KR20150081434A - 당원 축적 질환을 위한 유전자 치료법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 전사 전사 인자(transcription factor) EB(TFEB) 단백질, 오솔로그(ortholog), 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체(allelic variant) 및 그들의 절편(fragments); TFEB 단백질, 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편을 포함하는 키메라 분자(chimeric molecule); 상기 단백질 또는 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편(fragments)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 폴리펩티드를 발현하는 유전적으로 변형된(genetically engineered) 숙주 세포 또는 약학적 조성물에 관련된 것이다. 바람직하게 폼페병 또는 다논병이다.
Description
본 출원은 2012년 10월 17일에 출원된 미국 임시 출원 61/715,187호의 이익을 청구하며, 이의 내용을 여기에 참조로서 통합한다.
본 발명은 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방시 사용을 위한 전사 인자(transcription factor) EB(TFEB) 단백질, 오솔로그(ortholog), 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체(allelic variant) 및 그들의 절편(fragments); 전사 인자 EB(TFEB) 단백질, 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편을 포함하는 키메라 분자(chimeric molecule); 상기 단백질 또는 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편(fragments)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 폴리펩티드를 발현하는 유전적으로 변형된(genetically engineered) 숙주 세포 또는 약학적 조성물에 관련된 것이다. 바람직하게는 폼페병 또는 다논병이다.
다수의 치료학적 접근들이 다른 전략들과 이론적 근거들에 기초하여, 리소좀 축적 질환(lysosomal storage diseases(LSD))의 치료를 위해 탐구되어 왔다. 이들은 조혈모세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)), 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy(ERT)), 기질 감소 치료법(substrate reduction therapy(SRT)), 약학적 샤프론 치료법(pharmacological chaperone therapy(PCT)), 및 유전자 치료법(GT)을 포함한다.
일반적으로 말하면, 이들 접근들은 두 개의 넓은 범주로 분리될 수 있다: 없어진 효소(missing enzyme)의 나머지 활성을 증가시키는 것을 목적으로 하는 것(HSCT, ERT, PCT 및 GT), 및 축적된 기질의 합성을 감소시키는 것을 목적으로 하는 것(SRT). 전형적으로, 이들 치료법들의 목표는 소위 "축적 식(storage equation)"의 평형을 복구하는 것이고, 그것은 기질의 합성 및 분해(degradation)의 균형이다.
그렇지만, 이들 접근들 각각은 전형적으로 특정 질환에 대해서만 나타나고, 많은 접근들이 LSD와 같은 다중시스템(multisystem) 장애의 다양한 양상을 완전하게 치료할 수는 없다.
폼페병은 리소좀 축적 질환이며, 또한 당원 축적 질환에도 속하며, 리소좀 가수분해 효소 산 알파-글루코시다제(lysosomal hydrolase acid alpha-glucosidase (GAA)), 당원 분해 리소좀 효소의 결핍 또는 기능 장애에 의해 일어난다. GAA의 결핍은 폼페 환자의 많은 조직에 리소좀 당원 축적을 야기하며, 심장 근육 및 골격근 조직에 최대로 심각하게 영향을 미친다. 모든 형태의 폼페병의 복합된 발생 정도는 1:40,000으로 평가되며, 이 질환은 민족 편애(ethnic predilection)없이 모든 그룹에 영향을 준다. 현재 환자들의 대다수가 더 천전히 진행되고, 청소년 또는 후기 발병(late-onset)형인 반면, 폼페병 형태들의 대략 3분의 1이 급속하게 진행되고, 치명적인 영아-발병형인 것으로 평가된다.
현재 폼페병에 대해 승인된 유일한 치료인, 효소 대체 요법은 중요한 한계를 보여준다(Schoser et al . (2008) "당원 축적 질환 제II형/폼페병의 치료학적 접근들(Therapeutic approaches in glycogen storage disease type II/Pompe Disease)", Neurotherapeutics 5:569-7). 예를 들면, 치료에도 불구하고, 일부 환자들은, 특히, 골격근에서, 제한된 임상적 혜택을 가지거나 질환 진행의 징후를 보여준다.
다논병도 리소좀 효소, 특히 리소좀 멤브레인의 필수적 성분에 대해 코딩하고, 오토파고솜-리소좀 융합에서 역할을 하는 것으로 나타나는 LAMP2 유전자에서의 변이에 의해 일어나는 당원 축적 질환이다. 다논병은 심각한 심근증 및 다양한 정도의 근육 약화가 특징이며, 종종 지적지능 결함과 연결된다. 이 병에 대한 특이적 치료는 없다.
폼페병과 다논병은 당원 축적 질환(GSD, 또한 글리코제노시스(glycogenosis) 및 덱스트린증(dextrinosis)) 그룹에 속한다. GSD는 근육, 간 및 다른 세포 타입 내에서 당원 합성 또는 파괴 과정에서의 결함에 기인한다. GSD는 두 종류의 원인이 있다: 유전적 또는 후천성(acquired). 유전적 GSD는 이들 과정에 수반되는 대사(metabolism)의 임의의 선천적인 에러에 의해 일어난다. 영국 콜롬비아의 연구에 따르면, 전체적으로, 대략 100000명 출생당 2.3명의 어린이(43,000명 중 1명)가 당원 축적 질환의 일부 형태를 가지고 있다. 미국에서는 20000~25000명 출생당 1명 발생하는 것으로 평가한다. 독일 연구는 40000명당 1명으로 평가한다.
본 발명은 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병에 대해 개선된 치료법을 제공하려고 한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 첨가제 및 선행하는 청구항들 중 어느 하나에서 규정된 화합물을 포함하는 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하려고 한다.
본 발명은 치료가 필요한 대상에게 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법을 제공하려고 한다.
본 발명은 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병에 대해 개선된 치료법을 제공한다. 부분적으로 본 발명은 근육내 당원 축적의 효과적인 정리(clearance) 및 근육 병리의 완화를 야기하는, 염기성-나선-고리-나선 류신-지퍼 전사 인자( basic-helix-loop-helix leucine-zipper transcription factor) MiTF/TFE 패밀리의 구성원인 전사 인자 EB(TFEB)가 세포외 공간으로 리소좀 엑소시토시스(exocytosis) 및 축적된 저장 물질의 폐기를 유도하도록 접근하는 유전자 치료법을 사용하여 효과적으로 골격근에 전달될 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서 본 발명은 먼저 골격근과 같은 주 질환 근육에서 TFEB 과발현으로 유도되는 축적된 기질의 정리가 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병의 임상적 징후를 치료할 수 있다는 것을 입증한다.
따라서 본 발명의 목적은 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 하기 그룹에서 선택되는 화합물이다:
a) 전사 전사 인자(transcription factor) EB(TFEB) 단백질, 오솔로그(ortholog), 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체(allelic variant) 및 그들의 절편(fragments);
b) TFEB 단백질, 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편을 포함하는 키메라 분자(chimeric molecule);
c) 상기 단백질 또는 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편(fragments)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
d) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및
e) 상기 폴리펩티드를 발현하는 유전적으로 변형된(genetically engineered) 숙주 세포.
바람직하게, 상기 당원 축적 질환은 근육, 간, 심장 및/또는 신경계에서 당원의 축적이 특징이다.
더 바람직하게, 상기 당원 축적 질환은 GSD 제Ia형(폰기에르케병(Von Gierke disease)), GSD 제I비-a형(type I non-a)(다양한 아형들), GSD 제II형(폼페병), GSD 제IIb형(다논병), GSD 제III형(코리병(Cori's disease) 또는 포르브스병(Forbes' disease)), GSD 제IV형(앤더슨병(Andersen disease)), GSD 제V형(맥카들병(McArdle disease)), GSD 제VI형(에르스병(Hers' disease)), GSD 제VII형(타루이병(Tarui's disease)), GSD 제IX형, GSD 제XI형(판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), GSD 제XII형(적혈구 알돌라아제 결핍증(Red cell aldolase deficiency)), GSD 제XIII형 및 GSD 제0타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
바람직하게, 상기 당원 축적 질환은 폼페병 또는 다논병이다.
바람직하게, 상기 화합물은 축적된 당원을 함유하는 목표 조직으로 전달된다.
바람직하게, 상기 목표 조직은 근육, 간, 심장 및/또는 신경계로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 목표 조직은 근육 및/또는 간이다. 더 바람직하게, 상기 근육은 골격근, 심근, 및/또는 횡경막(diaphragm)이다. 더욱더 바람직하게 상기 화합물은 전신 투여로 전달된다. 바람직하게 전신 투여는 정맥내 투여(intravenous administration)이다.
바람직한 구현예에서, 화합물은 국소 투여로 전달된다. 바람직하게, 국소 투여는 근육내 투여(intramuscular administration)이다. 바람직한 구현예에서 상기 TFEB 단백질은 SEQ ID NO:2와 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 TFEB 단백질이 SEQ ID NO:2와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 더 바람직하게 상기 TFEB 단백질이 SEQ ID NO:2로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 TFEB 단백질의 발현을 조절하는(control) 조직 특이적 프로모터 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 조직 특이적 프로모터 서열은 근육 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:3로 구성되는 MCK 프로모터 서열이다:
GGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCGGCCGCC(Tessitore A. et al, Mol Ther, 2007에서)
바람직하게 상기 조직 특이적 프로모터 서열은 간 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:4로 구성되는 PEPCK 프로모터 서열이다:
TATTTAAAGCGAGGAGGGCTAGCTACCAAGCACGGTTGGCCTTCCCTCTGGGAACACACCCTTGGCCAACAGGGGAAATCCGGCGAGACGCTCTGAG
바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1과 최소한 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1과 최소한 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터(viral vector), 플라스미드, 바이러스 입자(viral particles) 및 파지(phages)로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터이다.
바람직하게, 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 부속 벡터(adeno associated vectors(AAV)) 및 네이키드 플라스미드 DNA 벡터(naked plasmid DNA vectors)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터이다.
더 바람직하게, 상기 AAV 벡터는 키메라 및/또는 위형(pseudotyped) 벡터이다.
바람직하게, 상기 분자의 전달은 근육 및/또는 간에서 당원 축적의 감소를 야기하는 것이다. 바람직하게 상기 근육은 골격근이다.
더 바람직하게, 상기 분자의 전달은 강도, 심각도(severity), 또는 빈도, 또는 발병이 지연되는 측면에서 근육 및/또는 간에서 당원의 축적의 감소를 가져오는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 약학적으로 허용가능한 첨가제 및 선행하는 청구항들 중 어느 하나에서 규정된 화합물을 포함하는 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 약학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치료가 필요한 대상에게 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법이다.
상기 방법에서, 바람직하게 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 축적된 당원을 함유하는 목표 조직으로 전달된다. 더 바람직하게 상기 목표 조직은 근육, 간, 심장, 및/또는 신경계에서 선택된다. 더 바람직하게 목표 조직은 근육 및/또는 간이다. 더 바람직하게 근육은 골격근, 심장 근육, 및/또는 횡경막이다. 상기 방법에서, 바람직하게 핵산은 전신 투여로 전달된다. 바람직하게 전신 투여는 정맥내 투여(intravenous administration)이다. 바람직하게 핵산은 국소 투여로 전달된다. 더 바람직하게 국소 투여는 근육내 투여(intramuscular administration)이다. 더 바람직하게 상기 핵산은 바이러스 벡터이다. 바람직하게 바이러스 벡터는 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터이다.
더 바람직하게 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터이다. 더 바람직하게 AAV 벡터는 키메라 및/또는 위형(pseudotyped) 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 TFEB 유전자의 발현을 조절하는 조직 특이적 프로모터 서열을 더 포함한다.
바람직하게, 조직 특이적 프로모터 서열은 근육 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:3로 구성되는 MCK 프로모터 서열이다.
바람직하게, 조직 특이적 프로모터 서열은 간 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:4로 구성되는 PEPCK 프로모터 서열이다.
상기 방법에서, 바람직하게 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 최소한 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 최소한 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더 바람직하게 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게, TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2인 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산의 전달은 근육 및/또는 간에서 당원 축적의 감소를 가져온다. 더 바람직하게 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산의 전달은 골격근에서 당원 축적의 감소를 가져온다.
본 발명의 다른 목적은 치료가 필요한 대상에게 근육 및/또는 간에서 당원의 축적이 강도, 심각도(severity), 또는 빈도에서 감소되거나, 또는 발병(onset)이 지연되도록 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법이다.
바람직하게, TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 전신 투여된다. 바람직하게, TFEB 유전자는 정맥내로 투여된다.
바람직한 구현예에서, TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 근육내로 투여된다.
더 바람직하게, 핵산은 바이러스 벡터, 플라스미드, 바이러스 입자 및 파지로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터이다.
바람직하게, 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 부속 벡터(adeno associated vectors(AAV)) 및 네이키드 플라스미드 DNA 벡터(naked plasmid DNA vectors)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터이다.
특정 구현예에서, 목표 조직은 근육(예. 골격근, 심장 근육 및/또는 횡경막)이다.
본 발명에서 재조합체, 합성 또는 생물공학적 기능적 유도체, 단백질의 대립형질 변이체, 단백질의 펩티드 절편, TFEB 단백질, 그들의 합성 또는 생물공학적 기능적 유도체를 포함하는 키메라 분자는 TFEB의 치료학적 효과, 즉, 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병의 치료를 유지할 수 있는 분자로서 정의된다.
유도체들은 SEQ ID NO.2와 최소한 45%, 바람직하게는 최소한 75%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 한층 바람직하게는 최소한 90% 또는 95% 동일한 백분율을 가지는 단백질 또는 그들의 오솔로그를 포함하는 군에서 선택된다.
절편은 최소한 50 아미노산, 바람직하게는 최소한 100 아미노산, 더 바람직하게는 최소한 150 아미노산의 길이를 가지는 단백질을 말한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
본 발명에서 숙주 세포는 박테리아 세포, 균류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게 숙주 세포는 동물 세포이다.
약학적 조성물은 전신, 경구 또는 국소적 투여용이다.
본 발명에서, 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터, 위형 AAV 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 위형 AAV 벡터는 제2 AAV 혈청형(serotype)의 캡시드에서 하나의 AAV 혈청형의 게놈을 함유하는 벡터이다: 예를 들면 AAV2/8 벡터는 AAV8 캡시드와 AAV2 게놈을 함유한다(Auricchio et al . Hum . Mol . Genet . 10(26):3075-81 (2001)). 그러한 벡터들은 또한 키메라 벡터로서 알려져 있다. 네이키드 플라스미드 DNA 벡터 및 이 기술분야에서 알려진 다른 벡터는 본 발명에 따라서 TFEB 유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 전달 시스템의 다른 예들은 엑스 비보(ex vivo) 전달 시스템을 포함하며, 전기천공법, DNA 바이오리스틱스(DNA biolistics), 지질-매개 트랜스펙션(lipid-mediated transfection), 압축된 DNA-매개 트랜스펙션(compacted DNA-mediated transfection)과 같은 DNA 트랜스펙션 방법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 전이유전자(transgene)(즉, 여기서 설명된 TFEB 유전자) 및 조절적 요소(regulatory elements)를 수용할 수 있다. 다양한 방법들이 치료가 필요한 대상에게 여기서 설명된 TFEB 유전자를 엔코딩하는 바이러스 벡터를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터는 정맥내 주사 또는 혈관내 주사를 통해 전달될 수 있다. 전신 투여의 다른 경로는 동맥, 심장내, 복강내, 피하 또는 근육 주사, 근육내 투여와 같은 국소 투여를 통한 루트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 벡터는 특히, AAV 벡터, 특히 AAV2/1 또는 AAV2/9 벡터들은 1×10e10 바이러스 입자(vp)/kg 내지 1×10e13 vp/kg의 용량 범위에서 주사될 수 있다. 1×10e11 내지 1×10e12 vp/kg의 용량 범위는 인간에게 더 효과적일 것으로 예상되는 데, 이들 용량은 근육(심장 및 골격근) 및 간의 큰 유전자전달 효과(transduction efficiency)을 가져올 것으로 기대되기 때문이다.
본 발명의 벡터, 특히 AAV 벡터는 높은 근육 및 간 형질도입(transduction)을 제공할 것으로 기대되는 1×10e11 벡터 게놈(vg)/kg 내지 1×10e13 vg/kg의 용량으로 주사될 수 있다(Nathwani, A.C., et al. N Engl J Med 365, 2357-2365 (2011)).
아데노바이러스 벡터는 게놈은 형질도입된 세포의 게놈 내로 통합되지 않고 따라서 벡터 게놈은 활발하게 분열하는 세포내에서 소실된다. 첫 번째 투여로 유도된 중화 항-Ad 항체를 극복하기 위한 다른 혈청형으로 벡터를 재투여할 수 있게 하는 표현형 수정(phenotypic correction)을 유지하기 위해, TFEB 발현은 시간이 지나면 서서히 사라져야 한다(((Kim et al. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13282-13287 (2001); Morral et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:12816-12821)(1999)).
본 발명은 a) 유효량의 여기서 설명된 벡터 또는 유효량의 여기서 설명된 형질전환된 숙주 세포 및 b) 불활성 또는 생리학적으로 활성인, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 여기서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제"는 모든(any and all) 용매, 분산 매체, 코팅제, 항박테리아제 및 항균제, 및 생리학적으로 적합(physiologically compatible)한 유사한 것을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 첨가제의 예에는 물, 생리식염수, 인산 완충 생리식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 그들의 조합 중 하나 이상이 포함된다. 많은 경우에, 조성물 중에 설탕, 다가 알콜, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 관련된 적합한 담체의 예는 (1) pH ~7.4, 인간 혈청 알부민 약 1mg/ml 내지 25mg/ml를 함유하거나 함유하지 않는 둘베코 인산 완충 생리식염수, (2) 0.9% 생리식염수(0.9% w/v 염화나트륨(NaCl)), 및 (3) 5%(w/v) 덱스트로오스를 포함하고, 또한 트립타민과 같은 항산화제 및 트윈 20과 같은 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명으로 포함되는 약학적 조성물은 또한 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병의 치료를 위한 치료제를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들면 액체, 반고체를 포함하나, 바람직한 형태는 투여 및 치료적 적용의 의도된 양식에 의존한다. 일반적인 바람직한 조성물은 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액의 형태이다. 투여의 바람직한 양식은 비경구적(예를 들면, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하)이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 볼루스(bolus)로서 정맥내로 또는 일정 시간에 걸쳐서 연속적 주입에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 국소적 뿐만 아니라 전신적으로 치료 효과가 가해지도록, 근육내, 피하, 관절내, 활액내, 종양내, 종양 부근(peritumoral), 병변내 또는 병변 부근 루트를 통해 주사된다.
비경구 투여를 위해 멸균된 조성물은 마이크로 여과에 의한 멸균 후에, 적합한 용매 중에 요구되는 양으로 본 발명에서 설명된 벡터 또는 숙주 세포를 통합하여 준비될 수 있다. 용매 또는 부형제로서, 물, 생리식염수, 인산 완충 생리식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 그들의 조합이 사용될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 설탕, 다가 알콜, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 이들 조성물은 또한 보조제(adjuvants), 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 멸균 조성물은 또한 멸균수 또는 임의의 다른 주사 가능한 멸균 매체에 사용 시점에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 준비될 수 있다.
물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 파라핀 오일과 같은 불활성 희석제를 함유하는 약학적으로 허용가능한 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 일릭서(elixir)가 사용될 수 있다. 이들 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들면, 습윤 제품(product), 감미 제품, 증점 제품, 착향료 제품 또는 안정화 제품을 포함할 수 있다.
투약량은 원하는 효과에 의존하며, 치료 기간(duration) 및 사용되는 투여 경로는 알려진 방법을 사용하여 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 것이다.
의학 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 임의의 환자에 대한 복용량은 환자의 크기, 신체 표면적, 나이, 투여되는 특별한 화합물, 성별, 시간 및 투여 경로, 일반적 건강 상태 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자들에 의존한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"는 동등한 것으로 사용된다. 약/대략이 있던 없던 본 명세서에서 사용되는 임의의 숫자는 관련 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 인식되는 임의의 정상적 변동 범위를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 태양, 목적 및 이점이 하기하는 상세한 설명에서 명백하다. 그렇지만, 상세한 설명은 본 발명이 나타내는 구현예들은 오직 설명을 위한 방식으로만 제공되며 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 상세한 설명으로부터 이 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백해 질 것이다.
본 발명은 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병에 대해 개선된 치료법을 제공한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 첨가제 및 선행하는 청구항들 중 어느 하나에서 규정된 화합물을 포함하는 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료가 필요한 대상에게 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
도면을 함께 구성하는, 하기에 설명되는 수치들은 오직 예시의 목적이며 제한을 위한 것이 아니다.
도 1은 뮤린 Tcfeb 코딩 서열(mTFEB)을 함유하는 AAV2.1-거대세포바이러스(cytomegalovirus(CMV)) 플라스미드의 개략적인 도면을 나타낸다.
도 2는 AAV2/1-CMV-mTFEB가 근육내로 주사된 쥐의 글루코시다아제(GAA)-/-에서 당원 정리의 촉진 및 폼페병(PD) 병리의 감쇠를 보여주는 예시적 결과를 도시한 것이다. (A)는 TFEB-주사된 비복근(gastrocnemii)과 반대측(contralateral) 미치료된(untreated) 근육에서의 당원 분석으로서, 미치료된 근육에 비해서 TFEB-주사된 근육에서 당원 레벨이 상당하게 줄어든 것을 보여주는 당원 분석. (B) 미치료된 근육에 비해서 리소좀 당원 축적에 상응하는 반점 염색에서 감소를 보여주는 TFEB-치료된(TFEB-treated) 비복근의 과요오드산 쉬프 염색(Periodic acid schiff(PAS) stain). (C) 미치료된 근육에 비해서 TFEB 치료된 근육에서 LAMP1 소낭의 수 및 크기가 감소한 것을 보여주는 TFEB-주사된 비복근 및 반대측 미치료된 근육의 리소좀-부속된 멤브레인 단백질 1(LAMP1) 염색.
도 3은 GAA-/- 쥐에서 근섬유 초미세구조에 TFEB-주사의 영향에 대한 예시적 전자현미경(electron microscopy(EM)) 분석을 나타낸다. (A, B) 근섬유의 저배율 이미지에서 별표(*)는 당원을 함유하는 리소좀-비슷한 소기관을 나타낸다. (C, D) 리소좀 길이(평균±SE; n=100 리소좀 구조체) 및 근섬유 부분(평균±SE; n=50 필드)의 5㎛2 면적 내의 그들의 수의 측정. (E, F) 리소좀-비숫한 소기관의 고배율 이미지에서 별표(*)는 TFEB 과발현된 그들의 루멘에서 당원의 성긴 패턴(looser pattern)을 드러낸다. 검은 화살표는 오토파고솜 프로파일을 나타내며; 백색 화살표는 리소좀 내부로 집어삼켜진 미토콘드리아의 남은 부분을 보여준다. (G) 당원-함유 리소좀-비슷한 구조체(평균±SE; n=100 리소좀 구조체) 옆에 있는(flanking) 오토파고솜 수의 측정. 패널 C, D 및 G에서 "***"는 p<0.001로 t-검정에 따라서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다. 스케일바: A 및 B에서 1500 nm; E 및 F에서 450 nm.
도 4는 야생형 쥐, GAA-/- 미치료된 녹아웃 쥐(knockout mice), 및 GAA-/- AAV2/9-CMV-mTFEB-치료된 동물의 행동기능검사(와이어 매달리기(hanging wire), 스틸 매달리기(hanging steel) 및 로타로드(rotard))를 보여준다. GAA-/- 미처리 및 GAA-/- TFEB-치료된 쥐 모두 와이어 매달리기(A), 스틸 매달리기(B), 및 로타로드(C) 검사에서 야생형 동물에 비해서 손상된 수행 능력을 보였다. 그렇지만, 모든 검사에서 TFEB-치료된 동물들은 미치료된 동물들에 비해서 개선된 수행 능력 경향을 보였다.
도 5는 AAV2/9-CMV-m-TFEB-치료된 쥐의 간(A) 및 비근육(B)에서 실시간 PCR에 의해 분석된 TFEB 발현 레벨을 나타낸다. 치료된 동물들에서 분석은 간에서 대략 4배 증가를 비근육에서 대략 2배 증가를 그들의 상대 대조군에 비해서 보였다.
도 6은 미치료된 그리고 AAV2/9-CMV-mTFEB-치료된 GAA-/- 쥐(Gaa-/-)의 비근육에서 당원 레벨을 보여준다. TFEB-치료된 동물에서 당원 레벨이 미치료된 동물에 비해서 낮아졌다.
도 1은 뮤린 Tcfeb 코딩 서열(mTFEB)을 함유하는 AAV2.1-거대세포바이러스(cytomegalovirus(CMV)) 플라스미드의 개략적인 도면을 나타낸다.
도 2는 AAV2/1-CMV-mTFEB가 근육내로 주사된 쥐의 글루코시다아제(GAA)-/-에서 당원 정리의 촉진 및 폼페병(PD) 병리의 감쇠를 보여주는 예시적 결과를 도시한 것이다. (A)는 TFEB-주사된 비복근(gastrocnemii)과 반대측(contralateral) 미치료된(untreated) 근육에서의 당원 분석으로서, 미치료된 근육에 비해서 TFEB-주사된 근육에서 당원 레벨이 상당하게 줄어든 것을 보여주는 당원 분석. (B) 미치료된 근육에 비해서 리소좀 당원 축적에 상응하는 반점 염색에서 감소를 보여주는 TFEB-치료된(TFEB-treated) 비복근의 과요오드산 쉬프 염색(Periodic acid schiff(PAS) stain). (C) 미치료된 근육에 비해서 TFEB 치료된 근육에서 LAMP1 소낭의 수 및 크기가 감소한 것을 보여주는 TFEB-주사된 비복근 및 반대측 미치료된 근육의 리소좀-부속된 멤브레인 단백질 1(LAMP1) 염색.
도 3은 GAA-/- 쥐에서 근섬유 초미세구조에 TFEB-주사의 영향에 대한 예시적 전자현미경(electron microscopy(EM)) 분석을 나타낸다. (A, B) 근섬유의 저배율 이미지에서 별표(*)는 당원을 함유하는 리소좀-비슷한 소기관을 나타낸다. (C, D) 리소좀 길이(평균±SE; n=100 리소좀 구조체) 및 근섬유 부분(평균±SE; n=50 필드)의 5㎛2 면적 내의 그들의 수의 측정. (E, F) 리소좀-비숫한 소기관의 고배율 이미지에서 별표(*)는 TFEB 과발현된 그들의 루멘에서 당원의 성긴 패턴(looser pattern)을 드러낸다. 검은 화살표는 오토파고솜 프로파일을 나타내며; 백색 화살표는 리소좀 내부로 집어삼켜진 미토콘드리아의 남은 부분을 보여준다. (G) 당원-함유 리소좀-비슷한 구조체(평균±SE; n=100 리소좀 구조체) 옆에 있는(flanking) 오토파고솜 수의 측정. 패널 C, D 및 G에서 "***"는 p<0.001로 t-검정에 따라서 통계적으로 상당한 차이를 나타낸다. 스케일바: A 및 B에서 1500 nm; E 및 F에서 450 nm.
도 4는 야생형 쥐, GAA-/- 미치료된 녹아웃 쥐(knockout mice), 및 GAA-/- AAV2/9-CMV-mTFEB-치료된 동물의 행동기능검사(와이어 매달리기(hanging wire), 스틸 매달리기(hanging steel) 및 로타로드(rotard))를 보여준다. GAA-/- 미처리 및 GAA-/- TFEB-치료된 쥐 모두 와이어 매달리기(A), 스틸 매달리기(B), 및 로타로드(C) 검사에서 야생형 동물에 비해서 손상된 수행 능력을 보였다. 그렇지만, 모든 검사에서 TFEB-치료된 동물들은 미치료된 동물들에 비해서 개선된 수행 능력 경향을 보였다.
도 5는 AAV2/9-CMV-m-TFEB-치료된 쥐의 간(A) 및 비근육(B)에서 실시간 PCR에 의해 분석된 TFEB 발현 레벨을 나타낸다. 치료된 동물들에서 분석은 간에서 대략 4배 증가를 비근육에서 대략 2배 증가를 그들의 상대 대조군에 비해서 보였다.
도 6은 미치료된 그리고 AAV2/9-CMV-mTFEB-치료된 GAA-/- 쥐(Gaa-/-)의 비근육에서 당원 레벨을 보여준다. TFEB-치료된 동물에서 당원 레벨이 미치료된 동물에 비해서 낮아졌다.
본 발명은 유전자 치료법 접근을 이용하여 근육과 같은 목표 조직에서 전사 인자 EB(TFEB) 유전자의 과발현에 기반하는, 당원 축적 질환, 특히 폼페병 또는 다논병 치료를 위한 핵산 분자, 벡터, 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에게 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산을 전달하여 폼페병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 전신 투여(예를 들면, 정맥내 투여)에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 적합한 TFEB 유전자는 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터에 의해 전달된다.
본 발명의 다양한 양상이 다음 부분에서 상세히 설명된다. 이 부분은 본 발명을 제한하는 것으로 되지 않는다. 각 부분은 본 발명의 임의의 양상에 대해 적용될 수 있다. 이 명세서에서, "또는"의 사용은 다르게 기술하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
당원 축적 질환
당원 축적 질환(GSD, 또한 글리코제노시스 및 텍스트린증)은 근육, 간 및 다른 세포 형태 내에서 당원 합성 또는 파괴 과정에서 결함의 결과이다. GSD는 유전적 또는 후천성일 수 있고, 간, 근육 및 뇌에서 비정상적 유전(inherited) 당원 대사가 특징이다. 유전적 GSD는 선천적 대사 에러에 의해 초래되며 유전적으로 결함이 있는 효소를 수반한다. 그들은 대부분 상염색체 열성 질환(autosomal recessive disorders)으로서 유전되며 당원 합성 또는 이화 작용의 결함을 야기한다. GSD의 전체적인 발생 정도는 생존 출생아 20000-40000명당 1개 경우로 평가된다. 당원 분해의 장애는 일차적으로 간, 근육 또는 둘 다에 영향을 줄 수 있다. 12 형태가 넘고 효소 결핍 및 영향받는 조직에 기반하여 분류된다(Mingyi Chen, Glycogen Storage Diseases, Molecular Pathology Library, Volume 5, 2011, pp 677-681).
GSD는 하기 형태 및 관련된 아형을 포함한다:
폼페병은 에너지를 위해 사용되는 설탕의 저장 형태인 당원을 분해하는 데 필요한 효소 산 알파-글루코시다아제(enzyme acid alpha-glucosidase(GAA)) 결핍으로 인한 희귀한 유전적 장애이다. 폼페병은 또한 당원 축적 질환 제II형, GSD II, 제II형 당원 축적 질환, 글리코제노시스 제II형, 산 말타아제 결핍, 알파-1,4-글루코시다아제 결핍, 글리코겐성 심비대증(cardiomegalia glycogenic diffusa), 및 일반화된 글리코제노시스의 심장형(cardiac form of generalized glycogenosis)으로서 알려져 있다. 당원의 증가는 신체에 걸쳐서 진행성 근육 약화(근질환(myopathy))를 일으키고 다양한 신체 조직, 특히 심장, 골격근, 간, 호흡계 및 신경계에 영향을 준다.
존재하는 폼페병의 임상적 특징은 질환 발병의 나이 및 잔여 GAA 활성에 의존하여 넓게 다양할 수 있다. 잔여 GAA 활성은 질환의 심각성뿐만 아니라 당원 축적 양 및 조직 분포와 상관된다. 영아-발병 폼페병(정상 GAA 활성의 1% 미만)은 가장 심각한 형태이며, 근력 저하, 일반화된 근육 약화, 및 비후성 심근증, 및 심장 및 기타 근육 조직에서 대규모 당원 축적이 특징이다. 대체로 출생 1년 이내에 심폐 실패로 사망하게 된다(Hirschhorn et al. (2001) 당원 축적 질환 제II형: 산 알파-글루코시다아제(산 말타아제) 결핍(Glycogen Storage Disease Type II: Acid Alpha-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency), in Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8th Ed., New York: McGraw-Hill, 3389-3420). 청소년-발병(정상 GAA 활성의 1-10%) 및 성인-발병(정상 GAA 활성의 10-40%) 폼페병은 발병 나이, 임상 양상, 및 질환 진행에서 더 큰 변수를 가지며, 임상적으로 더 이질적이다. 청소년- 및 성인-발병 폼페병은 일반적으로 심각한 심장 관여(cardiac involvement)의 결여, 더 늦은 발병 나이, 및 더 느린 질환 진행이 특징이나, 최종적인(eventual) 호흡기 근육 또는 사지 근육 관여는 상당한 질병율과 사망율(morbidity and mortality)을 야기한다. 기대 수명은 다양할 수 있는 반면, 사망은 일반적으로 호흡 실패로 인해 생긴다(Hirschhorn et al. (2001) 당원 축적 질환 제II형: 산 알파-글루코시다아제(산 말타아제) 결핍(Glycogen Storage Disease Type II: Acid Alpha-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency), in Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8th Ed., New York: McGraw-Hill, 3389-3420).
다논병(당원 축적 질환 제IIb형 또는 정상 산 말타아제를 가진 당원 축적 질환)은 심각한 심근병증 및 다양한 정도의 근육 약화에 의해 임상적으로 특징지어지며 종종 지적지능 결핍과 관련되는, 근본적으로 다논 등에 의해 설명되는 대사 장애이다. 질환의 병리학적 특징은 골격 및 심장 근육 세포에 자가소화 물질(autophagic material) 및 당원을 함유하는 세포질내 액포(intracytoplasmic vacuoles)이다. 질환은 고전적으로 10살 넘는 남성에서 나타난다. 임상적 양상(clinical picture)은 남성 여성 모두에서 심각할 수 있으나, 발병은 일반적으로 여성에서 더 늦게 나타난다. 질환은 X-연관 열성 형질(X-linked recessive trait)로서 전송(transmit)되고 Xq24에 편재된 LAMP2 유전자에서 변이에 의해 일어난다. LAMP2 단백질은 리소좀 멤브레인의 필수적 성분이고 오토파고솜-리소좀 융합에서 역을 하는 것으로 나타난다. 생물학적 진단은 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)상 큰 액포(당원과 세포질 퇴화(cytoplasmic degradation)의 생성물로 채워진) 및 LAMP-2 단백질의 부재를 보여주는 근육 생검(muscle biopsies)과 조합하여 정상 또는 높은 산 말타아제 활성의 증명을 중심으로 다루어진다. 진단은 LAMP2 유전자의 분자 분석에 의해 확인될 수 있다. 감별 진단(differential diagnosis)은 과도한 자식작용(autophagia)(XMEA) 및 폼페병과 함께 X-연관 근질환(myopathy)을 포함해야 한다. 이 질환에 대한 특이적 치료는 없다. 대증 요법(Symptomatic treatment)은 심장의 징후(cardiac manifestations)에 대해 요구되며 환자는 심장 이식을 요구할 수도 있다. 환자는 초기 성인기동안 부정맥으로 인해 돌연사의 위험이 있다(Nishino I, Fu J, Tanji K, Yamada T, Shimojo S, Koori T, Mora M, Riggs JE, Oh SJ, Koga Y, Sue CM, Yamamoto A, Murakami N, Shanske S, Byrne E, Bonilla E, Nonaka I, DiMauro S, Hirano M. 일차 LAMP-2 결핍은 X-연관 액포 심근증 및 근질환(다논병)을 유발한다(Primary LAMP-2 deficiency causes X-linked vacuolar cardiomyopathy and myopathy (Danon disease). Nature. 2000 Aug 24;406(6798):906-10; Sugie K, Yamamoto A, Murayama K, Oh SJ, Takahashi M, Mora M, Riggs JE, Colomer J, Iturriaga C, Meloni A, Lamperti C, Saitoh S, Byrne E, DiMauro S, Nonaka I, Hirano M, Nishino I. 임상유전적으로 확인된 다논병의 병리학적 태양(Clinicopathological features of genetically confirmed Danon disease). Neurology. 2002 Jun 25;58(12):1773-8).
전사 인자 EB
전사 인자 EB(TFEB)는 bHLH-류신 지퍼 전사 인자. TFEB는 리소좀 생체내합성(biogenesis)에 수반되는 유전자 그룹에 대한 마스터 조절자이다[배위된 리소좀 발현 및 조절 네트워크(Coordinated Lysosomal Expression and Regulation(CLEAR) network)](Sardiello et al . (2009) "리소좀 생체내합성 및 기능을 조절하는 유전자 네트워크(A gene network regulating lysosomal biogenesis and function)", Science 325(5939):473-7; Palmieri et al . (2011) "CLEAR 네크워크의 특징은 세포 정리 경로의 통합된 제어를 드러낸다(Characterization of the CLEAR network reveals an integrated control of cellular clearance pathway)", Hum Mol Genet. 20(19):3852-66). 게다가, TFEB는 자가소화 경로를 따라서 복수 유전자의 발현을 조절하여 오토파고솜의 생체내합성을 조절한다(Settembre and Ballabio (2011) "TFEB는 오토파지를 조절한다: 세포 분해 및 재생 공정의 통합된 조정(TFEB regulates autophagy: an integrated coordination of cellular degradation and recycling processes)", Autophagy 7(11):1379-81; Settembre et al. (2011) "TFEB는 리소좀 생체내공학에 오토파지를 연결한다(TFEB links autophagy to lysosomal biogenesis)", Science 332(6036):1429-33).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
인간( HUMAN ) TFEB, NCBI GeneID = 7942; nt = NM_007162.2, 단백질 = NP_009093.1 (aa. 1-476)
CCAGCAGGTGGTGAAGCAGGAGCTGCCTAGCGAAGAGGGCCCAGGGGAGGCCCTGATGCTGGGGGCTGAGGTCCCTGACCCTGAGCCACTGCCAGCTCTGCCCCCGCAAGCCCCGCTGCCCCTGCCCACCCAGCCACCATCCCCATTCCATCACCTGGACTTCAGCCACAGCCTGAGCTTTGGGGGCAGGGAGGACGAGGGTCCCCCGGGCTACCCCGAACCCCTGGCGCCGGGGCATGGCTCCCCATTCCCCAGCCTGTCCAAGAAGGATCTGGACCTCATGCTCCTGGACGACTCACTGCTACCGCTGGCCTCTGATCCACTTCTGTCCACCATGTCCCCCGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGCGATGTGCTGTGAGAATTC(SEQ ID NO:1).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2로 나타낸 바와 같이 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
MASRIGLRMQLMREQAQQEEQRERMQQQAVMHYMQQQQQQQQQQLGGPPTPAINTPVHFQSPPPVPGEVLKVQSYLENPTSYHLQQSQHQKVREYLSETYGNKFAAHISPAQGSPKPPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMRLDDVLGYINPEMQMPNTLPLSSSHLNVYSSDPQVTASLVGVTSSSCPADLTQKRELTDAESRALAKERQKKDNHNLIERRRRFNINDRIKELGMLIPKANDLDVRWNKGTILKASVDYIRRMQKDLQKSRELENHSRRLEMTNKQLWLRIQELEMQARVHGLPTTSPSGMNMAELAQQVVKQELPSEEGPGEALMLGAEVPDPEPLPALPPQAPLPLPTQPPSPFHHLDFSHSLSFGGREDEGPPGYPEPLAPGHGSPFPSLSKKDLDLMLLDDSLLPLASDPLLSTMSPEASKASSRRSSFSMEEGDVL(SEQ ID NO:2).
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 실질적으로 상동 또는 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 적합한 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 상동이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 TFEB 유전자는 아미노산 치환, 삭제 및/또는 삽입을 함유하는 TFEB 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 적합한 TFEB 유전자는 인간의 야생형 TFEB 단백질의 S142 및/또는 S211에 상응하는 단백질에서 변이를 포함하는 TFEB 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특히, 적합한 TFEB 유전자는 S142A 및/또는 S211A 치환을 포함하는 TFEB 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
여기서 확립된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에에 대한 "퍼센트(%) 핵산 또는 아미노산 서열 동일성"은 필요하다면, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해서 서열의 정렬 및 갭(gap) 도입 후, 참조 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분률로서 정의된다. 이 기술분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열을 위한 BLASTN 및 아미노산 서열을 위한 BLASTP, 갭드(gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 사용 가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 그러한 프로그램들이 알트슐 등(Altschul et al.(1990)) "기본 로컬 배열 검색 툴(Basic local alignment search tool)", 제이. 몰. 바이올.(J. Mol . Biol . 215(3): 403-410); 알트슐 등(Altschul et al.), 효소학 방법(Methods in Enzymology ); 알트슐 등(Altschul et al.(1997)) 핵산 Res.(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); 바제바니스 등(Baxevanis et al.(1998)) 생물정보학: 유전자 및 단백질 분석의 실용 가이드(Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley); 및 마이세너 등(Misener et al .(eds.)), 생물정보학 방법 및 프로토콜(Bioinformatics Methods and Protocols )(분자 생물학 방법(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999.)에서 설명된다. 또한 동일한 서열을 확인하기 위해, 상기 언급된 프로그램들은 일반적으로 동일성의 정도의 지표를 제공한다.
TFEB 단백질의 상동 또는 유사체는 그러한 방법을 엮은 참고서에서 발견되는 것과 같은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 폴리펩티드 서열을 변경하기 위한 방법에 따라서 준비될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산의 보존적 치환은 하기 군내에서 아미노산들 사이에 만들어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 일부 구현예에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 만들어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특성들을 변경하지 않는 아미노산 치환을 말한다.
유전자 치료법
다양한 유전자 치료법 벡터들이 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 임의 혈청형의 아데노-부속 바이러스(AAV)가 사용될 수 있다. 본 발명의 소정 구현예에서 사용된 바이러스 벡터의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택된다(see, e.g., Gao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859; and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). 여기 열거된 것들 이외의 다른 혈청형이 사용될 수 있다. 게다가 위형 AAV 벡터도 여기서 설명된 방법에서 이용될 수 있다. 위형 AAV 벡터는 제2 AAV 혈청형의 캡시드에 하나의 AAV 혈청형의 게놈을 함유하는 것들이다; 예를 들면, AAV 벡터는 AAV2 캡시드 및 AAV1 게놈을 함유하고 AAV 벡터는 AAV5 캡시드 및 AAV2 게놈을 함유한다(Auricchio et al . (2001) Hum . Mol . Genet . 10(26):3075-81). 추가적인 예시적 AAV 벡터는 재조합 위형 AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7, AAV2/8 및 AAV2/9 혈청형 벡터이다. 그러한 벡터는 키메라 벡터로서도 알려져 있다. 예를 들면, AAV2/1 벡터는 캡시드 AAV1 및 역 말단 반복부위(ITR) AAV2를 가진다. 예시적 AAV2/9 벡터는 Medina et al . (2011) "Transcriptional activation of lysosomal exocytosis promotes cellular clearance", Dev . Cell 21(3):421-30에서 설명되고, 여기서 참조로서 통합된다.
전형적으로, AAV 벡터는 포유류에 대해 비병원성인 단일-가닥(ss) DNA 파보바이러스로부터 유래된다(Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129에서 검토됨). 간략하게, 재조합 AAV-기반 벡터는, 바이러스 DNA 복제, 팩키징(packaging) 및 통합(integration)을 개시하기 위해 사용되는 두 개의 플랭킹(flanking) 145-염기쌍(basepair(bp)) 역 말단 반복부위(inverted terminal repeats(ITRs))를 떠나, 제거되는 바이러스 게놈의 96%를 차지하는 rep 및 cap 바이러스 유전자를 가진다.
전형적으로, AAV 벡터는 전이유전자(즉, 여기서 설명된 TFEB 유전자) 및 약 4.5kb까지의 길이의 조절적 요소(regulatory elements)를 수용할 수 있다. 일부 구현예에서 전이유전자(즉, TFEB 유전자)는 조직 특이적 또는 유비쿼터스 프로모터와 같은 조절적 요소의 제어하에 있다. 일부 구현예에서, CMV 프로모터와 같은 유비쿼터스 프로모터는 TFEB 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 근육과 같은 조직 특이적 프로모터 또는 간 특이적 프로모터가 TFEB 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 제한되지 않는 실시예로서, 적합한 근육 특이적 프로모터는 인간 근육 크레아틴 키나아제(muscle creatine kinase(MCK)) 프로모터이고 적합한 간 특이적 프로모터는 포스포에놀피루브산 카복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)) 프로모터이다.
게다가, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, SV40, 네이키드 플라스미드 DNA 벡터 및 이 기술분야에서 알려진 다른 벡터가 본 발명에 따른 TFEB 유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
치료를 필요로 하는 대상에게 여기서 설명된 TFEB 유전자를 엔코딩하는 바이러스 벡터를 전달하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 적합한 전달 방법은 근육(골격근, 심장 근육, 횡경막 등), 간, 심장 및 신경계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 목표조직에 TFEB 유전자를 엔코딩하는 바이러스 벡터를 전달한다. 일부 구현예에서, TFEB 유전자를 엔코딩하는 바이러스 벡터는 정맥내 주사 또는 혈관내 주사를 통해서 전달될 수 있다. 전신 투여의 다른 경로는 동맥, 심장내, 복강내 및 피하를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서 바이러스 벡터는 근육 주사 또는 근육내 투여와 같은 국소 투여를 통해 전달될 수 있다.
폼페병의 치료
본 발명의 방법은 당원 축적 질환에 걸린(affected) 개인을 치료하는 데에, 특히 영아-, 청소년- 또는 성인-발병 폼페병에 걸린 개인에게 효과적이다. 여기서 사용된 용어 "치료(treat)" 또는 "처치(treatment)"는 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 하나 이상의 증상의 발병의 예방 또는 지연, 및/또는 질환의 하나 이상의 징후의 심각성 또는 빈도의 약화를 말한다. 예를 들면, 처치는 근육(예를 들면, 골격근 또는 심장 근육), 간, 심장, 신경계를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 영향을 받은 조직에서 당원 축적의 감소 또는 정리(clearance); 근육적 병리의 완화; 심장 상태(예를 들면, 폼페병에서 전형적으로 발견되는 확장종말기 및/또는 수축종말기 부피의 증가, 점진적 심근증의 감소, 완화 또는 예방) 또는 폐 기능(예를 들면, 울 때 기준 용량을 넘는 폐활량 증가 및/또는 우는 동안 산소 불포화도의 정상화)의 개선; 신경발달 및/또는 운동 기능의 개선(예를 들면, AIMS 점수 증가); 또는 이들 효과들의 임의의 조합을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 처치는 당원 정리의 개선, 특히 반대로 폼페병-부속 근육 병리 및/또는 심근증의 감소 또는 예방을 포함한다. 여기서 사용된 용어 "개선", "증가", 또는 "감소"는 여기서 사용된 처치의 개시에 앞서 동일한 개인의 측정치와 같은, 또는 여기서 사용된 처치의 부재시 통제된(control) 개인에서의 측정치(또는 다수의 통제된 개인들)와 같은, 기준 측정치에 대한 값을 나타낸다. "통제된 개인(control individual)"은 치료되는 개인(치료된 개인과 통제된 개인에서 질환의 단계는 비교할만한 것임을 보증하기 위해)과 대략 동일한 나이인 치료되는 개인으로서 폼페병(영아, 청소년 또는 성인-발병)의 동일 형태로 괴로워하는 개인이다.
치료되는 개인(또한 "환자" 또는 "대상"으로서 언급된)은 폼페병(즉, 영아-, 청소년-, 또는 성인-발병 폼페병)을 가지거나 또는 폼페병으로 발전할 잠재성을 가지는 개인(태아, 영아, 어린이, 청소년 또는 성인 인간)이다.
실시예
본 발명은 다음의 실시예들과 관련하여 더 잘 이해될 것이다. 그렇지만, 이들 실시예들은 오직 설명을 위한 목적이며 발명의 범위를 제한 것을 의미하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 기재된 구현예들의 다양한 변경 및 수정이 이 기술 분야의 통상의 기술자들에게 명백하며, 제한 없이 발명의 방법 및/또는 형태에 관련한 것들을 포함하는, 그러한 변경 및 수정이 발명의 정신 및 첨부된 청구항의 범위로부터 분리되지 않고 만들어질 것이다.
실시예 1. 아데노-부속 바이러스(Adeno-Associated Virus((AAV)) 벡터
이 실시예에서 실험들은 전사 인자 EB 유전자로 AAV 벡터의 클로닝 및 개발을 설명한다(도 1).
뮤린(murine) 전사 인자 EB를 위한 코딩 서열, Tcfeb 또는 mTFEB를 EGFP 서열(NotI-HindIII)을 대체하여 pAAV2.1-CMV-EGFP 플라스미드 내로 클론하고 3x FLAG 태그로 프레임내에 융합시켰다.
mTFEB 서열(SEQ ID NO: 5):
CATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAGAAGTCCCGGGAGCTGGAGAACCACTCCCGGCGCCTGGAGATGACTAACAAGCAGCTCTGGCTCCGCATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCACGCGTGCACGGCCTCCCCACCACCTCGCCGTCGGGTGTGAATATGGCCGAGCTGGCCCAGCAGGTGGTGAAGCAAGAGTTGCCCAGTGAGGATGGCCCAGGGGAGGCGCTGATGCTGGGGCCTGAGGTCCCTGAGCCTGAGCAAATGCCGGCTCTTCCTCCCCAGGCTCCGCTGCCCTCGGCCGCCCAGCCACAGTCTCCGTTCCATCACCTGGACTTCAGCCATGGCCTGAGCTTTGGGGGTGGGGGCGACGAGGGGCCCACAGGTTACCCCGATACCCTGGGGACAGAGCACGGCTCCCCATTCCCCAACCTGTCCAAGAAGGATCTGGACTTAATGCTCCTAGATGACTCCCTGCTCCCCCTGGCCTCTGACCCCCTCTTTTCTACCATGTCTCCTGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGTGATGTTCT
pAAV2.1 CMV-mTFEB 플라스미드의 서열(SEQ ID NO: 6):
GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
그런 후, 얻어진 pAd-Helper 및 pAA2.1-CMV-mTFEB-FLAG를 플라스미드를 싸는 pack2/1 또는 pack2/9로 함께 서브-컨플루언트 293 세포에서 3배(triple) 트랜스펙션했다(Gao G. et al. J Virol. 2004, 78(12):6381-8.). 재조합 AAV2/1 또는 AAV2/9 벡터를 CsCl로 2회 정제했다.
게놈 카피(GC/mL)로서 발현되는 벡터 역가는 TaqMan(Gao, G 2000)(Perkin-Elmer, Life and Analytical Sciences, Waltham, MA)을 사용하여 PCR 수량화 및 오리치오 등(Auricchio et al . (2001) Hum . Mol . Genet . 10(26):3075-81)에서 설명된 바와 같은 도트 블롯 분석에 의해 평가했다.
본 발명에서 AAV2.1은 TFEB를 코딩하는 플라스미드를 나타낸고 AAV2/1 또는 AAV2/9는 혈청형 1 또는 9 캡시드로 구성하는 TFEB를 함유하는 바이러스를 나타낸다.
실시예
2.
TFEB
과발현 및
PD
병리의 완화
이 실시예의 실험은 AAV2/1-CMV-mTFEB의 근육내 주사에 의한 TFEB 과발현이 축적 당원의 정리를 야기하고 폼페병 모델에서 근육 병리의 완화를 입증한다.
3'ITR에서 5'ITR pAAV2.1 CMV-mTFEB 플라스미드의 서열(SEQ ID NO: 7):
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAG[GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG]GTGTCCAGGCGGCCGCCATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAGAAGTCCCGGGAGCTGGAGAACCACTCCCGGCGCCTGGAGATGACTAACAAGCAGCTCTGGCTCCGCATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCACGCGTGCACGGCCTCCCCACCACCTCGCCGTCGGGTGTGAATATGGCCGAGCTGGCCCAGCAGGTGGTGAAGCAAGAGTTGCCCAGTGAGGATGGCCCAGGGGAGGCGCTGATGCTGGGGCCTGAGGTCCCTGAGCCTGAGCAAATGCCGGCTCTTCCTCCCCAGGCTCCGCTGCCCTCGGCCGCCCAGCCACAGTCTCCGTTCCATCACCTGGACTTCAGCCATGGCCTGAGCTTTGGGGGTGGGGGCGACGAGGGGCCCACAGGTTACCCCGATACCCTGGGGACAGAGCACGGCTCCCCATTCCCCAACCTGTCCAAGAAGGATCTGGACTTAATGCTCCTAGATGACTCCCTGCTCCCCCTGGCCTCTGACCCCCTCTTTTCTACCATGTCTCCTGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGTGA(TGTTCTGGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAG)TGAAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
볼드체( bold ) 뉴클레오티드 : 3' ITR 및 5' ITR 서열
이탤릭체 뉴클레오티드:
CMV
프로모터 서열
브래킷[..] 내 뉴클레오티드: SV40 인트론 서열
밑줄친 뉴클레오티드: mTFEB 서열
괄호(..) 내 뉴클레오티드: FLAG 서열
볼드체의 밑줄친 뉴클레오티드: WPRE 서열
이중 밑줄 뉴클레오티드: BGH polyA 서열
1개월령 GAA-/- 쥐에 단일 근육, 즉 오른쪽 비복근의 세 부위에 AAV2/1-CMV-mTFEB 벡터를 직접 근육내 주사를 주었다. 통제군으로서, 쥐의 반대측 근육 내로 AAV2/1-EGFP 벡터 또는 부형제 PBS(인산 완충 생리식염수) 단독으로 주사를 주었다. 동물들을 벡터의 최대 지속된 발현이 되도록 주사 후 45일 후에 희생시키고, 그들의 분석했다.
실시간 (RT)_PCR로 분석된 TFEB 발현의 평균 레벨이 통제군에 비해 AAV2/1-CMV-mTFEB-주사된 근육에서 10배 높아졌다. 야생형 쥐의 당원 레벨(당원 2.01±0.70㎍/단백질 mg)에 비해 통제하에 치료된 쥐의 근육의 당원 레벨(당원 15.48±1.80㎍/단백질 mg)이 증가했다. 반대로, TFEB로 치료된 쥐의 비복근 근육에서 당원 레벨은 병리학적 당원 축적의 거의-완벽한 정리를 나타내면서, 상당하게 감소했다(당원 2.8±0.88㎍/단백질 mg, p=0.0001). 예시적 결과를 도 2A에 나타낸다.
TFEB 과발현은 또한 PD 근육의 전형적인 병리의 감쇠를 가져왔다. 근육에 주사된 TFEB의 PAS 염색은 도 2B에 나타낸 바와 같이 리소좀 당원 축적(글리코제노시스)에 상응하는 반점 염색의 감소를 보여주고 또한 도 2C에 나타낸 바와 같이 LAMP1 액포의 감소를 보여준다.
EM 분석을 TFEB 과발현으로 유도된 초미세구조적 변화를 결정하기 위해 치료된 그리고 미치료된 비복근에 대해 수행했다. 미치료된 근육에서 초미세구조 분석은 도 3A에서 별표에 의해 표시된 바와 같이 당원으로 조밀하게 채워진 복수의 큰 리소좀-비슷한 구조의 존재에 기인하는 수축 장치(contractile apparatus)의 강한 붕괴와 함께 전형적인 PD의 비정상성을 보여준다.
TFEB 과발현은 근육 섬유 미세구조의 상당한 개선을 가져온다. 얇은 단편(sections)에서 검출된 당원-함유 리소좀의 크기 및 수의 명백한 감소가 도 3B에 나타낸 것처럼 관찰되었으며, 도 3C 및 3D에서 나타낸 바와 같이 형태계측학적 분석(morphometric analysis)에 의해 지지된다. 도 3E에서 별표로 표시한 것처럼, 전자-조밀 당원 입자로 싼 큰 리소좀-비슷한 소기관이 미치료된 섬유에서 보였으며, 도 3F에서 별표로 표시된 바와 같이 TFEB-치료된 근육의 내부에서 당원이 상당히 성긴 조직을 보여주었다.
당원-함유 소기관에 아주 근접하여 오토파고솜의 증가된 수가 또한 도 3F에서 검은 화살표로 나타낸 것처럼 관찰되었다. 중요하게, 일부 오토파고솜은 또한 아마도 시토졸(cytosol)에서 직접 유래된 당원 입자를 함유했다. 게다가, 리소좀 구조는 자주 도 3F에서 흰 화살표로 나타낸 바와 같이, 이웃하는 오토파고솜과 그들의 융합 활성을 나타내는, 그들의 루멘에서 다른 세포내 소기관의 나머지를 함유했다. TFEB-치료된 근육에서 리소좀 구조를 옆에 배치하는(flanking) 오토파고솜 수의 증가가 도 3G에서 나타낸 바와 같이 형태계측학적 분석에 의해 확인되었다. 따라서, 미세구조 분석은 당원 축적 감소 및 당원-함유 리소좀의 수 및 크기의 감소는 오토파지의 활성화 및 리소좀과 오토파고솜의 융합의 자극에 의해 매개되었다.
전체적으로, 이 실험에서 데이터는 근육내 주사에 의해 TFEB 과발현이 당원 축적 및 형태학적 비정상을 상당히 구제할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예
3.
AAV
/29-
CMV
-
mTFEB
는 당원 축적의 감소를 야기한다.
발명자들은 PD(Gaa-/-) 쥐에 mTFEB 전신 투여의 효과를 시험했다. 6개월령 Gaa-/- 쥐에 레트로-오비탈 투여를 통해 AAV2/9-CMV-mTFEB 벡터 1×1012 gc/쥐를 주사했다.
동물들이 2.5달의 나이일 때 행동기능 검사(와이어 매달리기, 스틸 매달리기, 로타로드)로 시험하고, 근육(비복근) 내 TFEB 발현 레벨 및 당원 함량을 측정하기 위해 희생시켰다.
모든 행동기능 검사에서, AAV2/9-CMV-mTFEB-치료 및 미치료된 동물 모두 야생형 동물에 비해 손상된 수행 능력을 보여주었다(도 4). 그렇지만, TFEB-치료된 동물은 미치료된 동물에 비해 쥐의 운동 활성(mice locomotor activity)에서 TFEB 과발현의 유용한 효과를 제시하는, 개선된 수행 능력을 나타내는 경향을 보여주었다.
실시간 PCR에 의해 분석된 TFEB의 발현 레벨을 치료된 쥐의 간과 비복근에서 평가했다. 분석은 TFEB-치료된 쥐에서 그들의 상대 통제군에 비해 간에서 대략 4배(3.97+0.27), 비복근에서 대락 2배(1.72+0.32) 증가를 보였다(도 5).
TFEB-치료된 동물의 비복근에서 발명자들은 미치료된 동물에 비해 감소된 당원 레벨(도 6)을 관찰했다. 이들 결과는 AAV2/9-CMV-mTFEB의 전신 투여 후 TFEB 과발현이 근육내 주사로 치료된 동물에서 관찰되는 것처럼, 기질 축적의 개선된 정리를 야기한다.
재료 및 방법
동물(Animals)
Gaa 유전자 엑손(exon) 6내로 네오(neo) 삽입하여 얻어진 GAA-/- 쥐(KO PD 쥐 모델)[Raben et al., 1998]를 찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories (Wilmington, MA))로부터 샀다. 동물 연구를, 실험 목적을 위해 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 연합 지침(European Union Directive) 86/609에 따라서 수행했다. 쥐에 대한 모든 절차는 신체적 불편, 정신적 고통, 통증 및 상처의 최소화를 보증하기 위한 목적하에 수행했다. 쥐를 애버틴 마취에 이어 자궁 전위에 의해 안락사시켰다.
AAV-TFEB의 근육내 주사
여섯 마리의 1개월령 GAA-/- 쥐에 100-㎕ 해밀튼 시린지를 사용하여 오른쪽 비복근 근육(각각 30㎕의 3 주사)의 3개의 다른 부위에 AAV2/1-CMV-mTFEB 벡터 제제 1011 GC/근육을 총 용량으로 주사했다. AAV2/1-CMV-EGFP 동등 용량 또는 동일 부피의 PBS를 비교를 위해 반대측 근육내로 주사했다. 동물을 주사 후 45일째 희생시키고, PBS로 관류하고, 그들의 근육을 모아서 분석했다. 비복근을 분리하고 생화학적 분석, 광현미경 및 면역형광현미경을 위한 샘플, 전자현미경(EM)을 위한 샘플을 얻었다. TFEB의 발현 레벨을 RT-PCR로 시험했다.
AAV-TFEB의 전신 주사
6개월령 Gaa-/- 쥐에 레트로-오비탈 투여를 통해 AAV2/9 CMV-mTFEB 벡터 1×1012 GC/쥐를 주사했다. AAv2/9 CMV-dGFP의 동등 용량 또는 PBS 동일 부피를 단독으로 대조군으로서 전신 투여로 주사했다. 동물들을 주사 후 45일째에 희생시키고, 그들의 기관을 수집했다. 생물화학적 분석, 광 및 면역형광 현미경을 위해, 그리고 전자 현미경(EM)을 위한 샘플을 얻었다. TFEB 발현 레벨을 RT-PCR로 시험했다.
근육에서 당원 분석
근육내 당원 농도를 분자 유전학 및 대사(Molecular Genetics and Metabolism, Vol. 80, No. 1-2: 159-169)에서 설명된 바와 같은 아스퍼질러스 니거 아밀로글루코시다아제(Aspergillus niger amyloglucosidase)로 소화 후 끓여진 조직 균질액(homogenate)로부터 방출된 포도당의 양을 측정하여 또는 상업적 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 분석했다.
H2O 중에서 조직의 균질화로 준비된 조직 용해물(lysates)을 90℃에서 10분간 열 변성시키고 4℃에서 10분간 원심분리했다. 상등액을 37℃에서 1시간 동안 800 U/mL 아밀로글루코시다아제 10μL와 같이 또는 없이 중복 배양하였다. 반응을 10분간 99℃에서 열 불활성화로 정지시켰다. 동일 조건에서 가수분해된 소 간에서 얻은 당원(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 표준 곡선을 생성하기 위해 사용했다. 샘플을 원심분리하고 상등액 내 포도당 레벨을 제조자의 지시서에 따라서 포도당 분석 시약(Glucose Assay Reagent(Sigma-Aldrich))을 사용하여 결정했다.
단백질 레벨을 바이오라드 프로테인 분석 키트(Biorad Protein Assay Kit)를 사용하여 제조자의 지시서에 따라서 용해물에서 측정했다. 데이터를 당원 마이크로그램/단백질 밀리글램(당원 mg/단백질 mg)으로 표현했다.
근육의 과요오드산 쉬프(PAS) 염색 및 LAMP1의 면역형광 분석
조직을 10% 포르말린에서 고정하고 파라핀에 임베드시켰다. 크리오스탯 단편(Cryostat sections)을 얻고 표준방법으로 HE 및 과요오드산-쉬프(PAS)로 염색했다. LAMP1의 면역형광 분석을 위해 조직을 4% PFA에서 24시간 동안 4 ℃에서 고정하고 파라핀(Sigma-Aldrich)에 임베드시키고, 70-100% 에탄올 구배로 탈수하고 일련의 7mm 단편을 얻었다. 면역형광 분석에 앞서 세템브레 등(Settembre et al . (2007) "복수의 설파타아제 결핍 쥐에서의 전신성 염증 및 신경퇴행(Systemic inflammation and neurodegeneration in a mouse model of multiple sulfatase deficiency)", PNAS 104:4506-11)에 설명된 바와 같이 수행했다.
일련의 단편을 파라핀을 제거하기 위해 크실렌으로 처리하고, 재수화시키고, 항원 회수(antigen retrieval)를 위해 15분 동안 마이크로파 오븐에서 0.05mol/L 글리신-HCL(pH 3.5)로 처리했다. 시료를 특이적 일차 항체로 밤새 배양 전에 블록킹 용액(PBS, 0.2% 트윈-20)과 10% 정상 세럼(Sigma-Aldrich)으로 1시간 동안 배양했다. 사용된 항체는 LAMP1(토끼 폴리클로날 1:300; Sigma) 및 FLAG M2(쥐 모노클로날 1:300; Sigma)였다. 세정 후, 단편을 몰레큘러 프로브(Molecular Probes)(Invitrogen, CA, USA)에서 구입한 2차 항체로 40분 동안 배양했다. 염색된 단편을 이어서 DAPI(Vector Laboratories, CA, USA)와 같이 벡타쉴드(Vectashield)로 고정(mount)시켰다. 이미지를 엑시오 캠 엠알(AxioCam MR) 카메라와 통합된 형광 현미경 찌이스(Zeiss(Thornwood, NY)) 엑시오플랜(Axioplan) 2를 이용하여 얻었다.
전자 현미경
근육 조직의 작은 조각들을 AAV-TFEB(도 3B 및 3F) 또는 통제군 AAV-EGFP(도 3A 및 3E)를 주사한 GAA-/- 쥐에서 절개하고, 0.2M HEPES 버퍼 중 1% 글루타르알데히드에 고정시키고, 우라닐아세테이트에서 그리고 OsO4에서 후-고정시켰다. 에탄올 및 프로필렌옥사이드의 차등화된 시리즈를 통해 탈수 후, 세포를 에폭시 수지(Epon 812, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 임베드시키고 72시간 동안 60℃에서 중합시켰다. 각 샘플로부터 얇은 단편을 레이카 EM UC6 울트라마이크로톰(Leica Mycosystems, Vienna, Austria)으로 잘라냈다. EM 이미지를 벨레타(VELETTA) CCD 디지털 카메라(Soft Imaging Systems GmbH, Munster, Germany)가 장착된 FEI 테크나이(Tecnai)-12 전자 현미경을 사용하여 얇은 단편으로부터 얻었다. 리소좀-비슷한 소기관의 수 및 그들의 치수뿐만 아니라 오토파고솜의 수의 수량화를 다른 섬유를 함유하는 얇은 단편을 통해 랜덤하게 분포된 50필드(5㎛2 치수)에서 iTEM 소프트웨어(Soft Imaging Systems GmbH, Munster, Germany)를 이용하여 수행했다.
윌콕슨 순위 합 검정(Wilcoxon rank sum test)을 메디안 값 비교를 위해 사용했다. 모든 통계학적 분석을 위해, 스튜던트 t-검정(Student's t-test) 및 95% 신뢰 인터바스(confidence intervas)(에러바: 1.96*SE)를 엑셀에서 계산했다. 차이는 p<0.05에서 유의한 것으로 하였다.
실시간(real-time(RT))-PCR로 분석된 TFEB 발현
조직에서 TFEB 발현 레벨을 평가하기 위해, 전체 RNA를 알엔이지 키트(RNeasy kit) 퀴아젠(Qiagen (Hilden, Germany))을 사용하여 제조자의 지시서에 따라서 추출했다. RNA □g 하나를 수퍼스크립트 II 제1 스트랜드 합성 시스템(SuperScript II First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA))으로 상대적 cDNA를 준비하기 위해 사용했다. 실시간 PCR을 라이트사이클러 480 기기(LightCycler 480 instrument (Roche, Basel, Switzerland))에서 SYBR-그린 PCR 마스터 믹스(SYBR-green PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA))를 사용하여 수행하고 데이터를 DDCt. TFEB Fw 프라이머: 5'-gcagaagaaagacaatcacaacc-3'(SEQ ID NO: 8); TFEB Rv 프라이머: 5'-gccttggggatcagcatt-3'(SEQ ID NO: 9)로서 나타냈다.
행동기능 분석
행동기능 절차를 위해 치료된 그리고 미치료된 쥐가 공표된 절차(Raben N. et al, J Biol Chem. 1998, 273(30):19086-92.; Sidman RL et al, J Neuropathol Exp Neurol. 2008, 67(8):803-18))에 따라서 다음 시험에 들어갔다: 와이어 매달리기, 스틸 매달리기 및 로타로드 시험.
참조문헌의 통합
이 명세서에서 인용된 모든 공개 및 특허 문헌은 각 개별 공개 또는 특허 문헌이 여기서 통합된 것처럼 동일 정도로 그 전체가 참조로서 통합된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Fondazione Telethon
<120> GENE THERAPY FOR GLYCOGEN STORAGE DISEASES
<130> PCT 121583
<150> US 61/715,187
<151> 2012-10-17
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcgtcac gcatagggtt gcgcatgcag ctcatgcggg agcaggcgca gcaggaggag 60
cagcgggagc gcatgcagca acaggctgtc atgcattaca tgcagcagca gcagcagcag 120
caacagcagc agctcggagg gccgcccacc ccggccatca atacccccgt ccacttccag 180
tcgccaccac ctgtgcctgg ggaggtgttg aaggtgcagt cctacctgga gaatcccaca 240
tcctaccatc tgcagcagtc gcagcatcag aaggtgcggg agtacctgtc cgagacctat 300
gggaacaagt ttgctgccca catcagccca gcccagggct ctccgaaacc cccaccagcc 360
gcctccccag gggtgcgagc tggacacgtg ctgtcctcct ccgctggcaa cagtgctccc 420
aatagcccca tggccatgct gcacattggc tccaaccctg agagggagtt ggatgatgtc 480
attgacaaca ttatgcgtct ggacgatgtc cttggctaca tcaatcctga aatgcagatg 540
cccaacacgc tacccctgtc cagcagccac ctgaatgtgt acagcagcga cccccaggtc 600
acagcctccc tggtgggcgt caccagcagc tcctgccctg cggacctgac ccagaagcga 660
gagctcacag atgctgagag cagggccctg gccaaggagc ggcagaagaa agacaatcac 720
aacttaattg aaaggagacg aaggttcaac atcaatgacc gcatcaagga gttgggaatg 780
ctgatcccca aggccaatga cctggacgtg cgctggaaca agggcaccat cctcaaggcc 840
tctgtggatt acatccggag gatgcagaag gacctgcaaa agtccaggga gctggagaac 900
cactctcgcc gcctggagat gaccaacaag cagctctggc tccgtatcca ggagctggag 960
atgcaggctc gagtgcacgg cctccctacc acctccccgt ccggcatgaa catggctgag 1020
ctggcccagc aggtggtgaa gcaggagctg cctagcgaag agggcccagg ggaggccctg 1080
atgctggggg ctgaggtccc tgaccctgag ccactgccag ctctgccccc gcaagccccg 1140
ctgcccctgc ccacccagcc accatcccca ttccatcacc tggacttcag ccacagcctg 1200
agctttgggg gcagggagga cgagggtccc ccgggctacc ccgaacccct ggcgccgggg 1260
catggctccc cattccccag cctgtccaag aaggatctgg acctcatgct cctggacgac 1320
tcactgctac cgctggcctc tgatccactt ctgtccacca tgtcccccga ggcctccaag 1380
gccagcagcc gccggagcag cttcagcatg gaggagggcg atgtgctgtg agaattc 1437
<210> 2
<211> 476
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Ser Arg Ile Gly Leu Arg Met Gln Leu Met Arg Glu Gln Ala
1 5 10 15
Gln Gln Glu Glu Gln Arg Glu Arg Met Gln Gln Gln Ala Val Met His
20 25 30
Tyr Met Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gly Gly Pro
35 40 45
Pro Thr Pro Ala Ile Asn Thr Pro Val His Phe Gln Ser Pro Pro Pro
50 55 60
Val Pro Gly Glu Val Leu Lys Val Gln Ser Tyr Leu Glu Asn Pro Thr
65 70 75 80
Ser Tyr His Leu Gln Gln Ser Gln His Gln Lys Val Arg Glu Tyr Leu
85 90 95
Ser Glu Thr Tyr Gly Asn Lys Phe Ala Ala His Ile Ser Pro Ala Gln
100 105 110
Gly Ser Pro Lys Pro Pro Pro Ala Ala Ser Pro Gly Val Arg Ala Gly
115 120 125
His Val Leu Ser Ser Ser Ala Gly Asn Ser Ala Pro Asn Ser Pro Met
130 135 140
Ala Met Leu His Ile Gly Ser Asn Pro Glu Arg Glu Leu Asp Asp Val
145 150 155 160
Ile Asp Asn Ile Met Arg Leu Asp Asp Val Leu Gly Tyr Ile Asn Pro
165 170 175
Glu Met Gln Met Pro Asn Thr Leu Pro Leu Ser Ser Ser His Leu Asn
180 185 190
Val Tyr Ser Ser Asp Pro Gln Val Thr Ala Ser Leu Val Gly Val Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Cys Pro Ala Asp Leu Thr Gln Lys Arg Glu Leu Thr Asp
210 215 220
Ala Glu Ser Arg Ala Leu Ala Lys Glu Arg Gln Lys Lys Asp Asn His
225 230 235 240
Asn Leu Ile Glu Arg Arg Arg Arg Phe Asn Ile Asn Asp Arg Ile Lys
245 250 255
Glu Leu Gly Met Leu Ile Pro Lys Ala Asn Asp Leu Asp Val Arg Trp
260 265 270
Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys Ala Ser Val Asp Tyr Ile Arg Arg Met
275 280 285
Gln Lys Asp Leu Gln Lys Ser Arg Glu Leu Glu Asn His Ser Arg Arg
290 295 300
Leu Glu Met Thr Asn Lys Gln Leu Trp Leu Arg Ile Gln Glu Leu Glu
305 310 315 320
Met Gln Ala Arg Val His Gly Leu Pro Thr Thr Ser Pro Ser Gly Met
325 330 335
Asn Met Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Val Lys Gln Glu Leu Pro Ser
340 345 350
Glu Glu Gly Pro Gly Glu Ala Leu Met Leu Gly Ala Glu Val Pro Asp
355 360 365
Pro Glu Pro Leu Pro Ala Leu Pro Pro Gln Ala Pro Leu Pro Leu Pro
370 375 380
Thr Gln Pro Pro Ser Pro Phe His His Leu Asp Phe Ser His Ser Leu
385 390 395 400
Ser Phe Gly Gly Arg Glu Asp Glu Gly Pro Pro Gly Tyr Pro Glu Pro
405 410 415
Leu Ala Pro Gly His Gly Ser Pro Phe Pro Ser Leu Ser Lys Lys Asp
420 425 430
Leu Asp Leu Met Leu Leu Asp Asp Ser Leu Leu Pro Leu Ala Ser Asp
435 440 445
Pro Leu Leu Ser Thr Met Ser Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Arg
450 455 460
Arg Ser Ser Phe Ser Met Glu Glu Gly Asp Val Leu
465 470 475
<210> 3
<211> 1409
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctagcaatta gctagctggg aaagggctgg gccccatgta aatatttcta aagcacccct 60
ctcccctccc ccctcagatc aggagtctga gggagaggca cagaggctcc ctttctctaa 120
gccagtcctc acctgcctaa gaagatgtga aggagaccca ggagaccctg ggatagggag 180
gaactcagag ggaagggaca ttcttttctt cgtcgcaatc ctgggagctc cctggaggag 240
gagacccgat cagcctgcaa tcctggcgcg tcccaggagg agaaagcggc ttcctctata 300
ctgtactctc ctccacagaa cccccctctc agccctggaa gtccttgctc acagccgagg 360
cgccgagagc gcttgctctg cccagatctg cgcgagtctg gcgcccgcgc tctgaacggc 420
gtcgctgccc agcccccttc cccgggaggt gggagcggcc acccagggcc ccgtggctgc 480
ccttgtaagg aggcgaggcc cgaggacacc cgagacgccc ggttataatt aaccaggaca 540
cgtggcgaac ccccctccaa cacctgcccc cgaacccccc catacccagc gcctcgggtc 600
tcggcctttg cggcagagga gacagcaaag cgccctctaa aaataactcc tttcccggcg 660
accgagaccc tccctgtccc ccgcacagcg gaaatctccc agtggcaccg agggggcgag 720
ggttaagtgg gggggagggt gaccaccgcc tcccaccctt gccctgagtt tgaatctctc 780
caactcagcc agcctcagtt tcccctccac tcagtcccta ggaggaaggg gcgcccaagc 840
gcgggtttct ggggttagac tgccctccat tgcaattggt ccttctcccg gcctctgctt 900
cctccagctc acagggtatc tgctcctcct ggagccacac cttggttccc cgaggtgccg 960
ctgggactcg ggtaggggtg agggcccagg gggcacaggg ggagccgagg gccacaggaa 1020
gggctggtgg ctgaaggaga ctcaggggcc aggggacggt ggcttctacg tgcttgggac 1080
gttcccagcc accgtcccat gttcccggcg gggggccagc tgtccccacc gccagcccaa 1140
ctcagcactt ggtcagggta tcagcttggt gggggggcgt gagcccagcc cctggggcgg 1200
ctcagcccat acaaggccat ggggctgggc gcaaagcatg cctgggttca gggtgggtat 1260
ggtgcgggag cagggaggtg agaggctcag ctgccctcca gaactcctcc ctggggacaa 1320
cccctcccag ccaatagcac agcctaggtc cccctatata aggccacggc tgctggccct 1380
tcctttgggt cagtgtcacc tcggccgcc 1409
<210> 4
<211> 2147
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ctttggggag tcctaagagg gcagctggca atggacacct agcagtccct ttgagactta 60
tttcagatgg agctgtagaa agatgccatg gctcacagtg cctccctggg aagggggcag 120
agggctgccc agtgaggcct cttgcgagca ggaaatcacc agagacaagg aaagaccaga 180
ccccaggatg acctcagtta ggccttgccc gactgtcctc agagtcccat tctctgtgtc 240
ctggttcttt tagaagatca tggacctcca ggtcatttcg taaccggaat ctgcctgcgg 300
ggggttttga caagctatgg tatagtgtat gtgggggtac tgacgaattg gaagatcatg 360
gagacccctt ctcctcctcc atcattggtc tgccacatcc ctcccaggcg actcacagca 420
gagagacctt ggatgtatgt agggtgcttt aaaactccag ctgagttaca gtctctcctt 480
tctgttttca ccttaacctt ccagggatgc aaacccacga caggtttagc agcagagtgg 540
aggctggcca tgaatctcag agaaagtgct cactggaaag gctggtttag cccaggcctg 600
atgtggaggc actgagctgg acgttctagc ggggttgaca cccaacagtt tacatagggg 660
gaggccaccc ctcctgagca gtctcggtga cttgaagagg aagccgcttc ttctgtacca 720
acacagaagc tccagcgaac ccccagaatg ctggcagtgt gggtgctatg taaaagtatt 780
tacatagctt tgtagagtga gccaagccca gtctgtttgg gatgactctt cacagtgcct 840
cgaatctgtc acacgtctta gtaagcagag tcacagagtt tctgtcacat catcctcctg 900
cctacaggga agtaggccat gtccctgccc cctactctga gcccagctgt gggagccagc 960
cctgcccaat gggctctctc tgattggctt ctcactcact tctaaactcc agtgagcaac 1020
ttctctcggc tcgttcaatt ggcgtgaagg tctgtgtctt gcagagaagg ttcttcacaa 1080
ctgggataaa ggtctcgctg ctcaagtgta gcccagtaga actgccaagc cccttcccct 1140
cctctcccta gactcttgga tgcaagaaga atccaggcag ctccaagggt gattgtgtcc 1200
aacctagaat gtcttgaaaa agacattaag gggactagag aagacagggg atccaacggt 1260
tctctgcagc ccagcctgac tgacatgtaa ctcttctggt tctcaccagc cagctggacc 1320
tgcttagtat tctttctgcc tcagtttccc agcctgtacc cagggctgtc atagttccat 1380
ttcaggcagt agtaatgaat gagctgacat aaaacattta gagcaggggt cagtatgtat 1440
atagagtgat tattctatat caggcattgc ctcctcggaa tgaagcttac aatcacccct 1500
ccctctgcag ttcatcttgg ggtggccaga ggatccagca gacacctagt ggggtaacac 1560
accccagcca actcggctgt tgcagacttt gtctagaagt ttcacgtctc agagctgaat 1620
tcccttctca tgacctttgg ccgtgggagt gacacctcac agctgtggtg ttttgacaac 1680
cagcagccac tggcacacaa aatgtgcagc cagcagcata tgaagtccaa gaggcgtccc 1740
ggccagccct gtccttgacc cccacctgac aattaaggca agagcctata gtttgcatca 1800
gcaacagtca cggtcaaagt ttagtcaatc aaacgttgtg taaggactca actatggctg 1860
acacgggggc ctgaggcctc ccaacattca ttaacaacag caagttcaat cattatctcc 1920
ccaaagttta ttgtgttagg tcagttccaa accgtgctga ccatggctat gatccaaagg 1980
ccggcccctt acgtcagagg cgagcctcca ggtccagctg aggggcaggg ctgtcctccc 2040
ttctgtatac tatttaaagc gaggagggct agctaccaag cacggttggc cttccctctg 2100
ggaacacacc cttggccaac aggggaaatc cggcgagacg ctctgag 2147
<210> 5
<211> 1601
<212> DNA
<213> Mus musculus
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atggctcagc tcgctcagtg gtcttgggca aatcccttct gcccggactc agtttctcct 60
tgtgcacaat gggagcaacc atacttatgc cagcctgtgc ttaaagacta cgaagatgat 120
gaatacttca tgggcctgtc tcccctcgac tacagggagc ccgaaccaac agctgccatg 180
gcgtcacgca tcgggctgcg catgcagctc atgcgggagc aggcccagca ggaggagcag 240
cgagagcgca tgcagcagca ggctgtcatg cattatatgc aacagcagca gcagcagcag 300
cagcagctgg gtgggccccc caccccagcc atcaacaccc ctgtccactt ccagtcgccc 360
ccgcctgtgc ccggggaggt gctgaaggtg cagtcctacc tggagaaccc cacctcctac 420
cacctgcaac agtcccagca tcagaaggtt cgggagtatc tgtctgagac ctatgggaac 480
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cccatggcca tgctacatat cagctccaac cccgagaaag agtttgatga tgtcattgac 660
aacattatgc gcctggacag cgtgctgggc tacatcaacc ctgagatgca gatgcctaac 720
acgctgcccc tgtctagcag ccacctgaac gtgtacagcg gtgaccccca ggtcacagcc 780
tccatggtgg gtgtcaccag cagctcctgc cctgccgacc tgactcagaa gcgagagcta 840
acagatgctg agagcagagc cctggccaag gagcggcaga agaaagacaa tcacaaccta 900
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gattacatcc ggaggatgca gaaggacctg cagaagtccc gggagctgga gaaccactcc 1080
cggcgcctgg agatgactaa caagcagctc tggctccgca tccaggagct ggagatgcag 1140
gcacgcgtgc acggcctccc caccacctcg ccgtcgggtg tgaatatggc cgagctggcc 1200
cagcaggtgg tgaagcaaga gttgcccagt gaggatggcc caggggaggc gctgatgctg 1260
gggcctgagg tccctgagcc tgagcaaatg ccggctcttc ctccccaggc tccgctgccc 1320
tcggccgccc agccacagtc tccgttccat cacctggact tcagccatgg cctgagcttt 1380
gggggtgggg gcgacgaggg gcccacaggt taccccgata ccctggggac agagcacggc 1440
tccccattcc ccaacctgtc caagaaggat ctggacttaa tgctcctaga tgactccctg 1500
ctccccctgg cctctgaccc cctcttttct accatgtctc ctgaggcctc caaggccagc 1560
agccgccgga gcagcttcag catggaggag ggtgatgttc t 1601
<210> 6
<211> 6468
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV2.1 CMV-mTFEB plasmid
<400> 6
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccagattta 240
attaaggctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 300
gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 360
catcactagg ggttccttgt agttaatgat taacccgcca tgctacttat ctacgtagcc 420
atgctctagg aagatcggaa ttcgccctta agctagctag ttattaatag taatcaatta 480
cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 540
gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 600
ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 660
ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 720
atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 780
cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 840
acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 900
acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 960
actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1020
gagctggttt agtgaaccgt cagatcctgc agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta 1080
agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt gtcgagacag 1140
agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca ctttgccttt 1200
ctctccacag gtgtccaggc ggccgcatgg ctcagctcgc tcagtggtct tgggcaaatc 1260
ccttctgccc ggactcagtt tctccttgtg cacaatggga gcaaccatac ttatgccagc 1320
ctgtgcttaa agactacgaa gatgatgaat acttcatggg cctgtctccc ctcgactaca 1380
gggagcccga accaacagct gccatggcgt cacgcatcgg gctgcgcatg cagctcatgc 1440
gggagcaggc ccagcaggag gagcagcgag agcgcatgca gcagcaggct gtcatgcatt 1500
atatgcaaca gcagcagcag cagcagcagc agctgggtgg gccccccacc ccagccatca 1560
acacccctgt ccacttccag tcgcccccgc ctgtgcccgg ggaggtgctg aaggtgcagt 1620
cctacctgga gaaccccacc tcctaccacc tgcaacagtc ccagcatcag aaggttcggg 1680
agtatctgtc tgagacctat gggaacaagt ttgctgccca cgtgagccca gcccaaggtt 1740
ccccgaagcc tgccccagca gcatccccag gggtgcgggc tggacacgta ctgtccacct 1800
cggccggcaa cagtgctccc aacagtccca tggccatgct acatatcagc tccaaccccg 1860
agaaagagtt tgatgatgtc attgacaaca ttatgcgcct ggacagcgtg ctgggctaca 1920
tcaaccctga gatgcagatg cctaacacgc tgcccctgtc tagcagccac ctgaacgtgt 1980
acagcggtga cccccaggtc acagcctcca tggtgggtgt caccagcagc tcctgccctg 2040
ccgacctgac tcagaagcga gagctaacag atgctgagag cagagccctg gccaaggagc 2100
ggcagaagaa agacaatcac aacctaattg agagaagacg caggttcaac atcaatgacc 2160
ggatcaagga gctgggaatg ctgatcccca aggccaacga cctggacgtg cgctggaaca 2220
aaggcaccat cctcaaggcc tctgtggatt acatccggag gatgcagaag gacctgcaga 2280
agtcccggga gctggagaac cactcccggc gcctggagat gactaacaag cagctctggc 2340
tccgcatcca ggagctggag atgcaggcac gcgtgcacgg cctccccacc acctcgccgt 2400
cgggtgtgaa tatggccgag ctggcccagc aggtggtgaa gcaagagttg cccagtgagg 2460
atggcccagg ggaggcgctg atgctggggc ctgaggtccc tgagcctgag caaatgccgg 2520
ctcttcctcc ccaggctccg ctgccctcgg ccgcccagcc acagtctccg ttccatcacc 2580
tggacttcag ccatggcctg agctttgggg gtgggggcga cgaggggccc acaggttacc 2640
ccgataccct ggggacagag cacggctccc cattccccaa cctgtccaag aaggatctgg 2700
acttaatgct cctagatgac tccctgctcc ccctggcctc tgaccccctc ttttctacca 2760
tgtctcctga ggcctccaag gccagcagcc gccggagcag cttcagcatg gaggagggtg 2820
atgttctggg atcccgggct gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca 2880
tcgactacaa ggatgacgat gacaagtagt gaaagcttgg atccaatcaa cctctggatt 2940
acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 3000
gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 3060
cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 3120
aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 3180
ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 3240
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 3300
ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct 3360
ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 3420
cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgagat ctgcctcgac 3480
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 3540
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 3600
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 3660
ggaagacaat agcaggcatg ctggggactc gagttaaggg cgaattcccg attaggatct 3720
tcctagagca tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 3780
ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 3840
gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 3900
gcagccttaa ttaacctaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 3960
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 4020
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 4080
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 4140
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 4200
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 4260
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 4320
catcgccccg atagacggtt tttcgccctt tgacgctgga gttcacgttc ctcaatagtg 4380
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 4440
aagggatttt tccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 4500
acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta taatttcagg tggcatcttt cggggaaatg 4560
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 4620
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 4680
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 4740
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 4800
tcgaactgga tctcaatagt ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 4860
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 4920
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 4980
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 5040
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 5100
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 5160
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagtaatgg 5220
taacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 5280
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 5340
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 5400
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 5460
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 5520
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 5580
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 5640
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 5700
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 5760
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 5820
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5880
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5940
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 6000
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 6060
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 6120
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 6180
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 6240
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6300
cggccttttt acggttcctg gccttttgct gcggttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 6360
tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 6420
gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaag 6468
<210> 7
<211> 3657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV2.1 CMV-mTFEB plasmid from 3'ITR to 5'ITR
<400> 7
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 240
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 300
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 360
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 420
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 480
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 540
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 600
tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 660
tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 720
cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg 780
tttagtgaac cgtcagatcc tgcagaagtt ggtcgtgagg cactgggcag gtaagtatca 840
aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac 900
tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 960
caggtgtcca ggcggccgca tggctcagct cgctcagtgg tcttgggcaa atcccttctg 1020
cccggactca gtttctcctt gtgcacaatg ggagcaacca tacttatgcc agcctgtgct 1080
taaagactac gaagatgatg aatacttcat gggcctgtct cccctcgact acagggagcc 1140
cgaaccaaca gctgccatgg cgtcacgcat cgggctgcgc atgcagctca tgcgggagca 1200
ggcccagcag gaggagcagc gagagcgcat gcagcagcag gctgtcatgc attatatgca 1260
acagcagcag cagcagcagc agcagctggg tgggcccccc accccagcca tcaacacccc 1320
tgtccacttc cagtcgcccc cgcctgtgcc cggggaggtg ctgaaggtgc agtcctacct 1380
ggagaacccc acctcctacc acctgcaaca gtcccagcat cagaaggttc gggagtatct 1440
gtctgagacc tatgggaaca agtttgctgc ccacgtgagc ccagcccaag gttccccgaa 1500
gcctgcccca gcagcatccc caggggtgcg ggctggacac gtactgtcca cctcggccgg 1560
caacagtgct cccaacagtc ccatggccat gctacatatc agctccaacc ccgagaaaga 1620
gtttgatgat gtcattgaca acattatgcg cctggacagc gtgctgggct acatcaaccc 1680
tgagatgcag atgcctaaca cgctgcccct gtctagcagc cacctgaacg tgtacagcgg 1740
tgacccccag gtcacagcct ccatggtggg tgtcaccagc agctcctgcc ctgccgacct 1800
gactcagaag cgagagctaa cagatgctga gagcagagcc ctggccaagg agcggcagaa 1860
gaaagacaat cacaacctaa ttgagagaag acgcaggttc aacatcaatg accggatcaa 1920
ggagctggga atgctgatcc ccaaggccaa cgacctggac gtgcgctgga acaaaggcac 1980
catcctcaag gcctctgtgg attacatccg gaggatgcag aaggacctgc agaagtcccg 2040
ggagctggag aaccactccc ggcgcctgga gatgactaac aagcagctct ggctccgcat 2100
ccaggagctg gagatgcagg cacgcgtgca cggcctcccc accacctcgc cgtcgggtgt 2160
gaatatggcc gagctggccc agcaggtggt gaagcaagag ttgcccagtg aggatggccc 2220
aggggaggcg ctgatgctgg ggcctgaggt ccctgagcct gagcaaatgc cggctcttcc 2280
tccccaggct ccgctgccct cggccgccca gccacagtct ccgttccatc acctggactt 2340
cagccatggc ctgagctttg ggggtggggg cgacgagggg cccacaggtt accccgatac 2400
cctggggaca gagcacggct ccccattccc caacctgtcc aagaaggatc tggacttaat 2460
gctcctagat gactccctgc tccccctggc ctctgacccc ctcttttcta ccatgtctcc 2520
tgaggcctcc aaggccagca gccgccggag cagcttcagc atggaggagg gtgatgttct 2580
gggatcccgg gctgactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgacta 2640
caaggatgac gatgacaagt agtgaaagct tggatccaat caacctctgg attacaaaat 2700
ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 2760
tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 2820
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 2880
cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 2940
tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 3000
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 3060
gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 3120
gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 3180
cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcga gatctgcctc gactgtgcct 3240
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 3300
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 3360
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 3420
aatagcaggc atgctgggga ctcgagttaa gggcgaattc ccgattagga tcttcctaga 3480
gcatggctac gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt 3540
gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa 3600
ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 3657
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 8
gcagaagaaa gacaatcaca acc 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 9
gccttgggga tcagcatt 18
Claims (72)
- f) 전사 전사 인자(transcription factor) EB(TFEB) 단백질, 오솔로그(ortholog), 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체(allelic variant) 및 그들의 절편(fragments);
g) TFEB 단백질, 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편을 포함하는 키메라 분자(chimeric molecule);
h) 상기 단백질 또는 오솔로그, 그들의 재조합체 또는 합성 또는 생명공학적 기능적 유도체, 그들의 대립형질 변이체 및 그들의 절편(fragments)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
i) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및
j) 상기 폴리펩티드를 발현하는 유전적으로 변형된(genetically engineered) 숙주 세포
로 이루어진 군에서 선택되는 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 화합물.
- 제1항에 있어서,
상기 근육, 간, 심장 및/또는 신경계에서 당원의 축적이 특징인 당원 축적 질환의 치료에서 사용을 위한 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 GSD 제Ia형(폰기에르케병(Von Gierke disease)), GSD 제I비-a형(type I non-a)(다양한 아형들), GSD 제II형(폼페병), GSD 제IIb형(다논병), GSD 제III형(코리병(Cori's disease) 또는 포르브스병(Forbes' disease)), GSD 제IV형(앤더슨병(Andersen disease)), GSD 제V형(맥카들병(McArdle disease)), GSD 제VI형(에르스병(Hers' disease)), GSD 제VII형(타루이병(Tarui's disease)), GSD 제IX형, GSD 제XI형(판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), GSD 제XII형(적혈구 알돌라아제 결핍증(Red cell aldolase deficiency)), GSD 제XIII형 및 GSD 제0타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 당원 축적 질환은 폼페병인 화합물.
- 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 당원 축적 질환은 다논병인 화합물.
- 축적된 당원을 함유하는 목표 조직으로 전달되는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
- 제6항에 있어서,
상기 목표 조직은 근육, 간, 심장 및/또는 신경계로부터 선택되는 화합물.
- 제7항에 있어서,
상기 목표 조직은 근육 및/또는 간인 화합물.
- 제8항에 있어서,
상기 근육은 골격근, 심근, 및/또는 횡경막(diaphragm)인 화합물.
- 전신투여로 전달되는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 전신투여는 정맥내 투여(intravenous administration)인 조성물.
- 국소 투여로 전달되는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
- 제12항에 있어서,
상기 국소 투여는 근육내 투여(intramuscular administration)인 화합물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 단백질이 SEQ ID NO:2와 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 단백질이 SEQ ID NO:2와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 단백질이 SEQ ID NO:2로구성되는 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 TFEB 단백질의 발현을 조절하는 조직 특이적 프로모터 서열을 포함하는 화합물.
- 제17항에 있어서,
상기 조직 특이적 프로모터 서열은 근육 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:3로 구성되는 MCK(muscle creatine kinase) 프로모터 서열인 화합물.
- 제17항에 있어서,
상기 조직 특이적 프로모터 서열은 간 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:4로 구성되는 PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 프로모터 서열인 화합물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1과 최소한 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1과 최소한 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터(viral vector), 플라스미드, 바이러스 입자(viral particles) 및 파지(phages)로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터인 화합물.
- 제23항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 부속 벡터(adeno associated vectors(AAV)) 및 네이키드 플라스미드 DNA 벡터(naked plasmid DNA vectors)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
- 제24항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
- 제25항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터인 화합물.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 키메라 및/또는 위형(pseudotyped) 벡터인 화합물.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분자의 전달은 근육 및/또는 간에서 당원 축적의 감소를 야기하는 것인 화합물.
- 제28항에 있어서,
상기 근육은 골격근인 화합물.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분자의 전달은 강도, 심각도(severity), 또는 빈도, 또는 발병이 지연되는 측면에서 근육 및/또는 간에서 당원 축적의 감소를 야기하는 것인 화합물.
- 약학적으로 수용가능한 첨가제 및 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에서 규정된 화합물을 포함하는 당원 축적 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 치료가 필요한 대상에게 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 전달하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법.
- 제32항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 근육, 간, 심장, 및/또는 신경계에서 당원의 축적이 특징인 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 GSD 제Ia형(폰기에르케병(Von Gierke disease)), GSD 제I비-a형(type I non-a)(다양한 아형들), GSD 제II형(폼페병), GSD 제IIb형(다논병), GSD 제III형(코리병(Cori's disease) 또는 포르브스병(Forbes' disease)), GSD 제IV형(앤더슨병(Andersen disease)), GSD 제V형(맥카들병(McArdle disease)), GSD 제VI형(에르스병(Hers' disease)), GSD 제VII형(타루이병(Tarui's disease)), GSD 제IX형, GSD 제XI형(판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), GSD 제XII형(적혈구 알돌라아제 결핍증(Red cell aldolase deficiency)), GSD 제XIII형 및 GSD 제0타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제32항, 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 당원 축적 질환은 폼페병인 방법.
- 제32항, 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 당원 축적 질환은 다논병인 방법.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 축적된 당원을 함유하는 목표 조직으로 전달되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서,
상기 목표 조직은 근육, 간, 심상 및/또는 신경계로부터 선택되는 방법.
- 제38항에 있어서,
상기 목표 조직은 근육 및/또는 간인 방법.
- 제39항에 있어서,
상기 근육은 골격근, 심근, 및/또는 횡경막인 방법.
- 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 전신 투여로 전달되는 방법.
- 제41항에 있어서,
상기 전신 투여는 정맥내 투여(intravenous administration)인 방법.
- 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 국소 투여로 전달되는 방법.
- 제43항에 있어서,
상기 국소 투여는 근육내 투여(intramuscular administration)인 방법.
- 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 바이러스 벡터인 방법.
- 제45항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터인 방법.
- 제46항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제47항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터인 방법.
- 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 키메라 및/또는 위형(pseudotyped) 벡터인 방법.
- 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 TFEB 유전자의 발현을 조절하는 조직 특이적 프로모터 서열을 포함하는 방법.
- 제50항에 있어서,
상기 조직 특이적 프로모터 서열은 근육 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:3로 구성되는 MCK 프로모터 서열인 방법.
- 제50항에 있어서,
상기 조직 특이적 프로모터 서열은 간 특이적 프로모터 서열, 바람직하게 SEQ ID NO:4로 구성되는 PEPCK 프로모터 서열인 방법.
- 제32항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 최소한 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1과 최소한 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:1로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 SEQ ID NO:2인 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제32항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산의 전달은 근육 및/또는 간에서 당원 축적의 감소를 야기하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서,
상기 핵산의 전달은 골격근에서 당원 축적의 감소를 야기하는 것인 방법.
- 치료가 필요한 대상에게 근육 및/또는 간에서 당원의 축적이 강도, 심각도(severity), 또는 빈도에서 감소되거나, 또는 발병(onset)이 지연되도록 전사 인자 EB(TFEB) 유전자를 엔코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 당원 축적 질환을 치료하는 방법.
- 제61항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 근육, 간, 심장, 및/또는 신경계에서 당원의 축적이 특징인 방법.
- 제62항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 GSD 제Ia형(폰기에르케병(Von Gierke disease)), GSD 제I비-a형(type I non-a)(다양한 아형들), GSD 제II형(폼페병), GSD 제IIb형(다논병), GSD 제III형(코리병(Cori's disease) 또는 포르브스병(Forbes' disease)), GSD 제IV형(앤더슨병(Andersen disease)), GSD 제V형(맥카들병(McArdle disease)), GSD 제VI형(에르스병(Hers' disease)), GSD 제VII형(타루이병(Tarui's disease)), GSD 제IX형, GSD 제XI형(판코니-비켈 증후군(Fanconi-Bickel syndrome)), GSD 제XII형(적혈구 알돌라아제 결핍증(Red cell aldolase deficiency)), GSD 제XIII형 및 GSD 제0타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제61항, 제62항 또는 제63항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 폼페병인 방법.
- 제61항, 제62항 또는 제63항에 있어서,
상기 당원 축적 질환은 다논병인 방법.
- 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 전신 투여되는 것인 방법.
- 제66항에 있어서,
상기 TFEB 유전자는 정맥내로 투여되는 것인 방법.
- 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 TFEB 유전자를 엔코딩하는 핵산은 근육내로 투여되는 것인 방법.
- 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 바이러스 벡터(viral vector), 플라스미드, 바이러스 입자(viral particles) 및 파지(phages)로 이루어진 군에서 선택되는 발현 벡터인 방법.
- 제69항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 부속 벡터(adeno associated vectors(AAV)) 및 네이키드 플라스미드 DNA 벡터(naked plasmid DNA vectors)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제70항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제71항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2 또는 AAV9 벡터인 방법.
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