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KR20150006477A - 단일-뉴클레오타이드 ｋｒａｓ 돌연변이에 특이적인 이-기능성 짧은-헤어핀 ｒｎａ (ｂｉ-ｓｈｒｎａ) - Google Patents

단일-뉴클레오타이드 ｋｒａｓ 돌연변이에 특이적인 이-기능성 짧은-헤어핀 ｒｎａ (ｂｉ-ｓｈｒｎａ) Download PDF

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KR20150006477A
KR20150006477A KR1020147034469A KR20147034469A KR20150006477A KR 20150006477 A KR20150006477 A KR 20150006477A KR 1020147034469 A KR1020147034469 A KR 1020147034469A KR 20147034469 A KR20147034469 A KR 20147034469A KR 20150006477 A KR20150006477 A KR 20150006477A
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KR
South Korea
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ras
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shrna
bifunctional
seq
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Application number
KR1020147034469A
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English (en)
Inventor
도날드 라오
자오후이 왕
존 제이. 네무나이티스
닐 센저
Original Assignee
그래댈리스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은, K-ras 유전자, 예를 들면, 돌연변이된 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA를 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법을 포함하고, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되며, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있다.

Description

단일-뉴클레오타이드 ＫＲＡＳ 돌연변이에 특이적인 이-기능성 짧은-헤어핀 ＲＮＡ (ＢＩ-ＳＨＲＮＡ){BI-FUNCTIONAL SHORT-HAIRPIN RNA (BI-SHRNA) SPECIFIC FOR SINGLE-NUCLEOTIDE KRAS MUTATIONS}
본 발명은 일반적으로 암 치료 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 K-ras 돌연변이에 특이적인 이기능성 shRNA(bi-specific short-hairpin RNA: 이기능성 짧은-헤어핀 RNA)에 관한 것이다.
본 발명의 배경은, 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, K- ras와 관련하여 기술된다.
KRAS (Kirsten-ras) 종양 유전자는 상당한 비율의 췌관 선암종(PDAC), 결장직장 및 비-소세포 폐암(NSCLC)에서 돌연변이된다. KRAS 돌연변이를 갖는 대부분의 PDAC(70 내지 90%) 환자에서, 5년 생존률은 5% 미만이다. KRAS는, 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질 계열의 일원이며, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 포함하는 다중 세포내 신호전달 경로의 필수 구성 성분이다. KRAS에서의 압도적으로 대다수의 돌연변이는, 코돈 12 또는 코돈 13에서 단일 아미노산 치환을 초래하는 단일 뉴클레오타이드 체세포 돌연변이이다. G12D, G12V, G12R 및 G12C KRAS 돌연변이가, PADC 환자에서 발견되는 KRAS 돌연변이의 90% 초과를 포함한다. KRAS 돌연변이는, 근본적으로, 본질적으로 활성인 KRAS 및 비조절된 다운스트림 신호전달을 초래한다.
(결장직장암에서의) 세툭시마브 항체 및 (BRAF 돌연변이체 흑색종에서의) 소분자 저해제 베무라페니브와 같은 표적화된 제제는, KRAS 돌연변이를 갖는 환자에서 성능이 저조하다. 결과적으로, 효과적인 암 치료학적 전략은, 야생형 기능성을 선택적으로 피하는 KRAS 돌연변이를 요구한다. KRAS 돌연변이를 갖는 암에 대한 조성물, 방법 및 치료에 대한 필요성이 크게 남아 있다.
발명의 요약
한 실시형태에서, 본 발명은, K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA를 포함하고; 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 상기 이기능성 RNA 분자는 K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적(cleavage-dependent) 및 개열-독립적(cleavage-independent) RNA-유도된 침묵(silencing) 복합체(complex)를 활성화시킬 수 있다. 한 양상에서, 이기능성 shRNA는, 서열번호 1 내지 22에 의해 정의되는 하나 이상의 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 이기능성 shRNA는, 서열번호 31 내지 52 또는 53 내지 56에 의해 정의되는 하나 이상의 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 하나 이상의 표적 부위 서열은 사람 K-ras 유전자 cDNA 서열(서열번호 27 내지 30) 내에 존재한다. 다른 양상에서, K-ras는, 돌연변이된 K-ras이다. 다른 양상에서, 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중(triplet) 삽입물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 삽입물을 포함하고, 여기서, 상기 삽입물은, RNA 간섭을 통해, K-ras 유전자인 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 shRNA를 암호화하고; 여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함한다. 한 양상에서, 표적 유전자 서열은 서열번호 1 내지 5를 포함한다. 다른 양상에서, shRNA에 대한 서열 정렬은, K-ras-TA-15 뉴클레오타이드 루프-19 뉴클레오타이드 표적 상보적 서열-3' 스템 아암-스페이서-5' 스템 아암-19 뉴클레오타이드 표적 변이체-TA-15 뉴클레오타이드 루프-19 뉴클레오타이드 표적 상보적 서열-3' 스템 아암인, 5' 스템 아암-19 뉴클레오타이드 표적을 포함한다. 다른 양상에서, 핵산 삽입물은, 서열번호 6 내지 27로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 하나 이상의 shRNA는, 돌연변이된 K-ras 유전자 cDNA 서열 내에 존재하는 표적 부위 서열을 갖는다. 다른 양상에서, 본 발명은, 치료학적 제제 담체; 및 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 치료학적 전달 시스템을 포함하고, 여기서, 상기 핵산 삽입물은, RAN 간섭을 통해, K-ras 유전자인 표적 유전자 서열의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하고; 여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 치료학적 제제 담체는, 압축된 DNA 나노입자이다. 다른 양상에서, DNA 나노입자는, 하나 이상의 다가 양이온(polycation)들에 의해 압축된 것이다. 다른 양상에서, 상기 하나 이상의 다가 양이온은, 10kDA 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-치환된 시스테인-리신 3-mer 펩타이드(CK30PEG10k)이다. 다른 양상에서, 상기 압축된 DNA 나노입자는 리포솜으로 추가로 캡슐화된다. 다른 양상에서, 상기 리포솜은 이층상 함입 소포(bilamellar invaginated vesicle: BIV)이다. 다른 양상에서, 상기 리포솜은, 가역적으로 차폐된(reversibly masked) 리포솜이다. 다른 양상에서, 상기 치료학적 제제 담체는 리포솜이다. 다른 양상에서, 상기 표적 유전자 서열은 서열번호 27 내지 30을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 핵산 삽입물은, 서열번호 31 내지 52 또는 53 내지 56으로부터 선택되는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 삽입물은 서열번호 1 내지 22로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21, 55, 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 shRNA를 암호화하는 핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함한다); 상기 발현 벡터를, 리포솜을 포함하는 치료학적 제제 담체와 결합시키는 단계; 및 상기 발현 벡터와 치료학적 제제 담체와의 복합체의 투여를 필요로 하는 환자에게 상기 발현 벡터와 치료학적 제제 담체와의 복합체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, K-ras 유전자를 발현하는 표적 조직에 하나 이상의 shRNA를 전달하는 방법을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치료학적 제제 담체는, 압축된 DNA 나노입자이다. 다른 양상에서, 상기 DNA 나노입자는, 10kDA 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-치환된 시스테인-리신 3-mer 펩타이드(CK30PEG10k) 또는 30-mer 리신 축합 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 다가 양이온과 함께 압축된다. 다른 양상에서, 상기 압축된 DNA 나노입자는, 이층상 함입 소포(BIV)이고 하나 이상의 "스마트" 수용체 표적화 모이어티로 장식되는, 리포솜으로 추가로 캡슐화된다. 다른 양상에서, 상기 하나 이상의 "스마트" 수용체 표적화 모이어티는 소분자 2가 베타-회전 모사체(beta-turn mimic)이다. 다른 양상에서, 상기 리포솜은, 가역적으로 차폐된 리포솜이다. 다른 양상에서, 상기 리포솜은 이층상 함입 소포(BIV)이다. 다른 양상에서, 상기 리포솜은, 가역적으로 차폐된 리포솜이다. 다른 양상에서, 상기 하나 이상의 "스마트" 수용체 표적화 모이어티는 소분자 2가 베타-회전 모사체이다. 다른 양상에서, 상기 핵산 삽입물은, 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 하나 이상의 표적 세포를 선택하는 단계; 및 상기 표적 세포를, RNA 간섭을 통해, 하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하는, 하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해하는 방법을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 shRNA는 siRNA(개열-의존적) 및 miRNA(개열-독립적) 모티프를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 사람 피험자에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은, 종양 세포 성장 억제를 필요로 하는 사람 피험자를 확인하는 단계; 및 상기 사람 피험자에게 치료학적 제제 담체 중의 발현 벡터 복합체를 종양 세포 성장을 억제시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하고; 여기서, 상기 발현 벡터가, RNA 간섭을 통해, 하나 이상의 표적 세포 중의 돌연변이된 K-ras인 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 shRNA를 발현하며; 여기서, 상기 하나 이상의 shRNA가, 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하고; 여기서, 상기 저해는 아폽토시스, 저지된 증식, 또는 감소된 종양 세포의 침습을 초래하는, 사람 피험자에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 치료학적 제제 담체는 이층상 함입 소포(BIV)를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 치료학적 제제 담체는, 소분자 2가 베타-회전 모사체인 하나 이상의 "스마트" 수용체 표적화 모이어티를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 투여 단계는, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 및 정맥내 주사로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 투여 단계는 종양내 주사를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 투여 단계는, DNA:리포플렉스(lipoplex)를 이용한 주사를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 종양 세포 성장은 K-ras를 발현한다. 다른 양상에서, 상기 종양 세포 성장은 사람 췌관 선암종이다. 다른 양상에서, 상기 종양 세포 성장은, 폐암, 결장암, 흑색종, 인슐린종, 중피종, 난소암, 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 종양 세포 성장은 췌장암이다. 다른 양상에서, 상기 bishRNA는 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 방법은, 제2 항-신생물제와의 병용 치료요법을 추가로 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 상기 방법은, 세툭시마브 또는 베무라페니브와의 병용 치료요법을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는, 돌연변이체 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 이기능성 shRNA 삽입물들을 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있다. 한 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, G12D-G12V-G12R, G12C-G12D-G12R, G12D-G12V-G12R, 또는 G12C-G12D-G12R 중 하나 이상으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 돌연변이체 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 이기능성 shRNA 삽입물들을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 포함하고, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있다. 한 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 비-돌연변이된 K-ras의 발현을 증가시킨다. 다른 양상에서, 상기 이기능성 shRNA는, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포 또는 조직을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 상기 세포 또는 조직 중의 하나 이상의 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 세포 또는 조직의 제1 서브세트에 후보 약물을 투여하고 상기 세포 또는 조직의 제2 서브세트에 위약을 투여하는 단계; (c) 상기 후보 약물 또는 위약의 투여 후 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (d) 상기 후보 약물이, 세포 또는 조직의 제2 서브세트에서 발생하는 임의의 감소와 비교하여 통계학적으로 유의한 야생형 K-ras와 비교하여, 돌연변이된 K-ras의 발현을 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 통계학적으로 유의한 감소는, 상기 후보 약물이, K-ras 유도된 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타내는, 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포 또는 조직을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법을 포함한다. 한 양상에서, 상기 세포 또는 조직은, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하도록 변형된 하나 이상의 검출가능한 유전자를 추가로 발현하고, 여기서, 상기 검출가능한 표지의 발현 수준은, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras에 대한 후보 물질의 효과와 상호 관련된다. 다른 양상에서, 세포 또는 조직은, K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형되었고, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되며, 여기서, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는, 효과적으로 침묵되는 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포들 또는 조직들을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 하기 중 하나 이상을 측정하는 단계: a. 상기 세포들 또는 조직들 중의 적어도 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 발현 수준; b. 상기 암 세포들 또는 조직들 중의 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 발현이 저하된 세포 환경에서 후보 유전자의 발현 수준 또는 후보 유전자들의 그룹의 발현 수준; 및 c. 상기 암 세포들 또는 조직들 중의 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 저하된 발현으로 이루어진 이러한 세포들의 표현형에 대한 후보 약물의 효과; (b) 상기 세포들 또는 조직들의 제1 서브세트에 후보 약물을 투여하고 상기 세포들 또는 조직들의 제2 서브세트에 위약을 투여하는 단계; (c) 상기 후보 약물 또는 위약의 투여 후 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (d) 후보 약물이, K-ras 돌연변이체 발현 세포 환경과 비교하여, 돌연변이된 K-ras의 발현이 감소된 세포 환경에서, 세포들 또는 조직들의 제2 서브세트에서 발생하는 임의의 감소와 비교하여 통계학적으로 유의한, 결정된 표현형을 생성하는데 효과적인지를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 통계학적으로 유의한 감소는, 상기 후보 약물이, 유의한 K-ras 돌연변이 배경 없이 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타내는, 효과적으로 침묵되는 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포 또는 조직을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법을 포함한다. 한 양상에서, 상기 세포 또는 조직은, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하도록 변형된 하나 이상의 검출가능한 유전자를 추가로 발현하고, 상기 검출가능한 표지물의 발현 수준은, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras에 대한 후보 물질의 효과와 상호 관련된다. 다른 양상에서, 상기 세포 또는 조직은, K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형되었고, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되며, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있다. 다른 양상에서, 상기 세포 또는 조직은, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 하나 이상의 삽입물을 포함하는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형되었다.
본 발명의 특징 및 이점의 보다 완전한 이해를 위해, 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명에 대한 참조가 하기에 이루어진다.
도 1은, 시험 벡터의 한 도식을 도시한다. 야생형 KRAS의 처음 17개 아미노산이 psiCHECK2 벡터의 레닐라 루시페라제 유전자(hRluc)의 아미노-말단에 삽입되었고, 한편, G12D, G12V, G12R, 또는 G12C KRAS 돌연변이체의 처음 17개 아미노산은, 동일한 벡터 상의 반딧불이(Firefly) 루시페라제 유전자(hluc+)의 아미노-말단에 삽입되었다.
도 2는, 시험 벡터의 야생형 및 돌연변이체 발현의 효과를 도시한다. 각각의 시험 벡터의 야생형(Wt) 및 돌연변이체(Mu) 발현을, 이원-Glo(Dual-Glo) 루시페라제 검정 시스템(Promega)을 사용하여 모 psiCHECK2 벡터와 비교하였다. Wt 대 Mu 발현 비교는 레닐라(RL) 대 반딧불이(FF)의 발현비로 평가되었다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 검정 시스템의 실증이다. 이기능성 shRNA(bi-shRNA) 발현 벡터(86, 87, 88, 89, 90, 91 또는 92, 각각 서열번호 1 내지 서열번호 7)로 시험 벡터를 동시-형질감염시킴으로써, 돌연변이체 대 야생형의 우선적 녹다운(도 3a)이 FF 대 RL 비율로 신속히 평가될 수 있다(패널 a). 돌연변이체 또는 야생형의 녹다운은, FF(도 3b) 또는 RL(도 3c)의 RLU를 빈(empty) 벡터 대조군(C)과 비교함으로써 개별적으로 추가로 분석될 수 있다.
도 4는 다양한 돌연변이체에 대한 위치 효과를 도시한다. G12D 돌연변이체에 대해 특이적인 bi-shRNA 작제물은, 단일 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 가이드 가닥의 처음 11개 위치들 중 하나에 배치시킴으로써 비교되었다. 야생형(wt) 및 돌연변이체(mu)에 대한 녹다운 백분율은 각각의 작제물에 대해 평가되었다. (n=3).
도 5는, 소정 미스매치가 도입되는 경우 녹다운 효능을 감소시킨 비교를 도시한다. 중심 영역에 돌연변이된 뉴클레오타이드를 갖는 G12D 작제물(p9, p10, 및 p11)은, 씨드(seed) 영역에, 또는 돌연변이된 뉴클레오타이드에 대한 병치로, 추가의 미스매치를 갖는 작제물과 비교하였다: 야생형(wt) 및 돌연변이체(mu). (n=3)
도 6은 G12D, G12V, G12R, 및 G12C에 대한 작제물의 위치 3 또는 4에 대한 선택적 녹다운을 도시한다. 돌연변이체 녹다운의 이점은, 4개의 돌연변이체 각각에 대해 특이적인 모든 시험 벡터에 대한, G12D, G12V, G12R, 및 G12C에 대한 위치 3 또는 4 bi-shRNAi 작제물 모두에 대해 비교하였다. 빈 벡터 대조군 샘플(샘플 C, 가로지르는 막대)을 초과하는 돌연변이체 대 야생형 비율은, 특정 돌연변이체 대립유전자에 대한 강력한 녹다운 이점을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 bi-shRNA 형질감염된 세포에서 KRAS 발현의 웨스턴 면역블롯 분석을 도시한다. HEK-293(WT), PANC-1(G12D 대립유전자) 및 MiaPaCa(G12C 대립유전자)는, 다양한 돌연변이체 표적화 bi-shRNA 작제물로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 수거된 세포 추출물을 웨스턴 면역블롯으로 반-정량적으로 분석하였다. (도 7a) PANC-1 세포는 G12D 표적화 작제물로 형질감염시켰다. (도 7b) G12D 작제물을 3개의 세포주를 사용하여 KRAS 녹다운에 대해 비교한다. (도 7c) G12C 작제물을 3개의 세포주를 사용하여 KRAS 녹다운에 대해 비교한다.
도 8은, 탠덤(tandem)으로의 6개의 miRNA를 갖는 miR-17-92 클러스터를 도시하는 도면이다.
도 9는, 단일 대응물과 녹다운 효능을 비교하기 위해, 리포터 시험 벡터를 사용하여 시험된 삼중 작제물의 결과를 도시한다.
도 10은, 본 발명의 하나 이상의 이기능성 shRNA를 포함하는 세포를 제조하는 도식을 도시한다.
도 11은, miR-17-92 갭 서열을 갖는 삼중 작제물(pGBI-129 및 pGBI-130)은 돌연변이체를 녹다운시킬 수 있고(레인 4 및 5), 한편, miR-17-92 골격 서열을 갖는 삼중 작제물(pGBI-131 및 pGBI-132)은 돌연변이체를 매우 효과적으로 녹다운시킬 수 있다(레인 6 및 7)는 사용 결과를 도시한다.
본 발명의 다양한 실시형태의 제조 및 사용이 하기에 상세히 논의되지만, 본 발명은, 매우 다양한 특정 상황에서 구체화될 수 있는 다수의 적용가능한 발명적 개념을 제공함이 이해되어야만 한다. 본원에서 논의되는 특정 실시형태들은, 단지 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 특정 방식을 설명하는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서, 많은 용어들이 하기에 정의된다. 본원에서 정의되는 용어는, 본 발명과 관련된 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. "하나", "한", 및 "상기"와 같은 용어는 단수의 실체만을 나타내는 것을 의미하는 것이 아니고, 설명을 위해 구체적인 예가 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 본원에서의 용어는, 본 발명의 특정 실시형태를 기술하기 위해 사용되지만, 이들의 사용은, 특허청구범위에서 개요된 것을 제외하고는, 본 발명을 제한하지는 않는다.
ras 원발-종양 유전자(proto-oncogene) 계열에서의 활성화 돌연변이는, 이들이 본질적으로 활성이 되게 하고, 모든 사람 암에서 빈번하게 관찰된다. 특히, KRas에서의 활성화 돌연변이는 췌장암의 90% 초과에서 관찰된다. Kras 돌연변이는 소분자를 이용하여 특이적으로 표적화하기 어려우므로, wt Kras 발현에 영향을 미치지 않으면서 Kras 돌연변이를 녹다운시키는 것이, 암을 치료하기 위한 실행가능한 접근법이다. 모든 RNAi 기반 Kras 돌연변이 녹다운은, 한 특정 돌연변이를 표적화하거나 부수적으로 wt 발현을 녹다운시킨다. 본 발명은, wt Kras 발현을 급격하게 감소시키지 않으면서 췌장암에서 확인된 Kras 돌연변이의 90% 초과를 녹다운시킬 수 있는 신규한 고안 및 작제물을 개시한다.
RNAi는 1998년의 파이어(Fire) 및 멜로(Mello)에 의한 노벨상 수상 발견이고, RNAi는, 유전자 기능을 이해하고 다양한 제I 임상 및 제II 임상 시험을 자극하는 매우 많은 연구 및 출판물들을 발전시켰다. 내인성 microRNA(miRNA)를 포함하는 소형 RNA에 의한 이러한 천연 발생 유전자-침묵 기작은, 유전자 서열에 고도로 의존적이므로; 상기 기작은, 이론상, 임의의 표적화된 유전자[들]의 발현을 강한 특이성으로 저해하는데 이용될 수 있다. RNAi는, 질환 치료를 위해 종래 "언드럭어블(undruggable)" 표적에 접근할 기회를 만드는 소분자의 개발에 내재하는 약리학적 제약에 의해 제한되지 않는다.
이러한 기작의 중심 참가자는, RNA 유도된 침묵 복합체(RNA Induced Silencing Complex: RISC)이다. 이 과정은, 전(pre)-RISC에 합입된 후 패신저(passenger) 가닥이 개열-의존적 또는 개열-독립적 방출되어 RISC를 함유하는 가이드(guide) 가닥을 형성하는, (패신저 가닥 및 가이드 가닥으로 구성된) 이중-가닥의 소형 RNA로 시작한다. 가이드 가닥(mRNA에 대해 안티-센스)은, (완전하거나 부분적으로 연장된) 서열 상보성을 통해 표적 mRNA를 인식하도록 RISC를 가이드한다. RISC의 주요 구성 성분은, 포유동물계에서 아르고너트(Argonaute) 단백질(Ago) 계열인 Ago 1, 2, 3 및 4이며, 이들 중 Ago 2는 추가의 분해(개열 의존적 경로)를 위한 표적 mRNA의 개열을 가능하게 하도록 엔도뉴클레아제 활성을 가지며; RISC를 함유하는 모든 Ago는, 개열-독립적 이펙터 경로를 통해 기능하여, p-바디(p-body)에서의 번역 억압 및 mRNA 격리를 초래하고, 후속적으로 분해를 초래할 수 있다. 개열-의존적 이펙터 과정은 가이드 가닥과 패신저 가닥 및 표적 mRNA 둘 다의 사이에, 특히, 중심 영역에, 광범위한 상동성을 필요로 하고; 한편, 개열-독립적 이펙터 과정은, 단지, 가이드 가닥과 패신저 가닥 및 표적 mRNA 둘 다의 사이에 부분적 상동성만을 필요로 한다.
본 발명은, RISC 복합체로부터 다운스트림에 존재하는 사건이 아닌, RISC 복합체에서 개열 의존적 및 개열 독립적 로딩 둘 다의 이점을 갖는다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "개열 의존적 및 개열 독립적"은, RISC, 및 RISC 복합체에서의 개열 의존적 및 개열 독립적 활성, 즉, 로딩에 대해 특이적으로 표적화되는 RNA(들)의 고안을 나타낸다. 본원 및 본원의 모 출원에서, 이들 "이기능성 shRNA"가, RISC 복합체의 각각의 개별적 부분을 표적화하는 것의 총합보다 더 높은 저해 활성을 가짐이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 보다 높은 저해 활성.
RNA 간섭은, 합성 이중 가닥의 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의해, 또는 벡터 유도된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)에 의해 유발될 수 있다. siRNA 및 벡터 유도된 shRNA 둘 다는, 각각 이들 각각의 이점과 함께, 시험관내 및 생체내 적용에서 유효한 것으로 입증되었다. 대부분의 siRNA는, Ago2 함유 RISC에의 효과적인 합입을 촉진하도록 구조적으로 고안되며, RNase III 함유 다이서(Dicer)-기질 고안은, 전-RISC에서의 초기 회합 및 프로세싱에 의해 siRNA의 효능을 10배 이상 개선한다. 벡터 유도된 shRNA는, 숙주 microRNA 생체내 합성(biogenesis) 경로를 이용하며, 이것이 보다 효과적인 것으로 밝혀진다. siRNA는 보다 쉽게 화학적으로 변형되고, 한편, shRNA 발현은 특정 프로모터에 의해 조정되고 조절될 수 있다.
본 발명자들은, 하나의 사전-프로그래밍된(pre-programed) 분자에서 RISC 로딩의 개열-의존적 및 개열-독립적 경로 둘 다를 이용함으로써 RNAi의 효능을 더욱 개선하기 위한 새로운 벡터 유도된 shRNA 기술인 이기능성 shRNA(bi-shRNA)를 개발하였다. 벡터 유도된 bi-shRNA는 각각의 mRNA 표적 서열에 대해 2개의 스템-루프 구조를 포함하고, 한 스템-루프 shRNA는 스템에서 완벽한 상보성을 가지며, 제2 스템-루프 shRNA는 스템의 패신저 가닥 상에 미스매치를 함유한다(이로써 가이드 가닥 상에 미스매치를 포함하는 선행 기술의 미스매치된 RNA와 차이가 난다). 중요하게도, RISC로의 합입 후, 2개의 구조물 각각으로부터 유도된 가이드 가닥들은 mRNA 표적 서열과 완전히 상보적이지만 상이한 Ago 함유 RISC와는 회합된다. bi-shRNA 고안은 siRNA 또는 종래의 shRNA와 비교하는 경우 보다 신속한 유전자 침묵의 개시, 보다 높은 효능, 및 보다 큰 내구성을 유도한다. 표적 특이적 bi-shRNA를 사용한 현재의 맞춤형 암 치료요법은, 변형된 이층상 함입 리포솜 전달 비히클을 사용하는 제I상 임상 연구로 이행 중이다. bi-shRNA의 고안, 작제 및 실행에 관여하는 주요한 분자적 방법들이 하기에 제공된다.
목적 및 실시형태에 따라, 몇몇의 상이한 벡터, 프로모터 또는 플라스미드 골격 및 전달 시스템을 사용할 수 있다. 효율적인 이식유전자 발현을 갖는 발현 벡터를 선택하는 것이 유용한 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은, 강력한 프로모터, 예를 들면, IE 5'UTR 및 부분적 인트론 A를 함유하는 연장된 CMV 프로모터를 갖는 발현 벡터(pUMVC3)가, CMV 프로모터에 바로 인접하는 클로닝 부위를 갖는 것보다 효과적임을 인식하였다. 소정 실시형태에서, 스템-루프 구조물 앞에 리드 전사물의 스트레치를 갖는 것이 유리하다. 또한, 하나 초과의 벡터 사용이 계획되는 경우, 효과적인 셔틀 전략이 사전에 해결되어야 한다; 발현된 카세트의 PCR 증폭에 의한 변형은 효과적이지 않다. 또한, 프로모터의 선택도 중요하다; RNA 폴리머라제 III 프로모터는 발현에 있어서는 훨씬 강력하지만, 핵 수송 및 RISC 로딩 단계 둘 다에서 내인성 miRNA 성숙 과정을 경쟁적으로 포화시키지 않으므로 소정 전달 비히클을 사용하여 시험관내에서 그리고 생체내에서 치명적 독성을 초래한다. RNA 폴리머라제 II 프로모터는, 비록 발현이 덜 강력하지만, 효과적으로 작용하며, 내인성 miRNA 경로에 대한 경쟁에 관하여 훨씬 덜 독성이다.
소정 실시형태에서, 특히, 다중 동물 모델 시스템이 이용되는 경우, 하나 초과의 종에서 작용할 수 있는 서열이 고안된다. 대부분의 표적 유전자에 관해, 종간에 보존되는 표적 뉴클레오타이드의 스트레치를 발견할 수 있다. 보존된, 그리고 녹다운에 대해 최적인 서열을 발견하기 위해, 상동성-매칭된 서열을 선택된 표적 부위 서열과 비교해야만 한다.
상이한 알고리즘[예를 들면, Dharmacon RNAi 디자인 센터(www.dharmacon.com) 및 IDT(www.idtdna.com)]을 이용하는 공공의 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 쉽게 입수할 수 있으며, 표적화된 유전자 내의 적절한 표적 부위를 위치시키기 위해 이용할 수 있다. 대부분의 컴퓨터 프로그램을 사용한 연구는 종종 추가의 분석을 위한 표적의 예비의 제1 세트를 수득할 것이다. 일부 이용가능한 출판물들은 제안을 제공하고, 제공하지 않는다. 목적하는 종 내의 다른 mRNA를 사용하여 잠재적인 종간의 상동성을 분석하기 위해, 각각의 표적 서열에 대한 BLAST 연구가 고려되어야만 한다.
일단 표적 부위 서열이 선택되면, bi-shRNA 고안 과정이 시작될 수 있고; 고안 과정은 하기에 제시된다. 본 발명자들에 의해 사용된 bi-shRNA 스템-루프 구조는, 임의의 기능성 miRNA 골격이 사용될 수 있지만, 잘-분석된 miR-30a 골격을 사용한다. bi-shRNA는 약 10개 뉴클레오타이드 길이의 갭으로 서로에 대해 바로 인접하게 위치되는 miR-30a 골격 상의 2개의 스템-루프 구조로 이루어진다. 보다 긴 뉴클레오타이드 갭을 사용할 수 있고, 또한 bi-shRNA의 다중 단위들은 다중 부위에서의 단일 유전자를 또는 동시에 다중의 상이한 유전자들을 표적화하는 단일 전사물로 함께 연결시키기 위해 고안될 수 있다.
발현 벡터의 다중 클로닝 부위에 위치되는 발현 단위를 작제하기 위해서, 함께 연속적으로 연결되는 합성적 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 어셈블리 전략이 개발되어 왔다. 대안으로, 본 발명자는, 또한, 특정 서열을 갖는 유전자 작제물의 합성을 생명공학 서비스 회사에 위탁할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 어셈블리 과정을 위해, 중복되는 DNA 단편을 고안하여 합성하였다. 2개의 스템-루프 구조 내의 여분의 서열 때문에, 5' 단편 및 3' 단편을 처음으로 라이게이션시킬 필요가 있다. 이어서, 5' 단편 및 3' 단편을 겔 상에서 정제할 수 있고, 중간 연결 단편에 추가로 라이게이션시킬 수 있다. 이러한 어셈블리 과정이 효과적이며, 주의 깊은 고안과 함께 많은 단편들이 상이한 이기능성 작제물에 반복적으로 사용될 수 있다.
각각의 표적에 대해, 비교하기 위해, 그리고, 이로부터 추가의 평가를 위한 높은 녹다운 효율을 갖는 작제물을 선별하기 위해, 3개 이상의 이기능성 작제물을 고안하고 작제하는 것이 최선이다. 녹다운 효능율은 시험관내 조직 배양 세포에서 비교될 수 있다. 본 발명자들은, 시험관내 형질감염 방법이 매우 상이한 효능을 갖기 때문에, 일반적으로 녹다운 효능을 내인적으로 발현되는 유전자와 비교하기가 어렵다는 것을 인식하였다; 이는, 특히, 형질감염 효능이 낮을 때 그러하며, 이는 형질감염되지 않은 세포로부터의 배경 노이즈에 기인하여 녹다운을 평가하기 힘들기 때문이다.
bi-shRNA에 의한 표적 유전자 녹다운의 효능 및 효율은 표적 및 계획된 적용에 따라 다양한 시험관내 및 생체내 시스템으로 시험될 수 있다. 이러한 시험관내 평가는, 다양한 배양된 세포에서 bi-shRNA 발현 플라스미드의 형질감염 후에 수행될 수 있다. 본 발명자들은, 플라스미드 DNA의 양이 대조군 벡터 또는 보편적 랜덤 서열을 사용하여 세심하게 제어되는 경우, 전기천공, 및 리포솜(예: 리포펙타민 2000) 둘 다에 의한 형질감염이 매우 효과적이라는 것을 밝혔다. 리포펙타민 또는 관련된 제제에 대해, 본 발명자들은 역방 형질감염 방법이 일반적으로 전방 형질감염 방법에 비해 덜 독성임을 밝혔다. 표적 유전자 녹다운은, 표적 유전자 mRNA에 대해서는 qRT-PR에 의해, 또는 표적 유전자 단백질에 대해서는 웨스턴 및/또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 한 검정 방법에서, 스템-루프 RT-PCR에 의해 성숙 shRNA의 발현이 검출되고, 다른 검정 방법에서, 표적 mRNA 개열이 5' RNA-리간드 매개된 RACE(5' RNA-Ligand Mediated RACE: 5' RLM-RACE)에 의해 검출된다. 스템-루프 RT-PCR은, 사용된 특정 프로브 프라이머에 의존적인 민감한 방법이다; 또한, 본 발명자는, 패신저 가닥 및 가이드 가닥 둘 다를 특이적으로 검출하고 정량할 수 있다. bi-shRNA에 대해, 상기 방법은 완전히 상보적인 가닥 및 미스매치된(부분적으로 상보적인) 패신저 가닥 둘 다를 차별적으로 스코어링할 수 있다. 5' RLM-RACE 방법은, 개열된 mRNA 말단에의 RNA 올리고머의 라이게이션을 요구하고, 결과적으로, 당해 방법을 덜 효과적이게 한다. 많은 라운드의 증폭이 종종 필요한 한, 네스티드(nested) 프라이머 고안이 특이성을 확보하는데 필수적이다.
bi-shRNA의 평가가능한 기능성은 표적 세포로의 효과적인 전달에 의존한다. 본 발명자들은, 일부 시험관내 형질감염 시스템이 종종 본질적으로 보다 복잡한 생체내 동물 모델로 번역되지 않는다는 것을 인식한다. 생체내에서의 체계적 적용을 위해 특이적으로 고안된 다수의 전달 시스템이 존재한다. 본 발명자들은 생체내 연구를 위해 융합적(fusogenic) 양이온성 DOTAP:콜레스테롤 이층상 함입 소포 리포플렉스(BIV)를 이용하며, 임상실에서 이를 성공적으로 번역하였다. 보다 초점을 맞춘 생체분산, 표적화된 전달, 및 증진된 세포내 흡수를 위한 변형 전략들이 개발된다. 효과적인 리포플렉스는, 숙주 이. 콜라이로부터의 임의의 오염이 없는 플라스미드를 사용해야만 한다. 엔도-비함유 플라스미드 정제 키트로 생성된 플라스미드가 일반적으로 사용되지만, GLP 또는 GMP 생성된 플라스미드가 더욱 효과적이다. 불행하게도, 콜란산(colanic acid) 및 다른 비-엔도톡신 회합된 다당류가 음이온 교환 크로마토그래피에 의해, 그리고, 염화 세슘 밀도 구배 원심분리에 의해, DNA와 함께 공동-정제된다. 따라서, 엔도톡신 제거는 이들 오염물을 제거하지 않으며, HPLC는 이들 오염물을 검출할 수 없다. 이를 교정하기 위해, 생체내 및 임상 적용을 위한 이들 오염물이 제거된 매우 높은 품질의 플라스미드를 생성하는 SupercleanTM 절차가 개발되었다. 리포솜 제제는 고도의 특수화된 장비를 필요로 한다; 본 발명자들은 통상적으로 GMP 설비에서 DOTAP:콜레스테롤 BIV를 생성한다. 사전-제조된 리포솜을 공동 연구자로부터 얻거나 판매자로부터 구매할 수 있다. 고품질 리포솜 및 플라스미드 DNA로 리포플렉스를 제조하는 과정이 하기에 기재된다. 리포플렉스 제형은 대부분의 실험실 세팅에서 달성될 수 있다. 일단 리포플렉스가 제조되면, 제형은, 느린 꼬리 정맥 주사를 통해 또는 카테터를 이용하여 실험 동물에 전신적으로 전달될 수 있다. 표적 부위 벡터 발현은, 각각, 플라스미드 DNA에 대해서는 PCR 방법, 그리고, 성숙한 bi-shNA에 대해서는 스템-루프 RT-PCR을 이용하여 분석될 수 있다. bi-shRNA 기능성은 표적 mRNA 개열에 대해서는 5' RLM-RACE로, 표적 단백질 녹다운에 대해서는 웨스턴 블롯 또는 IHC로 검정될 수 있다. 이들 분석들은 처리 후 약 48시간에 수행될 수 있다. 효능을 위해, 종종 실험 동물로의 반복적 전달이 필요하며; 투약 스케쥴은 실험적으로 결정되거나 최적화될 필요가 있다.
본 발명은, 개열-의존적 RISC 및 개열-독립적 RISC 경로로 들어가 이들과 상호작용하도록 고안될 수 있는 표적 유전자-특이적 shRNA를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이기능성 shRNA"는, 일반적으로, 각각 개별 스템-루프 구조의 스템 부분 내에 남아 있는 이중 가닥의 서열을 포함하는, 하나 이상의 RNA 분자를 의미하고, 여기서, 제1 RNA 분자는 개열-의존적 RISC 경로에 제시되도록 고안되고, 제2 RNA 분자는 개열-독립적 RISC 경로에 제시되도록 고안된다. 소정 실시형태에서, bi-shRNA는 모두 단일 가닥이다.
보다 구체적으로, 제1 가이드 가닥 서열은, 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA 전사물의 적어도 일부에 상보적, 바람직하게는 100% 상보적이다. 본 발명은, 표적 유전자의 mRNA 전사물에 결합할 수 있는 핵산 서열을 포함하고 개열-의존적 RISC 경로에 제시되는, (처음으로 패신저 가닥에 결합되어 이중 가닥의 스템을 형성하는) 이러한 가이드 가닥을 제공한다. 본 발명은, mRNA 전사물의 분해를 초래하는, mRNA 전사물에 대한 가이드 가닥 서열의 이러한 결합 및 개열-의존적 RISC 경로에 대한 제시를 제공한다.
특정 실시형태에서, 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA 전사물의 적어도 일부에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가이드 가닥 서열이 제공된다. 보다 구체적으로, 제2 가이드 가닥 서열은, 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA 전사물에 상보적, 바람직하게는 100% 상보적이고, 반면, 가이드 가닥의 제2 부분은, 표적 유전자 mRNA 전사물의 상응하는 서열과 미스매치되는 소정 염기를 함유한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "미스매치된(mismatched)" 염기 쌍은, 서로 결합되는(또는 하이브리드화되는) 경우, 염기 쌍의 샤가프(Chargaff) 규칙을 따르지 않는 핵산 서열 내의 2개의 질소성 염기를 말한다. 샤가프 규칙은, 제2 핵산 서열 내의 피리미딘인 티민(T)(또는 우리딘(U))과 쌍을 이룰 것인 제1 핵산 서열 내의 퓨린인 아데닌(A)을 제공한다. 또한, 샤가프 규칙은, 제1 핵산 서열 내의 퓨린인 구아닌(G)이 제2 핵산 서열 내의 피리미딘인 시토신(C)과 쌍을 이룰 것임을 제공한다. 따라서, 이러한 규칙을 따르지 않는 2개의 가닥(핵산 서열) 사이의 염기 쌍, 예를 들면, G와 U, A와 G, A와 C, G와 T, G와 U 사이의 쌍 등은 "미스매치된" 염기 쌍으로 여겨질 수 있다. 패신저 가닥에 비해 하나 이상의 "미스매치된" 염기 쌍을 함유하는 스템-루프 구조의 이중 가닥 서열 내의 가이드 가닥은 이중 가닥 스템 서열 내에 돌출(bulge)을 생성한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오타이드, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되는 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성되는 단편을 말한다. 핵산 분자는, 천연-발생 뉴클레오타이드(예: DNA 및 RNA), 또는 천연-발생 뉴클레오타이드의 유사체(예: 천연-발생 뉴클레오타이드의 α-에난티오머 형태) 또는 이둘의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는, 당 모이어티에 그리고/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은, 예를 들면, 할로겐, 알킬 그룹, 아민 및 아지도 그룹으로의 하나 이상의 하이드록실 그룹의 대체를 포함하거나, 당은, 에테르 또는 에스테르로서 기능성화될 수 있다. 또한, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예를 들면, 아자-당 및 카복실산 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형의 예로는, 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 익히 공지되어 있는 헤테로사이클릭 치환체가 포함된다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 및 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는, 또한, 폴리아미드 골격에 부착된 천연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는 소위 "펩타이드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 벡터"는, 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 일반적으로 프로모터의 제어 하에 위치되며, 이러한 유전자는 프로모터에 "작동적으로 연결된다"고 한다. 유사하게, 조절 요소 및 코어 프로모터는, 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동적으로 연결된다. 용어 "프로모터"는, 숙주 효모 세포에서의 구조적 유전자와 회합되는 경우, 구조적 유전자에 대해 적절한 성장 조건 하에 1) 전사, 2) 번역, 또는 3) mRNA 안정성 중 하나 이상을 프로모터 서열 부재 하에서의 전사, 번역, 또는 mRNA 안정성(mRNA의 보다 긴 반감기)에 비해 증가시키는 임의의 DNA 서열을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "종양 유전자(oncogene)"는, 악성 신생물 세포의 형성 및 생존을 허용하는 유전자를 말한다[Bradshaw, T.K.: Mutagenesis 1, 91-97 (1986)].
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "수용체"는, "리간드"라고 칭하는 생체활성 분자에 결합하는 세포-회합된 단백질"을 나타낸다. 이러한 상호작용은 세포에 대한 리간드의 효과를 매개한다. 수용체는 막 결합되거나, 세포질 또는 핵에 존재하고; 단량체(예: 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린성 수용체) 또는 다량체(예: PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 막-결합된 수용체는, 세포외 리간드-결합 도메인 및 전형적으로 신호 전달에 관여하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조를 특징으로 한다. 소정 막-결합된 수용체에서, 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 이펙터 도메인은, 완전한 기능성 수용체를 포함하는 별개의 폴리펩타이드에 위치된다.
용어 "하이브리드화하는"은, 핵산의 가닥이 염기 쌍을 통해 상보적인 가닥과 결합하는 임의의 과정을 말한다.
용어 "형질감염"은, 외래 DNA가 진핵 세포로 도입되는 것을 말한다. 형질감염은, 예를 들면, 인산 칼슘-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 바이오리스틱스(biolistics)를 포함하는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다양한 수단으로 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이기능성"은, 2개의 기계적 작용 경로(siRNA의 기계적 작용 경로 및 miRNA의 기계적 작용 경로)를 갖는 shRNA를 말한다. 용어 "전통적인" shRNA는, siRNA 작용 기작에 의해 작용하는 DNA 전사 유도된 RNA를 말한다. 용어 "이중(doublet)" shRNA는, 각각 2개의 상이한 유전자의 발현에 대해 작용하나 "전통적인" siRNA 모드로 작용하는, 2개의 shRNA를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "리포솜"은, 내부의 수성 공간을 둘러싸는 지질 이층으로 구성된 밀폐된 구조물을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "다가 양이온"은 동일한 분자 내에 4급 암모늄 라디칼과 같이 다중 양이온 모이어티를 갖는 물질을 나타내고, 유리 염기 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
따라서, 이기능성 shRNA는, 개열-의존적 RISC 및 개열-독립적 RISC 둘 다에 들어가 이들과 상호작용하도록 고안된 shRNA를 포함할 수 있다. 보다 높은 수준의 유전자 "녹-다운"은, siRNA 및 종래의 shRNA(즉, 개열-의존적 RISC 또는 개열-독립적 RISC에 들어가지만 이들 둘 다에 들어가지는 않도록 고안된 shRNA 작제물)을 포함하는 다른 현재-이용가능한 RNAi 방법 및 조성물과 비교하여, 이러한 이기능성 shRNA를 사용하여 달성된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 유전자 "녹-다운"은, 효과적인 정량적 및 지속적 발현 저해를 말한다. 이러한 유전자 "녹-다운"은, 표적 유전자 mRNA 번역의 억제, 증가된 표적 세포 아폽토시스 및/또는 세포 사멸에서 나타나고/나타나거나 명백할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "표적 유전자"는, 서열의 발현이 이기능성 shRNA를 사용하여 특이적이고 효과적으로 조정될 수 있는, 세포 중의 핵산 서열을 말한다. 소정 실시형태에서, 표적 유전자는 개체의 암의 성장(증식), 유지(생존) 및/또는 이동성(전이성) 거동에 연루될 수 있다. 그러나, 본 발명은, 표적 유전자는 임의의 다른 질환 또는 의학적 병태에 연루될 수 있고 암에 연루된 유전자에 제한되지 않는 표적을 제공한다. 예를 들면, 표적 유전자는 조사자 또는 의사가 침묵을 원하는(즉, 이러한 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는) 임의의 서열을 나타낼 수 있다.
벡터 서열은, 이기능성 shRNA를 암호화하는 서열에 직접적으로 또는 간접적으로 작동적으로 연결된(또는 접속된) 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 프로모터는, 모색되는 숙주 세포 및 효과에 기초하여 선택될 수 있다. 적합한 프로모터의 비제한적 예는 구성적 및 유도성 프로모터, 예를 들면, 유도성 RNA 폴리머라제 II(pol II)-기반 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터의 비제한적 예는, 테트라사이클린 유도성 또는 억제성 프로모터, RNA 폴리머라제 I 또는 III-기반 프로모터, pol II 의존적 바이러스 프로모터, 예를 들어, CMV-IE 프로모터, 및 pol III U6 및 H1 프로모터를 추가로 포함한다. 또한, 박테리오파지 T7 프로모터도 사용될 수 있다(이 경우, T7 폴리머라제도 존재해야 한다는 것을 알 수 있을 것이다). 특히, 본 발명은, 합입된 shRNA 싱글렛(singlet)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 2개 이상의 이기능성-shRNA(즉, 이펙터의 조합)를 포함할 수 있으므로, 임의의 단일 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 할 것이다. 각각의 합입된 프로모터는, shRNA 싱글렛 구성성분들 중 하나 또는 임의의 조합을 제어할 수 있다.
소정 실시형태에서, 프로모터는, 표적화된 세포에서 우선적으로 활성일 수 있고, 예를 들면, 종양 세포-특이적 프로모터를 사용하는 종양 세포에서 이기능성 shRNA 분자를 우선적으로 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 작제물의 숙주 세포로의 도입은, 이기능성 shRNA 전구체 전사물 내에 함유되는 2개 이상의 RNA 분자가 처음에 단일 일차 전사물 내에 남아 있는 조건 하에 수행되어, 별개의 RNA 분자(각각 이의 고유한 스템-루프 구조물을 포함)는 후속적으로 내인성 리보뉴클레아제에 의해 이러한 전구체 전사물로부터 절단되도록 할 수 있다. 또한, 본 발명은, 스플라이솜(splicesome)-매개된 핵 프로세싱을 촉진하기 위해 일차 전사물 서열 내에 전략적으로 위치될 수 있는, 스플라이스 공여자 및 수용자 서열을 제공한다. 이어서, 생성된 성숙 shRNA는, 세포에서 생성되는 표적 유전자 mRNA 전사물의 분해 및/또는 번역 억제를 유도할 수 있다. 대안으로, 각각의 전구체 스템-루프 구조물은 별개의 전사물의 부분으로서 생성될 수 있고, 이 경우, 각각의 shRNA-암호화 서열은 바람직하게는 이의 자신의 프로모터 및 전사 종결자 서열을 포함할 것이다. 추가로, 이기능성 shRNA 전구체 전사물은, 임의로, 하나 이상의 기능성 포유동물 단백질을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 서열을 추가로 포함하는, 단일 일차 전사물 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 mRNA 서열은, 환자의 면역계를 보강하는 것으로 알려진 소정 단백질을 암호화할 수 있거나, 달리는 이기능성 shRNA와 동시에 작동할 것인 일부 예방적 및/또는 치료적 효과를 제공한다.
본원에서 기술되는 shRNA 분자의 스템-루프 구조물은 약 40 내지 100개 뉴클레오타이드 길이, 또는 바람직하게는 약 50 내지 75개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 스템 영역은 약 19개 내지 45개 뉴클레오타이드 길이(또는 그 이상) 또는 보다 바람직하게는 약 20개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일수 있다. 스템은 완벽히 상보적인 두가닥(duplex)(그러나, 임의의 3' 테일에 대해서는 제외)을 포함할 수 있으나, 돌출부 또는 내부 루프가 존재할 수 있으며, 심지어 스템의 임의의 아암에서는 바람직할 수 있다. 이러한 돌출부 및 비대칭적 내부 루프의 수는 바람직하게는 소수(예: 1, 2 또는 3개)이고, 약 3개 뉴클레오타이드 이하의 크기이다. 말단 루프부는 약 4개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 약 25개 이하의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 루프부는 바람직하게는 6개 내지 15개 뉴클레오타이드 크기일 것이다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 이기능성 shRNA의 스템 영역은 패신저 가닥 및 가이드 가닥을 포함하고, 이로써, 가이드 가닥은, 표적 유전자(들)에 의해 암호화되는 표적 mRNA 전사물에 상보적인 서열을 함유한다. 바람직하게는, G-C 함량 및 가이드 가닥과 패신저 가닥의 매칭이 엔도뉴클레아제 개열과 함께 또는 개열 없이 열역학적으로-바람직한 가닥 풀림(unwind) 활성을 위해 주의 깊게 고안된다. 또한, 가이드 가닥의 특이성은 바람직하게는 BLAST 연구(www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST)를 통해 확인된다.
다중 표적 유전자의 발현 수준은, 본원에서 기술되는 방법 및 이기능성 shRNA를 사용하여 조정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은, 제1 세트의 이기능성 shRNA는 제1 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키도록 고안되는 서열(가이드 가닥)을 포함하도록 고안될 수 있는 한편, 제2 세트의 이기능성 shRNA는 제2 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키도록 고안되는 서열(가이드 가닥)을 포함하도록 고안될 수 있음을 제공한다. 상이한 세트의 이기능성 shRNA는 동일하거나 별개인 예비 전사물 내에서 발현되고 존재할 수 있다. 소정 실시형태에서, 이러한 다중 접근법, 즉, 2개 이상의 표적 유전자의 발현 수준을 조정하기 위해 본원에서 기술되는 이기능성 shRNA의 사용은 환자에게 향상된 치료 효과를 가질 수 있다. 예를 들면, 환자에게 암의 영향을 치료하거나 예방하거나 개선하기 위해 본원에서 기술되는 이기능성 shRNA가 제공되는 경우, 환자의 암에 연루되는 다중 유전자의 발현 수준을 감소시키도록 고안된 2개 이상의 유형의 이기능성 shRNA를 환자에게 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
소정 실시형태에서, 또한, 본 발명은, 천연 발생 miRNA(예: miR-30, 씨. 엘레강스(C. elegans) let-7 및/또는 lin-4)의 스템 서열을 포함할 수 있는, 이기능성 shRNA 서열을 제공한다. 예를 들면, miR-30 루프의 존재가 바람직할 수 있지만, 본 발명에 의하면, 이러한 구조의 변이도 허용될 수 있으며, 여기서, 예를 들면, miR-30 서열[BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)과 같은 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정됨]과 72% 초과, 바람직하게는 79% 초과, 더욱 바람직하게는 86% 초과, 가장 바람직하게는 93% 초과로 동일한 루프가 사용될 수 있다.
이기능성 shRNA를 암호화하는 전구체 서열(또는 작제물)은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 기술 및 전달 비히클 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 작제물을 포함하는 바이러스 벡터로의 감염이 수행될 수 있으며, 이 경우, 이러한 바이러스 벡터는 바람직하게는 결함이 있는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 홍역 벡터를 포함한다. 또한, 하나 이상의 작제물을 포함하는 플라스미드로의 형질감염이 이용될 수 있다. 이러한 플라스미드는 네이키드(naked) DNA로서 존재할 수 있거나, 예를 들어, 리포솜(예: 면역리포솜)과 공동으로 존재할 수 있다. 또한, 전달 비히클은 면역 리포플렉스, 표적화된 나노입자, 표적화된 리포솜, 사이클로덱스트린, 나노입자, 압타머, 덴드리머, 키토산 또는 이의 페길화된 유도체로 이루어질 수 있다. 전달 비히클의 특성은 표적 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.
이기능성 shRNA-암호화 작제물의 생체내 전달은 표적 조직에 따라 다양한 기술 중 임의의 것을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 전달은 직접 주사, 흡입, 정맥내 주사 또는 다른 물리적 방법 [(예를 들어, 노출 DNA를 사용하여) 조직의 가시적이고 접근가능한 영역을 표적하기 위한 마이크로-발사체를 통하는 것을 포함]에 의해 달성될 수 있다. 투여는 또한 적합한 경우 주사기 바늘, 투관침, 캐뉼라, 카테터 등을 통해 달성될 수 있다.
본원에서 기재되는 이기능성 shRNA를 사용하는 방법에 추가하여, shRNA 자체가 제공된다. 따라서, 추가의 양상은, 단일한 연속 서열 또는 2개 이상의 RNA 분자를 개별적으로 또는 집단적으로 암호화하는 다수의 별개의 서열들을 포함할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에 따라, 제1 RNA 분자는 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA 전사물의 일부에 상보적인 가이드 가닥 서열을 포함하는 이중 가닥 서열을 포함하지만, 제2 RNA 분자는 이러한 mRNA 전사물의 일부에 부분적으로 상보적인 제2 가이드 가닥 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 포함한다. 바람직하게는, 제2 RNA 분자의 제2 가이드 가닥 서열은 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA 전사물의 핵산 서열과 미스매치되는 하나 이상의 염기를 포함한다. 추가의 양상에 따라, 핵산 서열을 포함하고 본원에서 기재되는 방법을 수행하고 이기능성 shRNA를 발현하는데 사용될 수 있는 발현 벡터가 제공된다.
또한, 다양한 유형의 암을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 의학적 병태의 영향을 예방, 치료 및/또는 개선하기 위해 핵산 서열 및 이기능성 shRNA를 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, 본 발명에 따라, 본원에서 기재되는 이기능성 shRNA는 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이에 연루되는 하나 이상의 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 이기능성 shRNA는 암 세포에서 과다-발현되는 것으로 밝혀진 스캐폴드 단백질을 암호화하는 특정 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 표적 유전자의 비제한적 예는 K-ras를 포함한다.
RNA 간섭: 동물 및 식물 세포로의 인위적인 이중-가닥의 작은 간섭 RNA(siRNA)의 도입은 상보적인 서열을 갖는 표적화된 mRNA 분자의 분해를 유발할 수 있다; 이 과정은 RNA 간섭(RNAi)로 알려져 있다[Sharp 2001; Hutvagner and Zamore 2002; Zamore 2002; U.S. Pat. No. 6,506,559]. RNAi는 치료적 적용을 위한 강력한 잠재력을 갖는 유용한 실험적 수단으로 부가되었다[Fire, Xu et al. 1998; Hammond, Bernstein et al. 2000; Elbashir, Harborth et al. 2001; Senzer, Rao et al. 2009; Wang Z 2011]. 그러나, 포유동물 세포에서, shRNA를 사용한 RNAi의 유도는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형질감염을 필요로 하며, 이는 비히클 분해 시간 및 siRNA 생물학적 반감기에 의해 제한되는 유효한 침묵 기간 때문에 효과가 없을 수 있다. 이들 제한에도 불구하고, 제I 상 임상 연구에 대한 최근의 초기 결과 발표에서, 데이비스(Davis) 및 동료들은 리보뉴클레오타이드 리덕타제의 M2 아단위(RRM2)(CALAA-01)를 표적하는 페길화되고 트랜스페린 장식된 사이클로덱스트린-기반 siRNA의 전신 전달로 표적물 특이적 침묵 및 부위-특이적 절단을 설득력 있게 입증하였다[Davis, Zuckerman et al. 2010]. 생검이 이용가능한 흑색종을 갖는 3명의 보고된 환자는 용량이 점증되는 제I상 연구에 따라 처리되었으며, 21일의 주기에 대해 1, 3, 8 및 10일에 정맥내 주입으로 18, 24 또는 30 mg/m2의 CALAA-01이 투여되었다. 자발적 생검은, 각각의 환자에서 제1 주기의 최종 투여 후 수행되고 보관된 기록과 대조되었으며, 30 mg/m2가 투여된 환자에서 제1 주기 후 1개월(제2 주기 개시 전) 및 제2 주기의 최종 투여일에 수행되고 대조되었다. RRM2 mRNA 감소가 30 mg/m2에서 제2 주기 후 및 전의 조직 샘플을 비교하는 qRT-PCT에 의해 확인되었다. 동일한 환자에서, 제1 주기 전 및 후의 면역조직화학 및 웨스턴 블롯은 MMR2 단백질의 5배 감소를 입증하였다. 제안된 작용 기작을 지지하는 것으로서, 5'-RLM-RACE(상보적 DNA 말단의 5'-RNA-리가제-매개된 신속 증폭)는 예측된 절단 부위를 입증하였다. (투과형 전자 현미경을 사용한) 표적화된 종양 세포 도입 및 mRNA 및 단백질 발현 감소에 대한 이러한 사람에서의 최초 입증은, 전신 전달 후 예측된 부위-특이적 siRNA 절단과 함께, RNAi의 해독 적용에 대해 힘을 가한다.
siRAN는 혈청 안정성, 세포 흡수 및 작용 지속기간을 증가시키기 위해 화학적 변형을 필요로 한다. 대안적으로, siRNA는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 작제될 수 있다. shRNA는 플라스미드 작제물 상의 RNA 폴리머라제 III(또는 덜 자주 사용되는 RNA 폴리머라제 II) 프로모터로부터 세포에서 전사될 수 있는 스템-루프 구조물로 이루어진다[Miyagishi and Taira 2002; Yu, DeRuiter et al. 2002]. 염색체로부터 독립적으로인 플라스미드로부터의 shRNA의 구성적 발현은 합성적 siRNA에 비해 이점을 제공한다. shRNA 발현 단위는 세포내 전달 및 핵 수송을 위해 다양한 플라스미드 및 바이러스 벡터로 합입될 수 있다. 또한, 벡터 기반 shRNA 발현은 또한 조절되거나 유도될 수 있다 [Gossen and Bujard 1992; Gupta, Schoer et al. 2004; Dickins, Hemann et al. 2005]. 합성적 siRNA와는 반대로, shRNA는 세포의 핵에서 합성되고, 이어서 세포질로 프로세싱 및 수송되어 활성을 위해 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)로 합입된다 [Cullen 2005]. 유효하도록 하기 위해서, shRA는 내인성의 세포 microRNA 생합성 기구를 이용하도록 디자인되어야 한다.
이기능성 shRNA: 상기된 바와 같이, RNA 간섭(RNAi)는 전사, 전사후 및 해독 기작을 억제하여 유전자 발현을 조절할 수 있는 천연의 세포성 조절 과정이다. miR30-스캐폴드를 사용함으로써 본 발명자는 해독 억제, p-바디에서 [GW182-매개된] 제거(보유 저장기로서 또는 탈캡핑, 탈아데닐화 및 mRNA 분해 증진)(개열-독립적) 및 전사후 mRNA 절단(개열-의존적)을 동시에 유도함으로써 표적 유전자 발현의 보다 효과적인 침묵을 나타내었던 "이기능성" RNAi 전략을 개발하였다 [Rao D 2010].
본 발명자는 신규한 이기능성 shRNA(bi-shRNA) RNA 간섭(RNAi) 기술을 개발하였다. bi-shRNAi는 mRNA 절단, 분해 및 해독 억제가 동시에 수행되도록 프로그램된 엔도뉴클레아제 및 비-엔도뉴클레아제 아르고너트(Ago) 포함 RISC(RNA-유도된 침묵 복합체) 로딩을 허용함으로써 다른 RNAi 매개자보다 높은 효능 및 보다 긴 지속기간을 달성한다. KRAS 돌연변이체 선택적 녹다운에서 bi-shRNAi의 잠재력을 분석하기 위해서, 시험관내 이중 루시페라제 리포터 검정 시스템을 확립하여 동일한 검정 환경에서 돌연변이체 대립유전자 및 야생형 대립유전자의 녹다운 활성을 조직적으로 비교하였다. 본 발명은, 예를 들어, 췌관 선암종(PDAC)의 치료를 위한 G12D, G12V, G12R 및 G12C에 대해 선택적인 치료제의 개발을 포함한다.
가이드 가닥의 각각의 위치에서 단일 뉴클레오타이드 돌연변이를 갖는 G12D를 표적하는 일련의 bi-shRNA 발현 벡터 작제물 중에서, 돌연변이체 대립유전자에 대한 가장 두드러진 녹다운 활성이, 돌연변이체 뉴클레오타이드를 위치 2 내지 4에 배치함으로써 생성된다는 것이 밝혀졌다. 가이드 가닥의 다른 위치에서 추가의 미스매치의 녹다운 효과를 조사함으로써, 이 과정이 서열-특이적이라는 것이 밝혀졌다. 유사한 작제물을 G12V, G12R 및 G12C 돌연변이에 대해 제조하였으며, 이들은 이들의 각각의 표적 돌연변이체 대립유전자의 녹다운에 효과적이다. G12R 특이적 작제물은 G12C 돌연변이체와 교차-반응한다.
본 발명의 작제물을 HEK-293 세포(wt/wt), PANC-1 세포(wt/G12D 대립유전자) 및 MiaPaCa2 세포(wt/G12C 대립유전자)를 사용하여 KRAS 녹다운에 대해 대조군 벡터와 비교하였다. G12D 및 G12C 선택적 bi-shRNA 발현 벡터는, 각각 PANC-1 세포 및 MiaPaCa2 세포에서의 KRAS 발현의 감소와는 반대로, HEK-293에서 KRAS 발현을 감소시키지 않았다. 예를 들어, G12D, G12V, G12R 및 G12C를 녹다운할 수 있는 다량체적 bi-shRNA 단위를 갖는 단일 발현 작제물이 시험관내에서 및 생체내에서의 유효성 및 특이성에 대해 시험될 것이라는 것이 밝혀졌다.
KRAS(Kirsten-ras) 발암유전자는 췌관 선암종(PDAC), 결장직장 및 비소세포 폐암(NSCLC)의 상당 비율에서 돌연변이된다 [Downward J, Nat Rev Cancer. 2003;3:11-22]. KRAS 돌연변이를 갖는 대부분의(70 내지 90%)의 PDAC 환자에서, 5년 생존율을 5% 미만이다 [Saif MW et al. World J Gastroenterol. 2007;13;4423-4430]. KRAS는 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질 패밀리의 일원이며, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 포함한 다수의 세포내 신호전달 경로의 필수 성부이다. KRAS에서 압도적인 득표의 돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 체세포 돌연변이로서 코돈 12 또는 13에서 단일 아미노산 치환을 생성한다. G12D, G12V, G12R 및 G12C KRAS 돌연변이는 PADC 환자에서 발견되는 KRAS 돌연변이의 90% 초과를 차지한다 [COSMIC Database, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/]. KRAS 돌연변이는 본질적으로 구성적으로 활성인 KRAS 및 비조절되는 다운스트림 신호전달을 초래한다 [Schubbert S, et al. Nat Rev Cancer. 2007; 7: 295-308]. 또한, 표적화제, 예를 들어, 세툭시마브 항체(결장직장암에서) 및 소분자 저해제 베무라페니브(BRAF 돌연변이체 흑색종에서)는 KRAS 돌연변이를 갖는 환자에서 표적화가 저조하다 [Karapetis CS, et al. N Engl J Med 2008; 259 (17): 1757-1765]. 결과적으로, 효과적인 암 치료 전략은 선택적으로 야생형 기능성에 위해를 가하지 않는 KRAS 돌연변이를 필요로 한다. 본 발명자는 최근에 신규한 이기능성 shRNA RNA 간섭(bi-shRNAi) 기술을 개발하였다. 본 발명자는 신규한 이기능성 shRNA(bi-shRNA) RNA 간섭(RNAi) 기술을 개발하였다. bi-shRNAi는 mRNA 절단, 분해 및 해독 억제가 동시에 수행되도록 프로그램된 엔도뉴클레아제 및 비-엔도뉴클레아제 아르고너트(Ago) 포함 RISC(RNA-유도된 침묵 복합체) 로딩을 허용함으로써 다른 RNAi 매개자보다 높은 효능 및 보다 긴 지속기간을 달성한다. KRAS 돌연변이체 선택적 녹다운에서 bi-shRNAi의 잠재력을 분석하기 위해서, 시험관내 이중 루시페라제 리포터 검정 시스템을 확립하여 동일한 검정 환경에서 돌연변이체 대립유전자 및 야생형 대립유전자의 녹다운 활성을 조직적으로 비교하였다. 본 프로젝트의 목적은, PDAC의 치료를 위한 G12D, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이체 대립유전자를 특이적으로 표적화하는 단일 치료제를 개발하는 것이다.
siRNA는 대립유전자-특이적 녹다운이 조직적으로 분석되었으므로 단일 뉴클레오타이드가 차이나는 유전자를 구별한다(참조문헌 1 내지 4). 돌연변이체 대립유전자 특이적 녹다운은 알츠하이머병, 헌팅톤병 및 파킨슨병과 같은 질환에 대한 모델계를 사용하여 시험관내에서 입증되었다(참조문헌 10 내지 13). KRAS 돌연변이에 대한 대립유전자 특이적 유전자 침묵이 단일 G12C, G12D 또는 G12V KRAS 돌연변이에 대해 보고되었다(참조문헌 5 내지 9). 단일 제제로 다중 KRAS 돌연변이체 녹다운을 달성하는 어떠한 시도도 보고된바 없었다. 본 발명은 PDAC의4개의주요 KRAS 돌연변이체에 대한 가장 효과적인 bi-shRNAi 녹다운 조합을 밝히기 위한 조직적 접근을 포함한다.
(서열번호 1) G12D, 위치 2. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00001
(서열번호 2) G12D, 위치 3. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00002
(서열번호 3) G12D, 위치 4. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00003
(서열번호 4) G12D, 위치 5. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00004
(서열번호 5) G12D, 위치 6. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00005
(서열번호 6) G12D, 위치 7. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00006
(서열번호 7) G12D, 위치 8. miR-30a 골격 서열은 밑줄을 그어 나타냄.
Figure pct00007
(서열번호 8) G12D, 위치 9.
Figure pct00008
(서열번호 9) G12D, 위치 10.
Figure pct00009
(서열번호 10) G12D, 위치 11.
Figure pct00010
(서열번호 11) G12D, 위치 9, mod 4.
Figure pct00011
(서열번호 12) G12D, 위치 10, mod 5.
Figure pct00012
(서열번호 13) G12D, 위치 11, mod 6.
Figure pct00013
(서열번호 14) G12D, 위치 9, mod 10.
Figure pct00014
(서열번호 15) G12D, 위치 10, mod 11.
Figure pct00015
(서열번호 16) G12D, 위치 11, mod 12.
Figure pct00016
(서열번호 17) G12V, 위치 3.
Figure pct00017
(서열번호 18) G12V, 위치 4.
Figure pct00018
(서열번호 19) G12R, 위치 3.
Figure pct00019
(서열번호 20) G12R, 위치 4.
Figure pct00020
(서열번호 21) G12C, 위치 3.
Figure pct00021
(서열번호 22) G12C, 위치 4.
Figure pct00022
시험 벡터의 도해. 야생형 KRAS의 처음 17개 아미노산을 psiCHECK2 벡터의 레닐라(Renilla) 루시페라제 유전자(hRluc)의 아미노-말단에 삽입하는 한편, G12D, G12V, G12R 또는 G12C KRAS 돌연변이체의 처음 17개 아미노산을 동일한 벡터 상의 반딧불이 루시페라제 유전자(hluc+)의 아미노-말단에 삽입하였다.
KRAS 서열의 레닐라 유전자 또는 반딧불이 유전자로의 삽입: 사람 KRAS 야생형 서열의 처음 17개 아미노산:
Figure pct00023
(서열번호 58)을 해독 개시 ATG에서 psiCHECK2의 레닐라 유전자 서열에 삽입하였다. KRAS(WT) 서열 삽입 이후의 영역 내의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다(KRAS 서열은 밑줄을 그어 나타냄):
Figure pct00024
간단히 설명하면, 명명법은 하기와 같다: 이탤릭체는 레닐라 또는 반딧불이 암호화 서열이고, 흑자로 굵게 밑줄을 그은 것은 삽입된 KRAS 서열이고, 굵은 것은 G12 및 G13에 대한 삼중자 코돈이고, 이중 밑줄은 레닐라에 대해 검게 보이는 것을 제외하고는 서브-클로닝을 위해 사용된 제한 부위이다.
사람 KRAS 돌연변이체 서열(G12D)의 처음 17개 아미노산:
Figure pct00025
(서열번호24)를 해독 개시 ATG에서 psiCHECK2의 반딧불이 유전자 서열에 삽입하였다. KRAS(돌연변이체) 서열 삽입 이후의 영역 내의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다(KRAS 서열은 밑줄을 그어 나타냄):
Figure pct00026
시험 벡터의 작제: 적합한 삽입물을 갖는 DNA 단편을 유전자 합성 과정으로 생성하였다. 합성적 DNA 단편을 psiCHECK2로 삽입하여 하기 열거되는 바와 같은 시험 벡터를 생성하였다. 유전자 합성 및 벡터 작제는 에포치 라이프 사이언스 인크.(Epoch Life Sciences Inc., Missouri City, TX)와의 계약 하에 수행되었다.
(pGBI70) psiCHECK2-KRAS-W (GGTGGC): NheI 및 DraIII로 hRluc 중의 KRAS(WT)의 복합물(composite)을 분해하고 psiCHECK2의 NheI 및 DraIII 부위로 삽입하여 psiCHECK2-KRAS-WT 형성
(pGBI71) psiCHECK2-KRAS-WT/G12D (GATGGC): MluI 및 PspOMI로 hluc+ 중의 KRAS(G12D)의 복합물을 분해하고 psiCHECK2-KRAS-WT의 MluI 및 PspOMI 부위로 삽입하여 psiCHECk2-KRAS-WT/G12D 형성
(pGBI72) psiCHECK2-KRAS-WT/G12V (GTTGGC): MluI 및 PspOMI로 hluc+중의 KRAS(G12D)의 복합물을 분해하고 psiCHECK2-KRAS-WT의 MluI 및 PspOMI 부위로 삽입하여 psiCHECK2-KRAS-WT/G12V 형성
(pGBI73) psiCHECK2-KRAS-WT/G12R (CGTGGC): MluI 및 PspOMI로 hluc+ 중의 KRAS(G12D)의 복합물을 분해하고 psiCHECK2-KRAS-WT의 MluI 및 PspOMI 부위로 삽입하여 psiCHECK2-KRAS-WT/G12R 형성
(pGBI74) psiCHECK2-KRAS-WT/G12C (TGTGGC): MluI 및 PspOMI로 hluc+ 중의 KRAS(G12D)의 복합물을 분해하고 psiCHECK2-KRAS-WT의 MluI 및 PspOMI 부위로 삽입하여 psiCHECK2-KRAS-WT/G12C 형성
bi-shRNAi 디자인 및 작제. bi-shRNA 디자인은 본질적으로 이전에 공개된 바와 같이 수행하였다(참조문헌 14 및 15). 각각의 bi-shRNA 발현 단위를 유전자합성을 통해 모아 pUMVC3 벡터의 다중 클로닝 부위의 Sal I 및 Not I 부위로 삽입하였다.
세포 형질감염. 세포의 트랙스펙션은 전기천공(Gene Pulser MX Cell, BIO-RAD) 또는 리포펙타민 LTX(Invitrogen)에 의해 수행되었다. HEK-293 세포에 대한 전기천공 조건은 본질적으로 제작자에 의해 기구에 저장된 미리-세팅된 조건에 따른다. 리포펙타민 LTX를 사용한 형질감염은 제작자에 의해 권장되는 제안에 따르고, 또한 투입 DNA 농도 및 리포펙타민 비율을 조절함으로써 최적화되었다. 역 형질감염 방법이 모든 리포펙타민 형질감염에 사용되었다. 대부분의 공동-형질감염은 1:1 비율의 시험 벡터 및 bi-shRNAi 벡터와 함께 최적화된 총 농도의 DNA 및 리포펙타민 비율로 수행되었다. 시험 벡터 대 bi-shRNAi 벡터의 비율이 시험되고 또한 최적화되었다.
이중-루시페라제 검정: 이중-루시페라제 검정은 이중-Glo 루시페라제 검정 시스템(Promega)를 사용하여 수행되었으며, 본질적으로 제작자에 의해 제공되는 지침에 따른다. 발광 측정은 루미노스칸 어센트 마이크로플레이트 루미노미터(Luminoskan Ascent Microplate Luminometer: Thermo Scientific)를 사용하여 96 웰 포맷에서 수행되었다. 본질적으로, 세포는 96 웰 플레이트에서 형질감염되거나 형질감염 후 96 웰 플레이트에 도말되었다. 형질감염된 세포는 형질감염 후 24시간 또는 48시간에 검정되었다.
세포 성장 억제 검정: 세포 성장 억제 검정은 제작자의 권장 절차에 따라 세포-역가 블루 세포 생존력 검정 시약(Cell Titer-Blue Cell Viability Assay Reagent) 또는 세포 역가-Glo 발광 세포 생존력 검정 시약(Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay Reagent)(Promega)으로 수행되었다. 사용되는 각각의 세포주는 먼저 검정 전개 시간 내에 최적화되었다.
웨스턴 면역블롯으로 평가되는 KRAS 녹다운: 세포를 용해 완충액 CelLytic-M(Sigma)으로 용해시키고, 배양 디쉬의 표면을 긁어낸 후, 느리게 움직이는 진탕기 상에서 30분 동안 실온에서 항온처리하고, 간단히 원심분리하였다. 표준물로서 BSA와 함께 코마시 브래드포드 플러스 검정(Coomassie Bradford Plus Assay)으로 단백질 농도를 평가하기 위해 소량의 분취물을 취하였다. 등량의 단백질(일반적으로 5 내지 20 ug)을 미니-단백질 II 세포 시스템(Mini-Protein II Cell system: Bio-Rad)을 사용하여 프리-어셈블링된 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 상에서 분리하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 표준 조건으로 PVDF 막에 전기-이동시켰다. 이동된 막을 먼저 4℃에서 밤새 DPBS-T 중의 5% 비-지방 분유를 포함하는 차단 완충액으로 차단하였다. 세척 완충액의 2회 교환 후, 단백질을 먼저(KRAS 및 β-액틴에 대한)(Santa Cruz Biotechnology) 일차 항체의 결정된 희석물로 태깅하고(tagged), 이어서 HRP-접합된 이차 항체로 태깅하였다. 화학발광 검출은 G:BOX Chemi XT16 자동화된 화학발광 이미지 분석기(Syngene, Frederick, MD)과 함께 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 검출 시약을 사용하여 수행하였다. 막은 스트리핑된 후 상이한 항체 또는 β-액틴과 같은 하우스 키핑 단백질로 다시-프로빙될 수 있다.
각각의 돌연변이체 대립유전자에 대한 시험 벡터는 레닐라 대 반딧불이 발현 비율을 보유한다. 초점은 PDAC에서 가장 우세한 4개의 KRAS 돌연변이를 표적하는 대립유전자 특이적 녹다운 bi-shRNA를 디자인하는 것이었다. G12D, G12V, G12R 또는 G12C 돌연변이체 대립유전자 각각을 시험하기 위해 4개의 시험 벡터가 작제되었다. KRAS 서열의 삽입이 레닐라(RL) 또는 반딧불이(FF) 루시페라제의 발현 또는 활성에 차별적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 확실하게 하기 위해서 각각의 시험 벡터 작제물은 조사하였다. G12D, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이에 대한 시험 벡터는 모두 모 psiCHECK2 벡터와 같이 유사한 RL 대 FF 비율을 보유하였다(도 2). RL 루시페라제에 삽입된 단지 KRAS wt 서열만을 갖는 벡터(pGBI70)는 감소된 RL 대 FF 비율을 나타내며, 이는 삽입이 RL 루시페라제 활성에 영향을 미쳤다는 것을 나타내고(도시되지 않음), RL 대 FF 비율이 돌연변이체 함유 시험 벡터에서 보유되었으며, 이는 FF 루시페라제로의 KRAS 돌연변이체 서열의 삽입이 RL과 유사하게 FF 활성에 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다.
도 1은 시험 벡터의 도해를 나타낸다. 야생형 KRAS의 처음 17개 아미노산이 psiCHECK2 벡터의 레닐라 루시페라제 유전자(hRluc)의 아미노-말단에 삽입되었으며, 한편 G12D, G12V, G12R 또는 G12C KRAS 돌연변이체의 처음 17개 아미노산은 동일한 벡터 상의 반딧불이 루시페라제 유전자(hluc+)의 아미노-말단에 삽입되었다.
각각의 돌연변이체에 대한 시험 벡터는 레닐라 대 반딧불이 발현 비율을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 도 2는 시험 벡터의 야생형 및 돌연변이체 발현을 도시한다. 각각의 시험 벡터의 야생형(Wt) 및 돌연변이체(Mu) 발현이 이중-Glo 루시페라제 검정 시스템(Promega)를 사용하여 모 psiCHECK2 벡터와 비교되었다. Wt 대 Mu 발현 비교는 레닐라(RL) 대 반딧불이(FF)의 발현 비율로 평가되었다.
검정 시스템을 시험하기 위해서, G12D 돌연변이를 표적하는 수개의 bishRNA 발현 작제물을 작제하고, wt(RL) 서열 및 G12D 돌연변이체(FF) 서열을 포함하는 시험 벡터와 함께 공동-형질감염 실험을 수행하였다. 7개 bishRNA 작제물이 시험되었으며, 각각의 작제물은 가이드 가닥의 다양한 위치에서 돌연변이체 대립유전자 서열의 성분을 갖는다. 각각의 bishRNA 작제물은 G12D 시험 벡터와 함께 공동-형질감염되었으며, 이중-루시페라제 검정을 형질감염 후 48시간에 수행하였다. 수집된 자료는 도 3a에서 예시되는 바와 같이 야생형 대 돌연변이체 비율로 분석되거나 반딧불이(도 3b) 또는 레닐라(도 3c)의 상대적 발광 단위(RLU)에 의해 분석될 수 있다. 마이크로플레이트 발광기는 증폭 인자를 증대시키지 않으면서 각각의 웰 내의 적은 부위로부터 발광 시스널을 샘플링한다. 삼중 자료는 일반적으로 매우 작은 표준 편차를 가지며, 실험마다 재현성이 있다. 야생형 대 돌연변이체 비율은 돌연변이체 대 야생형 녹다운에서 각각의 bishRNA 작제물의 신속한 찾기를 제공한다. 빈 벡터 대조군(도 3a, 레인 C)을 능가하는 야생형 대 돌연변이체 비율은 돌연변이체 녹다운에 대한 이점을 나타내고, 대조군과 동일하거나 미만인 것은 이점이 없음을 나타낸다. 야생형 또는 돌연변이체 대립유전자의 각각의 작제물에 의한 녹다운 효율은 또한 빈 벡터(empty vector) 대조군에 대해 비교될 수 있다. 각각의 bishRNA 작제물은 야생형 또는 돌연변이체 녹다운 효율면에서 상이한 특성을 나타낸다.
돌연변이체 대 WT에 대한 경쟁적 녹다운 효율이 상대적 발광 단위(RLU) 또는 레닐라(RL) 대 반딧불이(FF) 비율에 의해 평가될 수 있다고 밝혀졌다. 도 3: 검정 시스템의 증명. 시험 벡터를 이기능성 shRNA(bi-shRNA) 발현 벡터(86, 87, 88, 89, 90, 91 또는 92)와 함께 공동-형질감염함으로써, 돌연변이체 대 야생형의 선택적 녹다운이 FF 대 RL 비율에 의해 신속하게 평가될 수 있다(패널 a). 돌연변이체 대 야생형의 녹다운은, 개별적으로 FF(패널 b) 또는 RL(패널 c)의 RLU를 빈 벡터 대조군(C)와 비교함으로써 더욱 분석될 수 있다.
다음, 비교 녹다운 효율이 측정되었으며, bi-shRNA 작제물의 가이드 가닥의 다양한 위치에 돌연변이체 서열을 배치시키는 경우 효율이 변동되는 것으로 밝혀졌다. 각각의 bishRNA 작제물은 도 3에서 도시되는 바와 같이 야생형 및 돌연변이체 대립유전자 녹다운에서 상이한 특성을 나타낸다. 다른 공개문들은 중심 영역이 siRNA 매개된 RNAi의 대립유전자-특이성에 중요하다고 밝히고 있다. 본 발명의 이기능성 전략의 특이성을 시험하고 이해하기 위해서, G12D 돌연변이된 뉴클레오타이드의 상보물을 가이드 가닥의 위치 2 내지 11에 배치시키는 일련의 작제물을 제조하고, 각각의 작제물의 특이성 및 효능을 체계적으로 분석한다. 위치 2 내지 11은 씨드(seed) 영역 및 중심 영역 모두를 포함하였다. 돌연변이된 뉴클레오타이드를 위치 5 및 10에 배치하는 것(도 3, P5 및 P10)은 야생형 또는 돌연변이체 어떠한 것에서도 녹다운을 나타내지 않았으며, 반면 위치 7, 8, 9 및 11(도 4, P7, P8, P9 및 P11)은 야생형 및 돌연변이체 녹다운 모두에서 매우 효과적이다. 씨드 영역에서의 위치 2, 3 및 4(도 4, P2, P3 및 P4)는 야생형 및 돌연변이체 녹다운에서 가장 우수한 식별을 나타내었다. 따라서, 씨드 영역, 특히 위치 3 및 4는 녹다운 특이성에 있어 가장 효과적이다.
도 4는 본 발명의 이기능성 shRNA의 위치 효과를 도시한다. 단일 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 가이드 가닥의 제1의 11 위치에 배치시킴으로써, G12D 돌연변이체에 대해 특이적인 bi-shRNA 작제물을 비교하였다. 야생형(wt) 및 돌연변이체(mu)에 대한 백분율 녹다운이 각각의 작제물에 대해 평가되었다(n=3).
추가의 미스매치를 가이드 가닥에 도입하였다. 가이드 가닥에 추가의 미스매치 도입이 녹다운 효율을 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 오니시(Ohnishi) 및 공동-연구자들은 씨드 영역에 미스매치를 도입하는 것이 중심 영역 (1)에서의 돌연변이체-대립유전자 인식을 증진시킨다고 보고하였다. 추가의 씨드 영역 미스매치를 갖는 bishRNA 작제물이 중심 영역 작제물(가이드 가닥의 P9, P10 및 P11에서 돌연변이된 뉴클레오타이드)에 대해 제조되었다. 또한, 녹다운의 잠재력을 시험하기 위해 돌연변이된 뉴클레오타이드에 대해 미스매치 병치를 갖는 bishRNA 작제물이 제조되었다. G12D 시험 벡터를 사용한 공동-형질감염 자료는 씨드 영역 미스매치가 야생형 및 돌연변이체 녹다운 효율을 모두 감소시켰으며(도 5, 레인 P9+P4 대 레인 P9; 레인 p10+p5 대 p10; 레인 p11+p6 대 p11) 단지 돌연변이체 인식 증진에 대해 약간의 개선이 있다는 것을 보인다. 돌연변이된 뉴클레오타이드로 미스매치 병치의 도입은 돌연변이체 및 야생형 모두에 대해 녹다운 효율을 극적으로 감소시켰다(도 5, 레인 P9+P10 대 레인 P9; 레인 P10+P11 대 레인 P10; 레인 P11+P12 대 레인 P11).
도 5는 녹다운 효율에 대한 미스매치 도입의 효과를 입증한다. 오니시 및 공동-연구자들은 씨드 영역에서의 미치매치 도입이 중심 영역 (1)에서의 돌연변이체 인식을 증진시킨다고 보고하였다. 중심 영역에서 돌연변이된 뉴클레오타이드를 갖는 G12D 작제물(p9, p10 및 p11)을 씨드 영역에서 또는 돌연변이된 뉴클레오타이드에 대해 병치로 추가의 미스매치를 갖는 작제물과 비교하였다: 야생형(wt) 및 돌연변이체(mu). (n=3)
이기능성 shRNA의 가능한 효과 및 표적화를 확대하기 위해서, 겹침 효과가 가능할 수 있도록 shRNA를 표적물의 특정 위치에 표적하였다. 위치 3 또는 4에서 돌연변이된 뉴클레오타이드를 갖는 작제물이 또한 G12V, G12R 및 G12C에 대해 선택적인 것으로 밝혀졌다. G12V, G12R 및 G12C에 대해 위치 3 또는 4에서 돌연변이된 뉴클레오타이드를 갖는 작제물을 4개의 시험 벡터 모두에 대한 G12D 작제물과 함께 시험하였다. G12D에 대한 위치 3 작제물이 위치 4 작제물 보다 효과적이며(도 6, G12D 레인), 다른 돌연변이체에 대해서는 활성이 적거나 없다(도 6, G12D 레인). 다른 한편으로, G12V에 대한 위치 4 작제물은 위치 3 작제물에 비해 효과적이며(도 6, G12V 레인), 다른 돌연변이체에 대해서는 활성이 적거나 없다(도 6, G12V 레인). G12R 작제물은 선택적이지 않으며, G12D, G12R 및 G12C에 대한 돌연변이체에 대해서 아주 고르게 조금 나은 활성을 갖는다(도 6, G12R 레인). G12C에 대해, 위치 3은 위치 4보다 우수하며, 다른 돌연변이체에 대해서는 활성이 적거나 없다(도 6, G12C 레인). 각각의 작제물에 대한 야생형 야생형 또는 돌연변이체의 녹다운 효율이 표 1에 요약되어 있다.
도 6은 G12D, G12V, G12R 및 G12C에 대한 위치 3 또는 4 작제물 상의 선택적 녹다운에 대해 입증한다. G12D, G12V, G12R 및 G12C에 대한 위치 3 또는 4 bi-shRNA 작제물 모두에 대한 돌연변이체 녹다운의 이점이 4개의 돌연변이체 각각에 대해 특이적인 모든 시험 벡터에 대해 비교되었다. 빈 벡터 대조군 샘플(샘플 C, 막대 가로지름)을 능가하는 돌연변이체 대 야생형 비율은 특정 돌연변이체 대립유전자에 대한 강력한 녹다운 이점을 나타낸다.
표 1은 주요 bi-shRNA 작제물의 야생형 및 돌연변이체 대립유전자 녹다운 효율을 나타낸다. 표 1은 표적 서열, 주요 bi-shRNA 작제물에 대한 가이드 가닥 서열 및 각각 돌연변이체 또는 야생형 대립유전자 서열번호 26-52에 대한 각각의 녹다운 효율을 요약한다.
표 1은 녹다운 서열번호 26-52에 대한 위치의 영향을 요약한다.
Figure pct00027
다음, 작제물은 암 세포에서의 유효성에 대해 시험되었다. KRAS 야생형 세포주 및 돌연변이체 대립유전자를 갖는 췌장암 세포주를 사용하여 시험 작제물이 시험되었다. 돌연변이체 KRAS 단백질 대 야생형 KRAS 단백질을 차등적으로 인식할 수 있는 항체가 없으며, 3개의 상이한 세포주가 각각의 작제물의 차등 녹다운을 시험하기 위한 3개의상이한 유전형과 함께 사용되었다. HEK-292은 야생형 KRAS(KRAS+/+)를 갖는 사람 배아 신장 세포주이고, PANC1은 이형접합형성 KRAS(KRAS+/G12D)를 갖는 사람 췌장암 세포주이고, MiaPaCa2는 이형접합형성 KRAS(KRAS+/G12C)를 갖는 사람 췌장암 세포주이다. 위치 2, 3 및 4 작제물은 다양한 효율로 KRAS 발현을 녹다운할 수 있었다(도 7a). 녹다운은 오히려 효과적이지 않으며, 형질감염되지 않은 대조군의 65 내지 70%는 형질감염 효율 및 야생형 KRAS의 존재 때문일 수 있다. 녹다운 효율은 3개의 상이한 세포주를 사용하여 K12D 및 K12C 돌연변이체에 대한 위치 3 및/또는 4 작제물에 대해 추가로 비교되었다. G12D 작제물은 KEK293 세포에서 KRAS를 녹다운하는 것으로 보이지 않았으며(도 7b), PANC1 세포에서 KRAS 녹다운에 가장 효과적이었으며(도 7b), MiaPaCa2에서 낮은 KRAS 녹다운 활성을 보였다(도 7b). 다른 한편으로, G12C 작제물은 HEK293 세포(도 7c) 및 PANC1 세포(도 7c) 모두에서 KRAS 녹다운에 효과적이지 않았으나, MiaPaCa2 세포에서 KRAS 녹다운에 효과적이었다(도 7c).
도 7a 내지 7c는 bi-shRNA 형질감염된 세포에서의 KRAS 발현에 대한 웨스턴 면역블롯 분석을 도시한다. HEK-293(WT), PANC-1(G12D 대립유전자) 및 MiaPaCa(G12C 대립유전자)는 다양한 돌연변이체 표적화 bi-shRNA 작제물로 형질감염되었다. 형질감염 후 48시간에 수거된 세포 추출물은 웨스턴 면역블롯으로 반-정량적으로 분석되었다. (a) PANC-1 세포는 G12D 표적화 작제물로 형질감염되었다. 도 7b는 3개의 세포주를 사용하여 KRAS 녹다운에 대한 G12D 작제물을 비교한다. 도 7c는 3개의 세포주를 사용하여 KRAS 녹다운에 대한 G12C 작제물을 비교한다.
표 2는 표준 안티센스, 표준 siRNA, 표준 shRNA 및 본 발명의 이기능성-shRNA 사이에서의 투약 요건을 요약한다.
Figure pct00028
가이드 가닥의 각각의 위치에서 단일 뉴클레오타이드 돌연변이를 갖는 G12D를 표적하는 일련의 bi-shRNA 벡터 작제물 중에서, 돌연변이체 대립유전자에 대해 가장 차별적인 녹다운 활성은 돌연변이체 뉴클레오타이드를 위치 2 내지 4에 배치시킴으로써 생성된다는 것이 밝혀졌다. 가이드 가닥의 다른 위치에서 추가의 미스매치의 녹다운 효과를 시험함으로써 이 과정이 서열-특이적이라는 것이 입증되었다.
본 발명의 이기능성 shRNA 녹다운의 조직적 분석은, 가이드 가닥의 중심 영역에 가장 효과적인 단일 뉴클레오타이드 변별 위치를 배치하는 대부분의 siRNA 기반 RNAi와는 대조적으로, 가이드 가닥의 위치 2 내지 4(씨드 영역)에 가장 효과적인 변별 위치를 배치한다.
유사한 작제물이 G12V, G12R 및 G12C 돌연변이에 대해 제조되었으며, 이들은 이들의 각각의 표적 돌연변이 대립유전자의 녹다운에 효과적이다. G12R 특이적 작제물은 G12C 돌연변이체와 교차-반응하고, 모두 기능성인 것으로 밝혀졌다.
선택된 작제물은 HEK-293 세포 야생형(wt), PANC-1 세포(G12D 대립유전자) 및 MiaPaCa2 세포(G12C 대립유전자)를 사용하여 KRAS 녹다운에 대해 대조군 벡터와 추가로 비교되었다. G12D 및 G12C 선택적 bi-shRNA 발현 벡터는, 각각 PANC-1 세포 및 MiaPaCa2 세포에서의 KRAS 발현 감소와는 대조적으로, HEK-298에서 KRAS 발현을 감소시키지 않았다.
본원에서의 교시를 이용하여 추가의 시험 작제물이 제조될 수 있으며, 녹다운 특이성을 더욱 입증하기 위해 단백질 녹다운 수준에서 및 시그널 변환 수준에서 적합한 KRAS 돌연변이체 발현 세포주와 함께 이용될 수 있다.
G12D, G12V, G12R 및 G12C를 녹다운할 수 있는 다량체적 bi-shRNA 단위를 갖는 단일 발현 작제물이 시험관내 및 생체내에서의 유효성 및 특이성에 대해 시험되고 있다.
miR-17-92 클러스터 서열을 사용하여 하나의 벡터에서 삼중 녹다운 능력을 갖는 다량체적 bi-shRNA의 작제. 도 8은 miR-17-92 클러스터가 6개의 miRNA를 세로로 일렬로 갖는다는 것을 도시한다.
이 영역의 서열은 gi|47076873|dbj|AB176708.1| 호모 사피엔스 C13orf25 v_2 mRNA, 완전 cds, miR-91-전구체-13 micro RNA, microRNA miR-91, microRNA miR-17, miR-18-전구체-13 micro RNA, microRNA miR-18, miR-19a-전구체-13 micro RNA, microRNA miR-19a, microRNA miR-20, miR-19b-전구체-13 micro RNA, microRNA miR-19b, miR-92-전구체-13 micro RNA, microRNA miR-92로부터 수득된다.
Figure pct00029
서열번호 57
굵고 밑줄친 영역은 micro RAN 서열이고, 이탤릭체 영역은 각각의 micro RNA 시스트론 사이의 갭이다.
2개의 세트의 삼중 bi-shRNA 다량체적 작제물이 3개의 상이한 KRAS 돌연변이에 대한 녹다운을 시험하기 위해 제조되었다. 제1 세트는 miR-30a 골격 스템-루프 구조를 유지하고 miR-17-92 클러스터 갭 서열을 사용한다. 제2 세트는 miR-17-92 클러스터 천연 스템-루프 구조물 골격을 사용하고 miRNA 서열을 bi-shRNA 표적화 서열로 대체한다. 삼중물의 2개의 조합이 각각의 세트에 대해 작제되었으며, pGBI-129 및 pGBI-130은 miR-17-92 갭 서열 내의 miR30a 골격을 갖는 한편, pGBI-131 및 pGBI-132는 miR-17-92 골격 및 갭 서열을 갖는다. bi-shRNA의 순서는 pGBI-130 및 pGBI-132에 대해 G12C-G12D-G12R이다. 서열은 하기에 나타나 있다.
miR-30a 골격과 함께 miR-17-92 갭 서열을 사용하며, 굵은 문자는 miR30a 골격 서열이고, 쿠리어 뉴(Courier new) 문자는 miR-17-92 갭 서열이고, 굵은 이탤릭체의 밑줄친 문자는 KRAS 표적화 서열이고, 각각의 말단에 있는 소문자 서열은 삽입 제한 부위 서열이다.
pGBI-12 (G12D-G12V-G12R):
Figure pct00030
Figure pct00031
pGBI-130 (G12C-G12D-G12R):
Figure pct00032
miR-17-92 골격을 사용하며, 굵은 문자는 miR-17-92 표적화 서열을 대체하는 KRAS 표적화 서열이다. 각각의 말단에 있는 소문자는 삽입 제한 효소 부위 서열이다.
pGBI-131(G12D-G12V-G12R):
Figure pct00033
Figure pct00034
pGBI-132 (G12C-G12D-G12R):
Figure pct00035
다수의 삽입 작제물. 상기에 나타낸 삽입물 서열은 전부 유전자 합성법으로 합성되었으며, pUMVC3 벡터로 클로닝되었다. 하나의 예에서, 삼중 작제물은 먼저 이들의 단일 상대물과 녹다운 효율을 비교하기 위해 리포터 시험 벡터를 사용하여 시험되었다. 도 9는 삼중 작제물 및 단일 작제물이 G12D 리포터를 효과적으로 녹다운할 수 있다는 것을 도시한다(상단 좌측 패널, 8번째 내지 11번째 막대 대 2번째 및 3번째 막대). pGBI-131(상단 우측 패널, 10번째 막대) 및 단일 작제물(5번째 막대)는 G12V를 녹다운할 수 있다. G12R에 대해 삼중 작제물 및 단일 작제물은 녹다운을 수행하지 못했다(하단 좌측 패널, 8번째 내지 11번째 막대 대 7번째 막대). 삼중 작제물 중 3개는 G12C에 대해 단일 작제물보다 우수하게 녹다운을 수행하였다(하단 우측 패널, 9번째 내지 11번째 막대 대 6번째 막대). 당업자는 작제물이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 삽입물들을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 삽입물은 상이한 유형(또는 겹침) 프로모터, 복제 기원, 항생제 또는 다른 내성 유전자, 선별 도메인 또는 유전자, 다양한 발현 도메인, 재조합 도메인 및 작제물의 발현 및 벡터의 전파에 필요한 다른 도메인들을 갖는 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 벡터들에 포함될 수 있다. 일반적으로, 본원에 나타낸 삼중 작제물 및 단일 작제물은 녹다운을 수행할 수 있다. 녹다운 효율은 시험되는 4개의 삼중 작제물 간에 서로 다르다.
본 발명자는 이어서 PANC-1 세포를 사용하여 삼중 작제물의 녹다운 효율을 시험한다. PANC-1 세포는 하나의 야생형 대립유전자 및 하나의 G12D 돌연변이체 대립유전자를 갖는 KRAS wt/G12D 유전형을 갖는다. 본 발명자는 삼중 작제물이 야생형 발현에는 영향을 미치지 않으면서 G12D 발현을 녹다운시키는데 효과적인지를 시험하였다. 모든 세포군을 시험하기 위해서, 본 발명자는 G418 내성 벡터를 갖는 형질전환체를 확립하였다. 푸울 중의 대부분의 G418 내성 형질전환체는 bi-sh-KRAS를 구성적으로 발현한다. 도 10은 형질전환체를 확립하기위한 도식을 나타낸다.
형질전환체의 확립된 푸울은 KRAS mRNA 집단에 대해 시험되었다. 본 발명자는 야생형 전사물 대 돌연변이체 전사물을 구분하기 위해서 제한 단편 길이 다형(RFLP)을 이용하였다. 생성된 BstXI이 야생형 단편은 절단하고 돌연변이 포함 단편은 온전하게 둘 것이므로, PCR 증폭 동안 BstXI 제한 부위를 도입하였다. BstXI 분해된 PCR 생성물은 4% 아가로즈 겔 상에서 분리되었으며, 상부의 밴드는 돌연변이체 집단을 나타내고, 하부의 밴드는 야생형 집단을 나타낸다. 도 11은 miR-17-92 갭 서열을 갖는 삼중 작제물(pGBI-129 및 pGBI-130)이 단지 약하게 돌연변이체를 녹다운할 수 있는 반면(레인 4 및 5), miR-17-92 골격 서열을 갖는 삼중 작제물(pGBI-131 및 pGBI-132)은 매우 효과적으로 돌연변이체를 녹다운할 수 있다(레인 6 및 7)는 것을 도시한다. 흥미롭고도 놀랍게도, pGBI-131 및 pGBI-132는 돌연변이체 mRNA 집단을 상당히 감소시켰을 뿐만 아니라 야생형 mRNA 발현을 증진시켰다. 삼중 작제물 pGBI-131 및 pGBI-132는 G12D 돌연변이체 mRNA를 효과적이고 선택적으로 감소시켰으며, 야생형 발현을 정상 수준으로 되돌린다.
본 명세서에서 논의되는 임의의 양상이 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여 또는 그 역으로 실시될 수 있다고 여겨진다. 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
본원에서 기재되는 특정 양상은 예시하고자 하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 각종 양상에 사용될 수 있다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여 본원에서 기재되는 구체적 절차에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위에 속하고 특허청구범위로 보호되는 것으로 간주된다.
본원에서 언급되는 모든 공개문 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가들의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공개문 및 특허 출원은, 각각의 개별적 공개문 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로, 본원에 참조로 포함된다.
임의의 수는, 특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일치한다. 특허청구범위에서 용어 "또는"은, 비록 명세서는 대체물 단독과 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지하지만, 대체물만을 언급하도록 명시되거나 대체물이 서로 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하도록 사용된다. 본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은, 수치가 장치, 값을 측정하는데 사용되는 방법 또는 연구 개체 간에 존재하는 차이에 대한 오차의 내재적 차이를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 특허청구범위(들)에 사용되는 단어 "포함하는"(및 "포함한다"과 같은 임의의 형태의 포함하는), "갖는"(및 "갖는다"와 같은 임의의 형태의 갖는) 또는 "함유하는"(및 "함유한다"와 같은 임의의 형태의 함유하는)은 포괄적 또는 비-제한적이며, 추가의 비인용된 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
본원에서 사용되는 "또는 이의 조합"은 당해 용어에 선행하는 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 의미한다. 예를 들면, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중의 하나 이상을 포함하는 것으로 의도되고, 순서가 특정 문맥에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB를 포함한다. 이러한 예의 연속으로, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들면, BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 포함하는 조합을 명백하게 포함한다. 문맥으로부터 달리 자명하지 않는 한, 당업자는 전형적으로 임의의 조합으로 항목 또는 용어의 개수가 제한되지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다.
본원에서 사용되는 "약", "실질적인", "실질적으로" 등과 같은 추정 표현은, 변형되는 경우, 반드시 절대적이거나 완전하지는 않지만, 소정의 상태가 존재하는 것으로 명시하는 것을 타당하게 하기에 충분히 밀접한 것으로 간주되는 상태를 지칭한다. 상기 기재가 다를 수 있는 정도는, 얼마나 많은 변화가 도입될 수 있으며 당업자가 변형된 특징을 여전히 요구되는 특성 및 능력을 갖는 것으로 인식하는 지에 달려있을 것이다. 일반적으로, 그러나 상기 논의를 조건으로, "약"과 같은 추정 표현으로 변형되는 본원에서의 수치 값은 기재된 값과 적어도 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15% 차이가 날 수 있다.
본원에서 기재되고 청구되는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 기술에 비추어 과도한 실험 없이 제조되어 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양상와 관련하여 기재되었으나, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 조성물 및/또는 방법 및 본원에서 기재되는 방법의 단계 또는 단계의 순서가 변동될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 모든 이러한 유사한 치환 및 변형이 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
참조 문헌
Figure pct00036
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> GRADALIS, INC. <120> BI-FUNCTIONAL SHORT-HAIRPIN RNA (BI-SHRNA) SPECIFIC FOR SINGLE-NUCLEOTIDE KRAS MUTATIONS <130> GRAD:1025 <150> US 61/644,875 <151> 2012-05-09 <150> US 13/890,957 <151> 2013-05-09 <160> 58 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctgtggt agttggagct gattagtgaa gccacagatg 60 taatcagctc caactaccac agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg tggtaggaag agatgattag tgaagccaca gatgtaatca 180 gctccaacta ccacagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 2 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgtggta gttggagctg atgtagtgaa gccacagatg 60 tacatcagct ccaactacca cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt ggtagtctta gctaatgtag tgaagccaca gatgtacatc 180 agctccaact accacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 3 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctggtag ttggagctga tggtagtgaa gccacagatg 60 taccatcagc tccaactacc agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg gtagttactg ctaatggtag tgaagccaca gatgtaccat 180 cagctccaac taccagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 4 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tcgactgctg ttgaagtgag cgccggtagt tggagctgat ggctagtgaa gccacagatg 60 tagccatcag ctccaactac cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgg tagttgtctc tgatagctag tgaagccaca gatgtagcca 180 tcagctccaa ctaccgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 5 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgtagtt ggagctgatg gcgtagtgaa gccacagatg 60 tacgccatca gctccaacta cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt agttggagct gatggcgtag tgaagccaca gatgtacgcc 180 atcagctcca actacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 6 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctagttg gagctgatgg cgttagtgaa gccacagatg 60 taacgccatc agctccaact agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccta gttggatgag atgacgttag tgaagccaca gatgtaacgc 180 catcagctcc aactagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 7 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcgactgctg ttgaagtgag cgccagttgg agctgatggc gtatagtgaa gccacagatg 60 tatacgccat cagctccaac tgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccag ttggagacta tggagtatag tgaagccaca gatgtatacg 180 ccatcagctc caactgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 8 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgttgga gctgatggcg tagtagtgaa gccacagatg 60 tactacgcca tcagctccaa cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt tgaagcacgt ggtgtagtag tgaagccaca gatgtactac 180 gccatcagct ccaacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 9 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcgactgctg ttgaagtgag cgccttggag ctgatggcgt aggtagtgaa gccacagatg 60 tacctacgcc atcagctcca agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctt ggagctatag gtctaggtag tgaagccaca gatgtaccta 180 cgccatcagc tccaagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 10 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctggagc tgatggcgta ggctagtgaa gccacagatg 60 tagcctacgc catcagctcc agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg gagctgtatg cgttcgctag tgaagccaca gatgtagcct 180 acgccatcag ctccagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 11 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgttgga gctgatggcg tagtagtgaa gccacagatg 60 tactatgcca tcagctccaa cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt tgaagcacgt ggtgtagtag tgaagccaca gatgtactat 180 gccatcagct ccaacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 12 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tcgactgctg ttgaagtgag cgccttggag ctgatggcgt aggtagtgaa gccacagatg 60 tacctatgcc atcagctcca agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctt ggagctatag gtctaggtag tgaagccaca gatgtaccta 180 tgccatcagc tccaagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 13 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctggagc tgatggcgta ggctagtgaa gccacagatg 60 tagcctatgc catcagctcc agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg gagctgtatg cgttcgctag tgaagccaca gatgtagcct 180 atgccatcag ctccagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 14 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgttgga gctcatggcg tagtagtgaa gccacagatg 60 tactacgcca tgagctccaa cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt tgaagcacgt ggtgtagtag tgaagccaca gatgtactac 180 gccatgagct ccaacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 15 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcgactgctg ttgaagtgag cgccttggag ctcatggcgt aggtagtgaa gccacagatg 60 tacctacgcc atgagctcca agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctt ggagctatag gtctaggtag tgaagccaca gatgtaccta 180 cgccatgagc tccaagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 16 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctggagc tcatggcgta ggctagtgaa gccacagatg 60 tagcctacgc catgagctcc agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg gagctgtatg cgttcgctag tgaagccaca gatgtagcct 180 acgccatgag ctccagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 17 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgtggta gttggagctg ttgtagtgaa gccacagatg 60 tacaacagct ccaactacca cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt ggtagtctta gctattgtag tgaagccaca gatgtacaac 180 agctccaact accacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 18 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctggtag ttggagctgt tggtagtgaa gccacagatg 60 taccaacagc tccaactacc agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg gtagttactg ctattggtag tgaagccaca gatgtaccaa 180 cagctccaac taccagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 19 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctgtggt agttggagct cgttagtgaa gccacagatg 60 taacgagctc caactaccac agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg tggtagactg agctagttag tgaagccaca gatgtaacga 180 gctccaacta ccacagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 20 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgtggta gttggagctc gtgtagtgaa gccacagatg 60 tacacgagct ccaactacca cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt ggtagtacta gctagtgtag tgaagccaca gatgtacacg 180 agctccaact accacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 21 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tcgactgctg ttgaagtgag cgcctgtggt agttggagct tgttagtgaa gccacagatg 60 taacaagctc caactaccac agttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgcctg tggtagactg agctagttag tgaagccaca gatgtaacaa 180 gctccaacta ccacagttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 22 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tcgactgctg ttgaagtgag cgccgtggta gttggagctt gtgtagtgaa gccacagatg 60 tacacaagct ccaactacca cgttgcctac tgcctcggaa gcagctcact acattactca 120 gctgttgaag tgagcgccgt ggtagtctta gcttatgtag tgaagccaca gatgtacaca 180 agctccaact accacgttgc ctactgcctc ggaagcttaa taaaggatct tttattttca 240 ttggc 245 <210> 23 <211> 208 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gctagccacc atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag 60 tgcttccaag gtgtacgacc ccgagcaacg caaacgcatg atcactgggc ctcagtggtg 120 ggctcgctgc aagcaaatga acgtgctgga ctccttcatc aactactatg attccgagaa 180 gcacgccgag gaggcacgtc gtgcctca 208 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgatggcg taggcaagag t 51 <210> 25 <211> 208 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cacttcgcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct gcagcgaccc 60 gcttaaaagc ttggcattcc ggtactgttg gtaaagccac catgactgaa tataaacttg 120 tggtagttgg agctgatggc gtaggcaaga gtgccgatgc taagaacatt aagaagggcc 180 ctgctccctt ctaccctctg gaggatgg 208 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc aagagt 36 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cttgtggtag ttggagctga tggcgtaggc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cttgtggtag ttggagctgt tggcgtaggc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 cttgtggtag ttggagctcg tggcgtaggc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cttgtggtag ttggagcttg tggcgtaggc 30 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 acaccatcaa cctcgacta 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 caccatcaac ctcgactac 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 accatcaacc tcgactacc 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ccatcaacct cgactaccg 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 catcaacctc gactaccgc 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 atcaacctcg actaccgca 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tcaacctcga ctaccgcat 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 caacctcgac taccgcatc 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 aacctcgact accgcatcc 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 acctcgacta ccgcatccg 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 caacctcgac taccgtatc 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 aacctcgact 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cgttgcctac tgcctcggaa gcaaaagtct gtagaaaagt aagggaaact caaacccgct 1020 gttgaagtga gcgccgtggt agtactagct agtgtagtga agccacagat gtacacgagc 1080 tccaactacc acgttgccta ctgcctcgga agcttaataa aggatctttt attttcattg 1140 gctggggatt gtgaccagaa gattttgaaa attaaatatt actgaagatt tcgacttcca 1200 ctgttaaatg tacaagatac atgaaatatt aaagaaaatg tgtaactttt tgtgtaaata 1260 catcttgtgc ggccgcggat 1280 <210> 54 <211> 1280 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cgtcgtcgac tttcttcccc attagggatt atgctgaatt tgtatggttt atagttgtta 60 gagtttgagg tgttaattct aattatctat ttcaaattta gcaggaaaaa agagaacatc 120 accttgtaaa actgaagatt gtgaccatcg actgctgttg aagtgagcgc ctgtggtagt 180 tggagcttgt tagtgaagcc acagatgtaa caagctccaa ctaccacagt tgcctactgc 240 ctcggaagca gctgcctcgg gaagccaagt tgggctttaa agtgcagggc ctgctgatgt 300 tgagtgcttt tgctgttgaa gtgagcgcct gtggtagact gagctagtta gtgaagccac 360 agatgtaaca agctccaact accacagttg cctactgcct cggaagctta ataaaggatc 420 ttttattttc attggctaag aagttatgta ttcatccaat aattcaagcc aagcaagtat 480 ataggtgttt taatagtttt tgttttcgac tgctgttgaa gtgagcgccg tggtagttgg 540 agctgatgta gtgaagccac agatgtacat cagctccaac taccacgttg cctactgcct 600 cggaagctat ttccttcaaa tgaatgattt ttactaattt tgtgtacttt tattgtgtcg 660 atgtagaatc tgcctggtct atctgatgtg acagcttctg ctgttgaagt gagcgccgtg 720 gtagtcttag ctaatgtagt gaagccacag atgtacatca gctccaacta ccacgttgcc 780 tactgcctcg gaagcttaat aaaggatctt ttattttcat tggctagctg tagaactcca 840 gcttcggcct gtcgcccaat caaactgtcc tgttactgaa tcgactgctg ttgaagtgag 900 cgcctggtag ttggagctgt tggtagtgaa gccacagatg taccaacagc tccaactacc 960 agttgcctac tgcctcggaa gcaaaagtct gtagaaaagt aagggaaact caaacccgct 1020 gttgaagtga gcgcctggta gttactgcta ttggtagtga agccacagat gtaccaacag 1080 ctccaactac cagttgccta ctgcctcgga agcttaataa aggatctttt attttcattg 1140 gctggggatt gtgaccagaa gattttgaaa attaaatatt actgaagatt tcgacttcca 1200 ctgttaaatg tacaagatac atgaaatatt aaagaaaatg tgtaactttt tgtgtaaata 1260 catcttgtgc ggccgcggat 1280 <210> 55 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 cgtcgtcgac tttcttcccc attagggatt atgctgaatt tgtatggttt atagttgtta 60 gagtttgagg tgttaattct aattatctat ttcaaattta gcaggaaaaa agagaacatc 120 accttgtaaa actgaagatt gtgaccagtc agaataatgt gtggtagttg gagctgatgt 180 gatatgtgca tctcatcagc tccaactacc accattatgg tgacagctgc ctcgggaagc 240 caagttgggc tttaaagtgc agggcctgct gatgttgagt gctttttgtt cgtggtagtc 300 ttagctaatg tgaagtagat tagcatctca tcagctccaa ctaccaccat aagaagttat 360 gtattcatcc aataattcaa gccaagcaag tatataggtg ttttaatagt ttttgtttgc 420 agtcctctgt ttggtagttg gagctgttgg agaagaatgt agtccaacag ctccaactac 480 catggtggcc tgctatttcc ttcaaatgaa tgatttttac taattttgtg tacttttatt 540 gtgtcgatgt agaatctgcc tggtctatct gatgtgacag cttctgtagc acttggtagt 600 tactgctatt ggtgtttagt tatctccaac agctccaact accatactgc tagctgtaga 660 actccagctt cggcctgtcg cccaatcaaa ctgtcctgtt actgaacact gttctatggt 720 tgtggtagtt ggagctcgtg tgtgtgatat tctgccacga gctccaacta ccacctgtgg 780 tagtgaaaag tctgtagaaa agtaagggaa actcaaaccc ctttctacac gtggtagtac 840 tagctagtgg tgtttctgta tggcacgagc tccaactacc actgagtttg gtggggattg 900 tgaccagaag attttgaaaa ttaaatatta ctgaagattt cgacttccac tgttaaatgt 960 acaagataca tgaaatatta aagaaaatgt gtaacttttt gtgtaaatac atcttgtgcg 1020 gccgcggat 1029 <210> 56 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cgtcgtcgac tttcttcccc attagggatt atgctgaatt tgtatggttt atagttgtta 60 gagtttgagg tgttaattct aattatctat ttcaaattta gcaggaaaaa agagaacatc 120 accttgtaaa actgaagatt gtgaccagtc agaataatgt tgtggtagtt ggagcttgtt 180 gatatgtgca tctacaagct ccaactacca cacattatgg tgacagctgc ctcgggaagc 240 caagttgggc tttaaagtgc agggcctgct gatgttgagt gctttttgtt ctgtggtaga 300 ctgagctagt tgaagtagat tagcatctac aagctccaac taccacacat aagaagttat 360 gtattcatcc aataattcaa gccaagcaag tatataggtg ttttaatagt ttttgtttgc 420 agtcctctgt tgtggtagtt ggagctgatg agaagaatgt agtcatcagc tccaactacc 480 actggtggcc tgctatttcc ttcaaatgaa tgatttttac taattttgtg tacttttatt 540 gtgtcgatgt agaatctgcc tggtctatct gatgtgacag cttctgtagc actgtggtag 600 tcttagctaa tgtgtttagt tatctcatca gctccaacta ccactactgc tagctgtaga 660 actccagctt cggcctgtcg cccaatcaaa ctgtcctgtt actgaacact gttctatggt 720 ttggtagttg gagctgttgg tgtgtgatat tctgcccaac agctccaact accactgtgg 780 tagtgaaaag tctgtagaaa agtaagggaa actcaaaccc ctttctacac tggtagttac 840 tgctattggg tgtttctgta tggccaacag ctccaactac catgagtttg gtggggattg 900 tgaccagaag attttgaaaa ttaaatatta ctgaagattt cgacttccac tgttaaatgt 960 acaagataca tgaaatatta aagaaaatgt gtaacttttt gtgtaaatac atcttgtgcg 1020 gccgcggat 1029 <210> 57 <211> 1050 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tttcttcccc attagggatt atgctgaatt tgtatggttt atagttgtta gagtttgagg 60 tgttaattct aattatctat ttcaaattta gcaggaaaaa agagaacatc accttgtaaa 120 actgaagatt gtgaccagtc agaataatgt caaagtgctt acagtgcagg tagtgatatg 180 tgcatctact gcagtgaagg cacttgtagc attatggtga cagctgcctc gggaagccaa 240 gttgggcttt aaagtgcagg gcctgctgat gttgagtgct ttttgttcta aggtgcatct 300 agtgcagata gtgaagtaga ttagcatcta ctgccctaag tgctccttct ggcataagaa 360 gttatgtatt catccaataa ttcaagccaa gcaagtatat 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Claims (49)

  1. K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성(bi-functional) shRNA(short-hairpin RNA: 짧은 헤어핀 RNA)로서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵(silencing) 복합체를 활성화시킬 수 있는, 이기능성 shRNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가, 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56에 의해 정의되는 하나 이상의 서열을 포함하는, 이기능성 shRNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가, 서열번호 31 내지 52에 의해 정의되는 하나 이상의 서열을 포함하는, 이기능성 shRNA.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 표적 부위 서열이 사람 K-ras 유전자 cDNA 서열(서열번호 27 내지 30) 내에 존재하는, 이기능성 shRNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 K-ras가, 돌연변이된 K-ras인, 이기능성 shRNA.
  6. 프로모터; 및
    상기 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 삽입물은, RNA 간섭을 통해, K-ras 유전자인 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 shRNA를 암호화하고;
    상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표적 유전자 서열이 서열번호 1 내지 5를 포함하는, 발현 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 shRNA를 위한 서열 정렬이, K-ras-TA-15 뉴클레오타이드 루프-19 뉴클레오타이드 표적 상보적 서열-3' 스템 아암-스페이서-5' 스템 아암-19 뉴클레오타이드 표적 변이체-TA-15 뉴클레오타이드 루프-19 뉴클레오타이드 표적 상보적 서열-3' 스템 아암인, 5' 스템 아암-19 뉴클레오타이드 표적을 포함하는, 발현 벡터.
  9. 제6항에 있어서, 상기 핵산 삽입물이, 서열번호 6 내지 27 또는 53 내지 56으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  10. 제6항에 있어서, 상기 벡터가, 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA 삽입물들의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 카피를 포함하는, 발현 벡터.
  11. 제6항에 있어서, 하나 이상의 shRNA가, 돌연변이된 K-ras 유전자 cDNA 서열 내에 존재하는 표적 부위 서열을 갖는, 발현 벡터.
  12. 치료학적 제제 담체; 및
    프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 치료학적 전달 시스템으로서,
    상기 핵산 삽입물은, RAN 간섭을 통해, K-ras 유전자인 표적 유전자 서열의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하고;
    상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하는, 치료학적 전달 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 제제 담체가, 압축된(compacted) DNA 나노입자, 또는 하나 이상의 다가 양이온(polycation)을 갖는 압축된 DNA 나노입자인, 전달 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 다가 양이온이, 10kDA 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-치환된 시스테인-리신 3-mer 펩타이드(CK30PEG10k)인, 전달 시스템.
  15. 제13항에 있어서, 상기 압축된 DNA 나노입자가, 리포솜, 가역적으로 차폐된 리포솜, 또는 이층상 함입 소포(BIV) 중 하나 이상으로 추가로 캡슐화되는, 전달 시스템.
  16. 제12항에 있어서, 상기 표적 유전자 서열이 서열번호 27 내지 30을 포함하는, 전달 시스템.
  17. 제12항에 있어서, 상기 핵산 삽입물이, 서열번호 31 내지 52로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는, 전달 시스템.
  18. 제12항에 있어서, 상기 핵산 삽입물이, 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는, 전달 시스템.
  19. K-ras 유전자를 발현하는 표적 조직에 하나 이상의 shRNA를 전달하는 방법으로서,
    프로모터, 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 shRNA를 암호화하는 핵산 삽입물을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함한다);
    상기 발현 벡터를, 리포솜을 포함하는 치료학적 제제 담체와 결합시키는 단계; 및
    상기 발현 벡터와 치료학적 제제 담체와의 복합체의 투여를 필요로 하는 환자에게 상기 발현 벡터와 치료학적 제제 담체와의 복합체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, K-ras 유전자를 발현하는 표적 조직에 하나 이상의 shRNA를 전달하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 치료학적 제제 담체가, 압축된 DNA 나노입자인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 DNA 나노입자는, 하나 이상의 다가 양이온들에 의해 압축된 것이고, 여기서, 상기 하나 이상의 다가 양이온은, 10kDA 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-치환된 시스테인-리신 3-mer 펩타이드(CK30PEG10k) 또는 30-mer 리신 축합 펩타이드를 포함하는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 압축된 DNA 나노입자는, 하나 이상의 수용체 표적화 모이어티를 포함하는 이층상 함입 소포(BIV)인 리포솜 내로 추가로 캡슐화되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 수용체 표적화 모이어티가, 소분자 2가 베타-회전 모사체를 포함하는, 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 핵산 삽입물이, 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 방법.
  25. 하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    상기 하나 이상의 표적 세포를 선택하는 단계; 및
    상기 표적 세포를, RNA 간섭을 통해, 하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 하나 이상의 shRNA는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하는,
    하나 이상의 표적 세포에서 K-ras 유전자의 발현을 저해하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 shRNA가 siRNA(개열-의존적) 및 miRNA(개열-독립적) 모티프를 포함하는, 방법.
  27. 사람 피험자에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    종양 세포 성장 억제를 필요로 하는 사람 피험자를 확인하는 단계; 및
    상기 사람 피험자에게 치료학적 제제 담체 중의 발현 벡터 복합체를 종양 세포 성장을 억제시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하고;
    여기서, 상기 발현 벡터가, RNA 간섭을 통해, 하나 이상의 표적 세포 중의 돌연변이된 K-ras인 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있는 하나 이상의 shRNA를 발현하며;
    여기서, 상기 하나 이상의 shRNA가, 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시키는 이기능성 RNA 분자를 포함하고;
    여기서, 상기 저해는 아폽토시스, 저지된 증식, 또는 감소된 종양 세포의 침습을 초래하는,
    사람 피험자에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 치료학적 제제 담체가 이층상 함입 소포(BIV)를 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 치료학적 제제 담체가, 소분자 2가 베타-회전 모사체를 포함하는 하나 이상의 수용체 표적화 모이어티를 포함하는, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 투여가, 종양내, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 및 정맥내 주사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 투여가, DNA:리포플렉스를 이용한 주사를 포함하는, 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 종양 세포 성장이, 돌연변이된 K-ras를 발현하는, 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 종양 세포 성장이 사람 췌관 선암종인, 방법.
  34. 제27항에 있어서, 상기 종양 세포 성장이, 폐암, 결장암, 흑색종, 인슐린종, 중피종, 난소암, 및 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제27항에 있어서, 상기 bishRNA가 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제27항에 있어서, 제2 항-신생물제를 사용한 병용 치료요법을 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제27항에 있어서, 세툭시마브 또는 베무라페니브를 사용한 병용 치료요법을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 돌연변이체 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 이기능성 shRNA 삽입물들을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 상기 이기능성 RNA 분자는, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있는, 발현 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는, 발현 벡터.
  40. 제38항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가, G12D-G12V-G12R, G12C-G12D-G12R, G12D-G12V-G12R, 또는 G12C-G12D-G12R 중 하나 이상으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함하는, 발현 벡터.
  41. 제38항에서, 상기 이기능성 shRNA가, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 삼중 삽입물을 포함하는, 발현 벡터.
  42. 돌연변이체 K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75 또는 100개의 이기능성 shRNA 삽입물들을 포함하는 발현 단위를 포함하는 세포로서, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열은 상기 K-ras 유전자 내에 위치되고, 상기 이기능성 RNA 분자가, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있는, 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는, 세포.
  44. 제42항에 있어서, 상기 이기능성 shRNA가 야생형 K-ras의 발현을 증가시키는, 세포.
  45. 효과적으로 침묵되는 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포들 또는 조직들을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법으로서,
    (a) 하기 중 하나 이상을 측정하는 단계:
    a. 상기 세포들 또는 조직들 중의 적어도 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 발현 수준;
    b. 상기 암 세포들 또는 조직들 중의 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 발현이 저하된 세포 환경에서 후보 유전자의 발현 수준 또는 후보 유전자들의 그룹의 발현 수준; 및
    c. 상기 암 세포들 또는 조직들 중의 하나 이상의 돌연변이된 K-ras 유전자들의 저하된 발현으로 이루어진 이러한 세포들의 표현형에 대한 후보 약물의 효과;
    (b) 상기 세포들 또는 조직들의 제1 서브세트에 후보 약물을 투여하고 상기 세포들 또는 조직들의 제2 서브세트에 위약을 투여하는 단계;
    (c) 상기 후보 약물 또는 위약의 투여 후 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
    (d) 후보 약물이 K-ras 돌연변이체 발현 세포 환경과 비교하여, 돌연변이된 K-ras의 발현이 감소된 세포 환경에서, 세포들 또는 조직들의 제2 서브세트에서 발생하는 임의의 감소와 비교하여 통계학적으로 유의한, 결정된 표현형을 생성하는데 효과적인지를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 통계학적으로 유의한 감소는, 상기 후보 약물이, 유의한 K-ras 돌연변이 배경 없이 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타내는,
    효과적으로 침묵되는 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하는 세포 또는 조직을 치료하는데 유용한 것으로 생각되는 후보 약물을 평가하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 세포 또는 조직이, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras를 포함하도록 변형된 하나 이상의 검출가능한 유전자를 추가로 발현하고, 상기 검출가능한 표지물의 발현 수준이, 야생형 K-ras 및 하나 이상의 돌연변이된 K-ras에 대한 후보 물질의 효과와 상호 관련되는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 세포 또는 조직이, K-ras 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형되었고, 상기 이기능성 RNA 분자의 하나 이상의 표적 부위 서열이 K-ras 유전자 내에 위치되며, 상기 이기능성 RNA 분자가, K-ras의 발현 수준을 감소시키기 위해 개열-의존적 및 개열-독립적 RNA-유도된 침묵 복합체를 활성화시킬 수 있는, 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 세포 또는 조직이 서열번호 1 내지 22 또는 53 내지 56으로부터 선택되는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형된, 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 세포 또는 조직이, 서열번호 2, 18, 20, 21; 또는 서열번호 2, 18 및 20의 조합; 또는 서열번호 21, 2 및 18의 조합으로부터 선택되는 특정 K-ras 돌연변이를 표적화하는 하나 이상의 삽입물을 포함하는 이기능성 shRNA를 발현하도록 변형된, 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220085311A (ko) * 2020-12-15 2022-06-22 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252526B2 (en) * 2006-11-09 2012-08-28 Gradalis, Inc. ShRNA molecules and methods of use thereof
US9132146B2 (en) 2009-12-23 2015-09-15 Gradalis, Inc. Furin-knockdown and GM-CSF-augmented (FANG) cancer vaccine
TW201402813A (zh) * 2012-05-09 2014-01-16 Gradalis Inc 對單核苷酸ｋｒａｓ突變具專一性之雙功能性短髮夾ｒｎａ（ｂｉ－ｓｈｒｎａ）
WO2014143659A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Araxes Pharma Llc Irreversible covalent inhibitors of the gtpase k-ras g12c
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
CA3089881C (en) * 2013-11-26 2024-04-02 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Personalized medicine approach for treating cognitive loss
LU92353A1 (en) * 2014-01-14 2015-07-15 Univ Muenster Wilhelms Antibody-mediated delivery of RNAI
EP3134528A4 (en) * 2014-04-25 2017-12-06 Strike Bio, Inc. Multiple targeted rnai for the treatment of cancers
WO2015164818A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Strike Bio, Inc. Multiple targeted rnai for the treatment of cancers
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
AR102094A1 (es) 2014-09-25 2017-02-01 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas kras con una mutación g12c
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
KR20180005178A (ko) 2015-04-10 2018-01-15 아락세스 파마 엘엘씨 치환된 퀴나졸린 화합물 및 이의 사용방법
JP6789239B2 (ja) 2015-04-15 2020-11-25 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｋｒａｓの縮合三環系インヒビターおよびその使用の方法
HK1251257A1 (zh) * 2015-06-10 2019-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System 用於醫治疾病的外泌體的用途
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058768A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10730867B2 (en) 2015-09-28 2020-08-04 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10975071B2 (en) 2015-09-28 2021-04-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058807A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356359B1 (en) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3364977A4 (en) 2015-10-19 2019-09-04 Araxes Pharma LLC PROCESS FOR SCREENING INHIBITORS OF RAS
KR20240113606A (ko) 2015-11-16 2024-07-22 아락세스 파마 엘엘씨 치환된 헤테로사이클릭 그룹을 포함하는 2-치환된 퀴나졸린 화합물 및 이의 사용 방법
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
EP4487869A2 (en) * 2016-04-22 2025-01-08 CureVac SE Rna encoding a tumor antigen
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018064510A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10377743B2 (en) 2016-10-07 2019-08-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of RAS and methods of use thereof
WO2018098352A2 (en) * 2016-11-22 2018-05-31 Jun Oishi Targeting kras induced immune checkpoint expression
CA3049926A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Heparegenix Gmbh Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death
WO2018140514A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
WO2018140513A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c modulators for treating cancer
WO2018140512A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
EP3573964A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
EP3573967A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Fused hetero-hetero bicyclic compounds and methods of use thereof
EA201991804A1 (ru) * 2017-02-01 2020-02-07 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ мРНК, КОДИРУЮЩЕЙ ПЕПТИДЫ С АКТИВИРУЮЩЕЙ ОНКОГЕННОЙ МУТАЦИЕЙ
TW201906832A (zh) 2017-05-25 2019-02-16 美商亞瑞克西斯製藥公司 用於癌症治療之化合物及其使用方法
EP3630747A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Araxes Pharma LLC Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
CA3063440A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of kras
WO2018225873A1 (ja) * 2017-06-09 2018-12-13 協和発酵キリン株式会社 核酸含有ナノ粒子
AU2018316166A1 (en) 2017-08-07 2020-02-06 The Regents Of The University Of California Platform for generating safe cell therapeutics
AU2019226586B2 (en) * 2018-03-02 2024-08-29 Elicio Therapeutics, Inc. Compounds including a mutant KRAS sequence and a lipid and uses thereof
CN112512507A (zh) * 2018-04-19 2021-03-16 得克萨斯州大学系统董事会 使用外排体对肿瘤抑制因子的治疗性调节
WO2019226612A1 (en) * 2018-05-21 2019-11-28 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Compositions and methods for treating rsv-infections
US12134620B2 (en) 2018-08-01 2024-11-05 Araxes Pharma Llc Heterocyclic spiro compounds and methods of use thereof for the treatment of cancer
CN114641570A (zh) * 2019-08-14 2022-06-17 科迪亚克生物科学公司 具有靶向kras的反义寡核苷酸的细胞外囊泡
CN110835644B (zh) * 2019-12-16 2021-08-17 广州市宝创生物技术有限公司 K-ras基因突变位点检测试剂盒
CN112980840A (zh) * 2019-12-17 2021-06-18 南京大学 用于癌症治疗的多靶向siRNA
US20230039652A1 (en) * 2021-07-09 2023-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
WO2024220653A1 (en) * 2023-04-19 2024-10-24 Gradalis, Inc. Compositions and methods for modulating sialic acid production and treating hereditary inclusion body myopathy (hibm)
WO2025054270A1 (en) * 2023-09-06 2025-03-13 Gradalis, Inc. Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050288242A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of RAS gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2007522793A (ja) * 2003-10-23 2007-08-16 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた、ＲＮＡ干渉を介したＮＯＧＯ及び／又はＮＯＧＯ受容体遺伝子発現の阻害
CN101563104A (zh) * 2006-02-01 2009-10-21 约翰霍普金斯大学 用于肿瘤或传染性疾病免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸结合物
DK2040725T3 (da) * 2006-06-23 2014-04-22 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Målrettet afgivelse af lægemidler, terapeutiske nukleinsyrer og funktionelle nukleinsyrer til pattedyrceller via intakte dræbte bakterieceller
US8252526B2 (en) * 2006-11-09 2012-08-28 Gradalis, Inc. ShRNA molecules and methods of use thereof
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
EP2190995A2 (en) * 2007-09-18 2010-06-02 Intradigm Corporation Compositions comprising k-ras sirna and methods of use
CN102782139B (zh) * 2009-10-30 2015-11-25 格兰达利斯有限公司 在表达pdx-1的神经内分泌肿瘤中靶向pdx-1癌基因的新治疗性rna干扰技术
TW201402813A (zh) * 2012-05-09 2014-01-16 Gradalis Inc 對單核苷酸ｋｒａｓ突變具專一性之雙功能性短髮夾ｒｎａ（ｂｉ－ｓｈｒｎａ）

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220085311A (ko) * 2020-12-15 2022-06-22 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
WO2022131744A1 (ko) * 2020-12-15 2022-06-23 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물

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SG11201407239SA (en) 2014-12-30

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