본 발명은 이러한 핵산을 함유하는 발현 벡터와 같은 벡터를 추가로 고려한다. 특정 구현예에서, 변형된 CGL을 코딩하는 핵산은 비제한적으로 이종성 프로모터를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 하나의 구현예에서, 변형된 CGL은 벡터(예를 들면, 유전자 요법 벡터)에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이러한 바이러스는 표적 세포에서 변형된 CGL-코딩 핵산의 발현을 가능하게 하는 재조합 DNA 기술로 변형될 수 있다. 이들 벡터는 비바이러스(예를 들면, 플라스미드) 또는 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 우두 바이러스) 기원의 벡터로부터 유도될 수 있다. 비바이러스 벡터는 바람직하게는 세포성 막을 교차하는 DNA의 진입을 용이하게 하는 제제와 복합체화된다. 이러한 비바이러스 벡터 복합체의 예는 DNA와 지질-기반 전달 시스템의 응축을 용이하게 하는 다가양이온성 제제와의 제형을 포함한다. 지질-기반 전달 시스템의 예는 핵산의 리포좀 기반 전달을 포함한다.
더욱 추가의 측면에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 고려한다. 숙주 세포는 박테리아(예를 들면, 이. 콜라이), 진균 세포(예를 들면, 효모), 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 원상태 CGL로부터 메티오닌 분해 활성을 갖는 목적하는 CGL 돌연변이체를 추가로 구별하기 위해, ilvA 및 metA의 결실을 갖는 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이 ilvA - metA -)를 제조하고 사용하여 목적하는 돌연변이체를 동정할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 변형된 CGL을 발현시키는 숙주 세포로 도입된다. 단백질은 임의의 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 하나의 구현예에서, 단백질은 단백질이 당화되도록 숙주 세포에서 발현된다. 또 하나의 구현예에서, 단백질은 단백질이 비당화되도록 숙주 세포에서 발현된다.
본 발명의 특정 측면은 또한 변형된 CGL 펩타이드, 유전자 요법 벡터에서 변형된 CGL을 코딩하는 핵산 또는 본 발명의 제형의 투여에 의한 치료 방법, 및 특히 종양 세포 또는 암 보유 대상체의 치료 방법을 고려한다. 대상체는 마우스와 같은 임의의 동물일 수 있다. 예를 들면, 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 더욱 구체적으로는 인간 환자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 암 환자를 선별하는 것을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 대상체 또는 환자는 메티오닌-제한된 식이 또는 정상 식이로 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 암은 메티오닌 고갈에 민감한 임의의 암이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 투여함을 포함하여, 종양세포 또는 암 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 일부 구현예에서, 투여는 암 세포의 적어도 일부가 사멸되도록 하는 조건하에서 발생한다. 또 하나의 구현예에서, 제형은 생리학적 조건에서 메티오닌 분해 활성을 갖는 이러한 변형된 CGL을 포함하며, 추가로 부착된 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 임의의 상기 논의된 CGL 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형이다. 이러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 상기 CGL 변이체 모두는 인간 요법에 유용한 것으로 고려될 수 있다.
추가의 구현예에서, 메티오닌 분해 활성을 갖는 비박테리아(포유동물, 예를 들면, 영장류 또는 마우스) 변형된 CGL 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 치료 방법이 또한 제공될 수 있다.
종양 세포는 메티오닌에 대한 그들의 영양 배지에 의존하기 때문에, 투여 또는 치료는 반드시 세포 자체에 관한 것이 아니라 세포의 영양원에 관한 것일 수 있다. 따라서, 생체내 적용에서, 종양 세포의 치료는 종양 세포 집단을 위한 영양 배지를 조작된 메티오니나제와 접촉시킴을 포함한다. 이 구현예에서, 배지는 메티오닌 고갈이 목적시되는 혈액, 림프액, 척수액 및 유사 체액일 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따라서, 조작된 메티오니나제를 함유하는 이러한 제형은 정맥내, 피부내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 활막내, 기관내, 비강내, 초자체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심막내, 탯줄내, 안내, 경구, 국소, 흡입, 주입, 연속 주입, 국재화된 관류, 카테터를 통해, 세척을 통해, 액체 조성물(예를 들면, 리포좀)로, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기 경로의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 또한 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여함을 포함할 수 있다. 제2 항암 요법은 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조작된 메티오닌 또는 조작된 메티오닌을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물은 대상체에서 종양을 치료하는데 사용하기 위해 제공된다. 또 하나의 구현예에서, 종양 치료용 약제를 제조하는데 있어서 조작된 메티오닌 또는 조작된 메티오닌을 코딩하는 핵산의 용도가 제공된다. 상기 조작된 메티오니나제는 상기 구현예의 임의의 조작된 메티오니나제일 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물과 관련하여 논의된 구현예는 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 구현예는 또한 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 적용될 수 있다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩한다" 또는 "코딩하는"은 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 본 발명이 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 사용되지만, 이들 용어는 각각 "포함한다" 또는 "포함하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원 명세서에서 사용된 단수형("a" 또는 "an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 특허청구범위(들)에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 단수형 용어("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다.
특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 비록 개시내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지할지라도 명백하게 대안만을 나타내거나 대안이 상호 배타적임을 나타내는 것으로 명시되지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 "또 하나의"는 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 수치가 그 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 및 방법에 대한 오차의 고유 변화 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변화를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 한편, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 정신 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 당해 기술 분야의 숙련가에게 자명해질 것이기 때문에, 단지 예시로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
도면의 간단한 설명
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 증명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 - hCGL-8mut-1-4를 갖는 hCGL의 서열 정렬. 강조된 잔기는 돌연변이된 잔기 및 그들의 위치를 나타낸다. hCGL = 서열식별번호: 1; hCGL-8mut-1 = 서열식별변호: 3; hCGL-8mut-2 = 서열식별번호: 4; hCGL-8mut-3 = 서열식별번호: 5; 및 hCGL-8mut-4 = 서열식별번호: 6.
도 2 - 각각 겉보기 IC50 값 0.25 μM 및 0.21 μM을 생성하는 hCGL-8mut-1의 적정으로 처리된 전립선 종양 세포주 PC3(개방 원) 및 DU145 (고형 정사각형)에 대한 효과.
도 3 - 시간 함수로서 37 ℃에서 풀링된 인간 혈청 중에서 배양된 페길화된 hCGL-8mut-1의 활성: 겉보기 T0.5 = 100 ± 4 h.
도 4 - PEG-hCGL-8mut-1의 단회 용량은 마우스 모델에서 식이 중재 없이 혈청 L-메티오닌을 15시간 동안 치료적으로 관련된 수준으로 감소시킬 수 있다.
도 5 - 정상 식이 상의 마우스에서 혈청 L-메티오닌을 감소시키는데 있어서 200 mg/kg PEG-hCGL-NLV (개방 정사각형) 및 50 mg/kg PEG-hCGL-8mut-1 (개방 원)의 단회 용량의 비교.
예시적 구현예의 설명
본 발명은 hMGL-NLV 돌연변이체(E59N, R119L, E339V)에 대한 향상된 인간 메티오닌-γ-분해효소(hMGL)를 위한 물질의 조성물을 개시한다. 이들 돌연변이체는 높은 촉매적 활성을 나타내고, 따라서 저농도의 치료제가 환자의 투여를 위해필요할 수 있다. 이들 조작된 인간 효소는 아미노산 L-메티오닌을 분해한다.
이들 조성물은 암-특이적 대사 결함을 통해 종양 세포를 특이적으로 표적화하는 방법을 제공한다. 박테리아 효소가 또한 화학을 실행할 수 있는 반면, 이들의 용도는 매우 불안정하고 면역원성인 것으로 입증되었다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 아미노산을 포함하는 화합물을 의미하고, 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 비-원상태 방식으로 작동가능하게 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "반감기"(½-수명)는, 예를 들면, 포유동물에 주사 후 시험관내 또는 생체내에서 이의 폴리펩타이드의 농도가 반으로 감소하는데 필요한 시간을 의미한다.
용어 "작동가능한 조합으로", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 성분이 의도한 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 연결, 예를 들면, 핵산 분자가 소정의 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 유도할 수 있는 방식으로의 핵산 서열의 연결 또는 융합 단백질이 생성되도록 하는 방식으로의 아미노산 서열의 연결을 의미한다.
용어 "링커"는 두 개의 상이한 분자를 작동가능하게 연결하는 분자 브릿지로서 작용하는 화합물또는 잔기를 나타내는 것을 의미하고, 여기서 링커의 한 부분은 제1 분자에 작동가능하게 연결되고, 링커의 또 하나의 부분은 제2 분자에 작동가능하게 연결된다.
용어 "페길화된"은 소정의 이의 고도의 생체적합성 및 변형 용이성으로 인해 약물 담체로서 널리 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 접합을 의미한다. PEG는 화학적 방법을 통해 PEG 쇄의 말단에서 하이드록시 그룹을 통해 활성제에 커플링(예를 들면, 공유 결합)될 수 있지만, PEG 자체는 분자당 최대 2개의 활성제로 제한된다. 상이한 접근법에서, PEG와 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체적합성을 유지하지만 분자당 다수의 부착점의 추가 이점을 가지고 (따라서 더 큰 약물 부하를 제공하고), 다양한 용도에 적합하도록 합성적으로 설계될 수 있는 신규한 생체물질로서 개발되었다.
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 이의 전구체의 생성을 위해 필요한 조절 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리펩타이드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 목적하는 효소 활성이 유지되도록 코딩 서열 중 임의 부분에 의해 코딩될 수 있다.
용어 "원상태"는 천연 발생 공급원으로부터 분리되었을 때 유전자의 전형적인 형태, 유전자 생성물 또는 그 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 의미한다. 원상태 형태는 천연 집단에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이고, 따라서 임의로 정상 또는 야생형 형태로 지칭되는 것이다. 대조적으로, 용어 "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이체"는 원상태 유전자 또는 유전자 생성물과 비교했을 때 서열 및 기능적 특성에서 변형(즉, 변경된 특성)을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미한다.
용어 "벡터"는 핵산 서열이 이를 복제할 수 있는 세포 내로 도입을 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 의미하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 이 서열이 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래적이거나 서열이, 그 서열이 보통 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에서 세포 내의 서열에 대해 상동성임을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공염색체(예를 들면, YAC)를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하도록 충분히 잘 구비되어 있다(참조: 예를 들면, Maniatis 등, 1988 및 Ausubel 등, 1994, 둘 다 본원에 참고로 편입된다).
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에서, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 다른 경우에, 이들 서열은, 예를 들면, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있고, 이는 특정 숙주 세포 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 전사 및 번역을 통제하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 또한 제공하고 아래에 기재된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본원 전반에 사용된 용어 "치료적 이점" 또는 "치료적으로 효과적인"은 이 상태의 의료적 치료와 관련하여 상기 대상체의 웰빙을 촉진시키거나 향상시키는 것을 의미한다. 이는 비제한적으로 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함한다. 예를 들면, 암의 치료는, 예를 들면, 종양 크기의 감소, 종양 침입성의 감소, 암 성장률의 감소 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암 보유 대상체의 지속적 생존을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "K M"은 효소의 미카엘리스-멘텐 상수를 의미하고, 소정의 효소가 효소 촉매작용된 반응에서 이의 최대 속도의 절반을 제공하는 특정 기질의 농도로서 정의된다. 본원에 사용된 용어 "k cat"는 효소가 최대 효율에서 작동하는, 각 효소 부위가 단위시간 당 생성물로 전환되는 기질 분자의 턴오버 횟수 또는 기질 분자의 수를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "k cat/K M"은 얼마나 효율적으로 효소가 기질을 생성물로 전환시키는지의 척도인 특이성 상수이다.
용어 "시스타티오닌-γ-분해효소"(CGL 또는 시스타티오나제)는 시스타티오닌의 시스테인으로의 가수분해를 촉매작용하는 임의의 효소를 의미한다. 예를 들면, 이는 시스타티오닌-γ-분해효소의 영장류 형태 또는 특히 시스타티오닌-γ-분해효소의 인간 형태를 포함한다.
"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료적 이점을 수득할 목적으로 대상체에게 치료제의 투여 또는 적용 또는 대상체에 대한 절차 또는 양식의 성능을 의미한다. 예를 들면, 치료는 메티오니나제의 약제학적 유효량의 투여를 포함할 수 있다.
"대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 예를 들면, 영장류, 포유동물 및 척추동물을 의미한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
II. 메티오닌-γ-분해효소 및 시스타티오닌 -γ-분해효소
분해효소는 다양한 화학 결합의 분해를 촉매작용하여 흔히 새로운 이중 결합 또는 새로운 환 구조를 형성하는 효소이다. 예를 들면, 이 반응을 촉매작용하는 효소는 분해효소이다: ATP → cAMP + PPi. 분해효소는 그들이 단지 한쪽 방향의 반응에서 하나의 기질을 요구하지만, 역반응을 위해서는 두 개의 기질을 요구한다는 점에서 다른 효소와 상이하다.
다수의 피리옥살-5'-포스페이트(PLP)-의존 효소가 시스테인, 호모시스테인 및 메티오닌의 대사에 연관되어 있으며, 이들 효소는 Cys/Met 대사 PLP-의존 효소로 지칭되는 진화상 관련 패밀리를 형성한다. 이들 효소는 약 400개의 아미노산으로 구성된 단백질이며, PLP 그룹은 폴리펩타이드의 중앙 위치에 위치된 라이신 잔기에 부착된다. 이 패밀리의 일원은 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL), 시스타티오닌-γ-신타제(CGS), 시스타티오닌-β-분해효소(CBL), 메티오닌-γ-분해효소(MGL) 및 O-아세틸호모세린(OAH)/O-아세틸-세린(OAS) 설프하이드릴라제(OSHS)를 포함한다. 이들 모두에서 나타나는 공통점은 외부 기질 알디민을 유도하는 미카엘리스 복합체의 형성이다. 반응의 추가 과정은 특정 효소의 기질 특이성에 의해 결정된다.
예를 들면, 본 발명자들은 PLP-의존 분해효소 패밀리 일원, 예를 들면, 인간 시스타티오닌-γ-분해효소 내로 특정 돌연변이를 도입하여 이의 기질 특이성을 변경시켰다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 hMGL-NLV보다 실질적으로 더 높은 촉매적 활성을 갖는 기질로서의 L-Met를 분해하는 새로운 능력을 갖는 신규한 변이체를 생성하였다. 다른 구현예에서, 새로운 메티오닌 분해 활성을 생성하기 위한 다른 PLP-의존 효소의 변형이 또한 고려될 수 있다.
PLP-의존 효소로서, 메티오닌-γ-분해효소(EC 4.4.1.11)는 다음의 화학 반응을 촉매작용하는 효소이다: L-메티오닌 + H2O → 메탄티올 + NH3 + 2-옥소부타노에이트. 따라서, 이 효소의 두 기질은 L-메티오닌 및 H2O인 반면, 이의 3개의 생성물은 메탄디올, NH3 및 2-옥소부타노에이트이다. 이 효소는 분해효소의 패밀리, 구체적으로 탄소-황 분해효소의 부류에 속한다. 이 효소 부류의 체계적인 명칭은 L-메티오닌 메탄티올-분해효소(탈아민화 2-옥소부타노에이트-형성성)이다. 다른 공동 사용 명칭은 L-메티오니나제, 메티오닌 분해효소, 메티오니나제, 메티오닌 데티오메틸라제, L-메티오닌-감마-분해효소 및 L-메티오닌 메탄티올-분해효소(탈아민화)를 포함한다. 이 효소는 셀레노아미노산 대사에 참여한다. 이는 하나의 보조인자, 피리독살-5'-포스페이트를 사용한다.
메티오니나제는 보통 389 내지 441개 아미노산으로 구성되며, 동종 사량체를 형성한다. 메티오니나제 효소는 일반적으로 분자량 약 45kDa의 4개의 동일한 서브유닛으로 구성된다(참조: Sridhar 등, 2000; Nakamura 등, 1984). 효소의 구조는 결정화에 의해 밝혀졌다(참조: Kudou 등, 2007). 사량체의 각 세그먼트는 3개의 영역으로 구성된다: 2개의 나선과 3개의 베타-가닥을 포함하는 연장된 N-말단 도메인(잔기 1 내지 63), 8개의 알파-나선 사이에 샌드위치된 거의 평행의 7개 가닥의 베타-시트로 구성된 거대한 PLP 결합 도메인(잔기 64 내지 262) 및 C-말단 도메인 (잔기 263 내지 398). 보조인자 PLP는 촉매 기능을 위해 필요하다. 촉매작용에 중요한 아미노산이 구조를 기반으로 동정되었다. 다른 c-패밀리 효소에서 또한 강하게 보존되고 있는 인접하는 서브유닛의 Tyr59 및 Arg61은 PLP의 포스페이트 그룹과 접촉한다. 이들 잔기는 활성 부위 내의 주된 앵커로서 중요하다. 한 단량체의 Lys240, Asp241 및 Arg61 및 인접한 단량체의 Tyr114 및 Cys116은 효소에 특이성을 부여하는 메티오니나제 활성 부위에서 수소-결합 네트워크를 형성한다.
시스타티오닌-γ-분해효소(CGL 또는 시스타티오나제)는 시스타티오닌을 시스테인 및 α-케토부티레이트로 분해시키는 효소이다. 피리독살 포스페이트는 이 효소의 보결 분자단이다. 비록 포유동물이 메티오니나제(MGL)를 갖지 않지만, 이들은 박테리아 MGL 효소와 서열, 구조 및 화학적 상동성을 갖는 시스타티오나제를 함유한다. 실시예에 제시된 바와 같이, 단백질 유전자조작을 사용하여 L-메티오닌의 분해에 대한 활성이 없는 시스타티오나제를 이러한 아미노산을 고속으로 분해할 수 있는 효소로 전환시켰다.
III. 메티오니나제 유전자조작
인간이 메티오닌-γ-분해효소(MGL 또는 메티오니나제)를 생성하지 않기 때문에 인간 요법을 위해 생리학적 조건하에서 메티오닌을 분해하기 위한 높은 활성 및 특이성 뿐만 아니라 혈청과 같은 생체 유체에서 높은 안정성을 갖고, 이들이 정상적으로 면역학적 내성을 유도하는 원상태 단백질이기 때문에 또한 비면역원성인 메티오니나제를 조작할 필요가 있다.
pMGL (피. 푸티다(P. putida )로부터의 MGL)을 이용한 동물 연구에서 제시된 바람직하지 않은 면역원성 효과로 인해, 인간 효소에서 L-메티오닌 분해 활성을 조작하는 것이 바람직하다. 인간 단백질에 대한 면역학적 내성은 이러한 효소가 비면역원성이거나 최소로 면역원성이 되어 충분히 내성이도록 한다.
조작된 메티오니나제로서 MGL 활성을 갖는 신규한 효소의 특정 측면은 이러한 필요성을 다룬다. 비록 포유동물은 MGL을 갖지 않지만, 이들은 박테리아 MGL 효소와 서열, 구조 및 화학적 상동성을 갖는 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)를 갖는다. CGL은 포유동물 황전환 경로에서 마지막 단계를 촉매작용하는 사량체이다(참조: Rao 등, 1990). CGL은 L-시스타티오닌의 L-시스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매작용한다. 인간 CGL(hCGL) cDNA는 이전에 클로닝되고 발현되었지만, 비교적 저수율(약 5mg/L 배양물)이었다(참조: Lu 등, 1992; Steegborn 등, 1999).
예를 들면, 시스타티오닌-γ-분해효소가 원상태 형태로 메티오니나제 활성을 나타내지 않는 반면, 고효율로 메티오닌을 가수분해시키기 위해 돌연변이유발을 통해 변형된 영장류(특히 인간) 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL 또는 시스타티오나제)와 관련된 방법 및 조성물이 제공되었다.
일부 구현예는 변형된 단백질 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 구현예는 비변형된 버전과 비교할만한 적어도 하나의 기능적 활성, 바람직하게는 메티오니나제 효소 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 혈청 안정성을 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드"의 기능 또는 활성을 의미할 때, 당해 분야의 숙련가는 이것이, 예를 들면, 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드에 비해 추가의 이점, 예를 들면, 메티오니나제 효소 활성을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드는 원상태 시스타티오닌-γ-분해효소, 구체적으로는 인간 시스타티오닌-γ-분해효소이다. 구체적으로, "변형된 단백질"에 관한 구현예는 "변형된 폴리펩타이드"에 대하여 실시될 수 있고 반대의 경우로도 실시될 수 있음이 고려된다.
활성의 측정은 특히 단백질의 활성에 관하여 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 검정을 사용하여 달성할 수 있고, 비교 목적을 위해, 예를 들면, 변형된 또는 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드의 원상태 및/또는 재조합 버전의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 메티오니나제 활성은 알파-케토부티레이트, 메탄티올 및/또는 암모니아와 같은, 메티오닌의 전환으로부터 생성되는 임의의 기질의 생성을 검출하는 임의의 검정에 의해서 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드, 예를 들면, 변형된 시스타티오닌-γ-분해효소는 메티오닌 분해 활성에서 이의 증가를 기반으로 동정될 수 있다. 예를 들면, 비변형된 폴리펩타이드의 기질 인식 부위가 동정될 수 있다. 이러한 동정은 구조 분석 또는 상동성 분석을 기반으로 할 수 있다. 이러한 기질 인식 부위의 변형을 포함한 돌연변이체의 집단이 생성될 수 있다. 추가의 구현예에서, 메티오닌 분해 활성이 증가된 돌연변이체는 돌연변이체 집단으로부터 선택될 수 있다. 목적하는 돌연변이체의 선택은 메티오닌 분해로부터 부산물 또는 생성물의 검출과 같은 방법을 포함할 수 있다.
변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 보유할 수 있고, 따라서, 결실을 가진 단백질, 치환을 가진 단백질 및 결실과 치환을 가진 단백질이 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이들 변형된 단백질은 추가로 삽입 또는, 예를 들면, 융합 단백질 또는 링커를 가진 단백질과 같은 추가된 아미노산을 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 원상태 단백질의 1개 이상의 잔기가 결여되지만, 원상태 단백질의 특이성 및/또는 활성을 보유할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 특정 유기체, 예를 들면, 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체 종류에서 항원성을 나타내도록 결정되는 단백질의 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 것이다.
치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 함유하며, 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적이거나 그렇지 않을 수 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형태 및 전하를 갖는 것으로 대체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로.
결실 또는 치환 이외에, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 보유할 수 있으며, 이는 전형적으로 폴리펩타이드에 적어도 하나의 잔기의 부가를 포함한다. 이것은 표적화 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질로 칭명되는 말단 부가가 이하 논의된다.
용어 "생물학적 기능성 등가물"은 당해 분야에서 잘 이해되고 있고, 본원에서 추가로 상세히 정의된다. 따라서, 대조군 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 등가인 약 70% 내지 약 80% 또는 약 81% 내지 약 90% 또는 약 91% 내지 약 99%의 아미노산을 갖는 서열이 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한 포함된다. 변형된 단백질은 특정 측면에서 이의 원상태 대응물에 생물학적 기능성 등가물일 수 있다.
또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 잔기, 예를 들면, 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열을 포함할 수 있다는 것이 이해되고, 본질적으로 서열이 단백질 발현이 연관되는 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하는 상기 제시된 기준을 충족시키는 한 본원에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같을 것이다. 말단 서열의 부가는 특히, 예를 들면, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분에 인접하는 다양한 비코딩 서열을 포함할 수 있거나 다양한 내부 서열, 즉, 유전자내에서 발생하는 것으로 공지된 인트론을 포함할 수 있다.
IV. 요법을 위한 효소적 L-메티오닌 고갈
특정 측면에서, 폴리펩타이드는 간세포 암종, 흑색종 및 신장 세포 암종과 같은 메티오닌 고갈에 민감한 암을 포함한 질환을 L-메티오닌을 고갈시키는 새로운 효소로 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 구체적으로 메티오닌 분해 활성을 갖는 변형된 시스타티오닌-γ-분해효소를 사용하는 치료 방법을 개시한다. 아래에 기재된 바와 같이, 현재 이용가능한 메티오닌-γ-분해효소는 전형적으로 박테리아-유도 단백질이기 때문에 인간 요법에서 이들을 이용하는데 몇 가지 문제가 있다. 본 발명의 특정 구현예는 치료적 효능이 증가된 메티오닌-γ-분해효소 활성을 갖는 신규한 효소를 제공한다.
메티오닌 (L-Met) 고갈은 암의 잠재적 치료로서 오랫동안 연구되어 왔다. L-Met는 필수 아미노산인 반면, 많은 악성 인간 세포주 및 종양은 메티오닌에 대한 상대적으로 더 큰 요건을 갖는 것으로 밝혀졌다(참조: Halpern 등, 1974; Kreis 및 Goodenow, 1978; Breillout 등, 1990; Kreis 등, 1980; Kreis, 1979). 메티오닌-의존적 종양 세포주는 정상적으로 호모시스테인을 다시 L-Met로 재생하는 효소인 메티오닌 신타제를 전혀 제공하지 않거나 낮은 수준으로 제공한다(참조: Halpern 등, 1974; Ashe 등, 1974). 대부분의 정상 세포는 호모시스테인 및 호모시스틴과 같은 전구체에서 성장할 수 있는 반면, 다수의 악성 세포는 이들의 세포외 환경으로부터 직접 L-Met를 포획해야 한다. 또한, 임의의 급속히 성장하는 신생물은 성장에 필요한 필수적인 구성 요소의 결핍에 의해 유해하게 영향을 받을 수 있다. 메티오닌은 이의 고갈이 감소된 단백질 합성 뿐만 아니라 유전자 조절에 특히 중요한 이상조절된 S-아데노실메티오닌(SAM)-의존성 메틸화 경로를 유도하기 때문에 특히 중요하다.
정상 세포와 암 세포 사이의 메티오닌 요건의 차이는 치료적 기회를 제공한다. 효소적 메티오닌 고갈은 다수의 동물 모델 연구 뿐만 아니라 단계 I 임상 시험에서 탐구되고 있다(참조: Tan 등, 1997a; Tan 등, 1996a; Lishko 등, 1993; Tan 등, 1996b; Yoshioka 등, 1998; Yang 등, 2004a; Yang 등, 2004b; Tan 등, 1997b).
인간은 메티오닌 가수분해 효소가 없기 때문에, 다양한 공급원으로부터의 박테리아 L-메티오닌-γ -분해효소(MGL)가 암 요법에 대해 평가되어 왔다. 메티오닌-γ-분해효소는 메티오닌의 메탄티올, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매작용한다. 다양한 공급원으로부터의 박테리아 효소가 정제되어 암 세포주에 대한 메티오닌 고갈 제제로서 시험되었다. 피. 푸티다 (pMGL) 공급원은 다른 공급원과 비교하여 높은 촉매 활성, 낮은 K M 값, 및 상대적으로 높은 k cat 값 때문에 치료적 적용을 위해 선택되었다(참조: Esaki 및 Soda, 1987; Ito 등, 1976). 더욱이, pMGL에 대한 유전자는 이. 콜라이(E. coli ) 내로 클로닝되고, 단백질은 높은 단백질 수율로 발현되었다(참조: Tan 등, 1997a; Hori 등, 1996).
생체내 연구가 동물 모델 뿐만 아니라 인간에 대해 수행되었다. 탄 등(Tan 등 (1997a))은 누드 마우스에 이종 이식된 인간 종양으로 연구를 수행하였고, 폐, 결장, 신장, 뇌, 전립선 및 흑색종 암이 모두 pMGL에 민감하다는 것을 발견하였다. 추가로, 동물에서 체중 감소의 부재하에 결정되었기 때문에, 유효 용량에서 독성은 검출되지 않았다. 이들 실험에서 채혈 샘플로부터 측정된 반감기는 단지 2시간인 것으로 결정되었다. 추가로, MGL 활성을 유지하기 위해 PLP의 주입이 필요하다. 매우 짧은 반감기에도 불구하고, 탄 등(Tan 등 (1997a))은 염수 대조군과 비교하여 종양 성장의 억제를 보고하였다.
양 등(Yang 등 (2004b))은 영장류 모델에서 MGL의 약동학, 메티오닌 고갈 측면에서의 약력학, 항원성 및 독성을 연구하였다. 용량-범위 연구가 정맥내로 투여된 1000 내지 4000 단위/kg으로 수행되었다. 최고 용량은 주사 후 30분까지 혈장 메티오닌을 검출불가능한 수준(0.5 μM 미만)으로 감소시킬 수 있었고, 8시간 동안 메티오닌 수준은 검출불가능하게 잔류했다. 약동학 분석은 pMGL이 2.5 시간의 반감기로 제거되었음을 나타냈다. 2주 동안 하루 8시간마다 그 용량을 투여한 결과 2 μM 미만으로 혈장 메티오닌의 정상-상태 고갈을 유도했다. 가벼운 독성은 감소된 음식 섭취 및 약간의 체중 감소를 통해 관찰되었다. 불행하게도, 28일째의 재도전시 한 마리 동물에서 과민성 쇼크 및 사망을 초래하여 pMGL이 인간요법에 상당한 단점인 매우 면역원성임을 가리킨다. 하이드로코르티손에 의한 후속적 전처리는, 비록 구토가 빈번하게 관찰되었지만, 과민성 반응을 방지했다. 추가의 재도전이 66일째, 86일째 및 116일째에 수행되었다. 1차 도전 후 항-rMGL 항체가 검출되었고 치료 기간 동안 농도가 증가되었다.
MGL의 치료학적 실행에 대한 이들 관찰된 장애에 반응하여, 양 등(등 (2004b))은 효소의 페길화 및 이의 반감기 및 면역원성에 대한 영향을 연구하였다. 효소는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 석신이미딜 글루타레이트(MEGC-PEG-5000)에 커플링되었다. 용량 범위 연구가 재차 수행되었고 4,000 단위/kg(90 mg/kg)은 12시간 동안 혈장 메티오닌을 <5 μmol/L로 감소시키기에 충분하였다. 약동학 분석은 비페길화 효소에 비하여 페길화 효소의 혈청 청소능 반감기의 36배 향상을 나타냈다. 페길화는 또한 감소된 음식 섭취의 단지 약간의 독성 및 최소 체중 감소가 관찰되었기 때문에 면역원성을 다소 약화시켰다. 그러나, 활성 반감기는, L-Met 수준이 비페길화 효소의 8시간과 대조적으로 단지 12시간 동안 검출 수준 아래로 유지됨에 따라 향상되지 않았다. 이들 결과는, 항신생물제로서 L-Met 고갈 효소의 사용이 유망하지만, 면역원성 및 약동학의 중대한 결함으로 도전을 받고 있다.
본 발명의 특정 측면은 종양과 같은 질환을 치료하기 위한 메티오닌 분해 활성을 갖는 변형된 시스타티오닌-γ-분해효소를 제공한다. 특히 변형된 폴리펩타이드는 인간 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있고, 따라서 인간 환자에서 알러지 반응을 예방하고, 반복 투여를 허용하며, 치료적 효능을 증가시킬 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양은 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견된 것들과 같은 임의의 악성 세포 유형을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 비제한적으로 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있다. 예시적인 혈액 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는, 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평상피 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종 포함), 복막의 암, 간세포 암, 위 또는 위암(위장 암 및 위장 기질 암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장 암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장 암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 악성 흑자 흑색종, 선단 흑자성 흑색종, 결절성 흑색종 뿐만 아니라 B-세포 림프종(저등급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 작은 림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 작은 비절단된 세포 NHL; 거대종양 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 모발 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수 백혈병(AML) 및 만성 골수아세포 백혈병을 포함한다.
암은 구체적으로 하기 조직학적 형태일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대한 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평상피 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립 중 선암종; 선암종, 가족성 용종증 대장균; 고형 암종; 악성 유암종; 세기관지-폐포성 선암종; 유두상 선암종; 혐색소 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 이구성 선암종; 점액표피양 암종; 낭샘암종; 유두상 낭샘암종; 유두상 장액 낭샘암종; 점액성 낭샘암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 관상 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유선 파제트병; 샘꽈리 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평상피 화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유선외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유질 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽세포종; 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 난소고환종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중간콩팥종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽 연골육종; 골의 거대세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 법랑아세포성 선육종; 악성 사기질모세포종; 법랑아세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경아교종; 뇌실막세포종; 별아교세포종; 원형질 별아교세포종; 원섬유성 별아교세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절신경교세포종; 신경교세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 작은 림프구; 악성 림프종, 대세포, 확산; 악성 림프종, 여포성; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 작은 창자 질환; 백혈병; 림프모양 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 및 모발 세포 백혈병.
시스타티오나제로부터 유도된 조작된 인간 메티오니나제는 본원에서 종양 세포, 종양 조직 또는 암을 보유한 포유동물의 순환으로부터 메티오닌을 고갈시키거나 메티오닌의 고갈이 바람직한 것으로 고려되는 메티오닌의 고갈을 위한 다양한 양식에서 항종양제로서 사용될 수 있다.
고갈은 포유동물의 순환에서는 생체내, 조직 배양 또는 다른 생물학적 배지 중의 메티오닌 고갈이 목적시되는 경우에는 시험관내 및 생체액, 세포 또는 조직이 체외에서 조작된 후 환자 포유동물의 체내로 반환되는 경우 생체외 절차로 수행될 수 있다. 순환, 배양 배지, 생체액 또는 세포로부터 메티오닌의 고갈은 처리될 물질에 접근가능한 메티오닌의양을 감소시키기 위해 수행되고, 따라서 고갈되는 물질을 메티오닌 고갈 상태하에 조작된 인간 메티오니나제의 메티오닌 고갈 양과 접촉시켜 접촉되는 물질 중의 주위 메티오닌을 분해함을 포함한다.
종양 세포는 메티오닌을 위한 이들의 영양 배지에 의존하기 때문에, 고갈은 세포를 위한 영양원에 관한 것이지 반드시 세포 자체에 관한 것은 아니다. 따라서, 생체내 적용에서, 종양 세포의 치료는 종양 세포 집단을 위한 영양 배지를 조작된 메티오니나제와 접촉시킴을 포함한다. 이 구현예에서, 배지는 혈액, 림프액, 척수액 및 메티오닌 고갈이 목적시되는 유사 체액일 수 있다.
메티오닌-고갈 효능은 적용에 따라 매우 다양할 수 있고, 전형적으로 물질 중에 존재하는 메티오닌의 양, 목적하는 고갈율 및 메티오니나제에의 노출에 대한 물질의 내성에 의해 좌우된다. 물질 중의 메티오닌 수준 및 따라서 물질로부터 메티오닌 고갈율은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 화학적 및 생화학적 방법에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. 예시적인 메티오닌-고갈 양은 본원에서 추가로 기재되어 있고, 처리될 물질 밀리리터(mL) 당 0.001 내지 100 단위(U)의 조작된 메티오니나제, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 U의 조작된 메티오니나제일 수 있다.
메티오닌-고갈 조건은 메티오니나제 효소의 생물학적 활성에 적합한 완충제 및 온도 조건이며, 효소에 적합한 중간 정도의 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들면, 생리학적 조건을 포함한다. 예시적 조건은 약 4 내지 40 ℃, 약 0.05 내지 0.2M NaCl에 등가인 이온 강도 및 약 5 내지 9의 pH를 포함하는 반면, 생리학적 조건이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항종양제로서 조작된 메티오니나제를 사용하는 방법을 고려하고, 따라서 종양 세포 집단을 치료학적 유효량의 조작된 메티오니나제와 종양 세포 성장을 억제하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
하나의 구현예에서, 생체내 접촉은 정맥내 또는 복강내 주사로 본 발명의 조작된 메티오니나제를 포함하는 생리학적으로 허용되는 조성물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하여 환자에 존재하는 종양 세포의 순환성 메티오닌 공급원을 고갈시킴으로써 달성된다. 조작된 메티오니나제의 접촉은 또한 조작된 메티오니나제를 종양 세포를 함유하는 조직내로 투여함으로써 달성될 수도 있다.
조작된 메티오니나제의 치료학적 유효량은 목적하는 효과를 달성하기 위해, 즉, 종양조직내에서 또는 환자의 순환에서 메티오닌을 고갈시켜 종양 세포가 분열하는 것을 정지하도록 계산된 소정량이다. 따라서, 본 발명의 조작된 메티오니나제의 투여를 위한 투여량 범위는 종양 세포 분열 및 세포 순환의 증상이 감소되는 목적하는 효과를 생성하기에 충분할 만큼 많은 양이다. 투여량은 과다점성 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전 등과 같은 부작용을 일으킬 만큼 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 다양할 수 있고, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증의 경우에는 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
예를 들면, 치료학적 유효량의 조작된 메티오니나제는 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우 ml 당 조작된 메티오니나제 약 0.001 내지 약 100 단위(U), 바람직하게는 약 0.1 U 이상, 더 바람직하게는 1 U 이상의 혈관내 (혈장) 또는 국소 농도를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 전형적인 용량은 체중을 기준으로 투여될 수 있고, 약 5 내지 1000 U/킬로그램(kg)/일의 범위, 바람직하게는 약 5 내지 100 U/kg/일, 더 바람직하게는 약 10 내지 50 U/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 40 U/kg/일의 범위이다.
조작된 메티오니나제는 주사에 의해 또는 경시적으로 점진적 주입에 의해 비경구 투여될 수 있다. 조작된 메티오니나제는 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 공동내, 경피, 진피로 투여될 수 있거나, 연동 수단에 의해 전달될 수 있거나, 종양 세포를 함유하는 조직내로 직접 주사될 수 있거나, 포텐셜 바이오센서 또는 메티오닌을 함유할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다.
조작된 메티오니나제를 함유하는 치료 조성물은 통상적으로, 예를 들면, 단위 용량의 주사에 의한 것과 같이 정맥내로 투여된다. 치료 조성물과 관련하여 사용될 경우 용어 "단위 용량"은 대상체에게 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 단위를 가리키며, 각 단위는 필요한 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 혼합되어 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 물질의 소정량을 함유한다.
조성물은 투여 제형에 적합한 방식 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여량은 치료 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체 시스템의 용량 및 목적하는 치료 효과의 정도에 의해 좌우된다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의해 결정되며 각 개체에 따라 다르다. 그러나, 전신 적용을 위한 적합한 투여 범위는 본원에서 개시되어 있고 투여 경로에 의존한다. 최초 투여 및 추가접종 투여에 적합한 섭생이 또한 고려되며 최초 투여 후 1시간 이상의 간격으로 연속 주사 또는 다른 투여에 의해 반복 용량이 전형적이다. 예시적 다중 투여가 본원에 기재되어 있고, 연속적으로 조작된 메티오니나제의 높은 혈청 및 조직 수준으로, 반대로 메티오닌의 낮은 혈청 및 조직 수준으로 유지시키는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로, 생체내 요법에 특정된 범위로 혈중 농도를 유지시키기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
V. 접합체
본 발명의 조성물 및 방법은, 예를 들면, 이종성 펩타이드 세그먼트 또는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과의 접합체를 형성함으로써 향상을 위해 조작된 메티오니나제의 추가 변형을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 메티오니나제는 효소의 유체역학적 반경을 증가시키고 이에 따라 혈청지속성을 증가시키기 위해 PEG에 연결시킬 수 있다. 특정 측면에서, 개시된 폴리펩타이드는 임의의 표적화제, 예를 들면, 종양 세포 상의 외부 수용체 또는 결합 부위에 특이적이고 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드에 접합시킬 수 있다(미국 특허 공보 2009/0304666).
A. 융합 단백질
본 발명의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종성 도메인에 연결된 조작된 인간 메티오니나제를 가질 수 있다. 예를 들면, 융합은 또한 다른 종으로부터의 리더 서열을 이용하여 이종성 숙주에서 단백질의 재조합 발현이 가능하게 할 수 있다. 또 하나의 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 단백질 친화성 태그, 예를 들면, 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 예를 들면, 바람직하게는 절단가능한 항체 에피토프의 부가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토오스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함한다.
특정 구현예에서, 조작된 인간 메티오니나제는 생체내 반감기를 증가시키는 펩타이드, 예를 들면, XTEN 폴리펩타이드(참조: Schellenberger 등, 2009), IgG Fc 도메인, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드에 연결될 수 있다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이와 같은 단백질은, 예를 들면, 완전 융합 단백질의 새로운 합성에 의해 또는 이종성 도메인을 코딩하는 DNA 서열의 부착 후 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.
부모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은 일렬로 연결된 폴리펩타이드 사이에 스플라이싱된 펩타이드 링커를 코딩하는 가교성 DNA 세그먼트와 유전자를 결합시킴으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성되는 융합 단백질의 적절한 폴딩을 가능하게 하기에 충분한 길이여야 한다.
B. 링커
특정 구현예에서, 조작된 메티오니나제는 이작용성 가교결합 시약을 사용하여 화학적으로 접합시키거나 펩타이드 링커와 단백질 수준에서 융합시킬 수 있다.
이작용성 가교결합 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조물의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 동정 및 구조 연구를 포함한 다양한 목적으로 광범위하게 사용되어 왔다. 적합한 펩타이드 링커가 또한 조작된 메티오니나제, 예를 들면, Gly-Ser 링커를 연결시키는데 사용될 수 있다.
두 개의 동일한 작용기를 수반하는 동종이작용성 시약은 동일하고 상이한 거대분자들 또는 거대분자의 서브유닛 사이에 가교결합 및 폴리펩타이드 리간드의 이의 특정 결합 부위에의 결합을 유도하는데 매우 효율적인 것으로 입증되었다. 이종이작용성 시약은 2개의 상이한 작용기를 함유한다. 2개의 상이한 작용기의 차별적인 반응성을 이용함으로써 가교결합은 선택적 및 순차적 둘 다로 조절될 수 있다. 이작용성 가교결합 시약은 이들의 작용기, 예를 들면, 아미노-, 설프하이드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카복실-특이적 그룹의 특이성에 따라 분할될 수 있다. 이들 중, 유리 아미노 그룹에 대한 시약은 이들의 상업적 이용가능성, 합성 용이성 및 이들이 적용될 수 있는 온화한 반응 조건 때문에 특히 대중화되고 있다.
대부분의 이종이작용성 가교결합 시약은 1차 아민-반응성 그룹 및 티올-반응성 그룹을 함유한다. 또 하나의 예에서, 이종이작용성 가교결합 시약 및 가교결합 시약을 사용하는 방법은 기재되어 있다(미국 특허 제5,889,155호, 구체적으로 이의 전문이 본원에 참고로 편입됨). 가교결합 시약은 친핵성 하이드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 결합하여, 일례로서, 알데하이드의 유리 티올에의 커플링을 가능하게 한다. 가교결합 시약은 다양한 작용기를 가교결합시키기 위해 변형될 수 있다.
추가로, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 결합/커플링제 및/또는 기전이 인간 조작된 메티오니나제, 예를 들면, 항체-항원 상호작용, 아비딘 바이오틴 연결, 아미드 연결, 에스테르 연결, 티오에스테르 연결, 에테르 연결, 티오에테르 연결, 포스포에스테르 연결, 포스포르아미드 연결, 무수물 연결, 디설파이드 연결, 이온성 및 소수성 상호작용, 이중특이적 항체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 결합시키는데 사용될 수 있다.
합리적인 혈중 안정성을 갖는 가교결합제가 사용되는 것이 바람직하다. 표적화 및 치료/예방 제제를 접합시키는데 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체적으로 장애된 디설파이드 결합을 함유하는 링커가 더 큰 생체내 안정성을 제공한다는 것을 증명할 수 있다. 따라서, 이들 링커는 결합제의 한 그룹이다.
장애된 가교결합제 이외에, 비장애 링커가 또한 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(참조: Wawrzynczak 및 Thorpe, 1987). 이러한 가교결합제의 사용은 당해 분야에서 잘 이해되고 있다. 또 하나의 구현예는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
일단 화학적으로 접합되면, 펩타이드는 일반적으로 접합체를 비접합제 및 다른 오염물로부터 분리하기 위해 정제할 것이다. 다수의 정제 기술이 그들을 임상적으로 유용하도록 하는 충분한 순도의 접합체를 제공하는데 사용 가능하다.
크기 분리에 기초하는 정제 방법, 예를 들면, 겔 여과, 겔 침투 또는 고성능 액체 크로마토그래피가 일반적으로 가장 유용할 것이다. 다른 크로마토그래피 기술, 예를 들면, 블루-세파로오스 분리도 또한 사용될 수 있다. 나트륨 N-라우로일-사르코신(SLS)과 같은 약한 세정제를 사용하는 것과 같은 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하는 통상적인 방법이 유용할 수 있다.
C. 페길화
본 발명의 특정 측면에서, 조작된 메티오니나제의 페길화와 관련된 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들면, 조작된 메티오니나제는 본원에 개시된 방법에 따라 페길화될 수 있다.
페길화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 쇄를 또 하나의 분자, 보통 약물 또는 치료적 단백질에 공유 결합시키는 방법이다. 페길화는 PEG의 반응성 유도체를 표적 거대분자로 배양함으로써 통상적으로 달성된다. 약물 또는 치료 단백질에 PEG의 공유 결합은 숙주의 면역계로부터 제제를 "위장할" 수 있거나(감소된 면역원성 및 항원성), 제제의 유체역학적 크기(용액 중의 크기)를 증가시킬 수 있고, 이는 신장 청소능을 감소시킴으로써 이의 순환 시간을 연장시킨다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 수 용해성을 제공할 수 있다.
페길화의 제1 단계는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 PEG 중합체의 적합한 작용화이다. 동일한 반응성 잔기로 각 말단이 활성화되는 PEG는 "동종이작용성"으로서 공지되어 있는 한편, 존재하는 작용기가 상이한 경우 PEG 유도체는 "이종이작용성" 또는 "이종작용성"이라고 한다. PEG 중합체의 화학적 활성 또는 활성화된 유도체는 목적하는 분자에 PEG를 결합시키기 위해 제조된다.
PEG 유도체의 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링될 분자상의 이용가능한 반응성 그룹의 유형에 기초한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노 그룹 및 C-말단 카복실산이 또한 사용될 수 있다.
제1 세대 PEG 유도체를 형성하기 위해 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실 그룹과 반응성인 그룹, 전형적으로 무수물, 산 클로라이드, 클로로포르메이트 및 카보네이트와 반응시킨다. 제2 세대 페길화 화학에서, 더 효율적인 작용기, 예를 들면, 알데하이드, 에스테르, 아미드 등이 접합용으로 이용된다.
페길화의 적용이 점점 더 발전되고 정교해짐에 따라 접합을 위한 이종이작용성 PEG의 필요성이 증가하고 있다. 이들 이종이작용성 PEG는 친수성, 가요성 및 생체적합성 스페이서가 필요한 두 독립체를 결합시키는데 매우 유용하다. 이종이작용성 PEG를 위한 바람직한 말단 그룹은 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카복실산 및 NHS 에스테르이다.
가장 흔한 변형제 또는 링커는 메톡시 PEG (mPEG) 분자를 기준으로 한다. 이들의 활성은 알코올 말단에 단백질-변형 그룹을 부가하는 것에 의해 좌우된다. 일부 예에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 디올)이 전구체 분자로서 사용된다. 이어서, 디올은 이종- 또는 동정-이량체성 PEG-연결된 분자를 제조하기 위해 양쪽 말단에서 변형된다.
단백질은 일반적으로 비양자화 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노 그룹과 같은 친핵성 부위에서 페길화된다. 시스테이닐-특이적 변형 시약의 예는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 및 PEG 비닐설폰을 포함한다. 4개 모두는 온화한 조건하에서 강하게 시스테이닐-특이적이고 중성 내지 약 알칼리성 pH이지만, 각각은 약간의 결점을 갖는다. 말레이미드로 형성된 티오에테르는 알칼리성 조건하에서 다소 불안정할 수 있기 때문에 이러한 링커에 의한 제형화 옵션에 약간의 제한이 있을 수 있다. 요오도 PEG로 형성된 카바모티오에이트 결합은 더욱 안정하지만, 유리 요오드는 일부 조건하에서 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 디설파이드 결합을 형성하지만 이러한 결합은 또한 알칼리성 조건하에서 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 요오도 PEG에 비하여 상대적으로 느리지만, 형성된 티오에테르 결합은 매우 안정하다. 이의 보다 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응의 조절을 더 용이하게 할 수 있다.
원상태 시스테이닐 잔기에서 부위-특이적 페길화는, 이들 잔기가 보통 디설파이드 결합의 형태로존재하거나 생물학적 활성을 위해 필요하기 때문에, 거의 수행되지 않는다. 한편, 부위 지향적 돌연변이유발을 사용하여 티올-특이적 링커를 위해 시스테이닐 페길화 부위를 도입할 수 있다. 시스테인 돌연변이는 시스테인이 페길화 시약에 접근가능하고, 페길화 후 여전히 생물학적으로 활성이도록 설계되어야 한다.
아민-특이적 변형제는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 이소티오시아네이트 및 기타 몇 가지를 포함한다. 모두 온화한 조건하에서 반응하며 아미노 그룹에 대해 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마도 더 반응성인 제제 중 하나이지만, 이의 높은 반응성은 페길화 반응을 대규모에서 조절하기 어렵게 할 수 있다. PEG 알데하이드는 아미노 그룹과 이민을 형성한 다음, 수소화시아노붕소나트륨에 의해 2차 아민으로 환원된다. 수소화붕소나트륨과 달리, 수소화시아노붕소나트륨은 디설파이드 결합을 환원시키지 않는다. 그러나, 이 화학물질은 매우 독성이고, 특히 휘발성이 되는 낮은 pH에서 조심스럽게 다루어야 한다.
대부분의 단백질 상의 다수의 라이신 잔기로 인해 부위-특이적 페길화는 도전이 될 수 있다. 다행히, 이들 시약은 비양자화 아미노 그룹과 반응하기 때문에, 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 저-pK 아미노 그룹으로 페길화를 유도할 수 있다. 일반적으로, 알파-아미노 그룹의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노 그룹보다 1 내지 2 pH 단위 더 낮다. pH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써 N-말단에 대한 높은 선택성이 빈번히 달성될 수 있다. 그러나, 이는 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성을 위해 필요하지 않은 경우에만 가능하다. 여전히, 페길화로부터의 약동학적 이점은 빈번하게 시험관내 생물활성의 상당한 손실보다 더 커서 페길화 화학과 무관하게 훨씬 더 큰 생체내 생물활성을 갖는 생성물을 초래한다.
페길화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 가지 파라미터가 있다. 다행히, 보통 4가지 또는 5가지 이하의 중요한 파라미터가 있다. 페길화 조건의 최적화를 위한 "실험 설계" 접근법이 매우 유용할 수 있다. 티올-특이적 페길화 반응의 경우, 고려되는 파라미터는 다음을 포함한다: 단백질 농도, PEG 대 단백질 비율 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간 및 일부 경우에 산소 배제. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성에 기여할 수 있고, 이는 페길화 생성물의 수율을 감소시킨다.) 아민-특이적 변형의 경우에, pH가 특히 N-말단 아미노 그룹을 표적화할 때 훨씬 더 중요할 수 있다는 것 이외에는, 동일한 요소 (산소 제외와 함께)가 고려되어야 한다.
아민- 및 티올-특이적 변형 모두의 경우, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 온도, 단백질 농도 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, PEG 링커의 반응성은 페길화 반응의 개시 이전에 공지되어야 한다. 예를 들면, 페길화제가 단지 70% 활성인 경우, PEG의 사용량은 활성 PEG 분자만이 단백질 대 PEG 반응 화학양론에서 계수된다는 것을 보장해야 한다.
VI. 단백질 및 펩타이드
특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드, 예를 들면, 조작된 메티오니나제를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 융합 단백질에 포함되거나 상기 기재된 바와 같은 제제에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 단백질 또는 펩타이드는 일반적으로 비제한적으로 유전자로부터 번역된 전장 서열까지 약 200개 초과의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개 아미노산의 펩타이드를 가리킨다. 편의상 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "아미노산 잔기"는 당해 분야에 공지된 임의의 천연 발생 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방체를 가리킨다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 차단하는 임의의 비아미노산 없이 연속적이다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기의 서열은 하나 이상의 비아미노산 잔기에 의해 차단될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질 또는 펩타이드"는 천연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중의 적어도 하나 또는 적어도 하나의 변형되거나 특이한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
단백질 또는 펩타이드는 표준 분자 생물학 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩타이드의 분리 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이미 개시되어 있고, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 컴퓨터의 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 이와 같은 하나의 데이터베이스는 (전세계적인 웹 ncbi.nlm.nih.gov/ 상에서 이용가능) 미국 국립 생물공학 정보센터 유전자은행 및 GenPept 데이터베이스이다. 공지된 유전자의 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 사용하거나 당해 분야의 숙련가에게 공지된바와 같이 증폭시키고/시키거나 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 시판 제제가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
VII. 핵산 및 벡터
본 발명의 특정 측면에서, 조작된 메티오니나제 또는 조작된 인간 메티오니나제를 함유하는 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 사용된 발현 시스템에 따라 핵산 서열은 통상적인 방법을 기반으로 선택할 수 있다. 예를 들면, 조작된 메티오니나제가 인간 시스타티오나제로부터 유도되고 이. 콜라이에 드물게 사용되는 다중 코돈을 함유하면, 발현을 방해할 수 있다. 따라서, 각 유전자 또는 이의 변이체는 이. 콜라이 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 다양한 벡터가 또한 목적 단백질, 예를 들면, 조작된 메티오니나제를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 비제한적으로 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존 또는 리포좀계 벡터를 포함한다.
VIII. 숙주 세포
숙주 세포는 조작된 메티오니나제 및 이의 접합체의 발현 및 분비가 가능하도록 형질전환될 수 있는 임의의 것일 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 또는 사상균일 수 있다. 다양한 박테리아는 에스케리치아( Escherichia ) 및 바실러스(Bacillus)를 포함한다. 사카로마이세스( Saccharomyces ), 키유베로마이세스(Kiuyveromyces), 한세눌라( Hansenula ) 또는 피치아( Pichia ) 속에 속하는 효모가 적합한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 다음 속을 포함한 다양한 종의 사상균이 발현 숙주로서 사용될 수 있다: 아스페르길루스( Aspergillus ), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라( Neurospora ), 페니실리움( Penicillium ), 세팔로스포륨(Cephalosporium), 아킬라( Achlya ), 포도스포라( Podospora ), 엔도티아(Endothia), 뮤코르( Mucor ), 코클리오볼루스( Cochliobolus ) 및 피리쿨라리아(Pyricularia).
사용가능한 숙주 유기체의 예는 박테리아, 예를 들면, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli ) MC1061, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) BRB1 (Sibakov 등, 1984), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ) SAI123 (Lordanescu, 1975) 또는 스트렙토코쿠스 리비단스(Streptococcus lividans ) (Hopwood 등, 1985)의 유도체; 효모, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ) AH 22 (Mellor 등, 1983) 또는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe ); 및 사상균, 예를 들면, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans ), 아스페르길루스 아와모리( Aspergillus awamori ) (Ward, 1989), 또는 트리코데르마 리세이( Trichoderma reesei ) (Penttila 등, 1987; Harkki 등, 1989)를 포함한다.
포유동물 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61), 랫트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 랫트 간암 세포(H-4-II-E; ATCCCRL 1548), SV40-형질전환된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 뮤린 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다. 상기한 것들은 당해 분야에 공지된 많은 가능한 숙주 유기체의 제한이 아니라 예시적인 것을 의미한다. 원칙적으로, 분비할 수 있는 모든 숙주는 원핵이든 진핵이든 사용될 수 있다.
조작된 메티오니나제 및/또는 이들의 융합 단백질을 발현시키는 포유동물 숙주 세포는 부모 세포주를 배양하는데 전형적으로 사용되는 조건하에서 배양된다. 일반적으로, 세포는 전형적으로 5 내지 10% 혈청, 예를 들면, 태아 소 혈청이 보충된 생리학적 염 및 영양소 함유 표준 배지, 예를 들면, 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM에서 배양한다. 배양 조건은 또한 표준이고, 예를 들면, 배양물은 목적하는 수준의 단백질이 달성될 때까지 정지상 또는 롤러 배양물에서 37 ℃에서 배양한다.
IX. 단백질 정제
단백질 정제 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은 한 단계에서 세포, 조직 또는 기관의 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획으로의 균질화 및 조 분획화를 포함한다. 목적하는 단백질 또는 폴리펩타이드는 달리 특정하지 않는 한 부분 또는 완전 정제 (또는 균질성으로의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합화된 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전점 전기영동이다. 특히 효율적인 펩타이드 정제 방법은 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다.
정제된 단백질 또는 펩타이드는 다른 성분으로부터 분리가능한 조성물을 의미하고, 여기서 상기 단백질 또는 펩타이드는 이의 천연적으로 획득가능한 상태에 비하여 어느 정도로 정제된다. 따라서, 단리되거나 정제된 단백질 또는 펩타이드는 또한 이것이 천연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질 또는 펩타이드를 가리킨다. 일반적으로, "정제된"은 분획화에 적용되어 다양한 다른 성분들이 제거된 단백질 또는 펩타이드 조성물을 가리키며, 이 조성물은 실질적으로 이의 발현된 생물학적 활성을 유지한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 지정은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들면, 조성물 중의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 가리킨다.
단백질 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술이 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이들은, 예를 들면, 황산암모늄, PEG, 항체 등으로의 침전, 열변성 후 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전점 전기영동, 겔 전기영동 및 이들의 조합 및 다른 기술을 포함한다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 바꿀 수 있거나 특정 단계를 생략하고서도 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조를 위한 적합한 방법을 초래할 수 있다고 간주된다.
단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법이 본 개시내용에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은, 예를 들면, 활성 분획의 고유 활성을 결정하거나 SDS/PAGE 분석에 의해 분획내 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 고유 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 고유 활성과 비교하며, 이에 따라 그 안의 순도의 정도를 계산하여 "-배 정제 값"으로 평가하는 것이다. 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 물론 정제를 수행하기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의해 좌우된다.
단백질 또는 펩타이드가 가장 정제된 상태로 항상 제공되는 일반적인 요건은 없다. 사실, 덜 실질적으로 정제된 생성물이 특정 구현예에서 유용성을 가질 수 있음이 고려된다. 부분적인 정제는 소수의 정제 단계를 조합하여 사용하거나 동일한 일반적인 정제 방식의 다른 형태를 이용함으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일 기술에 비하여 일반적으로 보다 큰 "-배" 정제를 초래하는 것으로 이해된다. 보다 낮은 정도의 상대적 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 전체 회수에서 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 이점을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 단리되거나 정제된, 예를 들면, 조작된 메티오니나제, 조작된 메티오니나제를 함유하는 융합 단백질 또는 페길화 후의 조작된 메티오니나제일 수 있다. 예를 들면, His 태그 또는 친화성 에피토프가 이러한 조작된 메티오니나제에 포함되어 정제를 용이하게 할 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 단리되는 물질과 이와 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특정 친화성에 의존하는 크로마토그래피 절차이다. 이는 상호 작용의 수용체-리간드 유형이다. 컬럼 재료는 결합 파트너 중의 하나를 불용성 매트릭스에 공유 커플링함으로써 합성된다. 이어서, 컬럼 재료는 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 일어나지 않는 조건(예를 들면, 변경된 pH, 이온 강도, 온도 등)으로 변경함으로써 일어난다. 매트릭스는 분자를 임의의 유의적인 정도로 흡착하지 않고 광범위한 범위의 화학적, 물리적 및 열 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 리간드는 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 커플링되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 단단한 결합을 제공해야 한다. 또한, 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않고서 물질을 용출시킬 수 있어야 한다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자가 크기별로 또는 보다 기술적인 용어로 이들의유체역학적 용적을 기준으로 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 이는 보통 큰 분자 또는 거대분자 복합체, 예를 들면, 단백질 및 공업용 중합체에 적용된다. 전형적으로, 수용액을 사용하여 샘플을 컬럼을 통해 이송시키는 경우, 이 기술은 유기 용매가 이동상으로서 사용되는 경우 사용되는 명칭 겔 침투 크로마토그래피와 대조적으로 겔 여과 크로마토그래피로 공지되어 있다.
SEC의 기본 원리는 상이한 크기의 입자들이 상이한 속도로 정지상을 통해 용출(여과)한다는 것이다. 이는 크기에 따라 입자의 용액을 분리를 초래한다. 모든 입자들이 동시에 또는 거의 동시에 로딩되는 전제하에, 같은 크기의 입자는 함께 용출되어야 한다. 각각의 크기 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량의 범위를 갖는다. 배제 한계는 그 범위의 최상위에 해당하는 분자량으로 정의되며 분자가 너무 커서 정지상에 포획되지 않는 경우이다. 침투 한계는 분리 범위의 최하위에 해당하는 분자량으로 정의되며 충분히 작은 크기의 분자들이 정지상의 세공내로 완전히 침투할 수 있고 이 분자량 이하의 모든 분자들은 단일 밴드로서 용출할 수 있을 만큼 작은 경우이다.
고성능 액체 크로마토그래피 (또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리하고, 동정하고 정량화하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 흔히 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 패키징 재료를 유지시키는 컬럼(정지상), 컬럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프 및 분자의 체류 시간을 보여주는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 정지상, 분석될 분자 및 사용된 용매(들) 사이의 상호작용에 따라 다양하다.
X. 약제학적 조성물
신규한 메티오니나제는 종양 세포 성장을 억제하기 위해, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암을 가진 암환자의 암세포를 사멸시키기 위해 전신 또는 국소 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 정맥내, 척수내 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 또는 항증식성 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이들은 수술 또는 다른 절차 이전의 환자에게 암 부하를 감소시키기 위해 투여된다. 대안적으로, 이들은 임의의 잔류성 암(예를 들면, 수술이 제거하지 못한 암)이 생존하지 않음을 보장하기 위해 수술 후 투여할 수 있다.
본 발명은 치료제의 특정 특성으로 제한되는 것은 의도되지 않는다. 예를 들면, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료제는 가축과 같은 포유류에 수의용으로 투여되거나 다른 치료제와 유시한 방식으로 인간에게 임상용으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 방식 뿐만 아니라 개체 대상체의 특화된 요건에 따라 다양할 수 있다.
이러한 조성물은 전형적으로 주사제로서 사용하기 위한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는, 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이다. 또한, 필요한 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
임상 적용이 고려되는 경우, 단백질, 항체 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 의도한 용도에 적합한 형태로 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 조작된 메티오니나제 또는 추가의 제제를 포함할 수 있다. 어구 "약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 적절한 예로서 인간과 같은 동물에게 투여될 때 부작용, 알레르기 또는 다른 유해한 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 가리킨다. 본원에 개시된 방법에 의해 단리된 적어도 하나의 조작된 메티오니나제 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 본원에 참고로 편입된 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990)에 예시된 바와 같이, 본 개시내용으로부터 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 또한, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 생물학적 표준의 FDA 사무소에 의해요구되는 무균성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같은(참조: 예를 들면, 본원에 참고로 편입된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990)) 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장성 제제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이러한 유사 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분에 비적합한 경우를 제외하고 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 특정 구현예는 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지의 여부 및 주사제와 같이투여 경로에 멸균성일 필요가 있는지의 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내, 진피내, 경피, 척추강내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 지속 주입, 직접 국재화된 관류욕 표적 세포로, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물(예를 들면, 리포좀)로, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 상기한 것들의 임의의 조합(참조: 예를 들면, 본원에 참고로 편입된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990)으로 투여될 수 있다.
변형된 폴리펩타이드는 유리 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물내로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 유리 아미노 그룹으로 형성된 것들 또는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산 또는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 하이드록사이드 또는 이러한 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 투여 제형에 적합한 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여된다. 제형은, 예를 들면, 주사가능한 용액 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸과 같은 비경구 투여용으로 제형화되거나 약물 방출 캡슐 등과 같은 영양 투여용으로 제형화된 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
추가로, 본 발명의 특정 측면에 따라 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 불활성희석제 없이 약제학적으로 허용되는 담체에 제공될 수 있다. 담체는 동화성이어야 하며, 액체, 반-고체, 즉, 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수령자 또는 이에 함유된 조성물의 치료적 유효성에 유해한 경우를 제외하고, 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여가능한 조성물에서의 이의 사용은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 생리식염수, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 산화방지제를 포함할 수 있다. 추가로, 미생물의 작용의 예방은 방부제, 예를 들면, 비제한적으로 파라벤(예를 들면, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함한 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 초래될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따라 조성물은 담체와 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉, 용액, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡착 등에 의해 조합된다. 이러한 절차는 당해 분야의 숙련가에게 통상적이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 조합되거나 혼합된다. 혼합은 연삭과 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 안정화제는 또한 조성물을 치료적 활성의 손실, 즉, 위에서의 변성으로부터 보호하기위해 혼합 공정에 첨가될 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예는 완충제, 아미노산, 예를 들면, 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예를 들면, 덱스트로스, 만노스, 갈락토오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨 등을 포함한다.
추가의 구현예에서, 조작된 메티오니나제, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 물에서 특징적으로 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 임의의 광범위한 범위의 물질을 포함하는 것으로 정의된다. 이와 같은 광범위한 부류의 화합물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에서 사용됨에 따라, 이는 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연 발생적이거나 합성(즉, 사람에 의해 설계 또는 생성)일 수 있다. 그러나, 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파타이드, 에테르 및 에스테르-연결된 지방산을 갖는 지질 및 중합성 지질 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물도 또한 조성물 및 방법에 포함된다.
당해 분야의 숙련가는 지질 비히클에 조성물을 분산시키는데 사용될 수 있는 기술의 범위에 친숙할 것이다. 예를 들면, 조작된 메티오니나제 또는 이의 융합 단백질은 당해 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유 결합되거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 또는 리포좀과 함께 함유되거나 복합체를 형성하거나, 또는 달리 지질 또는 지질 구조와 관련될 수 있다. 분산은 리포좀을 형성할 수 있거나 그렇지 않을 수도 있다.
동물 환자에 투여된 조성물의 실제 투여량은 체중, 상태의 중증도, 치료될 질환의 종류, 이전 또는 병행되는 치료적 중재, 환자의 특발성 질환 및 투여 경로와 같은 신체적 및 생리적 요인에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 다양할 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우라도 개체 대상체를 위해 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 약 60%, 예를 들면, 이들 범위 내에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 성분(들)의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 소정 단위 용량으로 획득되는 정도이다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 요소가 이러한 약제학적 제형을 제조하는 분야의 숙련가에 의해 고려되며, 이와 같이 다양한 투여량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, to 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상 및 이들 범위 내에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 상기 기재된 수치를 기반으로 하여 투여될 수 있다.
XI. 병용 치료
특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 조작된 메티오니나제를 제2 또는 추가 요법과 조합하여 투여함을 포함한다. 이러한 요법은 메티오닌 의존성과 관련되는 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들면, 질환은 암일 수 있다.
병용 요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료 또는 보호 효과를 향상시키고/시키거나 또 하나의항암 또는 항과증식성 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료적 및 예방적 방법 및 조성물은 목적하는 효과, 예를 들면, 암 세포의 사멸 및/또는 세포성 과증식의 억제를 달성하기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 방법은 세포를 조작된 메티오니나제 및 제2 요법 모두와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 제제(즉, 조작된 메티오니나제 또는 항암제)와 접촉시킬 수 있거나, 조직, 종양 및/또는 세포를 둘 이상의 별개의 조성물 또는 제형과 접촉시킬 수 있고, 이? 하나의 조성물은 1) 조작된 메티오니나제, 2) 항암제 또는 3) 조작된 메티오니나제 및 항암제 둘 다를 제공한다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 수술 요법 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
세포에 적용될 때 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 치료 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접 병렬로 위치되는 방법을 기재하기 위해 사용된다. 세포 사멸을 달성하기 위해, 예를 들면, 두 제제는 세포를 사멸시키거나 세포가 분할되는 것을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포로 전달된다.
조작된 메티오니나제는 항암 치료 전, 치료 동안, 치료 후 또는 항암 치료에 대한 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시에 내지 수 분 내지 수 일 내지 수 주의 범위의 간격으로 할 수 있다. 조작된 메티오니나제가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 일반적으로 두 화합물이 여전히 환자에 유리하게 조합 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않았음을 보장한다. 이러한 경우에, 환자에게 조작된 메티오니나제 및 항암 요법을 서로 약 12 내지 24시간 또는 72시간 이내에, 더욱 특히 서로 약 6 내지 12시간 이내에 제공할 수 있다는 것이 고려된다. 일부 상황에서, 수 일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 각 투여 사이에 경과하는 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90일 이상 지속될 것이다(이러한 상기 범위는 중재 일을 포함한다). 하나의 제제는 1일 내지 90일의 임의의 날(이러한 상기 범위는 중재 일을 포함한다) 또는 이의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 또 하나의 제제는 1일 내지 90일의 임의의 날(이러한 상기 범위는 중재 일을 포함한다) 또는 이의 임의의 조합에 제공되는 것이 고려된다. 하루(24시간) 이내에, 환자는 제제(들)를 1회 또는 다중 투여할 수 있다. 또한, 치료 과정 후, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 존재한다는 것이 고려된다. 이 기간은 환자의 상태, 예를 들면, 그들의 진단, 강도, 건강 등에 따라 1 내지 7일, 및/또는 1 내지 5주, 및/또는 1 내지 12개월 또는 그 이상(이러한 상기 범위는 중재 일을 포함한다) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 이하 예의 경우, 조작된 메티오니나제는 "A"이고, 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
본 구현예의 임의의 화합물 또는 요법의 환자에의 투여는, 존재하는 경우, 제제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적 프로토콜을 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
A. 화학요법
다양한 화학요법제가 본 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 의미한다. "화학치료제"는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 세포 내에서 이들의 활동 방식, 예를 들면, 그들이 세포 주기에 영향을 미치는지 그리고 어떤 단계에 있는지에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 제제는 DNA를 직접 가교결합시키고, DNA에 삽입하거나 핵산 합성에 영향을미침으로써 염색체 및 유사분열 수차를 유도하는 능력을 기반으로 특성화될 수 있다.
화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민 및 에틸렌이민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드 및 우라실 머스타드; 니트로수레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들면, 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 안티오바이오틱 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 아이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들면, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항-대사물, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-부신, 예를 들면, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들면, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파마이드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들면, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 젬시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
B. 방사선요법
DNA 손상을 유도하고 광범위하게 사용된 다른 인자는 일반적으로 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에 방사성 동위 원소의 지시 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태, 예를 들면, 마이크로웨이브, 양성자 빔 조사(미국 특허 5,760,395 및 4,870,287) 및 UV-조사가 또한 고려된다. 이들 인자 모두가 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 보상 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 범위의 손상에 영향을 미치는 것이 가장 가능하다. X-선의 투여량 범위는 연장된 기간 동안(3 내지 4주) 1일 조사량 50 내지 200뢴트겐 내지 단일 조사량 2000 내지 6000뢴트겐이다. 방사성 동위 원소의 투여량 범위는 매우 다양하고, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 좌우된다.
C. 면역요법
숙련가는 면역요법이 구현예의 방법과 조합하여 또는 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역요법은 일반적으로 종양 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)은 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 효과기로서 작용할 수 있거나, 이는 세포 사멸에 실제로 영향을 미칠 수 있는 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료제, 방사선핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고, 단지 표적화 제제로서 기능한다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 동반하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
면역요법의 한 측면에서, 종양 세포는 표적화할 수 있는, 즉, 대다수의 다른 세포에는존재하지 않는 일부 마커를 포함해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하고, 이들 중 어느 하나는 본 구현예의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 통상적인 종양 마커는 CD20, 암 배아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 측면은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 사이토카인, 예를 들면, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들면, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들면, FLT3 리간드를 포함하는 면역 자극 분자도 또한 존재한다.
현재 조사 중이거나 사용 중인 면역요법의 예는 면역 보조제, 예를 들면, 마이코박테리움 보비스, 플라스모디엄 팔시파럼, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 5,801,005 및 5,739,169; Hui 및 Hashimoto, 1998; Christodoulides 등, 1998); 사이토카인 요법, 예를 들면, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF (Bukowski 등, 1998; Davidson 등, 1998; Hellstrand 등, 1998); 유전자 요법, 예를 들면, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53 (Qin 등, 1998; Austin-Ward 및 Villaseca, 1998; 미국 특허 5,830,880 및 5,846,945); 및 단클론성 항체, 예를 들면, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi 등, 1998; 미국 특허 5,824,311)이다. 하나 이상의 항암 요법이 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
D. 수술
암을 갖는 사람의 약 60%는 예방적, 진단 또는 단계적, 치유적 및 고식적 수술을 포함하는 일부 형태의 수술을 받을 것이다. 치유적 수술은 암성 조직의 모두 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴되는 절제를 포함하고, 다른 요법, 예를 들면, 본 구현예의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적 요법과 같은 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 의미한다. 종양 절제 이외에, 수술 치료는 레이져 수술, 냉동 수술, 전기 수술, 현미경 조절 수술(모스 수술)을 포함한다.
암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 모두의 절제시, 공동이 체내에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법을 갖는 영역의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 물론 다양한 투여량일 수 있다.
E. 다른 제제
다른 제제가 치료의 치료적 효능을 향상시키기 위해 본 구현예의 특정 측면과 함께 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 이들 추가 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식억제성 및 분화 제제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 민감성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접합 수 상승에 의한 세포내 신호전달의 증가는 인접하는 과증식성 세포 집단에 대한 항과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포 증식 억제성 또는 분화 제제는 치료의 항과증식성 효능을 향상시키기 위해 본 구현예의 특정 측면과 함께 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 구현예의 효능을 향상시키기 위해 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 국소 부착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감성을 증가시키는 다른 제제, 예를 들면, 항체 c225는 치료 효능을 향상시키기 위해 본 구현예의 특정 측면과 함께 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
XII. 키트
본 발명의 특정 측면은 치료적 키트와 같은 키트를 제공할 수 있다. 예를 들면, 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 약제학적 조성물 및 임의로 사용 지침서를 포함할수 있다. 키트는 또한 이러한 조성물의 투여를 달성하기 위한 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대상체 키트는 암성 종양내로 조성물의 직접적인 정맥내 주사를 달성하기 위한 카테터와 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체 키트는 임의로 전달 장치와 함께 사용하기 위해 약제로서 제형화 또는 동결건조된 조작된 메티오니나제의 예비-충전된 앰풀을 포함할 수 있다.
키트는 라벨이 있는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 상기 기재된 바와 같은 치료적 적용 또는 비치료적 적용에 효과적인 조작된 메티오니나제를 포함하는 조성물을 보유할 수 있다. 용기 상의 라벨은 조성물이 특정 요법 또는 비치료적 적용을 위해 사용된다는 것을 지시할 수 있고, 또한 상기 기재된 바와 같은 생체내 또는 시험관내 용도의 방향을 나타낼 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 침, 주사기 및 사용 지침서를 갖는 포장내 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함한다.
XIII. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 증명하기 위해 포함된다. 당해 분야의 숙련가는 아래 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에 잘 기능하는 것으로 본 발명자들에 의해 개발된 기술을 대표하고, 따라서 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음이 인해되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 본 개시내용에 비추어, 개시되어 있는 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1 - 메티오닌-γ-분해효소 활성을 위해 조작된 시스타티오닌 -γ-분해효소
CGL은 포유동물 황전환 경로에서 마지막 단계를 촉매작용하는 사량체이다(참조: Rao 등, 1990). CGL은 L-시스타티오닌의 L-시스테인, 알파-케토부티레이트 및 암모니아로의 전환을 촉매작용한다. 인간 CGL(hCGL) cDNA는 비교적 낮은 수율(약 5 mg/L 배양물)로 이전에 클로닝되고 발현되었다(참조: Lu 등, 1992; Steegborn 등, 1999). 가이드로서 CGL 및 MGL 효소의 서열 및 구조적 정렬을 사용하여, hCGL을 메티오닌의 효율적인 분해를 위한 효소로 전환시켰다.
실시예 2 - 유전자 합성 및 향상된 변형된 발현
인간 시스타티오닌 -γ-분해효소
인간 시스타티오닌-γ-분해효소 유전자는 이. 콜라이에서 거의 이용되지 않고 발현을 방해할 수 있는 다수의 코돈을 함유한다. 따라서, 이. 콜라이에서 단백질 발현을 최적화하기 위해, 각 유전자는 DNA-Works 소프트웨어를 사용하여 설계된 코돈 최적화 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 조립하였다(참조: Hoover 등, 2002). 각 작제물은 클로닝을 단순화하기 위한 N-말단 NcoI 제한 부위, 인-프레임 N-말단 His6 태그 및 C-말단 EcoRI 부위를 함유한다. pET28a 벡터(Novagen) 내로 클로닝 후, 적절한 시스타이오나제 발현 벡터를 함유하는 이. 콜라이 (BL21)를 진탕기 플라스크에서 250 rpm에서 50 μg/mL 칸나마이신을 함유하는 테리픽 브로쓰(TB) 배지를 사용하여 약 0.5 내지 0.6의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에서 성장시켰다. 이 시점에서 배양물을 25 ℃에서 진탕기로 전환시키고, 0.5 mM IPTG로 유도하고 추가로 12시간 동안 단백질을 발현시켰다. 이어서, 세포 펠렛을 원심분리로 수집하고, IMAC 완충제(10 mM NaPO4/10 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)에 재현탁시켰다. 프렌치 압력 세포로 용해한 후, 용해물을 4 ℃에서 20분 동안 20,000 x g으로 원심분리하고, 생성되는 상청액을 니켈 IMAC 컬럼에 적용하고, 10 내지 20 컬럼 용적의 IMAC 완충제로 세척한 다음, IMAC 용출 완충제 (50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)로 용출시켰다. 이어서, 효소를 함유한 분획을 10 mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP)와 함께 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 10,000 MWCO 원심분리 여과 장치(AMICON®)를 사용하여, 단백질을 100 mM PBS, 10% 글리세롤, pH 7.3 용액으로 수 회 완충제 교환했다. 이어서, 효소 분액을 액체 질소에서 플래시 냉동시키고, -80 ℃에서 저장하였다. 이러한 방식으로 정제된 CGL 및 CGL 변이체는 SDS-PAGE 및 쿠마씨 염색에 의해 평가된 바와 같이 >95% 균질성이었다. 수율은 6M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 20 mM 인산염 완충제, pH 6.5의 최종 완충제 농도에서 계산된 흡광 계수, λ280 = 29,870 M-1cm- 1를 기준으로 하여 약 400 mg/L 배양물로 계산되었다(참조: Gill 및 von Hippel, 1989).
실시예 3 - 메티오닌-γ-분해효소 활성 및 클론의 등급화를 위한 96-웰 플레이트 스크린
MGL 및 CGL 둘 다는 이들의 각각의 기질로부터 2-케토부탄산을 생성한다. 3-메틸벤조티아졸린-2-온 하이드라존(MBTH)을 사용하는 α-케토 산을 검출하기 위한 비색계 분석(참조: Takakura 등, 2004)을 작은 라이브러리를 스크리닝하고 가장 큰 METase(메티오닌-γ-분해효소) 활성을 갖는 클론을 등급화하기 위한 96-웰 플레이트 포맷으로 조정하였다. 이 플레이트 스크린은 돌연변이유발 라이브러리로부터 가장 활성인 클론을 채집하기 위한 용이한 방법을 제공한다. 부모 대조군보다 더 큰 활성을 나타내는 클론을 추가의 특성화를 위해 선택하여 동력학 분석을 위한 약간의 변이체보다 더 정제할 필요성을 제거한다.
돌연변이된 hCGL, hCGL 또는 pMGL을 함유하는 단일 콜로니를 50 μg/mL 칸나마이신을 함유하는 75 μL의 TB 배지/웰을 함유하는 96-웰 배양 플레이트에서 채집했다. 이어서, 이들 배양물을 약 0.8 내지 1의 OD600에 도달할 때까지 플레이트 진탕기 상에서 37 ℃에서 성장시켰다. 25 ℃로 냉각시킨 후, 50 μg/mL 칸나마이신 및 0.5 mM IPTG를 함유하는 추가의 75μL의 배지/웰을 첨가하였다. 발현을 2시간 동안 진탕시키면서 25 ℃에서 수행한 후, 100μL의 배양물/웰을 96-웰 검정 플레이트로 옮겼다. 이어서, 검정 플레이트를 원심분리시켜 세포를 펠렛화하고, 배지를 제거하고, 50 μL/웰의 B-PER® 단백질 추출 시약(Pierce)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 원심분리로 제거한 후, 용해물을 37 ℃에서 5mM L-Met와 10 내지 12시간 동안 배양했다. 이어서, 반응물을 1M 나트륨 아세테이트, pH 5 중의 0.03% MBTH 용액 3부를 첨가하여 유도체화하였다. 플레이트를 50 ℃에서 40분 동안 가열하고, 냉각시킨 후 미세역가 플레이트 판독기로 320 nm에서 판독했다.
실시예 4 - hCGL - E59N - R119L - E339V로부터 유도된 향성된 메티오닌 분해 변이 체를 생성하기 위한 라이브러리 설계
hCGL-E59N-R119L-E339V (hCGL-NLV) 메티오닌 분해 효소를 위한 유전자를 활성이 향상된 추가의 변이체를 생성하기 위한 개시점으로 사용했다. 아미노산 서열 정렬은 다양한 유기체로부터 MGL 및 CGL 서열을 사용하여 생성했다. 돌연변이유발을 위해 선택된 영역은 MGL 효소 모두가 하나의 보존된 잔기를 갖고 CGL 효소 모두가 상이한 보존된 잔기를 갖는 특정 정렬 부위에서 동정되었다. MGL 및 CGL이 매우 상동성 구조를 갖지만, 이들은 서로 각각의 기질을 분해하지 않아서 MGL 및 CGL 효소 사이의 계통발생학적으로 보존된 아미노산 서열 차이는 이들 각각의 기질을 분해시키기 위해 중요한 잔기를 나타낼 수 있다. 라이브러리는 하나의 보존된 잔기를 코딩하는 부모 hCGL-NLV 주형을 위한 코돈 또는 상응하는 MGL 보존된 잔기를 위한 코돈을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 중첩 확장 PCR로 생성하였다. 최종 조립된 PCR 생성물은 NcoI 및 EcoRI로 소화시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 pET28a 벡터에 결찰시켰다. 생성되는 결찰은 이. 콜라이 (BL21)로 직접 형질전환시키고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 후속적 스크리닝을 위해 LB-칸나마이신 플레이트 상에 플레이팅했다. 라이브러리의 이론적 다양성보다 두 배 더 많은 콜로니(즉, 라이브러리에 의해 코딩된 모든 가능한 유전자 서열)를 스크리닝했다. 부모 hCGL-NLV 변이체보다 더 큰 활성을 나타내는 클론을 단리시키고, 향상된 활성을 부여하는 돌연변이체를 동정하기 위해 서열분석했다. 향상된 L-메티오닌 분해 활성을 갖는 클론은 기재된 바와 같이 돌연변이유발의 반복 라운드에서 주형으로서 사용되었다.
실시예 5 - 향상된 인간 메티오닌 분해 변이체의 특성화
실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 수 라운드의 돌연변이유발 및 스크리닝 후, 원래의 3개의 돌연변위 부위(즉, E59N-R119L-E339V) 이외에 5개의 아미노산 위치가 hCGL-NLV에 비해 향상된 메티오닌 분해 활성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 이들 추가의 위치는 hCGL (서열식별번호에 위치한다: 1) 잔기 63, 91, 268, 311 및 353 (참조: 도 1). 이들 위치 중의 하나 이상의 S63L, L91M, K268R, T311G 및 I353S로의 돌연변이는 위치 59, 119 및 339에서 잔기의 돌연변이와 함께, hCGL-NLV와 비교하여 L-메티오닌을 분해시키기 위한 향상된 k cat/K M 값을 초래했다. 특히, 서열식변번호: 3, hCGL-E59N-S63L-L91M-R119L-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-1); 서열식별번호: 4, hCGL-E59I-S63L-L91M-R119L-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-2); 서열식별번호: 5, hCGL-E59N-S63L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-3); 및 서열식별번호: 6, hCGL-E59I-S63L-L91M-R119A-K268R-T311G-E339V-I353S (hCGL-8mut-4)에 상응하는 아미노산 치환을 함유하는 변이체는 L-메티오닌을 분해시키기 위한 최고 k cat/K M 값을 갖는 것으로 나타났다. 이들 변이체(hCGL-8mut-(1-4))는 실시예 2에 기재된 바와 같은 SDS-PAGE로 평가된 바와 같이 95% 초과의 균질성으로 정제하였고, 실시예 3에 기재된 바와 유사한 1mL 스케일 MBTH를 사용하여 pH 7.3 및 37 ℃에서 100 mM PBS 완충제 중의 L-Met를 분해하는 이들의 능력에 대해 동력학적으로 특성화하였다.
Figure pct00001
실시예 6 - 종양 세포주에 대한 hCGL -8 mut -1의 세포독성
hCGL-8mut-1의 시험관내 세포독성은 흑색종 세포주 A375 및 전립선암 세포주 DU145 및 PC3에 대해 평가하였다. 세포를 A375 세포의 경우 DMEM 배지 중 또는 전립선 종양 세포주의 경우 RPMI-1640 배지 중의 96-웰 배양 플레이트 중에서 약 3000 세포/웰로 접종하고, 다양한 농도의 효소로 치료 전 24시간 동안 성장시켰다. 5일 치료 후, 증식은 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 검정을 사용하여 측정했다. A375에 대해 생성된 데이터의 분석은 0.08 μM의 겉보기 IC50 값을 수득하였고, PC3 전립선 종양 세포의 경우 DU145에 대해 0.21 μM 그리고 PC3에 대해 0.25 μM의 겉보기 IC50 값을 수득하였다(도 2).
실시예 7 - hCGL -8 mut -1의 약리학적 제제
hCGL-8mut-1 효소는 하나의 예외를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제했다: IMAC 컬럼에 결합 후, 단백질을 0.1% 트리톤® 114을 함유하는 IMAC 완충제로 광범위하게(90 내지 100 컬럼 용적) 세척했다. 이어서, 컬럼을 10 내지 20 컬럼 용적의 IMAC 완충제로 세척하고, IMAC 용출 완충제(50 mM NaPO4/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)로 용출시켰다. 트리톤® 114에 의한 세척은 내독소 제거용으로 사용했다. 정제된 단백질은 10,000 MWCO 여과 장치를 사용하여 pH 8.3의 100 mM NaPO4 완충제로의 완충제 교환에 적용하였다. 후속적으로, PLP를 10mM의 농도로 첨가하고 단백질을 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 메톡시 PEG 석신이미딜 카복시메틸 에스테르 5000 MW (JenKem Technology)를 hCGL-8mut-1에 80:1 몰 비로 첨가하고, 일정한 교반하에 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 생성된 혼합물을 100,000 MWCO 여과 장치 (Amicon)를 사용하여 광범위하게 완충제 교환시키고(10% 글리세롤 함유 PBS), 0.2 마이크론 주사기 필터(VWR)로 멸균시켰다. 모든 페길화 효소를 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 키트(Cape Cod Incorporated)를 사용하여 지질다당류(LPS) 함량에 대해 분석했다.
실시예 8 - 페길화된 hCGL -8 mut -1의 혈청 안정성
페길화된 hCGL-8mut-1의 혈청 안정성은 37 ℃에서 최종 농도 10μM에서 풀링 인간 혈청 중에서 효소의 배양으로 시험하였다. 상이한 시점에서, 분액을 회수하고, 미국 특허에 기재된 바와 같이 DTNB 검정을 사용하여 활성에대해 시험하였다 공보 이의 전문이 본원에 참고로 편입된 2011/0200576. 데이터를 플롯팅한 후, 페길화된 hCGL-8mut-1은 101 ± 4 h의 반감기(T0.5)를 갖는 것으로 계산되었다(도 3).
실시예 9 - 마우스에서 페길화된 hCGL -8 mut -1의 약력학 분석
마우스 모델에서 L-메티오닌을 제거하는데 있어서 실시예 4 내지 7에 개시된 조작된 인간 메티오닌 분해 효소의 효능을 평가하기 위해, 각각 3마리 동물의 세 그룹에게 정상 식이를 유지하면서 50mg/kg의 PEG-hCGL-8mut-1을 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 그룹은 혈청 수집을 위한 심장 정맥천공에 의해 8, 24 및 48시간에 상응하는 시점에 희생시켰다. 이어서, 혈청 샘플을 본질적으로 아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)(전세계적 웹 chem.agilent.com/Library/datasheets/Public/5980-3088.PDF 상)에 의해 기재된 바와 같이 o-프탈알데하이드(OPA)에 의한 유도체화에 이어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 L-메티오닌 함량에 대해 분석했다. PEG-hCGL-8mut-1을 사용하는 이 투여 방식은 15시간 동안 5 μM 미만의 수준으로 L-메티오닌의 고갈을 가능하게 했다(도 4). 대조적으로, 정상 식이 중인 마우스에게 200mg/kg의 페길화된 hCGL-NLV의 투여는 단지 4시간 동안 약 10μM로 혈청 L-메티오닌을 감소시켰다(도 5).
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 측면에서 기재되어 있는 반면, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 제제들을 치환할 수 있음은 자명할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기 참조 문헌은, 본원에 나타낸 것들에 예시적인 절차 또는 다른 상세 보충을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 구체적으로 인용된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 23 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Arg His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 24 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 24 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Leu Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Arg His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405 <210> 25 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 25 Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln 1 5 10 15 His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp 20 25 30 Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys 35 40 45 Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Asn Tyr Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Ala Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Arg His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu 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Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Thr Val Thr 85 90 95 Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp 100 105 110 Val Tyr Gly Gly Thr Asn Ala Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe 115 120 125 Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu 130 135 140 Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr 145 150 155 160 Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val 165 170 175 His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser 180 185 190 Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr 195 200 205 Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu 210 215 220 Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn 245 250 255 Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Arg His Phe Lys Asn 260 265 270 Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys 275 280 285 Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys 290 295 300 Arg Gln Cys Thr Gly Cys Gly Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly 305 310 315 320 Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr 325 330 335 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly 355 360 365 Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu 370 375 380 Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro 385 390 395 400 Ser Gly Ser His Ser 405

Claims (37)

  1. 원상태 영장류 CGL 아미노산 서열(참조 서열식별번호: 1 및 7 내지 10)와 비교하여 적어도 하나의 치환을 갖는 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소로서, 상기 적어도 하나의 치환은 원상태 영장류 CGL 서열의 위치 59, 63, 91, 119, 268, 331, 339 및/또는 353에 하나의 치환을 포함하고, 상기 적어도 하나의 치환은 단지 위치 59에서 Val, 위치 59에서 Asn, 위치 119에서 Leu 및/또는 위치 339에서 Val일 수 없는, 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 i) 위치 59에서 Asn 또는 Ile, ii) 위치 63에서 Leu, iii) 위치 91에서 Met, iv) 위치 119에서 Leu 또는 Ala, v) 위치 268에서 Arg, vi) 위치 311에서 Gly, vii) 위치 339에서 Val 및/또는 viii) 위치 353에서 Ser을 포함하는, 효소.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 위치 63에서 Leu, 위치 91에서 Met, 위치 268에서 Arg, 위치 311에서 Gly, 위치 339에서 Val 및 위치 353에서 Ser를 포함하는, 효소.
  4. 청구항 3에 있어서, 위치 59에서 Asn 또는 Ile 및 위치 119에서 Leu 또는 Ala를 추가로 포함하는, 효소.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 위치 59에서 Asn, 위치 63에서 Leu, 위치 91에서Met, 위치 119에서 Leu, 위치 268에서 Arg, 위치 311에서 Gly, 위치 339에서 Val 및 위치 353에서 Ser을 포함하는, 효소.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 위치 59에서 Ile, 위치 63에서 Leu, 위치 91에서 Met, 위치 119에서 Leu, 위치 268에서 Arg, 위치 311에서 Gly, 위치 339에서 Val 및 위치 353에서 Ser을 포함하는, 효소.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 위치 59에서 Asn, 위치 63에서 Leu, 위치 91에서 Met, 위치 119에서 Ala, 위치 268에서 Arg, 위치 311에서 Gly, 위치 339에서 Val 및 위치 353에서 Ser을 포함하는, 효소.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 위치 59에서 Ile, 위치 63에서 Leu, 위치 91에서 Met, 위치 119에서 Ala, 위치 268에서 Arg, 위치 311에서 Gly, 위치 339에서 Val 및 위치 353에서 Ser을 포함하는, 효소.
  9. 청구항 1에 있어서, 이종성 펩타이드 세그먼트를 추가로 포함하는, 효소.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 이종성 펩타이드 세그먼트가 XTEN 펩타이드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드인, 효소.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 효소가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 커플링된, 효소.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 효소가 하나 이상의 Lys 또는 Cys 잔기를 통해 PEG에 커플링된, 효소.
  13. 청구항 1의 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 핵산이 박테리아, 진균, 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인, 핵산.
  15. 청구항 14의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 청구항 14의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 숙주 세포가 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 박테리아 세포가 유전자 ilvA 및 metA의 결실을 갖는 이. 콜라이(E. coli) 균주인, 숙주 세포.
  19. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 청구항 1의 효소 또는 청구항 13의 핵산을 포함하는 약제학적제형.
  20. 종양 세포 또는 대상체에게 청구항 19의 제형을 투여함을 포함하여, 종양 세포 또는 종양 세포를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 대상체가 메티오닌 제한 식이로 유지되는, 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 대상체가 정상 식이로 유지되는, 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 대상체가 인간 환자인, 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 제형이 정맥내, 진피내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 기관내, 안구내, 비강내, 초자체내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심막내, 탯줄내, 경구, 흡입, 주사, 주입, 연속 주입, 직접 국재화된 관류 욕 표적 세포로, 카테터를 통해 또는 세척을 통해 투여되는, 방법.
  25. 청구항 20에 있어서, 상기 제형이 종양 세포의 영양 배지에 투여되는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 영양 배지가 혈액, 림프액 또는 척수액인, 방법.
  27. 청구항 20에 있어서, 적어도 제2 항암 요법을 상기 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 제2 항암 요법이 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법인, 방법.
  29. 대상체의 종양 세포를 치료하는데 사용하기 위한, 청구항 1의 효소 또는 청구항 13의 핵산을 포함하는 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 효소가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 커플링된, 조성물.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 효소 산이 박테리아, 진균, 곤충 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인, 조성물.
  32. 청구항 29에 있어서, 상기 조성물이 종양내, 정맥내, 진피내, 동맥내, 복강내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립선내, 늑막내, 기관내, 안구내, 비강내, 초자체내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심막내, 탯줄내, 경구 투여용으로 제형화된, 조성물.
  33. 청구항 29에 있어서, 상기 조성물이 종양 세포의 영양 배지에의 투여용으로 제형화된, 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 영양 배지가 혈액, 림프액 또는 척수액인, 조성물.
  35. 청구항 29에 있어서, 적어도 제2 항암 요법을 추가로 포함하는, 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 제2 항암 요법이 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법인, 조성물.
  37. 종양 세포 치료용 약제를 제조하는데 있어서 청구항 1에 따르는 효소 또는 청구항 13에 따르는 핵산의 용도.
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