KR20140122532A - 축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 축산 부산물로부터 고순도 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질병 등으로부터 오염되지 않은 축산 부산물로부터 비 콜라겐 물질을 제거하여 고순도의 콜라겐을 추출 정제함으로써 식용, 화장품용 또는 의료용 원료로 사용할 수 있는 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.

Description

축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법 {A method for extracting high purity collagen from animal byproducts}

본 발명은 축산 부산물로부터 고순도 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질병 등으로부터 오염되지 않은 축산 부산물로부터 비 콜라겐 물질을 제거하여 고순도의 콜라겐을 추출 정제함으로써 식용, 화장품용 또는 의료용 원료로 사용할 수 있는 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.

콜라겐(collagen)은 몸속에서 결합조직을 이루는 주요한 단백질로, 신체구성 단백질 중 25 ~ 35 %의 매우 많은 부분을 차지한다. 인체 부분별 콜라겐 구성비를 보면, 이의 상아질 18%, 피부표피 아래 진피의 70%, 관절 연골의 50%, 뼈의 유기물 중 80%, 뼈와 근육을 이어주는 힘줄의 80% 그리고, 눈의 각막과 결막에서 주성분을 이루고 있다.

동물에서 발견되는 콜라겐은 대부분 제 1형 콜라겐으로, 300kDa의 단량체로 이루어져 있으며, 특정부위에 공유결합을 가지고 있다. 그렇기 때문에 성숙한 조직에서 발견되는 콜라겐은 낮은 용해성을 가진다. 또한 콜라겐을 구성하는 아미노산은 글루탐산, 하이드록시프롤린, 글리신, 프롤린 및 알라닌 등이며, 그 중 콜라겐에만 특이적으로 존재하는 하이드록시프롤린의 함량이 높은 것이 특징이다.

콜라겐은 나이가 들수록 체내에서 합성하는 능력을 잃게 되는데, 18세 정도가 되면 콜라겐 생성 속도는 급속히 떨어지기 시작하여 40세에는 18세에 비해 절반 이하가 되는 것으로 알려져 있다. 또한 나이가 들게 되면 신진대사가 둔해져, 오래된 콜라겐이 분해되지 않고 계속 축적되면 콜라겐을 합성하는 재료도 부족해짐으로써 노화가 촉진된다.

이러한 이유로 인해, 식품이나 화장품, 의약 관련 분야 등에서는 콜라겐 개발과 이를 이용한 화장품, 식용 및 생체 소재 개발 등에 대해 지속적으로 연구되고 있다. 지금까지는 소나 돼지에서 얻어진 콜라겐이 주로 이용되어 왔지만, 소에서 발생되는 광우병의 발병 이후로 소나 돼지 이외의 어류나 기타 축산물에서 유래하는 콜라겐이 주목을 받아 화장품이나 건강식품, 의약품 등의 원료로서 이용이 검토되고 있다. 이는 사람으로부터 진화적으로 멀리 떨어져 있는 하등척추동물인 어류나 기타 축산물에서 사람과 공통되는 감염증이 비교적 발견되어 있지 않고, 소나 돼지의 콜라겐에 비하여 안전성이 높기 때문이다.

종래에 일반적인 콜라겐 소 돼지와 같은 축산물 외에 오징어 등의 어류나, 녹용, 닭발 등과 같은 동물의 특수 부위에서 콜라겐을 추출하는 방법이 알려지고 있다.

한국특허등록 제10-892605호에서는 닭발을 이용한 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물 제조방법과 이를 조미료에 활용하는 기술이 제안되어 있다. 여기서는 닭발을 염소계 소독제로 표백 및 살균하고, 열수 또는 단백질 분해효소로 콜라겐을 포함하는 단백질을 추출한 다음, 여과, 분리 및 농축하여 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물을 제조하는 기술이 제안되어 있다.

한국특허공개 제2012-120571호에서는 오징어 내피 부분을 분리 선별 취합하고 알칼리 전해수에 세척하고 산성 전해수에 살균 소독하는 전처리 공정을 거친 오징어 내피를 10-20%의 수분율로 건조하고 분쇄한 다음 효소를 이용하여 가수분해하여 콜라겐 펩타이드를 추출하고 농축하여 스프레이 건조하는 콜라겐 펩타이드 제조에 관해 기술하고 있으며, 또 한국특허공개 제2012-134935호에서는 오징어 껍질을 건조 및 분쇄한 오징어 껍질분말에 수산화나트륨 수용액을 가하여 비콜라겐 단백질을 제거하고, 중화 및 수세한 다음 물과 뉴트라제 효소를 첨가하여 가수분해하고, 다시 플라보자임 효소로 2차 가수분해하여 여과, 건조하는 콜라겐 조성물의 추출방법이 제안되어 있다.

한국특허등록 제10-1105603호에서는 동물 조직에서 산 용해, 펩신처리, 염 침전, 여과, 2차 산 용해, 2차 염 침전, 상 분리 및 농축, 산 용해 등을 거쳐서 콜라겐을 고순도로 처리하는 방법이 제안되어 있다. 여기서는 동물의 조직을 염산용액으로 연화시킨 후 펩신효소를 이용하고 인산용액에 넣어 콜라겐을 조직으로부터 분리해내고 염화나트륨으로 침전시킴으로써 효소분리된 콜라겐을 회수하는 방법과, 이를 다시 인산용액에 용해하고 희석한 후 제균 여과한 다음 염 침전시켜서 콜라겐을 분리하고 수분을 제거한 뒤 콜라겐 침전물을 가압, 농축하고 인산용액에 재용해하고 수산화나트륨용액으로 중화하여 콜라겐 용액을 제조방법을 제안하고 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출방법은 산과 염기 처리 및 효소처리 등을 이용하는 전형적인 추출방법으로서 공정이 복잡하고 순도가 좋지 못하여 상업화가 어려운 문제가 있다.

또한, 한국특허공개 제2012-76901호에서는 오리 날개와 오리발로부터 화장용 원료 및 식품 원료로 사용할 수 있는 콜라겐 함유량이 높은 콜라겐 추출물을 조제하기 위한 오리 콜라겐 제조방법을 개시하면서, 상기 날개 및 발의 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 후 -20℃이하에 급냉시키는 원료 전처리 단계와, 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하는 단계와, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하는 단계와, 추출에 사용한 염을 제거하는 탈염단계와, 이를 농축 건조하여 콜라겐 함유 건조물을 얻는 건조공정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 오리의 콜라겐의 제조방법이 제안되어 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출 제조방법은 오리의 조직부위에서 산과 염기를 이용한 콜라겐을 추출방법으로서 지방제거와 건조 농축 등을 통해 콜라겐의 추출효율 개선에 주안점을 두고 있지만 기존의 전통적 방법을 벗어나지 못하고 있으며 콜라겐 함량이 비교적 낮고 그 순도 면에서도 고순도를 기대하기 어려워서 개선의 필요성이 있었다.

1. 한국특허등록 제10-892605호 2. 한국특허공개 제2012-120571호 3. 한국특허공개 제2012-134935호 4. 한국특허등록 제10-1105603호 5. 한국특허공개 제2012-76901호

위와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고 보다 고순도의 콜라겐을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 연구한 결과, 질병 등으로 오염되지 않은 축산 부산물을 탈회 처리하고 지방을 제거한 다음, 콜라겐을 추출하고, 챠콜을 이용한 불순물 제거 및 투석, 농축 후, 정제 공정에서 알코올로 침전시키는 일련의 과정을 거치게 되면 식품, 화장품 또는 의약 등의 용도로 활용 가능한 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있다는 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 축산 부산물로부터 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 식용, 화장품용 및 의료용 원료로 적용 가능한 고순도의 콜라겐을 포함하는 조직공학용 생체재료를 제공하는데 있다.

위와 같은 과제 해결을 위해, 본 발명은

질병으로 오염되지 않은 축산 부산물의 조직부위를 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비하는 단계;

절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액인 탈회용액 내에서 교반 및 초음파(Sonication) 처리하여 탈회시키고 세척하는 탈회단계;

탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거하는 지방제거 단계;

지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계;

콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 단계;

불순물이 제거된 콜라겐 용액을 투석막에서 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 단계;

농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계; 및

상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 60~100% 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 정제단계;

을 포함하는 축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 얻어진 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 캐스팅하여 조직공학적 생체재료 용으로 제조된 콜라겐-PLGA 필름 또는 콜라겐-PLGA 지지체를 포함한다.

본 발명은 기존에 버려지거나 미미하게 이용되어왔던 축산 부산물의 조직부위를 효과적으로 활용하여 고부가가치 재료로 활용하도록 할 수 있는 산업적 효과를 얻을 수 있으며, 특히 비 콜라겐성 물질을 제거하는 탈회 과정 중에 칼슘, 납 등의 금속이 제거되고 챠콜 등을 이용하여 불순물과 악취 등을 제거하는 등의 공정을 거쳐 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따라 추출된 고순도 콜라겐은 순도가 매우 우수하여 동결건조하여 분말 상으로 이용하거나 이를 겔, 용액, 필름 또는 지지체로 제작하여 사용하는 경우 식용, 화장품용 및 조직공학용 재료나 다양한 의료용 원료로 매우 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있는 것이다.

도 1 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 조성을 확인한 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 분석결과이다.
도 2 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 하이드록시프롤린 함량을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 3 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 단백질 함량을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 4 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 점성을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 5 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 동결건조한 뒤의 결과물 사진이다.
도 6 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐 겔을 조직공학적 재료의 제작에 사용하기 위해 준비한 겔 상태의 사진이다.
도 7 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐 용액을 조직공학적 재료의 제작에 사용하기 위해 준비한 용액 상태의 사진이다.
도 8 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 제작한 콜라겐 지지체의 일 구현예를 보여주는 사진이다.
도 9 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 일 구현예로 제작한 콜라겐-PLGA 하이브리드 필름 사진이다.
도 10 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 일 구현예로 제작한 콜라겐-PLGA 하이브리드 지지체 사진이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 축산 부산물의 절단 조직 준비단계, 탈회단계, 지방제거 단계, 콜라겐 추출단계, 불순물 제거 단계, 농축 단계, 콜라겐 분말을 얻는 단계, 정제단계 등을 포함하여 고순도 콜라겐을 추출하는 것을 특징으로 한다.

이러한 본 발명의 추출방법은 종래에 비하여 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있으므로 식품, 화장품, 의료용 재료 등에 널리 활용할 수 있는 것이다.

본 발명은 축산 부산물의 절단 조직 준비단계에서 질병으로 오염되지 않은 축산 부산물의 조직부위를 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비한다. 이때 축산 부산물로서는 조류 또는 포유류의 조직부위가 사용될 수 있고, 바람직하게는 오리 또는 닭의 발, 머리, 날개의 조직부위가 사용될 수 있다. 세척은 증류수 등으로 세척하고 절단은 1~10mm 정도로 세절하는 것이 좋다.

탈회단계에서는 상기 절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액 내에서 교반 및 초음파 처리하여 조직을 연화시킨 다음 탈회시키고 세척하는 과정을 거친다. 이때 사용되는 산 용액으로서는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), HCl, 트리클로로아세트산(TCA) 및 포름산 중에서 선택된 산의 수용액이 사용될 수 있으며 그 중에서 에틸렌디아민테트라아세트산이 바람직하게 사용될 수 있다. 산 용액은 pH 4.5~6.5인 용액이 바람직한 바, pH가 4.5 보다 낮은 경우, 탈회단계에서 산 가용성으로 추출되어지는 콜라겐이 함께 추출되며, 조직이 산팽창되어 조직내의 섬유단백질 속으로 탈회용액의 침투가 어려워 추출 수율이 좋지 않게 되는 단점이 있다. 따라서, 상기와 같은 pH 4.5이상인 산 용액을 탈회과정에 사용함으로써 콜라겐의 수득율을 높일 수 있다. 그러나 위와 같은 pH가 높은 산성 탈회용액 사용 시 탈회시간이 3일~14일 정도로 길어지고 균일한 탈회가 이뤄지지 않는다는 단점이 있다. 그러므로 탈회과정 중에 4에서 초음파 처리를 하여 균일한 탈회가 이뤄지게 함과 동시에 탈회시간을 4~8시간으로 줄이고 조직의 연화 또한 돕게 된다. 산성의 탈회 용액은 일반적으로는 5~15% 농도의 수용액이 적당하고, 절단 조직의 5~10배의 부피비로 첨가하여 저온에서 탈회를 진행한다. 용액의 양이 조직 부피의 5배 미만일 경우에는 탈회의 완료에 어려움이 있고, 15배를 초과하는 경우에는 용액의 낭비가 크다는 문제점이 있다. 일반적으로 탈회의 완료점은 5% 암모늄술포네이트(Ammonium sulfate), 리튬카보네이트(Lithium carbonate) 등으로 확인할 수 있다.

지방 제거단계에서는 탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거한다. 염기 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 차아염소산나트륨 중에서 선택된 염기의 수용액, 또는 클로로포름과 에탄올의 혼합용액, n-헥산 중에서 선택된 유기용매 등을 사용할 수 있다. 그 중에서 클로로포름과 에탄올의 혼합용액이 바람직하게 사용될 수 있다. 염기 용액으로서는 0.5~2M의 염기 수용액을 사용할 수 있으며 pH 9 이하, 좋기로는 pH7.5~9가 바람직하다. pH가 9를 초과할 경우 지방뿐만 아니라 조직의 모든 단백질이 녹게 되어 수율이 낮아진다. 이러한 염기성 용액은 탈회가 완료된 절단 조직에 대해 1~10배의 량으로 첨가하여 바람직하게는 24~36시간 저온, 좋기로는 4℃에서 교반함으로서 지방의 제거가 이루어질 수 있다. 이렇게 지방을 제거하면 콜라겐을 제외한 칼슘, 납 등의 금속성분과 지방 등의 비 콜라겐 물질들이 제거될 수 있고 이런 과정을 거침으로서 추출되는 콜라겐의 순도가 더욱 좋아지게 된다.

콜라겐 추출단계에서는, 상기와 같이 지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 과정을 거친다. 여기서 사용되는 유기산 용액은 콜라겐을 용해할 수 있는 유기산이면 사용 가능하며, 바람직하게는 시트르산, 구연산, 초산 및 포름산 중에서 선택된 것이 사용될 수 있고, 이 중에서 시트르산이 더욱 바람직하게 사용될 수 있다. 지방이 제거된 절단 조직에 대해 3~8% 농도의 유기산 용액을 사용할 수 있고 1~20배의 부피비로 사용하여 24~48시간 저온 교반하면 조직에서 콜라겐이 추출된다. 이러한 유기산 용액으로의 추출은 수회 반복할 수 있다.

상기 추출된 콜라겐 추출 용액에 함유된 불순물 제거 단계에서는 콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 과정이다. 여기서 사용되는 챠콜은 과염소산칼슘(KClO₄), 과염소산나트륨(NaClO₄) 또는 이들의 혼합물을 사용하여 탄화물을 산화시켜 표면에 미세 다공구조를 형성시키는 방법으로 활성화된 챠콜을 콜라겐 추출 용액 에 대해 8~12g/L로 사용하는 것이 좋은데, 챠콜을 가하여 저온 교반한 다음 원심분리하여 불순물과 챠콜을 침전시켜 제거한다. 본 발명에 따르면 이러한 불순물의 제거로 제품의 순도가 증가할 뿐만 아니라, 부패나 악취의 원인을 제거하여 더욱 안정성이 보장된 제품을 만들 수 있다.

농축 단계에서는 상기와 같이 불순물이 제거된 콜라겐 용액에 염을 가하여 침전시키고 이를 투석막을 이용하여 증류수와 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 투석 외액으로 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 과정을 거친다. 이때 불순물이 제거된 콜라겐 용액에 염을 첨가하여 투석막으로는 예컨대 셀룰로오스 한외여과막에 충전하고 증류수를 이용하여 투석을 실시한다. 투석하는 과정에서 염이 제거되고 산성을 가지는 콜라겐 용액이 중성화되고 농축이 이루어진다. 이렇게 투석을 통해 농축된 콜라겐은 원심분리하고 세척하면 농축이 완료되는데, 이 경우 이를 동결건조하여 분말화하는 것이 다음 단계 진행을 위해서 바람직하다.

이를 위해, 분말화 단계로서 농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계를 거친다. 이때 세척은 일반적으로는 알코올 등으로 수회 세척하고 증류수에 재현탁하여 동결건조하는 과정을 거치게 된다.

본 발명에 따르면 고순도 콜라겐을 얻기 위해, 정제단계로서 상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 과정을 거칠 수 있다. 이때 사용되는 산 용액은 탈회과정에서 사용된 것을 사용할 수 있는 데, 여기에 추가로 HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술포닉산)을 첨가하여 혼합용액으로 사용하는 것이 바람직하다. 가장 좋기로는 탈회용액으로 사용된 것 중에서 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)를 사용하고 여기에 HEPES를 첨가한 EDTA-HEPES 혼합용액을 사용하는 것이 좋다, 이렇게 산 용액에 녹인 콜라겐 용액 원심분리하여 일정 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거하는데, 울트라필터, 3,000~30,000 NMWL의 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거한다. 그 다음으로는, 이를 알코올 용액, 바람직하게는 60~100% 알코올 용액 중에서 12-36시간, 좋기로는 하루 침전시켜서 다시 저속 원심분리(1200~3000rpm, 3분, 20℃)로 좋기로는 10,000 NMWL이하, 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거하면 정제된 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있게 된다. 여기서 수거된 좋기로는 10,000 NMWL이하, 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐은 조직공학적으로 적용시 분해 및 흡수가 좋고, 염증반응 또한 줄여준다. 이렇게 수거된 고순도의 콜라겐은 활용성을 좋게 하기 위해 동결건조시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 이런 과정으로 추출한 고순도 콜라겐은 기존의 콜라겐보다 단백질 함량이 30% 이상 낮으며, 하이드록시프롤린 함량이 2배 가까이 높아서 기존에 비해 매우 우수한 순도를 가지는 것으로 얻어질 수 있다. 또한, type I 콜라겐이 대부분 차지하고 그 점도 또한 우수하므로 화장품, 식용, 의료생체 재료 등으로 매우 적합하다.

본 발명에 따라 추출한 고순도 콜라겐은 겔이나 용액 상태로 이용할 수 있고, 조작공학적 재료로 제작된 필름형이나 지지체로 만들어 사용될 수 있다.

필름형은 예컨대 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 용매 캐스팅하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 필름으로 제조된 것을 포함한다. 이때 용매캐스팅은 분말 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하는 방법으로 하여 필름형으로 제작할 수 있다.

또한, 지지체는 역시 유사하게 분말 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 염 캐스팅 방법으로 하여 지지체로 제작할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 얻어진 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA를 이용하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 필름 또는 콜라겐-PLGA 지지체를 포함한다.

상기와 같은 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

[절단 조직 준비단계]

오리발을 증류수에 하루 동안 담가 핏물을 제거하고 증류수로 여러 번 세척하였다. 오리발을 1mm ~ 10mm 크기로 잘게 절단하여, 이 절단 조직을 원료로 사용하였다. 절단한 원료를 -20℃ 이하의 냉장고에서 급속 동결시켜 보관하였다.

[탈회단계]

상기 절단 조직의 10배(w/v)의 10% EDTA 용액을 첨가하여 4에서 1시간 교반 및 4시간 초음파 처리하여 탈회하였다. 탈회의 완료점은 5% 암모늄술포네이트 등으로 확인하였다. 탈회가 완료되면 조직을 증류수에 여러 번 세척하였다.

[지방 제거단계]

탈회를 마친 절단 조직을 지방제거를 위하여 클로로포름과 메탄올을 3 : 1로 섞은 용액을 사용하였다. 24시간 동안 4에서 250rpm으로 교반하여 지방제거 후 조직을 수거하여 증류수로 여러 번 세척한다.

[콜라겐 추출 단계]

상기 지방이 제거된 절단 조직을 알코올과 아세톤을 이용하여 추가적으로 세척한 뒤, 5%의 시트르산을 8배수(w/v) 첨가하여 48시간 저온(4℃)에서 250rpm으로 교반하여 조직에서 콜라겐이 산성용액으로 녹아나오게 하였다. 이 콜라겐이 추출된 용액을 180~250㎛ 체에 걸러 녹지않은 조직은 수거하여 다시 산성 용액을 가하여 교반하였고, 추출된 용액은 냉장보관하였다.

[불순물 및 악취 제거 단계]

추출된 용액에 L당 10g의 활성화된 챠콜을 가하여 4시간 동안 저온에서 교반하였다. 이때 사용된 챠콜은 탄화물에 NaClO₄를 첨가한 뒤 24시간 교반 후 세척하여 37℃ 인큐베이터에서 건조시켜 미세 다공질의 활성화된 챠콜을 사용하였다. 가해 준 챠콜을 제거하기 위해 원심분리(12000rpm, 20분, 4℃)하여 불순물과 챠콜을 침전시켰다. 상등액을 수거하여 2.0㎛ 필터페이터, 0.22㎛ 멤브레인에 차례로 통과시켜 남아있는 챠콜과 불순물을 제거하였다.

[투석 및 농축 단계]

상기에서 얻은 용액에 1M의 염을 첨가하여 12~24hr 침전시킨 뒤, 셀룰로오스 한외여과막(3500Mw)에 충전시켜 24시간 이상 증류수를 투석외액으로 투석하여 염을 제거함과 동시에 산성 콜라겐 용액을 중성이 되게 하였다. 증류수는 1일 5회 이상 교환해주었다. 여기서는 48시간 투석한 뒤, 투석 외액을 폴리에틸렌글리콜로 바꿔주어 콜라겐 용액을 24시간 동안 농축시켰다. 농축이 완료된 콜라겐 용액은 수거하여 원심분리(12000rpm, 20분, 4℃) 한 뒤, 70% 알코올로 2회 세척하고 증류수에 재현탁시켜 동결건조하여 콜라겐을 파우더의 형태로 얻었다.

[정제단계]

상기에서 얻은 콜라겐 파우더를 다시 산 용액에 녹인 뒤, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술포닉산(EDTA-HEPES) 용액과 1M의 NaCl을 가하여 30분 정도 교반하였다. 이 용액을 울트라필터(10,000 NMWL)를 사용하여 원심분리(8,000xg, 30분, 10℃)하고 필터에 걸러지는 콜라겐만 수거하였다. 수거된 콜라겐은 0.45㎛, 0.22㎛ 주사기 필터로 차례로 거른 뒤 60% 알코올을 3배수(w/v)로 넣어준 뒤, 냉장고에서 24시간 보관하여 침전시켰다. 이 침전물을 저속 원심분리(1200~3000rpm, 3분, 20℃)하여 수거한 뒤, 70, 80, 90, 95 및 100% 알코올에 차례로 탈수시켰다. 탈수가 완료 된 뒤 얻어진 콜라겐을 다시 증류수에 재 분산시켜 동결건조하였다.

비교예

동일 시료에 대해 기존의 콜라겐 추출방법으로 오리발에서 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 뒤, 급냉시켜 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하고, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하여, 염을 제거하고 이를 농축 건조하는 방법으로, 한국특허공개 제10-2012-0076901호에 명시된 실시예 1~5에서 제시하고 있는 전처리 단계, 지방제거단계, 콜라겐 추출단계, 탈염 및 농축단계 등을 거쳐 콜라겐 추출물을 얻었다.

실험예 1

[콜라겐 조성 분석]

상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 조성을 알아보기 위하여 5% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 그 결과 도 1 에 도시한 바와 같이 분자량 200, 140, 120 kDa의 type I 콜라겐이 대부분임을 확인하였으며, type III 콜라겐도 다량 포함되어 있음을 확인하였다. 도 1의 S는 표준물질이고 A는 기존의 방법으로 추출한 콜라겐이며 B는 본 발명의 방법으로 추출한 콜라겐이다.

실험예 2

[콜라겐 및 단백질 함량 분석]

상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 콜라겐 함량을 측정하고자, 콜라겐이 분해될 때 특이적으로 분해되는 하이드록시프롤린 함량을 측정하여 콜라겐의 함량을 분석하였다. 하이드록시프롤린 함량 측정 결과 기존 방법의 추출법 보다는 본 발명의 추출법으로 추출한 콜라겐에서 하이드록시프롤린 함량이 2배 가까이 높음을 알 수 있었다. 그 측정 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.

또한 이렇게 추출한 콜라겐이 기존의 방법과 비교하여 고순도의 콜라겐임을 추출했음을 확인하기 위하여 단백질 함량 분석을 실시하였다. 단백질 함량 분석은 Coomassie Plus Reagent (Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, USA) 을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 3에서와 같이 기존의 방법보다 30% 정도 낮은 단백질을 함유하고 있음을 확인하였다. 도 3에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.

실험예 3

[콜라겐 점도 분석]

콜라겐의 점도는 점도계(Rheometer)를 이용하여 측정하였다. 동결건조 된 콜라겐을 0.5% 산용액에 50mg/mL의 농도가 되도록 첨가한 뒤, 2시간 동안 4에서 교반하여 0~ 50의 온도범위에서 절대 점도를 측정하였다. 점도 측정 결과 기존 방법의 추출법 보다는 본 발명의 추출법으로 추출한 콜라겐에서 점성이 3배 가까이 높음을 알 수 있었다. 그 측정 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.

이러한 실험예 1-3의 결과, 실시예에 따른 콜라겐 추출방법으로 얻어진 콜라겐은 비교예의 방법에서 얻어진 콜라겐에 비해 단백질 함량이 훨씬 적고 하이드록시플롤린 함량은 월등하게 높아서 비교예의 추출방법에 비해 고순도의 콜라겐을 추출할 수 있음이 확인되었고, 실시예에서 얻어진 콜라겐의 경우 비교에에 비해 점성도 훨씬 큰 것으로 확인되었다.

제조실시예

[콜라겐 겔, 용액, 필름 및 지지체 제작]

상기 실시예에 의해 추출하여 얻은 고순도 콜라겐 용액을 이용하여 겔, 용액, 필름 및 지지체를 각각 제작하였다. 그 제작에 사용된 실시예에서 얻어진 콜라겐을 동결건조한 형태는 도 5에 도시한 바와 같았다.

동결 건조된 콜라겐을 0.03%의 농도로 펩신이 첨가된 0.5% 산성용액에 50mg/mL로 첨가하여 2시간 동안 4에서 교반하여 고순도 콜라겐 겔을 얻었으며, 이 겔은 도 6에 도시한 바와 같다. 조직공학적 사용을 위해 사용 전 0.45, 0.22 um 실린지 필터에 차례로 통과시켜 멸균하였다.

동결건조된 콜라겐을 0.3% 산성용액에 10mg/mL의 농도로 분산시켰으며, 이렇게 얻어진 콜라겐 용액은 도 7에 도시한 바와 같다. 조직공학적인 사용을 위해 0.45, 0.22 um 실린지 필터에 차례로 통과시켜 멸균하였다.

이 용액을 몰드에 넣고 냉동한 다음, 동결건조시키고, EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide ; 1-에틸-3-(3-ㄷ디디메틸아미노프로필)카보디이미드]로 가교하여 도 8과 같은 통상의 지지체를 완성하였다.

한편, 상기 실시예에서 정제 뒤 파우더 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 용매 캐스팅 방법으로 도 9와 같은 콜라겐/PLGA 필름을 제작하였다.

또한 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 염 캐스팅 방법으로 도 10과 같은 콜라겐/PLGA 지지체를 제작하였다. 그 다음, 이러한 조직공학용 지지체들은 70% 알코올, 감마선, 에틸렌옥사이드(EO) 가스를 이용하여 멸균하였다.

도 9는 고순도 콜라겐을 용매 캐스팅 방법으로 제작한 콜라겐/PLGA 하이브리드 필름 사진이고, 도 10은 콜라겐/PLGA 하이브리드 지지체 사진을 보여주는 것이다.

Claims (9)

1. 질병으로 오염되지 않은 축산 부산물의 조직부위를 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비하는 단계;
   절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액인 탈회용액 내에서 교반 및 초음파(Sonication) 처리하여 탈회시키고 세척하는 탈회단계;
   탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거하는 지방제거 단계;
   지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계;
   콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 단계;
   불순물이 제거된 콜라겐 용액을 투석막에서 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 단계;
   농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계; 및
   상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 60~100% 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 정제단계;
   을 포함하는 축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
2. 청구항 1에 있어서, 축산 부산물은 조류 또는 포유류인 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
3. 청구항 1에 있어서, 탈회단계에서 사용된 산 용액은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), HCl, 트리클로로아세트산(TCA) 및 포름산 중에서 선택된 산의 수용액인 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
4. 청구항 1에 있어서, 불순물을 제거하는 단계에서 활성화된 챠콜은 콜라겐 용액에 대하여 8~12g/L로 첨가하는 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
5. 청구항 1에 있어서, 투석은 투석막을 이용하여 증류수와 폴리에틸렌글리콜을 투석 외액으로 하여 시행하는 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
6. 청구항 1에 있어서, 정제단계에서 산 용액으로는 탈회단계에서 사용한 탈회용액과 동일한 산 용액을 사용하며, 여기에 에틸렌디아민테트라아세트산-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술포닉산) 용액을 첨가하여 콜라겐 추출물을 녹이고, 원심분리는 3,000~30,000 NMWL의 울트라필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
7. 청구항 1에 있어서, 정제단계에서 알코올 용액 중에서 침전은 12-36시간 침전시키는 것을 특징으로 하는 고순도 콜라겐의 추출방법.
   
8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 하나의 항에 따라 추출된 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 용액 캐스팅하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 필름.
   
9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 하나의 항에 따라 제조된 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 염 캐스팅하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 지지체.

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