KR20150009656A

KR20150009656A - 양막 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150009656A
Application number: KR20130083705A
Authority: KR
Inventors: 김성환; 김무현
Original assignee: 학교법인 동아학숙
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2015-01-27

Abstract

본 발명은 양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 양막 간엽줄기세포는 주화성(chemotactic), 세포 이동, 및 혈관생성(angiogenic properties)과 관련 유전자와 단백질을 지방 간엽줄기세포와 비교하여 높은 수준으로 발현분비하고, 심근 경색을 감소시키며, 혈관 밀집도를 유의하게 증가시키고, 다중 주변분비 인자(multiple paracrine factors)의 분비를 촉진하며, 좌심실 구출율(LVEF)을 유의하게 증가시킴으로써 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

양막 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물{COMPOSITIONS COMPRISING AMNIOTIC MESENCHYMAL STEM CELL FOR TREATING ISCHEMIC DISEASE}

본 발명은 양막 간엽줄기세포에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 양막 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

심혈관 질환은 서구 사회에서 중요한 사망원인으로 남아있다(Lloyd-Jones D, et al. Heart disease and stroke statistics. 2009, a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 2009;119:480-6). 심근경색(myocardial infarction, MI)은 직접적으로 심장 확장증(heart dilation)과 심부전(cardiac failure)에 이르며 종종 심각한 불구에 이른다. 심근경색의 치료에 관련된 외과수술 기술의 발전에도 불구하고, 손상된 심장 조직을 복구하는데 아직은 많은 어려움이 있다. 최근에 줄기세포이식이 심근경색 치료를 위하여 잠재력을 지닌 새로운 치료법으로서 제시되었다(Kamihata H, et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation 2001;104: 1046-52). 그러나, 호스트 조직(host tissue)에 이식된 줄기세포의 낮은 생존율과 교차분화 비율(trans-differentiation rate)은 중대한 제한사항으로 간주되므로, 충분한 치료 효과를 얻지 못하고 있는 실정이다(Shake JG, et al. Ann Thorac Surg 2002;73:1919-25/ Cho HJ, et al. J Exp Med 2007;204:3257-69/ Byun KH, Kim SW. Korean Circ J 2009;39:87-92/ Kang HJ, et al. Korean Circ J 2012;42:390-6).

한편, 케모카인(chemokine)은 헤파린 결합 펩타이드(heparin-binding peptide)의 작은 패밀리(family)로, 원래는 면역반응의 감시와 염증반응의 중계 능력과 관련하여 알려져 있다. 케모카인은 혈관내피세포 전구체(endothelial progenitor)와 혈관생성성 염증세포(pro-angiogenic inflammatory cell)를 끌어들임으로써 신혈관생성에 영향력을 발휘한다. 케모카인은 또한 케모카인 수용체(receptor)를 활성화(activation)하여, 다운스트림 신호전달 체계(downstream signaling pathways)를 통하여 내피 기능(endothelial function)의 조절에 중요한 역할을 수행한다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 케모카인 수용체인 CXCR1, CXCR2, CCR2를 발현한다고 보고되었다(Ringe J, et al. J Cell Biochem 2007;101: 135-46). 그러나, 인간 양막 간엽줄기세포(AMMs)와 관련된 화학주성(chemotactic) 성질은 아직까지 완전히 밝혀지지 않고 있다.

인간 태반유래 양막(amnion)은 버려지는 태반으로부터 얻기 쉽고, 다기능성 줄기세포(multi-potent stem cell) 및 다른 전구 세포가 풍부하다(Alviano F, et al. BMC Dev Biol 2007;7:11./ Portmann-Lanz CB, et al. Am J Obstet Gynecol 2006;194:664-73).

인간의 양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)는 혈관 형성능력(angiogenic)이 강하며, 최근에 다양한 조직의 세포 형(cell type)으로 교차분화(trans-differentiation) 할 수 있는 잠재력을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다(Kim SW, et al. PLoS One 2012;7:e41105./ Kim SW, et al., Cardiovasc Res 2012;93:525-34).

그러나 허혈성 질환(ischemic disease)과 관련된 AMMs의 치료능력과 생존 특성은 지금까지 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 허혈성 질환에 대한 AMMs의 치료 특성을 규명하여 새로운 허혈성 질환 치료제를 발굴하고자 예의 연구노력한 결과, AMMs이 다른 중간엽 줄기세포에 비하여 주화성(chemotactic), 세포 이동 및 혈관생성(angiogenic properties)과 관련된 GCP-2, NAP-2, HIF-1a, CCR2, CCR3, 및 CCR5 유전자와 GCP-2 및 IL-8 단백질을 높은 수준으로 발현하고, 심근 경색을 감소시키며, 혈관 밀집도를 유의하게 증가시키며, 다중 주변분비(paracrine) 인자의 분비를 촉진하고, 피부 상처에 높은 수준으로 생착(engraft)하며, 좌심실 구출율(LVEF)을 유의하게 증가시킴으로써, 허혈성 질환에 대한 치료적 효능이 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 높은 수준으로 주화성(chemotactic), 세포 이동 및 혈관생성과 관련된 유전자와 단백질을 발현분비하고, 심근 경색을 감소시키며, 허혈성 질환에 대한 치료적 효능이 있는 양막 간엽줄기세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 양막 간엽줄기세포를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 허혈성 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 허혈성 질환의 치료용 약물(medicament)을 제조하기 위한 양막 간엽줄기세포의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 NOD/SCID 마우스를 이용한 심근경색 모델을 통하여 양막 간엽줄기세포의 치료 능력을 연구하였고, 허혈성 부위에 AMMs 세포를 이식하여 유전자 발현의 변화, 다중 주변분비 인자(paracrine factor)의 분비, 세포 이동 및 혈관 생성에 미치는 영향, 심근경색의 경감 여부 등을 종합적으로 분석하여 양막 간엽줄기세포 주입 또는 이식이 허혈성 질환의 치료를 증진함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 케모카인 리간드인 GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2), NAP-2(neutrophil activating protein), 및 HIF-1a(hypoxia inducible factor) 유전자를 고발현하여 혈관형성(angiogenesis)을 촉진시키는 작용을 수행한다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해 CCR2, CCR3, 및 CCR5 유전자 발현이 증가되어 케모카인 신호 전달 및 세포 이동(cell migration)을 증진하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해, 세포 이동(cell migration) 및 세포 부착(cell adhesion)이 촉진되어 허혈성 질환의 치료에 바람직하다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키고, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시켜 심장 기능을 개선시키는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관밀집도(vascular density)를 증가시켜 허혈성 질환의 치료에 바람직하다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 이용되는 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해 증가된 내피세포 교차분화(endothelial trans-differentiation) 능력을 갖는다. 이러한 특징은 국소 주입된 AMMs이 새롭게 형성된 혈관에 병합되고, 혈관내피세포로 교차분화(endothelial trans-differentiation) 하여 허혈성 질환의 치료에 직접 작용할 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 뇌졸중, 또는 허혈성 하지질환을 포함하며, 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 또는 허혈성 심부전을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 1ml 당 1.0 x 10⁴개 내지 1.0 x 10⁸개, 바람직하게는 1.0 x 10⁵개 내지 1.0 x 10⁷개, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10⁶개의 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 나타낼 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 적합한 제형의 예로는 비경구 투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제 등을 들 수 있다. 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.

상기 약학 제제에는 유효 성분 외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 추가로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 약학 제제는 통상적인 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구적 투여방법에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 주사에 의해 투여되거나, 질환 부위 또는 그 주변의 진피 또는 피하에 직접 주입되어 이식될 수 있다.

본 발명의 세포의 1일 투여량은 1.0 x 10⁵내지 1.0 x 10⁷, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁶ 세포/kg체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등에 따라 변할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 주화성(chemotactic), 세포 이동, 및 혈관생성(angiogenic properties)과 관련된 유전자를 높은 수준으로 발현분비하고, 심근 경색을 감소시키며, 혈관 밀집도를 유의하게 증가시키고, 다중 주변분비 인자(multiple paracrine factors)의 분비를 촉진하며, 좌심실 구출율(LVEF)을 유의하게 증가시킴으로써 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 세포의 형태학적 특징을 비교한 사진이다(Bars: 200 μm).
도 1b는 qRT-PCR을 통해 화학 주성 및 혈관생성 유전자 발현의 프로파일을 분석한 그래프이다(n=4 per group; ^*p〈0.05, ^**p〈0.01, AMMs vs. ADMs. 약어: ns, not significant).
도 1c는 GCP-2 및 IL-8 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 1d는 RT-PCR을 통해 화학주성 수용체(chemokine receptor)의 유전자 발현을 분석한 사진이다(약어: M, molecular weight DNA ladder)
도 2a는 화학주성 분석을 통한 이동 세포의 이미지 및 이를 비교 분석한 그래프이다(n=5 / 군).
도 2b는 콜라겐 I에 부착한 세포(adherent cells)의 이미지 및 부착한 세포의 수를 비교 분석한 그래프이다(n=5 /군, ^**p〈0.01, AMMs vs. ADMs.).
도 3a는 세포 이식 후, LAD 결찰(LAD ligation)과 함께 심장 초음파 검사 이미지를 촬영한 사진이다.
도 3b는 AMMs 이식 후, LVEDD, LVESD, 및 LVEF 수치의 증감을 나타낸 그래프이다(n=7 / 군).
도 3c는 심장에 매슨 트리크롬 염색(Masson's trichrome staining) 결과를 나타낸 그림이다.
도 3d는 PBS 버퍼만 주입한 대조군, 및 ADMs을 투여한 군과 비교한 AMMs 투여군의 경색 부위를 도시한 그림이다(n=7 / 군. ^*p〈0.05, ^**p〈0.01)
도 4a는 경색 영역 주위의 혈관 밀도를 촬영한 사진이다(n=6 / 군. Green color: ILB4, Blue color: DAPI)
도 4b는 AMMs 투여 후, 다중 주변분비 인자(multiple paracrine factors)의 단백질 발현 수준을 웨트턴 블롯 분석을 통하여 분석한 그림이다(n=4 / 군).
도 4c는 AMMs 투여 7일 시점에 적출한 조직 부분에서 수행한 TUNEL 어쎄이 수행 결과를 나타낸 그림이다.
도 4d는 TUNEL 어쎄이 수행 결과를 토대로 결과를 각각의 군들에서 발생한 세포자연사 세포(apoptotic cells)를 계수한 그래프이다.
도 5a는 심근경색 부위의 경계에 분포한 Dil표지된 ADMs 및 AMMs 세포를 공초점 현미경을 사용하여 촬영한 사진이다.
도 5b는 심근경색 부위에 생착하여 혈관 내피 세포(endothelial cell)로 교차분화(transdifferentiated)한 AMMs 세포를 ADMs 세포와 비교하여 도시한 그래프이다(n=7 / 군. ^**p〈0.01).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 실험 방법 및 실험 재료 준비

1-1. 세포 배양

정상인의 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts, HDFs) 및 인간 제대 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. 다섯 명의 다른 공여자로부터 획득된 인간 양막 간엽줄기세포는 써모 사이언티픽 사(Thermo Scientific Inc., Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 간엽줄기세포 특징 분석자료(characterization data)와 멀티리니지 분화 능력(multi-lineage differentiation potentials)은 제조사에 의하여 증명되었다.

HDFs, AMMs, 및 ADMs는 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에서 배양하였으며, 배지에는 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신(Gibco)이 첨가되었다. HUVECs는 내피세포 성장배지(endothelial growth medium EGM-2, Lonza Walkersville, MD, USA)에서 배양하였다. 인간 샘플(human sample)을 포함한 모든 프로토콜은 동아대학교의 생명윤리위원회(Institutional Review Board)에서 승인받았으며, 실험은 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에서 채택된 원리를 따랐다.

1-2. RT-PCR 및 qRT-PCR 분석

qRT-PCR은 종래 방법에 따라 실시하였다(Kim MH, et al., J Mol Cell Cardiol 2011;51:702-12.). 전체 RNA는 제조사의 지시에 따라서 RNA-stat 시약(Iso-Tex Diagnostics, Friendswood, TX, USA)을 사용하여 세포로부터 분리하였고, 분리된 RNA는 Taqman 시약(Taqman Reverse Transcripton Reagents, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 역전사(reverse-transcription)하였다. cDNA는 인간 특이적 프라이머(human specific primers)와 Taq 폴리머라제(iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)를 사용하여 합성하였다. DNA 발현 수준은 검출 시스템(ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 정량적으로 평가했다. qRT-PCR 사이클링 조건은 95℃에서 10분 후, 95℃ 15초와 60℃ 1분의 40 사이클 이다. GAPDH를 통해 기준을 정한 후, 실험 샘플에서 타깃 유전자의 상대적인 발현정도를 공식[Rel Exp=2-△CT(배수차이)]을 사용하여 결정하였다. 이 공식에서 △Ct=(타깃 유전자의 Ct)-(GAPDH 컨트롤 유전자의 Ct) 이다. PCR 사이클 수는 소프트웨어(Lightcycler 3.5 software, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 사용하여 측정하였다.

RT-PCR 및 qRT-PCR 프라이머의 유전자와 카탈로그 넘버는 다음과 같다: GCP-2(Hs00234140), NAP-2(Hs00234007), MCP-1(Hs00234077), 및 Hif-1a(Hs00153153).

그리고, 하기 기재된 RT-PCR 프라이머가 사용되었다:

5′-gaaggtggagaagctccctg/ttctttagccatgtggcctg-3′ : CCR2(206 bp),

5′-atgactgtgagcggagcaag/ggaatgggatgtatctgccc-3′ : CCR3(192 bp),

5′ gcaacatgctggtcatcctc/caaacacagcatggacgaca-3′ : CCR5(279 bp),

5′-aaggcagaagcaacccaaat/tcaaggttcgtccgtgttgt-3′ : CXCR2(145 bp),

5′ tggggcagcccagaacatca/gccgcctgcttcacacctt-3′ : GAPDH(198 bp).

모든 프라이머 및 프로브 세트는 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)으로부터 구입하였다.

1-3. 화학주성 분석(Chemotaxis assay)

화학주성 분석(chemotaxis assay)은 코어링(Coring, NY, USA)에서 구입한 트랜스웰 시스템(Transwell system)을 사용하여 실행하였다. 상술하면, MCP-2(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 100 ng/ml 농도로 하부 챔버(lower chamber)에 첨가했다. 각각의 군에서 1 × 105/웰 세포가 무혈청(serum-fee) DMEM 상태의 상위 웰 챔버(upper well chamber)로 초기배양(seeding) 되었다. 그 후 트랜스 웰 시스템(transwell system)에서 37℃, 12시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 삽입된 멤브레인(membranes)의 아래 면으로 이동한 세포를 다섯 번의 무작위로 분리된 필드를 사용하여 정량화하였다.

1-4. 부착 분석(Adhesion assay)

부착 분석(adhesion assay)은 종래 방법을 변형하여 실행하였다(Ii M, Takenaka H, Asai J, et al. Circ Res 2006;98:697-704). 타입 I 콜라겐(Sigma)을 20ug/웰로 미리 코팅한 6-웰 플레이트에 세포(1 × 10⁵/well)를 초기배양(seeding) 하였다. 이것을 DMEM 배지에서 5 % CO₂, 37도에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 2시간 후 세포를 PBS로 조심스럽게 3회 세척하고, 각각의 블라인드 조사자(independent blinded investigator)에 의하여 5 곳의 랜덤한 현미경 필드(microscopic field)에서 부착된 세포(adherent cell) 수를 조사하였다.

1-5. MI(myocardial infarction) 유도 및 세포 이식

모든 과정은 동아의대 기관 동물 보호 및 이용 위원회(DIACUC)에서 승인되었다. 총 24 개체의 NOD/SCID 마우스(NODCB17-Prkdc^scid/J strain, The Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine, USA)는 8-10 주령이며, 4개의 군으로 무작위로 나누었다[MI+AMMs 군(n=6), MI+ADMs군(n=6), MI+PBS군(대조군, n=6), no MI+only surgery(샴(Sham) 대조군, n=6].

MI는 앞서서 종래 기술에 따라 LAD 결찰(ligation)을 통하여 유도하였다(Strieter RM, et al. J Biol Chem 1995;270:27348-57). 모든 동물은 3.5% 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate, 1ml/100g)를 복강 주사하여 마취시켰으며, 기관을 통하여 입관하여(endotracheally intubated), ASV 기기(Inspira Advanced Safety Ventilator, NP 55-7095, Harvard Corp, USA)를 사용하여 기계적으로 공기를 주입하였다. ASV 기기는 분당 120회의 0.25-0.3ml 공기(room air)를 공급한다. 각각의 실험동물은 심장을 관찰하기 위한 자세(right lateral position)로 놓았고, 심장은 좌흉개술(left thoracotomy)을 통하여 열었다. 심막(pericardium)을 제거한 후, 좌측 전하행 동맥(left anterior descending artery, LAD)은 입체현미경(stereomicroscope)(Nissho Optical, Japan)을 사용하게 볼 수 있게 하였고, 8.0 나일론 봉합선(nylon suture)(Tyco Healthcare, USA)을 가지고 막히도록 하였다.

결찰(ligation) 후 즉시, 좌심방 주위 창백(left ventricular pallor)을 관찰하여 폐색(occlusion)을 확인하였다. 각각 40μl 배지(대조군), 1x10⁶ AMMs(AMM군), 및 1x10⁶ ADMs(ADM군) 세포를 심근을 통하여 경색 부위(infarcted region) 경계부분의 5 군데(apical lateral, apical anterior, basal anterior, mid anterior and mid lateral)로 주입하였다. 흉부를 닫고, 폐를 다시 부풀렸고(re-inflated), 실험동물이 자발적인 호흡이 일어날 때까지 엎드린 자세(prone position)로 이동시켰다. 이 과정에 앞서, AMMs군과 ADMs군은 1 × 10⁶ 정도로 100mm 배양 접시(culture dishes)에 37℃와 4℃에서 15분 동안 준비하고, 4μM Dil(chloromethyl - benzamido - 1,1′ - dioctadecyl - 3,3,3′3′ - tetramethylindo - carbocyanine, Molecular Probes, USA)로 표지(labeling) 하였다.

1-6 심장기능 검사(Measurement of cardiac function)

초음파 심장검사(echo-cardiography)는 모든 3개의 군에서 세포 이식 후 2주와 4주째에 실행되었다. 실험동물은 3.5% 클로랄 하이드레이트(1 ml/100g)로 마취시켰다. 초음과 심장검사(echo-cardiography)는 상업적으로 이용할 수 있는 15-16MHz 소형 선상 배열 트랜스듀서(linear array transducer, hockey stick)를 갖는 초음파 심장검사 시스템(Sonos 4500, PHILIPS)을 사용하여 실행하였다. 모든 측정은 경험 있는 심장학자가 각각의 군에 대해 블라인드 테스트하였다. LVESD(Left ventricular end systolic diameter)와 LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 값은 2D TMV(two dimensional targeted M-mode view)에 의해서 얻었다. 좌심실 구출율(LVEF, Left ventricular ejection fraction)은 초음파 심장검사 시스템에 의해 자동으로 계산되었다. 각 실험군으로 세포 이식 후 이중 블라인드(double-blinded) 방식으로 실험 데이터를 평가하였다.

1-7. 조직학 분석(Histological examinations)

줄기세포 주입 후, 4주 후에 모든 실험동물을 안락사 시키고, 심장을 적출하여 OCT 조직배양배지(OCT Tissue-Tek medium; OCT compound: Miles, EIKhart, NJ, USA)를 사용하여 즉시 냉동(cryo-frozen)하였다. 심장은 좌심실(left ventricle)의 윗부분(apex)과 밑바닥 부분으로 5um 두께의 냉동미세절단기(cryostat, Leica RM 2145 microtome)를 사용하여 가로방향으로 잘랐다. 모세혈관 조밀도(capillary density) 측정을 위하여 경색된 조직의 각각의 군으로부터 5개의 냉동 섹션(frozen section)을 순차적으로 ILB4(biotinylated isolectin B4, 1:250; Vector Laboratory Inc, Burlingame,CA) 1차 항체와 SA(streptavidin Alexa Fluor 488, 1:400; Invitrogen) 2차 항체로 염색하였다. 5개의 조직 섹션(tissue section)으로부터 5곳을 무작위로 선택하였고, 선택된 위치에서의 모세혈관(capillary) 수를 계수하였다. 영상은 공초점 현미경(Zeiss LSM 510 laser-scanning confocal microscope, Goettingen, Germany)을 사용하여 기록하였다. 매슨 트리크롬 염색(Masson's Trichrome staining)은 스켄크 등(Schenk S, et al. Stem Cells 2007;25:245-51.)의 방법에 따라 수행하여, 정량적 콜라겐 분석(quantitative collagen analysis)을 수행하였고, 경색부분의 크기(infarction size)가 측정 가능하도록 하였다. 모든 조직 섹션(histological section)은 디지털 스캐닝 현미경(digital scanning microscopy, Scanscope, Aperio, Vista, CA, USA)을 사용하여 검사하였다. 에보트 등(Abbott JD, et al. Circulation 2004;110:3300-5)의 방법에 따라서, 전체 부위(total area)와 좌심실 심근(LV myocardium)의 경색된 흉터 부위(infarct scar area)는 디지털 이미지(digital image) 상에서 수작업으로 추적하였고, 컴퓨터를 사용하여 자동으로 측정하였다. 백분율로 표시된 경색부위의 크기(infarct size)는 모든 섹션의 LV 영역(area) 총합에서 모든 섹션의 총합을 나눈 후 100을 곱하여 계산하였다. 세포자멸사(apoptosis)를 검사하기 위한 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling) 반응은 FISH 키트(fluorescein in situ cell death detection kit, Roche-Molecular)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 5개 조직 섹션(tissue section)에서 5 군데의 필드를 무작위로 선택하였고, 자멸한 세포(apoptotic cell)의 수를 각 필드에서 계수하였다.

1-8. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

심근(myocardium)의 3 그룹에서 발현된 Ang-1(Angiopoietin), Ang-2, VEGF-A(vascular

endothelial growth factor), eNOS(endothelial nitric oxide synthase)를 측정하기 위하여 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)을 실행하였다. 냉동된 조직은 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Sigma-Aldrich)을 포함한 완충액(ice-cold lysis buffer)[50 mM Tris(PH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS 및 1% NP-40]에서 균질화(homogenize) 하였으며, 균질기(Dounce homogenizer, Glas-Col., USA)를 얼음위에서 사용하였다. 균질현탁액(homogenate)은 1000g에서 원심분리하여 불필요한 부분을 제거하였고, 단백질 농도는 바이오 레드 단백질 분석(Bio-Rad protein assay)을 사용하여 결정하였다. 10% SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔 로딩에 앞서 균질현탁액(homogenate)은 5×SDS 샘플 버퍼를 동일 부피로 섞었다. 전기영동(electophoresis) 후 나이트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시키고, 블로킹 버퍼(blocking buffer, 5% 스킴 밀크와 0.1% Tween 20 함유 PBS)에서 최소 30분 동안 인큐베이션 하였다.

멤브레인을 항 VEGF-A 래빗 다클론 항체(rabbit polyclonal anti VEGF-A, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology), 항 eNOS 래빗 다클론 항체(rabbit polyclonal anti-eNOS, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology), 항 Ang-1 염소 다클론 항체(goat polyclonal anti-Ang-1, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology), 항 Ang-2 염소 다클론 항체(goat polyclonal anti-Ang-2, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology), 및 항 ß-actin 항체(anti-ß-actin, 1:5000, Sigma)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안(overnight) 탐침(probing) 하였다.

이어서, 멤브레인을 IgG 결합 항 토끼 HRP 2차 항체(secondary anti-rabbit HRP-linked IgG, 1:2000, Cell Signaling)와 IgG 결합 항 염소 HRP 2차 항체(anti-goat HRP-linked IgG, 1:2000, Cell Signaling)를 사용하여 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 이 후, ECL 화학발광 시약(chemiluminescent reagents)으로 현상하였고, 이미징 시스템(LAS 4000 imaging system, FUJIFILIM)을 사용하였다. 인간 샘플은 IL-8, GCP-2(R&D system) 및 ß-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)의 항체를 가지고 탐침(probing) 하였다.

1-9. 통계학적 분석(Statistical analysis)

데이터는 표준 오차와 함께 평균값으로 나타내었다. 통계 분석은 SPSS 프로그램 패키지(SPSS version 12.0; SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하였다. 두 그룹 사이의 차이는 Student's t-test를 사용하여 비교하였다. 그룹들은 ANOVA 테스트(one-way analysis of variance test)를 사용하여 비교하였다. p<0.05의 값이 통계적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.

실시예 2. AMMs의 세포 특성 분석

HUVECs(HUV), ADMs, 및 AMMs을 배양하여, 형태학적 표현형(morphological phenotype)을 검사하였다. AMMs을 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 관찰하였을 때, AMMs은 ADMs와 유사하게 섬유아세포 유사 형태(fibroblast-like morphology)를 나타내었다(도 1A).

AMMs은 70 세대 이상 동안, 자발적인 분화(differentiation)와 증식(proliferation)을 하지 않았다. 유동세포분석 결과(flow cytometrical results)는 AMMs이 최소한의 조혈 세포 마커(haematopoietic cell markers)(CD14, CD34 and CD45)를 발현하고, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 및 CD166을 높게 발현하여, MSCs 특이적 특징을 보임을 확인할 수 있었다(미도시).

실시예 3. AMMs의 케모카인 및 혈관생성 유전자 발현 분석

AMMs의 주화성(chemotactic)과 혈관생성 능력(angiogenic properties)을 평가하기 위하여 qRT-PCR을 실행하였다. AMMs 군에서는 대표적인 케모카인 리간드인 GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2, CXCL6 대비 46.4배), NAP-2(neutrophil activating protein, CXCL6 대비 10.2배), IL-8(CXCL6 대비 2.5배: 미도시)을 ADMs과 비교하여 상당히 높은 수준으로 발현하였다(도 1B).

그러나, MCP-1 유전자와 CCL2 유전자의 발현은 유의한 차이가 없었다. 또한, AMMs 군에서는 HIF-1a(hypoxia inducible factor)가 ADMs 군 및 HUVEC 군과 비교하여 상당히 높은 수준으로 발현되었는데, HIF-1a는 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 전사(transcription)를 자극함으로써 혈관생성(angiogenesis)을 위한 강력한 자극제로 작용한다.

qRT-PCR에서 확인한 결과를 검증하기 위하여, 단백질 발현 수준을 측정했다. 면역블롯(immunoblot) 결과, ADMs 군과 비교하여 AMMs 군에서는 GCP-2 단백질과 IL-8 단백질의 발현 수준이 더 높은 것을 알 수 있었다(도 1C).

케모카인 수용체가 케모카인 신호 전달과 세포 이동(cell migration)에 필수적인 역할을 할 것이라는 가정에 따라, 우리는 또한 케모카인 수용체의 발현 수준을 평가하였다. AMMs 군이 ADMs 군에 비해 CCR2, CCR3, 및 CCR5 유전자를 높게 발현하지만(도 1D), CXCR2 유전자의 발현 레벨은 ADMs 군과 AMMs 군에서 유사하므로, AMMs가 강력한 화학주성 능력(chemotactic properties)을 갖고 있음을 보여준다.

실시예 4. AMMs의 이동(migration) 및 부착(adhesion) 능력 분석

AMMs에서 CCR2, CCR3, 및 CCR5의 높은 발현이 그 기능과 관련 있는지를 결정하기 위하여 화학주성 분석(chemotaxis assay)을 실행하였다. 세포를 배양하고, CCR2, CCR3, CCR5의 리간드인 MCP-2를 100ng/ml로 24시간 처리하였다. 24시간 동안 AMMs에 대한 처리는 ADMs와 비교하여 세포이동을 상당히 증가시켰다(p<0.01)(도 2A). 또한, 혈관형성 기능(angiogenic function)을 검사하기 위하여 부착 분석(adhesion assay)을 실행하였다. ECM 단백질(extracellular matrix protein)인 콜라겐(collagen I)에 대한 부착 세포(adherent cell) 수는 ADMs군 보다 AMMs군에서 상당히 높게 관찰되었다(p<0.01)(도 2B).

실시예 5. MI 모델에서 AMMs의 치료 능력(therapeutic effects) 분석

허혈성 심장(ischemic heart)에서 AMMs의 치료효과(therapeutic effects)를 검사하기 위하여, MI 마우스 모델을 사용하여 AMMs을 이식하였다. ADMs과 PBS를 투여한 그룹이 대조군으로 사용되었다. 세포 이식 후 2주 후, 및 4주 후에 초음파 심장검사(echocardiography) 분석을 실시하였다. 2주 후, 초음파 심장검사 결과(echocardiography results)는 각 세포들이 이식된 군들 사이에서 LVEDD와 LVESD의 감소에 대해 큰 차이가 없음이 확인되었다. 그러나, 4주 후, 초음파 데이터는 AMMs 이식 군은 PBS 투여군과 비교할 때, LVEDD(3.77 ± 0.14mm versus 4.18 ± 0.17mm; p=0.047)와 LVESD(2.65 ± 0.15 mm versus 3.32 ± 0.15 mm; p=0.004) 결과 값이 상당하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 3A 및 B).

또한, AMMs의 이식(transplantation)은 ADMs군, PBS 그룹과 비교하여 LVEF를 상당히 증가시켰다(60.2±1.8% versus 54.7 ± 1.5%; p=0.012, versus 47.1 ± 2.6%; p=0.0004). 매슨 트리크롬 염색(Masson's trichrome staining)은 또한 AMMs을 이식한 그룹(14.7% ± 0.5%)에서의 경색부분 크기(infarct size)가 ADMs을 이식한 그룹(18.4% ± 1.3%, p=0.012)과 PBS 그룹(22.4% ± 1.4%, p<0.001) 보다 훨씬 작음을 보여주었다(도 3C and D). ADMs을 이식한 그룹은 또한 PBS 그룹(p=0.022)과 비교하여 경색부분 크기(infarct size)에서 상당히 감소함을 알 수 있었다.

실시예 6. AMMs 이식에 따른 in vivo 혈관 밀도 및 혈관 생성인자 분석

AMMs을 이식한 후, 모세혈관(capillary)과 소동맥(arteriole) 밀집도(density)를 관찰하여, 허혈성 부위(ischemic area)의 경계 지점(border zone)에서 혈관밀집도(vascular density)를 관찰하였다. 그 결과, ADMs과 PBS를 처리한 군 보다 AMMs을 처리한 군에서 혈관밀집도가 훨씬 높음을 알 수 있었다(AMM versus ADM p<0.05; AMMs versus control, p<0.01, 도 4A). 경색된 심장(infarcted hearts)으로 이식된 AMM의 잠재적 치료기작(potential repair mechanisms)을 조사하기 위하여, 다중 주변분비 인자(multiple paracrine factors)의 단백질 발현 수준을 조사하였다.

조사는 세포 이식 후 3일의 회복 기간을 갖는 심근 샘플(myocardial sample)을 사용하였다. AMMs을 처리한 심장에서는, ADM 혹은 PBS를 처리한 그룹과 비교하여 Ang-1 과 VEGF 레벨이 상당한 증가하였다(도 4B, p<0.01). 그러나, Ang-2, eNOS 레벨에서는 뚜렷한 변화가 발견되지 않았다.

실시예 7. AMMs 이식에 따른 세포자연사 수준 분석

조직에서 Ang-1와 VEGF-A 같은 생물학적 인자(biological factor)의 상향조절(up-regulation)은 세포자멸사(apoptosis) 레벨이 낮아지는 것과 관련이 있으므로, 실험 7일 시점에 적출한 조직 부분에서 TUNEL 어쎄이가 수행되었다(도 4C). 심근경색(myocardial infarction)에서 TUNEL 양성 핵(positive nuclei)의 수는 ADMs 군 혹은 PBS 투여군과 비교하여 AMMs 군에서 상당히 낮게 발견되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. AMMs의 생착/생존능(engraftment/survival potential) 및 혈관내피세포 전환분화(EC trans-differentiation) 분석

신속한 혈관재형성(rapid revascularization)과 관련하여 허혈이 일어난 부분(ischemic area)에서 이식된 세포의 생존은 성공적인 심근 회복(myocardial repair)을 위하여 필수적이다. 따라서, 이식한 세포의 생존 능력 정도를 조사했다. 세포 이식 4주 후 시점에서, ADMs 투여군과 비교하여, 상당히 높은 수의 Dil 표지 AMMs(Dil labeled AMMs)를 주입된 장소에서 확인할 수 있었다(도 5A 및 B). 더 나아가, ADMs 군와 비교하여 혈관내피세포로 교차 분화된 많은 수의 AMMs(endothelial trans-differentiated AMMs)을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 국소 주입된 AMMs는 새롭게 형성된 혈관에 병합되어, 혈관내피세포로의 교차분화(endothelial trans-differentiation)할 수 있는 잠재력이 있음을 알 수 있었다(도 5A 및 B).

Claims

양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 GCP-2(granulocyte chemotactic protein-2), NAP-2(neutrophil activating protein), 및 HIF-1a(hypoxia inducible factor) 유전자를 고발현하여 혈관형성(angiogenesis)을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해 CCR2, CCR3, 및 CCR5 유전자 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해, 세포 이동(cell migration) 및 세포 부착(cell adhesion)이 증가된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 LVEDD(left ventricular end diastolic diameter) 및 LVESD(Left ventricular end systolic diameter) 값을 감소시키고, LVEF(Left ventricular ejection fraction) 값을 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 허혈성 부위(ischemic area)의 혈관밀집도(vascular density)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 양막 간엽줄기세포(AMMs)는 지방 간엽줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADM)에 비해 증가된 내피세포 교차분화(endothelial trans-differentiation) 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약제학적 조성물.
양막 간엽줄기세포(amniotic mesenchymal stem cells, AMMs)의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법.