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KR20150129033A - 저 산성 종 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

저 산성 종 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Publication number
KR20150129033A
KR20150129033A KR1020157029562A KR20157029562A KR20150129033A KR 20150129033 A KR20150129033 A KR 20150129033A KR 1020157029562 A KR1020157029562 A KR 1020157029562A KR 20157029562 A KR20157029562 A KR 20157029562A KR 20150129033 A KR20150129033 A KR 20150129033A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
antibody
less
antigen
binding portion
Prior art date
Application number
KR1020157029562A
Other languages
English (en)
Inventor
나타라잔 라마수브라만얀
리화 양
매튜 오몬 헤리그스태드
홍 양
카르틱 서브라마니안
샤오베이 정
다이앤 디. 동
웬 청 림
캐트린 에이. 기퍼드
제라 케이막칼란
크리스토퍼 슘사에
Original Assignee
애브비 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2013/031681 external-priority patent/WO2013158279A1/en
Priority claimed from PCT/US2013/031485 external-priority patent/WO2013158275A1/en
Application filed by 애브비 인코포레이티드 filed Critical 애브비 인코포레이티드
Publication of KR20150129033A publication Critical patent/KR20150129033A/ko

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Abstract

본 발명은, 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종(AR) 조성물, 및 이러한 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방법, 예를 들면, 세포 배양 및/또는 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 또한, 장애, 예를 들면, TNFα가 유해한 장애을 치료하는데 이러한 조성물을 이용하기 위한 방법이 제공된다.

Description

저 산성 종 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법{LOW ACIDIC SPECIES COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND USING THE SAME}
관련 출원
본 출원은, 2013년 3월 14일에 출원된 국제 특허 출원 일련번호 제PCT/US2013/031485호 및 2013년 3월 14일에 출원된 국제 특허 출원 일련번호 제PCT/US2013/031681호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명의 배경
생물약제학적 적용을 위한 단백질을 포함하는 조성물의 제조는, 상기 조성물 내의 단백질 변이체 및 불순물의 변하는 수준을 나타내는 단백질을 제조하는 것으로 공지되어 있는, 업스트림(upstream) 프로세스 기술(예를 들면, 세포 배양) 및 다운스트림(downstream) 프로세스 기술(예를 들면, 단백질 정제)의 사용을 포함한다. 이러한 단백질 변이체로는, 프로세스-관련된 불순물을 포함하는 산성 종의 존재가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 모노클로날 항체(mAb) 제제에 있어서, 산성 종은 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전점 전기영동(isoelectric focusing))와 같은 각종 방법에 의해 검출할 수 있다. 목적하는 항체 생성물 분자에 대한 이들의 유사한 화학적 특성 때문에, 산성 종의 환원은 모노클로날 항체 제조에서 도전이다.
산성 종의 환원은, 생산물 안정성, 생산물 안전성, 및 생산물 효능을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다수의 생산물 특성에 영향을 미치는 잠재력을 가지므로, 산성 종의 환원은, 상업적으로 제조되는 재조합 생물학적 치료제(biotherapeutics)와 관련하여 특히 이롭다. 따라서, 저 산성 종 조성물 및 낮은 수준의 산성 종을 갖는 단백질 조성물, 예를 들면, 항체를 제조하는 고-효율성 방법에 대한 요구가 당해 분야에 남아 있다.
본 발명의 요약
본 발명은, 낮은 백분율의 산성 종을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물의 제조를 초래하는, 단백질의 제조, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 제조를 위한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 기술의 동정 및 최적화에 기초한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 이들 저 산성 종 조성물은, 비(non)-저 산성 종 조성물과 비교하여, 치료학적 효능을 향상시키고 생물학적 특성을 향상시키며, 예를 들면, 연골 조직 침투를 증가시키고/시키거나, 연골 파괴를 감소시키고/시키거나, 활액 증식을 감소시키고/시키거나, 골 부식을 감소시키고/시키거나, 관절염 스코어 및/또는 조직병리학 스코어에 의해 측정시 관절염의 발병에 대한 보호를 증가시키고/시키거나, 세포 침윤을 감소시키고/시키거나, 프로테오글리칸 손실을 감소시키고/시키거나, 연골세포 사멸을 감소시키고/시키거나, TNFα 친화도를 증가시켰다.
따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종(저 AR) 조성물로서, 상기 조성물은 약 15% 이하의 AR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종(저 AR) 조성물을 제공한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 저 AR 조성물은 약 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.0% 내지 약 10% AR, 약 0.0% 내지 약 5% AR, 약 0.0% 내지 약 4% AR, 약 0.0% 내지 약 3% AR, 약 0.0% 내지 약 2% AR, 약 3% 내지 약 5% AR, 약 5% 내지 약 8% AR, 또는 약 8% 내지 약 10% AR, 또는 약 10% 내지 약 15% AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제공한다.
한 실시형태에서, 상기 저 AR 조성물은 제1 산성 종 영역(AR1) 및 제2 산성 종 영역(AR2)을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 저 AR 조성물은 약 0.1% 이하의 AR1 및 약 3% 이하의 AR2, 또는 약 0.0%의 AR1 및 약 1.4% 이하의 AR2를 포함한다. 관련 실시형태에서, 상기 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR1, 또는 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR1, 약 3% 내지 약 5%의 AR1, 약 5% 내지 약 8%의 AR1, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR1, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 포함하는, 제공한다.
이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR2, 약 0,0% 내지 약 5%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제공한다.
다른 실시형태에서, 저 AR 조성물, 예를 들면, 아달리무마브의 저 AR 조성물은 약 1.4% 이하의 AR을 포함한다. 예를 들면, 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 저 AR 조성물, 예를 들면, 약 1.4% 이하의 AR을 포함하는 아달리무마브의 저 AR 조성물은 약 0.01% AR1 및 약 1.4% 이하의 AR2를 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은, 예를 들면, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 핵산, 크로마토그래피 재료, 및/또는 배지 구성성분, 및 응집체와 같은 생산물 관련 불순물을 포함하는 산성 종 및 다른 프로세스-관련된 불순물을 실질적으로 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 조성물의 항체 또는 이의 항원-결합부는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부이다. 예를 들면, 이러한 실시형태의 한 양상에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부는, 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 및 1 x 10-3S-1 이하의 Koff 속도 상수를 갖는 사람 TNFα로부터 해리된다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부는, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다.
이러한 실시형태의 또 다른 양상에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부는, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 실시형태의 또 다른 양상에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부는 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부이다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 아달리무마브를 포함하고, 현재 승인되어 있고 문헌["Highlights of Prescribing Information" for HUMIRA® (adalimumab) Injection (Revised Jan. 2008)]에 기술되어 있는 HUMIRA®로서 제형화된 아달리무마브에 존재하는 AR의 백분율과 동일하지 않은 AR의 백분율을 갖고, 상기 문헌의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 아달리무마브를 포함하고, 현재 승인되어 있고 문헌["Highlights of Prescribing Information" for HUMIRA® (adalimumab) Injection (Revised Jan. 2008)]에 기술되어 있는 HUMIRA®로서 제형화된 아달리무마브에 존재하는 AR의 백분율보다 더 낮은 AR의 백분율을 갖고, 상기 문헌의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는, 저 AR 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 AR을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부는, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 AR을 포함한다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부는 아달리무마브 또는 이의 항원-결합부이고, 상기 조성물은 약 10% 미만의 AR을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물은 약 0.1% 이하의 AR1 및 약 3% 이하의 AR2, 또는 약 0.0%의 AR1 및 약 1.4% 이하의 AR2를 포함한다.
한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부(예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브)를 포함하는 저 AR 조성물 중의 산성 종은, 전하 변이체, 구조 변이체 및 단편화 변이체(예를 들면, 도 188을 참조한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 변이체를 포함한다.
예를 들면, 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 저 AR 조성물 중의 전하 변이체는 AR1 종이고, 예를 들면, 탈아미드화 변이체, 당화(glycation) 변이체, 아푸코실화(afucosylation) 변이체, 메틸글리옥살(MGO) 변이체 또는 시트르산 변이체를 포함한다. 예를 들면, 저 AR 조성물이 아달리무마브를 포함하는 경우, 탈아미드화 변이체는, 아달리무마브의 Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 저 AR 조성물이 아달리무마브를 포함하는 경우, 당화 변이체는, 아달리무마브의 Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인할 수 있다.
이러한 실시형태의 다른 양상에서, 항체 또는 이의 항원-결합부(예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브)를 포함하는 저 AR 조성물 중의 구조 변이체는 AR1 종이고, 예를 들면, 글리코실화(glycosylation) 변이체 또는 아세톤화 변이체를 포함한다.
이러한 실시형태의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 항원-결합부(예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브)를 포함하는 저 AR 조성물 중의 단편화 변이체는 AR1 종이고, 예를 들면, Fab 단편 변이체, C-말단 절단 변이체, 또는 중쇄 가변 도메인이 손실된 변이체를 포함한다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부(예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브)를 포함하는 저 AR 조성물 중의 산성 종은 AR2 종이고, 전하 변이체, 예를 들면, 탈아미드화 변이체 또는 당화 변이체를 포함한다. 예를 들면, 저 AR 조성물이 아달리무마브를 포함하는 경우, 탈아미드화 변이체는, 아달리무마브의 Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 저 AR 조성물이 아달리무마브를 포함하는 경우, 당화 변이체는, 아달리무마브의 Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인할 수 있다.
한 실시형태에서, 저 AR 조성물 중의 산성 종의 백분율은, 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, WCX-10 HPLC를 이용하여 측정한다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 저 AR 조성물 중의 산성 종 백분율은, 등전점 전기영동(IEF)을 이용하여 측정한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 생산물 제조-유도된 산성 종을 포함한다. 예를 들면, 이러한 실시형태의 한 양상에서, 산성 종은 세포 배양-유도된 산성 종이다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 저 AR 조성물의 산성 종은, 프로세스 조건, 중간 조건, 또는 사용하기 전의 선반(shelf) 보관 조건 하에 보관시에 주로 생성되는 보관-유도된 산성 종이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 저 AR 조성물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은, TNFα가 유해한 장애를 갖는 대상체에게 본 발명의 저 AR 조성물, 예를 들면, 저 AR 아달리무마브 조성물을 투여하여 TNFα가 유해한 장애를 갖는 대상체를 치료함으로써, TNFα가 유해한 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, TNFα가 유해한 장애는, 류마티스 관절염(RA), 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염(JIA), 궤양성 결장염, 및 크론 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하기 위한 업스트림 방법이 포함된다. 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 아미노산 농도와 비교하여, 증가된 농도의, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 배양 배지 중의 아미노산 농도는 약 0.025 내지 20g/L이다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 칼슘 농도와 비교하여, 증가된 농도의 칼슘을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 칼슘 농도는 약 0.005 내지 5mM이다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 세포 배양 배지는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 아미노산 농도와 비교하여, 증가된 농도의, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 니아신아미드, 칼슘, 및 아미노산의 농도와 비교하여, 증가된 농도의 니아신아미드, 칼슘, 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 실시형태의 한 양상에서, 하나 이상의 아미노산은, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 약 7.1 내지 6.8의 pH를 갖는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지의 교환 속도와 비교하여, 변경된 교환 속도를 갖는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 정화된(clarified) 수거물을 추출하고, 상기 정화된 수거물에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 하나 이상의 아미노산은, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 및 류신, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 정화된 수거물을 추출하고, 상기 정화된 수거물의 pH를 4.5 내지 6.5로 조정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하기 위한 업스트림 방법이 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 제1 샘플을 크로마토그래피 배지에 접촉시키는 단계(여기서, 상기 접촉은 부하 완충액과 관련하여 발생한다); 상기 크로마토그래피 배지를, 부하 완충액과 실질적으로 동일한 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및 크로마토그래피 배지를 수집하는 단계를 포함하고, 상기 크로마토그래피 샘플은, 약 10% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하고, 이에 의해 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물이 제조되는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 결합된 항체 물질은, 세척 완충액과 상이한 조성을 갖는 완충액으로 용출된다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 상기 크로마토그래피 배지는, 음이온 교환 흡착 물질, 양이온 교환 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 및 음이온 교환 혼합 방식 배지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 크로마토그래피 배지는, 양이온 교환(CEX) 및 소수성 상호작용 기능성 그룹을 포함하는 혼방 방식 배지이다. 다른 실시형태에서, 상기 크로마토그래피 배지는, 음이온 교환(AEX) 및 소수성 상호작용 기능성 그룹을 포함하는 혼합 방식 배지이다. 예를 들면, 상기 혼합 방식 배지는 Capto MMC 수지일 수 있고, CEX 수지는 Poros XS 수지일 수 있고, AEX 수지는 Poros 50HQ 수지일 수 있다.
한 실시형태에서, 상기 크로마토그래피 배지는 CEX 흡착 물질 또는 혼합 방식 배지이고, 부하 및 세척 완충액의 pH는 항체의 등전점보다 더 낮다. 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 샘플은, 제1 샘플과 비교하여 감소된 수준의 항체 단편을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 샘플은, 제1 샘플과 비교하여 감소된 수준의 숙주 세포 단백질을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 샘플은, 제1 샘플과 비교하여 감소된 수준의, 전하 변이체(예를 들면, 탈아미드화 변이체, 당화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO 변이체 또는 시트르산 변이체), 구조 변이체(예를 들면, 글리코실화 변이체 또는 아세톤화 변이체), 또는 단편화 변이체(예를 들면, Fab 단편 변이체, C-말단 절단 변이체 또는 중쇄 가변 도메인이 손실된 변이체) 중 하나 이상을 함유한다.
한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 제1 샘플을 부하 완충액 중의 친화성 크로마토그래피 배지(예를 들면, 단백질 A 수지)에 접촉시키고, 상기 친화성 크로마토그래피 배지로부터 상기 샘플을 제1 용출된 샘플로서 용출시키는 단계; 상기 제1 용출된 샘플을 부하 완충액 중의 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 흡착 물질(예를 들면, Poros 50HQ 수지)과 접촉시키고, 상기 AEX 크로마토그래피 흡착 물질로부터 상기 샘플을 제2 용출된 샘플로서 용출시키는 단계; 및 상기 제2 용출된 샘플을 부하 완충액 중의 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 흡착 물질(예를 들면, Poros XS 수지)과 접촉시키고, 상기 CEX 크로마토그래피 흡착 물질로부터 상기 샘플을 제3 용출된 샘플로서 용출시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 제3 용출된 샘플은, 3% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하고, 이에 의해 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물이 제조된다. 한 실시형태에서, 상기 제2 용출된 샘플은 CEX 크로마토그래피와 1회 이상의 추가의 횟수로 접촉된다. 한 실시형태에서, 상기 방법은, 상기 제3 용출된 샘플에 대한 바이러스 여과를 수행하여 여과된 샘플을 얻는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 상기 여과된 샘플을, 한외여과/투석여과(UF/DF)를 이용하여 여과하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 샘플을, 부하 완충액 중의, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 흡착 물질, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 및 음이온 교환 혼합 방식 배지로 이루어진 그룹 중 하나 이상과 접촉시키는 단계, 및 AEX 크로마토그래피 흡착 물질, CEX 크로마토그래피 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 또는 음이온 교환 혼합 방식 배지로부터 상기 샘플을 용출시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 용출된 샘플은, 약 3% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하고, 이에 의해 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물이 제조되는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 방법은, 상기 용출된 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 배지와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은, 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 특허청구범위에 의해 추가로 설명된다.
도 1은, 생세포 밀도(viable cell density)에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 2는, 생존력(viability)에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 3은, 수거 역가(harvest titer)에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 4는, 10일째 WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 5는, 12일째 WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 6은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 7은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 8은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 9는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 10은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 11은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2에의 아르기닌 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 12는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 3에의 아르기닌 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 13은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb1 생산성 세포주에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=1).
도 14는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주에서의 총 아르기닌 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 15는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1 실험으로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=1).
도 16은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=2).
도 17은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 18은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 19는, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 20은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 21은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 22는, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 23은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 24는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 25는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 26은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2에의 리신 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 27은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 3에의 리신 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 28은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb1 생산성 세포주에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=1).
도 29는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주에서의 총 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 30은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 세포주 3, 배지 1로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=1).
도 31은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=2).
도 32는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 33은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 34는, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 35는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 36은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 37은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 38은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 39는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 40은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 41은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2에의 히스티딘 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 42는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 3에의 히스티딘 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 43은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb1 생산성 세포주에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=1).
도 44는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주에서의 총 히스티딘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 45는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 세포주 3, 배지 1로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=1).
도 46은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=2).
도 47은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 48은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 49는, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 50은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다.
도 51은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 52는, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 53은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 54는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 55는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 56은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2에의 오르니틴 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 57은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 3에의 오르니틴 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 58은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb1 생산성 세포주에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=1).
도 59는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주에서의 총 오르니틴 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 60은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 세포주 3, 배지 1 실험으로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=1).
도 61은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주로부터의 생산물의 카르복시펩티다제 소화의 효과를 도시한다(n=2).
도 62는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에의 다중 아미노산 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 62는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에의 다중 아미노산 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 63은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 증가된 아르기닌 및 리신 농도의 효과를 도시한다(n=3).
도 64는, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 증가된 아르기닌 및 리신 농도의 효과를 도시한다(n=3).
도 65는, 배양 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 증가된 아르기닌 및 리신 농도의 효과를 도시한다(n=3).
도 66은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 증가된 아르기닌 및 리신 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 67은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 아르기닌, 리신 및 pH 조정의 효과를 도시한다(n=2).
도 68은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 아르기닌, 리신 및 pH 조정의 효과를 도시한다(n=2).
도 69는, 배양 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 아르기닌, 리신 및 pH 조정의 효과를 도시한다(n=2).
도 70은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 아르기닌, 리신 및 pH 조정의 효과를 도시한다(n=2).
도 71은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 72는, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 73은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 74는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 75는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 76은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 77은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 78은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 79는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 80은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2에의 칼슘 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 81은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 2, 배지 3에의 칼슘 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 82는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb1 생산성 세포주에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 83은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주에서의 총 칼슘 농도의 효과를 도시한다(n=2).
도 84a 내지 도 84b는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 세포주 1, 배지 1에의 다중 아미노산 첨가의 효과, a) 전체 예상 플롯, b) 각각의 첨가제에 대한 예상 플롯을 도시한다(n=2).
도 85는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 86은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 87은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 88은, 11일째 WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 89는, 12일째 WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 90은, 생세포 밀도에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 91은, 생존력에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 92는, 수거 역가에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 93은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1에의 니아신아미드 첨가의 효과를 도시한다(n=2).
도 94a 내지 도 94d는, (a) 배양물 성장, (b) 배양물 생존력, (c) 산성 종, 및 (d) MGO 변형에 대한 아달리무마브-생산성 CHO 세포주 #1에서의 CD 배지 GIA-1D에의 아미노산 보충의 효과를 도시한다.
도 95는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 96은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 97은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 98은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 99는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 100은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 pH 조정 부가의 효과를 도시한다.
도 101은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 102는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 103은, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 104는, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 105는, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 106은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 pH 조정의 효과를 도시한다.
도 107은, 생세포 밀도에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 108은, 생존력에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 109는, 생존력에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 110은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 111은, 생세포 밀도에 대한 33℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 112는, 생존력에 대한 33℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 113은, 수거 역가에 대한 33℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 114는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 33℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 2의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 115는, 생세포 밀도에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 116은, 생존력에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 117은, 수거 역가에 대한 35℃에서의 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 118은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 1, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 119는, 생세포 밀도에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 120은, 생존력에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 121은, 수거 역가에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 122는, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 아달리무마브 생산성 세포주 3, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 123은, 생세포 밀도에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 124는, 생존력에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1의 용존 산소 조정 부가의 효과를 도시한다.
도 125는, 수거 역가에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 126은, WCX-10 프로파일 총 산성 영역에 대한 mAb2 생산성 세포주, 배지 1의 용존 산소 조정의 효과를 도시한다.
도 127은 산성화 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 128은 아르기닌 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 129는 히스티딘 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 130은 리신 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 131은 메티오닌 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 132는 아미노산 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 133은 CDM 정화된 수거물 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 134는 산성형 pH 연구 샘플 조제 스킴을 도시한다.
도 135는, 초기 산성 변이체 함량에 대한 후속적인 중화로의 저 pH 처리의 효과를 도시한다.
도 136은, 산성 변이체 형성 속도에 대한 후속적인 중화로의 저 pH 처리의 효과를 도시한다.
도 137은, 초기 산성 변이체 함량에 대한 샘플 조제 방법의 효과를 도시한다.
도 138은, 초기 산성 변이체 함량에 대한 샘플 조제 방법의 효과를 도시한다.
도 139는, 산성 변이체 형성 속도의 감소에 대한 아르기닌의 용량 의존적 효과를 도시한다.
도 140은, 초기 산성 변이체 함량에 대한 히스티딘 농도의 효과를 도시한다.
도 141은, 산성 변이체 형성 속도에 대한 히스티딘 농도의 효과를 도시한다.
도 142는, 초기 산성 변이체 함량에 대한 리신의 효과를 도시한다.
도 143은, 산성 변이체 형성 속도에 대한 리신의 효과를 도시한다.
도 144는, 초기 산성 변이체 함량에 대한 메티오닌의 효과를 도시한다.
도 145는, 산성 변이체 형성 속도에 대한 메티오닌의 효과를 도시한다.
도 146은, 초기 산성 변이체 함량에 대한 아미노산의 효과를 도시한다.
도 147은, 산성 변이체 형성 속도에 대한 아미노산의 효과를 도시한다.
도 148은, 초기 산성 변이체 함량에 대한 대안의 첨가제의 효과를 도시한다.
도 149는, 산성 변이체 형성 속도에 대한 대안의 첨가제의 효과를 도시한다.
도 150은, 아달리무마브 CDM 초기 산성 변이체 함량에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 151은, 아달리무마브 CDM 산성 변이체 형성 속도에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 152는, mAb B 가수분해물 초기 산성 변이체 함량에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 153은, mAb B 가수분해물 산성 변이체 형성 속도에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 154는, mAb C 가수분해물 초기 산성 변이체 함량에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 155는, mAb C 가수분해물 산성 변이체 형성 속도에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과를 도시한다.
도 156은, 산성 변이체 함량에 대한 산 유형/pH의 효과를 도시한다.
도 157은, 산성 변이체 함량에 대한 산 농축의 효과를 도시한다.
도 158은, 산성 변이체 함량에 대한 산 농축의 효과를 도시한다.
도 159는, 산성 변이체 함량에 대한 중화의 효과를 도시한다.
도 160은, 산성 변이체 함량에 대한 중화의 효과를 도시한다.
도 161은, 총 산성 종 환원에 대한 배지 교환 속도, 및 아르기닌 및 리신의 아미노산 보충의 효과를 도시한다.
도 162는, MGO 변형의 총량을 정확하게 정량하기 위한 변형 펩타이드 및 비변형 펩타이드 둘 다에 대한 특정 질량 추적물(trace)의 제제를 포함하는, 본 발명의 세포 배양 조건과 관련하여 발현되는 예시 항체의 LC/MS 펩타이드 맵핑 분석을 도시한다. 또한, 질량 스펙트럼은, 펩타이드 정체성을 확인하기 위해 크로마토그램의 특정 영역에 대해 분석한다.
도 163은, 아달리무마브의 발현과 관련된 총 산성 종들이 제1 산성 종 영역(AR1) 및 제2 산성 종 영역(AR2)으로 나뉘는 크로마토그램을 도시한다.
도 164는, 저 및 고 AR 함유 샘플의 25℃에서의 AR 성장을 도시한다.
도 165는, AEX 크로마토그래피와 관련하여 pH 농도구배 용출의 프로세스 크로마토그램을 도시한다.
도 166은, AEX 크로마토그래피와 관련하여 음이온 농도를 증가시킴에 의한 선형 농도구배 용출의 프로세스 크로마토그램을 도시한다.
도 167은, AEX 크로마토그래피와 관련하여 300g/L 부하 및 세척의 분획화의 프로세스 크로마토그램을 도시한다.
도 168은, AEX 크로마토그래피와 관련하여 AR 환원에 대한 pH의 효과를 도시한다.
도 169는, CEX 크로마토그래피와 관련하여 상이한 염(양이온) 농도에서의 프로세스 크로마토그램을 도시한다.
도 170은, 아달리무마브의 CEX 정제와 관련하여 회수 대 AR 환원을 도시한다.
도 171은, 당화된 부하 물질 및 CEX 용출물의 WCX-10 프로파일을 도시한다.
도 172는, Toyo Pearl MX TRP 650M 수지를 사용하여 CEX 컬럼으로부터 MGO 변형된 부하 물질 및 용출물의 WCX-10 프로파일을 도시한다.
도 173은, Tris 농도의 효과를 강조하는, CEX 크로마토그래피 동안의 리신 분포의 변화를 도시한다.
도 174는, MM 크로마토그래피와 관련하여 아달리무마브 AR 환원 및 회수 수율에 대한 pH 및 전도율의 효과를 도시한다.
도 175는, MM 크로마토그래피와 관련하여 상응하는 단백질 회수로 달성되는 AR 환원을 도시한다.
도 176은, 관류(Flow Through) 및 세척 동안의 총 아달리무마브 단백질 농도 수준 및 AR 수준을 도시한다.
도 177은, MM 크로마토그래피와 관련하여 관류 및 세척 동안의 총 mAb B 단백질 농도 수준 및 AR 수준을 도시한다.
도 178은, MM 크로마토그래피와 관련하여 관류 및 세척 동안의 총 mAb C 단백질 농도 수준 및 AR 수준을 도시한다.
도 179는, 상이한 MM 수지에 대한 mAb C의 누적 AR 파과율(%)(Cumulative % AR breakthrough)을 도시한다.
도 180은, MM 크로마토그래피와 관련하여 아달리무마브 AR 환원에 대한 pH-pI 및 전도율의 영향을 도시한다.
도 181은, MM 크로마토그래피와 관련하여 mAb B AR 환원에 대한 pH-pI 및 전도율의 영향을 도시한다.
도 182는, MM 크로마토그래피와 관련하여 mAb C AR 환원에 대한 pH-pI의 영향 및 경향을 도시한다.
도 183은, MM 크로마토그래피와 관련하여 AR 환원 및 수율에 대한 pH 및 전도율의 효과를 도시한다.
도 184는, MM 크로마토그래피와 관련하여 AR 환원 및 단백질 회수 대 pH를 도시한다.
도 185는, AR 환원 및 수율에 대한 pH, 전도율 및 단백질 부하량의 효과를 도시한다.
도 186은, AR 환원 및 수율에 대한 pH, 전도율 및 단백질 부하량의 효과를 도시한다.
도 187은, pH 9.1에서 아세테이트/Tris 완충액으로 실행한, 상이한 pKa 값에 대한, 몇몇의 상이한 AEX 흡착제로의 mAb B에 대한 AEX 흡착 pKa의 효과를 도시한다.
도 188은, 예시 항체를 포함하는 조성물 중에 존재하는 예시 AR1 및 AR2의 도식적 묘사이다. 제조-유도된 AR들 및 보관-유도된 AR들이 도시된다.
도 189는, 각종 포름산 농도에 대한 수율의 함수로서 누적 AR 환원을 도시한다.
도 190은, 저 AR 조성물의 제조를 위한 예시 유동 경로를 도시한다. 도 191은, 저 AR 조성물을 제조하는 "연속 크로마토그래피" 프로세스에 관한 실험 스킴을 도시한다.
도 192는, 연속 MM 프로세스의 각각의 사이클에서의 AR 백분율을 도시한다.
도 193은, 아달리무마브 중의 산성 종 및 염기성 종이 동정되고 각종 분획들이 기술되는, 크로마토그램을 도시한다.
도 194a 내지 도 194b는, 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스의 (a) 평균 관절염 스코어 및 (b) 성장 관련 체중 증가를 도시한다.
도 195는, 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스의 평균 관절염 스코어(곡선 아래 면적)를 도시한다.
도 196a 내지 도 196b는, 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스에 대한 (a) 평균 트로프(trough) 혈청 약물 수준 및 (b) 평균 트로프 혈청 ADA 수준을 도시한다.
도 197은, 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스에 대한 평균 PK 및 ADA 프로파일(곡선 아래 면적)을 도시한다.
도 198은, 복합 TNF 수준(곡선 아래 면적)을 도시하고, 10주의 치료 기간 동안 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스에 대한 아달리무마브의 누적 혈청 농도 값이 저 AR 및 대조군 AR 조성물에 대해 최고였고, AR1 분획에 대해 최저였음을 보여준다.
도 199는, 저 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 대조군 AR 조성물이 투여된 마우스의 연골세포 사멸, 활액 증식, 프로테오글리칸 손실, 연골 파괴, 및 골 부식을 도시한다.
도 200a 내지 도 200d는, (a) 저 AR 조성물; (b) 대조군 AR 조성물; (c) AR1 조성물; 및 (d) Lys-1/2 조성물이 투여된 마우스에 대한 각종 조직(발, 림프절, 비장, 피부, 무릎 및 혈청)의 평균 약물 수준을 도해한다.
도 201a 내지 도 201d는, (a) 저 AR 조성물; (b) 대조군 AR 조성물; (c) AR1 조성물; 및 (d) Lys-1/2 조성물이 투여된 마우스에 대한 각종 조직(발, 림프절, 비장, 피부, 무릎 및 혈청)의 평균 ADA 수준을 도해한다.
도 202a 내지 도 202d는, 위약, 저 AR 조성물, 대조군 (정상) AR 조성물, AR1 조성물, 및 Lys-1/2 조성물이 투여된 TNF-Tg197 유전자전이 마우스로부터 얻어진 척추 및 대퇴골의 마이크로 CT 분석의 결과를 보여준다. 그래프들은, (a) 척추골 체적; (b) 척추골 소주 수(trabecular number); (c) 척추골 소주 두께; 및 (d) 척추골 소주 공간에 대한 투여된 조성물의 효과를 도시한다.
도 203a 내지 도 203d는, 위약, 저 AR 조성물, 대조군 (정상) AR 조성물, AR1 조성물, 및 Lys-1/2 조성물이 투여된 TNF-Tg197 유전자전이 마우스로부터 얻어진 척추 및 대퇴골의 마이크로 CT 분석의 결과를 보여준다. 그래프들은, (a) 척추골 손실; (b) 척추골 소주 수; (c) 척추골 소주 두께; 및 (d) 척추골 소주 공간에 대한 투여된 조성물의 효과를 도시한다.
도 204a 내지 도 204d는, 위약, 저 AR 조성물, 대조군 (정상) AR 조성물, AR1 조성물, 및 Lys-1/2 조성물이 투여된 TNF-Tg197 유전자전이 마우스로부터 얻어진 척추 및 대퇴골의 마이크로 CT 분석의 결과를 보여준다. 그래프들은, (a) 척추골 체적/대퇴부 골간단(femoral metaphysis)시의 총 체적; (b) 대퇴부 골간단시 척추골 수; (c) 대퇴부 골간단시 척추골 두께; 및 (d) 대퇴부 골간단시 척추골 분리에 대한 투여된 조성물의 효과를 도시한다.
도 205는, 하기 조성물: 나이브(naive), 비히클(대조군), 저 AR 조성물(그룹 5), 저 숙주 세포 단백질(HCP) 조성물(그룹 7), AR1 조성물(AR1 산성 변이체만을 함유)(그룹 8), 및 Lys-1/2 조성물(Lys 1 및 Lys 2 변이체만을 함유)(그룹 9)이 투여된 마우스들의 6개의 그룹의 각각으로부터의 척추의 마이크로 CT 화상을 도시한다.
도 206은, 하기 조성물: 나이브, 비히클(대조군), 저 AR 조성물(그룹 5), 저 숙주 세포 단백질(HCP) 조성물(그룹 7), AR1 조성물(AR1 산성 변이체만을 함유)(그룹 8), 및 Lys-1/2 조성물(Lys 1 및 Lys 2 변이체만을 함유)(그룹 9)이 투여된 마우스들의 6개의 그룹의 각각으로부터의 대퇴골의 마이크로 CT 화상을 도시한다.
본 발명은, 저 백분율의 산성 종(AR) 및/또는 저 수준의 프로세스-관련 불순물(예를 들면, 숙주 세포 단백질 및 배지 구성성분)을 포함하는 단백질 조성물의 제조를 초래하는, 단백질 제조, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합부의 제조를 위한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 기술의 동정 및 최적화에 기초한다.
본원에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은, 대상체에게 투여시 증가된 치료학적 효능을 나타낸다. 예를 들면, 저 AR을 포함하는, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물은, TNFα가 유해한 장애, 예를 들면, 류마티스 관절염(RA), 소아 특발성 관절염(JIA), 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론 질환, 및 궤양성 결장염의 치료 및 예방에 있어서의 치료학적 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은, 저 AR 및/또는 저 수준의 프로세스-관련 불순물을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR, 약 3% 내지 약 5%의 AR, 약 5% 내지 약 8%의 AR, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 2.4% 또는 2.5%의 AR을 포함하는 조성물, 예를 들면, 아달리무마브 조성물이 아니다.
다른 실시형태에서, 저 AR 조성물은 제1 산성 종(AR1) 및 제2 산성 종(AR2)을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 저 AR 조성물은 약 0.1% 이하의 AR1 및 약 3% 이하의 AR2를 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 저 AR 조성물은 약 0.0%의 AR1 및 약 1.4% 이하의 AR2를 포함한다.
이러한 실시형태의 다른 양상에서, 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 0.2%의 AR1을 포함하는 조성물, 예를 들면, 아달리무마브 조성물이 아니다.
이러한 실시형태의 또 다른 양상에서, 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 2.2%의 AR2를 포함하는 조성물, 예를 들면, 아달리무마브 조성물이 아니다.
다른 실시형태에서, 저 AR 조성물, 예를 들면, 아달리무마브의 저 AR 조성물은 약 1.4% 이하의 AR을 포함한다. 예를 들면, 이러한 실시형태의 한 양상에서, 저 AR 조성물, 예를 들면, 1.4% 이하의 AR을 포함하는 아달리무마브의 저 AR 조성물은 약 0.0%의 AR1 및 약 1.4% 이하의 AR2를 포함한다.
한 실시형태에서, 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부이다.
I. 정의
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해서, 우선 소정 용어들을 정의한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "산성 종", "산성 영역" 및 "AR"은, 전체 산성 전하를 특징으로 하는 단백질의 변이체, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부를 말한다. 예를 들면, 모노클로날 항체(mAb) 제제에 있어서, 이러한 산성 종은 각종 방법, 예를 들면, 이온 교환, 예를 들면, WCX-19 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전점 전기영동)에 의해 검출될 수 있다. 도 188에 도시하는 바와 같이, 항체의 산성 종으로는 전하 변이체, 구조 변이체 및/또는 단편화 변이체가 포함될 수 있다. 예시의 전하 변이체로는 탈아미드화 변이체, 아푸코실화 변이체, 메틸글리옥살(MGO) 변이체, 당화 변이체, 및 시트르산 변이체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시의 구조적 변이체로는 글리코실화 변이체 및 아세톤화 변이체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예시의 단편화 변이체로는, Fc 및 Fab 단편, Fab가 손실된 단편, 중쇄 가변 도메인이 손실된 단편, C-말단 절단 변이체, 경쇄에서의 N-말단 Asp의 절제(excision)를 갖는 변이체, 및 경쇄의 N-말단 절단을 갖는 변이체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 펩타이드 쇄의 해리, 효소적 및/또는 화학적 변형으로 인한 표적 분자로부터의 임의의 절단된 단백질 종이 포함된다. 다른 산성 종 변이체로는, 쌍을 이루지 않은 디설파이드, 숙주 세포 단백질, 및 숙주 핵산, 크로마토그래피 재료, 및 배지 구성성분을 함유하는 변이체가 포함된다.
소정 실시형태에서, 단백질 조성물은 1개 초과의 유형의 산성 종 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 총 산성 종은, 예를 들면, 단백질 제제의 WCX-10 약한 양이온 교환 HPLC에서 나타나는 피크의 크로마토그래피 체류 시간에 근거하여 나눌 수 있다. 도 163은, 아달리무마브의 발현과 관련된 총 산성 종이 제1 산성 종 영역(AR1) 및 제2 산성 종 영역(AR2)으로 나뉘는 이러한 분할의 비-제한적 예를 도시한다.
도 188에 도식적으로 묘사되는 바와 같이, AR1은, 예를 들면, 전하 변이체, 예를 들면, 탈아미드화 변이체, MGO 변형된 종, 당화 변이체, 및 시트르산 변이체, 구조적 변이체, 예를 들면, 글리코실화 변이체 및 아세톤화 변이체, 및/또는 단편화 변이체를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, AR2는, 예를 들면, 전하 변이체, 예를 들면, 당화 변이체 및 탈아미드화 변이체를 포함할 수 있다.
특히, 아달리무마브(및 아달리무마브의 소정의 구조적 특징, 예를 들면, 아달리무마브의 하나 이상의 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 공유하는 항체)와 관련하여, AR1 전하 변이체는 탈아미드화 변이체, 당화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO(예를 들면, 하기 표 5에 나타낸 잔기에서의 MGO 변이체) 변이체 또는 시트르산 변이체를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 탈아미드화 변이체는, Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인한다. 다른 실시형태에서, 당화 변이체는 Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인한다. AR1 구조 변이체는 글리코실화 변이체 또는 아세톤화 변이체를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
AR1 단편화 변이체는 Fc 및 Fab 단편, Fab가 손실된 단편, 중쇄 가변 도메인이 손실된 단편, C-말단 절단 변이체, 경쇄에서의 N-말단 Asp의 절제를 갖는 변이체, 및 경쇄의 N-말단 절단을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
AR2 전하 변이체는 탈아미드화 변이체 또는 당화 변이체를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 여기서, 탈아미드화 변이체는, Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인할 수 있고, 당화 변이체는, Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인할 수 있다.
용어 "산성 종"은 프로세스-관련 불순물을 포함하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "프로세스-관련 불순물"은, 단백질을 포함하는 조성물 중에 존재하지만 단백질 자체로부터 유도된 것은 아닌 불순물을 말한다. 프로세스-관련 불순물로는 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 핵산, 크로마토그래피 재료, 및 배지 구성성분이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 "저 프로세스-관련 불순물 조성물"은, 불순물이 감소되지 않았던 조성물과 비교하여 감소된 수준의 프로세스-관련 불순물을 포함하는 조성물을 말한다. 예를 들면, 저 프로세스-관련 불순물 조성물은 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 그 이하의 프로세스-관련 불순물을 함유할 수 있다. 한 실시형태에서, 저 프로세스-관련 불순물 조성물은 프로세스-관련 불순물을 포함하지 않거나 프로세스-관련 불순물을 실질적으로 포함하지 않는다.
산성 종은 생산물 제조의 결과(본원에서 "제조-유도된 산성 종"이라고도 나타냄), 또는 보관의 결과("보관-유도된 산성 종"이라고도 나타냄)일 수 있다. 제조-유도된 산성 종은, 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 제조(업스트림 및/또는 다운스트림 프로세싱) 동안에 형성되는 산성 종이다. 예를 들면, 제조-유도된 산성 종은 세포 배양 동안에 형성될 수 있다("세포 배양-유도된 산성 종"). 보관-유도된 산성 종은, 제조 후 직접적으로 단백질의 집단에 존재할 수 있거나 존재할 수 없지만, 샘플이 보관되는 동안에 형성되거나 생성되는, 산성 종이다. 보관-유도된 산성 종의 유형 및 양은, 샘플의 제형에 기초하여 변할 수 있다. 보관-유도된 산성 종의 형성은, 특정 조건 하에 제제가 보관되는 경우 부분적으로 또는 완전히 억제될 수 있다. 예를 들면, 수성 제형은, 특정 온도에서 보관되어 AR 형성을 부분적으로 또는 완전히 억제할 수 있다. 예를 들면, 형성 또는 보관-유도된 AR은, 약 2℃ 내지 8℃에서 보관된 수성 제형 중에서 부분적으로 억제될 수 있고, -80℃에서 보관되는 경우에 완전히 억제될 수 있다. 또한, 저 AR 조성물은 감압 동결건조되거나(lyophilized) 또는 동결-건조(freeze-dried)되어 보관-유도된 AR의 형성을 부분적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에 사용되는 용어 "저 산성 종 조성물" 또는 "저 AR 조성물"은, 상기 조성물이 약 15% 미만의 산성 종을 함유하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 저 AR 조성물 중의 AR 백분율은, 샘플 중에 함유된 총 항체의 중량과 비교한 샘플 중의 산성 종의 중량을 말한다. 예를 들면, AR 백분율은, 예를 들면, 하기 실시예 1에 기술되어 있는 WCX-10와 같은 약한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 계산할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR, 약 3% 내지 약 5%의 AR, 약 5% 내지 약 8%의 AR, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR1, 약 3% 내지 약 5%의 AR1, 약 5% 내지 약 8%의 AR1, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR1, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1을 포함한다. 다른 실시형태에서, 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 저 산성 종 조성물은 약 3% 이하의 AR2를 포함한다.
다른 실시형태에서, 저 AR 조성물은 약 1.4% 이하의 AR을 포함한다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 상기 조성물은 약 1.4%의 AR2 및 약 0.0%의 AR1을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 탈아미드화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO 변이체, 당화 변이체, 시트르산 변이체, 글리코실화 변이체, 아세톤화 변이체, 또는 단편화 변이체 중 하나 이상의, 약 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4.5% 이하, 4% 이하, 3.5% 이하, 3% 이하, 2.5% 이하, 2% 이하, 1.9% 이하, 1.8% 이하, 1.7% 이하, 1.6% 이하, 1.5% 이하, 1.4% 이하, 1.3% 이하, 1.2% 이하, 1.1% 이하, 1% 이하, 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 또는 0.0%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 또한, 탈아미드화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO 변이체, 당화 변이체, 시트르산 변이체, 글리코실화 변이체, 아세톤화 변이체, 또는 단편화 변이체 중 하나 이상의, 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 8% 내지 약 10%, 또는 약 10% 내지 약 15%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 저 AR 조성물은 15% 미만의 탈아미드화 변이체를 포함할 수 있고, 한편, 다른 산성 변이체들 각각은, 단독으로 또는 조합으로, 15% 초과인 백분율로 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "비(non)-저 산성 종 조성물"은, 약 16% 초과의 산성 종을 함유하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물을 말한다. 예를 들면, 비-저 산성 종 조성물은 약 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 또는 25% 이상의 산성 종을 함유할 수 있다. 한 실시형태에서, 비-저 산성 종 조성물은 약 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 또는 25% 이상의 AR1을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 비-저 산성 종 조성물은 약 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 또는 25% 이상의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 저 AR 조성물은, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 대상체에서의 장애, 예를 들면, TNFα 활성이 유해한 장애의 치료 또는 예방에 있어서의 증가된 효능을 포함하는 생물학적 및 기능적 특성을 개선시켰다. 한 실시형태에서, 저 AR 조성물은 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부, 예를 들면, 아달리무마브 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물은, TNFα 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여하는 경우, 동일한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 증가된 연골 침투, 감소된 골 부식, 및/또는 감소된 연골 파괴를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "증가된 연골 침투"는, 동일한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 AR 조성물과 비교하여, 저 AR 조성물에 의한 생체내에서의 연골의 증가된 침투를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "감소된 연골 파괴"는, 동일한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 AR 조성물과 비교하여, 저 AR 조성물에 의한 생체내에서의 연골 조직의 파괴에 있어서의 측정가능한 감소를 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "감소된 골 부식"은, 동일한 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 저 AR 조성물에 의한 골 조직의 부식의 생체내에서의 측정가능한 감소를 말한다. 예를 들면, TNFα 활성이 유해한 질환 또는 장애의 생체내 모델, 예를 들면, 관절염의 마우스 모델을 이용하여, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 조성물에 의한 연골 침투, 골 부식, 및/또는 연골 파괴를 측정할 수 있다. 당해 분야에 인지되어 있는 관절염의 마우스 모델의 한 비-제한적 예로는 관절염의 사람 TNF 유전자전이 197 마우스 모델(TNF-Tg197)이 있다(문헌[Keffer, J. et al., EMBO J (1991) 10:4025-4031]을 참조하고, 이 문헌의 내용은, 관절염의 TNF-Tg197 모델의 추가의 상세 설명을 위해, 인용에 의해 본원에 명확히 포함된다).
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물은, 관절염의 동물 모델, 예를 들면, 관절염의 TNF-Tg197 모델에게 투여하는 경우, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 관절염 스코어, 및/또는 조직병리학 스코어에 의해 측정시, 관절염의 발병에 대한 증가된 보호를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "관절염 스코어"는, 관절염의 동물 모델에서의 관절염의 징후 및 증상을 말한다. 본원에서 사용되는 "조직병리학 스코어"는 국부 염증뿐만 아니라 연골 및 골에 관련된 방사선학적 손상(radiologic damage)을 말한다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물은, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 감소된 활액 증식, 감소된 세포 침윤, 감소된 연골세포 사멸, 및/또는 감소된 프로테오글리칸 손실을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물은, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 증가된 TNFα 친화도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "TNFα 활성이 유해한 장애"는, 상기 장애를 앓고 있는 대상체에서의 TNFα의 존재가, 상기 장애의 병인 또는 상기 장애의 악화에 기여하는 인자에 관여하는 것으로 밝혀졌거나 상기 장애의 병태생리 또는 상기 장애의 악화에 기여하는 인자에 관여하는 것으로 의심되는, 질환 및 다른 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, TNFα 활성이 유해한 장애는, TNFα 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시키는 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들면, 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 유체 중의 TNFα의 농도에 있어서의 증가(예를 들면, 대상체의 혈청, 혈장, 또는 활액)에 의해 입증될 수 있고, 이는, 상기 기술된 바와 같은 항-TNFα 항체를 이용하여 검출될 수 있다. TNFα 활성이 유해한 장애의 다수의 예들이 존재한다. 한 실시형태에서, TNFα 활성이 유해한 장애는 자가면역 장애이다. 한 실시형태에서, 자가면역 장애는, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 건선, 골관절염, 통풍성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 건선성 관절염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신 증후군, 소아 류마티스 관절염, 크론 질환, 궤양성 결장염, 활성 축성 척추관절염(active axial spondyloarthritis)(활성 axSpA) 및 비-방사선적 축성 척추관절염(non-radiographic axial spondyloarthritis)(nr-axSpA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. TNFα 활성이 유해한 장애는 U.S. 특허 제6,090,382호에, 그리고, 문헌[the "Highlights of Prescribing Information" for HUMIRA®(adalimumab) Injection (Revised Jan. 2008)]에도 제시되고, 이의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다. 특정 장애의 치료를 위해 본 발명의 방법을 이용하여 수득된 TNFα 항체 및 항체부의 사용은 하기에 추가로 상세하게 논의된다.
용어 "항체"는, 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄의 4개의 폴리펩타이드 쇄들로 이루어진 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약기함) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인들로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약기함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 CL의 1개의 도메인으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 명명된 보다 보존된 영역들 사이에 개재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명명된 초가변성 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 이루어진다.
용어 항체의 "항원-결합부"(또는 "항체부")는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편(예를 들면, 아달리무마브의 경우에 hTNFα)을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들을 포함하는 1가의 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 링크된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 포함하는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편, (v) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, 이 문헌의 전문 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다]; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음; 예를 들면, [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조하고, 이들의 전문의 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 또한, 이러한 단일 쇄 항체는, 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예를 들면, 디아바디(diabody)도 포함된다. 디아바디는, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 사이에서 쌍을 이루도록 하기에 너무 짧은 링커를 이용함으로써 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 것을 제외한, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에 발현되는 2가의 이특이적 항체이다(예를 들면, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123]을 참조하고, 이들의 전문의 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다). 또한, 추가로, 항체 또는 이의 항원-결합부는, 항체 또는 항체부의 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와의 공유결합적 또는 비-공유결합적 회합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는, 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, 이의 전문의 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다), 및 2가의 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058, 이의 전문의 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다)이 포함된다. 항체부, 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편은, 전체 항체로부터 종래 기술, 예를 들면, 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 소화를 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 한 양상에서, 항원 결합부는 완전 도메인 또는 완전 도메인들의 쌍이다.
용어 "캐뱃 번호매김", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에 인지되어 있는 이들 용어는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호매김 시스템을 말한다[참조: Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 및 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 이들의 전문 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다]. 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1에 대해 31 내지 35번 아미노산 위치, CDR2의 경우 50 내지 65번 아미노산 위치, 및 CDR3의 경우 95 내지 102번 아미노산 위치의 범위이다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1의 경우 24 내지 34번 아미노산 위치, CDR2의 경우 50 내지 56번 아미노산 위치, 및 CDR3의 경우 89 내지 97번 아미노산 위치의 범위이다.
용어 "사람 항체"는, 문헌[참조: Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 의해 기술되어 있는 바와 같은 사람 생식선 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면, CDR 및 특정한 CDR3 내에서, 사람 생식선 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내에서의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 돌연변이는, "선택적 돌연변이유발 접근법"을 이용하여 도입될 수 있다. 사람 항체는, 아미노산 잔기, 예를 들면, 사람 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 활성 개선 아미노산 잔기로 대체되는 하나 이상의 위치를 가질 수 있다. 사람 항체는, 사람 생식선 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 대체되는 20개 이하의 위치를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 위치가 대체된다. 한 실시형태에서, 이들 대체는 CDR 영역 내에 존재한다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "사람 항체"는, 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
어구 "재조합 사람 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는 사람 항체, 예를 들면, 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현되는 항체, 재조합 조합적 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들면, 문헌[Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295]을 참조하고, 상기 문헌의 전문 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다) 또는 다른 DNA 서열에의 사람 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 사람 항체는, 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다(참조: Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 그러나, 소정 실시형태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열에 대해 유전자전이된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)되고, 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 사람 생식선 VH 및 VL 서열과 관련되어 있으면서 생체내 사람 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다. 그러나, 소정 실시형태에서, 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이유발 접근법 또는 역-돌연변이(back-mutation) 또는 둘 다의 결과이다.
"단리된 항체"는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들면, hTNFα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가, hTNFα 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는, 단리된 항체)를 포함한다. hTNFα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종 유래의 TNFα 분자에 결합할 수 있다. 또한, 단리된 항체는 기타 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다. 적합한 항-TNFα 항체는 아달리무마브이다.
상표명 HUMIRA®(AbbVie)로서도 공지되어 있는 본원에서 사용되는 용어 "아달리무마브"는, 사람 종양 괴사 인자 α(TNFα)에 결합하는 사람 IgG1 항체를 말한다. 일반적으로, 아달리무마브 IgG-Fc 영역의 중쇄 불변 도메인 2(CH2)는, 아스파라긴 297(Asn-297)에서의 올리고사카라이드의 공유결합적 부착을 통해 글리코실화된다. 아달리무마브의 경쇄 가변 영역은 본원에서 서열번호 1로서 제공되고, 아달리무마브의 중쇄 가변 영역은 본원에서 서열번호 2로서 제공된다. 아달리무마브는, 서열번호 7의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2, 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 아달리무마브는, 서열번호 8의 CDR1, 서열번호 6의 CDR2, 및 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 서열번호 9에 제시된다. 중쇄 가변 영역의 핵산 서열은 서열번호 10에 제시된다. 경쇄의 전장 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시되고, 중쇄의 전장 아미노산 서열은 서열번호 12에 제시된다. 아달리무마브는 U.S. 특허 제6,090,382호; 제6,258,562호; 제6,509,015호; 제7,223,394호; 제7,541,031호; 제7,588,761호; 제7,863,426호; 제7,919,264호; 제8,197,813호; 제8,206,714호; 제8,216,583호; 제8,420,081호; 제8,092,998호; 제8,093,045호; 제8,187,836호; 제8,372,400호; 제8,034,906호; 제8,436,149호; 제8,231,876호; 제8,414,894호; 제8,372,401호에 기술되어 있고, 상기 문헌 각각의 전체 내용은 본원에 이들의 전문이 인용에 의해 명확히 포함된다. 또한, 아달리무마브는 문헌["Highlights of Prescribing Information for HUMIRA®(adalimumab) Injection (Revised Jan. 2008)]에 기술되어 있고, 상기 문헌의 내용은 인용에 의해 본원에 포함된다.
한 실시형태에서, 아달리무마브는, 둘 다 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 1x10-8M 이하의 Kd 및 1x10-3s-1 이하의 Koff를 갖는 사람 TNFα로부터 해리되고, 표준 시험관내 L929 검정에서 1x10- M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킨다. 다른 실시형태에서, 아달리무마브는, 5x10-4s-1 이하의 Koff 또는 1x10-4s-1 이하의 Koff를 갖는 사람 TNFα로부터 해리된다. 또 다른 실시형태에서, 아달리무마브는, 표준 시험관내 L929 검정에서 1x10-8M 이하의 IC50, 1x10-9M 이하의 IC50, 또는 1x10-10M 이하의 IC50으로 사람 TNFα 세포독성을 중화시킨다.
일반적으로, 아달리무마브 IgG-Fc 영역의 중쇄 불변 도메인 2(CH2)는, 아스파라긴 297(Asn-297)에서의 올리고사카라이드의 공유결합적 부착을 통해 글리코실화된다. 아달리무마브의 분석은, 본원에서 "리신 변이체 종"으로서 나타내는 3개의 주요 염기성 변이체(즉, Lys 0, Lys 1, 및 Lys 2)를 갖는 것을 밝혔다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "리신 변이체 종"은, 0, 1, 또는 2개의 C-말단 리신을 갖는 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 말한다. 예를 들면, "Lys 0" 변이체는, C-말단 리신을 포함하지 않는 중쇄를 갖는 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함한다. "Lys 1" 변이체는, C-말단 리신을 포함하는 1개의 중쇄를 갖는 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함한다. "Lys 2" 변이체는, C-말단 리신을 포함하는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 포함한다. 리신 변이체는, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부를 발현하는 숙주 세포의 발현 생산물의 약한 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, WCX-10)에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 도 163 및 도 193은 아달리무마브의 WCX-10 분석을 도시하고, 여기서, 3개의 리신 변이체들 및 2개의 산성 종 영역은 서로로부터 분해된다.
본 발명의 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 1개 초과의 리신 변이체 종을 포함할 수 있다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 상기 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 Lys 2 변이체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 Lys 1 변이체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 Lys 0 변이체를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 Lys 1 및 Lys 2, 또는 Lys 1 및 Lys 0, 또는 Lys 2 및 Lys 0 변이체 둘 다를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 항체 또는 이의 항원-결합부의 3개의 리신 변이체 종 모두, 즉, Lys 0, Lys 1 및 Lys 2를 포함할 수 있다.
단백질, 예를 들면, 항체 제제와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "업스트림 프로세스 기술"은, 세포(예를 들면, 목적하는 단백질의 세포 배양 동안)로부터의 단백질(예를 들면, 항체)의 생산 및 수집에 관여하는 활성을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포 배양"은, 목적하는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포의 군집을 생성시키고 유지하기 위한 방법, 및 목적하는 단백질의 생산 및 수집을 최적화하기 위한 방법 및 기술을 말한다. 예를 들면, 일단 발현 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주는, 관련 뉴클레오타이드 암호화 서열의 발현, 및 원하는 재조합 단백질의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 기술을 이용하는 경우, 목적하는 단백질은 세포내에서 또는 주변세포질 공간에서 생산되거나, 배지에 직접적으로 분비될 수 있다. 목적하는 단백질이 세포내에서 생산되는 실시형태에서, 숙주 세포 또는 용해된 세포인 미립자 잔해(예를 들면, 균질화(homogenization)로부터 기인함)는, 원심분리 또는 한외여과를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 수단에 의해 제거될 수 있다. 목적하는 단백질이 배지에 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청은, 우선 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon™ 또는 Millipore Pellicon™ 한외여과 유닛을 이용하여 농축시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "다운스트림 프로세스 기술"은, 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체를 정제하기 위해 업스트림 프로세스 기술 후에 사용되는 하나 이상의 기술들을 말한다. 예를 들면, 다운스트림 프로세스 기술은, 예를 들면, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 치환(displacement) 크로마토그래피를 이용한 단백질 생산물의 정제를 포함한다.
항체 또는 항체부(예를 들면, VH, VL, CDR3)를 암호화하는 핵산, 예를 들면, hTNFα에 결합하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "단리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이, 다른 서열이 사람 게놈 DNA에서 핵산을 자연적으로 플랭킹(flank)할 수 있는 hTNFα 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는, 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 항-TNFα 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 단리된 핵산은, 예를 들면, hTNFα 이외의 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 다른 서열은 함유하지 않는다. 또한, 어구 "단리된 핵산 분자"는, VH 및 VL 영역이 디아바디의 서열 이외의 다른 서열을 함유하지 않는 디아바디와 같은 2가의 이특이적 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 것으로 의도된다.
어구 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이러한 용어들은, 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 후손(progeny)도 나타내는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후속 세대에서 소정 변형이 발생할 수 있으므로, 이러한 후손은 실제로 모 세포와 실제로 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 단백질"은, 숙주 세포에 도입된 재조합 발현 벡터로 수행된 유전자의 전사 및 번역의 결과로서 생산된 단백질을 말한다. 소정 실시형태에서, 재조합 단백질은 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 사람화된 항체, 또는 완전 사람 항체이다. 소정 실시형태에서, 재조합 단백질은, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이소타입(isotype)의 항체이다. 소정 실시형태에서, 항체 분자는 전장 항체(예를 들면, IgG1 또는 IgG4 면역글로불린)이거나, 대안으로, 상기 항체는 단편(예를 들면, Fc 단편 또는 Fab 단편)일 수 있다.
어구 "정화된 수거물"은, 목적하는 항체를 함유하는 액체 물질로부터 큰 고체 입자를 제거하기 위한 원심분리, 및 더 미세한 고체 입자 및 불순물을 제거하기 위한 후속적 여과를 행한 후, 세포 배양물, 예를 들면, 발효 생물 반응기(bioreactor)로부터 추출된, 목적하는 단백질, 예를 들면, 목적하는 모노클로날 항체와 같은 목적하는 항체를 함유하는 액체 물질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "제조 규모(preparative scale)"는, 여전히 원하는 분리를 제공하면서 쉽게 규모-확대(scaled-up)되어 대규모 제조로 실행될 수 있는 정제 작업의 규모를 말한다. 예를 들면, 당해 분야 숙련가는, 실험실에서, 예를 들면, 0.5cm(i.d.) x 20cm(L) 컬럼을 이용하여 프로세스를 전개하고, 예를 들면, 동일한 수지로 팩킹된 30cm(i.d.) x 20cm(L) 컬럼을 이용하여 동일한 완충액 세트, 동일한 선형 유속(또는 체류 시간) 및 완충액 체적으로 작동시켜 이를 대규모 생산으로 이동시킬 수 있다. 제조 규모 분리에서, 컬럼 층 높이는 전형적으로 약 30cm 이하이고, 컬럼 압력 강하(column pressure drop)는 약 5bar 이하이다.
II. 본 발명의 저 산성 종 조성물
본 발명은, 단백질, 예를 들면, 아달리무마브와 같은 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR, 약 3% 내지 약 5%의 AR, 약 5% 내지 약 8%의 AR, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR1, 약 3% 내지 약 5%의 AR1, 약 5% 내지 약 8%의 AR1, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR1, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 또한, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함할 수 있다.
본원에서 입증되는 바와 같이, 이들 저 AR 조성물은 생물학적 특성을 개선시켰다(실시예 13 참조). 예를 들면, 본 발명의 저 AR 조성물은, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 증가된 연골 조직 침투, 감소된 연골 파괴, 감소된 활액 증식, 감소된 골 부식, 관절염 스코어 및/또는 조직병리학 스코어의 발병에 대한 증가된 보호, 감소된 세포 침윤, 감소된 프로테오글리칸 손실, 감소된 연골세포 사멸, 및/또는 증가된 TNF 친화도를 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 조성물은, 대상체에게 투여시 증가된 치료학적 효능을 나타낸다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물 중의 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합부이다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합부는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부일 수 있다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는, 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 상기 항체는 서열번호 7에 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 상기 항체는 서열번호 8에 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 6에 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 4에 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 RKUS 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 AR 조성물에 사용되는 항체 또는 이의 항원 결합부는 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 개시의 저 AR 조성물에 사용될 수 있는 항체는, 종래 모노클로날 항체 방법, 예를 들면, 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 하이브리드화 기술에 따른 목적하는 항원으로의 동물의 면역화를 포함하는 각종 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 하이브리드화 절차를 사용할 수 있다. 원칙적으로는, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 포함하는, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 다른 기술도 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 한 예시적 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 하이브리도마 생산은 매우 잘-확립되어 있는 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들면, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차도 공지되어 있다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용된 항체는 사람 항체, 키메라 항체, 또는 사람화된 항체일 수 있다. 본 발명의 저 AR 조성물에 사용된 키메라 항체 또는 사람화된 항체는, 상기 기술되어 있는 바와 같이 제조된 비-사람 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는, 목적하는 비-사람 하이브리도마로부터 수득되고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 비-뮤린(예를 들면, 사람) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작할 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 사람 불변 영역에 링크시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Cabilly et al.의 U.S. 특허 제4,816,567호를 참조한다). 사람화된 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 뮤린 CDR 영역을 사람 프레임워크에 삽입할 수 있다(예를 들면, 문헌[Winter의 특허 제5,225,539호, 및 Queen et al.의 U.S. 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호를 참조한다).
하나의 비-제한적 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항체는 사람 모노클로날 항체이다. 이러한 사람 모노클로날 항체는, 마우스 시스템보다는 사람 면역 시스템의 일부를 갖는 유전자전이(transgenic) 또는 염색체전이(transchromosomic) 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 이들 유전자전이 또는 염색체전이 마우스로는, 본원에 HuMAb Mouse®(Medarex, Inc.), KM Mouse®(Medarex, Inc.), 및 XenoMouse®(Amgen)로서 나타내는 마우스들이 포함된다. 또한, 본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항체 또는 이의 항원-결합부는, U.S. 특허 제6,090,382호에 기술되어 있는 방법을 이용하여 제조할 수 있고, 상기 문헌의 전체 내용은 인용에 의해 본원에 명확히 포함된다.
또한, 사람 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안의 염색체전이 동물 시스템은 당해 분야에서 입수가능하고, 본 개시의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, "TC 마우스"로서 나타내는, 사람 중쇄 전이염색체 및 사람 경쇄 전이염색체 둘 다를 갖는 마우스를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기술되어 있다. 또한, 사람 중쇄 및 경쇄 전이염색체를 갖는 소는 당해 분야에 기술되어 있고(예를 들면, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 및 PCT 출원 제WO 2002/092812호), 본 개시의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 재조합 사람 항체는, 재조합 조합적 항체 라이브러리, 예를 들면, 사람 림프구로부터 유도된 mRNA로부터 제조되는 사람 VL 및 VH cDNA를 이용하여 제조되는, scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 시판 키트(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612, 이들의 전체 교시는 본원에 포함된다)에 추가하여, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용하기에 특히 쉬운 방법 및 시약의 예는, 예를 들면, 문헌[예를 들면, Ladner et al. U.S. 특허 제5,223,409호; Kang et al. PCT 공보 제WO 92/18619호; Dower et al. PCT 공보 제WO 91/17271호; Winter et al. PCT 공보 제WO 92/20791호; Markland et al. PCT 공보 제WO 92/15679호; Breitling et al. PCT 공보 제WO 93/01288호; McCafferty et al. PCT 공보 제WO 92/01047호; Garrard et al. PCT 공보 제WO 92/09690호; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibody Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982]에서 발견될 수 있고; 상기 문헌들의 전체 교시는 본원에 포함된다.
또한, 본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 사람 모노클로날 항체는, 사람 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 이용하여, 면역화시 사람 항체 반응이 생성될 수 있도록 제조할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들면, 문헌[Wilson et al.의 U.S. 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호]에 기술되어 있다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 사람 항체는, 항-TNFα 항체 및 이의 항체부, 항-TNFα 관련 항체 및 항체부, 및 항-TNFα 항체와 등가의 특성, 예를 들면, 낮은 해리 역학을 갖는 hTNFα에 결합하는 높은 친화도 및 높은 중화 능력을 지닌 사람 항체 및 항체부이다. 한 양상에서, 본 발명은, 둘 다 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 및 1 x 10-3s-1 이하의 Koff 속도 상수를 갖는 hTNFα로부터 해리되는, 단리된 사람 항체 또는 이의 항원-결합부를 함유하는 저 AR 조성물을 제공한다. 특정 비-제한적 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항-TNFα 항체는 생리학적 조건 하에 TNFα에 대한 아달리무마브의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 아달리무마브 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항체 또는 이의 단편은 변경될 수 있고, 여기서, 상기 항체의 불변 영역은, 비변형 항체와 관련하여 하나 이상의 불변 영역-매개된 생물학적 이펙터 기능이 감소되도록 변형된다. Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 나타내도록 본 발명의 항체를 변형시키기 위해서, 항체의 면역글로불린 불변 영역 절편을, Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; 및 Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662]을 참조하고, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 포함된다). 또한, 항체의 FcR 결합 능력의 감소는, FcR 상호작용에 의존하는 다른 이펙터 기능들, 예를 들면, 옵소닌작용(opsonization) 및 식세포작용(phagocytosis) 및 항체-의존적 세포의 세포독성도 감소시킬 수 있다.
III. 업스트림 프로세스 기술을 이용한 저 AR 조성물의 제조
단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브를 포함하는 본 발명의 저 AR 조성물은, 세포 배양과 같은 업스트림 단백질 생산 동안에 조건을 조정함으로써 제조될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 업스트림 프로세스 기술 동안(예를 들면, 세포 배양 동안) 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 목적하는 단백질을 생산하는 숙주 세포에 의해 발현되는, 산성 종 변이체 또는 프로세스-관련 불순물을 저감시킴을 포함한다. 업스트림 프로세스 기술은, 단독으로 사용하거나, 하기 섹션 IV 및 실시예 10에 기술되어 있는 다운스트림 프로세스 기술과 병용할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 업스트림 프로세스 기술들 중 하나 이상은, 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 생산한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR, 약 3% 내지 약 5%의 AR, 약 5% 내지 약 8%의 AR, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 업스트림 프로세스 기술들 중 하나 이상은, 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 생산한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR1, 약 3% 내지 약 5%의 AR1, 약 5% 내지 약 8%의 AR1, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR1, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 업스트림 프로세스 기술들 중 하나 이상은, 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 생산한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 5% AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태는, 세포에 의해 발현되는 산성 종의 양을 한정하는 조건 하에, 목적하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양함을 포함한다. 본 발명의 몇몇의 실시형태는 산성 종 변이체로의 생산물의 전환을 한정하는 조건 하에 숙주 세포를 배양함을 포함한다.
세포 배양 조건은, 동일한 단백질을 포함하는 비-저 산성 종 조성물의 생산 동안의 조건과 비교하여 변형될 수 있다. 한 실시형태에서, 저 산성 종 조성물은, 증가된 농도의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 중에서 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양함으로써 생산된다. 다른 실시형태에서, 저 산성 종 조성물은, 증가된 농도의 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 포함하는 세포 배양 배지 중에서 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양함으로써 생산된다. 또 다른 실시형태에서, 저 산성 종 조성물은, 증가된 농도의 니아신아미드를 포함하는 세포 배양 배지 중에서 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양함으로써 생산된다. 소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 방법은, 하나 이상의 아미노산, 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물) 및/또는 니아신아미드, 및 이들의 조합물이 보충된 배지 중에서 세포를 배양함을 포함한다.
소정 실시형태에서, 저 산성 종 조성물은, pH 또는 용존 산소(DO)와 같은 프로세스 매개변수들이 조정되는, 예를 들면, 숙주 세포에 의해 생산된 산성 종의 양을 감소시키고/시키거나 산성 종 변이체로의 생산물의 전환을 감소시키도록 저감된 배양물에서 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다.
또한, 연속 또는 관류 기술을 이용하여 저 AR을 수득할 수 있다. 소정 실시형태에서, 산성 종의 감소는, 세포 배양 동안 배지 교환을 조정함으로써 수득된다.
다른 실시형태에서, 상기 보충물 및 변형 중 하나 이상은 조합할 수 있고, 하나의 단백질, 예를 들면, 항체, 조성물의 세포 배양 동안에 사용될 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항체 또는 이의 항원-결합부를 발현시키기 위해, 단백질을 암호화하는 DNA, 예를 들면, 항체의 경우에 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 링크되도록 하나 이상의 발현 벡터에 삽입한다. (예를 들면, U.S. Pat. 제6,090,382호를 참조하고, 이의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다.) 이와 관련하여, 용어 "작동적으로 링크되는"은, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자가, 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 행하도록 벡터에 라이게이션됨을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은, 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록(compatible) 선택된다. 소정 실시형태에서, 목적하는 단백질은 다중 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함할 것이다. 따라서, 소정 실시형태에서, 다중 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자, 예를 들면, 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로, 상기 유전자는 동일한 박현 벡터에 삽입된다. 유전자는 표준 방법(예를 들면, 유전자 단편 상의 상보성 제한 부위와 벡터의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 평활 말단(blunt end) 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 유전자 또는 유전자들을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 추가의 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만 항체 불변 영역 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 항-TNFα 항체-관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키기 위한 하나의 접근법은, 이들 서열을, VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동적으로 링크되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동적으로 링크되도록, 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 암호화한 발현 벡터들에 삽입하는 것이다. 추가로 또는 대안으로, 재조합 발현 벡터는, 숙주 세포로부터의 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 유전자는, 신호 펩타이드가 유전자의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame) 링크되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종(heterologous) 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩타이드)일 수 있다.
단백질 암호화 유전자 이외에도, 재조합 발현 벡터는, 숙주 세포에서 단백질 암호화 유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 가질 수 있다. 용어 "조절 서열"은, 프로모터, 인핸서, 및 단백질 암호화 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들면, 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있고, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안은, 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자들에 의존할 수 있음이 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 적합한 조절 서열은, 포유동물 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스(CMV)(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들면, SV40 프로모터/인핸서), 아데노 바이러스(예를 들면, 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소, 및 이의 서열의 추가의 설명을 위해, 예를 들면, 문헌[Stinski에 의한 U.S. 특허 제5,168,062호, Bell et al.에 의한 U.S. 특허 제4,510,245호 및 Schaffner et al.에 의한 U.S. 특허 제4,968,615호]을 참조하고, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다.
또한, 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 추가의 서열, 예를 들면, 숙주 세포에서의 벡터의 복제(예를 들면, 복제의 기원(origin))를 조절하는 서열, 및/또는 선택가능한 마커 유전자를 가질 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 가능하게 한다(예를 들면, 문헌[모두 Axel et al.에 의한 U.S. 특허 제4,399,216호, 4,634,665호 및 제5,179,017호]을 참조하고, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다). 예를 들면, 전형적으로 선택가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포에 대해 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 적합한 선택가능한 마커 유전자로는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr- 숙주 세포에서 사용하는 경우) 및 neo 유전자(G418 선택의 경우)가 포함된다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 항체 또는 항체부는, 숙주 세포에서의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포를, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시켜, 상기 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되어 상기 숙주 세포가 배양되는 배지에 분비되고, 이 배지로부터 항체가 회수될 수 있도록 한다. 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터에 포함시키고, 이 벡터를 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 U.S. 특허 제4,816,397호 & 제6,914,128호, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 포함된다]에 기술되어 있는 바와 같은 숙주 세포에 도입한다.
단백질, 예를 들면, 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 단백질을 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염된다. 각종 형태의 용어 "형질감염"은, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 단백질을 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 예를 들면, 이러한 진핵생물 세포, 및 특히 포유동물 세포가, 원핵생물 세포보다 적절히 폴딩된 면역학적 활성 단백질을 어셈블링하고 분비하는 경향이 더 크므로, 포유동물 숙주 세포와 같은 진핵생물 세포에서의 항체 발현이 적합하다. 단백질 유전자의 원핵생물 발현은 높은 수율의 활성 단백질 생산에 효과적이지 않은 것으로 보고되었다(Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, 이의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다).
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기 기술되어 있는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물로는 진정세균, 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 장내세균, 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Kelbsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 타이피뮤리움(Samonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스(Bacilli), 예를 들면, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예를 들면, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 비. 리켄포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들면, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 이. 콜라이 B, 이 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주들도 적합하지만, 하나의 적합한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이다. 이들 예는 제한되기보다는 설명을 위한 것이다.
원핵생물 이외에도, 진핵생물 미생물, 예를 들면, 사상 진균 또는 효모는 폴리펩타이드 암호화 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에, 또는 통상의 제빵 효모가 저등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주들, 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이. 막시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들면, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)가 통상적으로 입수가능하고, 본원에서 유용하다.
글리코실화된 단백질, 예를 들면, 글리코실화된 항체에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로 바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필러), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 각종 바이러스 균주들, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공공으로 입수가능하고, 이러한 바이러스들은 본 발명에 따른 본원의 바이러스로서, 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 이용할 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물에 사용되는 재조합 단백질의 발현 및 생산에 포유동물 세포를 사용할 수 있지만, 본 발명과 관련하여 다른 진핵생물 세포 유형도 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)]을 참조한다. 본 발명에 따른 재조합 단백질을 발현시키기에 적합한 포유동물 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr- CHO 세포 포함, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220]에 기술되어 있음, 예를 들면, 문헌[Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기술되어 있는 바와 같은 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용됨, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함됨), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 단백질 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 항체는, 숙주 세포에서의 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지로의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293, 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간세포암 세포주(Hep G2)가 있고, 이의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다.
숙주 세포는, 단백질 생산을 위한 상기-기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 종래 영양 배지에서 배양된다.
단백질을 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예를 들면, Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(Eagle) 배지(DMEM)(Sigma)가 숙주를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; 제WO 90/03430호; 제WO 87/00195호; 또는 U.S. Pat. 제Re. 30,985호]에 기술되어 있는 배지 중 임의의 배지를 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있고, 상기 문헌의 전체 교시는 본원에 인용에 의해 포함된다. 이들 배지 중 임의의 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들면, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액(예를 들면, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들면, 겐타마이신 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 포도당 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물들은, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, 및 pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이고, 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다.
또한, 숙주 세포를 사용하여 Fab 단편 또는 scFv 분자를 포함하는 온전한 단백질, 예를 들면, 항체의 일부를 생산할 수 있다. 상기 절차에 대한 변화는 본 발명의 범위 내임이 이해된다. 예를 들면, 소정 실시형태에서, 항체의 경쇄 또는 중쇄(그러나, 둘 다는 아님)를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 항원에의 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄는 표적 항체 이외의 항원에 대해 특이적인, 이기능성 항체는, 본 발명의 항체의 특이성에 따라, 표준 화학적 가교결합 방법에 의해 제2 항체에 본 발명의 항체를 가교결합시킴으로써 생산될 수 있다.
단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 재조합 발현에 적합한 시스템에서, 단백질, 예를 들면, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포에 도입한다. 재조합 발현 벡터를 이용하여, 단백질 유전자(들)는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 각각 작동적으로 링크되어 높은 수준의 유전자(들)의 전사가 구동된다. 또한, 재조합 발현 벡터는, 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하는 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 갖는다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 단백질, 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 온전한 단백질, 예를 들면, 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 단백질을 회수한다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 제조되거나, 배지에 직접적으로 분비될 수 있다. 한 양상에서, 단백질이 세포내에서 제조되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 새포인 미립자 잔해(예를 들면, 균질화(homogenization)로부터 기인함)는, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질이 배지에 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청은, 우선 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon™ 또는 Millipore Pellicon™ 한외여과 유닛을 이용하여 농축시킬 수 있다.
몇몇의 항체는 세포로부터 주위 성장 배지에 직접적으로 분비될 수 있고; 다른 항체들은 세포내에서 제조된다. 세포내에서 제조되는 항체에 관해, 정제 프로세스의 제1 단계는, 전형적으로, 기계적 전단력, 삼투압 충격(osmotic shock), 또는 효소 처리를 포함하는 각종 방법에 의해 이루어질 수 있는 세포의 용해를 포함한다. 이러한 파괴는 세포의 전체 함량을 균질화물에 방출시키고, 또한, 작은 크기로 인하여 제거하기 곤란한 준세포(subcellular) 단편을 생성시킨다. 이들은, 일반적으로, 분별 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 제거된다. 항체가 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청은, 우선 일반적으로 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon™ 또는 Millipore Pellicon™ 한외여과 유닛을 이용하여 농축시킨다. 항체가 배지에 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포도, 예를 들면, 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 항체는, 본 발명의 항체 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
산성 종(AR)을 조절하기 위한 아미노산 농도의 조정
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 산성 종 조성물을 제조하기 위해, 배지 중의 하나 이상의 아미노산 양을 조절한다(예를 들면, 증가시키거나 감소시킨다)(하기 실시예 섹션 참조). 하나 이상의 아미노산의 양의 이러한 증가 또는 감소는, 동일한 단백질의 비-저 산성 종 조성물이 제조되는 세포 배양 동안 사용된 본래 양의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들일 수 있다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지는, 산성 종을 저감시키는 것으로 본원에 기술되어 있는 아미노산들 또는 다른 조성물들 중 하나 이상을 포함할 것이다. 따라서, 보충되는 아미노산 또는 다른 조성물의 양을 조정하여 보충하기 전에 배지에 존재하는 양을 계산할 수 있다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 약 0.025 내지 20g/L, 또는 약 0.05 내지 15g/L, 또는 약 0.1 내지 14g/L, 또는 약 0.2 내지 13g/L, 또는 약 0.25 내지 12g/L, 또는 약 0.5 내지 11g/L, 또는 약 1 내지 10g/L, 또는 약 1.5 내지 9.5g/L, 또는 2 내지 9g/L, 또는 약 2.5 내지 8.5g/L, 또는 약 3 내지 8g/L, 또는 약 3.5 내지 7.5g/L, 또는 약 4 내지 7g/L, 또는 약 4.5 내지 6.5g/L, 또는 약 5 내지 6g/L의 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다. 소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 약 0.25g/L, 또는 약 0.5g/L, 또는 약 1g/L, 또는 약 2g/L, 또는 약 4g/L, 또는 약 8g/L의 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 단백질 또는 항체 조성물 중의 산성 종의 백분율을 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들만큼 감소시키기에 효과적인 양으로 하나 이상의 아미노산을 보충한다.
몇몇의 실시형태에서, 세포 배양 배지를 보충하기 위해 사용되는 하나 이상의 아미노산은 염기성 아미노산이다. 소정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 또는 아르기닌 또는 리신의 오르니틴과의 소정 조합, 또는 4개의 아미노산 모두의 소정 조합이다. 소정 실시형태에서, 아미노산은 단일 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 보다 긴 올리고펩타이드이다. 소정 실시형태에서, 디-, 트리-, 및/또는 올리고펩타이드는 개별적으로 단일 아미노산으로 이루어지고, 한편, 대안의 실시형태에서는 디-, 트리-, 및/또는 올리고펩타이드는 개별적으로 2개 이상의 특정 아미노산들로 이루어진다. 소정 실시형태에서, 아미노산의 양을 세포 배양물에 보충하여 아르기닌에 대해 약 0 내지 약 9g/L, 리신에 대해 약 0 내지 약 11g/L, 히스티딘에 대해 약 0 내지 약 11g/L, 및 오르니틴에 대해 약 0 내지 약 11g/L의 농도를 달성하였다. 아르기닌에 대해 약 0 내지 약 30g/L, 리신에 대해 약 0 내지 약 30g/L, 히스티딘에 대해 약 0 내지 약 30g/L, 및 오르니틴에 대해 약 0 내지 약 30g/L를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 보다 넓은 범위도 본 발명의 범위 내이다.
이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 하기 실시예 1에 설명되는 바와 같이, 실시예에서 사용되는 생산 배지에 아르기닌이 보충되어 9g/L 아르기닌의 총 농도가 달성된 경우, 정제 후 세포 배양 샘플 중에 존재하는 아달리무마브의 산성 종의 총량은, 대조군 샘플의 19.7%로부터 아르기닌 보충된 배지로 배양된 세포로부터 정제된 샘플의 12.2%로 감소되었다. 유사하게, 실시예에서 사용되는 생산 배지에 리신, 또는 히스티딘, 또는 오르니틴이 보충되어 각각 11g/L 리신, 10g/L 오르니틴 또는 10g/L 히스티딘의 총 농도를 달성하였고, 정제 후의 세포 배양 샘플 중에 존재하는 아달리무마브의 산성 종의 총량은 대조군 샘플과 비교하여 각각 11.5%, 10.4% 및 10.9%만큼 감소되었다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지는, 예를 들면, 배양의 출발시에, 또는 유가식(fed-batch)에서, 또는 연속 방식에서 보충된다. 공급량은, 오프라인 또는 온라인 측정에 기초하여 소정 농도가 달성되도록 계산될 수 있다. 보충물은 다량체, 예를 들면, arg-arg, his-his, arg-his-orn 등, 및/또는 예를 들면, 아미노산 또는 아미노산의 유사체의 화학적 변이체, 아미노산의 염 형태, 겔 등으로 고정화시킴으로써 방출 제어된 아미노산, 및/또는 완전 또는 일부 용해된 형태로서 첨가될 수 있다. 하나 이상의 보충물의 첨가는 산성 종의 측정량에 기초할 수 있다. 얻어진 배지는, 회분식(batch), 유가식, 케모스태트(chemostat) 및 관류를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 배양 방법에서, 그리고, 적합한 교반의 존재 또는 부재 하의 진탕 플라스크, 스피너 플라스크, 스터링된 생물 반응기, 에어리프트 생물 반응기, 막 생물 반응기, 고체 지지체 상에 유지되거나 미세공 비드에서와 같이 고정화/포획된 세포를 이용한 반응기, 및 원하는 세포주의 최적 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 세포 배양 장비와 함께 사용할 수 있다.
산성 종(AR)을 조절하기 위한 CaCl 2 및/또는 니아신아미드 농도의 조정
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충하여 약 0.05 내지 2.5mM, 또는 약 0.05 내지 1mM, 또는 약 0.1 내지 0.8mM, 또는 약 0.15 내지 0.7mM, 또는 약 0.2 내지 0.6mM, 또는 약 0.25 내지 0.5mM, 또는 약 0.3 내지 0.4mM의 칼슘 농도를 달성한다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 단백질 또는 항체 조성물 중의 산성 종의 양을 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들만큼 감소시키기에 효과적인 양으로 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충한다.
이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 하기 실시예 1에 설명되는 바와 같이, 실시예에서 사용되는 생산 배지에 1.05mM의 농도로 칼슘(예를 들면, 염화 칼슘 2수화물)을 보충한 경우, 정제 후 세포 배양 샘플 중에 존재하는 아달리무마브의 산성 종의 총량은, 대조군 샘플의 23.2%로부터 칼슘 보충된 배지로 배양된 세포로부터 정제된 샘플의 16.5%로 감소되었다.
소정 실시형태에서, 세포 배양물에는 상기 기술되어 있는 바와 같이, 칼슘, 예를 들면, CaCl2과 하나 이상의 염기성 아미노산의 조합물을 보충할 수 있다. 소정 실시형태에서, 세포 배양물 중의 칼슘과의 조합물 중의 염기성 아미노산 농도의 양은 아르기닌에 대해 약 0 내지 약 9g/L, 리신에 대해 약 0 내지 약 11g/L, 히스티딘에 대해 약 0 내지 11g/L, 및 오르니틴에 대해 약 0 내지 약 11g/L이다. 약 0 내지 약 30g/L의 아르기닌, 약 0 내지 30g/L의 리신, 약 0 내지 약 30g/L의 히스티딘, 및 약 0 내지 약 30g/L의 오르니틴을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 보다 넓은 범위도 본 발명의 범위 내이다.
소정 실시형태에서, 세포 배양 배지에는 니아신아미드를 보충하여 약 0.2 내지 3.0mM, 또는 약 0.4 내지 3.0mM, 또는 약 0.8 내지 3.0mM의 니아신아미드 농도를 달성한다.
몇몇의 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 단백질 또는 항체 샘플 중의 산성 종의 이질성(heterogeneity)을 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들만큼 감소시키기에 효과적인 양으로 니아신 아미드를 보충한다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 니아신아미드를 보충한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지에는, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기에 효과적인 양으로 니아신아미드를 보충한다.
이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 하기 실시예 1에 설명되는 바와 같이, 실시예에서 사용되는 생산 배지에 1.6mM의 농도로 니아신아미드를 보충한 경우, 정제 후 세포 배양 샘플 중에 존재하는 아달리무마브의 산성 종의 총량은, 대조군 샘플의 19.9%로부터 니아신아미드 보충된 배지로 배양된 세포로부터 정제된 샘플의 15.9%로 감소되었다. 별도의 예에서, 배지에 3mM의 니아신아미드를 보충한 경우, 정제 후 세포 배양 샘플 중에 존재하는 아달리무마브의 산성 종의 총량은, 대조군 샘플의 27.0%로부터 니아신아미드 보충된 배지로 배양된 세포로부터 정제된 샘플의 19.8%로 감소되었다.
소정 실시형태에서, 세포 배양물에는 니아신아미드, 칼슘, 예를 들면, CaCl2, 및/또는 하나 이상의 염기성 아미노산의 조합물을 보충할 수 있다. 소정 실시형태에서, 세포 배양물 중의 칼슘과의 조합물 중의 염기성 아미노산 농도의 양(보충 후)은 아르기닌에 대해 약 0 내지 약 9g/L, 리신에 대해 약 0 내지 약 11g/L, 히스티딘에 대해 약 0 내지 11g/L, 및 오르니틴에 대해 약 0 내지 약 11g/L이다. 약 0 내지 약 30g/L의 아르기닌, 약 0 내지 30g/L의 리신, 약 0 내지 약 30g/L의 히스티딘, 및 약 0 내지 약 30g/L의 오르니틴을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 보다 넓은 범위도 본 발명의 범위 내이다.
소정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산, 칼슘, 및/또는 니아신아미드는 배양의 출발시에 배지에 포함될 수 있거나, 유가식에서, 또는 연속 방식에서 첨가될 수 있다. 공급량은, 오프라인 또는 온라인 측정에 기초하여 소정 농도가 달성되도록 계산될 수 있다. 보충물의 첨가는 산성 종의 측정량에 기초할 수 있다. 특정 보충물의 다른 염들, 예를 들면, 칼슘, 예를 들면, 질산 칼슘도 사용할 수 있다. 얻어진 배지는, 회분식, 유가식, 케모스태트 및 관류를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 배양 방법에서, 그리고, 적합한 교반의 존재 또는 부재 하의 진탕 플라스크, 스피너 플라스크, 스터링된 생물 반응기, 에어리프트 생물 반응기, 막 생물 반응기, 고체 지지체 상에 유지되거나 미세공 비드에서와 같이 고정화/포획된 세포를 이용한 반응기, 및 원하는 세포주의 최적 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 세포 배양 장비와 함께 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은, 정화된 수거물을 보충함으로써 제조된다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 이러한 정화된 수거물을 상기 기술한 바와 같이(예를 들면, 칼슘, 니아신아미드, 및/또는 염기성 아미노산 또는 이들의 조합물과 함께) 보충하여 AR 형성을 감소시킬 수 있다(실시예 3 참조).
산성 종(AR)을 조절하기 위한 프로세스 매개변수의 조정
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은 용존 산소(DO) 농도 및/또는 세포 배양 실행의 pH의 조정에 의해 제조된다. 소정 실시형태에서, 이러한 조정은, 세포 배양물의 DO 농도를 증가시키거나 세포 배양물의 pH를 감소시킴을 포함한다. DO 농도의 이러한 증가 또는 pH의 감소는 본래 양의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들의 규모로 이루어질 수 있다.
소정 실시형태에서, 세포 배양은, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 또는 약 15% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 50%, 또는 약 80%, 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들로 유지된 DO 농도에서 실행하여 산성 종의 바람직한 감소를 달성한다.
소정 실시형태에서, pH는, 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성종이 형성되는 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 감소시키나 증가시킨다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 약 7.1의 대조군 pH로부터 약 약 6.7로의 pH 감소를 사용하여 세포 배양 동안의 산성 종 및 정화된 수거물과 관련된 산성 종의 형성 속도를 감소시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, DO 농도, 및/또는 pH는, 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방식으로 유지된다.
다른 실시형태에서, DO 농도 및/또는 pH는, 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방식으로 유지된다.
또 다른 실시형태에서, DO 농도, 및/또는 pH는, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방식으로 유지된다.
소정 실시형태에서, pH 및/또는 DO는, 단백질 또는 항체 샘플 중의 산성 종의 양을 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들만큼 감소시키기 위한 방식으로 유지된다.
이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 하기 실시예 2에 설명되는 바와 같이, 세포 배양 동안 5개의 상이한 pH 조건: 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 및 6.7이 평가된 경우, 산성 종 백분율은 pH 7.1 조건에서의 2.97%로부터 pH 6.7 조건에서의 21.5%로의 pH의 감소로, 총 8.2% 감소로 감소되었다.
또한, 하기 실시예 2에 설명되는 바와 같이(이에 제한되는 것은 아님), 35℃에서의 세포 배양 동안 3개의 상이한 DO 농도: 20% DO 농도, 30% DO 농도 및 50% DO 농도가 평가되었다. 산성 종의 백분율은 전체적으로 더 높은 DO 농도에서 더 낮았다. 특히, 산성 종의 백분율은 20% DO 농도 샘플에서의 23.9%로부터 50% DO 농도 샘플에서의 20.3%로의 DO 농도의 증가로, 총 3.6% 감소로 감소되었다.
소정 실시형태에서, 세포 배양에 의해 제조되는 저 AR 조성물은, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 목적하는 단백질을 발현하는 세포 배양물의 DO 농도 및/또는 pH를, 적합한 온도 또는 온도 전이(temperature shift) 전략, 이들에 제한되지 않지만, 예를 들면, 보다 낮은 프로세스 작동 온도, 보다 낮은 온도로의 온도 전이, 또는 초기 배양 시점에서의 온도 전이의 선택에 따라 유지함으로써 발휘될 수 있다. 이들 배양 조건은, 회분식, 유가식, 케모스태트 및 관류를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 배양 방법에서, 그리고, 적합한 교반의 존재 또는 부재 하의 진탕 플라스크, 스피너 플라스크, 스터링된 생물 반응기, 에어리프트 생물 반응기, 막 생물 반응기, 고체 지지체 상에 유지되거나 미세공 비드에서와 같이 고정화/포획된 세포를 이용한 반응기, 및 원하는 세포주의 최적 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 각종 세포 배양 장비와 함께 사용할 수 있다. 또한, pH 및/또는 DO 및/또는 온도를 조절하는 이들 방법은, 표적 수준의 AR을 유지하거나 달성하기 위해, 또는 세포 배양 동안 AR의 형성을 감소시키기 위해 상기 기술되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 아미노산, 니아신아미드, 및/또는 칼슘, 또는 이들의 조합과 같은 첨가제로의 배양 배지의 보충과 병용할 수 있다.
산성 종(AR)을 조절하기 위한 연속/관류 세포 배양 기술
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은 세포 배양 방법의 선택에 의해 제조된다. 소정 실시형태에서, 연속 또는 관류 기술의 사용은, 조합물 중의 산성 종의 바람직한 저감을 달성하기 위해 이용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이는, 배지 교환 속도(여기서, 교환 속도는 반응기의 배지 투입/배출(in/out)의 교환 속도이다)의 조절에 의해 얻어질 수 있다.
소정의 비-제한적 실시형태에서, 약 0 내지 약 20, 또는 약 0.5 내지 약 12 또는 약 1 내지 약 8 또는 약 1.5 내지 약 6의 세포 배양 실행의 배지 교환 속도(작업 체적(working volume)/일)의 유지는, 산성 종의 바람직한 감소를 달성하기 위해 사용할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 하기 실시예 4에 설명되는 바와 같이, 배지 교환 속도가 1.5인 것으로 선택된 경우, 산성 종은 8.1%였다. 6으로의 교환 속도의 추가의 증가로, 6%로의 산성 종의 추가의 감소가 얻어졌다.
소정 실시형태에서, 연속 또는 관류 기술(예를 들면, 교환 속도의 조절)은, 약 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 초래할 수 있다.
다른 실시형태에서, 연속 또는 관류 기술(예를 들면, 교환 속도의 조절)은, 약 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 초래할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 연속 또는 관류 기술(예를 들면, 교환 속도의 조절)은, 약 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 초래할 수 있다.
소정 실시형태에서, 연속 또는 관류 기술(예를 들면, 교환 속도의 조절)은, 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함하는 저 AR 조성물을 초래할 수 있다.
한 실시형태에서, 예를 들면, 상기 기술되어 있는 바와 같은 하나 이상의 아미노산, 칼슘 및/또는 니아신아미드, 또는 이들의 조합과 같은 첨가제를 함유하는 배지를 관류 배지로서 사용하여, AR의 표적 수준을 유지하거나 달성하거나, 세포 배양 동안 AR의 형성을 감소시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은, 예를 들면, 간헐적 수거 전략의 사용에 의해, 또는 세포 유지 장치 기술의 사용을 통해 제조된다.
IV. 다운스트림 프로세스 기술을 이용한 저 AR 조성물의 제조
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 단백질의 세포 배양에 따른 다운스트림 프로세스 기술(예를 들면, 정제)을 이용하여 제조할 수 있다. 다운스트림 프로세스 기술은 단독으로 사용하거나 상기 섹션 III 및 실시예 10에 기술되어 있는 업스트림 프로세스 기술과 병용할 수 있다.
저 AR 및/또는 저 프로세스-관련 불순물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 본원에 기술되어 있는 방법은, 예를 들면, 다중 모드(multimodal)(MM) 배지가 이온 교환 및 소수성 상호작용 기능성 그룹, 및 수성 염 용액 둘 다를 포함하는 다중 모드(MM) 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의한 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 정제를 포함한다. 한 실시형태에서, 동일한 또는 실질적으로 동일한 수성 염 용액을 부하 완충액 및 세척 완충액으로서 사용한다.
추가의 실시형태에서, 저 AR 및/또는 저 프로세스-관련 불순물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 본원에 기술되어 있는 방법은, 음이온 교환(AEX) 수지 및 수성 염 용액을 포함하는 크로마토그래피에 의한 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 정제를 포함한다. 한 실시형태에서, 동일한 또는 실질적으로 동일한 수성 염 용액을 부하 완충액 및 세척 완충액으로서 사용한다.
또한 추가의 실시형태에서, 저 AR 및/또는 저 프로세스-관련 불순물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 본원에 기술되어 있는 방법은, 양이온 교환(CEX) 흡착 수지 및 수성 염 용액을 포함하는 크로마토그래피에 의한 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 정제를 포함한다. 한 실시형태에서, 동일한 또는 실질적으로 동일한 수성 염 용액을 부하 완충액 및 세척 완충액으로서 사용하고, CEX 흡착 수지에 결합된 표적 단백질은, 부하/세척 완충액보다 높은 전도율 및/또는 pH를 갖는 완충액으로 용출된다.
또한 추가의 실시형태에서, 저 AR 및/또는 저 프로세스-관련 불순물을 포함하는 조성물의 제조를 위한 본원에 기술되어 있는 방법은, 예를 들면, 음이온 교환(AEX) 수지를 이용함으로써 몇몇의 배지의 조합, 및 적합한 완충액, 예를 들면, Tris/포르메이트 완충액 시스템 중의 양이온 교환(CEX) 흡착 수지를 이용한 크로마토그래피에 의한 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합부의 정제를 포함한다. 한 실시형태에서, 샘플은 이온 크로마토그래피 수지 전의 정제된 친화성 크로마토그래피 배지, 예를 들면, 단백질 A이다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 저 AR을 포함하는 조성물의 제조를 위한 본원에 기술되어 있는 방법은, 도 190에 반영된 예시 프로세스를 포함한다.
한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 제1 샘플을 부하 완충액(예를 들면, 저 농도의 Tris/포르메이트 완충액) 중의 친화성 크로마토그래피 배지에 접촉시키고, 친화성 크로마토그래피 배지로부터 상기 샘플을 제1 용출 샘플로서 용출시키고, 상기 제1 용출 샘플을 부하 완충액 중의 제1 크로마토그래피 배지, 예를 들면, AEX 크로마토그래피 수지에 접촉시키고, 상기 AEX 크로마토그래피 수지로부터 상기 샘플을 제2 용출 샘플로서 용출시킴을 포함한다. 이어서, 제2 용출 샘플을 부하 완충액 중의 제2 크로마토그래피 배지, 예를 들면, CEX 크로마토그래피 수지와 접촉시키고, 상기 샘플을 CEX 크로마토그래피 수지로부터 제3 용출 샘플로서 용출시킨다. 한 실시형태에서, CEX 크로마토그래피 수지는 1회, 2회, 3회, 또는 그 이상 용출시킨다. 한 실시형태에서, 프로세스는 임의로 하나 이상의 중간 여과 단계, pH 조절 단계 및 불활성화 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 다운스트림 프로세스 기술은, 단독으로 또는 다른 다운스트림 프로세스 기술과, 또는 하나 이상의 업스트림 프로세스 기술과 병용하여, 15% 이하의 AR, 14% 이하의 AR, 13% 이하의 AR, 12% 이하의 AR, 11% 이하의 AR, 10% 이하의 AR, 9% 이하의 AR, 8% 이하의 AR, 7% 이하의 AR, 6% 이하의 AR, 5% 이하의 AR, 4.5% 이하의 AR, 4% 이하의 AR, 3.5% 이하의 AR, 3% 이하의 AR, 2.5% 이하의 AR, 2% 이하의 AR, 1.9% 이하의 AR, 1.8% 이하의 AR, 1.7% 이하의 AR, 1.6% 이하의 AR, 1.5% 이하의 AR, 1.4% 이하의 AR, 1.3% 이하의 AR, 1.2% 이하의 AR, 1.1% 이하의 AR, 1% 이하의 AR, 0.9% 이하의 AR, 0.8% 이하의 AR, 0.7% 이하의 AR, 0.6% 이하의 AR, 0.5% 이하의 AR, 0.4% 이하의 AR, 0.3% 이하의 AR, 0.2% 이하의 AR, 0.1% 이하의 AR, 또는 0.0%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 함유하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제조한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR, 약 3% 내지 약 5%의 AR, 약 5% 내지 약 8%의 AR, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 다운스트림 프로세스 기술은, 단독으로 또는 다른 다운스트림 프로세스 기술과, 또는 하나 이상의 업스트림 프로세스 기술과 병용하여, 15% 이하의 AR1, 14% 이하의 AR1, 13% 이하의 AR1, 12% 이하의 AR1, 11% 이하의 AR1, 10% 이하의 AR1, 9% 이하의 AR1, 8% 이하의 AR1, 7% 이하의 AR1, 6% 이하의 AR1, 5% 이하의 AR1, 4.5% 이하의 AR1, 4% 이하의 AR1, 3.5% 이하의 AR1, 3% 이하의 AR1, 2.5% 이하의 AR1, 2% 이하의 AR1, 1.9% 이하의 AR1, 1.8% 이하의 AR1, 1.7% 이하의 AR1, 1.6% 이하의 AR1, 1.5% 이하의 AR1, 1.4% 이하의 AR1, 1.3% 이하의 AR1, 1.2% 이하의 AR1, 1.1% 이하의 AR1, 1% 이하의 AR1, 0.9% 이하의 AR1, 0.8% 이하의 AR1, 0.7% 이하의 AR1, 0.6% 이하의 AR1, 0.5% 이하의 AR1, 0.4% 이하의 AR1, 0.3% 이하의 AR1, 0.2% 이하의 AR1, 0.1% 이하의 AR1, 또는 0.0%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 함유하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제조한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은 약 0.0% 내지 약 10%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR1, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR1, 약 3% 내지 약 5%의 AR1, 약 5% 내지 약 8%의 AR1, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR1, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR1, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 다운스트림 프로세스 기술은, 단독으로 또는 다른 다운스트림 프로세스 기술과, 또는 하나 이상의 업스트림 프로세스 기술과 병용하여, 15% 이하의 AR2, 14% 이하의 AR2, 13% 이하의 AR2, 12% 이하의 AR2, 11% 이하의 AR2, 10% 이하의 AR2, 9% 이하의 AR2, 8% 이하의 AR2, 7% 이하의 AR2, 6% 이하의 AR2, 5% 이하의 AR2, 4.5% 이하의 AR2, 4% 이하의 AR2, 3.5% 이하의 AR2, 3% 이하의 AR2, 2.5% 이하의 AR2, 2% 이하의 AR2, 1.9% 이하의 AR2, 1.8% 이하의 AR2, 1.7% 이하의 AR2, 1.6% 이하의 AR2, 1.5% 이하의 AR2, 1.4% 이하의 AR2, 1.3% 이하의 AR2, 1.2% 이하의 AR2, 1.1% 이하의 AR2, 1% 이하의 AR2, 0.9% 이하의 AR2, 0.8% 이하의 AR2, 0.7% 이하의 AR2, 0.6% 이하의 AR2, 0.5% 이하의 AR2, 0.4% 이하의 AR2, 0.3% 이하의 AR2, 0.2% 이하의 AR2, 0.1% 이하의 AR2, 또는 0.0%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 함유하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 제조한다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 약 0.0 내지 약 10%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 5%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 4%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 3%의 AR2, 약 0.0% 내지 약 2%의 AR2, 약 3% 내지 약 5%의 AR2, 약 5% 내지 약 8%의 AR2, 또는 약 8% 내지 약 10%의 AR2, 또는 약 10% 내지 약 15%의 AR2, 및 상기 중 하나 이상의 이내인 범위들을 포함한다.
일반적 단백질 정제
목적하는 단백질의 업스트림 프로세싱에 따르면, 다운스트림 프로세스 기술을 이용하여 단백질을 정제할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 일단 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 정화된 용액 또는 혼합물이 얻어졌으면, 산성 종으로부터의 목적하는 단백질의 분리는, 친화성 분리 단계, 이온 교환 분리 단계, 혼합 방식 분리 단계, 및 소수성 상호작용 분리 단계를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 상이한 정제 기술의 조합을 단독으로 또는 조합으로 이용하여 유효화할 수 있다. 분리 단계는, 크로마토그래피 분리를 포함하는 특정 형태의 분리에 따라, 이들의 전하, 소수성 정도, 또는 크기, 또는 이들의 조합에 기초하여 단백질의 혼합물을 분리한다. 본 발명의 한 양상에서, 분리는, 양이온, 음이온 및 소수성 상호작용을 포함하는 크로마토그래피를 이용하여 수행한다. 몇몇의 상이한 크로마토그래피 수지들은, 포함된 특정 단백질에 대한 정제 스킴(scheme)의 정확한 테일러링(tailoring)을 가능하게 하는 이들 기술의 각각에 대해 이용할 수 있다. 각각의 분리 방법은, 단백질이 컬럼을 통해 상이한 속도로 횡단하도록 하여, 이들이 추가로 컬럼을 통과하거나 분리 배지에 선택적으로 부착함에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다. 이어서, 단백질은 상이한 용출 완충액에 의해 구별하여 용출된다. 몇몇의 경우, 항체는, 불순물이 컬럼에 우선적으로 부착되고 항체가 덜 부착되는 경우에, 불순물로부터 분리되고, 즉, 원하는 항체 변이체가 통과액(Flow Through) 중에 존재한다.
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물을, 크로마토그래피 분리를 이용하여 제조하여, 원하는 분획화, 예를 들면, 목적하는 단백질 및 하나 이상의 프로세스-관련 불순물을 포함하는 샘플의 산성 종 및 리신 변이체의 분획화 프로파일을 유발하기에 충분한 특정 조건들, 예를 들면, 염 농도, pH, DO 농도, 온도, 부하량 및 조건, 및 세척 조건을 동정한다. 소정 실시형태에서, 상기 방법은, 원하는 저 AR 조성물을 포함하는 얻어진 분획들을 풀링함을 추가로 포함한다.
정제 프로세스는, 상기 기술된 업스트림 제조 방법을 이용하여 그리고/또는 당해 분야의 종래 대안의 제조 방법에 의해 항체를 제조한 후에 분리 단계에서 시작할 수 있다. 일단 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체를 포함하는 정화된 용액 또는 혼합물이 수득되면, 프로세스-관련 불순물로부터의 목적하는 단백질의 분리, 예를 들면, 세포에 의해 생산된 다른 단백질, 및 생산물-관련 물질, 예를 들면, 산성 또는 염기성 변이체의 분리가 수행된다. 소정 비-제한적 실시형태에서, 이러한 분리는, CEX, AEX, 및/또는 MM 크로마토그래피를 이용하여 수행한다. 소정 실시형태에서, 친화성 분리 단계(들), 이온 교환 분리 단계(들), 혼합-방식 단계(들), 및/또는 소수성 상호작용 분리 단계(들)를 포함하는 하나 이상의 상이한 정제 기술들의 조합도 사용할 수 있다. 이러한 추가의 정제 단계들은, 단백질들의 전하, 소수성 정도, 및/또는 크기에 기초하여 단백질의 혼합물을 분리한다. 본 발명의 한 양상에서, 이러한 추가의 분리 단계들은, 소수성, 음이온 또는 양이온 상호작용(또는 이들의 조합)을 포함하는 크로마토그래피를 이용하여 수행한다. 다수의 크로마토그래피 수지들은, 포함된 특정 단백질에 대한 정제 스킴의 정확한 테일러링을 가능하게 하는 이들 기술의 각각에 대해 이용할 수 있다. 각각의 분리 방법은, 단백질이 컬럼을 통해 상이한 속도로 횡단하도록 하여, 이들이 추가로 컬럼을 통과하거나 분리 배지(또는 배지)에 선택적으로 부착함에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다. 이어서, 단백질은 상이한 용출 용출액에 의해 구별하여 용출된다. 몇몇의 경우, 목적하는 단백질은, 불순물이 컬럼의 수지에 특이적으로 부착하고 목적하는 단백질이 특이적으로 특이적으로 부착하지 않는 경우에, 불순물로부터 분리되고, 즉, 목적하는 단백질이 유출액(effluent) 중에 함유되고, 한편, 다른 경우, 목적하는 단백질은 컬럼의 수지에 부착할 것이고, 반면, 불순물 및/또는 생산물-관련 물질은, 세척 사이클 동안 컬럼의 수지로부터 추출된다.
최초 회수 및 바이러스 불활성화
소정 실시형태에서, 본 발명의 정제 방법의 초기 단계는 정화 및 샘플 매트릭스로부터의 항체의 최초 회수를 포함한다. 소정 실시형태에서, 최초 회수는, 세포 및 세포 잔해로부터 항체 생산물을 분리하기 위한 하나 이상의 원심분리 단계를 포함할 것이다. 샘플의 원심분리는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 7,000xg 내지 대략 12,750xg로 수행할 수 있다. 대규모 정제와 관련하여, 이러한 원심분리는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 얻어진 상청에서 150NTU의 탁도 수준을 달성하도록 설정된 유속으로 온-라인으로 발생할 수 있다. 이어서, 이러한 상청은 추가의 정제를 위해 수집하거나 샘플의 추가의 정화를 위해 하나 이상의 심층 필터들을 통해 인-라인 여과할 수 있다.
소정 실시형태에서, 최초 회수는, 샘플 매트릭스를 정화하기 위한 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함함으로써, 본 발명의 목적하는 항체의 정제를 보조할 것이다. 다른 실시형태에서, 최초 회수는, 샘플 매트릭스를 추가로 정화하기 위한 원심분리 후의 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 것이다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 심층 필터의 비-제한적 예로는 Millistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, B1HC 심층 필터(EMD Millipore), Cuno™ 모델 30/60ZA, 60/90 ZA, VR05, VR07, 탈지(delipid) 심층 필터(3M Corp.)가 포함된다. 0.2㎛ 필터, 예를 들면, Sartorius의 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이층(bi-layer) 또는 Millipore의 Express SHR 또는 SHC 필터 카트리지는 전형적인 심층 필터이다.
소정 실시형태에서, 최초 회수 프로세스는, 또한, 샘플 매트릭스 중에 존재할 수 있는 바이러스를 감소시키거나 불활성화시키기 위한 시점일 수 있다. 예를 들면, 바이러스 감소/불활성화의 각종 방법 중 임의의 하나 이상은, 가열 불활성화(저온 살균(pasteurization)), pH 불활성화, 완충액/세제 처리, UV 및 γ-선 조사 및 프로피오락톤과 같은 소정의 화학적 불활성화 제제, 예를 들면, U.S. Pat. 제4,534,972호에 기술되어 있는 바와 같은 구리 페난트롤린의 첨가를 포함하는 정제의 최초 회수 페이즈(phase) 동안 사용될 수 있다. 본 발명의 소정 실시형태에서, 샘플 매트릭스는 최초 회수 페이즈 동안에 세제 바이러스 불활성화에 노출된다. 다른 실시형태에서, 샘플 매트릭스는 최초 회수 페이즈 동안에 저 pH 불활성화에 노출된다.
바이러스 감소/불활성화가 사용된 이들 실시형태에서, 샘플 혼합물은, 필요레 따라, 추가의 정제 단계를 위해 조정될 수 있다. 예를 들면, 저 pH 바이러스 불활성화에 따르면, 샘플 혼합물의 pH는, 전형적으로, 정제 프로세스를 계속하기 전에 보다 중성의 pH, 예를 들면, 약 4.5 내지 약 8.5로 조정된다. 추가로, 원하는 전도도를 얻기 위해 상기 혼합물을 주사용수(WFI)로 희석시킨다.
정화된 수거물에 대한 첨가물
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 함유하는 정화된 수거물을 보충함으로써 제조된다. 정화된 수거물은, 큰 고체 입자를 제거하기 위한 원심분리, 및 보다 미세한 고체 입자 및 재료로부터 불순물을 제거하기 위한 후속적 여과를 행한 후 세포 배양물, 예를 들면, 발효 생물 반응기로부터 추출될 수 있다. 이러한 정화된 수거물에는 상기 기술된 바와 같이 (예를 들면, 칼슘, 니아신아미드 및/또는 염기성 아미노산, 또는 이들의 조합물을) 보충할 수 있거나, 조절, 예를 들면, AR 형성을 감소시키기 위해 pH를 저하시킬 수 있다(실시예 3 참조).
친화성 크로마토그래피
소정 실시형태에서, 본 발명의 기술에 의해 제조된 샘플을 친화성 크로마토그래피하여 산성 종으로부터 목적하는 단백질을 추가로 정제하는 것이 이로울 것이다. 소정 실시형태에서, 크로마토그래피 재료는 목적하는 ("포획") 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 재료의 비-제한적 예로는 단백질 A, 단백질 G, 예를 들면, 목적하는 항체에 의해 결합된 항원을 포함하는 크로마토그래피 재료, 및 Fc 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 재료가 포함된다. 특정 실시형태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는, 적합한 단백질 A 수지를 포함하는 컬럼에 최초 회수 샘플을 통과시킴을 포함한다. 소정 실시형태에서, 단백질 A 수지는 친화성 정제 및 각종 항체 이소타입, 특히, IgG1, IgG2, 및 IgG4의 단리에 유용하다. 단백질 A는, 이들의 Fc 영역을 통해 처음으로 포유동물 IgG에 결합하는 세균 세포벽 단백질이다. 이의 본래 상태에서, 단백질 A는 5개의 IgG 결합 도메인들 및 미지의 기능의 다른 도메인들을 갖는다.
단백질 A 수지에 대한 몇몇의 시판 공급원이 존재한다. 하나의 적합한 수지는 GE Healthcare로부터의 MabSelect™이다. 적합한 수지로는 GE Healthcare로부터의 MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose, EMD Millipore로부터의 ProSep HC, ProSep Ultra, 및 ProSep Ultra Plus, Life Technologies로부터의 MapCapture가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. MabSelect™로 팩킹된 적합한 컬럼의 비-제한적 예는 약 1.0cm 직경 x 약 21.6cm 길이 컬럼(약 17mL 베드(bed) 체적)이다. 이러한 크기의 컬럼은 소규모 정제에 이용할 수 있고, 규모 확대(scale up)를 위해 사용되는 다른 컬럼들과 비교할 수 있다. 예를 들면, 베드 체적이 약 6.6L인 20cm x 21cm 컬럼은 보다 큰 규모의 정제에 사용할 수 있다. 컬럼에 관계없이, 컬럼은 MabSelect™와 같은 적합한 수지를 이용하여 팩킹할 수 있다.
단백질 A 컬럼은 샘플 부하 전에 적합한 완충액으로 평형화될 수 있다. 컬럼의 부하 후, 적합한 세트의 완충액들을 이용하여 컬럼을 1회 또는 다수 회 세척할 수 있다. 이어서, 적절한 용출 완충액을 이용하여 단백질 A 컬럼을 용출할 수 있다. 예를 들면, 글리신-HCL 또는 시트르산을 용출 완충액으로서 사용할 수 있다. 용출물은, 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 모니터링할 수 있다. 목적하는 용출물 분획을 수집하고, 이어서, 추가의 프로세싱을 위해 준비할 수 있다.
단백질 A 용출물은 세제 또는 저 pH에 의해 바이러스 불활성화 단계를 행할 수 있고, 단, 이 단계는 단백질 A 포획 작업 전에 수행되지 않는다. 원하는 바이러스 불활성화 결과를 얻기 위해 적절한 세제 농도 또는 pH 및 시간을 선택할 수 있다. 바이러스 불활성화 후, 단백질 A 용출물은 후속적 정제 단계를 위해 일반적으로 pH 및/또는 전도도 조정된다.
단백질 A 용출물은 심층 필터를 통해 여과를 행하여 추가의 크로마토그래피 연마(polishing) 단계 전에 목적하는 항체로부터 탁도 및/또는 각종 불순물을 제거할 수 있다. 심층 필터의 예로는 Miilistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, 및 B1HC Pod 필터(EMD Millipore), 또는 Zeta Plus 30ZA/60ZA, 60ZA/90ZA, 탈지, VR07, 및 VR05 필터(3M)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 단백질 A 용출물 풀(pool)은, 심층 여과 단계로부터의 원하는 불순물 제거 및 생산물 회수를 수득하기 위해 적절한 pH 및 전도도로 조건조절될(conditioned) 필요가 있을 수 있다.
본 발명은, 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 목적하는 단백질의 포획에 한정되는 것은 아니다. 비-단백질 A 크로마토그래피 포획 단계도 행할 수 있다. 예를 들면, 양이온 교환 포획 및 비-크로마토그래피 방법, 예를 들면, 수성 2상 추출 또는 침전, 또는 당해 분야에 공지되어 있는 다른 방법들도 사용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피
소정 실시형태에서, 저 AR 조성물은, 최초 회수 샘플에 하나 이상의 음이온 교환 분리 단계를 행함으로써 제조된다. 소정 실시형태에서, 음이온 교환 단계는 상기-기술된 친화성 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 친화성 단계 후에 일어날 것이다.
음이온 교환 재료 대 하기에 상세하게 논의되는 양이온 교환 재료와 같은 양이온 교환 재료의 사용은, 주어진 용액 중의 목적하는 단백질의 국소 전하에 기초한다. 따라서, 양이온 교환 단계의 사용 전의 음이온 교환 단계, 또는 음이온 교환 단계 전의 양이온 교환 단계를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다. 또한, 음이온 교환 단계 단일, 양이온 교환 단계 단일, 또는 임의의 일련의 2개 단계의 조합(하나 또는 둘 다의 이온 교환 단계와 본원에 기술되는 다른 크로마토그래피 분리 기술과의 일련의 조합 포함)을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다.
분리의 수행시, 초기 단백질 조성물은, 각종 기술들 중 임의의 기술을 이용함으로써, 예를 들면, 배치(batch) 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 이용함으로써 음이온 교환 재료와 접촉될 수 있다.
예를 들면, 배치 정제와 관련하여, 음이온 교환 재료는, 원하는 출발 완충액 중에서 제조되거나 원하는 출발 완충액에 대해 평형화된다. 제조 또는 평형화시, 음이온 교환 재료의 슬러리(slurry)가 수득된다. 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체 용액은 상기 슬러리와 접촉되어 음이온 교환 재료에의 단백질 흡착이 가능해진다. AEX 재료에 결합하지 않는 산성 종을 포함하는 용액은, 예를 들면, 슬러리를 정치시켜(settle) 상청을 제거함으로써 슬러리로부터 분리된다. 슬러리에는 하나 이상의 세척 단계들 및/또는 용출 단계들을 행할 수 있다.
크로마토그래피 분리와 관련하여, 적절한 완충액 중에 제조된 크로마토그래피 지지 재료(예를 들면, AEX 재료)를 함유하기 위해 통상적으로 원통형인 크로마토그래피 기구를 사용한다. 원통형인 경우, 크로마토그래피 기구는 약 5mm 내지 약 2m의 직경, 및 5cm 내지 50cm의 높이를 가질 수 있고, 소정 실시형태에서, 특히, 대규모 프로세싱을 위해서는 30cm 이하의 높이를 사용한다. 일단 크로마토그래피 재료가 크로마토그래피 기구에 부가되면, 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체를 함유하는 샘플은 크로마토그래피 재료에 접촉되어 분리가 유도된다. 크로마토그래피 재료에 결합하지 않는, 예를 들면, 사용되는 AEX 재료에 따라 목적하는 단백질, 산성 종을 포함할 수 있는 용액의 임의의 부분은, 상기 재료를 세척하고 컬럼으로부터 분획을 수집함으로써 크로마토그래피 재료로부터 분리된다. 크로마토그래피 재료에는 하나 이상의 세척 단계들을 행할 수 있다. 이어서, 바람직한 경우, 크로마토그래피 재료는, 크로마토그래피 재료에 결합된 용액 중의 임의의 구성성분을 탈착(desorb)시키도록 고안된 용액과 접촉시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 세척 단계는, 부하 조건과 유사한 조건을 이용한 AEX 크로마토그래피와 관련하여, 또는 대안으로, 단계적(step wise) 또는 선형 농도구배 방식으로 세척액의 pH를 감소시키고/시키거나 이온 강도/전도도를 증가시킴으로써 수행할 수 있다. 얻어진 통과액 및 세척 분획을 분석할 수 있고, 하전된 변이체 종의 원하는 감소를 달성하기 위한 적절한 분획을 풀링할 수 있다. 소정 실시형태에서, 부하 완충액 및 세척 완충액 둘 다로서 사용된 수성 염 용액은, 목적하는 단백질의 등전점(pI)이거나 등전점 부근의 pH를 갖는다. 소정 실시형태에서, pH는 목적하는 단백질의 pI보다 약 0 내지 2유닛 높거나 낮다. 소정 실시형태에서, 이는 0 내지 0.5유닛 높거나 낮은 범위 내일 것이다. 소정 실시형태에서, 이는 항체의 pI일 것이다.
소정의 비-제한적 실시형태에서, 음이온성 제제는, 아세테이트, 포르메이트, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정의 비-제한적 실시형태에서, 양이온성 제제는, Tris, 아르기닌, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 완충액은 Tris/포르메이트 완충액이다. 다른 실시형태에서, 완충액은, 피리딘, 피페라진, L-히스티딘, Bis-tris, Bis-tris 프로판, 이미다졸, N-에틸모르폴린, TEA(트리에탄올아민), Tris, 모르폴린, N-메틸디에탄올아민, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), 디에탄올아민, 에탄올아민, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 피페라진, 1,3-디아미노프로판, 피페리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
팩킹된 음이온-교환 크로마토그래피 컬럼, 음이온-교환 막 장치, 음이온-교환 일체형(monolithic) 장치, 또는 심층 필터 배지는, 결합-용출(bind-elute) 방식, 통과(flow-through) 방식, 또는 생산물이 크로마토그래피 재료에 대한 결합을 나타내는 하이브리드 방식으로 작동할 수 있고, 또한, 부하 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 세척될 수 있다. 결합-용출 방식에서, 컬럼 또는 막 장치는, 우선 소정 단백질이 수지 기반 매트릭스 상에 고정화될 조건 하에 적절한 이온 강도 및 pH를 갖는 완충액으로 조건조절된다. 예를 들면, 소정 실시형태에서, 공급액 부하 동안, 목적하는 단백질은 정전기 인력으로 인하여 수지에 흡착될 것이다. 컬럼 또는 막 장치를 평형 완충액 또는 상이한 pH 및/또는 전도도를 갖는 다른 완충액으로 세척한 후, 음이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁하도록 용출 완충액의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시킴으로써 생산물 회수를 달성한다. pH를 변화시키고 이에 의해 용질의 전하를 변경시키는 것은, 용질의 용출을 달성하기 위한 다른 방법이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적이거나(농도구배 용출) 단계적일 수 있다(단계 용출). 통과 방식에서, 컬럼 또는 막 장치는, 목적하는 단백질이 수지 또는 막에 결합하지 않고, 한편, 산성 종은 컬럼 상에 유지되거나, 목적하는 단백질에 비하여 별개인 용출 프로파일을 갖도록, 선택된 pH 및 전도도에서 작동된다. 이러한 하이브리드 전략과 관련하여, 산성 종은, 목적하는 단백질과 별개의 방식으로 크로마토그래피 재료(또는 통과액)에 결합할 것이고, 예를 들면, 한편, 목적하는 단백질 및 목적하는 단백질의 소정 응집체 및/또는 단편은 크로마토그래피 재료에 결합할 수 있고, 목적하는 단백질을 우선적으로 제거하는 세척이 적용될 수 있다. 이어서, 컬럼은 다음 사용 전에 재생된다.
음이온 교환 치환체의 비-제한적 예로는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹이 포함된다. 추가의 비-제한적 예로는, 가교-링크된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본(backbone)을 갖는 단단한 중합체 비드인 Poros 50PI 및 Poros 50HQ; 고 유동(high flow) 아가로스 비드인 Capto Q Impres 및 Capto DEAE; 중합체 염기성 비드인 Toyopearl QAE-550, Toyopearl DEAE-650, 및 Toyopearl GigaCap Q-650; 촉수(tentacle) 이온 교환체를 갖는 합성 중합체 수지인 Fractogel® EMD TMAE Hicap; 1차 아민 리간드를 갖는 염-내성 크로마토그래피 막인 Sartobind® STIC nano; 강한 음이온 교환 크로마토그래피 막인 Sartobind Q nano; 무기 필터 보조제, 정제된 셀룰로스, 및 이온 교환 수지로부터 작제된 제타-플러스 심층 필터 배지인 CUNO BioCap; 및 무기 필터 보조제, 셀룰로스, 및 혼합 셀룰로스 에스테르로부터 작제된 심층-필터 배지인 XOHC가 포함된다. 상세한 정보는 표 1에 열거된다.
Figure pct00001
소정 실시형태에서, 목적하는 단백질을 포함하는 혼합물의 단백질 부하는, 컬럼에 대한 총 단백질 부하 약 50 내지 500g/L, 또는 약 75 내지 350g/L, 또는 약 200 내지 300g/L로 조정된다. 소정 실시형태에서, 부하 단백질 혼합물의 단백질 농도는 컬럼에 대한 재료의 단백질 농도 약 37g/L로 조정된다.
소정 실시형태에서, 첨가제, 예를 들면, 폴리 에틸렌 글리콜, 세제, 아미노산, 당, 카오트로픽(chaotropic) 제제를 첨가하여 분리의 성능을 향상시켜 보다 우수한 회수 또는 생산물 품질을 달성할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR을 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR을 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR을 갖거나 AR을 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브의 정제에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR1 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR1 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR1을 갖거나 AR1 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR2 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR2 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR2를 갖거나 AR2 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 용출 분획 중의 MGO 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 MGO 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 MGO를 갖거나 MGO 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다(예를 들면, 2013년 3월 12일에 출원된 U.S. 특허 출원 일련번호 제61/777,883호를 참조한다). 아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 용출 분획 중의 당화된 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 당화된 변이체(시프(Schiff) 염기 및 영구적으로 당화된 형태)를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 당화된 변이체가 감소되거나 당화된 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, AEX 크로마토그래피 단계의 부하, pH, 전도도, 및 용출 pH 전도도는, 생산물-관련 물질(AR 또는 리신 변이체)의 바람직한 분포를 달성하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 소정 실시형태는, 목적하는 단백질의 정제된 샘플의 리신 분포의 조정, 예를 들면, Lys 0의 증가 및 Lys 1 및 Lys 2의 감소에 관한 것이다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, Lys 0의 양이 감소되는 한편, Lys 1 및/또는 Lys 2의 양이 증가되는 샘플의 제조를 가능하게 한다.
소정 실시형태에서, AEX 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 추가로, 또는 전하 변이체 농도를 단지 조정하는 것 대신에, 분획들의 조합을 풀링하여 원하는 프로세스-관련 불순물 및/또는 생산물-관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
분광학 방법, 예를 들면, UV, NIR, FTIR, 형광성, 및 라만을 이용하여 AR 종의 수준을 온-라인, 앳-라인(at-line) 또는 인-라인 방식으로 모니터링할 수 있고, 이어서, 분광학 방법은, AEX 용출액으로부터 수집된 풀링된 재료 중의 전하 변이체, 예를 들면, 산성 종의 수준을 제어하는데 사용될 수 있다.
소정 실시형태에서, 당화, MGO 변형, 탈아미드화, 글리코실화와 같은 단백질의 화학적 변형으로부터 발생하는 특정 신호는, 얻어진 생산물의 생산물 품질의 실시간 또는 근(near) 실시간 제어를 가능하게 하는 이러한 인-라인, 온-라인 또는 앳-라인 방법을 통한 분광학적 방법에 의해 특이적으로 측정가능할 수 있다. 소정 실시형태에서, 온-라인, 앳-라인 또는 인-라인 모니터링 방법은, 원하는 생산물 품질/회수의 달성을 가능하게 하기 위해, 크로마토그래피 단계의 용출액 라인에 대해 또는 수집 용기에서 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, UV 신호는, 적절한 생산물 품질/회수를 달성하기 위한 대용물(surrogate)로서 사용할 수 있고, 여기서, UV 신호는, 통합(integration), 분화(differentiation), 이동 평균(moving average)으로서의 이러한 프로세싱 기술을 포함하지만 이들에 한정되지 않고 정상 프로세스 가변성이 해소될 수 있고 표적 생산물 품질이 달성될 수 있도록 적절하게 프로세싱될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 측정값을 인-라인 희석 방법과 조합하여, 부하/세척의 이온 농도/전도도가 피드백에 의해 제어될 수 있고, 따라서, 생산물 품질 제어도 가능해질 수 있다.
소정 실시형태에서, AEX 및 CEX의 조합 및 MM 방법은, 하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정 실시형태를 포함하는 생산물-관련 물질-조정된 재료를 제조하는데 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 하나의 기술에 의해 소정 아-종(sub-species)이 대부분 제거되어 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생산물 품질을 제공하도록 수행될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 원하는 AR, 생산물 품질, 이온 농도, 및/또는 바이러스 감소를 달성하도록 하는 추가의 개재(intervening) 크로마토그래피, 여과, pH 조정, 및/또는 UF/DF 단계의 사용을 포함한다.
하기에 그리고 실시예 11에 기술되는 바와 같이, AEX 크로마토그래피는 재순환(recycle) 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식과 함께 사용할 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 저 AR 조성물은, 조성물, 예를 들면, 최초 회수 샘플에 하나 이상의 양이온 교환 분리 단계를 행함으로써 제조할 수 있다. 소정 실시형태에서, CEX 단계는, 상기-기술된 친화성 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 친화성 단계 후에 발생할 것이다.
양이온 교환 재료 대 상기에 상세하게 논의된 음이온 교환 재료와 같은 음이온 교환 재료의 사용은, 주어진 용액 중의 목적하는 단백질의 국소 전하에 기초한다. 따라서, 음이온 교환 단계의 사용 전의 양이온 교환 단계, 또는 양이온 교환 단계 전의 음이온 교환 단계를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다. 또한, 양이온 교환 단계 단일, 음이온 교환 단계 단일, 또는 임의의 일련의 2개 단계의 조합(하나 또는 둘 다의 이온 교환 단계와 본원에 기술되는 다른 크로마토그래피 분리 기술과의 일련의 조합 포함)을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다.
분리의 수행시, 초기 단백질 혼합물은, 각종 기술들 중 임의의 기술을 이용함으로써, 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 단백질 A 또는 AEX와 관련하여 배치 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 이용함으로써 양이온 교환 재료와 접촉될 수 있다.
소정 실시형태에서, 부하 완충액 및 세척 완충액 둘 다로서 사용되는 수성 염 용액은, 목적하는 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 갖는다. 소정 실시형태에서, pH는 목적하는 단백질의 pI보다 약 0 내지 5유닛 낮다. 소정 실시형태에서, 이는 1 내지 2유닛 낮은 범위 내이다. 소정 실시형태에서, 이는 1 내지 1.5유닛 낮은 범위 내이다.
소정 실시형태에서, 수성 염 용액 중의 음이온성 제제의 농도는, 약 3.5 내지 10.5, 또는 약 4 내지 10, 또는 약 4.5 내지 9.5, 또는 약 5 내지 9, 또는 약 5.5 내지 8.5, 또는 약 6 내지 8, 또는 약 6.5 내지 7.5의 pH가 달성되도록 증가되거나 감소된다. 소정 실시형태에서, 수성 염 용액 중의 음이온성 제제의 농도는 5, 또는 5.5, 또는 6, 또는 6.5, 또는 6.8, 또는 7.5의 pH가 달성되도록 증가되거나 감소된다. CEX 방법에서 사용하기에 적합한 완충액 시스템으로는 트리스 포르메이트, 트리스 아세테이트, 황산 암모늄, 염화 나트륨, 및 황산 나트륨이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 수성 염 용액의 전도도 및 pH는, 양이온성 제제의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조정된다. 소정 실시형태에서, 양이온성 제제는 약 20mM 내지 500mM, 또는 약 50 내지 350mM, 또는 약 100 내지 300mM, 또는 약 100 내지 200mM 범위의 농도로 유지된다. 소정의 비-제한적 실시형태에서, 양이온성 제제는, 나트륨, Tris, 트로메탈민(tromethalmine), 암모늄, 아르기닌, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정의 비-제한적 실시형태에서, 음이온성 제제는, 포르메이트, 아세테이트, 시트레이트, 클로라이드 음이온, 설페이트, 포스페이트, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
팩킹된 양이온-교환 크로마토그래피 컬럼 또는 양이온-교환 막 장치는 결합-용출 방식, 통과 방식, 또는 생산물이 크로마토그래피 재료에 대한 결합을 나타내는 하이브리드 방식으로 작동할 수 있고, 또한, 부하 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 세척될 수 있다. 이들 방식의 상세설명은 상기에 요약되어 있다.
양이온 치환체로는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)가 포함된다. 추가의 양이온 재료로는, 고 유동 아가로스 비드인 Capto SP ImpRes; 기능성 하이드로겔 250 내지 400 이온성 그룹μeq/mL로 코팅 및 침투된 세라믹 비드인 CM Hyper D grade F; 50 내지 100μeq/mL 이온 용량(ionic capacity)을 갖는 친수성 폴리비닐 에테르 베이스 매트릭스인 Eshmuno S; 매크로 다공성(macroporous) 고 가교링크된 친수성 중합체 매트릭스 55 내지 75μeq/mL로 이루어진 소수성 양이온 교환 배지인 Nuvia C Prime; 90 내지 150μeq/mL 이온성 그룹을 갖는 UNOsphere 베이스 매트릭스를 갖는 Nuvia S; 가교-링크된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 단단한 중합체성 비드인 Poros HS; 가교-링크된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 단단한 중합체성 비드인 Poros XS; 0.225meq/mL의 이온 용량을 갖는 중합체 베이스 비드인 Toyo Pearl Giga Cap 650M; 중합체 베이스 비드인 Toyo Pearl Giga Cap S 650M; 중합체 베이스 비드인 Toyo Pearl MX TRP가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 언급된 재료들에 관한 상세한 정보는 표 2에 열거된다. CEX 크로마토그래피는, 본원에 기술되어 있는 MM 수지와 함께 사용할 수 있음에 주의한다.
Figure pct00002
소정 실시형태에서, 목적하는 단백질을 포함하는 혼합물의 단백질 부하는, 컬럼에 대한 총 단백질 부하 약 5 내지 150g/L, 또는 약 10 내지 100g/L, 약 20 내지 80g/L, 약 30 내지 50g/L, 또는 약 40 내지 50g/L로 조정된다. 소정 실시형태에서, 부하 단백질 혼합물의 단백질 농도는 컬럼에 부하된 재료의 단백질 농도 약 0.5 내지 50g/L, 또는 약 1 내지 20g/L로 조정된다.
소정 실시형태에서, 첨가제, 예를 들면, 폴리 에틸렌 글리콜, 세제, 아미노산, 당, 카오트로픽 제제를 첨가하여 분리의 성능을 향상시켜 보다 우수한 회수 또는 생산물 품질을 달성할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 용출 분획 중의 AR을 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR을 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR을 갖거나 AR을 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브의 정제에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR1 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR1 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR1을 갖거나 AR1 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR2 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR2 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR2를 갖거나 AR2 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 통과액 및 세척 분획 중의 MGO 변이체를 농축시키면서, 용출 분획 중의 MGO 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 MGO를 갖거나 MGO 변이체를 포함하지 않는 단백질 제제를 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 통과액 및 세척 분획 중의 당화된 변이체를 농축시키면서, 용출 분획 중의 당화된 변이체(시프 염기 및 영구적으로 당화된 형태)를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 당화된 변이체가 감소되거나 당화된 변이체를 포함하지 않는 단백질 제제를 제조하는데 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, CEX 크로마토그래피 단계의 부하, pH, 전도도, 및 용출 pH 전도도는, 산성 종의 바람직한 분포를 달성하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 소정 실시형태는, 목적하는 단백질의 정제된 샘플의 리신 분포의 조정, 예를 들면, Lys 0의 증가 및 Lys 1 및 Lys 2의 감소에 관한 것이다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, Lys 0의 양이 감소되는 한편, Lys 1 및/또는 Lys 2의 양이 증가되는 샘플의 제조를 가능하게 한다.
소정 실시형태에서, CEX 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 추가로, 또는 전하 변이체 농도를 단지 조정하는 것 대신에, 분획들의 조합을 풀링하여 원하는 프로세스-관련 불순물 및/또는 생산물-관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
소정 실시형태에서, 분광학 방법, 예를 들면, UV, NIR, FTIR, 형광성, 및 라만을 이용하여 생산물-관련 전하 변이체, 응집체, 저 분자량 변이체(예를 들면, 목적하는 단백질의 단편)의 수준을 온-라인, 앳-라인 또는 인-라인 방식으로 모니터링할 수 있고, 이어서, 분광학 방법은, CEX 용출액으로부터 수집된 풀링된 재료 중의 전하 변이체, 예를 들면, 산성 종의 수준을 제어하는데 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 당화, MGO 변형, 탈아미드화, 글리코실화와 같은 단백질의 화학적 변형으로부터 발생하는 특정 신호는, 얻어진 생산물의 생산물 품질의 실시간 또는 근 실시간 제어를 가능하게 하는 이러한 인-라인, 온-라인 또는 앳-라인 방법을 통한 분광학적 방법에 의해 특이적으로 측정가능할 수 있다. 소정 실시형태에서, 온-라인, 앳-라인 또는 인-라인 모니터링 방법은, 원하는 생산물 품질/회수의 달성을 가능하게 하기 위해, 크로마토그래피 단계의 용출액 라인에 대해 또는 수집 용기에서 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, UV 신호는, 적절한 생산물 품질/회수를 달성하기 위한 대용물로서 사용할 수 있고, 여기서, UV 신호는, 통합, 분화, 이동 평균으로서의 이러한 프로세싱 기술을 포함하지만 이들에 한정되지 않고 정상 프로세스 가변성이 해소될 수 있고 표적 생산물 품질이 달성될 수 있도록 적절하게 프로세싱될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 측정값을 인-라인 희석 방법과 조합하여, 부하/세척의 이온 농도/전도도가 피드백에 의해 제어될 수 있고, 따라서, 생산물 품질 제어도 가능해질 수 있다.
소정 실시형태에서, CEX 및 AEX의 조합 및/또는 MM 방법은, 하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정 실시형태를 포함하는 생산물-관련 물질-조정된 재료를 제조하는데 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 하나의 기술에 의해 소정 아-종이 대부분 제거되어 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생산물 품질을 제공하도록 수행될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 원하는 생산물 품질, AR, 이온 농도, 및/또는 바이러스 감소를 달성하도록 하는 추가의 크로마토그래피, 여과, pH 조정, UF/DF 단계의 사용을 포함한다.
하기에 그리고 실시예 11에 기술되는 바와 같이, CEX 크로마토그래피는 재순환 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식과 함께 사용할 수 있다.
혼합 방식 크로마토그래피
혼합 방식("MM") 크로마토그래피도 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 본원에 "다중 모드 크로마토그래피"로서도 나타내는 MM 크로마토그래피는, 결합되는 물질과 상호작용하는 2개 이상의 상이한 부위들, 그리고, 소정 실시형태에서는 공동-작동(co-operative) 부위를 제공할 수 있는 리간드를 포함하는 지지체를 이용하는 크로마토그래피 전략이다. 소정 실시형태에서, 이들 부위 중 하나는 리간드와 목적하는 물질 사이의 인력 유형의 전하-전하 상호작용을 제공하고, 다른 부위는 전자 수용체/공여체 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 가능하게 한다. 전자 공여체-수용체 상호작용으로는 수소-결합, π-π, 양이온-π, 전하 이동, 쌍극자(dipole)-쌍극자, 유도된 쌍극자 등과 같은 상호작용이 포함된다.
소정 실시형태에서, 혼합 방식 분리에 사용된 수지는 Capto Adhere이다. Capto Adhere은, 다중 방식 기능성을 갖는 강한 음이온 교환체이다. 이의 베이스 매트릭스는, 이온성 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용과 같은 상호작용에 대한 다수의 기능성을 나타내는 리간드(N-벤질-N-메틸 에탄올 아민)를 갖는 고도로 가교-링크된 아가로스이다. 소정 실시형태에서, 혼합 방식 분리에 사용된 수지는, PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel로부터 선택된다. PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel의 베이스 매트릭스는 매우 다공성인 가교-링크된 셀룰로스이다. 이들의 리간드는 각각 페닐프로필아민 및 헥실아민이다. 페닐프로필아민 및 헥실아민은 단백질 분리를 위한 상이한 선택성 및 소수성 옵션을 제공한다. 추가의 혼합 방식 크로마토그래피 지지체로는 Nuvia C Prime, Toyo Pearl MX Trp 650M, 및 Eshmuno® HCX가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 혼합 방식 크로마토그래피 수지는, 직접적으로 또는 스페이서(spacer)를 통해, 때때로 베이스 매트릭스라고 나타내는 유기 또는 무기 지지체에 커플링된 리간드들로 이루어진다. 지지체는, 입자, 예를 들면, 근본적으로 구상인 입자, 모놀리스(monolith), 필터, 막, 표면, 모세관(capillaries) 등의 형태로 존재할 수 있다. 소정 실시형태에서, 지지체는 천연 중합체, 예를 들면, 가교-링크된 탄수화물 재료, 예를 들면, 아가로스, 한천, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 젤란, 알기네이트 등으로부터 제조된다. 높은 흡착 용량을 얻기 위해서, 지지체가 다공성이고, 이어서, 리간드가 외부 표면뿐만 아니라 세공 표면에도 커플링될 수 있다. 이러한 천연 중합체 지지체는, 표준 방법, 예를 들면, 역 현탁 겔화(inverse suspension gelation)(S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))에 따라 제조될 수 있다. 대안으로, 지지체는 가교-링크된 합성 중합체와 같은 합성 중합체, 예를 들면, 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로부터 제조될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 표준 방법(예를 들면, 문헌["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)]을 참조한다)에 따라 제조할 수 있다. 다공성 천연 또는 합성 중합체 지지체는, 또한, 시판 공급원, 예를 들면, Amersham Biosciences(스웨덴, 웁살라)로부터 입수가능하다.
소정 실시형태에서, 목적하는 단백질을 포함하는 혼합물의 단백질 부하는, 컬럼에 대한 총 단백질 부하 약 50 내지 750g/L, 또는 약 75 내지 500g/L, 또는 약 100 내지 300g/L로 조정된다. 소정 실시형태에서, 부하 단백질 혼합물의 단백질 농도는 컬럼에 부하된 재료의 단백질 농도 약 1 내지 50g/L, 또는 약 9 내지 25g/L로 조정된다.
소정 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜, 세제, 아미노산, 당, 카오트로픽 제제와 같은 첨가제는, 보다 우수한 회수 또는 생산물 품질이 달성되도록 분리의 성능을 향상시키기 위해 첨가할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 MM 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR을 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR을 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR을 갖거나 AR을 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브의 정제에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR1 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR1 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR1을 갖거나 AR1 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브에 관한 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 유동 용출 분획 중의 AR2 전하 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 AR2 전하 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 AR2를 갖거나 AR2 변이체를 포함하지 않는 단백질 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다.
아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 MM 방법은, 용출 분획 중의 MGO 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 MGO 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 감소된 MGO를 갖거나 MGO 변이체를 포함하지 않는 단백질 제제를 제조하는데 사용할 수 있다. 아달리무마브와 관련된 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, 용출 분획 중의 당화된 변이체를 농축시키면서, 통과액 및 세척 분획 중의 당화된 변이체(시프 염기 및 영구적으로 당화된 형태)를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 근본적으로 전부 제거함으로써, 당화된 변이체가 감소되거나 당화된 변이체를 포함하지 않는 단백질 제제를 제조하는데 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, MM 크로마토그래피 단계의 부하, pH, 전도도, 및 용출 pH 전도도, 세척 pH 및 전도도, 및 용출 pH, 전도도는, 산성 종의 바람직한 분포를 달성하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 소정 실시형태는, 목적하는 단백질의 정제된 샘플의 리신 분포의 조정, 예를 들면, Lys 0의 증가 및 Lys 1 및 Lys 2의 감소에 관한 것이다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 방법은, Lys 0의 양이 감소되는 한편, Lys 1 및/또는 Lys 2의 양이 증가되는 샘플의 제조를 가능하게 한다.
소정 실시형태에서, MM 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 추가로, 또는 전하 변이체 농도를 단지 조정하는 것 대신에, 분획들의 조합을 풀링하여 원하는 프로세스-관련 불순물 및/또는 생산물-관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
소정 실시형태에서, 분광학 방법, 예를 들면, UV, NIR, FTIR, 형광성, 및 라만을 이용하여 AR 종의 수준을 온-라인, 앳-라인 또는 인-라인 방식으로 모니터링할 수 있고, 이어서, 분광학 방법은, MM 용출액으로부터 수집된 풀링된 재료 중의 전하 변이체, 예를 들면, 산성 종의 수준을 제어하는데 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 당화, MGO 변형, 탈아미드화, 글리코실화와 같은 단백질의 화학적 변형으로부터 발생하는 특정 신호는, 얻어진 생산물의 생산물 품질의 실시간 또는 근 실시간 제어를 가능하게 하는 이러한 인-라인, 온-라인 또는 앳-라인 방법을 통한 분광학적 방법에 의해 특이적으로 측정가능할 수 있다. 소정 실시형태에서, 온-라인, 앳-라인 또는 인-라인 모니터링 방법은, 원하는 생산물 품질/회수의 달성을 가능하게 하기 위해, 크로마토그래피 단계의 용출액 라인에 대해 또는 수집 용기에서 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, UV 신호는, 적절한 생산물 품질/회수를 달성하기 위한 대용물로서 사용할 수 있고, 여기서, UV 신호는, 통합, 분화, 이동 평균으로서의 이러한 프로세싱 기술을 포함하지만 이들에 한정되지 않고 정상 프로세스 가변성이 해소될 수 있고 표적 생산물 품질이 달성될 수 있도록 적절하게 프로세싱될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 측정값을 인-라인 희석 방법과 조합하여, 부하/세척의 이온 농도/전도도가 피드백에 의해 제어될 수 있고, 따라서, 생산물 품질 제어도 가능해질 수 있다.
소정 실시형태에서, 혼합 방식 및 AEX 및 CEX 방법의 조합은, 하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정 실시형태를 포함하는 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 하나의 기술에 의해 소정 아-종이 대부분 제거되어 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생산물 품질을 제공하도록 수행될 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 조합은, 원하는 생산물 품질, AR, 이온 농도, 및/또는 바이러스 감소를 달성하도록 하는 추가의 크로마토그래피, 여과, pH 조정, UF/DF 단계의 사용을 포함한다.
하기에 그리고 실시예 11에 기술되는 바와 같이, MM 크로마토그래피는 재순환 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식과 함께 사용할 수 있다.
연속적 크로마토그래피 및 재순환 크로마토그래피
연속적 크로마토그래피 및 재순환 크로마토그래피 방식은, 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하는데 사용할 수 있고, 하기에 기술된다. 이들 방법은, AR 감소 수준을 유지하면서, 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체의 회수에 있어서 유의한 개선을 초래한다. 이들 연속적 크로마토그래피 및 재순환 크로마토그래피 방식은, (a) 목적하는 저 산성 종 구성성분이, 크로마토그래피(통과액/세척액 크로마토그래피) 동안 결합되지 않은 분획 중에 수집되거나, (b) 목적하는 저 산성 종 구성성분이 우선 배지에 결합하고, 후속적으로, 결합된 구성성분을 용출시키는 조건으로 배지를 세척함으로써 회수되는 크로마토그래피 방법에 적용가능하다.
연속적 크로마토그래피 및 재순환 크로마토그래피 -- 통과액/세척액 크로마토그래피
목적하는 저 산성 종 구성성분이, 결합되지 않은 분획 중에 수집되는 경우에, 컬럼 상에 부하된 재료의 손실을 방지하는 하기 접근법을 사용한다.
한 실시형태에서, 컬럼이 부하되어, 표적 AR 수준을 초래하는 결합되지 않은 분획이 수집되는, 재순환 크로마토그래피 방식을 사용한다. 후속적으로, 컬럼을 재생하고 생산물을 잃는 대신에, 컬럼에 결합된 상태로 남아 있는 생산물의 회수를 초래하는 조건 하에 컬럼을 세척한다. 이들 조건 하에 회수된 이들 생산물은, 본래 공급 재료보다 유의하게 높은 AR 수준을 함유한다. 이러한 세척 분획은, 후속적 프로세싱에 대해 바람직한 분리를 달성하기에 적절한 조건(전형적으로 초기 제조와 유사한 조건)으로 조정하고, 본래 공급 재료와 합하여, (컬럼을 다음 사이클에 대해 적절하게 준비한 후에) 컬럼에 다시 부하한다. 제1 사이클로부터의 세척 분획 및 신선한 재료를 조합하여 다음 사이클을 위해 준비되는 재료의 양은, 바람직한 분리를 달성하기 위한 컬럼에 대한 표적 부하 용량(전형적으로 제1 사이클에 대한 표적 용량과 유사함)으로 조정된다.
제2 사이클의 수행시, 표적 AR 수준이 달성되도록 결합되지 않은 분획을 수집하고, 이어서, 후속적으로 컬럼 상에 남아 있는 생산물을 회수하기 위한 조건 하에 컬럼을 세척하는 유사한 전략이 사용된다.
한 실시형태에서, 이러한 재순환 크로마토그래피 방식은, 모든 부하 재료가 사용될 때까지 계속된다. 사이클의 수는, 컬럼 사이즈를 적절히 고안함으로써 제어될 수 있다.
재순환 크로마토그래피 방식의 사용시, 컬럼에 부하된 생산물의 회수는, 표적 AR 수준을 달성하면서 유의하게 개선된다.
재순환 크로마토그래피 방식의 몇몇의 변형을 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 소정 AR 수준을 표적으로 하는 수집된 분획은, 소정 기준에 기초하여 또는 컬럼의 용출물 또는 수집된 풀의 앳-라인, 오프-라인 또는 온-라인 분석에 기초하여 측정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 제1 사이클에 사용되는 세척 조건은, 원하는 양의 생산물이 원하는 생산물 품질로 회수되도록 조정할 수 있고, 후속적 단계에 적절한 부하 혼합물을 제조하는 것의 실현가능성(feasibility)에 의해서만 제한된다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 세척 조건은 부하 조건과 유사할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 컬럼 상에 남아있는 (바람직하거나 바람직하지 못한) 생산물 종의 전부를 회수하기 위해 세척 조건은 엄격할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 후속적 사이클에 사용되는 부하량, 부하 조건, 및 세척 조건은, 원하는 순도가 달성되도록 변형될 수 있고, 단, 후속적 사이클을 위한 부하 재료는, 보다 높은 수준의 AR을 함유하는 경향이 있다.
다른 실시형태에서, 마지막 사이클의 작동을 상이한 조건 하에 수행하여, 표적 순도 및 표적 회수를 달성하여 전체 회수 및 순도를 최적화할 수 있다.
또한, 본 발명의 저 AR 조성물을 제조하기 위한 방법은 연속적 크로마토그래피 방식으로 실행할 수 있다. 이러한 방식에서는 2개 이상의 컬럼들("제1" 컬럼 및 "제2" 컬럼으로서 나타냄)을 사용한다. 한 실시형태에서, 공급 재료는 제1 컬럼 상에 부하하고, 제1 컬럼으로부터의 결합되지 않은 분획을 수집하여 풀 재료가 표적 AR 수준을 함유하도록 한다. 이어서, 남아있는 생산물이 회수되는 조건 하에 컬럼을 세척한다. 이어서, 이러한 재료는, 원하는 부하 조건을 달성하기에 적절한 용액으로 동력학적으로 희석하고, 신선한 공급 재료와 혼합하여, 제2 컬럼에 보낸다. 제2 컬럼으로부터의 결합되지 않은 분획을 수집하여 표적 AR 수준을 달성한다. 이어서, 생산물을 회수하기 위한 조건 하에 제2 컬럼을 세척하고, 적절한 용액으로 희석시키고, 신선한 재료와 동력학적으로 혼합하여, 제1 컬럼(이는, 재생/세정 후에 부하량을 수용하도록 제조된다)에 보낸다. 한 실시형태에서, 이러한 사이클링은, 모든 부하 재료가 사용될 때까지 계속된다. 마지막 사이클은, 필요에 따라 부하 및 세척 조건이 적절하게 조정되는 "전형적" 방식으로 작동될 수 있다.
소정 실시형태에서, 이러한 연속적 크로마토그래피 방식은, 보다 높은 AR 수준을 함유하는 세척 재료가, 적절한 희석 후에 부하 탱크에 다시 보내질 수 있도록 수행할 수 있다. 이어서, 이러한 재료는, 후속적으로 또는 동시에 제2 컬럼에 부하되어, 2개의 컬럼들의 작동이 탠덤(tandem)으로 존재하지 않아 작동의 복잡성(complexity)을 감소시키도록 한다.
이러한 연속적 크로마토그래피 방식은, 재순환 크로마토그래피 방식과 유사하지만, 보다 효과적으로 수행될 수 있고, 따라서, 감소된 프로세싱 시간을 갖는다.
이러한 연속적 크로마토그래피 방식에 관해, 몇몇의 변형이 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 소정 AR 수준을 표적으로 하여 수집되는 분획은, 소정 기준에 기초하여 또는 컬럼의 용출물 또는 수집된 풀의 앳-라인, 오프-라인, 또는 온-라인 분석에 기초하여 측정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 제1 사이클에 사용되는 세척 조건은, 원하는 양의 생산물이 원하는 생산물 품질로 회수되도록 조정할 수 있고, 후속적 단계에 적절한 부하 혼합물을 제조하는 것의 실현가능성에 의해서만 제한된다. 이러한 실시형태의 한 양상에서, 세척 조건은 부하 조건과 유사할 수 있다. 이러한 실시형태의 다른 양상에서, 컬럼 상에 남아있는 (바람직하거나 바람직하지 못한) 생산물 종의 전부를 회수하기 위해 세척 조건은 엄격할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 후속적 사이클에 사용되는 부하량, 부하 조건, 및 세척 조건은, 원하는 순도가 달성되도록 변형될 수 있고, 단, 후속적 사이클을 위한 부하 재료는, 보다 높은 수준의 AR을 함유하는 경향이 있다.
다른 실시형태에서, 마지막 사이클의 작동을 상이한 조건 하에 수행하여, 표적 순도/회수를 달성하여 전체 회수 및/또는 순도를 최적화할 수 있다.
한 실시형태에서, 재순환 또는 연속적 방식을 위한 배지 선택은, 펜던트(pendant) 소수성 및 음이온 교환 기능성 그룹을 갖는 다수의 크로마토그래피 수지들 중 하나, 모놀리스 배지, 막 흡착 배지 또는 심층 여과 배지일 수 있다.
소정 실시형태에서, 막 또는 심층 필터 기반 배지("대류 배지"(convective media))는, 생산물의 덜 농축된 부분이 "재순환"되고, 한편, 순수한 분획이 선택적으로 풀링된다는 사실을 고려하면, 분리의 선택성이 높은 것이 요구되지 않으므로, 재순환 또는 연속적 크로마토그래피 방식에서 사용할 수 있다.
연속적 크로마토그래피 및 재순환 크로마토그래피 -- 용출 크로마토그래피
AR 감소를 위한 CEX 기술에 의해 예시된 바와 같은 크로마토그래피 또는 분리의 용출 방식에서, 부하 및 세척 단계를 위한 조건은, AR 농축된 재료가 통과액 및/또는 세척 분획 중에 수집되고, 한편, AR 감소된 재료가 용출 분획 중에 수집되도록 선택한다. CEX 기술의 전형적인 이행시, 생산물(원하는 전하 변이체)의 약 10 내지 40%는 통과액/세척 분획 중에 소실될 수 있다. 2개의 방식의 작동, 즉, 재순환 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식은, 표적 AR 수준을 유지하면서 개선된 회수를 제공한다.
재순환 크로마토그래피 방식에서, 부하 재료는, 일반적으로, 다중 사이클에 걸쳐 프로세싱된다. 재순환 크로마토그래피 방식의 이행시, 부하 재료는, 용출물이 표적 생산물 순도 또는 AR 수준을 함유하도록 제조된다. 이들 조건 하에, AR 농축된 재료는 통과액/세척 분획 중에 수집된다. 이러한 재료를 풀링하고, 추가의 신선한 부하 재료를 첨가하여 동일한 컬럼에 대한 크로마토그래피의 다음 사이클에 적절한 부하 용량을 달성한다. 특히, 한 실시형태에서, 컬럼은, 결합된 생산물(저 AR 수준을 가짐)이 회수되는 조건 하에 용출되고, 후속적으로, 재생 및 평형화되어 다음 사이클을 위해 준비된다.
다음 사이클에서, 합한 부하물(상기 사이클 1로부터의 통과액/세척액)을 표적 용량으로 부하한다. 통과액/세척 분획을 수집하고 풀링한다. 컬럼을 다시 용출시켜 저 AR 조성물을 함유하는 제2 용출물을 얻는다. 한 실시형태에서, 모든 부하 재료가 프로세싱될 때까지 이러한 순차를 계속한다.
다른 실시형태에서, 재순환 크로마토그래피 방식을 이행함으로써, AR 농축 재료로서 달리 버려지지 않을 재료가 추가로 정제되어 순수한 단백질 생산물이 "회수"되고, 이에 의해 단백질의 전체 회수가 개선된다. 한 실시형태에서, 회수의 수준은 사용된 사이클의 수에 의존한다.
재순환 크로마토그래피 방식에 관해, 몇몇의 변형이 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 통과액/세척 분획의 전체 풀을 전형적으로 신선한 재료와 합하여 전체 작동의 회수를 최대화한다. 그러나, 보다 높은 순도 또는 효율성을 달성하기 위해서 통과액 세척의 일부는 버릴 수 있다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 매우 높은 수준의 AR 종을 함유하는 소정 분획을 버릴 수 있다. 이러한 선택적 풀링을 가능하게 하기 위해서, 오프-라인, 인-라인 또는 앳-라인 방법을 이용하여 AR의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 부하량 및 부하, 세척 및 용출을 위한 조건은, 부하 풀 중에 존재할 것인 보다 높은 수준의 AR이 수용되도록 제2 사이클 및 후속적 사이클을 위해 변형될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 당해 방법의 마지막 사이클은, 표적 순도 및 회수를 달성하여 전체 회수 및 순도를 최적화할 수 있도록 하는 조건 하에 수행될 수 있다.
연속적 크로마토그래피 방식은 시간 효율성의 관점에서 추가의 이점을 제공한다. 이러한 방식의 작동시, 2개 이상의 컬럼들을 사용한다. 구체적으로, 재순환 방식에 관해서, 부하 용량에 적절한 조건, 부하, 세척 및 용출 조건은 작동을 위해 선택된다. 통과액 및 세척 분획(또는 이들의 일부)을, 신선한 재료를 함유하는 부하 탱크에 보낸다. 부하 및 세척 단계의 종료 후, 제1 컬럼을 용출시키고, 후속적으로 재생시킨다. 한편, 제2 컬럼에, 신선한 재료와 이전 사이클로부터의 세척 및 통과액의 혼합물인 재료를 부하한다. 제2 컬럼으로부터의 세척 및 통과액을 다시 부하 탱크로 되돌려 보낸다. 이어서, 제2 컬럼을 용출시키고, 재생시킨다. 이어서, 제1 컬럼이 부하되도록 준비하고, 사이클을 계속한다. 이러한 연속적 크로마토그래피 방식은, 생산물이 연속적으로 프로세싱되어 정제된 생산물이 반(semi)-연속적 방식으로 얻어지므로 효율적이다.
연속적 크로마토그래피 방식의 몇몇 변형을 사용할 수 있다. 한 실시형태에서, 통과액/세척 분획의 전체 풀을 신선한 재료와 합하여 전체 작동의 회수를 최대화한다. 그러나, 보다 높은 순도 또는 효율성을 달성하기 위해서 통과액 세척의 일부는 버릴 수 있다. 예를 들면, 매우 높은 수준의 AR 종을 함유하는 소정 분획을 버릴 수 있다. 이러한 선택적 풀링을 가능하게 하기 위해서, 오프-라인, 인-라인 또는 앳-라인 방법을 이용하여 산성 종의 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 부하량 및 부하, 세척 및 용출을 위한 조건은, 부하 풀 중에 존재할 것인 보다 높은 수준의 AR이 수용되도록 제2 사이클 및 후속적 사이클을 위해 변형될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 마지막 사이클의 작동을 상이한 조건 하에 수행하여 전체 회수 및 순도를 최적화할 수 있다.
재순환 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식은, 임의의 특정 크로마토그래피 수지와의 사용에 한정되지 않는다. 재순환 또는 연속적 방식에 사용되는 배지는, 펜던트 소수성 및 음이온 교환 기능성 그룹을 갖는 다수의 크로마토그래피 수지들 중 하나, 모놀리스 배지, 막 흡착 배지 또는 심층 여과 배지일 수 있다.
소정 실시형태에서, 막 심층 필터-기반 배지("대류 배지")는, 생산물의 덜 농축된 부분이 "재순환"되고, 한편, 순수한 분획이 선택적으로 풀링된다는 사실을 고려하면, 분리의 선택성이 높은 것이 요구되지 않으므로, 재순환 또는 연속적 크로마토그래피 방식에서 사용할 수 있다.
재순환 크로마토그래피 방식 및 연속적 크로마토그래피 방식을, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 AEX, CEX, 또는 MM 크로마토그래피 방법과 함께 사용하여 본 발명의 저 AR 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 11은, AEX, CEX 및 MM 기술을 이용한 AR 감소를 위한 재순환 방식의 크로마토그래피를 기술한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
또한, 본 발명의 저 AR 조성물은, 치환(displacement) 크로마토그래피 단계에 추가하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 이용하여 제조할 수 있다.
분리의 수행시, 샘플 혼합물은, 예를 들면, 배치 정제 기술을 이용하거나 컬럼 또는 막 크로마토그래피를 이용하여 HIC 재료와 접촉된다. HIC 정제 전에, 수지 또는 막에 대해 바람직한 단백질 결합을 달성하기 위해 염 완충액의 농도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는, 선택적 분리를 위한 목적하는 단백질의 국소 전하에 의존하지만, 소수성 상호작용 크로마토그래피는, 선택적 분리를 달성하기 위해 단백질의 소수성 특성을 사용한다. 단백질 상의 소수성 그룹은 수지 또는 막의 소수성 그룹과 상호작용한다. 보다 소수성일수록, 단백질은 더 강하고, 이는 컬럼 또는 막과 상호작용할 것이다. 따라서, HIC 단계는 프로세스-관련 불순물(예를 들면, HCP) 및 생산물-관련 물질(예를 들면, 응집체 및 단편)을 제거한다.
이온 교환 크로마토그래피와 유사하게, HIC 컬럼 또는 막 장치도 생산물 중에서 결합-용출 방식, 통과 방식, 또는 생산물이 크로마토그래피 재료에 대한 결합을 나타내는 하이브리드 방식으로 작동할 수 있고, 또한, 부하 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 세척될 수 있다. 이들 방식의 상세설명은 AEX 정제와 관련하여 상기에 요약되어 있다.
소수성 상호작용은 높은 이온 강도에서 가장 강하므로, 이러한 형태의 분리는, 전형적으로 이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 사용되는 것과 같은 염 용출 단계에 따라 편리하게 수행된다. 대안으로, 이러한 단계 전에 염을 저염 수준 공급 스트림(stream)에 첨가할 수 있다. HIC 컬럼에의 항체 흡착은 높은 염 농도를 선호하지만, 실제 농도는, 목적하는 단백질의 성질, 염 형태 및 선택된 특정 HIC 리간드에 따라 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 각종 이온들은, 이들이 소수성 상호작용(염석((salting-out) 효과)을 촉진하거나 물의 구조를 파괴시키고(카오트로픽 효과), 소수성 상호작용의 약화를 초래하는지에 따라 소위 솔루포빅 시리즈(soluphobic series)로 배열될 수 있다. 양이온은 염석 효과를 증가시키는 관점에서 Ba2+; Ca2+; Mg2+; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+로서 랭킹되고, 한편, 음이온은 카오트로픽 효과의 관점에서 PO43-; SO42-; CH3CO3-; Cl-; Br-; NO3-; ClO4-; I-; SCN-로서 랭킹될 수 있다.
일반적으로, Na+, K+ 또는 NH4+ 설페이트는 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진시킨다. 하기 관계를 고려하여 상호작용의 강도에 영향을 미치는 염을 제형화할 수 있다: (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4C1 > NaBr > NaSCN. 일반적으로, 약 0.75M 내지 약 2M의 황산 암모늄 또는 약 1M 내지 4M의 NaCl의 염 농도가 유용하다.
HIC 배지는, 통상적으로, 소수성 리간드(예를 들면, 알킬 또는 아릴 그룹)가 커플링되는 베이스 매트릭스(예를 들면, 가교-링크된 아가로스 또는 합성 공중합체 재료)를 포함한다. 적합한 HIC 배지는 아가로스 수지 또는 페닐 그룹으로 기능화된 막(예를 들면, GE Healthcare로부터의 Phenyl Sepharose™ 또는 Sartorius로부터의 Phenyl Membrane)을 포함한다. 다수의 HIC 수지는 상업적으로 입수가능하다. 그 예로는 Capto Phenyl, 저 치환 또는 고 치환의 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose™ High Performance, Octyl Sepharose™ High Performance(GE Healthcare); Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl(E. Merck, Germany); Macro-Prep™ Methyl 또는 Macro-Prep™ t-Butyl 컬럼(Bio-Rad, California); WP HI-Propyl (C3)™(J. T. Baker, New Jersey); 및 Toyopearl™ 에테르, 페닐 또는 부틸(TosoHaas, PA)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
바이러스 여과
바이러스 여과는 전체 정제 프로세스에서 전용의 바이러스 감소 단계이다. 이 단계는 일반적으로 크로마토그래피 연마 단계 후에 수행된다. 바이러스 감소는, Asahi Kasei Pharma로부터의 Planova 20N™, 50N 또는 BioEx, EMD Millipore로부터의 Viresolve™ 필터, Sartorius로부터의 ViroSart CPV, 또는 Pall Corporation으로부터의 Ultipor DV20 또는 DV50™ 필터를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 적합한 필터들의 사용을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 여과 성능을 얻기에 적합한 필터를 선택하는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
한외여과 / 투석여과
본 발명의 소정 실시형태는 한외여과 및 투석여과 단계를 사용하여 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체 생산물을 추가로 농축시키고 제형화한다. 한외여과는 문헌[Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); 및 Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9)]에 상세히 기술되어 있다. 하나의 여과 프로세스는 문헌[Millipore catalogue entitled "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96)]에 기술되어 있는 접선 유동 여과이다. 한외여과는 일반적으로 0.1㎛보다 더 작은 세공 크기를 갖는 필터를 이용한 평균 여과인 것으로 간주된다. 이러한 작은 세공 크기를 갖는 필터들을 사용함으로써, 샘플의 체적은, 필터 막 세공을 통한 샘플 완충액의 침투를 통해 감소될 수 있고, 한편, 단백질, 예를 들면, 항체는 막 표면 위에 보유된다.
투석여과는, 염, 당, 및 비수성 용매를 제거하고 교환하여 결합된 종으로부터 결합되지 않은 종을 분리하고/하거나, 저 분자량 종을 제거하고/하거나, 이온성 및/또는 pH 환경의 신속한 변화를 야기하기 위해 막 필터를 이용하는 방법이다. 미세용질(microsolute)은, 침투 유속과 대략 동등한 속도로 투석여과된 용액에 용매를 첨가함으로써 가장 효과적으로 제거된다. 이는, 용액으로부터 미세종(microspecies)을 일정 체적으로 세척제거하여 보유된 목적하는 단백질이 효과적으로 정제된다. 본 발명의 소정 실시형태에서, 투석여과 단계는, 임의의 추가의 크로마토그래피 또는 다른 정제 단계들 전에, 본 발명과 관련하여 사용되는 각종 완충액들을 교환하기 위해서뿐만 아니라 단백질 제제로부터 불순물을 제거하기 위해서도 사용한다.
당해 분야 숙련가들 중 하나는 UF/DF 작동에 적절한 막 필터 장치를 선택할 수 있다. 본 발명에 적합한 막 카세트(membrane cassette)의 예로는, EMD Millipore로부터의 10kD, 30kD 또는 50kD의 막을 갖는 Pellicon 2 또는 Pellicon 3 카세트, GE Healthcare로부터의 Kvick 10kD, 30kD 또는 50kD 막 카세트, 및 Pall Corporation으로부터의 Centramate 또는 Centrasette 10kD, 30kD 또는 50kD 카세트가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
예시적 정제 전략
소정 실시형태에서, 최초 회수는, pH 감소, 원심분리, 및 여과 단계를 순차적으로 사용하여 생산 생물 반응기 수거물로부터 세포 및 세포 잔해(HCP 포함)를 제거함으로써 진행할 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명은, 상기 최초 회수로부터의 샘플 혼합물에 하나 이상의 AEX, CEX, 및/또는 MM 정제 단계를 행하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 소정 실시형태는 추가의 정제 단계들을 포함할 것이다. 이온 교환 크로마토그래피 방법 전에, 이온 교환 크로마토그래피 방법 동안에, 또는 이온 교환 크로마토그래피 방법 후에 수행될 수 있는 추가의 정제 절차들의 예로는 에탄올 침전, 등전점 전기영동, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 Sepharose™, 추가의 음이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 추가의 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 G, 항체, 특이적 기질, 리간드 또는 항원을 포획 시약으로서 이용함)가 포함된다.
전략들의 이러한 조합의 구체예는, 표 80 내지 표 87 및 표 76 내지 표 78에 포함된 본 발명과 관련된 유용한 특정 조합에 관한 특정 데이터와 함께 하기에 제시된다.
소정 실시형태에서, 결합되지 않은 통과액 및 세척 분획은 추가로 분획화될 수 있고, 표적 생산물 순소를 제공하는 분획의 조합이 풀링될 수 있다.
소정 실시형태에서, 단백질 농도는, 항체 생산물과 생산물-관련 기질 사이의 차별적 분할 거동(differential partitioning behavior)이 달성되도록 조정하여 순도 및/또는 수율이 추가로 개선될 수 있도록 한다. 소정 실시형태에서, 부하는, 부하 동작 동안 상이한 단백질 농도에서 수행하여 임의의 특정 정제 단계 동안의 생산물 품질/수율을 개선시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 컬럼 온도는, 임의의 특정 정제 단계의 분리 효율 및/또는 수율을 개선시키도록 독립적으로 변화시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 부하 및 세척 완충액 매트릭스는, 유사한 "수지 상호작용" 거동을 달성하면서 상기 신규 분리를 유효화하도록, 상이할 수 있거나 화학물질들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 부하 및 세척 완충액은, 세척 단계 동안 달성되는 생산물의 세척제거의 관점에서 기능이 실질적으로 유사하게 유지하면서 이온 강도 또는 pH의 관점에서 상이할 수 있다. 소정 실시형태에서, 첨가제, 예를 들면, 아미노산, 당, PEG 등을 부하 또는 세척 단계에 첨가하여 분획 거동을 조정하여 분리 효율 및/또는 수율을 달성할 수 있다.
소정 실시형태에서, 부하 & 세척 단계는, 컬럼 용출물 또는 수집된 풀 또는 상기 둘 다 중의 생산물 관련 불순물/물질 수준의 인-라인, 앳-라인 또는 오프-라인 측정에 의해 제어하여, 표적 생산물 품질 및/또는 수율을 달성할 수 있다. 소정 실시형태에서, 부하 농도는, 인-라인 또는 배치 또는 완충액 또는 다른 용액으로의 연속적 희석에 의해 동력학적으로 제어하여, 분리 효율 및/또는 수율을 개선하기 위해 필요한 분획화를 달성할 수 있다.
V. 샘플 순도를 검정하는 방법
숙주 세포 단백질의 검정
본 발명은, 또한, 본 발명의 저 AR 조성물 중의 숙주 세포 단백질(HCP) 농도의 잔류 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 기술되어 있는 바와 같이, HCP는 최종 표적 물질 생산물로부터 배제되는 것이 바람직하다. 예시적 HCP로는, 항체 생산의 공급원으로부터 기원하는 단백질이 포함된다. 표적 항체로부터 HCP를 확인하고 충분히 제거하는 것에 대한 실패는 대상체에서의 감소된 효율 및/또는 역 반응(adverse reaction)을 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "HCP ELISA"는, 검정에서 사용된 제2 항체가, 목적하는 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포, 예를 들면, CHO 세포로부터 생산된 HCP에 대해 특이적인 ELISA를 말한다. 제2 항체는, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 종래 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 제2 항체는, 샴(sham) 생산 및 정제 실행에 의해 수득되는 HCP를 이용하여 제조할 수 있고, 즉, 목적하는 항체를 제조하기 위해 사용된 동일한 세포주를 사용하지만, 세포주는 항체 DNA로 형질감염되지 않는다. 예시적 실시형태에서, 제2 항체는, 선택된 세포 발현 시스템, 즉, 표적 항체를 제조하기 위해 사용된 세포 발현 시스템에서 발현된 것과 유사한 HCP를 이용하여 제조된다.
일반적으로, HCP ELISA는, 항체들, 즉, 제1 항체 및 제2 항체의 2개의 층들 사이에 HCP를 포함하는 액체 샘플을 샌드위치(sandwich)시킴을 포함한다. 샘플은, 샘플 중의 HCP가 제1 항체, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 친화성 정제된 염소 항-CHO(Cygnus)에 의해 포획되는 시간 동안 항온배양한다. 항체, 예를 들면, 비오티닐화된 항-CHO HCP를 생성하기 위해 사용된 세포로부터 제조된 HCP에 대해 특이적인, 표지된 제2 항체, 또는 항체들의 블렌드가 첨가되고, 샘플 내에서 HCP에 결합한다. 소정 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항체는 폴리클로날 항체들이다. 소정 양상에서, 제1 항체 및 제2 항체는, HCP에 대항하여 생성된 폴리클로날 항체들의 블렌드이다. 샘플 중에 함유된 HCP의 양은, 제2 항체의 표지에 기초하여 적절한 시험을 이용하여 측정한다.
HCP ELISA는, 상기 기술되어 있는 프로세스를 이용하여 수득된 용출물 또는 통과액과 같은 항체 조성물 중의 HCP의 수준을 측정하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은, HCP 효소 링크된 면역흡착 검정("ELISA")에 의해 측정시 검출가능한 수준의 HCP를 갖지 않는, 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
산성 종(AR)의 검정
본원에 기술되어 있는 기술을 이용하여 제조된 크로마토그래피 샘플 중의 산성 종의 수준은, 실시예 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 분석될 수 있다. 소정 실시형태에서, CEX-HPLC 방법을 사용한다. 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 양이온 교환 크로마토그래피는 Dionex Propac WCX-10, 분석 컬럼 4mm x 250mm(Dionex, CA) 상에서 수행될 수 있다. 이어서, Agilent 1200 HPLC 시스템을 HPLC로서 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 10mM의 이염기성(dibasic) pH 7.5 인산 나트륨(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 pH 5.5 염화 나트륨(이동상 B)와 같은 이동상(mobile phase)들을 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 이원 농도구배(binary gradient)(94% A, 6% B: 0 내지 20min; 84% A, 16% B: 20 내지 22min; 0% A, 100% B: 22 내지 28min; 94% A, 6% B: 28 내지 34min)를 280nm에서의 검출과 함께 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 정량(quantitation)은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 소정 실시형태에서, 소정 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크는 산성 피크로서 함께 나타낸다.
크기 변이체의 검정
소정 실시형태에서, 본원에 기재되어 있는 기술을 이용하여 제조된 크로마토그래피 샘플 중의 응집체, 단량체, 및 단편의 수준을 분석한다. 소정 실시형태에서, 응집체, 단량체, 및 단편은, 각각의 분자에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법을 이용하여 측정한다. 예를 들면, 이들에 제한되는 것은 아니지만, TSK-겔 G3000SWxL, 5㎛, 125Å, 7.8 X 300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)을 소정 실시형태와 관련하여 사용할 수 있고, 한편, TSK-겔 Super SW3000, 4㎛, 250Å, 4.6 X 300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)을 대안의 실시형태에서 사용할 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 언급된 컬럼들은 Agilent 또는 Shimazhu HPLC 시스템과 함께 사용한다. 소정 실시형태에서, 샘플 주사는, 예를 들면, pH 6.8에서 100mM의 황산 나트륨 및 100mM의 인산 나트륨으로 이루어진 이동상을 이용하여 등용매 용출(isocratic elution) 조건 하에 이루어지고, 214nm에서의 UV 흡광도로 검출된다. 소정 실시형태에서, 이동상은 pH 7.4에서 1X PBS로 이루어질 것이고, 용출 프로파일은 280nm에서의 UV 흡광도로 검출된다. 소정 실시형태에서, 정량은, 검출된 피크의 상대적 면적에 기초한다.
크기 변이체를 검정하기 위해 임의의 추가의 기술, 예를 들면, 질량 분광학을 이용할 수 있다.
VI. 본 발명의 저 AR 조성물을 이용한 치료 방법
본 발명의 저 AR 조성물은, 조성물 중에 포함된 치료학적 단백질이 치료에 적절한 대상체에서의 임의의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
"장애"는, 단백질로의 치료로부터 이익을 얻는 임의의 병태이다. 이로는, 대상체가 의심스러운 장애에 걸리기 쉽게 하는 이들 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 예를 들면, 아달리무마브의 경우, 저 AR 조성물의 치료학적 유효량을 투여하여, TNFα 활성이 유해한 장애를 치료할 수 있다.
TNFα 활성이 유해한 장애로는, 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시키기 위해서 TNFα 활성의 억제가 기대되는 장애가 포함된다. 이러한 장애는, 예를 들면, 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 유체 중의 TNFα 농도의 증가(예를 들면, 대상체의 혈청, 혈장, 활액 등 중의 TNFα 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있고, 이는 항-TNFα 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
TNFα는, 패혈증, 감염, 자가면역 질환, 이식 거부 및 이식편-대-숙주 질환을 포함하는 매우 다양한 TNFα 관련 장애의 병리생리학에 연루되어 왔다(예를 들면, 문헌[Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Moeller et al.의 U.S. 특허 제5,231,024호; Moeller, A., et al. Vasilli, P. (1992) Annu . Rev. Immunol. 10:411-452에 의한 유럽 특허 공개 제260 610 B1호; Tracey, K.J. and Cerami, A. (1994) Annu . Rev. Med. 45:491-503]을 참조한다). 따라서, 본 발명의 저 AR 조성물 또는 저 프로세스-관련 불순물 조성물은, 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 또는 건선성 관절염, 장 장애, 예를 들면, 크론 질환 또는 궤양성 결장염, 척추관절병증, 예를 들면, 강직성 척추염, 또는 피부 장애, 예를 들면, 건선을 치료하는데 사용할 수 있다.
TNFα 활성이 유해한 장애는 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 문헌[U.S. 특허 제8,231,876호 및 U.S. 특허 제6,090,382호]에 상세하게 기술되어 있고, 상기 문헌 각각의 전문은 본원에 인용에 의해 명백하게 포함된다. 한 실시형태에서, "TNFα 활성이 유해한 장애"로는 패혈증(패혈성 쇼크, 내독소성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군 포함), 자가면역 질환(류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염 및 통풍성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신 증후군, 다중 시스템 자가면역 질환, 루푸스(전신성 루푸스, 루프스 신염 및 루푸스 뇌염 포함), 크론 질환 및 자가면역 청력 손실 포함), 활성 축성 척추관절염(활성 axSpA) 및 비-방사선적 축성 척추관절염(nr-axSpA), 감염성 질환(말라리아, 수막염, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 인플루엔자 및 감염에 후속하는 악액질 포함), 동종이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환, 악성 종양, 폐 장애(성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 폐 쇼크, 만성 폐 염증 질환, 폐 유육종증, 폐 섬유증, 규폐증, 특발성 간질성 폐 질환 및 만성 폐색성 기도 장애(COPD), 예를 들면, 천식 포함), 장 장애(염증성 장 장애, 특발성 염증성 장 질환, 크론 질환 및 크론 질환-관련 장애(방광, 질, 및 피부의 누공; 장 폐색; 농양; 영양 결핍증; 코르티코스테로이드 사용으로부터의 합병증; 관절의 염증; 결절성 홍반; 괴저성 농피증; 눈의 병변; 크론 관련 관절통, 누관성 크론 미정 결장염 및 낭염) 포함), 심장 장애(심장의 허혈, 심장 기능부전, 재협착증, 울혈성 심 부전, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근 경색, 심장 정지에 의해 야기된 심혈관 조직 손상, 심장 우회술에 의해 야기된 심혈관 조직 손상, 심인성 쇼크, 및 고혈압, 죽상 동맥경화증, 심근병증, 관상 동맥 연축, 관상 동맥 질환, 판막 질환, 부정맥, 및 심근병증 포함), 척추관절병증(강직성 척추염, 건선성 관절염/척추염, 장병증성 관절염, 반응성 관절염 또는 라이터(Reiter) 증후군, 및 미분화 척추관절병증 포함), 대사 장애(비만, 및 1형 진성 당뇨병, 2형 진성 당뇨병, 당뇨병성 신경병증, 말초 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 궤양, 망막병증 궤양 및 당뇨병성 거대혈관병증을 포함하는 당뇨병 포함), 빈혈, 통증(급성 및 만성 통증, 예를 들면, 신경병증성 통증 및 수술-후 통증, 만성 하부 요통, 군발성 두통, 대상포진 신경통, 환지통, 중추성 통증, 치아 통증, 오피오이드(opioid)-내성 통증, 내장 통증(visceral pain), 수술 통증, 골 손상 통증, 노동 및 출산 동안의 통증, 일광화상을 포함하는 화상으로부터 기인하는 통증, 출산 후 통증, 편두통, 협심증 통증, 및 방광염을 포함하는 비뇨생식관-관련 통증 포함), 간 장애(간염, 알콜성 간염, 바이러스성 간염, 알콜성 간 경변, a1 안티트립신 결핍증, 자가면역 간 경변, 잠복성 간 경변, 적격성 간염, 간염 B 및 C, 및 지방간염, 낭성 섬유증, 원발성 담즙성 간 경변, 경화성 담관염 및 담도 폐쇄 포함), 피부 및 손발톱 장애(건선(만성 플라크(plaque) 건선, 적상(guttate) 건선, 역위(inverse) 건선, 농포성 건선 및 다른 건선 장애 포함), 심상성 천포창, 피부경화증, 아토피성 피부염(습진), 유육종증, 결절성 홍반, 화농성 한선염, 편평태선, 스위트(Sweet) 증후군, 피부경화증 및 백반증 포함), 혈관염(베체트(Behcet) 질환 포함), 및 기타 장애, 예를 들면, 소아 류마티스 관절염(JRA), 자궁내막증, 전립선염, 맥락막 혈관신생, 좌골 신경통, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 포도막염, 습윤 황반 변성, 골다공증 및 골 관절염이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는, 살아있는 유기체, 예를 들면, 원핵생물 및 진핵생물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 포유동물, 예를 들면, 사람, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 및 유전자전이 비-사람 동물이 포함된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 대상체는 사람이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료한다"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 방지학적 조치 둘 다를 말한다. 치료를 필요로 하는 것들로는 이미 장애를 갖는 것들뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 것들도 포함된다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 대상체에게 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 AR 조성물을 투여하여, TNFα 활성이 억제되거나 TNFα 활성이 유해한 장애가 치료되도록 하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, TNFα는 사람 TNFα이고, 대상체는 사람 대상체이다. 한 실시형태에서, 항-TNFα 항체는 아달리무마브이고, 또한 HUMIRA®로서도 나타낸다.
저 AR 조성물은, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법들에 의해 투여될 수 있다. 투여의 예시적 경로/방식으로는 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이 포함된다. 소정 양상에서, 저 AR 조성물은 경구 투여될 수 있다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같은 투여의 경로 및/또는 방식은, 원하는 결과에 따라 다를 것이다.
투약 용법은, 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇의 분할 용량이 경시에 따라 투여될 수 있거나, 용량은, 치료학적 상황의 긴급함에 의해 나타내는 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 소정 실시형태에서, 투여의 용이함 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투약 단위 형태는, 치료되는 포유동물 대상체에 대해 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위들을 말하고, 각각의 단위는, 요구되는 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 생산하는 것으로 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 설명은, (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성되는 특정 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 배합의 당해 분야에 내재하는 제한에 의해 구술되고, 상기 (a) 및 (b)에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적 비-제한적 범위는 0.01 내지 20mg/kg, 또는 1 내지 10mg/kg, 또는 0.3 내지 1mg/kg이다. 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부, 예를 들면, 아달리무마브를 포함하는 저 AR 조성물에 관하여, 예시적 용량은 격주로 40mg이다. 몇몇의 실시형태에서, 특히, 궤양성 결장염 또는 크론 질환의 치료를 위한 예시적 용량으로는 160mg의 개시 용량(1일)(예를 들면, 1일 4회의 40mg 주사 또는 연속 2일 동안 1일 2회의 40mg 주사), 2주 후 80mg의 제2 용량, 및 2주 후 시작하여 격주로의 40mg의 유지 용량이 포함된다. 대안으로, 건선의 경우, 예를 들면, 용량은 80mg의 개시 용량, 이어서, 개시 용량 1주 후에 출발하여 격주로 40mg을 포함할 수 있다.
용량 값은, 완화되는 병태의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있음에 주의해야 한다. 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투약 용법은, 개체 요구, 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시에 따라 조정되어야만 한다는 것과 본원에 제시되는 용량 범위는 단지 예시적인 것이고 특허청구범위의 조성물의 범위 또는 실행을 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 추가로 이해되어야만 한다.
VII. 본 발명의 저 AR 조성물을 함유하는 약제학적 제형
본 발명은, 본 발명의 저 AR 조성물을 포함하는 제제 및 제형을 추가로 제공한다. 본 출원에 걸쳐 상세하게 기술되어 있는 구조적 및 기능적 특성들 중 임의의 하나 이상을 갖는 항체 및 항체 단편을 포함하는 본원에 기술되어 있는 항체 및 항체 단편 중 임의의 것은, 하기에 기술되어 있는 바와 같이 제형화되거나 제조될 수 있음이 이해되어야만 한다. 각종 제형들이 항체를 포함하는 것으로 이 섹션에 기술되어 있는 경우, 이러한 항체는, 본원에 기술되어 있는 항체 및 항체 단편의 특징들 중 임의의 하나 이상을 갖는 항체 또는 항체 단편일 수 있음이 이해된다. 한 실시형태에서, 항체는 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부이다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적(치료학적) 조성물로서 제형화될 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 투여될 수 있다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변할 것이다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는, 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 하나 이상의 비-독성 재료를 의미한다. 이러한 제제는 일상적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성(compatible) 담체, 및 임의의 다른 치료학적 제제를 함유할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 제제는, 또한, 일상적으로 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 사람에게의 투여에 적합한 캡슐화 물질을 함유할 수 있다. 용어 "담체"는, 활성 성분이 이와 함께 조합되어 적용 가능해지는 천연의 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 또한, 약제학적 조성물의 구성성분들은, 바람직한 약제학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않도록 하는 방식으로, 본 발명의 항체와, 그리고, 서로 혼합될(co-mingled) 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물은, 당해 분야에 공지되어 있고 치료학적 용도로 허용되는 형태로 존재한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 액체 제형이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 감압 동결건조된 제형이다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 재구성된(reconstituted) 액체 제형이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 적합한 액체 제형이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 액체 제형은 수성 제형이다. 다른 실시형태에서, 액체 제형은 비-수성이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 액체 제형은, 수성 담체가 증류수인 수성 제형이다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 항체를, 원하는 용량에 대해 적절한 w/v을 초래하는 농도로 포함한다. 항체는, 제형 중에 약 1mg/ml 내지 약 500mg/ml의 농도로, 예를 들면, 1mg/ml 이상, 5mg/ml 이상, 10mg/ml 이상, 15mg/ml 이상, 20mg/ml 이상, 25mg/ml 이상, 30mg/ml 이상, 35mg/ml 이상, 40mg/ml 이상, 45mg/ml 이상, 50mg/ml 이상, 55mg/ml 이상, 60mg/ml 이상, 65mg/ml 이상, 70mg/ml 이상, 75mg/ml 이상, 80mg/ml 이상, 85mg/ml 이상, 90mg/ml 이상, 95mg/ml 이상, 100mg/ml 이상, 105mg/ml 이상, 110mg/ml 이상, 115mg/ml 이상, 120mg/ml 이상, 125mg/ml 이상, 130mg/ml 이상, 135mg/ml 이상, 140mg/ml 이상, 150mg/ml 이상, 200mg/ml 이상, 250mg/ml 이상, 또는 300mg/ml 이상의 농도로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 약 100mg/ml 이상, 약 mg/ml 이상, 130mg/ml 이상, 또는 약 150mg/ml 이상의 본 발명의 항체를 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 제형 중에 포함되는 항체는 농도는, 약 1mg/ml 내지 약 25mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 75mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 100mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 125mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 150mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 75mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 100mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 125mg/ml 내지 약 150mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 125mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 125mg/ml, 약 75mg/ml 내지 약 125mg/ml, 약 100mg/ml 내지 약 125mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 75mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 25mg/ml 내지 약 75mg/ml, 약 50mg/ml 내지 약 75mg/ml, 또는 약 25mg/ml 내지 약 50mg/ml이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 약 90mg/ml 내지 약 110mg/ml 또는 약 100mg/ml 내지 약 210mg/ml의 항체를 포함한다.
항체를 포함하는 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 서로 악 영향을 미치지 않는 전형적으로 상보적 활성을 갖는 것인, 치료되는 특정 징후(indication)에 필요한 하나 이상의 활성 화합물들을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 활성 화합물은, 의도된 목적에 효과적인 양으로 적합하게 조합으로 존재한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 원하는 순도를 갖는 항체를, 완충제, 사카라이드, 염, 계면활성제, 가용화제, 폴리올, 희석제, 결합제, 안정화제, 염, 친유성 용액, 아미노산, 킬레이트화제, 또는 보존제 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관용으로(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), 원하는 최종 농도로 감압 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는, 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 완충제, 예를 들면, 히스티딘, 포스페이트, 시트레이트, 글리신, 아세테이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트레할로스, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN, 폴리소르베이트 80, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
완충제는 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트, 글리신 또는 아세테이트일 수 있다. 사카라이드 부형제는 트레할로스, 슈크로스, 만니톨, 말토스 또는 라피노스일 수 있다. 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 80, 또는 Pluronic F68일 수 있다. 염은 NaCl, KCl, MgCl2, 또는 CaCl2일 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 개선된 pH 제어를 제공하기 위한 완충제 또는 pH 조정제를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형은 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0, 또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9.0의 pH를 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 6.0의 pH를 갖는다. 당해 분야 숙련가는, 제형의 pH가, 일반적으로 제형 중에 사용되는 특정 항체의 등전점과 동일하지 않아야만 함을 이해한다.
전형적으로, 완충제는, 유기 또는 무기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적 완충제로는 유기산염, 예를 들면, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염; Tris, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 아미노산 구성성분은 완충 능력을 행할 수도 있다. 본 발명의 제형 중에서 완충제로서 이용될 수 있는 대표적 아미노산 구성성분으로는 글리신 및 히스티딘이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 소정 실시형태에서, 완충제는 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트, 글리신, 및 아세테이트로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 완충제는 히스티딘이다. 다른 특정 실시형태에서, 완충제는 시트레이트이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 완충제는 글리신이다. 완충제의 순도는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 99.5% 이상이어야만 한다. 본원에서 히스티딘 및 글리신과 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "순도"는, 예를 들면, 문헌[The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001)]에 기술되어 있는 바와 같은 당해 분야에서 이해되는 히스티딘 또는 글리신의 화학적 순도를 말한다.
완충제는, 전형적으로, 원하는 이온 강도 및 요구되는 완충 능력에 따라, 약 1mM 내지 약 200mM 또는 상기 이내의 임의의 범위 또는 값의 농도로 사용된다. 비경구 제형에 사용되는 종래 완충제의 통상의 농도는 문헌[Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications, Volume 1, 2nd Edition, Chapter 5, p. 194, De Luca and Boylan, "Formulation of Small Volume Parenterals", Table 5: Commonly used additives in Parenteral Products]에서 발견할 수 있다. 한 실시형태에서, 완충제는 약 1mM, 또는 약 5mM, 약 10mM, 또는 약 15mM, 또는 약 20mM, 또는 약 25mM, 또는 약 30mM, 또는 약 35mM, 또는 약 40mM, 또는 약 45mM, 또는 약 50mM, 또는 약 60mM, 또는 약 70mM, 또는 약 80mM, 또는 약 90mM, 또는 약 100mM의 농도로 존재한다. 한 실시형태에서, 완충제는 1mM, 또는 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM, 또는 60mM, 또는 70mM, 또는 80mM, 또는 90mM, 또는 100mM의 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 완충제는 약 5mM 내지 약 50mM의 농도로 존재한다. 다른 특정 실시형태에서, 완충제는 약 5mM 내지 약 20mM의 농도로 존재한다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 완충제로서 히스티딘을 포함한다. 한 실시형태에서, 히스티딘은 본 발명의 제형 중에 약 1mM 이상, 약 5mM 이상, 약 10mM 이상, 약 20mM 이상, 약 30mM 이상, 약 40mM 이상, 약 50mM 이상, 약 75mM 이상, 약 100mM 이상, 약 150mM 이상, 또는 약 200mM 이상의 히스티딘의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 1mM 내지 약 200mM, 약 1mM 내지 약 150mM, 약 1mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 200mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 히스티딘을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 제형은 약 1mM, 약 5mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 150mM, 또는 약 200mM의 히스티딘을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제형은 약 10mM, 약 25mM의 히스티딘을 포함하거나 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 탄수화물 부형제를 포함할 수 있다. 탄수화물 부형제는, 예를 들면, 점도 향상제, 안정화제, 벌킹제(bulking agent), 및/또는 가용화제 등으로서 작용할 수 있다. 탄수화물 부형제는 일반적으로 중량 또는 체적에 의해 약 1% 내지 약 99%, 예를 들면, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 15% 내지 약 20%로 존재한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 1%, 또는 1.5%, 또는 2%, 또는 2.5%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%로 존재한다.
본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제로는 모노사카라이드, 예를 들면, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 및 소르보스 등; 디사카라이드, 예를 들면, 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 및 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예를 들면, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 및 전분 등; 및 알디톨, 예를 들면, 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 및 크실리톨 소르비톨(글루시톨) 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 탄수화물 부형제는 슈크로스, 트레할로스, 락토스, 만니톨, 및 라피노스로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 트레할로스이다. 다른 특정 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 만니톨이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 슈크로스이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 탄수화물 부형제는 라피노스이다. 탄수화물 부형제의 순도는 98% 이상 또는 99% 이상, 또는 99.5% 이상이어야만 한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 트레할로스를 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 4% 이상, 약 8% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 또는 약 40% 이상의 트레할로스를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 30%, 또는 약 4% 내지 약 20%의 트레할로스를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 1%, 약 2%, 약 4%, 약 6%, 약 8%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 또는 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 4%, 약 6% 또는 약 15%의 트레할로스를 포함한다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은, 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트화제, 유화제 및 보존제로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제형은 염, 예를 들면, NaCl, KCl, CaCl2, 및 MgCl2로부터 선택되는 염을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제형은 NaCl을 포함한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 약 10mM 이상, 약 25mM 이상, 약 50mM 이상, 약 75mM 이상, 약 80mM 이상, 약 100mM 이상, 약 125mM 이상, 약 150mM 이상, 약 175mM 이상, 약 200mM 이상, 또는 약 300mM 이상의 염화 나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 제형은 약 10mM 내지 약 300mM, 약 10mM 내지 약 200mM, 약 10mM 내지 약 175mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 25mM 내지 약 300mM, 약 25mM 내지 약 200mM, 약 25mM 내지 약 175mM, 약 25mM 내지 약 150mM, 약 50mM 내지 약 300mM, 약 50mM 내지 약 200mM, 약 50mM 내지 약 175mM, 약 50mM 내지 약 150mM, 약 75mM 내지 약 300mM, 약 75mM 내지 약 200mM, 약 75mM 내지 약 175mM, 약 75mM 내지 약 150mM, 약 100mM 내지 약 300mM, 약 100mM 내지 약 200mM, 약 100mM 내지 약 175mM, 또는 약 100mM 내지 약 150mM의 염화 나트륨을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 제형은 약 10mM, 약 25mM, 약 50mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 100mM, 약 125mM, 약 150mM, 약 175mM, 약 200mM, 또는 약 300mM의 염화 나트륨을 포함할 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 또한, 아미노산, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 또는 아미노산 염을 포함할 수 있다. 제형은 약 1mM 이상, 약 10mM 이상, 약 25mM 이상, 약 50mM 이상, 약 100mM 이상, 약 150mM 이상, 약 200mM 이상, 약 250mM 이상, 약 300mM 이상, 약 350mM 이상, 또는 약 400mM 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제형은 약 1mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 25mM 내지 약 250mM, 약 25mM 내지 약 300mM, 약 25mM 내지 약 350mM, 약 25mM 내지 약 400mM, 약 50mM 내지 약 250mM, 약 50mM 내지 약 300mM, 약 50mM 내지 약 350mM, 약 50mM 내지 약 400mM, 약 100mM 내지 약 250mM, 약 100mM 내지 약 300mM, 약 100mM 내지 약 400mM, 약 150mM 내지 약 250mM, 약 150mM 내지 약 300mM, 또는 약 150mM 내지 약 400mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 1mM, 약 1.6mM, 25mM, 약 50mM, 약 100mM, 약 150mM, 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 350mM, 또는 약 400mM의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 저 AR조성물의 제형은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "계면활성제"는, 양친매성(amphipathic) 구조를 갖는 유기 물질을 말하고; 즉, 이들은, 서로 다른(opposing) 가용성 경향의 그룹들, 전형적으로는 유용성(oil-soluble) 탄화수소 쇄 및 수용성 이온 그룹으로 이루어진다. 계면활성제는 표면-활성 모이어티(moiety)의 전하에 따라, 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제로 분류할 수 있다. 계면활성제는 종종 생물학적 재료의 각종 약제학적 조성물 및 제제에 대한 습윤제, 유화제, 가용화제, 및 분산제로서 사용된다. 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴리옥사머(예를 들면, 폴리옥사머 188); Triton; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들면, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUA™ 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들면, PLURONICS™, PF68 등)와 같은 약제학적으로 허용되는 계면활성제는, 응집을 감소시키기 위해, 임의로 본 발명의 제형에 첨가할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제형은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 계면활성제는, 제형을 투여하기 위해 펌프 또는 플라스틱 컨테이너를 사용하는 경우에 특히 유용하다. 약제학적으로 허용되는 계면활성제의 존재는, 단백질이 응집되는 경향을 완화시킨다. 제형은, 약 0.001% 내지 약 1%, 또는 약 0.001% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.1% 범위의 농도로 존재하는 폴리소르베이트를 포함할 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은, 0.001%, 또는 0.002%, 또는 0.003%, 또는 0.004%, 또는 0.005%, 또는 0.006%, 또는 0.007%, 또는 0.008%, 또는 0.009%, 또는 0.01%, 또는 0.015%, 또는 0.02%의 농도로 존재하는 폴리소르베이트를 포함한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 희석제, 결합제, 안정화제, 친유성 용액, 보존제, 또는 항원보강제(adjuvant) 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 통상의 부형제 및/또는 첨가제를 임의로 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 첨가제를 본 발명의 제형에 사용할 수 있다. 통상적으로 사용되는 부형제/첨가제, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 킬레이트화제(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, EDTA, DTPA, 또는 EGTA)는 본 발명의 제형에 임의로 첨가되어 응집을 감소시킬 수 있다. 이들 첨가제는, 제형을 투여하기 위해 펌프 또는 플라스틱 컨테이너를 사용하는 경우에 특히 유용하다.
보존제, 예를 들면, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐수은 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화 마그네슘(이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 헥사하이드레이트), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 나트륨 데하이드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물은, 본 발명의 제형에, 약 0.001% 내지 약 5%, 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값과 같은 임의의 적합한 농도로 임의로 첨가할 수 있다. 본 발명의 제형에 사용되는 보존제의 농도는, 세균 효과(microbial effect)를 수득하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 보존제에 의존적이고, 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정된다.
본 발명의 제형에 이용될 수 있는 다른 고려된 부형제/첨가제로는, 예를 들면, 착향료, 항균제, 감미제, 항산화제, 정전기 방지제, 지질, 예를 들면, 인지질 또는 지방산, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 단백질 부형제, 예를 들면, 혈청 알부민(사람 혈청 알부민(HSA), 재조합 사람 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인, 및 염-형성 카운터이온(counterion), 예를 들면, 나트륨 등)이 포함된다. 본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 이들 및 추가의 공지되어 있는 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는, 예를 들면, 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005), 및 "Physician's Desk Reference", 60th ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2005)]에 열거되어 있는 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체의 투여 방식, 가용성 및/또는 안정성에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 일상적으로 선택될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 문헌["Highlights of Prescribing Information" for HUMIRA®(adalimumab) Injection (Revised Jan. 2008), 상기 문헌의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술되어 있는 바와 같이, 시판 아달리무마브(HUMIRA®) 제형 중에 존재하는 것과 동일하거나 유사한 부형제 및 완충제와 함께 제형화된다. 예를 들면, 피하 투여되는 각각의 HUMIRA®의 사전 충전된 시린지는, 대상체에게 0.8mL(40mg)의 약물 생산물을 전달한다. 각각의 0.8mL의 HUMIRA®는 40mg의 아달리무마브, 4.93mg의 염화 나트륨, 0.69mg의 일염기성 인산 나트륨 2수화물, 1.22mg의 이염기성 인산 나트륨 2 수화물, 0.24mg의 시트르산 나트륨, 1.04mg의 시트르산 1수화물, 9.6mg의 만니톨, 0.8mg의 폴리소르베이트 80, 및 주사용수, USP를 함유한다. 수산화 나트륨은 pH를 조정하기 위해 필요에 따라 첨가한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 사람 혈액과 등장성일 수 있고, 여기서, 본 발명의 제형은 필수적으로 사람 혈액과 동일한 삼투압을 가진다는 것은, 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것이다. 이러한 등장성 제형은 일반적으로 약 250mOSm 내지 350mOSm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은, 예를 들면, 증기압 또는 동결식(ice-freezing type) 삼투압계를 사용함으로써 측정할 수 있다. 제형의 장력(tonicity)은, 장력 조정제의 사용에 의해 조정된다. "장력 조정제"는, 제형의 등장성을 제공하기 위해 제형에 첨가될 수 있는, 약제학적으로 허용되는 불활성 물질이다. 본 발명에 적합한 장력 조정제로는 사카라이드, 염 및 아미노산이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 약 100mOSm 내지 약 1200mOSm, 또는 약 200mOSm 내지 약 1000mOSm, 또는 약 200mOSm 내지 약 800mOSm, 또는 약 200mOSm 내지 약 600mOSm, 또는 약 250mOSm 내지 약 500mOSm, 또는 약 250mOSm 내지 약 400mOSm, 또는 약 250mOSm 내지 약 350mOSm의 삼투압을 갖는다.
본 발명의 저 AR 조성물의 제형의, 임의의 한 구성성분 또는 각종 구성성분들의 임의의 조합의 농도는, 최종 제형의 바람직한 장력이 달성되도록 조정한다. 예를 들면, 항체에 대한 탄수화물 부형제의 비는, 당해 분야에 공지되어 있는 방법(예를 들면, U.S. 특허 제6,685,940호)에 따라 조정될 수 있다. 소정 실시형태에서, 항체에 대한 탄수화물 부형제의 몰비는, 약 1몰의 항체에 대하여 약 100몰 내지 약 1000몰의 탄수화물 부형제, 또는 약 1몰의 항체에 대하여 약 200몰 내지 약 6000몰의 탄수화물 부형제, 또는 약 1몰의 항체에 대하여 100몰 내지 약 510몰의 탄수화물 부형제, 또는 약 1몰의 항체에 대하여 약 100몰 내지 약 600몰의 탄수화물 부형제일 수 있다.
또한, 최종 제형의 바람직한 등장성은, 제형의 염 농도를 조정함으로써 달성될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염 및 장력 조정제로서 본 발명에 적합한 것들로는 염화 나트륨, 선식산 나트륨, 황산 나트륨, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 및 염화 칼슘이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은 NaCl, MgCl2, 및/또는 CaCl2을 포함한다. 한 실시형태에서, NaCl의 농도는 약 75mM 내지 약 150mM이다. 다른 실시형태에서, MgCl2의 농도는 약 1mM 내지 약 100mM이다. 장력 조정제로서 본 발명에 적합한 것들을 포함하는 약제학적으로 허용되는 아미노산으로는 프롤린, 알라닌, L-아르기닌, 아스파라긴, L-아스파르트산, 글리신, 세린, 리신, 및 히스티딘이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 내독소 및/또는 관련 발열성 물질을 실질적으로 포함하지 않는 발열원-불포함(pyrogen-free) 제형이다. 내독소로는, 미생물 내부에 국한되어 있고 미생물이 파쇄되거나 사멸하는 경우에만 방출되는 독소가 포함된다. 또한, 발열성 물질로는 세균 및 다른 미생물의 외부 막으로부터의 발열-유도성 내열성(thermostable) 물질(당단백질)이 포함된다. 이들 물질들 둘 다는, 사람에게 투여하는 경우에 발열, 고혈압 및 쇼크를 야기할 수 있다. 잠재적인 해로운 효과로 인하여, 낮은 양의 내독소라도 정맥내 투여된 약제학적 약물 용액으로부터 제거되어야만 한다. 미국 식품 의약품국("FDA")은, 정맥내 약물 적용에 대해 단 1시간의 기간 내에 체중 킬로그램당 용량당 5 내독소 단위(EU)의 상한을 설정하여 왔다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료학적 단백질이 체중 킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여되는 경우, 항체로의 경우에서와 마찬가지로, 미량의 해롭고 위험한 내독소라도 제거되어야만 한다. 소정의 특정 실시형태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10EU/mg 미만, 또는 5EU/mg 미만, 또는 1EU/mg 미만, 또는 0.1EU/mg 미만, 또는 0.01EU/mg 미만, 또는 0.001EU/mg 미만이다.
생체내 투여를 위해 사용되는 경우, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 멸균되어야만 한다. 본 발명의 제형은, 멸균 여과, 방사선조사 등을 포함하는 각종 멸균 방법에 의해 멸균될 수 있다. 한 실시형태에서, 항체 제형은, 사전 멸균된 0.22-미크론 필터로 필터-멸균된다. 주사용 멸균 조성물은, 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)]에 기술되어 있는 바와 같은 종래 약제학적 관례에 따라 제형화될 수 있다. 본원에 개시되어 있는 것과 같은 항체를 포함하는 제형은 보통 감압 동결건조된 형태로 또는 용액 중에 보관될 것이다. 항체를 포함하는 멸균 조성물은, 멸균 접속 포트(access port)를 갖는 컨테이너, 예를 들면, 정맥내 용액 백(bag) 또는 제형의 회수(retrieval)를 가능하게 하는 어댑터(adapter), 예를 들면, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스톱퍼(stopper)를 갖는 바이알 내에 위치되는 것으로 생각된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 사전-충전된 시린지로서 제공된다.
한 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은 감압 동결건조된 제형이다. 용어 "감압 동결건조된" 또는 "동결-건조된"은, 50% 이상의 수분이 제거된 감압 동결건조와 같은 건조 절차를 수행한 물질의 상태를 포함한다.
어구 "벌킹제"는, 약제학적으로 허용되고 감압 동결건조된 케이크(lyo cake)에 부피(bulk)를 더하는 화합물을 포함한다. 당해 분야에 공지되어 있는 벌킹제로는, 예를 들면, 덱스트로스, 리보스, 및 프럭토스 등과 같은 단당을 포함하는 탄수화물, 만니톨, 이노시톨 및 소르비톨과 같은 당 알콜, 트레할로스, 슈크로스 및 락토스를 포함하는 디사카라이드, 전분, 덱스트란, 키토산, 히알루로네이트, 단백질(예를 들면, 젤라틴 및 혈청 알부민), 글리코겐, 및 합성 단량체 및 중합체와 같은 천연 발생 중합체가 포함된다.
"동결건조 보호제(lyoprotectant)는, 목적하는 단백질(예를 들면, 본 발명의 항체)과 조합하는 경우, 감압 동결건조 및 후속적 보관시에 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 방지하거나 감소시키는 분자이다. 동결건조 보호제로는 당 및 이들의 상응하는 당 알콜; 아미노산, 예를 들면, 글루탐산 1나트륨 또는 히스티딘; 메틸아민, 예를 들면, 베타인; 이액(lyotropic) 염, 예를 들면, 황산 마그네슘; 폴리올, 예를 들면, 3가(trihydric) 또는 보다 높은 분자량의 당 알콜, 예를 들면, 글리세린, 덱스트란, 에리스리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; PLURONICS™; 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 동결건조 보호제의 추가의 예로는 글리세린 및 젤라틴, 당, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스 및 스타키오스가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 환원당의 예로는 글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로스, 이소-말툴로스 및 락툴로스가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 비-환원당의 예로는 당 알콜 및 다른 직쇄 다가 알콜로부터 선택되는 폴리하이드록시 화합물의 비-환원 글리코사이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 당 알콜의 예로는 모노글리코사이드, 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로스와 같은 디사카라이드의 환원에 의해 수득되는 화합물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 글리코사이드 측쇄 그룹은 글루코사이드성 또는 갈락토사이드성일 수 있다. 당 알콜의 추가의 예로는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말툴로스가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 트레할로스 또는 슈크로스는 동결건조 보호제로서 사용된다.
동결건조 보호제는, 동결건조 보호량의 동결건조 보호제의 존재 하의 단백질의 감압 동결건조 후, 단백질이 감압 동결건조 및 보관시에 필수적으로 단백질의 물리적 및 화학적 안정성 및 통합성(integrity)을 보유함을 의미하는 "동결건조 보호량"으로 동결건조-전 제형에 첨가한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 제형의 동결건조 보호제(예를 들면, 트레할로스) 및 항체 분자의 몰비는 약 10 이상, 약 50 이상, 약 100 이상, 약 200 이상, 또는 약 300 이상이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제형의 동결건조 보호제(예를 들면, 트레할로스) 및 항체 분자의 몰비는 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 50, 약 100, 약 200, 또는 약 300이다.
"재구성된" 제형은, 동결건조된 항체 제형을 희석제 중에 용해시켜 재구성된 제형 중에 항체가 분산되도록 함으로써 제조된 것이다. 재구성된 제형은, 항체로 치료되는 환자에게의 투여(예를 들면, 비경구 투여)에 적합하고, 본 발명의 소정 실시형태에서는 정맥내 투여에 적합한 것일 수 있다.
본원의 목적하는 "희석제"는, 약제학적으로 허용되고(사람에게의 투여에 대해 안전하고 비-독성이고) 액체 제형, 예를 들면 감압 동결건조 후 재구성된 제형의 제조에 유용한 것이다. 몇몇의 실시형태에서, 희석제로는 멸균수, 주사용 정균수(bacteriostatic water)(BWFI), pH 완충액(예를 들면, 포스페이트-완충된 염수), 멸균 염수 용액, 링거액, 또는 덱스트로스 용액이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 대안의 실시형태에서, 희석제는 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함할 수 있다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물의 제형은, 본 발명의 항체를 포함하는 감압 동결건조된 제형이고, 여기서, 상기 항체의 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상은, 바이알의 체적의 절반이 당해 제형으로 충전된 상기 바이알을 분당 400쉐이크(shake)의 속도로 4시간 동안 쉐이킹함에 따라 상기 바이알로부터 회수될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제형은, 본 발명의 항체를 포함하는 감압 동결건조된 제형이고, 여기서, 상기 항체의 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상은, 바이알의 체적의 절반이 상기 제형으로 충전된 상기 바이알로부터 3회의 냉동/해동 사이클을 행함에 따라 회수될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 제형은, 본 발명의 항체를 포함하는 감압 동결건조된 제형이고, 여기서, 상기 항체의 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상은, 상기 제형으로부터 생성된 감압 동결건조된 케이크를 재구성함으로써 회수될 수 있다.
한 실시형태에서, 재구성된 액체 제형은, 감압 동결건조-전 액체 제형과 동일한 농도로 항체를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 재구성된 액체 제형은, 항체를, 감압 동결건조-전 액체 제형보다 더 높은 농도로, 예를 들면, 감압 동결건조-전 액체 제형보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배 더 높은 농도로 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 재구성된 액체 제형은 본 발명의 항체를, 감압 동결건조-전 액체 제형보다 더 낮은 농도로, 예를 들면, 감압 동결건조-전 액체 제형보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배 더 낮은 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물의 약제학적 제형은 전형적으로 안정한, 예를 들면, 실온에서 안정한 제형이다.
본 발명의 항체를 포함하는 제형과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "안정성" 및 "안정한"은, 주어진 제조, 조제, 운반 및 보관 조건 하에 응집, 분해 또는 단편화에 대한 상기 제형 중의 항체의 저항성을 말한다. 본 발명의 "안정한" 제형은, 주어진 제조, 조제, 운반 및 보관 조건 하에 생물학적 활성을 보유한다. 항체의 안정성은, HPSEC, 정적 광 산란(SLS), 푸리에 변환 적외 분광법(FTIR), 원편광 2색성(CD), 요소 언폴딩 기술(urea unfolding technique), 고유의 트립토판 형광성, 시차 주사 열량계, 및/또는 ANS 결합 기술에 의해 측정시, 참조 제형에 대해 비교한 응집, 분해 또는 단편화의 정도에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 참조 제형은, PBS 중의 10mg/ML의 본 발명의 항체로 이루어진 -70℃에서 동결된 참조 표준일 수 있다.
본 발명의 저 AR 조성물의 치료학적 제형은 특정 투약을 위해 제형화될 수 있다. 투약 용법은, 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇의 분할 용량이 경시에 따라 투여될 수 있거나, 용량은, 치료학적 상황의 긴급함에 의해 나타내는 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투약 단위 형태는, 치료되는 대상체에 대해 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위들을 말하고; 각각의 단위는, 요구되는 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 생산하는 것으로 계산된 소정 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 설명은, (a) 항체의 고유한 특징 및 달성되는 특정 치료학적 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 치료를 위한 이러한 항체의 배합의 당해 분야에 내재하는 제한에 의해 구술되고, 상기 (a) 및 (b)에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 치료학적 조성물은, 경구, 비강, 폐, 국소(협측 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여와 같은 투여의 특정 경로를 위해 제형화될 수 있다. 제형은 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 약학의 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 용량형을 제조하기 위해 담체 재료와 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 치료되는 대상체, 및 투여의 특정 방식에 따라 다를 것이다. 단일 용량형을 제조하기 위해 담체 재료와 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료학적 효과를 생산하는 조성물의 양일 것이다. 한 예로서, 소정 실시형태에서, 항체(항체 단편 포함)는 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 소정의 다른 실시형태에서, 항체(항체 단편 포함)는, 예를 들면, 카테터(catheter), 스텐트(stent), 와이어(wire), 심근내 전달, 심장주위내 전달, 또는 심장 내막내 전달을 통한 심혈관계에의 국소 전달을 위해 제형화된다.
국소 또는 경피 투여에 적합한 본 발명의 저 AR 조성물의 제형으로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은, 멸균 조건 하에 약제학적으로 허용되는 담체와, 그리고, 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진제와 혼합될 수 있다(US 특허 제7,378,110호; 제7,258,873호; 제7,135,180호; 제7,923,029호; 및 US 공개 제20040042972호).
본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은, 장 및 국소 투여 이외의 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 각피하(subcuticular), 관절내, 막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본 발명의 저 AR 조성물의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은, 환자에게 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여의 방식에 대해 바람직한 치료학적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 수득되도록 변화시킬 수 있다. 선택된 용량 수준은, 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 에스테르, 염, 또는 이들의 아미드의 활성, 투여의 방식, 투여의 시점, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적 건강 및 이전 병력 포함하는 각종 약동학적 인자들, 및 의학 분야에 익히 공지되어 있는 유사한 인자들에 의존할 것이다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 항체는, 생체내에서 적절히 분포되도록 제형화될 수 있다. 예를 들면, 혈-뇌 장벽(BBB)은, 주로 고도로 친수성인 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료학적 화합물이 BBB를 가로지를 수 있음(바람직한 경우)을 확실히 하기 위해서, 이들은, 예를 들면, 리포솜 내에 제형화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서, 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,399,331호]을 참조한다. 리포솜은, 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 운송됨으로써 표적으로 하는 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol . 29:685]을 참조한다). 예시적 표적화 모이어티로는 폴레이트 또는 비오틴(예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,416,016호]을 참조한다); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res. Commun . 153:1038); 항체(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett . 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), 본 발명의 제형, 및 본 발명의 분자의 구성성분을 포함할 수 있는 다양한 종; p120(Schreier et al. (1994) J. Biol . Chem . 269:9090)이 포함되고; 또한, 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 치료학적 화합물은 리포솜 내에 제형화될 수 있고; 다른 실시형태에서, 리포솜은 표적화 모이어티를 포함한다. 다른 실시형태에서, 리포솜 내의 치료학적 화합물은, 볼루스 주사에 의해 원하는 영역에 근접한 부위에 전달된다. 이러한 방식으로 투여되는 경우, 조성물은, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동적이어야만 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정해야만 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 본 발명의 항체는, 뇌에 국소적으로 전달되어 혈뇌 장벽이 효과적인 전달을 느리게 할 위험을 완화시킬 수 있다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 저 AR 조성물은, 당해 분야에 공지되어 있는 의학적 장치로 투여할 수 있다. 예를 들면, 소정 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은, 카테터, 스텐트, 또는 와이어 등을 통해 국소적으로 투여된다. 예를 들면, 한 실시형태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은, 니들리스(needleless) 피하 주사 장치, 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 제4,596,556호]에 개시되어 있는 장치들로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 익히 공지되어 있는 이식물(implant) 및 모듈(module)의 예로는, 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식가능한 미세주입 펌프를 개시하는 U.S. Pat. 제4,487,603호; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료학적 장치를 개시하는 U.S. Pat. 제4,486,194호; 의약을 정확한 주입 속도로 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 U.S. Pat. 제4,447,233호; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능한 주입 장치를 개시하는 U.S. Pat. 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. Pat. 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 U.S. Pat. 제4,475,196호가 포함된다. 다수의 다른 이러한 이식물, 전달 시스템, 및 분자들도 당해 분야 숙련가들에게 공지되어 있다.
본 발명의 저 AR 조성물을 위한 유효 용량 및 투약 용법은, 치료되는 질환 또는 병태에 의존하고, 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 당해 분야 숙련가들 중 하나는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 이러한 인자들에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있다.
VIII. 본 발명의 저 AR 조성물을 함유하는 대안의 제형
대안의 수성 제형
또한, 본 발명은, 문헌[U.S. 특허 제8,420,081호 및 제WO2012/065072호, 상기 문헌의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술되어 있는 바와 같이, 단백질 및 물을 포함하는 수성 제형으로서 제형화된 저 AR 조성물을 제공한다. 이들 수성 제형에서, 단백질은 추가의 제제를 요구하지 않으면서 안정하다. 이러한 수성 제형은, 당해 분야의 종래 제형에 비하여, 추가의 부형제를 요구하지 않으면서 수중 단백질의 안정성, 단백질의 가용성을 유지하기 위한 추가의 부형제를 요구하지 않으면서 단백질의 증가된 농도, 및 낮은 삼투질 농도를 포함하는 다수의 이점을 갖는다. 또한, 이들은, 제형 중의 단백질이, 예를 들면, 7℃에서 또는 냉동/해동 조건에서, 심지어 높은 단백질 농도 및 반복된 냉동/해동 프로세싱 단계들에서도 액체 형태로서 보관되는 보관 동안 안정하게 유지되므로, 유리한 보관 특성을 갖는다. 한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 제형은, 수성 제형은 유의한 유광(opalescence), 응집, 또는 침전을 나타내지 않도록 높은 농도의 단백질을 포함한다.
한 실시형태에서, 단백질, 예를 들면, 항체, 예를 들면, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 물을 포함하는 수성 저 AR 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 제형은, 이들에 한정되지 않지만, 예를 들면, 낮은 전도성, 예를 들면, 약 2.5mS/cm 미만의 전도성, 약 10㎍/mL 이상의 단백질 농도, 약 30mOsmol/kg 이하의 삼투질 농도와 같은 소정 특징을 갖고/갖거나, 단백질은 약 47kDa 초과의 분자량(Mw)을 갖는다. 한 실시형태에서, 제형은, 이들에 한정되지 않지만, 연장된 시간(예를 들면, 약 3개월 이상 또는 약 12개월 이상) 동안 액체 제형 중에서의 안정성 또는 1회 이상의 냉동/해동 사이클에 걸친 안정성(더 이상의 냉동/해동 사이클이 존재하지 않는 경우)과 같은 개선된 안정성을 갖는다. 한 실시형태에서, 제형은, 동결된, 감압 동결건조된, 또는 분무-건조된 형태로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 형태로 약 3개월 이상 동안 안정하다.
한 실시형태에서, 제형은, 예를 들면, 약 2.5mS/cm 미만의 전도성, 약 2mS/cm 미만의 전도성, 약 1.5mS/cm 미만의 전도성, 약 1mS/cm 미만의 전도성, 또는 약 0.5mS/cm 미만의 전도성을 포함하는 낮은 전도성을 갖는다.
다른 실시형태에서, 제형 중에 포함된 저 AR 조성물은, 예를 들면, 약 1mg/mL 이상, 약 10mg/mL 이상, 약 50mg/mL 이상, 약 100mg/mL 이상, 약 150mg/mL 이상, 약 200mg/mL 이상, 또는 약 200mg/mL 초과의 농도를 포함하는 정해진(given) 농도를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제형은 약 15mOsmol/kg 이하의 삼투질 농도를 갖는다.
본원에 기술되어 있는 수성 제형은 표준 부형제, 예를 들면, 장력 변형제, 안정화제, 계면활성제, 항산화제, 동해 방지제(cryoprotectant), 벌킹제, 동결건조 보호제, 염기성 구성성분, 및 산성 구성성분에 의존하지 않는다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 제형은 물, 하나 이상의 단백질, 및 비이온성 부형제(예를 들면, 염, 유리 아미노산)를 함유한다.
소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 수성 제형은, 50mg/mL 이상의 단백질 농도 및 물을 포함하는 저 AR 조성물을 포함하고, 여기서, 상기 제형은 30mOsmol/kg 이하의 삼투질 농도를 갖는다. 수성 제형의 삼투질 농도의 하한도 본 발명에 포함된다. 한 실시형태에서, 수성 제형의 삼투질 농도는 15mOsmol/kg 이하이다. 본 발명의 수성 제형은 30mOsmol/kg 미만의 삼투질 농도를 가질 수 있고, 또한, 높은 단백질 농도를 갖고, 예를 들면, 단백질의 농도는 100mg/mL 이상이고, 200mg/mL 이상 만큼 존재할 수 있다. 상기 인용된 농도 및 삼투질 농도 단위의 중간인 범위는, 또한, 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한 및/또는 하한으로서 상기 열거된 값들 중 임의의 값의 조합을 이용한 값들의 범위도 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 기술되어 있는 수성 제형의 농도는 단백질 크기에 의해 한정되지 않고, 제형은 임의의 크기 범위의 단백질을 포함할 수 있다. 5kDa 내지 150kDa, 또는 그 이상의 크기 범위일 수 있는, 40mg/mL 이상 및 200mg/mL 이상만큼의 단백질, 예를 들면, 40mg/mL, 65mg/mL, 130mg/mL, 또는 195mg/ml를 포함하는 수성 제형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제형 중의 단백질은
약 15kD 이상의 크기, 약 20kD 이상의 크기; 약 47kD 이상의 크기; 약 60kD 이상의 크기; 약 80kD 이상의 크기; 약 100kD 이상의 크기; 약 120kD 이상의 크기; 약 140kD 이상의 크기; 약 160kD 이상의 크기; 또는 약 160kD 초과의 크기이다. 또한, 상기 인용된 크기의 중간인 범위는 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한 및/또는 하한으로서 상기 열거된 값들 중 임의의 값의 조합을 이용한 값들의 범위도 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 기술되어 있는 수성 제형은, 용액 중의 단백질의 수력학적 직경(hydrodynamic diameter)(Dh)을 특징으로 한다. 용액 중의 단백질의 수력학적 직경은, 단백질을 Dh를 측정하기 위한 확립된 분석적 방법인 동적 광 산란(DLS)을 이용하여 측정할 수 있다. 모노클로날 항체, 예를 들면, IgG에 대한 전형적인 값은 약 10nm이다. 저-이온성 제형은, 단백질의 Dh가, 이온성 부형제를 포함하는 단백질 제형보다 현저하게 낮다는 점에서 특성확인될 수 있다. 순수를 교환 배지로서 이용하여, 문헌[U.S. 특허 제8,420,081호]에 기술되어 있는 바와 같이 투석여과/한외여과(DF/UF) 프로세스를 이용하여 이루어진 수성 제형 중의 항체의 Dh 값은, 단백질 농도와 독립적으로 종래 제형 중의 항체의 Dh보다 현저하게 낮다. 한 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 수성 제형 중의 항체는 4nm 미만, 또는 3nm 미만의 Dh를 갖는다.
한 실시형태에서, 수성 제형 중의 단백질의 Dh는, 단백질 농도와 관계없이 완충된 용액 중의 동일한 단백질의 Dh보다 더 작다. 따라서, 소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 방법에 따라 제조된 수성 제형 중의 단백질은, 동일한 정해진 농도에서 완충된 용액 중의 단백질의 Dh보다 25% 이상 더 적은 Dh를 가질 것이다. 완충된 용액의 예로는 포스페이트 완충된 염수(PBS)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 수성 제형 중의 단백질은, 정해진 농도에서 PBS 중의 단백질의 Dh보다 50% 이상 더 적거나; 정해진 농도에서 PBS 중의 단백질의 Dh보다 60% 이상 더 적거나; 정해진 농도에서 PBS 중의 단백질의 Dh보다 70% 이상 더 적거나; 정해진 농도에서 PBS 중의 단백질의 Dh보다 70% 초과로 더 적은 Dh를 갖는다. 상기 인용된 백분율의 중간인 범위, 예를 들면, 역 55%, 56%, 57%, 64%, 및 68% 등도 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상기 인용된 값들 중 임의의 값의 조합을 상한 및/또는 하한으로서 이용한 값의 범위, 예를 들면, 약 50% 내지 약 80%도 포함되는 것으로 의도된다.
한 양상에서, 수성 제형은 단백질을 약 0.01mg/kg 내지 10mg/kg의 용량으로 포함한다. 다른 양상에서, 단백질의 용량은 격주마다 투여되는 대략 1mg/kg, 또는 매주 투여되는 대략 0.3mg/kg을 포함한다. 당해 분야 숙련가는, 대상체에게 투여하기에 적절한 용량 및 용법을 알 수 있다.
대안의 고체 단위 제형
또한, 본 발명은, 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Attorney Docket No. 117813-31001]에 기술되어 있는 바와 같이, 본원에서 고체 단위로서 나타내는, 단백질(바람직하게는 치료학적 단백질) 및 안정화제의 안정한 고체 조성물로서 제형화된 본 발명의 저 AR 조성물을 제공한다. 구체적으로, 단백질에 비하여 높은 비율의 당을 가짐에도 불구하고, 본 발명의 고체 단위는, 주위 조건, 예를 들면, 실온 및 실내 습도 하에 연장된 시간 동안 보관된 경우, 구조적 강직성(rigidity)을 유지하고 형태 및/또는 체적의 변화에 저항함이 발견되었다. 본 발명의 고체 단위는 자유-유동성(free-flowing)을 유지하고, 유의한 분해 및/또는 응집물 형성없이 단백질의 장기 물리적 및 화학적 안정성을 유지할 수 있다. 본 발명의 고체 단위는, 이들이 경구 전달을 위해 제형화될 수 있고 물과 같은 희석제 중에서 쉽게 재구성됨을 포함하여, 당해 분야에 걸쳐 다수의 이점을 갖는다. 고체 단위는 쉽게 용해되므로, 이들은 이중 챔버 전달 장치에 사용될 수 있고, 환자 사용을 위한 장치로 직접적으로 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "고체 단위"는, 약제학적 투여에 적합하고 단백질, 예를 들면, 항체 또는 펩타이드, 및 안정화제, 예를 들면, 당을 포함하는 조성물을 말한다. 고체 단위는 구조적 강직성 및 형태 및/또는 체적의 변화에 대한 저항성을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 고체 단위는, 치료학적 단백질의 약제학적 제형을 감압 동결건조시킴으로써 얻어진다. 고체 단위는, 불규칙한 형태의 단위를 포함하는 임의의 형태, 예를 들면, 구, 정육면체, 피라미드, 반구, 원통, 및 티어드롭(teardrop) 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 기하학적 형태일 수 있다. 한 실시형태에서, 고체 단위는 약 1ml 내지 약 20ml 범위의 체적을 갖는다. 한 실시형태에서, 고체 단위는 분무 건조 기술을 이용하여 수득되지 않고, 예를 들면, 고체 단위는 분말 또는 과립이 아니다.
본원에서 사용되는 어구 "다수의 고체 단위"는 고체 단위의 수집물 또는 집단을 말하고, 여기서, 수집물은 실질적으로 균일한 형태, 예를 들면, 구 및/또는 체적 분포를 갖는 2개 이상의 고체 단위를 포함한다. 한 실시형태에서, 다수의 고체 단위는 자유-유동성이다.
IX. 본 발명의 저 AR 조성물을 포함하는 키트 및 제조 물품
또한, 본 발명의 저 AR 조성물을 포함하는 키트 및 사용하기 위한 지침서는 본 발명의 범위 내이다. 본원에서 사용되는 용어 "키트"는, 질환 또는 장애를 치료하기 위해 본 발명의, 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하기 위한 구성성분들을 포함하는 패키징된 제품을 말한다. 키트는, 이의 구성성분들을 보유하는 박스 또는 컨테이너를 포함할 수 있다. 박스 또는 컨테이너에는 라벨 또는 식약청 승인 프로토콜이 부착된다. 박스 또는 컨테이너는, 플라스틱, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌, 또는 프로필렌 용기 내에 함유될 수 있는 본 발명의 구성성분들을 보유한다. 용기는 마개를 갖는 튜브(capped-tube) 또는 병일 수 있다. 또한, 키트는 본 발명의 항체를 투여하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들면, 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사성 독성제 또는 본 발명의 하나 이상의 추가 항체 (예를 들면, 제1 항-TNFα 항체와 별개인 TNFα 항원 중의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 갖는 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 키트는, 전형적으로 키트의 내용물에 대한 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은, 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 그렇지 않으면 키트에 수반되는 임의의 글, 또는 기록 물질을 포함한다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항체 단편의 액체 제형 또는 감압 동결건조된 제형으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 액체 제형으로 충전된 컨테이너는 사전-충전된 시린지이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 제형은 멸균 액체로서 단일 용량 바이알 중에 제형화된다. 예를 들면, 제형은, 1.2ml의 표적 용적을 갖는 3cc USP 타입 I 보로실리케이트 앰버 바이알(West Pharmaceutical Services - Part No. 6800-0675)에 공급될 수 있다. 임의로, 약제 또는 생물학적 생산물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로의 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영하는 경고가 이러한 컨테이너(들)와 조합될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명의 액체 제형으로 충전된 컨테이너는 사전-충전된 시린지이다. 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 사전-충전된 시린지가 본 발명의 액체 제형과 함께 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 사전-충전된 시린지는, 이들에 한정되지 않지만, 예를 들면, PCT 공개 WO05032627, WO08094984, WO9945985, WO03077976, 미국 특허 US6792743, US5607400, US5893842, US7081107, US7041087, US5989227, US6807797, US6142976, US5899889, US7699811, US7540382, US7998120, US7645267, 및 미국 특허 공개 번호 US20050075611에 기재되어 있다. 사전-충전된 시린지는 다양한 재료로 이루어질 수 있다. 한 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 유리 시린지이다. 다른 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 플라스틱 시린지이다. 당해 분야 숙련가들 중 하나는, 시린지를 제조하기 위해 사용되는 재료의 특성 및/또는 품질이 시린지 내에 보관되는 단백질 제형의 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 이해한다. 예를 들면, 시린지 챔버의 내부 표면에 부착되는 실리콘 기반 윤활제는 단백질 제형 중의 입자 형성에 영향을 미칠 수 있음이 이해된다. 한 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 실리콘 기반 윤활제를 포함한다. 한 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 베이크트 온 실리콘(baked on silicone)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 실리콘 기반 윤활제를 포함하지 않는다. 당해 분야 숙련가는, 또한, 시린지 배럴(barrel), 시린지 팁 캡(tip cap), 플런저(plunger) 또는 스토퍼(stopper)로부터 제형으로 누출되는 소량의 오염 요소들도 제형의 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 이해한다. 예를 들면, 제조 프로세스 동안 도입되는 텅스텐은 제형 안정성에 유해한 영향을 미칠 수 있음이 이해된다. 한 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 텅스텐을 500ppb 이상의 수준으로 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 저 텅스텐 시린지이다. 다른 실시형태에서, 사전-충전된 시린지는 텅스텐을 약 500ppb 내지 약 10ppb, 약 400ppb 내지 약 10ppb, 약 300ppb 내지 약 10ppb, 약 200ppb 내지 약 10ppb, 약 100ppb 내지 약 10ppb, 약 50ppb 내지 약 10ppb, 약 25ppb 내지 약 10ppb 수준으로 포함할 수 있다.
소정 실시형태에서, 또한, 세포로부터 목적하는 단백질의 정제 또는 면역침전, 목적하는 단백질의 시험관내 또는 생체내 검출을 포함하는 다양한 목적, 예를 들면, 연구 및 진단에 유용한 본 발명의 항체를 포함하는 키트가 제공된다. 목적하는 단백질의 단리 및 정제를 위해, 키트는, 비드(예를 들면, 세파로즈 비드)에 커플링된 항체를 함유할 수 있다. 목적하는 단백질을 시험관내에서, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 검출하고 정량하기 위한 항체를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품에 관해서, 키트는, 컨테이너, 및 컨테이너 상에 또는 컨테이너와 화합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 컨테이너는, 하나 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들면, 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 추가의 컨테이너가 포함될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물에 대한 상세설명뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단학적 사용을 위한 지침서를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은, 완성된 패키징되고 라벨링된 약제 제품을 포함한다. 이러한 제조 물품은, 적절한 용기 또는 컨테이너, 예를 들면, 유리 바이알, 사전-충전된 시린지 또는 용봉된 기타 컨테이너 중의 적절한 단위 용량형을 포함한다. 한 실시형태에서, 단위 용량형은, 비경구 투여에 적합한 항체를 포함하는 멸균 미립자 불포함 용액으로서 제공된다. 다른 실시형태에서, 단위 용량형은, 재구성에 적합한 항체를 포함하는 멸균 감압 동결건조된 분말로서 제공된다.
한 실시형태에서, 단위 용량형은 정맥내, 근육내, 비내, 경구, 국소 또는 피하 전달에 적합하다. 따라서, 본 발명은, 각각의 전달 경로에 적합한 멸균 용액을 포함한다. 본 발명은, 재구성에 적합한 멸균 감압 동결건조된 분말을 추가로 포함한다.
임의의 약제 제품에 관해서, 패키징 재료 및 컨테이너는 보관 및 운송 동안 제품의 안정성을 보호하도록 디자인된다. 또한, 본 발명의 제품은, 의심스러운 질환 또는 장애를 적절히 예방하거나 치료하는 방법뿐만 아니라 약제를 투여하는 방법 및 투여하는 빈도에 대해 의사, 기술자 또는 환자에게 알리는 사용 지침서 또는 다른 정보물을 포함한다. 다시 말해서, 제조 물품은, 실제 용량, 모니터링 절차 및 다른 모니터링 정보를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 투약 용법을 지시하거나 제안하는 지침 수단을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은, 패키징 재료, 예를 들면, 박스, 병, 튜브, 바이알, 컨테이너, 사전-충전된 시린지, 스프레이, 취입기(insufflator), 정맥내(i.v.) 백, 및 엔벨로프(envelope) 등; 및 상기 패키징 재료 내에 함유되는, 항체를 함유하는 액체 제형을 포함하는 약제학적 제제의 하나 이상의 단위 용량형을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 패키징 재료는, 상기 항체가, 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나 관리하기 위해 사용될 수 있는 방법을 나타내는 지침 수단을 포함한다.
본 발명은, 하기 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 임의의 방식으로 제한하도록 구성되지 않아야만 한다.
X. 실시예
실시예 1: 배지 구성성분의 첨가에 의한 세포 배양물 중의 산성 종의 정도를 감소시키는 방법
숙주 세포에 의한 재조합 단백질의 생산은, 상기 세포에 의해 생산된 단백질의 집단 중에 존재하는 생산물-관련 전하 불균질성(heterogeneity)을 초래할 수 있다. 단백질의 집단 중의 산성 종의 존재는 생산물-관련 전하 불균질성의 일례이다. 숙주 세포에 의해 생산된 단백질의 집단 중에 존재하는 산성 종의 양의 제어는, 숙주 세포의 배양 조건을 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
이러한 실시예에서의 실험들은, 아미노산, 염화 칼슘 및 니아신아미드의 보충량을 세포 배양 배지에 보충하는 것이, 배양 수거물 중의 산성 종의 양을 감소시킴으로써 생산물 품질을 개선시킴을 입증한다. 연구에 포함된 아미노산은, 염기성인 아미노산의 그룹에 속하는 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘이었다. 연구는, 진탕 플라스크 및 생물 반응기에서, 그리고, 배치식 및 유가식(fed-batch) 배양 포맷으로, 다중 세포주 및 항체로부터의 예를 포함한다. 보충물의 농도를 증가시킴에 의한 산성 종의 감소 정도의 용량 의존적 효과가 관찰되었다. 또한, 이들 배지 첨가제를 개별적으로 또는 산성 종 감소에 적합한 조합으로 보충할 가능성도 입증되었다.
재료 및 방법
세포 공급원 및 적응 배양
하기에 다루어진 연구에서 3개의 아달리무마브 생산성 세포주(세포주 1, 세포주 2, 및 세포주 3), 1개의 mAb1 생산성 세포주 및 1개의 mAb2 생산성 세포주를 사용하였다. 아달리무마브 생산성 세포주에 대해, 세포는, 110RPM(세포주 1), 180RPM(세포주 2), 140RPM(세포주 3)으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 비-배플형(non-baffled) 진탕 플라스크(Corning)와 10L 또는 20L 웨이브 백(wave bag)(GE)을 조합하여 이들의 각각의 성장 배지(화학적으로 정의된 배지(배지 1) 또는 가수분해물 기반 배지(배지 2 또는 배지 3))에서 배양하였다. 가수분해물 기반 배지(배지 3)에서의 세포를 이용한 실험을 위해, 세포를 배지 1에 해동하였고, 이어서, 몇몇의 계대(passage)에 걸쳐 배지 3에 적응시켰다. 생산 단계 배양을 개시할 수 있도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 세포주 1 및 세포주 2에 대해 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 그리고 세포주 3에 대해 36℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
mAb1 생산성 세포주에 관해서, 세포는, 130RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 비-배플형 진탕 플라스크(Corning)와 20L 웨이브 백(GE)을 조합하여 화학적으로 정의된 성장 배지(배지 1)에서 배양하였다. 생산 단계 배양을 개시할 수 있도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 36℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
mAb2 생산성 세포주에 관해서, 세포는, 140RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 비-배플형 진탕 플라스크(Corning)와 20L 웨이브 백(GE)을 조합하여 화학적으로 정의된 성장 배지(배지 1)에서 배양하였다. 생산 단계 배양을 개시할 수 있도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
세포 배양 배지
성장 및 생산 배지는, 화학적으로 정의된 배지 제형(배지 1) 또는 가수분해물-기반 배지 제형(배지 2 및 배지 3)으로부터 제조하였다. 배지 1의 제조를 위해, 배지(IVGN GIA-1, Invitrogen으로부터의 등록상표의 기본 배지)에 L-글루타민, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨, 및 메토트렉세이트 용액을 보충하였다. 생산 배지는, 메토트렉세이트를 제외한 성장 배지 중의 모든 구성성분으로 이루어졌다. 또한, 세포주 1에 대해, 성장 및 생산 배지 둘 다에 인슐린을 보충하였다. 또한, mAb1 및 mAb2 생산성 세포주에 대해, 성장 배지에 인슐린을 보충하였다.
가수분해물-기반 제형(배지 2)에 대해, 성장 배지는 PFCHO(SAFC로부터의 등록상표의 화학적으로 정의된 제형), 덱스트로스, L-글루타민, L-아스파라긴, HEPES, 폴록사머 188, 시트르산 철, 재조합 사람 인슐린, 이스톨레이트(Yeastolate)(BD), 파이톤 펩톤(BD), 일- 및 이-염기성 인산 나트륨, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨 및 메토트렉세이트로 이루어졌다. 생산 배지는, 메토트렉세이트를 제외한 성장 배지에서 열거된 모든 구성성분들로 이루어졌다.
가수분해물-기반 제형(배지 3)에 대해, 성장 배지는 OptiCHO(Invitrogen), L-글루타민, 이스톨레이트(BD), 파이톤 펩톤(BD) 및 메토트렉세이트로 이루어졌다. 생산 배지는, 메토트렉세이트를 제외한 성장 배지에서 열거된 모든 구성성분들로 이루어졌다.
실험에 사용된 아미노산은, Milli-Q 수 중에서 재구성하여 100g/L의 스톡 용액을 제조하였고, 이는 후속적으로 성장 및 생산 기본 배지 둘 다에 보충되었다. 아미노산의 첨가 후, 배지는, 5N 염산/5N NaOH를 이용하여 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 pH로 이동시켰고, 염화 나트륨의 농도를 조정함으로써 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 삼투질 농도로 이동시켰다.
실험에 사용된 염화 칼슘 2수화물(Sigma 또는 Fluka)은, Milli-Q 수 중에서 재구성하여 스톡 용액을 제조하였고, 이는 후속적으로 생산 기본 배지에 보충되었다. 염화 칼슘의 첨가 후, 배지는, 6N 염산/5N NaOH를 이용하여 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 pH로 이동시켰고, 염화 나트륨의 농도를 조정함으로써 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 삼투질 농도로 이동시켰다.
실험에 사용된 니아신아미드(Sigma 또는 Calbiochem)는, Milli-Q 수 중에서 재구성하여 스톡 용액을 제조하였고, 이는 후속적으로 생산 기본 배지에 보충되었다. 니아신아미드의 첨가 후, 배지는, 6N 염산/5N NaOH를 이용하여 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 pH로 이동시켰고, 염화 나트륨의 농도를 조정함으로써 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 삼투질 농도로 이동시켰다.
모든 배지는 Corning 1L 필터 시스템(0.22㎛ PES)을 통해 여과하였고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
Figure pct00003
생산 배양
생산 배양은 500ml 진탕 플라스크(Corning)에서 또는 3L 생물 반응기(Applikon)에서 개시하였다. 진탕 플라스크 실험의 경우, 이중 500mL Corning 통기 비-배플형 진탕 플라스크(200mL 작업 체적)를 각각의 조건에 대해 사용하였다. 상기 진탕 플라스크는, 아달리무마브 생산성 세포주 1에 대해 110rpm, 아달리무마브 생산성 세포주 2에 대해 180rpm, 아달리무마브 생산성 세포주 3에 대해 140rpm, mAb1 생산성 세포주에 대해 130rpm, 또는 mAb2 생산성 세포주에 대해 140rpm으로 설정된 쉐이커 플랫폼 상의 35℃ 또는 36℃ 및 5% CO2로 유지된 항온배양기 내에 유지하였다. 생물 반응기 실험의 경우, 3L 생물 반응기(1.5L 작업 체적)는, 35℃, 30% 용존 산소(DO), 200rpm, 3일 내에 7.1 내지 6.9의 pH 프로파일, 그 후 pH 6.9에서 실행하였다. 모든 실험에서, 세포는 1:5의 분할 비율로 씨드 트레인(seed train)으로부터 생산 단계로 이동시켰다.
배양은 배치식 또는 유가식으로 수행하였다. 배치식에서, 세포는 각각의 생산 배지에서 배양하였다. 배지 글루코스 농도가 3g/L 미만으로 감소된 경우에 1.25%(v/v)의 40% 글루코스 스톡 용액을 공급하였다. 유가식에서, 배양은, 하기 공급 스케쥴 - (4%(v/v) - 6일, 7일, 및 8일 각각)에 따라 IVGN 공급액(Invitrogen으로부터의 등록상표의 화학적으로 정의된 공급 제형)을 이용하여, 3일째에 10X Ex-Cell PFCHO 공급액(등록상표의 화학적으로 정의된 제형) - 3%(v/v)와 함께 수행하였다. 또한, 글루코스 농도가 3.0g/L 미만인 경우에 배양물에 1.25%(v/v)의 40% 글루코스 스톡 용액을 공급하였다.
2 x 1.5mL의 역가 분석(titer analysis)을 위한 보유 샘플을 8일째에 시작한 생물 반응기 실험에 대해 매일 수집하여 -80℃에서 동결시켰다. 후에 각각으로부터 취한 샘플은 역가 분석을 수행하였다.
진탕 플라스크 및 반응기의 수거 절차는, 단백질 A 정제 및 WCX-10 분석을 행하기 전에, 3,000RPM에서 30분 동안의 배양 샘플의 원심분리, 및 -80℃에서의 PETG 병에의 상청의 보관을 포함하였다.
WCX -10 검정
세포 배양 수거 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 변이체들의 정량을 위해 이 방법을 사용한다. Dionex ProPac WCX-10 분석 컬럼(Dionex, CA) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
아달리무마브 및 mAb1 샘플의 경우, 사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
mAb2 샘플의 경우, 사용된 이동상은, 20mM의 (4-모르폴리노)에탄설폰산 1수화물(MES) pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 MES, 500mM의 염화 나트륨 pH 6.5(이동상 B)였다. 최적화된 농도구배(분/%B): 0/3, 1/3, 46/21, 47/100, 52/100, 53/3, 58/3을 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 약물 제품에 상응하는 주요 피크보다 더 빠른 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를, 산성 피크로서 함께 표시한다(도 1).
메틸글리옥살( MGO ) 정량을 위한 리신-C 펩타이드 맵핑
펩타이드 맵핑을 위해 거의 보편적으로 사용되는 전형적인 트립신 소화는, 리신 및 아르기닌인 2개의 염기성 아미노산의 카르복실 측쇄에서 변성되고 환원되고 알킬화된 단백질을 개열시킨다. 메틸글리옥살(MGO)은, 아르기닌 잔기를 변형시킬 수 있는 해당작용 부산물로서 유도되는 소분자 대사물이다. 아르기닌의 변형은, 트립신이 이러한 부위를 커팅하는 것을 방지하여, 착오-개열(mis-cleavage)을 초래한다. MGO 변형된 펩타이드의 양의 정량에 대한 도전은, 등가의 비-변형된 펩타이드에 대해 비교되는 것이 아니라 오히려 변형된 펩타이드보다 다양한 이온화 잠재력을 가질 경향이 있는 2개의 모 개열된 펩타이드에 대해 비교된다는 것이다. MGO-변형된 펩타이드의 실제로 정확한 직접적 측정값을 측정하기 위해, 이는, 이의 비-변형된 대응부(counterpart)와 비교하여 백분율로서 나타내야만 한다. 엔도프로페이나제(endoproteinase) 리신-C를 대안의 효소로서 이용하면, 리신 잔기에서만 개열이 발생한다. 그 결과는, MGO 변형의 존재 및 부재 하의 동일한 펩타이드의 직접적인 비교이고, 이는, 변형된 종의 미량 수준 정량에 있어서도 높은 정확도를 제공한다.
절차: 샘플을 4mg/mL의 공칭 농도로 희석시켰다. 8M의 구아니딘-HCl을 상기 샘플에 3:1 비로 첨가하여 6M의 구아니딘-HCl 중의 1mg/mL 농도를 초래하였다. 상기 샘플을 10mM의 최종 농도 DTT로 37℃에서 30분 동안 환원시키고, 이어서, 25mM 최종 농도의 요오도아세트산으로 암소에서 37℃에서 30분 동안 알킬화시켰다. 이어서, 상기 샘플은, NAP-5 컬럼을 이용하여 10mM Tris pH 8.0으로 완충제 교환되었다. 이어서, 상기 샘플은, 1:20의 효소 대 단백질 비로 엔도프로테이나제 Lys-C를 이용하여 37℃에서 4시간 동안 소화시켰다. 상기 소화는, 각각의 샘플에 5μL의 포름산을 첨가함으로써 켄칭되었다(quenched). 샘플은 LC/MS 펩타이드 맵핑에 의해 분석하였다. 간략하게, Waters BEH C18 1.7μ 1.0 x 150mm UPLC 컬럼 상에 50μL의 샘플을 98%의 0.08% 포름산, 수중 0.02% TFA 및 2%의 0.08% 포름산, 아세토니트릴 중의 0.02% TFA와 함께 부하하였다. Waters Acquity UPLC 시스템을 이용하여 135분 내에 조성을 65%의 0.08% 포름산, 수중의 0.02% TFA 및 35%의 0.08% 포름산, 아세토니트릴 중의 0.02% TFA로 변경하였다. Thermo Scientific LTQ-Orbitrap 질량 분광계를 이용하여 용출 피크를 모니터링하였다. 비질량(specific mass) 추적(trace)은, 각각의 부위에서 MGO 변형의 총량을 정확하게 정량하기 위해, 변형된 및 비-변형된 펩타이드 둘 다에 대해 얻었다. 또한, 질량 스펙트럼은, 펩타이드 동일성을 확인하기 위해 크로마토그램의 특정 영역에 대해 분석하였다. 예시 데이터 세트는 도 162에 나타낸다.
결과
세포 배양 배지에 대한 아르기닌 보충의 효과
아르기닌의 첨가는, 다중 세포주, 배지 및 모노클로날 항체에 걸친 몇몇의 실험 시스템에서 시험하였다. 하기는, 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 2개의 상이한 아달리무마브 생산성 세포주(세포주 2 및 세포주 3)가 배양된 2개의 대표적인 실험의 상세한 설명이다.
다양한 총량의 아르기닌(1(대조군), 1.25, 1.5, 2, 3, 5, 9g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 2를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 18 내지 22 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 9g/L의 아르기닌 시험 조건으로의 샘플에서 생세포 밀도 프로파일에서 약간의 감소가 관찰되었지만, 성장 및 생존력 프로파일은, 다양한 시험 조건들 사이에 비슷하였다(도 1 및 도 2). 수거물 역가는 조건들 사이에 비슷하였다(도 3). 배양 10일째 및 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 4 및 도 5). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 10일째에 19.7%만큼 높았다. 이 실험에서 아르기닌의 총 최고 농도(9g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 12.2%로 감소되었다. 2g/L 초과의 아르기닌 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 4). 또한, 12일째 수거 샘플에서 아르기닌 증가를 갖는 산성 종의 감소에 있어서 유사한 경향이 관찰되었다(도 5). 또한, 1g/L 아르기닌 샘플 중의 산성 종의 정도는 19.7%(10일째 수거물)로부터 25.5%(12일째 수거물)로 증가하였지만, 9g/L 아르기닌 시험 조건에서의 이러한 증가는 12.2%(10일째 수거물)로부터 13.9%(12일째 수거물)로 유의하게 작았다. 따라서, 총 아르기닌의 증가는, 배양의 특정 시점에서의 총 산성 종의 정도 및 배양 시간에 따른 산성 종의 증가율의 감소를 초래하였다.
다양한 총량의 아르기닌(1(대조군), 3, 5, 7, 9g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 3을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 7 내지 10 x 106세포/ml 범위 내의 최대 VCD로 성장하였다. 9g/L의 아르기닌 조건으로의 샘플에서 생세포 밀도 및 생존력 프로파일에서 약간의 감소가 관찰되었지만, 성장 및 생존력 프로파일은, 다양한 시험 조건들 사이에 비슷하였다(도 6 및 도 7). 또한, 생산물 역가는 모든 조건들 사이에 비슷하였다(도 8). 배양 10일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 9). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 10일째에 23.3%만큼 높았다. 이 실험에서 아르기닌의 총 최고 농도(9g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 17.0%로 감소되었다. 보다 높은 아르기닌 농도를 갖는 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
화학적으로 정의된 배지 또는 가수분해물 기반 배지에서 다중 세포주를 이용하여 추가의 실험을 수행하여 이 방법의 광범위한 적용가능성을 입증하였다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정(setup)은, 상기 기술된 것과 유사하였다. 아달리무마브에 대해 수행된 다양한 실험들의 결과의 요약은 도 10, 도 11, 및 도 12에 요약된다. 또한 각각의 경우에서, 증가된 아르기닌 농도를 갖는 산성 종의 감소가 관찰되었다.
아달리무마브 이외에, 산성 종 감소를 위한 이 방법의 이용은, 또한, 다른 mAb 생산성 세포주(mAb1 및 mAb2를 생산하는 세포주들)를 포함하는 프로세스에 대해 입증되었다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은 상기 섹션에 그리고 상기 재료 및 방법에 기술된 것과 유사하였다. 각각의 mAb에 상응하는 실험에 대한 증가된 아르기닌 농도를 갖는 산성 종의 감소는 도 13 및 도 14에 요악된다. mAb2에 관해서, 9g/L의 아르기닌 농도에서 산성 종의 유의한 감소가 관찰되었다.
Attorney Docket No. 117813-74101(이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다)에서, 본 발명자들은, 리신 변이체 분포의 조정을 위해 배양 배지에의 아르기닌의 보충을 이용함을 기술한다. 전체 단백질 집단으로부터 완전하게 제거되는 산성 종의 분획화에 추가하여, 산성 종의 분획화는 또한 리신 변이체의 이동에 따라(Lys 0으로부터 Lys 1 및 Lys 2로) 이동하는 것이 가능하다. 리신 변이체의 이러한 재분포와는 독립적인 산성 종 감소를 추정하기 위해, WCX-10 전에, 아르기닌 보충 실험의 대표적인 세트로부터의 단백질 A 용출물 샘플을 효소 카복시펩티다제로 전-처리하였다. 아달리무바브 실험으로부터의 샘플의 한 세트 및 mAb2 실험으로부터의 샘플의 다른 세트를 이 분석에 사용하였다. 샘플의 카복시펩티다제 처리는, 각각의 이들 샘플 중의 Lys1/Lys2의 Lys0으로의 완전한 전환에 의해 입증되는 바와 같이 C-말단 리신 잔기의 개열을 초래하였다(본원에 데이터 나타내지 않음). 이러한 전환의 결과로서, 이들 샘플에서 정량된 산성 종은, 리신 변이체 이동에 상응하여 이전에 이동되었고, 아마도 WCX-10 전에 카복시펩티다제로 처리되지 않은 샘플에 대해 계산되지 않았을 수 있는 이들 종을 포함하는 것으로 기대되는 산성 종의 응집물 총합에 상응하였다. 증가하는 농도의 아르기닌을 갖는 카복시펩티다제 처리된 샘플에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 15 및 도 16). 이는, 본원에 기술되어 있는 산성 종 감소가 리신 변이체 재분포에 상응하는 산성 종의 가능한 이동에 완전히 기여되지 않음을 시사한다.
세포 배양 배지에의 리신 보충의 효과
리신의 첨가는, 다중 세포주, 배지 및 모노클로날 항체에 걸친 몇몇의 실험 시스템에서 시험하였다. 하기는, 아달리무마브의 생산을 위해 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 2개의 상이한 세포주(세포주 2 및 세포주 3)가 배양된 2개의 대표적 실험의 상세한 설명이다.
다양한 총 농도의 리신(1(대조군), 5, 7, 9, 11g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 2를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 17 내지 23 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 대조군 샘플에 대하여 모든 샘플에 있어서 생세포 밀도 프로파일에서의 약간의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 17). 생존력 프로파일은 조건들 사이에 비슷하였다(도 18). 배양 10일째 및 11일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 19). 모든 조건에 대한 역가는 비슷하였다. 배양 11일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 20). 대조군 중의 산성 종의 백분율은 26.5%만큼 높았다. 이 실험에서 리신의 최고 시험 농도(11g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 15.0%로 감소되었다. 보다 높은 총 리신 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
다양한 총 농도의 리신(1(대조군), 3, 5, 7, 9, 11g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 3을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 9.5 내지 11.5 x 106세포/ml 범위 내의 최대 VCD로 성장하였다. 대조군 샘플에서의 리신 농도보다 더 높은 리신 농도를 갖는 샘플에서 생세포 밀도 및 생존력 프로파일의 약간의 감소가 관찰되었지만, 성장 및 생존력 프로파일은 다양한 시험 조건들 사이에 비슷하였다(도 21 및 도 22). 배양 10일째, 11일째 및 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 23). 모든 조건에 대한 역가는 비슷하였다. 배양 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 24). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 26.6%만큼 높았다. 이 실험에서 리신의 최고 시험 농도(11g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 18.1%로 감소되었다. 보다 높은 총 리신 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
화학적으로 정의된 배지 또는 가수분해물 기반 배지에서 다중 세포주를 이용하여 추가의 실험을 수행하여 이 방법의 광범위한 적용가능성을 입증하였다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에서 기술된 것과 유사하였다. 아달리무마브에 대해 수행된 다양한 실험들의 결과의 요약은 도 25, 도 26, 및 도 27에 요약된다. 또한, 각각의 경우에서, 증가된 리신 농도를 갖는 산성 종의 감소가 관찰되었다.
아달리무마브 이외에, 산성 종 감소를 위한 이 방법의 이용은, 또한, 2개의 다른 mAb를 포함하는 프로세스에 대해 입증되었다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에 기술된 것과 유사하였다. 각각의 mAb에 상응하는 실험에 대한 리신 첨가를 갖는 산성 종의 감소는 도 28 및 도 29에 요악된다. mAb2에 관해서, 11g/L의 리신 농도에서 산성 종의 유의한 감소가 관찰되었다.
Attorney Docket No. 117813-74101(이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다)에는, 리신 변이체 분포의 조정을 위해 배양 배지에의 리신의 보충을 이용함이 기술되어 있다. 리신 변이체의 이러한 재분포와는 독립적인 산성 종 감소를 추정하기 위해, WCX-10 전에, 리신 보충 실험의 대표적인 세트로부터의 단백질 A 용출물 샘플을 효소 카복시펩티다제로 전-처리하였다. 아달리무바브 실험으로부터의 샘플의 한 세트 및 mAb2 실험으로부터의 샘플의 다른 세트를 이 분석에 사용하였다. 샘플의 카복시펩티다제 처리는, 각각의 이들 샘플 중의 Lys1/Lys2의 Lys0으로의 전환에 의해 입증되는 바와 같이 C-말단 리신 잔기의 개열을 초래하였다. 이러한 전환의 결과로서, 이들 샘플에서 정량된 산성 종은, 리신 변이체 이동에 상응하여 이전에 이동되었고, 아마도 WCX-10 전에 카복시펩티다제로 처리되지 않은 샘플에 대해 계산되지 않았을 수 있는 이들 종도 포함하는 것으로 기대되는 산성 종의 응집물 총합에 상응하였다. 보충되지 않은 샘플 중의 26.8%로부터 10g/L의 리신이 보충된 샘플 중의 21.1%로의 아달리무마브 샘플에 대해 증가하는 농도의 리신을 갖는 카복시펩티다제 처리된 샘플에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었고, 총 산성 종은 5.7%의 감소를 나타냈다(도 30). 또한, mA2 샘플에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다(도 31). 이는, 본원에 기술되어 있는 산성 종 감소가 리신 재분포에 상응하는 산성 종의 가능한 이동에 완전히 기여되지 않음을 시사한다.
세포 배양 배지에의 히스티딘 보충의 효과
히스티딘의 첨가는, 다중 세포주, 배지 및 모노클로날 항체에 걸친 몇몇의 실험 시스템에서 시험하였다. 하기는, 아달리무마브의 생산을 위해 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 2개의 상이한 세포주(세포주 2 및 세포주 3)가 배양된 2개의 대표적 실험의 상세한 설명이다.
다양한 총 농도의 히스티딘(0(대조군), 4, 6, 8, 10g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 2를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 12 내지 22 x 106세포/ml 범위 내의 최대 VCD로 성장하였다. 성장에 있어서 유의한 감소를 갖는 10g/L 히스티딘 조건으로 생세포 밀도 프로파일에서의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 32). 또한, 생존력에 대한 상응하는 효과가 관찰되었다(도 33). 배양 10일째, 11일째 및 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였고, 각각의 샘플에 대한 수거일을 보고하였다(도 34). 히스티딘 보충을 갖는 조건에 대해 역가에 있어서 소량의 용량 의존적 감소가 존재하였다. 11 내지 12일째에, 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 35). 대조군 중의 산성 종의 백분율은 26.5%만큼 높았다. 이 실험에서 히스티딘의 최고 시험 농도(10g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 15.6%로 감소되었다. 증가된 히스티딘 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
다양한 총 농도의 히스티딘(0(대조군), 2, 4, 6, 8g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 3을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 6 내지 10 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 대조군 샘플에서의 히스티딘 농도보다 더 높은 히스티딘 농도를 갖는 모든 조건에서 생세포 밀도 프로파일의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 36). 생존력 프로파일은 이러한 세포주를 이용한 조건들 사이에 더 비슷하였다(도 37). 배양 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 38). 모든 조건에 대한 역가는 비슷하였다. 배양 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 39). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 26.2%만큼 높았다. 이 실험에서 히스티딘의 최고 시험 농도(11g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 20.0%로 감소되었다. 증가된 히스티딘 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
화학적으로 정의된 배지 또는 가수분해물 기반 배지에서 다중 세포주를 이용하여 추가의 실험을 수행하여 이 방법의 광범위한 적용가능성을 평가하였다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에서 기술된 것과 유사하였다. 아달리무마브에 대해 수행된 다양한 실험들의 결과의 요약은 도 40, 도 41, 및 도 42에 제시된다. 배지 1 중의 세포주 1(도 40)로, 그리고, 배지 3 중의 세포주 2(도 42)로, 증가된 히스티딘 농도를 갖는 산성 종의 감소가 관찰되었다. 배지 3 중의 세포주 2에 관해서, 보다 높은 농도의 히스티딘에서 추가의 유의한 감소를 갖지 않는 4g/L의 히스티딘까지 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 42). 배지 2 중의 세포주 1에 관해서, 히스티딘 농도 범위(0 내지 4g/L) 내에서 산성 종의 유의한 감소는 관찰되지 않았다(도 41). 아달리무마브 이외에, 산성 종 감소를 위한 이 방법의 이용은, 또한, 2개의 다른 mAb를 포함하는 프로세스에 대해 입증되었다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에 기술된 것과 유사하였다. 각각의 mAb에 상응하는 실험에 대한 증가된 히스티딘 농도를 갖는 산성 종의 감소는 도 43 및 도 44에 요악된다. mAb2에 관해서, 이전에 나타낸 아르기닌 및 리신 보충으로 보고된 결과와는 대조적으로, 대조군에서의 28.1%로부터 4g/L 히스티딘 샘플에서의 21.5%로의 총 산성 종에 있어서 명백하게 유의한 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
Attorney Docket No. 117813-74101(이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다)에는, 리신 변이체 분포의 조정을 위해 배양 배지에 증가된 히스티딘의 이용함이 기술되어 있다. 또한, 리신 변이체의 이러한 재분포와는 독립적인 산성 종 감소를 추정하기 위해, WCX-10 전에, 히스티딘 보충 실험의 대표적인 세트로부터의 단백질 A 용출물 샘플을 효소 카복시펩티다제로 전-처리하였다. 아달리무바브 실험으로부터의 샘플의 한 세트 및 mAb2 실험으로부터의 샘플의 다른 세트를 이 분석에 사용하였다. 샘플의 카복시펩티다제 처리는, 각각의 이들 샘플 중의 Lys1/Lys2의 Lys0으로의 완전한 전환에 의해 입증되는 바와 같이 C-말단 리신 잔기의 개열을 초래하였다(본원에 데이터 나타내지 않음). 증가하는 농도의 히스티딘을 갖는 카복시펩티다제 처리된 샘플에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 45 및 도 46). 이는, 본원에 기술되어 있는 산성 종 감소가 리신 재분포에 상응하는 산성 종의 가능한 이동에 완전히 기여되지 않음을 시사한다.
세포 배양 배지에의 오르니틴 보충의 효과
오르니틴의 첨가는, 다중 세포주, 배지 및 모노클로날 항체에 걸친 몇몇의 실험 시스템에서 시험하였다. 하기는, 아달리무마브의 생산을 위해 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 2개의 상이한 세포주(세포주 2 및 세포주 3)가 사용된 2개의 대표적 실험의 상세한 설명이다.
다양한 총 농도의 히스티딘(0(대조군), 4, 6, 8, 10g/L)을 갖는 배지 1에서 세포주 2를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 15 내지 22 x 106세포/ml 범위 내의 최대 VCD로 성장하였다. 오르니틴 보충을 갖는 생세포 밀도에서의 약간의 감소가 관찰되었다(도 47). 또한, 생존력 프로파일에 있어서 상응하는 차이가 관찰되었다(도 48). 배양 11일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 49). 모든 조건에 대한 역가들은 비슷하였다. 11일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 50). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 26.5%였다. 이 실험에서 오르니틴의 최고 시험 농도(10g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 16.1%로 감소되었다. 증가된 오르니틴 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
다양한 총 농도의 오르니틴(0(대조군), 2, 4, 6, 8g/L)이 보충된 배지 1에서 세포주 3을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 9.5 내지 11.5 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 생세포 밀도 및 생존력 프로파일은 비슷하였다(도 51 및 도 52). 배양 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 53). 모든 조건에 대한 역가는 비슷하였다. 배양 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 54). 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 24.8%만큼 높았다. 이 실험에서 오르니틴의 최고 시험 농도(8g/L)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 20.5%로 감소되었다. 증가된 오르니틴 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
화학적으로 정의된 배지 또는 가수분해물 기반 배지에서 다중 세포주를 이용하여 추가의 실험을 수행하여 이 방법의 광범위한 적용가능성을 평가하였다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에서 기술된 것과 유사하였다. 아달리무마브에 대해 수행된 다양한 실험들의 결과의 요약은 도 55, 도 56, 및 도 57에 요약된다. 배지 1 중의 세포주 1에 관해서, 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 55). 그러나, 가수분해물 배지인 배지 2 중의 세포주 1에 관해서는 조건들에 대해 산성 종의 유의한 감소가 관찰되지 않았다(도 56). 배지 3 중의 세포주 2에 관해서, 보다 높은 오르니틴 농도에서 추가의 감소를 갖지 않는 2g/L 오르니틴 샘플에서 대조군 샘플에서의 22.1%로부터 18.7%로의 산성 종의 감소가 관찰되었다(도 57).
아달리무마브 이외에도, 산성 종 감소를 위한 이러한 방법의 이용은, 또한, 2개의 다른 mAb들에 관여하는 프로세스들에 대해 입증되었다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기 섹션에서 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에서 기술된 것과 유사하였다. 각각의 mAb에 상응하는 실험에 대한 오르니틴 첨가로의 산성 종의 감소는 도 58 및 도 59에 요약된다. mAb1의 경우에, 시험된 농도 범위 내에서 총 산성 종의 7.3%의 용량 의존적 감소가 관찰되었다. mAb2의 경우, 보다 높은 오르니틴 농도에서 최소의 추가의 감소를 갖는 1g/L 오르니틴 농도 샘플에서 약 2% 감소가 관찰되었다.
다른 아미노산으로 수행된 분석과 유사하게, 오르니틴 실험의 대표적 세트로부터의 단백질 A 용출물 샘플도 WCX-10 전에 효소 카복시펩티다제로 전-처리하였다. 아달리무바브 실험으로부터의 샘플의 한 세트 및 mAb2 실험으로부터의 샘플의 다른 세트를 이 분석에 사용하였다. 증가하는 농도의 오르니틴을 갖는 카복시펩티다제 처리된 샘플에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다(도 60 및 도 61). 또한, 산성 종의 백분율은, 특정 농도의 오르니틴에 대해, 처리되지 않은 샘플과 카복시펩티다제 처리된 샘플 사이에 비슷하였다. 이는, 산성 종 감소가, 임의의 리신 재분포에 상응할 수 있는 산성 종의 가능한 이동에 비의존적임을 나타낸다.
세포 배양 배지에의 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 보충의 조합의 증가 효과
이 실험에서, 산성 종 감소를 위한 4개의 아미노산 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 오르니틴의 병용이 입증된다. 본원에 기술된 실험은, 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 아달리무마브 생산성 세포주 2를 이용하여 수행하였다. 이 실험에서 아르기닌 및 리신의 농도 범위는 1 내지 3g/L였고, 한편, 이 실험에서 히스티딘 및 오르니틴에 대한 농도 범위는 0 내지 2g/L였다. 보다 낮은 농도, 또는 단일 아미노산 농도가 증가된 조건과 비교하여, 배지 중에서 아미노산의 배합물이 증가된 조건에서 총 산성 종의 추가의 감소가 관찰되었다(도 62). 배합물 중에 보다 많은 아미노산이 증가된 경우 총 산성 종에 있어서 점진적인 감소가 관찰되었다. 산성 종의 백분율은, 최저 농도 샘플 중의 21.9%로부터 4개의 아미노산들 모두가 고농도인 샘플 중의 12.3%로 감소되었다.
증가된 아르기닌 및 리신을 이용한 세포 배양 및 수거 기준의 선택 및/또는 pH의 조정을 이용한 산성 종의 제어
기본 배지 중의 아미노산(아르기닌, 리신) 농도의 증가는, 또한, 총 산성 종의 최적의 감소를 달성하기 위해 배양물을 수거하는 때의 선택과 조합할 수 있다. 이러한 예에서, 연구는, 배지 1에서 (아달리무마브를 생산하는) 세포주 1로 3L 생물 반응기에서 수행하였다. 2개의 세트의 조건들을 시험하였다: 대조군 조건(아르기닌 1g/L, 리신 1g/L); 시험 조건 1(아르기닌 3g/L, 리신 5g/L). 세포 성장, 생존력 및 역가 프로파일을 조건들 사이에 비슷하였다(도 63, 도 64, 및 도 65). 각각의 반응기로부터 4일째 내지 10일째에 매일마다 소량의 세포 배양 수거물을 수집하여, 단백질 A 정제 및 WCX-10 분석을 수행하였다. 대조군 조건에서의 산성 종의 백분율은 12.1%(4일째)로부터 24.6%(10일째)로 증가하였다(도 66). 시험 조건 1에서의 산성 종의 백분율은, 각각의 상응하는 배양일에서의 대조군 조건에서 관찰된 것보다 더 낮았다. 또한, 시험 조건에서의 산성 종의 백분율도 8.7%(4일째)로부터 18.8%(10일째)로 증가하였다. 또한, 배양 지속기간에 따른 산성 종의 증가율은 두 조건에 대한 생존력의 강하와 상호관련되었고, 8일째에 급격하게 증가하였다. 따라서, 배양 배지 중의 아르기닌 및 리신 농도를 증가시킴과 함께, 수거일의 선택/수거 생존률의 선택을 함께 사용하여 바람직한 산성 종의 감소를 달성할 수 있다.
기본 배지 중의 아미노산(아르기닌, 리신) 농도의 증가는, 총 산성 종의 추가의 감소를 달성하기 위해 프로세스 pH 조정과 함께 조합할 수 있다. 이러한 예에서, 연구는, 배지 1에서 (아달리무마브를 생산하는) 세포주 1로 3L 생물 반응기에서 수행하였다. 3개의 세트의 조건들을 이중으로 시험하였다: 대조군 조건(아르기닌(1g/L), 리신(1g/L), 3일 내에 pH 7.1→6.9, 그 후 pH 6.9); 시험 조건 1(아르기닌(3g/L), 리신(3g/L), 3일 내에 pH 7.1→6.9, 그 후 pH 6.9); 시험 조건 2(아르기닌(3g/L), 리신(3g/L), 3일 내에 pH 7.1→6.8, 그 후 pH 6.8). 대조군과 비교하여, 조건 2에 대해 VCD 프로파일 및 수거 역가에서 약간의 감소가 관찰되었다(도 67, 도 68 및 도 69). 생존력이 50% 미만이었을 때 배양물을 수거하였고, 배양 수거물에 단백질 A 및 WCX-10 분석을 수행하였다. 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 19.1%였다. 산성 종의 백분율은 시험 조건 1에서 14.3%로, 그리고, 시험 조건 2에서 12.8%로 감소되었다(도 70). 따라서, 이는, 보다 낮은 최종 프로세스 pH의 선택과 함께 아미노산 농도의 증가는 산성 종의 정도를 추가로 감소시키기 위해 조합하여 사용될 수 있음을 입증한다.
세포 배양 배지에의 CaCl 2 의 보충 효과
염화 칼슘의 첨가는, 다중 세포주, 배지 및 모노클로날 항체에 걸친 몇몇의 실험 시스템에서 시험하였다. 하기는, 아달리무마브의 생산을 위해 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 2개의 상이한 세포주(세포주 2 및 세포주 3)가 배양된 2개의 대표적 실험의 상세한 설명이다.
다양한 농도의 칼슘(0.14, 0.84 및 1.54mM)을 갖는 배지 1에서 세포주 2를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 22 내지 24.5 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 모든 시험 조건에 대한 생세포 밀도 및 생존력 프로파일은 비슷하였다(도 71 및 도 72). 배양 10일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다(도 73). 모든 조건에 대한 역가들은 비슷하였다. 10일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 74). 0.14mM 칼슘 조건에서의 산성 종의 백분율은 23.8%였다. 이 실험에서 칼슘의 최고 시험 농도(1.54mM)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 21.6%로 감소되었다. 증가된 칼슘 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
다양한 총 농도의 칼슘(0.14, 0.49, 0.84, 1.19, 1.54, 1.89mM)을 갖는 배지 1에서 세포주 3을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 9.5 내지 10.5 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 모든 시험 조건에 대한 생세포 밀도 및 생존력 프로파일은 비슷하였다(도 75 및 도 76). 배양 11일째에, 역가 분석을 위해 샘플을 수집하였다. 모든 조건에 대한 수거 역가들은 비슷하였다(도 77). 11일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 78). 0.14mM 칼슘 조건에서의 산성 종의 백분율은 23.7%였다. 이 실험에서 칼슘의 최고 시험 농도(1.89mM)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 20.7%로 감소되었다. 증가된 칼슘 농도를 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
화학적으로 정의된 배지 또는 가수분해물 기반 배지에서 다중 세포주를 이용하여 추가의 실험을 수행하여 이 방법의 광범위한 적용가능성을 평가하였다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기에 그리고 상기 재료 및 방법 섹션에서 기술된 것과 유사하였다. 아달리무마브에 대해 수행된 다양한 실험들의 결과의 요약은 도 79, 도 80, 및 도 81에 요약된다. 또한, 각각의 경우에 칼슘 농도가 증가된 산성 종의 감소가 관찰되었다.
아달리무마브 이외에도, 산성 종 감소를 위한 이러한 방법의 이용은, 또한, 2개의 다른 mAb들에 관여하는 프로세스들에 대해 입증되었다. 이들 실험의 각각에 대한 실험 설정은, 상기에 기술된 것과 유사하였다. 각각의 mAb에 상응하는 실험에 대한 오르니틴 첨가로의 산성 종의 감소는 도 82 및 도 83에 요약된다. mAb1의 경우에, 15.4%(0.14mM 칼슘 샘플)로부터 11.8%(1.54mM 염화 칼슘 보충된 샘플)로의 작지만 유의한 산성 종 감소가 관찰되었다. mAb2의 경우, 28.9%(0.14mM 칼슘 샘플)로부터 23.1%(1.40mM 염화 칼슘 보충된 샘플)로의 보다 큰 산성 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
아르기닌, 리신, 염화 칼슘, 니아신아미드의 조합으로의 농도 증가 효과
이 실험에서, 산성 종 감소를 위한 아미노산 아르기닌, 리신, 무기염 염화 칼슘 및 비타민 니아신아미드의 병용 효과가 평가되었다. 본원에 기술된 실험은, 3%(v/v) PFCHO(SAFC로부터의 적절하게 화학적으로 정의된 배지 제형)가 보충된 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 (아달리무마브를 생산하는) 세포주 2를 이용하여 수행하였다. 이 실험에서 중심적 복합체 DOE 실험 설계(central composite DOE experimental design)을 사용하였다. 각각의 조건에 대한 기본 배지에는 다양한 농도의 4개의 보충물들이 보충되었다. 각각의 조건에 대해 이중으로 세포 배양을 수행하였다. 수거시, 단백질 A 정제 후 WCX-10 분석을 수행하였다. 하기 표 4에, 보충된 각각의 구성성분의 농도, 및 각각의 조건에 대해 수득된 총 산성 종(또는 AR) %를 포함하는 DOE 설계로부터의 실험 조건들이 요약된다. 이들 구성성분들의 조합으로의 증가된 농도에 걸쳐 산성 종의 감소가 관찰되었다. 예를 들면, 4개의 구성성분들 모두가 이들의 최대 농도로 존재한 조건(#24)에서, 총 AR %는 9.7%로 감소된 것으로 보고되었다. 상기 실험으로부터의 데이터를 이용하여, AR 감소를 위한 배지에의 이들 구성성분들의 첨가 효과를 예측하는 모델(R2: 0.92, P<0.0001)이 도 84에 기술되어 있다. 상기 모델은, 산성 종 감소에 대한 각각의 4개의 구성성분들로부터의 기여를 예측하였다. 또한, 총 AR의 표적 감소를 달성하기 위해, 이러한 모델을 이용하여 배지에 대한 이들 다양한 구성성분들의 농도의 선택을 예측하는 것도 가능할 수 있다.
Figure pct00004
산성 종 감소를 위한 세포 배양 배지에의 니아신아미드 보충의 사용
이전 섹션에 기술되어 있는 다른 보충물과의 조합으로의 니아신아미드의 사용 이외에, 또한, 2개의 mAb: 아달리무마브 및 mAb1에 대한 하기 실험에서 입증되는 바와 같이 다른 보충물과 독립적으로 니아신아미드 첨가를 사용할 수 있다.
아달리무마브에 상응하는 실험을 위해, 다양한 양의 니아신아미드(0, 0.2, 0.4, 0.8 및 1.6mM)가 보충된 배지 1에서 세포주 1을 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 8.5 내지 11 x 106세포/ml 범위 내의 최대 VCD로 성장하였다. 최대 니아신 보충(이 실험의 경우 1.6mM)으로 생세포 밀도 프로파일에서 약간의 감소가 관찰되었다(도 85). 시험 조건들에 대한 생존력 프로파일은 비슷하였다(도 86). 배양 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플들을 수집하였다. 모든 조건에 대한 역가들은 비슷하였다(도 87). 11일째 및 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 88 및 도 89). 대조군 샘플(니아신아미드 보충 부재) 중의 산성 종의 백분율은 10일째에 19.6%였다. 이 실험에서 니아신아미드의 최고 시험 농도(1.6mM)를 갖는 10일째 샘플에서, 산성 종의 백분율은 15.9%로 감소되었다. 보다 높은 아르기닌 농도를 갖는 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다. 12일째 샘플에서 니아신아미드 보충으로 유사한 산성 종 감소가 관찰되었다.
mAb2에 상응하는 실험을 위해, 다양한 양의 니아신 아미드(0, 0.1, 0.5, 1.0, 3.0 및 6.0mM)가 보충된 배지 1에서 mAb2 생산성 세포주를 배양하였다. 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 글루코스 공급만을 갖는 배치 포맷으로 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 세포는, 시험되는 다양한 조건에 대해 14 내지 21.5 x 106세포/ml 범위 내의 최대 생세포 밀도(VCD)로 성장하였다. 3.0mM 및 6.0mM 니아신아미드 농도로의 조건에 대해 생세포 밀도 프로파일에서 약간의 감소가 관찰되었다(도 90). 모든 시험 조건에 대한 생존력 프로파일은 비슷하였다(도 91). 배양 12일째에, 역가 분석을 위해 샘플들을 수집하였다(도 92). 모든 조건에 대한 역가들은 비슷하였다. 12일째에, 각각의 조건에 대해 이중 진탕 플라스크를 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다(도 93). 대조군 샘플(니아신아미드 보충 부재) 중의 산성 종의 백분율은 27.0%였다. 이 실험에서 니아신아미드의 최고 시험 농도(6.0mM)를 갖는 샘플에서, 산성 종의 백분율은 19.8%로 감소되었다. 니아신아미드 보충을 갖는 시험 조건에서 산성 종의 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
항체의 메틸글리옥살( MGO ) 변형의 감소를 위한 세포 배양 배지에의 염기성 아미노산 아르기닌 및 리신의 보충
이 실험에서, 산성 종 감소에 대한 MGO 변형의 효과를 조사하였다. 하기 기술되는 바와 같은 아미노산들이 보충된 화학적으로 정의된 배지(배지 1)에서 아달리무마브 생산성 세포주 1을 배양하였다.
재료 및 방법
세포 공급원 및 적응 배양
세포는, 110RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 비-배플형 진탕 플라스크(Corning)와 10L 또는 20L 웨이브 백(GE)을 조합하여 이들 각각의 성장 배지(화학적으로 정의된 배지(배지 1))에서 배양하였다. 생산 단계 배양을 개시하도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 36℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
세포 배양 배지
배지 1의 제조를 위해, 배지(IVGN GIA-1, Invitrogen으로부터의 등록상표의 기본 배지 제형)에 L-글루타민, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨, 및 메토트렉세이트 용액을 보충하였다. 생산 배지는, 메토트렉세이트를 제외한 성장 배지 중의 모든 구성성분으로 이루어졌다. 또한, 성장 및 생산 배지 둘 다에 인슐린을 보충하였다.
실험에 사용된 아미노산(아르기닌(Sigma, A8094) 및 리신(Calbiochem, 4400))은, Milli-Q 수 중에서 재구성하여 100g/L의 스톡 용액을 제조하였고, 이는 후속적으로 성장 및 생산 기본 배지 둘 다에 보충되었다. 아미노산의 첨가 후, 배지는, 6N 염산/5N NaOH를 이용하여 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 pH로 이동시켰고, 염화 나트륨의 농도를 조정함으로써 보충되지 않은(대조군) 배지와 유사한 삼투질 농도로 이동시켰다.
모든 배지는 Corning 1L 필터 시스템(0.22㎛ PES)을 통해 여과하였고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
생산 배양은 3L 생물 반응기(Applikon)에서 개시하였다. 생물 반응기 실험의 경우, 3L 생물 반응기(1.5L 작업 체적)는, 35℃, 30% DO, 200rpm, 7.1의 pH 설정점에서 실행하였다. 세포는 1:5의 분할 비율로 씨드 트레인으로부터 생산 단계로 이동시켰다.
배양은 배치식 또는 유가식으로 수행하였고, 각각의 생산 배지(아르기닌(4g/L) 또는 리신(4g/L)가 보충된 배지 1)에서 배양하였다. 배지 글루코스 농도가 3g/L 미만으로 감소된 경우에 1.25%(v/v)의 40% 글루코스 스톡 용액을 공급하였다.
2 x 1.5mL의 역가 분석(titer analysis)을 위한 보유 샘플을 8일째에 시작하여 매일 수집하여 -80℃에서 동결시켰다. 후에 각각으로부터 취한 샘플은 역가 분석을 수행하였다.
진탕 플라스크 및 반응기의 수거 절차는, 단백질 A 정제 및 WCX-10 분석을 행하기 전에, 3,000RPM에서 30분 동안의 배양 샘플의 원심분리, 및 -80℃에서의 PETG 병에의 상청의 보관을 포함하였다.
WCX -10 검정
상기 재료 및 방법 섹션에 상기 기술되어 있는 바와 같은 WCX-10 검정 방법을 사용하였다.
MGO 정량을 위한 리신-C 펩타이드 맵핑
MGO 정량을 위한 리신-C 펩타이드 맵핑을 위한 절차는, 상기 재료 및 방법 섹션에 상기 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다.
결과 및 논의
배양물의 대다수는, 9 내지 10 x 106세포/mL의 범위 내의 유사한 피크 VCD로 성장하였다(도 94A). 또한, 배양물의 생존력 프로파일은 10 내지 25%의 수거 생존력과 비슷하였다. 배양 지속기간(10일)은 조건들 사이에 유사하였다(도 94B).
단백질 A 정제 후 수거 샘플에 대해 WCX-10을 이용하여, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다. 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 36.5%였다. 아르기닌 및 리신이 보충된 배양물로부터의 샘플에서 총 산성 종의 백분율은 각각 20.1% 및 28.0%로 감소되었다(도 94C). 또한, 이들 배양물에서 AR1 %의 유의한 감소가 관찰되었다: 대조군 샘플에서의 16.8%로부터 7.3%(아르기닌 보충된 배양물) 및 12.8%(리신 보충된 배양물)(도 94C). 또한, MGO 변형의 정도는, Lys-C 펩타이드 맵핑을 이용하여 정량하였고, MGO 변형에 보다 민감성인 것들 중에서 MGO 변형된 펩타이드의 백분율로서 보고되었다. 이들 결과로부터, 아미노산들이 보충된 배양물에서 MGO 변형 %도 유의하게 감소되었음이 밝혀진다(도 94D).
실시예 2: 프로세스 매개변수를 조정함으로써 세포 배양물 중의 산성 종의 정도를 감소시키는 방법
본 실시예에서 하기 기술되는 실험들은, 세포 배양 프로세스 매개변수를 온-라인(on-line) 변경하는 것을 이용하여 목적하는 단백질, 예를 들면, 항체 아달리무마브 또는 mAb2의 산성 종을 조정하고/하거나 감소시킬 수 있음을 입증한다. 예를 들면, 증가된 용존 산소 농도 및/또는 최종 pH의 감소는 AR의 감소를 초래할 수 있다.
재료 및 방법
세포 공급원 및 적응 배양
본 실시예에서 다루어진 연구에서 2개의 아달리무마브 생산성 CHO 세포주(세포주 1 및 세포주 3), 및 1개의 mAb2 생산성 세포주를 사용하였다. 해동시, 아달리무마브 생산성 세포주 3은, 140RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 진탕 플라스크와 20L 웨이브 백을 조합하여 화학적으로 정의된 성장 배지(배지 1)에서 배양하였다. 생산 단계 배양을 개시할 수 있도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 36℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
해동시, 아달리무마브 생산성 세포주 1은, 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 110RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 진탕 플라스크와 20L 웨이브 백을 조합하여 가수분해물 기반 성장 배지(배지 2)에서 배양하였다. 몇몇의 경우, 배양물은 pH 7.1, 35℃ 및 30% DO의 씨드 반응기(seed reactor)에 이동시킬 수 있다. 생산 단계 배양을 개시하기 전에 1개 또는 2개의 계대로 7 내지 13일 동안 10L 또는 20L 웨이브백에서 증식시킴으로써 배지 1 또는 배지 2에 대해 배양물을 적응시킬 수 있다.
해동시, mAb2 생산성 세포는, 140RPM으로의 쉐이커 플랫폼 상의 통기 비-배플형 진탕 플라스크(Corning)와 20L 웨이브 백(GE)을 조합하여 배지 1에서 배양하였다. 생산 단계 배양을 개시할 수 있도록 하는 세포의 요구되는 수를 얻기 위해, 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양물을 증식시켰다.
세포 배양 배지
배지 1, 화학적으로 정의된 성장 또는 생산 배지는 기본 IVGN CD 배지(등록상표 제형)로부터 제조되었다. IVGN CD 배지 제형의 제조를 위해, 등록 상표 배지에 L-글루타민, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨, 및 메토트렉세이트 용액을 보충하였다. 생산 배지는, 메토트렉세이트를 제외한 성장 배지 중의 모든 구성성분으로 이루어졌다. 또한, 세포주 1 및 mAb2에 대해, 배지에 인슐린을 보충하였다. 또한, 세포주 3 또는 1에 대해 각각 생산 배지에 10mM 또는 5mM의 갈락토스(Sigma, G5388) 및 0.2μM 또는 10μM의 망간(Sigma, M1787)을 보충하였다. 염화 나트륨의 농도에 의해 삼투질 농도를 조정하였다. 모든 배지는 필터 시스템(0.22㎛ PES)을 통해 여과하였고, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
배지 2는, 기본 등록상표 배지, Bacto TC Yeastolate 및 Phytone Peptone을 함유하는 가수분해물 기반 배지이다.
생산 배양
생산 배양은 3L 생물 반응기(Applikon)에서 개시하였다. 3L 생물 반응기(1.5 내지 2.0L 작업 체적)는, 35℃, 30% DO(용존 산소), 200rpm, 3일 내에 7.1 내지 6.9의 pH 프로파일, 그 후 pH 6.9에서 실행하였다. 모든 실험에서, 세포는 1:5.6의 분할 비율(1:5의 비율로의 mAb2 제외)로 웨이브 백으로부터 생산 단계로 이동시켰다. 배지 글루코스 농도가 3g/L 미만으로 감소된 경우에 대략 1.25%(v/v)의 40% 글루코스 스톡 용액을 공급하였다.
반응기의 수거 절차는, 단백질 A 정제 및 WCX-10 분석을 행하기 전에, 3,000RPM에서 30분 동안의 배양 샘플의 원심분리, 및 -80℃에서의 PETG 병에의 상청의 보관을 포함하였다.
WCX-10 검정
세포 배양 수거 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 변이체들을 정량하였다. Dionex ProPac WCX-10 분석 컬럼(Dionex, CA) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 아달리무마브 생산성 세포주의 경우, Shimadzu LC10A HPLC 시스템을 HPLC로서 사용하였다. 사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다. mAb B에 대해 사용된 WCX-10 방법은 다양한 완충액을 사용하였다. 사용된 이동상은, 20mM의 (4-모르폴리노) 에탄설폰산 1수화물(MES) pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 MES, 500mM의 염화 나트륨 pH 6.5(이동상 B)였다. 최적화된 농도구배(분/%B): 0/3, 1/3, 46/21, 47/100, 52/100, 53/3, 58/3을 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 약물 제품에 상응하는 주요 피크보다 더 빠른 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를, 산성 피크로서 함께 표시한다.
결과
세포주 1을 이용한 배지 1에서의 프로세스 pH의 효과
본 연구에서 5개의 상이한 pH 조건들을 평가하였다: 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 및 6.7. 배양은 7.1의 pH 설정점에서 시작하였고, 이어서, 4일 내에 표적 pH 설정점으로 감소시켰다. 최대 세포 밀도가 다른 배양물보다 훨씬 더 낮은 pH 6.7 조건에서의 배양을 제외한 모든 배양물들은 8일째에 동일한 최대 생세포 밀도에 도달하였다(도 95). 또한, pH 7.1 및 pH 7.0에서의 배양의 생존력은 다른 배양물보다 훨씬 빠르게 강하되었다. pH 7.1 및 pH 7.0에서의 배양의 생존력은 10일째에 각각 38% 및 54%였고; 한편, 보다 낮은 pH(pH 6.9, 6.8 및 6.7 포함)에서의 배양의 생존력은 동일한 날에 70%를 초과하였다(도 96). 배양 마지막 날에 채취한 샘플을 IgG 농도에 대해 측정하였다. 각각의 시험 조건의 역가는, pH의 감소에 상응하여 pH 7.1 조건에서의 1.2g/L로부터 pH 6.8 조건에서의 1.8g/L로 증가하였지만, 생산물 역가는 pH 6.7에서 계속해서 증가하지 않았다(1.6g/L)(도 97). 배양물은 10일째에 또는 12일째에 수거하였다. 수거물은 단백질 A 정제하였고, 이어서, WCX-10을 이용하여 분석하였다. WCX-10 분석으로부터 얻어진 피크 면적을 정량하였다(도 98). 산성 종의 백분율은, pH의 감소에 상응하여 pH 7.1 조건에서의 56.0%로부터 pH 6.7 조건에서의 14.0%로 감소되었다. pH 6.9, 6.8 및 6.7에서의 배양물이 10일째에 70% 생존력으로 존재하였으므로, 생존력이 약 50%에 도달하였을 때에 이들 배양에 대해 12일째에 추가의 샘플을 채취하였다. 또한, 이들 샘플들에 대해 WCX-10 분석을 수행하였다. 12일째의 산성 종의 백분율은, 이들 3개의 조건들(즉, pH 6.9, 6.8 및 6.7)에 대해 10일째와 비교하여 증가하였지만; 산성 종의 백분율의 증가는 보다 낮은 pH에서 더 작았다. 산성 종의 백분율은, 각각 10일째(70% 생존력) 내지 12일째(50% 생존력)에 18.8%(pH 6.9), 8.1%(pH 6.8) 및 3.5%(pH 6.7)로 증가하였다. 따라서, 산성 종의 백분율은 12일째에도 보다 낮은 pH에서 더 낮았다. 산성 종 백분율은, pH 6.9 조건에서의 39.1%로부터 pH 6.7 조건에서의 17.5%로 12일째에 총 21.6%의 감소로 pH의 감소에 따라 감소되었다.
또한, 총 산성 종의 보다 큰 분획 내의 특정 산성 변이체를 특이적으로 감소시키는 프로세스 pH의 효과를 평가하였다. 표 5에, 산성 종 분획의 몇몇의 아-종의 정도의 요약을 제시하였다. 총 산성 종의 감소와 함께, 이 섹션에서 제시된 방법도, AR1, AR2 및 MGO 변형된 생산물 변이체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 아-종의 감소를 위해 사용할 수 있다.
Figure pct00005
세포주 1을 이용한 배지 2에서의 프로세스 pH의 효과
본 연구에서 3개의 상이한 pH 조건들을 평가하였다: 7.0, 6.9, 및 6.8. 배양은 7.1의 pH에서 시작하였고, 이어서, 배양 3일 내에 표적 pH 설정점으로 감소시켰다. 8일째까지 상이한 pH 설정점에 걸친 생세포 밀도 및 생존력은 비슷하였다. 8일째 후, 생세포 밀도 및 생존력은, 보다 낮은 pH 설정점에서 약간 더 높았다(도 99 및 도 100). 약 50% 생존력에서 배양물을 수거하였다. 생산물 역가는, pH 6.9 및 7.0에 비하여 pH 6.8에서 약간 더 높았다(도 101). WCX-10 분석으로부터 얻어진 피크 면적을 정량하였다(도 102). 산성 종의 백분율은, pH 7.0 조건에서의 20.7%로부터 pH 6.8 조건에서의 18.1%로 총 2.6%의 감소로 감소되었다.
세포주 3을 이용한 배지 1에서의 프로세스 pH의 효과
본 연구에서 5개의 상이한 pH 조건들을 평가하였다: 7.1, 7.0, 6.9, 6.8, 및 6.7. 배양은 7.1의 pH 설정점에서 시작하였고; 이어서, 배양 4일 내에 표적 pH 설정점으로 감소시켰다. 이러한 세포주 및 배지를 이용한 pH 설정점은 세포 성장 및 생존력에 대한 유의한 효과를 나타냈다. 세포 밀도는, 보다 높은 pH에서 더 낮았고, 생존력도, 보다 높은 pH에서 더 빠르게 강하되었다(도 103 및 도 104). 10일째에 또는 생존력이 50% 이하로 강하되었을 때에 세포를 수거하였다. pH가 감소됨에 따라 역가는 약간 증가하였고, pH 6.8 조건에서 가장 높은 역가에 도달하였다(도 105). WCX-10 분석으로부터 얻어진 피크 면적을 정량하였다(도 106). 산성 종의 백분율은, pH 7.1 조건에서의 29.7%로부터 pH 6.7 조건에서의 21.5%로 총 8.2%의 감소로 감소되었다.
35℃에서 세포주 1을 이용한 배지 2에서의 용존 산소(DO)의 효과
본 연구에서 3개의 상이한 용존 산소(DO) 조건들을 평가하였다: 20%, 30%, 및 50%. 배양은 35℃로 설정하였다. 세포 밀도 및 생존력은, 상이한 DO 조건들에서 매우 비슷하였다(도 107 및 도 108). 각각의 조건에 대해 50%의 표적 생존력에서 배양물을 수거하였다. 수거 역가는, 20% DO에 비하여 50% DO에서 더 높았다(도 109). 또한, 수거물은 WCX-10 분석 전에 단백질 A 정제를 행하였다. 각각의 시험 조건들에서 산성 종의 백분율은 각각 20.6%(20% DO), 19.0%(30% DO), 및 17.7%(50% DO)였다(도 110). 산성 종의 백분율은 일반적으로 보다 높은 용존 산소 농도에서 더 낮았다. 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 20.6%로부터 50% DO 조건에서의 17.7%로 총 2.9%의 감소로 감소되었다.
33℃에서 세포주 1을 이용한 배지 2에서의 용존 산소(DO)의 효과
본 연구에서 3개의 상이한 DO 조건들을 평가하였다: 20%, 30%, 및 60%. 세포 밀도, 생존력 및 생산물 역가는, 상이한 DO 조건들에서 매우 비슷하였다(도 111, 도 112, 및 도 113). 각각의 시험 조건들에서 산성 종의 백분율은 각각 20.1%(20% DO), 17.8%(30% DO), 및 17.7%(60% DO)였다(도 114). 산성 종의 백분율은 일반적으로 보다 높은 용존 산소 농도에서 더 낮았다. 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 20.1%로부터 60% DO 조건에서의 17.7%로 총 2.4%의 감소로 감소되었다.
35℃에서 세포주 1을 이용한 배지 1에서의 용존 산소(DO)의 효과
본 연구에서 3개의 상이한 용존 산소(DO) 조건들을 평가하였다: 20%, 30%, 및 50%. 배양은 35℃로 설정하였다. 세포 밀도 및 생존력은, 상이한 DO 조건들에서 매우 비슷하였다(도 115 및 도 116). 각각의 조건에 대해 40%의 표적 생존력에서 배양물을 수거하였다. 수거 역가는, 20% DO에 비하여 30% 및 50% DO에서 더 높았다(도 117). 또한, 수거물은 WCX-10 분석 전에 단백질 A 정제를 행하였다. 각각의 시험 조건들에서 산성 종의 백분율은 각각 23.9%(20% DO), 22.4%(30% DO), 및 20.3%(50% DO)였다(도 118). 산성 종의 백분율은 일반적으로 보다 높은 용존 산소 농도에서 더 낮았다. 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 23.9%로부터 50% DO 조건에서의 20.3%로 총 3.6%의 감소로 감소되었다.
세포주 3을 이용한 배지 1에서의 용존 산소(DO)의 효과
본 연구는 2개의 상이한 DO 조건들(20% DO 및 50% DO)을 갖는 4개의 상이한 온도 수준(33℃, 34℃, 35℃ 및 36℃)에서 수행하였다. 일반적으로, 상이한 용존 산소 수준에서의 세포 성장은, 세포 밀도가 50% DO에서 더 낮았던 35℃에서의 성장을 제외하고는 유사하였다(도 119). 10일째에 또는 약 50% 생존력에서 배양물을 수거하였다(도 120). 약 50% 생존력에서의 역가는 상이한 DO 조건들에서 비슷하였다(도 121). 산성 종의 백분율은, 일반적으로 각각의 시험 온도 조건에서 보다 높은 용존 산소에서 더 낮았다(도 122). 10일째에, 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 25.2%로부터 50% DO 조건에서의 22.7%로 감소되었고, 이는 2.5%의 감소이며; 산성 종의 백분율은, 35℃에서 DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 23.2%로부터 50% DO 조건에서의 19.4%로 총 3.8%의 감소로 감소되었고; 산성 종의 백분율은, 34℃에서 DO 증가에 따라 20% DO 조건에서의 18.2%로부터 50% DO 조건에서의 17.1%로 총 1.1%의 감소로 감소되었고, 산성 종의 백분율은, 33℃에서 DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 14.3%로부터 50% DO 조건에서의 12.9%로 총 1.4%의 감소로 감소되었다. 12일째에, 34℃ 시험 조건들에 대해 생존력이 약 50%였을 때, 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 21.5%로부터 50% DO 조건에서의 20.6%로 총 0.9%의 감소로 감소되었다. 마지막으로, 14일째에, 33℃ 시험 조건들에 대해 생존력이 약 50%였을 때, 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 19.7%로부터 50% DO 조건에서의 17.9%로 총 1.8%의 감소로 감소되었다. 요약하면, 상이한 수거일에 대한 모든 시험 온도 조건에서, 산성 종 백분율은 보다 높은 용존 산소 농도에서 더 낮았다.
mAb2 를 갖는 배지 1에서의 용존 산소(DO)의 효과
6개의 상이한 DO 조건들을 평가하였다: 10%, 20%, 30%, 50%, 60% 및 80%. 배양은 35℃로 설정하였다. 일반적으로, 세포 밀도, 생존력, 및 역가는, 상이한 용존 산소 조건들에서 비슷하였다(도 123, 도 124 및 도 125). 각각의 시험 조건들에서 산성 종의 백분율은 각각 26.5%(10% DO), 27.3%(20% DO), 27.3%(30% DO), 25.8%(50% DO), 24.4%(60% DO) 및 24.5%(80% DO)였다(도 126). 산성 종의 백분율은 일반적으로 보다 높은 용존 산소 농도에서 더 낮았다. 산성 종의 백분율은, DO의 증가에 따라 20% DO 조건에서의 27.3%로부터 80% DO 조건에서의 24.5%로 총 2.8%의 감소로 감소되었다.
실시예 3: 정화된 세포 배양 수거물에 아미노산을 첨가함으로써, 그리고 정화된 수거물의 pH를 변화시킴으로써 산성 종을 감소시키는 방법
본 실시예는, 항체 제제 중의 산성 종의 수준을 감소시키고 제어하기 위한 프로세스를 기술한다. 구체적으로, 본 실시예는, 정화된 수거물 중의 산성 변이체 함량을 감소시키는 방법, 및 정화된 수거물 중의 산성 종의 형성률(formation rate)을 감소시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은, 정화된 수거물에 각종 아미노산과 같은 첨가제를 첨가하거나, 산성 물질을 이용하여 정화된 수거물의 pH를 조정함을 포함한다.
하기에 나타낸 바와 같이, 정화된 수거물 중의 항체 산성 종은, 정화된 수거물에 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 첨가제를 각각 100mM 및 50mM보다 더 많은 농도로 첨가함으로써 감소될 수 있다. 또한, AR 감소는, 정화된 수거물을 pH 6 또는 pH 5로 pH 조정함으로써 달성될 수 있다. 또한, 산성 변이체 형성률은, 농도 의존적 방식으로의 아르기닌 또는 히스티딘의 사용을 통해, 또는 정화도니 수거물의 저 pH 처리에 의해 감소될 수 있다.
재료 및 방법
정화된 수거물 재료
하기 기술되는 이하 실험들에서 아달리무마브 정화된 수거물 재료의 상이한 배치들을 사용하였다. 정화된 수거물은, 목적하는 조성물, 예를 들면, 큰 고체 입자를 제거하기 위한 원심분리, 및 재료로부터 보다 미세한 고체 입자 및 불순물을 제거하기 위한 후속적 여과를 행한 후 발효 생물 반응기로부터 추출된, 목적하는 모노클로날 항체를 함유하는 액체 재료이다. 정화된 수거물은, 본원에 기술되어 있는 저 pH 처리 연구에 사용하였다. 또한, 정화된 수거물은, 정화된 수거물 중의 산성 종의 존재에 대한 아미노산 농도의 효과를 연구하기 위한 실험에, 그리고, 본원에 기술되어 있는 산형(acid type)-pH 처리 연구에도 사용하였다. 본원에 기술되어 있는 산성 종의 존재에 대한 아미노산의 효과를 연구하기 위한 실험 및 저 pH 처리 연구를 위해 mAb-B 및 mAb-C 정화된 수거물 재료의 상이한 배치들을 사용하였다.
재료의 제조
우선, 정화된 수거물 재료는, 3M 시트르산을 이용하여 pH 4로 조정하였다. 이어서, pH 4의 재료를, 3M 수산화 나트륨으로 5, 6, 또는 7의 표적 pH로 pH 조정하기 전에 60분 동안 교반하였다. 이어서, 상기 재료를 추가의 60분 동안 교반하였다. 이어서, 샘플은, SLA-3000 원심분리기 보울(centrifuge bowl)을 갖는 Sorvall Evolution RC에서 7300xg로 15분 동안 원심분리를 행하였다. 이어서, 원심분리된 재료로부터 얻어진 상청은, B1HC 심층 필터(Millipore), 이어서, 0.22㎛ 멸균 필터를 이용하여 심층 여과하였다. 이어서, 상이한 pH의 여과물들을, 산성 변이체의 형성률을 평가하기 위해 상이한 시간 동안 보유하였다. 상기 보유 후, 단백질 A 친화성 컬럼으로 상기 재료를 정제하였고, 용출물을 샘플링하였고, WCX-10 방법을 이용하여 분석하였다. 제조 스킴은 하기 도 127에 나타낸다.
산성 종에 대한 아르기닌의 효과를 연구하기 위한 재료를 2개의 방식으로 제조하였다. 5mM, 10mM, 30mM 및 100mM의 보다 낮은 표적 아르기닌 농도를 위해, 이들은, 필요로 하는 표적 아르기닌 농도를 얻기 위해 pH 7(아세트산으로 조정된 pH)에서 적절한 양의 0.5M 아르기닌 스톡 완충액을 첨가함으로써 제조되었다. 50mM, 100mM, 300mM, 500mM, 760mM, 1M 및 2M의 보다 높은 표적 아르기닌 농도를 위해, 이들은, 표적 아르기닌 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 아르기닌(고체)을 첨가하고, 후속적으로 빙초산을 이용하여 7의 최종 pH로 적정함으로써 제조되었다. 제조 방법이 상이한 효과를 초래할 수 있는지를 측정하기 위해 2개의 방법을 이용하여 아르기닌을 100mM의 최종 농도로 조정하였다. 모든 실험에 대해, 아르기닌 첨가 후 처리된 정화된 수거물을, 표시된 지속기간 동안 실온에 보유하였고, 이어서, 단백질 A 컬럼으로 정제하였고, 산성 변이체를 분석하였다. 이러한 연구는 2개의 결과를 제공하였다: (1) 0일째로부터의 샘플의 데이터는, 정화된 수거물 중의 산성 종 감소에 대한 아르기닌의 효과를 제공하였고, (2) 상이한 보유일을 갖는 샘플들의 데이터는, 산성 종의 형성률 감소에 대한 아르기닌의 효과를 제공하였다. 제조 스킴은 도 128에 나타낸다.
히스티딘의 효과를 연구하기 위한 재료를 5mM, 10mM, 30mM, 50mM, 100mM, 200mM 및 250mM의 표적 농도로 제조하였다. 표적 히스티딘 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 히스티딘(고체)을 첨가하고, 후속적으로 빙초산을 이용하여 7의 최종 pH로 적정함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플 제조 스킴은 도 129에 나타낸다.
리신의 효과를 연구하기 위한 재료를 5mM, 10mM, 30mM, 50mM, 100mM, 200mM, 300mM, 500mM 및 1000mM의 표적 농도로 제조하였다. 표적 리신 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 리신 하이드로클로라이드(고체)를 첨가하고, 후속적으로 염산을 이용하여 7의 최종 pH로 적정함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플 제조 스킴은 도 130에 나타낸다.
메티오닌의 효과를 연구하기 위한 재료를 5mM, 10mM, 30mM, 50mM, 100mM, 200mM 및 300mM의 표적 농도로 제조하였다. 표적 메티오닌 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 메티오닌(고체)을 첨가하고, 후속적으로 빙초산을 이용하여 7의 최종 pH로 적정함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플 제조 스킴은 도 131에 나타낸다.
상이한 아미노산의 효과를 연구하기 위한 재료를, 평가되는 각각의 20개의 아미노산들뿐만 아니라 아미노산 대신에 아세트산 나트륨을 이용한 2개의 대조군, 및 간단히 빙초산을 이용하여 정화된 수거물의 pH를 pH 7로 감소시킨 다른 것들에 대해 상이한 표적 농도로 제조하였다. 아미노산에 대한 표적 농도는 하기 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
표 6에 나타낸 표적 아미노산 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 아미노산(고체)을 첨가하고, 후속적으로 빙초산을 이용하여 7의 최종 pH로 정제함으로써 샘플을 제조하였다. 샘플 제조 스킴은 도 132에 나타낸다.
아미노산 이외의 다른 첨가제들의 효과를 연구하기 위한 재료를, 평가되는 각각의 첨가제들뿐만 아니라 아르기닌 대신에 수산화 나트륨을 사용하여 재료의 pH를 pH 10으로 한 후 이를 빙초산으로 pH 7로 다시 중화시킨 대조군에 대해 상이한 표적 농도로 제조하였다. 첨가제들에 대한 표적 농도는 하기 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
표 6 또는 표 7에 나타낸 표적 아미노산 농도를 얻기 위해 샘플에 적절한 양의 첨가제를 첨가하고, 후속적으로 빙초산을 이용하여 7의 최종 pH로 적정함으로써 샘플을 제조하였다.
도 133에 나타낸 하기 스킴을 이용하여, CDM 정화된 수거물에 대한 상기 언급된 방법들의 효과를 연구하기 위한 재료를 제조하였다.
상기 언급된 방법들의 효과를 연구하기 위해 mAb B 가수분해물 정화된 수거물을 이용하였다.
상기 언급된 방법들의 효과를 연구하기 위해 mAb C 가수분해물 정화된 수거물을 이용하였다.
처리된 정화된 수거물에 대한 보유 연구
상기 언급된 샘플 제조 후, 4℃에서 또는 실온에서 보유(holding)할 목적으로 샘플을 별도의 멸균 스테인리스 스틸 컨테이너에 넣었다. 각각의 재료에 대해, 평가된 보유의 각각의 날에 대해 상이한 컨테이너를 사용하였다. 산성화된 샘플에 대해, 상기 온도들 중 어느 하나에서의 보유의 0, 3, 7 및 14일째에 샘플의 산성 변이체 조성물을 평가하였다. 아르기닌 함유 재료에 대해, 실온에서의 보유의 0, 5 및 8일째에 샘플의 산성 변이체 조성물을 평가하였다. 히스티딘 함유 재료에 대해, 실온에서의 보유의 0, 3 및 7일째에 샘플의 산성 변이체 조성물을 평가하였다.
산형 및 정화된 수거물에 대한 pH 효과
본 연구에서 산성 변이체 감소에 대한 산형, 정화된 수거물 pH 및 아르기닌 함량의 효과를 평가하였다. 연속한 3일에 걸쳐 삼중으로 0mM(아르기닌 첨가하지 않음) 또는 500mM의 표적 아르기닌 농도로의 샘플을 제조하였고, 이어서, 빙초산, 인산, 3M 시트르산 또는 6M 염산을 이용하여 5, 6 또는 7의 표적 pH 값으로 적정하였다. 500mM의 표적 아르기닌 농도를 얻기 위해 정화된 수거물에 2M 아르기닌 아세테이트 pH 7 스톡 완충액을 첨가함으로써 하나의 다른 샘플을 제조하였다. 샘플 제조 스킴은 도 134에 나타낸다.
단백질 A 정제
부하 수지 L당 10g의 아달리무마브의 5mL의 rProtein A FF Hitrp 컬럼(GE Healthcare)을 이용하고 3.4mL/분의 유속으로 작동시켜 샘플의 단백질 A 정제를 수행하였다. 5개의 컬럼 체적(CV)의 평형화(1X PBS pH 7.4)에 이어서 샘플을 부하하고, 이어서, 상기 컬럼을 평형화 완충액으로 세척하여 비-특이적으로 결합된 불순물을 제거하고, 이어서, 0.1M 아세트산, 0.15M 염화 나트륨으로 단백질을 용출시킨다.
용출물 샘플을 수집하고, 수집 후 45분 내지 75분에 1M Tris pH 9.5를 이용하여 pH 6.9 내지 7.2로 중화시켰다. 이어서, 샘플을 -80℃에서 1일 이상 동안 동결시킨 후 해동시켜 WCX-10 분석을 수행하였다.
정화된 수거물에 대한 정제 방법, 산 농축 및 중화의 효과
본 연구에서 산성 변이체 감소에 대한 상이한 유형의 크로마토그래피 수지를 이용한 정제 방법, 산 농축 및 pH 중화의 효과를 평가하였다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 이하 샘플을 제조하였다.
Figure pct00008
이어서, 제조된 각각의 재료를 Mabselect Sure 또는 Fractogel S 포획을 이중으로 행하였다. 용출물 샘플을 수집하고, 수집 후 45분 내지 75분에 1M Tris pH 9.5를 이용하여 pH 6.9 내지 7.2로 중화시켰다. 이어서, 샘플을 -80℃에서 1일 이상 동안 동결시킨 후 해동시켜 WCX-10 분석을 수행하였다.
산성 변이체 분석( WCX -10 검정)
5mm x 250mm Dionex ProPac WCX-10 분석 컬럼(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. Shimadzu LC10A HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 검정을 수행하였다. 사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 우세한 리신 0 피크의 체류 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를, 산성 변이체 피크(AR)로서 함께 표시한다.
결과
후속적 중화를 이용한 저 pH 처리의 효과
저 pH 처리 및 후속적 중화의 결과는 하기 도 135 및 도 136에 나타낸다. 도 136은, 저 pH 처리 및 pH 5 또는 6으로의 후속적 중화가 시간에 따른 산성 변이체 형성률을 감소시킴을 보여준다. 그러나, 도 135에 나타낸 바와 같이 초기 산성 변이체 함량의 유의한 감소는 없다.
아르기닌 처리의 효과
아르기닌 처리의 결과는 도 137 및 도 138에 나타낸다. 도 137 및 도 138은, 샘플 제조 방법이, 정제된 수거물 중의 산성 종의 상이한 수준을 초래하였음을 보여준다. 0.5M 아르기닌 pH 7 스톡 완충액의 첨가는 산성 종을 증가시키는 경향이 있고, 한편, 순수한 아르기닌의 첨가 및 pH 7로의 후속적 아세트산 적정은 100mM보다 더 큰 아르기닌 농도로 산성 변이체를 감소시켰다. 또한, 2개의 100mM 아르기닌 샘플들을 비교하는 경우에 처리방법으로 인한 효과가 입증되고, 이는 2개의 방법 사이에 산성 변이체의 1%의 절대차(absolute difference)를 나타낸다.
도 139는, 산성 변이체 형성률이, 정화된 수거물 중의 아르기닌 농도의 증가에 따라 감소함을 보여주고, 500mM 아르기닌의 주위 농도 또는 그 이상에서 안정상태(plateauing)이다. 그러나, 샘플 제조의 2개의 방법은 유의하게 상이한 산성 변이체의 형성률을 초래하지 않는다.
히스티딘 처리의 효과
히스티딘 처리의 결과는 도 140 및 도 141에 나타낸다. 아르기닌 처리 효과와 유사하게, 도 149에 나타낸 바와 같이, 정화된 수거물에 히스티딘을 첨가하고, 후속적으로 아세트산으로 pH 중화시킨 경우, 산성 변이체는, 50mM보다 높은 히스티딘 농도로 감소되었다. 도 141은, 산성 변이체 형성률이, 정화된 수거물 중의 히스티딘 농도의 증가에 따라 감소함을 보여주고, 200mM 히스티딘의 주위 농도 또는 그 이상에서 안정상태이다.
리신 처리의 효과
리신 처리의 결과는 도 142 및 도 143에 나타낸다. 아르기닌 처리 효과와 유사하게, 도 149에 나타낸 바와 같이, 정화된 수거물에 리신을 첨가하고, 후속적으로 아세트산으로 pH 중화시킨 경우, 산성 변이체는, 약 1% 또는 그 이상 유의하게 감소되었다. 도 153은, 산성 변이체 형성률이, 정화된 수거물 중의 리신 농도의 증가에 따라 감소함을 보여준다.
메티오닌 처리의 효과
메티오닌 처리의 결과는 도 154 및 도 165에 요악된다. 아르기닌 처리 효과와 유사하게, 도 149에 나타낸 바와 같이, 정화된 수거물에 메티오닌을 첨가하고, 후속적으로 아세트산으로 pH 중화시킨 경우, 산성 변이체는, 10mM 초과의 농도에서 약 1% 또는 그 이상 유의하게 감소되었다. 도 145는, 산성 변이체 형성률이, 정화된 수거물 중의 메티오닌 존재에 의해 유의하게 영향을 받지 않음을 보여준다.
다른 아미노산 처리의 효과
각종 아미노산으로의 처리 결과는 하기 도 146 및 도 147에 요약된다. 도 146에 나타낸 바와 같이, 아르기닌, 히스티딘, 리신 및 메티오닌을 포함하는 14개의 아미노산의 첨가는, 정화된 수거물 중의 보다 낮은 양의 산성 변이체 함량을 초래하였다. 또한, 아세트산 나트륨의 첨가 또는 아세트산의 사용은 산성 변이체 함량의 감소도 야기하였다. 도 147은, 산성 변이체 형성률이, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 및 류신을 포함하는 몇몇의 아미노산에 의해 감소됨을 보여준다.
대안의 첨가제 처리의 효과
다른 첨가제로의 처리 결과는 하기 도 148 및 도 149에 요약된다. 도 148에 나타낸 바와 같이, 임의의 첨가제의 첨가는, 아달리무마브 가수분해물 정화된 수거물 중의 보다 낮은 산성 변이체 함량을 초래하지 않았다. 그러나, 도 149는, 산성 변이체 형성률이 대부분의 첨가제에 의해 감소됨을 보여준다.
아달리무마브 CDM 정화된 수거물에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과
CDM 정화된 수거물 연구의 결과는 하기 도 150 및 도 151에 요약된다. 도 150에 나타낸 바와 같이, 저 pH/아르기닌 처리는, 아달리무마브 CDM 정화된 수거물 중의 보다 낮은 산성 변이체 함량을 초래하지 않았다. 그러나, 도 151은, 산성 변이체 형성률이 모든 처리에 의해 유의하게 감소됨을 보여준다.
mAb B 가수분해물 정화된 수거물에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과
mAb B 가수분해물 정화된 수거물 연구의 결과는 하기 도 152 및 도 153에 요약된다. 도 152 및 도 153에 나타낸 바와 같이, 저 pH/아르기닌 처리는, mAb B 가수분해물 정화된 수거물에서 보다 낮은 산성 변이체 함량 및 보다 느린 산성 변이체 형성률 둘 다를 초래한다.
mAb C 가수분해물 정화된 수거물에 대한 저 pH/아르기닌 처리의 효과
mAb C 가수분해물 정화된 수거물 연구의 결과는 하기 도 154 및 도 155에 요약된다. 도 154 및 도 155에 나타낸 바와 같이, 저 pH/아르기닌 처리는, mAb C 가수분해물 정화된 수거물에서 보다 낮은 산성 변이체 함량 및 보다 느린 산성 변이체 형성률 둘 다를 초래한다.
산형 및 pH의 효과
산형-pH 연구로부터 얻어진 결과는 도 156에 요약된다. 보다 큰 산성 종 감소는 보다 낮은 pH에서 얻어진다. 또한, 아르기닌 첨가는 산성 종 함량을 추가로 감소시키지만, 사용된 고농도(500Mm)를 고려하는 경우 유의한 정도로 감소시키는 것은 아니다. 또한, 상기 결과는, 후속적 산 적정으로 순수한 아르기닌 분말을 이용하는 것은 약간 더 우수하게 수행되지만, 아르기닌 아세테이트 스톡 완충액의 사용으로 약 1%의 산성 종 감소가 달성될 수 있음을 보여준다. pH 조정에 사용된 산형과 관련하여, 관찰된 상이한 산들 사이에 유의한 차이는 존재하지 않았다.
정제 방법, 산 농축 및 중화의 효과
당해 연구로부터 얻어진 결과는 도 157, 도 158, 도 159, 및 도 160에 요약된다. 도 157 및 도 158은, 사용된 산이 보다 높은 농도로 존재하는 경우, 사용되는 보다 낮은 농도의 산에 비하여 가수분해물 정화된 수거물 중의 산성 변이체 함량의 감소가 존재함을 나타낸다. 도 159 및 도 160은, 정화된 수거물이 낮은 pH로 처리된 후에 pH 7로 염기 중화되는 경우, 산성 변이체 함량의 증가가 존재함을 보여준다. 또한, 상기 도면들은 Fractogel 수지가 Mabselect Sure보다 산성 변이체를 더 잘 제거할 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 연속적 배지 관류 기술을 이용하여 세포 배양물 중의 AR을 감소시키는 방법
상기 실시예 3에서 입증된 바와 같이, 단백질의 집단 중의 산성 종의 생성 또는 형성은, 정화된 수거물 또는 소비된 배지 중의 항체의 보유 동안에 발생할 수 있다. 따라서, 생성물 항체의 안정성 향상 가능성 및 산성 종 생성의 감소 가능성은 연속적/관류 기반 세포 배양 기술을 이용하여 탐구되었다. 세포 배양의 종료시에 얻어지는 단백질 집단 중에 존재하는 산성 종의 양의 제어 또는 감소는, 생물 반응기에의 신선한 배지의 교환 속도(생물 반응기로부터의 생성물 항체로 소비된 배지의 제거)를 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
재료 및 방법
세포 공급원
여기에서 다루어진 연구에서 하나의 아달리무마브 생산성 CHO 세포주(세포주 1)를 사용하였다. 해동시, 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 110rpm으로의 쉐이커 플랫폼 상의 일련의 통기 진탕 플라스크 내의 화학적으로 정의된 성장 배지(배지 1)에서 바이알을 배양하였다. 배양물을 증식시켜 관류 컬티백(perfusion cultibag)의 접종에 충분한 수의 세포를 수득하였다.
세포 배양 배지
본 연구에서 화학적으로 정의된 성장 또는 생산 배지를 사용하였다. 배지 제형의 제조를 위해, 적절한 배지(Invitrogen)에 L-글루타민, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨, 재조합 사람 인슐린 및 메토트렉세이트 용액을 보충하였다. 관류 단계 배지는, 보다 높은 농도의 재조합 사람 인슐린의 제외하고 메토트렉세이트 용액을 배제하고는 성장 배지 중의 모든 구성성분으로 이루어졌다.
관류 배양
Sartorius Cultibag RM 10L perfusion pro 1.2my(로트 1205-014) 관류 백에서의 Sartorius BIOSTAT RM 20 광학 관류 시스템(SN# 00582|12)으로 관류 배양을 수행하였다. 1.5L의 작업 배양 체적 및 pH 7.00, 용존 산소 30%, 25rpm, 35℃, 0.3slpm의 에어 오버레이(air overlay) 및 15sccm의 CO2 오버레이의 구동 조건으로 관류 백을 실행하였다. 배양 3일째에 pH 제어를 개시하였다. 0.5M 수산화 나트륨 및 CO2 첨가로 pH를 제어하였다.
관류 컬티백에 통합된 통합(integrated) 1.2㎛ 필터를 통해, 소비된 배양물을 '수거'함으로써 관류를 수행하였다. 수거와 동일한 속도로 공급 라인을 통해 배양물에 신선한 배지를 첨가하였다. 관류는 프로세스 4일째에 1.0교환/일(ex/일)로 시작하였다. 관류 속도는, 글루코스 요구, 락테이트 축적 및 샘플링 계획에 맞추어 조정되었다. 관류 5 내지 6일째에 관류 세포-불포함 수거 샘플을 1.5, 3.0 및 6.0교환 체적/일로 수집하였다. 각각의 수거 샘플에 대해 신선한 수거 백을 사용하였다. 이어서, 단백질 A를 이용하여 샘플을 정제하였고, WCX-10 검정을 이용하여 분석하였다.
관류 배양은 프로세스 8일째에 종료되었다.
WCX -10 검정
세포 배양 수거 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체를 정량하였다. Dionex ProPac WCX-10 분석 컬럼(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다. mAb2 샘플에 사용된 WCX-10 방법은 상이한 완충액을 사용하였다. 사용된 이동상은 20mM의 (4-모르폴리노) 에탄설폰산 1수화물(MES) pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 MES, 500mM의 염화 나트륨 pH 6.5(이동상 B)였다. 최적화된 농도구배(분/%B): 0/3, 1/3, 46/21, 47/100, 52/100, 53/3, 58/3을 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다. 정량은 상기 기술된 바와 같이 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다.
결과
관류 기술의 사용 및 산성 종에 대한 배지 교환 속도의 선택의 효과
배지 1에서 아달리무마브 생산성 세포주 1을 배양하였고, 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같이 배양을 수행하였다. 표 8에 기술되어 있는 바와 같이, 교환 속도를 5일 내지 6일 사이의 24시간의 기간에 걸쳐 변경시켜 산성 종의 정도에 대한 배지 교환 속도의 영향을 탐구하였다. 소비된 배지 중의 생성물 항체를, 17hrs의 기간에 걸쳐 1.5체적/일의 연속적 배지 교환 속도로 수거 백에 수집하였다. 이어서, 상기 수거 백을 새로운 백으로 교환하였고, 이전 백을 4℃로 이동시켰다. 후속적으로 그리고 계속하여, 배지 교환 속도를 3 내지 6체적/일로 증가시켰고, 생성 수거물은 각각 5 및 2hrs의 시간에 걸쳐 수집하였다. 4℃로 하룻밤 유지한 후, 3개의 수거 샘플을 단백질 A를 통해 프로세싱하였고, WCX-10을 이용하여 산성 종에 대해 분석하였다. 1.5체적/일의 배지 교환 속도에 따라 샘플 중의 산성 종의 백분율은 8.1%였다. 이러한 실험에서 시험된 최고 교환 속도에 따른 샘플에서, 산성 종의 백분율은 6%로 감소되었다. 산성 종 중의 교환 속도 의존적 감소는 3개의 샘플에서 관찰되었다(표 9). 산성 변이체(AR1 및 AR2) 내에서의 상이한 아-종의 감소도 알려졌다. 교환 속도에 따른 체적 생산성의 증가도 관찰되었다.
Figure pct00009
실시예 5: 연속적 관류 기술의 사용 및 배양 배지에의 아미노산의 첨가를 통한 산성 종 감소 방법
상기 실시예 4에 제시된 바와 같이, 세포 배양의 종료시에 얻어지는 단백질의 집단 내에 존재하는 산성 종의 양의 감소는, 생물 반응기에의 신선한 배지의 교환 속도를 변형시킴으로써 (또는 생물 반응기로부터 생성물 항체를 이용하여 소비된 배지의 제거함으로써) 달성할 수 있다. 본 실시예에서, 배양 배지에의 염기성 아미노산(아르기닌 및 리신)의 보충과 조합하여 높은 배지 교환 속도의 사용을 통해 산성 종을 추가로 감소시키는 능력이 기술된다.
재료 및 방법
세포 공급원
아달리무마브 생산성 CHO 세포주(세포주 1)를 사용하였다. 해동시, 35℃, 5% CO2 항온배양기에서 110rpm으로의 쉐이커 플랫폼 상의 일련의 통기 진탕 플라스크 내의 화학적으로 정의된 성장 배지(배지 1)에서 바이알을 배양하였다. 배양물을 증식시켜 관류 컬티백의 접종에 충분한 수의 세포를 수득하였다.
세포 배양 배지
본 연구에서 화학적으로 정의된 성장 또는 생산 배지를 사용하였다. 배지 제형의 제조를 위해, 적절한 배지(Invitrogen)에 L-글루타민, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨, 재조합 사람 인슐린 및 메토트렉세이트 용액을 보충하였다. 관류 단계 배지는, 보다 높은 농도의 재조합 사람 인슐린의 제외하고 메토트렉세이트 용액을 배제하고는 성장 배지 중의 모든 구성성분으로 이루어졌다. 아르기닌 및 리신은 분말로서 배지 용액에 직접 첨가하였다. 아미노산 첨가 후, 필요에 따라 5N NaOH 및 5N HCL을 이용하여 pH를 보충되지 않은 배지의 pH로 조정하였고, 염화 나트륨의 농도를 변화시킴으로써 삼투질 농도를 보충되지 않은 배지의 삼투질 농도로 조정하였다.
관류 배양
Sartorius Cultibag RM 10L perfusion pro 1.2my(로트 1205-014) 관류 백에서의 Sartorius BIOSTAT RM 20 광학 관류 시스템(SN# 00582|12)으로 관류 배양을 수행하였다. 1.5L의 작업 배양 체적 및 pH 7.00, 용존 산소 30%, 25rpm, 35℃, 0.3slpm의 에어 오버레이 및 15sccm의 CO2 오버레이의 구동 조건으로 관류 백을 실행하였다. 배양 3일째에 pH 제어를 개시하였다. 0.5M 수산화 나트륨 및 CO2 첨가로 pH를 제어하였다.
관류 컬티백에 통합된 통합 1.2㎛ 필터를 통해, 소비된 배양물을 '수거'함으로써 관류를 수행하였다. 수거와 동일한 속도로 공급 라인을 통해 배양물에 신선한 배지를 첨가하였다. 관류 속도는, 실행 동안에 글루코스 요구, 락테이트 축적 및 샘플링 계획에 맞추어 조정되었다. 관류 6 내지 8일째에 관류 세포-불포함 수거 샘플을 1.5, 3.0, 4.0, 6.0 및 8.0교환 체적/일로 수집하였다. 각각의 수거 샘플에 대해 신선한 수거 백을 사용하였다. 이어서, 단백질 A를 이용하여 샘플을 정제하였고, WCX-10 검정을 이용하여 분석하였다.
WCX-10 검정
세포 배양 수거 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체를 정량하였다. Dionex ProPac WCX-10 분석 컬럼(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다. mAb2 샘플에 사용된 WCX-10 방법은 상이한 완충액을 사용하였다. 사용된 이동상은 20mM의 (4-모르폴리노) 에탄설폰산 1수화물(MES) pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 MES, 500mM의 염화 나트륨 pH 6.5(이동상 B)였다. 최적화된 농도구배(분/%B): 0/3, 1/3, 46/21, 47/100, 52/100, 53/3, 58/3을 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다. 정량은 상기 기술된 바와 같이 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다.
결과: 관류 기술의 사용 및 산성 종에 대한 배지 교환 속도의 선택의 효과
배지 1에서 아달리무마브 생산성 세포주 1을 배양하였고, 상기 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같이 배양을 수행하였다. 교환 속도를 6일 내지 8일 사이의 2일의 기간에 걸쳐 변경시켜 산성 종의 정도에 대한 배지 교환 속도의 영향을 탐구하였다. 소비된 배지 중의 생성물 항체를, 22hrs의 기간에 걸쳐 1.5체적/일의 연속적 배지 교환 속도로 수거 백에 수집하였다. 이어서, 상기 수거 백을 새로운 백으로 교환하였고, 이전 백을 4℃로 이동시켰다. 후속적으로 그리고 계속하여, 배지 교환 속도를 7일째에 3 내지 6체적/일로 그리고 8일째에 4 내지 8체적/일로 증가시켰고, 생성 수거물을 수집하였고, 4℃로 이동시켰다. 수거 샘플을 단백질 A를 통해 프로세싱하였고, WCX-10을 이용하여 산성 종에 대해 분석하였다. 1.5체적/일의 배지 교환 속도에 따른 대조군 샘플 중의 산성 종의 백분율은 7.7%였다. 1.5체적/일의 배지 교환 속도에 따른 아르기닌 및 리신 보충된 세포 배양물 중의 산성 종의 백분율은 4.3%였다. 이러한 실험에서 시험된 최고 교환 속도(8체적/일)에 따른 샘플에서, 산성 종의 백분율은 대조군 샘플에서 5.4%로 감소되었고, 아르기닌 및 리신 보충된 세포 배양물 샘플에서는 3.0%로 감소되었다. 산성 종 중의 교환 속도 의존적 감소는 두 배양물 모두에서 관찰되었다(도 161). 따라서, 배양 배지에의 아르기닌/리신 보충의 교환 속도 조정과의 조합을 이용하여 AR을 추가로 감소시킬 수 있다.
실시예 6: 표적 AR% 또는 AR 감소를 달성하기 위한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 조합
업스트림 및 다운스트림 프로세스 기술, 예를 들면, 본원에 개시되어 있는 본 발명의 세포 배양 및 크로마토그래피 분리는 함께 조합되거나 당해 분야의 방법들과 조합되어, 최종 표적 AR 값을 제공하거나 AR% 감소를 달성할 수 있다. AR 감소를 위한 업스트림 방법으로는, 본 출원에 기술되어 있는 것들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, AR 감소를 위한 다운스트림 방법도 본원에 기술되어 있다. 예시의 업스트림 및 다운스트림 프로세스 기술로는 세포 배양 첨가제 및 조건; 정화된 수거물 첨가제 및 pH/염 조건; 혼합 방식 배지 분리; 음이온 교환 배지 분리; 및 양이온 교환 배지 분리가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 실시예는, 표적 AR 값 또는 AR 감소의 달성에 있어서 이들 기술들 중 하나 이상의 조합된 효과를 입증하고, 이에 의해 비전하 불균질성(specific charge heterogeneity)을 갖는 항체 재료의 제조를 가능하게 한다. 다운스트림 기술 및 업스트림 기술의 조합의 추가의 예는 본원에 제공된다.
본 실시예에서, 업스트림 및 다운스트림 방법의 조합은, 본 출원에서 앞서 입증된 바와 같이 아르기닌(2g/L) 및 리신(4g/L)이 보충된 3L 생물 반응기 세포 배양물 중의 산성 종의 감소에 관여한다. 이러한 전략의 결과는 표 10에 요약된다. 총 산성 종은, 대조군 샘플의 20.5%로부터 첨가제가 보충된 배양물 유래의 샘플의 10.2%로 감소되었다. 본 연구에서, 300L 생물 반응기 중의 아미노산 아르기닌(2g/L) 및 리신(4g/L)이 보충된 배지 1(화학적으로 정의된 배지)에서 아달리무마브 생산성 세포주 1을 배양하였다. 배양 12일째에, 배양물을 수거하였고, 이어서, 후속적으로 단백질 A 정제 후 WCX-10을 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다. 산성 종의 백분율은, 300L 수거 샘플 중의 9.1%인 것으로 추정되었다.
Figure pct00010
AR 수준을 9.1%로 효과적으로 감소시킨, 아르기닌 및 리신 첨가를 사용하여 300L 생물 반응기에 의해 생산된 재료를, 1차 AR 감소 방법으로서 혼합 방식 크로마토그래피를 사용하는 다운스트림 프로세스를 이용하여 정제하였다.
단백질 A 크로마토그래피 단계에 의해, 이어서, 저 pH 바이러스 불활성화 단계로 아달리무마브를 정제하였다. 여과된 바이러스 불활성화된 재료를 완충액 교환하였고, Capto Adhere 컬럼에 부하하였다. 이어서, Capto Adhere 재료의 통과액은, 통과액 방식뿐만 아니라 결합/용출(bind/elute) 방식으로 HIC 컬럼을 이용하여 정제하였다. 표 11에 나타내는 바와 같이, AR 감소는, 다른 단계들로부터의 소정의 기여를 갖는 MM 단계로 처음으로 달성되었다. 또한, 당해 표는, 이들 조합된 기술들을 사용하여, 추가의 생성물 관련 물질, 예를 들면, 응집체 및 프로세스 관련 불순물, 예를 들면, HCP가 효과적으로 감소될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00011
상기 실시예에서 명백한 바와 같이, MM 방법은 AR 수준을 2.26%까지 더 감소시켰다. 따라서, 감소를 위한 업스트림 기술은 다운스트림 기술과 조합하여 AR 수준/AR 감소를 달성할 수 있다.
실시예 7: 음이온 교환( AEX ) 크로마토그래피 실시예
재료 및 방법
크로마토그래피 방법
여기서 주의된 것을 제외하고는 본 실시예와 관련하여 기술되어 있는 재료 및 방법을 하기 실시예 8 및 실시예 9에서도 사용하였다.
명시된 것을 제외하고는 사전-팩킹된 수지 컬럼을 하기 실험들에서 사용하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충 시스템에서 컬럼을 평형화시켰다. 컬럼 부하물은, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 용출물 또는 농축된 CEX 크로마토그래피 용출물로부터 완충액 교환(상기 용출물이, 혼합 방식 표적 완충액 시스템 유래의 상이한 완충액 구성성분으로 존재한 경우) 또는 명시된 바와 같은 표적 pH 및 전도도를 수득하기 위한 스톡 용액 및/또는 물의 첨가(상기 용출물이, 혼합 방식 표적 완충액 시스템과 동일한 완충액 구성성분으로 존재한 경우)에 의해 제조하였다. 제조된 부하 재료를 여과하여, 명시된 바와 같은 표적 부하량(단백질 g/수지 L)에 따라 컬럼에 부하하였고, 이어서, 명시된 바와 같은 체적의 평형화 완충액 또는 평형화 완충액과 유사한 완충액으로 세척하였다. 컬럼 통과액/세척액을 분획으로서 또는 풀(pool)로서 수집하였다. 0.1M 아세트산, 0.15M NaCl pH3, 또는 0.1M 아세트산 용액, pH 3을 이용하여 또는 명시된 바와 같이 혼합 방식 컬럼을 재생시켰다. 컬럼 세정에 1M NaOH 용액을 사용하였다.
완충액 제조 방법
AEX용 완충액은, 음이온 농도(산)를 표적 값으로 고정시키고, 양이온 구성성분(염기)을 갖는 용액을 적절한 pH가 달성되도록 조정함으로써 음이온에 대한 특정 이온 농도를 표적화하여 제조하였다. 예를 들면, 10mM 아세테이트-Tris 완충액, pH 8.7을 제조하기 위해, 물에 빙초산을 10mM의 표적 농도로 용해시키고, 농축된 Tris-염기를 이용하여 pH 8.7로 조정하였다. 또한, 예를 들면, 10mM 포르메이트-Tris 완충액, pH 8.7을 제조하기 위해, 물에 포름산을 10mM의 표적 농도로 용해시키고, 농축된 Tris-염기를 이용하여 pH 8.7로 조정하였다.
CEX용 완충액은, 양이온 농도(염기)를 표적 값으로 고정시키고, 음이온 구성성분(산)을 갖는 용액을 적절한 pH가 달성되도록 조정함으로써 양이온에 대한 특정 이온 농도를 표적화하여 제조하였다. 예를 들면, 140mM Tris-포르메이트 완충액, pH 7.5를 제조하기 위해, 물에 Tris 염기를 140mM의 표적 농도로 용해시키고, 포름산을 이용하여 pH 7.5로 조정하였다.
AR 감소 및 회수율 계산
일반적으로, 통과액/세척액 분획을 수집하고, WCX-10 방법을 이용하여 AR 수준에 대해 분석하였다. 상기 분획들의 실제 또는 계산된 풀링에 의해, 회수율 및 상응하는 AR 수준을 계산하였다.
아달리무마브에 대한 WCX -10
아달리무마브 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체는 하기 방법에 따라 정량하였다. 분석 컬럼 Dionex ProPac WCX-10 4mm x 250mm(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. HPLC로서 Agilent 1200 HPLC 시스템을 사용하였다. 사용된 이동상은, 10mM의 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM의 이염기성 인산 나트륨, 500mM의 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 소정 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를, 산성 피크로서 함께 표시한다.
mAb -B에 대한 WCX -10
mAb-B 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체는 하기 방법에 따라 정량하였다. 분석 컬럼 Dionex ProPac WCX-10 4mm x 250mm(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. HPLC로서 Agilent 1200 HPLC 시스템을 사용하였다. 사용된 이동상은, 20mM의 4-모르폴린에탄설폰산(MES), pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 4-모르폴린에탄설폰산(MES), 500mM의 염화 나트륨 pH 6.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(87% A, 13% B: 0 내지 5분; 87% A, 13% B: 5 내지 35분; 75% A, 25% B: 35 내지 40분; 0% A, 100% B: 40 내지 43분; 87% A, 13% B: 43 내지 46분; 87% A, 13% B: 46 내지 55분)를 280nm, bw 8nm; ref 360nm, bw 100nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 주요 이소형(Isoform) 피크 이전에 용출되는 모든 피크들은 산성 영역으로서 합계되었고, LYS-2 피크 이후에 용출되는 모든 피크들은 염기성 영역으로서 합계될 것이다.
mAb -C에 대한 WCX -10
mAb-C 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체의 정량화에 대해 mAb-C 방법을 사용하였다. 분석 컬럼 Dionex ProPac WCX-10 4mm x 250mm(Dionex, CA)에 대해 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. HPLC로서 Agilent 1200 HPLC 시스템을 사용하였다. 사용된 이동상은, 20mM의 4-모르폴린에탄설폰산(MES), pH 6.5(이동상 A) 및 20mM의 4-모르폴린에탄설폰산(MES), 250mM의 염화 나트륨 pH 6.0(이동상 B)였다. 이원 농도구배(97% A, 3% B: 0 내지 1분; 79% A, 21% B: 1 내지 46분; 0% A, 100% B: 46 내지 47분; 0% A, 100% B: 47 내지 52분; 97% A, 3% B: 52 내지 53분; 97% A, 3% B: 53 내지 60분)를 280nm, bw 8nm; ref 360nm, bw 100nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초한다. 주요 이소형 피크 이전에 용출되는 모든 피크들은 산성 영역으로서 합계될 것이고, 주요 이소형 피크 이후에 용출되는 모든 피크들은 염기성 영역으로서 합계될 것이다.
크기 배제 크로마토그래피
하기 방법에 따라, 수집된 샘플의 분자량 분포를 정량하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는, HP Agilent HPLC 시스템에 대해 TSK-gel G3000SWxL, 5㎛, 125Å, 7.8 X 300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)을 이용하여 수행하였다. 주사는, 200mM의 황산 나트륨, 100mM의 인산 나트륨, pH 6.8의 이동상을 이용하여 등용매 용출 조건 하에 이루어지고, 214nm에서의 흡광도로 검출된다. 정량은, 검출된 피크의 상대적 면적에 기초한다.
숙주 세포 단백질( HCP ) ELISA
HCP 검정은 프로세스 특이적 항원 기반 ELISA에 기초한다. 샘플 희석을 적용하여 캘리브레이션(calibration) 범위 내에서의 판독을 달성하였다. 검정의 정량 한계는 0.625ng/mL이다.
UV 분광법 A 280
UV A280을 이용하여 단백질 A 용출 후 샘플에 대한 단백질 농도를 측정하였다. Agilent UV 분광 광도계에서 검정을 수행하였다. 단백질 농도는, 비어-램버트 법칙(Beer-Lambert's Law), A = εlc(여기서, A는 흡광도이고, ε는 흡광 계수(extinction coefficient)이고, l은 경로 길이이고, c는 농도이다)를 이용하여 측정하였다. 흡광도는 280nm에서 취하였고, 경로 길이는 1cm였고, 흡광 계수는 아달리무마브에 대해 1.39, mAb B에 대해 0.38, mAb C에 대해 1.43이었다.
실시예 AEX 7.1: Mab :배지: 완충액 조합에 적절한 작동 조건의 결정
특정 항체 & 수지에 대한 본 발명의 실증이 본 실시예에 제공되고, 이는 하기로 이루어진다.
1. 생성물 및 불순물이, 생성물의 pI를 초과하는 주어진 pH에서 결합하도록 하는 음이온 농도의 선택.
2. 생성물의 pI 초과의, 생성물의 pI의, 그리고 생성물의 pI 미만의 범위에 걸친 pH 농도구배 용출의 수행.
3. 단백질이 음이온 교환 배지로부터 용출되는 pH 범위의 측정.
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros 50PI가 선택된다. 5mM의 아세테이트 (음이온) 농도에서 실험을 수행하였다. 9.0의 pH에서 5mM 아세테이트/Tris를 이용하여 컬럼을 평형화시켰다. 5mM 아세테이트/Tris pH 9.0에서 아달리무마브를 제조하였고, 20g-단백질/수지 L로 컬럼에 부하하였다. 10CV의 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 이어서, 5mM 아세테이트/Tris의 음이온 농도에서 9.0 내지 7.0의 pH 농도구배를 수행하였다. 프로세스 크로마토그램은 도 165에 나타낸다.
특정 항체 & 수지에 대한 본 발명의 실증이 본 실시예에 제공되고, 이는 하기로 이루어진다.
1. 주어진 pH에 대해, 생성물 및 불순물이 AEX 흡착제에 결합하도록 하는 출발 음이온 농도의 선택.
2. 컬럼에의 소량의 단백질의 부하, 이어서, pH를 일정하게 유지하면서 음이온 농도를 증가시킴에 의한 선형 농도구배 용출의 수행.
3. 단백질이 음이온 교환 배지로부터 용출되는 음이온 농도 범위의 측정.
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros 50HQ가 선택된다. pH 8.7에서 실험을 수행하였다. 8.7의 pH에서 10mM 아세테이트/Tris를 이용하여 컬럼을 평형화시켰다. 10mM 아세테이트/Tris pH 8.7에서 아달리무마브를 제조하였고, 20g-단백질/수지 L로 컬럼에 부하하였다. 10CV의 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하였다. pH 8.7에서 10 내지 100mM 아세테이트/Tris로부터의 선형 농도구배를 수행하였다. 프로세스 크로마토그램은 도 166에 나타낸다.
이러한 일반적 접근법을 사용하여, 임의의 수지/mAb 조합에 대해 적절한 작동 조건을 표 12에 나타낸 예와 같이 결정하여 본 발명을 실행한다.
Figure pct00012
본 발명의 실행시, 바람직한 산성 종 감소는, 부하 및 세척 분획의 적절한 풀링에 의해 달성될 수 있다. 부하 및 세척에 걸친 각각의 분획을 수집하고, 후속적으로 이의 생성물 품질을 측정함으로써, 주어진 분획까지의 칭량된 평균을 이용하여 누적 AR 감소 및 누적 수율을 계산할 수 있다. 추가로, 주어진 분획에서 컬럼에 부하된 총 단백질에 대해 회수된 단백질을 비교함으로써 순간 수율(instantaneous yield)을 추정할 수 있다. 샘플 계산은 하기에 나타낸다.
샘플 계산 A: 주어진 분획까지의 누적 수율
Figure pct00013
샘플 계산 B: 주어진 분획까지의 누적 AR 감소
Figure pct00014
샘플 계산 C: 주어진 분획에 대한 순간 수율
Figure pct00015
특정 항체 & 수지에 대한 본 발명의 실증이 본 실시예에 제공되고, 이는 하기로 이루어진다.
1. 주어진 pH에 대한 음이온 농도 및 음이온 교환 배지.
2. 주어진 조건에 대한 생성물의 동적 결합 능력 초과로의 음이온 교환 배지의 부하.
3. 평형화 및 부하 단계에서 사용된 유사한 pH 및 음이온 농도를 함유하는 완충액으로의 컬럼 세척
4. 부하 및 세척 단계에 걸친 분획의 수집 및 생성물 품질 프로파일(예를 들면, AR, 응집체 등)의 후속적 측정.
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros 50PI가 선택된다. 5mM 아세테이트/아르기닌 pH 8.8에서 실험을 수행하였다. pH 8.8에서 5mM 아세테이트/아르기닌을 이용하여 컬럼을 평형화시켰다. 5mM 아세테이트/아르기닌 pH 8.8에서 아달리무마브를 제조하였고, 300g-단백질/수지 L로 컬럼에 부하하였다. 20CV의 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 도 167에 나타낸, 30g-단백질/수지 L를 나타내는 체적 중에 분획을 수집하였다. 이어서, 각각의 분획을 생성물 품질 및 누적 수율에 분석하였고, AR 감소를 계산하였고, 표 13에 나타내었다. 본 실시예로부터, 표적으로 하는 생성물 품질 및/또는 단계 수율을 산출하는 수행 조건을 결정하는 것이 당해 분야 숙련가에게 명백해진다.
이러한 일반적 접근법을 사용하여, 임의의 수지/mAb/완충액 조합에 대한 주어진 작동 조건에 대한 성능을 평가한다.
Figure pct00016
실시예 AEX 7.2: AEX 흡착제를 이용한 AR 감소의 입증
이러한 데이터 세트는, AR 감소가 3개의 상이한 AEX 흡착제들로 달성되었음을 입증한다. 각각의 수지는, 실시예 7.1에서 개요된 프로세스로부터 측정된 아세테이트 농도에서 그리고 pI 미만, pI 부근, 및 pI 초과의 pH 값(예를 들면, pH 8.5 내지 9.0)에서 아달리무마브를 이용하여 평가하였다. 표 14는 이들 실험으로부터의 결과를 요약한다.
Figure pct00017
이러한 데이터 세트에 따라 8개의 상이한 AEX 흡착제로 AR 감소가 달성되었음이 입증된다. 각각의 수지는, 실시예 7.1에 개요된 프로세스를 이용한 고급 스크리닝 방법을 이용하여 시험하였고, 2개의 상이한 pH(예를 들면, pH 8.7 및 9.0) 및 2개의 상이한 아세테이트 농도(예를 들면, 10mM 및 20mM)에서 아달리무마브를 이용하여 4회 실행하였다. 이들 실험에서, 150g/L에서 부하 분획을 분석함으로써 순간(예를 들면, 누적이 아님) AR 감소를 측정하였고, 후속적으로 모든 수지들에 대해 비교하였다. 표 15는 이들 실험으로부터의 결과를 요약한다.
Figure pct00018
이러한 데이터 세트에 따라 2개의 상이한 AEX 크로마토그래피 막으로 AR 감소가 달성되었음이 입증된다. 각각의 막은, 표 15에 개요된 조건을 이용하여 시험하였다. 이들 실험으로부터의 결과는 표 16에 제시된다.
Figure pct00019
이러한 데이터 세트에 따라 2개의 상이한 하전된 심층 필터로 AR 감소가 달성되었음이 입증된다. 이들 실험으로부터의 결과는 표 17에 제시된다.
Figure pct00020
실시예 AEX 7.3: 다른 항체, Mab B 및 Mab C를 이용한 AR 감소의 입증
본 발명의 AR 감소 기술은, AEX 흡착제를 이용한 다중 항체로 입증되어 왔다. 항체는 상이한 위치에서 상이한 양의 하전된 잔기를 갖고, 이는, 한 항체로부터 다른 항체를 분류하는 AEX 컬럼에 대해 전하 상호작용 거동을 초래한다. 따라서, 음이온 유형, 음이온 농도의 영향은 각 항체에 대해 상이하다.
하기 표 18 및 표 19는 mAb B 및 mAb C에 대한 데이터를 보여준다. 데이터는, AR 감소 기술이 다른 항체들에 대해 매우 효과적으로 작용함을 명백히 입증한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
실시예 AEX 7.4: 상이한 pH 조건을 이용한 AR 감소의 입증 - 아달리무마브
본 발명의 AR 종은 부하 단계 동안 결합되고; 따라서 결합 pH는 주요 변수이다. 바람직한 성능을 제공하는 음이온 농도는 운전 pH(operational pH)에 의해 변할 것이다.
본 실시예에서, 상이한 실험들에 따른 데이터는, 단백질의 pI에 대한 pH 선택의 AR 감소에 대한 영향을 입증하는 것으로 밝혀진다. 이러한 데이터 세트는, 당해 분야 숙련가에게, 본 발명을 실행하기 위한 실험을 수행하기 위한 pH 범위를 결정하기 위한 기초를 제공한다. 또한, 이는, pH 선택이 몇몇의 인자들에 의존하고 pH와 AR 감소 사이의 관계도 mAb 의존적이라는 사실을 강조한다.
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros 50PI가 선택되었다. 명시된 각각의 pH에서 5mM의 아세테이트/아르기닌의 농도에서 실험을 수행하였다. 명시된 각각의 pH에서 5mM 아세테이트/아르기닌으로 아달리무마브를 제조하였고, 300g-단백질/수지 L로 컬럼에 부하하였다. 20CV의 평형화 완충액으로 컬럼을 세척하였다. AR 감소에 대한 pH 효과를 나타내는 결과는 도 168에 나타낸다.
또한, 표 20에 열거되어 있는 다중 mAb의 pI로부터 ±0.5 pH 단위의 범위 내의 pH 선택 범위를 갖는 본 발명을 이용하여 AR 감소가 달성될 수 있음이 명백하다. 이들 실험의 각각은, 아세테이트/Tris 완충액 시스템이 300g/L 부하된 Poros50HQ 수지를 이용하여 수행하였다.
Figure pct00023
실시예 AEX 7.5: 상이한 이온 농도를 이용한 AR 감소의 입증 - 아달리무마브
음이온 농도는 음이온 교환 크로마토그래피의 성능에 있어서 주요 변수이다. 항체/수지/pH의 모든 조합에 대해, AR 감소를 제공하는 음이온 농도의 범위가 존재하고; 실시예 7.1에 개요된 전략에 따라 AR 감소 및 각각의 음이온 농도에 대해 상응하는 회수를 측정할 수 있다.
하기 표 21은 AR 감소에 대한 음이온 농도의 효과를 나타낸다. 또한, 당해 표는 상이한 pH 값에 대한 음이온 농도의 효과도 포함한다. 데이터는, 각각의 pH에서의 음이온 농도의 범위에 걸쳐 AR 감소가 효과적으로 달성될 수 있음을, 그리고, 농도 범위가 pH에 의존함을 입증한다.
Figure pct00024
실시예 AEX 7.6: 아달리무마브와 상이한 완충액 시스템을 이용한 AR 감소의 입증
음이온 유형 및 농도는 음이온 교환 크로마토그래피에 있어서 주요 변수이다. 본 발명은, 음이온 유형으로서의 아세테이트 및 포르메이트, 및 카운터 양이온 유형으로서의 Tris 및 아르기닌을 이용하여 입증되었다. 최적 pH 및 양이온 농도는 각각의 양이온 유형/혼합물에 대해 상이하고, 실시예 7.1에서 상기 개요된 전략을 이용하여 유도되었다. 표 22는, 상이한 음이온/양이온 유형에 대한 AR 감소 및 상응하는 회수 데이터를 나타낸다.
Figure pct00025
실시예 AEX 7.7: 상이한 부하를 이용한 AR 감소의 입증
또한, 완충액 음이온 유형, 음이온 농도, AEX 흡착제, 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 실시예 7.1에 개요된 전략을 단백질 부하의 임의의 범위에 적용할 수 있다. 음이온으로서 아세테이트를 이용한 pH 8.7에서의 Poros 50HQ에 대한 관련 단백질 부하의 범위(예를 들면, 100 내지 350g/L)는 표 23에 나타내고, 이는, 조사된 부하 범위에 걸쳐 강력한 AR 감소를 나타낸다.
Figure pct00026
실시예 AEX 7.8: 상이한 부하 농도를 이용한 AR 감소의 입증
또한, 완충액 음이온 유형, 음이온 농도, AEX 흡착제, 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 실시예 7.1에 개요된 전략을, 변하는 단백질 농도의 컬럼 공급 스트림의 임의의 범위에 적용할 수 있다. 15mM 아세테이트/Tris pH 8.7에서의 Poros 50HQ에의 아달리무마브 300g/L 부하에 대한 변하는 단백질 부하 농도의 범위(예를 들면, 100 내지 350g/L)는 표 24에 나타낸다.
Figure pct00027
실시에 AEX 7.9: 대안의 세척 방식
본 실시예에서, 아달리무마브 및 Poros50HQ 수지를 선택하였다. 각각의 실험에서, (구체화된 바와 같이) 주어진 아세테이트 농도에서의 평형화, 부하 및 세척 pH 값에 있어서 변화가 이루어졌다. 표 25 및 표 26은 단계 수율 및 AR 감소에서의 pH 변화의 효과를 나타낸다.
Figure pct00028
Figure pct00029
이전 섹션에서 논의된 바와 같이, 작동 pH 및 이의 생성물 pI와의 관계는 AEX에서의 AR 종 감소에 중요하다. 유사하게, 다수의 mAb들이 AEX 흡착제의 pKa와 유사하므로 AEX 흡착제의 pKa에 대한 작동 pH도 중요하다. 이러한 효과는, pH 9.1에서 아세테이트/Tris 완충액으로 실행하여 몇몇의 상이한 pKa 값을 이용하여, 몇몇의 상이한 AEX 흡착제를 이용하여 mAb B에 대해 나타내어진다.
이전 섹션에서 논의된 바와 같이, 아달리무마브에 대한 AR은, WCX-10 방법에서 보여진 피크들의 소정 보유 시간에 기초하여 AR1 및 AR2라고 명명하는 2개의 영역들로 추가로 그룹 분류된다. 이들 2개의 영역들에서의 변이체들의 특징은 상이한 것으로 예측되고, 이러한 이유로, 이들 그룹들에 속하는 변이체들을 감소시키는 방법은 구체적으로 기술될 수 있다.
추가로, 소정 AR 감소를 달성하는 것 이외에도, 소정 변이체들을 감소시키거나 제거하는 것을 고려하여 소정의 절대 수준의 AR 수준을 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 절대 수준의 AR, AR1, 및 AR2를 달성함에 있어서 본 발명의 능력은 표 27에서 입증된다. 본 발명의 방법은 AR2 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 따라서, AR 수준의 전체 감소가 달성된다. 표 27에 제시되는 데이터에 의해 예시되는 바와 같은 표적 절대 수준을 달성하기 위해 당해 방법을 사용할 수 있다. AR2의 그룹 하에 다수의 종들이 존재하고, 이러한 아-종을 감소시키기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은, 표 27에 제시되는 데이터에 의해 예시되는 바와 같이, AR 감소뿐만 아니라 산성 종의 표적 절대 수준도 효과적으로 달성할 수 있다.
Figure pct00030
Figure pct00031
실시예 AEX 7.10: AR 감소에 추가하여 HCP 및 응집체 감소의 입증
AEX 크로마토그래피는 응집체 및 HCP 수준을 감소시키는데 효과적이다. 본 발명에서, AR 감소를 위해 선택된 작동 조건 하에 HCP 및 응집체 수준이 효과적으로 감소될 수 있음이 입증되었다. 표 28 및 표 29는, AR 감소와 함께 달성된 응집체 및 HCP 제거를 나타낸다. 데이터는, 관련된 다른 프로세스 및 생성물 관련된 물질/불순물은 AEX 흡착제에 대한 본 발명을 이용하여 달성될 수 있고, 이러한 이유로, 모노클로날 항체의 대규모 정제시 효과적인 연마 단계로서 기능함을 명확하게 나타낸다.
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 AEX 7.11: AR 감소를 제어하는 수단의 입증
중간 재료의 품질에 기초하여 프로세스를 변형함으로써 최종 생성물 품질을 제어하는 것은, 안전성 및 효능을 확보하는 관점에서 생성물 품질을 확보하는 효과적인 방법으로서 제안되어 온 접근법이다.
세포 배양 및 기타 업스트림 단계 동안에 생성된 AR 수준이 변할 수 있음을 고려하여, 생성물 품질을 제어하는 수단을 실행하는 다운스트림 프로세스 단계를 설계하는 것이 바람직하고; 생성물의 품질에 영향을 미치는 프로세스 매개변수를 제어하는 특정 수단을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서, pH 및 부하(즉, g/L)가, 변형되어 AR 종의 바람직한 분리를 달성할 수 있는 매개변수이므로 이러한 제어가 가능하다. 예를 들면, 주어진 음이온 농도 및 pH에서 보다 높은 수준의 AR 감소를 달성하기 위해, 컬럼에의 부하를 감소시킬 수 있다. 추가로, 주어진 음이온 농도 및 부하에 대해, 보다 높은 AR 종의 감소를 달성하기 위해 pH를 증가시킬 수 있다.
한 예로서, 그리고 임의의 방식에 제한되지 않으면서, 본 실시예에서, 부하액 및 세척액의 pH 및 컬럼에의 총 부하를 변화시킴으로써 AR 수준이 제어될 수 있음이 입증되었다. 본 연구를 위해 파일럿(pilot) 규모 Poros HQ 컬럼(10cm 직경 x 22.5cm 높이, 1.8L)을 사용하였다.
부하 재료 및 스톡 완충액 둘 다는, 스톡 Tris 용액으로 친화성 포획된 재료를 적정함으로써 특정된 pH의 18mM 아세테이트/Tris로 제조된다. 부하 재료의 AR 수준은 상기 실행 둘 다에 대해 동일하였다. 이러한 실험은, 표 30에 나타내는 pH 및 컬럼에의 단백질 부하를 조정함으로써 최종 AR 수준을 조정하고, 한편, 허용가능한 수율을 유지할 수 있는 방법을 입증한다.
Figure pct00034
실시예 AEX 7.12: Tris / 포르메이트 완충액 시스템을 이용한 AEX : 포름산 완 충액 시스템에서의 Poros 50 HQ 에 대한 아달리무마브에 관한 산성 종 감소
본 실시예는, AEX를 이용한 AR 감소를 위한 Tris/포르메이트 완충액 시스템의 사용의 입증을 제공한다. 본 실시예의 실행시, 바람직한 산성 종 감소는, 부하 및 세척 분획의 적절한 풀링에 의해 달성될 수 있다. 부하 및 세척에 걸쳐 각각의 분획을 수집하고 후속적으로 이들 분획의 생성물 품질을 측정함으로써, 주어진 분획까지 칭량된 평균을 이용하여 누적 AR 감소 및 누적 수율을 계산할 수 있다. 추가로, 순간 수율은, 주어진 분획에서 컬럼에 부하된 총 단백질에 대해 회수된 단백질을 비교함으로써 추정될 수 있다.
AEX 흡착제
가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본(backbone)을 갖는 리지드(rigid) 50㎛ 중합체성 비드인 Poros 50HQ(Applied Biosciences, part# 1-2459-11)를 본 실험에 사용하였다.
AEX 크로마토그래피 방법
Poros 50HQ를 1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 팩킹하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충액 시스템에서 상기 컬럼을 평형화시켰다. 표적 이온 농도를 얻기 위해 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 부하물을 제조하여, 컬럼에 부하하였고, 이어서, 20CV를 위해 평형화 완충액으로 세척하였다. 부하 및 세척 단계 동안에 통과액 및 세척 분획으로 항체 생성물을 수집하였다. 이어서, 100mM 포르메이트로 컬럼/하우징을 재생시켰고, 1M의 NaOH 용액을 컬럼 세정에 사용하였다.
샘플 계산은 하기에 나타낸다:
샘플 계산 A: 주어진 분획까지의 누적 수율
Figure pct00035
샘플 계산 B: 주어진 분획까지의 누적 AR 감소
Figure pct00036
샘플 계산 C: 주어진 분획까지의 순간 수율
Figure pct00037
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros 50HQ를 선택하였다. 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 및 40mM 포르메이트/Tris pH 8.8에서 실험을 수행하였다. 각각의 실행에 대해 각각의 포르메이트/Tris를 이용하여 pH 8.8로 컬럼을 평형화시켰다. 아달리무마브는 10mM, 15mM, 20mM, 30mM, 및 40mM 포르메이트/Tris pH 8.8로 제조하여, 상기 컬럼에 300 내지 500g-단백질/L-수지로 부하하였다. 약 25g-단백질/L-수지를 나타내는 체적에서 분획을 수집하였다. 이들 분획을 실행 동안 생성물 품질, 누적 수율, 및 누적 AR 감소에 대해 분석하였다(도 189에 도시함). 100, 200, 300, 400, 및 500g/L 부하시 순간 수율 및 AR 감소는 표 31에 나타낸다. 본 실시예는, 일반적으로 Tris/포르메이트 완충액 시스템의 유효성을, 그리고, 구체적으로는 AR 감소를 위한 AEX 컬럼에 대한 포르메이트 이온의 유효성을 입증한다. 추가로, 본 실시예는 AEX AR 감소 방법이 각종 완충액 시스템에 적용됨을 확인시켜 준다.
Figure pct00038
실시예 8: 양이온 교환 크로마토그래피 실시예
실시예 CEX 8.1: Mab:수지:완충액 조합에 적절한 작동 조건의 결정
특정 항체 & 수지에 대한 본 발명의 실증이 본 실시예에 제공되고, 이는 하기로 이루어진다.
1. 단백질의 pI 미만인 pH의 선택.
2. 100 내지 150mM의 범위 내의 NaCl 농도 선택 및 예를 들면, 115, 125, 135 농도에서의 실험 수행.
3. 통과액/세척 분획 대 용출액 중의 산성 종 분포의 측정.
4. 바람직한 산성 종 수준 및 회수를 제공하는 NaCl 농도의 선택.
본 실시예에서는 아달리무마브를 선택하였고, Poros XS를 선택하였다. pH 6.0에서 실험을 수행하였다. 프로세스 크로마토그램은 도 169에 나타낸다. 각각의 실험에 대한 회수 대 AR 감소 곡선은 도 170 및 표 32에 나타낸다. 이러한 세트의 실험들로부터, 용출물의 회수가 74%가 되도록 125mM의 나트륨 농도를 선택할 수 있고, 이는 5.4%의 AR 감소를 제공한다. 대안으로, 약 75%의 회수를 제공할 것인 5.4%의 AR 감소 값을 선택할 수 있다.
이러한 일반적 접근법을 사용하여, 임의의 수지/mAb 조합에 대해 적절한 작동 조건을 결정하여 본 발명을 실행한다.
본 발명의 소정 실시형태들의 실행시, 바람직한 산성 종 감소는 세척 분획과 용출 분획의 절적한 풀링에 의해 달성될 수 있다. 이전 섹션에서 기술된 실시예에서, 용출 분획은, 표 32에 나타낸 바와 같이 세척 분획과 함께 풀링되어 풀링된 분획들에 따라 약 1% 내지 약 7%의 AR 감소를 달성할 수 있다. 이러한 접근법을 실행하여 도 170에서 예시된 바와 같은 표적 수율 및 AR 감소를 달성할 수 있다.
Figure pct00039
실시예 CEX 8.2: CEX 흡착제를 이용한 AR 감소의 입증
이러한 데이터 세트를 컴파일링하여 8개의 상이한 CEX 흡착제를 이용하여 달성된 AR 감소를 입증한다. 상기 실시예 8.1에 개요된 전략에 기초하여 각각의 수지에 대한 조건이 유도되었다. 표 33은, 사용된 조건 및 달성된 AR 감소 및 달성된 상응하는 회수를 요약한다.
당해 데이터는, 당해 기술이 10개의 수지들 모두에서 AR 감소를 산출하는데 있어서 강력함을 나타낸다. 상기 실시예 8.1에 기술되어 있는 바와 같이, AR 감소가 회수와 균형을 이룰 수 있고, 최적 조건을 선택할 수 있다. 실험은 pH 7.5에서 수행하였다. pH 제어를 위해 29mM Tris-아세테이트를 사용하였다.
Figure pct00040
실시예 CEX 8.3: 기타 항체: mAb B 및 mAb C를 이용한 AR 감소의 입증
본 발명의 AR 감소 기술은, CEX 흡착제들을 이용한 다중 항체들로 입증되었다. 항체들은, 상이한 위치에서 상이한 양의 하전된 잔기들을 갖고, 이는, 한 항체가 다른 항체와 상이한 CEX 컬럼 상에서 전하 상호작용 거동을 유도한다. 따라서, 양이온 유형, 양이온 농도의 영향은 각각의 항체에 대해 상이하다.
각각의 항체/수지 조합에 대해, 상기 실시예 8.1에 개요된 실험 전략을 사용하여, AR 감소를 제공한 각각의 양이온 유형에 대한 양이온 농도를 측정하였다.
하기 표 34 및 표 35는 mAb B 및 mAb C에 대한 데이터를 나타낸다. 데이터는, AR 감소 기술이 다른 항체들에 대해 매우 효과적으로 적용함을 명백하게 입증한다. 또한, 농도 범위는 상이한 항체들 사이에 상이함은 명백하다. 선택된 pH 범위는 항체의 등전점과 관련되어 있었고, 분자의 pI보다 대략 1 내지 2 유닛 적게 선택되었다.
Figure pct00041
Figure pct00042
실시예 CEX 8.4: 상이한 pH 조건을 이용한 AR 감소의 입증 - 아달리무마브
본 발명의 AR 종은 통과액/세척 분획으로 제거된다. 따라서, 결합 pH가 주요 변수이다. 바람직한 성능을 제공하는 양이온 농도는 결합 pH에 따라 변할 것이다. 따라서, 각각의 결합 pH에 대해, 상기 실시예 8.1에 개요된 실험 전략을 행하여 AR 감소를 초래하는 이온 농도의 범위를 결정한다.
아달리무마브에 대해 상이한 pH를 이용한 실험의 결과는 표 36에 나타낸다. 나타내어진 바와 같이, 보다 낮은 pH에서, 세척 분획 중의 AR 감소를 달성하는데 요구되는 양이온 농도는 더 높다. 낮은 pH에서보다 높은(pI에 더 가까운) pH에서 AR 감소가 유의하게 더 강력하고 최적임은 예측되지 않는다. 표 37에 나타낸 바와 같은 pI에 더 가까운 pH에서 양이온 교환 크로마토그래피를 작동시키는 것은 당해 분야 숙련가에게 명백하지 않다. 문헌 데이터는 분자의 pI보다 적어도 3유닛 적은 최적 pH를 제안한다.
Figure pct00043
Figure pct00044
실시예 CEX 8.5: 상이한 이온 농도를 이용한 AR 감소의 입증 - 아달리무마브
양이온 농도는 양이온 교환 크로마토그래피의 성능에 있어서 주요 변수이다. 항체/수지/pH의 모든 조합에 대해 AR 감소를 제공하는 양이온 농도의 범위가 존재하고; 상기 실시예 8.1에 개요된 전략에 따라서 각각의 양이온 농도에 대해 AR 감소 및 상응하는 회수를 측정할 수 있다.
하기 표 38은 AR 감소에 대한 양이온 농도의 효과를 나타낸다. 또한, 당해 표는 상이한 pH 값들에 대한 양이온 농도의 효과를 포함한다. 데이터는, 각각의 pH에 대해 양이온 농도의 범위에 걸쳐 AR 감소가 효과적으로 달성될 수 있고, 농도 범위가 pH에 의존함을 입증한다. 또한, 당해 표는 상이한 양이온 유형에 대한 농도 범위의 예를 포함한다.
Figure pct00045
실시예 CEX 8.6: 아달리무마브와 상이한 완충액 시스템을 이용한 AR 감소의 입증
양이온 유형 및 농도는 양이온 교환 크로마토그래피에서 주요 변수이다. 본 발명은, 각각의 경우에 양이온 유형/혼합물로서 Tris, 나트륨/Tris, 암모늄/Tris 및 아르기닌/Tris을 이용하여 AR의 효과적인 감소를 갖는 것으로 입증되었다. 당해 분야 숙련가에 대해 이해될 것인 바와 같이, 최적 pH 및 양이온 농도는 각각의 양이온 유형/혼합물에 대해 상이하고, 이는 상기 실시예 8.1에 개요된 전략을 이용함으로써 유도되었다. 실험은 pH 7.5에서 수행하였다. pH 제어를 위해 29mM Tris-아세테이트를 이용하였다. 표 39는, 상이한 양이온 유형/혼합물에 대한 AR 감소 및 상응하는 회수의 데이터를 나타낸다.
Figure pct00046
실시예 CEX 8.7: 상이한 부하를 이용한 AR 감소의 입증
또한, 완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 상기 실시예 8.1에 개요된 전략은, 용출에 이어지는 결합의 작동 방식 또는 흡착제 결합 능력 미만의 컬럼 부하 인자를 나타내는, 즉, 과부하되지 않는 단백질 부하의 임의의 범위에 적용될 수 있다. 양이온으로서 Tris를 이용한 pH 7.5에서의 Poros XS에 대한 관련 단백질 부하의 범위는, 표 40에서 강력한 AR 감소를 나타내는 것으로 보여진다.
Figure pct00047
실시예 CEX 8.8: 상이한 부하 농도를 이용한 AR 감소의 입증
또한, 완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 상기 실시예 8.1에 개요된 전략은, 변하는 단백질 농도의 컬럼 공급 스트림의 임의의 범위에 적용될 수 있다. 양이온으로서 Tris를 이용한 pH 7.5에서의 Poros XS에 대한 변하는 단백질 부하 농도의 범위는, 표 41에서 강력한 AR 감소를 나타내는 것으로 보여진다.
Figure pct00048
상기 기술한 바와 같이, 아달리무마브에 대한 AR은, WCX-10 방법에서 보여진 피크들의 소정 보유 시간에 기초하여 AR1 및 AR2라고 명명하는 2개의 영역들로 추가로 그룹 분류된다. 이들 2개의 영역들에서의 변이체들의 특징은 상이한 것으로 예측되고, 이러한 이유로, 이들 그룹들에 속하는 변이체들을 감소시키는 방법은 구체적으로 기술될 수 있다.
추가로, 소정 AR 감소를 달성하는 것 이외에도, 소정 변이체들을 감소시키거나 제거하는 것을 고려하여 소정의 절대 수준의 AR 수준을 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 절대 수준의 AR, AR1, 및 AR2를 달성함에 있어서 본 발명의 능력은 표 42에서 입증된다.
AR1 종을 포함하는 특정 종을 동정하고 정량하여 본 발명의 방법에 의한 이러한 종의 감소를 입증할 수 있다. 이러한 종들 중 2개인 당화된 mAb 및 MGO 변형된 mAb이 동정되었고, 본 발명의 방법에 의해 감소되는 것으로 밝혀졌다. 전하 변이체들의 산성 종 부분 중에는 이들 종이 존재하지만, 전형적으로 문헌에 기술되어 있는 산성 종들은, 명백하게 상이한 탈아미드화된 mAb이다.
Figure pct00049
본 발명의 방법은 AR2 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 따라서, AR 수준의 전체 감소가 달성된다. 표 42에 제시되는 데이터에 의해 예시되는 바와 같은 표적 절대 수준을 달성하기 위해 당해 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은, 표 42에 제시되는 데이터에 의해 예시되는 바와 같이, AR 감소뿐만 아니라 산성 종의 표적 절대 수준도 효과적으로 달성할 수 있다.
실시예 CEX 8.9: 당화된 종 및 메틸글리옥실화된 종 감소의 입증
완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 상기 실시예 8.1에 개요된 전략은, 특정 번역-후 변형으로 더 연장될 수 있다. 산성 종은, 본 출원에서 분석적 약 양이온 교환(WCX) HPLC 컬럼에 대한 주요 피크보다 덜 보유되는 불순물로서 정의되지만, 세포 대사 변형, 예를 들면, 당화 및 메틸글리옥살(MGO)로부터 유도된 특정 공지의 생성물 관련된 물질은 산성 종의 부분인 것으로 특이적으로 동정될 수 있다. 도 171 및 도 172는, 당화 항체 및 MGO 변형된 항체가, 크로마토그램의 AR1 영역에서 WCX 방법에 의해 해상되고 시험관내에서 농축될 수 있는 고유한 종임을 입증하는 시험관내 표지화 실험의 결과를 나타낸다. 또한, 여기에 기술되는 본 발명은, 당화된 항체 및 MGO 변형된 항체가, 상기 실시예 8.1에 기술되어 있는 바와 같은 CEX를 이용한 완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 효과적으로 제거될 수 있음을 나타낸다. AR1의 정량적 감소 및 이에 따른 CEX 및 CEX-혼합 방식 수지에 의한 당화된 종 및 MGO 종은 표 43 및 표 44에 나타낸다.
Figure pct00050
Figure pct00051
실시예 CEX 8.10: 리신 분포 변형의 입증
산성 종을 감소시키기 위한 상기 실시예 8.1에 개요된 전략은, 또한, 전하 이질성을 유도하는 공지의 번역-후 변형인 C-말단 Lys 변이체의 분포를 조정하는데 사용할 수 있다. WCX 분석은 조성 분석이므로, 산성 종의 감소를 통해 Lys 이소형의 분포에 있어서 약간의 작은 변화가 예측된다. 그러나, 완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해, 산성 종을 감소시키는 것 이외에도, 보다 염기성인 이소형(Lys 1 및 Lys 2)에 대해 용출 풀을 농축시킬 수 있다. 표 45 및 도 173은 염기성 이소형 농축에 대한 pH 및 양이온(Tris) 농도의 영향의 비-제한적 예를 나타낸다.
Figure pct00052
실시예 CEX 8.11: AR 감소에 추가하여 HCP 및 응집체 감소의 입증
본 발명에서, 통과액/세척 분획 중의 AR 농축된 종을 세척 제거한 후, 용출 조건의 적절한 조정에 의해 HCP 및 응집체 수준이 효과적으로 감소될 수 있음이 입증되었다.
표 46 및 표 47은, AR 감소와 함께 달성된 HCP 및 응집체 제거를 나타낸다. 데이터는, 본 발명을 이용하여 CEX 흡착제에 대해 다른 프로세스 관련 불순물 및 생성물 관련 물질이 달성될 수 있고, 따라서 모노클로날 항체의 대규모 정제에 있어서 효과적인 연마(polishing) 단계로서 기능함을 명백하게 보여준다.
Figure pct00053
Figure pct00054
실시예 CEX 8.12: AR 감소 제어 수단의 입증
중간 물질의 품질에 기초하여 프로세스를 변형시킴으로써 최종 생성물 품질을 제어하는 것은, 안전성 및 효능을 확보하는 관점에서 생성물 품질을 확보하는 효과적인 방식으로서 제안되어 온 접근법이다.
세포 배양 및 기타 업스트림 단계 동안에 생성된 AR 수준이 변할 수 있음을 고려하여, 생성물 품질을 제어하는 수단을 실행하고, 프로세스 매개변수를 제어하여 생성물 품질에 영향을 미치는 특정 수단을 추가로 갖는, 다운스트림 프로세스 단계를 설계하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는, 양이온 농도가, AR 종의 바람직한 분리를 달성하기 위해 변형될 수 있는 단일 매개변수이므로 이러한 제어가 가능하다. 예를 들면, 보다 높은 수준의 AR 감소를 달성하기 위해, 부하 물질 및 세척 완충액의 Tris 농도는 감소될 수 있고, 따라서, 통과 분획에 AR 농축된 종이 수집될 수 있다.
한 예로서, 그리고, 임의의 방식에 제한되지 않고, 부하액 및 세척액 중의 Tris 농도를 변화시킴으로써 AR 수준이 제어될 수 있음이 본 실시예에서 입증되었다. 파일롯 스케일 Poros XS 컬럼(10cm 직경 x 22cm 높이, 1.7L)을 본 연구에 사용하였다.
부하 재료 및 스톡 완충액은 둘 다 동일한 pH에서 300mM Tri 농도로 제조한다. 부하 재료의 AR 수준은, X%인 것으로 측정되었다. 부하 재료 및 평형화/세척 완충액은, AR 수준과 Tris 농도 사이의 소정 상호관계에 기초하여 표적 Tris 농도로 인-라인(in-line) 희석한다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, Tris 농도가 156mM로 조정된 경우, 4.1의 최종 AR 감소가 달성되었지만, 반면, Tris 농도가 150mM로 조정된 경우, 3.1의 최종 AR 수준이 달성되었다(표 48). 이는, 바람직한 생성물 품질의 달성을 확보하는 AR 수준의 매우 예측가능한 제어를 가능하게 한다.
Figure pct00055
부하(프로세스 스트림) 및 평형화/세척 완충액 중의 pH 양이온 유형 및 농도의 주의 깊은 제어를 통해 실시예 CEX 8.1에서 입증된 산성 종 감소 이외에도, 용출 완충액의 조성물은, 또한, 생성물 품질 프로파일을 추가로 개선시키는데 사용할 수 있다. 생성물을 용출시키기 위한 각종 양이온 유형, 농도 및 pH의 영향을 시험하였다. 표 49에 나타낸 바와 같이 용출 완충액에 대한 광범위한 선택이 존재한다. 실험은, Poros XS 수지를 이용하여 수행하였다.
Figure pct00056
실시예 CEX 8.13: 양이온-HIC 혼합 방식 수지를 이용한 AR 감소의 입증
완충액 양이온 유형, 농도 및 pH의 주의 깊은 제어를 통해 산성 종을 감소시키기 위한 상기 실시예 8.1에 개요된 전략은, 양이온 교환 메커니즘을 포함하는 혼합 방식 또는 다중-모드 흡착제와 같은 기타 크로마토그래피 흡착제를 포함하는 것으로 확장될 수 있다. 표 50은, 2개의 양이온-소수성 상호작용 혼합 방식 수지에 대해 사용된 조건 및 달성된 AR 감소를 요약한다. 당해 데이터는, 실시예 8.1에 개요된 기술이, 이들 유형의 수지에 대해 AR 감소를 산출하는데 있어서 강력함을 명백하게 나타낸다. 상기 실시예 8.1에 기술되어 있는 바와 같이, AR 감소가 회수와 균형을 이룰 수 있고, 최적 조건을 선택할 수 있다. 추가의 입증으로서, mAb 2도, 양이온 농도, 회수 및 AR 감소 사이의 관계를 나타내는 동일한 결과를 갖는 것으로 평가되었다. 실시예 8.1에서 앞서 나타낸 바와 같이, 상이한 분자에 대한 최적 조건은 변한다. 또한, CEX-HIC 혼합 방식 수지에 적용된 경우에 이러한 기술은, 앞서 기술된 바와 같은 불순물의 감소도 나타낸다.
Figure pct00057
Figure pct00058
이전 섹션에 기술되어 있는 바와 같이, 아달리무마브에 대한 AR은, WCX-10 방법에서 보여진 피크들의 소정 보유 시간에 기초하여 AR1 및 AR2라고 명명하는 2개의 영역들로 추가로 그룹 분류된다. 이들 2개의 영역들에서의 변이체들의 특징은 상이한 것으로 예측되고, 이러한 이유로, 이들 그룹들에 속하는 변이체들을 감소시키는 방법은 구체적으로 기술될 수 있다.
추가로, 소정 AR 감소를 달성하는 것 이외에도, 소정 변이체들을 감소시키거나 제거하는 것을 고려하여 소정의 절대 수준의 AR 수준을 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 절대 수준의 AR, AR1, 및 AR2를 달성함에 있어서 본 발명의 능력은, 추가의 프로세스-관련 불순물 또는 산성 종의 수준을 나타내는 표 52a와 표 52b 및 표 52c에서 입증된다.
AR1 종을 포함하는 특정 종을 동정하고 정량하여 본 발명의 방법에 의한 이러한 종의 감소를 입증할 수 있다. 전하 변이체들의 산성 종 부분 중에는 이들 종이 존재하지만, 전형적으로 문헌에 기술되어 있는 산성 종들은, 명백하게 상이한 탈아미드화된 mAb이다. 이들 결과는, 추가의 펜던트(pendant) 소수성 상호작용 기능성을 갖는 양이온 교환 수지가 CEX 흡착제와 유사하게 AR 감소를 효과적으로 제공할 수 있음을 나타낸다.
[표 52a]
Figure pct00059
[표 52b]
Figure pct00060
[표 52c]
Figure pct00061
실시예 8.14: Tris / 포르메이트 완충 시스템과 CEX : 상이한 Tris / 포르메이트 농도를 이용한 AR 감소 - 아달리무마브
본 실시예는 Tris/포르메이트 완충액 시스템 및 CEX를 이용한 AR 감소의 입증을 제공한다. 양이온(예를 들면, Tris) 농도는 양이온 교환 크로마토그래피의 성능에 있어서 주요 변수이다.
CEX 흡착제:
가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 리지드 50㎛ 중합체성 비드인 Poros XS(Applied Biosciences, part# 4404338)를 본 실험에 사용하였다.
CEX 크로마토그래피 방법
Poros XS를 1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 팩킹하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충액 시스템에서 상기 컬럼을 평형화시켰다. 명시된 바와 같은 표적 이온 농도를 얻기 위해 완충액 교환 또는 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 컬럼 부하물을 제조하여, 대략 40g 단백질/L 수지로(또는 명시된 바와 같이) 컬럼에 부하하였고, 이어서, 20CV를 위해(또는 명시된 바와 같이) 평형화 완충액으로 세척하였다. 이어서, 항체 생성물을 용출시켰고, 컬럼을 재생시켰다.
본 실시예에서는 아달리무마브 및 Poros XS를 선택하였다. 포름산을 이용하여 pH 7.5로 완충된 120 내지 150mM의 Tris 농도에서 실험을 수행하였다. 각각의 실행에 대해 각각의 Tris/포르메이트를 이용하여 pH 7.5로 컬럼을 평형화시켰다. 아달리무마브는 각각의 Tris/포르메이트 pH 7.5로 제조하여, 상기 컬럼에 35 내지 45g-단백질/L-수지로 부하하였다. 이어서, 컬럼을 평형화 완충액을 이용하여 20CV로 세척하였고, 이어서, 140mM Tris/포르메이트 + 140mM 황산 나트륨 완충액으로 pH 5.2에서 용출시켰다. 용출물을 생성물 품질 및 수율에 대해 분석하였다.
하기 표 53은, 7.5의 pH에서 Tris/포르메이트 완충액 시스템에서 Poros XS 상에서 아달리무마브에 관한 AR 감소 및 응집체 감소에 대한 Tris 농도의 효과를 나타낸다. 당해 데이터는, Tris 농도 및 컬럼 부하의 범위에 걸쳐 AR 및 응집체 감소가 효과적으로 달성될 수 있음을 입증한다. 본 실시예는, AR 감소를 위한 CEX 컬럼에 대한 포르메이트와 관련하여, 일반적으로 Tris/포르메이트 완충액 시스템의 유효성, 및 구체적으로는 Tris 양이온의 유효성을 입증한다. 추가로, CEX AR 감소 방법은 각종 완충액 시스템에 적용됨을 확인시켜 준다.
Figure pct00062
CEX 크로마토그래피를 위한 세척 체적
CEX 부하 재료로서 단백질 A 용출물을 이용하여 실험을 수행하였다. 128mM Tris-포르메이트 완충액 시스템, pH 7.5, 40g/L 부하의 부하/세척 완충액 조건 하에 실행 1을 수행하였다. 세척 완충액 20CV를 이용하여 세척을 수행하였다. 160mM Tris-포르메이트 완충액 시스템, pH 7.5, 40g/L 부하의 부하/세척 완충액 조건 하에 실행 2를 수행하였다. 세척 완충액 6CV를 이용하여 세척을 수행하였다.
표 54에 나타내는 바와 같이, 실행 1 및 실행 2는 유사한 수율 및 AR 감소를 제공하였다. 따라서, 이들 결과는, 상응하는 부하 조건에 따라 세척 체적을 변화시킴으로써 프로세스 성능을 달성할 수 있음을 입증한다.
Figure pct00063
실시예 9: 혼합 방식 크로마토그래피 실시예
실시예 MM 9.1: 수지 및 pH 조합
본 실시예에서는, 일반적 기술에서 개요된 접근법을 사용하여 본 발명을 실행하기 위한 작동 조건을 결정하였다. 구체적으로, 반응 표면 설계 DOE를, mAb AR 감소 및 회수 수율을 평가하는데 적용하였다.
특정 항체 & 수지에 대한 본 발명의 실증이 본 실시예에 제공되고, 이는 하기로 이루어진다.
1. 6.8 내지 8.4의 범위에서의 pH의 선택.
2. 2.3 내지 13.7mS/cm의 범위에서의 전도도의 선택.
3. 통과액/세척 분획에서의 산성 종 분포의 측정.
4. 바람직한 산성 종 수준 및 회수를 제공하는 최적 pH 및 전도도의 선택.
본 실시예에서, 아달리무마브 및 수지 Capto Adhere을 선택하였다. 표 55에 열거된 표적 pH 및 전도도에서 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 이러한 연구는 산성 종 감소에 대한 부하 pH 및 전도도의 효과를 입증하였다. 산성 종 감소는, pH를 조작함으로써 유의하게 영향을 받을 수 있다. AR 감소는 pH를 증가시키고/시키거나 전도도를 감소시킴에 따라 증가하였다(표 55, 표 56 및 도 174).
Figure pct00064
Figure pct00065
실시예 MM 9.2: 분획 풀링
본 실시예에서, 아달리무마브 및 수지 Capto Adhere을 선택하였다. pH 7.85 및 2.5mS/cm의 전도도에서 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 컬럼 통과액을 전체 부하 및 세척 페이즈(phase)에 걸쳐 분획화하였다. 각각의 분획을 산성 종 및 단백질 회수에 대해 분석하였다. 도 175, 도 176 및 표 57은, 상응하는 회수로 달성된 AR 감소를 입증한다. 이들 AR 감소 및 회수는, 부하/세척 동안 개시로부터 다양한 시점까지의 분획의 누적 풀에 상응한다. 이는 표 57에 나타내고, 여기서, AR 감소는 이들 풀의 각각에 상응한다. 이러한 데이터는 도 175에 플롯팅한다.
Figure pct00066
실시예 MM 9.3: 혼합 방식 흡착제를 이용한 AR 감소의 입증
본 실시예에서, 아달리무마브를 선택하였다. pH 7.85 및 2.5, 3.5, 및 4.5mS/cm의 전도도에서 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 동일한 부하 재료를 상이한 혼합 방식 수지 컬럼들에 적용하였다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 표 58은, 3개의 혼합 방식 수지 모두가 mAb 산성 종을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 수지 리간드들의 차이로 인하여, AR 감소 수준은 소정 조건 하에 약간 다를 수 있다.
Figure pct00067
실시예 MM 9.4: 다른 항체: mAb B 및 mAb C를 이용한 AR 감소의 입증
본 실시예에서는, 아달리무마브 이외에 다른 2개의 상이한 모노클로날 항체(mAb B 및 mAb C) 및 수지 Capto Adhere를 선택하였다. 다중 pH 및 전도도 조건에서 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 모든 mAb의 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. mAb C는, 또한, 동일한 작동 조건 하에 Capto Adhere 이외의 다른 2개의 MM 수지에도 적용되었다. 표 59는, 작동 조건 및 달성되는 AR 감소 및 달성되는 상응하는 회수를 요약한다. 그 결과는, 당해 기술이, 또한, 최적 pH 및 전도도 조건을 갖는 다른 모노클로날 항체에 대해 산성 종을 감소시킬 수 있음을 입증한다. Tris-아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다.
Figure pct00068
도 177은, Tris-아세테이트 완충액을 이용하여 pH 7.0 및 3.0mS/cm의 전도도에서 작동된 Capto Adhere 컬럼을 통과한 mAb B 누적 풀 AR을 나타낸다. 도 178은, Tris-아세테이트 완충액을 이용하여 pH 8.5 및 3.0mS/cm의 전도도에서 작동된 Capto Adhere 컬럼을 통과한 mAb C 누적 풀 AR을 나타낸다. 그래프 둘 다는, 아달리무마브와 비교하여 상이한 AR 값에 따른 유사한 AR 통과 곡선을 입증한다(도 176). 도 179는, pH 8.5 및 3.0mS/cm의 전도도에서 작동된 Tris-아세테이트 완충액을 이용한 3개의 상이한 혼합 방식 수지에 따른 Mab C의 AR 통과 곡선을 나타낸다. 데이터는, 혼합 방식 수지를 이용한 AR 감소 기술이 다른 항체들에 대해 매우 효과적으로 작용함을 명백하게 입증한다.
실시예 MM 9.5: 아달리무마브 항체 재료를 이용한 상이한 수지에 따른 AR 감소에 대한 상대적 pH의 입증
본 실시예에서, 상이한 실험들로부터 편집된 데이터는, AR 감소에 대한 단백질의 pI에 대한 pH 선택의 영향을 입증하는 것으로 밝혀진다. 이러한 데이터 세트는, 당해 분야 숙련가에게 본 발명을 실행하기 위한 pH 범위를 결정하는 기반을 제공한다. 추가로, 이는, pH 선택이 몇몇의 인자들에 의존하고 pH와 AR 감소 사이의 관계도 mAb 의존적이라는 사실을 강조한다. 도 180은, 표 60에 열거된 조건들 하에 Capto Adhere를 이용하여 수행한 실험들로부터 데이터를 편집한, AR 감소에 대한 pH-pI 및 전도도의 영향을 입증한다. 도 181은, 표 61에 열거된 조건들 하에 Tris/아세테이트 완충액 시스템 및 다중 혼합 방식 수지를 이용하여 작동한 실험들을 포함하는 mAb B AR 감소에 대한 pH-pI 및 전도도의 영향을 보여준다. 도 182는, 표 62에 열거된 조건들 하에 Tris/아세테이트 완충액 시스템 및 다중 혼합 방식 수지를 이용하여 작동된 실험들을 포함하는 mAb C AR 감소에 대한 pH-pI 및 전도도의 영향을 보여준다. 모든 부하 재료들은 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 또한, 아달리무마브에 대한 pI로부터 + 0.5 내지 -2.5 pH 단위의 범위 내에서의 pH 선택의 범위를 이용한 본 발명으로 AR 감소가 달성될 수 있음은 명백하다. 당해 분야 숙련가는, 표적 AR 감소를 달성하기에 적절한 pH를 선택할 수 있다.
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
실시예 MM 9.6: AR 감소에 대한 pH의 효과
반응 표면 설계 DOE를, mAb AR 감소에 대한 pH 및 전도도의 영향을 평가하는데 적용하였다. 본 실시예에서, 아달리무마브 및 Capto Adhere을 선택하였다. Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 당해 실험을 수행하였다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 시험되고 표 63 및 표 64에서 입증된 범위의 pH 및 전도도 이외에도, 보다 높은 pH 범위가 또한 연구되었다(도 183).
그 결과는, 도 183 및 도 184에서 6.8 내지 9.5의 광범위한 pH 범위에서 mAb 산성 종이 감소될 수 있음을 입증하였다.
Figure pct00072
Figure pct00073
실시예 MM 9.7: 상이한 이온 농도/이온 강도를 이용한 AR 감소의 입증 - 아달리무마브
본 실시예에서, 아달리무마브를 선택하였다. 이전에 나타낸 시험된 전도도 범위 이외에도, 보다 낮은 전도도 및 보다 높은 전도도 범위가 또한 Capto Adhere로 연구되었다. 표 65 및 표 66은, Tris/아세테이트 완충액 시스템과 Capto Adhere을 이용한 DOE 연구 조건을 나타낸다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 것이었고, pH 조정되었다. 각각의 실행시 피크의 상승하는 측에 대해 UV A280의 50mAU 및 피크의 하강하는 측에 대해 150mAU로부터 컬럼 통과액 풀을 수집하였다. 도 185는 pH(6.8 내지 8.4), 전도도(2.3 내지 13.7mS/cm), 및 단백질 부하량(116 내지 354g/L)의 효과를 입증한다. 도 186은 약 1mS/cm만큼 낮은 전도도에서의 AR 감소를 입증한다. 표 67은 황산 암모늄-Tris-아세테이트 완충액 시스템을 이용한 86mS/cm의 전도도에서의 AR 감소를 입증한다.
그 결과는, 1 내지 86mS/cm의 광범위한 전도도 범위에서 mAb 산성 종이 감소될 수 있음을 입증하였다.
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
실시예 MM 9.8: 아달리무마브와 상이한 완충액 시스템을 이용한 AR 감소의 입증
본 실시예에서, 아달리무마브 및 수지 Capto Adhere을 선택하였다. 다중 pH 및 전도도 조건에서의 하기 표에 열거된 상이한 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 단백질 A 용출물 또는 CEX 용출물로부터 부하 재료 pH를 조정하였다. 그 결과는, 표 68 및 표 69에서 각종 완충액 시스템을 이용하여 mAb 산성 종이 감소될 수 있음을 입증한다.
Figure pct00077
Figure pct00078
실시예 MM 9.9: 상이한 부하를 이용한 AR 감소의 입증
표 66에서의 조건 하에 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 부하 재료는 단백질 A 친화성 포획으로부터의 아달리무마브였고, pH 조정되었다. 각각의 실행시 피크의 상승하는 측에 대해 UV A280의 50mAU 및 피크의 하강하는 측에 대해 150mAU로부터 컬럼 통과액 풀을 수집하였다. 프로파일(도 186)로부터 보여지는 바와 같이, 부하 능력은 AR 감소에 대한 영향을 갖지만, AR 감소는 광범위한 부하 능력에 걸쳐 달성될 수 있고, 단지 AR 감소와 회수 사이의 균형(trade-off)이다.
실시예 MM 9.10: 상이한 부하 농도를 이용한 AR 감소의 입증
본 실시예에서, Capto Adhere을 선택하였다. pH 7.8 ± 0.1 및 전도도 3.0 ± 0.05mS/cm에서 Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 부하 재료는 농축된 CEX 포획으로부터의 아달리무마브였고, pH 조정되었다. 이어서, 제조된 부하 재료를 2개의 부분으로 나누었다. 하나는 Capto adhere 컬럼에 직접 부하하였고, 다른 부분은 평형화 완충액으로 2배 희석하여 상이한 단백질 농도를 제조하였다. 표 70은, 부하 단백질 농도가 mAb 산성 종 감소에 대해 유의한 영향을 갖지 않았음을 입증한다.
Figure pct00079
실시예 MM 9.11: 대안의 세척 양식
본 실시예에서, mAb 아달리무마브 및 수지 Capto Adhere을 선택하였다. Tris/아세테이트 완충액 시스템을 이용하여 실험을 수행하였고, 부하 재료 pH는 단백질 A 용출물로부터 조정되었다. 실행 둘 다를 위한 평형화 완충액은 Tris/아세트산 pH 7.8 ± 0.1 및 전도도 3.0 ± 0.1mS/cm이었다. 농도 구배 전도도 세척 연구에서, 제2 완충액은 Tris/아세트산 pH 7.8 ± 0.1 및 전도도 6.0mS/cm이었다.
그 결과는, 부하 후 pH 및 전도도가, 영향을 받은 최소 AR 감소에 따라 변할 수 있음을 입증하였다(표 71 참조).
Figure pct00080
실시예 MM 9.12: 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 항체 제제 중의 AR 수준의 절대값 달성의 입증
본 실시예에서, mAb 아달리무마브를 선택하였다. 표 72에 열거된 조건 하에 다중 완충액 시스템 및 다중 MM 흡착제를 이용하여 실험을 수행하였다. 부하 재료 pH는 단백질 A 용출물로부터 조정하였다.
상기 기술되어 있는 바와 같이, 아달리무마브에 대한 AR은, WCX-10 방법에서 보여진 피크들의 소정 보유 시간에 기초하여 AR1 및 AR2라고 명명하는 2개의 영역들로 추가로 그룹 분류된다. 이들 2개의 영역들에서의 변이체들의 특징은 상이한 것으로 예측되고, 이러한 이유로, 이들 그룹들에 속하는 변이체들을 감소시키는 방법은 구체적으로 기술될 수 있다. 추가로, 소정 AR 감소를 달성하는 것 이외에도, 소정 변이체들을 감소시키거나 제거하는 것을 고려하여 소정의 절대 수준의 AR 수준을 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 절대 수준의 AR, AR1, 및 AR2를 달성함에 있어서 본 발명의 능력은 표 72에서 입증된다.
Figure pct00081
실시예 MM 9.13: AR 감소에 추가하여 HCP 및 응집체 감소의 입증
산성 종 감소 이외에도, MM 흡착제는 다른 생성물/프로세스 관련 물질/불순물을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 본 발명의 실행시, AR 감소가 이루어지고, 다른 불순물/물질은 유의하게 제거될 것으로 예측되고, 그 이유는 산성 종보다 더 강하게 결합해야만 하기 때문이다. 표 73 및 표 74에 나타낸 데이터는, 상이한 수지, 완충액 시스템, pH, 전도도 및 분자를 이용하여 유의한 HCP 및 응집체 감소를 입증한다.
Figure pct00082
Figure pct00083
실시예 MM 9.14: 대안의 분리 전략과 MM의 조합
MM 흡착제에 의한 산성 종 감소는, 다른 수단에 의한 항체의 포획 후에, 또는 포획 단계에 이어지는 하나 이상의 중간 단계 후에 수행되는 것으로 예측된다. 하기 본 실시예에서, 양이온 교환 포획 단계 또는 단백질 A 친화성 포획 단계 후에 MM 흡착제 단계를 수행하였다. 표 75에 나타낸 바와 같이, AR 감소는 단백질 A 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피 후에 2개의 상이한 전도도에서 달성되었다.
Figure pct00084
아달리무마브는, CEX 크로마토그래피 단계와 이어지는 저 pH 바이러스 불활성화 단계에 의해 정제하였다. 여과된 바이러스 불활성화된 재료를 완충액 교환하였고, Capto Adhere 컬럼 상에 부하하였다. 이어서, Capto Adhere 재료의 통과액을, 결합/용출 방식을 이용한 HIC 컬럼으로 정제하였다. 표 76에 나타낸 바와 같이, AR 감소는 주로 MM 단계와 다른 단계들로부터의 기여로 달성하였다.
Figure pct00085
아달리무마브는, 단백질 A 크로마토그래피 단계와 이어지는 저 pH 바이러스 불활성화 단계를 정제하였다. 여과된 바이러스 불활성화 재료를 완충액 교환하였고, Capto Adhere 컬럼 상에 부하하였다. 이어서, Capto Adhere 재료의 통과액을, 결합/용출 방식 및 통과 방식을 이용한 HIC 컬럼으로 정제하였다. 표 77에 나타낸 바와 같이, AR 감소는 주로 MM 단계와 다른 단계들로부터의 기여로 달성하였다.
Figure pct00086
실시예 10: 표적 AR % 또는 AR 감소를 달성하기 위한 업스트림 및 다운스트 림 프로세스 조합
본 실시예는, 표적 AR 값 또는 AR 감소를 달성하는데 있어서 하나 이상의 업스트림 및 다운스트림 프로세스 기술의 조합된 효과를 입증하고, 이에 의해 특정 전하 이질성을 갖는 항체 조성물의 제조를 가능하게 한다.
실시예 10.1: MM을 이용한 업스트림 및 다운스트림 기술의 조합
본 실시예에서, 업스트림 및 다운스트림 방법의 조합은, 아르기닌(2g/L) 및 리신(4g/L)이 보충된 3L 생물 반응기 세포 배양물에서의 산성 종의 감소를 포함한다. 이러한 전략의 결과는 표 78에 요약한다. 총 산성 종은, 대조군 샘플에서의 20.5%로부터 첨가제가 보충된 배양물 유래의 샘플에서의 10.2%로 감소되었다.
본 연구에서, 300L 생물 반응기의 아미노산 아르기닌(2g/L) 및 리신(4g/L)이 보충된 배지 1(화학적으로 정의된 배지)에서 아달리무마브 생산성 세포주 1을 배양하였다. 배양 12일째에, 배양물을 수거하였고, 이어서, 후속적으로 WCX-10 후 단백질 A 정제를 이용하여 분석하였고, 산성 종에 상응하는 총 피크(들) 면적의 백분율을 정량하였다. 산성 종의 백분율은, 300L 수거 샘플 중에서 9.1%인 것으로 추정된다.
Figure pct00087
AR 수준을 9.1%로 효과적으로 감소시킨, 아르기닌 및 리신 첨가를 사용하여 300L 생물 반응기에 의해 생성된 재료는, 1차 AR 감소 방법으로서 혼합 방식 크로마토그래피를 사용하는 다운스트림 프로세스를 이용하여 정제하였다.
아달리무마브는, 단백질 A 크로마토그래피 단계와 이어지는 저 pH 바이러스 불활성화 단계에 의해 정제하였다. 여과된 바이러스 불활성화된 재료를 완충액 교환하였고, Capto Adhere 컬럼 상에 부하하였다. 이어서, Capto Adhere 재료의 통과액을, 결합/용출 방식 및 통과 방식을 이용한 HIC 컬럼으로 정제하였다. 표 79에 나타낸 바와 같이, AR 감소는 주로 MM 단계와 다른 단계들로부터의 기여로 달성하였다. 또한, 당해 표는, 이들 조합된 기술을 사용하여 추가의 생성물 관련 물질, 예를 들면, 응집체, 및 프로세스 관련 불순물, 예를 들면, HCP를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다.
Figure pct00088
상기 실시예로부터 명백한 바와 같이, MM 방법은 AR 수준을 2.26%까지 추가로 감소시켰다. 따라서, 감소를 위한 업스트림 기술은, 바람직한 AR 수준/AR 감소를 달성하기 위해 다운스트림 기술과 조합할 수 있다.
실시예 CEX 10.2: 프로세스 조합에서의 AR 감소의 입증
양이온 교환을 이용하여 산성 종을 감소시키기 위한 상기 기술되어 있는 방법들은, 독립적인 작동으로서 또는 추가의 산성 종 감소를 제공하는 다른 프로세스 단계들 또는 추가의 상보적 및 보충적 정제를 제공하는 다른 프로세스 단계들과의 조합으로 사용할 수 있다(표 80 내지 표 87 참조). 여기서, 하기 프로세스 조합들이 비-제한적 예로서 제공된다.
1. 친화성 → MM → CEX
2. 친화성 → AEX → CEX
3. 친화성 → CEX
4. CEX 포획 → CEX
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
실시예 10.3: 프로세스 조합: Tris / 포르메이트 완충액 시스템을 이용한 단백질 A, AEX , CEX 조합
실시예 10.3에서, Tris/포르메이트 완충액 시스템에서의 AEX 및 CEX 크로마토그래피를 이용한 미세 정제에 이은 단백질 A 친화성 포획 프로세스 조합을 통한 AR 감소가 실험되었다.
재료 및 방법
재료
항체
정화된 수거물의 친화성 포획 후 아달리무마브 모노클로날 항체 제제가 얻어졌다. 포획 단계로부터의 용출물은 필요에 따라 완충액 교환하였다.
AEX 흡착제:
본 실험에서, 가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 리지드 50㎛ 중합체성 비드인 Poros 50HQ(Applied Biosciences, part# 1-2459-11)을 사용하였다.
CEX 흡착제:
본 실험에서, 가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 리지드 50㎛ 중합체성 비드인 Poros XS(Applied Biosciences, part# 4404338)를 사용하였다.
방법
AEX 크로마토그래피 방법
1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 Poros 50HQ를 팩킹하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충액 시스템에서 상기 컬럼을 평형화시켰다. 명시된 바와 같은 표적 이온 농도를 얻기 위해 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 부하물을 제조하여, 명시된 바와 같은 컬럼에 부하하였고, 이어서, 20CV를 위해 평형화 완충액으로 세척하였다. 부하 및 세척 단계 동안에 통과액 및 세척 분획으로 항체 생성물을 수집하였다. 이어서, 100mM 포르메이트로 컬럼/하우징을 재생시켰고, 1M의 NaOH 용액을 컬럼 세정에 사용하였다.
CEX 크로마토그래피 방법
1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 Poros XS를 팩킹하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충액 시스템에서 상기 컬럼을 평형화시켰다. 명시된 바와 같은 표적 이온 농도를 얻기 위해 완충액 교환 또는 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 부하물을 제조하여, 대략 40g(또는 명시된 바와 같이) 단백질/L 수지를 컬럼에 부하하였고, 이어서, 20CV를 위해(또는 명시된 바와 같이) 평형화 완충액으로 세척하였다. 이어서, 항체 생성물을 용출하였고, 컬럼을 재생시켰다.
완충액 제조 방법
음이온 농도(산)를 표적 값으로 고정하고 양이온 구성성분(염기)을 이용하여 용액이 적절한 pH를 달성하도록 조정함으로써 음이온에 대해 특정 이온 농도를 표적으로 하는 AEX용 완충액을 제조하였다. 예를 들면, 10mM 포르메이트-Tris 완충액을 제조하기 위해서, pH 8.7 포름산을 물에 10mM의 표적 농도로 용해시켰고, 농축된 Tris-염기를 이용하여 pH 8.7로 조정하였다.
양이온 농도(염기)를 표적 값으로 고정하고 음이온 구성성분(염기)을 이용하여 용액이 적절한 pH를 달성하도록 조정함으로써 양이온에 대해 특정 이온 농도를 표적으로 하는 CEX용 완충액을 제조하였다. 예를 들면, 140mM Tris-포르메이트 완충액을 제조하기 위해서, pH 7.5 Tris 염기를 물에 140mM의 표적 농도로 용해시켰고, 포름산을 이용하여 pH 7.5로 조정하였다.
AR 감소 및 회수 계산
일반적으로, 용출물 분획 및 통과액(FT)/세척 분획을 수집하였고, WCX-10 방법을 이용하여 AR 수준에 대해 분석하였다. 분획들의 실제 또는 계산된 풀링에 의해 회수 및 상응하는 AR 수준을 계산하였다.
분석 방법
아달리무마브에 대한 WCX -10
아달리무마브 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체는 하기 방법에 따라 정량하였다. 분석 컬럼 4mm x 250mm(Dionex, CA)인 Dionex ProPac WCX-10 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. Agilent 1200 HPLC 시스템을 HPLC로서 사용하였다. 사용된 이동상은 10mM 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM 이염기성 인산 나트륨, 500mM 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은, 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초하였다. 소정 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를 산성 피크로서 함께 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피
수집된 샘플의 분자량 분포를, 하기 방법에 따라 정량하였다. HP Agilent HPLC 시스템 상의 TSK-겔 G3000SWxL, 5㎛, 125Å, 7.8 X 300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다. 등용매 용출 조건 하에 200mM 황산 나트륨, 100mM 인산 나트륨, pH 6.8을 이용하여 주사하고, 214nm에서의 흡광도로 검출하였다. 정량은, 검출된 피크의 상대적 면적에 기초하였다.
UV 분광학 A 280
UV A280을 이용하여 단백질 A 용출 후 샘플에 대한 단백질 농도를 측정하였다. Agilent UV 분광광도계에 대해 검정을 수행하였다. Beer-Lambert 법칙, A = εlc(여기서, A는 흡광도이고, ε은 흡광 계수이고, l은 경로 길이이고, c는 농도이다)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 280nm에서 흡광도를 측정하였고, 경로 길이는 1cm였고, 흡광 계수는 아달리무마브에 대해 1.39였고, mAb B에 대해 1.38이었고, mAb C에 대해 1.43이었다.
결과
Tris/포르메이트 완충액 시스템에서 Poros 50HQ 및 Poros XS를 이용한 미세 정제에 이어지는 단백질 A 친화성 포획의 프로세스 조합을 통한 AR 감소를 하기와 같이 수행하였고, 이는, 1.4%의 최종 AR을 초래하였다. 유동 경로에 따른 이러한 예시적 저 AR 프로세스는 도 190에 제시된다.
단백질 A
단백질 A 친화성 포획에 관해, 2.2 x 20cm MabSelect SuRe(GE Healthcare) 컬럼을 팩킹하였고, HETP/Asymmetry 분석에 의해 자격을 확인하였다. 4분의 체류 시간으로의 결합-용출 방식을 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 수지 리터당 37g의 단백질을 컬럼에 부하하였다.
컬럼은, 고농도 Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 세척하였고, 저농도 Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 세정하였고, 후속적으로 저 pH Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 용출하였다. 이어서, 컬럼을 재생시켰고, 수지에 적절한 하이드록시드 용액으로 세척하였다.
포름산을 이용하여 MabSelect Sure™ 용출물 풀을 pH 3.7로 적정하였고, 1시간 동안 두었다. 산성화된 재료를 주위 온도에서 1시간 동안 혼합하였다. VI 풀을 8.7의 pH로 중화시켰다(즉, AEX 부하). 부하하기 전에 AEX 부하물을 여과하였다.
AEX 크로마토그래피
Poros 50HQ 수지로 팩킹된 1.0cm 직경 x 9.5cm 길이 컬럼을 이용하여 AKTAavant25 시스템 상에서 모든 AEX 크로마토그래피 실험을 수행하였고, HETP/Asymmetry 분석에 의해 자격을 확인하였다. 각각의 실험은 주위 온도에서 수행하였다. AEX 단계는 225g/L의 수지 부하로 수행하였다. 평형화 및 부하는, 저 농도의 포르메이트/Tris 완충액, 예를 들면, 15mM의 포르메이트/Tris 완충액을 이용하여 8.7의 pH에서 수행하였다. 세척은, 아세테이트 및 Tris를 이용하여 동일한 pH에서 수행하였다. 각각의 실행은, 3분의 체류 시간에서 약 10g/L의 부하 농도로 주위 온도에서 수행하였다. 컬럼을 재생시켰고, 수지에 적절한 용액으로 세척하였다.
하기 분획에서 통과액을 수집하였다: 100mAu-175g/L, 175g/L 내지 200g/L, 200g/L 내지 225g/L + 1CV의 세척. 이어서, A280 질량 분광법에 의해 상기 분획들을 측정하였고, WCX-10 및 SEC 검정에 의해 분석하였다.
Tris 및 포름산의 스톡 용액을 이용하여 Poros 50HQ FTW 풀을 135mM Tris/포르메이트 pH 7.5로 조정하였다.
CEX 크로마토그래피
Poros XS 수지로 팩킹된 1.0cm 직경 x 11cm 길이 컬럼을 이용하여 AKTAavant150 시스템 상에서 모든 CEX 크로마토그래피 실험을 수행하였고, HETP/Asymmetry 분석에 의해 자격을 확인하였다. 각각의 실험은, 주위 온도에서 5.8mg/mL 부하, 40g/L 수지 부하, 및 6분의 체류 시간을 이용하여 수행하였다. 평형화, 부하, 및 세척은, 고농도의 Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 7.5의 pH에서 수행하였다. 황산 나트륨 및 Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 용출하였다. 용출물은 400mAU 내지 100mAU의 한 분획으로 수집하였다. 3회 사이클을 수행하였다. 컬럼을 재생시켰고, 수지에 적절한 용액으로 세척하였다.
Virosart CPV 바이러스 필터를 이용하여 UFDF 프로세싱 전에 Poros XS 용출물에 대해 바이러스 여과를 수행하였다.
Ultracel 3 Biomax 30kDa 필터를 (물에의) 투석여과 및 CEX 용출물의 농축에 사용하였다.
Poros50HQ 분획의 누적 AR은, 함께 풀링되도록 하는 6% 미만이었고, CEX 부하 조건으로 조정하였다. 3회 사이클의 CEX를 수행하였다. 3회의 CEX 용출 사이클은 모두 3% 미만의 AR, 및 0.2% 미만의 HMW를 가졌고, 함께 풀링되었다.
각각의 단위 작동에 대한 단계 수율은, 38%로 달성되는 최종 전체 수율과 함께 표 88에 열거된다. 당해 프로세스는, 1.4%의 최종 AR(0.0%의 AR1 및 1.4%의 AR2) 및0.10%의 최종 HMW를 갖는 아달리무마브 조성을 달성하는 것이 가능하였다.
Figure pct00097
실시예 11: "재순환" AEX 및 CEX 기술을 이용한 AR 감소
본 실시예는, AEX, CEX, 및 MM 기술을 이용한 AR 감소를 위한 크로마토그래피의 "재순환" 방식을 기술한다.
재료 및 방법
재료
항체
아달리무마브 모노클로날 항체 제제는, 정화된 수거물의 친화성 포획 후에 얻어진 재료였다. 포획 단계로부터의 용출물은 필요에 따라 완충액 교환하였다.
AEX 흡착제:
가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 리지드 50㎛ 중합체성 비드인 Poros 50HQ(Applied Biosciences, part# 1-2459-11)를 본 실험에 사용하였다.
CEX 흡착제:
가교-연결된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 이루어진 백본을 갖는 리지드 50㎛ 중합체성 비드인 Poros XS(Applied Biosciences, part# 4404338)를 본 실험에 사용하였다.
방법
AEX 크로마토그래피 방법
Poros 50HQ를 1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 팩킹하였다. 상기 컬럼을 완충액 시스템에서 적절한 pH 및 전도도로 평형화시켰다. 표적 이온 농도를 수득하기 위해 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 부하물을 제조하였고, 이를 컬럼에 부하하였고, 이어서, 20CV의 평형화 완충액으로 세척하였다. 부하 및 세척 단계 동안에 통과액 및 세척 분획에서 항체 생성물을 수집하였다. 이어서, 100mM 포르메이트를 이용하여 컬럼/하우징을 재생시켰고, 1M의 NaOH 용액을 컬럼 세척에 사용하였다.
CEX 크로마토그래피 방법
Poros XS를 1.0cm x 10.0cm(OmniFit) 컬럼에 팩킹하였다. 상기 컬럼을 완충액 시스템에서 적절한 pH 및 전도도로 평형화시켰다. 명시된 바와 같은 표적 이온 농도를 수득하기 위해 완충액 교환 또는 스톡 용액의 첨가에 의해 평형화 완충액에서 컬럼 부하물을 제조하였고, 이를 컬럼에 대략 40g 단백질/L 수지로(또는 명시된 바와 같이) 부하하였고, 이어서, 20CV의(또는 명시된 바와 같이) 평형화 완충액으로 세척하였다. 이어서, 항체 생성물을 용출시켰고, 컬럼을 재생시켰다.
완충액 제조 방법
AEX용 완충액은, 음이온 농도(산)를 표적 값으로 고정시키고, 양이온 구성성분(염기)을 갖는 용액을 적절한 pH가 달성되도록 조정함으로써 음이온에 대한 특정 이온 농도를 표적화하여 제조하였다. 예를 들면, 10mM 포르메이트-Tris 완충액, pH 8.7을 제조하기 위해, 물에 포름산을 10mM의 표적 농도로 용해시키고, 농축된 Tris-염기를 이용하여 pH 8.7로 조정하였다.
CEX용 완충액은, 양이온 농도(염기)를 표적 값으로 고정시키고, 음이온 구성성분(산)을 갖는 용액을 적절한 pH가 달성되도록 조정함으로써 양이온에 대한 특정 이온 농도를 표적화하여 제조하였다. 예를 들면, 140mM Tris-포르메이트 완충액, pH 7.5를 제조하기 위해, 물에 Tris 염기를 140mM의 표적 농도로 용해시키고, 포름산을 이용하여 pH 7.5로 조정하였다.
AR 감소 및 회수율 계산
일반적으로, 용출물 분획 및 통과액/세척 분획을 수집하였고, WCX-10 방법을 이용하여 AR수준에 대해 분석하였다. 상기 분획들의 실제 또는 계산된 풀링에 의해, 회수율 및 상응하는 AR 수준을 계산하였다.
분석 방법
아달리무마브에 대한 WCX-10
아달리무마브 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체는 하기 방법에 따라 정량하였다. 분석 컬럼 4mm x 250mm(Dionex, CA)인 Dionex ProPac WCX-10 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 사용된 이동상은 10mM 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM 이염기성 인산 나트륨, 500mM 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은, 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초하였다. 소정 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를 산성 피크로서 함께 나타낸다.
크기 배제 크로마토그래피
수집된 샘플의 분자량 분포를, 하기 방법에 따라 정량하였다. HP Agilent HPLC 시스템 상의 TSK-겔 G3000SWxL, 5㎛, 125Å, 7.8 X 300mm 컬럼(Tosoh Bioscience)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다. 등용매 용출 조건 하에 200mM 황산 나트륨, 100mM 인산 나트륨, pH 6.8의 이동상을 이용하여 주사하고, 214nm에서의 흡광도로 검출하였다. 정량은, 검출된 피크의 상대적 면적에 기초하였다.
UV 분광학 A 280
UV A280 분광법을 이용하여 단백질 A 용출 후 샘플에 대한 단백질 농도를 측정하였다. Agilent UV 분광광도계에 대해 검정을 수행하였다. Beer-Lambert 법칙, A = εlc(여기서, A는 흡광도이고, ε은 흡광 계수이고, l은 경로 길이이고, c는 농도이다)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 280nm에서 흡광도를 측정하였고, 경로 길이는 1cm였고, 흡광 계수는 아달리무마브에 대해 1.39였고, mAb B에 대해 1.38이었고, mAb C에 대해 1.43이었다.
실시예 11.1: 재순환 AEX 크로마토그래피
본 실시예에서, 순환 전략을 사용하여 주어진 표적 생성물 품질 기여를 위한 회수 수율을 증가시켰다. 주어진 포르메이트 농도 및 pH에 대한 AR 감소는, 부하를 조정함으로써 조정할 수 있다. 또한, 회수 수율은, 주어진 부하에 대해 고정된다. 이러한 전략에서, 부하는, 통과액 분획에서 표적 AR 수준을 달성하도록 선택된다. 이어서, 컬럼은, 부하보다 약간 더 높은 포르메이트 농도로 용출된다. 용출물을 수집하고, 이어서, 물로 희석시켜 부하 포르메이트 농도에 매칭시키고, 부하 탱크에 다시 첨가한다. 이러한 컬럼 순환은 수회 반복한다(그리고, "재순환" 크로마토그래피"라고 칭한다).
이러한 실험에 관해, 통과액(FT) 풀 중의 표적 AR 수준은 5%로 설정하였다. 우선 Poros 50HQ 컬럼을 200g/L의 수지에 부하하였고, 평형화/세척 완충액 및 부하 조건 15mM 아세테이트/Tris pH 8.7을 이용하여 수지에 부하된 20g/L의 단백질에서 통과액을 수집하였다. 통과액 분획에 WCX-10 검정을 수행하였고, 누적 AR 파과율을 계산하였다. 수지에 부하된 150g/L의 단백질에서 발생하는 5%의 누적 AR 파과율이 관찰되었고, 모든 후속적 실험은 150g/L 부하에서 실행하였다.
순환상은, 표 89에 설명된 스킴(scheme)을 포함하였다. AEX 부하물은, 3M Tris를 이용하여 MabSelect SuRe 용출물을 적절한 pH로 조정함으로써 제조하였고, 15mM 아세테이트로 희석시켰고, 이어서, 여과하였다. 부하 및 세척의 통과액을 2개의 별도의 용기에 수집하였다. 세척물을 충분한 MabSelect SuRe 용출물과 섞어 150g/L로 다른 순환을 수행하였고, 조건을 15mM 아세테이트/Tris pH 8.7로 조정하였다. 상기 기술된 순차의 단계들을 이용하여 총 4회의 순환을 수행하였다. 각각의 실행은, 표 89에 열거된 크로마토그래피 조건에 따라 주위 온도에서 3분의 체류 시간으로 수행하였다. 100mAu로부터 단계의 종료까지 통과액을 한 분획으로 수집하였고, 단계의 개시로부터 50mAu까지 세척액을 수집하였다. 이어서, FT 세척액은 A280에 의해 측정하였고, WCX-10 및 SEC 검정에 의해 분석하였다.
Figure pct00098
본 연구에서 프로세스 불순물의 수준을 제어하는 수단으로서 AEX 컬럼에 대해 세척 분획을 순환시키는 것을 실행하였다. 각각의 사이클(Cn)에서 세척 분획을 수집하였고, 적절한 부하 조건으로 조정하였고, 후속적 사이클(Cn+1)에서 부하하였다. 부하량은, 5%의 AR 파과율을 제공하도록 조정하였다. 총 4회 사이클을 수행하였다.
Figure pct00099
단계 수율 및 생성물 품질은 표 90에 열거된다. 리신 %(총합 리신 변이체, 즉, 0, 1, 또는 2 말단 리신을 함유하는 mAb인 Lys 0, Lys 1 및 Ly2)는, 생성물의 바람직한 (비-AR 함유) 분획의 정량이고, 여기서 재순환 방법이 바람직한 생성물의 93% 초과를 회수할 수 있음을 나타내기 위해 제공된다. 보다 높은 수준의 AR을 함유하는 생성물을 각각의 사이클의 세척 분획에서 회수하고, 이는, 이어서, 후속적 AEX 사이클에 다시 재순환된다. 세척 분획의 재순환은 누적 수율을 향상시키고, 한편, 표 91에 나타낸 바와 같이 생성물 품질을 유지한다. 누적 수율은 4회 사이클로 65%로부터 81%로 증가하였고, 한편, AR 수준을 약 6%로 그리고 단량체 수준을 약 99.4%로 유지하였다.
Figure pct00100
실시예 11.2: 재순환 CEX 크로마토그래피
이들 실험은, CEX 부하 재료로서 단백질 A 용출물을 이용하여 수행하였다. 사이클 1(대조군)은, 160mM Tris-아세테이트, pH 7.5, 40g 단백질/L 수지의 부하/세척 완충액 조건 하에 수행하였다. 사이클 2는, 사이클 1로부터의 세척액 부분 및 부하 재료로서의 신선한 단백질 A 용출물을 조합함으로써 수행하였다. 보다 높은 AR을 함유한 (피크에 도달하기 전의) 보다 이른 세척액은 제거하였고, 세척액의 나머지는 부하에 포함시켰다. 부하 및 세척 조건은 사이클 1과 동일한 조건이었다. 사이클 3 및 사이클 4는 사이클 2와 동일한 방식으로 수행하였다.
표 92에 나타낸 결과는, 4회 실행으로의 재순환 크로마토그래피가 53.4%로부터 65.1%로 수율을 증가시킴을 나타낸다. 사이클 1에 대한 AR 감소는 8.84%이고, 반면, 4 사이클 재순환 크로마토그래피는 7.79%이다. 유사한 생성물 품질을 달성하면서, 재순환 크로마토그래피 접근법은 수율을 유의하게 향상시킬 수 있다.
Figure pct00101
실시예 11.3: MM 재순환 크로마토그래피를 이용한 AR 감소
하기 재료 및 방법을 실시예 11.3에 대해 사용하였다.
재료 및 방법
단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 포획된 재료
300L 생물 반응기(SUL101912)로부터 얻어진 아달리무마브 정화된 수거물 재료를 단백질 A 친화성 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, MabSelect SuRe)에 부하하였고, 다운스트림 프로세스 생성물 트레인에서 사용된 완충액 구성성분만을 함유하는 설계된 완충액 시스템으로 용출시켰다. 본 연구의 경우에 있어서, MabSelect SuRe 수지에 결합된 아달리무마브는 20mM 아세트산으로 용출시켰다.
수지
다중 방식 배지는, 전통적 이온 교환 배지와 비교하여 상이한 선택성을 제공하는 다중 기능성 그룹을 갖는 리간드 및/또는 염기 매트릭스를 갖는다. 이들 예에서, 음이온 교환 및 소수성 상호작용 기능성 그룹을 갖는 다중 방식 배지는, 항체 제제로부터 산성 종 및 다른 불순물을 제거하는 것으로 밝혀진다.
본 연구에서, 다중 방식 기능성을 갖는 강한 음이온 교환체인 Capto adhere(GE Healthcare, HiScreen™ 사전 팩킹된 컬럼, Cat# 28-9269-81)을 평가하였다. 이의 염기 매트릭스는, 상호작용, 예를 들면, 이온성 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용에 대해 다수의 기능성을 나타내는 리간드 (N-벤질-N-메틸 에탄올 아민)을 갖는 고도로 가교-연결된 아가로스이다. 이들 리간드들은 단백질 분리를 위한 상이한 선택성 및 소수성 옵션을 제공한다.
Capto Adhere 리간드 구조
Figure pct00102
방법
크로마토그래피 방법
하기 실험에서는 사전-팩킹된 수지 컬럼을 사용하였다. 적절한 pH 및 전도도를 갖는 완충액 시스템에서 컬럼을 평형화시켰다. 프로세스는 도 191로서 설명된다. 컬럼 부하물은 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터 제조되었다. 제조된 부하 재료를 여과하였고, 명시된 바와 같은 표적 부하량(g 단백질/L 수지)에 따라 컬럼에 부하하였고, 이어서, 평형화 완충액 및 명시된 바와 같은 체적의 평형화 완충액과 유사한 세척 완충액으로 세척하였다. 부하 동안의 컬럼 통과액을 풀로서 수집하였고, 세척 동안의 컬럼 통과액을 별도로 수집하였다. 이어서, 다음 사이클 사용을 위해 0.1M 아세트산(pH 3) 용액을 이용하여 상기 컬럼을 재생시켰다. 사이클 A 세척 풀을 단백질 A 용출물과 혼합하여, 하기 사이클에 대해 표적 능력으로 부하하기 위한 항체 재료를 제조하였다. 조합된 풀(세척 풀 + 단백질 A 용출물)의 pH 및 전도도는, 2M Tris 및 Milli Q 수를 사용하여 조정하여 설계된 pH 및 전도도를 달성하였다. 이어서, 이러한 재료 0.45㎛ 필터(Corning 폴리스티렌)를 통해 여과하였다.
완충액 제조 방법
음이온 구성성분 용액(산)을 표적 값으로 시작하고, 상기 용액을 양이온 구성성분(염기)으로 조정하여 적절한 pH를 달성하고, 후속적으로 물을 첨가하여 표적 전도도를 달성함으로써 특정 pH 및 전도도를 표적으로 하는 완충액을 제조하였다. 예를 들면, pH 7.85 및 2.5mS/cm의 전도도를 갖는 Tris-아세테이트 완충액을 제조하기 위해, 3M Tris 용액을 이용하여 250mM 아세트산 용액을 7.85 ± 0.05으로 pH 조정하였고, 이어서, 물을 첨가하여 용액의 전도도를 2.5 ± 0.5mS/cm로 조정하였고, 이어서, 필요에 따라 3M 아세트산 용액 또는 3M 또는 2M Tris 용액을 첨가함으로써 최종 용액 pH를 7.85 ± 0.05로 확인하거나 조정하였다.
본 연구에서, pH 7.9 및 전도도 2.5mS/cm를 갖는 Tris/아세테이트 완충액을 컬럼 평형화에 사용하였고; pH 7.9 및 전도도 5.0mS/cm를 갖는 Tris/아세테이트 완충액을 부하 후 세척 완충액으로 사용하였다.
Capto Adhere 부하 재료 제조
사이클 A:
2M Tris를 이용하여 단백질 A 용출물을 pH 7.9로 적정하였고, Milli Q 수를 이용하여 2.5mS/cm의 전도도로 희석시켰다. 이어서, 제조된 재료를 컬럼에 부하하기 전에 0.22㎛ 필터로 여과하였다.
사이클 B:
전체 사이클 A 세척 풀을 단백질 A 용출물과 혼합하여 하기 사이클에 대해 충분한 부하물을 제조하였다. 2M Tris 및 Milli Q 수와 혼합한 후 pH 및 전도도를 조정하여 pH 7.9 및 2.5mS/cm의 전도도를 달성하였다. 이어서, 이러한 재료를 컬럼에 부하하기 전에 0.45㎛ 필터(Corning 폴리스티렌 필터)를 통해 여과하였다.
사이클 C:
전체 사이클 B 세척 풀을 단백질 A 용출물과 혼합하여 하기 사이클에 대해 충분한 부하물을 제조하였다. 2M Tris 및 Milli Q 수와 혼합한 후 pH 및 전도도를 조정하여 pH 7.9 및 2.5mS/cm의 전도도를 달성하였다. 이어서, 이러한 재료를 컬럼에 부하하기 전에 0.45㎛ 필터(Corning 폴리스티렌 필터)를 통해 여과하였다.
사이클 D:
전체 사이클 C 세척 풀을 단백질 A 용출물과 혼합하여 하기 사이클에 대해 충분한 부하물을 제조하였다. 2M Tris 및 Milli Q 수와 혼합한 후 pH 및 전도도를 조정하여 pH 7.9 및 2.5mS/cm의 전도도를 달성하였다. 이어서, 이러한 재료를 컬럼에 부하하기 전에 0.45㎛ 필터(Corning 폴리스티렌 필터)를 통해 여과하였다.
AR 감소 및 회수율 계산
일반적으로, 통과액/세척 분획을 수집하였고, WCX-10 방법을 이용하여 AR수준에 대해 분석하였다. 상기 분획들의 실제 또는 계산된 풀링에 의해, 회수율 및 상응하는 AR 수준을 계산하였다.
분석 방법
아달리무마브에 대한 WCX-10
아달리무마브 프로세스 샘플 중에 존재하는 산성 종 및 다른 전하 변이체는 하기 방법에 따라 정량하였다. 분석 컬럼 4mm x 250mm(Dionex, CA)인 Dionex ProPac WCX-10 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. Agilent 1200 HPLC 시스템을 HPLC로서 사용하였다. 사용된 이동상은 10mM 이염기성 인산 나트륨 pH 7.5(이동상 A) 및 10mM 이염기성 인산 나트륨, 500mM 염화 나트륨 pH 5.5(이동상 B)였다. 이원 농도구배(94% A, 6% B: 0 내지 20분; 84% A, 16% B: 20 내지 22분; 0% A, 100% B: 22 내지 28분; 94% A, 6% B: 28 내지 34분)를 280nm에서의 검출과 함께 사용하였다.
정량은, 검출된 피크의 상대적 면적 백분율에 기초하였다. 소정 시간보다 더 적은 상대적 체류 시간에서 용출되는 피크를 산성 피크로서 함께 나타낸다.
UV 분광학 A 280
UV A280을 이용하여 단백질 A 용출 후 샘플에 대한 단백질 농도를 측정하였다. Agilent UV 분광광도계에 대해 검정을 수행하였다. Beer-Lambert 법칙, A = εlc(여기서, A는 흡광도이고, ε은 흡광 계수이고, l은 경로 길이이고, c는 농도이다)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 280nm에서 흡광도를 측정하였고, 경로 길이는 1cm였고, 흡광 계수는 아달리무마브에 대해 1.39였다.
재순환 및 연속적 크로마토그래피의 입증
본 실시예에서, 아달리무마브 및 수지 Capto Adhere을 선택하였다. 각각의 사이클에서 수지 리터당 75그램의 아달리무마브를 Capto Adhere 컬럼에 부하하였고, 총 4회 사이클을 수행하였다. Capto Adhere 컬럼에 부하된 100g/L의 부하 재료를 이용한 단일 실행을 참조로서 실행하여 AR 감소 및 mAb 회수를 비교하였다. 도 192는, MM 프로세스의 각각의 사이클의 부하, 통과액 풀(FT), 세척 풀(세척) 중의 AR 백분율, 및 전체 FT 중의 누적 AR %를 설명한다. 도 192에 나타낸 바와 같이, 이전 사이클로부터 얻어진 세척 풀 중의 보다 높은 AR %로 인하여 증가된 각각의 사이클에서의 부하 AR %를 재-프로세싱하였고, 이는 통과액 풀 중의 AR %의 약간의 증가를 초래하였다.
도 192로부터, 대략 5%의 전체 감소를 달성하는 수집된 풀 중의 AR 수준이 4회 사이클 모두에서 유지됨이 명백해진다. 따라서, 재순환 방식은 생성물 AR 수준을 유지할 수 있음이 명백해진다. 표 93은 각각의 단계에 대해 수득된 회수율 및 전체 회수율을 보여준다. 재순환 방식은, 4회 사이클을 실행한 경우에 유사한 생성물 품질을 달성하는 단일 실행과 비교하여 회수율에서의 유의한 향상(10% 증가)을 초래함이 명백해진다. 표 93에서 보여지는 바와 같이, 누적 회수율은 각각의 추가의 사이클에 따라 증가한다. 따라서, 사이클의 수를 증가시킴으로써 추가의 향상이 달성될 수 있다. 또한, 사이클 1에서의 수행 대 사이클 1 내지 4에서의 수행(누적)을 비교하는 경우, 크로마토그래피 방식을 사용함으로써 회수율에서의 20% 증가가 달성될 수 있음이 명백해진다.
Figure pct00103
실시예 12: AR 감소의 보관
본 발명은, 목적하는 주어진 단백질에 대해 산성 종을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 실시예에서, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 AEX 및 CEX 정제 기술과 함께 본 발명에서 나타낸 바와 같은 세포 배양물에의 아르기닌 및 리신의 보충의 조합을 이용하여 아달리무마브를 제조하여 각각 2.5% 및 6.9%의 최종 AR을 갖는 저-AR 및 고-AR 샘플을 제조하였다. 상기 샘플 둘 다를, 25℃ 및 65% 상대 습도로 제어된 환경에서 10주 동안 항온배양하였고, 2주마다 AR 측정하였다. 도 164는 10주의 항온배양에 걸친 각각의 샘플에 대한 AR의 성장을 보여준다. 도 164로부터, AR의 성장률은 선형이고 저-AR 및 고-AR 샘플 둘 다의 사이에 유사함이 명백해진다. 이들 결과에 기초하여, 감소된 AR 재료는 고-AR 샘플과 동일한 AR 수준에 도달하기 전에 3배 더 길게 보관할 수 있다. 이는 치료학적 사용을 위한 다른 단백질의 보관 취급 및 사용에 매우 유리할 수 있으므로 유의하게 유용하다. 또한, 상기 나타낸 바와 같이, 보관-유도된 AR의 형성은, 제제가 특정 조건 하에 보관되는 경우에 억제될 수 있다. 예를 들면, 수성 제형은 특정 온도에서 보관하여 AR 형성이 부분적으로 또는 완전하게 억제될 수 있다. 또한, 형성 또는 보관-유도된 AR은, 약 2℃와 8℃ 사이에서 보관된 수성 제형에서 부분적으로 억제될 수 있고, -80℃에서 보관된 경우 완전하게 억제될 수 있다. 또한, 저 AR 조성물은 동결건조하여 보관-유도된 AR의 형성이 부분적으로 또는 완전하게 억제될 수 있다.
실시예 13: 저 AR 조성물의 증가된 생물학적 활성
본 실시예는, 생체내 아달리무마브를 포함하는 예시적 저 AR 조성물의 증가된 효능을 기술한다. 본 실시예에서 사용된 저 AR 조성물은, 상기 실시예 8.14에 기술된 바와 같이 CEX 감소 방법을 이용하여 제조하였다. 특히, 본 실시예에서 사용된 저 AR 조성물은, 7.5의 pH에서 Tris/포르메이트 완충액 시스템에서 Poros XS 컬럼을 이용하여 제조하였다. 저 AR 조성물은 3.1%의 AR을 갖고, 여기서, 상기 조성물은 0.1%의 AR1 및 3.0%의 AR2를 포함한다. 본 실시예에서, 이 조성물은 "저 AR 조성물"로서 나타낸다.
관절염을 위한 동물 모델
이러한 저 AR 아달리무마브 조성물의 효능을 연구하기 위해서, 사람 TNF-Tg197 마우스를 이용하여 생체내에서 실험을 수행하였다. TNF-Tg197 마우스 모델은, 항-사람 TNFα 치료 방식을 시험하는데 사용되는 익히 인식되어 있는 관절염의 마우스 모델이다. TNF-Tg197 마우스 모델은 문헌[Keffer, J. et al., (1991) EMBO J 10:4025-4031]에 기술되어 있고, 상기 문헌의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다. 생체내에서의 과량의 TNF 생산 효과를 연구하기 위한 사람 TNF 유전자를 지니는 유전자전이 마우스를 개발하였다.
Tg197 마우스는 양쪽 뒷발의 발목 관절에서 종창 및 손상된 운동을 발병하고, 이는 사람 류마티스 관절염과 매우 유사하다. Tg197 마우스에서의 질환의 임상학적 징후는 4주의 연령에서 시작하고, 보다 느린 체중 증가, 관절 염좌 및 종창, 관절 변형 및 강직증 및 손상된 운동을 포함한다. 조직병리학적 분석은, 활막의 과다형성증, 대략 3주의 연령에서의 백혈구 침윤, 및 이어서 판누스(pannus) 형성, 9 내지 11주의 연령에서의 질환의 진행 단계에서의 관절 연골 파괴 및 섬유 조직의 대량 생성을 밝힌다. 이러한 모델은 아달리무마브를 포함하는 항-TNFα 치료제의 개발에 사용되어 왔다.
방법
마우스의 그룹(6마리 수컷 및 6마리 암컷)에 하기 아달리무마브 제형들 중 하나를 투여하였다: 저 AR 조성물(그룹 5), 저 숙주 세포 단백질(HCP) 조성물(그룹 7), AR1 조성물(AR1 산성 변이체만을 함유함)(그룹 8), 및 Lys-1/2 조성물(Lys 1 및 Lys 2 변이체만을 함유함)(그룹 9). 이들 조성물(분획)은 도 193의 크로마토그래프에 나타낸다. 마우스의 다른 그룹에, 변형되지 않은 AR 수준 및 변형되지 않은 Lys 변이체를 갖는 아달리무마브를 함유하는 "대조군 AR 조성물" 또는 "정상" 조성물로서도 나타내어지는 대조군 조성물을 투여하였다. 6마리 마우스를 포함하는 위약 그룹도 포함되었다.
대조군 AR 조성물을 포함하는 각각의 조성물을, 1주의 연령에서 아달리무마브의 내성 용량(tolerizing dose)으로 시작하여, 이어서, 1mg/kg의 추가의 주당 용량으로 10주 동안 각각의 그룹의 마우스에게 투여하였다. 2.5주 내지 13.5주까지, 매주 체중 및 관절염 스코어 측정을 수행하였고, 매주 혈청을 수집하였다. 또한, 연구의 종료시, 관류된 마우스로부터의 조직 샘플을 수득하였고, 분석하였다. 약물 수준, 항-약물 항체(ADA), 및 복합 및 유리 TNF 수준을 시험하기 위해 하기 조직을 수거하였다: 앞발, 서혜부, 슬와 및 장간막 림프절, 비장, (피부 샘플을 위한) 꼬리, 무릎. 마이크로-CT 스캐닝을 위해 대퇴골 및 척추 조직을 수거하였다.
결과
도 194A에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물을 투여 받은 마우스는, 대조군 AR 조성물을 포함하여 시험된 모든 조성물들 중 최저 관절염 스코어를 가졌고, 이는, 관절염의 치료에 있어서 증가된 효능을 나타낸다. 또한, 도 194B에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물이 투여된 마우스는, 대조군 조성물과 비슷한 평균 체중 증가를 나타냈고, 이는, 저 AR 조성물의 안전성 및 마우스의 체중 증가 및 성장에 영향을 미치는 저 AR 조성물의 부작용의 부재를 나타낸다.
도 195에 나타낸 바와 같이, 마우스의 12 내지 13주 치료 기간 동안, 저 AR 조성물은, 시험된 다른 조성물들과 비교하여 관절염 스코어에 의해 측정된 마우스에서의 관절염의 발병에 대해 최고의 보호를 제공하였다. Lys-1/2 조성물이 다음으로 가장 효과적이었다. AR1 조성물은 관절염 스코어의 발병에 대해 가장 적은 보호를 제공하였고, 이는 대조군 AR 조성물보다 덜 보호적이었다.
ADA의 혈청 수준 및 약물 수준은 3 내지 14주의 연령에 측정하였다. 도 196B에나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물이 투여된 동물은, 측정된 시간 프레임에 걸쳐 낮은 평균 수준의 ADA를 나타냈다. 또한, 저 AR 조성물이 투여된 동물은, 대조군(도 196A)과 비슷한 약물 혈청 수준을 나타냈고, 이는, 혈청 중의 약물의 부재가 저 수준의 혈청 ADA에 관여하지 않았음을 나타낸다.
도 197에 제시되는 바와 같이, 10주의 치료 기간 동안의 누적 혈청 농도 값(PK)은, 저 AR 조성물이 투여된 동물에 대해 가장 높았고 AR1 조성물이 투여된 동물에 대해 가장 낮았다. Lys-1/2 조성물은 다음으로 가장 높은 저 AR 조성물이었고, AR 대조군 조성물보다 더 높았다. 또한, 도 197에 나타낸 바와 같이, AR1 조성물이 투여된 동물에 대해 최고의 ADA 역가가, 그리고, 저 AR 조성물이 투여된 동물에 대해 최저의 ADA 역가가 관찰되었다.
또한, 복합 TNF 수준은, 10주 치료 기간 동안의 누적 혈청 농도 값이, 대조군 AR 조성물이 투여된 동물에 대해 가장 높았고, AR1 조성물이 투여된 동물에 대해 가장 낮았음을 보여준다(도 198). 저 AR 조성물에 대한 누적 혈청 농도 값은 대조군 AR 조성물의 수준보다 약간 낮았다.
마우스의 관절의 조직병리학 평가는, 저 AR 조성물 및 Lys-1/2 조성물에 의해 가장 높은 보호가 제공되었음을 나타냈고, 이는, 저 AR 조성물 및 Lys-1/2 조성물이 생체내에서 관절에서의 관절염 형성에 대해 보호함을 나타낸다. 도 199에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물은, 세포 침윤, 활막 증식, 프로테오글리칸 손실, 연골 파괴 및 골 부식을, 대조군 AR 조성물을 포함하는 다른 조성물들보다 더 효과적으로 보호하였다. AR1 조성물에 의한 보호는 대조군 AR 조성물보다 더 낮았고, 이는, 관절 손상에 관한 AR1에 의한 유해 효과를 나타낸다.
도 200A 내지 도 200D는, 저 AR 조성물, 대조군 AR 조성물, AR1 조성물, 및 Lys-1/2 조성물에 관한 각종 조직(발, 림프절, 비장, 피부, 무릎 및 혈청)에 대한 평균 약물(PK) 수준을 나타낸다. 여기에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물이 투여된 동물은, 시험된 다른 조성물들이 투여된 동물만큼 높거나 상기 동물보다 더 높은 약물 수준을 가졌다.
도 201A 내지 도 201D는, 동일한 조성물(저 AR 조성물, 대조군 AR 조성물, AR1 조성물, 및 Lys-1/2 조성물)에 대한 동일한 조직에서의 평균 ADA 수준을 설명한다. 도 201A 내지 도 201D에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물에 관해, 최고 ADA 농도는 발(이는 동물에서의 최고 수준의 염증 위치에 상응함), 및 혈청에 존재한다.
도 202A 내지 도 202D 및 도 203A 내지 도 203D는, 저 AR 조성물, 대조군 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 나이브(naive), (대조군) 및 위약이 투여된 연구의 종료시 유전자전이 마우스로부터 얻어진 척추 및 대퇴골의 마이크로 CT 분석의 결과를 보여준다. L5 척추골 골 체적, L5 척추골 소주 수(vertebra trabecular number), L5 척추골 소주 두께, 및 L5 척추골 소주 공간에 대해 샘플을 분석하였다. 도 202A 내지 도 202D 및 도 203A 내지 도 203D에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물 및 Lys-1/2 조성물은, 대조군(정상) AR 조성물과 비교하여 보다 큰 골 체적, 소주 수, 소주 두께 및 소주 공간을 초래하였다.
도 204A 내지 도 204D는, 저 AR 조성물, 대조군 AR 조성물, AR1 조성물, Lys-1/2 조성물, 및 나이브(대조군), 및 위약이 투여된 연구의 종료시 유전자전이 마우스로부터 얻어진 척추 및 대퇴골의 마이크로 CT 분석의 추가의 결과를 보여준다. 대퇴부 골간단에서의 소주 골 체적, 대퇴부 골간단에서의 소주 수, 대퇴부 골간단에서의 소주 두께, 및 대퇴부 골간단에서의 소주 분리에 대해 샘플을 분석하였다. 도 204A 내지 도 204D에 나타낸 바와 같이, 저 AR 조성물은, 대조군(정상) AR 조성물과 비교하여 보다 큰 대퇴부 골간단에서의 소주 골 체적, 대퇴부 골간단에서의 소주 수, 및 대퇴부 골간단에서의 소주 두께를 초래하였다.
또한, 도 205 및 도 206은, 각각 하기 조성물들이 투여된 6개의 그룹의 마우스들 각각으로부터의 척추 및 대퇴골의 실제 마이크로 CT 화상을 보여준다: 나이브, 비히클(대조군), 저 AR 조성물(그룹 5), 저 숙주 세포 단백질(HCP) 조성물(그룹 7), AR1 조성물(AR1 산성 변이체만을 함유함)(그룹 8), 및 Lys-1/2 조성물(Lys 1 및 Lys 2 변이체만을 함유함)(그룹 9). 척추 및 대퇴골 둘 다에서 보여지는 바와 같이, 저 AR 조성물(그룹 5)은, 비히클과 비교하여 골 부식으로부터의 보호를 제공하였고, 이는 비히클과 비교하여 그룹 5 화상에서 가시적인 골 부식이 적었기 때문이다.
이들 실험의 결과는, TNF-Tg197 마우스에서 1mg/kg의 아달리무마브의 주당 용량이, TNF-Tg197 마우스 모델에서의 관절염 스코어 및 조직병리학 스코어에 의해 측정시 관절염 발병(연골 및 골에 관련된 방사성 손상 및 국소 염증)으로부터의 보호를 제공함을 입증한다. 따라서, 정상 수준의 AR 변이체를 갖는 대조군 AR 조성물은 소정 수준에서 효과적이었다.
저 AR 제형 또는 Lys-1/2 조성물 중 어느 하나를 함유하는 제형은, 관절염 스코어 및 조직병리학 스코어에 의해 측정시, 대조군 AR 그룹과 비교하여, 관절염 발병으로부터 최대 보호를 제공하였고, 세포 침윤, 활막 증식, 프로테오글리칸 손실, 연골 파괴, 및 골 부식을 포함하는 시험된 매개변수들 모두에 있어서 대조군 AR그룹과 비교하여 증가된 효능을 나타냈다. 따라서, 저 AR 조성물 및 Lys-1/2 조성물은, 대조군 AR 조성물과 비교하여 관절염의 치료 및 예방에 있어서의 효능을 증가시켰다.
아달리무마브 AR1 조성물은, 본 연구에서 조사된 모든 양상들: AR1에 의해 발휘된 유해한 효과를 나타내는 보다 적은 체중 증가, 보다 높은 관절염 스코어, 및 보다 높은 관절에서의 조직병리학 스코어에 있어서 아달리무마브 대조군 그룹을 함유하는 정상 AR보다 덜 효과적이었다.
하기를 포함하는 각종 제형의 혈청 수준에서 주목할만한 차이가 관찰되었다: AR1 조성물로 치료된 동물은, 다른 그룹과 비교하여 최저 농도의 아달리무마브를 가졌고, 저 ar 조성물로 치료된 동물은, 다른 그룹과 비교하여 최고 농도의 아달리무마브를 가졌다. 또한, AR1 조성물은 혈청 중의 ADA의 최고 역가를 가졌다.
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본 발명은 본원에 기술되어 있는 특정 실시형태에 의한 범위에 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기술되어 있는 거 이외에도 본 발명의 각종 변형은, 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야 숙련가에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은, 첨부된 청구범위의 범위 내인 것으로 의도된다.
본 출원에 걸쳐 인용된 문헌 참조, 허여된 특허, 및 공개된 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 참조문헌의 내용은, 인용에 의해 본원에 명백히 포함된다. 본원에 첨부된 도면 및 서열목록 및 표의 전문이 인용에 의해 본원에 명백히 포함됨이 추가로 이해되어야만 한다. 또한, 이하 출원들의 전문도 인용에 의해 본원에 명백히 포함된다: 발명의 명칭이 "STABLE SOLID PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING SAME"인 미국 가특허 출원 61/XXX,XXX, Attorney Docket Number 117813-31001; 이와 같은 날짜에 출원된 발명의 명칭이 "LOW ACIDIC SPECIES COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME USING DISPLACEMENT CHROMATOGRAPHY"인 미국 가특허 출원 61/XXX,XXX, Attorney Docket Number 117813-73602; 이와 같은 날짜에 출원된 발명의 명칭이 "MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE"인 미국 가특허 출원 61/XXX,XXX, Attorney Docket Number 117813-73802; 이와 같은 날짜에 출원된 발명의 명칭이 "MODULATED LYSINE VARIANT SPECIES AND METHODS FOR PRODUCING AND USING THE SAME"인 미국 가특허 출원 61/XXX,XXX, Attorney Docket Number 117813-74101; 및 이와 같은 날짜에 출원된 발명의 명칭이 "PURIFICATION OF PROTEINS USING HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY"인 미국 가특허 출원 61/XXX,XXX, Attorney Docket Number 117813-74301.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> LOW ACIDIC SPECIES COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND USING THE SAME <130> 117813-73920 <150> PCT/US2013/031485 <151> 2013-03-14 <150> PCT/US2013/031681 <151> 2013-03-14 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab light chain variable region <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adalimumab heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 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Lys 450

Claims (133)

  1. 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물로서, 상기 조성물은 약 15% 미만의 산성 종을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산성 종이 제1 산성 영역(AR1) 및 제2 산성 영역(AR2)을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약 5% 이하의 산성 종(AR)을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약 4% 이하의 산성 종(AR)을 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약 3% 이하의 산성 종(AR)을 포함하는, 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.1% 이하의 AR1 및 약 3% 이하의 AR2를 포함하는, 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 약 1% 이하의 AR1을 포함하는, 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.1% 이하의 AR1을 포함하는, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 약 3% 이하의 AR2를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약 2% 이하의 산성 종(AR)을 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물이 약 1.4% 이하의 산성 종(AR)을 포함하는, 조성물.
  12. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 약 1.4%의 AR2 및 약 0.0%의 AR1을 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종(AR)이 전하 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체, 당화(glycation) 변이체, 아푸코실화(afucosylation) 변이체, MGO 변이체 또는 시트르산 변이체를 포함하는, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 구조 변이체가 글리코실화(glycosylation) 변이체 또는 아세톤화 변이체를 포함하는, 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 단편화 변이체가 Fab 단편 변이체, C-말단 절단 변이체, 또는 중쇄 가변 도메인이 손실된 변이체를 포함하는, 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 산성 종이 AR2이고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체 또는 당화 변이체를 포함하는, 조성물.
  18. 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 핵산, 크로마토그래피 재료, 및/또는 배지 구성성분을 실질적으로 포함하지 않는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제12항 또는 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합부가 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합부가, 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 및 1 x 10-3S-1 이하의 Koff 속도 상수를 갖는 사람 TNFα로부터 해리되는, 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는, 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합부가 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부인, 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비(non)-저 산성 종 조성물과 비교하여 증가된 연골 조직 침투를 나타내는, 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 증가된 TNF 친화도를 나타내는, 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 연골 파괴를 나타내는, 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 골 부식을 나타내는, 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 활액 증식을 나타내는, 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 세포 침윤을 나타내는, 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 연골세포 사멸을 나타내는, 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 프로테오글리칸 손실을 나타내는, 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 관절염의 동물 모델에게 투여되는 경우, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 관절염 스코어의 발병에 대한 증가된 보호를 나타내는, 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 상기 조성물이, 관절염의 동물 모델에게 투여되는 경우, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 조직병리학 스코어의 발병에 대한 증가된 보호를 나타내는, 조성물.
  34. 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물로서,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하고, 상기 조성물은 약 10% 미만의 산성 종(AR)을 포함하는,
    항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부인, 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 상기 산성 종이 제1 산성 영역(AR1) 및 제2 산성 영역(AR2)을 포함하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.1% 이하의 AR1 및 약 3% 이하의 AR2를 포함하는, 조성물.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종(AR)이 전하 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체, 당화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO 변이체 또는 시트르산 변이체를 포함하는, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 탈아미드화 변이체가, Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인하는, 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 상기 당화 변이체가, Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인하는, 조성물.
  43. 제39항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 구조 변이체가 글리코실화 변이체 또는 아세톤화 변이체를 포함하는, 조성물.
  44. 제39항에 있어서, 상기 산성 종이 AR1이고, 상기 단편화 변이체가, Fab 단편 변이체, C-말단 절단 변이체, 또는 중쇄 가변 도메인이 손실된 변이체를 포함하는, 조성물.
  45. 제39항에 있어서, 상기 산성 종이 AR2이고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체 또는 당화 변이체를 포함하는, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 탈아미드화 변이체가, Asn393 및 Asn329를 포함하는 아스파라긴 잔기에서 그리고 Gln3 및 Gln6을 포함하는 글루타민 잔기에서 발생하는 탈아미드화로부터 기인하는, 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 당화 변이체가, Lys98 및 Lys151에서 발생하는 당화로부터 기인하는, 조성물.
  48. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 증가된 연골 조직 침투를 나타내는, 조성물.
  49. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 증가된 TNF 친화도를 나타내는, 조성물.
  50. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 연골 파괴를 나타내는, 조성물.
  51. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 골 부식을 나타내는, 조성물.
  52. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 활액 증식을 나타내는, 조성물.
  53. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 세포 침윤을 나타내는, 조성물.
  54. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 연골세포 사멸을 나타내는, 조성물.
  55. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여 감소된 프로테오글리칸 손실을 나타내는, 조성물.
  56. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 관절염의 동물 모델에게 투여되는 경우, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 관절염 스코어의 발병에 대한 증가된 보호를 나타내는, 조성물.
  57. 제34항에 있어서, 상기 조성물이, 관절염의 동물 모델에게 투여되는 경우, 비-저 산성 종 조성물과 비교하여, 조직병리학 스코어의 발병에 대한 증가된 보호를 나타내는, 조성물.
  58. 제1항 내지 제12항, 제14항 내지 제18항, 제25항 내지 제38항 또는 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  59. 제1항 내지 제12항, 제14항 내지 제18항, 제25항 내지 제38항 또는 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종 %가, WCX-10 HPLC를 이용하여 측정되는, 조성물.
  60. 제1항 내지 제12항, 제14항 내지 제18항, 제25항 내지 제38항 또는 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종 %가, 등전점 전기영동(IEF)을 이용하여 측정되는, 조성물.
  61. 제1항 내지 제12항, 제14항 내지 제18항, 제25항 내지 제38항 또는 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종이, 생산물 제조-유도된 산성 종인, 조성물.
  62. 제62항에 있어서, 상기 산성 종이, 세포 배양물-유도된 산성 종인, 조성물.
  63. 제1항 내지 제12항, 제14항 내지 제18항, 제25항 내지 제38항 또는 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 종이, 보관-유도된 산성 종인, 조성물.
  64. TNFα가 유해한 장애를 갖는 대상체에게 제1항 또는 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하고, 이에 의해 TNFα가 유해한 장애를 갖는 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, TNFα가 유해한 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법.
  65. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 류마티스 관절염(RA)인, 방법.
  66. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 건선인, 방법.
  67. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 건선성 관절염인, 방법.
  68. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 강직성 척추염인, 방법.
  69. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 크론 질환인, 방법.
  70. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 궤양성 결장염인, 방법.
  71. 제64항에 있어서, TNFα가 유해한 상기 장애가 소아 특발성 관절염인, 방법.
  72. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 아미노산 농도와 비교하여, 증가된 농도의, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 배양 배지 중의 아미노산 농도가 약 0.025 내지 20g/L인, 방법.
  75. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 칼슘 농도와 비교하여, 증가된 농도의 칼슘을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 칼슘 농도가 약 0.005 내지 5mM인, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 아미노산 농도와 비교하여, 증가된 농도의, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제75항 또는 제77항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  79. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
    항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지 중의 니아신아미드, 칼슘, 및 아미노산의 농도와 비교하여, 증가된 농도의 니아신아미드, 칼슘, 및 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산이, 아르기닌, 리신, 오르니틴 및 히스티딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  82. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 약 7.1 내지 6.8의 pH를 갖는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  84. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 비-저 산성 종 조성물을 제조하기 위해 사용된 세포 배양 배지의 교환 속도와 비교하여, 변경된 교환 속도를 갖는 세포 배양 배지 중에서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  86. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 정화된 수거물을 추출하고, 상기 정화된 수거물에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산이, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산 및 류신, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  89. 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 항체 또는 이의 항원 결합부를 발현하는 세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 정화된 수거물을 추출하고, 상기 정화된 수거물의 pH를 4.5 내지 6.5로 조정하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법.
  90. 제87항에 있어서, 상기 저 산성 종 조성물이 약 10% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  91. (a) 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 제1 샘플을 크로마토그래피 배지에 접촉시키는 단계(여기서, 상기 접촉은 부하 완충액과 관련하여 발생한다);
    (b) 상기 크로마토그래피 배지를, 부하 완충액과 실질적으로 동일한 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및
    (c) 크로마토그래피 샘플을 수집하는 단계
    를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조함을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    상기 크로마토그래피 샘플은, 약 10% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 결합된 항체 물질이, 세척 완충액과 상이한 조성을 갖는 완충액으로 용출되는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 배지가, 음이온 교환 흡착 물질, 양이온 교환 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 및 음이온 교환 혼합 방식 배지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 배지가, 양이온 교환(CEX) 및 소수성 상호작용 기능성 그룹들을 포함하는 혼합 방식 배지인, 방법.
  95. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 배지가, 음이온 교환(AEX) 및 소수성 상호작용 기능성 그룹들을 포함하는 혼합 방식 배지인, 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 혼합 방식 배지가 Capto MMC 수지인, 방법.
  97. 제93항에 있어서, 상기 양이온 교환(CEX) 흡착 물질이, CEX 수지 및 CEX 막 흡착제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 CEX 수지가 Poros XS 수지인, 방법.
  99. 제93항에 있어서, 상기 음이온 교환(AEX) 흡착 물질이, AEX 수지 및 AEX 막 흡착제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 AEX 수지가 Poros 50HQ 수지인, 방법.
  101. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 배지가 CEX 흡착 물질 또는 혼합 방식 배지이고, 부하 및 세척 완충액들의 pH가 항체의 등전점 미만인, 방법.
  102. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 제1 샘플과 비교하여 감소된 수준의 항체 단편을 함유하는, 방법.
  103. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 제1 샘플과 비교하여 감소된 수준의 숙주 세포 단백질을 함유하는, 방법.
  104. 제91항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 제1 샘플과 비교하여, 감소된 수준의, 전하 변이체, 구조 변이체, 또는 단편화 변이체 중 하나 이상을 함유하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 감소된 수준의 산성 종 AR1을 함유하고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체, 당화 변이체, 아푸코실화 변이체, MGO 변이체 또는 시트르산 변이체를 포함하는, 방법.
  106. 제104항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 감소된 수준의 산성 종 AR1을 함유하고, 상기 구조 변이체가 글리코실화 변이체 또는 아세톤화 변이체를 포함하는, 방법.
  107. 제104항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 감소된 수준의 산성 종 AR1을 함유하고, 상기 단편화 변이체가 Fab 단편 변이체, C-말단 절단 변이체, 또는 중쇄 가변 도메인이 손실된 변이체를 포함하는, 방법.
  108. 제104항에 있어서, 상기 크로마토그래피 샘플이, 감소된 수준의 산성 종 AR2를 함유하고, 상기 전하 변이체가 탈아미드화 변이체 또는 당화 변이체를 포함하는, 방법.
  109. (a) 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 제1 샘플을 부하 완충액 중의 친화성 크로마토그래피 배지에 접촉시키고, 상기 친화성 크로마토그래피 배지로부터 상기 샘플을 제1 용출된 샘플로서 용출시키는 단계;
    (b) 상기 제1 용출된 샘플을 부하 완충액 중의 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 흡착 물질과 접촉시키고, 상기 AEX 크로마토그래피 흡착 물질로부터 상기 샘플을 제2 용출된 샘플로서 용출시키는 단계; 및
    (c) 상기 제2 용출된 샘플을 부하 완충액 중의 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 흡착 물질과 접촉시키고, 상기 CEX 크로마토그래피 흡착 물질로부터 상기 샘플을 제3 용출된 샘플로서 용출시키는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조함을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    상기 제3 용출된 샘플은, 3% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 배지가 단백질 A 수지인, 방법.
  111. 제109항에 있어서, 상기 제1 샘플을 친화성 크로마토그래피 배지에 접촉시킨 후, 상기 친화성 크로마토그래피 배지를 고농도의 Tris/포르메이트 완충액으로 세척하는, 방법.
  112. 제109항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 배지 상의 제1 샘플을 저농도의 Tris/포르메이트 완충액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  113. 제109항에 있어서, 상기 제1 샘플이, 상기 친화성 크로마토그래피 배지로부터 저 pH Tris/포르메이트 완충액을 이용하여 용출되는, 방법.
  114. 제109항에 있어서, 상기 AEX 크로마토그래피 흡착 물질 및 상기 CEX 흡착 물질을 위한 부하 완충액이 저농도의 Tris/포르메이트 완충액인, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 부하 완충액이 약 8.7의 pH를 갖는, 방법.
  116. 제109항에 있어서, 상기 제1 용출된 샘플을 AEX 크로마토그래피 흡착 물질에 접촉시킨 후, 상기 AEX 크로마토그래피 흡착 물질을 저농도의 Tris/포르메이트 완충액으로 세척하는, 방법.
  117. 제109항에 있어서, 상기 저농도 완충액이 약 8.7의 pH를 갖는, 방법.
  118. 제109항에 있어서, 상기 제2 용출된 샘플을 CEX 크로마토그래피 흡착 물질에 접촉시킨 후, 상기 CEX 크로마토그래피 흡착 물질을 고농도의 Tris/포르메이트 완충액으로 세척하는, 방법.
  119. 제109항에 있어서, 단계 (c)가 1회 이상의 추가의 횟수로 반복되는, 방법.
  120. 제109항에 있어서, 단계 (c)가 3회 반복되는, 방법.
  121. 제109항에 있어서, 상기 양이온 교환(CEX) 흡착 물질이, CEX 수지 및 CEX 막 흡착제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 CEX 수지가 Poros Xs 수지인, 방법.
  123. 제109항에 있어서, 상기 음이온 교환(AEX) 흡착 물질이, AEX 수지 및 AEX 막 흡착제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 AEX 수지가 Poros 50HQ 수지인, 방법.
  125. 제109항에 있어서, 상기 제3 용출된 샘플에 대한 바이러스 여과를 수행하여 여과된 샘플을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 여과된 샘플을, 한외여과/투석여과(UF/DF)를 이용하여 여과하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  127. (a) 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 샘플을, 부하 완충액 중의, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 흡착 물질, 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 및 음이온 교환 혼합 방식 배지로 이루어진 그룹 중 하나 이상에 접촉시키는 단계, 및
    (b) AEX 크로마토그래피 흡착 물질, CEX 크로마토그래피 흡착 물질, 혼합 방식 배지, 양이온 교환 혼합 방식 배지, 또는 음이온 교환 혼합 방식 배지로부터 상기 샘플을 용출시키는 단계를 포함하여, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조함을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 저 산성 종 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    상기 용출된 샘플은, 약 3% 미만의 산성 종을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합부의 조성물을 포함하는, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 용출된 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 배지에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  129. 제72항, 제75항, 제79항, 제82항, 제84항, 제89항, 제91항, 제109항, 또는 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합부가 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부인, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합부가, 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 및 1 x 10-3S-1 이하의 Koff 속도 상수를 갖는 사람 TNFα로부터 해리되는, 방법.
  131. 제129항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는, 방법.
  132. 제129항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  133. 제130항, 제131항, 또는 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체 또는 이의 항원-결합부가 아달리무마브 또는 이의 항원 결합부인, 방법.
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