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KR20150085459A - 대장암 마커로서의 신규 ntrk1 융합유전자 및 이의 용도 - Google Patents

대장암 마커로서의 신규 ntrk1 융합유전자 및 이의 용도 Download PDF

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KR20150085459A
KR20150085459A KR1020140143631A KR20140143631A KR20150085459A KR 20150085459 A KR20150085459 A KR 20150085459A KR 1020140143631 A KR1020140143631 A KR 1020140143631A KR 20140143631 A KR20140143631 A KR 20140143631A KR 20150085459 A KR20150085459 A KR 20150085459A
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KR102267407B1 (ko
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신은지
박옥구
박도윤
신나리
최찬
이재혁
권채화
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주식회사 엘지생명과학
주식회사 엘지생명과학
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Abstract

LMNA(Lamin A) 또는 TPM3(Tropomyosin 3)와 NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)와의 융합단백질 및 이를 암호화하는 융합유전자 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 상기 융합단백질, 상기 융합유전자, 또는 상기 융합유전자의 전사산물을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다. 아울러, NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제의 스크리닝 방법 및 NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 대장암에 특이적인 진단 마커를 제공함으로써, 정확한 대장암 진단을 가능하게 하며, 대장암 환자의 계층화를 통해 임상예후를 예측하는 것, 대장암에 대한 치료의 유효성을 예측하는 것, 특히 NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료의 유효성을 예측하는 것이 가능해진다. 이에 따라, 약물을 투여하는 것이 유효하지 않다고 생각되는 대장암 환자에 대한 약물의 투여를 제한할 수 있으므로, 효율적이고 안전한 맞춤형 대장암 치료를 실현하는 것이 가능해진다.

Description

대장암 마커로서의 신규 NTRK1 융합유전자 및 이의 용도{Novel NTRK1 fusion gene as colon cancer marker and the uses thereof}
LMNA(Lamin A) 또는 TPM3(Tropomyosin 3)와 NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)와의 융합단백질 및 이를 암호화하는 융합유전자 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 상기 융합단백질, 상기 융합유전자, 또는 상기 융합유전자의 전사산물을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다. 아울러, NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제의 스크리닝 방법 및 NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
대장암은 암 사망에 있어서 제2-3위를 차지하는 암으로 전체 암의 약 13% 정도를 차지하고 있다. 미국의 경우, 연간 약 50,310명이 대장암으로 사망하고 136,830명의 새로운 대장암 환자가 발생한다고 보고되고 있다. 우리나라에서는 사망률에 있어서 전체 암에서 차지하는 비율이 대장암이 폐암, 간암, 위암에 이어 제4위를 차지하고 있다. 1980년에 전체 암의 5.8%를 차지하던 것이 1985년에는 6.1%, 1995년에는 8.2%, 2002년에는 11.2%, 2012년에는 12.9%로 지속적인 증가 추세를 보이고 있으며, 1999년도 자료와 비교해 볼 때 2011년에는 위암, 간암 및 자궁경부암의 사망률이 감소한 데 비해 대장암에 의한 사망률은 5.6%의 증가하였다.
대장내시경을 이용한 조기진단 및 근치술, 화학요법 등의 발달로 전체 대장암 환자의 5년 생존율이 약 64.7%로 보고되고 있다. 그러나 1기 대장암 환자의 5년 생존율이 89.8%, 2-3기 대장암 환자의 5년 생존율이 70.5%로 향상된 반면, 말기 대장암 환자의 5년 생존율은 12.9%로 지난 30여년 간 정체되었고, 기존 치료법을 통하여 생존율을 향상시키기는 어려운 실정이다. 최근 보험급여가 인정된 얼비툭스(머크사) 및 아바스틴(로슈사) 등의 표적치료제에 의한 말기 대장암 환자의 무병생존 연장기간은 기존의 화학요법 대비 각각 0.9개월(p = 0.048) 및 1.4개월(p = 0.0023)로 임상적 실효성이 불충분한 상황이다. 유방암 및 폐암 등과 비교할 때, 대장암은 유전체학적 연구가 미비하고, 이에 따라 분자수준의 환자계층화가 미비한 실정이다. 따라서, 대장암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 무엇보다도 분자수준의 환자계층화 및 새로운 대장암 맞춤 타겟의 발굴이 시급하다.
대장암의 발생과정에는 여러 종류의 암 유전자, 종양 억제유전자 등 다양한 유전자 변화가 관여하는 것으로 알려져 있다. 실제 대장암은 발암과정에서 일어나는 유전적 변화가 가장 많이 밝혀진 암이다. 대장암은 한 개의 암 유전자 또는 종양억제 유전자의 변화가 단독으로 암을 유발시킬 수 있는 것이 아니고 정상 대장 점막세포가 선종의 단계를 거쳐 대장암으로 진행되기 위해서는 수년에 걸친 긴 세월을 통해 여러 개의 암 관련 유전자의 변화가 축적되어야 하는데 이를 대장암 발생에 있어서 유전자의 다단계적 변화라고 한다. 여기서 중요한 것은 각 단계에서의 유전자 변화 순서가 아니라 궁극적으로 누적되는 유전자들의 변화의 총합이다. 대장암 발생과정에 관여하는 유전적 변화로는 암 유전자와 종양 억제유전자의 돌연변이, DNA 메틸화 이상 및 DNA 수리 유전자의 돌연변이도 관계된다.
암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 상호작용이 복합적으로 연관되어 진행되므로, 전체 유전자의 발현 및 돌연변이를 조사하고 비교하여 새로운 암 유전자 및 치료용 타겟을 발굴하고자 하는 유전체적 접근이 이루어지고 있다. 암세포에서 특이적으로 발현이 증가하거나 감소하는 유전자들은 세포분열, 세포신호전달, 세포 골격, 세포 운동, 세포 방어, 유전자 및 단백질의 발현 그리고 세포 내 물질 대사 등 암세포의 생존 및 증식에 관여하는 것으로 보고되고 있다. 암 유전체학의 발전은 유방암 및 폐암 등의 환자계층화 및 계층별 환자의 맞춤 치료용 타겟 발굴에 기여하였다. 그러나 발굴된 타겟에 대한 임상적 실효성에 대한 평가의 부재는 암 유전체학을 통해 연구개발된 맞춤형 항암 치료제의 임상연구 실패의 주요 원인으로 평가되고 있다.
NTRK1 융합유전자는 다양한 암종에 걸쳐 보고된 바 있다. 대장암과 갑상선 유두암에서는 TPM3-NTRK1의 융합유전자가 보고되었고(Martin-Zanca 등, Nature, 1986년, 319권, 743~748 페이지; Wilton 등, Cytogenetics and cell genetics, 1995년, 68권, 122~124 페이지), 폐암에서는 미오신 탈인산화효소 Rho 상호작용 단백질(myosin phosphatase Rho interacting protein: MPRIP) 또는 CD74-NTRK1 융합유전자가 보고되었으며(Vaishnave 등, Nature medicine, 2013년, 19권, 1469~1472 페이지; 특허번호 WO 2014071358 A2), 스피트조이드(Spitzoid) 흑색종에서는 TP53 또는 라민 A/C (lamin A/C: LMNA)-NTRK1 융합유전자가 보고되었고(Wiesner 등, Nature communications, 2014년 5권, 3116; 특허번호 WO 2013059740 A1), 담낭암에서는 RAB 지티파아제 유사 활성 단백질 1(RAB GTPase activating protein 1-like: RABGAP1L)-NTRK1 융합유전자가 보고되었으며(Ross 등, The oncologist, 2014년, 19권, 235~242 페이지), 다형교아종에서는 뉴로파신(neurofascin: NFASC) 또는 브레비칸(brevican: BCAN)-NTRK1 융합유전자가 보고되었다(Kim 등, PloS one, 2014년, 9권, e91940). 그러나 NTRK1 융합유전자의 암 유전자로서의 역할은 일부 암종에서 규명된 반면, 대장암에서 NTRK1 융합유전자의 암 유전자로서의 역할, 빈도 및 임상적 의의는 포괄적으로 규명된 바 없다.
본 발명자들은 대장암의 유전체학적 연구를 통해 대장암 환자계층화 및 예후예측, 그리고 치료의 타겟이 될 수 있는 유전자의 발견을 위하여 예의 연구 노력한 결과, 한국인 및 중국인 대장암 조직 내 LMNA-NTRK1 및 TPM3-NTRK1 융합유전자 및 이의 발현이 특정 환자군에서 현저히 증가하며, NTRK1 융합유전자 및 이에 의해 암호화되는 융합전사산물 및 융합단백질은 대장암의 임상예후를 결정하는 인자로, 이를 억제하는 경우 대장암 치료 효능이 있다는 것을 알아냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은, LMNA(Lamin A) 또는 TPM3(Tropomyosin 3)와 NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)와의 융합단백질 및 이를 암호화하는 융합유전자 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 융합단백질, 상기 융합유전자, 또는 상기 융합유전자의 전사산물을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 150례의 대장암 임상 조직과 50례의 정상 대장 임상 조직으로부터 추출한 전사체의 차세대 전사체 염기서열분석에 의해, TPM3-NTRK1 융합전사산물 및 LMNA-NTRK1 융합전사산물을 검출하였다. TPM3-NTRK1 융합유전자는 1번 염색체 q21.3와 q23.1 영역 간의 역위에 의해서 발생하였고, LMNA-NTRK1 융합유전자는 상기의 염색체 q22와 q23.1 영역 간의 결실에 의해서 발생하였다.
상기한 신규한 융합유전자 및 이에 암호화 된 융합전사산물 및 융합단백질은 147례의 한국인 대장암 임상 조직 중 3례(2%)에서 검색되었다. 상기의 사실로부터 대장암에서 융합전사산물 및 융합단백질의 발현은 유전자 융합에 의한 것이 밝혀졌다.
NTRK1 융합전사산물이 확인된 3례의 대장암 임상 조직은 KRAS, NRAS 및 PIK3CA 등 공지의 대장암 유전자의 체세포 돌연변이를 갖지 않았다. 또한 상기의 NTRK1 융합유전자를 종양성이 없는 NIH3T3 세포주에서 강제로 발현시켰을 때 체외 및 채내 종양성이 획득되었다. 상기의 사실로부터 NTRK1 유전자융합은 대장암에 있어서 원인 유전자(driver oncogene)인 것이 밝혀졌다.
본 발명의 융합단백질은 29.2%의 한국인 대장암 환자에서 확인되었고, 25.6%의 중국인 대장암 환자에서 확인되어, 상기의 융합유전자는 한국인 및 중국인 등 동북아시아인의 대장암에 있어서 높은 빈도로 관찰되는 원인 유전자인 것이 밝혔다. 또한 본 발명의 융합유전자 또는 이에 암호화되는 융합단백질을 갖는 대장암 환자의 생존율은 본 발명의 융합유전자 또는 이에 암호화되는 융합단백질을 갖지 않는 대장암 환자의 생존율보다 낮아, 본 발명의 융합유전자가 대장암 환자의 임상예후를 예측하는 진단 마커로 가능하다는 것을 알아내었다.
상기의 유전자 융합은, NTRK1 단백질의 향상된 활성화를 초래하는 것이라고 생각되며, 이러한 활성화가 발생하고 있는 대장암 환자에 있어서는, NTRK1 단백질에 대한 저해제가 치료에 있어서 유효성을 나타내는 것이라고 생각된다. 이 때문에, 본 발명자들은, 대장암에 있어서, 해당 융합유전자를 표적으로 하여 약물에 의한 치료의 유효성을 예측하는 것이 가능하며, 또한, 이 예측에 있어서 약물에 의한 치료가 유효하다고 판정된 환자에 해당 약물을 투여하면, 효율적인 치료가 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은, TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자간의 융합유전자 및 이에 암호화되는 융합전사산물 및 융합단백질의 존재를 지표로 대장암 환자의 임상예후를 진단하는 방법, NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료의 유효성을 판정하는 방법, 이 유효성의 판정을 이용한 대장암의 치료 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 이하의 발명을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 LMNA(Lamin A) 또는 TPM3(Tropomyosin 3)와 NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)와의 융합단백질 및 이를 암호화하는 융합유전자 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하기의 구조식으로 이루어진 융합단백질을 제공한다.
N-[LMNA(Lamin A)의 N 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)의 C 말단을 포함하는 단편]-C, 또는
N-[TPM3(Tropomyosin 3)의 N 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편]-C.
또한, 본 발명은 하기의 구조식으로 이루어진 융합유전자 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
5'-[LMNA 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3', 또는
5'-[TPM3의 5' 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3'.
즉, 본 발명은 LMNA의 N 말단을 포함하는 단편 또는 TPM3의 N 말단을 포함하는 단편과 NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편이 연결된 융합단백질 및 LMNA 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편 또는 TPM3 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편과 NTRK1 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편이 연결된 융합단백질에 관한 것으로, 상기 LMNA, TPM3 또는 NTRK1은 인간 유래일 수 있다. 본 발명의 융합단백질은 NTRK1 융합단백질, 또는 경우에 따라 LMNA-NTRK1 융합단백질 또는 TPM3-NTRK1 융합단백질과 혼용될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명 실시예에 있어서 나타내는 바와 같이, 인간 대장암 환자에서 LMNA 단백질과 NTRK1 단백질과의 융합예를 처음으로 밝혀졌다. 또한 TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자의 융합 및 이에 암호화된 융합전사산물과 융합단백질을 갖는 대장암 환자의 빈도 및 임상예후를 대규모 대장암 환자 코호트 분석을 통해 처음으로 확인하였다(표 1).
본 발명에서 TPM3 단백질을 암호화하는 TPM3 유전자는 인간으로부터 유래하는 것일 수 있고 인간의 염색체 1번(q21.3)에 위치하며, 이로부터 암호화되는 TPM3 단백질은 총 아미노산 길이가 285aa인 폴리펩티드이다. TPM3 단백질 또는 TPM3 단백질 단편은 TPM3-NTRK1 융합단백질의 N 말단쪽 융합파트너이다. 예컨대, TPM3 유전자는 GenBank accession no. NM_152263에서 제공되는 염기 서열을 갖는 것일 수 있으며, TPM3 단백질은 NM_152263에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 특히 상기 TPM3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 TPM3 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 TPM3의 N 말단을 포함하는 단편은 NM_152263의 8번째 엑손(1번 염색체 상의 (-) 가닥(strand)을 기준으로 154134289~154142876 염기위치)까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 엑손 8의 3’말단에 코돈(codon)을 이루지 못하는 1개의 뉴클레오타이드(g)가 존재하는 형태일 수 있다(표 2 및 표 3). 특히 상기 TPM3의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
LMNA 단백질을 암호화하는 LMNA 유전자는 인간으로부터 유래하는 것일 수 있고 인간의 염색체 1번(q22)에 위치하며, 이로부터 암호화되는 LMNA 단백질은 총 아미노산 길이가 664aa인 폴리펩티드이다. LMNA 단백질 또는 LMNA 단백질 단편은 LMNA-NTRK1 융합단백질의 N 말단쪽 융합파트너이다. LMNA 유전자는 GenBank accession no. NM_170707에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, LMNA 단백질은 NM_170707에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 일 수 있다. 특히 상기 LMNA 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 LMNA 유전자는 서열번호 28의 핵산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 LMNA의 N 말단을 포함하는 단편은 NM_170707의 6번째 엑손(1번 염색체 상의 (+)가닥을 기준으로 156084504~156105740 염기위치)까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 엑손 6의 3’말단에 코돈(codon)을 이루지 못하는 1개의 뉴클레오타이드(c)가 존재하는 형태일 수 있다(표 6 및 표 7). 특히 상기 LMNA의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
NTRK1 단백질을 암호화하는 NTRK1 유전자는 인간으로부터 유래하는 것일 수 있고 인간의 염색체 1번(q23.1)에 위치하며, 이로부터 암호화되는 NTRK1 단백질은 총 아미노산 길이가 796aa인 단백질이다. NTRK1 단백질 또는 NTRK1 단백질 단편은 TPM3-NTRK1 융합단백질의 C 말단쪽 융합 파트너이다. 예컨대, 상기 NTRK1 유전자는 GenBank accession no. NM_001012331에 제공되는 염기 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 NTRK1 단백질은 NM_001012331에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 특히 상기 NTRK1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 NTRK1 유전자는 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 핵산 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편은 NM_001012331의 엑손 9(1번 염색체 상의 (+)가닥을 기준으로 156830671~156844363 염기위치) 또는 엑손 11(1번 염색체 상의 (-)가닥을 기준으로 156830671~156845312 염기위치) 또는 엑손 12(1번 염색체 상의 (-)가닥을 기준으로 156830671~156845872 염기위치)부터 마지막 엑손까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 엑손 9의 3’말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(ac)와 엑손 11의 3’말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(gc) 및 엑손 12의 3’말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(gt)는 코돈을 이루지 못하는 형태일 수 있고, TPM3 단백질의 단편과 융합 시에 앞서 설명한 바와 같이 TPM3 단백질의 단편에 추가로 포함된 1개의 뉴클레오타이드(g)와 연결되어 코돈(gac 또는 ggc 또는 ggt)을 이루어 하나의 아미노산(D 또는 G)을 코딩할 수 있다. 특히 상기 NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편은 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서 융합파트너인 단백질의 단편들의 절단점(break point; 또는 융합 부위)은 이들을 암호화하는 유전자의 엑손(exon)을 기준으로 설명되며, 상기 단편의 N말단(C말단 융합파트너의 경우) 또는 C말단(N말단 융합 파트너의 경우) 마지막에 포함되는 엑손과 절단되어 제거되는 엑손 사이의 인트론(intron) 부위 중 어느 지점에서 절단되어도 암호화되는 단백질 단편의 아미노산 서열에는 영향을 미치지 않게 되므로, 실제 절단되는 지점은 상기 인트론 위치 중 어느 지점이어도 무방하다.
한편, 본 발명에서 LMNA-NTRK1 융합유전자는 서열번호 33의 염기서열을 가지는 것일 수 있으며, LMNA-NTRK1 융합단백질은 서열번호 34의 염기서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 TPM3-NTRK1 융합유전자는 서열번호 21,서열번호 22 또는 서열번호 23의 염기서열을 가지는 것일 수 있으며, TPM3-NTRK1 융합단백질은 서열번호 24, 서열번호 25 또는 서열번호 26을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 별다른 언급이 없는 한, 본 명세서에 기재된 유전자, 전사산물 또는 전사산물 유래 cDNA 또는 DNA 분자를 시퀀싱하여 결정된 모든 뉴클레오타이드 서열들은 자동화된 차세대 염기서열 시퀀서 또는 생거법 염기서열 시퀀서를 사용하여 결정될 수 있고, 결정된 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 모든 아미노산 서열들은 자동화된 펩타이드 시퀀서를 사용하여 결정될 수 있다. 이 자동화된 접근에 의하여 결정된 뉴클레오타이드 서열은 실제 서열과 비교하여 일부 에러를 포함할 수 있다. 예컨대, 자동에 의하여 결정된 뉴클레오타이드 서열들은 시퀀싱된 cDNA 또는 DNA 분자의 실제 뉴클레오타이드 서열과 전형적으로 약 90% 이상, 구체적으로 약 95% 이상, 보다 구체적으로 약 99% 이상, 더욱 구체적으로 약 99.9% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 실제 서열과 비교하여 결정된 뉴클레오타이드에서 하나의 삽입 또는 결손은 포함할 수 있으며, 이와 같은 삽입 또는 결손에 의하여 뉴클레오타이드 서열 번역시의 프레임시프트(frameshift)가 야기되어, 암호화되는 아미노산 서열이 실제 아미노산 서열과 완전하게 다르게 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질, 상기 융합유전자, 또는 상기 융합유전자의 전사산물을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 융합단백질 및 융합유전자는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어, “대장암(colon cancer)”은 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암으로, 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭한 것을 의미한다.
한편, 본 발명에서 LMNA 또는 TPM3와 NTRK1의 융합단백질 및 융합유전자는 대장암을 진단하는 진단용 마커로 사용될 수 있으며, 본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 대장암 진단 마커는 LMNA-NTRK1(Lamin A-Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1) 또는 TPM3-NTRK1(Tropomyosin 3-Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1) 융합유전자로, 대장암 조직 또는 세포에서 발현이 증가하는 유전자들이다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 대장암 진단 마커는, 대장암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다. 이때, 정상 대장 상피 세포와 대장암 세포에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자들은 제외하고, 예를 들어 대조군으로 사용한 정상 조직에서 발현되는 유전자들에 비해 대장암 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가되는 유전자들을 선별할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자와의 융합유전자는 대장암에 있어서의 원인 유전자이며, 상기의 융합에 의해 NTRK1 단백질 발현의 항진, 나아가서는 NTRK1 단백질의 항상적인 활성화가 생기고, 대장암의 악성화에 기인한 불량예후의 진단 및 NTRK1 단백질 저해제에 의한 치료의 개연성이 높다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 NTRK1 융합유전자 또는 이에 암호화되는 융합전사산물 및 융합단백질은 고형암, 구체적으로 대장암 환자에게서 특이적으로 발견되거나 발현되는 것으로 확인되었으므로, 상기 융합유전자 또는 이에 암호화되는 융합전사산물 및 융합단백질은 고형암, 구체적으로 대장암의 예후예측 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
생물학적 시료 중의 본 발명의 융합유전자 발현 수준은 융합유전자의 전사산물, 특히 mRNA 등과 융합단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는, 상기 융합유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머는 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머는 프라이머에 의해 증폭되는 영역이 융합 대상인 두 유전자의 융합점을 포함하도록, 융합점을 사이에 두도록 설계된 프라이머일 수 있으며, 상기 융합유전자를 구성하는 융합 대상인 두 유전자가 TPM3 유전자 및 NTRK1 유전자인 경우, TPM3 단백질의 N 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머와 NTRK1의 C 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머쌍이며, 특히, 서열번호 35 및 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머쌍일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 융합유전자를 구성하는 융합 대상인 두 유전자가 LMNA 유전자 및 NTRK1 유전자인 경우, LMNA 단백질의 N 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머와 NTRK1의 C 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머쌍이며, 특히, 서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열로 구성된 프라이머쌍일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 "융합유전자를 측정하는 제제"는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자인 본 발명의 융합유전자 존재 자체를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 융합유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 것일 수 있다. 특히, 상기 융합유전자에 특이적으로 결합하는 프로브는 표 8의 특징을 갖는 프로브를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 Abnova사에서 판매하는 NTRK1 Split FISH Probe( Cat# FS0024, Taiwan)의 프로브를 사용하여 측정하였다.
본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자인 본 발명의 융합유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 융합유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
특히, 본 발명에서 상기 융합유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체는 LMNA 또는 TPM3와 NTRK1의 융합위치 근방 또는 NTRK1의 C 말단에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 본 발명에서는 신규한 대장암 마커 융합단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 대장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.
구체적으로, 상기 대장암 진단용 키트는 역전자 중합효소-PCR(RT-PCR) 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 특히, 상기 대장암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 단백질 칩을 수행하거나, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 단백질 칩 키트나 ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 대장암이 의심되는 개체의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 NTRK1 융합유전자는 LMNA 유전자 또는 TPM3 유전자의 5' 말단을 구성하는 폴리뉴클레오티드; 및 NTRK1 유전자의 3' 말단을 구성하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 "개체"란 대장암이 생길 수 있는 동물로, 대장암이 의심되는 한 제한되지 않는다. 또한, 상기 방법을 통하여 진단에 필요한 정보를 얻을 수 있는 질환으로는 TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자와의 융합유전자의 발현, 또는 NTRK1 유전자의 융합에 의존적으로 NTRK1 유전자의 발현이 인정되는 암종이라면 제한되지 않으며, 특히 대장암일 수 있다.
본 발명에서 용어, 개체의 시료란 대장암 마커인 LMNA-NTRK1 또는 TPM3-NTRK1 융합유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준이 차이나는 조직, 예를 들면, 세포, 조직, 장기, 체액(혈액, 림프액 등), 소화액, 객담, 폐포-기관지 세정액, 뇨, 변뿐만 아니라, 이들의 생체 시료로부터 얻어지는 핵산 추출물(유전체 추출물, 전사체 추출물, 전사체 추출물로부터 조제된 cDNA 조제물이나 aRNA 조제물 등)이나 단백질 추출물도 포함등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 한다. 또한, 상기 시료는, 포르말린 고정 처리, 알코올 고정 처리, 동결 처리 또는 파라핀 포매 처리가 실시되어 있는 것이어도 된다. 또한, 유전자, 전사산물, cDNA 또는 단백질은, 상기 시료의 종류 및 상태 등을 고려하여, 거기에 적합한 공지의 수법을 선택하여 조제하는 것이 가능하다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 발현 수준을 대장암 의심 개체에서의 발현 수준과 비교함으로써 대장암 의심 개체의 실제 대장암 여부를 진단할 수 있다. 즉, 대장암으로 추측되는 세포에 대해서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포에 대해서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 대장암으로 추측되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 대장암으로 추측되는 세포를 대장암으로 판단할 수 있는 것이다. 즉, 상기 방법에서 대장암이 의심되는 개체의 분리된 시료로부터 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
LMNA-NTRK1 또는 TPM3-NTRK1 융합유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 LMNA-NTRK1 또는 TPM3-NTRK1 융합단백질으로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현 량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현 량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 펩티드 단편의 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 구체적인 대장암 의심 개체의 임상 시료에서 상기 융합단백질, 융합유전자 또는 전사산물을 검출하기 위하여 (a) 상기 임상 시료에 상기 융합단백질, 이를 암호화하는 융합유전자 및 상기 융합유전자에 상응하는 전사산물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 처리(첨가)하고 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 과정을 통해 얻어진 반응물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계 (a) 이전에 임상 시료를 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 임상 시료를 준비하는 단계는 대장암 의심 개체로부터 임상 시료를 얻는(분리하는) 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 단계 (a)에서 상기 상호작용하는 물질은 상기 융합단백질(전부 또는 일부; 예컨대 융합 부위)에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 앱타머 및 상기 융합유전자 또는 전사산물(전부 또는 일부; 예컨대 융합 부위)에 결합하는 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 앱타머 등), 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이들 상호작용 하는 물질은 자유 래디컬, 방사성-동위원소, 형광염료, 발색기질, 효소, 박테리오파지, 조효소 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역화학적 표지 물질이 부착되거나, 상기 표지 물질과 함께 사용될 수 있다. 상기 단계 (b)에서, 상기 반응물은 단계 (a)에서 얻어진 상기 융합단백질, 융합유전자, 및 전사산물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 이와 상호작용하는 물질이 상호작용(결합)하여 생성된 복합체(complex)일 수 있다. 상기 반응물을 검출하는 단계에서 반응물이 검출되면 상기 융합단백질, 융합유전자 또는 전사산물이 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
NTRK1 융합단백질을 암호화하는 융합유전자 또는 이에 상응하는 전사산물과 상호작용하는 물질은 상기 융합유전자 또는 전사산물과 혼성화가 가능한 핵산 분자일 수 있다. 예컨대, 상기 핵산 분자는 임상 시료 내의 상기 융합유전자, 상기 융합유전자의 융합 부위 또는 상기 융합유전자 또는 융합 부위에 상응하는 전사산물과 특이적으로 혼성화가 가능한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, siRNA, 마이크로RNA 등), 프로브(예컨대, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp), 앱타머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 융합단백질을 암호화하는 융합유전자 또는 융합유전자에 상응하는 전사산물 분자와 혼성화가 가능한 핵산 분자는 상기 융합유전자 내의 융합 부위를 포함하는 연속하는 50 내지 250개, 구체적으로 100 내지 200개의 염기로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 단편을 증폭할 수 있도록 상기 폴리뉴클레오타이드 단편의 양 말단에 인접하는 20 내지 100개, 구체적으로 25 내지 50개의 염기서열 또는 이와 상보적인 서열과 혼성화가 가능한 20 내지 100bp, 또는 25 내지 50bp 길이의 프라이머쌍일 수 있다. 상기 '혼성화가 가능하다'함은 검출 대상 염기서열과 완전히 상보적이거나, 80% 이상(예컨대 80-100%), 구체적으로 90% 이상(예컨대 90-100%) 상보적인 염기서열을 가져서 상기 검출 대상 유전자 또는 전사산물과 특이적으로 결합 가능함을 의미한다.
또 다른 예에서, NTRK1 융합유전자 또는 이의 전사산물과 특이적으로 상호작용하는 물질은 자유 래디컬, 방사성-동위원소, 형광염료, 발색기질, 효소, 박테리오파지, 조효소 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역화학적 표지 물질이 부착되거나, 상기 표지 물질과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, 각 융합유전자에 혼성 가능한 형광직접접합법(fluorescence in situ hybridization)용 프로브와 연쇄중합반응(polymerase chain reaction)용 프라이머쌍을 이용할 수 있다(표 8 및 표 9).
또 다른 예에서, NTRK1 융합단백질의 검출은 상기 융합단백질 또는 대장암에서 NTRK1 유전자의 융합에 의존적으로 발현하는 NTRK1 단백질과 상호작용하는 물질, 예컨대 특이적으로 결합하는 물질(예컨대, 항체, 앱타머 또는 화합물 등)을 이용하여 상기 융합단백질과 상기 물질(예컨대, 항체 또는 앱타머)과의 상호작용, 즉 복합체 형성을 검출하는 통상적인 에세이법, 예컨대, 면역크로마토그래피(immunochromatography), 면역조직학염색(immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 효소 면역분석(enzyme immunoassay), 형광면역분석(fluorescence immunoassay), 발광면역분석(luminescence immunoassay), 웨스턴블라팅(western blotting) 및 유세포분석(flow cytometry cell sorting) 등에 의하여 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 환자의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 대장암 환자의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법
상기 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계는 상기 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에서 설명한 바와 거의 동일하다.
다만, 측정하는 시료가 대장암 의심 개체의 분리된 시료가 아닌 대장암 환자의 분리된 시료라는 측면과, 본 발명에서 정상 대조군이란 NTRK1 융합유전자가 발현되지 않은 정상군 및 대장암 환자군이라는 측면에서 차이가 있다.
본 발명에서 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법은 대장암 환자의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, 같거나 낮을 경우보다 대장암 치료 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 또한, NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준을 비교하는 것에는 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 여부를 확인하는 것이 포함된다. 즉, NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현되지 않은 대장암 환자보다 발현된 대장암 환자가 대장암 치료 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명에서 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법은 대장암 환자의 분리된 시료로부터 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료 유효성이 높다고 예측하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법은 대장암 환자의 분리된 세포에 NTRK1 융합단백질 저해제를 처리하여, NTRK1 융합유전자의 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 대장암 치료의 유효성을 평가하는 대상이 되는 'NTRK1 단백질 저해제'로서는, NTRK1 단백질의 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 억제할 수 있는 물질이면 특별한 제한은 없다. NTRK1 단백질의 기능, 구체적으로는 티로신키아나제, 구체적으로는 기타의 티로신키아나제를 저해할 수 있는 물질이어도 된다. 본 발명에 적용할 수 있는 공지의 NTRK1 단백질 저해제로서는, 예를 들면, (5S,6S,8R)-6-하이드록시-6-(하이드록시메틸)-5-메틸-7,8,14,15-테트라하이드로-5H-16-옥사-4b,8a,14-트리아자-5,8-메타노이벤조[b,h]사이클로옥타[jkl]사이클로펜타[e]-아스-인다센-13(6H)-원(일반명: 레스타우르티닙(lestaurtinib): FLT3, JAK2, TRKA, TRKB 및 TRKC를 표적으로 하는 화합물), N-[5-((2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일)-1,4,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4-c]피파졸-3-일]-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤자마이드(일반명: 다누세르팁(danusertib): ARK1, RET, ABL, FGFR1, TRKA를 표적으로 하는 화합물), N,1,4,4-테트라메일-8-((4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-4,5-디하이드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사마이드 (일반명: 미르시클립(milciclib): CDK2, TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), RXDX-101 (코드명: ROS1, ALK, TRKA를 표적으로 하는 화합물), TSR-011 (코드명: TRKA, TRKB, TRKC, ALK를 표적으로 하는 화합물), PLX-7486 (코드명: CSF1R, TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), NMS-E628 (코드명: ROS1, JAK2, ALK, TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 AZD-7451의 화합물 (TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), 코드명 NMS-P626의 화합물 (TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 RXDX-102의 화합물 (TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 ARRY-47의 화합물 (TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물)을 들 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 NTRK1 융합유전자에 의한 암호화되는 단백질의 발현에 따라 216명의 한국인 대장암 환자 코호트의 10년 생존기간을 분석하여 NTRK1 융합단백질이 발현된 63명의 대장암 환자는 NTRK1 융합단백질이 발현되지 않는 153명의 대장암 환자에 비하여 생존기간이 유의적으로 단축되는 것을 확인하였다(도 12). 이는 대장암 환자에서 NTRK1 융합유전자 및 이로부터 발현되는 융합단백질이 측정될 경우 대장암 치료 예후가 나쁘다는 것을 확인한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하며, 구체적으로 대장암 치료용 후보물질을 NTRK1 융합유전자를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및 상기 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 NTRK1 융합유전자는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 것에는, 융합유전자의 전사산물 및 이의 단백질 등의 수준을 측정하는 방법 등이 있고, 상기 융합유전자의 전사산물의 수준을 측정하는 방법이나 융합단백질의 수준을 측정하는 방법은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 대장암 치료제의 스크리닝 방법은 특히 대장암 치료용 후보물질 처리에 의해 NTRK1 융합유전자의 발현 수준이 낮아질 경우, 대장암 치료제로 판단하는 것일 수 있다.
구체적으로, 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 NTRK1 융합유전자의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. NTRK1 융합유전자(LMNA-NTRK1 또는 TPM3-NTRK1), 또는 이로부터 발현되는 단백질의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하고, 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 통하여 대장암 치료제로 스크리닝된 물질을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 NTRK1 융합단백질의 기능 저해를 통한 대장암 치료제 스크리닝 방법은 대장암 세포주 KM12를 이용하여 확인하였다. 다중 티로신키나아제 저해제인 레스타우르티닙과 크리조티닙은 토크리스 바이오사이언스사 (영국)에서 구입하였고, NTRK1 단백질 특이적인 저해제인 ARRY-470은 LG생명과학에서 합성하였고, 한국과학기술원에서 제공받은 화합물을 상기 본 발명의 스크리닝 방법을 통하여 스크리닝한 결과 대한민국 공개특허 제10-2013-0106186호에 개시된 화합물 8(본 발명에서 5f) 및 화합물 27(본 발명에서 6s)이 스크리닝되었다. 상기 스크리닝된 화합물 8(5f)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이고 화합물 27(6s)는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 각각의 저해제는 0.64 nM에서 10 μM의 농도로 4일간 처리하였고, 세포증식의 억제 정도는 ATP-Glo Bioluminometric Cell Viability Assay kit (바이오티움사, 미국)를 이용하여 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 융합단백질의 활성이나 융합유전자의 발현을 억제하는 등의 작용을 할 수 있다. 상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 상술한 바와 같이, NTRK1 단백질의 기능, 구체적으로 NTRK1 티로신키아나제의 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 억제할 수 있는 물질이면 특히 제한은 없다. NTRK1 티로신키나아제를 저해할 수 있는 한, 기타 티로신키나아제를 저해하는 물질이어도 된다. 본 발명에 적용할 수 있는 공지의 RET 티로신키나아제 저해제로서는 상술한 바와 같이, 예를 들면, (5S,6S,8R)-6-하이드록시-6-(하이드록시메틸)-5-메틸-7,8,14,15-테트라하이드로-5H-16-옥사-4b,8a,14-트리아자-5,8-메타노이벤조[b,h]사이클로옥타[jkl]사이클로펜타[e]-아스-인다센-13(6H)-원(일반명: 레스타우르티닙(lestaurtinib): FLT3, JAK2, TRKA, TRKB 및 TRKC를 표적으로 하는 화합물), N-[5-((2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일)-1,4,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4-c]피파졸-3-일]-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤자마이드(일반명: 다누세르팁(danusertib): ARK1, RET, ABL, FGFR1, TRKA를 표적으로 하는 화합물), N,1,4,4-테트라메일-8-((4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-4,5-디하이드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사마이드 (일반명: 미르시클립(milciclib): CDK2, TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), RXDX-101 (코드명: ROS1, ALK, TRKA를 표적으로 하는 화합물), TSR-011 (코드명: TRKA, TRKB, TRKC, ALK를 표적으로 하는 화합물), PLX-7486 (코드명: CSF1R, TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), NMS-E628 (코드명: ROS1, JAK2, ALK, TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 AZD-7451의 화합물 (TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물), 코드명 NMS-P626의 화합물 (TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 RXDX-102의 화합물 (TRKA를 표적으로 하는 화합물), 코드명 ARRY-47의 화합물 (TRKA, TRKB, TRKC를 표적으로 하는 화합물)일 수 있으며, 특히 ARRY-470, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00003
[화학식 2]
Figure pat00004

또한, 상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 NTRK1 융합유전자 발현 억제제일 수 있으며, NTRK1 융합유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, NTRK1 융합단백질 저해제는 NTRK1 융합단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 LMNA-NTRK1 또는 TPM3-NTRK1 융합유전자의 발현 억제제 또는 상기 융합유전자로부터 발현되는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 상기 대장암 치료용 약제학적 조성물은 NTRK1 융합단백질에 특이적인 항체를 이용하여, 대장암 환자의 혈청 내에서 암의 이동을 증가시키는 활성을 가지는 NTRK1 융합단백질을 제거하는 방법에 이용되어, 대장암을 치료할 수 있다. 본 발명자들은 스크리닝을 통해 NTRK1 융합단백질 억제 효과를 보이는 화합물이 대장암 세포 증식을 억제하는 효과를 가지는 것을 확인하여 NTRK1 융합유전자 또는 이로부터 발현되는 융합단백질이 대장암 치료의 타겟이 될 수 있음을 규명하였다.
이와 같은 대장암 치료용 조성물은 NTRK1 융합유전자 또는 이로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하여 항암 활성을 촉진할 수 있는 물질은 제한없이 포함하나, 그 예로서 단백질, 앱타머, 펩티드, 탄수화물, 화합물일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 NTRK1 융합단백질 저해제, 개체 및 조성물은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 해당 저해제의 종류나 대장암의 종류 등에 따라 선택되지만, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따라 대장암에 특이적인 진단 마커를 제공함으로써, 정확한 대장암 진단을 가능하게 하며, 대장암 환자의 계층화를 통해 임상예후를 예측하는 것, 대장암에 대한 치료의 유효성을 예측하는 것, 특히 NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료의 유효성을 예측하는 것이 가능해진다. 이에 따라, 약물을 투여하는 것이 유효하지 않다고 생각되는 대장암 환자에 대한 약물의 투여를 제한할 수 있으므로, 효율적이고 안전한 맞춤형 대장암 치료를 실현하는 것이 가능해진다.
도 1은 일루미나사의 HiSeq 2000을 이용한 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 150명의 대장암 임상 조직 및 50명의 동일 환자 유래의 정상 대장 임상 조직 중 3개의 대장암 임상 조직에서 NTRK1 유전자 융합에 의해 NTRK1 유전자의 전사산물의 발현이 증가되었음을 나타내는 그림과 데이터 분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 NTRK1 융합유전자로부터 암호화된 융합전사산물을 생어시퀀싱(Sanger sequencing)에 의해 염기서열을 분석하여 NTRK1이 LMNA 또는 TPM3와 융합되었음을 나타내는 그림과 데이터 분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 전사산물 수준에서 NTRK1 융합유전자가 확인 된 대장암 및 정상 대장 임상 조직쌍을 대상으로 NTRK1 단백질의 발현을 분석하여, NTRK1 융합유전자를 갖는 대장암 특이적인 NTRK1 단백질 발현을 나타내는 그림이다.
도 4는 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 전사산물 및 단백질 수준에서 NTRK1 융합유전자가 확인 된 (a) 대장암 및; (b) 정상 대장 임상 조직쌍을 대상으로 NTRK1 유전자의 융합여부를 형광직접접합법(fluorescence in situ hybridization)을 통해 DNA 수준에서 분석하여, 대장암 특이적인 NTRK1 유전자의 융합을 나타내는 그림이다. 노란색 화살표는 유전자 융합에 의해 분리된 NTRK1 유전자를 나타낸다. 기준자는 5 마이크로미터를 나타낸다.
도 5는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자의 단일 융합 부위 및 TPM3 유전자와 NTRK1 유전자의 3종류의 융합 부위를 나타내는 그림이다.
도 6은 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자의 단일 융합유전자와 TPM3 유전자와 NTRK1 유전자의 3종류의 융합유전자에 의해 암호화되는 융합단백질의 구조를 나타내는 그림이다.
도 7은 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 147명의 대장암 임상 조직에서 대장암 특이적인 암 유전자 및 억제 유전자의 체세포 돌연변이를 분석하여 NTRK1 융합유전자가 있는 대장암 임상 조직은 대장암 특이적인 암 유전자의 체세포 돌연변이가 없는 것을 확인한 그림이다.
도 8은 LMNA-NTRK1 및 TPM3-NTRK1 융합유전자를 종양성이 없는 NIH3T3 세포주에서 강제로 발현시켜 세포괴 형성 유무(colony formation assay)를 평가하여 NTRK1 융합유전자의 발현이 NIH3T3 세포주의 체외 종양성을 유도하는 것을 나타낸 그림이다. 음성대조군으로 NTRK1 융합유전자가 없는 공백터(empty vector)를 강제 발현하였고, 양성대조군으로 TPM3-NTRK1 융합유전자가 있는 KM12 대장암 세포주를 사용하였다.
도 9는 LMNA-NTRK1 및 TPM3-NTRK1 융합유전자를 종양성이 없는 NIH3T3 세포주에서 강제로 발현시켜 면역기능이 결핍된 누드마우스의 등쪽 피하에 접종한 후 종양 형성 유무를 평가하여 NTRK1 융합유전자의 발현이 NIH3T3 세포주의 체외 종양성을 유도하는 것을 나타낸 그림이다. 양성대조군으로 TPM3-NTRK1 융합유전자가 있는 KM12 대장암 세포주를 사용하였다.
도 10은 NTRK1 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 216명의 한국인 대장암 환자 코호트 유래의 조직마이크로어레이(tissue microarray) 및 472명의 중국인 대장암 환자 코호트 유래의 조직마이크로어레이에서 분석하여 한국인 대장암 환자 코호트 중 29.1% 및 중국인 대장암 코호트 중 25.6%에서 NTRK1 단백질의 발현을 확인한 그림이다.
도 11은 NTRK1 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 확인된 한국인 대장암 환자 코호트 유래의 임상 조직 중 NTRK1 단백질의 발현 수준이 높을 수록 NTRK1 유전자의 융합 빈도가 높아졌음을 형광직접접합법으로 나타낸 그림이다. 노란색 화살표는 유전자 융합에 의해 분리된 NTRK1 유전자를 나타낸다. 기준자는 10 마이크로미터를 나타낸다.
도 12는 NTRK1 유전자에 의한 암호화되는 단백질의 발현에 따라 216명의 한국인 대장암 환자 코호트의 10년 생존기간을 분석하여 NTRK1 단백질이 발현된 63명의 대장암 환자는 NTRK1 단백질이 발현되지 않는 153명의 대장암 환자에 비하여 생존기간이 유의적으로 단축되는 것을 나타낸 그림이다.
도 13은 TPM3-NTRK1 융합유전자가 있는 KM12 대장암 세포주를 대상으로 티로신키나아제 저해제 중 NTRK1 단백질에 대한 저해능이 있는 레스타우르티닙(lestaurtinib) 및 NTRK1 단백질에 대한 저해능이 없는 크리조티닙(crizotinib)과 NTRK1 단백질 특이적 저해제인 대한민국 공개특허 제10-2013-0106186호에 개시된 화합물 8(5f) 및 화합물 27(5s) 및 ARRY-470을 농도별로 적용하여 KM12 세포증식이 NTRK1 특이적 저해제에서 더욱 감소하는 것을 나타낸 그림이다.
도 14는 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 중간값 118.5 백만개의 얼라인된 리드는 생산하였고 100개의 염기 중 1개의 염기에서 오차가 발생할 수 있는 수준은 94.3%로 확인되었음을 나타낸 그림이다.
도 15는 80% 이상의 임상 조직에서 발현이 인정되는 18,725개의 유전자 발현량을 기초로 전체 임상 조직을 PCA (Principle Component Analysis)로 분석하여 이상치(outlier) 임상조직 3개를 확인한 그림이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : LMNA 또는 TPM3 - NTRK1 융합유전자 및 이에 의해 암호화된 전사산 물 및 융합 단백질
본 발명에서는 하기 실시예를 통하여, 대장암에 있어서 LMNA 단백질과 NTRK1 단백질과의 융합예를 본 발명에서 처음으로 밝혔다. 또한 TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자의 융합 및 이에 암호화된 융합전사산물과 융합단백질을 갖는 대장암 환자의 빈도 및 임상예후가 대규모 대장암 환자 코호트 분석을 통해 본 발명에서 처음으로 확인되었다.
1-1. NTRK1 와 융합단백질을 이루는 유전자
우선, 본 발명에서 확인된 대장암 조직에서 특이적으로 존재하는 NTRK1 융합유전자를 다음의 표 1에 정리하였다.
대장암 특이적 NTRK1 융합유전자
공여유전자 (donor gene) 영역 수납유전자 (acceptor gene) 영역 거리 (Mb)
TPM3 1q21.3 NTRK1 1q23.1 2.6
LMNA 1q22 NTRK1 1q23.1 0.6
본 발명의 NTRK1 융합유전자는 상기 표 1에서 정리하고 있는 단백질 단편들의 절단점(break point; 또는 융합 부위)에서 절단 및 융합된다. 상기 단편의 N말단(C말단 융합파트너의 경우) 또는 C말단(N말단 융합 파트너의 경우) 마지막에 포함되는 엑손과 절단되어 제거되는 엑손 사이의 인트론(intron) 부위 중 어느 지점에서 절단되어도 암호화되는 단백질 단편의 아미노산 서열에는 영향을 미치지 않게 되므로, 실제 절단되는 지점은 상기 인트론 위치 중 어느 지점이어도 무방하다.
1-2. TPM3 - NTRK1 융합유전자 및 TPM3 - NTRK1 융합단백질
본 발명에서 TPM3 단백질을 암호화하는 TPM3 유전자는 인간 유래 TPM3 유전자를 이용하였으며 인간의 염색체 1번(q21.3)에 위치하며, 이로부터 암호화되는 TPM3 단백질은 총 아미노산 길이가 285aa인 단백질이다. TPM3 단백질 또는 TPM3 단백질 단편은 TPM3-NTRK1 융합단백질의 N 말단쪽 융합파트너이다.
본 발명에서 TPM3 단백질은 인간 유래 TPM3를 사용하였고, 이를 암호화하는 NTRK1 유전자는 인간의 염색체 1번(q21.3)에 위치한다. 이로부터 암호화되는 TPM3 단백질은 총 아미노산 길이가 285 aa인 단백질이다. TPM3 단백질 또는 TPM3 단백질 단편은 TPM3-NTRK1 융합단백질의 N 말단쪽 융합 파트너이다.
본 발명에서는 상기 GenBank accession no. NM_152263의 염기 서열을 갖는 TPM3 유전자를 사용하였다.
상기 TPM3 단백질의 단편은 NM_152263의 8번째 엑손(1번 염색체 상의 (-) 가닥(strand)을 기준으로 154134289~154142876 염기위치)까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것을 사용하였다. 본 발명에서 사용한 상기 TPM3 단백질을 암호화하는 엑손 8의 3' 말단에 코돈(codon)을 이루지 못하는 1개의 뉴클레오타이드(g)가 존재하였다. 상기 TPM3 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 및 이로부터 암호화되는 TPM3 단백질에 대하여 아래의 표 2 및 3에 정리하였다.
TPM3 단백질의 단편을 암호화 하는 유전자
TPM3 유전자
Accession No.		 TPM3 단백질 암호화 부위
(CDS)		 TPM3 단백질 단편 암호화 부위:
엑손 기준		 TPM3 단백질 단편 암호화 부위:
cDNA 기준		 염색체 상
절단위치		 5' 말단 방향 절단위치
염기서열
NM_152263 118~975 (858bp)
(서열번호 1)		 엑손 1~엑손 8 118~891 + 1nt (g) (775bp) (서열번호 2) chr1: 154142876 5'-ATT GAT GAC CTG GAA g-3'
(서열번호 3)
TPM3 단백질의 단편
TPM3 단백질의 전체 길이
(Accession No.)		 TPM3 단백질 단편 부위 N-말단방향 절단위치
아미노산 서열
285aa (NP_689476)
(서열번호 4)		 1~258aa + 1nt (g) (아미노산 서열: 서열번호 5) N-IDDLE + 1nt (g) (아미노산 서열: 서열번호 6)
본 발명에서 NTRK1 단백질은 인간 유래 NTRK1을 사용하였고, 이를 암호화하는 NTRK1 유전자는 인간의 염색체 1번(q23.1)에 위치한다. 이로부터 암호화되는 NTRK1 단백질은 총 아미노산 길이가 796aa인 단백질이다. NTRK1 단백질 또는 NTRK1 단백질 단편은 TPM3-NTRK1 융합단백질의 C 말단쪽 융합 파트너이다.
본 발명에서는 GenBank accession no. NM_001012331의 염기 서열을 갖는 NTRK1 유전자를 사용하였다.
상기 NTRK1 단백질의 단편은 NM_001012331의 엑손 9(1번 염색체 상의 (+)가닥을 기준으로 156830671~156844363 염기위치) 또는 엑손 11(1번 염색체 상의 (-)가닥을 기준으로 156830671~156845312 염기위치) 또는 엑손 12(1번 염색체 상의 (-)가닥을 기준으로 156830671~156845872 염기위치)부터 마지막 엑손까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것을 사용하였다. 이때, 엑손 9의 3' 말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(ac)와 엑손 11의 3' 말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(gc) 및 엑손 12의 3' 말단의 처음 시작하는 2개의 뉴클레오타이드(gt)는 코돈을 이루지 못하는 서열을 가지고 있었다. 상기 코돈을 이루지 못하는 서열들은 TPM3 단백질의 단편과 융합 시에 앞서 설명한 바와 같이 TPM3 단백질의 단편에 추가로 포함된 1개의 뉴클레오타이드(g)와 연결되어 코돈(gac 또는 ggc 또는 ggt)을 이루어 하나의 아미노산(D 또는 G)을 암호화하였다. 상기 NTRK1 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 및 이로부터 발현되는 NTRK1 단백질에 대하여 아래의 표 4 및 표 5에 정리하였다.
NTRK1 단백질의 단편을 암호화 하는 유전자
NTRK1 유전자
(Accession No.)		 NTRK1 단백질의 암호화 부위 (CDS) NTRK1 단백질 단편 암호화 부위:
엑손 기준		 NTRK1 단백질 단편 암호화 부위:
cDNA 기준		 염색체 상 절단위치 3' 말단 방향 절단위치 염기서열
NM_002529 52~2447 (2396bp)
(서열번호 7)		 엑손 9~엑손 17 2nt (ac) +1236~2447 (1214bp) (서열번호 8) chr1:156844363 5'- ac ACT AAC AGC ACA TCT -3' (서열번호 9)
NM_002529 52~2447 (2396bp)
(서열번호 7)		 엑손 11~엑손 17 2nt (gc) + 1393~2447 (1055bp) (서열번호 10) chr1:156845312 5'- gc CCG GCT GTG CTG GCT -3' (서열번호 11)
NM_002529 52~2447 (2396bp)
(서열번호 7)		 엑손 12~엑손 17 2nt (gt) + 1540~2447 (908bp) (서열번호 12) chr1:156845872 5'- gt GTT CAC CAC ATC AAG -3' (서열번호 13)
NTRK1 단백질의 단편
NTRK1 단백질의 전체 길이 (Accession No.) NTRK1 단백질 단편 부위 C-말단방향 절단위치 아미노산 서열
796aa (NP_002520)
(서열번호 14)		 2nt (ac) + 400~796 (아미노산 서열: 서열번호 15) 2nt (ac) + TNSTS-C (아미노산 서열: 서열번호 16)
796aa (NP_002520)
(서열번호 14)		 2nt (gc) + 453~796 (아미노산 서열: 서열번호 17) 2nt (gc) + PAVLA-C (아미노산 서열: 서열번호 18)
796aa (NP_002520)
(서열번호 14)		 2nt (gt) + 502~796 (아미노산 서열: 서열번호 19) 2nt (gt) + VHHIK-C (아미노산 서열: 서열번호 20)
상기 TPM3 단백질 또는 그의 단편과 NTRK1 단백질 또는 그의 단편이 융합된 TPM3-NTRK1 융합단백질을 암호화하는 융합유전자(TPM3-NTRK1 융합유전자)는 5' 말단에 상기한 바와 같은 TPM3 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자 및 3' 말단에 상기한 바와 같은 NTRK1 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하도록 제조하였다.
상기 표에서 확인할 수 있듯이 본 발명에서 TPM3-NTRK1 융합유전자로 5' 말단 쪽에 NM_152263의 엑손 1부터 엑손 8까지의 뉴클레오타이드 서열과 3' 말단 쪽에 NM_002529의 엑손 9 또는 엑손 11 또는 엑손 12부터 엑손 17까지의 뉴클레오타이드 서열이 연결된 융합유전자를 제조하였다. 구체적으로, 본 발명에서 5' 말단 쪽에 NM_152263의 118번째부터 892번째까지의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)과 3' 말단 쪽에 NM_002529의 1234번째 또는 1391번째 또는 1538번째부터 2447번째까지의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 8; 서열번호10; 서열번호 12)이 연결된 TPM3-NTRK1 융합유전자(서열번호 21: 서열번호 3과 서열번호 9를 포함하는 염기서열; 서열번호 22: 서열번호 3과 서열번호 11을 포함하는 염기서열; 서열번호 23: 서열번호 3과 서열번호 13을 포함하는 염기서열)를 제조하였다.
또한, 본 발명에서 상기 제조된 TPM3-NTRK1 융합유전자로부터 암호화된 TPM3-NTRK1 융합단백질은 N말단 쪽에 NP_689476의 1번째부터 258번째까지의 아미노산 서열(서열번호 5)과 C말단 쪽에 NP_002520의 400번째 또는 453번째 또는 502번째부터 796번째까지의 아미노산 서열(서열번호 16; 서열번호 18; 서열번호 20)이 연결된 융합단백질(서열번호 24: 서열번호 6과 서열번호 16을 포함하는 아미노산 서열; 서열번호 25: 서열번호 6과 서열번호 18을 포함하는 아미노산 서열; 서열번호 26: 서열번호 6과 서열번호 20을 포함하는 아미노산 서열)이였다.
1-3. NMNA - NTRK1 융합유전자 및 NMNA - NTRK1 융합단백질
본 발명에서 대표적으로 실시한 LMNA 단백질을 암호화하는 LMNA 유전자는 인간 유래 LMNA 유전자를 이용하였으며 인간의 염색체 1번(q22)에 위치하며, 이로부터 암호화되는 LMNA 단백질은 총 아미노산 길이가 664aa인 단백질이다. LMNA 단백질 또는 LMNA 단백질 단편은 LMNA-NTRK1 융합단백질의 N 말단쪽 융합파트너이다.
본 발명에서는 GenBank accession no. NM_170707의 염기 서열을 갖는 TPM3 유전자를 사용하였다.
상기 LMNA 단백질의 단편은 NM_170707의 6번째 엑손(1번 염색체 상의 (+)가닥을 기준으로 156084504~156105740 염기위치)까지의 뉴클레오타이드 서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것을 사용하였다. 본 발명에서 사용한 상기 LMNA 단백질을 암호화하는 엑손 6의 3' 말단에 코돈(codon)을 이루지 못하는 1개의 뉴클레오타이드(c)가 존재하였다. 상기 LMNA 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 및 이로부터 암호화되는 LMNA 단백질에 대하여 아래의 표 6 및 7에 정리하였다.
LMNA 단백질의 단편을 암호화 하는 유전자
LMNA 유전자
(Accession No.)		 LMNA 단백질 암호화 부위 (CDS) LMNA 단백질 단편 암호화 부위: 엑손 기준 LMNA 단백질 단편 암호화 부위: cDNA 기준 염색체 상 절단위치 5' 말단 방향 절단위치 염기서열
NM_170707 250~2244 (1995bp) (서열번호 27) 엑손 1~엑손 6 250~1233 + 1nt (c) (985bp) (서열번호 28) chr1:156105740 5'-GAG GAC TCA CTG GCC c-3' (서열번호 29)
LMNA 단백질의 단편
LMNA 단백질의 전체 길이 (Accession No.) LMNA 단백질 단편 부위 N-말단방향 절단위치 아미노산 서열
664aa (NP_733821) (서열번호 30) 1~328aa + 1nt (c) (아미노산 서열: 서열번호 31) N-EDSLA + 1nt (g) (아미노산 서열: 서열번호 32)
본 발명에서 상기 LMNA 단백질 또는 그의 단편과 NTRK1 단백질 또는 그의 단편이 융합된 LMNA-NTRK1 융합단백질을 암호화하는 융합유전자(LMNA-NTRK1 융합유전자)는 5' 말단에 상기한 바와 같은 LMNA 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자 및 3' 말단에 상기 실시예 1-2에서 설명한 NTRK1 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하도록 제조하였다.
구체적으로 본 발명에서 5' 말단 쪽에 NM_170707의 엑손 1부터 엑손 6까지의 뉴클레오타이드 서열과 3' 말단 쪽에 NM_002529의 엑손 11부터 엑손 17까지의 뉴클레오타이드 서열이 연결된 LMNA-NTRK1 융합유전자를 제조하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 5' 말단 쪽에 NM_170707의 250번째부터 1234번째까지의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 28)과 3' 말단 쪽에 NM_002529의 1391번째부터 2447번째까지의 뉴클레오타이드 서열(서열번호10)이 연결된 LMNA-NTRK1 융합유전자(서열번호 33: 서열번호 29와 서열번호 11를 포함하는 염기서열)를 제조하였다.
또한, 본 발명에서 상기 제조된 LMNA-NTRK1 융합유전자로부터 암호화된 LMNA-NTRK1 융합단백질은 N-말단 쪽에 LMNA 단백질의 1번째부터 328번째까지의 아미노산 서열(서열번호 31)과 C-말단 쪽에 NTRK1 단백질의 453번째부터 796번째까지의 아미노산 서열(서열번호 18)이 연결된 융합단백질(서열번호 34: 서열번호 32와 서열번호 18을 포함하는 아미노산 서열)이었다.
실시예 2: NTRK1 융합유전자 또는 이의 전사산물 측정 수단
본 발명에서는 NTRK1 융합유전자(TPM3 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자의 융합유전자) 및 이에 암호화된 융합전사산물과 융합단백질을 갖는 대장암 환자의 빈도 및 임상예후에 대하여 대장암 환자에서 분석하기 위해서, 해당 NTRK1 융합유전자 또는 이의 전사산물을 측정하고자 하였다. 이를 위해서는 다양한 방법이 가능하나 본 발명에서는 NTRK1 융합유전자에 혼성가능한 형광직접접합법(fluorescence in situ hybridization: FISH)용 프로브(NTRK1 Split FISH Probe, Cat# FS0024, Abnova, Taiwan)를 사용하였으며, NTRK1 융합전사산물에 혼성가능한 연쇄중합반응용 프라이머를 제조하였다.
NTRK1 융합유전자에 혼성 가능한 형광직접접합법용 프로브
접합 부위 길이 표지 물질
서열번호 7의 5' 말단
(chr1: 156390000~156814000)		 약 420 kb TexRed
서열번호 7의 3' 말단
(chr1: 156851000~157630000)		 약 780 kb FITC
NTRK1 융합전사산물에 혼성 가능한 연쇄중합반응용 프라이머
융합유전자 융합 부위 Forward Primer Sequence Reverse Primer Sequence
TPM3-NTRK1 서열번호 21;
서열번호 22;
서열번호 23		 5'- AAG AAG ATA AAT ATG AGG -3'
(서열번호 35)		 5'- CCG TGC CGC ATA TAC TCA AA -3'
(서열번호 36)
LMNA-NTRK1 서열번호 33 5'- CCA GGT GGA GCA GTA TAA GAA G -3'
(서열번호 37)		 5'- TGT GGG TTC TCG ATG ATG TG -3'
(서열변호 38)
또한, NTRK1 융합단백질의 검출은 상기 융합단백질 또는 대장암에서 NTRK1 유전자의 융합에 의존적으로 발현하는 NTRK1 단백질과 상호작용하는 물질, 예컨대 특이적으로 결합하는 물질(예컨대, 항체, 앱타머 또는 화합물 등)을 이용하여 상기 융합단백질과 상기 물질(예컨대, 항체 또는 앱타머)과의 상호작용, 즉 복합체 형성을 검출하는 통상적인 에세이법, 예컨대, 면역크로마토그래피(immunochromatography), 면역조직학염색(immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 효소 면역분석(enzyme immunoassay), 형광면역분석(fluorescence immunoassay), 발광면역분석(luminescence immunoassay), 웨스턴블라팅(western blotting) 및 유세포분석(flow cytometry cell sorting) 등에 의하여 검출할 수 있다. 예컨대, NTRK1 단백질을 검출하는 면역조직학검사용 항체를 아래 표 10에 예시하였다. 본 발명에서는 NTRK1 단백질을 검출하는 면역조직학검사용 항체(Anti-NTRK1 Antibody EP1058Y (Cat# TA301109, OriGene, USA))를 이용하였다.
NTRK1 융합단백질과 상호작용하는 면역조직학검사용 항체
항원 작용 부위 음성대조 양성대조 기타 적용
NTRK1 단백질 아미노산 서열 중 791번째 타이로신 및 그 주변의 펩타이드 NTRK1 단백질의 카이네이즈 도메인 C-말단 임파구(lymphocytes) 신경절 세포(ganglion cells) 웨스턴블라팅, 형광면역분석, 유세포분석
실시예 3: 임상 조직을 이용한 실험
본 발명에 사용된 신선 동결(fresh frozen) 임상 조직은 2008년부터 2012년에 부산대학교병원 및 화순전남대학교병원에서 외과적 절제를 받은 대장암 환자로부터 수집되어 한국인체자원은행 부산대학교병원 거점은행 및 화순전남대학교병원 거점은행에서 보관 후 분양되었다. 대장암 조직은 국제 암게놈 컨소시움(International Cancer Genome Consortium: ICGC)의 지침에 따라 선발되었다. 예컨대, 임상조직은 병리학적 진단 후 60% 이상의 암세포 및 20% 미만의 괴사세포(necrotic cells) 또는 정상세포로 구성된 임상 조직만을 사용하였다. 대장암 가족력이 있는 대장암 환자로부터 수집된 대장암 임상 조직은 제외되었다. 최종적으로 150례의 대장암 조직 및 50례의 정상 대장 조직이 사용되었다.
실시예 4: 현미부수체 불안정성 분석( microsatellite instability analysis : MSI )
상기 실시예 3의 대장암 임상조직 중 포르말린 고정 후 파라핀으로 포매된(formalin-fixed paraffin-embedded) 조직에서 전체 DNA를 추출한 후 베데스다 마커(BAT26, D5S346, BAT25, D17S250, D2S123)를 이용하여 현미부수체 불안정성을 조사하였다.
구체적으로, 전체 DNA는 QIAmp DNA FFPE Tissue kit (키아젠사, 독일)을 이용하여 추출하였다. DNA 순도 및 농도는 ND-100 분광광도계(spectrophotometer) (나노드롭테크놀로지사, 미국)로 측정하였다. 다중(multiplex) 연쇄중합반응 후 획득한 증폭산물의 길이와 신호강도에 따라 현미부수체 불안정성을 판단하였다. 추출된 DNA의 불완전성 등으로 연쇄중합반응이 실패한 경우 DNA중합요소 엡실론(DNA polymerase epsilon: POLE)를 포함한 주요 유전자의 체세포 돌연변이의 총 수를 고려하여 현미부수체 불안전성을 판단하였다.
실시예 5: 차세대 전사체 염기서열 분석 ( RNA - seq )
전체 RNA는 RNAiso Plus(타카다 바이오사, 일본)로 추출하여 DNase I(키아젠사)로 전처리 한 다음 RNeasy Mini kit(키아젠사)로 정제하였다. RNA 완전성은 Bioanalyer (아질런트사, 미국)로 분석하였고, RNA 완전성 지표(RNA Integrity Number: RIN)가 6 이상인 대장암 임상 조직 유래 RNA를 RNA-seq에 적용하였다. RNA-seq을 위한 라이브러리는 TruSeq RNA sample preparation kit (일루미나사, 미국)으로 제작하였다. 예컨대, mRNA은 폴리-T 올리고가 부착된 마그네틱 비드(magnetic beads)로 회수한 후 음향전단(acoustic shearing) 방식으로 파편화하였다. 파편화 된 mRNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase) 및 랜덤핵사머(random hexamer)를 이용하여 1차 cDNA를 제작하였고, DNA 중합효소 I(DNA polymerase I)과 RNase H를 이용하여 2차 cDNA를 제작하였다. 2차 cDNA는 어뎁터를 접합 한 후 연쇄중합반응을 통해 cDNA 라이브러리를 완성하였다. cDNA 라이브러리는 HiSeq 2000 (일루미나사)를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 약 100백만개의 101bp 길이의 페어드엔드 리드(paired-end reads)가 생산하였다.
실시예 6: 염기서열 분석
상기 실시예 5에서 차세대 전사체 염기서열 분석을 통해 생산한 페어드엔드 리드는 GSNAP 및 TopHat을 이용하여 5% 불일치를 허용하는 조건에서 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI, 미국)에서 제공하는 인간참조유전체(hg 19)에 얼라인(align) 하였다. 페어드엔드 리드는 또한 공공데이터베이스로부터 추출한 161,250개의 mRNA (RefSeq 데이터베이스로부터 36,742개의 mRNA, USCS 데이터베이스로부터 73,671개의 mRNA 및 Ensembl 데이터베이스로부터 161,214개의 mRNA)로 구성한 인간참조전사체에 얼라인하여 mRNA 편집(mRNA splicing)에 기인한 미스얼라인(misalignment)을 최소화하였다.
실시예 7: 융합유전자 분석
인프레임(in-frame) 융합유전자는 GFP 알고리즘을 통해 검색하였고, deFuse 및 FusionMap 알고리즘으로 교차검증하였다. 예컨대, GFP를 통한 융합유전자는 다음의 조건을 통해 검색하였다.
(1) 융합전사체를 구성하는 상이한 공여유전자(donor gene)와 수납유전자(acceptor gene)에 얼라인 된 리드쌍(discordant read pairs) 및 융합 부위(exonic fusion breakpoint)에 얼라인된 리드(exon-spanning reads)가 존재하는 경우 수락한다.
(2) 공여 및 수납유전자 DNA 가닥의 방향성(strand orientation)이 염색체 전좌 또는 역위 또는 결실을 통해 유전자융합을 설명하는 경우 수락한다.
(3) 염기서열의 상동성이 높은 경우 (E값 < 0.01) 제외한다.
(4) 거리가 10bp 미만의 비논리적 리드쌍인 경우 제외한다.
융합유전자는 다음의 조건을 통해 확정하였다.
(1) GFP 또는 deFuse 또는 FusionMap 중 2개의 알고리즘에서 검색된 융합유전자를 수락한다.
(2) 공여유전자와 수납유전자에 얼라인된 리드쌍이 10개 이상인 경우 수락한다.
(3) 융합 부위에 얼라인된 리드가 10개 이상인 경우 수락한다.
(4) 공여유전자와 수납유전자가 동일한 염색체 내에 존재하고 유전자간 거리가 100Kb 이상인 경우 수락한다.
(5) 아웃프레임(out-frame) 융합유전자는 제외한다.
(6) 융합 부위 이후에 존재하는 수납유전자의 엑손들이 융합되지 않은 수납유전자의 엑손들과 비교하여 과발현된 경우 수락한다.
실시예 8: 이상발현유전자( differentially expressed gene : DEG ) 분석
이상발현유전자는 미국 브로드연구소(Broad Institute)의 GenePattern 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 생산하고 TopHat으로 얼라인된 리드는 Cufflinks를 이용하여 전사체로 조합하였다. 각각의 유전자별로 얼라인된 리드의 수는 FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per Million) 방법으로 표준화한 후 각각의 유전자별 발현량으로 표시하였다. 80% 이상의 임상조직에서 0 이상의 FPKM을 갖는 18,725개의 유전자 발현량을 기초로 전체 임상조직을 PCA (Principle Component Analysis)로 분석하여 이상치(outlier) 임상조직 3개(6쌍)를 제거하였다. PCA 분석을 통해 총 147개의 대장암 임상조직 및 47개의 정상 임상조직에서 얻어진 18,725개의 유전자가 이상발현유전자 분석의 대상이 되었다. 대장암 임상조직에서 특이적인 이상발현유전자는 쌍체 양측 t검정(pairwise 2-sided t-test) (p < 0.05) 및 Benjamini-Hochart 다중비교보정(FDR < 0.05)를 통해 검색하였다.
실시예 9: 체세포 돌연변이( non - synonymous somatic mutation ) 분석
단일염기변이(single nucleotide variances: SNVs)는 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 생산된 리드를 GSNAP을 통해 인간참조전사체에 얼라인하여 검색하였다. 단일염기변이는 다음의 조건을 통해 검색하였다.
(1) 위치 특이적으로 얼라인되는 리드의 수가 2개 이상인 경우 수락한다.
(2) 상기 위치의 평균 염기품질이 20 이상인 경우 수락한다.
(3) 상기 위치의 대립유전자(allele) 빈도가 3% 이상인 경우 수락한다.
(4) 상기 위치에 얼라인된 리드의 수가 10개 이상인 경우 수락한다.
유전자의 어노테이션(annotation)은 RefSeq을 참고하고, 생식세포 돌연변이(germline variants)는 다음의 조건을 통하여 제거하였다.
(1) dbSNP137와 비교하여 전체 임상조직 중 대립유전자형(minor allele)의 빈도가 1% 이상인 경우 제외한다.
(2) 59명의 한국인참조유전체와 비교하여 정상인에서 관찰된 생식세포 돌연변이는 제외한다.
(3) 본 발명에서 사용된 47례의 정상 대장조직에서 관찰된 생식세포 돌연변이는 제외한다.
정상 대장조직쌍이 없는 대장암 임상조직에서는 예상치보다 높은 체세포 돌연변이의 빈도가 관찰되는 점을 고려하여, 체세포 돌연변이는 음성선발(negative selection)을 기준으로 검색하였다.
실시예 10: 역전사연쇄중합반응( reverse transcriptase - polymerase chain reaction: RT - PCR )과 생어시퀀싱 ( Sanger sequencing )
NTRK1 융합전사체는 역전사연쇄중합반응 및 생어시퀀싱을 통해 확인하였다. 연쇄중합반응의 조건은 아래의 표 11에 정리하였다.
NTRK1 융합전사체 확인용 연쇄중합반응 조건
공여유전자 수납유전자 프라이머 연쇄중합반응 조건 연쇄중합반응 산물
TPM3 (엑손 8) NTRK1 (엑손 9 또는 엑손 11 또는 엑손 12) 서열번호 35 및 서열번호 36 변성(denaturation): 94도 30초
결합(annealing): 55.7도 30초
신장(extension)
72도 30초
총 30회		 406bp
553bp
712bp
LMNA (엑손 6) NTRK1 (엑손 11) 서열번호 37 및 서열번호 38 변성: 94도 30초
결합: 54도 30초
신장: 72도 30초
총 30회		 354bp
연쇄중합반응의 산물은 TOPO TA 벡터(라이프 테크놀로지사, 미국)에 삽입한 다음 생어법으로 시퀀싱하였다.
실시예 11: 형광직접접합( fluorescence in situ hybridization : FISH )
NTRK1 융합유전자는 NTRK1 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 결합하는 분리 형광직접접합 (split FISH) 프로브를 이용하여 확인하였다(아브노바사, 대만). 예컨대, 포르말린 고정 후 파라핀으로 포매 된 대장암 및 정상 임상조직의 절단면은 파라핀을 제거하고, 프로티아제를 처리한 다음 75도에서 변성하였다. 변성된 임상조직의 절단면은 표 8에 정리된 프로브와 함께 ThermoBrite (아보트사, 미국)에서 17시간 배양하였다. 배앙된 임상조직의 절단면은 세척 후 DAPI(아보트사)를 이용하여 대조염색하였고, TexRed와 FITC 신호의 거리를 관찰하였다.
실시예 12: 면역조직학분석( immunohistochemistry ) 및 임상병리학적( clinicopathological ) 분석
NTRK1 융합단백질은 NTRK1 유전자 융합에 의존적으로 발현한다는 점에 착안하여, NTRK1 융합단백질의 발현은 표 10에 정리된 NTRK1 단백질 특이적인 항체(오리진사, 미국)를 이용하여 면역조직학적으로 확인하였다. 뇌의 신경절 세포 및 임파구는 각각 NTRK1 융합단백질 발현의 면역조직학분석의 양성대조군 및 음성대조군으로 사용하였다.
NTRK1 융합단백질의 발현 빈도는 216명의 한국인 대장암 환자 코호트 및 472명의 중국 대장암 환자 코호트(바이오맥스사, 미국)에서 구축한 조직마이크로어레이(tissue microarray)를 이용하여 면역조직학적으로 분석하였다. NTRK1 융합단백질 발현의 면역조직학분석을 통해 한국인 대장암 환자는 NTRK1 융합단백질 양성환자와 음성환자로 계층화하였고, 계층화된 환자군은 대장암의 위치, 대장암 침윤도(invasion depth), 신경주위침윤(perineural invasion), 림프혈관색전(lymphovascular emboli), 임파절전이(lymphnode metastasis), 현미부수체 불안정성 및 10년 생존율을 비교하였다.
실시예 13: NIH3T3 세포주에서 NTRK1 융합유전자의 발현
TPM3, LMNA 및 NTRK1 유전자의 cDNA는 오리진사로부터 구입하였다. LMNA (엑손 6)-NTRK1 (엑손 11) 및 TPM3 (엑손 8)-NTRK1 (엑손 9 또는 엑손 11 또는 엑손 12) 융합전사산물은 오버랩익스텐션(overlap extension) 연쇄중합반응을 통해 제작하였다. 제작된 융합전사산물은 Cold Fusion Cloning kit (시스템 바이오사이언스사, 미국)를 이용하여 IRES-GFP가 장착된 pcDNA3.1 (라이프 테크놀로지사)에 클로닝하였다. 클로닝된 융합유전자는 생어시퀀싱을 통해 확인한 후 TPM3-NTRK1 및 LMNA-NTRK1 융합전사산물 발현 벡터를 완성하였다. NIH3T3 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였다. 융합전사산물 발현 벡터는 FUGENE 6 (로슈, 독일)을 이용하여 NIH3T3 세포주에 도입하였다. 형질전환 된 NIH3T3 세포주는 G418(라이크 테크놀로지사)를 이용하여 선발하였고, GFP 단백질 발현을 이용한 유세포 분석을 통해 완성하였다.
실시예 14: NTRK1 융합유전자의 종양성 분석
TPM3-NTRK1 또는 LMNA-NTRK1 융합유전자의 종양성은 형질전환 된 NIH3T3 세포주의 체외 세포괴 형성능 및 체내 종양성 평가를 통해 확인하였다. 체외 세포괴 형성능은 총 1,200개의 형질전환 된 NIH3T3 세포를 0.3% 상단 아가로즈(agarose)에 도입한 다음 0.5% 하단 아가로즈 위에서 3주일간 배양하여 형성된 세포괴의 수와 크기를 관찰하였다. 융합유전자가 없는 공벡터가 도입된 NIH3T3 세포주와 TPM3-NTRK1 융합유전자가 있는 KM12 대장암 세포주는 각각 음성 및 양성대조군으로 사용되었다. 형성된 세포괴는 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 광학현미경으로 개수하였다. 체내 종양성은 총 백만 개의 형질전환 된 NIH3T3 세포 또는 KM12 세포를 면역능이 결핍된 누드마우스의 등쪽 피하에 접종한 후 관찰하였다. 실험군별로 5마리의 누드마우스를 사용하였다. 세포 접종 후 측정 가능한 종양이 형성되면 3일 간격으로 세포 접종 후 총 32일 동안 종양의 크기를 측정하였다.
실시예 15: 약물 스크리닝
NTRK1 융합단백질의 기능 저해를 통한 대장암 치료 약물 스크리닝 방법은 KM12 세포주를 이용하여 확인하였다. 다중 티로신키나아제 저해제인 레스타우르티닙과 크리조티닙은 토크리스 바이오사이언스사 (영국)에서 구입하였고, NTRK1 단백질 특이적인 저해제인 ARRY-470은 LG생명과학에서 합성하였고, 한국과학기술원에서 제공받은 화합물을 상기 본 발명의 스크리닝 방법을 통하여 스크리닝한 결과 공개특허 제10-2013-0106186호에 개시된 화합물 8(본 발명에서 5f) 및 화합물 27(본 발명에서 6s)이 스크리닝되었다. 상기 스크리닝된 화합물 8(5f)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이고 화합물 27(6s)는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure pat00005
[화학식 2]
Figure pat00006

상기 각각의 저해제는 0.64 nM에서 10 μM의 농도로 4일간 처리하였고, 세포증식의 억제 정도는 ATP-Glo Bioluminometric Cell Viability Assay kit (바이오티움사, 미국)를 이용하여 확인하였다.
상기 NTRK1 융합유전자 또는 이에 암호화된 NTRK1 융합단백질의 활성을 저해하여 대장암을 치료할 수 있는 약물을 스크리닝 한 결과, 다중 티로신키나아제 억제제 중 NTRK1 단백질에 활성을 갖는 레스타우르티닙은 약 10.7 nM의 농도에서 KM12 세포의 성장을 50% 억제하였고, NTRK1 단백질에 선택적인 저해제인 ARRY-470은 약 3.2 nM에서 KM12 세포의 성장을 50% 억제하였다. 반면, NTRK1 단백질에 낮은 활성을 갖는 크리조티닙은 약 184.8 nM의 농도에서 KM12 세포의 성장을 50% 억제하였다. NTRK1 단백질에 높은 선택성을 갖는 공개특허 제10-2013-0106186호에 개시된 화합물 8(본 발명에서 5f) 및 화합물 27(본 발명에서 6s)은 낮은 세포투과도 때문에 비교적 낮은 544.2 nM 및 929.1 nM에서 KM12 세포의 성장을 50% 억제하는 것을 확인하였다(도 13 참고).
실시예 16: 한국인 대장암 임상조직에서 관찰된 인프레임 융합유전자
상기 차세대 전사체 염기서열분석을 통해 중간값 118.5 백만개의 얼라인된 리드는 생산하였고 100개의 염기 중 1개의 염기에서 오차가 발생할 수 있는 수준은 94.3%로 확인되었다 (도 14 참고). PCA 분석 결과 3개의 임상조직이 이상치로 확인되었고, 이상치 임상조직을 포함하는 대장암 및 정상 대장 임상조직 3쌍이 본 발명에서 제외되었다 (도 15 참고). 따라서 대장암 임상조직 147례 및 정상 대장 임상조직 47례가 본 발명에 사용되었다. GFP 또는 deFuse 또는 FusionMap 알고리즘을 이용한 융합유전자 분석 결과 9개의 인프레임 융합유전자가 확인되었다 (표 12 참고).
한국인 대장암 임상조직에서 관찰된 인프레임 융합유전자
시료ID Stage Discordant paired-end reads spanning reads Distance
(bp)		 공여 유전자
(Donor gene)		 FPKM Location 수여 유전자
(Acceptor)		 FPKM Location
LGP088T Ⅲ 27 153 2620933 TPM3 59 chr1:154142876 NTRK1 31 chr1:156844363
LGC012T Ⅲ 25 132 2620933 TPM3 94 chr1:154142876 NTRK1 20 chr1:156845312
TPM3 94 chr1:154142876 NTRK1 20 chr1:156845872
LGC026T Ⅱ 11 15 675664 LMNA 145 chr1:156105740 NTRK1 32 chr1:156845312
LGC007T Ⅲ 21 197 771740 PTPRK 17 chr6:128841404 RSPO3 31 chr6:127469793
LGC054T Ⅲ 36 140 771740 PTPRK 15 chr6:128505577 RSPO3 37 chr6:127469793
LGC030T Ⅲ 56 374 2667510 NAGLU 255 chr17:40693224 IKZF3 55 chr17:37922746
LGP047T Ⅱ 45 206 1020112 GTF3A 641 chr13:27999075 CDK8 93 chr13:26923209
LGP024T Ⅱ 24 98 55463 RAD51AP1 7 chr12:4662255 AKAP3 18 chr12:4737971
LGP031T Ⅱ 17 53 28829615 RASA1 11 chr5:86564807 LOC644100 19 chr5:115394422
확인된 융합유전자로는 타이로신 탈인산화효소, 수용체 타입, K(tyrosine phosphatase, receptor type, K: PTPRK) 유전자와 R 스폰딘 3(R-spondin 3: RSPO3) 유전자간의 융합유전자가 2례의 대장암 임상조직에서 확인되었고(1.4%), N-아세틸클루코사미니다제, 알파(N-acetylglucosaminidase, alpha: NAGLU) 유전자와 아키로스 페밀리 징크 핑거 3(IKAROS family zinc finger 3: IKZF3) 유전자간의 융합유전자가 1례의 대장암 임상조직에서 확인되었고(0.7%), 일반 전사인자 IIIA(general transcription factor IIIA: GTF3A) 유전자와 사이클린 의존적 키나아제 8(cyclin-dependent kinase 8: CDK8) 유전자간의 융합유전자가 1례의 대장암 임상조직에서 확인되었고(0.7%), RAD51 연관 단백질 1(RAD51 associated protein 1: RAD51AP1) 유전자와 A 키나아제 고정 단백질 3(A kinase anchor protein 3: AKAP3) 유전자간의 융합유전자가 1례의 대장암 임상조직에서 확인되었고(0.7%), RAS p21 활성 단백질 1(RAS p21 protein activator 1: RASA1) 유전자와 ADP 리보실레이션 유사인자 14 유사 단백질(ADP-ribosylation factor-like 14 effector protein-like: LOC644100) 유전자간의 융합유전자가 1례의 대장암 임상조직에서 확인되었고(0.7%), 라민 A/C(lamin A/C: LMNA) 또는 트로포미오신 3(tropomysosin 3: TPM3) 유전자와 신경영양성 타이로신 키나아제, 수용체, 타입 1(neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1: NTRK1) 유전자간의 융합유전자가 3례의 대장암 임상조직에서 확인되었다(2.0%). 상기의 융합유전자 중 NTRK1 유전자는 세포막에 고정되어 있는 TrkA 단백질을 암호화하는 유전자로 대장암 및 갑상선 유두암에서 TPM3-NTRK1 융합유전자가 보고되었고, 폐선암에서는 미오신 탈인산화효소 Rho 상호작용 단백질(myosin phosphatase Rho interacting protein: MPRIP) 유전자 또는 CD74 유전자와 NTRK1 유전자간의 융합유전자가 보고되었고, 스피트조이드(Spitzoid) 흑색종에서는 TP53 유전자 또는 LMNA 유전자와 NTRK1 유전자간의 융합유전자가 보고되었고, 담낭암에서는 RAB 지티파아제 유사 활성 단백질 1(RAB GTPase activating protein 1-like: RABGAP1L) 유전자와 NTRK1 유전자간의 융합유전자가 보고되었고, 다형성고아종에서는 뉴로파신(neurofascin: NFASC) 유전자 또는 브레비칸(brevica: BCAN) 유전자와 NTRK1 유전자간의 융합유전자가 보고되었다. 그러나 대장암에서 NTRK1 융합유전자의 빈도 및 임상적 의의는 규명되지 않았다.
실시예 17: NTRK1 유전자, NTRK1 융합유전자 및 이의 단백질 분석
NTRK1 유전자 엑손의 발현은 NTRK1 융합유전자가 확인된 대장암 임상조직에서만 관찰되었다(도 1 참고). 역전사연쇄중합반응 및 생어시퀀싱을 이용하여 NTRK1 융합전사산물을 분석한 결과, TPM3-NTRK1 융합유전자는 TMP3 유전자 중 chr1: 154142876 위치에서 절단되어 서열번호 2를 보존하고, 구체적으로 서열번호 3을 5' 말단방향으로 보존하고, NTRK1 유전자 중 chr1:156844363 또는 chr1:156845312 또는 chr1:156845872 위치에서 절단되어 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12를 보존하고, 구체적으로 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13을 3' 말단방향으로 보존한 형태로 융합되었음이 확인되었다. LMNA-NTRK1 유전자는 LMNA 유전자 중 chr1:156105740 위치에서 절단되어 서얼변호 28을 보존하고, 구체적으로 서열번호 29를 5' 말단방향으로 보존하고, NTRK1 유전자 중 chr1:156845312 위치에서 절단되어 서열번호 10을 보존하고, 구체적으로 서열번호 11을 3' 말단방향으로 보존한 형태로 융합되었음이 확인되었다 (도 2 참고).
NTRK1 단백질에 대한 항체, 구체적으로 NTRK1에 의한 암호화되는 NTRK1 단백질, 구체적으로 TrkA 단백질의 C말단 부위에 결합하는 항체를 이용한 면역조직학 분석 결과, NTRK1 융합전사산물이 확인된 대장암 임상조직에서 TRKA 발현이 확인되었다(도 3 참고). NTRK1 융합유전자는 NTRK1 유전자에 대한 형광직접접합 분석으로 재확인하였다. NTRK1 유전자의 5' 말단은 TexRed가 표지된 프로브로 접합하였고, NTRK1 유전자의 3' 말단은 FITC가 표지된 프로브로 접합한 결과, NTRK1 융합전사산물 및 융합단백질이 확인된 대장암 임상조직에서 분리된 적색과 녹색의 프로브 신호가 확인되었고(도 4 참고), 정상 대장 임상조직에서는 합쳐진 적색과 녹색의 프로브 신호가 확인되었다(도 5 참고). NTRK1 융합유전자 및 융합단백질을 추정한 결과, NTRK1 융합단백질은 NTRK1 단백질 중 티로신키아나제 도메인이 잘 보존되어 있는 것이 확인되었다(도 6 참고).
실시예 18: NTRK1 융합유전자의 종양성 확인
NTRK1 융합유전자의 종양성은 갑상선 유두암 및 폐선암에서 보고되었다. 그러나 대장암에서 NTRK1 융합유전자의 종양성은 충분히 검증되지 않았다. TPM3-NTRK1 융합유전자 및 LMNA-NTRK1 융합유전자의 종양성을 확인하고자 인실리코(in silico) 및 체외 및 체내 평가가 실시되었다. 체세포 돌연변이 분석 결과를 기반으로 NTRK1 융합유전자의 종양성을 인실리코 방법으로 분석한 결과, NTRK1 융합유전자가 확인된 대장암 임상조직에서는 대표적인 대장암 유전자의 체세포 돌연변이가 관찰되지 않았다(도 7 참고). 이를 통하여 NTRK1 융합유전자가 대장암의 원인 유전자(driver oncogene)로서 작용하는 것을 확인하였다. NTRK1 융합유전자의 강제발현을 통해 형질전환된 NIH3T3 세포는 체외에서 KM12 대장암 세포주와 유사한 수준의 세포괴를 형성하였다. 이와 대조적으로 NTRK1 융합유전자가 없는 공벡터를 도입한 NIH3T3 세포주는 세포괴를 형성하지 않았다(도 8 참고). 형질전환된 NIH3T3 세포주를 면역능이 결핍된 누드마우스에 접종한, NTRK1 융합유전자가 도입된 NIH3T3 세포주는 세포 접종 후 18일째부터 측정이 가능한 종양이 형성되었고, 세포 접종 후 32일째에는 KM12 대장암 세포주와 유사한 수준의 종양으로 발달하였다(도 9 참고).
실시예 19: NTRK1 단백질 발현과 NTRK1 융합유전자의 상관성
NTRK1 단백질은 NTRK1 유전자 융합에 의존적으로 발현한다는 점에 착안하여, 216명의 한국인 대장암 환자 코호트 및 472명의 중국인 대장암 환자 코호트로부터 구축한 조직마이크로어레이와 NTRK1 단백질, 구체적으로 NTRK1 유전자에 의해 암호화된 TrkA 단백질의 C말단 부위에 결합하는 항체를 이용하여 NTRK1 융합유전자의 빈도를 관찰한 결과, 29.2%의 한국인 대장암 환자 유래의 대장암 임상조직에서 NTRK1 단백질이 발현하는 것이 확인되었고, 25.6%의 중국인 대장암 환자 유래의 대장암 임상조직에서 NTRK1 단백질이 발현하는 것이 확인되었다 (도 10 참고). NTRK1 단백질 발현과 NTRK1 융합유전자의 상관성을 확인하고자, 한국인 대장암 환자 코호트로부터 NTRK1 단백질 발현이 확인된 한국인 대장암 환자의 임상조직에 NTRK1 유전자에 대한 형광직접접합을 실시하였다. 분리된 NTRK1 형광직접접합 신호의 빈도는 NTRK1 단백질의 발현이 확인된 임상조직에서 관찰되었다 (p < 0.0192) (도 11 및 표 13 참고). 따라서, NTRK1 융합유전자는 NTRK1 단백질 발현의 일부, 구체적으로 42.9%의 원인 유전자임이 확인되었다.
NTRK1 단백질 발현과 NTRK1 융합유전자의 상관성
Sample ID Cytoplasmic TrkA expression NTRK1 fusion P value
IHC FISH
Colon_50_FISH01 Strong Frequently detected 0.0192
Colon_50_FISH02 Strong Not detected
Colon_50_FISH03 Strong Not available
Colon_50_FISH04 Strong Frequently detected
Colon_50_FISH05 Strong Not detected
Colon_50_FISH06 Moderate Frequently detected
Colon_50_FISH07 Moderate Not detected
Colon_50_FISH08 Mild Not detected
Colon_50_FISH09 Mild Not detected
Colon_50_FISH10 Mild Not detected
Colon_50_FISH11 Negative Not detected
Colon_50_FISH12 Negative Not detected
Colon_50_FISH13 Negative Not detected
Colon_50_FISH14 Negative Not detected
Colon_50_FISH15 Negative Not detected
실시예 20: NTRK1 융합단백질과 대장암 환자군 생존율
상기 임상 시료를 받은 대장암 환자 중에 추적이 가능한 216명의 한국인 대장암 환자에 대해 코호트 분석을 진행하였다. 216명의 한국인 대장암 환자에 대한 10년 생존율 추적 중 42명의 환자(24.1%)가 추적기간 동안 사망하였다.
먼저, 임상 시료를 분석한 결과에 따라 전체 216명의 한국인 대장암 환자는 NTRK1 단백질의 발현에 따라 NTRK1 융합단백질 양성 환자군과 NTRK1 융합단백질 음성 환자군으로 계층화하였다. 계층화된 대장암 환자군 간의 임상병리학적 분석 결과, NTRK1 융합유전자 또는 이에 암호화된 NTRK1 융합단백질이 확인된 대장암 환자군은 좌측 대장에 대장암이 위치하고(p = 0.0504), 대장암의 침윤도가 높으며(p = 0.0437), 양성의 신경주위침윤 또는 림프혈관색전이가 관찰되고(p = 0.0429), 임파절 전이가 높고(p = 0.015), 현미부수체가 안정한 것으로(p = 0.0024) 확인되었다 (표 14 참고).
대장암 환자(한국인) 코호트의 임상병리적 특징
N Cytoplasmic TrkA P value
(-) (+)
나이 (years) 216 70.35 70.22 0.4675
크기 (cm) 216 5.199 5.548 0.2959
성별 0.3351
Male 118 85 33
Female 98 68 30
위치 0.0504
Right colon 87 67 20
Left colon 129 86 43
Histological type 0.0761
well 16 13 3
Moderate 178 120 58
Poor 10 10 0
Mucinous 12 10 2
Invasion depth
(T1-2 vs. T3)		 0.0437
T1 12 10 2
T2 23 19 4
T3 181 124 57
Perineural invation
(PNI)		 0.1315
Negative 149 109 40
Positive 67 44 23
Lymphovascular emboli (LVE) 0.2229
Negative 142 103 39
Positive 74 50 24
PNI/LVE 0.0429
Negative 119 90 29
Positive 97 63 34
Lymphnode metastasis
(N0 vs N1-2)		 0.015
N0 124 95 29
N1a 40 23 17
N1b 32 22 10
N2a 13 9 4
N2b 7 4 3
Microsatellite status 0.0024
MSS 180 119 61
MSI-L 6 5 1
MSI-H 30 29 1
상기 대장암 계층군의 10년 생존율을 분석한 결과, NTRK1 융합단백질이 확인된 대장암 환자군은 NTRK1 융합단백질이 확인되지 않은 대장암 환자군보다 유의적으로 낮은 생존율이 관찰되었다 (p = 0.0411, 위험도 = 0.5346, 95% 신뢰구간 = 0.2548~0.9722)(도 12 참고).
실시예 21: 결론
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, TPM3-NTRK1 융합유전자 또는 이에 암호화된 융합전사산물 및 융합단백질 또는 NTRK1 유전자의 융합에 의존적인 NTRK1 유전자의 전사산물 및 단백질의 검출에 의하여 대장암 환자의 예후를 진단하고, NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료의 유효성을 예측하는 것이 가능해진다.
NTRK1 단백질에 대한 저해 효과를 가지는 저해제는 이미 여러 암종의 치료를 위한 임상연구에 도입되어 있다. 예를 들면 레스타우르티닙은 전립선암, 신경아세포종, 골수성 백혈병에 대한 치료효과를 연구 중에 있고, 다누세르팁은 전립선암, 비소세포폐암, 만성 골수성 백혈병에 대한 치료효과를 연구 중에 있고, 미르시클립은 갑상선암 및 기타 고형암에 대한 치료효과를 연구 중에 있고, RXDA-101은 기타의 고형암에, TSR-011은 비소세포폐암에, NMS-P626은 대장암에, RXDX-102는 기타의 암종에 대한 치료효과를 연구 중에 있다.
이와 같이, NTRK1 유전자의 융합 또는 이에 의존적인 NTRK1 유전자의 전사산물 및 단백질의 발현은 복수의 암종에서 생겨 있다. NTRK1 융합유전자는, KRAS, NRAS, PIK3CA 등 대장암 유전자의 돌연변이로부터 괴리하고 있다. 따라서, NTRK1 융합유전자는, 기존의 NTRK1 단백질 저해제, 구체적으로 NTRK1 티로신키나아제에 대한 저해능을 갖는 티로신티나아제 저해제의 표적이 될수 있다. 또한, NTRK1 융합유전자의 존재는 한국인을 포함한 중국인 대장암 환자에 있어서도 인정된다. 따라서, 본 발명의 방법은, 한국인 및 중국인 대장암 환자에 있어서, 대장암 치료의 효율을 높이는 동시에, 매우 유용하다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LG Life Sciences Ltd. <120> Novel NTRK1 fusion gene as colon cancer marker and the uses thereof <130> KPA140037-KR-P1 <150> KR 10-2014-0004491 <151> 2014-01-14 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 858 <212> DNA <213> TPM3 cds <400> 1 atgatggagg ccatcaagaa aaagatgcag atgctgaagt tagacaagga gaatgctctg 60 gatcgggcag agcaagctga agctgagcag aagcaggcag aagaaagaag taaacagctg 120 gaggatgagc tggcagccat gcagaagaag ctgaaaggga cagaggatga gctggacaag 180 tattctgaag ctttgaagga tgcccaggag aagctggaac tggcagagaa gaaggctgct 240 gatgctgagg ctgaggtggc ctccttgaac cgtaggatcc agctggttga agaagagctg 300 gaccgtgctc aggagcgcct ggccactgcc ctgcaaaagc tggaagaagc tgaaaaagct 360 gctgatgaga gtgagagagg tatgaaggtt attgaaaacc gggccttaaa agatgaagaa 420 aagatggaac tccaggaaat ccaactcaaa gaagctaagc acattgcaga agaggcagat 480 aggaagtatg aagaggtggc tcgtaagttg gtgatcattg aaggagactt ggaacgcaca 540 gaggaacgag ctgagctggc agagtctaag tgttctgagc tggaggagga gctgaagaat 600 gtcaccaaca acctcaagtc tcttgaggct caggcggaga agtactctca 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Lys Asp Glu Glu Lys Met Glu Leu 130 135 140 Gln Glu Ile Gln Leu Lys Glu Ala Lys His Ile Ala Glu Glu Ala Asp 145 150 155 160 Arg Lys Tyr Glu Glu Val Ala Arg Lys Leu Val Ile Ile Glu Gly Asp 165 170 175 Leu Glu Arg Thr Glu Glu Arg Ala Glu Leu Ala Glu Ser Lys Cys Ser 180 185 190 Glu Leu Glu Glu Glu Leu Lys Asn Val Thr Asn Asn Leu Lys Ser Leu 195 200 205 Glu Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ser Gln Lys Glu Asp Lys Tyr Glu Glu 210 215 220 Glu Ile Lys Ile Leu Thr Asp Lys Leu Lys Glu Ala Glu Thr Arg Ala 225 230 235 240 Glu Phe Ala Glu Arg Ser Val Ala Lys Leu Glu Lys Thr Ile Asp Asp 245 250 255 Leu Glu Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Lys Leu Lys Tyr Lys Ala Ile Ser 260 265 270 Glu Glu Leu Asp His Ala Leu Asn Asp Met Thr Ser Ile 275 280 285 <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> TPM3 fragment <400> 5 Met Met Glu Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Met Leu Lys Leu Asp Lys 1 5 10 15 Glu Asn Ala Leu Asp Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ala Glu Gln Lys Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Arg Ser Lys Gln Leu Glu Asp Glu Leu Ala Ala Met Gln 35 40 45 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PRT <213> TPM3-NTRK1 fusion site aa seq <400> 26 Ile Asp Asp Leu Glu Gly Val His His Ile Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 1995 <212> DNA <213> LMNA CDS <400> 27 atggagaccc cgtcccagcg gcgcgccacc cgcagcgggg cgcaggccag ctccactccg 60 ctgtcgccca cccgcatcac ccggctgcag gagaaggagg acctgcagga gctcaatgat 120 cgcttggcgg tctacatcga ccgtgtgcgc tcgctggaaa cggagaacgc agggctgcgc 180 cttcgcatca ccgagtctga agaggtggtc agccgcgagg tgtccggcat caaggccgcc 240 tacgaggccg agctcgggga tgcccgcaag acccttgact cagtagccaa ggagcgcgcc 300 cgcctgcagc tggagctgag caaagtgcgt gaggagttta aggagctgaa agcgcgcaat 360 accaagaagg agggtgacct gatagctgct caggctcggc tgaaggacct ggaggctctg 420 ctgaactcca aggaggccgc actgagcact gctctcagtg agaagcgcac gctggagggc 480 gagctgcatg atctgcgggg ccaggtggcc aagcttgagg cagccctagg tgaggccaag 540 aagcaacttc aggatgagat gctgcggcgg gtggatgctg agaacaggct gcagaccatg 600 aaggaggaac tggacttcca gaagaacatc tacagtgagg agctgcgtga gaccaagcgc 660 cgtcatgaga cccgactggt ggagattgac aatgggaagc agcgtgagtt tgagagccgg 720 ctggcggatg cgctgcagga actgcgggcc cagcatgagg accaggtgga gcagtataag 780 aaggagctgg agaagactta ttctgccaag ctggacaatg ccaggcagtc tgctgagagg 840 aacagcaacc tggtgggggc tgcccacgag gagctgcagc agtcgcgcat ccgcatcgac 900 agcctctctg cccagctcag ccagctccag aagcagctgg cagccaagga ggcgaagctt 960 cgagacctgg aggactcact ggcccgtgag cgggacacca gccggcggct gctggcggaa 1020 aaggagcggg agatggccga gatgcgggca aggatgcagc agcagctgga cgagtaccag 1080 gagcttctgg acatcaagct ggccctggac atggagatcc acgcctaccg caagctcttg 1140 gagggcgagg aggagaggct acgcctgtcc cccagcccta cctcgcagcg cagccgtggc 1200 cgtgcttcct ctcactcatc ccagacacag ggtgggggca gcgtcaccaa aaagcgcaaa 1260 ctggagtcca ctgagagccg cagcagcttc tcacagcacg cacgcactag cgggcgcgtg 1320 gccgtggagg aggtggatga ggagggcaag tttgtccggc tgcgcaacaa gtccaatgag 1380 gaccagtcca tgggcaattg gcagatcaag cgccagaatg gagatgatcc cttgctgact 1440 taccggttcc caccaaagtt caccctgaag gctgggcagg tggtgacgat ctgggctgca 1500 ggagctgggg ccacccacag cccccctacc gacctggtgt ggaaggcaca gaacacctgg 1560 ggctgcggga acagcctgcg tacggctctc atcaactcca ctggggaaga agtggccatg 1620 cgcaagctgg tgcgctcagt gactgtggtt gaggacgacg aggatgagga tggagatgac 1680 ctgctccatc accaccacgg ctcccactgc agcagctcgg gggaccccgc tgagtacaac 1740 ctgcgctcgc gcaccgtgct gtgcgggacc tgcgggcagc ctgccgacaa ggcatctgcc 1800 agcggctcag gagcccaggt gggcggaccc atctcctctg gctcttctgc ctccagtgtc 1860 acggtcactc gcagctaccg cagtgtgggg ggcagtgggg gtggcagctt cggggacaat 1920 ctggtcaccc gctcctacct cctgggcaac tccagccccc gaacccagag cccccagaac 1980 tgcagcatca tgtaa 1995 <210> 28 <211> 985 <212> DNA <213> LMNA fragment cDNA <400> 28 atggagaccc cgtcccagcg gcgcgccacc cgcagcgggg cgcaggccag ctccactccg 60 ctgtcgccca cccgcatcac ccggctgcag gagaaggagg acctgcagga gctcaatgat 120 cgcttggcgg tctacatcga ccgtgtgcgc tcgctggaaa cggagaacgc agggctgcgc 180 cttcgcatca ccgagtctga agaggtggtc agccgcgagg tgtccggcat caaggccgcc 240 tacgaggccg agctcgggga tgcccgcaag acccttgact cagtagccaa ggagcgcgcc 300 cgcctgcagc tggagctgag caaagtgcgt gaggagttta aggagctgaa agcgcgcaat 360 accaagaagg agggtgacct gatagctgct caggctcggc tgaaggacct ggaggctctg 420 ctgaactcca aggaggccgc actgagcact gctctcagtg agaagcgcac gctggagggc 480 gagctgcatg atctgcgggg ccaggtggcc aagcttgagg cagccctagg tgaggccaag 540 aagcaacttc aggatgagat gctgcggcgg gtggatgctg agaacaggct gcagaccatg 600 aaggaggaac tggacttcca gaagaacatc tacagtgagg agctgcgtga gaccaagcgc 660 cgtcatgaga cccgactggt ggagattgac aatgggaagc agcgtgagtt tgagagccgg 720 ctggcggatg cgctgcagga actgcgggcc cagcatgagg accaggtgga gcagtataag 780 aaggagctgg agaagactta ttctgccaag ctggacaatg ccaggcagtc tgctgagagg 840 aacagcaacc tggtgggggc tgcccacgag gagctgcagc agtcgcgcat ccgcatcgac 900 agcctctctg cccagctcag ccagctccag aagcagctgg cagccaagga ggcgaagctt 960 cgagacctgg aggactcact ggccc 985 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> LMNA 5' terminal cleavage site seq <400> 29 gaggactcac tggccc 16 <210> 30 <211> 664 <212> PRT <213> LMNA full length <400> 30 Met Glu Thr Pro Ser Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Gly Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ser Ser Thr Pro Leu Ser Pro Thr Arg Ile Thr Arg Leu Gln Glu Lys 20 25 30 Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Leu Ala Val Tyr Ile Asp Arg 35 40 45 Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Leu Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Ser Glu Glu Val Val Ser Arg Glu Val Ser Gly Ile Lys Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asp Ala Arg Lys Thr Leu Asp Ser Val Ala 85 90 95 Lys Glu Arg Ala Arg Leu Gln Leu Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Glu 100 105 110 Phe Lys Glu Leu Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys Glu Gly Asp Leu Ile 115 120 125 Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys 130 135 140 Glu Ala Ala Leu Ser Thr Ala Leu Ser Glu Lys Arg Thr Leu Glu Gly 145 150 155 160 Glu Leu His Asp Leu Arg Gly Gln Val Ala Lys Leu Glu Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Glu Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Glu Met Leu Arg Arg Val Asp 180 185 190 Ala Glu Asn Arg Leu Gln Thr Met Lys Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys 195 200 205 Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg Glu Thr Lys Arg Arg His Glu Thr 210 215 220 Arg Leu Val Glu Ile Asp Asn Gly Lys Gln Arg Glu Phe Glu Ser Arg 225 230 235 240 Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu Arg Ala Gln His Glu Asp Gln Val 245 250 255 Glu Gln Tyr Lys Lys Glu Leu Glu Lys Thr Tyr Ser Ala Lys Leu Asp 260 265 270 Asn Ala Arg Gln Ser Ala Glu Arg Asn Ser Asn Leu Val Gly Ala Ala 275 280 285 His Glu Glu Leu Gln Gln Ser Arg Ile Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ala 290 295 300 Gln Leu Ser Gln Leu Gln Lys Gln Leu Ala Ala Lys Glu Ala Lys Leu 305 310 315 320 Arg Asp Leu Glu Asp Ser Leu Ala Arg Glu Arg Asp Thr Ser Arg Arg 325 330 335 Leu Leu Ala Glu Lys Glu Arg Glu Met Ala Glu Met Arg Ala Arg Met 340 345 350 Gln Gln Gln Leu Asp Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asp Ile Lys Leu Ala 355 360 365 Leu Asp Met Glu Ile His Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu 370 375 380 Glu Arg Leu Arg Leu Ser Pro Ser Pro Thr Ser Gln Arg Ser Arg Gly 385 390 395 400 Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Gln Thr Gln Gly Gly Gly Ser Val Thr 405 410 415 Lys Lys Arg Lys Leu Glu Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser Phe Ser Gln 420 425 430 His Ala Arg Thr Ser Gly Arg Val Ala Val Glu Glu Val Asp Glu Glu 435 440 445 Gly Lys Phe Val Arg Leu Arg Asn Lys Ser Asn Glu Asp Gln Ser Met 450 455 460 Gly Asn Trp Gln Ile Lys Arg Gln Asn Gly Asp Asp Pro Leu Leu Thr 465 470 475 480 Tyr Arg Phe Pro Pro Lys Phe Thr Leu Lys Ala Gly Gln Val Val Thr 485 490 495 Ile Trp Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr His Ser Pro Pro Thr Asp Leu 500 505 510 Val Trp Lys Ala Gln Asn Thr Trp Gly Cys Gly Asn Ser Leu Arg Thr 515 520 525 Ala Leu Ile Asn Ser Thr Gly Glu Glu Val Ala Met Arg Lys Leu Val 530 535 540 Arg Ser Val Thr Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp 545 550 555 560 Leu Leu His His His His Gly Ser His Cys Ser Ser Ser Gly Asp Pro 565 570 575 Ala Glu Tyr Asn Leu Arg Ser Arg Thr Val Leu Cys Gly Thr Cys Gly 580 585 590 Gln Pro Ala Asp Lys Ala Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Gln Val Gly 595 600 605 Gly Pro Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Thr Arg 610 615 620 Ser Tyr Arg Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asn 625 630 635 640 Leu Val Thr Arg Ser Tyr Leu Leu Gly Asn Ser Ser Pro Arg Thr Gln 645 650 655 Ser Pro Gln Asn Cys Ser Ile Met 660 <210> 31 <211> 328 <212> PRT <213> LMNA fragment <400> 31 Met Glu Thr Pro Ser Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Gly Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ser Ser Thr Pro Leu Ser Pro Thr Arg Ile Thr Arg Leu Gln Glu Lys 20 25 30 Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Leu Ala Val Tyr Ile Asp Arg 35 40 45 Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Leu Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Ser Glu Glu Val Val Ser Arg Glu Val Ser Gly Ile Lys Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asp Ala Arg Lys Thr Leu Asp Ser Val Ala 85 90 95 Lys Glu Arg Ala Arg Leu Gln Leu Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Glu 100 105 110 Phe Lys Glu Leu Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys Glu Gly Asp Leu Ile 115 120 125 Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys 130 135 140 Glu Ala Ala Leu Ser Thr Ala Leu Ser Glu Lys Arg Thr Leu Glu Gly 145 150 155 160 Glu Leu His Asp Leu Arg Gly Gln Val Ala Lys Leu Glu Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Glu Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Glu Met Leu Arg Arg Val Asp 180 185 190 Ala Glu Asn Arg Leu Gln Thr Met Lys Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys 195 200 205 Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg Glu Thr Lys Arg Arg His Glu Thr 210 215 220 Arg Leu Val Glu Ile Asp Asn Gly Lys Gln Arg Glu Phe Glu Ser Arg 225 230 235 240 Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu Arg Ala Gln His Glu Asp Gln Val 245 250 255 Glu Gln Tyr Lys Lys Glu Leu Glu Lys Thr Tyr Ser Ala Lys Leu Asp 260 265 270 Asn Ala Arg Gln Ser Ala Glu Arg Asn Ser Asn Leu Val Gly Ala Ala 275 280 285 His Glu Glu Leu Gln Gln Ser Arg Ile Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ala 290 295 300 Gln Leu Ser Gln Leu Gln Lys Gln Leu Ala Ala Lys Glu Ala Lys Leu 305 310 315 320 Arg Asp Leu Glu Asp Ser Leu Ala 325 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> LMNA N terminus cleavage site seq <400> 32 Glu Asp Ser Leu Ala 1 5 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> LMNA-NTRK1 fusion site seq <400> 33 gaggactcac tggcccgccc ggctgtgctg gct 33 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> LMNA-NTRK1 fusion site aa seq <400> 34 Glu Asp Ser Leu Ala Gly Pro Ala Val Leu Ala 1 5 10 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM3-NTRK1 Forward Primer Sequence <400> 35 aagaagataa atatgagg 18 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM3-NTRK1 Reverse Primer Sequence <400> 36 ccgtgccgca tatactcaaa 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMNA-NTRK1 Forward Primer Sequence <400> 37 ccaggtggag cagtataaga ag 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMNA-NTRK1 Reverse Primer Sequence <400> 38 tgtgggttct cgatgatgtg 20

Claims (42)

  1. 하기의 구조식으로 이루어진 융합단백질:
    N-[LMNA(Lamin A)의 N 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1(Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1)의 C 말단을 포함하는 단편]-C, 또는
    N-[TPM3(Tropomyosin 3)의 N 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편]-C.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LMNA, TPM3 또는 NTRK1는 인간 유래인 것인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 유래 LMNA은 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 LMNA의 N 말단을 포함하는 단편은 인간 유래 LMNA 단백질에 있어서 N 말단으로부터 1번째 내지 328번째 아미노산을 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 LMNA의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  6. 제2항에 있어서, 상기 인간 유래 TPM3은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 TPM3의 N 말단을 포함하는 단편은 인간 유래 TPM3 단백질에 있어서 N 말단으로부터 1번째 내지 258번째 아미노산을 포함하는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 TPM3의 N 말단을 포함하는 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합단백질.
  9. 제2항에 있어서, 상기 인간 유래 NTRK1은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편은 인간 유래 NTRK1 단백질에 있어서 N 말단으로부터 400번째 내지 796번째 아미노산, 453번째 내지 796번째 아미노산, 또는 502번째 내지 796번째 아미노산을 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 NTRK1의 C 말단을 포함하는 단편은 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합단백질.
  12. 제1항에 따른 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 하기의 구조식으로 이루어진 융합유전자 폴리뉴클레오티드:
    5'-[LMNA 유전자의 5' 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3', 또는
    5'-[TPM3의 5' 말단을 포함하는 단편]-[NTRK1 유전자의 3' 말단을 포함하는 단편]-3'.
  14. 제13항에 있어서, 상기 LMNA 유전자는 서열번호 28의 핵산 서열로 구성된 것인, TRK1 융합유전자 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 TPM3 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열로 구성된 것인, TRK1 융합유전자 폴리뉴클레오티드.
  16. 제13항에 있어서, 상기 NTRK1 유전자는 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 핵산 서열로 구성된 것인, TRK1 융합유전자 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항에 따른 NTRK1 융합단백질, 제13항에 따른 융합유전자, 또는 상기 융합유전자의 전사산물을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 융합유전자의 전사산물은 mRNA인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 융합유전자의 mRNA를 측정하는 제제는 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인, 대장암 진단용 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머는 프라이머에 의해 증폭되는 영역이 융합 대상인 두 유전자의 융합점을 포함하도록, 융합점을 사이에 두도록 설계된 프라이머인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 융합 대상인 두 유전자가 TPM3 유전자 및 NTRK1 유전자인 경우, TPM3 단백질의 N 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머와 NTRK1의 C 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머쌍인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 35 및 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머쌍인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 융합 대상인 두 유전자가 LMNA 유전자 및 NTRK1 유전자인 경우, LMNA 단백질의 N 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머와 NTRK1의 C 말단을 암호화하는 염기서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 프라이머쌍인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 융합유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열로 구성된 프라이머쌍인 것인, 대장암 진단용 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 상기 융합유전자를 측정하는 제제는 상기 융합유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 것인, 대장암 진단용 조성물.
  26. 제17항에 있어서, 상기 NTRK1 융합단백질을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인, 대장암 진단용 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 NTRK1 융합단백질에 특이적인 항체는 NTRK1 단백질의 C 말단에 결합하는 것인, 대장암 진단용 조성물.
  28. 제17항의 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
  29. 제28항에 있어서, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
  30. 대장암이 의심되는 개체의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 NTRK1 융합유전자는 LMNA 유전자 또는 TPM3 유전자의 5' 말단을 구성하는 폴리뉴클레오티드; 및 NTRK1 유전자의 3' 말단을 구성하는 폴리뉴클레오티드인, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 대장암이 의심되는 개체의 분리된 시료로부터 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  33. 대장암 환자의 분리된 시료로부터 NTRK1 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 대장암 환자의 분리된 시료로부터 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, 대장암 치료 예후가 같거나 낮을 경우보다 나쁠 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 대장암 환자의 분리된 시료로부터 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 융합유전자, 이의 전사산물 또는 이의 단백질 발현 수준보다 높을 경우, NTRK1 단백질 저해제에 의한 대장암 치료 유효성이 높다고 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료 예후를 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
  36. 대장암 치료용 후보물질을 NTRK1 융합유전자를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및 상기 NTRK1 융합유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
  37. 제36항에 있어서, 대장암 치료용 후보물질 처리에 의해 NTRK1 융합유전자의 발현 수준이 낮아질 경우, 대장암 치료제로 판단하는 것인, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
  38. NTRK1 융합단백질 저해제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 ARRY-470, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    [화학식 2]
    Figure pat00008

  40. 제38항에 있어서, 상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 NTRK1 융합유전자 발현 억제제인 것인, 대장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 NTRK1 융합유전자 발현 억제제는 NTRK1 융합유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 상기 NTRK1 융합단백질 저해제는 NTRK1 융합단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
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