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KR20160024391A - 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도 - Google Patents

종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도 Download PDF

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KR20160024391A
KR20160024391A KR1020167001991A KR20167001991A KR20160024391A KR 20160024391 A KR20160024391 A KR 20160024391A KR 1020167001991 A KR1020167001991 A KR 1020167001991A KR 20167001991 A KR20167001991 A KR 20167001991A KR 20160024391 A KR20160024391 A KR 20160024391A
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엘리자베쓰 이. 에반스
어니스트 에스. 스미쓰
마우리스 자우더러
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백시넥스 인코포레이티드
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Abstract

본원은 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량과 병용하여 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 플렉신-B1-발현 암 세포의 종양 성장 및 전이를 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4D 억제성 분자의 용도{USE OF SEMAPHORIN-4D INHIBITORY MOLECULES IN COMBINATION WITH AN IMMUNE MODULATING THERAPY TO INHIBIT TUMOR GROWTH AND METASTASES}
전자 제출된 서열 목록의 참조
본 출원과 함께 제출된 텍스트 파일의 전자 제출 서열 목록(명칭: 58008_133124_SEQ_LST.txt; 크기: 37,171 바이트; 생성일: 2014년 6월 20일)의 내용을 그 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
기술분야
본 발명은 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4D 억제성 분자의 용도에 관한 것이다.
CD100이라고도 알려진 세마포린 4D(SEMA4D)는 세마포린 유전자 패밀리에 속하는 경막 단백질(예를 들면, 서열번호 1(인간); 서열번호 2(쥣과동물))이다. SEMA4D는 동종이량체로서 세포 표면 상에 발현되지만, 세포 활성화시 SEMA4D는 단백질가수분해성 절단을 통해 세포 표면으로부터 방출되어, 역시 생물학적으로 활성인, 그 단백질의 가용성 형태, sSEMA4D가 생성된다. 예를 들면, [Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167(2003); Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17-23(2008)]를 참조한다.
SEMA4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 포함한, 림프 기관, 및 비림프 기관, 예컨대 뇌, 심장, 및 신장에서 높은 수준으로 발현된다. 림프 기관에서, SEMA4D는 휴지기 T 세포 상에서 풍부하게 발현되지만 휴지기 B 세포 및 항원-제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(DC) 상에서는 약하게만 발현된다. 그러나, 그 발현은 다양한 면역학적 자극에 의한 활성화 후 이들 세포에서 상향조절된다. 면역 세포로부터 가용성 SEMA4D의 방출은 세포 활성화에 의해서도 역시 증가된다. SEMA4D는 일부 암의 발병에 연관되어 있고(Ch'ng et al., Cancer 110:164-72(2007); Campos et al., Oncology Letters, 5:1527-35(2013); Kato et al., Cancer Sci. 102:2029-37(2011)), 몇몇 보고는 이러한 영향의 한 기전은 종양 혈관생성을 촉진하는데서 SEMA4D의 역할이라고 제안하고 있다(Conrotto et al., Blood 105:4321-4329(2005). Basile et al., J Biol. Chem. 282: 34888-34895(2007); Sierra et.al. J. Exp. Med. 205:1673(2008); Zhou et al., Angiogenesis 15:391-407(2012)). 종양 성장 및 전이는 내피 세포 및 혈관계를 비롯하여, 종양 세포, 기질 및 면역 침투물 간 크로스 톡의 복잡한 과정을 포함한다. SEMA4D는 다수의 종양 유형에서 과발현되고 또한 종양 미세환경으로 동원되는 염증성 세포에 의해 생성되지만, 종양 기질을 구성하는 상이한 T 세포 유형의 이동, 생존, 분화 및 조직화에서 SEMA4D의 역할이 무엇인지에 대한 질문은 여전히 검토되어야 한다.
본 출원은 종양 세포의 진행을 억제, 감소, 저해, 방지, 완화 또는 지연시키거나, 종양 세포를 수축시키거나, 또는 직접적으로 공격하는 단일 작용제로서 작용하거나 또는 그들의 치료적 혜택을 강화시키기 위해 다른 면역 조절 요법과 병용하여 작용시킬 수 있는 안전하고 효과적인 암 치료에 대한 요구를 해결한다. 구체적으로, SEMA4D는 종양 성장을 촉진하거나 또는 억제하는 면역 세포 및 마크로파지의 침윤, 성숙화 및 조직화에서 역할을 하여서, 암을 갖는 피험체에서 종양 성장 및 전이를 감소시키는 효과적인 방법의 개발에 기여할 수 있는 것으로 확인되었다.
본 출원의 일정 측면은 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 갖는 피험체에서 종양 성장 또는 전이 또는 종양 성장과 전이 둘 모두를 억제시키거나, 지연시키거나, 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 결합 분자는 그 수용체(예를 들면, 플렉신-B1)와 SEMA4D의 상호작용을 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D-매개 플렉신-B1 신호 전달(signal transduction)을 억제한다. 일부 실시양태에서, 전이의 억제, 지연, 또는 감소는 원발성 종양 성장 억제, 지연, 또는 감소와 독립적으로 발생된다. 일부 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 신경내분비암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 두경부암, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 다른 암 피험체와 비교하여 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준이 높다.
일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503 및 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체와 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67의 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신, 면역자극제, 입양 T 세포 또는 항체 요법, 면역 관문 차단 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조절제는 인터루킨, 사이토카인, 케모카인, 면역 관문 차단의 길항제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 요법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 요법은 수술 또는 외과적 절차, 방사선 요법, 화학요법 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절제 또는 면역 조절 요법은 별도로(separately) 또는 동시에(concurrently) 투여된다.
일부 실시양태에서, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법제의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 갖는 피험체에서 종양 성장을 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 그 수용체와 SEMA4D의 상호작용을 억제한다. 일부 실시양태에서, 수용체는 플렉신-B1이다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D-매개 플렉신-B1 신호 전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 신경내분비암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 두경부암, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67과 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67이 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 6, 7 및 8을 포함하는 VHCDR1 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 각각 서열번호 14, 15 및 16을 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 및 VL은 각각 서열번호 9 및 서열번호 17 또는 서열번호 10 및 서열번호 18을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여, 면역자극제, 입양 T 세포 또는 항체 요법의 투여, 면역 관문 차단 억제제의 투여, 조절성 T 세포(Treg) 조절인자의 투여, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 면역 관문 차단 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 관문 차단 억제제는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, Treg 조절인자는 사이클로포스파미드이다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법은 별도로 또는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법의 조합 투여는 단리된 결합 분자 또는 면역 조절 요법 단독 투여에 비해 치료적 효능이 강화된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 다른 암 피험체와 비교하여 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준이 높다. 일부 실시양태에서, 피험체의 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준는 다른 암 환자의 순환계의 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수 보다 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5배이다. 일부 실시양태에서, 피험체의 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 예를 들어, 다른 암 환자와 비교시, 각각 약 147 내지 약 588 범위 및 약 1173 내지 약 3910 범위이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 B 세포 및/또는 T 세포 수준이 건강한 비암(non-cancer) 환자의 B 세포 및/또는 T 세포 범위 내에 속하거나 또는 그 이상이다. 일부 실시양태에서, 피험체의 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포 수준은 예를 들어 건강한 비암 환자와 비교시 개별적으로, 약 225 내지 약 275 또는 그 이상의 범위 및 약 1350 내지 약 1650 또는 그 이상의 범위이다.
일부 실시양태에서,(a) 암을 갖는 피험체에서 B 세포 및/또는 T 세포의 수를 결정하는 단계; 및(b) 피험체에서 B 세포 및/또는 T 세포의 수가 소정의 한계 수준을 초과하면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 피험체를 면역요법으로 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 다른 암 환자의 순환계에서 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수 보다 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5배이다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은, 예를 들면 다른 암 환자와 비교시, 각각 약 147 내지 약 588 범위 및 약 1173 내지 약 3910 범위이다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 건강한 비암 환자의 B 세포 및/또는 T 세포의 범위내이거나 또는 그 이상이다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은, 예를 들면 건강한 비암 환자와 비교시, 각각 약 225 내지 약 275 또는 그 이상의 범위 및 약 1350 내지 약 1650 또는 그 이상의 범위이다.
일부 실시양태에서, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량의 조합을 암을 갖는 피험체에게 투여하는 단계로서, 여기서 조합 투여는 단리된 결합 분자 또는 다른 면역 조절 요법 단독 투여에 비하여 치료적 효능이 강화되는 것인 단계를 포함하는 암을 갖는 피험체를 면역요법으로 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여, 면역자극제, 입양 T 세포 또는 항체 요법의 투여, 면역 관문 차단 억제제의 투여, 조절성 T 세포(Treg) 조절인자의 투여, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 면역 관문 차단 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 관문 차단 억제제는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 이의 조합이다. 일부 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, Treg 조절인자는 사이클로포스파미드이다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법은 별도로 또는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 다른 암 피험체와 비교시 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준이 높다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 다른 암 환자에서 순환계 내 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수의 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5배이다. 일부 실시양태에서, 피험체의 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 예를 들면 다른 암 환자와 비교시 각각 약 147 내지 약 588 범위 및 약 1173 내지 약 3910의 범위이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 B 세포 및/또는 T 세포의 수준이 건강한 비암 환자의 B 세포 및/또는 T 세포 범위 내이거나 또는 그 보다 높다. 일부 실시양태에서, 피험체에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 예를 들면 건강한 비암 환자와 비교시 약 225 내지 약 275 또는 그 이상의 범위 및 약 1350 내지 약 1650 또는 그 이상의 범위이다. 일부 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 신경내분비암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 두경부암, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 언급된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503 또는 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체와 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 언급된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503 또는 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체가 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67의 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67이다.
또한 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량과 종양 세포를 접촉시키는 단계로서, 여기서 종양 세포의 성장이 억제되거나, 지연되거나, 또는 감소되는 것인 단계를 포함하는, Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 암을 갖는 피험체에 SEMA4D 결합 분자의 투여를 포함하고, 여기서 피험체의 암 세포는 Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 폐암, 또는 전립선암이다.
(a) Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합의 발현에 대해 피험체의 암 세포를 분석하는 단계; 및(b) 피험체의 암 세포가 Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현하면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 갖는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 제48항 또는 제49항의 방법은 항-HER2/neu 결합 분자의 유효량의 투여를 더 포함한다. 제48항 또는 제49항의 방법에서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67과 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합한다. 제48항 또는 제49항의 방법에서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67이 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다. 제48항 또는 제49항의 방법에서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 제53항의 방법에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 6, 7, 및 8을 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 각각 서열번호 14, 15 및 16을 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 제54항의 방법에서, VH 및 VL은 각각 서열번호 9 및 서열번호 17 또는 서열번호 10 및 서열번호 18을 포함한다.
도 1a-1b: 동계 결장(syngeneic colon)26 종양 세포를 이식한 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 1a는 1 mg(50 mg/kg)의 항-SEMA4D 항체(Ab) 67 또는 2B8 이소타입 대조군 면역글로불린(2B8 대조군 Ig)으로 주 2회 처치된 Balb/c 및 SCID 마우스에서 결장26 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 1b는 하기 실시예 1에 정의된 바와 같이, 항-SEMA4D Ab 67 또는 2B8 대조군 Ig로 처치한 Balb/c 및 SCID 마우스의 생존 시간을 도시한다.
도 2: 종양 세포를 이식하고 먼저 항-CD8 고갈 항체(클론 2.43, BioXCell) 또는 대조군 래트 Ig(150 mg/kg)로 처치한 후 도 1a에서 처럼 2B8 대조군 Ig 또는 항-SEMA4D Ab 67로 처치한 Balb/c 마우스에서 결장26 종양 부피의 측정을 도시한다.
도 3a-3b: 그라프트된 마우스의 결장26 종양에서 면역 세포 밀도 측정. 도 3a는 대조군 Ig 또는 항-SEMA4D Ab 67로 처치 후 항-Cd8 항체로 염색된 종양 면적%로 결정된 CD8+ T 세포의 밀도를 도시한다. 도 3b는 대조군 Ig 또는 항-SEMA4D Ab 67로 처치 후 항-CD20 항체로 염색된 종양 면적%로 결정된 CD20+ B 세포의 밀도를 도시한다.
도 4a-4d: 결장26 그라프트된 마우스에서 종양의 최첨단에서 마크로파지 및 CD8+ T 세포 분포의 측정. 도 4a는 도 1에 도시된 바와 같이 27일 먼저 그라프트되고 대조군 Ig 또는 항-SEMA4D Ab 67로 처치된 마우스로부터의 대표적인 결장26 종양의 영상을 도시한다. 도 4b는 항-F4/80 항체로 염색된 픽셀 면적%로 결정된, 종양 모서리로부터 300 픽셀 너비 영역(250 미크론)으로서 정의된, 종양의 최첨단에서 M1 유형 마크로파지 밀도의 측정을 도시한다. 도 4c는 항-CD206 항체로 염색된 픽셀 면적%로 결정된 종양 최첨단에서 M2 유형 마크로파지 밀도의 측정을 도시한다. 도 4d는 세포독성 T 세포 항-CD8 항체로 염색된 픽셀 면적%로 결정된, 종양의 최첨단에서 CD8+ T 세포 밀도의 측정을 도시한다.
도 5a-5d: 동계 결장26 종양 세포로 이식된 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 5a는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(종양 접종 후 8일에 100 ㎍ 및 11일 및 14일에 50 ㎍)과 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로, 그리고 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11와 병용하여 항-PD1/RMP1-14(3일에 100 ㎍, 주2회)로 처치한 Balb/c 마우스에서 결장26 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 5b는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로, 그리고 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11과 병용하여 항-PD1/RMP1-14(3일에 100 ㎍, 주2회)로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 5c는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로, 그리고 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11와 병용하여 항-PD1/RMP1-14(3일에 100 ㎍, 주2회)로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 퇴행 빈도를 도시한다(p 값, *0.05 및 **0.01). 도 5d는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 단일요법(항-SEMA4D/MAb 67-2 또는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11)과 비교하여 항-SEMA4D/MAb 67-2 및 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11의 조합으로 처치된 마우스의 종양 침윤성 림프구 중 프로염증성 사이토카인 IFnγ의 측정을 도시한다. 도 5e는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 단일요법(항-SEMA4D/MAb 67-2 또는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11)과 비교하여 항-SEMA4D/MAb 67-2 및 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11의 조합으로 처치된 마우스의 비장에서 회수된 종양 침윤성 림프구 중 펩티드-특이적 IFNγ 분비 반응자의 빈도를 도시한다.
도 6a-6e: 종양-특이적 세포독성 CD8+ T 세포의 종양 침윤에 영향을 주는 항-SEMA4D 항체의 측정. 도 6a는 펩티드의 존재 및 부재 둘 모두시 MAb 67-처치된 마우스에서 IFNγ 분비 세포의 측정을 도시한다. 도 6b는 대표적인 ELISPOT 영상을 도시한다. 도 6c는 종양-침윤성 림프구(TIL)에서 항-종양 사이토카인, 예컨대 IFNγ 및 TNFα의 측정을 도시한다. 도 6d는 항-SEMA4D/MAb 67 항체로 처치한 마우스의 TIL에서 프로염증성 사이토카인 IFNγ 및 TNFα의 측정을 도시한다. 도 6e는 항-SEMA4D/MAb 67 항체로 처치한 마우스의 종양 침윤성 림프구에서 펩티드-특이적 IFNγ 분비 반응자의 빈도를 도시한다.
도 7a-7d: 동계 결장26 종양 세포로 이식된 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 7a는 대조군 래트 Ig 또는 래트 항-PD1/MAbRMP1-14(100 ㎍, 종양 접종 후 3일에 시작하여 2주 동안, 주당 2회)와 함께 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)를 처치한 Balb/c 마우스에서 결장26 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 7b는 대조군 래트 Ig 또는 래트 항-PD1/MAbRMP1-14와 함께 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 7c 및 7d는 대조군 래트 Ig 또는 래트 항-PD1/MAbRMP1-14와 함께 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 퇴행 빈도를 도시한다.
도 8a-8e: 동계 결장26 종양 세포로 이식된 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 8a는 사이클로포스파미드(CY)(50 mg/kg, IP)와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로 처치된 Balb/c 마우스에서 결장26 종양 부피의 평균 측정을 도시한다. 도 8b는 사이클로포스파미드(CY)(50 mg/kg, IP)와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로 처치된 Balb/c 마우스에서 결장26 종양 부피의 중간값 측정을 도시한다. 도 8c는 사이클로포스파미드와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치된 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 8d 및 8e는 사이클로포스파미드(CY)와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 퇴행의 빈도를 도시한다.
도 9a-9c: Tubo.A5 종양 세포로 이식된 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 9a는 항-Neu/MAb7.16.4(αNeu)(200 ㎍ IP 주1회 X2 21일 및 28일에, 종양 부피(TV)가 대략 200 mm3이 되었을때 시작)와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주2회)로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 9b는 항-Neu/MAb7.16.4(αNeu)와 함께 또는 없이, 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 9c는 항-Neu/MAb7.16.4(αNeu)와 함께 또는 없이 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 퇴행의 빈도를 도시한다.
도 10a-10e: Tubo.A5 종양 세포를 이식한 Balb/c 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 10a는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로 처치한 Balb/c 마우스에서 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 10b는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 10c-10e는 Tubo.A5 종양 모델에서 종양 퇴행의 빈도를 도시한다. 구체적으로, 도 10c는 Tubo.A5 종양이 그라프트된 대조군 마우스를 도시한다. 도 10d는 항-SEMA4D/MAb 67-2로 처치 후 Tubo.A5 종양 그라프트를 거부하여 원래 그라프트 후 90일에 Tubo.A5 종양을 재공격시킨 마우스를 도시한다. 도 10e는 생체내에서 종양 생존능을 검증하기 위해 도 10d와 동일한 종양 그라프트로 공격시킨 나이브 마우스를 도시한다.
도 11a-11b: Tubo.A5 종양 모델에서 T 세포 침윤 및 MDSC의 측정. 도 11a는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로 처치한 Balb/c 마우스의 종양에서 CD3+ T 세포의 측정을 도시한다. 도 11b는 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회)로 처치한 Balb/c 마우스의 종양에서 CD11b+Gr1+MDSC의 측정을 도시한다.
도 12a-12d: 결장26 또는 Tubo.A5 종양 세포로 이식된 마우스에서 종양 부피의 측정. 도 12a는 대조군 마우스 IgG1/2B8.1E7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 6) 또는 다양한 수준의 항-SEMA4D/MAb 67-2(1, 10 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 6)로 처치한 Balb/c 마우스에서 Tubo.A5 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 12b는 대조군 마우스 IgG1/2B8.IE7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 6) 또는 다양한 수준의 항-SEMA4D/MAb 67-2(1, 10 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 6)로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다. 도 12c는 대조군 마우스 IgG1/2B8.IE7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(5 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 또는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(5 mg/kg, IP, 주1회 x 5)와 다양한 수준의 항-SEMA4D/MAb 67-2(0.3, 3, 10, 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 5)의 조합으로 처치한 Balb/c에서 결장26 종양 부피의 측정을 도시한다. 도 12d는 대조군 마우스 IgG1/2B8.IE7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 항-SEMA4D/MAb 67-2(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(5 mg/kg, IP, 주1회 x 5), 또는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(5 mg/kg, IP, 주1회 x 5) 및 다양한 수준의 항-SEMA4D/MAb 67-2(0.3, 3, 10, 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 5)의 조합으로 처치한 Balb/c 마우스의 생존 시간을 도시한다.
도 13: 결장26 및 Tubo.A5 종양 모델에서 종양 재공격 후 종양 퇴행 및 성장을 도시한 상기 도면들에서 수행된 실험들의 요약.
I. 정의
용어 "한" 또는 "하나"의 실체는 1 이상의 그러한 실체를 의미하며, 예를 들어, "하나의 폴리뉴클레오티드"는 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로 이해한다. 예컨대 용어 "한"(또는 "하나"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 없이 2종의 특정한 특성들 또는 성분들 각각의 특별한 개시로서 이해한다. 따라서, 본원에서 예컨대 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하고자 하는 것이다. 유사하게, 예컨대 "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 실시양태 각각을 포함하고자 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시와 관련된 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]는 본원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 용어 사전을 숙련가에게 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 국제 단위계(SI)에서 승인한 형태로 표시한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 표시하지 않으면, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기된다. 본원에서 제공되는 제목은 본원의 다양한 측면 또는 실시양태의 한정이 아니며, 전체로서 명세서에 참조될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의되는 용어들은 그 전체로 명세서에 참조되어 보다 완전하게 정의된다.
실시양태가 "포함하는"이라는 표현으로 기술되는 경우마다, "이루어지는" 및/또는 "실질적으로 이루어지는"이라는 용어로 기술되는 유사한 실시양태가 또한 제공된다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회가 추천하는 그들에 대해 통상적으로 알려진 3글자 기호 또는 한 글자 기호로 본원에서 언급된다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 용인되는 한 글자 코드로 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 세포 개체군이 비조절 세포 성장으로 특징되는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 또는 그를 기술한다. 암의 예에는 제한없이, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병이 포함된다. 이러한 암의 보다 구체적인 예에는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 육종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포암 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
일정 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법을 통해 치료할 수 있는 전이성 암은 제한없이, 전이성 육종, 유방 암종, 난소암, 두경부암, 및 췌장암을 포함한다. 일정 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법을 통해 치료할 수 있는 전이성 암 또는 종양 세포는 SEMA4D에 대한 플렉신-B1 및/또는 플렉신-B2 수용체를 발현한다.
"혈관생성"은 혈관 리모델링의 주요 결정인자에 의해 자극받은, 내피 세포가 역동적으로 그들의 세포 대 세포 및 세포 대 매트릭스 접촉을 변형시키고 성숙한 혈관 나무로 재조직화되게 방향성있게 이동하는 복합적인 다단계 형태형성 사건을 의미한다(Bussolino et al., Trends Biochem Sci. 22:251-256(1997); Risau, Nature 386:671-674(1997); Jain, Nat. Med. 9:685-693(2003)). 신규한 혈관의 형성은 배아 발생 동안 핵심적인 단계이지만, 생리학적 및 병리학적 상태, 예컨대 망막증, 류마티스 관절염, 허혈증, 및 특히 종양 성장 및 전이시의 성인에서도 발생한다(Carmeliet, Nat. Med. 9:653-660(2003)).
본원에서 사용되는 용어 "임상 실험실"은 살아있는 피험체, 예를 들면 인간에서 유래된 물질들을 검사하거나 또는 처리하는 시설을 의미한다. 처리의 비제한적인 예에는 예를 들어 살아있는 피험체, 예를 들어 인간의 임의의 질환 또는 건강의 손상에 대한 진단, 예방, 또는 치료, 또는 건강 평가에 대한 정보를 제공하려는 목적으로 인간 신체에서 유래된 물질의 생물학적, 생화학적, 혈청학적, 화학적, 면역조직학적, 혈액학적, 생물리학적, 세포학적, 병리학적, 유전학적, 또는 다른 검사를 포함한다. 이들 검사는 또한 샘플을 회수하거나 또는 아니면 획득하거나, 준비하거나, 결정하거나, 측정하거나, 또는 아니면 살아있는 피험체, 예를 들어 인간의 체내 다양한 물질, 또는 살아있는 피험체, 예를 들어 인간 신체로부터 얻은 샘플의 존재 또는 부재를 기술하는 절차를 포함할 수 있다.
용어 "증식성 질병" 및 "증식성 질환"은 비정상적인 세포 증식 예컨대 암과 연관된 질병을 의미한다.
본원에서 사용하는 "종양" 및 "신생물"은 전암성 병변을 포함하는 양성(비암성) 또는 악성(암성)인, 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 생성된 임의의 조직 덩어리를 의미한다. 일정 실시양태에서, 본원에서 기술하는 종양은 플렉신-B1 및/또는 플렉신-B2를 발현하고, SEMA4D 및 활성화된 Met를 발현한다.
본원에서 사용하는 용어 "건강관리 혜택 제공자"는 전체적으로 또는 부분적으로 1 이상의 건강관리 혜택, 혜택 계획, 건강 보험, 및/또는 건강 지출 계정 프로그램에 환자 접근성을 제공하거나, 제시하거나, 공급하거나, 지불하거나, 또는 그것을 제공하는 것과 연관된 개별 당사자, 조직, 또는 그룹을 포함한다.
용어 "면역 조절 요법" 또는 "면역요법"은 피험체에서 면역 반응을 유도 및/또는 강화하여 피험체에서 질환 또는 질병에 영향을 주는 치료를 의미한다. 면역 조절 요법은 암 백신, 면역자극제, 입양 T 세포 또는 항체 요법, 및 면역 관문 차단을 포함한다(Lizee et al. 2013. Harnessing the Power of the Immune System to Target Cancer. Annu. Rev. Med. Vol. 64 No. 71-90).
용어 "면역 조절제"는 면역 요법의 활성제를 의미한다. 면역 조절제는 다양한 재조합, 합성 및 천연, 조제물을 포함한다. 면역 조절제의 예에는 제한없이, 인터루킨 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12; 사이토카인 예컨대 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 인터페론; 다양한 케모카인 예컨대 CXCL13, CCL26, CXCL7; 면역 관문 차단의 길항제 예컨대 항-CTLA-4, 항-PD1 또는 항-PD-L1(PD-1의 리간드), 항-LAG3, 항-B7-H3, 합성 사이토신 포스페이트-구아노신(CpG) 올리고데옥시뉴클레오티드, 글루칸; 및 조절성 T 세포(Treg)의 조절인자 예컨대 사이클로포스파미드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "전이", "전이성" 및 다른 문법적 균등물은 새로운 위치에서 유사한 암성 병변이 발병되게 원래 부위(예를 들면, 원발성 종양)로부터 신체의 다른 영역으로 이동하거나 또는 확산되는 암 세포를 의미한다. "전이성" 또는 "전이하는" 세포는 이웃 세포와의 부착성 접촉부를 상실하여 질환의 원발성 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하여 이웃 신체 구조를 침해하는 것이다. 이 용어는 또한 제한없이, 원발성 종양으로부터 암 세포의 탈착, 순환계로 종양 세포의 혈관내 주입, 그들의 생존 및 먼 부위로의 이동, 부착 및 순환계로부터 새 부위로 혈관외유출, 및 먼 부위에서 미세군집화, 및 먼 부위에서 종양 성장 및 발병을 포함하는 전이 과정을 의미한다.
용어 "치료 유효량"은 피험체 또는 포유동물에서 질환 또는 질병을 "치료하는"데 효과적인 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소형 유기 분자, 또는 다른 약물의 양을 의미한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키거나; 암 세포 분열을 지체 또는 중지시키거나, 종양 크기 증가를 감소 또는 지체시키거나; 예를 들면 연조직 및 뼈로 암 확산을 포함한, 주변 기관으로 암 세포 침윤을 억제, 예를 들면 저해, 지체, 예방, 중지, 지연 또는 역전시키거나; 종양 전이를 억제, 예를 들면 저해, 지체, 예방, 수축, 중지, 지연 또는 역전시키거나; 암과 연관된 1 이상의 증상을 어느 정도 완화시키거나, 이환율 및 사망률을 감소시키거나; 삶의 질을 개선시키거나; 또는 이러한 효과의 조합일 수 있다. 약물이 성장을 방지하고/하거나 존재하는 암 세포를 사멸하는 정도까지, 세포증식억제성 및/또는 세포독성이라고 할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한" 등의 용어는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 질병의 증상을 치유하거나, 지연시키거나, 또는 감소시키고/시키거나 그 진행을 중단시키는 치료적 수단 및 2) 표적으로 삼은 병리학적 상태 또는 질병의 발병을 예방하고/하거나 완화시키는 예방학적 또는 예방적 수단 둘 모두를 의미한다. 따라서 치료가 필요한 것은 이미 질병을 갖는 것; 질병을 가질 경향이 있는 것; 및 질병을 예방해야하는 것을 포함한다. 피험체는 그 환자가 다음 중 1 이상을 보이면 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료된다": 암 세포의 수 감소 또는 이의 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 또는 종양 성장의 지체 또는 역전, 예를 들어 연조직 및 뼈로 암의 확산을 포함한, 예를 들면 주변 장기로 암 세포 침윤의 전이를 억제, 예를 들어 저해, 방지, 지체, 수축, 지연 또는 역전; 종양 전이의 억제, 예를 들면 저해, 지체, 방지, 수축, 역전, 지연, 또는 부재; 종양 성장의 억제, 예를 들면 저해, 지체, 방지, 수축, 역전, 지연, 또는 부재; 특정 암과 연관된 1 이상의 증상의 경감; 이환율 및 사망률 감소; 삶의 질 개선; 또는 이러한 효과들의 일부 조합. 유리하거나 또는 바람직한 임상적 결과는 제한없이, 검출가능하거나 또는 검출가능하지 않건간에, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정한(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도(부분적이거나 또는 전체적이건간에)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지않으면 예상되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미한다. 치료가 필요한 것은 이미 병태 또는 질병이 있는 것을 비롯하여 병태 또는 질병을 가질 경향이 있는 것 또는 병태 또는 질병을 예방해야 하는 것을 포함한다.
"피험체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 바람직한 임의의 피험체, 구체적으로 포유동물 피험체를 의미한다. 포유동물 피험체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 마우스, 말, 소, 젖소, 곰 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 어구 예컨대 "단일 작용제로서 또는 1 이상의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 항체의 투여로 혜택을 받는 피험체" 및 "치료가 필요한 동물"은 단일 작용제 또는 1 이상의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 항체의 투여로 혜택을 얻을 수 있는 피험체, 예컨대 포유동물 피험체를 포함한다.
본 발명의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 이의 광의로서 항원성 결정부에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 일 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D, 예를 들면 약 150 kDa의 경막 SEMA4D 폴리펩티드 또는 약 120 kDa의 가용성 SEMA4D 폴리펩티드(통상 sSEMA4D라고 함)에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자 유래의 적어도 2 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자 유래의 적어도 3 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자 유래의 적어도 4 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자 유래의 적어도 5 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자 유래의 적어도 6 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D에 대한 플렉신-B1 수용체의 길항제일 수 있다. 길항제는 수용체의 신호전달 기능을 방해하는 결합 분자를 의미한다. 길항제는 천연 리간드의 결합을 경쟁적으로 차단하지만 정상적인 생리학적 반응을 촉발시키는데는 실패한다. 결합 분자는 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 또는 경쟁적 억제제로서 작용하거나 또는 천연 리간드에 의한 신호전달을 방해하는 다른 생물학적 또는 소형 분자 약물일 수 있다. 본 발명은 단일 작용제로서 또는 1 이상의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체, 예를 들어 암 환자에서 종양 성장 및 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 전체 크기 항체 예컨대 천연 발생 항체라고 구체적으로 언급하지 않으면, 용어 "항-SEMA4D 항체"는 전체 크기 항체를 비롯하여, 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 이러한 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예를 들면 천연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다. 또한 SEMA4D 결합 분자는 SEMA4D 또는 이의 플렉신-B1 수용체에 결합하여 이들의 활성을 억제하는 다른 생물학적 물질 또는 소형 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고 상기에 기술되고 예를 들면, Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호에 기술된 바와 같은, 1 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질전환된 동물 또는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 가변 도메인(들)이 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 갖는, 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.
"인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 항체 또는 이의 단편이 SEMA4D 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합하는, 본원에 기술된 항체 분자(예를 들면, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 상기 기술된 바와 같은 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체를 포함한다. 당분야의 숙련가들에게 알려진 표준 기술을 사용하여 인간 항-SEMA4D 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입시킬 수 있으며, 제한없이 아미노산 치환을 야기하는 부위 지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법이 포함된다. 일정 측면에서, 변이체(유도체 포함)는 기준 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3에 비하여 50 미만의 아미노산 치환, 40 미만의 아미노산 치환, 30 미만의 아미노산 치환, 25 미만의 아미노산 치환, 20 미만의 아미노산 치환, 15 미만의 아미노산 치환, 10 미만의 아미노산 치환, 5 미만의 아미노산 치환, 4 미만의 아미노산 치환, 3 미만의 아미노산 치환, 또는 2 미만의 아미노산 치환을 코딩한다.
일정 실시양태에서, 아미노산 치환은 이하에 더욱 기술하는, 보존성 아미노산 치환이다. 대안적으로, 돌연변이는 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위적으로, 예컨대 포화 돌연변이유발법에 의해 도입될 수 있고, 얻어진 돌연변이체는 활성(예를 들어, SEMA4D 폴리펩티드, 예를 들어 인간, 쥣과동물, 또는 인간과 쥣과동물 둘모두의 SEMA4D에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체의 이러한 변이체(또는 이의 유도체)는 또한 "최적화"되거나 또는 "항원 결합에 대해 최적화"되고 항원에 대한 친화성이 개선된 항체를 포함하는 인간 또는 완전한 인간 항체라고도 할 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 정상적으로 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다. 예를 들어, [Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]를 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하게 광범위한 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당분야의 숙련가는 중쇄를 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류하고 그중에서 일부는 하위부류(예를 들어, γ1-γ4)로 분류함을 이해할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정짓는 것은 이러한 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위부류(이소타입) 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 충분히 특징규명되어 있고 기능적 분화가 부여된 것으로 알려져 있다. 이들 부류 및 이소타입 각각의 별형은 본 발명의 관점에서 당분야의 숙련가가 쉽게 이해할 수 있으며, 따라서 본 발명의 범주에 속한다. 모든 면역글로불린 부류는 본 발명의 범주에 명확하게 속하고, 이하 설명은 대체로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 대한 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량이 대략 23,000 달톤인 동일한 2개 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량이 53,000-70,000인 동일한 2개 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개 사슬은 전형적으로 "Y" 입체구조로 이황화 결합에 의해 연결되며 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 출발하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 괄호로 묶는다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 이황화 연결 또는 비공유 연결에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체형태의 분기된 말단에 N 말단 부터 각 사슬 바닥의 C 말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동체의 영역으로 분류된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이러한 점에서, 경쇄(VL 또는 VK) 및 중쇄(VH) 부분 둘모두의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것을 이해한다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성 예컨대 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관습적으로, 불변 영역 도메인의 번호매김은 그들이 항원 결합 부위 또는 항체의 아미노 말단으로부터 더 멀어질수록 증가된다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이며, CH3 및 CL 도메인을 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 다시 말해서, 항체의, VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내 상보성 결정 영역(CDR)의 서브셋은 조합되어 3차원 항원 결정 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차원 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VL 사슬 각각의 3개 CDR에 의해 한정된다. 일부 예에서, 예를 들어, 카멜리드 종에서 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린을 기반으로 조작된 일부 면역글로불린 분자에서, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄 없이, 중쇄만으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993)]를 참조한다.
천연 발생 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 수성 환경에서 항체가 그의 3차원 입체 구조를 취하면서 항원 결정 도메인을 형성하도록 구체적으로 자리잡은 짧은 비연속적인 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 하는, 항원 결합 도메인 내 아미노산의 나머지는 분자간 가변성을 덜 나타낸다. 프레임워크 영역은 대개 β-시트 입체구조를 채택하고 CDR은 연결되어 있고, 일부 경우에서는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간, 비공유 상호작용에 의해 올바른 배향성으로 CDR이 자리잡도록 제공되는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 자리잡은 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이러한 상보성 표면은 그의 동족 에피토프에 항체의 비공유적 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 그들이 정확하게 정의되어 있기 때문에, 당분야의 숙련가에 의해 임의의 소정 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 식별될 수 있다(이하를 참조함).
당분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 정의가 2 이상인 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 반대로 명확하게 언급되지 않으면 모든 이러한 의미를 포함하고자 한다. 특정예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에 존재하는 비인접한 항원 조합 부위를 기술하는 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 참조하여 본원에 편입시킨, [Kabat et al.(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"] 및 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)]에 의해 기술되어 있으며, 여기서 정의는 서로에 대해 비교시 아미노산 잔기의 중복 또는 서브셋을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 언급하기 위한 각 정의의 적용은 본원에서 정의하고 사용되는 용어의 범주에 포함시키고자 한다. 상기 인용된 참조 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 1에 기재하였다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 다양하다. 당분야의 숙련가는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려해 어떠한 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
카밧 초티아
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1 표 1의 모든 CDR 정의의 번호매김은 [Kabat et al.]에 기재된 번호매김 관례에 따름(이하 참조).
[Kabat et al.]은 또한 임의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 번호매김 체계를 정의하였다. 당분야의 숙련가는 서열 그 자체 이상의 임의의 실험적 데이타에 의지하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 "카밧 번호매김" 체계를 명확하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용되는 "카밧 번호매김"은 [Kabat et al.(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 기재된 번호매김 체계를 의미한다. 달리 특정하지 않으면, 본 발명의 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 참조는 카밧 번호매김 체계를 따른다.
본원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 제한없이, 다클론, 단일클론, 다중특이적, 이중특이적, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들면 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fv(scFv), 이황화-연결 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에 개시된 항-SEMA4D 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함한다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다. 본원의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 등), 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일정 실시양태에서, 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 1 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본원에서 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH2 도메인의 적어도 일부분(예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)이 결여된다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 부분)이 천연 발생 면역글로불린 분자와는 아미노산 서열이 다양하도록 개질될 수 있음을 당분야의 숙련가는 이해할 것이다.
본원에 개시된 일부 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 한 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩티드 사슬의 그것과 동일하다. 다르게, 개시된 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들면, 각각의 단량체는 예를 들어 이중특이적 항체를 형성하는, 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 단일클론 항체의 단편으로 구성되고 결과적으로 2개의 상이한 유형의 항원에 결합하는 인공적인 단백질이다. 이중특이적 항체 형태에 대한 변이는 본 발명의 범주에 속하는 것으로 간주한다. 이중특이적 항체는 당분야에 공지된 기술을 사용해 생성시킬 수 있고, 예를 들어 다음의 문헌들을 참조한다: [Ghayur et al., Expert Review of Clinical Pharmacology 3.4(July 2010): p491]; [Lu et al., J. Biological Chemistry Vol. 280, No. 20, p. 19665-19672(2005)]; [Marvin et al., Acta Pharmacologic Sinica 26(6):649-658(2005)]; 및 [Milstein C et al., Nature 1983; 305: 537-40; 30]; [Brennan M et al., Science 1985; 229: 81-3]; [Thakur et al., Curr Opin Mol Ther. 2010 Jun;12(3):340-9]; 및 미국 공개 특허 출원 제2007/0004909호.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자에서 유래될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함한다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로, IgG1 분자에서 유래되고, 부분적으로 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서 유래되고, 부분적으로 IgG4 분자에서 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 카파 또는 람다 경쇄에서 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일정 측면에서, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인의 적어도 하나를 포함한다.
본원에 개시된 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들), 예를 들어 그들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, SEMA4D)의 관점에서 기 술되거나 또는 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드의 부분이 "에피토프" 또는 "항원성 결정부"이다. 표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2 에피토프를 포함하고, 항원의 크기, 입체구조, 및 유형에 따라서, 임의 개수의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 표적 폴리펩티드 상의 "에피토프"는 비폴리펩티드 성분이거나 또는 그를 포함할 수 있고, 예를 들어 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있음을 주의한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5 아미노산으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 적어도 7, 적어도 9, 일부 경우에는 적어도 약 15 내지 약 30 아미노산을 포함한다. CDR이 그 3차원 형태의 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식하므로, 에피토프를 포함하는 아미노산은 인접할 필요가 없고, 일부 경우에서, 동일한 펩티드 사슬에 존재하지 않을 수도 있다. 본원의 항-SEMA4D 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 약 15 내지 약 30개의 인접하거나 또는 인접하지 않은 SEMA4D의 아미노산의 서열을 포함한다.
"특이적으로 결합하다"는, 일반적으로, 그 항원 결합 도메인을 통해 항체가 에피토프에 결합하고, 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프간의 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 이러한 정의에 따라서, 항체가 무작위의, 미관련 에피토프에 결합하는 것보다 더 용이하게 그의 항원 결합 도메인을 통해, 그 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 할 수 있다. 용어 "특이성"은 일정 항체가 일정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화성을 한정하기 위해 본원에서 사용한다. 예를 들어, 항체 "A"가 항체 "B" 보다 소정 에피토프에 대해 보다 높은 특이성 또는 친화성을 갖는다고 간주되거나, 또는 항체 "A"가 관련 에피토프 "D"에 대한 것보다 높은 특이성 또는 친화성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 말할 수 있다.
"우선적으로 결합하다"는 항체가 관련있거나, 유사하거나, 상동성이거나, 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 소정 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있더라고, 관련 에피토프 보다는 그 에피토프에 결합할 가능성이 더 있다.
비제한적인 예로서, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 낮은 해리 상수(KD)로 제1 에피토프에 결합하면 상기 제2 에피토프에 우선적으로 결합한다고 간주한다. 다른 비제한적인 예에서, 항체자 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 적어도 한 자릿수만큼 낮은 친화성으로 제1 에피토프에 결합하면 제1 항원에 우선적으로 결합한다고 할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 적어도 2자릿수만큼 낮은 친화성으로 제1 에피토프에 결합하면 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 할 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 낮은 오프 속도(k(off))로 제1 에피토프에 결합하면 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 적어도 한자릿수만큼 낮은 친화성으로 제1 에피토프에 결합하면 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 적어도 2자릿수만큼 낮은 친화성으로 제1 에피토프에 결합하면 제1 에피토프에 우선적으로 결합한다고 할 수 있다.
항체는 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 에피토프에 우선적으로 결합하면 소정 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 할 수 있다. 경쟁적 억제는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁적 ELISA 어세이에 의해 결정할 수 있다. 항체는 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 만큼 소정 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화성"은 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 측정치를 의미한다. 예를 들면, [Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28]를 참조한다. 본원에서 사용되는 용어, "친화력"은 면역글로불린 개체군과 항원 간 복합체의 총 안정성을 의미하며, 다시 말해서, 항원과 면역글로불린 혼합물의 기능적 조합 강도를 의미한다. 예를 들면, [Harlow at pages 29-34]를 참조한다. 친화력은 특정 에피토프를 갖는 개체군 중 개별 면역글로불린 분자의 친화성, 및 또한 면역글로불린과 항원의 원자가와 관련있다. 예를 들면, 고도로 반복적인 에피토프 구조를 갖는 항원, 예컨대 중합체와 2가 단일클론 항체간 상호작용은 높은 친화력 중 하나이다.
본원의 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 그들의 교차 반응성 관점에서 기술되거나 또는 특정된다. 본원에서 사용되는 용어 "교차 반응성"은 제2 항원과 반응하는, 하나의 항원에 특이적인 항체의 능력; 2개의 상이한 항원성 물질 간의 관련성 측정을 의미한다. 따라서, 항체가 그 형성을 유도하는 것 이외의 다른 에피토프에 결합하면 교차 반응성이라고 한다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도되는 유도되는 에피토프와 동일한 많은 상보성 구조적 특징을 포함하며, 일부 경우에서, 원래 것보다 실제로 더 잘 맞을 수 있다.
예를 들면, 일정 항체는 그들이 관련있지만, 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어 기준 에피토프와 동일성이 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50%(당분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용해 계산시)인 에피토프에 결합하면, 교차 반응성을 어느 정도 갖는다. 항체는 기준 에피토프에 대한 동일성이 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만(당분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 사용해 계산시)인 에피토프에 결합하지 않으면 교차 반응성이 거의 없거나 또는 없다고 할 수 있다. 항체는 그 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르쏘로그, 또는 상동체에 결합하지 않으면, 일정 에피토프에 대해 "고도로 특이적"이라고 할 수 있다.
항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들어 본원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 본원의 폴리펩티드, 예를 들어 SEMA4D, 예컨대 인간, 쥣과동물, 또는 인간과 쥣과동물 둘 모두의 SEMA4D에 대한 그들의 결합 친화성 관점에서 기술되거나 또는 특정될 수 있다. 일정 측면에서, 결합 친화성은 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것을 포함한다. 일정 실시양태에서, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면, 본원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 5 x 10-9 내지 약 6 x 10-9의 Kd로 인간 SEMA4D에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면, 본원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1 x 10-9 내지 약 2 x 10-9의 Kd로 쥣과동물 SEMA4D에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위는 제1 종에서 얻거나 또는 그로부터 유래되고 불변 영역(온전하거나, 부분적이거나 또는 개질됨)은 제2 종에서 얻은 임의의 항체를 의미하는 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 인간 이외의 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)에서 유래되고 불변 영역은 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 가변 도메인이 적어도 부분적으로 기지 특이성의 항체 유래의 1 이상의 CDR 교체에 의해, 필요하다면 부분적인 프레임워크 영역 교체 및 서열 변화에 의해 변경된 항체를 의미한다. CDR이 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래되었을지라도, CDR은 상이한 부류의 항체 또는 상이한 종 유래 항체로부터 유래되었다고 추정한다. 기지 특이성의 인간이외 항체 유래의 1 이상의 "도너" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 그라프트된 조작된 항체를 본원에서 "인간화 항체"라고 한다. 일정 측면에서, 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 다른 것에 전달하기 위해 도너 가변 도메인 유래의 완전한 CDR로 CDR 전체를 교체할 필요는 없다. 대신, 표적 항원에 대한 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기만을 전달할 수 있다.
인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 가변 도메인 내 프레임워크 영역은 오직 인간 기원의 잔기를 포함할 수 있음을 더욱 인식하며, 이러한 경우 인간화 항체의 이들 프레임워크 영역은 "완전한 인간 프레임워크 영역"이라고 한다(예를 들면, 본원에서 전체로 참조하여 편입시킨, 미국 공개 특허 출원 제US 2010/0285036 A1호에 Mab 2503으로서 개시된 MAb VX15/2503을 참조함). 대안적으로, 도너 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 1 이상의 잔기는 SEMA4D 항원과의 결합을 강화시키거나 또는 적절한 결합을 유지하는 것이 필요하다면, 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 가변 도메인의 인간 프레임워크 영역(들)의 상응하는 위치 내에서 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 따라서 인간 및 도너 프레임워크 잔기의 혼합물을 포함하게 되며, 본원에서 "부분 인간 프레임워크 영역"이라고 한다.
예를 들면, 항-SEMA4D 항체의 인간화는 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-SEMA4D 항체의 상응하는 서열로 치환시켜서, Winter 및 동료들의 방법에 따라 실질적으로 수행할 수 있다(Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988)). 또한, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조하며, 본원에 이들을 참조하여 편입시킨다. 최종 인간화 항-SEMA4D 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 완전한 인간 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR을 포함한다. 일례에서, 인간화 항-SEMA4D 항체의 1 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내 잔기는 상응하는 인간이외(예를 들어, 설치류) 잔기에 의해 치환되고(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 제6,180,370호 참조), 이러한 경우 최종 인간화 항-SEMA4D 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에 부분적 인간 프레임워크 영역을 포함하게 된다. 유사한 방법을 항-VEGF 항체의 인간화에 사용할 수 있다.
또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도너 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 항체 성능(예를 들어, 원하는 친화성을 갖도록)을더욱 개선시키기 위해 수행된다. 대체로, 인간화 항체는 CDR의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 그것인, 적어도 하나, 전형적으로 2의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하게 된다. 인간화 항체는 경우에 따라서 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함하게 된다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, [Jones et al., Nature 331:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)]를 참조하고, 이들을 참조하여 본원에 편입시킨다. 따라서, "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 인간이외의 종 유래의 상응하는 서열로 치환된 항체를 포함한다. 실제로, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위 유래 잔기에 의해 치환된 전형적으로 인간 항체이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조한다. 또한 미국 특허 제6,180,370호, 및 국제 공개 특허 출원 제WO01/27160호를 참조하며, 여기서는 인간화 항체 및 예정된 항원에 대한 친화성이 개선된 인간화 항체를 생성시키는 기술이 개시되어 있다.
II. 표적 폴리펩티드 설명 - SEMA4D
본원에서 사용하는 용어 세마포린-4D", "SEMA4D", 및 "SEMA4D 폴리펩티드"는 "SEMA4D" 및 "Sema4D"처럼, 상호교환적으로 사용된다. 일정 실시양태에서, SEMA4D는 세포 표면 상에 발현되거나 또는 세포에 의해 분비된다. 다른 실시양태에서, SEMA4D는 막 결합되어 있다. 다른 실시양태에서, SEMA4D는 가용성, 예를 들어 sSEMA4D이다. 다른 실시양태에서, SEMA4D는 전체 크기 SEMA4D 또는 이의 단편, 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩티드이고, 여기서 SEMA4D의 단편 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩티드는 전체 크기 SEMA4D의 기능적 특성의 일부 또는 전부를 보유한다.
전체 크기 인간 SEMA4D 단백질은 150 kDa의 2개 폴리펩티드 사슬로 이루어진 동종이량체 경막 단백질이다. SEMA4D는 세포 표면 수용체의 세마포린 패밀리에 속하고 또한 CD100이라고도 한다. 인간 및 마우스 SEMA4D/Sema4D 둘 모두는 그들의 경막 형태로부터 단백질가수분해적으로 절단되어, 120 kDa 가용성 형태가 생성되어서, 2개의 Sema4D 이소폼이 생긴다(Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464(2003)). 세마포린은 뉴런과 그들의 적절한 표적 간에 정밀한 연결을 확립하는데서 중요한 역할을 수행하는 축삭돌기 유도 인자로서 본래는 정의된 가용성 및 막결합 단백질로 이루어진다. 구조적으로 고려되는 IV 부류 세마포린, SEMA4D는 17개의 보존된 시스테인 잔기, Ig-유사 도메인, 리신-풍부 스트레치, 소수성 경막 영역, 및 세포질 꼬리부를 포함하는, 특징적인 'Sema' 도메인이 후속되는 아미노-말단 신호 서열로 이루어진다.
SEMA4D 폴리펩티드는 약 13 아미노산의 신호 서열에 이어서 약 512 아미노산의 세마포린 도메인, 약 65 아미노산의 면역글로불린-유사(Ig-유사) 도메인, 104 아미노산의 리신-풍부 스트레치, 약 19 아미노산의 소수성 경막 영역, 및 110 아미노산의 세포질 꼬리부를 포함한다. 세포질 꼬리부의 티로신 인산화를 위한 공통 부위는 티로신 키나아제에 의한 SEMA4D의 예상되는 회합을 뒷받침한다(Schlossman et al., Eds.(1995) Leucocyte Typing V(Oxford University Press, Oxford).
SEMA4D는 적어도 3개의 기능적 수용체, 플렉신-B1, 플렉신-B2 및 CD72를 갖는 것으로 알려져 있다. 플렉신-B1은 비림프양 조직에서 발현되고 SEMA4D에 대한 높은 친화성(1 nM) 수용체로 확인되었다(Tamagnone et al., Cell 99:71-80(1999)). 플렉신 신호전달의 SEMA4D 자극은 뉴런의 성장 원뿔 붕괴를 유도하고, 프로세스 확장 붕괴 및 희소돌기아교세포의 아폽토시스를 유도하는 것으로 확인되었다(Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255(2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216(2005)). SEMA4D에 결합 후, 플렉신 B1 신호전달은 R-Ras의 불활성화를 매개하여서, 세포외 매트릭스에 대한 인테그린 매개 부착의 감소를 비롯하여, RhoA의 활성화를 초래하여, 세포골격의 재조직화에 의한 세포 붕괴를 야기한다. 예를 들어, [Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800(2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005))]를 참조한다. 플렉신-B2는 SEMA4D에 대한 중간 친화성을 가지며 최근 보고는 PLXNB2가 케라티노사이트 상에서 발현되고, SEMA4D-양성 γδ T 세포를 활성화시켜, 상피 회복에 기여한다고 시사하였다(Witherden et al., Immunity. 2012 Aug 24;37(2):314-25). 　
림프양 조직에서, CD72는 낮은 친화성(300 nM) SEMA4D 수용체로 활용된다(Kumanogoh et al., Immunity 13:621-631(2000)). B 세포 및 항원 제시 세포(APC)는 CD72를 발현하고, 항-CD72 항체는 많은 sSEMA4D와 같은 효과, 예컨대 CD40-유도된 B 세포 반응의 강화 및 CD23의 B 세포 발산 등을 갖는다. CD72는 많은 억제성 수용체와 회합될 수 있는, 티로신 포스파타아제 SHP-1을 동원하여 B 세포 반응의 음성 조절인자로서 작용하는 것으로 여겨진다. CD72와 SEMA4D의 상호작용은 SHP-1의 해리, 및 이러한 음성 활성화 신호의 손실을 야기한다. SEMA4D는 시험관내에서 T 세포 자극 및 B 세포 응집과 생존을 촉진하는 것으로 확인되었다. SEMA4D-발현 세포 또는 sSEMA4D의 부가는 시험관내에서 CD40-유도된 B 세포 증식 및 면역글로불린 생성을 향상시키고 생체내 항체 반응을 가속시킨다(Ishida et al., Inter. Immunol. 15:1027-1034(2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676(2001)). sSEMA4D는 공자극성 분자의 상향 조절 및 IL-12의 높은 분비를 포함하여, CD의 CD40 유도된 성숙화를 향상시킨다. 또한, sSEMA4D는 면역 세포 이동을 억제할 수 있고, 이는 항-SEMA4D 마우스 항체의 부가에 의해 역전될 수 있다(Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347(2001); Delaire et al., J. Immunol. 166:4348-4354(2001)).
Sema4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 포함하는, 림프양 기관, 및 비림프양 기관, 예컨대 뇌, 심장, 및 신장에서 높은 수준으로 발현된다. 림프양 기관에서, Sema4D는 휴지기 T 세포 상에서 풍부하게 발현되지만 휴지기 B 세포 및 항원-제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(CD)에서는 약하게만 발현된다.
세포 활성화는 SEMAD의 표면 발현뿐만 아니라 가용성 SEMA4D(sSEMA4D)의 생성도 증가시킨다. SEMA4D의 발현 패턴은 면역계에서 중요한 생리학적 역할뿐만 아니라 병리학적 역할을 함을 시사한다. SEMA4D는 B 세포 활성화, 응집 및 생존을 촉잰하고; CD40-유도된 증식 및 항체 생성을 향상시키며; T 세포 의존적 항원에 대한 항체 반응을 강화시키고; T 세포 증식을 증가시키며; 수지상 세포 성숙화 및 T 세포를 자극하는 능력을 강화시키고; 탈수초화 및 축삭 변성에 직접적으로 연관된다(Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002); 및 Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001)).
SEMA4D 넉아웃(SEMA4D-/-) 마우스는 SEMA4D가 체액성 및 세포성 면역 반응 둘 모두에서 중요한 역할을 한다는 추가적인 증거를 제공하였다. SEMA4D-/- 마우스에서 비림프양 조직에 대해 알려진 이상증은 없다. SEMA4D-/- 마우스 유래의 수지상 세포(DC)는 이성자극 능력이 불충분하고 sSEMA4D의 부가에 의해 구제될 수 있는, 공자극성 분자의 발현에 결합을 보인다. SEMA4D(SEMA4D-/-)의 마우스 결핍은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질-특이적 T 세포가 SEMA4D 부재시에 불충분하게 생성되기 때문에, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩티드에 의해 유도되는 실험적 자가면역 뇌척수염 발병이 실패하였다(Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002)). 유의한 양의 가용성 SEMA4D가 또한 자가면역-경향 MRL/lpr 마우스(전신 자가면역 질환, 예컨대 SLE 모델)의 혈청에서 검출되었지만, 정상 마우스에서는 그러하지 않았다. 또한, sSEMA4D의 수준은 자가 항체의 수준과 상관있었고 연령에 따라 증가하였다(Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001)). 가용성 SEMA4D는 또한 탈수초성 질환을 갖는 환자의 혈청 및 뇌척수액에서 축적되는 것으로 확인되었고, sSEMA4D는 인간 만능성 신경 전구체(Dev 세포)의 아폽토시스를 유도시켰고, 프로세스 확장을 억제하고 또한 시험관내에서 래트 희소돌기아교세포의 아폽토시스를 유도하였다(Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255(2004)). 이러한 아폽토시스는 항-SEMA4D 단일클론 항체(MAb)에 의해 차단되었다.
III. 항-SEMA4D 항체
SEMA4D에 결합하는 항체는 당분야에서 설명된바있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2008/0219971 A1호, US 공개 특허 출원 제2010/0285036 A1호, 및 US 공개 특허 출원 제2006/0233793 A1호, 국제 공개 특허 출원 제WO 93/14125호, 제WO 2008/100995호, 및 제WO 2010/129917호, 및 [Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8(1995)]를 참조하며, 이들 각각을 그 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
본원은 대체로 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함하는, 피험체, 예를 들어 인간 암 환자에서 종양 성장 또는 전이를 억제시키거나, 지연시키거나, 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일정 실시양태에서, 항체는 그의 수용체, 예를 들어 플렉신-B1 및/또는 플렉신-B2 중 1 이상의 SEMA4D의 상호작용을 차단한다. 일정 실시양태에서, 암 세포는 플렉신-B1 및/또는 플렉신-B2를 발현한다. 이러한 특성들을 갖는 항-SEMA4D 항체는 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 항체는 제한없이, US 공개 특허 출원 제2010/0285036 A1호 및 US 공개 특허 출원 제2008/0219971 A1호에 완전하게 기술된 MAb VX15/2503, 67, 76, 2282, 및 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 제공하는 방법에서 사용될 수 있는 추가적인 항체는 US 공개 특허 출원 제2006/0233793 A1호에 기술된 BD16 항체를 비롯하여 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체; 또는 US 공개 특허 출원 제2008/0219971 A1호에 기술된 MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284, 및 MAb 2285 중 어느 하나를 비롯하여, 이의 임의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 일정 실시양태에서 본원에서 제공하는 방법에서 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체는 인간, 쥣과동물, 또는 인간과 쥣과동물 SEMA4D에 결합한다. 또한 임의의 상기 언급한 항체의 결합 또는 활성을 경쟁적으로 억제하는 항체 및/또는 임의의 상기 언급항 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 유용하다.
일정 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 기준 항-SEMA4D 항체, 예를 들면 상기 기술된 것들의 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95%인 아미노산 서열을 갖는다. 추가 실시양태에서, 결합 분자는 기준 항체와 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지며, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열번호 9, 10, 25, 또는 48의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 27, 또는 서열번호 28과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 1 이상은 1, 2, 3, 4 또는 5개 보존성 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 27, 또는 서열번호 28과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 25, 또는 서열번호 48과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열번호 17, 18, 29, 또는 47의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 30, 서열번호 31, 또는 서열번호 32와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 보존성 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 30, 서열번호 31, 또는 서열번호 32와 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호29, 또는 서열번호 47과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 여기서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합된다.
본원에서 제공하는 방법에서 사용하기 위해, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 생산하기 위한 모든, 본원에 기술된 바와 같은 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 그러한 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본원의 항-SEMA4D 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체가 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 변이체는 부모 항-SEMA4D 항체의 바람직한 결합 특성을 보유하게 된다. 항체 변이체를 제조하는 방법은 대체로 당분야에서 이용가능하다.
돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, [Walker and Gaastra, eds.(1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492(1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382(1987); Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor, N.Y.)]; 미국 특허 제4,873,192호를 참조하고, 여기서 인용된 참조문헌들을 참조하여 본원에 편입시킨다. 관심 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 안내서는 [Dayhoff et al.(1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352]의 모델에서 찾을 수 있으며, 이 전체를 참조하여 본원에 편입시킨다. [Dayhoff et al.]의 모델은 적합한 보존성 아미노산 치환을 결정하기 위한 점 허용 돌연변이(PAM) 아미노산 유사성 매트릭스(PAM 250 매트릭스)를 사용한다. 일정 측면에서, 보존성 치환, 예컨대 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 일정 아미노산을 교환하는 것이 사용된다. [Dayhoff et al.] 모델의 PAM 250 매트릭스에서 교시하는 바와 같은 보존성 아미노산 치환의 예는 제한없이, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 및 Phe↔Trp↔Tyr을 포함한다.
항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 관심 폴리펩티드의 변이체를 구축하는데 있어서, 변이체가 계속 바람직한 특성을 보유하도록, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 세포 표면 상에서 발현되거나 또는 세포에 의해 분비되는, 예를 들어 SEMA4D, 예컨대 인간, 쥣과동물, 또는 인간과 쥣과동물 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있고 SEMA4D 차단 활성을 가질 수 있도록 개질된다. 일정 측면에서, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 돌연변이는 리딩 프레임을 유지하고 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보성 영역을 생성시키지 않는다. 예를 들어, EP 공개 특허 출원 제75,444호를 참조한다.
항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 결합 특이성을 측정하는 방법은 제한없이, 표준 경쟁적 결합 어세이, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비 모니터링용 어세이, T 세포 증식 어세이, 아폽토시스 어세이, ELISA 어세이 등을 포함한다. 예를 들면, WO 93/14125; [Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001); 및 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255(2004)]에 기술된 바와 같은 어세이를 참조하며, 이들 문헌 모두를 참조하여 본원에 편입시킨다.
항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 항-혈관생성 능력을 측정하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.
본원에 개시된 불변 영역, CDR, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하여, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100% 동일한지 여부를 본원에서 설명하는 경우, 동일성%는 당분야에 공지된 방법 및 컴퓨트 프로그램/소프트웨어, 예컨대 제한없이 BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 사용하여 결정할 수 있다. BESTFIT은 2개 서열 간 최고의 상동성 절편을 찾기 위해 [Smith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이 예를 들면, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 배열 프로그램을 사용하는 경우, 물론, 변수들은 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열의 총 아미노산 개수의 최대 5%의 상동성 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 목적을 위해서, 서열 상동성 백분율은 BLOSUM 매트릭스는 62이고, 갭 확장 패널티는 2이며 갭 오픈 패널티는 12인 아핀 갭 서치를 사용하는 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘을 사용해 결정될 수 있다. 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘은 [Smith and Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]에 교시되어 있다. 변이체는, 예를 들면 1 내지 15 아미노산 잔기만큼 적게, 1 내지 10 아미노산 잔기만큼 적게, 예컨대 6-10, 5만큼 적게, 4, 3, 2, 또는 심지어 1 아미노산 잔기 만큼 적게 기준 항-SEMA4D 항체(예를 들면, MAb VX15/2503, 67, 76, 또는 2282)와 다를 수 있다.
항-SEMA4D 항체의 불변 영역은 다양한 방식으로 이펙터 기능이 변경되게 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,737,056B1호 및 미국 공개 특허 출원 제2004/0132101A1호를 참조하며, 여기서는 Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화시키는 Fc 돌연변이가 개시되어 있다.
본원에서 제공되는 방법에서 유용한 일정 항-SEMA4D 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 당분야에 공지된 기술들을 사용해 이펙터 기능이 감소되도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점돌연변이 또는 다른 수단에 의함)는 순환하는 개질된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜서 종양 국재화를 증가시킬 수 있다. 다른 사례에서, 본원과 일관되는 불변 영역 개질은 보체 결합을 완화시켜서 혈청 반감기를 감소시킨다. 불변 영역의 또 다른 개질을 사용하여 높은 항원 특이성 또는 항체 가요성 덕분에 강화된 국재화를 허용하는 이황화 연결부 또는 올리고당 모이어티를 개질시킬 수 있다. 개질의 최종적인 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 종양 국재화, 생체분포성 및 혈청 반감기는 과도한 실험없이 당분야에 잘 알려진 면역학적 기술을 사용해 측정하고 정량화할 수 있다.
본원에서 제공하는 방법에서 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체는 예를 들어 공유 부착이 항체가 그 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 임의 유형의 분자를 공유 부착시켜 개질시킨 유도체를 포함한다. 예를 들면, 제한없이, 항체 유도체는 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 연결 등에 의해 개질된 항체를 포함한다. 제한없이, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함한, 기지의 기술에 의해 임의의 수많은 화학적 개질이 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 1 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄의 아미노산(예를 들먼, 리신, 아르기닌, 히스트딘), 산성 측쇄의 아미노산(예를 들먼, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 쓰레옹닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 다르게, 돌연변이는 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위적으로 도입될 수 있고, 예컨대 포화 돌연변이유발법에 의해 도입될 수 있으며, 최종 돌연변이체는 활성(예를 들면, 항-SEMA4D 폴리펩티드에 결합하는 능력, 그 수용체와 SEMA4D 상호작용을 차단하는 능력, 또는 피험체, 예를 들어 암 환자에서 전이를 억제, 지연 또는 감소시키는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위한 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들면, 항체 분자의 오직 프레임워크 영역 또는 CDR 영역에 돌연변이를 도입시키는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 항체의 능력에 대해 효과가 없거나 또는 거의 없을 수 있다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 용법을 최적화하거나, 또는 하이브리드 항체 생성을 개선시키는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 비중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 당분야의 숙련가는 예컨대 항원 결합 능력 변경 또는 결합 활성 변경(예를 들먼, 항원 결합 활성의 개선 또는 항체 특이성 변화) 없이 바람직한 특성을 갖는 돌연변이체 분자를 디자인하고 시험할 수 있다. 돌연변이유발 후, 코딩된 단백질은 무작위적으로 발현될 수 있고 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예를 들면, SEMA4D 폴리펩티드의 적어도 한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에 기술된 기술을 사용하거나 또는 당분야에 공지된 기술을 임의로 변형시켜 결정할 수 있다.
일정 실시양태에서, 본원에 제공되는 방법에서 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체는 적어도 하나의 최적화된 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화된 CDR"이란 CDR이 그러한 최적화된 CDR을 포함하는 항-SEMA4D 항체에 부여되는 결합 친화성 및/또는 항-SEMA4D 활성이 개선되도록 개질 및 최적화되는 것을 의도한다. "항-SEMA4D 활성" 또는 "SEMA4D 차단 활성"은 SEMA4D와 연관된 다음의 활성 중 1 이상을 조정하는 활성을 포함할 수 있다: B 세포 활성화, 응집 및 생존; CD40-유도된 증식 및 항체 생산; T 세포 의존적 항원에 대한 항체 반응; T 세포 또는 다른 면역 세포 증식; 수지상 세포 성숙화; 탈수초화 및 축삭 변셩; 다능성 신경 전구체 및/또는 희소돌기아교세포의 아폽토시스; 내피 세포 이동의 유도; 자발적 단핵구 이동의 억제; 종양 세포 성장 또는 전이의 억제, 지연, 또는 감소, 세포 표면 플렉신 B1 또는 다른 수용체와의 결합, 또는 SEMA4D+ 세포의 표면 상에서 발현되는 SEMA4D 또는 가용성 SEMA4D와 연관된 임의의 다른 활성. 특정 실시양태에서, 항-SEMA4D 활성은 원발성 종양 세포 성장 및 종양 전이의 억제, 지연 또는 감소와 조합하여, 또는 원발성 세포 정상 및 종양 전이와 독립적으로, 종양 전이를 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키는 능력을 포함한다. 항-SEMA4D 활성은 또한 제한없이, 림프종을 포함한 일정 유형의 암, 자가면역 질환, 중추신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 염증성 질환을 포함한 염증성 질환, 이식 거부, 및 침윤성 혈관생성증을 포함한, SEMA4D 발현과 연관된 질환의 발생률 또는 중증도를 감소시키는데 기여할 수 있다. 쥣과동물 항-SEMA4D MAb BD16을 기반으로 최적화된 항체의 예는 미국 공개 특허 출원 제2008/0219971 A1호, 국제 공개 특허 출원 제WO 93/14125호 및 [Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8(1995)]에 기술되어 있으며, 이들 각각을 그들 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다. 개질은 항-SEMA4D 항체가 SEMA4D 항원에 대한 특이성을 보유하고 개선된 결합 친화성 및/또는 개선된 항-SEMA4D 활성을 갖도록 CDR 내 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다.
IV. 항-SEMA4D 항체의 결합 특징
일정 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체이다. 일정 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D의 에피토프에 결합한다. SEMA4D의 한 변이체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되어 있으며, SEMA4D의 다른 변이체에 대한 것은 서열번호 15 및 서열번호 16으로 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, VX15/2503으로 명명된 항-SEMA4D 항체가 제공된다. 항체 VX15/2503의 결합 특징을 갖는 항체가 또한 본원에 개시된다. 이러한 항체는 제한없이, VX15/2503을 비롯하여, VX15/2503에 결합할 수 있는 에피토프(이하에 정의된 바와 같음)에 결합하는 항체와 경쟁적 결합 어세이에서 경쟁하는 항체를 포함한다. 항체가 동일하거나 또는 유사한 특징을 갖는지 여부를 평가하는 방법은 전통적인 정량 방법 예컨대 항원성 에피토프(예를 들면, SEMA4D 펩티드)에 대한 항체 친화성 또는 친화력을 결정 및 비교하는 것을 포함한다. 항체의 결합 특징을 비교하는 다른 예시적인 방법은 경쟁적 웨스턴 블랏팅, 효소 면역어세이법, ELISA, 및 유세포측정법을 포함한다. 항체-항원 결합 특징을 평가 및 비교하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. SEMA4D에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 VX15/2503의 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 항체 VX15/2503 및 67은 동일한 6개 CDR을 공유하고 동일한 SEMA4D 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 항원의 에피토프(들) 또는 일부분(들). 예를 들어 그들이 인식하거나 또는 특이적으로 결합하는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들면, SEMA4D) 관점에서 기술되거나 또는 특정된다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드의 일부분이 "에피토프" 또는 "항원성 결정부"이다.
일부 실시양태에서, "에피토프"는 항체를 생성하는데 사용되고/되거나 항체가 특이적으로 결합하게 되는 항원성 분자의 일부분을 의도한다. "SEMA4D 에피토프"는 항-SEMA4D 항체가 결합하는 SEMA4D 단백질의 일부분을 포함한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 직선 방식으로 다른 것의 뒤에 연속적으로 배열된 에피토프 내 잔기), 비선형 아미노산 잔기(본원에서는 "비선형 에피토프" 또는 "입체구조(conformational) 에피토프"라고함; 이들 에피토프는 연속적으로 배열되지 않음), 또는 선형과 비선형 아미노산 잔기 둘 모두를 포함할 수 있다. 비선형 에피토프 또는 입체구조 에피토프는 또한 항체의 인식 구조의 전체 입체구조에 기여하지만, 항체에 반드시 결합하지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 전형적으로, 에피토프는 짧은 아미노산 서열, 예를 들면, 약 5개 아미노산 길이이다. 에피토프를 동정하는 체계적인 기술들이 당분야에 알려져 있고, 예를 들면 이하 기재된 실시예에서 기술한다.
표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함하지만, 전형적으로 적어도 2 에피토프를 포함하고, 항원의 크기, 입체구조, 및 유형에 따라서, 임의 개수의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 표적 폴리펩티드 상의 "에피토프"는 비폴리펩티드 성분이거나 또는 그를 포함하며, 예를 들어, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있음을 주의한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 약 5 아미노산으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 적어도 7, 적어도 9, 또는 적어도 약 15 내지 약 30 아미노산을 포함할 수 있다. CDR이 그의 3차원 형태의 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식하므로, 에피토프에 포함되는 아미노산은 인접할 필요가 없고, 일부 경우에서는, 동일한 펩티드 사슬 상에도 존재하지 않을 수 있다. 본 발명의 항-SEMA4D 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 또는 약 15 내지 약 30개의 SMEA4D의 인접하거나 또는 인접하지 않은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 표적 폴리펩티드 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46으로 기재된 서열)과의 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 4, 3, 2, 1 또는 0 아미노산 치환을 제외하고 표적 폴리펩티드 아미노산 서열(서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46에 기재된 서열)과 동일하다. 다른 실시양태에서, 에피토프는 보존성 아미노산 치환(예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0 보존성 아미노산 치환)을 제외하고 표적 폴리펩티드 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 42, 서열번호 44, 또는 서열번호 46에 기재된 서열)과 동일하다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 서열번호 42, 서열번호 44, 또는 서열번호 46에 기재된 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 에피토프는 서열번호 42, 서열번호 44, 또는 서열번호 46에 기재된 서열이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 선형 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체구조 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 LKVPVFYALFTPQLNNV(서열번호 1에 기재된 전체 길이 SEMA4D 아미노산 서열의 잔기 304 내지 320에 상응하는, 서열번호 42), KWTSFLKARLIASRP(서열번호 1에 기재된 전체 길이 SEMA4D 아미노산 서열의 잔기 270 내지 284에 상응하고, 위치 281은 시스테인 또는 알라닌일 수 있는, 서열번호 44), 또는 EFVFRVLIPRIARV(서열번호46; 서열번호 1에 기재된 전체 길이 SEMA4D 아미노산 서열의 잔기 243 내지 256에 상응함)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 서열번호 42, 44 및 46에 기재된 아미노산 서열 중 1 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기 243 내지 320이 스패닝된 도메인에 포함되는 비연속적인 에피토프이다.
V. 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 면역 조절 요법과 병용하여 치료적 항-SEMA4D 항체를 사용하는 치료 방법
본원의 방법은 그러한 억제, 지연 또는 감소가 필요한 피험체, 예를 들면 암 환자에서 종양 성장 또는 전이를 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키기 위한 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용한 항-SEMA4D 또는 항-플렉신-B1 결합 분자, 예를 들면 이의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하는, 항체의 용도에 관한 것이다. 일정 실시양태에서, 암 세포는 SEMA4D 수용체를 발현하고, 일정 실시양태에서 수용체는 플렉신-B1이다. 이하의 설명이 항-SEMA4D 항체의 투여를 언급하지만, 본원에 기술된 방법은 예를 들면 SEMA4D 중화 활성을 갖고/갖거나 그의 수용체와 SEMA4D의 상호작용을 차단하는, SEMA4D, 예를 들면, 인간, 마우스, 또는 인간과 마우스 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원의 항체의 바람직한 특성을 보유하는 이들 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체에 동일하게 적용할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 또한 예를 들면, SEMA4D 중화 활성을 갖고/갖거나 그의 수용체와 SEMA4D의 상호작용을 차단하는, SEMA4D, 예를 들면 인간, 마우스, 또는 인간과 마우스 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원의 항체의 바람직한 특성을 보유하는 다른 생물학적 생성물 또는 소형 분자에도 적용할 수 있다.
일 실시양태에서, 항-SEMA4D 분자, 예를 들어, 이의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체를 포함한, 항체는 그러한 억제, 지연 또는 감소를 필요로하는 피험체, 예를 들면 암 환자에서 종양 성장을 억제시키거나, 지연시키거나 또는 감소시키기 위한 단일 작용제로서 사용될 수 있다. 일정 실시양태에서, 암 세포는 SEMA4D 수용체, 예컨대, 예를 들어 플렉신-B1 또는 플렉신-B2를 발현한다. 다른 실시양태에서, 암 세포는 SEMA4D 수용체와 함께 작용할 수 있는 다른 수용체를 발현한다. 이러한 수용체의 예에는 HER2(ErbB2)가 있다. Her2와 조합하여 플렉신-B1 또는 플렉신-B2의 발현이 관찰되는 암의 예에는 폐암, 유방암, 전립선암, 및 난소암이 포함한다. 이와 같이, 일정 실시양태에서 항-SEMA4D 분자, 예를 들면 이의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하는 항체는 폐암, 유방암, 전립선암, 또는 난소암을 갖는 피험체에서 종양 성장을 억제시키거나, 지연시키거나, 또는 감소시키기 위한 단일 작용제로서 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 면역 조절 요법은 암 백신, 면역자극제, 입양 T 세포 또는 항체 요법, 및 면역 관문 차단의 억제제가 포함된다(Lizee et al. 2013. Harnessing the Power of the Immune System to Target Cancer. Annu. Rev. Med. Vol. 64 No. 71-90).
암 백신 . 암 백신은 비정상 세포, 예컨대 암에 대해 신체의 면역계 및 자연적인 내성을 활성화시켜서, 질환을 제거하거나 또는 제어한다. 암 백신은 일반적으로 종양 항원-특이적 헬퍼 세포 및/또는 CTL 및 B 세포를 활성화시키는 면역원성의 종양 항원으로 이루어진다. 백신은 제한없이, 수지상 세포, 특히 종양 세포 또는 종양 항원이 더해진 자가유래 수지상 세포, 면역 자극제 예컨대 GM-CSF가 형질감염된 이종성 종양 세포, 재조합 바이러스, 또는 일반적으로 강력한 면역 보조제 예컨대 CpG와 함께 투여되는 단백질 또는 펩티드를 포함하여, 다양하게 존재할 수 있다.
면역자극제 . 면역자극제는 다양한 기전을 통해서 많은 암 환자에서 억제되는, 종양에 대한 면역 반응을 강화시키거나 또는 증가시키는 작용을 한다. 면역 조절 요법은 림프구, 마크로파지, 수지상 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 또는 이들 세포 예컨대 세포독성 T 림프구(CTL) 또는 자연 살해 T(NKT) 세포의 서브셋을 표적으로 할 수 있다. 면역 캐스케이드가 상호작용하기 때문에, 한 세트의 면역 세포에 대한 효과는 종종 다른 세포로의 확산에 의해 증폭되며, 예를 들면, 강화된 항원 제시 세포 활성이 T 및 B 림프구의 반응을 촉진한다. 면역자극제의 예에는 제한없이, HER2, 사이토카인 예컨대 G-CSF, GM-CSF 및 IL-2, 박테리아 유래의 세포막 분획, 자연 살해 T(NKT) 세포를 활성화시키도록 CD1d와 연합된 당지질, cpG 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
면역계의 골수식균 세포인, 마크로파지는 T 세포 동원 및 활성화를 유도하여 특이적 면역력을 촉진시킬 수 있는, 선천성 방어 기전의 근본적인 부분이다. 그럼에도 불구하고, 종양 미세환경 내에 그들의 존재는 강화된 종양 진행과 관련있고 암 세포 성장 및 확산, 혈관생성 및 면역 억제를 촉진하는 것으로 확인되었다. 그들의 표현형 환경에서 핵심 플레이어는 M1(종양 억제 마크로파지) 및 M2(종양 촉진 마크로파지) 극단을 포함하는 기능적 스펙트럼 내에서 그들의 기능을 선택적으로 조율하는, 마크로파지가 노출되는 미세환경 신호이다(Sica et al., Seminars in Cancer Biol. 18:349-355(2008)). 암 동안 증가된 마크로파지 수는 일반적으로 불충분한 예후와 상관있다(Qualls and Murray, Curr. Topics in Develop. Biol. 94:309-328(2011)). 고형 종양에 공통적인 복수의 고유한 기질 세포 유형 중에서, 종양-연관 마크로파지(TAM)은 종양 진행을 촉진하는데 중요하다. TAM 분극화를 조절하는 분자 경로의 표적화는 항암 요법에 대한 상당한 약속을 잡고있다(Ruffell et al., Trends in Immunol. 33:119-126(2012).
입양 세포 전달(이식). 입양 세포 전달은 암 세포를 공격하기 위해 T-세포 기반 세포독성 반응을 채택할 수 있다. 환자의 암에 대해 천연 또는 유전자 조작 반응성을 갖는 자가유래 T 세포를 시험관내에서 생성시키고 확장시킨 후 암 환자에게 역으로 전달할 수 있다. 한 연구는 시험관내 확장된 자가유래 종양-침윤성 림프구의 입양 전송은 전이성 흑색종을 갖는 환자에 효과적인 치료법이었다(Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC, Morgan RA, Dudley ME(April 2008). "Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy". Nat. Rev. Cancer 8(4): 299-308). 이는 절제된 환자 종양에 존재하는 T 세포를 취하여 달성할 수 있다. 이들 T 세포를 종양-침윤성 림프구(TIL)이라고 하며 종양 항원에 대한 그들의 특이성 때문에 종양으로 왕래하는 것으로 추정된다. 이러한 T 세포는 고농도의 IL-2, 항-CD3 및 동종반응성 공급 세포를 사용해 시험관내에서 증폭되도록 유도시킬 수 있다. 이어서 그들의 항암 활성을 더욱 증대시키기 위해서 IL-2의 외생성 투여와 함께 환자에 다시 전달한다. 다른 연구에서, 자가유래 T 세포는 그들을 표적 종양 항원에 반응성이게 하는 키메라 항원 수용체가 형질도입되었다(Liddy et al., Nature Med. 18:980-7,(2012); Grupp et al., New England J. Med. 368:1509-18,(2013)).
다른 입양 세포 전달 요법은 환자에 재주입되는 생체외 천연 또는 개질 종양 항원에 노출된 자가유래 수지상 세포를 채택한다. 프로벤지는 이러한 FDA 승인 요법으로서 자가유래 세포를 전립선산 포스파타아제 및 GM-CSF의 융합 단백질과 항온반응시켜서 전립선 종양을 갖는 환자를 치료한다. GM-CSF는 항원 제시 수지상 세포의 분화 및 활성을 촉진시키는 것으로 여겨진다(Small et al., J. Clin. Oncol. 18: 3894-903(2000); 미국 특허 제7,414,108호).
면역 관문 차단. 면역 관문 차단 요법은 진행중인 면역 반응을 제한하는 음성적 피드백 제어를 제거하여 T-세포 면역력을 강화시킨다. 이러한 유형의 요법은 부수적인 조직 손상을 최소화하기 위해 PD-L1(항-PD1 또는 항-PD-L1)을 발현하는 종양 조직 또는 주변 조직(항-CTLA4)에서의 생리학적 면역 반응의 진폭 및 지속기간을 조정하는데 결정적인 면역계의 억제성 경로를 표적으로 한다. 종양은 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 저항의 주요 기전으로서 일정 면역-관문 경로를 활용하도록 진화될 수 있다. 많은 면역 관문이 리간드-수용체 상호작용에 의해 개시되므로, 이들 관문은 수용체 또는 리간드에 대한 항체에 의해 차단시킬 수 있고 리간드 또는 수용체의 가용성 재조합 형태에 의해 조정될 수 있다. 면역 관문의 중화는 종양-특이적 T 세포가 그렇지않으면 면역억제성 종양 미세환경에서 기능을 계속하게 한다. 면역 관문 차단 요법의 예에는 세포독성 T-림프구-회합된 항원 4(CTLA-4), PD-1, 이의 리간드 PD-L1, LAG3 및 B7-H3을 표적으로 하는 것들이 있다.
사이클로포스파미드. 화학요법제로 통용되는 사이클로포스파미드는 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 사이클로포스파미드는 이펙터 T 세포에 대해 조절성 T 세포(Treg)의 기능을 차등적으로 억제한다. Treg는 항암 면역 반응을 조절하는데 중요하다. 종양-침윤성 Treg는 이전에 좋지않은 예후와 연관있었다. Treg를 특이적으로 표적화하는 작용제가 현재 이용가능하지 않지만, 사이클로포스파미드는 다른 T 세포에 비해 Treg를 우선적으로 억제할 수 있는 임상적으로 적합한 작용제로서 부상되고 있어서, 항종양 면역 반응의 보다 효과적인 유도가 가능하다.
다른 면역-조절 요법: 다른 실시양태에서, SEMA4D 또는 플렉신-B1 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 사용한 요법은 저 용량 화학요법 또는 방사선 요법과 병용될 수 있다. 표준 화학요법은 흔히 면역억제성이지만, 저용량의 화학요법제 예컨대 사이클로포스파미드, 독소루비신, 및 파클리탁셀은 암을 위한 백신 요법에 대한 반응을 향상시키는 것으로 확인되었다(Machiels et al., Cancer Res. 61:3689-3697(2001)). 일부 사례에서, 화학요법은 종양 환경에서 면역 반응을 음성적으로 조절하는 골수 유래 억제인자 세포(MDSC) 및 T 조절성 세포(Treg)를 차등적으로 불활성화시킬 수 있다. 방사선 요법은 일반적으로 이온화 방사선의 직접적인 종양사멸성 효과를 활용하도록 적용되었다. 게다가, 고선량 방사선은 화학요법처럼, 면역억제성이다. 그러나, 수많은 관찰결과들은 선량 분할 및 시퀀싱의 적절한 조건 하에서, 방사선 요법이 면역 조절제의 효과 및 종양-특이적 면역 반응을 강화시킬 수 있음을 시사하였다. 이러한 효과에 기여하는 몇몇 기전 중 하나는 방사선-유도된 종양-세포 사멸에 의해 방출된 종양 항원의 다른 항원 제시 세포 및 수지상 세포에 의한 교차-제시이다.(Higgins et al., Cancer Biol. Ther. 8:1440-1449(2009)). 실제로, 방사선 요법은 종양에 대한 인시츄 백신접종을 유도(Ma et al., Seminar Immunol. 22:113-124(2010))하고 이는 SEMA4D 또는 플렉신-B1 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 사용하는 요법과 병용하여 증폭될 수 있다.
일 실시양태에서, 면역 조절 요법은 제한없이, 인터루킨 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12; 사이토카인 예컨대 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론; 다양한 케모카인 예컨대 CXCL13, CCL26, CXCL7; 면역 관문 차단의 길항제 예컨대 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-LAG3 및 항-B7-H3; 합성 사이토신 포스페이트-구아노신(CpG), 올리고데옥시뉴클레오티드, 글루칸, 조절성 T 세포(Treg)의 조절인자 예컨대 사이클로포스파미드, 또는 다른 면역 조절제를 포함한, 면역 조절제일 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 조절제는 4-1BB(CD137)에 대한 효현제 항체이다. 최근 보고에 따르면, 이러한 4-1BB에 대한 효현제 항체는 종양에 고도로 세포독성인 KLRG1+ T 세포의 새로운 부류를 생성시킬 수 있다(Curran et al., J. Exp. Med. 210:743-755(2013)). 모든 경우에서, 추가적인 면역 조절 요법은 항-SEMA4D 또는 항-플렉신-B1 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체, 요법 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여된다. 병용 요법이 다른 면역 조절제의 투여와 병용하여, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여를 포함하는 경우, 본원의 방법은 어떠한 순서든 동시 또는 연속 투여로, 개별 제제 또는 단일 약학 제제를 사용하는, 공동투여를 포함한다.
일 실시양태에서, 면역 조절 요법은 제한없이, 수술 또는 외과적 절차(예를 들면, 비장절제술, 간절제술, 림프절절제술, 루코포레시스, 골수 이식술 등); 방사선 요법; 경우에 따라 자가유래 골수 이식, 또는 다른 암요법과 병용한 화학요법을 포함한, 암요법제일 수 있고, 여기서 추가적인 암요법은 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 요법 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여된다. 병용 요법이 다른 치료제의 투여와 병용하여, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함하는 경우, 본원의 방법은 어떠한 순서든 동시 또는 연속 투여로, 개별 제제 또는 단일 약학 제제를 사용한, 공동투여를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원은 혈액학적 암을 배제하고 예컨대 뇌, 난소, 유방, 직장 및 다른 조직에서 발견되는 것과 같은, 고형 종양을 갖는 다른 환자와 비교하여 순환계 내 상승된 수준의 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포로 암 환자를 치료하기 위한, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는, 항-SEMA4D 또는 항-플렉신-B1 결합 분자, 예를 들면 그의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함한, 항체의 용도에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "상승된"은 다른 암 환자에 비해 순환계에서 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 개수가 적어도 1.5배, 예를 들면 약 1.5 내지 약 5배, 예를 들면 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 또는 그 이상의 배수인 암 환자를 의미한다. 비제한적인 일례에서, 고형 종양을 갖는 34명 환자군에서, B 세포의 평균 개수는 혈액 마이크로리터 당 98개이고 T 세포의 평균 개수는 혈액 마이크로리터 당 782개였다. 따라서, B 세포 및 T 세포 수준이 상승된 암 환자의 이 서브셋에서 관찰된 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및 T 세포의 평균 개수는 다른 암 환자와 비교시, 개별적으로 약 147 내지 약 588 범위, 및 약 1173 내지 약 3910 범위일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원은 정상 개체의 범위 내 또는 그 이상인 순환계에서 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포의 수준으로 암 환자를 치료하기 위한, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용한, 항-SEMA4D 또는 항-플렉신-B1 결합 분자, 예를 들면 그의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함한, 항체의 용도에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "정상"은 건강한 비암 환자에서 존재하는 B 및/또는 T 세포 수준을 의미한다. 본원에서 사용하는 용어 "이내"는 B 및/또는 T 세포 수준의 10% 차이를 의미한다. 비제한적인 일례에서, 정상 수준의 범위는 예를 들면, 마이크로리터 당 약 250 세포 또는 그 이상의 B 세포 계측치 및/또는 마이크로리터 당 약 1500 세포 또는 그 이상의 T 세포 계측치를 포함한다. 따라서, B 세포 및 T 세포 수준이 상승된 암 환자에서 혈액 마이크로리터 당 B 세포 및 T 세포의 평균 개수는 건강한 비암 환자와 비교시, 각각 약 225 내지 약 275 또는 그 이상의 범위 및 약 1350 내지 약 1650 및 그 이상의 범위이다. 물론, 당분야의 숙련가는 B 및 T 세포의 수준이 다양한 인자들, 예를 들면 암의 유형, 암의 병기 등에 따라 다양할 수 있고, 상기 제공된 것 보다 낮은 수준도 또한 일정 유형 또는 병기의 암에 대해서는 상승된 수준을 구성함을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, T 및 B 세포 절대 계측치는 BD 트루카운트관 및 BD FACScanto 유세포 측정기를 활용하는 6색상 직접 면역형광발광 어세이인, 검증된 유세포측정 기반 면역표현형 어세이(BD 멀티테스트 6-색상 TBNK 시약)를 사용해 측정한다. 이 어세이는 말초 혈액에서 T 세포의 CD4 및 CD8 하위개체군을 비롯하여 T, B 및 NK 세포의 비율 및 절대 계측치를 결정하는데 통상적으로 사용된다. 말초 혈액 세포는 먼저 CD45+ 림프구 상에서 게이팅된다. T 세포는 이 게이트 내에서 CD3+ 세포로 정의되고 B 세포는 이 게이트 내에서 CD19+ CD3- 세포로 정의된다. 백분율은 적절한 게이트를 설정한 후 유세포 측정기로부터 직접 간단하게 취하며, 절대 계측치는 다음의 식(BD 절차 매뉴얼에서 직접 취함)을 사용해 계산한다: [(세포 개체군 내 사건#/절대 계측치 비드 영역 내 사건#)]* [(비드#/테스트a)/테스트 부피] = 세포 개체군 절대 계측치, 여기서 "a"는 BD 트루카운트관 호일 파우치 라벨에 존재하는 값이다.
본원에 기술된 방법은 또한 항-SEMA4D 결합 분자로 항-플렉신-B1 결합 분자의 치환에도 적용할 수 있음을 이해해야 한다.일부 실시양태에서, 항-플렉신-B1 결합 분자는 플렉신-B1과 SEMA4D의 결합을 차단하고/하거나 SEMA4D에 의한 플렉신-B1의 활성화를 방해하여 플렉신-B1과 SEMA4D의 상호작용을 억제시키는데 사용될 수 있다. 또한 본원의 방법은 SEMA4D 또는 플렉신-B1의 활성을 억제하기 위한 소형 분자 약물 또는 다른 생물학적 생성물의 용도에 적용할 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 항-SEMA4D 결합 분자 이외의 소형 분자 약물 또는 생물학적 생성물은 플렉신-B1과 SEMA4D의 결합을 차단하고/하거나 SEMA4D에 의한 플렉신-B1의 활성화를 방해하여 플렉신-B1과 SEMA4D의 상호작용을 억제하는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 치료는 환자에 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 또는 도포, 또는 환자 유래의 단리된 조직 또는 세포주에 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 결합 분자의 투여 또는 도포를 포함하고, 여기서 환자는 암 세포의 전이를 갖거나, 또는 암 세포의 전이가 발생될 위험성이 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 또한 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여, 환자에 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 투여 또는 도포, 또는 환자 유래의 단리된 조직 또는 세포주에 항-SEMA4D 결합 분자 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법을 포함하는 약학 조성물의 투여 또는 도포를 포함하고자 하며, 여기서 환자는 암 세포의 전이를 갖거나, 또는 암 세포의 전이가 발생될 위험성을 갖는다.
단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 결합 단편은 다양한 악성 및 비악성 종양의 치료에 유용하다. "항종양 활성"은 종양과 직접 연관되거나 또는 종양 환경의 기질 세포와 강접적으로 연관된 SEMA4D 생성율 또는 축적율 감소와, 그에 따라 요법 동안 존재하는 종양 또는 발생된 종양의 성장 속도 감쇄, 및/또는 존재하는 신생물(종양) 세포 또는 새롭게 형성된 신생물 세포의 파괴, 및 그에 따라 요법 동안 종양의 전체 크기 및/또는 전이 부위 개수의 감소를 의도하고자 한다. 예를 들면, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법제와 병용한 적어도 하나의 항-SEMA4D 항체를 사용한 요법은 인간에서 SEMA4D-발현 세포와 연관된 질환 상태의 치료 면에서 효과적인, 생리학적 반응, 예를 들면, 전이의 감소를 야기시킨다.
일 실시양태에서, 본원은 종양 세포의 성장 또는 전이를 억제시키거나, 감소시키거나, 예방하거나, 지연시키거나, 또는 최소화시키기 위한 암의 치료 또는 예방에서 또는 전암성 상태에서 사용하기 위한, 약물로서 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하거나 또는 단일 작용제로서, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도에 관한 것이다.
본원의 방볍에 따라서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 적어도 하나의 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 악성 인간 세포에 대한 양성적인 치료 반응을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 암 치료와 관련한 "양성적인 치료 반응"은 이들 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편의 항종양 활성과 연관된 질환의 개선, 및/또는 질환과 연관된 증상의 개선을 의도한다. 구체적으로, 본원에서 제공되는 방법은 환자에서 원발성 종양의 전이의 발생 및/또는 종양의 성장을 억제시키거나, 예방하거나, 감소시키거나, 완화시키거나, 지연시키거나, 또는 축소시킨다. 원위 종양 과성장의 예방을 관찰할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 질환의 개선은 완전한 반응으로 특징될 수 있다. "완전한 반응"이란, 골수에서 종양 전이의 존재 또는 예를 들면 원발성 종양 부위에서 임의의 이전의 비정상적인 방사선촬영 실험의 정상화와 함께 임상적으로 검출가능한 전이의 부자를 의도한다. 대안적으로, 질환의 개선은 부분적인 반응으로 분류될 수 있다. "부분적인 반응"은 모든 측정가능한 전이(즉, 원발성 종양에서 떨어진 부위에서 피험체에 존재하는 종양 세포의 개수)의 적어도 약 50% 감소를 의도한다. 다르게, 질환의 개선은 무재발 생존 또는 "무진행 생존"으로 분류될 수 있다. "무재발 생존"은 임의 부위에서 종양의 재발까지의 시간을 의도한다. "무진행 생존"은 모니터링하는 부위에서 종양의 추가적인 성장이 검출되기 전 시간이다.
전이의 억제, 지연, 또는 감소는 골수 천자(BMA), 또는 면역조직화학을 포함한, 스크리닝 기술 예컨대 영상법, 예를 들어 형광발광 항체 영상법, 골스캔 영상법, 및 종양 생검 샘플링을 사용해 평가할 수 있다. 이들 양성적인 치료 반응이외에도, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 사용한 요법을 겪은 피험체는 질환과 연관된 증상 개선의 유리한 효과를 경험할 수 있다.
임상 반응은 제한없이 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 겸출가능한 변화를 포함하여, 스크리닝 기술 예컨대 자기 공명 영상법(MRI), x-방사선 영상법, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔법, 유세포측정법, 형광발광-활성화 세포 분류(FACS) 분석법, 조직학, 총체적 병리학, 및 혈액 화학법을 사용해 평가할 수 있다.
본원의 방법 및 시스템을 적용하기 위해서, 일정 실시양태에서, 환자 유래 샘플은 (1) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량; 또는 (2) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 포함하는 요법을 Her2+ 및 플렉신 B1+ 또는 플렉신 B2+인 종양을 갖는 피험체에 투여하기 전 또는 후에 획득할 수 있다. 일부 사례에서, 요법이 시작된 후 또는 요법이 종료된 후에 환자로부터 연속적인 샘플을 획득할 수 있다. 샘플은 예를 들면 건강관리 제공자(예를 들면, 의사) 또는 건강관리 혜택 제공자에 의해 요청되거나, 동일하거나 또는 다른 건강관리 제공자(예를 들면, 간호원, 병원) 또는 임상 실험실에 의해 획득되고/되거나 처리되고, 처리된 후, 결과는 또 다른 건강관리 제공자, 건강관리 혜택 제공자 또는 환자에게 전달될 수 있다. 유사하게, 1 이상의 점수의 측정/결정, 점수간 비교, 점수의 평가 및 치료 결정은 1 이상의 건강관리 제공자, 건강관리 혜택 제공자, 및/또는 임상 실험실에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "건강관리 제공자"는 살아있는 피험체, 예를 들면 인간 환자와 직접적으로 상호작용하고 그에 투여하는 개체 또는 기관을 의미한다. 건강관리 제공자의 비제한적인 예는 의사, 간호사, 테크니션, 치료사, 약사, 상담사, 대체 의학 종사자, 의료 시설, 개인 병원, 응급실, 클리닉, 응급 진료 센터, 대체 의학 클리닉/시설, 및 일반 및/또는 전문 치료, 평가, 유지, 및/또는 제한없이, 일반적인 의학, 전문 의학, 수술, 및/또는 임의 유형의 다른 치료, 평가, 유지, 요법, 약물 및/또는 조연을 포함한, 환자의 건강 상태 전반, 또는 이의 임의의 일부에 관련된 조언을 제공하는 임의의 다른 독립체를 포함한다.
일부 측면에서, 건강관리 제공자는 (1) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량; 또는 (2) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 포함하는 요법을 투여하거나 또는 다른 건강관리 제공자에게 이를 투여하도록 지시할 수 있으며, 여기서 피험체는 Her2+ 및 플렉신 B1+ 또는 플렉신 B2+인 종양 세포를 갖거나, 또는 가질 것으로 의심된다. 건강관리 제공자는 다음의 행동을 이행하거나 또는 다음의 행동을 수행하도록 다른 건강관리 제공자 또는 환자를 지시할 수 있다: 샘플 획득, 샘플 처리, 샘플 제출, 샘플 수용, 샘플 전달, 샘플 분석 또는 측정, 샘플 정량, 샘플 분석/측정/정량 후 얻은 결과 제공, 샘플 분석/측정/정량 후 얻은 결과 수용, 1 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과 비교/점수화, 1 이상의 샘플로부터의 비교/점수 제공, 1 이상의 샘플로부터 비교/점수 획득, Her2+ 및 플렉신 B1+ 또는 플렉신 B2+인 종양 세포를 갖거나, 또는 가질 것으로 의심되는 피험체에게 요법(예를 들면, (1) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량; 또는 (2) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량) 투여, 요법의 투여 개시, 요법의 투여 중단, 요법의 투여 지속, 요법 투여의 일시적 유예, 투여되는 치료제의 양 증가, 투여되는 치료제의 양 감소, 일정량의 치료제 투여 지속, 치료제 투여 빈도 증가, 치료제 투여 빈도 감소, 치료제에 대한 동일 투여 빈도 유지, 적어도 다른 치료제 또는 요법으로 요법 또는 치료제를 대체, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 추가의 치료제와 병용. 일부 측면에서, 건강관리 혜택 제공자는 예를 들면, 샘플의 수집, 샘플의 처리, 샘플의 제출, 샘플의 수용, 샘플의 전달, 샘플의 분석 또는 측정, 샘플의 정량, 샘플의 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 제공, 샘플의 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 전달, 1 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 비교/점수매김, 1 이상의 샘플의 비교/점수의 전달, 요법 또는 치료제의 투여, 요법 또는 치료제의 투여 시작, 요법 또는 치료제의 투여 중단, 요법 또는 치료제의 투여 지속, 요법 또는 치료제 투여의 일시적 유예, 투여되는 치료제의 양 증가, 치료되는 치료제의 양 감소, 일정량의 치료제의 투여 지속, 치료제의 투여 빈도 증가, 치료제의 투여 빈도 감소, 치료제의 동일 투여 빈도 유지, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 치료제로 대체, 또는 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 추가 치료제와 병용을 허가하거나 또는 거절할 수 있다.
또한 건강관리 혜택 제공자는 예를 들면 요법의 처방을 허가하거나 또는 거절할 수 있거나, 요법에 대한 보급을 허가하거나 또는 거절할 수 있거나, 요법의 비용 변제를 허가하거나 또는 거절할 수 있거나, 요법에 대한 적격을 결정하거나 또는 거절을 할 수 있다.
일부 측면에서, 임상 실험실은 예를 들면, 샘플을 수집 또는 획득하거나, 샘플을 처리하거나, 샘플을 제출하거나, 샘플을 수용하거나, 샘플을 전달하거나, 샘플을 분석 또는 측정하거나, 샘플을 증량하거나, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 제공하거나, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 수용하거나, 1 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 비교/점수화하거나, 1 이상의 샘플의 비교/점수를 제공하거나, 1 이상의 샘플의 비교/점수를 얻거나, 또는 다른 관련 활동을 할 수 있다.
VI. 진단 및 치료 방법
일정 실시양태에서, 본원은 피험체로서, B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포의 수준이 상승되어 있는 피험체, 예를 들면 암 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 피험체의 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준이 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 소정의 한계 수준 보다 높거나, 또는 제한없이 다른 암 환자 또는 건강한 비암 환자 유래 샘플을 포함한 1 이상의 대조군 샘플에서의 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준에 비해 높으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. B 세포, T 세포, 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준은 건강관리 제공자 또는 임상 실험실에서 측정할 수 있고, 여기서 샘플, 예를 들면 혈액 샘플은 건강관리 제공자 또는 임상 실험실에 의해 환자로부터 얻는다. 일 측면에서, 환자의 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘 모두의 수준은 혈구계산-기반 면역표현형 어세이로 측정할 수 있다.
일정 실시양태에서, 본원은 피험체의 종양 세포에서 채취한 샘플의 Her2 및 플렉신 B1 또는 플렉신 B2 발현이 소정의 한계 수준 보다 높거나, 또는 1 이상의 대?군 샘플 중 Her2 및 플렉신 B1 또는 플렉신 B2 발현에 비해 높으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체, 예를 들면 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 피험체의 종양 세포 내 Her2, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 발현은 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준에서 건강관리 제공자 또는 임상 실험실에서 측정할 수 있다. 일정 측면에서, Her2, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 발현은 인시츄로, 예를 들면 영상화 기술로 측정할 수 있다. 일정 측면에서, Her2, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 발현은 생검을 통해 피험체에서 얻은 종양 세포 샘플에서 측정할 수 있다. 일 측면에서, 종양 세포 중 Her2, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 발현은 Her2, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 단백질을 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 적용하는 면역어세이로 측정할 수 있다. 다른 측면에서, 플렉신 B1, 및/또는 플렉신 B2 발현은 정량적 유전자 발현 어세이, 예를 들면 RT-PCR 어세이를 통해 측정할 수 있다.
본원은 또한 피험체, 예를 들면 암 환자가 (1) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량; 또는 (2) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 사용한 치료로부터 혜택을 받는지 여부에 대한 건강관리 제공자, 건강관리 혜택 제공자, 또는 임상 실험실에 의해 결정을 용이하게 하기 위한 방법, 어세이, 및 키트를 제공하고, 여기서 피험체는 Her2+ 및 플렉신 B1+ 또는 플렉신 B2+인 종양 세포를 갖거나, 또는 가질 것으로 의심된다. 본원에서 제공하는 방법, 어세이, 및 키트는 또한 피험체, 예를 들면 암 환자가 (1) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량; 또는 (2) 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 사용한 치료로부터 혜택을 얻는지 여부에 대한 건강관리 제공자, 건강관리 혜택 제공자, 또는 임상 실험실의 결정을 용이하게 한다(예를 들어, 여기서 피험체의 종양 세포는 Her2 및 플렉신 B1 또는 플렉신 B2를 발현하거나, 또는 발현하는지 측정될 수 있음).
본원은 환자로부터 채취된 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준이 소정의 한계 수준 보다 높거나, 또는 1 이상의 대조군 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준보다 높으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체, 예를 들면 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 샘플은 환자로부터 얻으며 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준 측정을, 예를 들어 임상 실험실에 제출한다.
또한, 본원은 (a) 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포 수준의 측정에 대해 피험체로부터 채취된 샘플을 제출하는 단계; 및 (b) 피험체의 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준이 소정의 한계 수준 보다 높거나, 또는 1 이상의 대조군 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준보다 높으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체, 예를 들어 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 (a) 피험체, 예를 들어 암 환자에서 얻은 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 피험체의 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준은 예를 들면 혈구측정-기반 면역표현형 어세이로 측정되는 것인 단계; (b) 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준이 소정의 한계 수준보다 높은지, 또는 1 이상의 대조군 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준보다 높은지 여부를 결정하는 단계; 및 (c) 피험체의 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준이 소정의 한계 수준보다 높거나, 또는 1 이상의 대조군 샘플의 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준보다 높으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에게 투여하도록 건강관리 제공자에게 조언하거나, 지시하거나, 또는 허가하는 단계를 포함하는, 피험체, 예를 들어 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 피험체의 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준은 혈구계산-기반 면역표현형 어세이로 측정할 수 있다. 일정 측면에서, 이 어세이는 "현장현시(point of care)" 진단 키트로서 제제화된, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 어세이를 사용하여, 환자를 치료하는 건강관리 전문가에 의해, 피험체에서 얻은 샘플에 대해 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 샘플은 피험체로부터 얻어서, 제한없이, 본원에 기술된 바와 같은 혈구계산-기반 면역표현형 어세이 사용을 포함하는, 건강관리 전문가의 지시에 따라서, 샘플 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포 수준의 측정을 위해, 예를 들면, 임상 실험실에 제출된다. 일정 측면에서, 이러한 어세이를 수행하는 임상 실험실은 피험체의 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준이 소정의 한계 수준보다 높거나, 또는 1 이상의 대조군 중 B-세포, T-세포, 또는 T-세포와 B-세포의 수준보다 높으면, 피험체가 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 사용한 치료로부터 혜택을 받는지 여부에 대해 건강관리 제공자 또는 건강관리 혜택 제공자에게 조언할 수 있다.
일정 측면에서, 본원에 제공되는 바와 같은 면역어세이의 결과는 환자의 보험이 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자 및 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법을 사용한 치료를 포괄하는지 여부를 결정하기 위해 건강관리 혜택 제공자에게 제출될 수 있다.
VII. 약학 조성물 및 투여 방법
단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 준비하고 이를 필요로하는 피험체에게 투여하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있거나 또는 당분야의 숙련가가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 경로는 각각의 치료제에 대해 동일하거나 또는 상이한 시점에, 예를 들면 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용하는 용어 비경구는 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 이들 모든 투여 형태가 본원의 범주 내에 속하는 것으로 명확하게 고려되지만, 투여 형태의 예에는 주사, 구체적으로 정맥내 또는 동맥내 주사용 액체 또는 드립일 수 있다. 주사용으로 적합한 약학 조성물은 완충제(예를 들면, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들면, 폴리솔베이트), 경우에 따라 안정화제(예를 들면, 인간 알부민) 등을 포함한다. 그러나, 본원의 교시와 호환성인 다른 방법에서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법제와 병용한 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 부정적인 세포 개체군의 부위에 직접 전달되어서 치료제에 대한 질환 조직의 노출을 증가시킨다.
본원에서 기술한 바와 같이, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용한 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 질환 예컨대 고형 종양을 포함한, 신생물 질병의 생체내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이러한 점에서, 해리된 결합 분자는 활성제의 안정성을 촉진하고 투여가 용이하도록 제제화될 수 있다. 일정 실시양태에서, 본원에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는, 무독성, 멸균 담체 예컨대 생리적 염수, 무독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용된, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 약학적 유효량은 표적에 유효한 결합을 달성하고 혜택, 즉 암 환자에서 전이를 억제, 지연 또는 감소시키는 것을 달성하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 약학 조성물은 예를 들면, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질 예컨대 포스페이트, 글리신, 솔브산, 칼륨 솔베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 울 지방을 포함한, 약학적 허용 담체를 포함한다.
비경구 투여용 조제물은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 예를 들면, 염수 및 완충 매질을 포함한, 물, 알코올/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 약학적 허용 담체는 제한없이, 0.01-0.1 M, 또는 0.05 M 인간염 완충제 또는 0.8% 염수를 포함한다. 다른 일반적인 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링커 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스계의 것들 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 예를 들면 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 존재할 수 있다.
보다 구체적으로, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수성 용액(여기서는 수용성) 또는 분산물 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에서, 조성물은 멸균되며 용이한 시린지 사용성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야만하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 코팅제 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우 일정 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기 적합한 제제는 [Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.) 16th ed.(1980)]에 기술되어 있다.
미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일정 실시양태에서, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 이룰 수 있다.
임의의 경우에서, 멸균된 주사용 용액은 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 적절한 용매에 일정량의 활성 화합물(예를 들면, 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 그 자체 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용)을 도입시키고, 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 다른 성분들을 함유하는, 멸균된 비히클에 활성 화합물을 도입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에서, 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 바람직한 성분들의 분말을 얻을 수 있는, 진공 건조 또는 냉동 건조법을 포함한다. 주사를 위한 조제물은 처리되어, 용기, 예컨대 앰플, 백, 보틀, 시린지 또는 바이알에 채워지고 당분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉된다. 또한, 조제물은 키트 형태로 포장되어 팔릴 수 있다. 이러한 제조 물품은 관련 조성물이 질환 또는 질병을 앓거나, 또는 그에 취약한 피험체를 치료하는데 유용함을 표시한 라벨 또는 포장 삽입물을 구비할 수 있다.
비경구 제제는 단일 볼러스 용량, 유지 용량이 후속되는 주입 또는 로딩 볼러스 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특별히 고정되거나 또는 가변적인 간격, 예를 들면, 1일 1회, 또는 "필요에 따른" 기준으로 투여될 수 있다.
일정 약학 조성물은 예를 들면 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함한, 허용되는 제형으로 경구 투여될 수 있다. 일정 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 통상의 가용화제 또는 분산제를 적용한, 염수 중 용액으로서 제조될 수 있다.
단일 제형을 생성시키기 위해 담체 물질과 배합되는 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용되는, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 수 있다. 조성물은 단일 용량으로서, 다수 용량으로서 또는 정해진 기간 동안 주입으로서 투여될 수 있다. 투약 계획은 또한 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 발명의 범주를 유지하면서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료적 효과를 생성시키는데 충분한 양으로 상기 언급한 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 기지의 기술에 따라서 통상의 약학적 허용 담체 또는 희석제와 함께 본원에 제공되는 항체와 조합하여 제조된 통상의 제형으로 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 약학적 허용 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수들에 의해 좌우됨을 당분야의 숙련가는 인식하게 된다. 당분야의 숙련가는 또한 본원에 제공된 바와 같은 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 1 이상의 종을 포함하는 칵테일이 사용될 수 있음을 더욱 이해한다.
"치료적 유효 용량 또는 양" 또는 "유효량"은 투여시 치료하려는 질환을 갖는 환자의 치료에 대해 양성적인 치료 반응, 예를 들면 환자에서 전이의 억제, 지연, 또는 감소를 일으키는 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 양을 의도한다.
전이의 억제, 지연, 또는 감소를 위한, 본원의 조성물의 치료 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 포함한, 많은 상이한 인자들에 따라 다양할 수 있다. 일정 실시양태에서 환자는 인간이지만, 형질전환 포유동물을 포함한 인간외 포유동물도 치료할 수 있다. 치료 용량은 안정성 및 효능을 최적화하기 위해 당분야의 숙련가에게 알려진 통상적인 방법을 사용해 적정할 수 있다.
단일 작용제 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 투여되는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 본원의 개시사항을 고려하여 과도한 실험없이 당분야의 숙련가 중 한명이 쉽게 결정할 수 있다. 투여 방식 및 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 투여되는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 개별 양에 영향을 주는 요인들은 제한없이, 질환의 중증도, 병력, 전이 가능성, 및 요법을 겪을 개체의 연령, 신장, 체중, 건강 및 신체적 상태를 포함한다. 유사하게, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용되어 투여되는, 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 투여 방식 및 피험체가 작용제의 단일 용량 또는 다수 용량을 겪을지 여부에 따라 좌우된다.
본원은 또한 암을 갖는 피험체를 치료하기 위한 약물의 제조에서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공하고, 여기서 약물은 적어도 하나의 다른 요법으로 사전치료된 피험체에서 사용된다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 피험체가 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약물을 받기 전에 1 이상의 다른 요법(예를 들면, 적어도 하나의 다른 암 요법으로 치료됨)을 받았음을 의미한다. "사전치료된" 또는 "사전치료"는 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하여 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면, 본원에 개시된 단일클론 항체 VX15/2503, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 사용한 치료의 개시 전에, 2년 이내, 18개월 이내, 1년내, 6개월 이내, 2개월 이내, 6주 내, 1개월 내, 4주내, 3주내, 2주내, 1주내, 6일 내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내, 또는 심지어 1일 이내에 적어도 하나의 다른 요법으로 치료받은 피험체를 포함한다. 피험자가 사전 요법 또는 요법들에 의한 사전치료에 반응자였는지는 필수적이지 않다. 따라서, 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 받은 피험체는 사전 요법, 또는 사전치료가 복수의 요법을 포함하는 1 이상의 사전 요법들에 대해 반응했었거나, 또는 반응에 실패(예를 들어, 암이 난치성)했을 수 있다. 단일 작용제로서 또는 적어도 하나의 다른 면역 조절 요법과 병용하는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 받기 전에 피험체가 사전치료를 받은 다른 암 요법의 예에는 제한없이, 수술; 방사선 요법; 경우에 따라 자가유래 골수 이식과 병용되는 화학요법으로서, 적합한 화학치료제는 제한없이, 상기 본원에 열거된 것들을 포함하는 것인 화학요법; 다른 항암 단일클론 항체 요법; 제한없이, 상기 본원에 열거된 소형 분자를 포함하는, 소형 분자 기반 암요법; 백신/면역요법 기반 암 요법들; 스테로이드 요법; 다른 암 요법; 또는 이의 임의의 조합이 포함된다.
본원의 실시는 달리 언급하지 않으면, 당분야의 기술에 속하는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 채택한다. 예를 들면, 다음의 문헌들을 참조한다: [Sambrook et al., ed.(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed.(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed.,(1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed.(1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds.(1984) Transcription And Translation; Freshney(1987) Culture Of Animal Cell(Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cell And Enzymes(IRL Press)(1986); Perbal(1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cell,(Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds.(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds.,(1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1986); 및 Ausubel et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)].
항체 조작의 일반 원리는 [Borrebaeck, ed.(1995) Antibody Engineering(2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 기재되어 있다. 단백질 조작의 일반 원리는 [Rickwood et al., eds.(1995) Protein Engineering, A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 기재되어 있다. 항체 및 항체-햅텐 결합의 일반 원리는 [Nisonoff(1984) Molecular Immunology(2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)]; 및 [Steward(1984) Antibodies, Their Structure and Function(Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 기재되어 있다. 추가적으로, 당분야에 알려져 있어서 구체적으로 기술하지 않은 면역학의 표준 방법은 일반적으로 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York]; [Stites et al., eds.(1994) Basic and Clinical Immunology(8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)] 및 [Mishell and Shiigi(eds)(1980) Selected Methods in Cellular Immunology(W.H. Freeman and Co., NY)]를 따랐다.
면역학의 일반적인 원리를 기술한 표준 참조문헌들은 다음의 문헌들을 포함한다: [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein(1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds.(1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press, NY); Campbell(1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al.,(Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds.(2000) Kuby Immunnology(4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al.(2001) Immunology(6th ed.; London: Mosby); Abbas et al.(2005) Cellular and Molecular Immunology(5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel(2001) Antibody Engineering(Springer Verlan); Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press); Lewin(2003) Genes VIII(Prentice Hall2003); Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler(2003) PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)].
상기 언급된 모든 참조문헌을 비롯해 본원에 인용된 참조문헌은 그들 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
이하 실시예는 예시로 제공되며 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 면역적격 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D항체의 능력 검사
실험 디자인. 기본 실험 디자인은 다음과 같다. 결장26 종양 세포는 0.2 mL 염수로 동계 면역적격 Balb/c 마우스(5x10^5 세포) 또는 면역 결핍 SCID 마우스(1x10^5 세포)의 옆구리에 피하 이식하였다. 대조군 Ig 2B8 또는 항-SEMA4D Ab 67를 사용하는 치료를 종양 이식 후 2일에 개시하였다. 마우스(n=20)는 복강(IP) 주사를 통해 1.0 mg(대략 50 mg/kg)의 각각의 단일클론 항체를 사용해 주 2회 처치하였다. 종양은 이식 후 3일에 출발하여 3x/주로 칼리퍼를 사용해 측정하였다. 종양은 이식 후 3일에 시작하여 칼리퍼를 사용해 3x/주로 측정하였다. 마우스는 3일에 시작해 2x/wk로 체중 측정하였다. 동물은 종양 부피가 1000 ㎣에 도달하면 희생시켰다.
항-SEMA4D 치료는 적격 면역계의 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장은 칼리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 다음의 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고 l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피(도 1a) 및 종양 부피 = 1000 ㎣인 종료까지의 시간으로 정의된, 카플란 메이어 생존 곡선(도 1b)을 도 1a 및 1b에 도시하였다. 통계 분석은 변수의 2원 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 각각 이용해 수행하였고, 이는 Balb/c 마우스에서 항-SEMA4D 항체를 사용해 통계적으로 유의한 치료 효과를 보여주었다.
29% 종양 성장 지연이 Balb/c 마우스에서 얻어졌지만, SCID 마우스에서는 어떠한 치료 관련 종양 성장 지연도 관찰되지 않았다. 종양 성장 지연(TGD)은 대조군과 비교하여 치료군에서 중간치의 종료까지 시간(TTE)의 증가로 정의된다: % TGD - [(T-C)/C] x 100, 여기서 T = 치료군에 대한 중간치 TTE, C = 대조군에 대한 중간치 TTE임. 항-SEMA4D 항체 67을 처치한 Balb/c 동물은 대조군 동물에 비해 희생 시 원발성 종양 부피가 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났다(P<0.0001). 이러한 결과는 항-SEMA4D 항체는 적격 면역계의 마우스에서는 종양 성장을 지연시키는데 효과적이었지만, 면역 결핍 마우스에서는 그렇지 않았다.
실시예 2: CD8+ 이펙터 T 세포의 존재에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 결장26 종양 세포를 Balb/c 마우스(0.2 mL 염수 중 5x10^5 세포)의 옆구리에 피하 이식하였다. 항-CD8 고갈 항체(클론 2.43, BioXCell) 또는 대조군 래트 Ig(클론 LTF-2, BioXCell)(150 mg/kg)는 -1, 0, 1, 11 및 그 이후 매주 복강(IP) 주사를 통해 주사하였다. 대조군 Ig 2B8 또는 항-SEMA4D Ab 67을 사용한 치료를 2일에 개시하였다. 마우스(n=20)를 복강 주사를 통해 1.0 mg(대략 50 mg/kg)의 단일클론 항체를 주 2회 처치하였다. 종양은 이식 후 3일에 시작하여 캘리퍼를 이용해 3x/주로 측정하였다. 동물은 대조군의 평균 종양 부피가 1000 ㎣에 도달하였을때 희생시켰는데, 래트 Ig 치료군의 경우는 30일이었고, 항-CD8 치료군의 경우 26일이었다.
항-SEMA4D 치료는 CD8+ T 림프구 존재 하에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 부피는 다음의 식을 사용하여 칼리퍼에 의해 측정하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 저비, 보다 작은 측정치이고 l = 종양의 길이(mm)이다. 종양 부피의 통계적 차이는 대조군 Ig 2B8을 사용한 항체 치료군과 비교한 양방 1원 변수 분석(ANOVA)을 사용해 결정하였다. 평균 종양 부피는 도 2에 나타내었다.
종양 성장의 억제를 또한 결정하였다. 종양 성장 억제(TGI)는 다음의 식을 사용해 측정하였다: %TGI = 1-[(Tf-Ti)/평균(Cf-Ci)]; 기록된 %TGI는 각 처치된 종양에 대한 %TGI의 평균이다. 종양 부피의 통계적 차이는 양방 1원 변수 분석(ANOVA)를 사용한 후 대조군 2B8 처리군과 비교하는 던넷 다중 비교법을 사용해 결정하였다. 30% 종양 성장 억제가 항-SEMA4D 항체 치료 후 얻어졌지만, CD8+ T 세포가 고결된 경우에는 어떠한 치료 관련 효과도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 항-SEMA4D에 의한 종양 성장 억제는 CD8+ 이펙터 T 세포의 존재에 의존적임을 보여준다.
실시예 3: 종양 침윤성 림프구(TIL)의 밀도를 증가시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 결장26 종양 세포를 Balb/c 마우스(0.2 mL 중 5x10^5 세포)의 옆구리에 피하 이식하였다. 대조군 Ig 2B8 또는 항-SEMA4D Ab 67에 의한 치료는 2일에 개시하였다(50 mg/kg IP, 주 2회, n=10). 종양은 이식 후 3일에 시작하여 칼리퍼로 3x/주로 측정하였다. 동물은 대조군의 평균 종양 부피가 1000 ㎣에 도달한, 27일에 희생시켰다. 주변 기질 및 피부를 포함하여, 종양을 회수하고 포르말린에 24시간 동안 고정시킨 후 70% 에탄올로 옮겼다. 이어서 샘플을 파라핀 삽입을 위해 처리하고, 5 미크론 섹션을 최종 블록으로부터 잘라내었다.
인접한 섹션은 다음의 방법을 사용하여 Sema4D, CD8, 및 CD20에 대해 염색하였다:
a. Sema4D 검출을 위해서, 슬라이드를 1시간 동안 60℃에서 소성시킨 후, 탈파라핀화시키고 크실린 및 등급화 에탄올 수조를 통해 재탈수시켰다. 에피토프 복구는 표적 복수 용액(Dako, Carpinteria, CA)에서 20분 비등시킨 후 30분 냉각시켜 수행하였다. 슬라이드를 0.05% Tween-20(TPBS)를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 내생성 퍼옥시다아제를 이중 효소 차단제(Dako, Carpinteria, CA)로 10분 차단하여 불활성화시켰다. 슬라이드를 TPBS로 2회 세척한 후, 비특이적 결합은 TPBS 중 2.5% 정상 염소 혈청과 20분 항온반응을 통해 차단시켰다. 1회 TPBS 세척 후, 슬라이드는 TPBS 중 2 ㎍/mL의 토끼 항-Sema4D와 60분간 항온반응시킨 후, 2 TPBS 세척하였다. 이어서 슬라이드는 20분간 엔비젼 HRP 표지된 염소 항-토끼 중합체(Dako, Carpinteria, CA)와 항온반응시키고 TPBS로 2회 세척하고 5분 DAB+ 항온반응(Dako, Carpinteria, CA)시였다. 섹션은 해리스 헤마토실린으로 대비염색시키고, 탈염식시킨 후, 수돗물을 사용해 푸르게 하고, 탈수시키고, 퍼마운트로 비수성 고정시켰다.
b. CD8는 상기 방법을 사용하였지만, 2 ㎍/mL의 시판 토끼 다클론 항체(Abbiotec)를 사용해 검출하였다.
c. CD20은 상기 방법을 사용하였지만, 차단을 위해 정상 당나귀 혈청을 사용하고, 1 ㎍/mL의 염소 항-CD20 1차 항체(Santa Cruz)를 사용한 후, 20분간 HRP-표지된 항-염소 항체(Golden Bridge)를 사용해 검출하였다.
d. 슬라이드는 올림푸스 Ix50 현미경에 결합된 레티가 QICAM-12 비트 카메라를 사용해 20X 확대율에서 영상화시켰다.
항-SEMA4D 치료는 종양 침윤성 면역 세포(TIL)의 빈도를 증가시켰다. 면역 세포 밀도는 전체 종양의 섹션을 스캔하고, CD8+ 또는 CD20+ 종양 침윤성 림프구(TIL)의 면적을 정량한 후, 총 종양 면적에 대해 정규화하여 측정하였다. 그룹 당 9(대조군 Ig) 또는 10(항-SEMA4D Ab 67)마리 마우스 유래 섹션을 분석에 사용하였다. 통계적 유의성은 양방 미대응 T 검정법을 사용해 95% CI까지 CD8 및 CD20에 대해 계산하였다.
항-SEMA4D 항체 67로 결장26 종양의 치료는 대조군과 비교하여 CD8+ T 세포 밀도 및 CD20+ T 세포 밀도 둘 모두를 증가시켰다. CD20+ T 세포의 밀도 증가는 0.0388의 P값으로 95%까지 통계적으로 유의하였다. CD8+ T 세포의 밀도는 경향을 보였지만 통계적으로 유의하지 않았다. 이러한 발견들은 결장26 종양의 항-SEMA4D 치료가 종양 침윤성 면역 세포의 빈도 증가를 초래함을 보여주었다. 결과들은 도 3a 및 3b에 그래프로 나타내었다.
실시예 4: 종양의 최첨단에서 M1 및 M2 마크로파지 서브셋 및 CD8+ T 세포의 이동 및 분포에 영향을 미치는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
항-SEMA4D 치료는 종양의 최첨단에서 마크로파지 및 CD8+ T 세포 분포를 변경시켰다. 마크로파지 분포는 전체 종양의 섹션을 스캐닝하고, M1(2 ㎍/mL의 Alexa647 접합된 래트 항-F4/80(Biolegend, 클론 BM8)으로 염색) 및 M2(2 ㎍/mL의 바이오틴 접합된 래트 항-CD206(Biolegend, 클론 C068C2)의 면적을 정량한 후, 종양 내 M1 및 M2 밀도를 결정하기 위해 총 종양 면적에 대해 정규화하여 측정하였다. 그룹 당 9(대조군 Ig) 또는 10(항-SEMA4D Ab 67) 마리 처치된 마우스 유래 섹션을 분석에 사용하였다. 종양 성장 앞쪽에서 세포 밀도를 결정하기 위해서, 300 픽셀 너비 영역(250 미크론)을 종양의 최첨단으로부터 정의하였다. M1 및 M2에 대한 통계적 유의성은 95% CI까지 크루스칼-월라스 및 던의 사후 검정과 1원 ANOVA를 사용해 계산하였다. 종양의 최첨단에 대해 정규화한 M1 마크로파지 밀도의 변화는 유의하였다.
CD8+ T 세포 개수는 항-CD8 항체(1:250으로 Abbiotec Cat#250596) 및 DAB 검출 시스템으로 염색한 전체 종양 섹션에서 측정하였다. 전체 종양 섹션에서 CD8+ 사건의 개수는 Imagepro 소프트웨어를 사용해 양성 신호에 대한 한계치 이후 계산하였다. 각 동물에 대한 CD8+ 밀도는 CD8+ 사건의 개수를 전체 종양 픽셀 영역을 나누어서 계산하였다. 개별 CD8 밀도는 2B8 및 mAb67 처리된 동물(n=10)에서 CD8+ T 세포 분포에 도달하게 평균내었다. 통계적 유의성은 95% CI까지 크루스칼-월라스 및 던의 사후 검정과 1원 ANOVA를 사용해 계산하였다.
SEMA4D 분포는 Ab 67에 의해 인식되는 것과 구별되는 에피토프에 대한 항체로 SEMA4D에 대해 염색한 전체 종양의 섹션을 스캐닝하고 Sema4D 분포에 대해 분석하여 측정하였다. 그룹 당 9(대조군 Ig) 또는 10(항-SEMA4D Ab 67)마리 처리 마우스 유래 섹션을 분석에 사용하였다.
결장26 종양 세포는 시험관내에서 배양시 SEMA4D를 낮은 수준으로 발현하였지만, 종양의 최첨단에서 생체내에서 SEMA4D는 상향조절되었다. 이는 종양의 주변에서는 고농도로 SEMA4D 발현의 농도 구배 확입을 초래하였다. 항-SEMA4D 항체를 사용한 치료는 SEMA4D를 중화시키고 발현 구배를 파괴하였다. 이는 결과적으로 도 4a에 도시된 바와 같이, 마크로파지의 이동 및 분포를 현저하게 변화시켰다. 구체적으로, 항-SEMA4D Ab 67이 처리된 종양은 도 4b에 도시한 바와 같이 종양의 최첨단에서 M1+ 프로염증성 마크로파지의 수준이 더 높았다. M1+ 마크로파지의 증가는 통계적으로 유의하였다. 항-SEMA4D Ab 67이 처리된 종양은 또한 도 4c에 도시한 바와 같이 종양의 최첨단에서 프로종양 M2 마크로파지의 빈도가 감소되는 것으로 확인되었다. 이러한 발견들은 항-SEMA4D Ab 67 처치가 종양 최첨단에서 종양 억제성 마크로파지, 즉 M1의 밀도를 증가시키는 한편, 동일 영역에서 종양 촉진 마크로파지, 즉 M2의 존재를 감소시키는 방식으로 마크로파지 분포를 변경시킴을 보여주었다. 또한, 이러한 발견들은 도 4d에 도시된 바와 같이, MAb67-처치된 마우스에서 단리된 종양 내 CD8+ T 세포 밀도의 전반적인 증가를 보여주었다. 이러한 발견들은 MAb 67-2에 의한 SEMA4D의 중화가 고도의 증식성 종양 세포 및 그 구역 도처의 CD8+ T 세포쪽으로 항-종양 M1 마크로파지의 진입 및 최첨단으로 확대를 촉진함을 시사한다(삽도).
실시예 5: 항-CTLA4 항체와 병용하여 사용시 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 5x105 결장26 종양 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2에 의한 치료는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(종양 접종 후 8일에 100 ㎍ 및 종양 접종 후 11일 및 14일에 50 ㎍)과 함께 또는 없이 접종 후 1일에 개시하였다(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5). 항-PD1/RMP1-14에 의한 치료는 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11과 병용하여 접종 후 1일에 개시하였다(3일에 100 ㎍, 주 2회). 그룹 당 20마리 마우스가 존재하였다. 종양은 이식 후 5일에 시작하여 칼리퍼를 사용해 2x/주로 측정하였다. 동물들은 종양 부피가 1000 ㎣에 도달했을때 희생시켰다.
항- SEMA4D 및 항- CTLA4 항체의 조합은 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장은 칼리퍼에 의해 측정하였고 측정치를 사용해 다음의 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 1000 ㎣인 종료까지 시간으로 정의된, 카플란 메이어 생존 곡선을 각각 도 5a 및 5b에 도시하였다. 통계 분석은 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 사용해 수행하였고, 항-SEMA4D 항체(9% 종양 성장 지연, TGD**) 및 항-CTLA4 항체(2% TGD, ns)에 의한 통계적으로 유의한 치료 효과를 보여주었으며, 항-SEMA4D 및 항-CTLA4 항체(최대 TGD, 114%****)의 조합에 의해 종양 성장 지연이 상당히 유의하게 증가되었음을 보여주었다. 이 반응은 적어도 60일 동안 지속되었다.
결장26 종양 모델에서 종양 퇴행 빈도를 또한 결정하였다. 퇴행은 적어도 2회 연속 측정 동안 < 50 ㎣로 측정되는 종양으로 정의되는, 뚜렷한 종양의 결여이다. 도 5c에 도시한 바와 같이, 항-SEMA4D 및 항-CTLA4 항체의 조합은 결장26 종양 모델에서 퇴행 개수를 증가시켰다. 병용 요법(항-SEMA4D+ 항CTLA4 항체)의 퇴행은 피셔의 정확 검정에 의해 결정시 대조군 Ig(p <0.0001)과 비교하고 항-CTLA4 또는 항-SEMA4D 단일요법(p = 0.0022)과 비교하여 통계적으로 유의하였다. 중요한 것은, 이러한 발견들이 항-SEMA4D 및 항-CTLA4 항체의 조합이 상승적이었음을 보여주었고, 이는 조합이 항-SEMA4D 항체 단독 또는 항-CTLA4 항체 단독 치료보다, 유의하게 더욱 효과적이어서, 지속적인 종양 퇴행 빈도를 증가시킴을 보여주었다. 또한, 이들 결과는 항-SEMA4D 및 항-CTLA4 항체의 조합이 항-PD1 및 항-CTLA4의 조합과 적어도 비슷하게 유효하거나, 또는 보다 더 양호함을 보여주었다.
항-SEMA4D 항체에 의한 치료는 종양-반응성 CTL 활성을 증가시키고, 또한 항-CTLA4-매개 CTL 활성을 강화시킴을 더욱 보여주었다. 후속 실험을 수행하여 종양-특이적 종양 침윤성 백혈구(TIL)의 빈도 및 프로염증성 사이토카인의 분비에 대한, 항-CTLA4 및 항-SEMA4D 병용 요법과 비교한, 항-CTLA 단일요법의 효과를 조사하였다. 이러한 후속 실험에서, 대조군 IgG1/MAb2B8, 항-CTLA4/MAbUC10-4F10, 또는 항-CTLA4/MAbUC10-4F10 및 항-SEMA4D/MAb67의 조합으로 생체내에서 처치된 결장26 종양-보유 마우스의 비장 및 종양으로부터 면역 세포를 단리하였다. 최종 항-CTLA4 항체 용량 후 1일 및 종양 퇴행 직전인, 15일에 조직을 회수하였다. 총 CD45+ TIL을 분비된 사이토카인 수준에 대해 평가하였고, MHC-I-제한된 결장26 종양-특이적 면역우성 gp70 펩티드 존재 하에서 IFNg 분비 CD8+ T 세포의 빈도를 ELISPOT에 의해 결정하였다. MHC I 특이적 반응자의 빈도는 펩티드-함유 웰에서 배지 대조군을 빼서 계산하였다.
도 5d에 도시한 바와 같이, 프로-염증성 사이토카인 IFNg의 높은 수준이 항-CTLA4 항체 단일요법(p=0.0135)을 처치한 마우스의 종양에서 관찰되었고, 항-CTLA4 및 항-SEMA4D의 병용 요법으로 치료후 더욱 유의하게 강화되었다(대조군 또는 단일요법과 비교하여 p=0.0002). 도 5e에서, 펩티드-특이적 IFNg 분비 반응자의 높은 빈도가 항-CTLA4 항체를 처치한 마우스의 비장에서 관찰되었다. 이러한 발견은 주변부에서 T 세포 활성화를 유도하는 것으로 보고되었기 때문에 예상하였었다. 항-CTLA4 및 항-SEMA4D의 병용 요법은 비장에서 활성을 더 강화시키는 것으로 확인되지 않았다. 대조적으로, 펩티드-특이적 IFNg 분비 반응자의 빈도의 실질적인 증가가 항-CTLA4 단일요법 치료 후 TIL에서 관찰되었고, 항-CTLA4 및 항-SEMA4D 병용 요법으로 치료 후 더욱 유의하게 강화되었다. 이러한 발견은 항-SEMA4D 치료의 부가가 국재화된 종양-특이적 방식으로 종양-특이적 CD8+ T 세포 활성이 유의하게 개선될 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 종양-특이적 세포독성 CD8+ T 세포의 종양 침윤에 영향을 미치는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
MAb 67-2 치료는 종양-특이적 TIL의 빈도 및 프로염증성 사이토카인의 분비를 증가시킨다. 4주의 생체내 항-SEMA4D 치료 후, 종양을 자성 분리를 통해 해리시키고 CD45+ 세포에 대해 농축시켰다. 5마리 마우스로부터 모은 CD45+ TIL을 다양한 세포 밀도에서, 면역우성 종양 펩티드, AH-1의 존재 및 부재 하에 항온반응시켰다. IFNγ 분비 세포를 ELISPOT에 의해 측정하였고; 펩티드 특이적 반응은 펩티드가 없는 웰의 평균을 빼서 결정하였다. 각각의 샘플은 6 복제물로 시험하였고 상기에 그래프화하였다. 통계 유의성은 만-위트니 비모수 t 검정법으로 결정하였다.
IFNγ 분비 세포의 증가는 도 6a에 도시한 바와 같이, 펩티드 존재 및 부재 둘 모두시 MAb 67-처치된 마우스에서 관찰되었다. CD45+ TIL, 특히 MHC-I-제한된 펩티드-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포는 MAb 67-2에 의한 처리 후 활성화된 이펙터 세포를 나타낸다. 도 6b는 대표적인 ELISPOT 영상을 도시한다. 다음으로, CD45+ TIL을 48시간 동안 생체외에서 배양하였고 CBA 분석을 사용해 사이토카인 분비에 대해 분석하였다. 도 6c에 도시된 바와 같이, Mab 67-2는 TIL에서 항-종양 사이토카인, 예컨대 IFNγ 및 TNFα의 분비를 촉진한다. 통계적 유의성은 만-위트니 비모수 t 검정법으로 결정하였다.
후속 실험을 수행하여 종양-특이적 종양 침윤성 백혈구(TIL)의 빈도 및 프로-염증성 사이토카인의 분비에 대한 MAb 67-2 치료의 효과를 조사하였다. 대조군 IgG1/MAb2B8 또는 항-SEMA4D/MAb67로 생체내에서 처치한 결장26 종양-보유 마우스의 종양으로부터 면역 세포를 단리하였다. 전체 CD45+ TIL을 분비된 사이토카인 수준에 대해 분석하였고, MHC-I-제한된 결장26 종양-특이적 면역우성 gp70 펩티드의 존재 하에서 IFNg 분비 CD8+ T 세포의 빈도를 ELISPOT에 의해 결정하였다. MHC I 특이적 반응자의 빈도는 펩티드-함유 웰에서 배지 대조군을 빼서 계산하였다.
도 6d에서 도시한 바와 같이, 프로-염증성 사이토카인 IFNg 및 TNFa의 높은 수준이 항-SEMA4D 항체로 처치한 마우스의 TIL에서 관찰되었다. 또한, 도 6e에 도시한 바와 같이, 펩티드-특이적 IFNg 분비 반응자의 높은 빈도가 항-SEMA4D 항체로 처치한 마우스의 TIL에서 관찰되었다. 이러한 발견은 항-SEMA4D 치료의 부가가 국재화된 종양-특이적 방식으로 종양-특이적 CD8+ T 세포 활성을 유의하게 개선시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 항-PD1 항체와 병용하여 사용시 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 5x105 결장26 종양 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2에 의한 치료는 접종 후 1일에 개시하였다(50 mg/kg, IP, 주1회). 각 마우스 그룹을 또한 대조군 래트-Ig 또는 래트 항-PD1/MAbRMP1-14(100 ㎍, 종양 접종 후 3일에 시작하여 주2회, X 2 주)로 처치하였다. 그룹 당 마우스는 20마리였다. 종양을 이식 후 5일에 시작하여 칼리퍼에 의해 3x/주로 측정하였다. 동물은 종양 부피가 1000 ㎣에 도달하면 희생시켰다
항- SEMA4D 및 항-PD1 항체의 조합은 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장은 칼리퍼로 측정하였고 측정치를 사용하고 다음의 식을 이용해 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 1000 ㎣인 종류까지 시간으로 정의된, 카플란 메이어 생존 곡선을 각각 도 7a 및 7b에 도시하였다. 통계 분석은 각각 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 사용해 수행하였고, Balb/c 마우스에서 항-PD1 항체와 병용한 항-SEMA4D 항체에 의한 통계적으로 유의한 치료 효과를 보여주었다. 이러한 발견은 항-SEMA4D 및 항-PD1 항체의 조합이 항-SEMA4D 또는 항-PD1 항체 단독 치료 보다 더 효과적임을 보여준다.
결장26 종양 모델에서 퇴행의 빈도를 측정하고 도 7c 및 7d에 도시하였다. 퇴행은 적어도 2 연속 측정 동안 < 50 ㎣로 측정되는 종양으로 정의되는, 뚜렷한 종양의 결여이다. 항-SEMA4D 및 항-PD1 항체의 조합은 결장26 종양 모델에서 퇴행 수를 증가시켰다. 병용 요법(αSEMA4D+ α PD1 항체)에 대한 퇴행은 피셔의 정확 검정으로 결정시, 대조군 Ig(p=0.0083) 또는 단일 작용제 항-PD-1(p=0.02)과 비교하여 통계적으로 유의하였다.
실시예 8: 사이클로포스파미드와 병용하여 사용시 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 5x105 결장26 종양 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2에 의한 치료는 접종 후 1일에 개시하였다(50 mg/kg, IP, 주1회). 사이클로포스파미드(50 mg/kg, IP)에 의한 치료는 12일 및 20일에 투여하였다. 그룹 당 마우스는 20마리였다. 종양은 이식 후 5일에 시작하여 칼리퍼에 의하 3x/주로 측정하였다. 종양 부피가 1000 ㎣에 도달하면 동물을 희생시켰다.
항-SEMA4D 항체 및 사이클로포스파미드의 조합은 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장은 칼리퍼로 측정하였고 측정치를 사용하고 다음의 식을 이용해 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피, 중간 종양 부피, 및 종양 부피 = 1000 ㎣인 종료까지의 시간으로 정의되는, 카플란 메이어 생존 곡선을 도 8a, 8b 및 8c에 각각 도시하였다. 통계 분석은 각각 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 사용해 수행하였고, Balb/c 마우스에서 사이클로포스파미드와 조합한 항-SEMA4D 항체에 의한 통계적으로 유의한 치료 효과를 도시하였다.
구체적으로, 이러한 결과는 항-SEMA4D 항체를 사이클로포스파미드와 조합하여 사용시 232% 종양 성장 지연(TGD)을 보였다. 이 결과는 만텔 콕스 로그 등급 분석으로 결정시, 대조군 Ig(p <0.0001)와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 만텔 콕스 로그 등급 분석에 의해 결정시, 항-SEMA4D 항체 치료를 단독으로 사용하는 경우 3% TGD(대조군 Ig(p =0.0282)와 비교하여 통계적으로 유의함)였고 사이클로포스파미드 치료를 단독으로 사용시 96% TGD(대조군 Ig(p <0.0001)과 비교하여 통계적으로 유의함)였다. 반응은 적어도 81일 동안 지속되었다. 이러한 결과들은 항-SEMA4D 항체와 사이클로포스파미드의 조합이 항-SEMA4D 항체 단독 또는 사이클로포스파미드 단독 치료 보다 종양 성장을 지연시키는데 더 효과적임을 보여주었다.
결장26 종양 모델에서 퇴행의 빈도를 또한 측정하였고 도 8d 및 8e에 도시하였다. 적어도 2 연속 측정 동안 < 50 ㎣로 측정되는 종양으로 정의되는, 뚜렷한 종양의 결여이다. 항-SEMA4D 항체 및 사이클로포스파미드의 조합은 결장26 종양 모델에서 퇴행의 수를 증가시킨다. 병용 요법(αSEMA4D 항체 + 사이클로포스파미드)에 대한 퇴행은 피셔의 정확 검정에 의해 측정시, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다(p <0.003). 이들 결과는 항-SEMA4D 항체와 병용시 사이클로포스파미드의 치료에 대한 높은 효능 및 반응을 증명하였다.
실시예 9: 항-HER2/neu 항체와 병용하여 사용시 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 3x104 Tubo.A5 종양 세포는 암컷 Balb/c 마우스의 유선 지방체에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8.1E7 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2에 의한 치료는 접종 후 7일에 개시하였다(50 mg/kg, IP, 주1회 X6). 항-Neu/MAb7.16.4(200 ㎍ IP 주1회 X2)에 의한 치료는 종양 부피가 대략 200 ㎣가 되었을 때, 21일 및 28일에 개시하였다. 그룹 당 15마리 마우스가 존재하였다. 종양은 이식 후 11일에 시작하여 칼리퍼에 의해 2x/주로 측정하였다. 종양 부피가 800 ㎣에 도달하면 동물을 희생시켰다.
항- SEMA4D 및 항- HER2 / Neu 항체의 조합은 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장은 칼리퍼에 의해 측정하였고 측정치를 사용하고 다음의 식을 이용해 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다., 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 800 ㎣인 종료까지 시간으로 정의되는 카플란 메이어 생존 곡선을 도 9a 및 9b에 각각 도시하였다. 통계 분석은 각각 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 사용해 수행하였고, Balb/c 마우스에서 항-Her2/Neu 항체와 병용한 항-SEMA4D 항체의 통계적으로 유의한 치료 효과를 보여주었다. 결과는 항-SEMA4D 항체를 항-Neu 항체와 병용하여 사용시 48% 종양 성장 지연을 보여주었고 이는 만텔 콕스 로그 등급 분석으로 결정시 비관련 대조군 항체(p=0.017) 또는 항-Neu 단일요법(p =0.006)과 비교하여 통계적으로 유의하였다.
Tubo 종양 모델에서 종양 퇴행의 빈도를 또한 측정하였고 도 9c에 도시하였다. 퇴행은 적어도 2 연속 측정 동안 < 50 ㎣로 측정된 종양으로 정의되는, 뚜렷한 종양의 결여이다. 항-SEMA4D 및 항-Neu 항체의 조합은 Tubo-보유 마우스에서 퇴행 수를 증가시켰다. 병용 요법(αSEMA4D + αNeu 항체)에 대한 퇴행은 피셔의 정확 검정으로 측정시 대조군 Ig(p =0.016)와 비교하여 통계적으로 유의하였다.
실시예 10: 생체내 유선 암종 모델의 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 능력 검사
실험 디자인. 3x104 Tubo.A5 종양 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 유선 지방체에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8.1E7 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2에 의한 치료는 접종 후 6일에 개시하였다(50 mg/kg, IP, 주1회 X6). 그룹 당 20마리 마우스가 존재하였지만, 일부 마우스는 궤양화 또는 전반적으로 좋지않은 건강으로 인해 종료에 도달하기 전 이른 폐사로 인해 분석에서 배제하였다. 종양은 캘리퍼를 사용하여 이식 후 13일에 시작해 2x/주로 측정하였다. 종양 부피가 800 ㎣에 도달하면 동물을 희생시켰다.
항-SEMA4D 항체 치료는 마우스에서 종양 성장을 지연시켰다. 종양 성장을 칼리퍼에 의해 측정하고 측정치를 사용하고 다음의 식을 이용해 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 800 ㎣인 종료까지 시간으로 정의된, 카플란 메이어 생존 곡선을 도 10a 및 10b에 각각 도시하였다. 통계 분석은 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 각각 사용해 수행하였고, 항-SEMA4D 항체에 의한 통계적으로 유의한 치료 효과를 보여주었다. 결과는 항-SEMA4D 항체 치료에 의한 최대 종양 성장 지연(133%)을 보여주었고, 만텔 콕스 로그 등급 분석으로 결정시, 미관련 대조군 항체와 비교하여 통계적으로 유의하였다(p<0.0001).
Tubo.A5 종양 모델에서 종양 퇴행의 빈도를 또한 측정하였고, 도 10c-10e에 도시하였다. 퇴행은 적어도 2 연속 측정 동안 < 50 ㎣로 측정되는 종양으로 정의된, 뚜렷한 종양의 결여이다. 이식 후 90일에, 85%(12/14)의 MAb67-처치된 마우스가 무종양 퇴행체였고 14마리중 한 마리는 대조군 Ig를 처치한 마우스에서 0/14 퇴행과 비교하여, 측정가능한 종양이 전혀 발생되지 않았다. 90일에, 그들의 원발성 종양을 완전하게 거부한 마우스(13/14의 MAb67-처치된 마우스)를 반대쪽면에 생존 Tubo.A5(30,000)로 공격하였고, 나이브 마우스를 그라프트에 대한 대조군으로 포함시켰다. 도 10d에 도시한 바와 같이, 항-SEMA4D를 처치한 모든 13마리 마우스는 후속 종양 곡격을 거부하여 면역학적 기억 반응을 시사하였고, 반대로 나이브 마우스는 도 10e에 도시한 바와 같이 종양 공격을 거부하지 않았다. 퇴행 빈도는 피셔의 정확 검정으로 결정시, 대조군 Ig(p<0.0001)와 비교하여 통계적으로 유의하였다.
실시예 11: Tubo.A5 종양 모델에서 T 세포 침윤 및 MDSC에 대한 항-SEMA4D 항체의 효과
실험 디자인. Tubo.A5 종양을 동계 BALB/c 마우스에 이식하였다. 쥣과동물 대조군 Ig 또는 항-SEMA4D MAb 67에 의한 치료를 6일에 개시하였다(50 mg/kg IP, 주1회). 종양은 종양 퇴행 직전, 39일에 회수하였다. FACS14-21 마우스/군의 종양에서 모은 림프구 세포 분획에 대해 FACS를 수행하였다. 어세이 복제물의 평균을 도시하였고; 양방 t-검정을 사용해 유의성을 확인하였다.
도 11a 및 11b에 도시한 바와 같이, 항-SEMA4D 항체 요법은 항-SEMA4D를 처치한 마우스의 종양에서 CD3+ T 세포 침윤을 증가시키고 CD11b+Gr1+ MDSC를 감소시켰다. 이들 데이타는 항-종양형성성 T 세포 반응의 증가 및 면역억제 세포, 예컨대 MDSC의 감소를 시사한다. 이들 데이타는 결장 26 모델에서 관찰된 면역 균형의 조정과 일관적이다.
실시예 12: Tubo.A5 및 결장26 종양 모델에서 MAb67의 용량 적정
Tubo.A5 종양 모델에 대한 실험 디자인. 3x104 Tubo.A5 종양 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 유선 지방체에 피하 이식하였다. 대조군 마우스 IgG1/2B8.1E7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 6) 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(1, 10 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 6)에 의한 치료는 접종 후 6일에 개시하였다. 그룹 당 적어도 20 마리 마우스가 존재하였지만, 일부 마우스는 궤양화 또는 전반적인 좋지않은 건강으로 초래된 종료에 도달하기 전 이른 폐사로 인해 분석에서 배제하였다. 종양은 이식 후 13일에 시작하여 칼리퍼를 사용해 2x/주로 측정하였다. 동물은 종양 부피가 800 ㎣에 도달하면 희생시켰다.
결장26 종양 모델에 대한 실험 디자인. 5x105 결장26 종양 세포는 암컷 Balb/c 마우스의 옆구리에 피하 이식시켰다. 대조군 마우스 IgG1/2B8.IE7(50 mg/kg, IP, 주1회 x 5) 또는 항-SEMA4D/MAb 67-2(0.3, 3, 10, 또는 50 mg/kg, IP, 주1회 x 5)에 의한 치료는, 항-CTLA4/MAb UC10-4F10-11(종양 접종 후 8일에 100 ㎍∼5 mg/kg, 및 종양 접종 후 11일 및 14일에 50 ㎍∼2.5 mg/kg)와 함께 또는 없이, 접종 후 1일에 개시하였다. 그룹 당 15마리 마우스가 존재하였다. 종양은 이식 후 5일에 시작하여 칼리퍼를 사용해 2x/주로 측정하였다. 동물은 종양 부피가 ≥ 1000 ㎣에 도달시 희생시켰다.
최소 유효 용량은 대략 3mg/kg이다. 50 또는 10 mg/kg MAb67로 Tubo.A5의 치료는 대조군 IgG와 비교하여 통계적으로 유의하게 종양 성장을 지연(각각 p<0.0001 및 p=0.0015)시켰지만, 서로 유의하게 다르지 않았다. 50 또는 10 mg/kg MAb67를 처리한 Tubo.A5 종양에서 38%(9/24) 및 54%(6/13)의 퇴행 빈도가 또한 통계적으로 유의하였다(p=0.0069 및 p=0.0014). 대조적으로, 1 mg/kg Mab67은 유효하지 않았고 종양 성장을 유의하게 지연시키지 않았다(p=0.01441). 이 모델에서, 최소 유효 용량은 1 내지 10 mg/kg으로 결정되었다. 종양 성장은 칼리퍼에 의해 측정하였고, 측정치를 사용하고 다음의 식을 이용해 종양 부피를 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 800 ㎣인 종료까지 시간으로 정의된 카플란 메이어 생존 곡선을 각각 도 12a 및 12b에 도시하였다. 통계 분석은 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 각각 이용해 수행하였다.
유효한 MAb67 용량의 추가적인 정교화는 결장26 모델에서 실시하였고 ≥ 3 mg/kg로 결정되었다. 항-CTLA4 + 항-SEMA4D에 의한 결장26 종양의 치료는 항-SEMA4D/MAb 67의 용량이 ≥ 3 mg/kg일 경우 항-CTLA4 단일요법과 비교하여 최대 종양 성장 지연(119%)이 야기되었고; 항-CTLA4 단일요법과 비교하고 만텔 콕스 로그 등급 분석을 사용해 결정시, 10 mg/kg MAb67에서, p=0.0101이고 3 mg/kg에서, p=0.0571이었다. 3 내지 50 mg/kg의 모든 용량은 서로 유의하게 상이하지 않았다. 대조적으로, 항-CTLA4를 0.3 mg/kg MAb67와 병용하여 투여시, 그 차이가 10 mg/kg MAb 67(p=0.0325)에 의한 치료와 통계적으로 상이하였지만, 항-CTLA4 단일요법에 의한 치료와 비교해서는 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.4945). 종양 성장을 칼리퍼에 의해 측정하였고 측정치를 사용해 종양 부피를 다음의 식을 이용해 계산하였다: (w 2 x l)/2, 여기서 w = 너비, 보다 작은 측정치이고, l = 종양의 길이(mm)이다. 평균 종양 부피 및 종양 부피 = 1000 ㎣인 종료까지 시간으로 정의된, 카플란 마이어 생존 곡선을 도 12c 및 12d에 각각 도시하였다. 통계 분석은 2원 변수 분석(ANOVA) 및 로그 등급 분석을 각각 이용하여 수행하였다.
실시예 13: 결장26 및 Tubo.A5 종양 모델에서 종양 성장을 지연시키는 항-SEMA4D 항체의 효과
실험 디자인. 도 13은 결장26 및 Tubo.A5 종양 모델에서 종양 재공격 후 종양 퇴행 및 성장을 보여주는 상기 실시예에서 수행된 실험의 요약이다. 개별 실험의 실험 디자인은 상기 실시예에 요약되어 있다.
항-SEMA4D 항체 요법은 완전하고 항구적인 종양 퇴행을 야기시킨다. 도 13에 도시된 바와 같이, 항-SEMA4D 항체 요법에 의한 치료는 결장26 및 Tubo.A5 모델 둘 모두에서 대조군 마우스 IgG1에 의한 치료와 비교하여 통계적으로 유의한 종양 퇴행 증가를 야기시켰으며, 각각 7%(P ≤ 0.001***) 및 85%(P ≤ 0.0001****)였다. 또한, 항-SEMA4D 항체 요법에 의한 치료는 항-PD1 단독 치료와 달리 유의하지 않았지만(7%인 항-SEMA4D 단독 vs. 8%인 항-PD1 단독, n.s.), 항-PD1 요법과 병용하여 사용시 유의하게 강화되었다(28%의 병용 요법 vs. 7%의 항-SEMA4D 또는 8%의 항-PD1 단일요법, P ≤ 0.0001****). 또한, 항-CTLA4 요법과 병용한 항-SEMA4D 항체 요법에 의한 치료는 항-CTLA4 단독 치료와 비교시 종양 퇴행이 통계적으로 유의하게 증가되었다(74%의 병용 요법 vs. 20%의 항-CTLA4 단일요법, P ≤ 0.0001****). 부가적으로, 항-CTLA4 요법과 병용한 항-SEMA4D 항체 요법의 치료는 항-PD1과 병용한 항-SEMA4D에 의한 치료와 비교하여 종양 퇴행이 통계적으로 유의하게 증가되었다(74%의 항-SEMA4D/항-CTLA4 병용 요법 vs. 60%의 항-SEMA4D/항-PD1 병용 요법, P ≤ 0.001****). 항-PD1과 병용한 항-SEMA4D와 비교하여 항-CTLA4와 병용한 항-SEMA4D 간의 보다 높은 분명한 상승효과는 이러한 면에서 모든 면역 관문 차단 억제제가 균등하지 않고 기전의 차이가 차등적인 치료 혜택과 연관될 수 있음을 의미한다. 마지막으로, 사이클로포스파미드와 병용한 항-SEMA4D에 의한 치료는 사이클로포스파미드 단독 치료와 비교하여 종양 퇴행이 통계적으로 유의하게 증가되었다(병용 요법의 경우 40% vs. 사이클로포스파미드 단일요법의 경우 10%, P ≤ 0.01**).
본원에 기재된 실시양태의 많은 변형 및 다른 실시양태가 전술한 설명 및 관련 도면에 제시한 교시의 장점을 가짐을, 본원이 속하는 분야의 숙련가는 이해할 것이다. 따라서, 본원은 개시된 특정 실시양태에 국한되지 않으며 변형 및 다른 실시양태를 본원에 개시된 실시양태의 목록 및 첨부된 청구항의 범주에 포함시키고자 함을 이해해야 한다. 특정 용어가 본원에서 채택되었지만, 그들은 단지 일반적인 설명의 의미로 사용된 것이며 제한하려는 목적이 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> Evans, Elizabeth E. Smith, Ernest S. Zauderer, Maurice <120> USE OF SEMAPHORIN-4D INHIBITORY MOLECULES IN COMBINATION WITH AN IMMUNE MODULATING THERAPY TO INHIBIT TUMOR GROWTH AND METASTASES <130> 58008-133124 <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/907845 <151> 2013-11-22 <150> 61/884771 <151> 2013-09-30 <150> 61/874241 <151> 2013-09-05 <150> 61839170 <151> 2013-06-25 <160> 48 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Met Cys Thr Pro Ile Arg Gly Leu Leu Met Ala Leu Ala Val 1 5 10 15 Met Phe Gly Thr Ala Met Ala Phe Ala Pro Ile Pro Arg Ile Thr Trp 20 25 30 Glu His Arg Glu Val His Leu Val Gln Phe His Glu Pro Asp Ile Tyr 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Leu Ser Glu Asp Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 50 55 60 Gly Ala Arg Glu Ala Val Phe Ala Val Asn Ala Leu Asn Ile Ser Glu 65 70 75 80 Lys Gln His Glu Val Tyr Trp Lys Val Ser Glu Asp Lys Lys Ala Lys 85 90 95 Cys Ala Glu Lys Gly Lys Ser Lys Gln Thr Glu Cys Leu Asn Tyr Ile 100 105 110 Arg Val Leu Gln Pro Leu Ser Ala Thr Ser Leu Tyr Val 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sapiens <400> 23 atgaggatgt gcacccccat tagggggctg ctcatggccc ttgcagtgat gtttgggaca 60 gcgatggcat ttgcacccat accccggatc acctgggagc acagagaggt gcacctggtg 120 cagtttcatg agccagacat ctacaactac tcagccttgc tgctgagcga ggacaaggac 180 accttgtaca taggtgcccg ggaggcggtc ttcgctgtga acgcactcaa catctccgag 240 aagcagcatg aggtgtattg gaaggtctca gaagacaaaa aagcaaaatg tgcagaaaag 300 gggaaatcaa aacagacaga gtgcctcaac tacatccggg tgctgcagcc actcagcgcc 360 acttcccttt acgtgtgtgg gaccaacgca ttccagccgg cctgtgacca cctgaactta 420 acatccttta agtttctggg gaaaaatgaa gatggcaaag gaagatgtcc ctttgaccca 480 gcacacagct acacatccgt catggttgat ggagaacttt attcggggac gtcgtataat 540 tttttgggaa gtgaacccat catctcccga aattcttccc acagtcctct gaggacagaa 600 tatgcaatcc cttggctgaa cgagcctagt ttcgtgtttg ctgacgtgat ccgaaaaagc 660 ccagacagcc ccgacggcga ggatgacagg gtctacttct tcttcacgga ggtgtctgtg 720 gagtatgagt ttgtgttcag ggtgctgatc ccacggatag caagagtgtg caagggggac 780 cagggcggcc tgaggacctt gcagaagaaa tggacctcct tcctgaaagc ccgactcatc 840 tgctcccggc cagacagcgg cttggtcttc aatgtgctgc gggatgtctt cgtgctcagg 900 tccccgggcc tgaaggtgcc tgtgttctat gcactcttca ccccacagct gaacaacgtg 960 gggctgtcgg cagtgtgcgc ctacaacctg tccacagccg aggaggtctt ctcccacggg 1020 aagtacatgc agagcaccac agtggagcag tcccacacca agtgggtgcg ctataatggc 1080 ccggtaccca agccgcggcc tggagcgtgc atcgacagcg aggcacgggc cgccaactac 1140 accagctcct tgaatttgcc agacaagacg ctgcagttcg ttaaagacca ccctttgatg 1200 gatgactcgg taaccccaat agacaacagg cccaggttaa tcaagaaaga tgtgaactac 1260 acccagatcg tggtggaccg gacccaggcc ctggatggga ctgtctatga tgtcatgttt 1320 gtcagcacag accggggagc tctgcacaaa gccatcagcc tcgagcacgc tgttcacatc 1380 atcgaggaga cccagctctt ccaggacttt gagccagtcc agaccctgct gctgtcttca 1440 aagaagggca acaggtttgt ctatgctggc tctaactcgg gcgtggtcca ggccccgctg 1500 gccttctgtg ggaagcacgg cacctgcgag gactgtgtgc tggcgcggga cccctactgc 1560 gcctggagcc cgcccacagc gacctgcgtg gctctgcacc agaccgagag ccccagcagg 1620 ggtttgattc aggagatgag cggcgatgct tctgtgtgcc cggataaaag taaaggaagt 1680 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gccagggaca agccctttga cgtcaagtgt gagctgaagt tcgctgactc agacgcagat 2580 ggagac 2586 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide epitope of proteolipid protein PLP(139-151) <400> 24 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR1 <400> 26 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR2 <400> 27 Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR3 <400> 28 Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser 1 5 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR1 <400> 30 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR2 <400> 31 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR3 <400> 32 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 33 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 <400> 33 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta ttctgattac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagacccc 300 tacggctgga ctatggactc ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR1 <400> 34 ggctacacct ttactaggta ctggatgcac 30 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR2 <400> 35 tacattaatc ctagcactgg ttattctgat tacaatcaga agttcaagga c 51 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR3 <400> 36 gacccctacg gctggactat ggactcc 27 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 <400> 37 gacatccaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120 ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tcgagatcaa a 321 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR1 <400> 38 catgccagtc agaacattaa tgtttggtta agc 33 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR2 <400> 39 aaggcttcca acttgcacac a 21 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR3 <400> 40 caacagggtc aaagttatcc gtacacg 27 <210> 41 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Epitope 1 <400> 41 ctgaaggtgc ctgtgttcta tgcactcttc accccacagc tgaacaacgt g 51 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope 1 <400> 42 Leu Lys Val Pro Val Phe Tyr Ala Leu Phe Thr Pro Gln Leu Asn Asn 1 5 10 15 Val <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Epitope 2 <400> 43 aaatggacct ccttcctgaa agcccgactc atctgctccc ggcca 45 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope 2 <400> 44 Lys Trp Thr Ser Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Arg Pro 1 5 10 15 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Epitope 3 <400> 45 gagtttgtgt tcagggtgct gatcccacgg atagcaagag tg 42 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope 3 <400> 46 Glu Phe Val Phe Arg Val Leu Ile Pro Arg Ile Ala Arg Val 1 5 10 <210> 47 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2282 VL domain <400> 47 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp His Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2282 VH domain <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Tyr His Gly Tyr Ala Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Asn Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (55)

  1. 암을 가진 피험체에서 종양 성장을 억제, 지연, 또는 감소시키는 방법으로서, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 억제, 지연 또는 감소 방법.
  2. 제1항에 있어서, 결합 분자는 SEMA4D와 이의 수용체의 상호작용을 억제하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 수용체는 플렉신(Plexin)-B1인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 결합 분자는 SEMA4D-매개 플렉신-B1 신호 전달을 억제하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 암은 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 신경내분비암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 두경부암, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67과 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67이 SEMA4D와 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6, 7 및 8을 각각 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 서열번호 14, 15 및 16을 각각 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, VH 및 VL은 각각 서열번호 9 및 서열번호 17 또는 서열번호 10 및 서열번호 18을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여, 면역자극제의 투여, 입양 T 세포 또는 항체 요법, 면역 관문 차단(immune checkpoint blockade) 억제제의 투여, 조절성 T 세포(Treg) 조절인자의 투여, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역 조절 요법은 면역 관문 차단 억제제를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 면역 관문 차단 억제제는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 이의 조합인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여를 포함하는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, Treg 조절인자는 사이클로포스파미드인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법은 별도로(separately) 또는 동시에(concurrently) 투여되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법의 조합 투여는 단리된 결합 분자 또는 면역 조절 요법 단독 투여에 비해 강화된 치료 효능을 야기하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 피험체는 다른 암 피험체와 비교했을 때 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘다의 상승된 수준을 갖는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 다른 암 환자의 순환계(circulation)에서 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수의 약 1.5배 내지 약 5배인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 각각 약 147 내지 약 588 및 약 1173 내지 약 3910의 범위인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 피험체는 B 세포 및/또는 T 세포 수준이 건강한 비암(non-cancer) 환자의 B 세포 및/또는 T 세포의 범위 내이거나 그 보다 높은 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포 수준은 각각 약 225 내지 약 275 또는 그 이상 및 약 1350 내지 약 1650 또는 그 이상의 범위인 방법.
  23. 면역요법으로 암을 가진 피험체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 암을 가진 환자에서 B 세포 및/또는 T 세포의 수를 결정하는 단계; 및
    (b) 피험체에서 B 세포 및/또는 T 세포의 수가 소정의 한계 수준을 넘으면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량을 피험체에 투여하여 암을 가진 피험체를 치료하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 다른 암 환자의 순환계에서 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수의 약 1.5배 내지 약 5배인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 각각 약 147 내지 약 588 및 약 1173 내지 약 3910의 범위인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 건강한 비암 환자의 B 세포 및/또는 T 세포의 범위 내이거나 그 보다 높은 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 소정의 한계 수준은 각각 약 225 내지 약 275 또는 그 이상 및 약 1350 내지 약 1650 및 그 이상의 범위인 방법.
  28. 면역요법으로 암을 가진 피험체를 치료하는 방법으로서, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량 및 1 이상의 다른 면역 조절 요법의 유효량의 조합을 암을 가진 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 조합 투여는 단리된 결합 분자 또는 다른 면역 조절 요법 단독 투여에 비해 강화된 치료 효능을 야기하는 것인 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여, 면역자극제의 투여, 입양 T 세포 또는 항체 요법, 면역 관문 차단 억제제의 투여, 조절성 T 세포(Treg) 조절인자의 투여, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 면역 조절 요법은 면역 관문 차단 억제제를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 면역 관문 차단 억제제는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 이의 조합인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 면역 조절 요법은 암 백신의 투여를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, Treg 조절인자는 사이클로포스파미드인 방법.
  34. 제28항에 있어서, 단리된 결합 분자 및 면역 조절 요법은 별도로 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 피험체는 다른 암 피험체와 비교했을 때 B 세포, T 세포 또는 B 세포와 T 세포 둘다의 상승된 수준을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 다른 암 환자의 순환계에서 B 세포 및/또는 T 세포의 평균 수의 약 1.5배 내지 약 5배인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 각각 약 147 내지 약 588 및 약 1173 내지 약 3910의 범위인 방법.
  38. 제28항에 있어서, 피험체는 B 세포 및/또는 T 세포의 수준이 건강한 비암 환자의 B 세포 및/또는 T 세포의 범위 내이거나 그 보다 높은 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 피험체에서 혈액 1 마이크로리터 당 B 세포 및/또는 T 세포의 수준은 각각 약 225 내지 약 275 또는 그 이상 및 약 1350 내지 약 1650 또는 그 이상의 범위인 방법.
  40. 제28항에 있어서, 암은 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 백혈병, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피암, 복막의 암, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 신경내분비암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 뇌암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 식도암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 두경부암, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503 또는 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체와 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  42. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503 또는 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체가 SEMA4D와 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67의 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67인 방법.
  46. Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제, 지연, 또는 감소시키는 방법으로서, 종양 세포를 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하고, 종양 세포의 성장이 억제되거나, 지연되거나, 또는 감소되는 것인 억제, 지연 또는 감소 방법.
  47. 제46항에 있어서, 접촉은 암을 가진 피험체에 SEMA4D 결합 분자의 투여를 포함하고, 피험체의 암 세포는 Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 암은 유방암, 난소암, 폐암, 또는 전립선암인 방법.
  49. 암을 가진 피험체를 치료하는 방법으로서,
    (a) Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합의 발현에 대해 피험체의 암 세포를 분석하는 단계; 및
    (b) 피험체의 암 세포가 Her2 및 플렉신 B1, 플렉신 B2, 또는 이의 조합을 발현하면 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자의 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 항-HER2/neu 결합 분자의 유효량의 투여를 더 포함하는 방법.
  51. 제48항 또는 제49항에 있어서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67과 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  52. 제48항 또는 제49항에 있어서, 단리된 결합 분자는 기준 단일클론 항체 VX15/2503 또는 67이 SEMA4D와 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  53. 제48항 또는 제49항에 있어서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6, 7 및 8을 각각 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 서열번호 14, 15 및 16을 각각 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, VH 및 VL은 각각 서열번호 9 및 서열번호 17 또는 서열번호 10 및 서열번호 18을 포함하는 것인 방법.
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