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KR20140142298A - 경구투여 - Google Patents

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KR20140142298A
KR20140142298A KR1020147029245A KR20147029245A KR20140142298A KR 20140142298 A KR20140142298 A KR 20140142298A KR 1020147029245 A KR1020147029245 A KR 1020147029245A KR 20147029245 A KR20147029245 A KR 20147029245A KR 20140142298 A KR20140142298 A KR 20140142298A
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데이비드 베커
캐롤라인 에크블라드
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애피바디 에이비
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Abstract

본 발명은 생물제제의 투여 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 원하는 치료 활성을 부여한 모이어티; 및 알부민과 결합하는 펩타이드 모이어티를 포함하는 경구 투여용 화합물을 제공한다.

Description

경구투여{Oral administration}
본 발명은 생물제제의 투여 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티(moiety); 및 알부민과 결합하는 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 경구 투여용 화합물을 제공한다.
단백질 치료제의 경구 전달
현재 시장에서 대다수의 단백질 및 펩타이드 치료제는 비경구 경로로, 즉 정맥주사, 근육주사, 또는 피하주사와 같이 위장관을 통과하지 않고 투여된다. 체순환으로 직접 들어가는 정맥투여는 100% 생체이용률과 약물 작용의 빠른 발현을 제공한다. 그러나, 혈액내에 약물의 즉각적인 고농도는 부작용의 위험을 증가시킨다. 더욱이, 임의의 주사 방법에 의한 투여는 통증과 불편함 때문에 낮은 환자의 컴플라이언스(compliance)와 관련이 있다. 자가 투여는 종종 가능하지 않으며 이런 이유로 치료는 병원에서 수행되어야만 한다. 후자는 약물의 반감기가 짧고, 잦은 반복된 투여가 치료 작용의 적절한 수준을 유지하기 위해 요구되는 경우 까다로운 문제가 된다. 병원 치료, 그리고 경우에 따라서 환자의 필요한 입원은 또한 사회에 대한 증가된 비용을 의미한다. 따라서 간소화한 투여는 각각 특별한 장점 및 제한과 관련된 경구, 비강내, 폐, 경피 또는 직장과 같은 대체적 전달 경로를 위해 의도된 약물 개발을 위한 주요 추진력이다. 경구투여는 특히 소아환자의 치료용으로 가장 편리한 투여 경로 중 하나로 남아있다. 더욱이 경구 제제는 멸균 조건에서 생산을 필요로 하지 않는데, 이는 약물 단위당 제조비용을 감소시킨다(Salama et al, Adv Drug Deliv Rev. 58:15-28, 2006). 일부의 단백질 치료제에 대하여, 경구 전달 경로는 인슐린에 대하여 제시되어온 바와 같이 심지어 더 생리적일 수도 있다(Hoffman and Ziv, Clin Pharmacokinet. 33:285-301, 1997).
통상적인 저분자량 약물의 경구 전달은 실제로 잘 확립되어 왔다. 그러나 크고, 덜 안정적이며 종종 극성인 펩타이드 및 단백질 치료제의 경구전달은 약물이 1) 위의 산성 환경에 저항력이 있어야 하고 2) 위장관에서 효소 분해에 저항력이 있어야 하며 3) 장표피를 가로질러 혈액 순환계에 도달할 수 있어야 하는 것을 포함하는 또 다른 과제에 직면한다. 상이한 접근 방법들이 단백질 자체를 변형시키거나 제제 또는 약물 운반 시스템을 최적화하는 것으로 이러한 과제들을 대처하기 위하여 시도되어 왔다.
경구 생체이용률에 영향을 미치는 인자
경구로 투여되는 단백질 치료제의 생체이용률은 분자량, 아미노산 서열, 소수성, 등전점(pI), 용해성 및 pH 안정도와 같은 단백질의 생리학적 특성뿐만 아니라 위장관에서 맞딱뜨리는 생물학적 장벽, 즉 단백질 분해 환경과 장벽을 통한 큰 분자들의 대체로 부족한 흡수에도 달려있다.
위장관의 생리화학적 환경은 개체의 급식상태에 따라 다양하다. 절식과 섭식 단계 사이에서 달라지는 인자들은 pH, 위장액의 구성 및 위의 용량을 포함한다. 인간의 경우, 위의 pH는 절식 상태에서 3-7까지 오르는 반면 섭식 상태에서는 대략 1-2 정도이다. pH는 소장 전체에서 다양하나, 절식 및 섭식 상태에서 각각 평균적으로 대략 pH 5 및 6.5이다(Klein, AAPS J.12:397-406, 2010). pH 차이는 각각 특정의 최적 pH와 관련된 단백질 분해효소의 활성 수준에 영향을 미친다. 위에서 지배적인 단백질 분해효소인 펩신은 약 pH 2에서 최적의 활성을 가지나, 소장의 트립신과 키모트립신(chymotrypsin)은 약 pH 8에서 최적의 활성을 가진다. 더욱이, 위를 비우는 것은 속도 제한 단계이다. 음식, 특히 유지식품은 위를 비우는 것과 이에 따른 약물 흡수 속도를 느리게 하며(Singh, Clin Pharmacokinet. 37:213-55, 1999), 따라서 약물이 단백질 분해효소에 노출되는 시간을 늘린다. 그러므로, 약물의 생체이용률은 약물이 상당량의 액체 또는 다른 종류의 액체와 함께하거나 함께하지 않고 식사 중 또는 식간에 섭취되었는지 여부에 영향을 받을 수 있다.
장벽을 통한 부족한 흡수는 경구로 전달되는 단백질 치료제의 생체이용률을 제한하는 주요 인자로 남아있다. 경구로 섭취되는 약물은 여느 영양소와 마찬가지로 장벽을 통과하기 위한 두 가지 선택권을 갖는다; 세포를 횡단하는 통로와 관련된 트랜스셀룰라(transcellular) 경로 또는 밀착 연접을 통해 인접한 세포 사이의 통로와 관련된 파라셀룰라(paracellular) 경로를 이용하는 것이다. 500 Da 미만의 분자량을 갖는 저분자는 상기 두 가지 경로를 이용하여 통과할 수 있다(Muller, Curr Issues Mol Biol.13:13-24, 2011). 장벽을 통과하기 위한 큰 분자량을 가진 약물의 능력은 전하, 친유성 및 친수성과 같은 약물의 생리화학적 특성에 달려있다. 친유성 약물은 트랜스셀룰라(transcellular) 경로가 우세한 반면, 친수성 약물은 파라셀룰라(paracellular) 경로에 의해 통과할 수 있다(Salama et al, 2006, supra). 그러나, 파라셀룰라 공간의 크기는 10 및 30-50 Å 사이이며 파라셀룰라 수송은 일반적으로 15 Å(~3.5 kDa) 이하의 반경을 가지는 분자에 제한된다고 제안되었다(Rubas et al, J Pharm Sci. 85:165-9, 1996). 트랜스셀룰라 경로에 대해서 말하자면, 저분자량 물질은 수동 확산에 의해 손쉽게 통과한다. 그러나, 고분자량 물질은 음세포작용(pinocytocis, 비특이성 "세포 음용") 또는 통과세포외배출(transcytosis, 수용체 매개 수송)과 같은 에너지 소비를 필요로 하는 능동적인 과정에 국한된다.
마지막으로, 생체이용률은 또한 연령(약물은 일반적으로 태아, 신생아 및 노년 인구에서 더 느리게 대사된다), 위장관의 건강, 및 일반적 질병 상태(예를 들어 간부전, 나쁜 신장 기능)를 포함하는 환자간 가변성에 의할 뿐만 아니라, 환자내 가변성, 즉 동일한 환자에서 시간의 흐름에 따른 가변성에 의해 영향을 받는다.
경구 투여된 단백질 및 펩타이드의 생체이용률 증가는 치료적으로 효과적인 용량의 전달을 가능하게 하고 제조 비용을 감소시키며 보다 적게 환자간 및 환자내 가변성을 가지게 하는데 결정적이다. 단백질 치료제의 경구 생체이용률을 향상시키기 위한 전략은 소수성, 전하, pH 안정성 및 용해성과 같은 생리화학적 특성을 변화시키는 것; 약물 제제내에 단백질 분해효소 억제제 또는 흡수 개선제를 포함시키는 것; 그리고 에멀전(emulsion), 리포좀, 마이크로스피어 또는 나노입자와 같은 제제 운반체를 사용하는 것 등 광범위하다(reviewed in Park et al, Reactive and Functional Polymers, 71:280-287, 2011).
단백질의 생체 내 반감기 연장
경구 투여되는 펩타이드 및 단백질 약물의 상대적으로 낮은 생체이용률을 고려하면, 생물학적 활성 형태에서 장 상피막을 통과하기 위해 다루는 부분의 긴 생체 내 혈장 반감기를 유지하는 것이 관련되게 된다. 빠른 신장 청정(renal clearance)을 막기 위한 몇 가지 전략들이 문헌에서 기술되었으며, 당업자들에게 알려졌다. 상기 전략들은 알부민, 항체 또는 그의 단편을 융합, 결합 또는 그와 관련된 것, 또는 하나 또는 몇 개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도체의 결합을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜화(PEGylation)는 또한 점막을 통한 흡수를 촉진하고, 펩타이드 약물을 안정화하고 단백질 분해효소에 의한 분해를 방지하는 것으로 보고되었다(Meibohm, Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Biotech Drugs, Wiley-VCH, 2006). 생체 내 투여 후 긴 반감기를 보이는 분자들의 관계는 동일한 분자들의 투여 전 직접 융합 또는 결합보다 선호될 수 있는데, 이는 작은 크기를 유지하고 긴 반감기를 보이는 분자 일부의 단백질 분해를 방지하기 위함이다.
생체 내 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 혈정 알부민과의 관계
혈청 알부민은 포유류 혈청에서 가장 풍부한 단백질이며(인간에서 35-50 g/l, 즉 0.53-0.75mM), 혈청 알부민과 생체 내에서 관계를 가지게 하는 펩타이드 또는 단백질을 공유결합시킨 운반 분자를 위한 여러 전략들이 예를 들어 WO91/01743, WO01/45746 및 데니스 등의 문헌에서 기술되었다(J Biol Chem 277:35035-43, 2002). 최초 문헌은 그 중에서도 다른 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 연쇄상구균 단백질 G(SpG)로부터 유래한 알부민 결합 펩타이드 또는 단백질의 이용을 기술하고 있다. 그 발상은 세균에서 유래된, 알부민 결합 펩타이드/단백질과 혈액에서 빨리 제거되는 것으로 보여왔던 치료적으로 관심있는 펩타이드/단백질을 융합하는 것이다. 생산된 융합 단백질은 생체 내에서 혈청 알부민과 결합하고, 융합된 치료학적으로 관심있는 펩타이드/단백질의 총 반감기를 증가시키는 그의 긴 반감기에 장점이 있다. WO01/45746 및 데니스 등은 동일한 개념에 관련이 있는데, 하지만 여기서, 저자들은 혈청 알부민과 결합하기 위한 비교적 짧은 펩타이드를 활용하였다. 상기 펩타이드들은 파지 발현 펩타이드 라이브러리로부터 선택되었다. 또한 US2004/0001827(데니스)로 발표된 미국 특허출원은 혈청 알부민에 결합하고 종양 표적화용으로 생활성 화합물에 결합된, 파지 발현 기술에 의해 다시 확인된 펩타이드 리간드를 포함하는 구조물의 이용을 개시하고있다.
세균 수용체 단백질의 알부민 결합 도메인
연쇄상구균 단백질 G(SpG)는 연쇄상구균의 특정 균주의 표면에 존재하는 두가지 기능을 가진 수용체이며 IgG 및 혈청 알부민 모두에 결합할 수 있다(Bjorck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). 그 구조는 몇 개의 구조적으로 그리고 기능적으로 상이한 도메인이 고도로 반복되고(Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), 엄밀히 말하면 세 개의 Ig-결합 도메인과 세 개의 혈청 알부민 결합 도메인으로 되어있다 (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). SpG에서 세 개의 혈청 알부민 결합 도메인 중 하나의 구조는 세 개의 나선 묶음 주름(helix bundle fold)을 보이는 것으로 밝혀졌다(Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996; Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). 46 아미노산 모티프는 ABD(알부민 결합 도메인)으로 정의되었고 그 뒤에 또한 G148-GA3(단백질 G-관련 알부민 결합을 위한 GA)로 지정되었다.
단백질 G의 것과는 다른 세균 알부민 결합 도메인 또한 확인되었는데, 이의 일부는 단백질 G의 것과 구조적으로 유사하다. 상기 알부민 결합 도메인을 포함하는 단백질의 예로는 PAB, PPL, MAG, 및 ZAG 단백질이 있다(Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006). 상기 알부민 결합 도메인의 구조적이고 기능적인 연구가 예를 들어 요한슨과 그 공동연구자들에 의해 수행되고 보고되었다(Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997).
상기 기술된 세 개의 나선 묶음 주름 단백질에 더하여, 또한 알부민과 결합하는 다른 관계없는 세균 단백질이 있다. 예를 들어, "M 단백질"로 지정된 연쇄상구균 단백질의 패밀리는 알부민과 결합하는 멤버를 포함한다(참조, 예를 들면 Table 2 in Navarre & Schneewind, MMBR 63:174-229, 1999). 비제한적인 예로는 단백질 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, 및 H가 있다.
조작된 ABD 변이체
로작(Rozak) 등은 다양한 종 특이성 및 안정성에 대하여 선택되고 연구된 G148-GA3의 인공 변이체의 생성을 보고했으며(Rozak et al, 2006, supra), 반면에 존슨 등은 매우 많이 향상된 인간 혈청 알부민에 대한 친화성을 가지는 G148-GA3의 인공 변이체를 개발했다(Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008; WO2009/016043).
몇 개의 T- 및 B- 세포 에피토프가 알부민 결합 도메인 G148을 인간 투여를 위한 약학 조성물로 이용하는데 덜 적합하게 만드는 연쇄상구균 단백질 G 균주148(G148)의 알부민 결합 영역내에서 실험적으로 규명되었다(Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003). 면역 촉진 특성을 감소시키기 위해, 더 적은 수의 잠재적인 B- 및 T-세포 에피토프를 가지지만 유지된 높은 알부민 결합 능력을 가지는 새로운 ABD 변이체가 WO2012/004384에 기술된 바와 같이 개발되었다.
상기 배경 설명으로부터 명백한 바와 같이, 경구 경로를 통하여 투여될 수 있는 치료학적으로 효과적인 생물제제의 필요성이 남아있다.
본 발명의 여러 측면들은 하기에 더 정의된 분자들의 경구 투여를 가능하게 하는 것을 통해 이러한 필요성을 다루고 있다. 따라서, 본 발명은 경구 투여를 통해 치료에 사용하기 위한 그 분자들; 이러한 분자들을 포함하고 경구 투여에 적합하게 제형화된 약학 조성물; 및 이러한 분자들 또는 약학 조성물이 이러한 치료를 필요로 하는 객체에게 경구로 투여되는 치료 방법을 제공한다.
I 치료용 화합물
첫번째 측면으로, 본 발명은
- 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG,PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 단편 또는 그의 어느 하나의 유도체로 구성되는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘(exendin) 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편에서 선택되지 않는 것인, 경구 투여를 통한 치료용 화합물을 제공한다.
상기 정의된 화합물은, 예를 들어 알려진 유기 화학 방법을 이용하여 공유결합에 의해 연결될 수 있거나, 하나 또는 두 개의 모이어티 모두가 폴리펩티드라면, 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 시스템에서 하나 또는 그 이상의 융합 폴리펩티드로서 발현되거나, 어떠한 다른 방식으로 직접적으로 연결되거나 또는 다수의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 매개될 수도 있는 적어도 두 개의 모이어티 (I) 및 (II)를 포함한다. 다른 모이어티들과 알부민 결합 모이어티의 결합에 관한 고찰을 위하여, 예를 들어 상기와 같이 정의된 화합물을 제공하기 위하여, 예를 들면 본 명세서에 참고로 포함된 PCT 문헌 WO2010/054699 및 WO2012/004384를 참조하라.
원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I)
본 발명의 하나의 실시형태에서, 모이어티 (I)으로 지정된 화합물의 일부는 예를 들어 인슐린, 인슐린 유사체, IL-2, IL-5, GLP-1, BNP, IL 1-RA, KGF, 스템젠®(Stemgen®), GH, G-CSF, CTLA-4, 마이오스타틴(myostatin), 인자 VII(Factor VII), 인자 VIII(Factor VIII) 및 인자 IX(Factor IX), 및 그들 중 어느 하나의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 인간 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 혈액 응고 및 보체 인자, 선천성 면역 방어 및 조절성 펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 성분을 포함한다.
다른 하나의 실시형태에서, 모이어티 (I)은 모듈린(modulin), 세균성 독소, 호르몬 (엑센딘 제외), 선천성 면역 방어 및 조절성 펩타이드, 효소 및 활성 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 비-인간 생물학적 활성 단백질을 포함한다.
또 다른 하나의 실시형태에서, 모이어티 (I)은 표적 분자와의 선택적 상호작용이 가능한 결합 폴리펩티드를 포함한다. 상기 결합 폴리펩티드는 예를 들어 항체, 단편, 및 항체 결합 활성을 실질적으로 보유하고 있는 이들의 도메인; 미소체, 맥시바디(maxybody), 아비머(avimer), 및 다른 작은 이황화결합 단백질; 및 포도상구균 단백질 A 및 그의 도메인, 다른 세 개의 나선 도메인, 리포칼린(lipocalin), 안키린(ankyrin) 반복 도메인, 셀룰로스 결합 도메인, 감마 크리스탈린(γ crystalline), 녹색 형광 단백질, 인간 세포독성 T 림프구-관련 항원 4, 쿠니쯔(Kunitz) 도메인과 같은 단백질 분해 효소 억제제, PDZ 도메인, SH3 도메인, 펩티드 압타머, 포도상구균 핵산 분해 효소, 텐다미스탯(tendamistat), 파이브로넥틴 타입 III 도메인, 트랜스페린, 징크 핑거(zinc finger) 및 코노톡신(conotoxin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 스캐폴드에서 유래한 결합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 일 실시형태의 일부 예에서, 결합 폴리펩티드는 포도상구균 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체를 포함하며 Nilsson B et al, Protein Engineering 1:107-133, 1987에서 기술되었다. 다수의 상이한 표적에 대한 친화성을 갖는 상기 변이체들은 이에 제한되지 않지만 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함되는 WO95/19374; Nord et al, Nat Biotech (1997) 15:772-777; 및 WO2009/080811과 같은 다수의 선행 문헌들에 기술된 바와 같이 라이브러리 및 더 조작된 것으로부터 선택되었다. 본 발명에 따른 치료용 화합물의 실시형태에서, 모이어티 (I)에 대응하는 단백질 Z의 변이체는 서열번호 719, 서열번호 720, 및 서열번호 721로부터 선택되는 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다. 상기 언급된 논문 및 PCT 문헌에 기술된 바와 같이, X를 포함하는 아미노산 위치는 단백질 Z 변이체의 결합 기능에 모두 관련되고, Z 변이체가 결합하도록 설계된 표적이 무엇이냐에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는 이들 실시형태에서, 모이어티 (I)의 스캐폴드 아미노산 서열은 서열번호 719 또는 서열번호 720를 포함한다.
모이어티 (I)이 표적 분자와 선택적 상호작용을 할 수 있는 결합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 실시형태에서, 상기 표적 분자는 CD14, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD40, CD52, CD56, CD70, CD138, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX, CEA, IL-2 수용체, IGF1R, VEGFR2, MUC1, PDGFR-베타, PSMA, TAG-72, FOLR1, 메소텔린(mesothelin), CA6, GPNMB, 인테그린(integrin) 및 ephA2와 같은 암-관련 또는 다른 세포 표면 관련 항원; TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-18, IL-23, IL-36, G-CSF, GM-CSF와 같은 사이토카인 및 그들의 수용체; IL-8, CCL-2 , CCL11와 같은 케모카인 및 그들의 수용체; C3 및 인자(factor) D와 같은 보체 인자; HGF 및 마이오스타틴(myostatin)과 같은 성장 인자; GH, 인슐린 및 소마토스타틴(somatostatin)과 같은 호르몬; 알츠하이머 질병의 A?펩타이드와 같은 펩타이드; 다른 질병-관련 아밀로이드(amyloid) 펩타이드; 히스타민(histamine) 및 IgE와 같은 고민감성 매개체; 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor)와 같은 혈액 응고 인자; 및 세균성 독소 및 뱀독(snake venoms)과 같은 독소로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
하나의 대체 실시형태에서, 모이어티 (I)은 치료 활성을 가진 비단백질성(non-proteinaceous) 성분을 포함한다. 특정 관심의 예는 세포독성 제제와 항염증 제제인데, 알부민이 종양 조직과 염증 부위에서 축적되는 것을 보여왔기 때문이다(Kratz and Beyer, Drug Delivery 5: 281-99, 1998; Wunder et al, J. Immunol. 170: 4793-801, 2003). 이것은 결국 관련있는 종양 조직 또는 염증 부위에 표적화 및 축적을 위한 알부민 결합 모이어티와 함께 상기 화합물을 경구 전달하는 것에 대한 근거를 제공한다. 세포독성 제제의 비제한적인 예로 칼리케아마이신(calicheamycin), 아우리스타틴(auristatin), 독소루비신, 마이탄시노이드(maytansinoid), 탁산, 엑테이나시딘(ecteinascidin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 캠프토테신(camptothecin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 사이클로스포린 및 그들의 유도체, 및 그의 조합이 있다. 항염증 제제의 비제한적인 예로 비-스테로이드 항염증 약물(NSAIDs), 사이토카인 억제 항염증 약물(CSAIDs), 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 프레드니손(prednisone), 사이클로스포린, 모로니시드 계피산(morroniside cinnamic acid), 레플루노마이드(leflunomide) 및 그들의 유도체, 및 이의 조합이 있다.
상기 실시형태에서, 비단백질성 모이어티 (I) 및 알부민 결합 모이어티 (II)는 비-공유결합적으로 연관된 것일 수도 있으나, 서로 공유적으로 결합되는 것이 현재 바람직하다.
비단백질성 모이어티 (I)과 알부민 결합 모이어티 (II)의 결합은 용해성을 증가시킬 수도 있으며, 그렇게 함으로써 생체이용률을 증가시킬 수도 있는데, 부족한 용해성의 화합물은 반대로 경구 투여에 적합하지 않다.
알부민과 결합하는 모이어티 ( II )
여기에서 정의된 바와 같이, 경구 투여를 통한 치료용 화합물은 알부민에 결합하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하며 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 단편 또는 그 중 어느 하나의 유도체를 포함한다.
배경 기술 섹션 및 여기에서 인용한 로작 등 및 요한슨 등의 논문에서 설명된 바와 같이, 다수의 상기 알부민 결합 단백질은 GA 도메인으로 표시된 알부민 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 화합물의 모이어티 (II)는 자연적으로 발생한 GA 도메인 또는 그의 유도체를 포함한다. 이러한 GA 도메인의 유용한 구체적인 예는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA1, 도메인 GA2, 및 도메인 GA3와 이들의 유도체이다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3을 포함한다. 이 알부민 결합 도메인은 또한 본 문헌에서 "ABD" 또는 "ABDwt"으로 자주 표시되었으며, 첨부된 목록의 서열번호 515의 아미노산 서열을 가진다. 다른 하나의 실시형태에서, 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3의 유도체를 포함한다. 여러 상기 유도체들은, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 상기 언급한 WO2009/016043 및 WO2012/004384에 기술된 바와 같이 개발되었다.
WO2009 /016043에서 개시된 바와 같이 ABD 유사체를 포함하는 모이어티 ( II )
따라서, 참고문헌 WO2009/016043와 관련하여, 본 발명의 경구 투여를 통한 치료용 화합물의 모이어티 (II)는 알부민 결합 모티프로 구성될 수 있으며, 모티프는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I
여기서, 서로 독립적으로,
X5 는 Y 및 F로부터 선택되고;
X8 은 N, R, 및 S로부터 선택되고;
X9 는 V, I, L, M, F 및 Y로부터 선택되고;
X11 은 N, S, E, 및 D로부터 선택되고;
X12 는 R, K, 및 N으로부터 선택되고;
X14 는 K 및 R로부터 선택되고;
X20 은 D, N, Q, E, H, S, R 및 K로부터 선택되고;
X23 은 K, I, 및 T로부터 선택되고;
X24 는 A, S, T, G, H, L 및 D로부터 선택되고; 및
X25 는 H, E, 및 D로부터 선택된다.
상기 언급된 서열 종류의 정의와 관련하여, 상기 화합물에서 모이어티 (II)에서 사용하기 위한 알부민 결합 폴리펩티드는 WO2009/016043의 실험 섹션에서 상세히 기술된 바와 같이 식별되고 특징지어진 다수의 알부민 결합 폴리펩티드의 통계분석을 기반으로 한다. 간략하게, 변이체는 ABDwt(서열번호 515)의 모 폴리펩티드 서열의 무작위 변위체의 큰 풀(pool)로부터 선택되었으며, 상기 선택은 알부민과의 상호작용, 예를 들면 파지 디스플레이(phage display) 또는 다른 선택 실험을 기반으로 한다. 식별된 알부민 결합 모티프, 또는 "ABM"은 모 스캐폴드의 알부민 결합 영역에 상응하며, 이 영역은 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인 내에 두 개의 알파 나선을 구성한다. 모 스캐폴드에서 두 개의 ABM 나선의 최초 아미노산 잔기는 이미 알부민과 상호작용하기 위한 결합 표면을 구성하는데, 이 결합 표면은 대체 알부민 결합 능력을 제공하기 위해 본 발명에 따른 치환에 의해 변형된다.
일 실시형태에서, X5 는 Y이다.
일 실시형태에서, X8 은 N 및 R로부터 선택되며, 특히 R일 수 있다.
일 실시형태에서, X9 는 L이다.
일 실시형태에서, X11 은 N 및 S로부터 선택되며, 특히 N일 수 있다.
일 실시형태에서, X12 는 R 및 K로부터 선택되며, 예를 들어 X12 는 R이 되거나 K가 될 수 있다.
일 실시형태에서, X14 는 K이다.
일 실시형태에서, X20 은 D, N, Q, E, H, S 및 R로부터 선택되며, 특히 E일 수 있다.
일 실시형태에서, X23 은 K 및 I로부터 선택되며, 특히 K일 수 있다.
일 실시형태에서, X24 는 A, S, T, G, H 및 L로부터 선택된다.
더욱 구체적인 일 실시형태에서, X24 은 L이다.
좀 더 구체적인 일 실시형태에서, X23X24 는 KL이다.
다른 더욱 구체적인 일 실시형태에서, X23X24 는 TL이다.
일 실시형태에서, X24 는 A, S, T, G 및 H로부터 선택된다.
더욱 구체적인 일 실시형태에서, X24 는 A, S, T, G 및 H로부터 선택되며, X23 은 I이다.
일 실시형태에서, X25 는 H이다.
WO2009/016043의 실험 섹션에서 상세하게 기술된 바와 같이, 알부민 결합 변이체의 선택은 상당량의 개개의 알부민 결합 모티프(ABM) 서열들을 식별하게 하였다. 이들 서열들은 본 발명의 맥락에서 모이어티 (II)로서 알부민 결합 아미노산 서열의 정의에서 ABM 서열의 개개의 실시형태를 구성한다. 상기 개개의 알부민 결합 모티프의 서열은 서열번호 1-257로서 도 1에 나타낸다. 특정의 실시형태에서, ABM은 서열번호 1-257로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 더욱 구체적인 실시형태에서, ABM 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 155, 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244, 및 서열번호 245로부터 선택된다. 다른 더 구체적인 실시형태에서, AMB 서열은 서열번호 3, 서열번호 53, 서열번호 239로부터 선택된 것이다.
알부민 결합 모이어티 (II)의 실시형태에서, ABM은 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인의 일부를 형성할 수 있다. 예를 들어, ABM은 상기 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인 내에 상호연결 고리를 가진 두 개의 알파 나선의 일부를 필수적으로 구성하거나 형성할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 상기 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인은 세균 수용체 단백질의 세 개의 나선 도메인으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이러한 세균 수용체 단백질의 비제한적인 예는 연쇄상구균, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 및 피네골디아(Finegoldia) 종으로부터 분리된 알부민 결합 수용체 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되며, 예를 들어 단백질 G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 구체적인 실시형태에서, ABM은 단백질 G의 일부를 형성하며, 예를 들어 연쇄상구균 균주 G148로부터 분리된 단백질 G와 같다. 본 실시형태의 상이한 변이체에서, ABM이 일부를 형성한 것의 세 개의 헬릭스 묶음 단백질 도메인은 연쇄상구균 균주 G148로부터 분리된 단백질 G의 도메인 GA1, 도메인 GA2 및 도메인 GA3로 구성되는 군으로부터 선택되며, 특히 도메인 GA3이다.
대체 실시형태에서, ABM은 하나 또는 그 이상의 황색 포도상구균으로부터 분리된 세균 수용체 단백질 단백질 A의 다섯개의 세 개의 나선 도메인(five three-helix domains)의 일부를 형성한다; 즉 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인은 단백질 A 도메인 A, B, C, D, 및 E로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 유사한 실시형태에서, ABM은 단백질 Z의 일부를 형성하는데, 이는 황색 포도상구균으로부터 분리된 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된다.
ABM이 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인의 "일부를 형성"하는 실시형태에서, ABM의 서열은 상기 ABM이 원래의 도메인에서 유사한 구조적 모티프를 대체하도록 자연적으로 발생하는(또는 그렇지 않으면 원래의) 세 개의 나선 묶음 도메인의 서열 내로 "삽입" 되거나 서열 쪽으로 "이식"되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 이론적으로 구속받고 싶지 않지만, ABM은 세 개의 나선 묶음의 세 개의 나선 중 두 개를 구성하는 것으로 생각되어지고, 따라서 임의의 세 개의 나선 묶음 내에서 상기 두 개의 나선 모티프를 대체할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 두 개의 ABM 나선에 의한 세 개의 나선 묶음 도메인 중 두 개의 나선의 교체는 폴리펩티드의 기본 구조에 영향을 미치지 않게 수행되어야만 한다. 즉, 이 실시형태에 따른 폴리펩티드의 Cα 골격의 전체 접힘은 일부를 형성하는 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인의 것과 실질적으로 동일할 것이며, 예를 들어 동일한 순서로 이차 구조의 동일한 요소를 가지는 것 등이다. 따라서, 본 발명에 따른 ABM은 만약 본 발명의 실시형태에 따른 폴리펩티드가 원래의 도메인과 동일한 접힘을 가진다면 세 개의 나선 묶음 도메인의 "일부를 형성"하고, 이것은 기본 구조적 특성이 공유된다는 것을 시사하며, 이들 특성은 예를 들어 유사한 CD 스펙트럼을 생기게 한다. 당업자는 관련된 다른 파라미터를 안다.
하나의 실시형태에서, 알부민 결합 폴리펩티드는 세 개의 나선 묶음 단백질 도메인인데, 이는 상기 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프와 세 개의 나선 배열 중 나머지를 만드는 추가 서열을 포함한다. 따라서, 본 실시형태에서, 모이어티 (II)는 다음의 아미노산 서열을 갖는 알부민 결합 도메인을 포함한다:
LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY-[ABM]-LAALP
여기에서
[ABM]은 이 섹션에서 상기 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이며, 또한 서로 독립적으로,
Xa 는 V 및 E로부터 선택되고;
Xb 는 L, E 및 D로부터 선택되고;
Xc 는 N, L 및 I로부터 선택되고;
Xd 는 R 및 K로부터 선택되고; 및
Xe 는 D 및 K로부터 선택된다.
일 실시형태에서, Xa 는 V이다.
일 실시형태에서, Xb 는 L이다.
일 실시형태에서, Xc 는 N이다.
일 실시형태에서, Xd 는 R이다.
일 실시형태에서, Xe 는 D이다.
다시, WO2009/016043의 실험 섹션에서 상세히 기술된 바와 같이, 다수의 알부민 결합 변이체의 선택 및 서열분석은 개개의 알부민 결합 도메인 서열의 확인을 유도하였다. 이들 서열은 본 발명의 경구 투여에 의한 치료에 사용되는 화합물의 모이어티 (II)에 포함된 알부민 결합 도메인의 개개의 실시형태를 포함한다. 이들 개개의 알부민 결합 도메인의 서열은 도 1 및 서열번호 258-514로서 나타낸다. 또한 여기서 정의로 포함되는 것은 서열번호 258-514로부터 선택되는 서열과 85% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 알부민 결합 도메인이다. 구체적인 실시형태에서, 알부민 결합 도메인의 서열은 서열번호 259, 서열번호 260, 서열번호 266, 서열번호 272, 서열번호 282, 서열번호 284, 서열번호 303, 서열번호 306, 서열번호 310, 서열번호 311, 서열번호 312, 서열번호 412, 서열번호 496, 서열번호 497, 서열번호 498, 서열번호 499, 서열번호 500, 서열번호 510, 서열번호 502, 및 이들과 85% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 서열로부터 선택된다. 본 발명의 이러한 측면의 더 구체적인 실시형태에서, 알부민 결합 폴리펩티드의 서열은 서열번호 260, 서열번호 310, 서열번호 496 및 이들과 85% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 서열로부터 선택된다.
WO2012 /004384에서 기술된 바와 같이 ABD 유도체를 포함하는 모이어티 ( II )
그 대신에 WO2012/004384와 관련하여, 본 발명에 따라 경구 투여를 통한 치료에 사용하기 위한 화합물의 모이어티 (II)는 알부민 결합 도메인을 포함할 수 있는데, 이는 다음으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
i) LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP
여기에서 서로 독립적으로,
X3 은 E, S, Q 및 C로부터 선택되고;
X6 은 E, S 및 C로부터 선택되고;
X7 은 A 및 S로부터 선택되고;
X10 은 A, S 및 R로부터 선택되고;
X14 는 A, S, C 및 K로부터 선택되고;
X26 은 D 및 E로부터 선택되고;
X39 는 D 및 E로부터 선택되고;
X40 은 A 및 E로부터 선택되고;
X43 은 A 및 K로부터 선택되고;
X44 는 A, S 및 E로부터 선택되고;
45 위치의 L은 존재하거나 부존재하고; 또한
46 위치의 P는 존재하거나 부존재함;
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 아미노산 서열.
이러한 정의를 따르는 알부민 결합 도메인은 일련의 특성들을 나타내는데, 이는 예를 들어 인간에 대한 투여용 치료 분자를 위한 융합 또는 결합 동반자로서 사용하기에 적합하게 만든다. 이러한 종류의 알부민 결합 도메인의 장점은 WO2012/004384에서 상세히 설명된다.
일 실시형태에서, X6 은 E이다.
다른 실시형태에서, X3 은 S이다.
다른 실시형태에서, X3 은 E이다.
다른 실시형태에서, X7 은 A이다.
다른 실시형태에서, X14 는 S이다.
다른 실시형태에서, X14 는 C이다.
다른 실시형태에서, X10 은 A이다.
다른 실시형태에서, X10 은 S이다.
다른 실시형태에서, X26 은 D이다.
다른 실시형태에서, X26 은 E이다.
다른 실시형태에서, X39 는 D이다.
다른 실시형태에서, X39 는 E이다.
다른 실시형태에서, X40 은 A이다.
다른 실시형태에서, X43 은 A이다.
다른 실시형태에서, X44 는 A이다.
다른 실시형태에서, X44 는 S이다.
다른 실시형태에서, 위치 45의 L 잔기는 존재한다.
다른 실시형태에서, 위치 46의 P 잔기는 존재한다.
다른 실시형태에서, 위치 46의 P 잔기는 부존재한다.
다른 실시형태에서, 이 섹션에서 정의에 따른 알부민 결합 도메인은 X7 이 L, E, 또는 D도 아니라는 단서에 적용된다.
모이어티 (II)에서 사용되는 이 섹션에서 정의를 따르는 알부민 결합 도메인은 WO2012/004384에서 상세히 기술된 바와 같이 적합한 결합 동반자와의 결합을 위해 준비될 수 있다.
일 실시형태에서, 모이어티 (II)의 알부민 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 516-659 및 서열번호 679-718 중 어느 하나로부터 선택되며, 예를 들어 서열번호 516-659 중 어느 하나로부터 선택된다. 더 구체적으로, 아미노산 서열은 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557, 서열번호 564-565, 서열번호 679-685, 및 서열번호 707-718로부터 선택된다. 따라서 아미노산 서열은 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557, 및 서열번호 564-565로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 정의에 따른 알부민 결합 도메인은 i) 에서 정의된 서열의 N- 및/또는 C-말단에 위치한 하나 또는 그 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 더 포함한다. 이들 추가적인 아미노산 잔기는 상기 도메인에 의한 알부민의 결합을 향상시키고, 접힌 알부민 결합 도메인의 구조적 안정성을 개선시키는 역할을 할 수도 있으나, 예를 들어 상기 폴리펩티드의 생산, 정제, 체내 또는 체외에서 안정화, 결합, 표지 또는 검출 중 하나 또는 그 이상 뿐만 아니라, 이들의 임의 조합과 관련된 다른 목적에도 잘 동등하게 역할을 할 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 잔기는, 예를 들면 치료 효과를 부여하는 모이어티 (I)에; 친화성 기질을 얻기 위해 크로마토그래피 수지에 또는 라디오메탈과 착화를 위한 킬레이트 모이어티에 화학적 결합을 목적으로 추가된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기(들)를 포함할 수 있다.
따라서 아미노산 서열 i) 의 N- 또는 C- 말단에서 알파 나선에 바로 앞 또는 뒤의 아미노산은 일 실시형태에서 구조적인 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 개선된 구조적 안정성에 기여할 수 있는 아미노산 잔기의 일 실시예는 상기 정의된 바와 같이 아미노산 서열 i) 의 N-말단에 위치한 세린 잔기이다. N-말단 세린 잔기는 어떤 경우에는 세린 측쇄의 감마 산소와 글루담산 잔기의 폴리펩티드 골격 NH사이에 수소결합을 수반함으로써 정규적인 S-X-X-E 캡핑 박스(capping box)를 형성할 수도 있다. N-말단 캡핑은 본 정의에 따른 알부민 결합 도메인을 구성하는 세 개의 나선 도메인 중 첫 번째 알파 나선의 안정성에 기여할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 추가적인 아미노산은 상기 도메인의 N-말단에 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 아미노산 서열은 다시말해서 하나 또는 그 이상의 세린 잔기(들)에 의해서 선행된다. 다른 실시형태에서, 추가적인 아미노산은 상기 도메인의 N-말단에 글라이신 잔기를 포함한다. 아미노산 서열 i)은 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 또는 임의의 적절한 수의 아미노산 잔기에 의해 선행될 수 있다고 이해된다. 따라서, 아미노산 서열은 단일 세린 잔기, 단일 글라이신 잔기, 또는 글라이신-세린(GS) 조합 또는 글라이신-세린-세린(GSS) 조합과 같은 이들 두가지의 조합에 의해 선행될 수 있다. N-말단에 추가적인 아미노 잔기를 포함하는 알부민 결합 도메인의 실시예는 서열번호 660-678, 예를 들어 서열번호 660-663 및 서열번호 677-678로 서술된다. 또 다른 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기는 상기 서열 i) 에 의해 정의된 바와 같이 N-말단에 글루탐산을 포함한다.
유사하게, C-말단 캡핑은 알부민 결합 도메인을 구성하는 세 개의 나선 도메인 중 세 번째 알파 나선의 안정성을 개선시키기 위해 이용될 수 있다. 프롤린 잔기는 i) 에서 정의된 아미노산 서열의 C-말단에서 존재하는 경우, 캡핑 잔기로서 적어도 부분적으로 기능할 수도 있다. 그러한 경우에, C-말단에 프롤린 잔기 다음의 라이신 잔기는 예를 들어 L45와 P46이 존재할 때 i) 에서 정의된 아미노산 서열의 류신 및 알라닌 잔기의 카보닐기와 폴리펩티드 골격에서 라이신 앞에 두 번째와 세 번째에 위치한 아미노산의 카보닐기와 라이신 잔기의 입실론(epsilon) 아미노기 사이를 수소 결합시킴으로써 알부민 결합 도메인의 세 번째 나선의 추가적 안정화에 기여할 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 추가적인 아미노산은 상기 도메인의 C-말단에 라이신 잔기를 포함한다.
추가적인 아미노산은 알부민 결합 도메인의 생산에 관련될 수 있다. 특히, P46이 존재하는 실시형태에 따른 알부민 결합 도메인이 화학 펩타이드 합성에 의해 생산될 때, C-말단 프롤린 뒤에 하나 또는 그 이상의 선택적인 아미노산 잔기가 이점을 제공할 수 있다. 이러한 추가적인 아미노산 잔기는 예를 들어 상기 합성의 다이펩타이드(dipeptide) 단계에서 다이케토피페라진(diketopiperazine)과 같은 원하지 않은 물질의 형성을 방지할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 일 예는 글라이신이다. 따라서, 일 실시형태에서, 추가적인 아미노산은 프롤린 잔기의 바로 다음 또는 상기 설명된 바와 같은 추가적인 라이신 및/또는 글라이신 잔기의 다음에 있는, 도메인의 C-말단에 글라이신 잔기를 포함한다. 그 대안적으로, 폴리펩티드 생산은, 존재하는 경우, 아미노산 서열 i)의 C-말단 프롤린 잔기의 아마이드화로부터 이점이 있을 수 있다. 이 경우에, 상기 C-말단 프롤린은 카르복실 탄소에 추가적인 아민 그룹을 포함한다. 이 섹션에서 기술된 상기 도메인, 특히 펩타이드 합성중에 라세믹화하는 것으로 알려진 프롤린 또는 다른 아미노산과 함께 그들의 C-말단에서 끝나는 도메인의 일 실시형태에서, C-말단에 글라이신의 추가 또는 프롤린의 아마이드화는, 존재하는 경우, C-말단 아미노산 잔기의 라세믹화라는 잠재적 문제에 또한 직면할 수 있다. 이렇게 하여 아마이드화된 도메인이 화학적 합성에 의한 것 보다는 재조합 수단에 의해 생산되는 것으로 의도하는 경우, C-말단 아미노산의 아마이드화는 당해 기술분야에서 알려진 여러 방법들에 의해, 예를 들어 아마이드화 PAM 효소의 사용을 통해 수행될 수 있다.
C-말단에서 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 알부민 결합 도메인의 예는 서열번호 660-667, 예를 들어 서열번호 663-665로 기록된다. 당업자는 예를 들면 펩타이드 합성을 위한 다양한 종류의 미리 만들어진 기질에 의해, C-말단 변형을 수행하는 방법을 알게 된다.
다른 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기는 상기 도메인의 N- 및/또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 시스테인 잔기는 i) 에서 정의된 바와 같이 아미노산 서열의 바로 앞 및/또는 뒤일 수도 있거나 또는 상기 기술된 바와 같이 임의의 다른 추가적인 아미노산 잔기의 앞 및/또는 뒤일 수도 있다. 폴리펩티드 사슬의 N- 및/또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 포함하는 알부민 결합 도메인의 예는 서열번호 664-665 (C-말단) 및 서열번호 666-667 (N-말단)으로 기술된다. 폴리펩티드 사슬에 시스테인 잔기를 추가함으로써, 알부민 결합 도메인의 위치가 지정된 결합을 위한 티올(thiol) 그룹이 얻어질 수도 있다. 대안적으로, 셀레노시스테인 잔기는 위치-특이적 결합을 촉진시키기 위하여 시스테인 잔기의 도입과 유사한 방식으로 폴리펩티드 사슬의 C-말단에 도입될 수 있다(Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006).
일 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 두 개 이하의 시스테인 잔기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 한 개 이하의 시스테인 잔기를 포함한다.
모이어티 ( II )의 일반적으로 적용 가능한 측면
일부의 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 화합물에서 모이어티 (II) 내의 알부민 결합 도메인은 상호작용의 KD 값이 최대 1　x　10-8 M, 즉 10 nM이 되도록 알부민에 결합한다. 일부의 실시형태에서, 상기 상호작용의 KD 값은 최대 1　x　10-9 M, 최대 1　x　10-10 M, 최대 1　x　10-11 M, 또는 최대 1　x　10-12 M이다.
일 실시형태에서, 모이어티 (II) 내의 알부민 결합 도메인은 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 인간 이외의 다른 종으로부터 유래된 알부민, 예를 들면 마우스, 래트, 개, 및 짧은 꼬리 원숭이로부터 유래된 알부민과 대신에 또는 추가적으로 결합한다.
상기에서 광범위하게 설명된 바와 같이, 알부민 결합 모이어티 (II)는 서열번호 258-718 또는 그의 서브 세트로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 큰 알부민 결합 도메인에서 알부민 결합 모티프로서 서열번호 1-257로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 임의의 폴리펩티드의 기능, 예를 들면 이들 폴리펩티드 도메인의 알부민 결합 능력은 폴리펩티드의 삼차 구조에 의존한다. 하지만 그의 구조에 영향을 미치지 않고 알파 나선 폴리펩티드에서 아미노산의 서열을 변화시키는 것이 가능하다(Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008). 따라서, 자연적으로 발생하는 알부민 단백질의 변형된 변이체 또는 상기에서 상세히 기술된 그의 유도체의 변형된 변이체는 모이어티 (II)에 포함된 알부민 결합 도메인을 위한 후보물질로 또한 예상된다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능성 그룹(예를 들어 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기는 동일한 기능 그룹으로부터 다른 아미노산 잔기로 교환될 수 있다.
따라서 모이어티 (II)는 서열번호 1-718과 비교하여 조금의 차이만 보이는 상기 개시된 알부민 결합 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 하나의 상기 정의는 서열번호 258-718로부터 선택된 서열과 적어도 85%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 알부민 결합 도메인이다. 일부 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 258-718로부터 선택된 서열과 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 용어 "% 동일한" 또는 "% 동일성"은 다음과 같이 계산된다. 쿼리(query) 서열은 CLUSTAL W 알고리즘을 이용하여 표적 서열에 정렬된다(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). 비교는 정렬된 서열의 가장 짧은 것에 대응하는 창(window)을 통해 행한다. 정렬된 서열의 가장 짧은 것은 어떤 경우에는 여기서 개시된 알부민 결합 도메인과 같은 표적 서열일 수 있다. 다른 경우에, 쿼리 서열은 정렬된 서열의 가장 짧은 것을 구성할 수도 있다. 쿼리 서열은 예를 들어 적어도 10개의 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개의 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 40개의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 각 위치에서 아미노산 잔기들이 비교되며, 표적 서열과 동일한 유사성(identical correspondence)을 가지는 쿼리 서열에서 위치의 백분율은 % 동일성으로 보고된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알부민 결합" 및 "알부민 결합 친화성"은 예를 들어 블라코어(Blacore) 장비와 같은 표면 플라스몬(Plasmon) 공명 기술을 이용함으로써 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 나타낸다. 예를 들어 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이, 알부민 결합 친화성은 알부민 또는 그의 단편을 측정 장비의 센서 칩에 고정시키고, 시험되는 폴리펩티드를 함유하는 시료는 칩에 통과시키는 실험에서 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험되는 폴리펩티드는 장비의 센서 칩에 고정시키고, 알부민 또는 그의 단편을 함유하는 시료는 칩에 통과시킨다. 이와 관련하여 알부민은 포유류 유래의 알부민, 예를 들면 인간 혈청 알부민일 수 있다. 다음에 당업자는 알부민에 대한 폴리펩티드의 결합 친화성의 적어도 정성적 측정을 확립하기 위한 상기 실험에 의하여 얻어진 결과들을 해석할 수 있다. 예를 들어 상호작용에 대한 KD 값을 측정하기 위하여 정량적 측정을 원하는 경우, 표면 플라스몬 공명 방법이 또한 사용될 수 있다. 결합 값은 예를 들어 비아코어2000 장비(Biacore2000 instrument, GE Healthcare)로 정의될 수 있다. 알부민은 측정 장치의 센서 칩에 적절히 고정시키고, 그의 친화도가 확인되는 폴리펩티드의 시료는 계열희석에 의해 준비하여 주입한다. 이어서 KD 값은 예를 들어 장치 제작자(GE Healthcare)에 의해 제공된 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델을 이용한 결과로부터 계산된다.
II 약학 조성물
두 번째 측면에서, 본 발명은 하기
a) - 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민에 결합하고 자연적으로 발생하는, M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 이 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 화합물; 및
b) 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제,
를 포함하는 경구 투여용 약학 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 상기 두 번째 측면은 본 발명의 첫 번째 측면과 관련되어 정의된 화합물을 성분 a)로서 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 경구 투여용 약학 조성물들에 존재하는 경우, 상기 화합물은 본 발명의 첫 번째 측면과 관련하여 상술한 성질, 특성, 특징 및/또는 실시형태의 어느 하나 또는 그 이상을 임의의 조합으로 나타낼 수 있다. 간결하게 하기 위해, 이 정보는 이 두 번째 측면과 관련하여 문자 그대로 반복하지 않을 것이나, 상기 설명과 관련하여 포함된다.
상기 약학 조성물은 또한 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제 b)를 포함한다. "부형제"는 약물 제형에서 희석제 또는 운반체로 사용되는 불활성 물질이다. 상기 부형제는 투여 또는 제조를 용이하게 하고, 산물 전달을 개선시키고, 약물의 일관된 방출 및 생체이용률을 촉진시키고, 안정성을 향상시키고, 산물 식별을 보조하고, 또는 다른 산물 특징을 향상시키기 위해 치료학적 활성 화합물 또는 화합물들과 혼합된다. 부형제는 결합제, 희석제/여과제, 윤활제, 활주제(glidant), 붕괴제, 광택제, 착색제, 현탁제, 피막형성제(film formers) 및 피막제(coatings), 가소제, 분산제, 방부제, 방향제, 감미료 등으로 분류될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 원하는 치료학적 활성을 부여하는 모이어티 (I)의 경구 생체이용률을 증가시키기 위한 적어도 하나의 성분을 추가로 포함한다. 상기 실시형태들에서, 논의되는 성분은 단백질 분해효소 억제제, 흡수 개선제, 점막점착제 중합체, 제형 운반체 및 이들의 임의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 성분들의 용도와 이들 뒤의 과학적 근거는 치료제의 경구 생체이용률을 개선하기 위한 일반적인 전략에 관한 다음 섹션에서 설명된다.
위장관의 산 및 효소 환경에 대한 약학 조성물의 내성은 위(예를 들어 펩신)와 장(예를 들어 트립신, 키모트립신, 및 카르복시펩티다아제)에 활성인 관련된 펩타이드- 및 단백질-표적화 효소의 하나 또는 그 이상의 억제제(칵테일 또는 개개의 표적화)를 첨가함으로써 증가될 수 있다. 이러한 억제제는 트립신 및 α-키모트립신 억제제, 예를 들면, 판크레아틴 억제제, 대두 트립신 억제제, FK-448, 카모스탯 메실레이트(camostat mesylate), 아프로티닌, 닭과 오리 오보뮤코이드(chicken and duck ovomucoids), 카르복시메틸셀룰로즈 및 보우만-버크(Bowman-Birk) 억제제; 또는 점막 접착성(mucoadhesive) 중합체 단백질 분해효소-억제제 결합체로부터 선택될 수 있다(Park et al, Reactive and Functional Polymers, 71:280-287, 2011).
장벽을 통한 폴리펩티드의 흡수를 증가시키고 따라서 치료 효율을 개선시키기 위해, 상피 장벽을 더 투과성있게 만드는 흡수 향상제가 약학 조성물 중에 포함될 수 있다. 흡수 향상제는 예를 들어 트랜스셀룰라(transcellular) 수송을 개선시키는 세포 막의 지질 이중층을 파괴하거나, 또는 파라셀룰라(paracellular) 수송을 용이하게 하는 융합막을 파열시키는 킬레이트 시약으로서 작용 할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서 사용되는 흡수 향상제의 비제한적인 예는 세제, 계면활성제, 담즙산염, 칼슘 킬레이트화제, 지방산, 중쇄 글리세라이드, 살리실산염, 알카노일 콜린, N-아세틸화 알파-아미노산, N-아세틸화 비-알파-아미노산, 키토산, 인지질, 소듐 카프레이트(sodium caprate), 아실 카르니틴(acyl carnitine) 및 폐쇄 소대(Zonula Occludens) 독소이다. (Park et al, 2011, supra; Salama et al, Adv Drug Deliv Rev. 58:15-28, 2006).
약학 조성물에서 추가 또는 대체 성분으로서, 점막접착성 중합체는 단백질 가수분해로부터 보호하는 잠재력을 가지나, 점액막에 위치-특이적 전달을 제공하고, 약물 흡수 부위에서 체류 시간을 연장시키며 막 침투를 개선하기 위해 주로 적용되는데, 이들 모두 장벽을 통해 증가된 흡수를 촉진한다. 본 발명의 약학 조성물에 사용하기 위한 비제한적인 예는 폴리(메타크릴릭 산-g-에틸렌 글리콜)[P(MAA-g-EG)] 하이드로겔 미세입자, 레시틴 결합 알지네이트 미세입자, 티올화 중합체(티오머), 위장의 점막접착성 패치 시스템(GI-MAPS) 및 점막점착성 중합체 단백질 분해효소-억제제 결합체가 있다(Park et al, 2011, supra)
에멀전, 리포좀, 마이크로스피어, 나노스피어, 나노캡슐 또는 완전한 피포와 같은 제형 운반체는 단백질 가수분해로부터 보호하는데 기여하고 장벽을 가로지르는 향상된 전달을 촉진시킬 뿐만 아니라 조절된 방출 속도를 제공한다. 이러한 제형 운반체는 본 발명의 약학 조성물에 사용되는 대체 또는 보충 성분을 구성한다. 특히, 변형된 표면 특성을 가지거나 표적화 물질에 결합된 나노 입자가 사용될 수 있다. 나노 입자의 표면 변형은 예를 들어 친수성 안정제, 생물접착성 중합체 또는 계면활성제로 코팅시킴으로써, 또는 나노 입자 제제에서 친수성 공중합체를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 친수성 중합체의 예는 PEG 및 키토산을 포함한다(des Rieux et al, J Control Release. 116:1-27, 2006). 표적화 나노 입자는 예를 들어 렉틴(letin) 또는 RGD(아르기닌-글라이신-아스파테이트)와 같은 리간드를 나노 입자에 결합시킴으로써 장벽의 상피 층의 장세포 또는 M-세포상에 발현되는 수용체에 특이적으로 부착하도록 설계된다(des Rieux et al, 2006, supra). M-세포는 또한 림프계로 전달하기 위한 경로를 제공한다(Rubas and Grass, Advanced Drug Delivery Reviews, 7:15-69, 1991).
본 발명의 약학 조성물은 예를 들어 알약, 정제, 캡슐, 분말 또는 과립제와 같은 고체형태; 반죽(pastes)과 같은 반-고체형태; 또는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액과 같은 액체형태로 경구 투여될 수 있다. 고체형태은 현재 바람직하며, 키토산, 알지네이트, 미세 결정성, 셀룰로스, 젖당, 자당, 녹말, 젤라틴, 유당, 폴리에틸렌, 글리콜, 폴리바이닐피롤리돈(PVP), 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘 및 나트륨 전분 글리콜산염(sodium starch glycolate)과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 액체형태의 제형은 감미료 또는 향미료, 유화제 또는 현탁제와 같은 부형제 또는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석액을 함유할 수 있다.
제형은 즉시, 지연 또는 조절 방출에 적용될 수 있다. 즉각 방출로 의도된 정제 또는 캡슐은 빠르게 분해되고 GI 관의 윗 부분, 즉 위에서 전체 활성 물질을 방출해야 한다. 그와는 반대로, 지연되거나 조절된 방출로 의도된 정제 또는 캡슐은 시간-의존적 방출(depot) 또는 위치-특이적 방출(예를 들어 장)을 위해 설계될 수 있다. 시간-의존적 방출은 예를 들어 기질 또는 막 조성에 따라 용해 또는 확산 조절된 방출에 기초할 수 있다. 위치-특이적 방출은 예를 들어 PH- 또는 효소 민감성에 기초할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 특히 바람직한 제형은 소장 또는 대장에서 방출되도록 의도된 장용제피 캡슐이다. 상기 장용제피 캡슐은 위의 고산성 pH에서 안정해야만 하지만, 장관의 약산성 pH에서 빠르게 분해되어야 한다. 제제를 형성하는 pH 민감성 장용 필름의 예는 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스프탈레이트(HPMCP), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 하이드록시프로필 메틸 아세테이트석시네이트(HPMCAS), 폴리바이닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP)와 같은 셀룰로스 중합체와 유드라짓® 유도체(Eudragit® derivatives), 쉘락(shellac, SH), 키토산 및 키틴과 같은 다른 중합체들을 포함한다.
III 치료 방법
세 번째 측면에서, 화합물의 경구 투여를 포함하는, 치료를 필요로 하는 포유류 대상체의 치료 방법으로서, 상기 화합물은,
- 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 세 번째 측면은 본 발명의 첫 번째 측면과 관련하여 정의된 바와 같은 화합물을 경구로 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 선택적으로, 이 화합물은 본 발명의 두 번째 측면과 관련하여 정의된 바와 같은 약학 조성물 중에 존재하여 투여(administered present)될 수 있다. 상기 화합물 및 약학 조성물 각각은 각기 개별적으로 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면과 관련하여 상기 기술된 성질, 특성, 특징 및/또는 실시형태의 어느 하나 또는 그 이상을 임의의 조합으로 나타날 수 있다. 간결하게 하기 위해서, 이 정보는 이 세 번째 측면과 관련하여 문자 그대로 반복하지 않을 것이나, 상기 개시와 관련하여 포함된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따르는 치료 방법은 명시된 투여량 요법(dosage regime)에 따라 수행된다. 최적의 투여량 요법은 치료 효과를 부여하는 모이어티의 효능, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화합물의 생체이용률, 및 치료하려는 질병의 종류에 의존할 것이다. 하지만, 화합물의 반감기를 연장시키는 것으로 생각되는 알부민 결합 모이어티 (II)를 포함하는 여기서 정의된 화합물은 치료 효과 수준에 도달하기 위해 한 번의 고투여량을 요구하지 않지만, 혈액 순환에서 지속된 체류 시간 때문에, 낮은 반복된 용량의 투여를 허용하며, 화합물 농도의 증가를 유도하고, 결국 지속가능한 원하는 치료 효과에 도달한다. 다시 말해서, 경구 투여 후에, 오래가지 못하는 치료보다는 낮은 생체이용률이 허용 가능할 것이다. 이러한 반복된 투여(dosing)는 적어도 한 달에 두번, 일주일에 한번, 일주일에 두번, 일주일에 세번, 하루에 한번, 하루에 두번, 예를 들어 하루에 적어도 세 번 제공될 수 있다.
특정 질병의 경우, 일 회분의 용량에 이어서 반복되는 낮은 용량을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 일 회분의 용량은 경구로 제형화된 약물을 여러 번 섭취하게 될 수 있으며, 적어도 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 또는 하루에 적어도 다섯 번 섭취할 수 있다. 대안적으로, 높은 일 회분의 용량은 정맥 또는 피하 주사와 같은 다른 경로를 통해 투여될 수도 있다. 지속된 치료 효과를 제공하는 목적으로 작용하는 그 이후의 투여는 적어도 한 달에 두 번, 일주일에 한 번, 일주일에 두 번, 일주일에 세 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번일 수도 있으며, 예를 들어 적어도 하루에 네 번 일 수도 있다.
용어의 정의 및 사용
본문에서, "생체이용률"은 체순환에 도달하는 활성 약물 물질의 투여된 용량의 부분을 나타낸다. 정의에 의하면, 정맥 내 투여된 약물의 생체이용률은 100%이다. 하지만, 약물이 다른 경로를 통해 예를 들어 경구 경로로 투여되는 경우, 생체이용률은 대사와 불완전한 흡수 때문에 감소한다. 절대 생체이용률은 비정맥 투여 후에 체순환에서 활성 약물의 생체이용률과 정맥 투여 후에 동일한 약물의 생체이용률을 비교한다. 그것은 비정맥투여를 통한 흡수된 약물의 부분과 동일한 약물의 상응하는 정맥 투여와의 비교로 계산된다. 상기 비교는 정규화 되어야만 한다(예를 들어 서로 다른 용량 또는 대상체의 다양한 몸무게를 설명한다). 약물의 절대 생체이용률을 결정하기 위하여, 생동학적 연구가 동맥 및 비동맥 투여 후 약물에 대한 시간 구성 대 혈장 약물 농도를 얻기 위하여 수행되어야만 한다. 상기 절대 생체이용률은 용량-정정한 곡선하면적(AUC) 비정맥을 AUC 정맥으로 나눈 것이다.
이해 본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 더 설명될 것이다.
도 1은 본문에서 논의된 다양한 아미노산 서열의 비공식 리스트를 제공하는 표이다.
도 2는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생산된 정제된 폴리펩티드 변이체의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다. 열 1-2; PEP04419 각각, 25 및 50 ㎍; 열 3-4; PEP10986 각각 25 및 50 ㎍; 및 열 5-6; PEP03973 각각, 25 및 50 ㎍. 열 M; 노벡스®샤프(Novex®Sharp) 미리 염색된 단백질 표준(분자량: 3.5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 110, 160 및 260 kDA).
도 3은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 마우스에서 PEP03973(빈 사각형), PEP10986(빈 삼각형), 및 PEP04419(빈 원) 각각의 경구 투여 후 약동학적 프로필을 보여준다. 도 3A는 시간에 따라 측정된 혈청에서의 농도를 보여준다(시점 당 세 동물의 평균). 도 3B는 A에서와 동일한 데이터를 나타내나 세 개의 폴리펩티드의 투여된 용량에서 변화에 맞게 조정했다(즉, 각 시점:[측정된 혈청 농도]/[투여된 용량]).
도 4는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 경구 위관 영양(빈 사각형) 또는 십이지장 투여(빈 사각형) 후에 래트로부터 얻어진 혈청 표본에서 PEP10896의 약동학적 프로필을 보여준다. 상기 PEP10896의 농도는 ELISA에 의해 결정되었으며 평균 nM +/- SD 값으로 나타내었다.
도 5는 실시예 4에서 기술된 바와 같이 PEP10896의 반복된 십이지장 투여 후 약제학적 프로필을 보여준다. 상기 폴리펩티드는 화살표로 그래프에 표시된 시점 0, 2, 및 24시간에 주어졌다. 상기 PEP10896의 농도는 ELISA에 의해 결정했으며 평균 nM +/- SD 값으로 나타내었다(빈 원). 실시예 3에서 결정된 바와 같이 단일 십이지장 투여 후 약동학적 프로필은 비교를 위해 나타내었다(빈 사각형).
실시예 1: 폴리펩타이드의 클로닝, 생산, 및 특성화
재료 및 방법
본 발명의 설명을 위해, 각각 PEP03973, PEP10986 및 PEP04419로 표시된 세 개의 폴리펩티드가 마우스의 경구 투여를 위해 제작되었다. PEP03973 및 PEP10986 각각은 단백질 Z의 변이체(포도상구균 단백질 A의 도메인 B의 유도체; Nilsson B et al, 1987, supra)와 N-말단으로 융합된 다른 알부민 결합 모이어티를 포함하며, 반면에 PEP04419는 Feldwisch et al 에서 앞서 기술된 바와 같이 MMA-DOTA(말레이미드-모노이미드-1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸-1,4,7,10-테트라아세트산) 와 C-말단으로 결합한 단백질 Z의 변이체이다(J. Mol. Biol. 398: 232-247, 2010; 여기서 ABY-025로 표기됨). 따라서, PEP04419는 임의의 알부민 결합 모이어티를 포함하지 않으며 비교를 위해 시험되었다. PEP03973은 야생형 알부민 결합 도메인을 포함하며(ABDwt, 서열번호 515; 즉 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 GA3 도메인; Kraulis et al, 1996, supra; Johansson et al, 2002, supra), 반면에 PEP10986은 GA3 도메인의 유도체를 포함한다(서열번호 528).
클로닝 및 폴리펩티드 변이체의 배양: 폴리펩티드 PEP03973 및 PEP10986을 각각 암호화하는 DNA는 기본 분자 생물학 기술을 이용하여 T7 프로모터, 여러 개의 클로닝 부위 및 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 발현 벡터 형태로 복제되었다. 발현 벡터는 Z 변이체 서열의 N-말단으로 아미노산 GSSLQ를 암호화하며, PEP03973 및 PEP10986에서 아미노산 VD 및 VDSS에 의해 Z 변이체 및 알부민 결합 도메인 서열이 각각 분리된다.
PEP03973 및 PEP10986의 발현을 위한 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 배양균은 각각 50 ㎍/ml 카나마이신 및 0.3 ml/l 거품 방지제 (Breox FMT 30)가 첨가된 800 ml의 TSB + YE 배지에 접종시키고 37℃에서 대략 2의 OD600 까지 증식시켰다. 이어서 단백질 발현은 1 M의 IPTG를 0.2mM의 최종 농도까지 첨가하여 유도하였다. 상기 배양은 다중발효기(multifermentor) 시스템 헤드빅(Hedvig, Belach Bioteknik, Stockholm, Sweden)을 이용하여 수행되었다. 배양균은 유도 5시간 후 15900 × g 로 20분간 원심분리 하여 채취하였다. 상층액을 버리고 세포 펠렛(pellet)을 수집하여 -20　℃ 에서 저장하였다. 단백질 발현 수준은 SDS-PAGE 및 염색된 겔의 육안 검사를 이용하여 결정하였다.
폴리펩티드 변이체의 정제: 가용성 PEP03973 및 PEP10986을 각각 가지는(harboring) 펠렛화된 세균 세포를 20U/ml 벤조나제®(Benzonase®) 가 첨가된 TST-완충액(25　mM 트리스-염산, 1 mM EDTA, 200 mM 염화나트륨, 0.05　% 트윈 20, pH 8)에 현탁시키고 초음파처리로 파괴하였다. 용해물을 원심분리로 정화시키고 TST-완충액으로 미리 평형화시킨 XK50 컬럼(GE Healthcare)에 채운 100ml 친화성 아가로스에 로딩하였다. 컬럼을 6 컬럼 부피(CV)의 TST-완충액으로 세척한 다음, 6 CV의 5 mM NH4Ac pH 5.5로 세척한 후, 결합된 단백질을 3 CV 0.1 M HAc로 용출시켰다. 유속은 15ml/분이며 280nm 신호를 관찰하였다. PEP03973 및 PEP10986 각각을 함유하는 분획물을 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다. 관련있는 분획물을 모으고 아세토나이트릴(ACN)을 최종 농도 10%가 될 때까지 첨가하고 RPC 용리액(Eluent) A(0.1 % TFA, 10 % ACN, 90　% 물)로 미리 평형화 시킨 125ml 소스(Source) 15 RPC(GE Healthcare)로 가득 찬 파인라인(FineLine) 컬럼에 로딩하였다. 5 CV의 RPC 용리액 A로 컬럼을 세척한 후, 결합된 단백질을 10 CV 동안 선형 구배 0-60% RPC 용리액 B(0.1% TFA, 80% ACN, 20% 물)로 용출시켰다. 유속은 30ml/분이며 280nm의 신호로 관찰하였다. 순수한 PEP03973 및 PEP10986을 각각 함유하는 분획물을 SDS-PAGE 분석으로 확인하고 별도로 모았다.
정제된 PEP03973 및 PEP10986을 각각 XK50 컬럼(GE Healthcare)에 가득 찬 500ml 세파덱스(Sephadex) G25m(GE Healthcare)를 이용한 완충액 상호교환에 의해 50mM NaAc pH 4.5 및 50mM 인산 나트륨 pH 7.0으로 옮겼다. 마지막으로, 농축은 3kDA MWCO를 가진 15ml 아미콘 초원심분리 필터 유닛(Amicon Ultra centrifugal filter units, Millipore)을 이용하여 수행하였다.
PEP04419는 실질적으로 Feldwisch et al (J. Mol. Biol. 2010, supra)에 기술된 바와 같이 생산되었다. 정제된 PEP04419는 완충액 상호교환에 의해 25 mM NH4Ac, 6.25 mM 염산, 112.5 mM 염화나트륨으로 옮겼으며 상기 PEP03973 및 PEP10986에 대해 기술한 바와 같이 농축하였다.
정제된 폴리펩티드 변이체의 분석: 단백질 농도의 결정은 나노드랍®(NanoDrop®) ND-1000 분광 광도계를 이용하여 280 nm 흡광도를 측정하여 수행되었다.
SDS-PAGE 분석을 위하여, 농축된 PEP03973, PEP10986, 및 PEP04419를 5mg/ml로 희석시키고 4xLDS 표본 완충액과 혼합하고, 70 ℃ 에서 15분간 배양하고 10 웰 NuPAGE® 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔에 로딩하였다. 상기 겔을 분자량 마커로서 Novex®Sharp 미리-염색된 단백질 표준(Novex®Sharp pre-stained protein standard )과 염색을 위한 쿠마시블루(Coomassie blue)를 채용한 노벡스 미니-셀(Novex Mini-Cell)에서 MES SDS 러닝 완충액과 함께 진행시켰다.
정제된 PEP03973, PEP10986, 및 PEP04419의 동일성을 확인하기 위하여, LC/MS-분석은 API-ESI 및 단일 쿼드러플(quadruple) 질량 분석기가 장착된 아질런트(Agilent) 1100 LC/MSD 시스템을 이용하여 수행하였다. 0.5ml/분의 유속으로 조박스(Zorbax) 300SB-C8 내로우-보어(Narrow-Bore) 컬럼(2.1 x 150 mm, 3.5 ㎛)에 25 ㎍을 로딩하였다. 단백질은 0.5ml/분으로 15분 이상 용리액 B를 10에서 70%의 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 분리는 30℃ 에서 수행하였다. 이온 신호 및 흡광도는 280과 220nm에서 관찰하였다. 상기 정제된 단백질의 분자량은 이온 신호의 분석으로 결정하였다.
결과
생산된 폴리펩티드 PEP03973, PEP10986, 및 PEP04419의 순도는 SDS-PAGE 분석에 의해 평가된 바와 같이 98%를 초과하는 것으로 추정되었다(도 1). 280nm에서 흡광도 측정에 의해 확인된 제조 농도 및 LC/MS-분석에 의해 확인된 정확한 분자량은 표 1에 요약하였다.
정제된 폴리펩티드의 제조 농도 및 분자량
폴리펩티드 변이체 농도(mg/ml) 이론적인 분자량(Da) 결정된 분자량(Da)
PEP03973 39.5 12421.9 12420.9 ± 1.3
PEP10986 55.2 12500.8 12499.9 ± 1.3
PEP04419 109.7 7556.3 7555.7 ± 0.8
실시예 2: 마우스에서 경구 투여된 폴리펩티드 변이체의 약동학적(pharmacokinetic) 분석
재료 및 방법
경구 투여: 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 폴리펩티드 변이체 PEP03973, PEP10986, 및 PEP04419를 시점 0에 위관 영양법으로 절식시킨 수컷 NMRI 마우스(독일, Charles River)에게 각각 65 μmol/kg, 92 μmol/kg, 및 298 μmol/kg 체중의 용량으로 경구 투여하였다. 사료는 투여 후 약 30분에 다시 공급하였다. 혈청 표본은 PEP03973 및 PEP10986 투여 후 1, 3, 8, 24, 48, 및 72시간, 그리고 PEP04419 투여 후 15, 30, 60, 180, 및 480분에 마취된 마우스의 심장 천자(cardiac puncture)로부터 얻었다. 세 마리의 마우스를 각 시점에 희생시켰다. 혈청에서 각각의 단백질 농도는 각 폴리펩티드 변이체 특이적인 샌드위치 ELISA 분석으로 측정하였다.
PEP03973에 대한 ELISA 분석: ELISA 접시(그레이너 96 웰 반 지역 접시(Greiner 96 well half area plates), cat no 675074)를 탄산 완충액(Sigma, cat no C3041)에 1 ㎍/ml (50 ㎕/well)의 사내(in-house) 생산된 염소 항-단백질 Z 면역글로불린(Igs)으로 4℃ 에서 밤새 코팅시켰다. 다음날 상기 접시를 PBS(2.68　mM 염화 칼륨, 0.47 mM KH2PO4, 137 mM 염화 나트륨, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4) + 0.5　% 카제인(Sigma, cat no C8654), PBSC로 1.5시간 동안 블로킹시켰다. 혈청 표본 및 기준으로 사용된 정제된 PEP03973은 전체 용량 50 ㎕/웰의 PBSC에서 3배 희석 시리즈로 두 번 반복하여(duplicates) 적정하였고 또 다른 1.5시간 동안 배양하였다. 결합된 PEP03973은 PBSC에 1 ㎍/ml 로 희석한 사내 생산된 50 ㎕/웰의 토끼 항-단백질 Z/ABDwt Ig을 첨가한 다음, PBSC에 20ng/ml로 희석한 50 ㎕/웰의 DELFIA Eu-N1-항-토끼 IgG(Perkin Elmer cat no AD0105)를 첨가하여 검출하였다. 상기 항체 배양 기간은 각 단계 후 세척과 함께 각각 1.5 및 1시간이다. 그 뒤에, 50 ㎕/웰의 향상 용액(Perkin Elmer cat 4001-0010)을 추가하고 시간 분해 형광(time resolved fluorescence, TRF)을 5분간 조심스럽게 교반한 후 ELISA 리더(Victor3, Perkin Elmer)에서 판독하였다. 혈청 표본에 PEP03973의 농도는 비선형 회귀(GraphPad Prism5)를 이용하여 PEP03973 표준 곡선으로부터 계산하였다.
PEP10986에 대한 ELISA 분석: 혈청 표본에서 PEP10986의 농도를 상기 PEP03973에 대하여 기술된 것과 유사한 ELISA 분석에 의해 확인하였으나, 코팅은 8 ㎍/ml의 사내 생산된 염소 항-단백질 Z Ig로 수행하였으며, 첫 번째 검출 단계는 2　㎍/ml 농도로 상기 서열번호 2로 명시된 알부민 결합 도메인에 특이적인 사내 생산된 토끼 Ig를 이용하여 수행하였다.
PEP04419에 대한 ELISA 분석: ELISA 접시(코스타 96 웰 반 지역 접시, Costar 96 well half area plates, cat no 3690)를 탄산 완충액에 2 ㎍/ml (50 ㎕/웰)의 단백질 Z에 대한 염소 Ig로 4 ℃에서 밤새 코팅시켰다. 다음날 상기 접시를 1.5시간 동안 PBSC로 블로킹시켰다. 혈청 표본 및 기준으로 사용된 정제된 PEP04419 은 전체 용량 50 ㎕/웰의 PBSC에서 2배 희석 시리즈로 두 번 반복하여 적정하였고 또 다른 1.5시간 동안 배양하였다. 상기 접시는 PBS + 0.05% Tween (PBST)으로 네 번 세척하였다. 결합된 PEP04419는 50 ㎕/웰의 토끼 항-단백질 Z Ig(PBSC에 0.125 ㎍/ml)에 이어 PBSC에 1:10000으로 희석한 50 ㎕/웰의 항-토끼 IgG-HRP(Dako, cat no P0448)로 검출하였다. 각 항체는 각 단계 후 세척과 함께 1시간 동안 배양하였다. 최종 세척 후, 반응을 50 ㎕/웰의 TMB 이뮤노퓨어(Immunopure, Thermo Scientific, cat no 34021)로 전개하고 50 ㎕/웰의 황산을 첨가하여 중지시켰다. 450nm의 흡광도에서 ELISA 리더(Victor3, Perkin Elmer)로 판독하였다. 혈청 표본에서 PEP04419 농도는 비선형 회귀(GraphPad Prism5)를 이용하여 PEP04419 표준 곡선으로부터 계산하였다.
결과
도 2에 도시된 바와 같이, 세 개의 투여된 폴리펩티드 모두는 경구 경로를 통하여 투여 후 섭취되었다. 놀랍게도, 알부민 결합 모이어티, 즉 PEP03979 및 PEP10986을 포함하는 폴리펩티드는 거의 두 배 크기임에도 불구하고 적어도 알부민 결합 모이어티가 없는 폴리펩티드, PEP04419 만큼 섭취되었다. 게다가, 알부민 결합 모이어티를 포함하는 폴리펩티드는 투여 후 8시간 섭취된 표본에서 검출될 수 없는 알부민 결합 모이어티가 없는 폴리펩티드와 비교하여 더 긴 체류시간을 보였다(도 3a 및 3b를 보라). 곡선하면적(area under curve, AUC)은 PEP03973, PEP10986, 및 PEP044194에서 각각 106, 96, 7nMh였다. 예상되는 약동학적 프로필은 PEP03973 및 PEP10986이 경구 투여에서 그들의 알부민 결합 능력을 유지한다는 것을 시사한다.
실시예 3: 래트에서 PEP10896의 경구 및 십이지장 투여의 약동학적 분석
재료 및 방법
경구 투여: 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 폴리펩티드 PEP10986을 절식시킨 수컷 스프라구 돌리 래트(Sprague Dawley rats, Charles River, Germany)에 67 μmol/kg 체중 용량으로 시점 0에 위관영양으로 경구로 투여하였다. 사료는 투여 후 약 30분에 재공급하였다. 혈액 표본은 투여 후 1, 3, 8, 24, 72, 120, 및 168시간에 아이소플루레인(isoflurane) 마취 상태에서 얻었다. 혈청에서 PEP10896의 농도는 실시예 2에서 기술된 샌드위치 ELISA 분석에 의해 측정하였다.
십이지장 투여: 유치 도뇨관(indwelling catheter, IITC Life Science, cat no S2C6)은 십이지장 시작점으로부터 10-15mm에 외과적으로 삽입하였고, 마취된 수컷 스프라구 돌리 래트(Charles River)의 등에 피하로 터널을 뚫었다. 3-5일의 회복 기간 후, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 폴리펩티드 PEP10986은 시점 0에 절식시킨 래트에 67 μmol/kg 체중 용량으로 직접 십이지장에 투여하였다. 사료는 투여 후 약 30분에 재공급하였다. 혈액 표본은 PEP10986의 투여 후 1, 3, 8, 24, 72, 120, 및 168 시간에 아이소플루레인 마취 상태에서 얻었다. 혈청에서 PEP10896의 농도는 실시예 2에서 기술된 샌드위치 ELISA 분석으로 측정하였다.
결과
구강 및 십이지장내 투여 후 얻어진 PEP10896의 약동학적 프로필은 도 4에 나타내었다. 상기 결과는 PEP10896이 경구 위관 영양 및 십이지장내 투여 후 둘 다 래트에서 경구 경로를 통해 섭취된다는 것을 보여준다. 십이지장 투여는 경구 위관 영양과 비교하여 높은 Cmax(3 시간) 농도로 표기된 바와 같이 증가된 장 흡수에 기여한다(11.3 대 0.71nM). 적어도 15배 높은 AUC는 향상된 흡수의 결과로서 얻어졌다. 알부민과 유사한 반감기를 가진 장기적인 약동학적 프로필은 PEP10986이 위관 영양에 의하던 또는 십이지장내 투여에 의하던 경구 흡수 후 알부민 결합 능력을 유지했다는 것을 시사했다.
실시예 4:래트에서 PEP10896의 반복된 십이지장 투여 약동학적 분석
재료 및 방법
반복된 십이지장 투여: 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 폴리펩티드 변이체 PEP10986를 실시예 3에서 기술된 바와 같이 절식시킨 래트의 십이지장으로 직접 투여하였다. PEP10986을 시점 0, 2, 및 24시간에 67 μmol/kg 체중 용량으로 세 번 투여하였다. 사료는 각 투여 후 약 30분에 재공급하였다. 혈액 표본은 PEP10986의 투여 후 1, 3, 5, 24, 27, 96, 144, 및 192시간에 아이소플루레인 마취 상태에서 얻었으며, 혈청은 기본 절차에 따라 제조하였다. 혈청에서 PEP10896의 농도는 실시예 2에 기술된 샌드위치 ELISA 분석에 의해 측정하였다.
결과
PEP10896의 약동학적 프로필은 도 5에 도시된 바와 같이 반복된 십이지장내 투여 후에 얻었다. 실시예 3에 기술된 십이지장 투여로부터의 결과는 단일 및 반복 투여 사이의 차이를 강조하기 위해 도 5에 포함시켰다. 반복 투여는 래트 혈청에서 폴리펩티드 PEP10896의 농도를 신장시켰고, 이는 PEP10986이 경구 흡수 후 알부민 결합 능력을 유지했다는 것을 시사한다. 상기 농도는 세 번째 투여 후 두배 이상 증가했는데, 이는 높은 혈청 수준이 반복 투여에 의해 얻어질 수 있다는 것을 시사한다.
실시형태의 항목별 리스트
1. 경구 투여를 통한 치료에 사용하기 위한 화합물로서, 상기 화합물은
- 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘(exendin) 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 경구 투여를 통한 치료에 사용하기 위한 화합물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 모이어티 (I)은 예를 들어 인슐린, 인슐린 유사체, IL-2, IL-5, GLP-1, BNP, IL 1-RA, KGF, 스템젠®(Stemgen®), GH, G-CSF, CTLA-4, 마이오스타틴, 인자 VII, 인자 VIII 및 인자 IX, 및 그들 중 어느 하나의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된, 인간 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 혈액 응고 및 보체 인자, 선천성 면역 방어 및 조절 펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 성분을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 모이어티 (I)은 모듈린(modulin), 세균성 독소, 호르몬, 선천성 면역 방어 및 조절 펩타이드, 효소 및 활성 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 비-인간 생물학적 활성 단백질을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 모이어티 (I)은 표적 분자와 선택적 상호작용이 가능한 결합 폴리펩티드를 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 항체 및 항체 결합 활성을 실질적으로 보유하고 있는 이들의 단편 및 도메인; 미소체, 맥시바디(maxybody), 아비머(avimer), 및 다른 작은 이황화결합 단백질; 및 포도상구균 단백질 A 및 그의 도메인, 다른 세 개의 나선 도메인, 리포칼린(lipocalin), 안키린(ankyrin) 반복 도메인, 셀룰로스 결합 도메인, 감마 크리스탈린, 녹색 형광 단백질, 인간 세포독성 T 림프구-관련 항원 4, 쿠니쯔(Kunitz) 도메인과 같은 단백질 분해 효소 억제제, PDZ 도메인, SH3 도메인, 펩티드 압타머, 포도상구균 핵산 분해 효소, 텐다미스탯(tendamistat), 파이브로넥틴 타입 III 도메인, 트랜스페린(transferrin), 징크 핑거(zinc finger) 및 코노톡신(conotoxin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 스캐폴드로부터 유래된 결합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택된 것인, 사용하기 위한 화합물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 포도상구균 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 서열번호 719, 서열번호 720, 및 서열번호 721로부터 선택된 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내는 것인, 사용하기 위한 화합물.
7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자는 CD14, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD40, CD52, CD56, CD70, CD138, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX, CEA, IL-2 수용체, IGF1R, VEGFR2, MUC1, PDGFR-베타, PSMA, TAG-72, FOLR1, 메소텔린(mesothelin), CA6, GPNMB, 인테그린(integrin) 및 ephA2와 같은 암-관련 또는 다른 세포 표면 관련 항원; TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-18, IL-23, IL-36, G-CSF, GM-CSF와 같은 사이토카인 및 그들의 수용체; IL-8, CCL-2 , CCL11와 같은 케모카인 및 그들의 수용체; C3 및 인자 D와 같은 보체 인자; HGF 및 마이오스타틴(myostatin)과 같은 성장 인자; GH, 인슐린 및 소마토스타틴(somatostatin)과 같은 호르몬; 알츠하이머 질병의 Aβ펩타이드와 같은 펩타이드; 다른 질병-관련 아밀로이드(amyloid) 펩타이드; 히스타민 및 IgE와 같은 고민감성 매개체; 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor)와 같은 혈액 응고 인자; 및 세균성 독소 및 뱀독(snake venoms)과 같은 독소로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 것인, 사용하기 위한 화합물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 모이어티 (I)은 a) 세포독성 제제, 예를 들어 칼리케아마이신(calicheamycin), 아우리스타틴(auristatin), 독소루비신(doxorubicin), 마이탄시노이드(maytansinoid), 탁산, 엑테이나시딘(ecteinascidin), 겔다나마이신(geldanamycin), 메토트렉세이트, 캠프토테신(camptothecin), 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린 및 그들의 유도체, 및 이들의 조합; 및 b) 항염증 제제, 예를 들어 비-스테로이드 항염증 약물(NSAIDs), 사이토카인 억제 항염증 약물(CSAIDs), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 메토트렉세이트, 프레드니손(prednisone), 사이클로스포린, 모로니시드 계피산, 레플루노마이드(leflunomide) 및 그들의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 비-단백질성 성분을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 자연적으로 발생한 GA 도메인 또는 이들의 유도체를 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
10. 제 9항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터 유래한 단백질 G의 도메인 GA1, 도메인 GA2, 및 도메인 GA3, 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 GA 도메인을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3 또는 그의 유도체를 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 서열번호 515의 아미노산 서열을 가지는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3를 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 알부민 결합 모티프를 포함하고, 상기 모티프는 다음의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 사용하기 위한 화합물:
GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I
여기서, 서로 독립적으로,
X5 는 Y 및 F로부터 선택되고;
X8 는 N, R 및 S로부터 선택되고;
X9 는 V, I, L, M, F 및 Y로부터 선택되고;
X11 는 N, S, E 및 D로부터 선택되고;
X12 는 R, K 및 N으로부터 선택되고;
X14 는 K 및 R로부터 선택되고;
X20 는 D, N, Q, E, H, S, R 및 K로부터 선택되고;
X23 는 K, I 및 T로부터 선택되고;
X24 는 A, S, T, G, H, L 및 D로부터 선택되고; 또한
X25 는 H, E 및 D로부터 선택된다.
14. 제 13항에 있어서, X5 는 Y인 것인, 사용하기 위한 화합물.
15. 제 13항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, X8은 N 및 R로부터 선택되고, 특히 R인 것인, 사용하기 위한 화합물.
16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, X9은 L인 것인, 사용하기 위한 화합물.
17. 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, X11은 N 및 S로부터 선택되고, 특히 N인 것인, 사용하기 위한 화합물.
18. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, X12는 R 및 K로부터 선택되고, R 또는 K인 것인 사용하기 위한 화합물.
19. 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, X14는 K인 것인, 사용하기 위한 화합물.
20. 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, X20은 D, N, Q, E, H, R, 및 S로부터 선택되고, 특히 E인 것인, 사용하기 위한 화합물.
21. 제 13항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, X23은 K 및 I로부터 선택되고, 특히 K인 것인 사용하기 위한 화합물.
22. 제 13항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, X24는 A, S, T, G, H 및 L로부터 선택되고, 특히 L인 것인, 사용하기 위한 화합물.
23. 제 22항에 있어서, X24는 L인 것인, 사용하기 위한 화합물.
24. 제 23항에 있어서, X23X24는 KL인 것인, 사용하기 위한 화합물.
25. 제 23항에 있어서, X23X24는 TL인 것인, 사용하기 위한 화합물.
26. 제 22항에 있어서, X24는 A, S, T, G, 및 H로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 화합물.
27. 제 26항에 있어서, X23은 I인 것인, 사용하기 위한 화합물.
28. 제 13항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, X25는 H인 것인, 사용하기 위한 화합물.
29. 제 13항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알부민 결합 모티프는 서열번호 1-257로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 155, 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244 및 서열번호 245로부터 선택되는 아미노산 서열, 더욱 특히 서열번호 3, 서열번호 53 및 서열번호 239로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것인, 사용하기 위한 화합물.
30. 제 13항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:
LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY-[ABM]-LAALP
여기서
[ABM]은 제 13항 내지 제 29항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고, 각각은 서로 독립적으로,
Xa 는V 및 E로부터 선택되고;
Xb 는L, E 및 D로부터 선택되고;
Xc 는N, L 및 I로부터 선택되고;
Xd 는R 및 K로부터 선택되고; 또한
Xe 는D 및 K로부터 선택된다.
31. 제 30항에 있어서, Xa는 V인 것인, 사용하기 위한 화합물.
32. 제 30항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, Xb는 L인 것인, 사용하기 위한 화합물.
33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, Xc는 N인 것인, 사용하기 위한 화합물.
34. 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, Xd는 R인 것인, 사용하기 위한 화합물.
35. 제 30항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, Xe는 D인 것인, 사용하기 위한 화합물.
36. 제 11항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 다음으로부터 선택되는 하나의 정의를 충족시키는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:
i) 아미노산 서열은 서열번호 258 -514로부터 선택되고, 특히 서열번호 259, 서열번호 260, 서열번호 266, 서열번호 272, 서열번호 282, 서열번호 284, 서열번호 303, 서열번호 306, 서열번호 310, 서열번호 311, 서열번호 312, 서열번호 412, 서열번호 496, 서열번호 497, 서열번호 498, 서열번호 499, 서열번호 500, 서열번호 501 및 서열번호 502로부터 선택되고, 더욱 특히 서열번호 260, 서열번호 310 및 서열번호 496으로부터 선택됨;
ii) 아미노산 서열은 (i)의 서열과 85% 또는 그 이상의 동일성을 가짐.
37. 제 11항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 다음으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:
i) LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP
여기서, 서로 독립적으로,
X3 은 E, S, Q 및 C로부터 선택되고;
X6 은 E, S 및 C로부터 선택되고;
X7 은 A 및 S로부터 선택되고;
X10 은 A, S 및 R로부터 선택되고;
X14 는 A, S, C 및 K로부터 선택되고;
X26 은 D 및 E로부터 선택되고;
X39 는 D 및 E로부터 선택되고;
X40 은 A 및 E로부터 선택되고;
X43 은 A 및 K로부터 선택되고;
X44 는 A, S 및 E로부터 선택되고;
위치 45의 L은 존재하거나 부존재하고; 또한
위치 46의 P는 존재하거나 부존재함;
ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열.
38. 제 37항에 있어서, 상기 X6는 E인 것인, 사용하기 위한 화합물.
39. 제 37항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, X3는 S 또는 E인 것인 사용하기 위한 화합물.
40. 제 37항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, X7은 A인 것인, 사용하기 위한 화합물.
41. 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, X14는 S 또는 C 인 것인, 사용하기 위한 화합물.
42. 제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, X10은 A 또는 S인 것인, 사용하기 위한 화합물.
43. 제 37항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, X26은 D 또는 E인 것인, 사용하기 위한 화합물.
44. 제 37항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, X39는 D 또는 E인 것인, 사용하기 위한 화합물.
45. 제 37항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, X40은 A인 것인, 사용하기 위한 화합물.
46. 제 37항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, X43은 A인 것인, 사용하기 위한 화합물.
47. 제 37항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, X44는 A 또는 S인 것인, 사용하기 위한 화합물.
48. 제 37항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 45의 L은 존재하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
49. 제 37항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 46의 P는 존재하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
50. 제 37항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 516-659 및 서열번호 679-718로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557, 서열번호 564-565, 서열번호 679-685 및 서열번호 707-718로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이거나, 또는 서열번호 516-659로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557 및 서열번호 564-565로 구성되는 어느 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
51. 제 37항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, i)에서 정의된 서열의 N- 및/또는 C-말단에 위치한 하나 또는 그 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 더 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
52. 제 51항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 660-665 및 서열번호 677-678로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
53. 전술한 어느 항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 상호작용의 KD가 최대 1　x　10-8 M, 예를 들어 최대 1　x　10-9 M, 예를 들어 최대 1　x　10-10 M, 예를 들어 최대 1　x　10-11 M, 예를 들어 최대 1　x　10-12 M로 알부민과 결합하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
54. 하기 a) 및 b)를 포함하는 경구 투여용 약학 조성물:
a) - 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민과 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 화합물; 및
b) 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제.
55. 제 54항에 있어서, 상기 화합물은 제 2-53항 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 약학 조성물.
56. 제 54항 내지 제 55항 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료 활성의 생체이용률을 증가시키기 위한 적어도 하나의 성분을 더 포함하는, 약학 조성물.
57. 제 56항에 있어서, 상기 성분은 단백질 분해효소 억제제, 흡수 향상제, 점막접착성 중합체, 제형 운반체 및 이들의 어느 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
58. 제 54항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 알약, 정제, 캡슐, 파우더 또는 과립제와 같은 고체형; 반죽과 같은 반-고체형; 및 엘릭시르제, 용액 또는 현탁액과 같은 액체형으로부터 선택된 것으로 존재하는 것인, 약학 조성물.
59. 제 54항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 즉각적, 지연된 또는 조절된 방출을 목적으로 설계된 제형인 것인, 약학 조성물.
60. 제 54항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 장용제피 캡슐로서 제형화 된 것인, 약학 조성물.
61. 화합물의 경구 투여를 포함하는, 치료를 필요로 하는 포유류 대상체의 치료 방법으로서, 상기 화합물은
- 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
- 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 치료방법.
62. 제 54항 내지 제 60항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 그러한 치료를 필요로 하는 포유류 대상체의 치료 방법.
63. 제 61항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 제 2항 내지 제 53항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> AFFIBODY AB <120> ORAL ADMINISTRATION <130> IPA140995-SE <150> EP12161808.6 <151> 2012-03-28 <150> US61/616,490 <151> 2012-03-28 <160> 721 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 1 Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Arg Ala Lys Thr Val 1 5 10 15 Glu Gly Val His Ala Leu Ile Gly His Ile 20 25 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 2 Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Val Ile Asn Arg Ala Lys Thr Val 1 5 10 15 Glu Gly Val His Ala Leu Ile Asp His Ile 20 25 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 3 Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ile Ile Asn Arg Ala Lys Thr Val 1 5 10 15 Glu Gly Val Arg Ala Leu Lys Leu His Ile 20 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 4 Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Val Ile Asn Arg Ala Lys Thr Val 1 5 10 15 Glu Gly Val Ser 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Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 698 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 698 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 699 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 699 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 700 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 700 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 701 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 701 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 702 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 702 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 703 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 703 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 704 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 704 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 705 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 705 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Lys Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 706 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 706 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ser Leu Pro 35 40 45 <210> 707 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 707 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Arg Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 708 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 708 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 709 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 709 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 710 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 710 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 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<213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 717 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 718 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <400> 718 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Cys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu 35 40 45 <210> 719 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 719 Glu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Leu Pro Asn Leu Thr 1 5 10 15 Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ala Phe Ile Xaa Lys Leu Xaa Asp Asp Pro Ser 20 25 30 Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln 35 40 45 <210> 720 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Engineered binding domain <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid 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<221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 721 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Glu Ile 1 5 10 15 Xaa Xaa Leu Pro Asn Leu Asn Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ala Phe Ile Xaa 20 25 30 Ser Leu Xaa Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55

Claims (17)

  1. 경구 투여를 통한 치료에 사용하기 위한 화합물로서, 상기 화합물은
    - 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
    - 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
    단, 모이어티 (I)은 엑센딘(exendin) 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 경구 투여를 통한 치료에 사용하기 위한 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 모이어티 (I)은 표적 분자와 선택적인 상호작용을 할 수 있는 결합 폴리펩티드를 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 포도상구균 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체이며, 상기 변이체는 서열번호 719, 서열번호 720 및 서열번호 721로부터 선택되는 스캐폴드 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타내는, 사용하기 위한 화합물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 서열번호 515의 아미노산 서열을 가지는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 알부민 결합 모티프를 포함하고, 상기 모티프는 하기 아미노산 서열로 구성되는 것인, 사용하기 위한 화합물:

    GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I

    여기서, 서로 독립적으로,

    X5 는 Y 및 F로부터 선택되고;
    X8 는 N, R 및 S로부터 선택되고;
    X9 는 V, I, L, M, F 및 Y로부터 선택되고;
    X11 는 N, S, E 및 D로부터 선택되고;
    X12 는 R, K 및 N으로부터 선택되고;
    X14 는 K 및 R로부터 선택되고;
    X20 는 D, N, Q, E, H, S, R 및 K로부터 선택되고;
    X23 는 K, I 및 T로부터 선택되고;
    X24 는 A, S, T, G, H, L 및 D로부터 선택되고; 또한
    X25 는 H, E 및 D로부터 선택된다.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 알부민 결합 모티프는 서열번호 1 -257로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 155, 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244 및 서열번호 245로부터 선택되는 아미노산 서열, 더욱 특히 서열번호 3, 서열번호 53 및 서열번호 239로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것인, 사용하기 위한 화합물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:

    LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY-[ABM]-LAALP
    여기서

    [ABM]은 제 5항 또는 제 6항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고, 각각은 서로 독립적으로,

    Xa 는V 및 E로부터 선택되고;
    Xb 는L, E 및 D로부터 선택되고;
    Xc 는N, L 및 I로부터 선택되고;
    Xd 는R 및 K로부터 선택되고; 또한
    Xe 는D 및 K로부터 선택된다.
  8. 제 3항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 하기 i) 및 ii)로부터 선택되는 하나의 정의를 충족시키는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:
    i) 서열번호 258 -514로부터 선택되고, 특히 서열번호 259, 서열번호 260, 서열번호 266, 서열번호 272, 서열번호 282, 서열번호 284, 서열번호 303, 서열번호 306, 서열번호 310, 서열번호 311, 서열번호 312, 서열번호 412, 서열번호 496, 서열번호 497, 서열번호 498, 서열번호 499, 서열번호 500, 서열번호 501 및 서열번호 502로부터 선택되고, 더욱 특히 서열번호 260, 서열번호 310 및 서열번호 496으로부터 선택됨;
    ii) (i)의 서열과 85% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열임.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 모이어티 (II)는 연쇄상구균 균주 G148로부터의 단백질 G의 도메인 GA3의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 하기 i) 및 ii)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물:

    i) LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP

    여기서, 서로 독립적으로,

    X3 은 E, S, Q 및 C로부터 선택되고;
    X6 은 E, S 및 C로부터 선택되고;
    X7 은 A 및 S로부터 선택되고;
    X10 은 A, S 및 R로부터 선택되고;
    X14 는 A, S, C 및 K로부터 선택되고;
    X26 은 D 및 E로부터 선택되고;
    X39 는 D 및 E로부터 선택되고;
    X40 은 A 및 E로부터 선택되고;
    X43 은 A 및 K로부터 선택되고;
    X44 는 A, S 및 E로부터 선택되고;
    위치 45의 L은 존재하거나 부존재하고; 또한
    위치 46의 P는 존재하거나 부존재함; 및

    ii) i)에서 정의된 서열과 적어도 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 유도체는 서열번호 516-659 및 서열번호 679-718로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557, 서열번호 564-565, 서열번호 679-685 및 서열번호 707-718로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이거나, 또는 서열번호 516-659로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 519-520, 서열번호 522-523, 서열번호 525-526, 서열번호 528-529, 서열번호 531-532, 서열번호 534-535, 서열번호 537-538, 서열번호 540-541, 서열번호 543-544, 서열번호 546-547, 서열번호 549-550, 서열번호 552-553, 서열번호 556-557 및 서열번호 564-565로 구성되는 어느 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 사용하기 위한 화합물.
  11. 하기 a) 및 b)를 포함하는 경구 투여용 약학 조성물:
    a) - 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
    - 알부민과 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
    단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 화합물; 및
    b) 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 화합물은 제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인, 약학 조성물.
  13. 제 11항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 활성의 경구 생체이용률을 증가시키기 위한 적어도 하나의 성분을 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 장용제피 캡슐로 제형화된, 약학 조성물.
  15. 화합물의 경구 투여를 포함하는, 치료를 필요로 하는 포유류 대상체의 치료 방법으로서, 상기 화합물은
    - 원하는 치료 활성을 부여하는 모이어티 (I); 및
    - 알부민에 결합하고 M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49, H, G, MAG, ZAG, PPL 및 PAB로부터 선택되는 자연적으로 발생하는 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 도메인, 그 중 어느 하나의 단편 또는 유도체를 포함하는 모이어티 (II)에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고,
    단, 모이어티 (I)은 엑센딘 서열, 엑센딘 유사체 서열, 엑센딘 활성 단편 서열 또는 엑센딘 유사체 활성 단편으로부터 선택되지 않는 것인, 치료 방법.
  16. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 경구 투여하는 단계를 포함하는, 그러한 치료를 필요로 하는 포유류 대상체의 치료 방법.
  17. 제 15항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인, 방법.
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