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KR20150139909A - Fap 및 dr5에 특이적인 이중특이성 항체, dr5에 특이적인 항체 및 사용 방법 - Google Patents

Fap 및 dr5에 특이적인 이중특이성 항체, dr5에 특이적인 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20150139909A
KR20150139909A KR1020157031505A KR20157031505A KR20150139909A KR 20150139909 A KR20150139909 A KR 20150139909A KR 1020157031505 A KR1020157031505 A KR 1020157031505A KR 20157031505 A KR20157031505 A KR 20157031505A KR 20150139909 A KR20150139909 A KR 20150139909A
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쉐리프 다오우티
닝핑 펭
콜러 클라우디아 페라라
가이 조지스
산드라 그로이-리카르트스
랄프 호쎄
크리스티안 클라인
막시밀리아네 쾨니히
외르크 묄레켄
에케하르트 뫼쓰너
휘펭 뉴
카트린 이 파크만
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스테판 제버
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인야 발트호이어
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바바라 바이서
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로슈 글리카트 아게
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Abstract

본 발명은 DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위 및 FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, DR5에 특이적인 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

FAP 및 DR5에 특이적인 이중특이성 항체, DR5에 특이적인 항체 및 사용 방법{BISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR FAP AND DR5, ANTIBODIES SPECIFIC FOR DR5 AND METHODS OF USE}
본 발명은 사멸 수용체 5(Death Receptor 5, DR5)에 특이적인 제 1 항원 결합 부위 및 섬유아세포 활성화 단백질(Fibroblast Activation Protein, FAP)에 특이적인 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, DR5에 특이적인 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
단클론성 항체는 암 세포에서 차별적으로 발현되는 항원들을 선택적으로 표적화하기 때문에, 이들은 암 치료에 있어서 강력한 치료제이다. 작동성(agonistic) 단클론성 항체에 의한 암 세포 상의 TRAIL(TNF 관련 세포자살 유도 리간드) 사멸 수용체의 표적화는, 상기 항체들이 표적화된 세포의 세포자살을 직접 유도할 수 있기 때문에, 새로운 세대의 단클론성 항체 치료법을 대표한다.
TRAIL의 결합시, DR4 및 DR5와 같은 TNFR-SF 계열의 사멸 수용체들은 삼량체화된다. 삼량체화는 외적인 세포자살 경로, 및 최종적으로 표적 세포의 사멸을 야기하는 카스파제(Caspase) 활성화를 포함한 복잡한 단계적 사건들을 유도한다. 세포자살 유도는 DR5의 과군집화(hyperclustering)(즉, 다수의 삼량체들의 군집화)가 일어나는 경우 더 증대된다. 사멸 수용체는 다양한 세포 유형에서 광범위하게 발현되지만, 외적 경로를 통한 세포자살의 유도는 종양 세포로 제한된다. 작동성 DR4 및 DR5 결합 항체는 사멸 수용체를 가교결합시킬 수 있고, 따라서 세포자살을 유도하기 때문에, 이들 수용체는 암 치료에서 흥미로운 표적이다. 최소한 8개의 사멸 수용체 표적화 분자들이 임상 개발에 들어갔으며, 대장암 또는 폐암같은 진행성 고형 종양과 같은 상이한 적응증의 가능한 치료를 위한 임상 시험에서 평가되었다. 또한, 림프종 및/또는 다발성 골수종과 같은 다른 적응증을 치료하기 위한 시도가 이루어졌다.
US 2007/0031414 A1 호 및 WO 2006/083971 호에 기술된 완전 인간 DR5 작동성 항체인 드로지투맙(Drozitumab)은 고농도에서 가교결합의 부재하에 다소의 시험관내 세포자살 활성을 나타낸다. 그러나, 생체내 데이터는 상이한 작용 방식을 나타내었다: FcγR 돌연변이 마우스에서(또는 FcγR 결합이 억제된 항체 변이체가 사용되었을 때) 드로지투맙은 불활성이어서, 상기 분자의 생체내 활성이 주로 FcγR 매개된 가교결합에 의존적임을 시시하였다. 상기 분자는 임상 2상까지 시험되었으며 안전한 것으로 보였지만(20 mg/kg까지 MTD가 도달하지 않았음), 어떤 유의적인 효능도 나타내지 않았다.
코나투무맙(Conatumumab, EP 1922337A 호에 기술됨)은 또 다른 완전 인간 DR5 작동성 항체이다. 코나투무맙의 활성은 절대적으로 Fc 수용체에 의한 가교결합에 의존성이다. 드로지투맙과 달리, 상기 항체는 비-리간드 차단성이다. 또한, 상기 분자는 임상 시험에서 단지 매우 제한된 효능만을 나타내었다.
키메라 DR5 항체인 LBY-135는 가교결합 의존성 활성 및 비-리간드 차단성과 관련하여 코나투무맙과 유사한 특성을 나타내고, 단일요법에서 어떤 유의적인 효능도 나타내지 않았다. 또한, LBY-135는 1상 시험의 등록 환자들의 일부에서 면역원성 징후를 나타내었다.
DR4 및 DR5의 재조합적으로 생산된 천연 리간드(TRAIL)인 둘라네르민(Dulanermin)은 임상 시험에서 단지 제한된 객관적 반응을 나타내었다. 천연 리간드의 사용은 여하튼 불리함을 갖는다: TRAIL은 사멸 수용체 및 유인(decoy) 수용체 둘 다를 포함하는 다중 수용체를 표적화하므로, 선택성이 관심사이다. 또한, TRAIL은, 용량 및 스케줄 파라미터에 영향을 미치는 요인인, 단클론성 항-DR 항체에 비해 훨씬 더 짧은 혈중 반감기를 갖는다. TRAIL의 매우 짧은 혈중 반감기는 단클론성 항-DR 항체에 비해 크고 빈번한 용량을 필요로 한다. 또한, 재조합 TRAIL은 생산하기에 매우 어렵고 지루하다.
전술한 3개의 DR5 작동성 항체 및 리간드 모두 개발이 중단되었다.
2개의 또 다른 완전 인간 항체인 마파투무맙(Mapatumumab)(항 DR4) 및 렉사투무맙(Lexatumumab)(항 DR5)은 여전히 개발중이지만, 이들 분자 또한 단일요법에서 유망한 효능을 나타내지는 않았다.
티가투주맙(Tigatuzumab)은, 물론 전신 독성 문제의 위험을 갖는 2차 가교결합의 부재하에 시험관내에서 활성인(이미 저농도에서) 것으로 설명되는 인간화 DR5 작동성 항체이다. 그러나, 모든 다른 기술된 작동성 DR5 항체들과 같이, 상기 분자도 또한 지금까지 1상/2상 연구에서 확실한 효능을 나타내지 않았으며, 최대 허용 용량 MTD는 단지 8 mg/kg이하로 나타났다.
사멸 수용체를 표적화함으로써 세포자살을 유도하는 상이한 접근방법이 사량체성 DR5 결합 나노바디인 분자 TAS266(WO 201198520A1 호)을 사용하여 추구된다. DR5 결합 잔기의 4가 배열형태로 인해, DR5 가교결합이 표준 2가 항체에 비해 증가되고, 이것은 증가된 활성을 야기할 수 있는 것으로 생각된다. 그러나, 그의 작은 크기로 인해, 상기 분자들은 (항체들에 비해) 오히려 짧은 반감기의 단점을 갖는다. 또한, 상기 사량체성 분자는 종양으로 표적화되지 않기 때문에 증가된 전신 독성 위험이 존재한다.
이중특이성 항체 플랫폼에서 DR5 항체 드로지투맙을 종양 항원 결합 잔기 또는 종양을 둘러싸고 있는 기질에 존재하는 항원과 결합시키는 것이 다음 2가지 효과를 달성하기 위한 새로운 접근방법으로 본 출원의 발명자들에 의해 기술된 바 있다: 첫째, DR5 결합 항체는 종양 부위로 표적화될 수 있어서 잠재적인 전신 독성 문제(특히 가교결합 비의존적 활성을 나타내는 DR5 항체를 사용할 때)를 피할 수 있었다. 둘째, 상기 종양 또는 종양 기질 표적화 잔기는 이어서 또한 DR5 과군집화 및 이어서 종양 부위 특이적 세포자살을 유도하는 가교결합 단위로 작용한다. 기본적인 개념은 상이한 종양 유형을 표적화하는 드로지투맙_scFv 융합 분자를 사용하여 입증되었다(WO 2011/039126 호 참조).
그런 점에서 DR5 및 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP; 진뱅크(GenBank) 등록번호 AAC51668)이 특히 흥미로웠다. 인간 FAP는 원래 단클론성 항체(mAb) F19(WO 93/05804 호에 기술됨, ATCC 번호 IIB 8269)를 사용하여 배양된 섬유아세포에서 확인되었다. 상기 단백질의 동족체들이 쥐를 포함하여 여러 종에서 발견되었다(문헌 [Niedermeyer et al., Int J Cancer 71, 383-389 (1997), Niedermeyer et al., Eur J Biochem 254, 650-654 (1998)]; 진뱅크 등록번호 AAH19190). FAP는 독특한 조직 분포를 갖는다: 상기 FAP는 일반적으로 정상 성인 조직에서는 부재하지만, 그의 발현은, 폐, 대장, 방광, 난소 및 유방암을 포함하여, 모든 원발성 및 전이성 상피 종양의 90% 이상의 반응성 기질 섬유아세포 상에서 고도로 상향조절되는 것으로 밝혀졌다[Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)]. 후속의 보고들은, FAP가 기질 섬유아세포에서 뿐 아니라 상피 유래의 악성 세포의 일부 유형에서도 발현되며, FAP 발현은 악성 표현형과 직접 상관됨을 밝혔다[Jin et al., Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003)]. 놀랍게도, 본 발명자들은 기질내의 FAP 및 종양 세포상의 DR5를 표적화하는 이중특이성 항체가 표적이 상이한 세포 상에 위치함에도 불구하고 실질적으로 세포자살을 유도함을 밝혀내었다.
추가의 조사시에, 본 출원의 발명자들은 WO 2011/039126 호에 기술된 scFv 함유 이중특이성 분자들이 모두 생산성, 안정성, 및 준최적의 비-특이적 활성을 유발하는 응집체 형성과 관련하여 다소의 본질적인 문제를 가짐을 밝혀내었다.
본 출원에서는, FAP 및 DR5를 표적화하는 새로운 이중특이성 항체가 제공된다. 본 출원의 발명자들은 가교결합후에만 활성인 새로운 DR5 결합 잔기를 개발하였다. 따라서, 종양 세포 세포자살의 유도는 FAP에 의한 DR5 과군집화에 의존성이며, Fc/FcR 상호작용에는 비의존적이다. 그러므로, FAP 및 DR5에 특이적인 이중특이성 항체 이외에, 또한 DR5에 결합하는 새로운 항체들이 본원에서 제공된다.
대조적으로, 전술한 바와 같은 통상적인 DR5 표적화 분자들의 활성은 Fc 수용체(FcR) 매개된 과군집화에 의존성이며, 종양에서 면역 침윤 및 활성화 상태에 의해 영향을 받는다([Li and Ravetch, PNAS 2012; Wilson, Cancer Cell 2011]; WO 2011098520A1 호). Fc/FcR 상호작용은 생리학적 인간 IgG 수준에 의해 손상될 수 있다. 따라서, 통상적인 DR5 표적화 분자의 활성은 종종 일부의 침윤 세포로 한정된다(Moessner, Blood 2010). DR5 및 FAP 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체를 사용함으로써, 민감성 종양 세포의 비율은 FAP에 의한 과군집화에 의해 상당히 증가될 수 있고, DR5 작용물질에 대한 본질적인 내성 문제가 감소된다. 새로운 DR5 결합 잔기는 FAP와의 가교결합 후에만 활성이며, 이것은 DR5 결합제 아포맙(Apomab) 및 티가투주맙에 비해 개선된 안전성 및 독성학 프로필을 제공할 수 있다. 지금까지 시험된 DR5 작용물질은 임상에서 안전하였지만, 상기 임상 프로그램들은 DR5 표적화 분자의 낮은 효능에 의해 지연되었다.
또한, 바람직한 새로운 DR5 결합 잔기는 드로지투맙과 상이한 에피토프에 결합한다.
중요하게, 새로운 DR5 결합 잔기는, 신규하고 확립된 이중특이성 포맷 둘 다를 포함하여, 많은 이중특이성 DR5-FAP 표적화 항체 포맷에 사용될 수 있다. 대조적으로, 드로지투맙에 대한 임의의 N-말단 융합이 불활성 분자를 야기하기 때문에, FAP 결합 잔기의 C-말단 융합은 단지 드로지투맙-기반 이중특이성 DR5-FAP 표적화 항체 포맷하에서만 가능하다. 따라서, 새로운 DR5 결합 잔기의 제공은 다양한 이중특이성 DR5-FAP 표적화 항체 포맷에 DR5 표적화 잔기를 사용하는 가능성을 상당히 확장시킨다. 이것은, 일부 이중특이성 항체 포맷이 생산성 및 활성 면에서 우수한 특성을 갖기 때문에 특히 중요하다.
본원에서는 새로운 DR5 결합 잔기 및 친화도 증진 FAP 결합 잔기를 포함하는 새로운 이중특이성 항체가 제공된다.
본 발명의 이중특이성 항체는, 하나 이상의 크로스오버(crossover)-Fab 단편들이 IgG 분자에 융합된 이중특이성 항체 포맷으로 제공된다. 크로스오버 Fab 단편은, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편이다. 크로스오버 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체 포맷은, 예를 들면, WO 2009080252 호, WO 2009080253 호, WO 2009080251 호, WO 2009080254 호, WO 2010/136172 호, WO 2010/145792 호 및 WO 2013/026831 호에 기술되었다.
지금까지는, scFv 함유 포맷내 DR5 FAP 이중특이성 항체만이 기술되었다(WO 2011/039126 호). 여기에 개시된 새로운 DR5 결합제의 유리한 성질 이외에, 크로스오버-Fab 기반 이중특이성 포맷의 사용은 생산시 개선된 수율 및 보다 적은 응집체 및 부산물을 야기한다. 또한, scFv- 및 scFab-기반 DR5-FAP 표적화 이중특이성 항체는 응집체를 형성하는 경향을 나타내었으므로, FAP의 부재하에서조차 DR5를 비-특이적으로 가교결합시키는 더 높은 위험을 갖는다. 따라서, 상기 포맷은 비-표적 세포(즉, 건강한 세포)에서 잠재적으로 세포자살을 유도하는 단점을 갖는다.
본원에 제공된 새로운 이중특이성 항체의 DR5 및 FAP 결합 잔기는 통상적인 DR5 항체에 비해 우수한 생체내 효능을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 이중특이성 항체는 높은 친화도하에 종양 기질 상의 FAP에 결합하고 더 낮은 친화도하에 종양 세포 상의 DR5에 결합한다. 또한, 본원에 제공된 DR5 및 FAP 표적화 이중특이성 항체는 밀접하게 관련된 단백질 DR4, DcR1, DcR2(DR5와 밀접하게 관련됨) 및 DPPIV(FAP와 밀접하게 관련됨)와 교차반응하지 않는다. 게다가, 본 발명에서 처음으로, 각각의 결합 특이성의 결합가 수에 관해 제한없이 다양한 이중특이성 포맷으로 DR5-FAP 이중특이성 항체를 제공하는 것이 가능하다.
요약하면, 본원에 제공된 새로운 이중특이성 DR5-FAP 항체는 매우 특이적이고 효능적이다. 이들은 정상 세포에 대한 낮은 결합하에, FAP 의존성 방식으로 종양 세포에서 DR5 과군집화에 의해 세포자살을 선택적으로 유도한다.
본 발명은 사멸 수용체 5(DR5) 표적화 항원 결합 부위를 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 제 2의 항원 결합 부위와 결합시킨 이중특이성 항체에 관한 것이다. 이에 의해, 사멸 수용체는 가교결합되고, 표적화된 종양 세포의 세포자살이 유도된다. 통상적인 사멸 수용체 표적화 항체에 비해 상기 이중특이성 사멸 수용체 작동성 항체의 이점은, FAP가 발현되는 부위에서만 세포자살을 유도하는 특이성뿐 아니라, DR5 과군집화의 유도로 인한 상기 이중특이성 항체의 보다 높은 효능이다. 또한, DR5에 결합하는 새로운 항체들이 제공된다. 상기에서 개략한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 신규하고 유리한 DR5-FAP 이중특이성 항체에 혼입되는 공지된 DR5 결합제에 비해 우수한 성질을 갖는 새로운 DR5 결합 잔기를 개발하였다.
한 태양에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9 및 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10 및 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11 및 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12 및 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13 및 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14 및 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 태양에서, 본 발명은,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위가
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하고;
FAP에 특이적인 항원 결합 부위가
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는
이중특이성 항체를 제공한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 서열번호 94 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 16 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
바람직하게, 상기 이중특이성 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 Fab 단편중 하나 이상은 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되고, 하나 이상의 Fab 단편은 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다).
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다).
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 DR5 및 FAP 둘 다에 대해 2가이다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 DR5에 대해 2가이고 FAP에 대해 1가이다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 3개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 DR5에 대해 3가이고 FAP에 대해 1가이다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 DR5에 대해 1가이고 FAP에 대해 1가이다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 상기 Fab 단편들 중 적어도 하나는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 연결된다.
한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기(effector) 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 한 태양에서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 존재한다. 한 태양에서, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 제거하는 3개의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다.
한 태양에서, 제 1 중쇄의 Fc 부분이 제 1 이량체화 모듈을 포함하고 제 2 중쇄의 Fc 부분이 제 2 이량체화 모듈을 포함하여 항체의 2개 중쇄의 헤테로이량체화(heterodimerization)를 가능하게 하는 이중특이성 항체가 제공된다. 한 태양에서, 제 1 이량체화 모듈은 놉 인투 홀(knob into hole) 방법에 따른 놉(knob)을 포함하고, 제 2 이량체화 모듈은 홀(hole)을 포함한다.
또 다른 태양에서, 다음을 포함하는, DR5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역(complementarity determining region) 1(CDR1);
(b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83의 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2);
(c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108의 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR3);
(d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86의 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28의 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97의 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3.
또 다른 태양에서, 다음을 포함하는, DR5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3.
또 다른 태양에서, 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 서열번호 94 및 서열번호 95의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
두번째 목적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
세번째 목적으로, 본 발명은 암 치료를 위한, 본 발명의, DR5 및 FAP를 표적화하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 바람직한 한 태양에서, 상기 암은 췌장암 또는 대장암종이다. 또 다른 태양에서, 이중특이성 항체 또는 DR5에 특이적으로 결합하는 항체의 약제로서의 용도가 제공된다. 바람직하게, 상기 용도는 암, 바람직하게는 췌장암 또는 대장암의 치료를 위한 것이다.
또 다른 목적으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체가 생성되도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
도 1은 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 발현 수준에 대한 2개의 상이한 세포주(SW872 및 GM05389)의 FACS 결합 분석 결과이다(a). 상이한 농도의 항 FAP 항체를 사용하여 측정된 형광 강도가 일련의 3가지 크기(검은색, 회색 및 빗금친 막대)에 걸쳐 나타나 있다. 2차 항체 및 세포만으로서 음성 대조군 반응이 점무늬 및 흰색 막대로 각각 나타나 있다. GM05389 세포는 배경보다 높았던 모든 검사된 항체 농도에 걸쳐 FAP의 발현을 나타낸 반면, SW872 세포의 경우 사용된 최고 항체 농도(10 ㎍/ml) 하에서 FAP 발현만을 검출할 수 있어서, 상기 세포들이 FAP 기반 결합/세포자살 유도 실험에 적합하지 않음을 시사한다. 또한, 상기 세포주는 드로지투맙 매개된 세포자살이 거의 일어나지 않는 것으로 나타난다(b). 드로지투맙 단독 또는 또 다른 상업적으로 시판하는 항 DR5 항체는 적절한 DNA 단편화를 유도하지 않았다. 드로지투맙이 항 인간 Fc 항체와 가교결합될 때에만 검출가능한 낮은 수준의 세포자살 유도를 관찰할 수 있다.
도 2는 드로지투맙을 사용한 FACS 결합 및 표지된 항 Fc 항체를 사용한 후속 검출에 의해 2개의 상이한 인간 종양 세포주(유방암 세포주 MDA-MB-231 및 신장암 세포주 ACHN) 상에서의 DR5 발현의 검출 결과이다. 두 세포주 모두 인간 DR5의 필적하는 낮은 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. ACHN(3a) 또는 MDA-MB-231(3b) 표적 세포는 단독으로 또는 동일한 수의 FAP 발현 GM05389 섬유아세포의 존재하에서 배양되었다. DR5-FAP 이중특이성 항체(scFv 융합체)를 각각 0.1 ㎍/ml(A) 및 0.7 nM(B)의 농도로 첨가하였으며, DNA 단편화 검출 전에 세포를 24 시간동안 배양하였다. 드로지투맙의 가교결합을 위해, 0.1 ㎍/ml의 2차 항 Fc 항체를 사용하였다.
도 4는 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. FAP 발현 섬유아세포(GM05389)의 존재 또는 부재하에서 이중특이성 DR5-FAP 항체(융합된 scFab를 갖는 드로지투맙)에 의한 ACHN 세포 상에서의 세포자살 유도. 상이한 FAP 결합 잔기를 갖는 이중특이성 분자의 활성을 2차 항 Fc 항체에 의한 가교결합의 존재 또는 부재하의 드로지투맙과 비교한다. 항체는 2개의 상이한 농도(1.0 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml)로 사용되었다. 상기 설정에서, 4G8 scFab 융합체를 함유하는 이중특이성 분자(4b)는 3F2 scFab 함유 분자(4a)에 비해 DNA 단편화 분석에서 우수한 세포자살 유도 활성을 나타내었다.
도 5는 항 FAP 크로스Fab 잔기가 표준 (G4S)4 링커에 의해 드로지투맙 IgG의 C-말단에 융합된 2개의 상이한 이중특이성 DR5-FAP 분자를 도식적으로 나타낸 것이다. 나타낸 바와 같이, 한 경우(A)에서는, VHCL 크로스Fab가 드로지투맙 IgG에 융합된 반면, (B)에서는 VLCH1 쇄가 IgG에 연결된다. 상기 2개 분자들은 IgG-크로스Fab 조합을 사용한 가능한 포맷에 대한 예일 뿐이며, 상기 조합은 또한 새로 단리된 DR5 결합제를 함유하는 이중특이성 분자에도 사용되었다. 다른 가능성은 상기 분자의 IgG 부분에서의 교차, 크로스Fab를 안정화시키기 위한 염 가교 및 하전된 잔기들의 실행, 또는 상이한 링커 길이 및 서열의 사용을 포함한다.
도 6은 상이한 이중특이성 DR5-FAP 항체 포맷의 정제시 응집체 함량을 비교한 것이다. 모든 포맷은 C-말단에 융합된 FAP 결합 도메인(클론 4G8)을 갖는 드로지투맙 IgG로 이루어진다. FAP 결합 잔기는 다이설파이드 안정화된 scFv(A), scFab(B) 또는 크로스Fab(C)로 이루어진다. 예비 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램은 3개의 구축물들 사이에 명백한 차이를 나타내었다. scFv 및 크로스Fab 분자의 생성은 필적하였으나, scFab 함유 구축물은 더 낮은 수율 및 더 높은 응집체 함량을 나타내었다. 상기 비교로부터, 크로스Fab 함유 분자가 가장 유망한 것으로 보였다.
도 7은 재조합 인간 FAP 발현 HEK293 세포에 대한 FACS 결합의 분석 결과이다. 새로운 크로스Fab 포맷의 DR5-FAP 이중특이성 분자를 scFab 분자, 모 4G8 IgG 및 비관련 음성 대조군인 드로지투맙과 비교하였다. 2개의 크로스Fab 분자는 IgG 대조군과 적어도 동일한 범위로 FAP에 결합하는 것으로 나타났다.
도 8은 재조합 인간 DR5 및 FAP에 대한 이중특이성 드로지투맙-FAP 분자(크로스Fab)의 동시 결합의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR, 비아코어(Biacore)) 분석 결과이다. 리간드로서 비오티닐화 인간 DR5-Fc를 스트렙타비딘 칩 상에 고정화시킨 후 첫번째 분석물(이중특이성 크로스Fab 분자)을 주입하였다. DR5-Fc에 대한 결합(90 초 결합) 및 짧은 해리 기간(10 초) 후에, 상이한 농도(100 nM, 500 nM)의 재조합 가용성 FAP(인간 또는 뮤린)를 두번째 분석물로서 첨가하고, 추가의 반응을 측정하였다 드로지투맙-X-FAP_A 포맷(A 및 B)의 결합을 드로지투맙-X-FAP_B(C 및 D)와 비교하였다. 각각의 구축물을 DR5, 및 인간(A, C) 또는 뮤린 FAP(B, D) 결합에 대해 측정하였다. 상기 분석에 의해, 모든 검사한 분자들에 있어서, DR5 및 인간/뮤린 FAP에 대한 동시 결합이 입증될 수 있었다.
도 9는 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. 2개의 크로스Fab 분자(드로지투맙-X-Fab-A 및 드로지투맙-X-Fab-B)를 2개 세포주(MDA-MB-231 및 GM05389) 공-배양 분석에서 드로지투맙 및 과-가교결합된 드로지투맙과 비교한 세포자살 유도 실험의 결과이다. (9a) 세포 사멸 검출 ELISA를 사용하여 24 시간후에 세포자살의 유도를 검출하였다. 모든 검사된 구축물들은 7 nM 및 0.7 nM의 농도로 사용되었다. 표적 및 효과기 세포의 세포자살 유도를 표적 세포 단독의 세포자살과 비교한다. (9b) 드로지투맙(+/- Fc 가교결합) 대 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 융합된 FAP 크로스Fab로 이루어진 이중특이성 DR5-FAP 분자를 사용한 세포 사멸 검출 ELISA(DNA 단편화)에서 공-배양 방관자 세포자살 유도의 비교. 친화도 증진된 FAP 결합 잔기(28H1)를 함유하는 분자는 더 낮은 친화도 FAP 결합제를 함유하는 분자에 비해 우수한 활성을 나타낸다.
도 10은 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. 이중특이성 드로지투맙-FAP 크로스Fab 분자에 의한 세포자살의 유도는 FAP에 의한 가교결합에 의존성이다. 도 10은 ELISA 플레이트에 코팅된 재조합 인간 FAP에 의해 가교결합된 크로스Fab 분자에 의한 MDA-MB-231 세포 상에서의 세포자살 유도 결과를 나타낸다. 대조군 분자(항 Fc 항체에 의해 가교결합된 드로지투맙)는 FAP 또는 비관련 대조군 단백질의 코팅과 무관하게 유사한 세포자살 유도를 나타내지만, 이중특이성 구축물은 FAP가 코팅되었을 때에만 유의적인 세포자살 활성을 나타내었다. 최고 구축물 농도(7 nM)에서 대조군 플라스미드의 코팅에 의해서만 세포자살이 검출될 수 있었으며, 이것은 아마도 MDA-MB-231 세포주의 기저 FAP 발현에 기인하는 듯하다. 세포자살 활성은 검사한 크로스Fab 분자 둘 다에 대해 유사하였으며 과-가교결합된 드로지투맙에서 관찰된 바와 동일한 범위였다.
도 11은 FAP 발현 인간 섬유아세포 GM05389를 사용한 공-배양 실험에서 상이한 인간 종양 세포주 상에서의 세포자살 유도(DNA 단편화)를 비교한 것이다. 드로지투맙 및 과-가교결합된 드로지투맙을 이중특이성 드로지투맙-4G8 크로스Fab 분자와 비교한다(모두 7.0 및 0.7 nM 농도에서). 사용된 종양 세포주는 MDA-MB-231(유방암), U-87MG(교모세포종), FaDu(편평상피암) 또는 A549(폐암)이었다. 7 nM 농도에서의 세포자살 유도는 4개 세포주 모두에 대해 유사하였으나, 0.7 nM에서는 세포주들 사이에 더 현저한 차이가 관찰되었다.
도 12는 새로운 DR5 결합제의 단리, 스크리닝 및 특성화에 사용된 인간 DR5 항원 구축물을 도식적으로 나타낸 것이다. 모든 구축물에 있어서, 동일한 DR5 도메인(세포외 도메인, ECD; aa 56 내지 207)이 놉-인투-홀 기술을 이용하여 단독으로(A), 이량체성 Fc 융합체로서(B) 또는 단량체성 Fc 융합체로서(C) 사용되었다. 모든 항원들은 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 형질감염되고 생성되었다.
도 13은 2차 항 Fc 항체와의 과-가교결합 후에 MDA-MB-231 세포 상에서의 세포자살 유도(DNA 단편화 분석)에 대한 46개의 특징적인 DR5 결합제(파지 디스플레이에 의해 단리됨)의 스크리닝 결과이다. 항체들은 7 nM(검은색 막대) 및 0.7 nM(빗금친 막대)의 농도에서 사용되었다. DR5 결합제의 대부분(42/46)이 과-가교결합 후에 상이한 정도로 DNA 단편화를 유도할 수 있었다.
도 14는 새로운 DR5 항체가 2차 가교결합의 부재하에 세포자살 활성을 나타내는지를 평가하기 위해, 2차 가교결합 항 Fc 항체의 존재 또는 부재하에서, 선택되는 일련의 새로운 DR5 결합제에 의한 DNA 단편화 ELISA 분석을 통해 측정된 MDA-MB-231 세포에서의 세포자살 유도 결과이다. 새로운 DR5 결합제를 가교결합의 부재하에 어느 정도 활성인 것으로 알려진 항체인 드로지투맙과 비교하였다.
도 15는 7 nM의 농도에서 상이한 가교결합된 DR5 항체들로 처리후 3개의 상이한 인간 종양 세포(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)의 세포 증식 억제의 분석(셀 타이터글로 분석법(Cell TiterGlo Assay)) 결과이다.
도 16은 7 nM의 농도에서 가교결합된 DR5 항체들로 처리후 3개의 인간 종양 세포주(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)에서 카스파제 8 활성화에 의해 측정된 세포자살 유도 평가 결과이다.
도 17은 표면 플라즈몬 공명(비아코어)에 의한 에피토프 비닝(binning) 실험의 결과이다. 인간 DR5에 대한 제 1 항체의 결합 후에, 검사될 또 다른 항체의 추가 결합을 분석하였다. 드로지투맙 에피토프와 중첩될 수도 있는 클론 422를 제외하고, 검사한 새로운 DR5 결합제들 중 어느 것도, 드로지투맙과 중첩되는 DR5 상의 영역에 결합하는 것으로 보이지 않지만, 이들은 서로 중에서 적어도 중첩되는 에피토프를 공유할 수 있다.
도 18은 리간드 차단 대 리간드 비-차단 항체를 측정하기 위한 TRAIL 경쟁 분석의 결과이다. 인간 TRAIL을 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 인간 DR5-Fc 및 DR5 항체로 이루어진 복합체를 분석물로 사용하였으며 고정화된 TRAIL에 대한 복합체의 결합을 분석하였다. 파지 디스플레이로부터 수득된 새로운 결합제의 대부분이 TRAIL 차단 분자였던 반면에, 토끼 면역화로부터 수득된 많은 DR5 항체들은 비-차단 유형의 것이었다.
도 19는 상이한 DR5 작동성 항체로 처리시 DLD-1 표적 세포의 증식 억제에 대한 인간 TRAIL의 영향을 나타낸 것이다. DLD-1 표적 세포는 상이한 농도의 인간 TRAIL의 부재(실선) 또는 존재(점선) 하에서 가교결합된 DR5 항체와 함께 배양하였다. DR5 항체에 의해 인식되는 에피토프에 따라서, TRAIL의 첨가는 세포 성장의 억제를 증가시키거나(비-리간드 차단) 증가시키지 않았다(리간드 차단). TRAIL 단독, 및 TRAIL을 차단하지 않는 것으로 알려진 항체를 대조군으로 배양하였다.
도 20은 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. 96 웰 플레이트 상에 코팅된 재조합 인간 FAP의 존재 또는 부재하에서 표적 세포주로서 MDA-MB-231 상에서 상이한 DR5-FAP 이중특이성 항체(FAP 클론 28H1)의 세포자살 유도 활성. 상기 설정에서, 코팅된 FAP는 종양 기질에서 발현된 FAP를 모방해야 한다. 이중특이성 항체는 2개의 농도(7.0 및 0.7 nM)에서 검사하였다. 새로운 DR5 결합제를 함유하는 이중특이성 분자의 경우, FAP의 존재하에서 농도 의존성 세포자살 유도만이 검출된 반면, 드로지투맙을 함유하는 대조군 분자는 또한 FAP의 부재하에서도 약간의 활성을 나타내어, 새로운 DR5의 활성이 엄격하게 가교결합 의존성임을 확인시켰다.
도 21은 DR5 발현 표적 세포로서 MDA-MB-231 및 가교결합을 위해 GM05389(FAP+ 섬유아세포)를 사용한 공-배양 분석에서 이중특이성 DR5-FAP 분자(2+2 크로스Fab 포맷)의 방관자 세포자살 유도 활성을 나타낸 것이다. 상이한 새로 단리된 DR5 결합제를 함유하는 분자를 3개 농도(7.0, 0.7 및 0.07 nM)에서 드로지투맙 함유 구축물과 비교하였다. 상기 조건하에서, 검사한 이중특이성 구축물 모두가 항 Fc mAb를 통한 또는 재조합 FAP를 통한 가교결합과 비교하여 동일한 활성을 나타내지는 않았다. 이것은 주로 가교결합후에 세포자살을 유도할 수 있는 모든 항체가 또한 더 천연 조건(항원-DR5 및 FAP는 상이한 세포 유형에서 발현된다)하에서 그렇지는 않음을 보여준다.
도 22는, 모두 항 Fc 항체와의 가교결합 후에, 드로지투맙에 비해, 인간 Fc의 C-말단에 융합된 새로운 DR5 결합 Fab로 처리된 MDA-MB-231 표적 세포를 사용한 세포 사멸 검출 ELISA(DNA 단편화) 결과이다. 검사한 Fc 융합 분자는 모두 가교결합된 드로지투맙과 동일한 범위로 표적 세포 상에서 세포자살 유도를 제공할 수 있어서, 그의 결합 및 활성 용량이 그의 N-말단에 Fc의 배치에 의해 차단되지 않음을 시사한다. 22a: 파지 디스플레이로부터 수득된 DR5 결합제, 22b: 면역화로부터 수득된 인간화 DR5 결합제.
도 23은 GM05389 섬유아세포를 사용한 공-배양 분석(세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석)에서 표적 세포주로서 MDA-MB-231 상에서의 세포자살 유도에 대해 이중특이성 DR5-FAP 항체(C-말단 28H1 크로스Fab 융합을 갖는 새로운 DR5 결합제)를 비교한 것이다.
도 24는 이중특이성 DR5-FAP 항체가 세포 사멸 검출 ELISA에서 DNA 단편화에 의해 측정시 방관자 분석에서 G401 세포 상에서 세포자살을 유도함을 보여준다.
도 25는 생산성 및 질에 관하여 평가된 또 다른 이중특이성 DR5-FAP 크로스Fab 포맷을 도식적으로 나타낸 것이다. 이들 4개의 분자들은 DR5 및 FAP 결합 잔기의 위치 및 결합가가 상이하다: 2개의 2+1 분자, 1개의 3+1 및 1개의 1+1 구축물을 평가하였다. 1개의 2+1 분자는 DR5 (5E11) 중쇄의 C-말단에 융합된 1개의 FAP (28H1) 크로스Fab를 함유하는(A) 반면, 두번째 2+1 포맷은 28H1 크로스Mab 대응물과 함께 Fc의 N-말단에 융합된 2개의 DR5 (5E11) Fab로 이루어진다(B). 세번째 분자(C)는 중쇄의 C-말단에 융합된 3개의 DR5 표적화 Fab 및 1개의 28H1 크로스Fab를 함유한다. 1+1 포맷(D)에서는, DR5 결합제 #174는 FAP 결합 잔기 4B9와 크로스Fab 배열로 결합된다. 모든 구축물들은 놉-인투-홀 기술을 이용한 헤테로이량체화에 의존한다.
도 26은 GM05489 섬유아세포와 공-배양된 MDA-MB-231 세포에서 DNA 단편화에 대한 세포 사멸 검출 ELISA에 의해 측정시 상이한 포맷의 이중특이성 DR5-FAP 분자(A: 5E11-28H1; B: 18F11-28H1)의 세포자살 활성을 나타낸 것이다. 드로지투맙-28H1의 표준 2+2 포맷을 3개의 상이한 농도에서 2+2, 2+1 및 3+1 포맷의 5E11-28H1 및 18F11-28H1 분자와 비교하였다.
도 27은 3개의 또 다른 이중특이성 포맷: 2+1, 신규 2+1(머리-꼬리(head-to-tail) 융합) 및 3+1 포맷과 비교한 5E11-28H1 분자(2+2 포맷)의 방관자 세포자살 유도 결과이다. MDA-MB-231을 표적 세포로 사용하였고, GM05389 섬유아세포를 FAP 의존성 가교결합을 위해 공-배양하였으며, 이중특이성 항체는 700 내지 0.007 nM의 농도에서 평가하였다.
도 28은 생산성, 부산물 프로필 및 활성의 평가를 위한 새로운 이중특이성 5E11-28H1 포맷(2+2)이다. 분자들은 교차의 부위 및 유형이 상이하다.
A: 28H1의 C-말단 교차(CH1CL)
B: 전체 N-말단 5E11 Fab의 교차
C: 5E11의 N-말단 VHVL 교차
D: 5E11의 N-말단 CH1CL 교차
E: C-말단 28H1 Fab의 완전 교차
F: C-말단 28H1 Fab의 교차(VHVL)
도 29는 0.0037 내지 60 nM의 농도 범위에 걸친 MDA-MB-231 상에서의 3개의 상이한 포맷의 5E11-28H1 크로스Fab를 사용한 FACS 결합 결과이다. PE 접합된 염소-항-인간 Fc (Fab)2를 검출에 사용하였다.
도 30은 세포자살 검출을 위한 DNA 단편화 ELISA 분석 결과이다. DNA 단편화에 의해 검출시 공-배양(3a) 및 단일-배양(3b, 3c) 설정에서 4개의 상이한 크로스Mab 변이체들의 세포자살의 유도. 4개의 상이한 변이체들은 모두 공-배양 설정에서 필적하는 용량-의존성 방식으로 종양 세포에서 세포자살을 유도한다. 단일-배양 설정에서는, MDA-MB231 종양 세포주에서도, GM05389 섬유아세포 세포주에서도 세포자살이 유도되지 않아서, 4개 변이체 모두의 세포자살 유도의 특이성 및 FAP-의존성을 나타낸다.
도 31은 종양 기질에서 FAP 발현을 확실하게 하기 위해 DLD-1(A; 누드 마우스) 또는 MDA-MB-231(B; SCID-베이지(beige) 마우스) 세포를 mu FAP 발현 3T3 섬유아세포와 공-주입한 마우스 이종이식 종양 모델에서의 생체내 효능을 나타낸 것이다. 종양이 이식된 후, 이중특이성 드로지투맙-28H1 분자(삼각형) 또는 드로지투맙 단독(사각형) 또는 비히클 대조군(다이아몬드)의 정맥내 주입에 의해 10 mg/kg에서 처리를 수행하였다. 효능은 비히클 대조군과 비교한 종양 성장 억제율(TGI)에 의해 측정하였다.
도 32는 그의 세포자살 유도 활성에 대한 생체내 효능 실험을 위해 생성된 이중특이성 DR5-FAP 분자의 평가 결과이다. 4개의 상이한 분자들을 DLD-1 세포의 DNA 단편화에 대한 세포 사멸 검출 ELISA에서 검사하였다. 뮤린 FAP를 발현하는 3T3 또는 재조합 3T3 세포를 가교결합을 위한 공-배양 분석에 사용하였다. 미처리 세포와 비교한 세포자살의 증가 배수를 나타내었다.
도 33은 3T3 세포 또는 뮤린 FAP를 발현하는 3T3 세포를 사용한 공-배양 분석후 DR5-FAP 이중특이성 항체로 처리후 DLD-1 세포의 생존율을 나타낸 것이다(셀 타이터글로). 미처리 대조군과 비교한 생존율 퍼센트를 나타내었다.
도 34는 2+2 포맷의 상이한 DR5-FAP 이중특이성 분자(10 mg/kg)를 비히클 대조군과 비교한 마우스 이종이식 모델의 결과이다. 모든 구축물들은 상이한 DR5 결합제: 5E11, 174 및 422에 융합된 28H1 FAP 크로스Fab를 함유하였다. 또한, Fc가 임의의 FcγR 상호작용을 억제하기 위한 돌연변이를 갖는(PGLALA) 1개의 분자(5E11-28H1)가 포함되었다. 효능은 종양 성장 억제율(TGI)로서 측정되었다.
도 35는 DNA 단편화 분석 결과이다. 항-DR5 항체는 수용체 과군집화시 용량-의존성 방식으로 세포 사멸을 유도한다. 생성된 토끼 항-DR5 항체는 상이한 효력하에, 하지만 항상 용량-의존성 방식으로 및 DR5 분자의 Fc-매개된 가교결합 후에만 MDA-MB231 세포의 세포자살을 유도할 수 있었다(위 패널). 항-토끼 Fc-특이적 2차 항체의 부재하에서, 유의적인 세포 사멸은 검출되지 않았다(아래 패널).
도 36은 세포 생존율이 수용체 과군집화시 용량-의존성 방식으로 항-DR5 항체에 의해 감소됨을 보여준다. 생성된 토끼 항-DR5 항체는 달라지는 효력하에, 하지만 항상 용량-의존성 방식으로 및 DR5 분자의 Fc-매개된 가교결합 후에만 MDA-MB231 세포의 생존율을 감소시킬 수 있었다(위 패널). 항-토끼 Fc-특이적 2차 항체의 부재하에서, 세포 생존율은 어떤 항체 농도에서도 영향받지 않았다(아래 패널).
도 37은 7 nM의 농도에서 상이한 가교결합된 DR5 항체로 처리시 3개의 상이한 종양 세포(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)의 세포 증식 억제 분석(셀 타이터글로 분석)의 결과이다.
도 38은 7 nM의 농도에서 가교결합된 DR5 항체로 처리후 3개의 인간 종양 세포(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)에서 카스파제 8 활성화에 의해 측정된 세포자살 유도의 평가 결과이다.
도 39는 스트레스받은 DR5 항체 샘플의 상대 활성 농도: 대표적 반응 곡선이다.
도 40은 면역화로부터 수득된 원래의 및 스트레스받은 DR5 항체의 상대 활성 농도이다.
도 41은 파지 디스플레이로부터 수득된 원래의 및 스트레스받은 DR5 항체의 상대 활성 농도이다.
도 42는 두 재조합 표적 둘 다에 대한 상이한 DR5-FAP 이중특이성 항체의 동시 결합의 표면 플라즈몬 공명(SPR, 비아코어) 분석 결과이다. 1차 반응에서, 재조합 인간 DR5-Fc에 대한 이중특이성 항체의 결합을 측정한 후, 재조합 인간(위 패널) 또는 뮤린 FAP(아래 패널)에 대한 결합을 분석하였다.
도 43은 DNA 단편화에 의해 검출시 공-배양 분석에서 2+2 이중특이성 구축물에 의한 DLD-1 및 H460 종양 세포주에서 세포자살의 유도 결과이다. DR5-결합 성분으로서 드로지투맙을 함유하는 이중특이성 구축물은 이미 FAP의 부재하에서 세포자살을 유도하지만, 면역화에 의해 수득된 새로운 DR5 결합제를 함유하는 모든 구축물은 FAP의 존재하에서만 세포자살을 유도한다. 새로 개발된 DR5 결합제, 예를 들면, 0011-28H1 및 0016-28H1을 갖는 구축물은, 드로지투맙 함유 이중특이성 구축물에 비해 특히 저농도에서 더 높은 정도로 세포자살을 유도할 수 있다.
도 44는 유세포측정 분석에 의해 측정시 DR5-발현 종양 세포주 MDA-MB-231에 대한 항-DR5-FAP 이중특이성 2+2 구축물의 결합 결과이다.
도 45a는 DNA 단편화(세포 사멸 검출 ELISA)에 의해 검출시 가교결합후 인간화 변이체의 세포자살 유도 결과이다: DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0066 내지 DR5TAA-0075, 검은색선)는 2차 항체와 가교결합시 용량-의존성 방식으로 세포자살을 유도한다. 여러 인간화 변이체, 예를 들면, DR5TAA-0067, DR5TAA-0071, DR5TAA-0074 및 DR5TAA-0075는, 키메라 변이체(DR5TAA-0052, 회색선)에 비해 최대 유도 및 용량-의존성과 관련하여 유사한 방식으로 세포자살을 유도할 수 있다. 도 45b는 DNA 단편화(세포 사멸 검출 ELISA)에 의해 검출시 추가 가교결합의 부재하에서 인간화 변이체의 세포자살 유도의 부재를 나타낸다: DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0066 내지 DR5TAA-0075)는 2차 항체에 의해 가교결합되지 않는 경우 세포자살을 유도하지 않는다.
도 46은 1+1 및 2+2 포맷의 이중특이성 항-DR5-FAP 항체에 의한 공-배양 시스템에서의 세포 사멸의 필적하는 유도 결과이다.
도 47은 종양 세포 및 섬유아세포 둘 다의 존재하에서만 세포 사멸을 유도하는 것에 있어서 이중특이성 항-DR5-FAP 항체의 고도의 특이성을 나타낸 것이다.
도 48은 DLD-1 CRC 공-주입 세포주 기반 이종이식 모델에서 이중특이성 항-DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)의 효능을 나타낸 것이다.
도 49는 Co5896 CRC 단편 기반 환자 유래 이종이식 모델(PDX)에서 이중특이성 항-DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)의 효능을 나타낸 것이다.
I. 정의
본 발명에 있어서, "수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 하기에 정의되는 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 수득된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 수득된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 태양에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 태양에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예, 항체)와 그의 결합 상대(예, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에서 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 태양들이 하기에서 기술된다.
"친화도 증진된" 항체는, 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 야기하는 변형을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 말한다.
용어 "사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체"는, 상기 항체가 DR5 및 FAP를 발현하는 세포를 표적화하는데 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도하에 DR5 및 FAP에 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 말한다. 특히 "사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체"는 종양 세포 상의 DR5 및 상기 종양을 둘러싸고 있는 기질내 FAP를 표적화하는 이중특이성 항체를 말한다. 한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체의, 비관련된 비-FAP 또는 비-DR5 단백질에 대한 결합의 정도는, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 분석법(예를 들면, 비아코어) 또는 유세포분석기(FACS)로 측정시 DR5 또는 FAP에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 상이한 종들로부터의 DR5 또는 FAP 중에서 보존되는 DR5 또는 FAP의 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 이중특이성 항체는 인간 및 사이노몰구스(cynomolgous) 원숭이 DR5, 및 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 마우스 FAP에 결합한다.
용어 "사멸 수용체 5(DR5)에 특이적으로 결합하는 항체"는, 상기 항체가 DR5를 발현하는 세포를 표적화하는데 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도하에 DR5에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 특이적으로 결합하는 항체의 비관련 비-DR5 단백질에 대한 결합 정도는, 예를 들면, 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA) 또는 유세포분석기(FACS)로 측정시 DR5에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 특이적으로 결합하는 항체는 상이한 종들로부터의 DR5 중에서 보존되는 사멸 수용체 5(DR5)의 에피토프에 결합한다. 바람직하게, 상기 항체는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 DR5에 결합한다. 용어 "사멸 수용체 5(DR5)에 특이적으로 결합하는 항체"는 또한 DR5 및 제 2의 항원에 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 포함한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우의 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 다양한 항체 구축물을 포함한다.
"항체 단편"은 비손상(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 비손상 항체의 일부분을 포함하는 비손상 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody), 크로스-Fab 단편; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. scFv 항체는, 예를 들면, 문헌 [Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기술되어 있다. 또한, 항체 단편은, VH 도메인의 특징을 갖거나, 즉, VL 도메인과 기능성 항원 결합 부위로 구성될 수 있거나, VL 도메인의 특징을 갖는, 즉, VH 도메인과 기능성 항원 결합 부위로 구성될 수 있음으로써 전장(full length) 항체의 항원 결합 성질을 제공하는 단일쇄 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fab 단편"은 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL), 및 중쇄의 VH 도메인 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 말한다. 한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 하나 이상의 Fab 단편을 포함한다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로도 지칭된다. 크로스오버 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 구성이 가능하며, 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다. 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환된다, 즉, 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 분자는 또한 크로스Fab( VLVH )로도 지칭된다. 다른 한편으로, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환될 때, 크로스오버 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 분자는 또한 크로스Fab( CLCH1 )로도 지칭된다.
"단일쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이며, 이때 상기 항체 도메인들 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서들: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 가지며; 상기 링커는 30개 이상의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일쇄 Fab 단편 a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 및 d) VL-CH1-링커-VH-CL은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 상기 단일쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기의 삽입(예를 들면, 카밧(Kabat) 번호체계에 따라 가변 중쇄내 위치 44 및 가변 경쇄내 위치 100)을 통한 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 더 안정화될 수 있다. 용어 "N-말단"은 N-말단의 마지막 아미노산을 의미한다. 용어 "C-말단"은 C-말단의 마지막 아미노산을 의미한다.
"융합된" 또는 "연결된"은 성분들(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유니트)이 펩티드 결합에 의해 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 펩티드 링커를 말하며, 바람직하게는 5개 이상 아미노산의 길이, 바람직하게는 5 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm으로, 이때 G는 글리신이고, S는 세린이고, (x는 3이고, n은 3, 4, 5 또는 6이고, m은 0, 1, 2 또는 3이거나) 또는 (x는 4이고, n은 2, 3, 4 또는 5이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고), 바람직하게는 x는 4이고, n은 2 또는 3이고, 보다 바람직하게는 x는 4이고, n은 2이다. 한 태양에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 말한다. 예를 들면, IgG 클래스의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 경쇄 불변 영역으로도 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는, α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)으로 불리는 5개 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 아형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 필수적으로 면역글로불린 힌지(hinge) 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 이루어진다.
기준 항체와 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 기준 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 말하며, 반대로, 기준 항체는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 대표적인 경쟁 분석법이 본원에 제공된다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전체에 특이적으로 결합하고 그와 상보성인 영역을 포함하는 항원 결합 분자의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "키메라" 항체는, 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조된, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다. 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체"의 다른 바람직한 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 변형되거나 변화된 것들이다. 상기 키메라 항체는 또한 "클래스-전환 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 절편 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 통상적인 재조합 DNA를 수반하며, 유전자 형질감염 기술이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허 제 5,202,238 및 5,204,244 호 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "세포독성 약제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 말한다. 세포독성 약제로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제(intercalating agent)); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들면, 핵산분해 효소; 항생물질; 독소, 예를 들면, 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하여, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제.
"효과기(effector) 기능"은 항체 이소타입(isotype)에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예로는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP); 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조작하다, 조작된, 조작"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 단편의 펩티드 주쇄의 임의 조작 또는 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개개 아미노산의 측쇄기의 변형, 및 이들 접근방법들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 최종 구축물이 바람직한 특성, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 또 다른 펩티드와의 증가된 결합을 갖는다면, 최종 구축물을 달성하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합도 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, Fc 영역의 결합 특성을 변화시키기 위해, 비-보존적 아미노산 치환, 즉, 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-천연 아미노산 또는 20개의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신)에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지향 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 다른 방법, 예를 들면, 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변화시키는 방법도 또한 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에서 동일 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 다양한 표시가 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린으로부터 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로 나타낼 수 있다.
약제, 예를 들면, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 효과적인 양을 말한다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 본원에서 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어지는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역중 아미노산 잔기의 번호는, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다. 본원에서 사용된 바와 같은 Fc 도메인의 "서브유니트"는 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉, 안정한 자가-결합을 할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유니트는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유니트의 결합을 촉진하는 변형"은, Fc 도메인 서브유니트를 포함하는 폴리펩티드와 호모이량체를 형성하는 동일한 폴리펩티드의 결합을 감소시키거나 방지하는, Fc 도메인 서브유니트의 펩티드 주쇄의 조작 또는 번역후 변형이다. 본원에서 사용된 바와 같은 결합을 촉진하는 변형은 특히 결합하기에 바람직한 2개의 Fc 도메인 서브유니트(즉, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유니트) 각각에 이루어진 별개의 변형을 포함하며, 이때 상기 변형은 2개의 Fc 도메인 서브유니트의 결합을 촉진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들면, 결합을 촉진하는 변형은, 그의 결합을 입체적으로 또는 정전기적으로 각각 유리하게 만들기 위해 Fc 도메인 서브유니트 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변화시킬 수 있다. 따라서, (헤테로)이량체화는, 서브유니트(예를 들면, 항원 결합 잔기)의 각각에 융합된 다른 성분들이 동일하지 않다는 점에서 비-동일할 수 있는, 제 1 Fc 도메인 서브유니트를 포함하는 폴리펩티드와 제 2 Fc 도메인 서브유니트를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 일어난다. 일부 태양에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인에서의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정 태양에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유니트 각각에 별개의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "비손상 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택되는 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리(repertory) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다. 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 또한 언급한 바와 같이, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또한, 예를 들면, "클래스 전환"에 의해, 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들면, IgG1으로부터 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 관해 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역에서 변형된 항체를 포함한다.
용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들면, NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이성인 동물(예, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함하는 것이다. 상기 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 가변 및 불변 영역들을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 초돌연변이에 적용되었던 것이다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은, 인간 생식계 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 그와 관련되지만 천연적으로는 생체내에서 인간 항체 생식계 레퍼토리 내에 존재할 수 없는 서열이다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아집단으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 상기 아집단은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 아집단이다. 한 태양에서, VL의 경우, 상기 아집단은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아집단 카파 I이다 한 태양에서, VH의 경우, 상기 아집단은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 아집단 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 태양에서, 인간화 항체는 하나 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전부 또는 거의 전부가 비-인간 항체에 상응하고, FR의 전부 또는 거의 전부가 인간 항체에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체"의 다른 형태는, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 관해 본 발명에 따른 성질을 제공하기 위해 불변 영역이 원래 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화된 항체이다.
용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열에 있어서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 상보성 결정 영역은 최고 서열 가변성을 가지고/가지거나 항원 인식에 수반된다. 대표적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재한다[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)]. 대표적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에 존재한다[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. 초가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되며, 상기 용어들은 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌 [Kagat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기술되었으며, 여기서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 속해야 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 나타내었다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 통상적으로 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 결정할 수 있다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure pct00001
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 번호 체계를 규정하였다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 서열 자체 이상의 임의의 실험 데이터를 의지하지 않고, 임의의 가변 영역 서열에 상기 "카밧 번호" 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "카밧 번호"는 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호 체계를 말한다. 달리 명시하지 않는 한, 항체 가변 영역에 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 카밧 번호 체계를 따른다.
VH에서의 CDR1은 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역들 내에 함유된다. 대표적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에 존재한다(문헌 [Almagro and Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 부여된다.
"면역접합체"는 세포독성 약제를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 태양에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 태양에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전 초점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정할 때, 95% 또는 99%보다 더 큰 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"DR5 및 FAP 항체에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별개 벡터들 내의 핵산 분자 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은, 천연 돌연변이를 함유하거나 단클론성 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자전이 동물을 이용하는 방법을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단클론성 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 대표적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 잔기(예를 들면, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 말한다. 네이키드 항체는 약학 제형중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
"실질적인 교차반응성이 아닌"은, 분자(예를 들면, 항체)가, 특히 표적 항원과 비교시, 상기 분자의 실질적인 표적 항원과 상이한 항원(예를 들면, 표적 항원에 밀접하게 관련된 항원)을 인식하지 못하거나 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체는 실질적인 표적 항원과 상이한 항원에 약 10% 미만 내지 약 5% 미만으로 결합할 수 있거나, 실질적인 표적 항원과 상이한 항원의 약 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만, 바람직하게는 약 2%, 1% 또는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2% 또는 0.1% 미만으로 이루어지는 양으로 실질적인 표적 항원과 상이한 항원에 결합할 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면, 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함하여, 유닉스(UNIX) 작업 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 그와 비교해 또는 그에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분율 X/Y
상기 식에서,
X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 평가된 아미노산 잔기의 수이고;
Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다.
아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술한 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이면서, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 제형중의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "사멸 수용체 5(DR5)"는 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 DR5를 말한다. 상기 용어는 "전장", 미처리된 DR5 뿐 아니라, 세포내에서의 처리로부터 야기되는 DR5의 임의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 DR5의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 대표적인 인간 DR5의 아미노산 서열은 서열번호 155에 나타내었다.
용어 "섬유아세포 활성화 단백질(FAP)"은 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FAP를 말한다. 상기 용어는 "전장", 미처리된 FAP 뿐 아니라, 세포내에서의 처리로부터 야기되는 FAP의 임의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 FAP의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 항-FAP 항체는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다. 대표적인 인간, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 FAP 엑토도메인(C-말단 폴리-라이신 및 6x His-태그를 가짐)의 아미노산 서열은 서열번호 156, 서열번호 157 및 서열번호 158에 각각 나타내었다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)은 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 태양에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 암은, 그의 난치성 형태 또는 그의 하나 이상의 조합을 포함하여, 증식성 질환, 예를 들면, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 복부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨(Hodgkin)병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추 신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암, 뇌하수체 선종 및 유잉(Ewing) 육종을 말한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리되어 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브리러를 검색할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150, 880-887 (1993); Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조).
용어 "항체의 항원-결합 부위"는 본원에서 사용될 때 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기들 이외의 다른 가변 도메인 영역들이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 많이 기여하고 항체의 성질을 규정하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기들에 따라서 결정된다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 말한다. 천연 항체는, 예를 들면, 단일특이성이다. 본 발명에 따른 "이중특이성 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 항체는 2개의 상이한 항원, 즉, 제 1 항원으로 DR5 및 제 2 항원으로 FAP에 특이적이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일특이성" 항체는, 그 각각이 동일 항원의 동일 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중특이성" 항체는, 그 각각이 동일 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.
본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 본원에서는 FAP 및 DR5에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 이중특이성 항체는 DR5의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 DR5를 발현하는 세포에 세포독성 약제를 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829 호, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체성 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링(electrostatic steering) 효과를 조작함으로써(WO　2009/089004A1 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들면, 미국 특허 제 4,676,980 호 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이성 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼(zipper)를 사용함으로써(예를 들면, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디(diabody)" 기술을 이용함으로써(예를 들면, 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들면, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들면, 문헌 [Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991)]에 기술된 바와 같은 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다(예를 들면, US　2006/0025576A1 호 참조).
본 발명의 항체 또는 단편은 또한, FAP 또는 DR5에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위뿐 아니라, 또 다른 상이한 항원을 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들면, US　2008/0069820 호 참조).
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "-가(valent)"는 항체 분자내에 특정한 수의 결합 부위의 존재를 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 항체 분자내 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 "2가"이며, "3가" 또는 "다가"(예를 들면, "4가" 또는 "6가")일 수 있다.
본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 가지며 이중특이성이다. 즉, 상기 항체는 2개보다 많은 결합 부위가 존재하는(즉, 항체가 3가 또는 다가인) 경우에도 이중특이성일 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체는, 예를 들면, 다가 단일쇄 항체, 디아바디 및 트리아바디(triabody) 뿐 아니라, 추가의 항원-결합 부위(예를 들면, 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2)가 하나 이상의 펩티드-링커에 의해 연결되는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체들은 단일 종으로부터의 전장 항체일 수 있거나, 키메라화 또는 인간화될 수 있다.
용어 "벡터"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구축물로서의 벡터 뿐 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작용가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 모든 상기 표현은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질감염체" 및 "형질감염된 세포"는 전이 수에 관계없이 그로부터 유도된 주요 대상 세포 및 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되는 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예, 항체) 및 그의 결합 상대(예, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들면, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에서 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 태양들이 하기에서 기술된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합" 또는 "특이적 결합"은 시험관내 분석법에서, 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명 분석법(SPR, 비아코어, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 스웨덴 웁살라)에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 말한다. 결합 친화도는 용어 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD(해리 상수), 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 결합 또는 특이적 결합은 10-8 몰/l 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 몰/l의 결합 친화도(KD)를 의미한다.
사멸 수용체에 대한 항체의 결합은 비아코어 분석법(지이 헬쓰케어, 스웨덴, 웁살라)에 의해 조사될 수 있다. 결합 친화도는 용어 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD(해리 상수), 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 특정 태양에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 집단을 포함하며, 특정 태양에서, 특정한 3차원 구조 특성 및/또는 특정한 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 한 영역이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특히 접두어 "글리코-"를 갖는 용어 "조작하다, 조작된, 조작", 및 용어 "글리코실화 조작"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 단편의 글리코실화 패턴의 임의의 조작을 포함하는 것으로 간주된다. 글리코실화 조작은, 세포에서 발현된 당단백질의 변형된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고사카라이드 합성 경로의 유전자 조작을 포함하여, 세포의 글리코실화 기관의 대사 조작을 포함한다. 또한, 글리코실화 조작은 글리코실화에 대한 돌연변이 및 세포 환경의 영향을 포함한다. 한 태양에서, 글리코실화 조작은 글리코실트랜스퍼라제 활성에서의 변화이다. 특정 태양에서, 상기 조작은 변화된 글루코사미닐트랜스퍼라제 활성 및/또는 푸코실트랜스퍼라제 활성을 야기한다.
II . 조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은 TRAIL 사멸 수용체 5(DR5)에 특이적인 제 1 항원 결합 부위 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적인 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 기반으로 한다. 또 다른 태양에서, DR5를 표적화하는 신규 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 암의 치료 또는 진단에 유용하다.
A. DR5 및 FAP 에 결합하는 대표적인 이중특이성 항체
한 양태에서, 본 발명은 DR5 및 FAP에 결합하는 단리된 이중특이성 항체를 제공한다. FAP 결합 잔기는 본원에 전체로 참고로 인용되는 WO 2012/020006 호에 기술되었다. DR5-FAP 이중특이성 항체에 사용되기에 특히 유리한 FAP 결합 잔기는 하기의 태양들에서 개략된다.
특정 태양에서, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 사멸 수용체를 특이적으로 가교결합시키고, 표적 세포의 세포자살이 유도된다. 통상적인 사멸 수용체 표적화 항체에 비해 상기 이중특이성 사멸 수용체 작동성 항체의 이점은 FAP가 발현되는 부위에서만 세포자살을 유도하는 특이성이다. 상기에서 개략된 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 신규하고 유리한 DR5-FAP 이중특이성 항체에 혼입될 수 있는 공지된 DR5 결합제에 비해 우수한 성질을 갖는 새로운 DR5 결합 잔기를 개발하였다.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5) 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9 및 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10 및 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11 및 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12 및 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13 및 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14 및 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 27의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 27의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 75의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 84의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 87의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 75의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 84의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 87의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 96의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 99의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 96의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 99의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 104의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 105의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 104의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 105의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 109의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 109의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 98의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 97의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 98의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 97의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 27의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 27의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및
(a) 서열번호 33의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 34의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 35의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 36의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 37의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 38의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 서열번호 94 및 서열번호 95의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15 및 서열번호 39의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 서열번호 16 및 서열번호 40의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는, C-말단 라이신이 제거된 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는, C-말단 라이신이 제거된 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄, 및 서열번호 151 또는 서열번호 152로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 항체, 및 임의의 상기 태양에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, FAP에 특이적인 제 2 항체를 포함한다. 한 태양에서, 상기 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열의 C-말단 라이신은 제거되었다.
한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄, 및 서열번호 151 또는 서열번호 152로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 제 1 항체, 및 서열번호 15의 가변 중쇄 및 서열번호 16의 가변 경쇄를 포함하는, FAP에 특이적인 제 2 항체를 포함한다.
한 태양에서, 서열번호 131, 서열번호 132 및 서열번호 124를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 133, 서열번호 132 및 서열번호 124를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
바람직한 한 태양에서, 서열번호 134, 서열번호 132 및 서열번호 124를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 262, 서열번호 263 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 135, 서열번호 136 및 서열번호 137을 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 138, 서열번호 139 및 서열번호 137을 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 274, 서열번호 275 및 서열번호 137을 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 276, 서열번호 277 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 278, 서열번호 279 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 124 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 124 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 144, 서열번호 143, 서열번호 124 및 서열번호 132를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161 및 서열번호 162를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
또 다른 양태에서, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위, 및 서열번호 15의 가변 중쇄 및 서열번호 16의 가변 경쇄를 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 FAP 및 DR5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 서열번호 7에, 그의 번역후 변형을 포함하여 VH 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는, 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열을 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위, 및 서열번호 15의 가변 중쇄 및 서열번호 16의 가변 경쇄를 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5 및 FAP에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 서열번호 8에, 그의 번역후 변형을 포함하여 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 서열번호 8의 가변 경쇄 및 서열번호 7의 가변 중쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 FAP 및 DR5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 15에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는, 서열번호 15에 그의 번역후 변형을 포함하여 VH 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 서열번호 8의 가변 경쇄 및 서열번호 7의 가변 중쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위; 및 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열을 포함하는, FAP에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5 및 FAP에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 16에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 서열번호 16에, 그의 번역후 변형을 포함하여 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VL을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 한 태양에서, 상기 항체는, 서열들의 번역후 변형을 포함하여, 각각 서열번호 7 및 서열번호 8 및 서열번호 15 및 서열번호 16의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여 단클론성 항체이다. 한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 상기 이중특이성 항체는 인간 항체이다.
B. DR5 에 결합하는 대표적인 항체
한 양태에서, 본 발명은 DR5에 결합하는 단리된 항체 및 항체 단편을 제공한다. 상기 사멸 수용체 작동성 항체는 DR5 및 제 2의 항원을 표적화하는 신규하고 유리한 이중특이성 항체에 혼입될 수 있는 공지된 DR5 결합제에 비해 우수한 성질을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28의 CDR2; 및
(f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 27의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 18의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 17의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 25의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 19의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 20의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열번호 22의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 75의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 83의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 84의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 86의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 28의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 87의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 96의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 99의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 104의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 105의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 108의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 109의 경쇄 CDR3.
한 양태에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
(b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
(c) 서열번호 98의 중쇄 CDR3;
(d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
(e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2;
(f) 서열번호 97의 경쇄 CDR3.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 서열번호 94 및 서열번호 95의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
한 태양에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5에 결합하는 항체는 DR5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5에 결합하는 항체는 서열번호 7에, 그의 번역후 변형을 포함하여 VH 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 사멸 수용체 5(DR5)에 결합하는 항체는, 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열을 포함한다.
특정 태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는, DR5에 결합하는 항체는 DR5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 태양에서, 서열번호 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 태양에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, DR5에 결합하는 항체는 서열번호 8에, 그의 번역후 변형을 포함하여 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VL을 포함하는, DR5 및 제 2 항원에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 한 태양에서, 상기 항체는, 서열들의 번역후 변형을 포함하여, 서열번호 7 및 서열번호 8의 VH 및 VL 서열을 각각 포함한다. 한 태양에서, 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VL을 포함하고, 하기 섹션 C에서 DR5-FAP 이중특이성 항체에 대해 개략되는 바와 같은 포맷을 갖는, DR5 및 제 2 항원에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 또 다른 태양에서, 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 태양에서와 같은 VL을 포함하고, 하기 섹션 D 및 E에서 DR5-FAP 이중특이성 항체에 대해 개략되는 바와 같은 하나 이상의 Fc 도메인 변형을 포함하는, DR5 및 제 2 항원에 결합하는 상기 이중특이성 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 임의의 상기 태양에 따른, DR5에 결합하는 항체는, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여 단클론성 항체이다. 한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른, DR5에 결합하는 상기 항체는 인간 항체이다.
C. DR5 및 FAP 에 결합하는 이중특이성 항체의 대표적인 포맷
한 태양에서, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fv, Fab, Fab', scFv, xFab, scFab, 디아바디 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들면, 비손상 IgG1 항체 또는 본원에서 정의되는 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소타입을 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 2가이며, 3가 또는 다가, 예를 들면, 4가 또는 6가일 수 있다.
본 발명의 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
또 다른 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 Fab 단편 중 하나 이상은 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되고, 하나 이상의 Fab 단편은 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다.
임의의 태양에서, Fab 단편은, 직접적으로, 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 또는 서로에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에 기술되어 있다. 적합한 비-면역원성 펩티드 링커로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커가 포함된다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기의 Fab 경쇄를 서로에 융합시키기에 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제 1 및 제 2 항원 결합 잔기의 Fab 중쇄를 연결시키기에 적합한 대표적인 펩티드 링커는 EPKSC(D)-(G4S)2 (서열번호 318)이다. 또한, 링커는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부분)을 포함할 수 있다. 특히 항원 결합 잔기가 Fc 도메인 서브유니트의 N-말단에 융합되는 경우, 상기 잔기는 추가의 펩티드 링커의 존재 또는 부재하에서 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부분을 통해 융합될 수 있다.
바람직하게, 상기 이중특이성 항체는 각각 FAP 및 DR5를 각각 표적화하는 2개의 결합 부위를 갖는 4가이다(2+2 포맷). 또 다른 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 DR5에 대한 3개의 결합 부위 및 FAP에 대한 1개의 결합 부위를 갖는 4가이다(3+1 포맷). 3+1 포맷은, 예를 들면, FAP를 표적화하는 1개의 Fab 단편 및 DR5를 표적화하는 1개의 Fab 단편을 2개의 DR5 결합 부위를 갖는 IgG 분자의 중쇄의 C-말단에 융합시키는 것을 통해 달성될 수 있다. 이것은 하기에서 보다 상세히 개략된다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 각각 DR5를 표적화하는 2개의 결합 부위 및 FAP를 표적화하는 1개의 결합 부위를 갖는 3가이다(2+1 포맷). 2+1 포맷은, 예를 들면, FAP를 표적화하는 Fab 단편을 2개의 DR5 결합 부위를 갖는 IgG 분자의 중쇄의 C-말단에 융합시키는 것을 통해 달성될 수 있으며, 이때 제 1 항체의 Fc 부분은 하기에서 개략하는 바와 같은 놉-인투-홀 방법에 따라 변형된다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 2가(1+1 포맷)이다, 즉, DR5 및 FAP 각각에 대해 1가이다. 본 발명의 2가 항체는 DR5를 표적화하는 1개의 결합 부위 및 FAP를 표적화하는 1개의 결합 부위를 갖는다. 1+1 포맷은, 예를 들면, 문헌 [Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-11192]에 기술된 크로스mab 기술에 의해서 및 하기에서 개략되는 바와 같이 달성될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 항체의 대표적인 포맷은 도 25 및 28에 나와 있다.
본원에는 임의의 상기 태양에 따른 임의의 서열을 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 상이한 이중특이성 항체 포맷들이 제공된다.
1. 2+2 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 1개 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
상기 이중특이성 항체는 FAP 및 DR5에 대해 각각 2개의 결합 부위하에 FAP 및 DR5 둘 다에 대해 2가이기 때문에, 상기 포맷은 또한 "2+2" 포맷으로 지칭된다. 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체의 대표적인 구조는 도 28에 도시되어 있다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편들은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로 지칭된다.
바람직한 한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따라서 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
또 다른 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다.
또 다른 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다.
Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편들은 각각 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편들은 또한 크로스Fab( VLVH )로 지칭되며, 각각 VLCH1 및 VHCL 쇄를 포함한다.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다.
또 다른 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 도메인; 각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편; 및 각각 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다.
Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편들은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편들은 또한 크로스Fab( CLCH1 )로 지칭되며, VHCL 및 VLCH1 쇄를 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 상기 이중특이성 항체는, 2개의 Fab 단편이 N-말단에 융합되고 2개의 Fab 단편이 C-말단에 융합된 Fc 도메인을 포함하며, 이때 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 한 태양에서, 2개의 Fab 단편은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 한 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
한 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 연결된다. 한 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 연결된다. 한 상기 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 상기 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3 쇄)의 C-말단에 연결된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 상기 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(즉, DR5에 특이적인 2개의 Fab 단편)을 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
또 다른 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되고, 2개의 Fab 단편이 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되고, 2개의 Fab 단편이 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되고, 2개의 Fab 단편이 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
또 다른 바람직한 태양에서, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커, 바람직하게는 약 10 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드 링커에 의해 IgG 분자에 융합된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 또는 (G4S)4 링커이다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되고, 2개의 Fab 단편이 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되고, 2개의 Fab 단편이 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 상기 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 Fab 단편을 포함하며, 이때 Fab 단편의 하나 이상은 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되고, 하나 이상의 Fab 단편은 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이때 Fab 단편의 하나 이상은 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되고, 하나 이상의 Fab 단편은 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다).
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유니트의 N-말단에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)에 연결된다).
한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 상기 2개의 Fab 단편은 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
한 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 연결된다.
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 N-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결된다).
한 태양에서, 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) Fc 도메인,
b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 Fab 단편은 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 서브유니트의 N-말단에 연결된다),
c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편(이때, 상기 2개의 Fab 단편은 불변 경쇄(CL)의 N-말단에서 Fc 도메인의 제 2 서브유니트의 N-말단에 연결된다).
한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 상기 2개의 Fab 단편은 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
2+2 포맷을 갖는 대표적인 항체
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
서열번호 2의 중쇄 CDR2;
서열번호 3의 중쇄 CDR3;
서열번호 4의 경쇄 CDR1;
서열번호 5의 경쇄 CDR2;
서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자; 및
b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
서열번호 10의 중쇄 CDR2;
서열번호 11의 중쇄 CDR3;
서열번호 12의 경쇄 CDR1;
서열번호 13의 경쇄 CDR2;
서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되며, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
서열번호 2의 중쇄 CDR2;
서열번호 3의 중쇄 CDR3;
서열번호 4의 경쇄 CDR1;
서열번호 5의 경쇄 CDR2;
서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자; 및
b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
서열번호 10의 중쇄 CDR2;
서열번호 11의 중쇄 CDR3;
서열번호 12의 경쇄 CDR1;
서열번호 13의 경쇄 CDR2;
서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되며, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자; 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되며, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자; 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되며, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
또 다른 태양에서, 본 발명의 상기 이중특이성 항체는, 하기에서 개략하는 바와 같이, IgG 분자의 Fc 부분에 변형을 포함한다.
한 태양에서, 2개의 서열번호 131의 VH( DR5 ) - Fc 부분 - VH( FAP ) - CL 쇄, 2개의 서열번호 132의 VL(DR5)-카파 경쇄, 및 2개의 서열번호 124의 VLCH1(FAP) 쇄를 포함하는, 전술한 바와 같은 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 2개의 서열번호 133의 VH( DR5 ) - Fc 부분 - VH( FAP ) - CL 쇄, 2개의 서열번호 132의 VL(DR5)-카파 경쇄, 및 2개의 서열번호 124의 VLCH1(FAP) 쇄를 포함하는, 전술한 바와 같은 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 2개의 서열번호 134의 VH( DR5 ) - Fc 부분 - VH( FAP ) - CL 쇄, 2개의 서열번호 132의 VL(DR5)-카파 경쇄, 및 2개의 서열번호 124의 VLCH1(FAP) 쇄를 포함하는, 전술한 바와 같은 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 2개의 서열번호 135의 VL( DR5 ) - CH1 - Fc 부분 - VH( FAP ) - CH1 쇄, 2개의 서열번호 136의 VH( DR5 )-CL 쇄, 및 2개의 서열번호 137의 VL( FAP )-카파 경쇄를 포함하는, 전술한 바와 같은 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다.
한 태양에서, 2개의 서열번호 138의 VH( DR5 )CL - Fc 펩티드 링커 - VH( FAP ) - CH1 쇄, 2개의 서열번호 139의 VH( DR5 )-CH1 쇄, 및 2개의 서열번호 137의 VL( FAP )-카파 경쇄를 포함하는, 전술한 바와 같은 2+2 포맷을 갖는 이중특이성 항체가 제공된다.
2. 2+1 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다).
상기 이중특이성 항체는 FAP에 대한 1개의 결합 부위 및 DR5에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 3가이므로, 상기 포맷은 또한 "2+1" 포맷으로도 지칭된다. 따라서, 본 섹션에 제공된 이중특이성 항체는 DR5에 대해 2가 및 FAP에 대해 1가이다.
2+1 포맷을 갖는 이중특이성 항체의 대표적인 구조는 도 25A 및 B에 도시되어 있다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로도 지칭된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다).
Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편은 각각 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편은 또한 크로스Fab( VLVH )로 지칭되며, VLCH1 및 VHCL 쇄를 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편 둘 다의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다).
Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편들은 또한 크로스Fab( CLCH1 )로 지칭되며, VHCL 및 VLCH1 쇄를 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 상기 이중특이성 항체는 2개의 Fab 단편이 N-말단에 융합된 Fc 도메인을 포함한다.
한 태양에서, 2개의 Fab 단편들은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 한 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
FAP 결합제 가 C-말단에 융합된, 2+1 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 한 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편이 펩티드 링커에 의해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다. 한 상기 태양에서, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 상기 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3 쇄)의 C-말단에 융합된다. FAP 결합제가 C-말단에 융합된, 2+1 포맷의 이중특이성 DR5-FAP 항체의 대표적인 구조는 도 25A에 도시되어 있다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되고, Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, b)의 FAP에 특이적인 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, b)의 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되고, Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, b)의 FAP에 특이적인 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, b)의 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자, 및
b) FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되고, Fab 단편은 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, b)의 FAP에 특이적인 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다. 한 태양에서, b)의 상기 Fab 단편은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
FAP 결합제 가 N-말단에 융합된, 2+1 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
또 다른 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 또 다른 Fab 단편이 펩티드 링커에 의해 IgG 분자의 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 N-말단에 융합된다. FAP 결합제가 N-말단에 융합된, 2+1 포맷의 이중특이성 DR5-FAP 항체의 대표적인 구조는 도 25B에 도시되어 있다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위(Fab 단편) 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스fab 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된다),
b) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스Fab( VLVH ) 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환된다),
b) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스Fab( CLCH1 ) 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환된다),
b) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스fab 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된다),
b) IgG 분자의 가변 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된, DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위(Fab 단편) 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스Fab( VLVH ) 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환된다),
b) IgG 분자의 가변 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된, DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, b)의 DR5에 특이적인 Fab 단편은 a)의 DR5에 특이적인 Fab 단편의 가변 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, FAP에 특이적인 Fab 단편은 크로스Fab( CLCH1 ) 단편이다, 즉, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환된다),
b) IgG 분자의 가변 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된, DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, b)의 DR5에 특이적인 Fab 단편은 a)의 DR5에 특이적인 Fab 단편의 가변 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된다.
또 다른 바람직한 태양에서, DR5에 특이적인 Fab 단편은 펩티드 링커, 바람직하게는 약 10 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드 링커에 의해 IgG 분자에 융합된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 또는 (G4S)4 링커이다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 상기 이중특이성 항체는, 하기에서 개략하는 바와 같이, IgG 분자의 Fc 부분에 변형을 포함한다.
3. 3+1 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 3개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다).
상기 이중특이성 항체는 FAP에 대한 1개의 결합 부위 및 DR5에 대한 3개의 결합 부위를 갖는 3가이므로, 상기 포맷은 또한 "3+1" 포맷으로도 지칭된다. 따라서, 본 섹션에 제공된 이중특이성 분자는 DR5에 대해 3가 및 FAP에 대해 1가이다.
3+1 포맷을 갖는 이중특이성 항체의 대표적인 구조는 도 25C에 도시되어 있다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로도 지칭된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 3개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 3개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다).
Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편은 또한 크로스Fab( VLVH )로 지칭되며, VLCH1 및 VHCL 쇄를 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
각각 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 3개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다).
Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들의 교환으로 인해, FAP에 특이적인 크로스오버 Fab 단편은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진 펩티드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 이루어진 펩티드 쇄를 포함한다. 상기 크로스오버 Fab 단편은 또한 크로스Fab( CLCH1 )로 지칭되며, VHCL 및 VLCH1 쇄를 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는, 2개의 Fab 단편이 N-말단에 융합되고 2개의 Fab 단편이 C-말단에 융합된 Fc 도메인을 포함하며, 이때 FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 2개의 Fab 단편은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 한 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, b) 및 c)의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다).
한 태양에서, b) 및 c)의 상기 2개의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, b) 및 c)의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 융합된다).
한 태양에서, b) 및 c)의 상기 2개의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위(Fab 단편)를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자,
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 1개의 Fab 단편, 및
c) DR5에 특이적인 1개의 Fab 단편(이때, b) 및 c)의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트의 C-말단에 융합된다).
한 태양에서, b) 및 c)의 상기 2개의 Fab 단편들은 상기 IgG 분자의 Fc 도메인의 제 2 서브유니트(CH3)의 C-말단에 융합된다.
또 다른 바람직한 태양에서, 상기 섹션에 기술된 임의의 태양의 b) 및 c)의 2개의 Fab 단편들은 펩티드 링커, 바람직하게는 약 10 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 펩티드 링커에 의해 IgG 분자에 융합된다. 바람직하게, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2 또는 (G4S)4 링커이다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 상기 이중특이성 항체는, 하기에서 개략하는 바와 같이, IgG 분자의 Fc 부분에 변형을 포함한다.
4. 1+1 포맷의 이중특이성 DR5 - FAP 항체
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, 하나 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다).
상기 이중특이성 항체는 FAP에 대한 1개의 결합 부위 및 DR5에 대한 1개의 결합 부위를 갖는 2가이므로, 상기 포맷은 또한 "1+1" 포맷으로도 지칭된다. 따라서, 본 섹션에 기술된 이중특이성 항체는 DR5에 대해 1가 및 FAP에 대해 1가이다. 1+1 포맷을 갖는 이중특이성 항체의 대표적인 구조는 도 25D에 도시되어 있다. 가변 영역 또는 불변 영역의 교환으로 인해, 상기 Fab 단편은 또한 "크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "크로스오버 Fab 단편"으로도 지칭된다. 1+1 포맷의 IgG 분자는 또한 크로스mab 포맷으로도 지칭된다(문헌 [Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-11192] 참조).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때 DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다), 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변영역은 교환된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
Fc 도메인,
DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및
FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편(이때, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 상기 이중특이성 항체는 2개의 Fab 단편이 N-말단에 융합된 Fc 도메인을 포함하며, 이때 1개 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다. 한 태양에서, 2개의 Fab 단편들은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다. 한 태양에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 태양에서, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편, FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 태양에서, 면역글로불린 분자는 IgG 클래스 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 태양에서, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 태양에서, 면역글로불린은 IgG4 서브클래스 면역글로불린이다. 또 다른 특정 태양에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 태양에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 이때 상기 IgG 분자의 1개의 팔(arm)(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 이때 상기 IgG 분자의 1개의 팔(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다. 상기 항체 포맷은 또한 크로스Mab(VHVL)로도 지칭된다.
한 태양에서, FAP에 특이적인 결합 부위를 포함하는 IgG 분자의 1개의 팔(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 이때 상기 IgG 분자의 1개의 팔(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다. 상기 항체 포맷은 또한 크로스Mab(CH1CL)로도 지칭된다.
한 태양에서, FAP에 특이적인 결합 부위를 포함하는 IgG 분자의 1개의 팔(Fab 단편)의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환된다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5에 특이적인 1개의 결합 부위 및 FAP에 특이적인 1개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하고, 이때 상기 IgG 분자의 1개의 팔(Fab 단편)의 완전 VH-CH1 및 VL-CL 도메인은 교환된다. 이것은 Fab 단편들의 1개 이상이 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합되는 것을 의미한다. 한 태양에서, 다른 Fab 단편은 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다.
상기 항체 포맷은 또한 크로스MabFab로 지칭된다. 한 태양에서, 2개의 Fab 단편은 모두 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 N-말단에 융합된다.
D. Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 Fc 부분이 변형된 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함한다. 변형된 Fc 부분은 야생형 Fc 부분에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다.
본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은, 그 각각의 서브유니트가 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이량체이다. Fc 도메인의 2개의 서브유니트는 서로와 안정하게 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 태양에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 태양에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 태양에서, Fc 도메인은 위치 S228(카밧 번호)에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 특정한 태양에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(문헌 [Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조). 다른 특정 태양에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 대표적인 서열을 서열번호 151에 나타내었다.
Fc 도메인은, 표적 조직에서의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하여, 본 발명의 이중특이성 항체에 유리한 약동학적 성질을 제공한다. 그러나, 동시에, Fc 도메인은 바람직한 항원-함유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로 본 발명의 이중특이성 항체의 바람직하지 않은 표적화를 유발할 수 있다. 따라서, 특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 그러한 한 태양에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)은, 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 한 태양에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 태양에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 태양에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히는 인간 FcγRIIIa이다. 한 태양에서, Fc 수용체는 억제 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 억제 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIB이다. 한 태양에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비 중 하나 이상이다. 특정 태양에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 태양에서, Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교시, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)이 약 70%보다 크고, 특히 약 80%보다 크고, 보다 특히 약 90%보다 큰, FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)의 결합 친화도를 나타낼 때 달성된다.
특정 태양에서, Fc 도메인은, 비-조작 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개의 서브유니트 각각에 존재한다. 한 태양에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 한 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 돌연변이가 하나보다 많이 존재하는 태양에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상 감소시킬 수 있다. 한 태양에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체는, 비-조작 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체에 비해, 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 태양에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 태양에서, Fc 수용체는 억제 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 억제 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히는 인간 FcγRIIB이다. 일부 태양에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 태양에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 특히 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특히는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 상기 수용체들 각각에 대한 결합은 감소된다. 일부 태양에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 또한 감소된다. 한 태양에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 유지는, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)이 FcRn에 대한 Fc 도메인의 비-조작 형태(또는 Fc 도메인의 상기 비-조작 형태를 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)의 결합 친화도보다 약 70% 더 큰 친화도를 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체는 상기 친화도의 약 80%보다 크고, 심지어 약 90%보다 더 큰 친화도를 나타낼 수 있다. 특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 비-조작 Fc 도메인에 비해, 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능으로는 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제공 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수의 감소, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포자살을 유도하는 직접 신호전달의 감소, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 한 태양에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP 및 감소된 사이토카인 분비 중 하나 이상이다. 특정 태양에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 한 태양에서, 감소된 ADCC는 비-조작 Fc 도메인(또는 비-조작 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
한 태양에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 태양에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 태양에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 한 상기 태양에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 태양에서, Fc 도메인은 위치 P329에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 태양에서, Fc 도메인은 위치 P329에 한 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택되는 위치에 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 태양에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정 태양에서, Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 한 상기 태양에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은, 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 특허출원 PCT/EP2012/055393 호에 기술된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 제거한다. PCT/EP2012/055393 호는 또한 상기 돌연변이 Fc 도메인을 제조하는 방법, 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 기술하고 있다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화도 및/또는 그의 효과기 기능을 더 감소시키기 위해, 한 태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정 태양에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 상기 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 본원에 전체로 참고로 인용된 PCT 특허출원 PCT/EP2012/055393 호에 기술되어 있다.
특정 태양에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, 감소된 Fc 수용체에 대한 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은, 아미노산 치환 L234A, L235A 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 태양에서, Fc 도메인의 N-글리코실화가 배제되었다. 한 상기 태양에서, Fc 도메인은 위치 N297에 아미노산 치환, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파트산(N297D)으로 치환하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기에서 및 PCT/EP2012/055393 호에 기술된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
돌연변이 Fc 도메인은 당해 분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 이용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-지향 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는, 예를 들면, 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은, 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 측정될 수 있으며, Fc 수용체는 예를 들어 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적절한 상기 결합 분석법은 본원에서 기술된다. 또는, Fc 수용체에 대한, Fc 도메인의 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화도는, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포와 같이 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 효과기 기능은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석법은 본원에서 기술된다. 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 다른 예는 미국 특허 제 5,500,362 호; 문헌 [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986); and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호; 문헌 [Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 위스콘신 매디슨) 참조). 상기 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 문헌 [Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 태양에서, 보체 성분, 특히 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 태양에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은, 본 발명의 이중특이성 항체가 C1q에 결합할 수 있으며 따라서 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, WO 2006/029879 호 및 WO 2005/100402 호에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); and Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
하기의 섹션은 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 바람직한 태양을 기술한다.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인은, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해, 감소된 Fc 수용체에 대한 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다), 및
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인은, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다),
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329 중 하나 이상의 위치에 존재한다),
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다),
b) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다),
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 바람직한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다),
b) Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들이 교환되는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1로 이루어지는 중쇄 CDR1;
서열번호 2의 중쇄 CDR2;
서열번호 3의 중쇄 CDR3;
서열번호 4의 경쇄 CDR1;
서열번호 5의 경쇄 CDR2;
서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
서열번호 10의 중쇄 CDR2;
서열번호 11의 중쇄 CDR3;
서열번호 12의 경쇄 CDR1;
서열번호 13의 경쇄 CDR2;
서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1로 이루어지는 중쇄 CDR1;
서열번호 2의 중쇄 CDR2;
서열번호 3의 중쇄 CDR3;
서열번호 4의 경쇄 CDR1;
서열번호 5의 경쇄 CDR2;
서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
서열번호 10의 중쇄 CDR2;
서열번호 11의 중쇄 CDR3;
서열번호 12의 경쇄 CDR1;
서열번호 13의 경쇄 CDR2;
서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 1로 이루어지는 중쇄 CDR1;
서열번호 2의 중쇄 CDR2;
서열번호 3의 중쇄 CDR3;
서열번호 4의 경쇄 CDR1;
서열번호 5의 경쇄 CDR2;
서열번호 6의 경쇄 CDR3
을 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
서열번호 10의 중쇄 CDR2;
서열번호 11의 중쇄 CDR3;
서열번호 12의 경쇄 CDR1;
서열번호 13의 경쇄 CDR2;
서열번호 14의 경쇄 CDR3
을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 다음을 포함한다:
a) 서열번호 7의 가변 중쇄 및 서열번호 8의 가변 경쇄를 포함하는, DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자(이때, Fc 도메인의 각각의 서브유니트는, 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다), 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, FAP에 특이적인 2개의 Fab 단편(이때, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 교환되고, 2개의 Fab 단편은 펩티드 링커에 의해 상기 IgG 분자의 불변 중쇄에 융합된다).
E. 헤테로이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명의 이중특이성 DR5-FAP 항체는 Fc 도메인의 2개 서브유니트 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 잔기를 포함하므로, Fc 도메인의 2개의 서브유니트는 전형적으로 2개의 비-동일 폴리펩티드 쇄에 포함된다. 상기 폴리펩티드들의 재조합 공-발현 및 후속 이량체화는 2개의 폴리펩티드들의 여러 가능한 조합들을 유도한다. 따라서, 재조합체 생산에서 본 발명의 이중특이성 항체의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유니트의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유니트 사이에 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 한 태양에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
특정 태양에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유니트 중 하나에 "놉" 변형 및 Fc 도메인의 2개 서브유니트 중 다른 하나에 "홀" 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀" 변형이다.
놉-인투-홀 기술은, 예를 들면, US 5,731,168 호; US 7,695,936 호; 문헌 [Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 헤테로이량체 생성을 촉진하고 호모이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동(cavity)에 위치할 수 있도록 제 1 폴리펩티드의 계면에 돌출부("놉") 및 제 2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입하는 것을 포함한다. 돌출부는 제 1 폴리펩티드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상보적 공동이 제 2 폴리펩티드의 계면에 생성된다.
따라서, 특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인의 제 1 서브유니트의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 2 서브유니트의 CH3 도메인 내의 공동에 위치할 수 있는 제 1 서브유니트의 CH3 도메인 내에 돌출부가 생성되고, Fc 도메인의 제 2 서브유니트의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 제 1 서브유니트의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제 2 서브유니트의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
돌출부 및 공동은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 예를 들면, 부위-지향 돌연변이유발에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 변이시킴으로써 제조될 수 있다.
특정 태양에서, Fc 도메인의 제 1 서브유니트의 CH3 도메인에서, 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제 2 서브유니트의 CH3 도메인에서, 위치 407에서의 티로신 잔기가 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 한 태양에서, Fc 도메인의 제 2 서브유니트에서, 추가로 위치 366에서의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
또 다른 태양에서, Fc 도메인의 제 1 서브유니트에서, 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제 2 서브유니트에서, 위치 349의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 서브유니트 사이에 다이설파이드 가교의 형성을 야기하여, 이량체를 더 안정화시킨다[Carter, J Immonol Methods 248, 7-15 (2001)].
대안적 태양에서, Fc 도메인의 제 1 및 제 2 서브유니트의 결합을 촉진하는 변형은, 예를 들면, 국제 특허출원공개 WO 2009/089004 호에 기술된 바와 같이 정전기 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은, 호모이량체 생성은 정전기적으로 불리하지만 헤테로이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유니트의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 포함한다.
한 태양에서, 임의의 상기 태양에 따른 DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체는 DR5에 특이적인 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 G(IgG) 분자를 포함하며, 이때 제 1 중쇄의 Fc 부분은 제 1 이량체화 모듈을 포함하고, 제 2 중쇄의 Fc 부분은 제 2 이량체화 모듈을 포함하여, IgG 분자의 2개 중쇄의 헤테로이량체화를 가능하게 한다.
다른 바람직한 태양에서, 놉 인투 홀 방법에 따라 제 1 이량체화 모듈은 놉을 포함하고, 제 2 이량체화 모듈은 홀을 포함한다(문헌 [Carter P.;　Ridgway J.B.B.;　Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2,　Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)] 참조).
F. 핵산 서열, 벡터 및 방법
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 전체 이중특이성 항원 결합 분자 또는 DR5에 결합하는 전체 항체를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 공-발현되는 다중(예를 들면, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는, 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합되어 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, Fab 단편의 경쇄 부분은, Fab 단편의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유니트 및 선택적으로 또 다른 Fab 단편(의 일부)를 포함하는, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 Fab 단편을 형성할 것이다. 또 다른 예로, 2개의 Fc 도메인 서브유니트 중 하나 및 선택적으로 하나 이상의 Fab 단편(의 일부)를 포함하는, 본원에 제공된 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 부분은, 2개의 Fc 도메인 서브유니트중 다른 하나 및 선택적으로 Fab 단편(의 일부)를 포함하는, 본원에 제공된 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현될 때, Fc 도메인 서브유니트들은 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
한 태양에서, 본 발명은, 서열번호 167, 175, 183, 191, 199, 207 및 209에 나타낸 바와 같은 가변 중쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 태양에서, 본 발명은, 서열번호 171, 179, 187, 195, 203, 208 및 210에 나타낸 바와 같은 가변 경쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 태양에서, 본 발명은, 서열번호 222, 224, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 264 및 265에 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 태양에서, 본 발명은, 서열번호 167, 175, 183, 191 및 199에 나타낸 바와 같은 가변 중쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
한 태양에서, 본 발명은, 서열번호 171, 179, 187, 195 및 203에 나타낸 바와 같은 가변 경쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호 167, 175, 183, 191, 199, 207 또는 209의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호 171, 179, 187, 195, 203, 208 또는 210의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호 167, 175, 183, 191 또는 199의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은, 서열번호 171, 179, 187, 195 또는 203의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함하는, 본 발명의 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
특정 태양에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DAN이다. 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
또 다른 목적에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 항체가 생성되도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
G. 항체 변이체
특정 태양에서, 상기에 기술한 것들 이외에, 본원에 제공된 이중특이성 항체 및 DR5에 결합하는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 아미노산 서열 변이체는, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구축물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 가져야 한다.
1. 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 "보존적 치환"이란 제목하에 표 B에 나타내었다. 표 B에 "대표적 치환"이란 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에서 더 기술하는 바와 같이 보다 실질적인 변화들이 제공되어 있다. 아미노산 치환은 해당 항체 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
[표 B]
Figure pct00002
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류들중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 수득된 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들면, 개선)을 가질 것이고/이거나 실질적으로 유지된 모 항체의 특정 생물학적 성질을 가질 것이다. 대표적인 치환 변이체는, 편리하게, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지-디스플레이 기반 친화도 증진 기술을 이용하여 생성될 수 있는 친화도 증진 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예를 들면, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, 변이(예를 들면, 치환)가 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화되는 잔기(예를 들면, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol . Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선별하는 것에 의한 친화도 증진이, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기술되어 있다. 친화도 증진의 일부 태양에서, 다양한 방법들 중 임의 방법(예를 들면, 실수유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링(chain shuffling) 또는 올리고뉴클레오티드-지향적 돌연변이유발)에 의해 증진을 위해 선택되는 가변 유전자 내에 변화가 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 구축된다. 상기 라이브러리는 이어서 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 변화를 도입하는 또 다른 방법은, 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위선정되는 HVR-지향적 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 태양에서, 변이가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟" 또는 SDR 외에서 일어날 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 태양에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발에 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항원과의 항체의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
2. 글리코실화 변이체
특정 태양에서, 본원에 제공된 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변이시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물이 변이될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 결합된, 분지된 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들면, 문헌 [Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐 아니라, 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 특정한 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체에서 올리고사카라이드의 변형이 수행될 수 있다.
한 태양에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 이중특이성 항체 변이체 또는 DR5에 결합하는 항체의 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체내 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65%, 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들면, WO 2008/077546 호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정할 때 Asn297에 결합된 모든 당구축물(glycostructure)(예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 만노스 고함량 구축물)의 합에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균량을 산출함으로써 측정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 말한다(Fc 영역 잔기의 Eu 번호체계); 그러나, Asn297은 또한, 항체내 미미한 서열 변화로 인해 위치 297의 약 ±3개 아미노산의 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 상기 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다(예를 들면, US 2003/0157108 호(프레스타 엘(Presta, L); US 2004/0093621 호(쿄와 하코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개공보의 예로는 다음이 포함된다: US 2003/0157108 호; WO 2000/61739 호; WO 2001/29246 호; US 2003/0115614 호; US 2002/0164328 호; US 2004/0093621 호; US 2004/0132140 호; US 2004/0110704 호; US 2004/0110282 호; US 2004/0109865 호; WO 2003/085119 호; WO 2003/084570 호; WO 2005/035586 호; WO 2005/035778 호; WO 2005/053742 호; WO 2002/031140 호; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech . Bioeng . 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포주([Ripka et al. Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986)]; 미국 특허출원 US 2003/0157108 A1 호(프레스타 엘); 및 WO　2004/056312 A1 호(아담스 등(Adams et al.)), 특히 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예를 들면, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들면, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech . Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 호 참조)가 포함된다.
예를 들면, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 이중특이성 항체 변이체 또는 DR5에 결합하는 항체의 변이체가 또한 제공된다. 상기 이중특이성 항체 변이체 또는 DR5에 결합하는 항체의 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체들의 예는, 예를 들면, WO 2003/011878 호(진-메레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 호(우마나 등)에 기술되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 호(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 호(라주 에스(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 호(라주 에스)에 기술되어 있다.
3. 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 태양에서, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체, 예를 들면, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 태양에서, 치환된 잔기는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 잔기, 예를 들면, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 접합시켜 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호체계); 중쇄의 A118(EU 번호체계); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호체계). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
H. 재조합 방법 및 조성물
본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는, 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 생성의 경우, 예를 들어, 전술한 바와 같은 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체(또는 단편)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 이중특이성 항체(단편) 또는 DR5에 결합하는 항체(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법들로는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다(예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel at al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술되어 있는 기술 참조). 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는, 이중특이성 항체(단편) 또는 DR5에 결합하는 항체(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작용가능하게 결합되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 존재하는 경우, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 인접(flanking) 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 미번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예를 들면, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물들에, 예를 들면, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면, 본 발명의 벡터는 번역후 또는 번역과 동시에 단백질분해성 절단에 의해 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 본 발명의 이중특이성 항체(단편) 또는 DR5에 결합하는 항체(단편), 또는 그의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 비융합된 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 제한하지 않고 분화된(specialized) 요소 또는 모티프, 예를 들면, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작용가능한 결합은, 유전자 산물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현이 일어나게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들면, 폴리펩티드 암호화 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 사이의 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작용가능하게 결합"된다. 따라서, 프로모터 영역은, 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 작용가능하게 결합되는 것이다. 프로모터는, 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 효과기, 억제인자 및 전사 종료 신호가 폴리뉴클레오티드와 작용가능하게 결합되어 세포-특이적 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 이들로는, 제한하지 않고, 척추동물 세포에서 작용하는 전사 조절 영역, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(예, 인트론-A와 함께, 즉시 조기발현(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(예, 조기발현 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편(이로 한정되지는 않는다)이 포함된다. 다른 전사 조절 영역으로는 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유도된 것들, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서, 및 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)가 포함된다. 유사하게, 다양한 전사 조절 요소들이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들로는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유도된 요소들(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 발현 카세트는 또한 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR), 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)의 역 말단 반복서열(ITR)과 같은 다른 특징들도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 영역과 결합될 수 있다. 예를 들면, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 분비를 목적하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 본 발명의 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 위치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 조면 소포체를 가로질러 성장 단백질 쇄의 확산이 개시되면 성숙 단백질로부터 분리되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 상기 신호 펩티드는 번역된 폴리펩티드로부터 분리되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 인지할 것이다. 특정 태양에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그와 작용가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 또는, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
후속의 정제를 촉진하거나(예를 들면, 히스티딘 태그) 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 표지화를 돕기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA가 이중특이성 항체(단편) 또는 DR5에 결합하는 항체(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드 내에 또는 그의 말단에 포함될 수 있다.
다른 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 태양에서, 하나 이상의 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기술된 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다. 한 상기 태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템을 말한다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 세포는 특정 발현 벡터로 적절하게 형질감염되거나 형질도입될 수 있으며, 대규모 발효조에 접종하여 임상 용도로 충분한 양의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 수득하기 위해 대량의 벡터 함유 세포를 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예를 들면, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 세균에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 폴리펩티드는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 분리될 수 있으며, 더 정제될 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균류 및 효모 균주를 포함하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 폴리펩티드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004); and Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조). (글리코실화) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다 ( Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, (유전자전이 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES, 등록상표) 기술을 설명하고 있는) 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 호 참조). 척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 dhfr_ CHO 세포[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]를 포함하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 단백질 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조하시오. 숙주 세포로는 배양 세포, 몇가지만 예를 들면, 포유동물 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포 뿐 아니라, 유전자전이 동물, 유전자전이 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포가 포함된다. 한 태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프종 세포(예, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 둘 다 갖는 항체이도록 항체 쇄 중 나머지 쇄를 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 태양에서, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에 제공된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 제조 방법이 제공된다.
이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 성분들은 유전적으로 서로에 융합된다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는, 그 성분들이 서로에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있으며, 효능에 대해 검사될 수 있다. 이중특이성 항체의 상이한 성분들 사이의 링커 서열의 예는 본원에 제공된 서열들에서 확인된다. 바람직한 경우, 융합체의 개개 성분들을 분리하기 위한 절단 부위를 혼입시키기 위해 추가의 서열, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열도 또한 포함될 수 있다.
특정 태양에서, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 일부를 형성하는 Fab 단편은 적어도 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비-천연 항체 및 그의 단편의 일부를 형성할 수 있고, 이로부터 유도될 수 있다. 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비-천연 항체는 고상-펩티드 합성을 이용하여 구성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있거나(예를 들면, 미국 특허 제 4,186,567 호에 기술된 바와 같이), 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다(예를 들면, 맥카퍼티(McCafferty)의 미국 특허 제 5,969,108 호 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 비-제한적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원을 가질 수 있다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체가 인간에 사용하기 위한 것인 경우, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유도된 항체의 키메라 형태를 사용할 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 윈터(Winter)의 미국 특허 제 5,565,332 호 참조). 인간화는, (a) 비-인간(예, 공여자 항체) CDR의 인간(예, 수용자 항체) 프레임워크 및 핵심(critical) 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것들)를 갖거나 갖지 않는 불변 영역 상으로의 그라프팅, (b) 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)의 인간 프레임워크 및 불변 영역 상으로의 그라프팅, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 구획으로 이들을 "클로킹(cloaking)"하는 것을 포함하는(이로 한정되지는 않는다) 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 다음 문헌들에 더 기술되어 있다: 문헌 [Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409 호; 문헌 [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술하고 있음); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("표면처리(resurfacing)"를 기술하고 있음); Dall' Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)("FR 셔플링"을 기술하고 있음); and Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)]. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-374 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기술되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론성 항체의 일부를 형성할 수 있으며, 이로부터 유도될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 자극에 반응하여 비손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 비손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자전이 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and MaCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다.
특정 태양에서, 본 발명에 유용한 Fab 단편은, 예를 들면, 본원에 전체로 참고로 인용된 미국 특허출원공개 제 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증대된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 능력은, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어 T100 시스템 상에서 분석)[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)] 및 전통적인 결합 분석법[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)]을 통해 측정할 수 있다. 경쟁 분석법을 이용하여, 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인을 확인할 수 있다. 특정 태양에서, 상기 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 동일 에피토프(예, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 대표적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Human Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 대표적인 경쟁 분석법에서는, 항원에 결합하는 제 1 표지화 항체 및 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 검사되는 제 2의 비표지 항체를 포함하는 용액중에서, 고정화된 항원을 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상등액중에 존재할 수 있다. 대조군으로, 제 1 표지화 항체는 포함하지만 제 2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액중에서 고정화 항원을 배양한다. 제 1 항체의 항원에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과잉 미결합 항체를 제거하고, 고정화 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화 항원과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 그것은 제 2 항체가 항원에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다(문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
본원에 기술된 바와 같이 제조된 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이성 항체의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스를 사용할 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 기본적으로 실시예에 기술된 바와 같이 이중특이성 항체를 단리할 수 있다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하여 다양한 공지된 임의의 분석 방법에 의해 측정할 수 있다.
I. 분석법
본원에 제공된, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 및 DR5에 결합하는 항체는, 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 그의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 성질에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나 특성화될 수 있다.
1. 친화도 분석법
DR5 및/또는 FAP에 대한, 본원에 제공된 이중특이성 항체 및 DR5에 결합하는 항체의 친화도는, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)와 같은 표준 기기장치, 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 나타낸 방법에 따라 측정할 수 있다. 또는, DR5 및/또는 FAP에 대한, 본원에 제공된 이중특이성 항체 및 DR5에 결합하는 항체의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들면, 유세포분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 태양은 하기에서 및 하기 실시예에서 기술한다.
한 태양에 따르면, KD는 25 ℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정한다.
Fc-부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태깅된 재조합 Fc-수용체를 CM5 칩 상에 고정화된 항-펜타 His 항체(키아겐(Qiagen))에 의해 포획하고, 이중특이성 구축물들을 분석물로 사용한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항 펜타-His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/ml로 희석한 후 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 6500 응답 단위(response unit, RU)의 커플링된 단백질을 수득한다. 리간드의 주입 후에, 1M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 이어서, Fc-수용체를 4 또는 10 nM에서 60 초동안 포획한다. 동적 측정을 위해, 이중특이성 구축물의 4-배 연속 희석물(약 500 내지 4000 nM의 범위)을 25 ℃에서 30 ㎕/분의 유량으로 120 초동안 HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 서펙턴트(Surfactant) P20, pH 7.4)중에 주입한다.
표적 항원에 대한 친화도를 측정하기 위해, 항 펜타-His 항체에 대해 기술된 바와 같은 활성화된 CM5-센서칩 표면 상에 고정화된 항 인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)에 의해 이중특이성 구축물을 포획한다. 커플링된 단백질의 최종량은 약 12000 RU이다. 이중특이성 구축물은 300 nM에서 90 초동안 포획된다. 표적 항원은 30 ㎕/분의 유량하에 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 180 초동안 유동 세포를 통과한다. 해리는 180 초동안 모니터링한다.
벌크 굴절률 차이는, 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감함으로써 보정된다. 정상 상태 반응을 이용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온식의 비-선형 곡선 적합(curve fitting)에 의해 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 단순한 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시킴으로써 산출한다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon로서 산출된다(예를 들면, 문헌 [Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)] 참조).
2. 결합 분석법 및 기타 분석법
한 양태에서, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석법을 이용하여 FAP 또는 DR5 각각에 결합하기 위해 특이적 항-FAP 항체 또는 특이적 항-DR5 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 태양에서, 상기 경쟁 항체는 특이적 항-FAP 항체 또는 특이적 항-DR5 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 그에 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 대표적 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 또 다른 방법들은 실시예 섹션에 기술되어 있다.
3. 활성 분석법
한 양태에서, 생물 활성을 갖는 그의, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들면, DNA 단편화, 표적화된 세포의 세포자살 및 용해의 유도를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체는 상기 생물 활성에 대해 검사된다. 세포 용해(예를 들면, LDH 방출의 측정에 의해) 또는 세포자살(예를 들면, TUNEL 분석법을 사용하여)을 검출하기 위한 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다. ADCC 또는 CDC를 측정하기 위한 분석법은 또한 본원에 전체로 참고로 인용된 WO 2004/065540 호(그중 실시예 1 참조)에 기술되어 있다.
J. 약학 제형
본원에 기술된 바와 같은, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 항체의 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 이중특이성 항체 또는 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 대표적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들면, rHuPH20(하일레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rHuPH20을 포함하여, 특정한 대표적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허출원공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
대표적인 동결건조 항체 제형은 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908 호에 기재된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 적절히 함께 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐에, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
K. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 및 DR5에 결합하는 새로운 항체들 중 임의의 항체가 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 다른 양태에서, 암을 치료하는데 사용하기 위한, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체를 제공한다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은, 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 한 바람직한 태양에서, 상기 암은 췌장암 또는 대장암이다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한, DR5에 결합하는 항체가 제공된다. 다른 양태에서, 암을 치료하는데 사용하기 위한, DR5에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한, DR5에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 태양에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의, DR5에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, DR5에 결합하는 항체를 제공한다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은, 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 한 바람직한 태양에서, 상기 암은 췌장암 또는 대장암이다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체의 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서, DR5에 결합하는 항체의 용도를 제공한다. 한 태양에서, 상기 약제는 암 치료를 위한 것이다. 다른 태양에서, 상기 약제는 암을 갖는 개체에게 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은, 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 태양에서, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 효과량의, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 태양에서, 상기 방법은, 개체에게 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 태양에 따른 "개체"는 인간일 수 있다. 한 바람직한 태양에서, 상기 암은 췌장암 또는 대장암이다.
다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 중 임의의 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체중 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체중 임의의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된, DR5에 결합하는 항체중 임의의 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된, DR5에 결합하는 항체중 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된, DR5에 결합하는 항체중 임의의 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 하기에 기술되는 바와 같은 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체는 비경구, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라, 국소 치료를 위해 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의애 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 만성인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본 발명에서 고려된다.
본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체는 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 선택적으로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로, 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로하에, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체의 적절한 투여량은, 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체에 대한 환자의 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 내지 10 mg/kg)의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체가, 예를 들면, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 유망 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급한 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상동안 반복 투여하기 위해, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 방법들도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법들에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
L. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로 또는 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 유지하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 질병을 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은, (a) 본 발명의 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 태양에서의 제품은 또한 조성물이 특정 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거(Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 또한 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 본 발명의, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체 또는 DR5에 결합하는 새로운 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III . 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예들이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여 다양한 다른 태양들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
상기에서 본 발명을 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 예로서 다소 상세히 기술하였지만, 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌들의 개시내용은 명백하게 본원에 참고로 인용된다.
실시예 1: DR5 - FAP 사멸 수용체 작동성 이중특이성 항체는 제 2 세포주에 의한 가교결합에 의해 한 세포주의 세포자살을 매개할 수 있다.
DR5와 같은 사멸 수용체의 가교결합(종양 세포에 의해 발현된 항원을 통한 가교결합과 별개로)에 의한 세포자살 유도의 한 접근방법은 종양을 둘러싸고 있는 기질을 표적화하는 것이다. 그 경우에, 표적화된 항원은 종양 세포에 의해서는 직접 나타나지는 않지만, 제 2의 상이한 세포 유형에 의해 나타난다. 상기 종류의 항원의 한 예가 FAP(섬유아세포 활성화 단백질)이다. 상기 단백질은, 이들이 종양 기질에서 발견될 때 활성화된 섬유아세포 상에서 발현된다.
인간 DR5 및 종양 기질로부터의 항원을 표적화하는 이중특이성 사멸 수용체 작동성 항체를 사용한 세포자살의 종양 표적화 유도의 가능성을 조사하기 위해, DR5를 인식하는 IgG1 부분 및 항체의 중쇄의 C-말단에 융합되는 FAP 결합 scFv로 이루어지는 이중특이성 분자를 생성하였다. DR5 표적화 IgG의 서열은 US 2007/0031414 A1 호에 기술된 바와 같은 드로지투맙 서열로부터 취하였다. FAP 결합 scFv 잔기의 가변 중쇄 및 경쇄의 서열은 WO 2012/020006A1 호에 기술된 바와 같은 파지 디스플레이에 의해 단리된 Fab 항 FAP 분자(3F2 또는 4G8)로부터 취하였다. FAP scFv는 (G4S)2 연결자(connector)에 의해 항 DR5 IgG 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된다. 항 FAP 항체는 둘 다 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 상의 상이한 에피토프에 결합하고, 인간, 뮤린 및 사이노몰구스 항원과 교차-반응성이다.
DR5 중쇄 또는 경쇄에 FAP 결합 scFv가 C-말단 융합된, 검사된 이중특이성 DR5-FAP 분자의 설명. 링커 및 연결자 길이 및 정제 수율이 나와 있다.
분자 설명 연결자 scFv내
링커		 수율
[mg/L]
3F2-scFv_HC
(서열번호 111)		 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 다이설파이드 안정화된 scFv(H44L100)의 융합 (G4S)2 (G4S)4 2.53
4G8-scFv_HC
(서열번호 112)		 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 다이설파이드 안정화된 scFv(H44L100)의 융합 (G4S)2 (G4S)4 4.29
4G8-scFv_LC
(서열번호 113)		 드로지투맙 경쇄의 C-말단에 다이설파이드 안정화된 scFv(H44L100)의 융합 (G4S)2 (G4S)4 2.15
상기 유형의 설정에서는, 2개의 상이한 세포주들이 시험관내 활성 분석에 사용되어야 한다: 1개의 세포주(표적 세포주)는 인간 DR5를 발현해야 하고, 세포자살 가능해야 하지만, FAP를 발현할 필요는 없다. 제 2 세포주(효과기 세포주)는 세포자살 음성(세포자살 내성에 의해 또는 DR5를 발현하지 않음으로써)이어야 하지만, 표면상에서 FAP를 발현할 필요는 없다.
목적하는 기준을 충족시키는 가능한 한 효과기 세포주는 인간 섬유아세포 세포주 GM05389이다. 도 1a에서 보이듯이, 상기 세포주는, 검사된 최고 항체 농도(10 ㎍/ml)하에서만 FAP 발현을 나타낸 세포주 SW872에 비해, 상당한 수준의 FAP를 발현하지만, 도 1b에서 보이는 바와 같이 비-가교결합된 드로지투맙에 의한 세포자살은 일어나지 않는다. 그러므로, 상기 세포주는, 표적 세포주의 DNA 단편화가 제 2 세포주 상에서 발현된 항원에 의한 가교결합에 의해 유도되는 세포자살 분석법에서 가능성 있는 효과기 세포주인 것으로 보인다.
표적 세포주로서 인간 신장-선암 세포주 ACHN 또는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231을 사용하였다. 이들은 필적하는 낮은 수준의 DR5를 발현하였으며(도 2) DR5 매개된 세포자살 유도에 민감하였다. 도 3에, FAP를 통한 DR5의 종양 표적화 가교결합에 의한 ACHN과 GM05389 세포주의 조합과 비교한 ACHN 세포의 DNA 단편화의 유도 결과가 요약되어 있다. 대조군 항체(드로지투맙)는, 두 세포주 모두에서 Fc 부분을 표적화하는 2차 항체(흰색 막대)에 의한 가교결합시 세포자살을 유도하지만, 또한 가교결합 부재하에서도 약간의 활성을 나타내었다. 이중특이성 DR5-FAP 분자는 표적 및 효과기 세포주(검은색 막대) 둘 다의 존재하에서 상당한 세포자살 유도를 나타내었다. FAP 발현 섬유아세포(GM05389)의 부재하에서, 비-가교결합된 드로지투맙(회색 막대)에 비해 세포자살이 약간 증가되었다. 이러한 결과는, ACHN 세포 상의 DR5 수용체가 섬유아세포 세포주 GM05389에 의해 발현된 FAP 항원에 결합시 가교결합되는 방식으로 해석한다. 모든 분자들은 필적하는 최대 세포자살 활성을 나타내었다.
실시예 2: 드로지투맙에 융합된 scFab 포맷의, 교차-반응성 FAP 결합제를 갖는 DR5 이중특이성 작동성 항체는 공-배양 분석법에서 세포자살 활성을 나탄내다
실시예 1에서 입증된 바와 같이, scFv 포맷에서 FAP 표적화 잔기가 드로지투맙 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 DR5-FAP 이중특이성 작동성 항체(2x2 포맷)는, 하나의 세포주가 FAP를 발현(효과기 세포)하는 반면 제 2의 세포주는 DR5 수용체 표적의 역할을 하는 2개 세포주 공-배양 설정에서 세포자살을 유도할 수 있다.
scFv 융합체를 함유하는 상기 분자들이 약간 불리한 성질(낮은 생산 수율 및 응집체를 형성하는 경향)을 나타내었기 때문에, FAP 결합 단위가, 드로지투맙의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 단일쇄 Fab(scFab)로 치환된 구축물들을 제조하여 표 2에 기술된 바와 같은 4개의 상이한 분자들의 생성을 유도하였다. 이중특이성 분자의 IgG 부분에 대한 scFab 단위의 연결은 (G4S)4 서열을 통해 일어나는 반면, scFab 내부 링커는 32개 아미노산으로 이루어진다.
상기 분자들은 표준 재조합 기술에 의해 일시적으로 생성되었으며, FAP 및 DR5 결합의 상세한 검사를 위해 충분한 양으로 및 우수한 질로 정제되었다(FACS; 비아코어, 도시되지 않음).
상이한 드로지투맙-FAP(scFab) 융합체의 설명 및 특성화. 모든 분자들에서, 항 FAP scFab는 20량체 연결자((S4G)4)에 의해 드로지투맙에 융합된다.
명칭 설명 수율
[ mg /L] 		연결자
GA803_A01_B01A_004
3F2_ scFab _ HC
(서열번호 114)		 scFab: 3F2; VLCL-VHCH1
드로지투맙 중쇄에
C-말단 융합 (2x2)		 3.9 (G4S)4
GA803_A01_B01B_005
3F2_ scFab _ LC
(서열번호 115)		 scFab: 3F2; VLCL-VHCH1
드로지투맙 경쇄에
C-말단 융합 (2x2)		 4.9 (G4S)4
GA803_A01_B02A_001
4 G8 _ scFab _ HC
(서열번호 116)		 scFab: 4G8; VLCL-VHCH1
드로지투맙 중쇄에
C-말단 융합 (2x2)		 2.0 (G4S)4
GA803_A01_B02B_002
4 G8 _ scFab _ LC
(서열번호 117)		 scFab: 4G8; VLCL-VHCH1
드로지투맙 경쇄에
C-말단 융합 (2x2)		 2.5 (G4S)4
제 2의 FAP 발현 '효과기' 세포주(예를 들면, 섬유아세포 세포주 GM05389)의 존재 및 부재하에서 DR5 발현 표적 세포주(예를 들면, 신세포암 세포주 ACHN)의 세포자살 유도에 대한 분석을 도 4a 및 4b에 나타내었다. 세포자살 유도는 DNA 단편화 분석법으로 분석하였다. 상기 분석법에서, 1:1의 표적 대 효과기 세포의 비를 사용하였으며, 드로지투맙, 과-가교결합된 드로지투맙 또는 이중특이성 구축물(모두 1 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml의 농도로 사용됨)의 존재하에서 24 시간동안 공-배양한 후 DNA 단편화를 분석하였다.
모든 검사된 구축물들에서, 이중특이성 분자들은, 드로지투맙에 융합된 scFab로서 사용된 FAP 결합제(3F2 또는 4G8)와 무관하게, 섬유아세포 효과기 세포주의 존재하에서만 ACHN 표적 세포에서 증가된 세포자살 유도를 나타내는 것이 입증될 수 있었다. 그러나, 이중특이성 분자의 고농도에서는, FAp 발현 섬유아세포의 부재하에서 낮은 정도의 세포자살 활성이 관찰될 수 있었다. 일반적으로 및 사용된 FAP 결합제와 무관하게, 중쇄의 C-말단에 scFab가 융합된 분자들은 scFab가 경쇄의 C-말단에 융합된 분자들에 비해 더 활성이었다. 또한, 4G8 함유 구축물들은 3F2 함유 분자들보다 더 효력이 있는 것으로 보였다. 그러나, scFab 기반 포맷의 활성은 유사한 scFv 기반 구축물에 비해 더 낮았다.
항 Fc 항체에 의한 추가의 가교결합이 없는 드로지투맙은 낮은 세포자살 유도를 나타내었다. 그러나, 2차 항 Fc 항체 단독에 의해 과-가교결합된 드로지투맙(매우 인공적인 상황)은 어떤 검사된 분자에 의해서도 달성될 수 없는 최고 세포자살 활성을 나타내었다.
실시예 3: 크로스Fab 포맷의 DR5 - FAP 이중특이성 작동성 항체는 scFab 함유 분자에 비해 우수한 특성을 나타낸다
평가된 scFab 함유 이중특이성 분자들은 여전히 약간의 불리한 특성(예를 들면, 낮은 발현 수율, 최적화가능한 세포자살 활성)을 나타내었으므로, 상기 불리한 점을 극복해야 하는 새로운 포맷을 분석하였다: 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 대한 크로스Fab 포맷의 FAP 결합제(4G8)의 융합. 상기 포맷에서, FAP 결합 잔기는 표 3에 기술되고 도 5에 나타낸 바와 같이 Fab 단편중 가변 영역의 '크로스오버' 교환에 사용된다. 크로스Fab 분자들은 20량체 연결자((G4S)4)를 통해 드로지투맙 중쇄에 연결된다.
2개의 상이한 포맷의 이중특이성 드로지투맙-FAP 크로스Fab 구축물의 설명 및 생산 수율
도면 명칭 설명 수율[ mg /L]
단량체[%]
5A GA803_A01_E02A_014
드로지투맙 _X_ FAP _A (2+2)
(서열번호 118,119,120)		 - 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 대한 4G8 VH-CL의 융합
(서열번호 118)
- 별개의 VL-CH1 카세트
(서열번호 120)
- 별개의 드로지투맙 경쇄 카세트
(서열번호 119)		 36.1


100.0
5B GA803_A01_E02A_015
드로지투맙 _X- FAP _B (2+2)
(서열번호 121,122,119)		 - 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 대한 4G8 VH-CH1의 융합
(서열번호 121)
- 별개의 VH-CL 카세트
(서열번호 122)
- 별개의 드로지투맙 경쇄 카세트
(서열번호 119)		 16.7


100.0
크로스Fab 분자 둘 다(구축물의 구성에 대해 또한 도 5 참조) 일시적으로 HEK293 EBNA 세포(부착 또는 현탁 세포)에서 생성하고 표준 방법에 의해 정제하였다. scFab 및 scFv 함유 이중특이성 구축물에 비해, 크로스Fab 분자는, 표 4에 나타낸 바와 같이, 상당히 증가된 발현 수준을 나타내어, 허용되는 낮은 응집체 함량하에 약 10배 더 높은 생성물 수율을 야기하였다.
도 6은 상이한 이중특이성 DR5-FAP 분자의 생성시 응집체 함량을 보여준다. 정제시 예비 크기 배제 크로마토그래피로부터의 크로마토그램을 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 대한 scFv(A), scFab(B) 및 크로스Fab(C) 융합체에 대해 나타내었다. scFv 및 scFab 융합 구축물은 크로스Fab 함유 분자에 비해 훨씬 더 높은 응집체 함량을 나타내었다. 정제시 상기 응집체의 제거는 물질의 상당한 손실을 야기하였으며, 이것은 정제후 수득된 수율로부터 쉽게 볼 수 있다.
재조합 HEK293 세포 상에서 발현된 인간 FAP에 대한 분자의 결합을 FACS 분석으로 검출하였다. 도 7은, 유사한 scFab 구축물(빗금친 막대) 또는 상응하는 FAP (4G8) IgG 분자(검은색 막대)에 비해, 2개의 드로지투맙-크로스Fab 분자(드로지투맙-X-FAP_A, 점무늬 막대 및 드로지투맙-X-FAP_B, 흰색 막대)의 FACS 결합 결과를 나타낸 것이다. 4G8 FAP 결합 잔기가 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 융합된 3개의 이중특이성 분자 모두, IgG 구축물로서 재조합 HEK 세포의 막상에서 발현된 인간 FAP와 유사하게 또는 유사한 범위로 결합하여, 상기 융합 위치가 검사된 FAP 결합제에 N-말단 차단 효과를 갖지 않음을 시사하였다. 상기 분석법에서 사용된 음성 대조군 분자(2차 검출 항체 및 드로지투맙)는 검출가능한 방식으로 FAP 발현 HEK 세포에 결합하지 않는다.
모든 상이한 검사된 이중특이성 DR5-FAP 분자의 수율 및 질 비교
분자 수율
[ mg /L] 		응집체 [%]
SEC 전 후 		저분자량 함량 [%] 단량체
[%]
1 3F2 scFv_HC
(서열번호 111)		 2.53 59 0.00 4.13 96.34
2 4G8 scFv_HC
(서열번호 112)		 4.29 n.d. 0.00 1.50 98.50
3 4G8 scFv_LC
(서열번호 113)		 2.15 73 0.00 0.00 100.00
4 3F2 scFab_HC
(서열번호 114)		 3.99 72 0.00 0.00 100.00
5 3F2 scFab_LC
(서열번호 115)		 4.99 n.d. 0.00 0.00 100.00
6 4G8 scFab_HC
(서열번호 116)		 2.03 78 0.00 0.00 100.00
7 4G8 scFab_LC
(서열번호 117)		 2.47 66 0.00 0.00 100.00
8 4G8-X-Fab_A
(서열번호 118,119,120)		 36.10 90 0.00 0.00 100.00
9 4G8-X-Fab_B
(서열번호 121,122,119)		 16.67 94 0.00 0.00 100.00
도 8에, DR5 및 FAP에 대한 이중특이성 크로스Fab 분자의 동시 결합을 평가한 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR, 비아코어)의 결과가 나타나 있다. 상기 분석을 위해, 항원(Fc 융합체로서 인간 DR5, 서열번호 316)을 비아코어 칩에 커플링시킨 후 제 1 분석물로서 크로스Fab 분자를 주입하였다. DR5에 scFab 분자를 결합시킨 후에, 재조합 가용성 인간 또는 뮤린 FAP(서열번호 156 및 157)를 제 2 분석물로서 사용하였다. 모든 검사한 이중특이성 분자에서, 제 2 분석물의 주입시 수득된, 제 1 분석물 주입후 전체 반응 속도의 증가에 의해 나타나는 바와 같이, DR5 및 인간 및 뮤린 FAP에 대한 농도 의존성 동시 결합을 보였다. 2개의 4가 이중특이성 크로스Fab 분자(2x2; 드로지투맙-X-FAP_A 및 드로지투맙-X-FAP_B)는 둘 다 DR5 및 인간 및 뮤린 FAP에 대해 유사한 결합을 나타내었다(도 8; A 내지 D).
도 9는, FAP 발현 섬유아세포 세포 GM05389의 부재 또는 존재하에서 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대한 드로지투맙 대 2개의 상이한 이중특이성 드로지투맙-X-FAP 분자 및 1개의 드로지투맙_4G8_scFab 구축물의 24 시간후 DNA 단편화 분석에 의해 측정시 세포자살의 유도를 나타낸 것이다. 적용된 조건하에서, 과-가교결합된 드로지투맙 및 이중특이성 DR5-FAP 분자는 농도 의존성 세포자살 유도를 나타내었다. 저농도에서 이중특이성 구축물은 소위 방관자 세포자살(존재하는 DR5 및 FAP 발현 세포주 만에 의한 세포자살 활성)에 의존적인 것으로 보였지만. 이들은 도한 고농도에서 MDA-MB-231 세포 단독의 세포자살을 유도하였다. 과-가교결합된 드로지투맙은, MDA-MA-231 세포만 존재하였을 때 저농도에서도 높은 수준의 세포자살을 유도하였다. 2개의 이중특이성 분자 모두 이미 0.7 nM의 농도에서 최대 세포자살 유도를 나타내었다.
FAP에 의한 가교결합에 의존성인 그의 세포자살 유도 활성에 대해 이중특이성 구축물의 특이성을 검사하기 위해, 상이한 분석 구성을 선택하였다(도 10). 상기 설정에서, 재조합 인간 FAP 또는 비관련 대조군 단백질(흰색 막대)을 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 상기 단백질들을 이중특이성 분자 또는 적절한 대조군과 함께 배양한 후, 표적 세포(MDA-MB-231)를 가하고 24 시간동안 배양하였다. 세포자살 유도를 나타내는 농도 의존성 DNA 단편화는, 도 10에서 보이는 바와 같이 과-가교결합된 드로지투맙(회색 막대), 이중특이성 scFab 분자(빗금친 막대) 및 이중특이성 크로스Fab 분자(검은색 막대)의 경우에서 입증될 수 있었다. 가교결합된 드로지투맙에 의한 세포자살 유도는 항상 FAP 또는 코팅된 대조군 단백질과 동일한 범위였지만(전체 검사한 농도 범위에 걸쳐), 크로스Fab 분자의 세포자살 활성은 대조군 단백질에 비해 FAP를 플레이트상에 코팅했을 때 더 높았다. 0.7 nM 이하의 농도에서, 코팅된 FAP의 존재하에서만 상당한 세포자살이 검출될 수 있었으며, 이는 표적 MDA-MB-231 세포 상에서의 DR5의 특이적 가교결합을 시사한다. 드로지투맙 중쇄의 C-말단에 크로스Fab로서 융합된 FAP 잔기를 함유하는 이중특이성 드로지투맙-FAP 구축물은, 도 11에서 보이듯이, 24 시간동안 공-배양 세포자살 분석법(DNA 단편화 분석법)에서 분석된 상이한 종양 세포주들에 대해 검사한 농도들에서 드로지투맙 단독에 비해 우수한 세포자살 유도를 나타내었다. 상기 분석법에서는, 드로지투맙, 항-Fc 항체와 가교결합된 드로지투맙 또는 드로지투맙-X-FAP 구축물(모두 7 nM 및 0.7 nM의 농도에서)의 존재하에서, FAP 발현 섬유아세포(GM05389)를 일련의 상이한 종양 세포주(MDA-MB-231, 유방암, 검은색 막대; U-87MG, 교모세포종, 회색 막대; FaDu, 두경부암, 흰색 막대; 및 A549, 폐암, 빗금친 막대)와 함께 공-배양하였다. 7 nM 농도에서 가교결합된 드로지투맙의 세포자살 유도를 100%로 설정하였고, 다른 검사한 분자들의 활성을 그에 따라 산출하였다. 7 nM 농도에서 드로지투맙 단독은 50% 이하의 활성(검사한 종양 세포주에 따라)을 나타내었지만, 크로스Fab 분자는 모든 검사한 세포주에서 과-가교결합된 드로지투맙의 75 내지 90% 범위의 세포자살 유도를 나타내었다. 0.7 nM에서 드로지투맙 단독은 낮은 활성을 나타내었지만, 이중특이성 분자는 상당한 세포자살 유도 활성(FaDu 세포에서 100%까지, 다른 검사한 세포주들에서 60 내지 90%)을 나타내었다.
실시예 4: 새로운 DR5 결합제 의 생성을 위한 항원 및 스크리닝 도구의 제조
이중특이성 포맷의 드로지투맙의 일부 준최적 성질(낮은 생산성, 가교결합 부재하에서의 활성, N-말단 융합은 항체를 불활성화시킴)로 인해, 이러한 불리한 점들을 극복하는 새로운 DR5 항체를 단리하였다. 새로운 DR5 결합제의 단리에 사용되기에 적절한 항원의 생성을 위해서 및 그의 스크리닝 및 선별을 위해, 일련의 융합 단백질을 제조하였다. 각각의 수용체 유전자로부터, 세포외 도메인(ECD) 암호화 영역을 PCR에 의해 증폭시키고 유전적 단백질 대응물에 융합시켜 하기의 포맷을 제조하였다(도 12에 도시된 바와 같음):
1. 프레임내에서 Avi-태그 및 Hexahis-태그에 융합된 세포외 도메인(ECD)
2. 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인에 이어 Avi 태그로 이루어지는 인간 IgG1의 Fc에 융합된 ECD. ECD와 Fc 사이에 AcTev 프로테아제 절단 부위가 삽입되었다(이량체성 항원 생성).
3. 2에서와 같으나 ECD가 놉-인투-홀 돌연변이하에 Fc에 융합된다. 항원-Fc 융합체는 Fc-홀 대응물과 공-발현되어 단량체성 항원을 수득한다.
인간 DR5 및 뮤린 DR5의 서열은 알려져 있고 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에 주석이 달렸지만, 사이노몰구스 동족체의 서열은 상기 데이터베이스에 기술되지 않았다. 인간 및 붉은털 원숭이(rhesus) DR5 유전자 서열들 중에서 동족체를 기준으로, 사이노몰구스 PBMC로부터 제조된 RNA로부터의 사이노몰구스 항원의 단리에 사용된 프라이머를 설계하였다. 간략하게, 키아겐의 RNeasy 키트를 사용하여 새로 단리된 사이노몰구스 혈액으로부터 RNA를 단리하였다. DNAseI 절단 및 RNA의 용출 후에, 키아겐의 원스텝(OneStep) RT-PCR 키트(cDNA 합성 및 증폭)(카탈로그 번호 210212)를 사용하여, 프라이머로서 공지된 붉은털원숭이 DR5 서열에 따라 설계된 GAB-4039(GCTGGCTCCTGGACTTCCATTTCC, 서열번호 163) 및 GAB4040 (GACCCAGGGAGGCGCGGGGAG; 서열번호 164)를 사용하여 사이노몰구스 DR5 유전자를 증폭시켰다. PCR 산물을 서열분석을 위해 pCR2.1 토포(Topo)(인비트로겐(Invitrogen)) 내에 클로닝하였다. 서열 분석은 인간 DR5 세포외 도메인에 대해 89% 상동성을 나타났다. 프라이머 GAB-4145 (GTGCATTCCATCACCCGACAATCCCTAGATCCC CAGCG; 서열번호 165) 및 GAB-4146 (GCGTCGACTGATTCTTTGTGGACACACTCAATGTCAC; 서열번호 166)을 사용하여, 사이노몰구스 DR5 유전자의 세포외 도메인을 인간 Fc와의 융합체로 유전자 발현 벡터내에 클로닝하였다.
목적 유전자의 발현은 MPSV 프로모터의 조절하에 일어난다. 또한, 3' 폴리아데닐화 부위 및 EBV 핵 항원(EBNA) 발현 HEK293 세포에서 플라스미드의 안정한 유지를 위한 oriP 서열이 포함된다.
항원 제조를 위해, 적절한 발현 벡터를 HEK293 EBNA 세포에 형질감염시켰다(Ca2PO4 매개 또는 PEI 의존성 형질감염). 배양 5 내지 7 일후에, 상등액을 수거하고, 단백질 A 결합(Fc 함유 항원)을 통해 또는 NI2 + 친화성 크로마토그래피(His-태그 함유 분자) 및 후속 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하였다. 필요한 경우, 단백질을 C-말단 Avi 태그에 의해 비오티닐화시켰다. 이것은, 생체내에서 birA 암호화 플라스미드의 공-형질감염/공-발현에 의해, 또는 항원의 정제후에 시험관내에서 아비디티(Avidity)로부터의 비오티닐화 키트(카탈로그 번호 BIRA)를 사용하여 수행될 수 있다. 하기의 항원들을 HEK293 EBNA에서의 일시적 유전자 발현에 의해 생성하였다:
인간 DR5에 대한 항체의 단리를 위한 항원 구축물 및 스크리닝 도구
# 항원 아미노산 포맷 공급원 등록번호
1 인간 DR5 56 - 207 ECD - Avi-his 오픈 바이오시스템즈 BC001281.1 O14763
2 인간 DR5 56 - 207 ECD - AcTev - hu Fc - Avi 위와 같음 O14763
3 인간 DR5 56 - 207 ECD - AcTev - hu Fc 놉 - Avi 위와 같음 O14763
4 뮤린 DR5 53 - 153 ECD - AcTev - hu Fc - Avi 오픈 바이오시스템즈 BC065141.1 Q9QZM4
5 사이노몰구스 DR5 58 - 185 ECD - AcTev - hu Fc - Avi 본원 및 WO 2004/
101608 A2 호에 기술됨		 서열번호 317
n.a.: 적용불가능
재조합 인간 DR4-Fc(카탈로그 번호 347-DR/CF), DcR1-Fc(카탈로그 번호 630-TR/CF), DcR2-Fc(카탈로그 번호 633-TR/CF) 및 OPG-Fc(카탈로그 번호 805-=S/CF)는 알앤디 바이오시스템즈(R&D Biosystems)에서 구입하였다.
실시예 5: 포괄적 Fab 라이브러리로부터 새로운 항 DR5 결합제 의 단리
인간 DR5에 대한 특이성을 갖는 항체를 Fab 포맷의 포괄적 파지-디스플레이 항체 라이브러리로부터 선택하였다(DP47-3). 상기 라이브러리는, 경쇄(L3)의 CDR3 및 중쇄(H3)의 CDR3에 무작위 서열 공간을 포함하는 V-도메인 쌍 Vk3_20(카파 경쇄) 및 VH3_23(중쇄)을 사용하여 인간 생식계 유전자를 기준으로 제작되었다. 라이브러리 제작은 3개 PCR-증폭 단편들의 조립에 의해, 스플라이싱에 의해, 중복 연장(overlapping extension)(SOE) PCR에 의해 수행되었다. 단편 1은 무작위 L3을 포함하는 항체 유전자의 5' 말단을 포함하고, 단편 2는 L3에서 H3까지 이어지는 중심 불변 단편인 반면, 단편 3은 무작위 H3 및 항체 유전자의 3' 부분을 포함한다. 하기의 프라이머 조합을 사용하여 DP47-3 라이브러리를 위한 상기 라이브러리 단편을 제작하였다: 단편 1(LMB3 - LibL1b_new), 단편 2(MS63 - MS64) 및 단편 3(Lib2H - fdseqlong) 각각. 라이브러리 단편들의 제조를 위한 PCR 파라미터는 94 ℃에서 5분 초기 변셩, 94 ℃에서 1분, 58 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분의 25 주기, 및 72 ℃에서 10 분동안 최종 신장이었다. 주형으로 동몰비의 3개 단편들을 사용하는 조립 PCR의 경우, 파라미터는 94 ℃에서 3분 초기 변성, 및 94 ℃에서 30 초, 58 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 2 분의 5 주기였다. 이 단계에서, 외부 프라이머를 첨가하고, 72 ℃에서 10 분동안 최종 신장에 앞서 추가로 20 주기를 수행하였다. 충분한 양의 전장 무작위 Fab 구축물의 조립 후에, 이들을 유사하게 처리된 수용체(acceptor) 파지미드 벡터와 함께 NcoI/NotI로 절단하였다. 22.8 ㎍의 Fab 라이브러리를 16.2 ㎍의 파지미드 벡터와 접합시켰다. 정제된 접합물을 68개 형질전환에 사용하여 4.2 x 1010의 최종 라이브러리 크기를 수득하였다. Fab 라이브러리를 나타내는 파지미드 입자들을 취하고 선별에 사용되도록 PEG/NaCl 정제로 정제하였다.
선별은 인간 IgG1 항체의 Fc-부분에 융합된 HEK293-발현된 단량체 또는 이량체성 인간 DR5에 대해 수행하였다. 단량체성 항원의 제조를 위해, Fc 놉-인투-홀 포맷을 2개의 상이한 CH2-CH3 쇄(이중 하나만이 N-말단 융합체로서 인간 DR5 엑토도메인을 함유한다)의 헤테로이량체화에 적용하였다. 항원들을 avi-태그에 의해 효소적으로 비오티닐화시켰다. 패닝(panning) 단계들을 하기 패턴에 따라 용액중에서 수행하였다: 1. Fc-결합제를 배제하기 위해 NUNC 맥시소프(maxisorp) 플레이트 상에 10 ㎍/ml에서 코팅된 hu IgG1을 사용하여 약 1012 파지미드 입자의 사전-제거, 2. 총 1 ml의 부피로 0.5 시간동안 100 nM 비오티닐화 인간 DR5에 대한 예비-제거 반응의 상등액으로부터의 비-Fc 결합 파지미드 입자의 결합, 3. 10 분동안 뉴트라비딘-코팅된 미세적정 플레이트 상에서의 배양에 의한 비오티닐화 hu DR5 및 부착된 특이적 결합 파지의 포획, 4. 5x 1 ml PBS/트윈(Tween)20 및 5x 1 ml PBS를 사용한 비드의 세척, 5. 10 분동안 1 ml 100 mM TEA(트라이에틸아민)의 첨가에 의한 파지 입자들의 용출 및 500 ㎕ 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)의 첨가에 의핸 중화, 6. 교차-반응성 결합제를 배제하기 위한 인간 DcR2 상의 용출 파지 입자들의 후-제거 단계, 및 7. 상등액중 파지 입자들에 의한 대수기 에스케리치아 콜라이 TG1 세포의 재-감염, 헬퍼파지 VCSM13에 의한 감염, 및 후속 선별 단계에서 사용될 파지미드 입자들의 후속 PEG/NaCl 침전. 선별은 100 nM에서 일정한 항원 농도를 사용하여 3 단계에 걸쳐 수행하였다. 단계 2에서, 뉴트라비딘-코팅된 미세적정 플레이트 상의 포획 대신, 10 분동안 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅된 자석 비드를 첨가하여 항원:파지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합제는 다음과 같이 ELISA에 의해 확인하였다: 웰 당 100 ㎕의 50 nM 비오티닐화 인간 DR5 또는 DcR2를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. 또한, 10 ㎍/ml 인간 IgG1을 NUNC 맥시소프 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 세균 상등액을 가하고 결합 Fab를, 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 그의 Flag-태그에 의해 검출하였다. 인간 DR5 상에서는 신호를 나타내지만, 인간 DcR2 및 인간 IgG1 상에서는 나타내지 않는 클론을 추가의 분석을 위해 선발후보 명단에 올렸다.
선별된 Fab 클론의 친화도(KD)는, 25 ℃에서, 뉴트라비딘 포획에 의해 NLC 칩상에 고정화된 비오티닐화 1가 또는 2가 DR5 항원을 사용하여 프로테온(ProteOn) XPR36 기기(바이오래드)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 항원(리간드)의 고정화: 재조합 항원들을 PBST(10 mM 포스페이트, 150 mM 염화나트륨, pH 7.4, 0.005% 트윈 20)를 사용하여 10 ㎍/ml로 희석한 다음, 다양한 접촉 시점에서 30 ㎕/분으로 주입하여, 수직 배향으로 200, 400 또는 800 반응 단위(RU)의 고정화 수준을 달성하였다. 분석물의 주입: 1회한(one-shot) 동적 측정을 위해, 주입 방향을 수평 배향으로 바꾸고, 정제된 Fab의 2배 연속 희석물(100 내지 3.125 nM 사이의 다양한 농도 범위)을, 120, 180 또는 200 초의 결합 시간 및 200 또는 240 초의 해리 시간하에, 별개의 채널 1 내지 5를 따라 50, 60 또는 100 ㎕/분으로 동시에 주입하였다. 완충제(PBST)를 6번째 채널을 따라 주입하여 참조를 위한 "인-라인(in-line)" 블랭크를 제공하였다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 적합화시켜 프로테온 매니저 v3.1 소프트웨어에서 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 결합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 비 koff/kon로서 산출하였다. 18 초의 접촉 시간동안 50mM NaOH를 100 ㎕/분의 유량으로 사용하여 수평 배향으로 재생을 수행하였다.
실시예 6: 선별된 DR5 결합제 는 가교결합시 세포자살을 유도할 수 있다
가교결합시에만 선별된 표적 세포의 세포자살을 유도할 수 있는 DR5 결합제를 확인하기 위해, Fab 라이브러리로부터 단리된 항체를 상응하는 hu IgG1 포맷으로 전환시켰다. 간략하게, 파지 디스플레이로부터의 46개 특징적인 DR5 결합제들의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를, 주형으로 Fab 클론을 사용한 표준 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 정제하고, 적절한 인간 불변 중쇄 또는 인간 불변 경쇄에 융합되는 적당한 발현 벡터에 삽입시켰다(제한 엔도뉴클레아제 및 리가제 기반 클로닝에 의해, 또는 인비트로겐의 인퓨젼(InFusion) 키트를 사용한 "재조합조작(recombineering)"에 의해). 상기 벡터들중 발현 카세트는 키메라 MPSV 프로모터 및 합성 폴리아데닐화 부위로 이루어진다. 또한, 플라스미드는, EBV 핵 항원(EBNA)을 갖는 HEK293 세포에서 플라스미드의 안정한 유지를 위해 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스로부터의 oriP 영역을 함유한다. 항체들을 기술된 바와 같은 HEK293 EBNA 세포에서 50 ml 규모로 일시적으로 생성하였다. 빠르고 고처리량 정제를 위해, 상등액을 중화시키고 단백질A 세파로스 패스트 플로우(ProteinA Sepharose Fast Flow) 비드(지이 헬쓰케어 카탈로그 번호 17-5138-01)와 함께 16 시간동안 배양하였다. 이어서, 상등액/비드 혼합물을 빈, 평형화된 PD-10 컬럼(지이 헬쓰케어 카탈로그 번호 17-0435-01) 위로 중력 유동에 의해 통과시켰다. 보유된 비드를 2회 세척하고 항체를 저 pH 단계하에 용출시켰다. 최종적으로, 용출된 단백질을 중화시키고, 280 nm에서의 흡광도 및 몰흡광계수를 사용하여 그 농도를 산출하였다. 항체 샘플의 응집체 함량은 조르박스(Zorbax) GF-250 컬럼(에이질런트(Agilent) 카탈로그 번호 PSMO 845006)을 사용하여 분석용 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
상기 정제 절차의 결과는 표 6에 요약되어 있다.
정제 결과 요약, 표 8의 서열번호 참조
항 DR5 mAb 역가 [ mg / ml ] 수율 [ mg / ml ] 단량체 함량 [%]
3E6 47.3 32.9 100
4C3 43.6 21.2 100
5E11 38.2 29.9 100
5F6 40.4 38.0 100
6A8 41.9 28.1 100
6F8 64.4 45.1 99
7B12 75.1 44.6 100
7H9 54.7 38.5 99
18F11 77.6 54.4 100
18F12 66.6 33.4 99
18H6 54.6 48.5 100
19F10 61.1 36.7 100
20F2 65.9 41.0 99
21C3 51.4 40.6 97
212 53.6 27.1 99
23C7 49.8 27.2 100
24B7 38.5 28.9 100
1B12 179.3 78.1 100
2C5 116.2 48.7 98
2E5 144.3 67.7 100
2F11 146.2 67.3 100
4A6 148.0 83.2 100
4F5 110.5 48.7 100
4G9 128.1 80.9 100
6F6 161.3 86.3 100
6H4 128.1 65.8 100
8D2 136.6 65.8 100
17A7 136.1 62.7 100
17H5 155.7 77.1 100
18A4 138.9 67.1 100
18A6 103.9 54.7 100
18A12 118.1 63.3 100
18E6 90.8 44.3 100
18F6 99.3 36.0 100
19C12 192.6 70.6 92
19D6 144.9 81.7 97
19G7 117.0 63.1 100
20E3 116.4 51.7 100
20F1 75.5 40.7 100
21H3 127.1 45.1 98
22E6 130.9 61.2 98
22E9 137.5 60.2 100
23G10 127.9 43.5 100
6F9 96.8 48.2 100
6G7 114.7 59.3 100
17A8 102.1 60.0 100
상기 소규모 형질감염 및 생성에 이어 단백질A 비드에 의한 정제는 매우 낮은 응집체 함량을 갖는, 타당한 양의 순수한 항체를 제공하였다. 도 13(a 내지 e)에, 세포자살 검출을 위한 표준 DNA 단편화 ELISA 분석 결과가 요약되어 있다. 각각의 항체는 2가지 상이한 농도(각각 가교결합을 위한 1.0 및 0.1 ㎍/ml의 항체와 함께, 1.0 ㎍/ml: 검은색 막대 및 0.1 ㎍/ml: 빗금친 막대)로 검사하였다. 수득된 데이터는, 100%로 설정된 가교결합된 드로지투맙(1.0 ㎍/ml에서)의 최대 활성으로 표준화시켰다. 분석된 항체들의 대부분은 가교결합후 MDA-MB-231 세포에서 세포자살의 농도 의존성 유도를 유도할 수 있었다. 46개 결합제 중 7개(15.2%)는 두 농도 모두에서 명백하게 드로지투맙보다 더 높은 활성을 나타내었다. 15개 항체(32.6%)는 드로지투맙과 동일한 활성 범위였으며, 검사한 분자들 중 20개(43.5%)는 가교결합시 세포자살을 유도하였지만 드로지투맙에 비해 훨씬 더 낮은 정도였다. 나머지 4개의 결합제("20E3", "19E6", "1B12" 및 "19C12", 8.7 %)는, 2차 항 Fc 항체에 의한 가교결합 후에조차도 불활성이었으며 세포자살을 유도하지 않았다.
실시예 7: 새로운 DR5 결합제 의 특성화
세포자살 활성 스크린의 결과에 근거하여, 46개의 평가된 DR5 항체중 12개를 추가의 보다 상세한 분석 및 특성화를 위해 선택하였다. 상기 항체들은 일시적으로 형질감염된 HER293 EBNA 세포에서 재-생성하였고, 기술된 바와 같이 표준 단백질A 친화도 컬럼에 이어 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 수율 및 단량체/응집체 함량을 측정하였다(표 7). 정제된 항체들을 표적 특이성, 종 교차반응성 및 친화도에 관해 특성화하였다(표 8). 또한, 열 안정성을 DLS에 의해 분석하고, 세포자살 유도 활성을 2차 가교결합 항-인간 Fc 항체의 존재 또는 부재하에서 비교하였다.
일련의 선택되는 DR5 항체, 표 8의 서열번호 참조
항체 서열번호
VH		 서열번호
VL		 수율
[mg/L]		 단량체
[%]		 특이성 교차반응성
18F11 94 95 33.00 100.0 DR5에 특이적

DR5, DcR1, DcR2 또는 OPG에
결합하지 않음		 인간 및 사이노몰구스 원숭이 DR5

뮤린 DR5에
결합하지 않음
18H6 8.40 71.2 위와 같음 위와 같음
18E6 31.50 100.0 위와 같음 위와 같음
6H4 30.30 100.0 위와 같음 위와 같음
5F6 42.18 100.0 위와 같음 위와 같음
20F2 106 107 30.00 100.0 위와 같음 위와 같음
4G9 42.90 100.0 위와 같음 위와 같음
22E9 100 101 39.96 100.0 위와 같음 위와 같음
21H3 102 103 32.35 100.0 위와 같음 위와 같음
4F5 36.63 100.0 위와 같음 위와 같음
5E11 7 8 31.68 100.0 위와 같음 위와 같음
24B7 19.73 100.0 위와 같음 위와 같음
새로운 DR5 결합제의 특성화
항체 서열번호
VH / VL 		친화도
[ nM ] 		결합활성
[ nM ] 		응집 온도
[℃]
18F11 94/95 504 1.1 64
18H6 555 2.7 n.d.
18E6 471 2.2 66
6H4 773 8.9 65
5F6 552 1.5 66
20F2 106/107 431 4.8 66
4G9 478 6.4 65
22E9 100/101 217 1.5 64
21H3 102/103 259 1.6 64
4F5 575 4.4 n.d.
5E11 7/8 162 1.1 65
24B7 300 2.3 65
모든 분석된 항체들은 인간 DR5를 특이적으로 인식하며, DR4, 유인 수용체(DcR1 및 DcR2) 및 오스테오프로테게린(OPG)과 같은 TNFR 상과로부터 가장 근접한 인간 동족체에는 결합하지 않는다. 모든 DR5 항체는 인간 및 사이노몰구스 DR5와 교차반응하지만, 뮤린 대응물(이것은 단지 약 30%의 서열 상동성으로 인해 기대되지 않음)은 인식하지 않는다. 인간 DR5에 대한 친화도는 매우 광범위하지만(162로부터 773 nM까지), 모든 측정된 결합활성은 낮은(한자리수) 나노몰 범위이다. 모든 검사된 DR5 결합제들은 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 실험으로 측정시 60 ℃보다 훨씬 높은 응집 온도하에 높은 열 안정성을 나타낸다.
일련의 선별된 DR5 결합제의 기능 활성을 측정하기 위해, DNA 단편화를 특이적으로 검출하는 세포 사멸 검출 ELISA 분석법(로슈(Roche); #11 774 425 001)을 이용하여 세포자살 유도를 분석하였다. 항체들은, 가교결합을 위한 동일 농도의 2차 항 인간 Fc 항체의 존재하에 1.0 및 0.1 ㎍/ml의 농도에서 사용되었다. 비교를 위해, 선택되는 DR5 결합제들의 활성이 가교결합에 의존하는지 또는 이들이 이미 그 자체로 활성인지를 평가하기 위해 항체들을 2차 항체의 부재하에서 1.0 ㎍/ml에서 사용하였다. 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231을 표적 세포주로 사용하였다. 도 14에는 상이한 DR5 결합제들의 세포자살 유도 결과가 요약되어 있다. 가교결합 후에 새로 단리된 DR5 항체들 모두 대조군 항체 드로지투맙과 동일한 범위로 세포자살을 유도한다. 그러나, 가교결합없이 이미 상당한 세포자살 유도 활성을 나타내는 드로지투맙과 달리, 새로운 DR5 결합제의 활성은 엄격하게 2차 항체에 의한 가교결합에 의존한다. 세포자살 활성은, 인간 DR5에 대한 최고 및 최저 친화도 둘 다를 갖는 항체에 대해 유사하였기 때문에, 그 표적에 대한 DR5 결합제의 친화도와 상관되는 것으로 보이지 않는다.
2가지 또 다른 분석법을 이용하여, 선택되는 DR5 결합제들의 활성을 평가하였다: 가교결합된 항체로 처리시 증식의 억제를 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 분석법(프로메가(Promega) #TB288)으로 측정하였다. 또한, 카스파제 8의 유도를 카스파제8-글로(Caspase8-Glo) 분석법(프로메가 #G8202)에 의해 측정하였다. 도 15는 3개의 상이한 종양 세포주들의 2차 항 Fc 항체에 의해 가교결합된 DR5 결합제의 7 nM 농도에서 증식의 최대 억제를 보여준다. 인간 대장 선암 세포주 DLD-1(검은색 막대)에 대한 효과를 대세포 폐암 세포주 HCI-H460(빗금친 막대) 및 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(흰색 막대)와 비교하였다. 3개 세포주 모두에서 상당한 증식 억제가 검출될 수 있었다. 7 nM에서 DLD-1의 증식 억제는 DR5 항체의 친화도와 상관되는 것으로 보이지만, NCI-H460에서는 그렇지 않으며 MDA-MB-231에서는 어느 정도로만 그러하다.
셀타이터-글로 분석법을 이용한 증식 억제에 대해 산출된 IC50 값
항체 서열번호
VH / VL 		DLD-1 NCI-H460 MDA-MB-231
5E11 7/8 0.50 3.91 > 7.00
22E9 100/101 0.56 4.00 > 7.00
21H3 102/103 1.57 6.20 > 7.00
24B7 1.86 5.00 > 7.00
20F2 106/107 2.01 6.53 > 7.00
4G9 4.30 > 7.00 > 7.00
18E6 4.62 6.89 > 7.00
5F6 6.39 > 7.00 > 7.00
18F11 94/95 > 7.00 > 7.00 > 7.00
4F5 > 7.00 > 7.00 > 7.00
6H4 > 7.00 > 7.00 > 7.00
도 16은 항 Fc 가교결합된 DR5 항체로 처리시 카스파제 8 활성화 결과를 요약한 것이다. 3개의 상이한 종양 세포주(DLD-1, 검은색 막대; NCI-H460, 빗금친 막대; 및 MDA-MB-231, 흰색 막대)에서 최대 카스파제 8 활성화가 7 nM의 농도에서 나타났다. 모든 항체들의 경우에서, 3개 세포주 모두에서 높은 수준의 카스파제 8 활성화가 검출될 수 있었다. 카스파제 8의 유도는 상이한 세포주들에 대해 동일한 범위였지만, 카스파제 8 유도 수준과 항체의 친화도와의 상관관계는 증식 억제에 대한 셀타이터-글로 분석법에서 보인것 만큼 현저하지 않았다.
카스파제 8-글로 분석법을 이용한 카스파제 8의 유도에 대해 산출된 EC50 값
항체 서열번호
VH / VL 		DLD-1 NCI-H460 MDA-MB-231
5E11 7/8 0.13 0.03 0.14
22E9 100/101 0.15 0.05 0.24
21H3 102/103 0.20 0.09 0.31
24B7 0.21 0.09 0.26
20F2 106/107 0.31 0.13 0.33
4G9 0.48 0.38 1.04
18E6 0.33 0.13 0.35
5F6 0.76 0.28 1.00
18F11 94/95 0.36 0.37 0.43
4F5 0.49 0.16 0.89
6H4 1.84 0.70 0.99
실시예 8: 에피토프 분석
새로 단리된 DR5 결합제에 의해 인식되는 에피토프의 종류 및 상대적 편재화를 더 상세히 특성화하기 위해, 정제된 IgG를 가지고 웨스턴/점 블롯(Western/Dot Blot) 분석법 및 비아코어 측정을 수행하였다. 웨스턴 블롯 대 점 블롯 결과의 비교는 항체가 선형 또는 입체형태적 에피토프를 인식하는지를 보여주지만, 비아코어 경쟁 실험은 상이하거나, 동일하거나 부분적으로 중첩되는 에피토프를 시사한다.
선형 또는 입체형태적 에피토프를 식별하기 위해, 인간 DR5를 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막 위에 블로팅하고, 상이한 DR5 결합제들과 함께 배양하고, 2차 항-huFc-HRP 항체(시그마 A0170)를 사용하여 검출하였다. 동시에, 인간 DR5를 막 위에 스포팅(spotting)하고, DR5 항체를 가하고, 동일한 2차 항체로 검출하였다. 점 블롯 실험에서만 항원의 결합이 입체형태적 에피토프를 시사하는데 그 이유는 상기 설정에서 항원이 그의 천연적인 3차원 입체형태로 분석되기 때문인 반면, 웨스턴 블롯 실험에서는 항원이 변성되었으며, 선형 에피토프만 접근가능해야 하기 때문이다.
웨스턴/점 블롯 분석의 결과 요약
항 DR5 mAb 서열번호
VH / VL 		웨스턴 블롯에서의
신호		 점 블롯에서의
신호
4G9 + +++
6H4 + ++
5F6 +++ +++
18F11 94/95 ++ +++
18H6 ++ +++
20F2 106/107 + +++
18E6 + +++
22E9 100/101 - ++
21H3 102/103 - +++
4F5 - ++
5E11 7/8 - +++
24B7 +++ +++
상기 결과에 근거하여, 분석된 항체들의 대부분은 hu DR5 상의 입체형태적 에피토프를 인식하지만, 2개의 항체(5F6, 24B7) 만이 웨스턴 블롯 분석에서 변성된 항원에 분명하게 결합하여 선형 에피토프에 대한 결합을 시사한다고 결론지을 수 있었다. 점 블롯에서의 강한 결합 및 웨스턴 블롯에서의 약한 결합은 또한 입체형태적 에피토프를 시사하지만, 이것은 아마도 인식되는 선형 신장서열(stretch)을 함유할 것이다(18F11, 18H6).
표면 플라즈몬 공명(SPR, 비아코어)에 의한 결합 경쟁 분석법을 2가지 상이한 설정으로 수행하였다. 전형적인 샌드위치 분석법에서는, 제 1 DR5 결합제를 칩 상에 고정화시킨 후 hu DR5를 첨가하고 결합시켰다. 이어서, 제 2의 DR5 항체를 주입하고 DR5에 대한 추가의 결합에 대해 분석하였다. 탠덤(tandem) 분석법에서는, hu DR5를 칩 상에 고정화시킨 후 제 2 DR5 결합제를 가하였다. 이어서, 제 2의 DR5 결합제를 주입하고 추가의 결합을 분석하였다. 도 17은 상기 결합 경쟁 분석법들의 결과를 요약한 것이다(4개의 새로운 DR5 항체와 드로지투맙의 비교). 상기 경쟁 분석법들로부터, 클론 5E11, 22E9 및 174(VH 서열번호 88, VL 서열번호 89, 예를 들면, 실시예 26 참조)는 아마도 공통 에피토프를 공유하는데, 그 이유는 이들 중 하나가 DR5에 결합하면 다른 2개중 어느 것도 항원에 결합할 수 없었기 때문인 것으로 결론지을 수 있었다. 상기 3개의 항체들은 명확하게 드로지투맙과 상이한 에피토프를 인식한다. 클론 422(VH 서열번호 82, VL 서열번호 85, 예를 들면, 실시예 26 참조)의 결합 부위는 5E11, 22E9 및 드로지투맙의 에피토프와 중첩될 수 있으나, 분명히 클론 174로부터의 에피토프와는 중첩되지 않는다. 인식되는 에피토프의 문제에 대한 분명한 대답은 동시-결정화 실험(DR5 + mAb) 후 구조 분석으로부터 얻어질 수 있다.
DR5 항체가 DR5 리간드 결합 부위와 유사하거나 그와 중첩되는 에피토프를 인식하는지를 평가하기 위해, 비아코어의 TRAIL 경쟁 분석법을 구성하였다. 이를 위해, 재조합 hu TRAIL(프레프로테크(Preprotech) No 310-04)을 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 인간 DR5-Fc 및 DR5 결합제로 이루어진 미리형성된 복합체를 분석물로 사용하였으며, 고정화된 TRAIL에 대한 결합을 측정하였다. 도 18에는 TRAIL 경쟁 실험의 결과가 나와 있다. 클론 422(도 18B에서 점선)를 제외하고, 검사된 복합체들중 어느 것도 고정화된 hu TRAIL(모두 실선)에 결합할 수 없기 때문에, 모든 새로 단리된 DR5 결합제들은 DR5 상의 TRAIL 결합 부위와 적어도 중첩되는 에피토프에 결합하는 것으로 보인다. 그와 대조적으로, DR5 단독(파선) 또는 DR5와 대조군 항체와의 복합체(짧은 파선)는 고정화된 리간드에 대한 분명한 결합을 나타내었다.
실시예 9: 비- 리간드 경쟁 DR5 항체는 리간드 경쟁 결합제 에 비해 TRAIL 의 존재하에서 증가된 시험관내 세포자살 활성을 나타낸다
새로운 DR5 결합제의 단리 및 스크리닝시, 인간 DR5 상의 상이한 에피토프들을 인식하는 항체들을 단리하였다. 항체를 분류하기 위한 한가지 가능한 기준은 이들을 리간드 차단 및 리간드 비-차단 분자로 나누는 것이다. 선택되는 결합제들 중에서, 상기 군들 각각에 대한 1개의 대표물을 선택하였다: 클론 5E11은 DR5에 대한 TRAIL 결합을 차단하는 것으로 확인되었지만, 클론 422는 리간드 비-차단 항체이다(도 18).
TRAIL 결합부와 적어도 중첩되는 에피토프에 대한 결합의 영향을 평가하기 위해, 상기 2개 후보를, 인간 TRAIL의 존재 또는 부재하에서 2차 항 Fc 항체와 가교결합후 DLD-1 CRC 표적 세포의 증식 억제에 대해 분석하였다. 웰 당 4000개 DLD-1 표적 세포를 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 가교결합된 항체를 첨가하였다: TRAIL을 차단하지 않는 항체 5E11, 422, 및 대조군 항체를 6개의 상이한 농도(6.67 nM로부터 출발하여 2.5배 희석 단계로 0.068 nM까지)로 사용하였다. 가교결합은 동몰 농도의 항 Fc 2차 항체를 첨가하여 달성하였다. TRAIL은 10, 4, 1.6, 0.64, 0.256 및 0.102 nM의 농도로 각각의 항체 농축물에 가하였다. 48 시간 배양 후에, 셀 타이터글로 시약을 첨가하였다. 상기 성장 억제 분석법의 결과는 도 19에 나타내었다. 비-리간드 차단 항체인 클론 422는, TRAIL 결합 부위 중첩 에피토프에 결합하는 클론 5E11에 비해 인간 TRAIL의 첨가시 상당히 증가된 항 증식성 활성을 나타내었음이 입증되었다. 가교결합된 5E11 항체의 첨가는 TRAIL 단독에 의한 성장 억제에 부가적인 효과를 갖지 않았다. 대조적으로, 인간 TRAIL과 함께 가교결합된 클론 422를 사용한 것은 활성에 상당한 부가적인 효과를 나타내었다.
DR5 상에서의 TRAIL 결합을 차단하지 않는 것으로 알려진 적절한 대조군 항체에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 시험관내 분석에서 관찰된 상기 효과가 생체내 설정으로 옮겨질 수 있는 지는 평가되어야 한다.
실시예 10: 이중특이성 2+2 포맷에서의 전환
새로운 DR5 결합제가 DR5의 과-가교결합에 의한 종양 세포의 세포자살의 표적화된 유도를 위한 이중특이성 항체의 제조에 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 일련의 DR5 항체들을 4가 이중특이성 분자들로 전환시켰다. 이들 이중특이성 항체는 DR5 및 FAP(섬유아세포 활성화 단백질) 각각에 대해 2개의 결합 잔기를 함유한다. 상이한, 선택되는 DR5 항체를, 단리된 고 친화성, 인간/뮤린/사이노몰구스 원숭이(hu/mu/cy) 교차반응성 FAP 결합제인 FAP 항체 28H1과 결합시키고, 파지 디스플레이에 의해 친화도를 증진시켰다. 사용된 2+2 포맷에서, 28H1 크로스Fab 도메인(VHCL)을, (G4S)4 연결자를 사용하여 항 DR5 중쇄의 C-말단에 융합시켰다. 2+2 포맷의 도식적인 구조는 도 28에 나타내었다. 다음은 2+2 포맷의 이중특이성 항체의 대표적인 쇄들이다.
[표 12a]
이중특이성, 4가 DR5 - FAP 크로스Mab 분자(모두 (G4S)4 연결자를 사용하여 항 DR5 중쇄의 C-말단에 융합된 28H1 크로스Fab 도메인(VHCL)을 가짐, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)
Figure pct00003
[표 12b]
이중특이성, 4가 DR5-FAP 크로스Mab 분자의 생성 데이터
Figure pct00004
모든 DR5-FAP 이중특이성 분자는 일시적으로 형질감염된 HER293 EBNA 세포에서 생성되었으며, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수득된 생성 수율은 타당한 범위(약 20 mg/L)이었다. 최종 정제 단계후 단량체 함량은 모든 분자에 있어서 96%보다 높았다.
표면 플라즈몬 공명(비아코어)에 의한 표적 결합 분석은 2+2 포맷의 모든 선택되는 이중특이성 항체가 도 42에 도시된 바와 같이 재조합 DR5 및 FAP(인간 및 뮤린)에 동시에 결합할 수 있음을 나타내었다.
DR5-FAP 이중특이성 분자가 MDA-MB-231 표적 세포주의 세포자살을 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, 이어서 첨가되는 이중특이성 항체에 의한 표적 세포 상에서의 DR5의 가교결합을 위해 96 웰 플레이트를 재조합 인간 FAP로 코팅하였다. 표적 세포(MDA-MB 231)의 첨가 및 24 시간동안 배양 후에, 세포자살 유도를 표준 DNA 단편화 ELISA 분석법으로 측정하였다. 도 20은 2개의 상이한 농도(7.0 nM 및 0.7 nM)에서, 드로지투맙과 비교한, 새로 단리된 DR5 결합제 및 C-말단에 융합된 28H1 FAP 크로스Fab를 함유하는 7개의 이중특이성 항체의 세포자살 유도의 비교를 나타낸 것이다. 모든 분자들은 FAP의 존재 및 부재하에서 검사하였다. 예상된 바와 같이, 고농도에서 드로지투맙 기반 이중특이성 분자는 이미 가교결합 FAP의 부재하에서도 상당한 정도로 세포자살을 유도하였다. 대조적으로, 새로운 DR5 결합제만을 사용한 DR5-FAP 이중특이성 분자는 플레이트 상에 코팅된 FAP의 존재하에서만 세포자살 유도를 나타내어, 상기 활성이 재조합 FAP에 의한 가교결합에 의존성임을 시사하였다.
이중특이성 분자가 또한 DR5보다 상이한 세포주 상에서 발현된 FAP에 의해 효과적으로 가교결합됨으로써 세포자살을 유도할 수 있는지를 측정하기 위해, 소위 방관자 공-배양 분석법을 구성하였다. 도 21은, 3가지 상이한 농도의 이중특이성 분자(7.0, 0.7 및 0.07 nM)와의 종양 세포주(MDA-MB-231) 및 FAP 발현 섬유아세포(GM05389) 공-배양 실험에서의 세포자살 유도의 결과를 나타낸 것이다. 각각 28H1 FAP 크로스Fab에 융합된 5E11, 22E9 및 20F2로부터의 DR5 결합 잔기를 함유하는 3개의 이중특이성 구축물은, 상응하는 항 Fc 가교결합된 IgG 분자에서 또한 관찰된 바와 같은 필적하는 정도의 세포자살 유도를 나타낸다. 그와 대조적으로, DR5 결합 부분으로서 6H4를 함유하는 분자는 가교결합된 IgG에 비해 감소된 활성을 나타내었다. 검사된 분자들(18H6 - 28H1)중 하나는 모든 농도에서 완전히 불활성이어서(가교결합된 IgG와 대조적으로), 모든 DR5 결합제가 종양 세포 상의 DR5를 과-가교결합시키는 이중특이성 분자의 제조에 적합한 것은 아님을 시사하였다. 그러므로, 세포자살의 표적화 유도의 접근방법에 있어서 올바른 DR5 항체를 선택하기 위해 에피토프 및 이중특이성 항체의 주의깊은 평가가 필요하다. 이와 관련하여, DR5에 대한 오히려 낮은 친화도 및 2+2 포맷의 높은 결합활성을 나타내는 DR5 결합제가 특히 유리하다. DR5에 대한 낮은 친화도는 정상 세포에 대한 이중특이성 항체의 결합을 방해하고, 따라서 종양 세포에서 FAP 의존성 방식으로 세포자살을 유도하기 위한 선택성을 증가시킨다. 상기 특성을 갖는 1개의 결합제는, 예를 들면, DR5 결합제 5E11이다.
기술된 바와 같이, 이중특이성 포맷으로의 그의 사용을 제한하는 드로지투맙의 단점들 중 하나는, 상기 항체가 제 2의 결합 잔기의 N-말단 융합을 허용하지 않는다는 사실이다. 상기 배열형태는 드로지투맙의 N-말단의 차단을 야기하고, 이것은 DR5에 대한 적절한 결합을 억제함으로써 세포자살의 유도를 방해한다. 새로 단리된 DR5 항체가 상기 유형의 포맷에 사용될 수 있는지를 검사하기 위해, 선택되는 DR5 결합제의 Fab가 (G4S)4 연결자에 의해 인간 Fc 영역에 C-말단에 융합된 Fc-융합 분자를 제조하였다. 상기 분자들은 HER293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되고, 단백질 A 비드를 통해 정제되고, 세포자살 유도 분석법에서 검사되었다. 도 22a에는, 2차 항 Fc IgG와의 가교결합후 상기 Fc-DR5 융합 분자들을 사용한 MDA-MB-231 세포에서의 DNA 단편화 분석법의 결과가 요약되어 있다. 모든 검사한 분자들은 표적 세포주의 세포자살을 유도할 수 있어서, 선택되는 DR5 결합제들이 N-말단에 차단되지 않고, 이에 의해 상기 결합제들에 사용될 수 있는 보다 광범위한 포맷을 확대시킴을 시사한다.
실시예 11: 파지 디스플레이 유도된 DR5 결합제 를 함유하는 2+2 이중특이 성 포맷의 열 안정성의 특성화
2+2 이중특이성 포맷으로 전환된 파지 디스플레이 유도된 DR5 결합제의 열 안정성을, 산란된 광 강도의 변화로서, 옵팀(Optim) 1000 시스템(아박타 그룹(Avacta Group) plc)을 사용하여 측정하였다. 마이크로 큐벳 어레이(micro cuvette array)에서, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl (pH 6.0) 중 9 ㎕의 샘플을 1 mg/ml의 농도에서 0.1 ℃/분의 속도로 25 ℃에서 90 ℃로 가열하였다. 산란된 광 강도(266 nm 레이저)를 0.4 ℃마다 기록하고, 소프트웨어 이고르프로(IgorPro), 버전 6.23(아박타 그룹 plc)으로 처리하였다. 응집 개시 온도는 산란 강도가 증가하기 시작하는 온도로 정의된다.
이중특이성 구축물의 열 안정성에 대한 척도로서 파지 디스플레이 유도된 DR5 결합제를 함유하는 이중특이성 항체(2+2 포맷)의 응집 개시 온도
TheraPS 명칭
이중특이성 항체		 별칭
이중특이성 항체		 서열번호 옵팀1000
Tagg (℃)
DR5TAA-0030 5E11-28H1 131,132,124 64
DR5TAA-0037 22E9_28H1 124,125,126 63
DR5TAA-0038 21H3_28H1 127,128,124 63
DR5TAA-0039 20F2_28H1 129,130,124 64
모든 검사한 DR5 항체들은 또한 2+2 이중특이성 구축물내에 클로닝될 때 60 ℃보다 매우 높은 응집 온도하에 높은 열 안정성을 나타내었다.
실시예 12: DR5 - FAP 이중특이성 항체는 상이한 표적 세포 상에서 세포자살을 유도할 수 있다
FAP 28H1 크로스Fab 잔기에 융합된 새로 단리된 DR5 결합제를 포함하는 2+2 포맷의 9개 DR5-FAP 이중특이성 항체(파지 디스플레이에 의해 단리된 4개, 실시예 22 내지 25에 기술된 바와 같은 토끼 면역화로부터 유도된 5개)를, GM05389 인간 FAP+ 섬유아세포를 사용한 공-배양 분석법에서 2개의 상이한 세포주(MDA-MB-231 및 G401) 상에서의 세포자살 유도에 대해 사이드-바이-사이드(side-by-side) 실험에서 비교하였다. 이중특이성 항체는 0.0007 내지 7 nM의 농도 범위에 걸쳐 검사하였다. DNA 단편화 분석법의 결과는 도 23(MDA-MB-231) 및 도 24(G401)에 요약되어 있다. 검사한 모든 이중특이성 항체들은 두 세포주 모두에서 우수한 세포자살 유도 활성을 나타내었다. MDA-MB-231 세포의 경우에서 수득된 결과에 따라서, 항체들을 2개의 군으로 분류할 수 있었다. 토끼 면역화로부터 수득된 1개는 0.7 nM의 농도에서 최대 세포자살 유도를 나타내었고, 항체 농도를 더 증가시킴에 따라 활성은 약간 감소하였다. 대조적으로, 이중특이성 2+2 포맷의 파지 디스플레이 유도된 결합제는 고농도에서 활성의 감소를 나타내지 않고, 일정하게 유지되거나 최고 농도까지 훨씬 더 증가되었다. 이중특이성 항체의 두 세트 모두에 있어서 GM05389 섬유아세포와의 공-배양에 G401 세포를 사용한 실험에서, 세포자살 유도의 최대값은 0.07 nM의 농도에서 이미 달성되었으며, 이어서 일정하게 유지되었다. 상기 설정에서, 모든 분자들은 세포자살 유도 수준의 측면에서 유사하게 수행되었다.
실시예 13: 상이한 이중특이성 포맷들의 비교
2+2 크로스Fab 포맷의 DR5-FAP 이중특이성 분자들은 매우 우수한 질로 잘 생성되며 2개 세포주 공-배양 설정에서 세포자살의 농도-의존성 특이적 유도를 매개할 수 있음이 입증되었다. 상기 이중특이성 분자들의 세포자살 유도 정도는, 2차 항 Fc 항체에 의해 과-가교결합된 상응하는 DR5 결합제들에서 관찰된 바와 동일한 범위이다. 추가의 상이한 DR5-FAP 이중특이성 분자들을 그의 세포자살 유도 능력에 대해 평가하기 위해, 도 25에 나타낸 바와 같이 DR5 및 FAP 결합제들을 상이한 포맷으로 및 상이한 결합가하에 결합시킨 하기의 구축물들을 제조하였다.
대안적인 DR5-FAP 이중특이성 포맷에 대한 설명
설명 결합가 DR5 FAP
1 DR5 중쇄(놉)의 C-말단에 크로스Fab(VHCL)로서 FAP 결합제의 융합. B24_E11A_001

DR5(5E11)-28H1Fc 놉 VHCL 2+1 (서열번호 142)
DR5(5E11) Fc 홀 (서열번호 143)
FAP(28H1) VLCH1 (서열번호 124)
DR5(5E11) LC (서열번호 132)

주: 놉-인투-홀; (G4S)4 연결자, 도 25A		 2+1 5E11 28H1
2 Fc-홀 상의 FAP 크로스Fab(VHCL). Fc-놉에 융합된 DR5 Fab(머리-꼬리). B24_E11E_001

DR5(5E11)_Fc 놉 Fab-Fab 머리-꼬리 2+1 (서열번호 145)
FAP(28H1)_Fc 홀VHCL (서열번호 146)
FAP(28H1) VLCH1 (서열번호 124)
DR5(5E11) LC (서열번호 132)

주: 놉-인투-홀;(G4S)2 연결자, 도 25B		 2+1 5E11 28H1
3 DR5 Fc-홀의 C-말단에 융합된 FAP 크로스Fab(VHCL). DR5 Fc-놉의 C-말단에 융합된 DR5 Fab. B24_E11A_002

DR5(5E11)-28H1 Fc 놉VHCL 3+1 (서열번호 143)
DR5(5E11)-DR5(5E11) Fc 홀 3+1 (서열번호 144)
FAP(28H1) VLCH1 (서열번호 124)
DR5(5E11) LC (서열번호 132)

주: 놉-인투-홀; (G4S)4 연결자, 도 25C		 3+1 5E11 28H1
4 DR5 중쇄(놉)의 C-말단에 크로스Fab(VHCL)로서 FAP 결합제의 융합. B16_E11A_001

DR5(18F11)-28H1Fc 놉VHCL 2+1 (서열번호 147)
DR5(18F11) Fc 홀 (서열번호 148)
FAP(28H1) VLCH1 (서열번호 124)
DR5(18F11) LC (서열번호 141)

주: 놉-인투-홀; (G4S)4 연결자, 도 25A		 2+1 18F11 28H1
5 DR5 Fc-홀의 C-말단에 융합된 FAP 크로스Fab(VHCL). DR5 Fc-놉의 C-말단에 융합된 DR5. B16_E11A_002

DR5(18F11)-28H1VHCLFc 놉 3+1 (서열번호 149)
DR5(18F11)-DR5(18F11) Fc 홀 (서열번호 150)
FAP(28H1) VLCH1 (서열번호 124)
DR5(18F11) LC (서열번호 141)

주: 놉-인투-홀; (G4S)4 연결자, 도 25C		 3+1 18F11 28H1
모든 분자들은 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되었으며, 표준 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피 프로토콜에 따라 정제되었다. 부산물 프로필 및 분자의 질은 SDS-PAGE, SEC 및 캘리퍼 분석에 의해 분석하였다.
또 다른 이중특이성 DR5-FAP 분자의 제조 결과 요약
구축물 설명 수율
[mg/ml]		 응집체
[%]		 단량체
[%]		 저분자량종
[%]
1 B24_E11E_001
 5E11_28H1;
Fc-놉상의 2+1 C-말단		 5.42 1.55 95.2 3.25
2 B24_E11A_001
 5E11_28H1;
Fc-놉상의 머리-꼬리		 5.99 0.74 98.08 0.74
3 B24_E11A_002
 5E11_28H1;
Fc-놉상의 3+1 C-말단		 5.39 1.80 98.20 0.00
4 B16_E11A_001 5E11_28H1;
Fc-놉상의 2+1 C-말단		 18.34 1.50 98.50 0.00
5 B16_E11A_002 5E11_28H1;
Fc-놉상의 3+1 C-말단		 3.32 0.90 99.10 0.00
표 15에 요약된 바와 같이, 상기 추가의 포맷들은 2+2 포맷에 비해 제조 및 정제하기에 더 어려운 것으로 보인다. 1개(B16_E11A_001)를 제외하고, 모두 유사한 2+2 분자와 같이 더 낮은 발현 수율을 나타낸다. 그러나, 응집체 함량은 오히려 낮았지만(<2%), 대부분의 경우에서 분자의 정제 또는 분해에 기인할 수 있는 더 낮은 분자량 종이 또한 검출될 수 있었다.
MDA-MB-231 상에서의 세포자살 유도 활성을 상이한 농도(7.0, 0.7 및 0.07 nM)에서 섬유아세포 공-배양 분석법(DNA 단편화)으로 검사하였다. 도 26은 2+2 포맷의 이중특이성 드로지투맙에 비해 3개의 상이한 포맷(2+2, 2+1 및 3+1)의 세포자살 활성 결과를 나타낸다. 상기 설정에서, 2+2 포맷의 5E11-28H1 이중특이성 분자는 전체적으로 드로지투맙 대조군에 비해 유사한 활성을 나타내었다. 최저 농도에서, 2+2 포맷의 5E11-28H1 이중특이성 분자는 드로지투맙 대조군에 비해 훨씬 더 높은 활성을 나타내었다. 대조적으로, 2+1 및 3+1 포맷은 2+2 포맷(드로지투맙 및 5E11) 둘 다에 비해 덜 활성인 것으로 보였다. 동일한 포맷을 상이한 DR5 결합제(18F11)를 사용하여 분석한 경우, 3개 분자 모두 드로지투맙 이중특이성 항체에 비해 감소된 세포자살 유도 활성을 나타내었다. 그러나, 18F11 이중특이성 분자에 있어서, 최대 세포자살 유도는 더 낮은 농도(0.07 nM)에서 일어난 반면, 드로지투맙 기반 분자는 농도 증가에 따라 더 높은 활성을 나타내었다.
분자들의 두번째 세트로, 추가의 2+1 포맷을, 2개의 DR5 결합 잔기가 Fc-놉 부분에 머리-꼬리로 융합되지만 FAP 표적화 Fab는 Fc-홀 대응물과 결합된 5E11-28H1 이중특이성 항체에 대해 평가하였다. 4개의 포맷 모두, GM05389 섬유아세포와의 공-배양에서 MDA-MB-231의 세포자살 유도에 대한 DNA 단편화 분석법에서 광범위한 농도(7.0에서 0.0007 nM까지의 범위)에 걸쳐 비교하였다. 2+1 분자는 둘 다 0.7 nM의 농도에서 최고 세포자살 활성을 나타낸 반면, 3+1 분자는 10배 더 낮은 농도에서 이미 최대 세포자살 유도를 나타내었다. 그러나, 새로운 포맷들 중 어느것도 통상적인 2+2 포맷에 비해 우수한 것으로 보이지 않았다.
실시예 14: 공-배양 분석 시스템에서 1+1 이중특이성 포맷의 기능 활성 검사
실시예 12에서 기술된 상이한 포맷 및 결합가 변이체 이외에, 비-교차 Fab에 DR5 결합제 0011(= 클론 174) 및 교차 Fab에 FAP 결합제 4B9를 갖는 1+1 포맷(도 25D에 도시된 바와 같음)의 또 다른 구축물을 제작하였다(서열번호 280 내지 282). 1+1 포맷의 기능 활성을, 2+2 포맷(도 28A에 도시된 바와 같음, DR5 결합제로서 0011 및 FAP 결합제로서 28H1을 함유; 서열번호 287 내지 289) 및 2차 가교결합의 존재 또는 부재하의 0011의 키메라 IgG(서열번호 90 내지 93)와 비교하였다.
세포자살 유도는, 종양 세포(MDA-MB-231) 및 섬유아세포(GM05389)로 이루어진 공-배양 시스템에서 가교결합 2차 항체의 존재 또는 부재하에서 항-DR5 및 항-DR5-FAP 이중특이성 항체들로 세포의 처리시 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE, 로슈 #11 774 425 001)로 측정하였다.
제 1 일: 세포의 제조. 부착성 MDA-MB-231 세포주(인간 유방암)는 10% 소 태아 혈청(깁코(Gibco)) 및 2mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 DMEM 배지(PAN)에서 성장하였으며, 정상적으로 1주에 2회 1:20으로 분열되었다. GM05389 섬유아세포는 15% 소 태아 혈청(깁코), 1x NEAS(PAN) 및 2mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 MEM + 얼(Earle) 배지(깁코)에서 성장하였으며, 정상적으로 1주에 2회 1:3으로 분열되었다. 공-배양 분석을 위해, 섬유아세포를 제 1 일에 1x104 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였으며, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 종양 세포 및 항체를 제 2 일에 첨가하였다.
단일배양 분석을 위해, 세포주를 상이한 플레이트에 동일 밀도로 접종하고, 밤새 배양하고, 다음날 항체로 처리하였다.
제 2 일: 세포자살의 유도. 배지를 흡인하고 항체(항-DR5 IgG 또는 항-DR5-FAP 이중특이성 항체)를 상이한 최종 농도(도면 참조)에서 단독으로 또는 가교결합 항체(염소 항-인간 IgG, 시그마 #I2136)과 함께 100 ㎕ 배지 중에 1:1 비로 세포에 첨가하였다.
공-배양 분석을 위해, 종양 세포를 항체가 100 ㎕의 최종 부피에 도달한 후 섬유아세포 상에 즉시 첨가하였다(1x104 세포/100 ㎕/웰).
배양물은 37 ℃에서 24 시간동안 배양하였다.
제 3 일: 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE). 면역분석법을 약간 변화시켜 제조사의 지시(로슈)에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포를 RT에서 100 ㎕/웰 2x-용해 완충제로 15 분동안 용해시켰다. 항-히스톤 및 항-DNA 항체로 이루어진 마스터 혼합물을 제조사의 지시에 따라 제조하고, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(로슈) 상에서 1:4 희석 용해물과 혼합하였다. RT에서 2시간 배양후, 웰을 세척하고, ABTS 기질을 첨가하고, 광도측정 분석에 충분한 색이 발색될 때까지(10 내지 30 분) RT에서 배양하였다. 테칸 스펙트라 레인보우 판독기(Tecan Spectra Rainbow Reader)로 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
결과는 도 46 및 47에 나타내었다.
단일특이성 항-DR5 항체(키메라 0011 및 드로지투맙 둘 다)가 그 자체로는 유의적 세포자살을 유도하지는 않았지만, 2차 항체에 의한 세포 표면상에서의 DR5 분자의 과군집화는 약 0.7 mM 농도에서 세포 사멸을 야기하였다. 그러나, 가장 우수한 세포자살 유도는, 항-DR5-FAP 이중특이성 항체(포맷 1+1 또는 2+2)가 공-배양물에 첨가되어 섬유아세포의 표면에 존재하는 FAP에 결합하는 제 2 잔기에 의해 종양 세포 상에 DR5 과군집화를 야기했을 때 달성되었다(도 46).
단일특이성 항-DR5 항체는 가교결합시 MDA-MB-231 세포의 세포자살을 유도하였지만, DR5 및 FAP에 대한 이중특이성 분자는 DR5-발현 종양 세포 및 FAP-발현 종양 결합된 섬유아세포의 존재하에서만 기능성이었다. 또한, 상기 분자들 중 어느 것도 섬유아세포의 생존율에 어떤 영향도 나타내지 않았다(내부 분석용 양성 대조군과 비교한 상대적 세포자살, 도 47 참조).
상기 활성 데이터는, FAP 특이적 세포자살 유도가 또한 2+2 포맷에서와 같은 필적하는 효능에서 각 표적에 대한 1개의 결합가를 갖는 1+1 포맷의 DR5-FAP 이중특이성 항체에 의해 달성될 수 있음을 보여준다.
실시예 15: 포괄적 플랫폼 기술로서 2+2 이중특이성 포맷
28H1 VHCL이 5E11 중쇄의 C-말단에 융합된 2+2 포맷의 이중특이성 DR5-FAP 크로스Fab 분자는 매우 우수한 포맷인 것으로 입증되엇다. 타당한 생성물 역가에서 생성가능한 것으로 입증된 상이한 DR5 결합제들의 경우, 상기 결합제는 안정하고, 단지 소량의 소실 또는 쌍을 잘못 이룬 경쇄를 나타내고, 재현가능하게 우수한 활성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 포맷 플랫폼을 확대시키기 위해, 종류 및 교차점의 위치가 상이한 추가의 이중특이성 5E11-28H1 분자를 제조하였다. 5개의 추가 포맷을 평가하였으며 모 분자는 도 28에 도시되어 있다. 5개의 추가 분자들 중 4개는 교차된 28H1 Fab를 더 이상 함유하지 않고, DR5 (5E11) 중쇄의 C-말단에 융합된 표준 Fab 영역((G4S)4 연결자에 의해 융합되는 VHCH1 또는 VLCL)을 함유한다.
추가 DR5-FAP 크로스Fab 분자에 대한 설명
도 28 개요 B C D E F
교차 유형 N-말단 Fab N-말단 VHVL N-말단 CH1CL C-말단 Fab C-말단 VHVL
5E11 IgG VLCL - Fc VLCH1 - Fc VHCL - Fc VHCH1 - Fc VHCH1 - Fc
28G1 Fab (중쇄 C-말단에 융합) VHCH1 VHCH1 VHCH1 VLCL VLCH1
추가 DR5-FAP 크로스Fab 분자의 대표적인 서열들
VLCL
DR5(5E11)_28H1
2+2
(도 28에서 분자 B)		 교차된 전체 Fab(VLCL-Fc)와 함께 (G4S)4 연결자에 의해 DR5 (5E11) 중쇄의 C-말단에 융합된 항 FAP 28H1 Fab (VHCH1)
VLCL (DR5) - Fc - VHCH1(FAP) (서열번호 274)
VHCH1 (DR5) (서열번호 275)
VLCL (FAP 28H1) (서열번호 137)
VHVL
DR5(5E11)_28H1
2+2
(도 28에서 분자 C)		 Fab에서의 교차(VLCH1-Fc)하에 (G4S)4 연결자에 의해 DR5 (5E11) 중쇄의 C-말단에 융합된 항 FAP 28H1 Fab (VHCH1)
VL (DR5) - CH1 - Fc 부분 - VH(FAP)-CH1 쇄 (서열번호 135)
VH (DR5) - CL (서열번호 136)
VL (FAP) - 카파 경쇄 (서열번호 137)
CH1LCL
DR5(5E11)_28H1
2+2
(도 28에서 분자 D)		 Fab에서의 교차(VHCL1-Fc)하에 (G4S)4 연결자에 의해 DR5 (5E11) 중쇄의 C-말단에 융합된 항 FAP 28H1 Fab (VHCH1)
VH (DR5) CL - Fc - VH(FAP)-CH1 쇄 (서열번호 138)
VL (DR5) - CH1 쇄 (서열번호 139)
VL (FAP) - 카파 경쇄 (서열번호 137)
DR5(5E11)_28H1
(VLCL)
2+2
(도 28에서 분자 E)		 (G4S)4 연결자에 의해 DR5 (5E11) Fc의 C-말단에 융합된 항 FAP (28H1) Fab (VLCL)
VH (DR5) - CH1 - Fc - VL(FAP) - CL (서열번호 276)
VL (DR5) - CL (서열번호 132)
VH (FAP) - CH1 (서열번호 277)
DR5(5E11)_28H1
(VLCH1)
2+2
(도 28에서 분자 F)		 (G4S)4 연결자에 의해 DR5 (5E11) Fc의 C-말단에 융합된 항 FAP (28H1) 크로스Fab (VLCH1)
VH (DR5) - CH1 - Fc - VL(FAP) - CL (서열번호 278)
VL (DR5) - CL (서열번호 132)
VH (FAP) - CL (서열번호 279)
모든 분자들은 HEK293 EBNA 세포에서 200 ml 규모로 일시적으로 생성되었으며, 표준 단백질A 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제되고, 최종적으로 분석되고 원래 포맷(5E11 중쇄에 융합된 28H1의 C-말단 CH1CL 교차(분자 A, 도 28))과 비교하여 특성화되었다.
표 16에서 요약된 바와 같이, 5개의 분자들을 2개의 군으로 분류할 수 있다: 한가지는 전체 Fab가 교차된 2개의 포맷(B + E)을 포함한다. 상기 2개 분자는 매우 낮은 생성물 역가를 제공하였으며, 정제후에도 여전히 대량의 응집체를 함유하였다. 그러므로, 이들 두 분자는 더 평가하지 않았다. 나머지 3개(5E11 VHVL 또는 CH1CL의 교차 및 VHVL로서 C-말단 28H1의 교차)는 수율 및 응집체 함량과 관련하여 훨씬 더 우수한 생성물 질을 나타내었다. 분자 C 및 D는 또한, 도 29에서 보이듯이 분자 A와 비교하여 FACS에 의해 MDA-MB-231 세포 상에서의 표적 결합에 대해 검사하였다. 또한, 분자 C, D 및 F의 세포자살 유도, 동시 및 독립적 표적 결합, 안정성 및 응집 경향 뿐 아니라 부산물 패턴의 측면에서 기능 활성을 포맷 A와 비교하였다(실시예 22 내지 25).
실시예 16: 공배양 분석 시스템에서 2+2 이중특이성 포맷 변이체의 기능 활성 검사
4개의 상이한 2+2 포맷 변이체(도 28의 포맷 A, C, D, F)를, 종양 세포(MDA-MB-231) 및 섬유아세포(GM05389)로 이루어진 공-배양 시스템에서 구축물들로 세포를 처리시 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE, 로슈 #11 774 425 001)에 의해 측정된 바와 같은 세포자살을 유도하는 그들의 기능 활성에 대해 비교하였다.
제 1 일 : 세포의 제조. 부착성 MDA-MB-231 세포주(인간 유방암)는 10% 소 태아 혈청(깁코) 및 2mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 DMEM 배지(PAN)에서 성장하였으며, 정상적으로 1주에 2회 1:20으로 분열되었다. GM05389 섬유아세포는 15% 소 태아 혈청(깁코), 1x NEAS(PAN) 및 2mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 MEM + 얼 배지(깁코)에서 성장하였으며, 정상적으로 1주에 2회 1:3으로 분열되었다.
공-배양 분석을 위해, 섬유아세포 및 종양 세포를 동일한 날에 각각 1x104 세포/100 ㎕/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였으며, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 단일배양 분석을 위해, 세포주를 상이한 플레이트에 동일 밀도로 접종하였다.
제 2 일 : 세포자살의 유도. 배지를 흡인하고 이중특이성 항체를 100 ㎕ 배지 중에 상이한 최종 농도(도면 참조)로 첨가하였다.
배양물은 37 ℃에서 24 시간동안 배양하였다.
제 3 일 : 세포 사멸 검출 ELISA ( CDDE ). 면역분석법을 약간 변화시켜 제조사의 지시(로슈)에 따라 수행하였다. 간략하게, 세포를 RT에서 100 ㎕/웰 2x-용해 완충제로 15 분동안 용해시켰다. 항-히스톤 및 항-DNA 항체로 이루어진 마스터 혼합물을 제조사의 지시에 따라 제조하고, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(로슈) 상에서 1:4 희석 용해물과 혼합하였다. RT에서 2시간 배양후, 웰을 세척하고, ABTS 기질을 첨가하고, 광도측정 분석에 충분한 색이 발색될 때까지(10 내지 30 분) RT에서 배양하였다. 테칸 스펙트라 레인보우 판독기로 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
결과는 도 30에 나타내었다. 공-배양(a) 및 단일-배양(b,c) 설정에서 4개의 상이한 크로스Mab 변이체들의 세포자살 유도를 DNA 단편화에 의해 검출하였다. 4개의 상이한 변이체들 모두 공-배양 설정에서 필적하는 용량-의존성 방식으로 종양 세포에서 세포자살을 유도하였다. 단일-배양 설정에서는, MDA-MB231 종양 세포주에서도 GM05389 섬유아세포 세포주에서도 세포자살은 유도되지 않아서, 4개 변이체 모두의 세포자살 유도의 특이성 및 FAP-의존성을 시시하였다. 상기 기능 활성 데이터는 이중특이성 2+2 포맷이 교차 유형 및 부위와 관련하여 상이한 배열형태에 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 17: 2+2 이중특이성 포맷 변이체의 독립 적 및 동시 표적 결합 검사
4개의 상이한 2+2 포맷 변이체(도 28의 포맷 A, C, D, F)를 SPR 분석법에 의해 독립적으로 및 동시에 두 표적 모두에 결합하는 그의 능력에 대해 추가로 비교하였다.
상이한 크로스mab 변이체에 대한 독립적인 DR5 - 및 FAP -결합의 평가
약 3000 공명 단위(RU)의 포획 시스템(5 ㎍/ml 항 인간 IgG (Fc); 지이 헬쓰케어, BR-1008-39)을, 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 세포의 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 블록의 온도는 12 ℃로 설정하였다. 포획 전에, 유동 세포를 작업 완충제(running buffer)로 2회 프라이밍하였다.
5 ㎕/분의 유량에서 60 초동안 5 ㎍/ml 용액을 주입하여 이중특이성 항체를 포획하였다. 순차적으로 또는 동시에 첨가된(10 ㎕/분의 유량) 각 리간드에 대한 활성 결합 능력을 측정함으로써, 이중특이성 항체에 대한 각 리간드의 독립적 결합을 분석하였다:
1. 180 초동안 5 ㎍/ml의 농도하에 인간 DR5의 주입(항원의 단일 결합 확인).
2. 180 초동안 5 ㎍/ml의 농도하에 인간 FAP의 주입(항원의 단일 결합 확인).
3. 180 초동안 5 ㎍/ml의 농도하에 인간 DR5 및 5 ㎍/ml의 농도하에 인간 FAP의 주입(동시에 DR5 및 FAP의 결합 확인).
30 ㎕/분의 유량에서 3m MgCl2 용액으로 60 초동안 세척하여 표면을 재생시켰다. 항 인간 IgG 표면으로부터 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
이중특이성 항체는, 접근방법 3의 수득된 최종 신호가 접근방법 1 및 2의 개별적인 최종 신호들의 합과 동일한 경우 상호 독립적으로 두 항원 모두에 결합할 수 있다.
4개의 상이한 크로스mab 변이체의 독립적인 DR5- 및 FAP-결합에 대한 정량적 평가
서열번호
 DR5 FAP 예상신호
DR5 + FAP		 측정된 신호 혼합:
DR5 + FAP		 예상치와
측정치 비
[ RU max ] [ RU max ] [ RU max ] [ RU max ] [%]
DR5TAA-0057
포맷 A		 134,132,124 37,1 40,8 77,9 76,7 98
DR5TAA-0077
포맷 C		 135,136,137 33,0 41,9 74,9 73,1 98
DR5TAA-0078
포맷 D		 138,139,137 27,1 38,4 65,5 63,6 97
DR5TAA-0081
포맷 F		 278,132,279 26.7 7.2 34 33 97
4개의 상이한 크로스mab 변이체 모두 DR5 및 FAP에 상호 독립적으로 결합할 수 있다.
크로스mab 에 대한 동시 DR5 - 및 FAP -결합의 평가
먼저, 약 600 공명 단위(RU)의 DR5(20 ㎍/ml)를, 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 세포를 25 ℃로 설정하고 샘플 블록은 12 ℃로 설정하고, 작업 완충제로 2회 프라이밍하였다. 두번째로, 30 ㎕/분의 유량에서 30 초동안 10 ㎍/ml의 이중특이성 항체 용액을 주입하였다. 세번째로, hFAP(10 ㎍/ml)를 30 ㎕/분의 유량에서 30 초동안 주입하였다. hFAP의 결합 반응은 hDR5에 결합된 이중특이성 항체의 양에 의존하며, 동시 결합을 나타낸다. 30 ㎕/분의 유량에서 글리신 pH2 용액(지이 헬쓰케어 BR-1003-55)으로 70 초동안 세척하여 표면을 재생시켰다. 동시 결합은 이전의 DR5 결합된 크로스mab에 대한 hFAP의 추가의 특이적 결합 신호에 의해 증명된다.
4개의 크로스mab 포맷(DR5TAA-0057, DR5TAA-0078, DR5TAA-0077 및 DR5TAA-0081)의 동시 DR5- 및 FAP-결합에 대한 평가는 4개의 상이한 크로스mab 변이체 모두 FAP 및 DR5에 동시에 결합할 수 있음을 보여주었다.
실시예 18: 2+2 이중특이성 포맷 변이체의 열 안정성 및 응집 경향 검사
4개의 상이한 2+2 포맷 변이체(도 28의 포맷 A, C, D, F)를 그의 열 안정성 및 응집체를 형성하는 그의 경향에 대해 더 분석하였다.
열 안정성
응집 개시 온도: 샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl (pH 6.0) 중에 1 mg/ml의 농도로 제조하고, 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통해 원심분리에 의해 광학 384-웰로 옮기고, 파라핀 오일로 덮어주었다. 샘플을 0.05 ℃/분의 속도하여 25 ℃로부터 80 ℃로 가열하면서 동적 광 산란에 의해 유체역학적 반경을 반복적으로 측정하였다. 응집 개시 온도는 유체역학적 반경이 증가되기 시작하는 온도로 정의된다.
응집 경향
샘플을 배합 완충제(20 mM His/HisCl, 240 mM 트레할로스, pH 6.0)에 투석시키고, 1 mg/ml의 농도로 조정하였다. 0.22 ㎛ 원심분리 필터 장치(밀리포어(Millipore)) 상에서의 멸균 여과 후에, 샘플을 40 ℃에서 2 주동안 저장한 반면, 대조군 샘플은 -80 ℃에서 유지시켰다. 응집체 형성을 TSK3000 SWXL 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 SE-HPLC로 모니터링하고, 40 ℃ 및 -80 ℃ 샘플 사이의 차이로서 기록하였다.
4개의 상이한 크로스mab 포맷의 열 안정성 및 응집 경향 평가
DR5TAA-0057
(서열번호 134,132,124)
포맷 A		 DR5TAA-0077
(서열번호 135,136,137)
포맷 C		 DR5TAA-0078
(서열번호 138,139,137)
포맷 D		 DR5TAA-0081
(서열번호 278,132,279)
포맷 F
DLS에 의한 안정성
[Tagg, oC]		 64 61 60 61
배합 완충제중
40 ℃에서 저장시
응집체 형성
[% 증가]		 0.4 0.3 2.2 0.5
열 안정성은 모 포맷 A에 비해 포맷 C, D 및 F에서 약간 감소하였으나, 61 ℃ 및 60 ℃하에 여전히 우수한 범위였다.
응집 경향은 포맷 A, C 및 F에서 매우 낮았으며, 포맷 D에서는 약간 증가하였다.
실시예 19: 질량 분석법에 의한 2+2 이중특이성 포맷 변이체의 부산물 프로필 평가
마지막으로, 4개의 상이한 2+2 포맷 변이체(도 28의 포맷 A, C, D, F)를 질량 분석법에 의해 그의 부산물 프로필에 대해 더 분석하였다.
상이한 구축물들의 탈글리코실화된 총 질량을 측정하고 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의해 확인하였다. 또한 LC 과잉재현과 같은 잠재적 부산물을 검출하고 상대적으로 정량화하였다. 간략하게, 100 ㎍의 정제된 항체를 37 ℃에서 3 mg/ml 이하의 단백질 농도에서 100　mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH　7) 중에서 14 U N-글리코시다제 F(로슈)로 2 시간동안 탈글리코실화시키고, 이어서 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 PHLC에 의해 탈염시켰다. 탈글리코실화된 총 질량은 트리버사 나노메이트(TriVersa NanoMate, 애드비온(Advion)) 광원이 장착된 맥시스(maXis) UHR-TOF(브루커(Bruker)) MS 시스템 상에서 ESI-MS에 의해 측정하였다.
상이한 DR5-FAP 이중특이성 항체 구축물들을 그의 탈글리코실화 형태에서 질량 분석법으로 분석하여 생성물의 정체 및 무결성을 평가하였다. 정체는 모든 평가된 구축물에 대해 확인할 수 있었다. 또한 상이한 구축물들은, 예를 들면, 한 LC 유형의 과잉재현하에 또는 1 또는 2개 LC의 손실하에 여러 부산물을 나타내었다. 모든 구축물들은 질적으로 및 양적으로 유사한 부산물 프로필을 나타내었다.
실시예 13 및 30 내지 33으로부터의 모든 결과는, 이중특이성 2+2 포맷이 교차 유형 및 부위와 관련하여 상이한 배열형태에 사용될 수 있음을 명백히 보여준다. 이것은 2+2 크로스Fab 포맷을 광범위하게 적용가능한 플랫폼 기술이 되게한다.
실시예 20: 드로지투맙 - FAP 이중특이성 분자는 비표적화 드로지투맙에 비해 우수한 생체내 효능을 나타낸다
시험관내 활성 분석에서 이중특이성 드로지투맙-FAP가 가교결합되지 않은 드로지투맙 단독에 비해 우수한 세포자살 유도 활성을 나타냄이 입증되었다. 이것이 또한 적절한 마우스 종양 모델에서의 생체내 효능으로 이어지는지를 평가하기 위해, 상이한 이종이식 모델을 구성하였다. 표준 마우스 종양 모델에서의 한가지 문제는 FAP 발현이 통상적으로 매우 낮고 인간 상황을 전혀 반영하지 않는다는 점이다. 인간 종양 기질에서 FAP 발현과 더 면밀하게 유사한 모델을 수립하기 위해, 마우스 FAP를 재조합적으로 발현하는 조작된 뮤린 섬유아세포(3T3 세포)를 각각의 종양 세포주(누드 마우스에서의 대장암 세포주 DLD-1 및 SCID 마우스에서의 유방암 세포주 MDA-MB-231)와 함께 공-주입하였다. 이를 위해, 3T3 섬유아세포를, MPSV 프로모터의 조절하에서 전장 뮤린 FAP 유전자를 위한 발현 카세트를 갖는 플라스미드로 안정하게 형질감염시켰다. 안정한 클론의 선택을 위해, 벡터는 퓨로마이신에 대한 내성을 제공하는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 추가의 발현 카세트를 추가로 갖는다. FACS 결합 실험에 의해 판정할 때 상이한 수준의 뮤린 FAP를 발현하는 여러 개의 클론을 선택하였다. 선택되는 한 mu FAP-3T3 세포주를 종양 세포주 DLD-1과 공-주입하여, mu FAP 발현 3T3 세포 없이 주입된 DLD-1 세포에 비해 상당히 증대된 종양 성장을 유도하였다. 또한, 인간/마우스 교차반응성 항 FAP 항체를 사용한 IHC 분석은, 예상된 바와 같이, 두 세포주 모두에서 종양 주위 기질에서 높은 수준의 FAP 발현을 입증하였다. 그러므로, 상기 공-이식된 피하 이종이식 모델을 사용하여 원래의 비표적화 드로지투맙 항체와 비교한 이중특이성 드로지투맙-FAP 분자의 생체내 효능을 평가하였다. 2x106 종양 세포를 뮤린 FAP를 발현하는 3T3 섬유아세포 20%와 공-이식하였다. 종양 세포 이식 12일(DLD-1) 및 10일(MDA-MB-231) 후에 치료를 개시하였다. 동물들에게 완충제, 드로지투맙(10 mg/kg) 또는 드로지투맙-FAP(10 mg/kg)를 주사(i.v.)하였다. 드로지투맙 대 이중특이성 드로지투맙의 분자량 차이(드로지투맙은 이중특이성 분자의 분자량의 60%일뿐이다)를 보상하기 위해, 이중특이성 드로지투맙을 1주일에 2회 투여한 반면, 드로지투맙은 1주일에 1회만 투여하였다. 도 31에, 시간 경과에 따른 평균 종양 부피(mm3)의 증가가 요약되어 있다. 도 31A는 DLD-1/mu FAP-3T3 공-주입 모델에서 드로지투맙 및 완충제 대조군과 비교한 드로지투맙-FAP의 생체내 효능을 나타낸다. 드로지투맙은 대조군에 비해 36%의 종양 성장 억제율(TGI)을 야기하는 단지 중간정도의 항-종양 효능을 나타낸 반면, 이중특이성 분자는 연구 종료때(제 33 일)에 99%의 종양 성장 억제율을 나타내었다. MDA-MB-231/mu FAP-3T3 공-주입 모델에서, 상기 차이는 훨씬 더 현저하였는데, 그 이유는 상기 모델에서 드로지투맙 단독으로는 완충제 대조군보다 우수한 효능을 나타내지 않은 반면 드로지투맙-FAP 이중특이성 항체는 제 32 일에 연구 종료시 77%의 종양 성장 억제율을 나타내었기 때문이다(도 31B). 상기 결과는 MDA-MB-231 세포주가 DLD-1 세포주보다 세포자살 유도에 더 내성임을 시사할 수 있다.
실시예 21: 28 H1 FAp 크로스Fab 와 함께 새로 단리된 DR5 결합제 를 사용한 DR5-FAP 이중특이성 분자의 항-종양 활성 평가
크로스Fab로서 항 FAP 항체 28H1에 융합된 이중특이성 포맷의 3개의 상이한 DR5 결합제(5E11, 174 및 422)의 생체내 효능을, 각각, 뮤린 FAP를 발현하는 3T3 섬유아세포와 공-주입된 DLD-1 및 MDA-MB-231 이종이식 모델에서 사이드-바이-사이드로 비교하였다. Fcγ 수용체에 대한 결합을 완전히 제거한(FcRn에 대한 친화도는 변화되지 않고) Fc 영역에서의 돌연변이를 갖는 5E11-28H1 크로스Fab로 이루어진 4번째 분자가 포함되었다. 이를 위해, 대규모 일시적 형질감염 및 제조를 수행하여 HEK 세포에서 충분한 물질을 생성시켰다.
생체내 실험을 위한 이중특이성 항체의 제조. 모든 물질은 <0.23 EU/mg의 허용되는 내독소 함량을 나타내었다.
샘플 Fc 영역 역가 [mg/L] 수율 [mg] 응집체 [%]
1 DR5(5E11)-FAP(28H1) VHCL 2+2 wt 60 75 < 2
2 DR5(5E11)-FAP(28H1) VHCL 2+2 PG_LALA* 80 100 < 2
3 DR5(174)- FAP(28H1) VHCL 2+2 wt n.d. 65 < 1
4 DR5(422)- FAP(28H1) VHCL 2+2 wt n.d. 96 < 1
* L234A; L235A; P329G
모든 분자들은 응집체 및 내독소 함량과 관련하여 탁월한 품질하에 우수한 수율로 생성되었다. 관련 항원에 대한 결합은 표 21에 요약된 바와 같은 상이한 방법(SPR 및 FRET)으로 분석하였다.
[표 21a]
인간 및 사이노몰구스 항원에 대한 DR5-FAP 이중특이성 분자의 친화도/결합활성
Figure pct00005
* 비아코어 측정
+ 태그라이트(TagLite)
생체내 실험이 개시되기 전에, 물질들을 먼저 시험관내 세포자살 유도 활성에 대해 검사하였다. 도 32는, 4개의 상이한 DR5-FAP 이중특이성 분자들을 7.0, 0.7 및 0.07 nM의 농도에서 비교한 세포 사멸 검출 ELISA의 결과를 요약한 것이다. 상기 분석법은, DLD-1 세포가 표적 세포로 사용되고, 3T3 또는 뮤린 FAP를 발현하는 재조합 3T3 세포가 가교결합을 위한 효과기 세포로 사용된 공-배양 분석법으로 구성되었다. DLD-1 - 3T3 공-배양 실험에서, DLD-1 세포에서는 거의 세포자살 유도를 검출할 수 없었던 반면, FAP 발현 3T3 세포를 사용한 설정에서는 세포자살 유도에 10배 증가가 관찰되어, 상기 활성이 재조합 3T3 세포의 표면 상에서 FAP에 의한 가교결합에 기인함을 시사하였다. 동일한 이중특이성 분자, 표적 및 효과기 세포를 사용하여 이중특이성 작동성 DR5-FAP 항체로 처리시 세포 생존율을 측정한 유시한 실험을 수행하였다. 상기 실험 결과는 도 33에 요약되어 있다. 여기서, DLD-1 세포의 세포 생존율의 상당한 감소가 FAP 발현 3T3 세포의 존재하에서만 관찰된 반면, 비변형된 3T3 세포(뮤린 FPA를 발현하지 않음)를 사용한 경우에는 생존율 감소가 나타나지 않았다.
4개의 이중특이성 DR5-FAP 분자 모두를, 뮤린 FAP 발현 3T3 섬유아세포의 20%와 공-주입된 2개의 상이한 종양 모델에서 생체내 효능의 평가에 사용하였다. 상기 생체내 효능 실험의 결과는 도 34에 나타내었다. 종양 및 섬유아세포 세포의 이식 후에, 10 mg/kg을 1주일에 2회 정맥내(i.v.) 투여하여 처리를 시작하였다. 명백하게, 비히클 대조군에 비해 상당한 종양 성장 억제율(TGI)로 입증되듯이, 두 모델 둘 다에서 4개 분자 모두 종양 성장을 제어할 수 있었다. 연구 종료시 종양 성장 억제율의 절대 퍼센트는 4개 분자 모두에서 유사한 범위였다. 하기의 결과가 DLD-1 및 MDA-MB-231 모델 각각에 대해 수득되었다: 5E11_28H1(wt Fc): 75%/95%; 5E11_28H1(PGLALA): 83%/99%; 클론 174: 66%/87% 및 클론 422: 73%/89%. 모든 분자들은 DLD-1 실험에서보다 MDA-MB-231 모델에서 약간 더 효력이 있었다.
[표 21b]
바람직한 DR5-FAP 이중특이성 항체의 특성화 요약
Figure pct00006
실시예 22 내지 25: 면역화에 의한 새로운 DR5 결합 잔기의 생성 및 특성화
파지 디스플레이 라이브러리(전술한 바와 같음)로부터의 개선된 성질을 갖는 새로운 DR5 항체의 선택 이외에, 토끼의 면역화에 의해 새로운 DR5 항체를 또한 제조한(실시예 22 내지 25) 후에 철저한 특성화(실시예 26 내지 28)를 수행하였다.
실시예 22: 토끼의 면역화
한 세트의 토끼를, 제 0 일에, 피내 적용에 의해, 완전 프로인트(Freund) 보조제로 유화시킨 400 ㎍의 재조합 인간 DR5(단량체성 Fc 융합)로 면역화시키고, 제 7, 14, 35, 63 및 91 일에, 근육내 및 피하 교대 적용에 의해, 완전 프로인트 보조제로 유화시킨 200 ㎍의 각각의 DR5-huFc로 면역화시켰다. 혈액(평가된 총 혈액 부피의 10%)은 제 21, 41, 69 및 97 일에 취하였다. 혈청을 제조하고, 이것을 ELISA에 의한 역가 측정(하기 참조)에 사용하고, 말초 단핵 세포를 단리하고, 이것을 B 세포 클로닝 과정(실시예 17)에서 항원-특이적 B 세포의 공급원으로 사용하였다.
또 다른 세트의 토끼를, 세포내 사멸 도메인이 결여된 인간 DR5를 암호화하는 플라스미드 발현 벡터를 사용하여, 400 ㎍ 벡터 DNA의 피내 적용에 의해 유전적으로 면역화시킨 후, 전기천공(750 V/cm의 5 제곱 펄스, 10 분의 기간, 1 초 간격)을 행하였다. 제 0, 14, 28, 49, 77 및 105 일에 토끼에게 6회 연속 면역접종을 하였다. 혈액(평가된 총 혈액 부피의 10%)은 제 35, 56, 84 및 112 일에 취하였다. 혈청을 제조하고, 이것을 ELISA에 의한 역가 측정(하기 참조)에 사용하고, 말초 단핵 세포를 단리하고, 이것을 B 세포 클로닝 과정에서 항원-특이적 B 세포의 공급원으로 사용하였다(실시예 23).
혈청 역가 측정
인간 DR5(단량체성 Fc 융합)를 PBS 중, 100 ㎕/웰로 0.3125 ㎍/ml에서 96-웰 NUNC 맥시소프 플레이트 상에 고정화시킨 다음, 플레이트를 PBS 중의 2% 크로테인(Crotein) C, 200 ㎕/웰로 차단하고; PBS 중 0.5% 크로테인 C, 100 ㎕/웰에 항혈청의 연속 희석물을 2중으로 적용하고; PBS 중 0.5% 크로테인 C, 100 ㎕/웰에 1:16000으로 희석된 HRP-접합된 당나귀 항-토끼 IgG 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))로 검출하였다. 모든 단계에서, 플레이트는 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 모든 단계 사이에, 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. BM 블루 POD 기질(BM Blue POD Substrate) 용액(로슈), 100 ㎕/웰을 첨가하여 신호를 발생시켰으며; 1 M HCl, 100 ㎕/웰을 첨가하여 중단시켰다. 흡광도는 기준으로 690 nm에 대해 450 nm에서 판독되었다. 역가는 반-최대 신호를 야기하는 항혈청의 희석률로 정의되었다.
실시예 23: 토끼로부터의 B-세포 클로닝
토끼 말초혈 단핵 세포( PBMC )의 단리
3마리 토끼(실시예 "토끼의 면역화"에 기술됨)를 혈액 공급원으로 사용하였다. 전혈(whole blood)을 함유하는 EDTA를 1x PBS(PAA, 오스트리아 파슁)로 2배 희석한 후, 제조사의 설명에 따라 포유동물 림포라이트(lympholyte)를 사용하여 밀도 원심분리를 행하였다. PBMC는 1x PBS로 2회 세척하였다.
EL -4 B5 배지
10% FCS(하이클론(Hy클론), 미국 유타 로간), 2 mM 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(PAA, 오스트리아 파슁), 2 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM HEPES(팬 바이오테크(PAN Biotech), 독일 아이덴바흐) 및 0.05 mM b-머캅토에탄올(깁코, 스코틀랜드 페이즐리)로 보충된 RPMI 1640(팬 바이오테크, 독일 아이덴바흐).
대식세포/단핵구의 고갈
멸균 6-웰 플레이트(세포 배양용)를 사용하여 비특이적 부착을 통해 대식세포 및 단핵구를 고갈시켰다. 4 ml 배지 및 면역화된 토끼로부터의 6x106 이하의 PBMC로 각 웰을 최대로 채우고, 37 ℃에서 배양기에서 1 시간동안 결합시켰다. 상등액 중의 세포(말초혈 림프구(PBL))를 항원 패닝 단계에 사용하였다.
플레이트의 코팅
단백질 상에서의 패닝을 위해, 멸균 스트렙타비딘 코팅된 6-웰 플레이트(마이크로코트(Microcoat), 독일 베른리트)를, 실온에서 PBS 중의 2 ㎍/ml 비오티닐화 재조합 인간 DR5(단량체성 Fc 융합)로 3 시간동안 코팅하였다. 인간 표면 DR5-양성 세포 상에서의 패닝을 위해, G401 세포를 멸균 세포 배양 6-웰 플레이트에 접종하고 배양시켜 합류된(confluent) 세포 단층을 생성하였다. 패닝전에 상기 6-웰 플레이트들을 멸균 PBS로 3회 세척하였다.
인간 DR5 단백질 상에서 B 세포의 증폭
인간 DR5 단백질로 코팅되거나 인간 DR5-양성 G401 세포로 덮인 6-웰 조직 배양 플레이트에 4 ml 배지당 6x106 이하의 PBL을 접종하고, 37 ℃에서 배양기에서 1 시간동안 결합시켰다. DR5 항원 상에서의 증폭 단계 후에, 1x PBS로 1 내지 2회 웰을 조심스럽게 세척함으로써 비-부착 세포들을 제거하였다. 잔류하는 점착성 세포를 37 ℃에서 배양기에서 10 분동안 트립신으로 분리시켰다. EL-4 B5 배지로 트립신화를 중단시켰다. 면역 형광 염색까지 세포를 얼음위에 유지시켰다.
면역 형광 염색 및 유세포분석
항-IgG FITC(AbD 세로텍(AbD Serotec), 독일 뒤셀도르프)를 단일 세포 분류(sorting)에 사용하였다. 표면 염색을 위해, 고갈 및 증폭 단계로부터의 세포를 PBS 중에서 항-IgG FITC 항체와 함께 배양하고, 4 ℃에서 어두운 상태에서 45 분동안 배양하였다. 염색후에 PBMC를 빙냉시킨 PBS로 2배로 세척하였다. 최종적으로 PBMC를 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 즉시 FACS 분석에 적용하였다. 5 ㎍/ml 농도의 프로피듐 요오다이드(비디 파밍겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아 샌디에이고)를 FACS 분석 전에 첨가하여 사멸 세포와 생 세포를 식별하였다. 컴퓨터 및 FACSDiva 소프트웨어가 장착된 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACSAria(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국)를 단일 세포 분류에 사용하였다.
B-세포 배양
토끼 B 세포의 배양균을 주블러 등(Zubler et al., 1985)에 의해 기술된 바와 유사한 방법에 의해 제조하였다. 간략하게, 단일 분류된 토끼 B 세포를, 96-웰 플레이트에서, 판소르빈(Pansorbin) 세포(1:100000)(칼바이오켐(Calbiochem)(메르크(Merck)), 독일 다름스타트), 5% 토끼 흉선세포 상등액(충전 TSN-M13(10242), 마이크로코트, 독일 베른리트) 및 감마-조사된 뮤린 EL-4-B5 흉선종 세포(2.5x104/웰)을 함유하는 200 ㎕/웰의 EL-4 B5 배지를 사용하여 37 ℃에서 5% CO2의 대기하에 배양기에서 7 일동안 배양하였다. B-세포 배양 상등액을 스크리닝을 위해 제거하고, 남은 세포를 즉시 수거하고 -80 ℃에서 100 ㎕ RLT 완충제(키아겐, 독일 힐덴) 중에서 냉동시켰다.
실시예 24: B-세포 PCR 및 재조합체 발현
리보핵산( RNA )의 단리
RNA를 단리해야 했던 세포를 먼저 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 세포 펠릿을 10 ㎕/ml 베타-머캅토에탄올과 함께 100 ㎕ RLT-완충제를 첨가하여 용해시켰다. 세포를 피펫으로 여러번 혼합시켜 재현탁하고 다중 웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 200 x g에서 짧게 원심분리하고 -20 ℃에서 냉동시켰다. RNA의 단리는 뉴클레오스핀(NucleoSpin, 등록상표) 96 RNA 키트(마슈레이-나겔(Macherey & Nagel))를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다.
역전사 폴리머라제 연쇄 반응
역전사는 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신테시스 슈퍼믹스(SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로겐(Invitrogen))를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다.
폴리머라제 연쇄 반응
폴리머라제 연쇄 반응은 어큐프라임(AccuPrime) Pfx 슈퍼믹스(인비트로겐)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 별개의 반응으로 증폭시켰다. 항체 발현 벡터를 표적화하기 위해 PCR-프라이머를 25 bp 중복서열하에 사용하였다. PCR-산물을 뉴클레오스핀(등록상표) 96 익스트랙트 II 키트(마슈레이-나겔)로 정제하였다.
서열분석 및 SLIC 클로닝
PCR 산물을 서열분석하여 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 DNA-서열을 결정하였다. PCR-산물을, 문헌 [Haun, R.S., et al., in BioTechniques 13 (1992) pp. 515-518 and Li, M.Z., et al., in Nature Methods 4 (2007) pp. 251-256]에 기술된 소위 SLIC-클로닝 방법에 의해 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 항체 발현을 위한 플라스미드를 제한 효소 절단에 의해 선형화시켰다. 선형화된 플라스미드를 예비 아가로스 전기영동에 의해 정제하고 겔(키아퀵 겔 추출 키트(Qiaquick Gel Extraction Kit)/키아겐)로부터 추출하였다. 정제된 플라스미드를, 클로닝될 PCR-산물에 대한 중복 프라이머(베이 25 bp)를 사용하여 PCR-프로토콜에 부가시켰다. 벡터와 삽입물을 둘 다 dNTP의 부재하에서 T4 DNA 폴리머라제(로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences))로 처리하여 돌출부를 생성한 다음, 벡터 및 삽입물을 RecA(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 단백질 및 ATP와 함께 배양하여 재조합을 촉진시켰다. 생성물을 에스케리치아 콜라이에 형질전환시켰다. 경쇄 및 중쇄를 위한 플라스미드 DNA를 단리하고, 각각의 쌍을 일시적 형질감염을 위해 결합시켰다.
HEK293 세포에서 항체 발현을 위한 일시적 형질감염
HEK293 세포(인비트로겐)를 F17-배지(깁코)에서 1x10e6 세포/ml까지 성장시켰다. 2x10e6 HEK293 세포를, 293-프리(노바겐(Novagen)) 및 옵티멤(OptiMEM, 등록상표)(깁코)에 현탁시킨 1 ㎍ HC + LC 플라스미드로 형질감염시켰다. 7 일후에, 배양 상등액을 수거하고, 단백질A에 의해 정제하고 분석하였다.
실시예 25: 면역화로부터 유도된 DR5 항체의 스크리닝
B-세포 배양 상등액을 384 웰 미세적정 플레이트에서 다중 병렬 ELISA-기반 결합 분석법으로 스크리닝하였다. DR5-발현 세포 G401에 대한 항체 결합 및 비오티닐화 재조합 인간 DR5(단량체성 Fc 융합) 및 사이노몰구스 DR5(이량체성 Fc 융합)에 대한 항체 결합은 1차 히트(hit)로서 선택되었지만, 인간 DR4(TNFRSF10A; 알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 347-DR-100) 및 인간 IgG1에 대해서는 결합되지 않았다. 2차 스크리닝에서, HEK 세포에서 재조합적으로 발현된 미세정제된 항체를, 인간 및 사이노몰구스 DR5에 대한 결합에 대해서, 및 또한 인간 DR4, 인간 DcR1(사내), 인간 DcR2(사내) 또는 인간 오스테오프로테게린(OPG; 알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 805-05-100)에 대한 결합의 부재에 대해 다시 검사하였다. 또한, 항체들을 가교결합 항-인간 Fc 항체의 존재 또는 부재하에서 G401 세포 상에서의 기능적 세포자살 분석법(세포 사멸 검출 ELISA)에서 검사하였다. Fc-매개된 가교결합시에만 세포자살을 유도할 수 있는(가교결합 부재하에서는 유도하지 않는) 항체들을 추가의 특성화 및 개발을 위해 선별하였다.
2차 스크리닝 후에 선별되고 SLIC 클로닝 절차에 의해 발현 플라스미드에 클로닝된 항체의 서열들을, 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 서브클로닝 및 재-서열분석에 의해 확인하였다.
이어서, 상기 서브클로닝되고 서열-확인된 발현 플라스미드를 HEK293 세포의 보다 대규모의 일시적 형질감염에 사용한 후, 단백질 A 정제를 수행하여 추가의 더 철저한 특성화 단계를 가능하게 하였다.
실시예 26: 면역화로부터 유도된 DR5 항체의 결합 성질의 특성화
토끼 면역화로부터 선택되는 DR5 항체를, 결합 ELISA 및 SPR 분석에 의해 그의 결합 성질, 종 교차-반응성 및 특이성에 대해 특성화하였다.
TRAIL 결합 수용체에 대한 단클론성 항체의 결합(면역분석법)
항원 결합 면역분석법을 실온에서 0.05% 트윈(등록상표)-20 및 0.5% BSA(로슈 다이아그노스틱스 GmbH)로 보충된 PBS 완충제를 사용하여 384 웰 스트렙타비딘 코팅된 미세적정 플레이트(마이크로코트 바이오테크놀로지 GmbH) 상에서 수행하였다. 125 ng/ml의 비오티닐화 인간 DR5(단량체성 Fc 융합) 단백질(사내) 또는 63 ng/ml의 비오티닐화 hFc 사이노몰구스 DR5 단백질(사내) 또는 63 ng/ml의 비오티닐화 DcR2(TNFRSF10D) 단백질(사내)을, 1:3000 희석된 항-토끼 Fc-HRP 접합체(지이 헬쓰케어) 및 1:50 희석된 B-세포 상등액의 혼합물을 함유하는 웰에 첨가하였다. 90 분 배양 후에, 플레이트를 PBST(0.2% 트윈(등록상표)-20 함유 포스페이트 완충 식염수)로 6회 세척하고, RT에서 BM 블루(등록상표) HRP 기질 용액(BM 블루(등록상표): 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, 로슈 다이아그노스틱스 GmbH)으로 30분간 발색시켰다. 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크 값은 상등액을 첨가하지 않고 정하였다.
면역원의 hFc 태그에 대한 음성 선택을 위해, 잭슨 이뮤노리서치로부터의 비오티닐화 항-인간 IgG(Fab 특이적)(카탈로그 번호 109-066-006), 인간 IgG1(사내) 및 항-토끼 Fc-HRP 접합체의 혼합물을 사용한 면역분석법을 이용하고 기술된 바와 같이 처리하였다. 인간 DR4(TNFRSF10A; 알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 347-DR-100), 인간 오스테오프로테게린(OPG; 알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 805-05-100) 및 인간 DcR1(TNFRSF10C; 알앤디 시스템즈 카탈로그 번호 630-TR-100)과 같은 관련 TRAIL 결합 수용체에 대한 결합을 검사하기 위해, 각각의 단백질 - hFc 키메라를, 맥시소프 384 웰 미세적정 플레이트(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), Nunc) 상에서 항-인간 Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 번호 109-006-098)로 포획함으로써 면역분석법을 확립시켰다.
생화학 ELISA로 검출시 인간 DR5(단량체성 Fc 융합) 및 사이노몰구스 DR5에 대한 면역화에 의해 유도된 DR5 항체(토끼 IgG)의 결합(EC50 [ng/ml]). 마우스 DR5, 인간 DR4, DcR1, DcR2 및 오스테오프로테게린에 대한 유의적 결합은 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음).
DR5 항체 클론 명칭 DR5 항체 클론
별칭 		EC50
인간 DR5
[ ng / ml ] 		EC50
사이노몰구스 DR5
[ ng / ml ] 		서열번호
VH / VL
DR5TAA -0005 039 2,5 3,7 41/46
DR5TAA -0006 058 2,0 1,6 51/55
DR5TAA -0010 481 2,8 8,7 60/64
DR5TAA -0013 298 2,1 2,1 68/71
DR5TAA -0019 461 3,5 2,2 74/78
DR5TAA -0016 422 4,0 2,7 82/85
DR5TAA -0011 174 2,0 4,3 88/89
토끼 면역화로부터 선택되는 DR5 항체는 ELISA에서 인간 및 사이노몰구스 DR5에 대해 우수하고 필적하는 결합 성질을 나타내지만, 이들은 뮤린 DR5는 인식하지 못한다. 모든 선택되는 항체들은 인간 DR4, DcR1, DcR2 및 오스테오프로테게린에 대한 결합 ELISA에서 유의적인 신호를 제공하지 않았기 때문에 모든 선택되는 항체들은 DR5에 대해 매우 특이적이다.
DR5 동적 친화도
약 3000 내지 5000 공명 단위(RU)의 포획 시스템(10 ㎍/ml 염소 항 토끼; 주문 코드 JLR111-005-046; 잭슨 이뮤노리서치)을, 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 세포는 25 ℃로 설정하고 샘플 블록은 12 ℃로 설정하였으며, 작업 완충제로 2회 프라이밍하였다.
DR5 항체는 1 ㎍/ml 용액을 10 ㎕/분의 유량에서 30 초동안 주입시켜 포획하였다. 100 nM에서 출발하여 0.41 nM까지 1:3 희석률로 30 ㎕/분의 유량에서 120 초동안 용액중에서 다양한 농도로 재조합 인간 DR5(단량체성 His-Avi 융합 단백질, 사내)를 주입하여 결합을 측정하였다. 해리 단계를 300 초 이하동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 작업 완충제로 전환시켜 촉발시켰다. 표면을 30 ㎕/분의 유량에서 100 mM H3PO4(인산) 용액으로 60초 세척하여 재생시켰다. 블랭크 표면으로부터 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 완충제 주입도 또한 감한다(= 이중 참조). KD 및 다른 동적 파라미터들의 산출을 위해, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.
면역화에 의해 유도된 DR5 항체(토끼 IgG)의 동적 친화도
DR5 항체 클론 명칭 DR5 항체 클론 별칭 ka
[ nM ] 		kd
[ nM ] 		KD
[ nM ] 		서열번호
VH / VL
DR5TAA -0005 039 1,60E+06 2,14E-02 1,33E-08 41/46
DR5TAA -0006 058 3,12E+05 1,85E-03 5,92E-09 51/55
DR5TAA -0010 481 1,11E+06 1,77E-02 1,59E-08 60/64
DR5TAA -0011 174 4,55E+05 1,93E-03 4,24E-09 88/89
DR5TAA -0013 298 4,07E+05 3,71E-03 9,12E-09 68/71
DR5TAA -0016 422 3,46E+05 5,02E-04 1,45E-09 82/85
DR5TAA -0019 461 9,00E+05 6,07E-04 6,75E-10 74/78
실시예 27: 면역화로부터 유도된 DR5 항체의 기능적 특성화
DNA 단편화 및 세포 생존율
가교결합 항체의 존재 또는 부재하에서 항-DR5 항체로 처리시, 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE, 로슈 #11 774 425 001) 및 셀 타이터 글로(CTG, 프로메가 #G7573) 각각으로 측정된 바와 같은 세포자살 및 세포 생존율을 평가함으로써 DR5 항체를 기능적으로 특성화시켰다.
세포의 제조: 부착성 MDA-MB-231 세포주는, 10% 소 태아 혈청(깁코) 및 2 mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 DMEM 배지(PAN)에서 성장되었으며, 정상적으로 1주일에 2회 1:10으로 분열되었다. 분석을 위해, 세포를 PBS로 세척하고, 어큐타제(Accutase)(PAA)로 플라스크로부터 분리시키고, 96-웰 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(코스타(Costar))에 50 ㎕중에 1x104 세포/웰(CDDE) 또는 0.25x104 세포/웰(CTG)의 밀도로 접종하고, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다.
토끼 항-DR5 항체에 의한 세포자살의 유도: 샘플(토끼 항-DR5 IgG, DR5-TAA-#)을, 상이한 농도로, 단독으로 또는 PBS 중에서 50 ㎕ 중 1:1 비로 가교결합 항체(염소 항-토끼 IgG, 잭슨 이뮤노리서치)와 함께 세포에 가하여, DR5 수용체의 가교결합을 유도하여 세포자살을 유도하였다. 세포는 37 ℃에서 24 시간(CDDE) 또는 48 시간(CTG)동안 배양하였다.
A) 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE): 면역분석법을 제조사의 지시에 따라(로슈) 수행하였다. 간략하게, 상등액을 조심스럽게 흡인하고, 세포를 RT에서 200 ㎕/웰 용해 완충제로 30 분동안 용해시켰다. 항-히스톤 및 항-DNA 항체로 이루어진 마스터 혼합물을 제조사의 지시에 따라 제조하고, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(로슈) 상에서 1:4 희석 용해물과 혼합하였다. RT에서 2시간 배양후, 웰을 세척하고, ABTS 기질을 첨가하고, 광도측정 분석에 충분한 색이 발색될 때까지(10 내지 30 분) RT에서 배양하였다. 테칸 스펙트라 레인보우 판독기로 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 35는 상기 실험의 결과를 나타낸다: 생성된 토끼 항-DR5 항체들은, 상이한 효능하에, 항상 용량-의존성 방식으로 및 DR5 분자의 Fc-매개된 가교결합 후에만 MDA-MB231 세포의 세포자살을 유도할 수 있었다. 항-토끼 Fc-특이적 2차 항체의 부재하에서, 유의적인 세포 사멸은 검출되지 않았다.
B) 셀 타이터 글로(CTG): 면역분석법을 제조사의 지시에 따라(프로메가) 수행하였다. 간략하게, 세포를 먼저 발광 기질(100 ㎕)을 함유하는 완충제에 용해시켰다. 교반기 상에서 10 분의 배양 시간 후에, 테칸 인피니트 플러스(TECAN Infinite Plus) 판독기로 발광을 측정하였다.
도 36은 상기 실험의 결과를 나타낸다: 세포 생존율은 용량-의존성 방식으로 수용체 과군집화시 항-DR5 항체에 의해 감소된다. 생성된 토끼 항-DR5 항체는 달라지는 효능하에, 항상 용량-의존성 방식으로 및 DR5 분자의 Fc-매개된 가교결합 후에만 MDA-MB231 세포의 생존율을 감소시킬 수 있었다. 항-토끼 Fc-특이적 2차 항체의 부재하에서, 세포 생존율은 어떤 항체 농도에서도 영향받지 않았다.
세포 생존율 및 카스파제 8 활성화
카스파제8-글로 카스파제 8 활성화 분석법(프로메가 cat#G8202) 및 셀타이터-글로 세포 생존율 분석법(프로메가 cat#TB288)을 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
카스파제 8 활성화 분석을 위해, 10,000개 암세포를 웰 당 75 ㎕로 불투명 백색 96 웰 플레이트(비디 팔콘(BD Falcon) cat#BD353296)에 접종하고, 37 ℃에서 5% CO2하에 밤새 배양하였다. 이어서, 항-DR5 항체를 항-토끼Fc 항체(25 ㎕중 동몰 농도의 DR5 및 토끼Fc 항체)와 함께 6개의 연속 희석물로 첨가하였다. 항체들을 37 ℃에서 5% CO2하에 3 시간동안 세포상에서 배양하였다. 이어서, 용해 완충제중 100 ㎕의 카스파제 8 기질을 각 웰에 첨가하고 웰을 혼합시켰다. 37 ℃에서 30 분간 더 배양한 후, 발광 신호를 스펙트라 맥스 M5 플레이트에서 판독하였다.
세포 생존율 분석을 위해, 4,000개 암세포를 흑색/투명 바닥 96 웰 플레이트(비디 팔콘 cat#BD353220)에 웰당 접종하고, 37 ℃에서 5% CO2하에 밤새 배양하였다. 이어서, 항-DR5 항체를 항-토끼Fc 항체(25 ㎕중 동몰 농도의 DR5 및 토끼Fc 항체)와 함께 6개의 연속 희석물로 첨가하였다. 항체들을 37 ℃에서 5% CO2하에 48 시간동안 세포상에서 배양하였다. 이어서, 100 ㎕의 셀타이터-글로 시약을 각 웰에 첨가하고 웰을 혼합시켰다. 실온에서 10 분간 더 배양한 후, 발광 신호를 스펙트라 맥스 M5 플레이트 판독기에서 판독하였다.
도 37은, 7 nM의 농도에서 상이한 가교결합된 DR5 항체로 처리시 3개의 상이한 인간 종양 세포(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)의 세포 증식 억제 분석(셀 타이터글로 분석법)을 나타낸다. 도 38은, 7 nM의 농도에서 가교결합된 DR5 항체로 처리후 3개의 인간 종양 세포주(DLD-1, NCI H460 및 MDA-MB-231)에서의 카스파제 8 활성화에 의해 측정된 세포자살 유도를 나타낸다. 모든 검사된 DR5 항체들은 모든 검사된 종양 세포주에서 높은 카스파제 8 활성화를 유도하였다. DR5 항체는 달라지는 효능하에 모든 검사된 세포주의 생존율을 감소시킬 수 있었다.
실시예 28: 파지 디스플레이 및 면역화에 의해 유도된 DR5 항체의 화학 안정성 평가
스트레스받은 DR5 항체 샘플의 생성
DR5 항체의 화학 안정성을 검사하기 위해, 스트레스받은 샘플을 생성하고, DR5 결합에 관해 기능적으로 특성화시켰다. 고-pH 스트레스는 특히 반응성 Asn 핫스팟의 탈아미드화를 유도하는 반면, pH 6.0에서, 예를 들면, 반응성 Asn 및 Asp 잔기로부터 숙신이미드 생성이 유도될 수 있다. 고-pH 스트레스를 위해, 샘플을 20 mM Na-포스페이트(pH 8.0)로 옮기고 40 ℃에서 5 일동안 배양하였다. 저-pH 스트레스를 위해, 샘플을 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 옮기고, 40 ℃에서 3 주동안 배양하였다. 대조군 샘플은 -80 ℃에서 유지시켰다.
스트레스받은 DR5 항체 샘플의 상대적 활성 농도의 측정
약 5000 공명 단위(RU)의 포획 시스템(20 ㎍/ml 염소 항 토끼; 주문 코드 JLR111-005-046; 잭슨 이뮤노리서치)를, 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수)(pH 7.4)이었다. 유동 세포의 온도는 25 ℃로 설정하고 샘플 블록의 온도는 12 ℃로 설정하였다. 포획전에, 유동 세포를 작업 완충제로 2회 프라이밍하였다.
이중특이성 항체를, 50 nM 용액을 10 ㎕/분의 유량에서 60 초동안 주입시켜 포획하였다. 200 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량으로 90 초동안 용액중에서 인간 DR5를 주입하여 결합을 측정하였다. 해리 단계를 90 초 이하동안 모니터링하고, 샘플 용액으로부터 작업 완충제로 전환시켜 촉발시켰다. 표면을 30 ㎕/분의 유량에서 0.85% H3PO4(인산) 용액으로 60초 세척하여 재생시켰다. 블랭크 표면으로부터 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
스트레스받은 항체의 상대 활성 농도는 포획 수준 및 결합 수준으로부터 산출된 비이다(스트레스받지 않은 기준 샘플과 비교하여, 포획 RU로 나눈 결합 RU).
도 39는 스트레스받은 DR5 항체 샘플의 상대 활성 농도 측정을 위해 사용된 대표적인 반응 곡선을 나타낸다. 도 40 및 41은 면역화 및 파지 디스플레이로부터 유도된 원래 DR5 항체 및 스트레스받은 DR5 항체의 상대 활성 농도를 나타낸다. pH 6 및 pH8 각각에서의 스트레스 후에 약간 감소된 상대 활성 농도를 나타낸 항체 DR5TAA-0013 및 DR5TAA-0010 이외에, 모든 다른 DR5 항체들은 pH 스트레스 후에 상대 활성 농도의 적절한 감소를 나타내지 않았다.
실시예 29: 공-배양 분석법에서 2+2 이중특이성 포맷의, 면역화 및 파지 디스플레이에 의해 유도된 DR5 -결합제 의 기능적 특성화
면역화로부터 유도된 새로운 DR5 결합제가 DR5의 과-가교결합에 의한 종양 세포의 세포자살의 표적화 유도를 위한 이중특이성 항체의 생성에 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, 한 세트의 DR5 항체를 FAP 항체 28H1과 함께 2+2 이중특이성 분자(도 18A에 도시된 바와 같음)로 전환시켰다. 이중특이성 구축물을 공-배양 분석법에서 그의 세포자살 유도 활성에 대해 검사하였다.
DLD-1 또는 H460 종양 세포(10,000 세포/웰)를, 각각의 처리에 3벌의 샘플이 가능하도록 150 ㎕의 총 부피로, 3T3 세포와 또는 뮤린 FAP를 발현하도록 형질감염된 3T3 세포와(2,500 세포/웰) 공-배양물로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간후에, 세포를 50 ㎕ 항체(4X 농도)로 24 시간동안 처리하였다(미처리 대조군: 50 ㎕ 배지).
세포 사멸 검출 ELISA : (로슈 어플라이드 사이언스 카탈로그 번호 11774 425 001): 제조사의 프로토콜에 언급된 바와 같이 정확하게 절차를 따랐다. 10 분동안 매분마다 405 nm에서의 흡광도 측정치(490 nm에서의 기준 파장값을 빼고)로부터 Vmax 값을 추정하였다. 3중 배경 값(용해 완충제 단독)의 평균을 모든 샘플로부터 감하였다. 데이터는 미처리 샘플에서의 세포자살 대비 증가 배수로 나타낸다.
도 43은 DNA 단편화로 검출시 공-배양 분석법에서 2+2 이중특이성 구축물에 의한 DLD-1 및 H460 종양 세포주에서의 세포자살 유도를 나타낸다. DR5-결합 성분으로 드로지투맙을 함유하는 이중특이성 구축물은 FAP의 부재하에서 이미 세포자살을 유도하지만, 면역화에 의해 유도된 새로운 DR5 결합제를 함유하는 모든 구축물은 FAP의 존재하에서만 세포자살을 유도한다. 0011-28H1 및 0016-28H1과 같이, 새로 개발된 DR5 결합제를 갖는 구축물은, 드로지투맙 함유 이중특이성 구축물에 비해 특히 저농도에서 더 높은 정도로 세포자살을 유도할 수 있다.
실시예 30: 2+2 이중특이성 포맷의, 면역화 및 파지 디스플레이에 의해 유도된 DR5 -결합제 의 세포 결합의 특성화
얼음위에서 1 시간동안 염색 완충제(PBS + 5% FCS) 중의 각각의 DR5-FAP 구축물 또는 드로지투맙 24 ㎍/ml로 세포를 염색하였다(5x104/50 ㎕). 2회 세척후에, 2차 항체 염소 항-인간 IgG-AF488(인비트로겐 #A11013)을 10 ㎍/ml로 첨가하고, 세포를 다시 얼음위에서 직사광으로부터 보호하여 1 시간동안 배양하였다. 2회의 추가 세척 단계 후에, 세포를 FACS 칸토(Canto)에서 측정하였다.
모든 검사된 구축물들은 달라지는 강도하에 MDA-MB-231에 대한 결합을 나타낸다(도 44 참조).
실시예 31: 면역화에 의해 유도된 DR5 항체의 VH 및 VL 도메인의 인간화
인간 생식계 서열과 동일한 프레임워크를 사용하여 토끼 DR5-결합 항체 DR5TAA-0011을 인간화시켰다. 인간 생식게 서열 hVH_3_64(진뱅크 등록번호 M99682) 및 hVH3_16(진뱅크 등록번호 P01767)은 VH 인간화 변이체에 대한 2개의 수용체(acceptor)였고, 인간 생식계 서열 hVK1_93(등록번호 P04431) 및 hVK1_5(진뱅크 등록번호 P01602)는 VL 인간화에 대한 수용체였다. 서열번호 23 및 26으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 구축물 및 서열번호 24, 29, 30, 31 및 32로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 구축물을 포함하는 8개의 인간화 DR5 항체를 수득하고 더 특성화하였다(실시예 27 내지 29).
면역화에 유도된 인간화 DR5 결합제
변이체 HC 변이체 서열번호 LC 변이체 서열번호
DR5TAA-0066 VH7 23 VL3 30
DR5TAA-0067 VH7 23 VL15 24
DR5TAA-0068 VH17 26 VL10 31
DR5TAA-0071 VH17 26 VL15 24
DR5TAA-0072 VH17 26 VL2 32
DR5TAA-0073 VH17 26 VL3 30
DR5TAA-0074 VH7 23 VL10 31
DR5TAA-0075 VH7 23 VL11 29
실시예 32: 면역화에 의해 유도된 인간화 DR5 -결합제의 기능적 특성화
가교결합 항체의 존재 또는 부재하에서 인간화 항-DR5 항체로 처리시, 세포 사멸 검출 ELISA(CDDE, 로슈 #11 774 425 001)로 측정된 바와 같은 세포자살을 평가함으로써 인간화 DR5 항체를 기능적으로 특성화시켰다.
세포의 제조: 부착성 MDA-MB-231 세포주(인간 유방암)는, 10% 소 태아 혈청(깁코) 및 2 mM L-글루타민(PAA)으로 보충된 DMEM 배지(PAN)에서 성장되었으며, 정상적으로 1주일에 2회 1:10으로 분열되었다. 분석을 위해, 세포를 PBS로 세척하고, 어큐타제(PAA)로 플라스크로부터 분리시키고, 96-웰 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(코스타)에 50 ㎕중에 1x104 세포/웰(CDDE)의 밀도로 접종하고, 37 ℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다.
인간화 항-DR5 항체에 의한 세포자살의 유도: 샘플(인간화 항-DR5 IgG, DR5-TAA-#)을, 상이한 농도로 단독으로 또는 PBS 중에서 50 ㎕ 중 1:1 비로 가교결합 항체(염소 항-인간 IgG, 시그마 #I2136)와 함께 세포에 가하여, DR5 수용체의 가교결합을 유도하여 세포자살을 유도하였다. 세포는 37 ℃에서 24 시간(CDDE)동안 배양하였다.
세포 사멸 검출 ELISA(CDDE): 면역분석법을 제조사의 지시에 따라(로슈) 수행하였다. 간략하게, 상등액을 조심스럽게 흡인하고, 세포를 RT에서 200 ㎕/웰 용해 완충제로 30 분동안 용해시켰다. 항-히스톤 및 항-DNA 항체로 이루어진 마스터 혼합물을 제조사의 지시에 따라 제조하고, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 편평한 바닥의 미세적정 플레이트(로슈) 상에서 1:4 희석 용해물과 혼합하였다. RT에서 2시간 배양후, 웰을 세척하고, ABTS 기질을 첨가하고, 광도측정 분석에 충분한 색이 발색될 때까지(10 내지 30 분) RT에서 배양하였다. 테칸 스펙트라 레인보우 판독기로 405 nm에서 흡광도를 판독하였다. 세포자살 신호는 2 ㎍/ml의 농도에서 키메라 항-DR5 항체의 세포자살로 표준화시켰다.
결과는 도 45에 나타내었다: 45a DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0066 내지 DR5TAA-0075, 검은색 선)는 2차 항체와 가교결합시 용량-의존성 방식으로 세포자살을 유도한다. DR5TAA-0067, DR5TAA-0071, DR5TAA-0074 및 DR5TAA-0075와 같은 여러개의 인간화 변이체가, 키메라 변이체(DR5TAA-0052, 회색 선)에 비해, 유도 및 용량-의존성의 최대치에 관해 유사한 방식으로 세포자살을 유도할 수 있다. 45b DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0066 내지 DR5TAA-0075)는 2차 항체에 의해 가교결합되지 않는 경우 세포자살을 유도하지 않는다. 따라서, 또한 인간화 변이체는 FAP의 존재하에서만 특이적으로 세포자살을 유도하는 이중특이성 포맷에 사용되기에 적합하다.
선택되는 인간화 변이체의 Fab는 (G4S)4 연결자를 통해 인간 Fc 영역에 C-말단에 융합되었다. 상기 분자들은 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되고, 단백질 A 비드를 통해 정제되고, 세포자살 유도 분석법에서 검사되었다. 도 22b에, 2차 항 Fc IgG와의 가교결합후 상기 Fc-DR5 융합 분자를 갖는 MDA-MB-231 세포에서의 DNA 단편화 분석의 결과가 요약되어 있다. 모든 검사한 분자들은 표적 세포주의 세포자살을 유도할 수 있으며, 이것은 선택되는 DR5 결합제가 N-말단상에서 차단되지 않아 상기 결합제와 함께 사용될 수 있는 광범위한 포맷을 확대시킴을 시사한다.
실시예 33: 면역화에 의해 유도된 인간화 DR5 -결합제 의 결합 친화도의 특성화
인간화 DR5-결합제를 SPR 분석에 의해 그의 결합 친화도에 대해 특성화하였다. 비아코어 특성화: 비아코어 3000 기기(지이 헬쓰케어)를 시스템내에 탑재된 CM5 센서와 함께 사용하였다. 상기 센서는 0.1% SDS, 50 mM NaOH, 10 mM HCl 및 100 mM H3PO4을 100 ㎕/분으로 1 분간 주입함으로써 미리조정하였다. 시스템 완충제는 10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20이었다. 샘플 완충제는 1 mg/ml 카복시메틸덱스트란(시그마)으로 보충된 시스템 완충제였다. 항-인간 항체 포획 시스템은 바이오센서 표면위에 설치하였다. 8000 상대 반응 단위의 염소 항-인간 Fcγ 단편-특이적 다클론성 항체(잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories))를 EDC/NHS 화학을 이용하여 제조사의 지시에 따라 고정화시켰다. 1M 에탄올아민을 사용하여 센서를 탈활성화시켰다.
20 nM의 각각의 항체 샘플을 10 ㎕/분의 유량으로 1 분동안 포획하였다. 기준으로, 20 nM 다클론성 인간 정상 IgG(로슈, Ident. 11717570)를 기준 유동 세포 1 상에서 포획하고 마이너스 신호를 모니터링하였다.
한 태양에서, 23.3 kDa 분석물 DR5를 30 ㎕/분으로 3 분의 결합 시간동안 0 nM, 3.3 nM, 11 nM, 2 x 33 nM, 100 nM 및 300 nM의 일련의 농도로 주입하였다. 복합체 해리는 5 분동안 모니터링하였다.
30 ㎕/분으로 10 mM 글리신 완충제(pH 1.5)를 1 분간 주입한 후 10 mM 글리신 완충제(pH 1.7)를 2회 연속 1 분씩 주입하여 시스템을 재생시켰다. 비아코어 평가 소프트웨어를 제조사의 지시에 따라 사용하여 동적 파라미터를 평가하였다.
결합 속도 상수 ka(1/Ms), 해리 속도 상수 k d (1/s) 및 해리 상수 KD는 RMAX 글로벌(global)하에 랭뮤어 모델에 따라 산출하였다.
DR5TAA-0011의 키메라 형태(DR5TAA-0052)와 비교시 DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0067 내지 DR5TAA-0075)의 단량체성 인간 DR5에 대한 동적 친화도
구축물 서열번호 VH/VL ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
DR5TAA-0067 23/24 2,6E05 5.2E-03 20
DR5TAA-0074 23/31 2.7E05 5.6E-03 21
DR5TAA-0071 26/24 3.0E05 4.6E-03 15
DR5TAA-0075 23/29 3.2E05 5.6E-03 17
DR5TAA-0052 90/92 3.5E05 2.4E-03 7
인간화 변이체들의 동적 결합 성질은, 키메라 변이체에 비해, KD 및 kd의 경우 약 3배 이내에서 유지되고 ka의 경우 약 2배 이내에서 유지되었다.
실시예 34: 면역화에 의해 유도된 인간화 DR5 -결합제 의 열 및 화학 안정성의 특성화
인간화 DR5-결합제를 그의 열 및 화학 안정성에 대해 특성화하였다. 샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl(pH 6.0) 중에서 1 mg/ml의 농도로 제조하고, 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통해 원심분리에 의해 광학 384-웰로 옮기고, 파라핀 오일로 덮어주었다. 샘플을 0.05 ℃/분의 속도하에 25 ℃로부터 80 ℃로 가열하면서 동적 광 산란에 의해 유체역학적 반경을 반복적으로 측정하였다. 응집 개시 온도는 유체역학적 반경이 증가되기 시작하는 온도로 정의된다.
항체의 열 안정성의 척도로서 DR5TAA-0011의 인간화 변이체(DR5TAA-0066 내지 DR5TAA-0075)의 응집 개시 온도
구축물 서열번호 VH/VL Tagg [℃]
DR5TAA-0071 26/24 71
DR5TAA-0067 23/24 70
DR5TAA-0074 23/31 68
DR5TAA-0073 26/30 72
DR5TAA-0068 26/31 69
DR5TAA-0072 26/32 71
DR5TAA-0066 23/30 71
DR5TAA-0075 23/29 68
DR5TAA-0011의 인간화 변이체는 68 ℃ 이상의 응집 온도하에 높은 열안정성을 나타낸다.
화학 안정성
스트레스받은 DR5 항체 샘플의 생성: DR5 항체의 화학 안정성을 검사하기 위해, 스트레스받은 샘플을 생성하고, DR5 결합에 관해 기능적으로 특성화시켰다. 고-pH 스트레스는 특히 반응성 Asn 핫스팟의 탈아미드화를 유도하는 반면, pH 6.0에서, 예를 들면, 반응성 Asn 및 Asp 잔기로부터 숙신이미드 생성이 유도될 수 있다. 고-pH 스트레스를 위해, 샘플을 20 mM Na-포스페이트(pH 8.0)로 옮기고 40 ℃에서 5 일동안 배양하였다. 저-pH 스트레스를 위해, 샘플을 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl(pH 6.0)로 옮기고, 40 ℃에서 3 주동안 배양하였다. 대조군 샘플은 -80 ℃에서 유지시켰다.
스트레스받은 DR5 항체 샘플의 분석: 비아코어 3000 기기(지이 헬쓰케어)를 시스템내에 탑재된 CM5 센서와 함께 사용하였다. 상기 센서는 0.1% SDS, 50 mM NaOH, 10 mM HCl 및 100 mM H3PO4을 100 ㎕/분으로 1 분간 주입함으로써 미리조정하였다. 시스템 완충제는 10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20이었다. 샘플 완충제는 1 mg/mL 카복시메틸덱스트란(시그마)로 보충된 시스템 완충제였다. 항-인간 항체 포획 시스템은 바이오센서 표면위에 설치하였다. 8000 상대 반응 단위의 염소 항-인간 Fcγ 단편-특이적 다클론성 항체(잭슨 래버러토리즈)를 EDC/NHS 화학을 이용하여 제조사의 지시에 따라 고정화시켰다. 1M 에탄올아민을 사용하여 센서를 탈활성화시켰다.
20 nM의 각각의 항체 샘플을 10 ㎕/분의 유량으로 1 분동안 포획하였다. 기준으로, 20 nM 다클론성 인간 정상 IgG(로슈, Ident. 11717570)를 기준 유동 세포 1 상에서 포획하고 마이너스 신호를 모니터링하였다.
또 다른 태양에서, 분석물을 0 nM 및 500 nM에서 2 분의 결합 시간동안 100 ㎕/분으로 주입하였다. 복합체 해리는 5 분동안 모니터링하였다.
스트레스 검사 전 및 후의 DR5TAA-0011의 인간화 변이체의 상대 활성 농도
구축물 서열번호 VH/VL 초기
(확정)		 pH 6.0 2주 40℃
초기 상태와 비교한
상대 활성 농도		 pH 7.4 2주 40℃
초기 상태와 비교한
상대 활성 농도
DR5TAA-0071 26/24 100% 103% 98%
DR5TAA-0067 23/24 100% 107% 107%
DR5TAA-0074 23/31 100% 103% 100%
DR5TAA-0073 26/30 100% 104% 101%
DR5TAA-0068 26/31 100% 103% 101%
DR5TAA-0072 26/32 100% 105% 101%
DR5TAA-0066 23/30 100% 102% 100%
DR5TAA-0075 23/29 100% 102% 99%
30 ㎕/분으로 10 mM 글리신 완충제(pH 1.5)를 1 분간 주입한 후 10 mM 글리신 완충제(pH 1.7)를 2회 연속 1 분씩 주입하여 시스템을 재생시켰다. 비아코어 평가 소프트웨어를 제조사의 지시에 따라 사용하여 동적 파라미터를 평가하였다.
항체/항원 복합체 반감기를 식 ln(2)/(60*kd)에 따라 분으로 산출하였다. 몰비를 산출하였다: MW(항체)/MW(항원) * BL(항원)/CL(항체).
데이터 기록점을 항체 주입 종료 직전에(항체 포획 수준, CL) 뿐 아니라, 분석물(후반 결합, BL) 주입 직전에 기록하였다. 포획 수준(CL) 및 후반 결합(BL) 반응 신호 높이를 이용하여 항체 결합 성능을 특성화하였다. 상대 결합 지수는 BL/CL로 산출하였다. 지수는 항체 샘플 대 비-스트레스 영향받은 항체 샘플의 상대 결합 지수로부터 달성되었다(상대 활성 결합).
결과는 표 27에 나타내었다. DR5TAA-0011의 인간화 변이체를 스트레스 검사에 적용하였다. 인간화 변이체 중 어느 것도 비-스트레스 초기 물질에 비해 인간 DR5에 대해 손상된 결합을 나타내지 않았다.
실시예 35: 재료 및 방법
달리 언급되지 않는 한, 하기의 물질들 및 방법을 상기에 개략한 실험들에서 사용하였다.
재조합 DNA 기술
모든 항체 및 항원 발현 벡터는 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 권고에 따라 사용하였다. 유전자 또는 유전자 단편은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키거나, 진아트(Geneart) AG(독일 레겐스부르크)의 합성 올리고뉴클레오티드로부터 자동 유전자 합성에 의해 생성하였다. PCR-증폭되거나 서브클로닝된 DNA 단편은 DNA 서열분석(시너진(Synergene) GmbH, 스위스)에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA는, 표준 맥시프레프(Maxiprep) 키트(키아겐)를 사용하여 형질감염-등급 플라스미드 DNA의 제조에 적절한 에스케리치아 콜라이 숙주 균주로 형질전환시키고 상기 숙주 균주에서 증폭시켰다. 이중특이성 분자의 제조를 위해, HEK293 EBNA 세포를, 표준 폴리에틸렌이민(PEI) 기반 방법을 이용하여 각각의 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 3개 발현 벡터들의 사용된 플라스미드 비는 1:1:1이었다. 형질감염된 세포는 7 일동안 배양한 후 정제를 위해 상등액을 수거하였다.
HEK293 EBNA 세포의 형질감염
본원에서 사용된 모든 (이중특이성) 항체 및 항원(상업적 공급원으로부터 수득되지 않은 경우)은, 하기에 기술되는 바와 같은 필요한 벡터를 위한 PEI 매개 형질감염 절차를 이용하여 HEK 293 EBNA 세포에서 일시적으로 생성되었다.
HEK293-EBNA 세포는 CD CHO 배양 배지중에서 무혈청 현탁액 중에서 배양하였다. 500 ml 교반 플라스크에서의 생성을 위해, 4억개 HEK293-EBNA 세포를 형질감염 24 시간전에 접종하였다. 형질감염을 위해 세포를 210　x　g로 5 분동안 원심분리시키고, 상등액을 예열된 20　ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20　ml CD CHO 배지 중에서 200　㎍ DNA의 최종량으로 혼합하였다. 540 ㎕ PEI의 첨가 후에 용액을 15 초동안 볼텍싱하고, 이어서 실온에서 10 분동안 배양하였다. 그 후에 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500　ml 교반 플라스크로 옮기고 5　% CO2 대기하에 배양기에서 37 ℃에서 3 시간동안 배양하였다. 배양 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고 세포를 24 시간동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1　mM 발포르산 및 7% 공급물 1을 첨가하였다. 7 일간 배양한 후, 210 x g에서 15 분동안 원심분리에 의한 정제를 위해 상등액을 수거하고, 용액을 멸균 여과(0.22　㎛ 필터)시키고, 나트륨 아지드를 0.01% w/v의 최종 농도로 가하고, 4 ℃에서 유지하였다. 생성후에, 상등액을 수거하고 항체 함유 상등액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과시키고 정제까지 4 ℃에서 저장하였다.
정제: 표준 + 단백질A 비드
단백질을 HEK293 EBNA 세포에서의 일시 발현에 의해 생성하였다. 본원에 기술된 모든 이중특이성 분자들은 표준 절차, 예를 들면, 단백질A 친화성 크로마토그래(액타 익스플로러(Akta Explorer)) 및 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스 200)를 사용하여 2 단계로 정제하였다.
상등액을 pH　8.0으로 조정(2　M 트리스, pH　8.0 사용)하고, 완충제 A(50　mM 인산나트륨, pH　7.0, 250　mM NaCl)로 평형화된 트리콘(Tricorn, 등록상표) 5/50 컬럼(지이 헬쓰케어, 컬럼 부피(cv)　=　1　ml)에 충전된 맙셀렉트 슈어 레진(Mabselect Sure resin)(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 적어도 5 컬럼 부피(CV)의 완충제 A로 세척하여 미결합 단백질을 제거하였다. 해당 단백질을 12 CV에 걸쳐 0 내지 100% 완충제 B(50　mM 인산나트륨, pH　7.0, 1　M NaCl)의 선형 pH-구배로 용출시켰다. 최종적으로, 10 CV의 완충제 B를 사용한 추가의 단계에 이어 5 CV 완충제 A의 평형화 단계를 포함시켰다. 해당 단백질을 함유하는 분획들을 취합하고 pH를 점차적으로 pH　6.0으로 조정(2　M 트리스 pH　8.0 사용)하였다. 한외-농축기(비바스핀(Vivaspin) 15R 30.000　MWCO HY, 사토리우스(Sartorius))를 사용하여 샘플을 0.5 내지 2 ml로 농축시키고, 이어서 20　mM 히스티딘(pH　6.0), 140　mM NaCl, 0.01% 트윈-20으로 평형화된 하이로드(HiLoad, 등록상표)　16/60 슈퍼덱스(등록상표) 200 예비용 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용하였다. 용출된 분획들의 응집체 함량을, 25 ℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7)에서 평형화시킨 TSK겔 G3000 SW XL 분석용 크기-배제 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다. 2% 미만의 올리고머를 함유하는 분획을 취합하고, 한외 농축기(비바스핀 15R 30.000　MWCO HY, 사토리우스)를 사용하여 1 내지 1.5 mg/ml의 최종 농도로 농축시켰다. 정제된 단백질을 액체 N2 중에서 냉동시키고 -80 ℃에서 저장하였다
신속하고 고-처리량 정제를 위해, 상등액을 2 M 트리스-HCl(pH 8.0)의 1/40th 컬럼을 사용하여 중화시키고, 4 ℃에서 단백질A 세파로스 패스트 플로우 비드(지이 헬쓰케어 카탈로그 번호 17-5138-01)와 함께 19 시간동안 회전시키며 배양하였다. 이어서, 상등액/비드 혼합물을 빈, 평형화된 PD-10 컬럼(지이 헬쓰케어 카탈로그 번호 17-0435-01) 위로 중력 유동에 의해 통과시켰다. 보유된 비드를 결합 완충제(10 mM 트리스, 50 mM 글리신, 100 mM NaCl, pH 8.0)로 2회 세척하고, 항체를 저 pH 단계(10 mM 트리스, 50 mM 글리신, 100 mM NaCl, pH2.5)로 용출시켰다. 마지막으로, 용출된 단백질을 1/40th 부피의 2M 트리스-HCl(pH 8.0)를 첨가하여 중화시켰다. 정제된 항체의 단백질 함량을 280 nm에서 측정된 흡광도 및 아미노산 서열로부터 산출된 몰 흡광 계수로부터 산출하였다. 항체 샘플의 응집체 함량은, 25 ℃에서 작업 완충제(200 mM 인산나트륨, 0.02% 나트륨 아지드, pH 7.0)에 평형화시킨 조르박스 GF-250 분석용 크기 배제 컬럼(에이질런트 카탈로그 번호 PSMO 845006)을 사용하여 분석하였다.
FACS 결합 분석
모든 사용된 표적 세포주를, 세포자살 분석을 수행하기 전에, 종양-관련 항원 및 DR5 사멸 수용체의 상대 발현 수준에 대해 분석하였다.
세포의 수 및 생존율을 측정하였다. 이를 위해, 부착하여 성장하는 세포를 세포 해리 완충제(깁코 - 인비트로겐 # 13151-014)로 분리시켰다. 세포를 원심분리(4 분, 400 x g)에 의해 수거하고, FACS 완충제(PBS/0.1% BSA)로 세척하고, 세포 수를 FACS 완충제 중에서 1.111 X 106 세포/ml로 조정하였다. 96 웰 환저 플레이트의 웰 당 180 ㎕의 상기 세포 현탁액을 사용하여, 웰 당 2 x 105 세포를 제공하였다. 세포를, 적절히 희석된 제 1 항체와 함께 4 ℃에서 30 분동안 배양하였다. 이어서, 세포를 원심분리(4 분, 400 x g)에 의해 수거하고, 상등액을 완전히 제거하고, 세포를 150 ㎕의 FACS 완충제로 1회 세척하였다. 세포를 4 ℃에서 어두운 상태에서 12 ㎕의 희석된 2차 항체(비표지된 1차 항체를 사용한 경우에) 또는 FACS 완충제에 30 분동안 재현탁시켰다. FACS 완충제로 2회 세척 단계 후에, 세포를 200 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁시키고, HTS FACS칸토 II(비디, 소프트웨어 FACS 디바)에서 분석하였다. 또는, 세포를 4 ℃에서 FACS 완충제 중에서 200 ㎕의 2% PFA(파라폼알데하이드)를 사용하여 20 분동안 고정시키고 나중에 분석할 수 있다. 모든 분석은 3중으로 수행하였다.
FACS 결합 분석을 위한 항체 및 농도
항체 공급원 설명 농도
[mg/ml]		 검사시 농도
[㎍/ml]
1. 1차 항체
항 hu DR5 (TRAIL R2) 알앤디 #MAB631 mu IgG1,
클론 71903		 0.5 5 - 10
드로지투맙 사내 hu IgG1 3.8 10
4G8 사내 hu IgG1 20.5 15
마우스 항-인간 FAP 칼바이오켐 #OP188 mu IgG1 1 10
드로지투맙-scFab-FAP 사내스 1.34 25
드로지투맙-X-FAP_A 1.44 25
드로지투맙-X-FAP_B 0.83 25
5E11_28H1_N-말단 VHVL 2.55 나타낸 바와 같음
5E11_28H1_N-말단 CH1CL 1.12 나타낸 바와 같음
5E11_28H1_C-말단 CH1CL 4.0 나타낸 바와 같음
2. 2차 항체
PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 잭슨 이뮤노리서치 랩 # 109-116-170 1:20 희석
FITC-접합된 F(ab')2 염소 항-마우스 IgG 특이적 세로텍 # STAR105F 1:20 희석
FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 잭슨 이뮤노리서치 랩 # 109-096-098 1:20 희석
비아코어 분석(표면 플라즈몬 공명, SPR )
IgG로서 또는 이중특이성 포맷으로 다양한 항-DR5 결합제들의 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 평가하였다. 모든 SPR 실험은 25 ℃에서 런닝 완충제(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 서팩턴트 P20, 비아코어, 프라이부르크/독일)로서 HBS-EP를 사용하여 비아코어 T100 상에서 수행하였다.
DR5 결합제의 종 교차-반응성의 측정을 위해, 마우스, 인간 및 사이노몰구스로부터의 비오티닐화 DR5를, 각각 약 300 RU의 고정화 수준하에 스트렙타비딘(SA) 센서 칩의 상이한 유동 세포들에 직접 커플링시켰다. IgG로서 다양한 DR5 결합제들을 500, 100 및 25 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량하에 60 초동안 주입한 후, 90 초의 해리 단계가 이어졌다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
두 번째 실험으로, huDR4Fc, huDcR1Fc, huDcR2Fc 및 rhuOPGFc를 아민 커플링에 의해 CM5 센서 칩에 고정화시킴으로써 DR5 결합제의 특이성을 측정하였다. 고정화 수준은 100 내지 400 RU이었다. 각각의 결합제를 500, 100 및 25 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량하에 60 초동안 상이한 유동 세포 위로 통과시키고 해리 단계를 90 초동안 모니터링하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
또한, IgG 및 2+2 포맷의 결합활성을 CM5 칩 상에서 고정화 인간 및 사이노몰구스 DR5 ECD를 사용하여 측정하였다(고정화 수준은 약 100 RU이었다). 각각의 구축물 또는 IgG를 1:2 희석 단계로 500 내지 0.97 nM의 농도에서 30 ㎕/분으로 90 초동안 상이한 유동 세포 위로 통과시켰다. 해리는 120 초동안 분석하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 동적 분석 또는 정상 상태 분석으로서 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식에 적합하도록, 동적 상수들을 비아코어 T100 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 산출하였다.
친화도는, 항-인간 Fab 또는 항-인간 Fc 항체(비아코어, 프라이부르크/독일)를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 프라이부르크/독일)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에 직접 커플링시킨 포획 포맷을 이용하여 평가하였다. 고정화 수준은 약 8,000 내지 10000 RU이었다. IgG 또는 2+2 포맷에서 DR5 결합제는 각각 50 또는 30 nM의 농도에서 30 ㎕/분의 유량으로 60 초동안 포획하였다. 1:2 희석 단계로 500 내지 0.975 nM(사이노몰구스 DR5) 또는 1000 내지 0.975 nM(huDR5)의 농도 범위에서 30 ㎕/분으로 120 초동안 인간 또는 사이노몰구스 DR5의 주입을 2+2 포맷에 대해 수행하였다. IgG의 친화도는 1:3 희석 단계로 2000 내지 20 nM의 농도에서 huDR5에 대해서만 측정하였다. 해리는 120 초의 시간동안 평가하였다. 단백질이 고정화되지 않은 기준 유동 세포 상에서 수득된 반응을 감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 동적 분석 또는 정상 상태 분석으로서 수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식에 적합하도록, 동적 상수들을 비아코어 T100 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 웁살라/스웨덴)를 사용하여 산출하였다.
전형적인 샌드위치 분석법으로 또는 탠덤 접근방법으로, 2개의 상이한 포맷으로 에피토프 비닝을 측정하였다. 전형적인 샌드위치 분석법에서는, 각각의 DR5 결합제를 아민 커플링에 의해 약 500 RU의 표적 고정화 수준하에 CM5 칩 표면 상의 한 유동 세포에 직접 고정화시켰다. 이어서, huDR5를 500 nM의 농도에서 60 초동안 각각의 유동 세포 위로 통과(유량 30 ㎕/분)시킨 후 또 다른 DR5 결합제를 30 nM의 농도에서 60 초동안 주입(유량 30 ㎕/분)하였다. 해리는 동일한 유량하에 60 초의 시간동안 모니터링하였다. 고정화된 것과 동일한 DR5 결합제의 주입을 대조군으로 이용하는데, 모든 DR5가 고정화된 결합제에 의해 결합되는 경우 반응 증가를 야기하지 않아야 하기 때문이다.
탠덤 접근방법에서는, huDR5ECD를 250 RU의 최종 반응하에 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 첫번째 DR5 결합제를 20 nM의 농도에서 90 초동안 유동 세포 위로 통과시킨 후, 두번째 DR5 결합제를 90 초동안 주입하였다. 해리는 90 초의 시간동안 모니터링하였다. 유량은 모든 단계에서 30 ㎕/분이었다. 2개의 결합제가 상이한 에피토프를 인식하는 경우, 반응 단위에서의 증가를 관찰할 수 있었다. 모든 DR5 분자가 1차 주입에 의해 포화되고 동일 에피토프에 대한 추가의 결합이 일어날 수 없는 것을 확인하기 위해 동일한 DR5 결합제의 주입을 대조군으로 이용하였다.
결합제 중 어느 것이 리간드 차단성인 지를 더 측정하기 위해, rhuTRAIL(페프로테크(Peprotech) 카탈로그 번호 310-04)을 2000 RU의 고정화 수준하에 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정화시켰다. huDR5 Fc 또는 huDR5 ECD를 검사할 각각의 DR5 결합제와 복합체화시키고(500 nM IgG와 100 nM DR5), 복합체를 50 ㎕/분의 유량하에 90 초동안 유동 세포 위로 통과시켰다. 해리는 120 초의 시간동안 평가하였다. 또한, 전형적인 샌드위치 분석법을 이용하여, huDR5Fc 또는 huDR5 ECD를 먼저 100 nM에서 주입한 후 각각의 DR5 결합제를 500 nM에서 주입하였다. 접촉 시간은 30 ㎕/분의 유량하에서 DR5의 경우 60 초 및 IgG의 경우 90 초였다. 해리 단계는 90 초동안 수행하였다. DR5 이외에, TRAIL에 결합할 수 있는 결합제를 비-리간드 차단성인 것으로 간주한 반면, 어떤 추가의 결합도 나타내지 않은 결합제는 리간드 차단성인 것으로 간주하였다.
2+2 포맷의 다양한 DR5 결합제들의 동시 결합을 고정화된 huDR5Fc 비오틴(고정화 수준 약 1000 RU)을 함유하는 SA 칩 상에서 확인하였다. 제 1 단계에서, 2+2 구축물을 90 초동안 주입한 후 인간 또는 뮤린 FAP를 500 또는 100 nM의 농도에서 90 초동안 주입하였다. 해리는 60 초동안 모니터링하였다. 모든 단계에서 유량은 30 ㎕/분이었다. 동시 결합은, 인간 또는 뮤린 FAP의 주입시 반응 단위에 추가의 증가가 관찰된 경우 확실한 것으로 간주하였다.
전형적인 샌드위치 분석법으로 또는 탠덤 접근방법으로, 2개의 상이한 포맷으로 에피토프 비닝을 측정하였다. 전형적인 샌드위치 분석법에서는, 각각의 DR5 결합제를 아민 커플링에 의해 약 500 RU의 표적 고정화 수준하에 CM5 칩 표면 상의 한 유동 세포에 아민 커플링에 의해 직접 고정화시켰다. 이어서, huDR5를 500 nM의 농도에서 60 초동안 각각의 유동 세포 위로 통과(유량 30 ㎕/분)시킨 후 또 다른 DR5 결합제를 30 nM의 농도에서 60 초동안 주입(유량 30 ㎕/분)하였다. 해리는 동일한 유량하에 60 초의 시간동안 모니터링하였다. 고정화된 것과 동일한 DR5 결합제의 주입을 대조군으로 이용하는데, 모든 DR5가 고정화된 결합제에 의해 결합되는 경우 반응 증가를 야기하지 않아야 하기 때문이다.
탠덤 접근방법에서는, huDR5ECD를 250 RU의 최종 반응하에 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 이어서, 첫번째 DR5 결합제를 20 nM의 농도에서 90 초동안 유동 세포 위로 통과시킨 후, 두번째 DR5 결합제를 90 초동안 주입하였다. 해리는 90 초의 시간동안 모니터링하였다. 유량은 모든 단계에서 30 ㎕/분이었다. 2개의 결합제가 상이한 에피토프를 인식하는 경우, 반응 단위에서의 증가를 관찰할 수 있었다. 모든 DR5 분자가 1차 주입에 의해 포화되고 동일 에피토프에 대한 추가의 결합이 일어날 수 없는 것을 확인하기 위해 동일한 DR5 결합제의 주입을 대조군으로 이용하였다.
결합제 중 어느 것이 리간드 차단성인 지를 더 측정하기 위해, rhuTRAIL(프레프로테크 카탈로그 번호 310-04)을 2000 RU의 고정화 수준하에 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정화시켰다. huDR5 Fc 또는 huDR5 ECD를 검사할 각각의 DR5 결합제와 복합체화시키고(500 nM IgG와 100 nM DR5), 복합체를 50 ㎕/분의 유량하에 90 초동안 유동 세포 위로 통과시켰다. 해리는 120 초의 시간동안 평가하였다. 또한, 전형적인 샌드위치 분석법을 이용하여, huDR5Fc 또는 huDR5 ECD를 먼저 100 nM에서 주입한 후 각각의 DR5 결합제를 500 nM에서 주입하였다. 접촉 시간은 30 ㎕/분의 유량하에서 DR5의 경우 60 초 및 IgG의 경우 90 초였다. 해리 단계는 90 초동안 수행하였다. DR5 이외에, TRAIL에 결합할 수 있는 결합제를 비-리간드 차단성인 것으로 간주한 반면, 어떤 추가의 결합도 나타내지 않은 결합제는 리간드 차단성인 것으로 간주하였다.
2+2 포맷의 다양한 DR5 결합제들의 동시 결합을 고정화된 huDR5Fc 비오틴(고정화 수준 약 1000 RU)을 함유하는 SA 칩 상에서 확인하였다. 제 1 단계에서, 2+2 구축물을 90 초동안 주입한 후 인간 또는 뮤린 FAP를 500 또는 100 nM의 농도에서 90 초동안 주입하였다. 해리는 60 초동안 모니터링하였다. 모든 단계에서 유량은 30 ㎕/분이었다. 동시 결합은, 인간 또는 뮤린 FAP의 주입시 반응 단위에 추가의 증가가 관찰된 경우 확실한 것으로 간주하였다.
DNA 단편화 ELISA
유도된 세포자살의 측정을 위해, 로슈의 세포 사멸 검출 ELISA PLUS 키트를 사용하였다. 간략하게, (분리, 및 세포 수 및 생존율 측정 후에) 96-웰 플레이트의 웰 당 104 FAP 발현 GM05389 세포를 200 ㎕의 적절한 배지에 접종하고, 37 ℃에서 5% CO2 대기하에 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를, 세포자살 유도 항체, 대조군 항체 및 다른 대조군을 적절한 농도로 함유하는 100 ㎕의 새 배지로 교체하였다.
이중특이성 항체 및 IgG는 0.7 및 7 nM의 최종 농도로 또는 나타낸 바와 같이 사용하였으며; 가교결합 항체는 1차 항체와 동일한 몰농도로 사용하였다. 항체 첨가후, 웰 당 104 세포자살 민감성 종양 세포를 첨가하였다.
세포를 37 ℃, 5% CO2에서 24 시간동안 배양하여 세포자살을 유도하였다. 세포를 원심분리(10 분, 200 x g)에 의해 수거하고 실온에서 200 ㎕의 용해 완충제(키트에 의해 공급) 중에서 배양하였다. 비손상 DNA 및 용해된 세포를 원심분리(10 분, 200 x g)에 의해 침전시키고, 단편화된 DNA를 함유하는 상등액 20 ㎕를 세포자살 유도에 대한 제조사의 권고에 따라 분석하였다.
증식 억제( 셀타이터글로 )
세포 생존율 분석을 위해, 4,000개 종양 세포/웰(75 ㎕ 부피로)을 검은색의 투명 바닥 96 웰 플레이트(비디 팔콘 cat#BD353220)에 접종하고 37 ℃에서 가습된 5% CO2 대기하에서 밤새 배양하였다. 이어서, 25 ㎕ 4x DR5 결합제 +/- 토끼-Fc(동일한 나노몰의 DR5 결합제 및 Fc)를 6개 농도의 2.5x 연속 희석물로 첨가하였다. 37 ℃에서 5% CO2 하에 48 시간동안 배양한 후, 100 ㎕의 셀타이터-글로 시약을 각 웰에 가하고 웰을 혼합하였다. 실온에서 10 분동안 더 배양한 후, 수득된 세포 생존율을 발광 환경하에서 스펙트라 맥스 M5 플레이트로 측정하였다.
카스파제 8의 유도( 카스파제 글로)
카스파제 8 활성화 분석을 위해, 75 ㎕중 10,000개 암 세포/웰을 불투명한 백색 96 웰 플레이트(비디 팔콘 cat#BD353296)에 접종하고, 37 ℃에서 가습 배양기에서 5% CO2하에 밤새 배양하였다. 이어서, 25 ㎕ 4x DR5 결합제 +/- 항-Fc(동몰비의 DR5 결합제 및 항 Fc)를 6개 농도의 2.5x 연속 희석물로 첨가하였다. 37 ℃에서 5% CO2 하에 3 시간동안 배양한 후, 용해 완충제중 100 ㎕의 카스파제 8 기질을 각 웰에 가하였다. 37 ℃에서 30 분동안 더 배양한 후, 결과를 발광 환경하에서 스펙트라 맥스 M5 플레이트 판독기에서 판독하였다.
FRET 분석법
세포상에서 이중특이성 분자의 결합을, 시간-분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET) 분석법(태그라이트(TagLite)로 불림)을 이용하여 측정하였다. Hek EBNA 세포를 60 내지 80% 컨플루언시(confluency)까지 성장시키고, SNAP 태그 및 MalE TM에 융합된 DR5 ECD를 암호화하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 간략하게, 2 ㎍ DNA를 4 ml 옵티멤 배지 및 30 ㎕ 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로겐 카탈로그 번호 11668-019)과 혼합하였다. 혼합물을 RT에서 20 분동안 배양하였다. 그동안, T75 플라스크에서 성장한 부착성 H다 EBNA 세포를 5 ml D-PBS로 세척한 후, 형질감염 혼합물 및 배양 배지(6 ml)(DMEM, 10% FCS, 글루타맥스, 비-필수 아미노산)를 첨가하였다. 이어서, 세포를 37 ℃에서 가습 배양기(5% CO2)에서 밤새 배양하였다. 세포를 5 ml D-PBS로 세척한 후, 100 nM SNAP-Lumi4-Tb(시스바이오(Cisbio) 카탈로그 번호)를 함유하는 5 ml 태그라이트 완충제(시스바이오 카탈로그 번호)의 혼합물을 첨가하였다. 이에 의해 DR5에 융합된 SNAP 태그에 형광 염료의 결합이 야기되었다. 37 ℃에서 1 시간동안 배양한 후, 세포를 태그라이트 완충제로 세척하여 미결합 염료를 제거하였다. 이어서, 384 웰 포맷(리더(Reader), 빅터(Victor), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))의 10000개 세포의 620 nm(여기 343 nm)에서의 형광 신호를 측정하여 표지화 효능을 조사하였다. 이어서, 세포를 10% DMSO로 치환된 배양 배지에서 냉동시키고, -80 ℃에서 저장하였다.
결합 분석법을 수행하기 위해, 미리표지화된 세포를 해동하고, 세척하고, 웰 당 1000개 세포를, 50 내지 0.097 nM 범위의 최종 농도에서(1:2 희석 단계) 5 ㎕ 구축물 및 표지된 5 ㎕ 항-huFc-d2(최종 농도 150 nM)와 혼합하였다. RT에서 배양 0 시간, 1 시간 및 3 시간후에, 형광 공여체(터븀(Terbium))에 대해서는 620 nm에서 및 형광 수용체에 대해서는 665 nm에서 형광 신호를 측정하였다. 665/620*1000의 비를 산출하고, 기준(150 nM 항-huFc-d2를 갖는 세포)을 감하였다. KD 측정을 위해, 결과를 1개 부위 적합-특이적 결합하에 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)에서 분석하였다.
동적 광 산란( DLS )에 의한 열 안정성 측정
단백질의 열 안정성을 동적 광 산란(DLS)에 의해 모니터링하였다. 1 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 여과된 단백질 샘플 30 ㎍을 2중으로 다이나프로(Dynapro) 플레이트 판독기(와이엇 테크놀로지 코포레이션(Wyatt Technology Corporation), 미국)에 적용하였다. 반경 및 총 산란 강도를 수집하면서 온도를 25 ℃에서 75 ℃까지 0.05 ℃/분으로 상승시켰다.
Figure pct00007
실시예 36: 28H1 FAP 크로스 Fab와 함께 새로 단리된 DR5 결합제 5E11을 포함하는 DR5- FAP 이중특이성 항체의 생체내 항종양 효능
이중특이성 항체 DR5-FAP(VH 서열번호 7, VL 서열번호 8)의 생체내 항종양 효능을, 누드 마우스에 이식된 다양한 종양 기원(예를 들면, CRC 및 췌장암)의 세포 및 단편 기반 환자 유래(PDX) 모델에서 입증하였다. 예로서, CRC 이종이식 모델 DLD-1(세포주 기반, 공-주입 모델) 및 Co5896(단편 기반)에 대한 데이터를 나타내었다.
시험 약제
이중특이성 항체 DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)를 로슈(독일 펜츠베르크)로부터 저장 용액으로서 제공받았다. 항체 완충제는 히스티딘을 포함하였다. 항체 용액은 주입 전에 저장액으로부터 완충제에 대략 희석하였다.
세포주 및 배양 조건
DLD-1 인간 CRC 세포는 원래 ATCC로부터 수득하였다. 종양 세포주는 통상적으로, 37 ℃에서 수-포화 대기하에 5% CO2에서, 10% 소 태아 혈청, 2.0 mM L-글루타민, 10 mM HEPES으로 보충된 1.0 mM 나트륨 피루베이트를 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 3 일마다 트립신/EDTA 1x 분열하에 계대 배양을 수행하였다. 추가로, 뮤린 섬유아세포 NIH3T3은 ATCC로부터 구입하였으며, 1.0 mM 나트륨 피루베이트, FCS 10% 및 L-글루타민 2.0 mM을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다.
환자-유래 이종이식 모델( PDX )
CRC 종양 이종이식 Co5896은 원래 환자로부터 수득하였으며, 안정한 성장 패턴이 확립될 때까지 약 3 내지 5회 계대배양하였다. 후속 생체내 연구를 위해, Co5896 종양 단편을 누드 마우스에서의 연속 계대배양에서 이종이식편으로부터 수득하였다. 공여 마우스로부터 제거후에, 종양을 단편(4 내지 5　mm 직경)으로 절제하고, 피하 이식까지 PBS에 담가두었다. 이소플루오란 마취하의 마우스에게 옆구리에 한쪽 피하 종양 이식물을 주입하였다.
동물
누드 마우스를 사육자(예를 들면, 찰스 리버(Charles River), 독일 슐츠펠트)로부터 구입하고, 전용 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라서 12 시간 명/12 시간 암의 일일 주기하에 특정-병원체-비함유 조건하에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착후에, 새로운 환경에 익숙해지도록 하기 위해서 및 관찰을 위해 동물들을 동물 시설의 격리 구역에서 1 주일동안 유지시켰다. 계속적인 건강 모니터링을 규칙적으로 수행하였다. 상용 사료(프로비미 클리바(Provimi Kliba) 3337) 및 물(pH 2.5 내지 3으로 산성화)은 무제한으로 제공하였다.
모니터링
동물들을 매일 임상 증상 및 부작용 검출에 대해 조절하였다. 실험 전체에 걸친 모니터링을 위해 동물들의 체중을 기록하였다.
동물의 처리
동물 처리는 동물 무작위선정후 중간 종양 크기가 약 100 내지 200 mm3이었을 때 세포 또는 단편 이식 후에 개시하였다. 항체는 모델에 따라서 단일 약제로서 10 또는 30 mg/kg으로 정맥내로 1주일에 1회 또는 2회 수주동안 투여되었다. 상응하는 비히클을 같은 날에 투여하였다.
항체 효능
DLD -1 CDC 공-주입 세포주 기반 이종이식 모델
DLD-1 CRC 이종이식편 함유 마우스를, 연구 제 9 일부터 제 20 일까지 10 및 1.0 mg/kg의 투여량으로 4회동안 이중특이성 항체 DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)로 처리하였다. 그 결과, 이중특이성 항체 DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)에 의한 처리는, 피하 DLD-1 이종이식편에 대한 강한 항-종양 효능하에 용량-관련된 유의적 항-종양 효능을 나타내었다. 종양 성장 억제율(TGI)은 각각 89%(10 mg/kg) 및 79%(1.0 mg/kg)에서 산출되었다. 대조적으로, DR5 Fc 돌연변이 항체 드로지투맙 PG, LALA(10 mg/kg, 1주일에 1회)로 처리 후에는, 항-종양 효능이 주목되지 않았다(도 48 참조). 고 FAP 함량(DLD-1/NIH3T3 섬유아세포를 사용한 공-주입 연구; 비 80/20, 도 48) 및 저 FAP 함량(DLD-1/MRC5 섬유아세포를 사용한 공-주입 연구; 비 30/70, 데이터 나타내지 않음) 하에 유사한 결과가 수득되었다.
Co5896 CRC 단편 기반 환자 유래 이종이식 모델( PDX )
Co5896 CRC 이종이식편 함유 마우스를, 연구 제 18 일부터 제 34 일까지 30 mg/kg의 용량에서 6회동안 이중특이성 항체 DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)로 처리하였다. 그 결과, 이중특이성 항체 DR5-FAP(DR5 결합제: VH 서열번호 7, VL 서열번호 8, FAP 결합제: VH 서열번호 15, VL 서열번호 16)에 의한 처리는, 피하 Co5896 환자-유래 이종이식편에 대한 강한 항-종양 효능하에 유의적인 항-종양 효능을 나타내었다. 종양 성장 억제율(TGI)은 76%에서 산출되었다(도 49). 다른 CRC 세포 모델에서도 유사한 결과가 수득되었다(데이터 나타내지 않음).
실시예 36: 인간 종양에서 FAP 출현율
인간 종양에서 FAP의 출현율을 IHC에 의해 평가하여 이중특이성 DR5-FAP 항체의 가능한 임상적 용도에 대한 정보를 얻었다.
비타텍스(Vitatex)로부터의 래트 항-인간 세프라제(Seprase) 항체(IgG2a, 클론 D8)(MABS1001)를 사용하여 벤타나 벤치마크 XT(Ventana Benchmark XT) 상의 다양한 종양 징후로부터의 2.5 ㎛ FFPET 절편을 면역염색시켰다. 절편들을 표준 CC1 처리에 적용한 후, 다코(Dako) 항체 희석제((S3022) 중에 5 ㎍/ml의 농도로 37 ℃에서 60 초동안 항체를 배양하고, 울트라뷰(Ultraview) DAB 검출 시스템(벤타나 #760-4456)을 사용하여 양성 염색을 검출하였다. Abcam으로부터의 부합되는 이소타입 항체(ab18450)를 음성 대조군으로 사용하였다.
이중특이성 DR5-FAP 항체에 대한 잠재적으로 흥미로운 임상 징후를 나타내는 두경부 편평세포암(HNSCC), 유방암, 대장암(CRC), 췌장암(PAC), 위암, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 중피종을 포함한 다양한 징후의 인간 종양에 FAP+ 기질 침윤물이 존재하였다(표 30).
인간 종양에서 FAP 출현율
종양 유형 중간 내지 높은 등급의 FAP + 침윤물을 갖는 경우 % 조사된 샘플의 n
HNSCC 90 10
유방암 77 105
3중 음성 BC 80 7
CRC 77 90
PAC 74 19
위암 68 28
NSCLC 66 90
중피종 60 10
서열
1. 파지 디스플레이 유래 DR5 결합제의 아미노산 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
2. 비-기능성 파지 디스플레이 유래 DR5 결합제 의 아미노산 서열
(CDRH1 = 서열번호 1, CDRH2 = 서열번호 2, CDRL1 = 서열번호 4 및 CDRL2 = 서열번호 5)
Figure pct00010
3. FAP 결합제 의 아미노산 서열
Figure pct00011
4. 통상적인 DR5 결합제를 포함하는 이중특이성 분자의 아미노산 서열
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
5. 파지 디스플레이 유래 DR5 결합제를 포함하는 이중특이성 분자의 아미노산 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
6. Fc 도메인 및 불변 경쇄의 아미노산 서열
Figure pct00024
7. 토끼 면역화로부터 유도된 DR5 결합제 의 아미노산 서열
클론 DR5TAA -0005 (별칭: 클론 039)
중쇄
VH
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssaymswvrqapgkglewigyiysgsgstwyaswvkgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargystmgdlwgpgtlvtvss (서열번호 41)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = sayms (서열번호 43)
CDR2 = yiysgsgstwyaswvkg (서열번호 44)
CDR3 = gystmgdl (서열번호 45)
경쇄
VL
qvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnrlawyqqkpgqppklliylastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlqcddaatyycaggysgninafgggtevvvk (서열번호 46)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqsvynnrla (서열번호 48)
CDR2 = lastlas (서열번호 49)
CDR3 = aggysgnina (서열번호 50)
클론 DR5TAA -0006 (별칭: 클론 058)
중쇄
VH
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssnhmswvrqapgkglewigyiyagsgsayyaswakgrftisrtsttvdlkmtslttedtatyfcagdagssywefnlwgpgtlvtvss (서열번호 51)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = snhms (서열번호 52)
CDR2 = yiyagsgsayyaswakg (서열번호 53)
CDR3 = dagssywefnl (서열번호 54)
경쇄
VL
lvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqkpgqppklliyhastlasgvpsrfsgsrsgiqttltisgvqcddaatyyclgvadarrddgfafgggtevvvk (서열번호 55)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 56)
CDR1 = qasqsigssls (서열번호 57)
CDR2 = hastlas (서열번호 58)
CDR3 = lgvadarrddgfa (서열번호 59)
클론 DR5TAA -0010 (별칭: 클론 481)
중쇄
VH
qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslssnaiswvrqapgmglewigiigssgytyyaswakgrftvsktsttvdleiaspttedtatyfcargysgasdysfnlwgpgtlvtvss (서열번호 60)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = snais (서열번호 61)
CDR2 = iigssgytyyaswakg (서열번호 62)
CDR3 = gysgasdysfnl (서열번호 63)
경쇄
VL
aydmtqtpdsvevavggtvtikcqasqtigdalawyqqkpgqrpnlliyrtstlasgvpsrfsgsgsgthftltisgvecadaatyycqqgatynnvlntfgggtevvvk (서열번호 64)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqtigdala (서열번호 65)
CDR2 = rtstlas (서열번호 66)
CDR3 = qqgatynnvlnt (서열번호 67)
클론 DR5TAA -0013 (별칭: 클론 298)
중쇄
VH
Qsleesggrlvtpgtpltltctasgftissyhmswvrqapgkglewigyiyagsastwyaswvkgrftisktsttvdlkmtslttedtatyfcardagssywefnlwgpgtlvtvss (서열번호 68)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = syhms (서열번호 69)
CDR2 = yiyagsastwyaswvkg (서열번호 70)
CDR3 = dagssywefnl (서열번호 54)
경쇄
VL
Lvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqtpgqppklliytasslassvpkrfsgsrsgtqftltisgvqcadaatyyclgiddvrrddgfafgggtevvvk (서열번호 71)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqsigssls (서열번호 57)
CDR2 = tasslas (서열번호 72)
CDR3 = lgiddvrrddgfa (서열번호 73)
클론 DR5TAA -0019 (별칭: 클론 461)
중쇄
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsnyamswvrqapgkglewigiisssgttyyaswakgrftisktsttvdlkvtspttedtatyfcaretyygysyaaglwgpgtlvtvss (서열번호 74)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = nyams (서열번호 75)
CDR2 = iisssgttyyaswakg (서열번호 76)
CDR3 = etyygysyaagl (서열번호 77)
경쇄
VL
Alvmtqtpssvsaavggtvtincqasqniysnlawfqqkpgqppklliyetsklasgvpsrfsgsgsgteftltisdlecddaatyycqsswhsistdcafgggtevvvk (서열번호 78)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqniysnla (서열번호 79)
CDR2 = etsklas (서열번호 80)
CDR3 = qsswhsistdca (서열번호 81)
클론 DR5TAA -0016 (별칭: 클론 422)
중쇄
VH
Qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslnnyamswvrqapgkglewigminkygtkyyatwtkgratisktsttldleitspttedtatyfcarvryagddyaewldvwgqgilvtvss (서열번호 82)
CH1-3
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = nyams (서열번호 75)
CDR2 = minkygtkyyatwtkg (서열번호 83)
CDR3 = vryagddyaewldv (서열번호 84)
경쇄
VL
Adivmtqtaspvsaavggtvtincqasqsisssyvswyqqkpgqppklliykastlasgvpsrfsgsgsgtqlsltirgvqcddaatyyclygysdvssseyvfgggtevvvr (서열번호 85)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqsisssyvs (서열번호 86)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = lygysdvssseyv (서열번호 87)
클론 DR5TAA -0011 (별칭: 클론 174)
중쇄
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvss (서열번호 88)
CH1-3
Gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk (서열번호 42)
CDR1 = ryami (서열번호 17)
CDR2 = fitsdssayyaswakg (서열번호 25)
CDR3 = ytysdgtdl (서열번호 19)
경쇄
VL
Adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvk (서열번호 89)
Ckappa
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc (서열번호 47)
CDR1 = qasqsistyls (서열번호 27)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
8. 토끼 Mab DR5TAA -0011의 키메라화 변이체의 아미노산 서열
클론 DR5TAA-0052 (키메라 변이체)
중쇄
VH
Qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvss (서열번호 90)
CH1-3
Astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 91)
CDR1 = ryami (서열번호 17)
CDR2 = fitsdssayyaswakg (서열번호 25)
CDR3 = ytysdgtdl (서열번호 19)
경쇄
VH
Adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlesadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvk (서열번호 92)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = qasqsistyls (서열번호 27)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
9. 토끼 Mab DR5TAA -0011의 인간화 변이체의 서열
Figure pct00025
인간화 변이체 중쇄
VH7
VH
Evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvss (서열번호 23)
CH1-3
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk constant chain (서열번호 91)
CDR1 = ryami (서열번호 17)
CDR2 = fitsdgstyyadsakg (서열번호 18)
CDR3 = ytysdgtdl (서열번호 19)
VH17
VH
qvqlvesggglvqpggslrlscsasgfsisryamiwvrqapgkgleyvgfitsdssayyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgqgtlvtvss (서열번호 26)
CH1-3
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 91)
CDR1 = ryami (서열번호 17)
CDR2 = fitsdssayyaswakg (서열번호 25)
CDR3 = ytysdgtdl (서열번호 19)
인간화 변이체 경쇄
VL2
VL
Diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik (서열번호 32)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = rasqsistyls (서열번호 20)
CDR2 = kasslas (서열번호 21)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
VL3
VL
Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik (서열번호 30)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = rasqsistyls (서열번호 20)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
VL10
VL
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveik (서열번호 31)
Ckappa
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = rasqsistyls (서열번호 20)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
VL11
VL
diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveik (서열번호 29)
Ckappa
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = qasqsistyls (서열번호 27)
CDR2 = kastlas (서열번호 28)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
VL15
VL
Adiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveik (서열번호 24)
Ckappa
Rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 93)
CDR1 = rasqsistyls (서열번호 20)
CDR2 = kasslas (서열번호 21)
CDR3 = qpnsgiatygaa (서열번호 22)
10. 토끼-유래 DR5 결합제를 함유하는 키메라 이중특이성 구축물의 아미노산 서열
구축물 DR5TAA -0061 (4B9 및 DR5TAA -0011을 함유하는 1+1 키메라 크로스mab )
LC ( DR5 )
adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec (서열번호 280)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvtssylawyqqkpgqaprllinvgsrratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgimlpptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 281)
HC ( DR5 )
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn
hkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs
fflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 282)
교차 HC ( FAP )
evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaiigsgastyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwfggfnywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhk
vyacevthqglsspvtksfnrgecdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp
vldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (서열번호 283)
구축물 DR5TAA -0032 (28 H1 및 DR5TAA -0005를 함유하는 2+2 키메라 크로스Mab )
LC ( DR5 )
aqvltqtpspvsaavggtvtincqasqsvynnrlawyqqkpgqppklliylastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlqcddaatyycaggysgninafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevth
qglsspvtksfnrgec (서열번호 284)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 285)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qsleesggrlvtpgtpltltctasgfslssaymswvrqapgkglewigyiysgsgstwyaswvkgrftisktsttvdlkitspttedtatyfcargystmgdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 286)
구축물 DR5TAA -0033 (28 H1 및 DR5TAA -0011을 함유하는 2+2 키메라 크로스Mab )
LC ( DR5 )
adivmtqtpasvsepvggtvtikcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfkgsgsgtdftltirdlecadaatyycqpnsgiatygaafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec (서열번호 287)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 288)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfsisryamiwvrqapgegleyigfitsdssayyaswakgrftisktsttvdlkmtspttedtatyfcarytysdgtdlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvn
hkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgs
fflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlk
sgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 289)
구축물 DR5TAA -0034 (28 H1 및 DR5TAA -0013을 함유하는 2+2 키메라 크로스Mab)
LC ( DR5 )
alvmtqtpsstsepvggtvtikcqasqsigsslswyqqtpgqppklliytasslassvpkrfsgsrsgtqftltisgvqcadaatyyclgiddvrrddgfafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec (서열번호 290)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 291)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qsleesggrlvtpgtpltltctasgftissyhmswvrqapgkglewigyiyagsastwyaswvkgrftisktsttvdlkmtslttedtatyfcardagssywefnlwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsde
qlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 292)
구축물 DR5TAA -0035 (28 H1 및 DR5TAA -0016을 함유하는 2+2 키메라 크로스Mab )
LC ( DR5 )
adivmtqtaspvsaavggtvtincqasqsisssyvswyqqkpgqppklliykastlasgvpsrfsgsgsgtqlsltirgvqcddaatyyclygysdvssseyvfgggtevvvrrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyac
evthqglsspvtksfnrgec (서열번호 293)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 294)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qsleesggrlvkpdetltltctvsgfslnnyamswvrqapgkglewigminkygtkyyatwtkgratisktsttldleitspttedtatyfcarvryagddyaewldvwgqgilvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqty
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dsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifpps
deqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 295)
구축물 DR5TAA -0036 (28 H1 및 DR5TAA -0019를 함유하는 2+2 키메라 크로스Mab )
LC ( DR5 )
alvmtqtpssvsaavggtvtincqasqniysnlawfqqkpgqppklliyetsklasgvpsrfsgsgsgteftltisdlecddaatyycqsswhsistdcafgggtevvvkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt
hqglsspvtksfnrgec (서열번호 296)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 297)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsnyamswvrqapgkglewigiisssgttyyaswakgrftisktsttvdlkvtspttedtatyfcaretyygysyaaglwgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgksggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsde
glksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 298)
11. 인간화 토끼-유래 DR5 -결합제를 함유하는 이중특이성 구축물의 아미노산 서열
구축물 DR5TAA -0117 (28 H1 및 DR5TAA -0067을 함유하는 2+2 인간화 크로스Mab )
LC ( DR5 )
adiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec (서열번호 299)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 300)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 301)
구축물 DR5TAA -0118 (28 H1 및 DR5TAA -0071을 함유하는 2+2 인간화 크로스Mab )
LC ( DR5 )
adiqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsistylswyqqkpgkapkrliykasslasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddaatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev
thqglsspvtksfnrgec (서열번호 302)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 303)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
qvqlvesggglvqpggslrlscsasgfsisryamiwvrqapgkgleyvgfitsdssayyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 304)
구축물 DR5TAA -0119 (28 H1 및 DR5TAA -0075를 함유하는 2+2 인간화 크로스Mab )
LC ( DR5 )
diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqsistylswyqqkpgqppkrliykastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqpnsgiatygaafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt
hqglsspvtksfnrgec (서열번호 305)
교차 LC ( FAP )
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsrsylawyqqkpgqaprlliigastratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqgqvipptfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkps
ntkvdkkvepkscd (서열번호 306)
HC ( DR5 - 교차 FAP )
evqlvetgggliqpggslrlscaasgftvsryamiwvrqapgkgleyigfitsdgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarytysdgtdlwgrgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyic
nvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvlds
dgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsshamswvrqapgkglewvsaiwasgeqyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgwlgnfdywgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeql
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (서열번호 307)
12. 인간화 토끼-유래 DR5-결합제의 C-말단 융합체의 아미노산 서열
Figure pct00026
13. DR5 결합제 및 그를 포함하는 이중특이성 분자의 핵산 서열
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
14. DR5 서열
Figure pct00059
15. FAP 서열
Figure pct00060
본 발명의 바람직한 태양이 제시되고 기술되어 있지만 본 발명은 그로 제한되지 않으며, 달리 다양하게 예시되고 하기 특허청구범위의 범주내에서 실시될 수 있음이 명백히 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> BISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR FAP AND DR5, ANTIBODIES SPECIFIC FOR DR5 AND METHODS OF USE <130> 31434 WO <140> PCT/EP2014/056511 <141> 2014-04-01 <150> US 61/808,128 <151> 2013-04-03 <160> 318 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR1 of VH <400> 1 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR2 of VH <400> 2 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR3 of VH <400> 3 Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR1 of VL <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR2 of VL <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder; CDR3 of VL <400> 6 Gln Gln Gly Thr Thr His Pro Ile Thr 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(5E11)binder_variable heavy chain (VH) <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (5E11) binder_variable light chain (VL) <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr His Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP (28H1) binder; CDR1 of VH <400> 9 Ser His Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1), binder; CDR2 of VH <400> 10 Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) binder; CDR3 of VH <400> 11 Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) binder; CDR1 of VL <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) binder; CDR2 of VL <400> 13 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) binder; CDR3 of VL <400> 14 Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1) binder_variable heavy chain (VH) <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP(28H1)binder_variable light chain (VL) <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VH7) and (174-VH17) binders; CDR1 of VH <400> 17 Arg Tyr Ala Met Ile 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VH7) binder; CDR2 of VH <400> 18 Phe Ile Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VH7) and (174-VH17) binders; CDR3 of VH <400> 19 Tyr Thr Tyr Ser Asp Gly Thr Asp Leu 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VL15), (174-VL10), (174-VL3) and (174-VL2) binders; CDR1 of VL <400> 20 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VL15) and (174-VL2) binders; CDR2 of VL <400> 21 Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VL15), (174-VL11), (174-VL10), (174-VL3) and (174-VL2) binders; CDR3 of VL <400> 22 Gln Pro Asn Ser Gly Ile Ala Thr Tyr Gly Ala Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (174-VH7) binder; variable heavy chain (VH) <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Phe 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cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcggtgta ttactgtcag cagggttctc agccgcccat tacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaa 324 <210> 180 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (21H3)_CDRL1 DNA <400> 180 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (21H3)_CDRL2 DNA <400> 181 ggagcatcca gcagggccac t 21 <210> 182 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (21H3)_CDRL3 DNA <400> 182 cagcagggtt ctcagccgcc cattacg 27 <210> 183 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 (20F2)_VH DNA <400> 183 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa 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Lysine in Fc pETR11052 DNA <400> 235 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggggtg 300 agggtgtctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360 aagggcccaa gcgtgttccc tctggccccc agcagcaaga gcacaagcgg cggaacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgacagtgtc ctggaacagc 480 ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtcac agtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgagc tgctgggcgg acccagcgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag ccccgggagg aacagtacaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcccccta gcagagatga gctgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcat tcttcctgta ctctaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtccctgt ctcccggggg aggcggagga tctggcggag gcggatccgg tggtggcgga 1380 tctgggggcg gtggatctga ggtgcagctg ctggaatctg ggggaggact ggtgcagcca 1440 ggcggatctc tgaggctgtc ctgcgctgct tccggcttta ccttctccag ccacgccatg 1500 agttgggtgc gccaggcacc cggaaaagga ctggaatggg tgtcagccat ctgggcctcc 1560 ggcgagcagt actacgccga tagcgtgaag ggccggttca ccatctctcg ggataacagc 1620 aagaatactc tgtacctgca gatgaactcc ctgcgcgctg aagataccgc tgtgtattac 1680 tgcgccaagg gctggctggg caacttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgactgtc 1740 tcgagcgctt ctgtggccgc tccctccgtg ttcatcttcc caccttccga cgagcagctg 1800 aagtccggca ctgcctctgt cgtgtgcctg ctgaacaact tctaccctcg ggaagccaag 1860 gtgcagtgga aagtggataa cgccctgcag tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag 1920 caggactcca aggacagcac ctactccctg agcagcaccc tgaccctgtc caaggccgac 1980 tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgaa gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg 2040 accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 2067 <210> 236 <211> 2067 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(5E11)-FAP(28H1) VHCL2+2 Removal of C-term. Lysine in Fc P329G/LALA mut. pETR11025 DNA <400> 236 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggggtg 300 agggtgtctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360 aagggcccat ccgtgttccc tctggcccct tccagcaagt ctacctctgg cggcacagcc 420 gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgacagtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga catccggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtcgtgac agtgccctcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 660 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaag ctgctggcgg ccctagcgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaatgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgggagcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcccccta gcagagatga gctgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcat tcttcctgta ctctaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtccctgt ctcccggggg aggcggagga tctggcggag gcggatccgg tggtggcgga 1380 tctgggggcg gtggatctga ggtgcagctg ctggaatctg ggggaggact ggtgcagcca 1440 ggcggatctc tgaggctgtc ctgcgctgct tccggcttta ccttctccag ccacgccatg 1500 agttgggtgc gccaggcacc cggaaaagga ctggaatggg tgtcagccat ctgggcctcc 1560 ggcgagcagt actacgccga tagcgtgaag ggccggttca ccatctctcg ggataacagc 1620 aagaatactc tgtacctgca gatgaactcc ctgcgcgctg aagataccgc tgtgtattac 1680 tgcgccaagg gctggctggg caacttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgactgtc 1740 tcgagcgctt ctgtggccgc tccctccgtg ttcatcttcc caccttccga cgagcagctg 1800 aagtccggca ctgcctctgt cgtgtgcctg ctgaacaact tctaccctcg ggaagccaag 1860 gtgcagtgga aagtggataa cgccctgcag tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag 1920 caggactcca aggacagcac ctactccctg agcagcaccc tgaccctgtc caaggccgac 1980 tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgaa gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg 2040 accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 2067 <210> 237 <211> 2043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHVL Cross DR5 (5E11)-FAP (28H1) pETR11827 2+2 DNA <400> 237 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtacta ctcatcccat tacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaaagctcc gctagcacca agggcccaag cgtgttccct 360 ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc ggaacagccg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtcc tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg 480 cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtcaca 540 gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 600 aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc 660 ccttgtcctg cccctgagct gctgggcgga cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc 720 aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc 780 cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc 840 aagaccaagc cccgggagga acagtacaac agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 900 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc 960 ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc aaggccaagg gccagcccag agaaccccag 1020 gtgtacaccc tgccccccag cagagatgag ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1080 ctggtcaagg gcttctaccc cagcgatatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagcct 1140 gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac 1200 tccaaactga ccgtggacaa gagccggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 1260 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaag 1320 tccggaggcg gcggaagcgg aggaggagga tccggaggag ggggaagtgg cggcggagga 1380 tctgaggtgc agctgctgga atccggcgga ggcctggtgc agcctggcgg atctctgaga 1440 ctgtcctgcg ccgcctccgg cttcaccttc tcctcccacg ccatgtcctg ggtccgacag 1500 gctcctggca aaggcctgga atgggtgtcc gccatctggg cctccggcga gcagtactac 1560 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 1620 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc caagggctgg 1680 ctgggcaact tcgactactg gggccagggc accctggtca ccgtgtccag cgctagcacc 1740 aagggcccct ccgtgtttcc tctggcccct agctctaaga gcaccagcgg aggaacagcc 1800 gccctgggct gcctcgtgaa agactacttc cccgagcccg tgacagtgtc ttggaactct 1860 ggcgccctga ccagcggcgt gcacacattt ccagctgtgc tgcagtccag cggcctgtac 1920 tctctgagca gcgtcgtgac tgtgcccagc tctagcctgg gaacccagac ctacatctgc 1980 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaaa gtggataaga aggtggaacc caagagctgc 2040 gac 2043 <210> 238 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(5E11)VHCL_pETR11484 DNA <400> 238 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggggtg 300 agggtgtctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcgtg 360 gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 420 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 480 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 540 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 600 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 660 aggggagagt gt 672 <210> 239 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP (28H1) VLCL_pETR9366 DNA <400> 239 gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60 ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct 180 gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc 300 cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 240 <211> 2070 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1CL Cross DR5(5E11)-FAP (28H1) pETR11828 2+2 DNA <400> 240 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggggtg 300 agggtgtctt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcgtg 360 gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc 420 tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg 480 gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac 540 tccacctaca gcctgagcag cacactgacc ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag 600 gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac 660 cggggcgagt gcgacaagac ccacacctgc cccccttgtc ctgcccctga actgctggga 720 ggccctagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780 cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg acccagaagt gaagttcaat 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agccccggga ggaacagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagaaccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctcgtga aaggcttcta cccctccgat 1140 atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactctaagc tgacagtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gtctcccggg ggaggcggag gatctggcgg aggcggatcc 1380 ggaggagggg gaagtggcgg cggaggatct gaggtgcagc tgctggaatc cggcggaggc 1440 ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc 1500 tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc 1560 atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc gactctgtga agggccggtt caccatctcc 1620 cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc 1680 gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg ggcaacttcg actactgggg ccagggcacc 1740 ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag ggcccctccg tgtttcctct ggcccctagc 1800 tctaagagca ccagcggagg aacagccgcc ctgggctgcc tcgtgaaaga ctacttcccc 1860 gagcccgtga cagtgtcttg gaactctggc gccctgacca gcggcgtgca cacatttcca 1920 gctgtgctgc agtccagcgg cctgtactct ctgagcagcg tcgtgactgt gcccagctct 1980 agcctgggaa cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agcccagcaa caccaaagtg 2040 gataagaagg tggaacccaa gagctgcgac 2070 <210> 241 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(5E11) VLCH1_pETR11480 DNA <400> 241 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtacta ctcatcccat tacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaaagctcc gctagcacca agggcccctc cgtgtttcct 360 ctggccccca gcagcaagag cacctctggc ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa 420 gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaactctg gcgccctgac cagcggcgtg 480 cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc ggcctgtact ccctgagcag cgtggtgaca 540 gtgccctcca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 600 aacaccaaag tggacaagaa ggtggaaccc aagagctgcg ac 642 <210> 242 <211> 2073 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(18F11)-FAP (28H1) VHCL 2+2 pETR9801 DNA <400> 242 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac gcggccgtat attactgtgc gaaaggggtg 300 cgtaagaagt ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcgag tgctagcacc 360 aagggcccaa gcgtgttccc tctggccccc agcagcaaga gcacaagcgg cggaacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgacagtgtc ctggaacagc 480 ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtcac agtgcctagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgagc tgctgggcgg acccagcgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag ccccgggagg aacagtacaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcccccca gcagagatga gctgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtcaag ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gacggcagct tcttcctgta ctccaaactg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcctga gccccggcaa gtccggaggc ggcggaagcg gaggaggagg atccggagga 1380 gggggaagtg gcggcggagg atctgaggtg cagctgctgg aatccggcgg aggcctggtg 1440 cagcctggcg gatctctgag actgtcctgc gccgcctccg gcttcacctt ctcctcccac 1500 gccatgtcct gggtccgaca ggctcctggc aaaggcctgg aatgggtgtc cgccatctgg 1560 gcctccggcg agcagtacta cgccgactct gtgaagggcc ggttcaccat ctcccgggac 1620 aactccaaga acaccctgta cctgcagatg aactccctgc gggccgagga caccgccgtg 1680 tactactgtg ccaagggctg gctgggcaac ttcgactact ggggccaggg caccctggtc 1740 accgtgtcca gcgctagcgt ggccgctccc agcgtgttca tcttcccacc cagcgacgag 1800 cagctgaagt ccggcacagc cagcgtggtg tgcctgctga acaacttcta cccccgcgag 1860 gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc ctgcagagcg gcaacagcca ggaatccgtg 1920 accgagcagg acagcaagga ctccacctac agcctgagca gcaccctgac cctgagcaag 1980 gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaagtga cccaccaggg cctgtccagc 2040 cccgtgacca agagcttcaa ccggggcgag tgc 2073 <210> 243 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(18F11) LC_pETR9070 DNA <400> 243 gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagggtcagt tgcctcccat tacgttcggc 300 caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 244 <211> 2067 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5(5E11)-FAP (28H1) Fc knob VHCL 2+1 pETR10427 DNA <400> 244 gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag 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DR5 (ECD)-AcTev-Fc-Avi <400> 317 Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp Pro Gln Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln 1 5 10 15 Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Arg Glu Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr 35 40 45 Ser Thr His Trp Asn Asp Phe Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys 50 55 60 Asp Ser Gly Glu Val Glu Val Asn Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr 65 70 75 80 Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu 85 90 95 Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val 100 105 110 Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser 115 120 125 Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp 130 135 140 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 165 170 175 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 180 185 190 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 195 200 205 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 210 215 220 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 225 230 235 240 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 245 250 255 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 260 265 270 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 275 280 285 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 290 295 300 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 305 310 315 320 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 325 330 335 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 340 345 350 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 355 360 365 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 370 375 380 Glu Trp His Glu 385 <210> 318 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 318 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (42)

  1. (a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1);
    (b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2);
    (c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR3);
    (d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 사멸 수용체 5(DR5)에 특이적인 1개 이상의 항원 결합 부위; 및
    (a) 서열번호 9 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 10 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열번호 11 및 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열번호 12 및 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 13 및 서열번호 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 14 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적인 1개 이상의 항원 결합 부위
    를 포함하는, DR5 및 FAP에 결합하는 이중특이성 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 및 서열번호 94 및 서열번호 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고;
    FAP에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 15 및 서열번호 39로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄; 및 서열번호 16 및 서열번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는,
    이중특이성 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위가
    (a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
    (c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
    (d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3
    을 포함하고;
    FAP에 특이적인 항원 결합 부위가
    (a) 서열번호 9의 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 10의 중쇄 CDR2;
    (c) 서열번호 11의 중쇄 CDR3;
    (d) 서열번호 12의 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 13의 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 14의 경쇄 CDR3
    을 포함하는,
    이중특이성 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하고; FAP에 특이적인 항원 결합 부위가 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간 항체인, 이중특이성 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간화 항체인, 이중특이성 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편을 포함하는, 이중특이성 항체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    1개 이상의 Fab 단편이 경쇄(VLCL)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되고, 1개 이상의 Fab 단편이 중쇄(VHCH1)를 통해 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되는, 이중특이성 항체.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    a) Fc 도메인;
    b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편으로서, 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되는 2개의 Fab 단편; 및
    c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편으로서, 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되는 상기 2개의 Fab 단편
    을 포함하는 이중특이성 항체.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    a) Fc 도메인;
    b) DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편으로서, 불변 중쇄(CH1)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되는 2개의 Fab 단편; 및
    c) FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편으로서, 불변 경쇄(CL)의 C-말단에서 Fc 도메인의 제 1 또는 제 2 서브유니트에 연결되는 2개의 Fab 단편
    을 포함하는 이중특이성 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인, DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개 이상의 Fab 단편을 포함하되, 1개 이상의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, 이중특이성 항체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 각각 포함하는 2개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 각각 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    DR5 및 FAP 둘 다에 대해 2가인 이중특이성 항체.
  14. 제 11 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 각각 포함하는 2개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    DR5에 대해 2가이고 FAP에 대해 1가인 이중특이성 항체.
  16. 제 14 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 추가로 포함하는 이중특이성 항체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    DR5에 대해 3가이고 FAP에 대해 1가인 이중특이성 항체.
  18. 제 11 항에 있어서,
    DR5에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편, 및 FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 1개의 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    DR5에 대해 1가이고 FAP에 대해 1가인 이중특이성 항체.
  20. 제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    FAP에 특이적인 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는, 이중특이성 항체.
  21. 제 7 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1개 이상의 Fab 단편이 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 연결되는, 이중특이성 항체.
  22. 제 7 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 이중특이성 항체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 L234, L235 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 존재하는, 이중특이성 항체.
  24. 제 23 항에 있어서,
    Fc 도메인의 각각의 서브유니트가 활성화 또는 억제 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329G인, 이중특이성 항체.
  25. 제 7 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 중쇄의 Fc 부분이 제 1 이량체화 모듈을 포함하고, 제 2 중쇄의 Fc 부분이 제 2 이량체화 모듈을 포함하여 제 1 항체의 2개의 중쇄들의 헤테로이량체화를 가능하게 하는, 이중특이성 항체.
  26. 제 25 항에 있어서,
    제 1 이량체화 모듈이 놉 인투 홀(knob into hole) 방법에 따른 놉을 포함하고, 제 2 이량체화 모듈이 홀을 포함하는, 이중특이성 항체.
  27. (a) 서열번호 1, 서열번호 17 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1);
    (b) 서열번호 2, 서열번호 18, 서열번호 25 및 서열번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2);
    (c) 서열번호 3, 서열번호 19, 서열번호 84, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 104 및 서열번호 108로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR3);
    (d) 서열번호 4, 서열번호 20, 서열번호 27 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 5, 서열번호 21 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 6, 서열번호 22, 서열번호 87, 서열번호 99, 서열번호 105, 서열번호 109 및 서열번호 97로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, DR5에 특이적으로 결합하는 항체.
  28. 제 27 항에 있어서,
    (a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1;
    (b) 서열번호 2의 중쇄 CDR2;
    (c) 서열번호 3의 중쇄 CDR3;
    (d) 서열번호 4의 경쇄 CDR1;
    (e) 서열번호 5의 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열번호 6의 경쇄 CDR3
    을 포함하는 항체.
  29. 제 27 항에 있어서,
    서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 23 및 서열번호 29; 서열번호 23 및 서열번호 30; 서열번호 26 및 서열번호 31; 서열번호 26 및 서열번호 32; 서열번호 26 및 서열번호 30; 서열번호 23 및 서열번호 31; 서열번호 82 및 서열번호 85; 서열번호 100 및 서열번호 101; 서열번호 102 및 서열번호 103; 서열번호 106 및 서열번호 107; 및 서열번호 94 및 서열번호 95로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 항체.
  30. 제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체.
  31. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
  32. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료를 위한 이중특이성 항체 또는 항체.
  33. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 이중특이성 항체 또는 항체.
  34. 약제의 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  35. 제 34 항에 있어서,
    약제가 암의 치료를 위한 것인 용도.
  36. 제 34 항에 있어서,
    약제가 췌장암 또는 대장암의 치료를 위한 것인 용도.
  37. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 중쇄 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  38. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 경쇄 또는 제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
  39. 제 37 항에 따른 핵산 서열 및/또는 제 38 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  40. 제 39 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  41. 항체가 생성되도록 제 40 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  42. 특히 전술한 실시예에 관한, 본원에 기술된 본 발명.
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