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KR20150083689A - 항 c-Met 항체 정제 방법 - Google Patents

항 c-Met 항체 정제 방법 Download PDF

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KR20150083689A
KR20150083689A KR1020140003544A KR20140003544A KR20150083689A KR 20150083689 A KR20150083689 A KR 20150083689A KR 1020140003544 A KR1020140003544 A KR 1020140003544A KR 20140003544 A KR20140003544 A KR 20140003544A KR 20150083689 A KR20150083689 A KR 20150083689A
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KR
South Korea
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leu
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val
gly
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Application number
KR1020140003544A
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김동욱
김건웅
임인환
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삼성전자주식회사
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Publication date
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Abstract

항 c-Met 항체의 정제 방법 및 이와 같은 정제 방법에 의하여 정제된 항 c-Met 항체 제제가 제공된다.

Description

항 c-Met 항체 정제 방법{Method of Purification of anti-c-Met antibody}
항 c-Met 항체의 정제 방법 및 이와 같은 정제 방법에 의하여 정제된 항 c-Met 항체 제제가 제공된다.
항체와 같은 유용한 단백질 약물이 개발됨에 따라, 단백질의 경제적인 대규모 정제 기술이 생명공학 산업에서 중요한 이슈가 되고 있다. 일반적으로, 생산하고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 적절한 포유동물 또는 박테리아 숙주세포에 삽입하고 이를 배양하여 목적 단백질을 생산한다. 이때 단백질 생산에 사용되는 숙주세포는 살아있는 유기체이므로, 당, 아미노산, 성장 인자 등 세포 성장에 필요한 다양한 영양 물질을 포함하는 복합 성장 배지에서 배양되어야 한다.
상기 숙주 세포의 배양물에는 목적 단백질 이외에도 다양한 영양 물질의 혼합물, 숙주세포 유래의 단백질 등 불순물이 함께 포함되어 있으므로, 이로부터 목적 단백질을 치료제로 사용하기 적절한 고순도 및 고수율로 분리하는 기술의 개발이 필요하다.
일 예는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 항체 정제 방법에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인, 항체 정제 방법을 제공한다:
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm 이하, 예컨대, 2.0 내지 5.5 mS/cm, 3.0 내지 5.5 mS/cm, 또는 4.0 내지 5.5 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도가 7.0 mS/cm 이하, 예컨대, 5.5 내지 7.0 mS/cm, 6.0 내지 7.0 mS/cm, 또는 6.5 내지 7.0 mS/cm인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도가 7.6 mS/cm 이상 또는 7.8 mS/cm 이상, 예컨대, 7.6 내지 9.5 mS/cm, 7.6 내지 9.0 mS/cm, 7.6 내지 8.5 mS/cm, 7.8 내지 9.5 mS/cm, 7.8 내지 9.0 mS/cm, 또는 7.8 내지 8.5 mS/cm인 조건.
또 다른 예는 상기의 항 c-Met 항체 정제 방법에 의하여 정제된 항 c-Met 항체 제제를 제공한다.
본 발명은 항 c-Met항체의 특이적인 정제 방법과 관련된 것으로, 항체의 활성을 유지하면서 고순도 및 고수율로 항체를 분리할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 항 c-Met 항체의 통상적인 정제 공정에 사용되는 세 단계의 컬럼 공정, 즉 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 중에서 두 번째 공정인 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항체 시료 및/또는 여기에 사용되는 버퍼(완충제)의 pH, 전도도 및/또는 염 농도가 항 c-Met 항체의 수율과 순도를 결정짓는 중요한 요인임을 밝혀서, 고순도 및 고수율로 항체를 정제할 수 있는 최적의 정제 조건을 제안한다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조건하에서 수행되는 경우, 항체의 정제 효율 (순도 및 수율)이 현저하게 높아짐을 확인하였다:
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm이하, 예컨대, 2.0 내지 5.5 mS/cm, 3.0 내지 5.5 mS/cm, 또는 4.0 내지 5.5 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 전도도가 7.0 mS/cm이하, 예컨대, 5.5 내지 7.0 mS/cm, 6.0 내지 7.0 mS/cm, 또는 6.5 내지 7.0 mS/cm인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 전도도가 7.6 mS/cm 이상 또는 7.8 mS/cm 이상, 예컨대, 7.6 내지 9.5 mS/cm, 7.6 내지 9.0 mS/cm, 7.6 내지 8.5 mS/cm, 7.8 내지 9.5 mS/cm, 7.8 내지 9.0 mS/cm, 또는 7.8 내지 8.5 mS/cm인 조건.
상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도는 5.5 mS/cm 이하, 예컨대, 2.0 내지 5.5 mS/cm, 3.0 내지 5.5 mS/cm, 또는 4.0 내지 5.5 mS/cm의 범위로 조절될 수 있다. 일 예에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도는 상기 시료의 염 농도 및/또는 pH에 의하여 조절 가능하다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도 범위는 상기 시료의 염 농도를 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM의 범위로 조절, 및/또는 상기 시료의 pH를 5.5 이하 또는 5.3 이하, 예컨대, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5.5, pH 5.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.3, pH 4.5 내지 5.3, 또는 pH 5.0 내지 5.3으로 조절함으로써 달성할 수 있다. 항체 시료 내의 HCP 및 중합체 생성 등을 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율, 및 바이러스 불활성화 단계와의 적절한 연계성을 고려할 때 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도, 염농도, 또는 pH 범위는 상기 범위인 것이 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도, 염농도, 또는 pH가 상기 범위보다 높은 경우 수율이 낮아질 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도, 염농도, 또는 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH는 5.5 이하 또는 5.3 이하, 예컨대, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5.5, pH 5.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.3, pH 4.5 내지 5.3, 또는 pH 5.0 내지 5.3일 수 있다. 항체 시료 내의 HCP, 중합체 생성 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율을 고려할 때 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH를 상기 범위로 하는 것이 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH가 상기 범위보다 낮은 경우, HCP 및 중합체의 함량이 높아져 순도가 낮아지고, 상기 범위보다 높은 경우 일부 항 c-Met 항체가 레진으로부터 이탈(용출)되어 수율이 낮아질 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도는 7.0 mS/cm 이하, 예컨대, 5.5 내지 7.0 mS/cm, 6.0 내지 7.0 mS/cm, 또는 6.5 내지 7.0 mS/cm 범위일 수 있다. 일 예에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도는 상기 세척 버퍼의 염 농도 및/또는 pH에 의하여 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도 범위는 상기 세척 버퍼의 염 농도를 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM 또는 40 내지 50 mM로 조절 및/또는 세척 버퍼의 pH를 5.2 내지 5.8, 예컨대, 5.3 내지 5.7, 또는 5.4 내지 5.6으로 조절함으로써 달성될 수 있다. 항체 시료 내의 HCP, 중합체 생성 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율을 고려할 때 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도, 염 농도, 또는 pH를 상기 범위로 하는 것이 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도, 염 농도, 또는 pH가 상기 범위보다 낮은 경우, HCP(host cell protein) 및 중합체 등의 불순물이 충분히 제거되지 않아 항체의 정제 순도가 낮아질 수 있고, 상기 범위보다 높은 경우 항 c-Met 항체가 레진으로부터 이탈되어 수율이 낮아질 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도, 염 농도, 또는 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
앞서 설명한 바와 같이, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 5.2 내지 5.8, 예컨대, 5.3 내지 5.7 또는 5.4 내지 5.6인 것이 항체 시료 내의 HCP, 중합체 생성 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율을 고려할 때 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 상기 범위보다 낮은 경우, HCP(host cell protein) 및 중합체 등의 불순물이 충분히 제거되지 않아 항체의 정제 순도가 낮아질 수 있고, 상기 범위보다 높은 경우 항 c-Met 항체가 레진으로부터 이탈되어 수율이 낮아질 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 일 예에서, 상기 세척 버퍼의 pH는 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 시료의 pH보다 낮은 범위일 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도는 7.6 mS/cm 이상 또는 7.8 mS/cm 이상, 예컨대, 7.6 내지 9.5 mS/cm, 7.6 내지 9.0 mS/cm, 7.6 내지 8.5 mS/cm, 7.8 내지 9.5 mS/cm, 7.8 내지 9.0 mS/cm, 또는 7.8 내지 8.5 mS/cm 범위일 수 있다. 일 예에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도는 상기 용출 버퍼의 염 농도 및/또는 pH에 의하여 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도 범위는 상기 용출 버퍼의 염 농도를 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM로 조절 및/또는 용출버퍼의 pH를 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.8 내지 7.3 또는 7.0 내지 7.2로 조절함으로써 달성될 수 있다. 항체 시료 내의 HCP, 중합체 생성 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율을 고려할 때 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도 또는 염 농도 범위를 상기 범위로 하는 것이 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 용출 버퍼의 전도도, 염 농도, 또는 pH가 상기 범위보다 낮은 경우, 항 c-Met 항체가 레진으로부터 이탈(용출)되지 않을 수 있고, 상기 범위보다 높은 경우, HCP 등과 같은 불순물들이 동시에 용출되어 항 c-Met 항체의 순도에 영향을 줄 수 있으며, 양이온 교환 크로마토그래피 이후 공정인 음이온 교환 크로마토그래피 공정에 영향을 줄 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도, 염 농도, 또는 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
앞서 설명한 바와 같이, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 pH가 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.8 내지 7.3 또는 7.0 내지 7.2 인 것이 항체 시료 내의 HCP, 중합체 생성 고려한 항 c-Met 항체의 순도 및 수율을 고려할 때 유리할 수 있다. 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 pH가 상기 범위보다 낮은 경우, 항 c-Met 항체가 레진으로부터 이탈(용출)되지 않을 수 있고, 상기 범위보다 높은 경우 경우 HCP 등과 같은 불순물들이 동시에 용출 될 수 있어 순도에 영향을 줄 수 있으므로, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 pH 범위는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
이에, 본 발명의 일 예에서, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 항체 정제 방법에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법이 제공된다:
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm 이하, 예컨대, 2.0 내지 5.5 mS/cm, 3.0 내지 5.5 mS/cm, 또는 4.0 내지 5.5 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도가 7.0 mS/cm 이하, 예컨대, 5.5 내지 7.0 mS/cm, 6.0 내지 7.0 mS/cm, 또는 6.5 내지 7.0 mS/cm인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도가 7.6 mS/cm 이상 또는 7.8 mS/cm 이상, 예컨대, 7.6 내지 9.5 mS/cm, 7.6 내지 9.0 mS/cm, 7.6 내지 8.5 mS/cm, 7.8 내지 9.5 mS/cm, 7.8 내지 9.0 mS/cm, 또는 7.8 내지 8.5 mS/cm인 조건.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 항체 시료, 세척 버퍼, 및 용출 버퍼의 전도도는 이들의 염 농도 및/또는 pH에 의하여 조절될 수 있으므로, 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하고, 이 때 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것일 수 있다:
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH가 5.5 이하 또는 5.3 이하, 예컨대, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5.5, pH 5.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.3, pH 4.5 내지 5.3, 또는 pH 5.0 내지 5.3인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 5.2 내지 5.8, 예컨대, 5.3 내지 5.7 또는 5.4 내지 5.6인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM 또는 40 내지 50 mM인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 pH가 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.8 내지 7.3 또는 7.0 내지 7.2인 조건.
일 구체예는, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 항체 정제 공정에 있어서, 다음의 조건 하에서 수행되는 항 c-Met 항체 정제 방법을 제공한다.
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료는 전도도가 5.5 mS/cm 이하, 예컨대, 2.0 내지 5.5 mS/cm, 3.0 내지 5.5 mS/cm, 또는 4.0 내지 5.5 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH가 5.5 이하 또는 5.3 이하, 예컨대, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5.5, pH 5.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.3, pH 4.5 내지 5.3, 또는 pH 5.0 내지 5.3인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 전도도가 7.0 mS/cm 이하, 예컨대, 5.5 내지 7.0 mS/cm, 6.0 내지 7.0 mS/cm 또는 6.5 내지 7.0 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 5.2 내지 5.8, 예컨대, 5.3 내지 5.7 또는 5.4 내지 5.6인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 전도도가 7.6 mS/cm 이상 또는 7.8 mS/cm 이상, 예컨대, 7.6 내지 9.5 mS/cm, 7.6 내지 9.0 mS/cm, 7.6 내지 8.5 mS/cm, 7.8 내지 9.5 mS/cm, 7.8 내지 9.0 mS/cm, 또는 7.8 내지 8.5 mS/cm인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 pH가 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.8 내지 7.3 또는 7.0 내지 7.2인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 항체 시료, 세척 버퍼, 및 용출 버퍼의 전도도는 이들의 염 농도 및/또는 pH에 의하여 조절될 수 있으므로, 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하고, 이 때 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 다음의 조건 하에서 수행되는 것일 수 있다:
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 염 농도기 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH가 5.5 이하 또는 5.3 이하, 예컨대, pH 3.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5.5, pH 5.0 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.3, pH 4.5 내지 5.3, 또는 pH 5.0 내지 5.3인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 5.2 내지 5.8, 예컨대, 5.3 내지 5.7 또는 5.4 내지 5.6인 조건;
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 염 농도가 50 mM 이하, 예컨대, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 30 내지 50 mM, 또는 40 내지 50 mM인 조건; 및
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 pH가 6.6 내지 7.4, 예컨대, 6.8 내지 7.3 또는 7.0 내지 7.2인 조건.
상기 항 c-Met 항체의 정제 방법에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는, 로딩되는 시료의 전도도, 및/또는 세척 버퍼 및 용출 버퍼의 pH, 염 농도, 및/또는 전도도를 제외하고는, 항체 정제에 통상적으로 사용되는 수지를 사용하고 통상적인 조건의 단계에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP SepharoseTMFast Flow, Sepharose High Performance SP, Sepharose XL, SepharoseTMHT, SOURCETM15S, SOURCETM30S, RESOURCETMS, Mono STM, CM Sepharose Fast Flow, Mini S, SP Sepharose Big Beads, Capto S 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수지를 사용할 수 있다. 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 항체 시료의 로딩 단계, 세척 버퍼를 이용한 세척 단계 및 용출 버퍼를 이용한 용출 단계를 필수적으로 포함하며, 이 외에 통상적인 단계, 예컨대, 전세척(pre-wash) 단계, 전살균(pre-sanitization) 단계, 평형화(equilibration) 단계, 스트립(strip) 단계, 후살균(post-sanitization) 단계, 재평형화(re-equilibration) 단계 및 저장 단계로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때, 전세척 단계 및 전살균 단계를 생략하여도 무방하다. 일 구체예에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 전세척 단계, 전살균 단계, 평형화 단계, 로딩 단계, 세척 단계, 용출 단계, 스트립(strip) 단계, 후살균(post-sanitization) 단계, 재평형화(re-equilibration) 단계 및 저장 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH는 아세트산, 시트르산, 트리스(Tris-base), HCl, NaOH 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의하여 조절될 수 있으며, 염 농도는 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4), 염화칼슘(CaCl2), 황산암모니움(Ammonium sulfate), 염화마그네슘(MgCl2), 염화칼륨(KCl), 황산나트륨(Na2SO4) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 조절될 수 있다. 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 포스페이트 계열(예컨대, 제 1 인산 나트륨, 제 2 인산 나트륨등), 아세테이트 계열(예컨대, 아세트산나트륨, 등), 시트레이트 계열(예컨대, 구연산나트륨 등), 카보네이트 계열(예컨대, 탄산나트륨 등), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris, Bis-Tris, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 상기 pH 범위로 포함하는 것일 수 있다. 상기 세척 버퍼의 염 농도는 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4), 염화칼슘(CaCl2), 황산암모니움(Ammonium sulfate), 염화마그네슘(MgCl2), 염화칼륨(KCl), 황산나트륨(Na2SO4) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 조절될 수 있으며, 일 예에서 염 농도 조절을 통하여 세척 버퍼의 전도도를 조절할 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 제1 인산나트륨 및 제 2 인산나트륨을 상기한 pH 범위가 되도록 포함하고, 염화나트륨을 상기한 염 농도가 되도록 포함하는 것일 수 있다. 이 때 상기 제1 인산나트륨과 제 2 인산나트륨의 농도는 10 내지 50 mM 범위에서 서로 같거나 다를 수 있으며, 예컨대, 서로 동일(예컨대, 약 20 mM)할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 포스페이트 계열(예컨대, 제 1 인산 나트륨, 제 2 인산 나트륨, 등), 아세테이트 계열 (예컨대, 아세트산나트륨 등), 시트레이트 계열 (예컨대, 시트르산나트륨 등), 카보네이트 계열 (예컨대, 탄산나트륨 등), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris, Bis-Tris, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 용출 버퍼의 염 농도는 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(MgSO4), 염화칼슘(CaCl2), 황산암모니움(Ammonium sulfate), 염화마그네슘(MgCl2), 염화칼륨(KCl), 황산나트륨(Na2SO4) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 조절될 수 있으며, 일 예에서, 염 농도 조절을 통하여 용출 버퍼의 전도도를 조절할 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 제 1 인산나트륨 및 제 2 인산나트륨을 상기한 pH 범위가 되도록 포함하고, 염화나트륨을 상기한 염 농도가 되도록 포함하는 것일 수 있다. 이 때 상기 제 1 인산나트륨과 제 2 인산나트륨의 농도는 10 내지 50 mM 범위에서 서로 같거나 다를 수 있으며, 예컨대, 서로 동일(예컨대, 약 20 mM)할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서 상기와 같은 pH 조절 물질 및/또는 염 농도 조절 물질을 통하여 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 시료, 세척 버퍼 및/또는 용출 버퍼의 pH 및/또는 염 농도를 조절함으로써 이들의 전도도를 적정한 범위로 조절할 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 단계 외에, 친화성 크로마토그래피 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 순차적으로 포함할 수 있다.
상기 친화성 크로마토그래피는 항체 정제에 통상적으로 사용되는 단백질 A 친화성 크로마토그래피로, 여기에 통상적으로 사용되는 수지 및 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 친화성 크로마토그래피는 Protein A Sepharose, MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수지를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 친화성 크로마토그래피는 항체 시료의 로딩 단계, 세척 버퍼를 이용한 세척 단계(1회 이상, 예컨대, 1회 내지 5회 또는 1회 내지 3회) 및 용출 버퍼를 이용한 용출 단계를 필수적으로 포함하며, 이 외의 통상적인 단계, 예컨대, 전세척(pre-wash) 단계, 전살균(pre-sanitization) 단계, 평형화(equilibration) 단계, 후살균(post-sanitization) 단계, 재평형화(re-equilibration) 단계 및 저장 단계로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체의 순도와 수율을 보다 높이기 위하여, 상기 친화성 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 pH 3.0 내지 3.5 또는 pH 3.1 내지 3.3인 것일 수 있다. 상기 용출 버퍼의 pH가 3.0 이하 이면 이합체 이상의 다중 중합체가 생성될 수 있고, pH가 3.5 이상이면 단백질 회수율이 떨어질 수 있으므로, 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 용출 버퍼의 pH는 상기 범위인 것이 좋다. 상기 용출 버퍼는 시트르산(Citric acid), 글리신(Glycin), 아르기닌(Arginin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 pH 3.0 내지 3.5 또는 pH 3.1 내지 3.3이 되도록 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 항체 정제에 통상적으로 사용되는 수지 및 조건을 사용하여 수행되는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 SP SepharoseTMFast Flow, Sepharose High Performance Q, Q Sepharose XL, SepharoseTMHT, SOURCETM15Q, SOURCETM30Q, RESOURCETMQ, Mono QTM, Mini Q, Q Sepharose Big Beads, Capto adhere 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수지를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 로딩 단계 및 추적(chase) 단계를 포함하고, 이 외에 통상적인 단계, 예컨대, 전살균(pre-sanitization) 단계, 재생(regeneration) 단계, 평형화(equilibration) 단계, 재생 단계, 세척(탈이온수) 단계, 후살균(post-sanitization) 단계, 및 저장 단계로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때, 상기 재생 단계 및 탈이온수 세척 단계는 생략하여도 무방하다. 상기 추적 단계에 있어서, CV(column volume) 값은 2 내지 4 CV, 예컨대, 약 3 CV 정도로 할 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH는 높을수록 중합체 형성이 억제되므로, 항체의 순도와 수율을 고려하여, 음이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH는 높게 하는 것이 좋다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료는 예컨대, pH 6.5 이상, pH 7.1 이상, pH 7.5 이상, 예컨대, pH 6.5 내지 9, pH 7 내지 8, 또는 pH 7.3 내지 7.7인 것일 수 있으며, 통상 별도 조절 공정을 거치지 않고 앞서 수행된 양이온 교환 크로마토그래피의 용출물을 사용할 수 있으나, 필요한 경우 pH 조절을 수행할 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH는 아세트산(Acetic acid), 시트르산(Cirtic acid), 트리스(Tris-base), HCl, NaOH 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의하여 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
또한, 상기 음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 추적(chase) 버퍼는 pH가 높을수록 항체 순도가 높게 나타나지만 다른 불순물도 증가하므로, 이러한 점을 고려하여, 상기 추적 버퍼의 pH는 6 내지 7, 예컨대, 6.3 내지 6.7일 수 있다. 상기 추적 버퍼는 포스페이트 계열(예컨대, 제 1 인산 나트륨, 제 2 인산 나트륨, 등), 아세테이트 계열(예컨대, 아세트산 나트륨 등), 시트레이트 계열(예컨대, 구연산나트륨등), 카보네이트 계열(예컨대, 탄산나트륨 등), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris, Bis-Tris, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 상기한 pH 범위가 되도록 포함하는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은, 상기한 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 이외에, 항체 정제에 통상적인 조건 하에서 수행되는 통상적인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 이외에, 바이러스 불활성화 단계 및 여과 단계(예컨대, 심층여과(depth filtration), 마이크로여과(microfiltration), 나노여과(nanofiltration), 한외여과(ultrafiltration), 및/또는 정용여과 (diafiltration))를 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 음이온 교환 크로마토그래피, 나노여과 단계, 및 한외여과/정용여과 단계를 포함할 수 있다(도 1 참조). 보다 구체적으로, 상기 항 c-Met 항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계, 제 1 심층여과 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 마이크로여과 단계, 음이온 교환 크로마토그래피, 나노여과 단계, 한외여과/정용여과 단계, 제 2 심층여과 단계, 제제화 단계 및 최종 마이크로여과 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 항 c-Met 항체 시료는 항 c-Met 항체를 발현하는 숙주세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 것을 의미하며, 각 단계에서 로딩되는 항 c-Met 항체 시료는 이전 단계를 거친 항 c-Met 항체 시료를 의미하는 것일 수 있다
다른 예에서, 상기한 항 c-Met 항체 정제 방법에 의하여 제조된 항 c-Met 항체 제제가 제공된다. 상기 항 c-Met 항체 제제는 항 c-Met 항체의 순도가 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것일 수 있다. 또한 상기 항 c-Met 항체 제제는 이합체를 초과하는 중합체 함량이 1%(w/w) 이하, 예컨대, 0.1 내지 1 %(w/w) 이하, 0.5 내지 1 %(w/w), 또는 0.7 내지 1 %(w/w)이고, 숙주세포 유래 단백질 (HCP) 함량이 중량 기준으로 4 ppm 이하, 예컨대, 0.5 내지 4 ppm, 1 내지 4 ppm, 또는 2 내지 4 ppm인 것일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 c-Met을 항원으로 인식하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 예컨대, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met에 특이적으로 결합하여 세포내 이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대, SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 별도의 언급이 없는 한, 항 c-Met 항체는 완전한 형태의 항 c-Met 항체뿐 아니라 상기 항체의 항원 결합 부위도 포함하기 위하여 사용된다.
상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met(예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met(예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met(예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met(예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 카이네이즈 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.
HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화결합 (disulfide bond)에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열이다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr(서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala(서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13(서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 부위; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변영역을 인간 항체의 불변영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 부위에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 부위 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementarity determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체 예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체는 생체에서 분리된 것일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변영역은 중쇄 불변영역과 경쇄 불변영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 부위 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 부위(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 부위와 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 부위와 단쇄의 가변 부위가 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역(비변형 인간 힌지 영역)을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다(대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨). 상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 부위와 중쇄 가변 부위를 제외한 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역은 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변영역과 중쇄 불변영역, IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열(이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열(이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열(이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘(histidine)이 티로신(tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 서열번호 106의 경쇄 상보성결정영역, 서열번호 107의 경쇄 가변 부위, 또는 서열번호 108의 경쇄를 포함하는 항 c-Met 항체일 수 있다.
일 예에서, 상기 항 c-Met 항체는 등전점(isoelectric point, pI)이 약 8 내지 약 8.5 또는 약 8.1 내지 약 8.3 정도인 것일 수 있다.
통상적으로, 항체를 포함한 단백질의 정제 특성은 단백질의 등전점에 영향을 받을 수 있으므로, 상기 제공되는 정제 방법에 의하여 정제 가능한 대상은 등전점이 약 8 내지 약 8.5 또는 약 8.1 내지 약 8.3 정도인 단백질, 예컨대, 항체로 확장될 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 c-Met의 과발현 및/또는 비정상적 활성화와 관련된 것일 수 있으며, 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성암 뿐 아니라 전이성 암을 포함한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료는 암의 성장 억제 및/또는 사멸 뿐 아니라, 암의 전이 및/또는 침습의 억제를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 정제 기술을 통하여, 보다 높은 순도의 항 c-Met 항체를 보다 높은 수율로 얻을 수 있으므로, 항 c-Met 항체를 이용한 의약 산업에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 항 c-Met 항체 정제 공정을 개략적으로 보여주는 모식도이다.
도 2는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 세척 및 용출 버퍼의 pH와 염 농도 차이에 따른 용출시의 HCP 양(상단)과 수율(하단)을 보여준다.
도 3는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 세척 버퍼의 염 농도에 따른 크로마토그래피 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a 및 4b는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 세척 버퍼의 연속적 pH 구배(4a: condition #1) 또는 불연속적 pH 구배(4b: condition #2)오른쪽) 조건 하에서의 SEC-HPLC chromatogram 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 불순물 포함에 따른 항체 활성 (Akt 인산화 활성: 왼쪽; c-Met 분해 활성: 오른쪽)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 친화성 크로마토그래피 단계에서의 세척 버퍼 pH 및 용출 버퍼 pH에 따른 순도(위쪽), 용출시의 HCP 양(가운데) 및 세척시의 HCP 양(가운데)을 보여준다.
도 7은 AC chromatogram 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 친화성 크로마토그래피 단계에서의 순도를 확인한 SEC-HPLC chromatogram 결과를 보여주는 그래프이고, 도 8b는 도 8a의 원 부분을 확대하여 보여주는 것이다.
도 9a 및 9b는 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 로딩 시료의 pH에 따른 중합체 형성 정도를 보여주는 SEC-HPLC chromatogram 그래프이다.
도 10a 내지 10c는 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 chase 버퍼의 pH에 따른 중합체 형성 정도를 보여주는 SEC-HPLC chromatogram 그래프이다 (10a: pH 6.5, 10b: pH 7.1, 10c: pH 7.5).
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작
1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산
1.1.1. 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.
1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x108 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x108 개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45%(w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37 ℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2x105 cells/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.
1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕(2 ㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.
상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 9일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여 받았다(한국 공개특허 제2011-0047698 참조).
1.1.4. 단일클론 항체의 생산
상기 참고 예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 마우스 단일클론 항체 AbF46를 생산하였다.
먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작
일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1.1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.
중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit(Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105 cells/㎖의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106 cells/㎖이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15 ㎖ tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2 ㎖과 mix하고(A), 또 다른 15㎖ tube에 FreestyleTM MAX reagent 100 ㎕와 OptiPro™ SFM 2 ㎖을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
이후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하여 c-Met에 대한 키메릭 항체 chAbF46 (이하, chAbF46으로 명명함)을 제작하였다.
1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작
1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )
H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.
H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.
1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )
H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.
H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.
H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.
이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit(Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105 cells/㎖의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106 cells/㎖이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent(invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15 ㎖ tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2 ㎖과 mix하고(A), 또 다른 15 ㎖ tube에 FreestyleTM MAX reagent 100 ㎕와 OptiPro™ SFM 2 ㎖을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하여 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 제작하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy(서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.
1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작
huAbF46 항체의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.
이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.
　
1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작
1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작
huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 1과 같다.
CDR 아미노산 서열
CDR-H1 DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3 DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2 WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(서열번호 12)
항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기(25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫 번째와 두 번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.
　
1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인
CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.
이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.
　
1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별
상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 2와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.
클론 이름 도출된 라이브러리 CDR 서열
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(서열번호 22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(서열번호 23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(서열번호 24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(서열번호 25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(서열번호 27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(서열번호 28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(서열번호 34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(서열번호 37)
1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환
선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변 부위를 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit(Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit(Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105 cells/㎖의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106 cells/㎖이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent(invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15㎖ tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM(invtrogen) 2㎖과 mix하고(A), 또 다른 15 ㎖ tube에 FreestyleTM MAX reagent 100 ㎕와 OptiPro™ SFM 2 ㎖을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ㎖을 취하고, AKTA Prime(GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ㎖/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2(L3-2 유래), huAbF46-H4-A3(L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.
1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조
상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.
huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.
상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변 부위, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변 부위 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit(Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit(Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System(invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105 cells/㎖의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106 cells/㎖이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent(invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15㎖ tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM(invtrogen) 2 ㎖과 mix하고(A), 또 다른 ㎖15 ㎖ tube에 FreestyleTM MAX reagent 100 ㎕와 OptiPro™ SFM 2 ㎖을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 얻었다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 L3-1Y/IgG2로 명명하였다. 상기 얻어진 L3-1Y/IgG2를 포함하는 세포 배양물을 아래의 항체 정제의 단백질 시료로서 사용하였다.
실시예 1. 항 c- Met 항체의 정제
항 c-Met 항체의 일반적인 정제 공정을 도 1에 나타내었다.
버퍼 ( Buffer )
항 c-Met 항체의 정제에 사용된 버퍼를 아래의 표 3에 정리하였다:
Step Buffer * pH
AC wash I 20 mM Sodium phosphate dibasic, 50 mM NaCl 7.5 ± 0.1
AC wash II 20 mM Sodium phosphate dibasic, 1 M NaCl 7.5 ± 0.1
AC Wash III 20 mM Sodium phosphate dibasic, 50 mM NaCl 5.5 ± 0.1
AC Elution 20 mM Citric acid 3.2 ± 0.1
AC Sanitization 0.5 M NaOH
Storage 20% EtOH
VI 1 M Citric acid
Neutralization 1 M Trisma-base
CIEX wash 20 mM Sodium phosphate monobasic, 20 mM Sodium phosphate dibasic, 50 mM NaCl 5.5 ± 0.1
CIEX elution 20 mM Sodium phosphate monobasic, 20 mM Sodium phosphate dibasic, 50 mM NaCl 7.1 ± 0.1
CIEX Strip 1 M NaCl
CIEX Sanitization 1 M NaCl, 1 M NaOH
CIEX storage 20% EtOH
AIEX chase 20 mM Sodium phosphate monobasic,　 20 mM Sodium phosphate dibasic, 50 mM NaCl 6.5 ± 0.1
AIEX Strip 0.1 M Citric acid
AIEX Sanitization 1 M NaOH
AIEX Storage 0.1 M NaOH
UF/DF 20 mM Succinic acid, 150 mM NaCl 6.0 ± 0.1
UF/DF Sanitization 0.5 M NaOH
UF/DF Storage 0.1 M NaOH
Formulation 20 mM Succinic acid, 150 mM NaCl, 5% PolySorbate 6.0 ± 0.1
항체 정제에 사용되는 모든 버퍼는 사용 전 제조하여 실온에 최대 일주일 정도까지만 보관하였고 사용하고 남은 buffer들은 모두 폐기하였다. 또한 모든 시약들은 제조 시 0.2 um(micrometer)의 microfilter를 시용하여 여과(microfiltration)를 거친 후 보관하였다.
1.1. 친화성 크로마토그래피 ( Affinity chromatography ; AC )
상기 참고예 1에서 얻어진 단백질 시료 (L3-1Y/IgG2) 18 L에 대하여, 친화성 크로마토그래피(MabSelectSuRe LX resin 사용; GE HealthCare)를 아래의 조건으로 수행하였다:
Figure pat00001
구체적인 조건 선정 과정은 실시예 3에서 설명된다. 이 공정은 1000 L 임상 시료 생산을 대비하여 연속 column work에도 적용할 수 있게 설계될 수 있다.
1.2. Low pH Virus Inactivation 및 neutralization
상기 실시예 1.1에서 얻어진 AC 용출물의 pH를 3.4 내지 3.6으로 적정한 뒤, 실온에서 1시간이상 반응시켜 바이러스 불활성화(virus inactivation)를 실시하였다. 이후 1 M Trisma-base를 이용하여 pH 5.4 내지 5.6으로 적정하여 neutralization 한 후, 4 ℃에서 12 내지 18시간동안 반응시켰다.
이 때, Low pH조건에서 12이상 반응시, 중합체 형성이 가속화되는 것을 확인하였다. 또한, neutralization 이후에는 배양조건 (배양 시 첨가 물질), AC eluant의 농도에 따라 단백질이 다소 불투명하게 변할 수 있으나, 회수율에는 크게 영향이 없는 것으로 확인하였다. 불투명한 것은 target 항체이기 보다는 fragment, aggregate, 배양세포 유래단백질 (Host cell protein; HCP)등으로 확인되었다.
1.3. Depth filtration -1
상기 Neutralization으로 유도된 불순물을 효과적으로 제거하기 위해, 상기 실시예 1.2. 과정을 거친 단백질 시료를 depth filter (Sartorius Stedim biotech)에 통과시켰다. Depth filter는 microfilter (Sartorius Stedim biotech)와 연속적으로 연결하고, 연동펌프(peristaltic pump; Sartorius Stedim biotech)를 통해 시료를 흘려주었다. 이때 유속은 최대 300 LMH, 1 L/min을 유지하였다.
Depth filter 및 조건은 아래의 표 4에 정리한 바와 같다:
Trial 1 Trial 2 units
AC column
Depth Filtration-1
Volume 0.51 0.80 (L)
Time 1.00 1.92 (hrs)
Flow rate 0.51 0.41 (l/hr)
Sartopure GF+ Sartoscale Cut Disc (bar)
Pore rating 1.2 0.65 (㎛)
Filter area 0.0025 0.00135 (m2)
Flux (average) 300 300 (lmh)
Sterile Filtration
Volume 0.507 1.66 (L)
Pressure 0.8 0.8 (bar)
Sartopore2 150 Cut Disc Cut Disc
Pore rating 0.45 + 0.2 0.45 + 0.2 (㎛)
Filter area 0.00135 0.00135 (m2)
Flux (average) 6900 7200 (lmh)
1.4. 양이온 교환 크로마토그래피 ( Cation Exchange Chromatography ; CIEX )
다음의 조건으로 수행하였다. 구체적인 조건 선정 과정은 실시예 2에서 설명된다.
Figure pat00002
1.5. Microfiltration ( MF )
상기 실시예 1.4에서 얻어진 CIEX 용출물을 18시간 이하로 보관하였다. 보관시 미생물의 번식을 막고, 용출물에 포함되어 있을지 모를 거대분자를 제거하기 위하여, microfilter를 실시하였다. 상기 얻어진 CIEX 용출물을 peristaltic pump를 통해 1 L/min의 유속으로 microfilter (Sartorius Stedim biotech)를 통과시켰다. 여과 조건은 아래 표 5에 정리하였다.
Trial 1 Trial 2 units
CIEX Column
MF; Sterile Filtration
Volume 0.844 2.21 (L)
Pressure 0.8 0.8 (bar)
Sartopore2 Cut Disc Cut Disc
Pore rating 0.45 + 0.2 0.45 + 0.2 (㎛)
Filter area 0.00135 0.00135 (m2)
Flux (average) 6200 6600 (lmh)
1.6. 음이온 교환 크로마토그래피 ( Anion Exchange Chromatography ; AIEX )
CaptoTM Adhere resin (GE HealthCare)을 사용하여 아래의 조건으로 수행하였다:
Figure pat00003
구체적인 조건 선정 과정은 실시예 4에서 설명된다. AIEX 공정을 연속으로 진행하기 위해서 Post-sanitization 이후 곧바로 equilibration하여 loading할 수 있도록 설계하였다.
1.7. Nanofiltration ( NF )
상기 얻어진 AIEX 정제 시료를 이용하여 두 차례 sizing을 실시한 이후 nanofilter(Sartorius Stedim biotech)의 size을 결정하였다. 구체적인 여과 조건을 아래의 표 6에 정리하였다:
Category Lab Scale Trials
Trial 1 Trial 2 units
Virus Pre-filtration
Volume 0.072 0.107 (L)
Pressure 2.0 2.0 (bar)
Sartopore2 Minisasrt Minisasrt
Pore rating 0.2 + 0.1 0.2 + 0.1 (㎛)
Filter area 0.0005 0.0005 (m2)
Flux (average) 86 70 (lmh)
Virus filtration
Volume 0.083 0.107 (L)
Pressure 2.0 2.0 (bar)
Virosart CPV Minisasrt Minisasrt
Pore rating 20 nm 20 nm (㎛)
Filter area 0.0005 0.0005 (m2)
Flux (average) 81 70 (lmh)
1.8. Ultrafiltration / Diafiltration ( UF / DF )
상기 nanofiltration된 시료에 대하여 UF/DF 공정을 수행하였다. UF/DF의 공정은 TMP 0.75 bar로 진행하였다. 여과 조건은 표 7에 정리하였다:
Category Lab Scale Trials
Trial 1 Trial 2 units
Ultrafiltration/ Diafiltration
Initial Volume 3.5 (L)
UF Factor 10 (X)
DF Factor 21 (X)
Final Volume 0.6 (L)
Sartocon Cut Disc
Pore rating 30 kDa 30 kDa (㎛)
Filter area 0.00135 (m2)
Flux (average) 900 (lmh)
UF/DF 공정은 pre-cleaning with 0.5 M NaOH, Pre-cleaning with DIW (deionized water; 탈이온수), Pre-equilibration, sample loading, UF 및 DF의 순서로 수행하였다.
각 단계의 구체적인 과정은 아래와 같다.
Pre - cleaning 및 pre - Equilibration
0.5 M NaOH를 이용하여 15분이상 시료를 cleaning한 후, DIW로 30분간 흘려주었다. 이후, Equilibration 및 UF buffer를 이용하여 시료의 pH 및 전도도가 buffer와 동일해질 때까지 세척을 실시하였다.
Sample loading
이와 같이 준비된 시료를 membrane casstee에 loading하였다.
Ultrafiltration( UF )
10분 경과 후, 본격적인 UF를 시작하였다. 농축은 30 내지 40 mg/㎖까지 가능하며, 최대 60 mg/㎖까지는 무리 없이 진행되는 것을 확인하였다.
Diafiltration( DF )
DF 공정은 UF 공정이 끝난 후 연속적으로 실시하였다. DF factor는 농축된 시료 부피의 약 4 내지 5 배로 설정하였다. buffer change를 정확히 인지하기 위해, 시료의 pH와 전도도를 측정하여 UF/DF buffer(20 mM Succinic acid, 150 mM NaCl; pH 5.9 내지 6.1)와 동일해질 때까지 실시하였다. UF/DF의 최종 농도는 30 내지 40 mg/㎖로 맞추었다.
1.9. Depth filtration -2
UF/DF가 끝난 시료에서 발생된 중합체등을 제거 하기 위해, 최종 제제화 이전에 Depth filtration-2를 실시하였다. Depth filtration의 최대 flux는 300 LMH를 유지하였다. Depth filter의 sizing조건은 아래 표 8과 같다.
Category Lab Scale Trials
Trial 1 Trial 2 units
Depth Filtration-2
Volume 0.4 (L)
Time 1.92 (min)
Flow rate 0.208 (l/hr)
Sartopure GF+ Cut Disc (bar)
Pore rating 0.65 (㎛)
Filter area 0.00135 (m2)
Flux (average) 370 (lmh)
1.10. 제제화( Formulation )
5%(v/v) polysorbate를 제제화 버퍼에 최종 부피의 1/100의 양으로 첨가하여 최종 제제에 0.05%(v/v)의 polysorbate가 존재하도록 하였다(최종 제제화 버퍼: 20 mM Succinic acid, 150 mM NaCl, 5% PolySorbate; pH 5.9 내지 6.1).
실시예 2. 양이온 교환 크로마토그래피의 정제 조건 선정
2.1. 양이온 교환 크로마토그래피 공정
항 c-Met 항체의 정제 공정에서, 두 번째 column 단계인 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography; CIEX) 단계는 단백질 중합체 제거, 발현세포 유래 단백질(HCP) 제거 등과 관련되어, 정제 항체의 순도와 활성을 결정짓는 중요한 단계이다. 단백질 중합체와 HCP는 면역원성 증가 및 효능 감소 등 생체 이용률 감소에 영향을 주는 주요한 인자이기 때문에 항체 정제 공정 개발에 주요한 분석 지표로 사용된다.
CIEX 공정은 SP SepharoseTM Fast Flow(SPFF) resin(GE HealthCare)을 사용하였으며, 아래와 같이 DIW wash step부터 Storage step까지 총10 단계로 구성하였다.
Figure pat00004
이 중에서, 세척 버퍼(위 그림의 wash 단계)의 pH와 전도도(염 농도)가 공정 중간 산물의 quality에 영향을 미칠 주요 인자로 선택하여 시험을 수행하였다.
2.2. 세척 버퍼 및 용출 버퍼의 적절한 조건 선정
전체적인 CIEX 공정은 실시예 1 및 실시예 2.1을 참조하여 수행하되, 단백질(항체)이 resin에 결합하고 세척을 거친 후 이를 회수하는 과정에서, 염에 의한 용출이 아닌 pH에 의한 용출이 일어나도록 시험을 수행하였다. pH elution을 하기 위해서는 첫째, resin에 표적 단백질을 loading할 때, 결합하지 않고 통과하여 빠지는 양이 없어야 손실량을 최소화 할 수 있으며, 둘째, 적정 pH로 세척하여야 불순물을 효과적으로 제거 할 수 있다. 이 두 조건을 동시에 만족하는 최적 pH를 세척 버퍼의 pH로 사용하고 이것을 약간 넘어서는 pH를 용출 버퍼의 pH로 결정하기로 계획하였다.
시험 조건은 아래의 표 9에 정리하였다:
LFR (linear flow rate; cm/h) VFR (volumetric flow rate; ㎖/min) Temp.(℃) Column
762 10 20 내지 22 Tricorn 10/100 &　10 cm bed height
양이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 세척 능력을 최대화하기 위한 세척 버퍼의 pH와 염 농도(전도도)를 선정하였다. 이를 위하여, sodium phosphate monobasic과 sodium phosphate dibasic을 혼합하여 연속적인 pH 구배를 수행하였으며, 염 농도의 영향을 보기 위하여, 0, 50, 100 mM의 NaCl을 각각의 sodium phosphate buffer에 넣어 주었다. gradient length는 기본적인 120 CV로 진행하였다. 상기 3가지 시험 조건을 아래의 표 10에 정리하였다:
Condition No. Buffer A Buffer B Salt(NaCl)
1 20 mM Na-Pi monobasic (pH 4.5) 20 mM Na-Pi Dibasic (pH 9.4) 0 mM
2 20 mM Na-Pi monobasic (pH 4.5) 20 mM Na-Pi Dibasic (pH 9.4) 50 mM
3 20 mM Na-Pi monobasic (pH 4.5) 20 mM Na-Pi Dibasic (pH 9.4) 100 mM
상기 3가지 조건에서 세척 및 용출시켜서 염 농도 및 pH에 따른 크로마토그램 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 좌하단에서 우상단으로 가로지르는 직선 그래프는 pH 변화(좌하단: pH 4.5; 우상단: pH 9.4)에 따른 단백질 용출량을 나타낸다. 도 3에서 보는 바와 같이, 세척 버퍼의 염 농도가 50 또는 100 mM일 때 단백질이 특정 pH 조건에서 용출되는 것으로 확인되었다. 특히 염 농도가 50 mM 일 때, 단백질의 peak가 두 개로 분리되는 것으로 확인되었는데, 이는 불순물 피크와 정제된 항체 단백질 피크가 분리되어 나타난 것으로, 순수한 항체 단백질의 회수가 용이함을 알 수 있다. 반면, 염 농도가 100 mM일 때는 항체가 resin에 결합하지 않고 불순물과 함께 동시에 즉시 용출되고, 염 농도가 0 mM일 때는 불순물과 항체가 모두 용출되지 않고 resin에 남아있게 되어, 두 경우 모두 순수한 항체를 얻을 수 없다. 따라서, 단백질 분리를 위한 적정한 세척 버퍼의 염 농도는 약 50 mM인 것으로 선정할 수 있다. 또한 도 3의 그래프 추이로 보아 세척 버퍼의 염 농도가 50 mM를 넘으면 항체 단백질의 손실이 커지므로, 세척 버퍼의 염 농도는 50 mM를 넘지 않도록 하는 것이 유리함을 알 수 있다. 또한 염 농도 50 mM에서의 항체 단백질 피크에 해당하는 pH가 약 5.7 정도인 것으로 나타났다.
상기 시험에서, 염 농도가 50mM인 경우, 세척 버퍼와 용출 버퍼의 조건은 다음과 같았다:
pH 전도도 (mS/cm)
세척 버퍼 5.5 6.9
용출 버퍼 7.1 7.8
2.3. pH 변화에 따른 중합체 제거 능력 시험
상기 실험 결과를 바탕으로, 로딩 단백질 시료와 세척 버퍼의 pH를 약 5.0 내지 약 6.5 정도로 하고 세척 버퍼의 염 농도는 약 50 mM로 선정할 수 있다. 이때 용출되는 시료에서 중합체가 확인되는 경우가 있으며 이는 단백질의 순도에 영향을 미칠 뿐만 아니라 활성에도 영향이 있는 것으로 확인이 되어 선행실험 결과를 좀더 세분화하여 적정 pH를 결정하였다.
아래 표 12에 나타낸 바와 같이, 20 mM Na-Pi monobaisc와 20 mM Na-Pi monobaisc dibasic을 혼합하여 연속적 pH 구배(Condition #1)와 불연속적 pH 구배(Condition #2) 조건을 만들어 용출 시험을 수행하였다.
Figure pat00005
우선, condition#1과 같이, 연속적 pH 구배를 이용하여 항 c-Met항체가 용출되지 않는 pH를 결정하였다. 그 pH 범위는 이전 실험에서 이미 보였듯이 pH 6.5 이하일 때이며, 그 이상이면 타깃 단백질이 resin에서 용출되는 것으로 확인 되였다. 이후, 범위를 줄여 condition #2와 같이 불연속적 pH 구배 실험을 실시하였다. pH 구배 범위는 pH 4 내지 pH 8로 하였다.
상기 두 조건에 대한 SEC-HPLC chromatogram(TSK G3000 swxl column 이용; TOSHO 사)의 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다. 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 연속적 pH 구배에서는 중합체를 포함한 타깃 단백질이 용출되는 반면, 불연속적 pH 구배 실험에서는 pH 변화에 따라 중합체와 타깃 단백질이 효과적으로 분리 되는 것으로 확인되었다. 특히 세척 버퍼의 pH가 5.4 내지 5.6일 때, 중합체는 전부 resin에 결합하지 않고 타깃 단백질만 손실 없이 resin에 전부 결합하는 것으로 확인되다. 또한, 용출 버퍼는 pH 7.1일 때 가장 수율이 높은 것으로 확인이 되었다.
2.4. 중합체 등의 불순물이 항체 활성도에 미치는 영향
상기 실시예 2.3 및 도 4a 및 4b에서 분리한 순수한 분획(4a: Fraction #1; 4b: Monomer Fraction)과 불순물이 포함된 분획(4a: Fraction #2; 4b: Multimer Fraction)을 준비하여, 세포에 처리시 항체의 Akt 인산화 활성(agonism)과 c-Met 분해 활성(efficacy)를 측정하여, 불순물(항체 이합체 이상의 다중 중합체)이 항체 활성에 미치는 영향을 시험하였다.
c-Met 분해 활성(efficacy)은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 항체가 c-Met에 결합하여 c-Met의 세포내재화 및 분해(degradation)를 일으키는 것을 이용하여, 총 c-Met 양의 증감을 파악하여 항체의 효능을 검사하였다. c-Met과 HGF의 결합이 암세포의 성장을 촉진시키는 것은 이미 알려져 있으므로,　총 c-Met 양이 감소하면 암세포의 성장도 저하되는 데서 착안한 것이다. 총 c-Met 양은 정량적 ELISA 방법으로　측정하였다.　상기 ELISA는 human total HGF R/c-Met ELISA kit(R&D systems)를 사용하여 수행하였다. 암세포로는 MKN45 위암 세포주 (JCRB0254)를 사용하였다. 2X105 cells/㎖의 MKN45 세포를 5 ug/㎖의 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2 (참고예 1)와 혼합하여 배양하였으며RPMI (Gibco), 37˚C, 5% CO2), 24 시간 후에 ELISA 실험을 진행하였다. 최종적으로 Super Aquablue(eBiosciences)를 사용하여 반응시켰으며 colorimetric signals은 450 nm 파장에서의 OD값으로 측정하였다. 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 처리하지 않은 비교군의 값을 100%로 환산하여 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2를 처리한 후의 값을 계산하였다.
Akt 인산화 (agonism) 정도는 정량적 ELISA 방법으로 측정하였다. Akt의 인산화 되는 자리는 Ser 473이며 PathScan phospho-AKT1(Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit(Cell signaling)을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 시험 하루 전에 2X105　cells/㎖의 Caki-1 신장암 세포주(ATCC, HTB-46)에 무혈청 배지(DMEM)에 5　ug/㎖의 항체를 섞은 혼합물을 30분간 처리한 후, 상기 ELISA kit을 사용하여 실험하였다. 결과는 Perkins Elmer사 기계로 측정하여 얻었다. agonism 비교를 위하여, 항 c-Met 항체인 5D5 항체(American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)로부터 입수한 ATCC Cat. #HB-11895 하이브로도마 세포로부터 분리 정제)를 사용하였다. Akt의 인산화 정도를 계산할 때는 5D5에 의한 인산화를 100%로 잡았으며 그 값과 비교하여 다른 항 c-Met항체의 인산화 유도 정도를 표시하였다. Akt에 의해 조절되고 있는 세포작용에는 세포증식, 세포생존, 세포크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침해(tissue invasion) 등이 있다. 이 모든 과정들은 암의 특징을 대표하는 것으로, 수많은 종양발생단백질(oncoprotein)과 종양발생 억제물질(tumor suppressor)은 Akt 경로 상에서 상호 교차적으로 영향을 미치며, 신호전달과 고전적인 대사조절의 연결점에서 세포의 작용을 미세하게 조절하는 기능을 수행한다. 따라서, 이와 같은 Akt의 활성형인 인산화된 Akt의 정도가 높을 수록 암세포가 더욱 활성화된 상태이므로, 항체가 Akt의 인산화를 얼마나 저해할 수 있는지를 살펴본 것이다.
상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 불순물 (multimer fraction)에 의하여, efficacy는 비슷하게 나왔지만, agonism을 높이는 것으로 확인되었다.
2.4. 최종 CIEX 공정 조건
위의 실험 결과를 기초로, 아래와 같은 조건으로 최종 CIEX 공정을 설계하였다.
Figure pat00006
CIEX 공정을 연속으로 진행하기 위해서 Post-sanitization이후 곧바로 equilibration하여 loading할 수 있게 설계하였다.
실시예 3. 친화성 크로마토그래피의 조건 선정
배양액으로부터 항체를 효율 적으로 분리 해 내기 위하여 친화성 크로마토그래피(AC) 공정의 적정 조건을 선정하기 위한 시험을 수행하였다.
실험설계법(DoE)으로 RSM(반응표면분석법)을 이용하였으며, AC 공정에서 사용되는 세척 버퍼의 최적의 pH 및 염 농도 조건 및 용출 버퍼의 pH 조건을 선정하였다.
AC 공정은 아래 그림과 같이, DIW wash step(pre-wash) 부터 Storage step까지 총12 단계로 구성하였다:
Figure pat00007
이 중에서, 용출물의 quality에 영향을 줄 것으로 예상되는 wash II 단계에서 pH와 염 농도에 대한 시험을 실시하였다. 동시에 용출 버퍼의 pH도 스크리닝하였다.
상기 실험 수행을 위한 정제 조건은 아래의 표 13과 같이 하였다:
LFR (cm/min) VFR (㎖/min) Temp. (℃) Column
12.7 10 20 내지 22 Tricorn 10/100 &　10 cm bed height
AC wash buffer II의 염 농도 및 pH는 AC 용출물 quality에 많은 영향을 주는 요소 이며, AC 용출 버퍼의 pH는 단백질 회수율과 회수 단백질의 quality(중합체 형성 여부 등)에 영향을 주는 인자이므로 이들을 조합하여 실험을 위한 버퍼 조건을 정하여 아래의 표 14에 정리하였다:
Step Buffer Salt　(mM NaCl) pH Vol. (CV)
AC Wash buffer I 20 mM Sodium phosphate dibasic - 7.5 3
AC Wash buffer II 20 mM Sodium phosphate dibasic 0 - 1000 4.5 ~ 7.5 3
AC Elution　I 20 mM Citric acid 2.5 ~ 3.5 3
상기 얻어진 결과를 아래의 표 15에 나타내었다:
Factor Wash _ pH Wash _ salt Elution _ pH Wash HCP Elution HCP Purity yield
Run No. pH 4.5 ~ 7.5 NaCl 0 ~ 1 M pH 2.5 - 3.5 (ng/㎖) (ng/㎖) (%) (%)
1 6.0 0.5 3.00 214.60 264.89 99.08 76.51
2 7.5 1.0 2.50 165.44 188.57 88.29 77.87
3 4.5 0.0 2.50 89.52 479.82 81.59 75.52
4 7.5 0.0 3.50 0.00 194.05 99.63 74.03
5 6.0 0.5 3.00 202.00 297.10 99.07 69.58
6 4.5 1.0 3.50 314.40 158.02 98.78 76.30
7 7.5 1.0 3.50 331.44 90.63 99.16 123.19
8 4.5 1.0 2.50 195.32 271.28 48.05 74.65
9 6.0 0.5 3.00 140.52 188.03 99.09 77.44
10 4.5 0.0 3.50 101.68 449.73 98.44 78.60
11 7.5 0.0 2.50 74.84 587.80 92.74 82.20
상기 표 17의 결과를 분석하여 도 6에 나타내었으며, AC chromatogram 결과를 도 7에, 순도를 확인한 SEC-HPLC chromatogram 결과 (TSK G3000 swxl column 이용; TOSHO사)를 도 8a 및 8b (도 8a의 원부분 확대)에 각각 나타내었다. 표 17 및 도 6 내지 8b에서 보여지는 바와 같이, 세척 버퍼의 pH와 염 농도는 높을 수록 세척 효과가 좋고, 용출 조건은 pH 3.0 내지 3.5 사이가 적절한 것으로 나타났다. 용출 버퍼의 pH가 3.0 이하 이면 이합체 이상의 다중 중합체가 생성되고, pH가 3.5 이상이면 단백질 회수율이 떨어지는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 통하여, 아래 그림과 같은 최종 AC 공정을 결정하였다.
Figure pat00008
이 공정은 1000 L 임상 시료 생산을 대비하여 연속 column work에도 적용할 수 있게 설계될 수 있다.
실시예 4. 음이온 교환 크로마토그래피의 조건 선정
실시예 2에서 선정된 양이온 교환 크로마토그래피 공정, 및/또는 상기 실시예 3에서 선정된 친화성 크로마토그래피의 조건에 더하여, 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX) 공정의 적정 조건을 추가로 선정하여, 숙주세포 유래 DNA 및 HCP제거를 통해 항체 정제의 효율을 보다 높일 수 있음을 시험하였다.
AIEX 공정은 항체 단백질이 resin에 결합하지 않고 불순물만 resin에 결합시켜 정제하는 방법으로 개발하였다. 항 c-Met 항체 L3-1Y/IgG2의 계산상의 pI가 8.1 정도임을 감안하여, 세 pH point(pH 6.5, 7.1, 7.5)를 결정하여 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH 및 chase 버퍼의 pH에 따른 시료의 quality를 살펴 보았다.
AIEX 공정은 아래의 그림에서와 같이 총 9단계로 구성하였으며, 앞서 설명한 3 point에서 로딩되는 항체 시료 및 chase 버퍼의 pH를 최적화하였다:
Figure pat00009
로딩 시료의 pH에 따라 중합체 형성되는 정도가 차이가 있을 것이라 예상하고, 상기 실시예 1에서 선정된 CIEX 공정 수행 후 PBS 상태로 보관중인 항체 시료의 pH를 1 M Sodium Phosphate dibasic 또는 1 M Sodium Phosphate monobasic를 사용하여 pH 6.5, pH 7.1, pH 7.5로 각각 조정 하였다. 이후 약 1시간 정도 실온에 둔 후 시료를 취하여 SEC-HPLC (TSK G3000 swxl column 이용; TOSHO사)를 통하여 순도 (중합체 형성 정도)를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 9a 및 9b (도 9a의 8.6 내지 10.4 minutes 부분 확대)에 나타내었다. 도 9a 및 9b에서 보여지는 바와 같이, 로딩 시료의 pH가 높을수록 중합체 형성이 억제되는 것으로 확인되었다. 따라서 앞선 CIEX 공정과의 연계성을 고려하여 AIEX 공정에서의 로딩 시료의 pH는 약 7.5로 선정하였다
또한, sodium phosphate monobasic과sodium phosphate dibasic을 혼합하여 pH를 pH 6.5, pH 7.1, 또는 pH 7.5로 적정하고, 이들을 각각 AIEX chase buffer로 사용하였다. 이후 약 1시간 정도 실온에 둔 후 시료를 취하여 SEC-HPLC(TSK G3000 swxl column 이용;TOSHO사)를 통하여 순도(중합체 형성 정도)를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 10a 내지 10c에 나타내었다. 도 10a는 pH 6.5의 결과, 도 10b는 pH 7.1의 결과, 및 도 10c는 pH 7.5의 결과를 각각 보여준다. 도 10a 내지 10c에서 보여지는 바와 같이, chase buffer의 pH가 높을수록 항체의 순도가 높게 나타나는 한편, 다른 불순물도 증가하는 것으로 분석되어, chase buffer의 pH는 6.5이 적정한 것으로 선정하였다.
위의 실험 결과를 기초로, 아래 그림과 같은 최종 공정을 결정하였다:
Figure pat00010
AIEX공정을 연속으로 진행하기 위해서 Post-sanitization 이후 곧바로 equilibration하여 loading할 수 있도록 설계될 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00220 20091006
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Method of purification of anti-c-Met antibody <130> DPP20133911KR <160> 108 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Ala or Val <220> 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actacatgag ctgggtccgc 180 cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300 agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360 gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 39 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of chAbF46 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> 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attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 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actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 52 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-light <400> 52 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 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ccaggtaaag ctccaaagat gttgattatt 600 tgggcttcta ccagagtttc tggtgttcca tctagatttt ctggttctgg ttccggtact 660 gattttactt tgaccatttc atccttgcaa ccagaagatt tcgctactta ctactgtcaa 720 caatcttact ctgctccatt gacttttggt caaggtacaa aggtcgaaat caagagagaa 780 ttcggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgggtgg tggtggatct 840 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct caggaactga caactatatg cgagcaaatc 900 ccctcaccaa ctttagaatc gacgccgtac tctttgtcaa cgactactat tttggccaac 960 gggaaggcaa tgcaaggagt ttttgaatat tacaaatcag taacgtttgt cagtaattgc 1020 ggttctcacc cctcaacaac tagcaaaggc agccccataa acacacagta tgttttttga 1080 gtttaaac 1088 <210> 56 <211> 5597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression vector including polynucleotide encoding scFv of huAbF46 antibody <220> <221> misc_difference <222> (573)..(578) <223> NheI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (588)..(938) <223> huAbF46 VH <220> <221> misc_difference <222> (939)..(1007) <223> linker <220> <221> misc_difference <222> 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ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 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agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 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<400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly 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ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1410 <210> 64 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG1 <400> 64 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 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taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagaggaag 720 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 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ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120 cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtgcgt 180 caggccccgg gtaagggcct ggaatggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cgtttcacta taagcagaga taattccaaa 300 aacacactgt acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 360 gctagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcaccgt ctcctcggct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 720 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgact cgag 1404 <210> 68 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light chain of huAbF46-H4-A1(H36Y) and human kappa constant region <400> 68 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 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ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata 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agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 60 agacatttcc 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acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 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His Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 89 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 1 5 10 15 Glu <210> 90 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH1 <400> 90 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH2 <400> 91 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH3 <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH4 <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AT-VH5 <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti c-Met humanized antibody(huAbF46-H4) <400> 95 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 96 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk1 <400> 96 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 97 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk2 <400> 97 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 98 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk3 <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 99 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AT-Vk4 <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U7-HC6) <400> 100 Glu Pro Ser Cys Asp Lys His Cys Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC7) <400> 101 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U3-HC9) <400> 102 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U6-HC8) <400> 103 Glu Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified hinge region(U8-HC5) <400> 104 Glu Lys Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human hinge region <400> 105 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 106 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of antibody L3-11Y <400> 106 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 107 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of antibody L3-11Y <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 108 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain of antibody L3-11Y <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Trp 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (17)

  1. 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 항체 정제 방법에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법:
    양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm 이하인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 전도도가 7.0 mS/cm 이하인 조건; 및
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 전도도가 7.6 mS/cm 이상인 조건.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도, 세척 버퍼의 전도도, 또는 용출 버퍼의 전도도는 상기 항체 시료, 세척 버퍼, 또는 용출 버퍼의 염 농도, pH, 또는 이들의 조합에 의하여 조절되는 것인,
    항 c-Met 항체의 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법:
    양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 염 농도가 50 mM 이하인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 pH가 5.5 이하인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼의 pH가 5.2 내지 5.8인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 염 농도가 50 mM 이하인 조건; 및
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼의 pH가 6.6 내지 7.4인 조건.
  4. 제2항에 있어서, 상기 염 농도는 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 황산암모니움, 염화마그네슘, 염화칼륨, 및 황산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 조절되는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 세척 버퍼는 포스페이트 계열, 아세테이트 계열, 시트레이트 계열, 카보네이트 계열, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris, Bis-Tris, 및 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 pH가 5.2 내지 5.8이 되도록 포함하는 것이고,
    상기 용출 버퍼는 포스페이트 계열, 아세테이트 계열, 시트레이트 계열, 카보네이트 계열, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), Tris, Bis-Tris, 및 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 pH가 6.6 내지 7.4가 되도록 포함하는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 용출 버퍼로서 pH 3.0 내지 3.5의 용출 버퍼를 사용하는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료는 pH 6.5 내지 9인 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 pH 6 내지 7의 추적(chase) 버퍼를 사용하는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  9. 제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 단계, 바이러스 불활성화 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 음이온 교환 크로마토그래피, 나노여과 단계, 한외여과 단계 및 정용여과 단계를 포함하고, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 다음의 조건 하에서 수행되는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법:
    양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm 이하인 조건;
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 전도도가 7.0 mS/cm 이하인 조건; 및
    양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 전도도가 7.6 mS/cm 이상인 조건.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 등전점이 8 내지 8.5인 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 c-Met 항체는,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
    서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
    을 포함하는 것인, 항 c-Met 항체의 정제 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항 c-Met 항체의 정제 방법에 의하여 생산되고, 항 c-Met 항의 순도가 95% 이상이고, 이합체를 초과하는 중합체 함량이 1 %(w/w) 이하이고, 숙주세포 유래 단백질 함량이 4 ppm이하인, 항 c-Met 항체 제제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 등전점이 8 내지 8.5인 것인, 항 c-Met 항체 제제.
  15. 제13항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 인식 또는 결합하는 항 c-Met 항체인, 항 c-Met 항체 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 c-Met 항체는,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
    서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
    을 포함하는 것인, 항 c-Met 항체 제제.
  17. 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 단백질 정제 방법에 있어서,
    상기 단백질은 등전점이 8 내지 8.5인 단백질이고,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피가 다음의 조건들로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인,
    단백질의 정제 방법:
    (1) 양이온 교환 크로마토그래피에 로딩되는 항 c-Met 항체 시료의 전도도가 5.5 mS/cm 이하인 조건;
    (2) 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 세척 버퍼는 전도도가 7.0 mS/cm 이하인 조건; 및
    (3) 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 용출 버퍼는 전도도가 7.6 mS/cm 이상인 조건.
KR1020140003544A 2014-01-10 2014-01-10 항 c-Met 항체 정제 방법 KR20150083689A (ko)

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