[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20140111688A - 아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자 - Google Patents

아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20140111688A
KR20140111688A KR1020147021789A KR20147021789A KR20140111688A KR 20140111688 A KR20140111688 A KR 20140111688A KR 1020147021789 A KR1020147021789 A KR 1020147021789A KR 20147021789 A KR20147021789 A KR 20147021789A KR 20140111688 A KR20140111688 A KR 20140111688A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
region
nucleic acid
acid molecule
stranded nucleic
mentioned
Prior art date
Application number
KR1020147021789A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101674778B1 (ko
Inventor
다다아키 오기
히로시 스즈키
도모히로 하마사키
에리코 아오키
Original Assignee
가부시키가이샤 보낙
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 보낙 filed Critical 가부시키가이샤 보낙
Publication of KR20140111688A publication Critical patent/KR20140111688A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101674778B1 publication Critical patent/KR101674778B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C225/00—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones
    • C07C225/02—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C225/04—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being saturated
    • C07C225/06—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/533—Physical structure partially self-complementary or closed having a mismatch or nick in at least one of the strands
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은, 용이 또한 효율적으로 제조가 가능해서 유전자의 발현을 억제할 수 있는 새로운 핵산 분자의 제공을 목적으로 한다.
표적 유전자의 발현을 억제하고 영역 (X), 링커 영역 (Lx) 및 영역 (Xc) 를 포함하는 발현 억제 서열을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자이 제공되는데, 이때 상기 링커 영역 (Lx) 는 영역 (Xc) 와 영역 (Xc) 사이에 결합되고, 영역 (Xc) 는 영역 (X) 와 상보적이며, 영역 (X) 및 (Xc) 중 적어도 하나는 발현 억제 서열을 포함하고, 링커 영역 (Lx) 는 아미노산으로부터 유래된 원자단을 포함한다. 상기 단일-가닥 핵산 분자는 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

Description

아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자 {SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE HAVING AMINO ACID BACKBONE}
본 발명은, 유전자 발현을 억제하는 단일-가닥 핵산 분자에 관한 것이고, 보다 상세하게는, 아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자, 그것을 포함하는 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
유전자의 발현을 억제하는 기술로서, 예를 들면, RNA 간섭 (RNAi) 이 알려져 있다 (비특허 문헌1). RNA 간섭에 의한 유전자의 발현 억제는, 예를 들면, 짧은 이중-가닥 RNA 분자를 세포 등에 투여함으로써 실시되는 것이 일반적이다. 상술된 이중-가닥 RNA 분자는, 통상, siRNA (small interfering RNA; 소형 간섭 RNA)으로 불린다. 분자내 어닐링에 의해, 부분적으로 이중 가닥을 형성한 환상의 RNA 분자에 의해서도, 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이 보고되어 있다 (특허 문헌 1).
[선행 기술 문헌]
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: Fire et al., Nature, 1998 Feb 19;391(6669):806-11
[특허 문헌]
특허 문헌 1: 미국 공개 공보 2004-058886
그러나, 상술된 각 수법에서는, 유전자의 발현 억제를 유도하는 RNA 분자는, 이하와 같은 문제가 있다.
우선, 상술된 siRNA 를 제조할 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 따로따로 합성한 다음 공정 말미에 이것들의 가닥을 혼성화 (hybridization) 하는 공정이 필요하다. 이것 때문에, 제조 효율이 나쁜 문제가 있다. 또한, 상술된 siRNA 를 세포에 투여할 때, 단일-가닥 RNA 의 해리를 억제한 상태로, 세포에 투여할 필요가 있기 때문에, siRNA 취급 조건의 설정에도 노동력을 필요로 한다. 환상의 RNA 분자의 경우, 그 합성이 곤란하다는 문제가 있다.
이것들의 RNA 분자는, 기본적으로 뉴클레오티드 잔기로 구성되어 있다. 현재, 상술된 RNA 분자에, 얼마간의 기능이나 표지를 부여할 경우, 예를 들면, 뉴클레오티드 잔기의 구성 요소, 즉 염기, 당 잔기 또는 인산을 수식하는 것을 시행하는 수 밖에 없는 것이 현상이다. 이것 때문에, RNA 간섭을 이용한 의약품 등의 개발에 있어서, 유전자 발현의 억제 기능을 유지한 상태로, 새로운 기능이나 표지를 부여하기 위한 개발이, 지극히 곤란하다.
따라서, 본 발명은, 용이 또한 효율적으로 제조가 가능하고 유전자의 발현을 억제할 수 있는 새로운 핵산 분자의 제공을 목적으로 한다.
상술된 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 핵산 분자는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자이며, 영역 (X), 링커 영역 (Lx) 및 영역 (Xc) 을 포함하고, 상술된 영역 (X) 과 상술된 영역 (Xc) 의 사이에, 상술된 링커 영역 (Lx) 이 연결되어, 상술된 영역 (Xc) 이, 상술된 영역 (X) 과 상보적이며, 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 의 적어도 하나가, 상술된 발현 억제 서열을 포함하고, 상술된 링커 영역 (Lx) 이, 아미노산으로 유도되는 원자단을 포함한다.
본 발명의 제 1 의 조성물은, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물이며, 상술된 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제 2 의 조성물은, 약학적 조성물이며, 상술된 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이며, 상술된 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 발현 유도 방법은, 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭을 유도하는 방법이며, 상술된 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 질환의 치료 방법은, 상술된 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자를, 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상술된 단일-가닥 핵산 분자가, 상술된 발현 억제 서열로서, 상술된 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 소유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일-가닥 핵산 분자는, 유전자의 발현 억제가 가능하다. 이것은 환상이 아니기 때문에, 그 합성이 용이하다. 이것은 단일-가닥이기 때문에, 이중-가닥 어닐링 공정이 없고, 효율적으로 제조가능하다. 또한, 상술된 링커 영역이 상술된 비(非)뉴클레오티드 잔기를 포함하기 위해서, 예를 들면, 종래와 같은 뉴클레오티드 잔기의 변경에 한정되지 않고, 예를 들면, 상술된 링커 영역에 있어서의 수식 등의 변경도 가능해 진다.
본 발명의 단일-가닥 핵산 분자의 구조에 따라, 유전자 발현을 억제할 수 있다는 점을 찾아낸 사람은 본 발명자가 처음이다. 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자의 유전자의 발현 억제 효과는, RNA 간섭과 같은 현상에 의한 것이라고 추측되지만, 본 발명에 있어서의 유전자 발현 억제는, RNA 간섭에 제한 및 한정되지 않는다.
도 1 은 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자의 예를 예시하는 모식도다.
도 2 는 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자의 또 다른 예를 예시하는 모식도다.
도 3 은 본 발명의 단일-가닥 핵산 분자의 그 밖의 예를 예시하는 모식도다.
도 4 는 본 발명의 실시예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 5 는 참고예로 사용한 ssRNA 를 나타낸다.
도 6 은 참고예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 7 은 참고예에 있어서의 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 8 은, 참고예에 있어서의 LAMA 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 9 은 참고예에 있어서의 LMNA 유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 10 은 참고예로 사용한 ssRNA 를 나타내는 도이다.
도 11 은 참고예에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 12 은 본 발명의 실시예에 있어서의 반딧불이 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 (pGL3Luc) 의, 반딧불이 루시퍼라아제 유전자 발현 억제 효과 (루시퍼라아제의 상대 활성) 를 나타내는 그래프이다.
본명세서에서 사용하는 용어는, 특히 언급하지 않는 한, 해당 기술 분야에서 보통 쓸 수 있는 의미로 쓸 수 있다.
1. ssPN 분자
본 발명의 단일-가닥 핵산 분자는, 전술과 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자이며, 영역 (X), 링커 영역 (Lx) 및 영역 (Xc) 을 포함하고, 상술된 영역 (X) 과 상술된 영역 (Xc) 과의 사이에, 상술된 링커 영역 (Lx) 이 연결되어, 상술된 영역 (Xc) 이, 상술된 영역 (X) 과 상보적이며, 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 의 적어도 하나가, 상술된 발현 억제 서열을 포함하고, 상술된 링커 영역 (Lx) 이, 아미노산으로 유도되는 원자단을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, "표적 유전자의 발현 억제"는, 예를 들면, 상술된 표적 유전자의 발현을 저해하는 것을 의미한다. 상술된 억제의 메커니즘은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 하향조절 (downregulation) 또는 침묵화 (silencing) 일 수 있다. 상술된 표적 유전자의 발현 억제는, 예를 들면, 상술된 표적 유전자로부터 유래된 전사 산물의 생성량의 감소, 상술된 전사 산물의 활성의 감소, 상술된 표적 유전자로의 번역 산물의 생성량의 감소, 또는 상술된 번역 산물의 활성의 감소 등에 의해 확인할 수 있다. 상술된 단백질은, 예를 들면, 성숙 단백질, 또는, 프로세싱 또는 번역후 수식에 적용되기 전의 전구체 단백질 등일 수 있다.
본 발명의 단일-가닥 핵산 분자는, 이하, 본 발명의 "ssPN 분자"라고도 지칭될 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 생체 내 또는 시험관 내에 있어서, 표적 유전자의 발현 억제에 사용할 수 있는 것부터, "표적 유전자의 발현 억제용 ssPN 분자" 또는 "표적 유전자의 발현 억제제"라고도 한다. 또한, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, RNA 간섭에 의해, 상술된 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것부터, "RNA 간섭용 ssNP분자", "RNA 간섭 유도용 ssPN 분자" 또는 "RNA 간섭제 또는 RNA 간섭 유도제"라고도 한다. 또한, 본 발명은, 예를 들면, 인터페론 유도 등의 부작용을 억제할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자에서, 그 5'말단과 3'말단은 서로 미연결이다. 따라서, "선상 단일-가닥 핵산 분자"라고 할 수도 있다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, 본 발명의 ssPN 분자가, 생체 내 또는 시험관 내에서 세포 내에 도입되었을 경우에, 상술된 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 나타내는 서열이다. 상술된 발현 억제 서열은, 특별히 제한되지 않고, 원하는 표적 유전자의 종류에 따라, 적당히 설정될 수 있다. 상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, siRNA 에 의한 RNA 간섭에 관여하는 서열을 적당히 적용할 수 있다. 일반적으로, RNA 간섭은 긴 이중가닥 RNA (dsRNA) 이 세포 내에서 Dicer 에 의해 절단되어 3' 말단이 돌출한 약 19 내지 21 염기의 이중가닥 RNA (siRNA:small interfering RNA) 를 생성하고, 그 한편의 단일-가닥 RNA 가 표적 mRNA 에 결합해, 상술된 mRNA 를 분해하여, 이로써 상술된 mRNA 의 번역이 억제되는 현상이다. 상술된 표적 mRNA 에 결합하는 상술된 siRNA 에 있어서의 단일-가닥 RNA 의 서열은, 예를 들면, 표적 유전자의 종류에 따라서 여러가지 종류가 보고되어 있다. 본 발명은, 예를 들면, 상술된 siRNA 의 단일-가닥 RNA 의 서열을, 상술된 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다.
본 발명은, 상술된 표적 유전자에 대한 상술된 발현 억제 서열의 서열 정보가 핵심이 아니고, 상술된 발현 억제 서열에 의한 상술된 표적 유전자의 발현 억제 활성을, 예를 들면, 세포 내에서 기능시키기 위한 핵산 분자의 구조에 관한 것임에 주목해야 한다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 출원시에 있어서 공지되어 있는 상술된 siRNA 의 단일-가닥 RNA 서열뿐 아니라, 미래에 동정될 수 있는 서열도 예를 들어 상술된 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다.
상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, 상술된 표적 유전자의 소정 영역에 대하여, 90% 이상의 상보성을 소유하고 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 95% 이며, 더욱 바람직하게는 98% 이며, 특히 바람직하게는 100% 이다. 이러한 상보성을 만족시키는 것에 의해, 예를 들면, 오프-타겟 (off-target) 효과를 충분히 경감할 수 있다.
구체예로서, 표적 유전자가 GAPDH 유전자의 경우, 상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, SEQ ID NO: 5로써 나타낸 19 염기장 (base length) 의 서열을 사용할 수 있다. 표적 유전자가 TGF-β1 의 경우, 상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, SEQ ID NO: 15로써 나타낸 21 염기장의 서열을 사용할 수 있고, 표적 유전자가 LAMA1 유전자의 경우, 상술된 발현 억제 서열은, 예를 들면, SEQ ID NO: 16 로써 나타낸 19 염기장의 서열을 사용할 수 있고, 표적 유전자가 LMNA 유전자의 경우, 예를 들면, SEQ ID NO: 17 로써 나타낸 19 염기장의 서열을 사용할 수 있다.
Figure pct00001
본 발명의 ssPN 분자에 의한 상술된 표적 유전자의 발현의 억제는, 예를 들면, RNA 간섭에 의해 달성되는 것으로 추측된다. 한편, 본 발명은, 이 메커니즘에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 소위 siRNA 와 같이, 2 개의 단일-가닥 RNA 로 이루어진 dsRNA 의 형태로 세포 등에 도입되는 것도 아니고, 세포 내에서, 상술된 발현 억제 서열을 절단시켜 제거하는 것이 반드시 필수적인 것도 아니다. 이것 때문에, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, RNA 간섭의 기능을 나타낸다고 말할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 생체내에 있어서의 인터페론 유도 등의 부작용을 억제할 수 있고, 뉴클레아제 내성에 뛰어난다.
상술된 링커 영역 각각은, 예를 들면, 상술된 비뉴클레오티드 구조만으로 이루어진 비뉴클레오티드 잔기(들)을 포함할 수 있거나, 또는 상술된 비뉴클레오티드구조를 갖는 비뉴클레오티드 잔기(들) 및 뉴클레오티드 잔기(들)를 포함할 수 있다다.
상술된 링커 영역에 있어서, 상술된 "아미노산으로 유도되는 원자단"은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 하기 식 (IA) 로 나타낸 원자단이다.
Figure pct00002
상술된 식 (IA) 중, 예를 들면,
X1 은, H2, O, S 또는 NH 이며,
원자단 A 는, 임의적이지만 펩티드 결합을 포함하지는 않는다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 링커 영역은, 예를 들면, 하기식 (I)로써 나타낸다.
Figure pct00003
상술된 식 (I) 중, 예를 들면,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이고;
Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이고;
L1 은 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비(非)치환될 수 있거나 또는
L1 은 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환해 수득된 폴리에테르 사슬이고,
단, Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이며, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리 서로 인접되지 않으며,
L2 은 m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
L2 은 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
단: Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 인접하지 않고.
Ra, Rb, Rc, 및 Rd 는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고,
m 은 0 내지 30 의 정수이고;
n 은 0 내지 30 의 정수이고;
상기 영역 (Xc) 및 (X) 는 각각 -OR1- 또는 -OR2- 을 통해 상술된 링커 영역 (Lx) 에 결합하고,
이때, R1 및 R2 는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상술된 구조 (I) 이고; 및
A 는 임의의 원자단이며, 하기 식 (Ia) 는 상술된 아미노산이고, 하기 식 (Ia) 는 펩티드 이외의 아미노산이다.
Figure pct00004
상술된 식 (I) 중, 예를 들면 X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이다. 상술된 식 (I) 에서, "X1 이 H2 임" 이란, X1 가 X1 이 결합하는 탄소 원자와 함께 CH2 (메틸렌기) 를 형성하는 것을 의미한다. X2 에 대해서도 동일하다.
상술된 식 (I) 에서, Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이다.
상술된 식 (I) 에서, L1 은 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이다. 상술된 알킬렌 탄소 원자(들) 상 수소 원자(들)은 예를 들어 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비치환될 수 있다. 대안적으로, L1 은 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 수소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬일 수 있다. 상술된 폴리에테르 사슬은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜이다. Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 서로 인접하지 않는다. 즉, 예를 들어 Y1 이 O 인 경우, 그 산소 원자와 L1 의 산소 원자는 서로 인접하지 않고, OR1 의 산소 원자와 L1 의 산소 원자는 서로 인접하지 않는다.
상술된 식 (I) 에서, L2 는 m 개의 탄소 원자를 가진 알킬렌 사슬이다. 상술된 알킬렌 탄소 원자(들) 상 수소 원자(들)은 예를 들어 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있다. 대안적으로, L2 는 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환시킴으로써 수득된 폴리에테르 사슬일 수 있다. Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자끼리는 서로 인접하지 않는다. 즉, 예를 들어 Y2 가 O 인 경우, 이 산소 원자와 L2 의 산소 원자는 서로 인접하지 않고, OR2 의 산소 원자와 L2 의 산소 원자는 서로 인접하지 않는다.
L1 의 n 및 L2 의 m 은 특별히 제한되지 않고, 이들 각각의 하한은 예를 들어 0 일 수 있고, 상한도 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, n 및 m 은 상술된 링커 영역 (Lx) 의 바람직한 길이에 따라 적절히 설정될 수 있다. 예를 들어, 제조 가격, 수율 등의 관점에서 볼 때, n 및 m 은 각각 바람직하게 0 내지 30, 더욱 바람직하게 0 내지 20 이며, 보다 더욱 바람직하게 0 내지 15 이다. n 및 m 은 동일 (n = m) 또는 상이할 수 있다. n + m 은 예를 들어, 0 내지 30, 바람직하게 0 내지 20, 더욱 바람직하게 0 내지 15 이다.
예를 들어, Ra, Rb, Rc 및 Rd 는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고, 상동 또는 상이할 수 있다. 상술된 치환기의 예에는 하기가 포함된다: 히드록시, 카르복시, 술포, 할로겐, 알킬 할라이드 (할로알킬, 예를 들어, CF3, CH2CF3, CH2CCl3), 니트로, 니트로소, 시아노, 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸), 알케닐 (예를 들어, 비닐), 알키닐 (예를 들어, 에티닐), 시클로알킬 (예를 들어, 시클로프로필, 아다만틸), 시클로알킬알킬 (예를 들어, 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸), 시클로알케닐 (예를 들어, 시클로프로페닐), 시클릴알킬, 히드록시알킬 (예를 들어, 히드록시메틸, 히드록시에틸), 알콕시알킬 (예를 들어, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 에톡시에틸), 아릴 (예를 들어, 페닐, 나프틸), 아릴알킬 (예를 들어, 벤질, 페네틸), 알킬아릴 (예를 들어, p-메틸페닐), 헤테로아릴 (예를 들어, 피리딜, 푸릴), 헤테로아릴알킬 (예를 들어, 피리딜메틸), 헤테로시클릴 (예를 들어, 피페리딜), 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬 (예를 들어, 모르폴릴메틸), 알콕시 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시), 할로겐화 알콕시 (예를 들어, OCF3), 알케닐옥시 (예를 들어, 비닐옥시, 알릴옥시), 아릴옥시 (예를 들어, 페닐옥시), 알킬옥시카르보닐 (예를 들어, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐), 아릴알킬옥시 (예를 들어, 벤질옥시), 아미노 [알킬아미노 (예를 들어, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노), 아실아미노 (예를 들어, 아세틸아미노, 벤조일아미노), 아릴알킬아미노 (예를 들어, 벤질아미노, 트리틸아미노), 히드록시아미노], 아미노알킬 (예를 들어, 아미노메틸), 알킬아미노알킬 (예를 들어, 디에틸아미노메틸), 카르바모일, 술파모일, 옥소, 실릴, 실릴옥시알킬 등. 이들 치환기는 하나 이상의 추가 치환기 또는 추가 보호기에 의해 임의 치환된다. 상술된 추가 치환기는 특별히 제한되지 않지만, 이것은 예를 들어 상기 예시된 치환기일 수 있다. 상술된 추가 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 이것은 하기에 예시된 보호기일 수 있다. 이하에 있어서도 동일하다.
상술된 보호기 (또는 상술된 추가 보호기) 는 예를 들어 반응성이 높은 관능성 기를 불활성화시키는 관능기이다. 보호기의 예는 공지된 보호기를 포함한다. 상술된 보호기와 관계 없이, 예를 들어 문헌 (J. F. W. McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York, 1973) 의 기재를 인용할 수 있다. 상술된 보호기는 특별히 제한되지 않고, 이의 예에는 하기가 포함된다: tert-부틸디메틸실릴기 (TBDMS), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기 (ACE), 트리이소프로필실릴옥시메틸기 (TOM), 1-(2-시아노에톡시)에틸기 (CEE), 2-시아노에톡시메틸기 (CEM), 톨릴술포닐에톡시메틸기 (TEM), 및 디메톡시트리틸기 (DMTr). R3 이 OR4 인 경우, 상술된 보호기는 특별히 제한되지 않고, 그의 예는 TBDMS 기, ACE 기, TOM 기, CEE 기, CEM 기, 및 TEM 기를 포함한다. 기타 보호기의 예에는 후술되는 화학식 (P1) 및 (P2) 에 의해 나타낸 실릴-함유기가 포함된다. 이하에 있어서도 동일하다.
상술된 식 (I) 에서, 수소 원자는 각각 독립적으로 예를 들어, 할로겐, 예컨대 Cl, Br, F, 또는 I 로 치환될 수 있다.
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 는 각각 예를 들어 -OR1- 또는 -OR2- 을 통해 상술된 링커 영역 (Lx) 에 결합된다. R1 및 R2 는 존재하거나 그렇지 않을 수 있다. R1 및 R2 이 존재하는 경우, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 상술된 식 (I) 로 나타낸 구조이다. R1 및/또는 R2 이 상술된 뉴클레오티드 잔기인 경우, 상술된 링커 영역 (Lx) 는 예를 들어 뉴클레오티드 잔기 R1 및/또는 R2 을 제외하는 상술된 식 (I) 의 구조를 갖는 상술된 비뉴클레오티드 잔기와, 상술된 뉴클레오티드 잔기(들)로 이루어진다. R1 및/또는 R2 가 상술된 식 (I) 로 나타내어지는 구조인 경우, 상술된 링커 영역 (Xc)은, 예를 들면, 상술된 식 (I) 의 구조를 갖는 상술된 비뉴클레오티드 잔기가 2 개 이상 서로 연결된 구조가 된다. 상술된 식 (I) 의 구조의 개수는 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4 일 수 있다. 링커 영역 (Lx) 가 복수의 상술된 구조를 포함하는 경우, 상술된 (I) 의 구조는 예를 들어 직접 연결될 수 있거나, 또는 상술된 뉴클레오티드 잔기(들) 을 통해 결합될 수 있다. 다른 한편, R1 및 R2 이 존재하지 않는 경우, 상술된 링커 영역 (Lx) 는 예를 들어 상술된 식 (I) 의 구조를 갖는 상술된 비뉴클레오티드 잔기 단독으로 이루어진다.
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 과, -OR1- 및 -OR2- 과의 조합은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 하기의 조건 중 임의의 것일 수 있다.
조건 (1):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 는 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조와 결합된다.
조건 (2):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 는 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조와 연결된다.
본 발명의 ssPN 분자에서, 상술된 식 (I) 중의 원자단 A 는 특별히 제한되지 않고 임의이나; 이것은 상술된 바와 같이 펩티드가 아닌 하기 식 (Ia) 으로 나타낸 아미노산이다.
Figure pct00005
상술된 식 (I), (IA) 또는 (Ia) 에서 원자단 A 는 예를 들어 사슬 원자단, 지환식 원자단, 및 방향족 원자단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상술된 사슬 원자단은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 언급할 수 있다. 상술된 지환식 원자단은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬 등을 언급할 수 있다. 상술된 방향족 원자단은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 축합된-고리 아릴, 축합된-고리 아릴알킬, 축합된-고리 알킬아릴 등을 언급할 수 있다. 상술된 식 (I), (IA) 또는 (Ia) 중 원자단 A 에서, 상술된 원자단 각각은 치환기 또는 보호기를 추가로 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 상술된 치환기 또는 보호기가 복수의 경우, 이들은 상동 또는 상이할 수 있다. 상술된 치환기는 예를 들어 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에 예시된 것, 더욱 구체적으로 예를 들어 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤릴, 이미다졸릴, 등이다. 상술된 보호기는 예를 들어 상술된 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에 대해 예시된 것과 동일하다.
본 발명에서, "아미노산"은 분자 중에 하나 이상의 아미노기 및 하나 이상의 카르복시기를 포함하는 임의의 유기 화합물을 지칭한다. "펩티드"는 2 개 이상의 분자의 아미노산이 펩티드 결합을 통해 결합되는 구조를 갖는 유기 화합물을 지칭한다. 상술된 펩티드 결합은 산 아미드 구조 또는 산 이미드 구조일 수 있다. 복수의 아미노기가 상술된 식 (Ia) 로 나타낸 아미노산 분자에 존재하는 경우, 상술된 식 (Ia) 에 명시하고 있는 아미노기는 임의의 아미노기일 수 있다. 추가적으로 복수의 카르복시기가 상술된 식 (Ia) 로 나타낸 아미노산 분자에 존재하는 경우, 상술된 식 (Ia) 에 명시된 카르복시기는 임의의 카르복시기일 수 있다.
본 발명의 단일-가닥 핵산의 상술된 링커 영역에 있어서, 상술된 아미노산은 예를 들어 천연 아미노산 또는 인공 아미노산일 수 있다. 본 발명에서, "천연 아미노산"은 천연에 존재하는 구조의 아미노산 또는 그의 광학 이성질체를 지칭한다. 상술된 천연 아미노산의 제조 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 천연으로부터 추출될 수 있거나 합성될 수 있다. "인공 아미노산"은 천연에 존재하지 않는 구조의 아미노산을 지칭한다. 즉, 상술된 인공 아미노산은, 아미노산, 즉 천연적으로 발생하지 않는 구조를 가지며 아미노기를 포함하는 카르복실산 유도체 (하나 이상의 아미노기 및 하나 이상의 카르복시기를 분자에 포함하는 유기 화합물) 이다. 상술된 인공 아미노산은 바람직하게 예를 들어 헤테로 고리를 포함하지 않는다. 상술된 아미노산은 예를 들어 단백질을 구성하는 아미노산일 수 있다. 상술된 아미노산은 예를 들어, 글리신, α-알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 히드록시리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 트립토판, β-알라닌, 1-아미노-2-카르복시시클로펜탄, 또는 아미노벤조산일 수 있고, 치환기 또는 보호기를 추가로 가질 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 상술된 치환기의 예에는 상술된 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에 대해 예시된 치환기가 포함된다. 더욱 구체적으로 예를 들어 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤릴, 이미다졸릴, 등을 언급할 수 있다. 상술된 보호기는 예를 들어 상술된 Ra, Rb, Rc 및 Rd 에 대해 예시된 보호기와 동일하다. 펩티드가 아닌 상술된 식 (Ia) 의 아미노산이 광학 이성질체, 기하 이성질체, 입체이성질체 등의 이성질체를 포함하는 경우, 임의의 이성질체가 이용될 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자에서, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 후술되는 링커 영역 (Ly) 는 예를 들어 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조 및 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 포함하지 않는다. 상술된 피롤리딘 골격의 예에는 피롤리딘의 5-원 고리를 구성하는 하나 이상의 탄소가 치환된 피롤리딘 유도체의 골격을 포함하고, 치환된 탄소의 예는 C-2 탄소 이외의 탄소 원자를 포함한다. 상술된 탄소는 예를 들어 질소, 산소 또는 황으로 치환될 수 있다. 상술된 피롤리딘 골격은 예를 들어 피롤리딘의 5-원 고리에서 탄소-질소 이중 결합 또는 탄소-탄소 이중 결합을 포함할 수 있다. 상술된 피롤리딘 골격에서, 피롤리딘의 5-원 고리를 구성하는 탄소 및 질소는 예를 들어 수소 또는 상술된 치환기에 결합할 수 있다. 상술된 링커 영역 (Lx) 는 예를 들어 상술된 피롤리딘 골격에서 임의의 원자를 통해 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 에 결합할 수 있다. 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 과 결합하는 상술된 피롤리딘 골격의 원자는 예를 들어 상술된 5-원 고리의 임의의 하나의 탄소 원자 또는 임의의 하나의 질소이다. 보다 구체적으로, 예를 들어 이것은 상술된 5-원 고리의 2-위치 탄소 (C-2) 또는 질소이다. 상술된 피롤리딘 골격의 예는 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 포함한다. 상술된 피페리딘 골격으로서, 예를 들어 피페리딘의 6-원 고리를 구성하는 하나 이상의 탄소가 치환된 피페리딘 유도체의 골격이 언급될 수 있다. 탄소가 치환되는 경우, 예를 들어 이것은 C-2 탄소 이외의 탄소 원자이다. 상술된 탄소는 예를 들어 질소, 산소 또는 황에 의해 치환될 수 있다. 상술된 피페리딘 골격은 또한 예를 들어 피페리딘의 6-원 고리에서 예를 들어 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함할 수 있다. 상술된 피페리딘 골격에서, 피페리딘의 6-원 고리를 구성하는 탄소 및 질소는 예를 들어 수소 기 또는 후술될 치환기에 결합할 수 있다. 상술된 링커 영역 (Lx) 는 또한 예를 들어 상술된 피페리딘 골격의 임의의 원자를 통해 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 와 결합할 수도 있다. 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 과 결합되는 상술된 피페리딘 골격의 원자는 예를 들어 상술된 6-원 고리의 임의의 하나의 탄소 원자 또는 임의의 하나의 질소, 더욱 구체적으로 예를 들어 상술된 6-원 고리의 2-위치 탄소 (C-2) 및 질소이다.
피롤리딘 골격을 포함하는 상술된 비뉴클레오티드 구조 또는 피페리딘 골격을 포함하는 상술된 비뉴클레오티드 구조는, 예를 들어 하기 식 (Ib) 로 나타낸 구조를 언급할 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자에서, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 후술되는 링커 영역 (Ly) 는 예를 들어 피롤리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조 및 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 포함하지 않는다.
Figure pct00006
상술된 식 (Ib) 에서, 예를 들어 X1, X2, Y1, Y2, L1, L2, R1 및 R2 는 상술된 식 (I) 에 대해 정의된 바와 같다.
R3 은 고리 A 상 C-3, C-4, C-5 또는 C-6 에 결합하는 수소 원자 또는 치환기이다. R3 이 상술된 치환기인 경우, 치환기 R3 은 1 개 이상일 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. R3 이 복수개 존재하는 경우, 이들은 상동 또는 상이할 수 있다. 치환기 R3 는 예를 들어 할로겐, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4, 옥소 기 (=O) 등이다. R4 및 R5 는 예를 들어 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고, 상동 또는 상이할 수 있다.
l 은 1 또는 2 이고; l = 1 인 경우, 고리 A 는 5-원 고리, 예를 들어 상술된 피롤리딘 골격이다. 상술된 피롤리딘 골격은 예를 들어 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등이고, 이들의 2가 구조에 의해 예시된다. l = 2 인 경우, 고리 A 는 6-원 고리, 예를 들어 상술된 피페리딘 골격이다. 골격 A 에서, 고리 A 상 C-2 이외의 하나의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황에 의해 치환될 수 있다. 고리 A 는 고리 A 에서 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함할 수 있다. 고리 A 는 예를 들어 L 형 또는 D 형일 수 있다. 고리 A 에서 고리 A 상 상술된 C-2 이외의 하나의 탄소 원자는 질소, 산소 또는 황에 의해 치환될 수 있고, 상술된 고리 A 에서 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함할 수 있다.
상술된 식 (I) 의 구조의 예에는 하기 식 (I-1) 내지 (I-4) 의 구조가 포함된다. 하기 식에서, n 및 m 은 상술된 식 (I) 에서와 동일하다.
Figure pct00007
Figure pct00008
상술된 식 (I-1) 내지 (I-4) 에서, n 및 m 은 특별히 한정되지 않고 상술된 바와 같다. 이의 특정 예는 상술된 식 (I-1) 이고, 식 중 n = 11 및 m = 12 이다. 이의 구조는 상술된 식 (I-1a) 에 의해 나타낸다. 또 다른 구체적인 예는 상술된 식 (I-1) (식 중, n = 5 및 m = 4) 이다. 그의 구조는 하기 식 (I-1b) 로 나타낸다. 또한 또다른 구체적인 예는 상술된 식 (I-4) (식 중, n = 5 및 m = 4) 이다. 이의 구조는 하기 식 (I-4a) 로 나타낸다.
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc) 은 상술된 영역 (X) 과 상보적이다. 따라서, 본 발명의 ssPN 분자에서, 이중 가닥은 영역 (X) 를 향해 상술된 영역 (Xc) 를 뒤집어 접고 상술된 영역 (Xc) 및 (X) 를 자가-어닐링함으로써 형성할 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자는 상술된 바와 같이 근육내 이중 가닥을 형성할 수 있다. 따라서, ssPN 분자의 구조는 예를 들어 RNA 간섭에 통상 사용하는 siRNA 와 같이 분리한 2 개의 단일-가닥 RNA 의 어닐링을 통해 수득된 이중-가닥 RNA 의 구조와는 분명히 다른 구조이다.
본 발명의 ssPN 분자에서, 예를 들어 오직 상술된 영역 (Xc) 만이 뒤집어 접혀져 상술된 영역 (X) 와 이중 가닥을 형성할 수 있거나, 또는 또 다른 이중 가닥이 또 다른 영역에서 형성될 수 있다. 이하, 전자의 ssPN 분자, 즉 이중 가닥 형성이 1 군데에서 발생한 ssPN 분자를 "제 1 의 ssPN 분자" 로서 지칭하고, 후자의 ssPN 분자, 즉 이중 가닥 형성이 두 군데에서 발생한 ssPN 분자를 "제 2 ssPN 분자"로서 지칭한다. 상술된 제 1 및 제 2 ssPN 분자의 예는 하기에 제시한다. 그러나, 본 발명이 이들 예시된 예에 의해 제한되는 것이 아닌 점에 주목한다.
(1) 제 1 의 ssPN 분자
상술된 제 1 의 ssPN 분자는 예를 들어 상술된 영역 (X), 상술된 영역 (Xc), 및 상술된 링커 영역 (Lx) 를 포함하는 분자이다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자는 상술된 영역 (Xc), 상술된 링커 영역 (Lx), 및 상술된 영역 (X) 를 예를 들어 5' 측에서 3' 측으로 상술된 순서로 포함할 수 있거나, 또는 상술된 영역 (Xc), 상술된 링커 영역 (Lx), 및 상술된 영역 (X) 을 상기 순서대로 3' 측에서 5'측으로 포함할 수 있다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc) 은 상술된 영역 (X) 과 상보적이다. 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 영역 (X) 의 전영역 또는 일부 영역에 대해서 상보적인 서열을 갖는 것이 유일하게 필수적이다. 바람직하게는, 상술된 영역 (Xc) 는 영역 (X) 의 전 영역 또는 일부와 상보적인 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 상술된 영역 (Xc) 는 예를 들어 상술된 영역 (X) 의 전 영역 또는 일부와 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 영역 (Xc) 에서 1 개 또는 몇 개의 염기가 상기에 비(非)상보적일 수 있다. 바람직하게, 영역 (Xc) 는 상기에 완전히 상보적이다. 상술된 표현 "1 개 또는 몇 개의 염기"란, 예를 들어 1 내지 3 개의 염기, 바람직하게 1 개의 염기 또는 2 개의 염기를 의미한다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 상술된 발현 억제 서열은 상술된 바와 같은 상술된 영역 (Xc) 및 (X) 중 하나 이상에 포함된다. 상술된 제 1 의 ssPN 분자는 예를 들어 상술된 하나의 발현 억제 서열 또는 2 개 이상의 발현 억제 서열을 포함할 수 있다.
후자의 경우, 상술된 제 1 의 ssPN 분자는 예를 들어 하기를 포함할 수 있다: 동일 표적 유전자에 대한 2 개 이상의 동일한 발현 억제 서열; 동일 표적 유전자에 대한 2 개 이상의 상이한 발현 억제 서열; 또는 상이한 표적 유전자에 대한 2 개 이상의 상이한 발현 억제 서열. 상술된 제 1 의 ssPN 분자가 상술된 2 개 이상의 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 각 발현 억제 서열의 위치는 특별히 제한되지 않고, 이들은 상술된 영역 (X) 및 (Xc) 에서부터 선택된 하나의 영역 또는 상이한 영역에 있을 수 있다. 상술된 제 1 의 ssPN 분자가 상이한 표적 유전자에 대해 상술된 2 개 이상의 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 예를 들어 상술된 제 1 의 ssPN 분자는 상이한 표적 유전자 중 2 개 이상의 종의 발현을 억제할 수 있다.
도 1 은 상술된 제 1 의 ssPN 분자의 하나의 예를 예시하는 모식도를 나타낸다. 도 1A 는 상술된 ssPN 분자에서 각 영역의 순서의 한 예를 나타내는 모식도이다. 도 1B 는 상술된 ssPN 분자에서 이중 가닥이 형성되어 있는 상태를 나타내는 모식도이다. 도 1B 에서 나타낸 바와 같이, 상술된 ssPN 분자에서, 이중 가닥이 상술된 영역 (Xc) 및 (X) 사이에서 형성되어 상술된 Lx 영역이 그 길이에 따라 루프 구조를 가진다. 도 1 에 나타낸 모식도는 단지 상술된 각 영역이 서로 연결되는 순서 및 이중 가닥을 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것이며, 이들이 예를 들어 각 영역의 길이, 상술된 링커 영역 (Lx) 의 형상 등을 제한하는 것은 아니다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc) 및 (X) 각각에서 염기의 수는 특별히 제한되지 않는다. 각 영역의 길이의 예를 하기에 제공한다. 그러나, 본 발명이 결코 이에 제한된은 것이 아님에 주목해야 한다. 본 발명에서, "염기수"는 예를 들어 "길이"를 의미하고, 이것은 "염기장"으로서 지칭될 수도 있다. 본 발명에서, 예를 들어 염기수의 수치 범위는 예를 들면 그 범위에 속하는 양의 정수 모두를 개시한다. 예를 들어, "1 내지 4 개의 염기"의 기재는 "1, 2, 3, 및 4 개의 염기"의 모든 개시를 의미한다 (이하, 동일하게 적용됨).
상술된 영역 (Xc) 은 예를 들어 상술된 영역 (X) 의 전영역에 완전히 상보적일 수 있다. 이 경우, 이것은 예를 들어 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 영역 (X) 의 5' 말단에서 3' 말단의 전 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어진 것을 의미한다. 다시 말해, 이것은 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 영역 (X) 과 동일한 염기 길이를 갖고, 상술된 영역 (Xc) 에서 모든 염기가 상술된 영역 (X) 에서의 모든 염기와 상보적이라는 점을 의미한다.
더욱이, 상술된 영역 (Xc) 은 예를 들어 상술된 영역 (X) 의 일부와 완전히 상보적일 수 있다. 이 경우, 이는 예를 들어 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 영역 (X) 의 일부와 상보적인 염기 서열로 이루어진 것을 의미한다. 다시 말해, 이는 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 영역 (X) 의 염기장보다 1 염기 이상 더 짧은 염기 길이의 염기 서열로 이루어지고 상술된 영익 (Xc) 에서의 모든 염기가 상술된 영역 (X) 의 일부 내 모든 염기와 상보적인 것을 의미한다. 상술된 영역 (X) 의 일부는 바람직하게 예를 들어 상술된 영역 (X) 에 있어서 상술된 영역 (Xc) 의 말단 염기 (1 번째의 염기) 로부터 출발해 연속하는 염기들로 이루어진 염기 서열을 가진 영역이다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 와 상술된 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 사이의 관계는 예를 들어 하기 조건 (3) 또는 (5) 를 만족한다. 예를 들어, 후자의 경우, 구체적으로 하기 조건 (11) 이 만족된다:
X > Xc … (3)
X - Xc = 1 내지 10, 바람직하게 1, 2, 또는 3,
더욱 바람직하게 1 또는 2 … (11)
X = Xc … (5)
상술된 영역 (X) 및/또는 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상술된 영역은 예를 들어 상술된 발현 억제 서열로만 이루어진 영역 또는 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 상술된 발현 억제 서열에서 염기 수는 예를 들어, 19 내지 30, 바람직하게 19, 20, 또는 21 이다. 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 영역(들)에서, 예를 들어 상술된 발현 억제 서열은 추가로 5' 측 및/또는 3'측 상 추가의 서열을 지닐 수 있다. 상술된 추가 서열에서 염기수는 예를 들어 1 내지 31, 바람직하게 1 내지 21, 더욱 바람직하게 1 내지 11 이다.
상술된 영역 (X) 에서 염기수는 특별히 제한되지 않는다. 상술된 영역 (X) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 상술된 영역 (X) 에서 염기수의 하한은 예를 들어 19 이고, 그 상한은 예를 들어 50, 바람직하게 30, 더욱 바람직하게 25 이다. 구체적으로 상술된 영역 (X) 에서 염기의 개수는 예를 들어 19 내지 50, 바람직하게 19 내지 30, 및 더욱 바람직하게 19 내지 25 이다.
상술된 영역 (Xc) 에서 염기수는 특별히 한정되지 않는다. 상술된 영역 (Xc) 에서 염기수의 하한은 예를 들어 19, 바람직하게 20, 및 더욱 바람직하게 21 이고, 그의 상한은 예를 들어 50, 더욱 바람직하게 40, 및 보다 더욱 바람직하게 30 이다.
상술된 ssPN 분자에서, 상술된 링커 영역 (Lx) 의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 상술된 링커 영역 (Lx) 의 길이는 예를 들어 상술된 영역 (X) 및 (Xc) 이 이중 가닥을 형성가능한 길이인 것이 바람직하다. 상술된 링커 영역 (Lx) 이 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들) 이외에 상술된 뉴클레오티드 잔기(들)을 포함하는 경우, 상술된 링커 영역 (Lx) 에서 염기수의 하한은 예를 들어 1, 바람직하게 2, 더욱 바람직하게 3 이고, 그의 상한은 예를 들어 100, 바람직하게 80, 더욱 바람직하게 50 이다.
상술된 제 1 의 ssPN 분자의 전장은 특별히 한정되지 않는다. 상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 염기의 총수 (전장 ssPN 분자에서의 염기수) 의 하한은 예를 들어 38, 바람직하게 42, 더욱 바람직하게 50, 보다 더욱 바람직하게 51, 및 특히 바람직하게 52 이고, 이의 상한은 예를 들어, 300, 바람직하게 200, 더욱 바람직하게 150, 보다 더욱 바람직하게 100, 및 특히 바람직하게 80 이다. 상술된 제 1 의 ssPN 분자에서, 상술된 링커 영역 (Lx) 을 제외하고는 염기의 총수의 하한은 예를 들어 38, 바람직하게 42, 더욱 바람직하게 50, 보다 더욱 바람직하게 51, 및 특히 바람직하게 52 이고, 이의 하한은 예를 들어 300, 바람직하게 200, 더욱 바람직하게 150, 보다 더욱 바람직하게 100, 및 특히 바람직하게 80 이다.
(2) 제 2 의 ssPN 분자
상술된 제 2 의 ssPN 분자는 예를 들어 상술된 영역 (X), 상술된 링커 영역 (Lx), 및 상술된 영역 (Xc) 에 더해 상술된 영역 (Y) 에 상보적인 영역 (Y) 및 영역 (Yc) 를 추가로 포함하는 분자이다. 상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 내부 영역 (Z) 는 서로 연결된 상술된 영역 (X) 및 상술된 영역 (Y) 으로 이루어진다. 상술된 제 1 의 ssPN 분자와 관련된 기재는 달리 언급되지 않는 한 상술된 제 2 의 ssPN 분자에도 적용된다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자는 예를 들어 상술된 영역 (Xc), 상술된 링커 영역 (Lx), 상술된 영역 (X), 상술된 영역 (Y), 및 상술된 영역 (Yc) 를 5' 측에서 3' 측으로 상기 순서대로 포함할 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Xc) 는 또한 "5' 측 영역 (Xc)" 로서 지칭되고; 상술된 내부 영역 (Z) 중의 상술된 영역 (X) 는 또한 "내부 5' 측 영역 (X)"로서 지칭되고; 상술된 내부 영역 (Z) 중의 상술된 영역 (Y) 는 "내부 3' 영역 (Y)" 로서 지칭되고; 및 상술된 영역 (Yc) 은 "3' 측 영역 (Yc)" 로서 지칭된다. 대안적으로, 상술된 제 2 의 ssPN 분자는 예를 들어 상술된 영역 (Xc), 상술된 링커 영역 (Lx), 상술된 영역 (X), 상술된 영역 (Y), 및 상술된 영역 (Yc) 를 상기 순서로 3'측에서 5'측 으로 포함할 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Xc) 는 또한 "3' 측 영역 (Xc)" 으로서 지칭되고; 상술된 내부 영역 (Z) 중 상술된 영역 (X) 는 "내부 3'측 영역 (X)" 로서 지칭되고; 상술된 내부 영역 (Z) 중의 상술된 영역 (Y) 는 또한 "내부 5' 영역 (Y)" 로서 지칭되고; 및 상술된 영역 (Yc) 는 또한 "5' 측 영역 (Yc)" 로서 지칭된다.
상기 기재된 바와 같이, 상술된 내부 영역 (Z) 는 예를 들어 상술된 영역 (X) 및 (Y) 이 서로 연결되어 있다. 예를 들어, 상술된 영역 (X) 및 (Y) 는 예를 들어 직접적으로 서로 연결되어 그 사이에 개재 서열을 갖지 않는다. 상술된 내부 영역 (Z) 는, "서로 연결되어 있는 상술된 영역 (X) 및 (Y) 로 이루어진" 으로서 정의되는 것이며, 이는 단지 상술된 영역 (Xc) 및 (Yc) 사이의 서열 관계를 나타내기 위한 것이다. 상기 정의는 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서 상술된 ssPN 분자, 상술된 영역 (X) 및 (Y) 의 사용에 있어서, 별개의 독립적인 영역인 것을 한정하는 것은 아니다. 다시 말해, 예를 들어 상술된 내부 영역 (Z) 이, 상술된 발현 억제 서열을 지닐 경우, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서, 상술된 영역 (X) 과 상술된 영역 (Y) 에 걸쳐, 상술된 발현 억제 서열이 배치될 수 있다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc) 은 상술된 영역 (X) 과 상보적이다. 상술된 영역 (Xc) 은, 상술된 영역 (X) 의 전영역 또는 그 부분 영역에 대하여 상보적인 서열을 갖고 있기만 하면 된다. 바람직하게는, 상술된 영역 (Xc) 는 상술된 영역 (X) 의 전영역 또는 그 부분 영역에 상보적인 서열을 포함하거나 또는 이루어진다. 상술된 영역 (Xc) 는 예를 들어 상술된 영역 (X) 의 전영역 또는 일부에 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 상술된 영역 (Xc) 에서 1 또는 몇몇의 염기가 이에 비상보적일 수 있다. 바람직하게, 상술된 영역 (Xc) 는 이에 완전히 상보적이다. 상술된 표현 "1 또는 몇몇의 염기"란, 예를 들어 1 내지 3 개의 염기, 바람직하게 1 개의 염기 또는 2 개의 염기를 의미한다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Yc) 는 상술된 영역 (Y) 과 상보적이다. 상술된 영역 (Yc) 는 상술된 영역 (Y) 의 전 영역 또는 일부와 상보적인 서열을 갖기만 하면 된다. 바람직하게, 상술된 영역 (Yc) 는 상술된 영역 (Y) 의 전 영역 또는 부분과 상보적인 서열을 포함하거나 이루어진다. 상술된 영역 (Yc) 는 예를 들어 상술된 영역 (Y) 의 전 영역 또는 일부와 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 상술된 영역 (Yc) 에서 1 또는 몇몇의 염기가 이에 비상보적일 수 있다. 바람직하게, 상술된 영역 (Yc) 은 이에 완전히 상보적이다. 상술된 표현 "1 또는 몇몇의 염기"란, 예를 들어 1 내지 3 개의 염기, 바람직하게 1 또는 2 개의 염기를 의미한다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (X) 및 (Y) 로 이루어진 상술된 내부 영역 (Z) 및 상술된 영역 (Xc) 중 하나 이상은 예를 들어 상술된 발현 억제 서열을 포함한다. 나아가, 상술된 영역 (Yc) 은 또한 상술된 발현 억제 서열을 포함할 수 있다. 상술된 내부 영역 (Z) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 예를 들어 상술된 영역 (X) 및 (Y) 중 하나는 상술된 발현 억제 서열을 포함할 수 있거나, 또는 상술된 발현 억제 서열이 상술된 영역 (X) 및 (Y) 에 걸쳐 포함될 수 있다. 상술된 제 2 의 ssPN 분자는 예를 들어 상기 언급된 하나의 발현 억제 서열 또는 상기 언급된 2 개 이상의 발현 억제 서열을 포함할 수 있다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자가 상술된 2 개 이상의 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 각 발현 억제 서열의 위치는 특별히 한정되지 않는다. 이들은 상술된 내부 영역 (Z) 및 상술된 영역 (Xc) 중 하나에 있을 수 있거나, 또는 상술된 내부 영역 (Z) 및 상술된 영역 (Xc) 중 하나, 및 이들 영역 이외의 임의의 영역 내 있을 수 있다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 예를 들어, 상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 서로 직접 연결될 수 있거나 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 전자의 경우, 예를 들어 상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 포스포디에스테르 결합 등에 의해 직접 연결될 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 상술된 제 2 의 ssPN 분자는 상술된 영역 (Yc) 과 (Y) 사이에 링커 영역 (Ly) 를 갖고 상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 이 상술된 링커 영역 (Ly) 을 통해 연결되도록 배치된다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자가 상술된 링커 영역 (Ly) 을 갖는 경우, 예를 들어, 상술된 링커 영역 (Ly) 은 상술된 뉴클레오티드 잔기(들) 로 이루어진 링커, 또는 상술된 바와 같은 피페리딘 골격 및 피롤리딘 골격 중 하나 이상을 포함하는 비뉴클레오티드 구조를 갖는 링커일 수 있다. 후자의 경우, 상술된 링커 영역 (Ly) 는 상술된 식 (I) 로 나타낼 수 있고, 예를 들어 상술된 링커 영역 (Lx) 에 있어서의 상술된 식 (I) 에 관련된 모든 기재가 상술된 링커 영역 (Ly) 에 모두 적용된다. 상술된 링커 영역 (Lx) 및 상술된 링커 영역 (Ly) 모두가 상술된 식 (I) 로 나타내어지는 경우, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 상술된 링커 영역 (Ly) 에서 A, X1, X2, Y1, Y2, L1, L2, R1 및 R2 는 각각 상동 또는 상이할 수 있다.
상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 예를 들어, -OR1- 또는 -OR2- 를 통해 상술된 링커 영역 (Ly) 에 각각 연결된다. 상술된 링커 영역 (Ly) 에서, R1 및 R2 는 상술된 링커 영역 (Lx) 에서와 같이 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 상술된 영역 (Xc) 및 (X) 와, 상술된 -OR1- 및 -OR2- 와의 조합, 및 상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 와 상술된 -OR1- 및 -OR2- 의 조합은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어 하기 조건 중 임의의 것일 수 있다:
조건 (1):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 가 상술된 식 (I) 의 구조에 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 결합되고; 및
상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 가 상술된 식 (I) 의 구조에 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 결합됨.
조건 (2):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 가 각각 -OR2- 및 -OR1- 를 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결되고; 및
상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결됨.
조건 (3):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 가 각각 -OR1- 및 -OR2- 를 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결되고; 및
상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결됨.
조건 (4):
상술된 영역 (Xc) 및 (X) 는 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결되고; 및
상술된 영역 (Yc) 및 (Y) 는 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 상술된 식 (I) 의 구조에 연결됨.
도 2 는 상술된 링커 영역 (Ly) 를 갖는 상술된 제 2 의 ssPN 분자의 예를 예시하는 모식도이다. 도 2A 는 하나의 예로서, 상술된 ssPN 분자에 대해서, 5'측에서 3'측을 향하고, 각 영역의 순서의 개략을 나타내는 모식도이다. 도 2B 는 상술된 ssPN 분자에 있어서 이중 가닥이 형성된 상태를 나타내는 모식도다. 도 2B 에서 나타낸 바와 같이, 상술된 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc) 과 상술된 영역 (X) 사이, 상술된 영역 (Y) 과 상술된 영역 (Yc) 의 사이에서, 이중 가닥이 형성되어, 상술된 Lx 영역 및 상술된 Ly 영역이, 그 길이에 따라서 루프 구조를 취한다. 도 2 에 나타낸 모식도는 어디까지나, 각 영역의 연결 순번 및 이중 가닥을 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타낸 것이며, 예를 들면, 각 영역의 길이, 링커 영역의 형상 등이 이것에 제한되지는 않는다. 또한, 도 2 에서, 5' 측 상 상술된 영역 (Xc) 가 존재하나, 상술된 (Xc) 의 위치는 이것에 제한되지 않고, 상술된 영역 (Xc) 는 3' 측에 위치할 수도 있다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (Xc), (X), (Y), 및 (Yc) 각각에서의 염기수는 특별히 제한되지 않는다. 각 영역의 길이의 예는 하기에 제공된다. 그러나, 본 발명이 결코 이에 제한되는 것은 아님에 주목한다.
상술된 영역 (Xc) 은, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 영역 (X) 의 전영역에 상보적일 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Xc) 은, 예를 들면, 상술된 영역 (X) 과 같은 염기장이며, 상술된 영역 (X) 의 전영역과 상보적인 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상술된 영역 (Xc) 이 보다 바람직하게는, 상술된 영역 (X) 과 같은 염기장이며, 또한, 상술된 영역 (Xc) 의 모든 염기가, 상술된 영역 (X) 의 모든 염기와 상보적인 것, 예를 들면, 영역 (Xc) 가 완전히 영역 (X) 와 상보적인 것이 더욱 바람직하다. 그러나, 영역 (Xc) 의 입체구조가 이에 제한되지는 않고, 영역 (Xc) 에서 1 개 또는 몇 개의 염기가 예를 들어 상술된 바와 같이 영역 (X) 의 상응하는 염기와 비상보적일 수 있다는 점에 주목한다.
또, 상술된 영역 (Xc) 은, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 영역 (X) 의 부분 영역에 상보적일 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Xc) 은, 예를 들면, 상술된 영역 (X) 의 부분 영역과 같은 염기장이며, 다시 말해, 상술된 영역 (X) 보다, 1 염기 이상 짧은 염기장의 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상술된 영역 (Xc) 은, 보다 바람직하게는, 상술된 영역 (X) 의 상술된 부분 영역과 같은 염기장이며, 또한, 상술된 영역 (Xc) 의 모든 염기가, 상술된 영역 (X) 의 상술된 부분 영역의 모든 염기와 상보적이고, 즉 예를 들면, 영역 (Xc) 는 영역 (X) 의 일부와 완전히 상보적이다. 상술된 영역 (X) 의 부분 영역은, 예를 들면, 상술된 영역 (X) 에 있어서의, 상술된 영역 (Xc) 측의 말단의 염기 (1 번째의 염기)로부터 출발해 연속하는 염기로 이루어진 염기 서열을 갖는 영역인 것이 바람직하다.
상기 기재된 바와 같이, 상술된 영역 (Yc) 은, 예를 들면, 상술된 영역 (Y) 의 전영역에 상보적일 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Yc) 은, 예를 들면, 상술된 영역 (Y) 과 같은 염기장이며, 상술된 영역 (Y) 의 전영역으로 상보적인 염기서열로 이루어진 것이 바람직하다. 상술된 영역 (Yc) 은, 보다 바람직하게는, 상술된 영역 (Y) 과 같은 염기장이며, 또한, 상술된 영역 (Yc) 의 모든 염기가, 상술된 영역 (Y) 의 모든 염기와 상보적이고, 즉 예를 들면, 영역 (Yc) 가 영역 (Y) 와 완전히 상보적이다. 그러나, 영역 (Yc) 의 입체구조가 이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 영역 (Yc) 에서 1 개 또는 몇몇의 염기가 영역 (Y) 에서 상응하는 염기와 비상보적일 수 있다.
더욱이, 상술된 영역 (Yc) 은, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 영역 (Y)의 부분 영역에 상보적일 수 있다. 이 경우, 상술된 영역 (Yc) 은, 예를 들면, 상술된 영역 (Y) 의 부분 영역과 같은 염기장이며, 다시 말해, 상술된 영역 (Yc) 가 상술된 영역 (Y) 보다도, 1 염기 이상 짧은 염기장의 염기서열로 이루진 것이 바람직하다. 상술된 영역 (Yc) 은, 보다 바람직하게는, 상술된 영역 (Y)의 상술된 부분 영역과 같은 염기장이며, 또한, 상술된 영역 (Yc) 의 모든 염기가, 상술된 영역 (Y) 의 상술된 부분 영역의 모든 염기와 상보적이고, 즉, 예를 들면, 영역 (Yc) 는 영역 (Y) 의 일부와 완전히 상보적이다. 상술된 영역 (Y) 의 부분 영역은, 예를 들면, 상술된 영역 (Y)에 있어서의, 상술된 영역 (Yc) 측의 말단의 염기 (1 번째의 염기) 로부터 출발하는 연속하는 염기로 이루어진 염기 서열을 갖는 영역인 것이 바람직하다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수 (Z) 과, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 및 상술된 영역 (Y) 의 염기수 (Y)와의 관계, 상술된 내부 영역 (Z)의 염기수 (Z) 와, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 및 상술된 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 과의 관계는, 예를 들면, 하기식 (1) 및 (2) 의 조건을 만족시킨다.
Z = X + Y … (1)
Z ≥Xc + Yc … (2)
상술된 제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 과 상술된 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 의 관계는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 하기식의 임의의 조건을 충족시킨다:
X = Y … (19)
X < Y … (20)
X > Y … (21).
제 2 의 ssPN 분자에서, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X), 상술된 영역 (Xc)의 염기수 (Xc), 상술된 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 및 상술된 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 의 관계는, 예를 들면, 하기 (a) 내지 (d) 의 임의의 것을 만족한다:
(a) 하기 표현 (3) 및 (4) 의 조건이 충족된다.
X > Xc … (3)
Y = Yc … (4)
(b) 하기 표현 (5) 및 (6) 의 조건이 충족된다.
X = Xc … (5)
Y > Yc … (6)
(c) 하기 표현 (7) 및 (8) 의 조건이 충족된다.
X > Xc … (7)
Y > Yc … (8)
(d) 하기 표현 (9) 및 (10) 의 조건이 충족된다.
X = Xc … (9)
Y = Yc … (10)
상술된 (a) 내지 (d) 에 있어서, 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 과 상술된 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 의 차이, 상술된 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 과 상술된 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 의 차이는, 예를 들면, 하기 조건을 충족시키는 것이 바람직하다.
(a) 하기 표현 (11) 및 (12) 의 조건이 충족된다.
X - Xc = 1 내지 10, 바람직하게 1, 2, 3, 또는 4,
더욱 바람직하게 1, 2, 또는 3
… (11)
Y - Yc = 0 … (12)
(b) 하기 표현 (13) 및 (14) 의 조건이 충족된다.
X - Xc = 0 … (13)
Y - Yc = 1 내지 10, 바람직하게 1, 2, 3, 또는 4,
더욱 바람직하게 1, 2, 또는 3 … (14)
(c) 하기 표현 (15) 및 (16) 의 조건이 충족된다.
X - Xc = 1 내지 10, 바람직하게, 1, 2, 또는 3,
더욱 바람직하게 1 또는 2 … (15)
Y - Yc = 1 내지 10, 바람직하게, 1, 2, 또는 3,
더욱 바람직하게 1 또는 2 … (16)
(d) 하기 표현 (17) 및 (18) 의 조건이 충족된다.
X - Xc = 0 … (17)
Y - Yc = 0 … (18)
상술된 (a) 내지 (d) 의 제2의 ssPN 분자에 대해서, 각각의 구조의 예를, 도3 의 모식도에 나타낸다. 도 3 은, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 상술된 링커 영역 (Ly) 을 포함하는 ssPN 분자를 나타낸다. 도 3A 은, 상술된 (a) 조건을 만족하는 ssPN 분자의 예를; 도 3B 은 상술된 (b) 의 조건을 만족하는 ssPN 분자의 예를; 도 3 C 은, 상술된 (c) 의 조건을 만족하는 ssPN 분자의 예를; 도 3D 은, 상술된 (d) 의 조건을 만족하는 ssPN 분자의 예를 나타낸다. 도 3 에서, 점선은 자가-어닐링에 의해 이중 가닥을 형성하고 있는 상태를 지시한다. 도 3 의 ssPN 분자 모두는 상술된 영역 (X) 의 염기수 (X) 와 상술된 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 의 관계가, 상술된 식 (20) 의 "X < Y" 을 만족하는 예에 관한 것이다. 그러나, 상기 관계가 이에 제한되는 것이 아니라는 점에 주목해야 하고, 상술한 바와 같이, 상술된 식 (19) 의 "X=Y" 또는 상술된 식 (21) 의 "X>Y" 도 만족될 수 있다. 또한, 도 3 은 어디까지나 상술된 영역 (X) 과 상술된 영역 (Xc) 과의 관계 및 상술된 영역 (Y) 과 상술된 영역 (Yc) 과의 관계를 나타내는 모식도로, 이는 예를 들면, 각 영역의 길이 및 형상, 링커 영역 (Ly) 의 유무 등을 제한하지 않는다.
상술된 (a) 내지 (c) 의 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 영역 (Xc) 과 상술된 영역 (X) 및 영역 (Yc) 과 (Y) 이, 각각 이중 가닥을 형성함으로써, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서, 상술된 영역 (Xc) 및 (Yc) 의 어느 것과도 나란히 배열되지 않은 염기를 갖는 구조이다. 이들은 또한 이중 가닥을 형성하지 않는 염기를 갖는 구조라고도 할 수 있다. 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서, 나란히 배열되지 않는 상술된 염기는 (또한, 이중 가닥을 형성하지 않는 염기라고도 지칭됨)을, 이하, "쌍이 아닌 (unpaired) 염기"라고 한다. 도 3 에서, 상술된 쌍이 아닌 염기의 영역을 "F" 로써 나타낸다. 상술된 영역 (F) 의 염기수는, 특별히 제한되지 않는다. 상술된 영역 (F) 의 염기수 (F) 은, 예를 들면, 상술된 (a)의 ssPN 분자의 경우, "X-Xc"의 염기수이며; 상술된 (b)의 ssPN 분자의 경우, "Y-Yc"의 염기수이며, 상술된 (c)의 ssPN 분자의 경우, "X-Xc"의 염기수와 "Y-Yc"의 염기수와의 합계수이다.
다른 한편, 상술된 조건 (d) 의 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 내부 영역 (Z) 의 전영역이, 상술된 영역 (Xc) 및 (Yc) 과 나란히 배열된 구조이며, 다시 말해 상술된 내부 영역 (Z) 의 전영역이 이중 가닥을 형성하는 구조라고도 할 수 있다. 상술된 조건 (d) 를 충족하는 ssPN 분자에 있어서, 상술된 영역 (Xc) 의 5' 말단과 상술된 영역 (Yc) 의 3'말단은 미연결이다.
상술된 영역 (Xc), 상술된 영역 (Yc), 및 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 상술된 쌍이 아닌 염기 (F) 의 염기수의 합계는, 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수가 된다. 이것 때문에, 상술된 영역 (Xc) 및 상술된 영역 (Yc) 의 길이는, 예를 들면, 상술된 내부 영역 (Z) 의 길이, 상술된 쌍이 아닌 염기의 수 및 쌍이 아닌 염기의 위치에 따라, 적당히 결정될 수 있다.
상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수는, 예를 들면, 19 염기 이상이다. 상술된 염기수의 하한은, 예를 들면, 19 염기이며, 바람직하게는 20 염기이며, 보다 바람직하게는 21 염기다. 상술된 염기수의 상한은, 예를 들면, 50 염기이며, 바람직하게는 40 염기이며, 보다 바람직하게는 30 염기다. 상술된 내부 영역 (Z)의 염기수의 구체예는, 예를 들면, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 염기이다. 상술된 내부 영역 (Z) 이, 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 경우, 예를 들면, 이 조건이 바람직하다.
상술된 내부 영역 (Z) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 내부 영역 (Z) 은, 예를 들면, 상술된 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역 또는 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 상술된 발현 억제 서열의 염기수는, 예를 들면, 19~30 염기이며, 바람직하게는, 19, 20 또는 21 염기다. 상술된 내부 영역 (Z) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 지닐 수 있다. 상술된 부가 서열의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 31 염기이며, 바람직하게는, 1 ~ 21 염기이며, 보다 바람직하게는, 1 ~ 11 염기이며, 더욱 바람직하게는, 1 ~ 7 염기이다.
상술된 영역 (Xc) 의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 29 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 7 염기이며, 보다 바람직하게는 1 ~ 4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기 또는 3 염기이다. 상술된 내부 영역 (Z) 또는 상술된 영역 (Yc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 예를 들면, 상기 기술된 바와 같은 염기수가 바람직하다. 구체예로서, 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수가, 19 ~ 30 염기 (예를 들면, 19 염기) 의 경우, 상술된 영역 (Xc)의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 7 염기이며, 보다 바람직하게는 1 ~ 4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기 또는 3 염기이다.
상술된 영역 (Xc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 영역 (Xc) 은, 예를 들면, 상술된 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역 또는 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 상술된 발현 억제 서열의 길이는, 예를 들면, 전술한 대로다. 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 지닐 수 있다. 상술된 부가 서열의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는, 1 ~ 7 염기이다.
상술된 영역 (Yc) 의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 29 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 7 염기이며, 보다 바람직하게는 1 ~ 4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기 또는 3 염기이다. 상술된 내부 영역 (Z) 또는 상술된 영역 (Xc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 염기수가 바람직하다. 구체예로서, 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수가, 19 ~ 30 염기 (예를 들면, 19 염기)의 경우, 상술된 영역 (Yc) 의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는 1 ~ 7 염기이며, 보다 바람직하게는 1 염기, 2 염기, 3 염기 또는 4 염기이며, 더욱 바람직하게는 1 염기, 2 염기 또는 3 염기이다.
상술된 영역 (Yc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 영역 (Yc) 은, 예를 들면, 상술된 발현 억제 서열만으로 구성되는 영역 또는 상술된 발현 억제 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 상술된 발현 억제 서열의 길이는, 예를 들면, 전술한 대로다. 상술된 영역 (Yc) 이 상술된 발현 억제 서열을 포함할 경우, 상술된 발현 억제 서열의 5'측 및/또는 3'측에, 추가로 부가 서열을 가질 수 있다. 상술된 부가 서열의 염기수는, 예를 들면, 1 ~ 11 염기이며, 바람직하게는, 1 ~ 7 염기이다.
상술한 바와 같이, 상술된 내부 영역 (Z), 상술된 영역 (Xc) 및 상술된 영역 (Yc) 의 염기수간의 관계는, 예를 들면, 상술된 식 (2) 의 "Z≥Xc+Yc" 로써 나타낼 수 있다. 구체예로서, "Xc+Yc"의 염기수는, 예를 들면, 상술된 내부 영역 (Z)의 염기수와 같거나, 또는 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기수 보다 작다. 후자의 경우, "Z-(Xc+Yc)" 은, 예를 들면, 1 ~ 10, 바람직하게는 1 ~ 4, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3 이다. 상술된 "Z-(Xc+Yc)"은, 예를 들면, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 쌍이 아닌 염기 영역 (F) 의 염기수 (F) 에 상당한다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 상술된 링커 영역 (Ly) 의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 상술된 링커 영역 (Lx) 은, 전술한 대로다. 상술된 링커 영역 (Ly) 의 구성 단위가 염기(들)를 포함할 경우, 상술된 링커 영역 (Ly) 의 염기수는, 그 하한이, 예를 들면, 1 염기이며, 바람직하게는 2 염기이며, 보다 바람직하게는 3 염기이며, 그 상한이, 예를 들면, 100 염기이며, 바람직하게는 80 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이다. 상술된 각링커 영역의 염기수는, 구체예로서, 예를 들면, 1 ~ 50 염기, 1 ~ 30 염기, 1 ~ 20 염기, 1 ~ 10 염기, 1 ~ 7 염기, 1 ~ 4 염기 등을 예시할 수 있지만, 이것으로 제한되지 않는다.
상술된 링커 영역 (Ly) 은, 예를 들면, 상술된 링커 영역 (Lx) 과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다.
상술된 제 2 의 ssPN 분자의 전장은, 특별히 제한되지 않는다. 상술된 제 2 의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 염기수의 합계 (전장의 염기수) 는, 하한이, 예를 들면, 38 염기이며, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이며, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이며, 그 상한은, 예를 들면, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이며, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이며, 특히 바람직하게는 80 염기이다. 상술된 제 2 의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 링커 영역 (Lx) 및 링커 영역 (Ly) 을 제외하는 염기수의 합계는, 그 하한이, 예를 들면, 38 염기이며, 바람직하게는 42 염기이며, 보다 바람직하게는 50 염기이며, 더욱 바람직하게는 51 염기이며, 특히 바람직하게는 52 염기이며, 그 상한은, 예를 들면, 300 염기이며, 바람직하게는 200 염기이며, 보다 바람직하게는 150 염기이며, 더욱 바람직하게는 100 염기이며, 특히 바람직하게는 80 염기이다.
본 발명의 ssPN 분자는, 상술한 바와 같이, 상술된 링커 영역 (Lx) 은 상술된 비뉴클레오티드 구조를 지니고 있는 것만이 오로지 필수적이고, 그 밖의 구성 단위는 특별히 제한되지 않는다. 상술된 구성 단위는, 예를 들면, 뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상술된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 잔기 및 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 상술된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 수식되지 않고 있는 것 (비수식된 뉴클레오티드 잔기) 및 수식된 것 (수식된 뉴클레오티드 잔기) 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것에 의해, 뉴클레아제의 내성을 향상시킬 수 있고, ssPN 의 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 뉴클레오티드 잔기 이외에, 추가로, 비뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다.
상술된 영역 (Xc), 상술된 영역 (X), 상술된 영역 (Y) 및 상술된 영역 (Yc) 각각의 구성 단위로서, 상술된 뉴클레오티드 잔기가 바람직하다. 상술된 각 영역은 예를 들면, 하기 잔기 (1) ~ (3) 로 구성된다:
(1) 비수식된 클레오티드 잔기(들)
(2) 수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(3) 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들).
상술된 링커 영역 (Lx) 은, 예를 들면, 상술된 비뉴클레오티드 잔기만으로 구성될 수 있거나, 또는 상술된 비뉴클레오티드 잔기와 상술된 뉴클레오티드 잔기로 구성될 수 있다. 상술된 링커 영역 (Lx) 은, 예를 들면, 하기 (4) ~ (7) 의 잔기 중 임이의 것으로 구성된다:
(4) 비뉴클레오티드 잔기(들)
(5) 비뉴클레오티드 잔기(들) 및 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(6) 비뉴클레오티드 잔기(들) 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(7) 비뉴클레오티드 잔기(들), 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들).
상술된 링커 영역 (Ly) 의 구성 단위는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 상술된 뉴클레오티드 잔기 및 상술된 비뉴클레오티드 잔기 등을 들 수 있다. 각각의 상술된 링커 영역은, 예를 들면, 상술된 뉴클레오티드 잔기(들)만으로 구성될 수 있고, 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)만으로 구성될 수 있거나, 또는 상술된 뉴클레오티드 잔기(들)과 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들) 모두로 구성될 수 있다. 상술된 링커 영역 각각은, 예를 들면, 하기 (1)~ (7)의 잔기 중 임의의 것으로 구성된다:
(1) 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(2) 수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(3) 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들) 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(4) 비뉴클레오티드 잔기(들)
(5) 비뉴클레오티드 잔기(들) 및 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(6) 비뉴클레오티드 잔기(들) 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들)
(7) 비뉴클레오티드 잔기(들), 비수식된 뉴클레오티드 잔기(들), 및 수식된 뉴클레오티드 잔기(들).
본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 링커 영역 (Lx) 을 제외하고, 상술된 뉴클레오티드 잔기만으로 구성되는 분자; 및 상술된 뉴클레오티드 잔기 이외에 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 뉴클레오티드 잔기는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 비수식뉴클레오티드 잔기만일 수도 있고; 상술된 수식뉴클레오티드 잔기만일 수도 있거나; 또는 상술된 비수식뉴클레오티드 잔기(들) 및 상술된 수식뉴클레오티드 잔기(들) 양자 모두일 수도 있다. 상술된 ssPN 분자가, 상술된 비수식뉴클레오티드 잔기(들) 및 상술된 수식뉴클레오티드 잔기(들)를 포함할 경우, 상술된 수식뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 또는 몇 개"이며, 구체적으로는, 예를 들면, 1 ~ 5 개, 바람직하게는 1 ~ 4 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개, 가장 바람직하게는 1 또는 2 개이다. 본 발명의 ssPN 분자가, 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)를 포함할 경우, 상술된 비뉴클레오티드 잔기의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 또는 몇 개"이며, 구체적으로는, 예를 들면, 1 또는 2 개이다.
본 발명의 ssPN 분자에 있어서, 상술된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 잔기가 바람직하다. 이 경우, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, "ssRNA분자" 또는 "P-ssRNA 분자" 로도 지칭된다. 상술된 ssRNA 분자는, 예를 들면, 상술된 링커 영역 (Lx) 을 제외하고, 상술된 리보뉴클레오티드 잔기만으로 구성되는 분자; 및 상술된 리보뉴클레오티드 잔기 이외에 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)를 포함하는 분자 등을 들 수 있다. 상술된 ssRNA 분자에 있어서, 상술된 리보뉴클레오티드 잔기는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 오로지 상술된 비수식된 리보뉴클레오티드 잔기만; 상술된 수식된 리보뉴클레오티드 잔기만; 또는 상술된 비수식된 리보뉴클레오티드 잔기(들) 및 상술된 수식된 리보뉴클레오티드 잔기(들) 양자 모두를 포함할 수 있다.
상술된 ssRNA 분자가, 예를 들면, 상술된 비수식된 리보뉴클레오티드 잔기 이외에 상술된 수식된 리보뉴클레오티드 잔기(들)를 포함할 경우, 상술된 수식된 리보뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 또는 몇 개"이며, 구체적으로는, 예를 들면, 1 ~ 5 개, 바람직하게는 1 ~ 4 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개, 가장 바람직하게는 1 또는 2 개이다. 상술된 비수식된 리보뉴클레오티드 잔기와는 대조적인 상술된 수식된 리보뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 리보오스 잔기가 데옥시리보스 잔기로 치환되어 수득된 상술된 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 등일 수 있다. 상술된 ssRNA 분자가, 예를 들면, 상술된 비수식된 리보뉴클레오티드 잔기 이외에 상술된 데옥시리보뉴클레오티드 잔기(들)를 포함할 경우, 상술된 데옥시리보뉴클레오티드 잔기의 개수는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, "1 또는 몇 개"이며, 구체적으로는, 예를 들면, 1 ~ 5 개, 바람직하게는 1 ~ 4 개, 보다 바람직하게는 1 ~ 3 개, 가장 바람직하게는 1 또는 2 개이다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 표지 물질을 포함하고, 상술된 표지 물질로 표지화될 수 있다. 상술된 표지 물질은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광물질, 색소, 동위체 (isotope) 등을 들 수 있다. 상술된 표지 물질은, 예를 들면 하기를 포함한다: 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 색소, 및 Cy5 색소 등의 형광단. 상술된 색소의 예에는 Alexa 색소, 예컨대 Alexa 488 을 포함한다. 상술된 동위체는, 예를 들면, 안정한 동위체 및 방사성동위체를 들 수 있다. 이들 중, 바람직하게는 안정한 동위체이다. 상술된 안정한 동위체는, 예를 들면, 피폭의 위험성이 적고, 전용의 시설도 쓰지 않는다. 따라서, 안정한 동위체는 취급성이 뛰어나고, 가격도 저감할 수 있다. 또한, 상술된 안정한 동위체는, 예를 들면, 이로 표지된 화합물의 물성 변화가 없고, 그리하여 트레이서 (tracer) 로서의 성질에 있어서 뛰어나다. 상술된 안정한 동위체는, 특별히 제한되지 않고, 그의 예에는 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, 33S, 34S, 및 36S 이 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 비뉴클레오티드 구조에 상술된 표지 물질을 도입하는 것이 바람직하고, 상술된 링커 영역 (Lx)의 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)에 상술된 표지 물질을 도입하는 것이 바람직하다. 상술된 비뉴클레오티드 잔기(들)에의 표지 물질의 도입은, 예를 들면, 용이하고 저렴한 비용으로 실시될 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 상술한 바와 같이, 상술된 표적 유전자의 발현을 억제를 할 수 있다. 이것 때문에, 본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 유전자가 원인이 되는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다. 상술된 ssPN 분자가 상술된 발현 억제 서열로서, 상술된 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함하는 경우, 예를 들면, 상술된 표적 유전자의 발현 억제에 의해, 상술된 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서, "치료"는, 예를 들면, 상술된 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선의 의미를 포함하고, 예를 들어 이것은 이들 중 임의의 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자의 사용 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상술된 표적 유전자를 지닌 대상에, 상술된 ssPN 분자를 투여할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자가 투여되는 상술된 투여 대상은, 예를 들면, 세포, 조직 또는 기관 등을 포함할 수 있다. 상술된 투여 대상은, 예를 들면, 인간, 인간을 제외하는 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상술된 투여는, 예를 들면, 생체 내 또는 시험관 내에서 행해질 수 있다. 상술된 세포는, 특별히 제한되지 않고, 그의 예에는 하기가 포함된다: 각종 배양 세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, 및 COS 세포; 줄기 세포, 예컨대 ES 세포 및 조혈 줄기 세포; 및 초기 배양 세포 등의 생체에서 단리된 세포.
본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 상술된 표적 유전자는, 특별히 제한되지 않고, 임의의 소망의 유전자를 설정할 수 있다. 상술된 발현 억제 서열은 상술된 유전자에 따라 적당히 설계될 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자의 구체예를 이하에 나타내지만, 본 발명이 이것에 제한되는 것은 아니다. 상술된 ssPN 분자의 염기 서열은, 예를 들면, 상술된 표적 유전자가 GAPDH 유전자의 경우, 1 또는 몇 개의 결실, 치환 및/또는 부가를 포함할 수 있는 SEQ ID NO: 4 또는 18 로 나타낸 염기 서열이고, 상술된 표적 유전자가 TGF-β1 의 경우, ssPN 분자는 1 또는 몇 개의 결실, 치환 및/또는 부가를 포함할 수 있는, SEQ ID NO: 19 ~ 23 의 염기 서열에 의해 예시된다. 하기 SEQ ID NO: 4 및 18 의 서열에 있어서, 밑줄 부분 GUUGUCAUACUUCUCAUGG (SEQ ID NO: 5) 이, GAPDH 유전자의 발현 억제에 관한 영역이다. 또한, 하기 SEQ ID NO: 19 ~ 23 에 있어서, "＊" 은, 쌍이 아닌 염기를 나타낸다. 하기 SEQ ID NO: 4 및 18 ~ 23 에 있어서, Lx 및 Ly 의 구조는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 후술의 실시예에 나타낸 구조 (Lg) 일 수 있다.
Figure pct00011
본 발명의 ssPN 분자의 사용에 관해서는, 후술하는 본 발명의 조성물, 발현 억제 방법 및 치료 방법 등의 기재를 인용할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 상술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능하기 때문에, 예를 들면, 의약품, 진단약 및 농약 및 의학, 생명과학 등의 연구 도구로서 유용하다.
본 발명에 있어서, 용어 "알킬"은, 예를 들어 직쇄 및 분지쇄 알킬기를 포함한다. 상술된 알킬에서 탄소 원자의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 1 내지 30, 바람직하게 1 내지 6 또는 1 내지 4 이다. 상술된 알킬 기의 예에는 하기가 포함된다: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, 및 n-데실. 이들 중 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 용어 "알케닐"은 예를 들어, 직쇄 및 분지쇄 알케닐을 포함한다. 상술된 알케닐의 예에는 하나 이상의 이중 결합을 갖는 상술된 알킬이 포함된다. 상술된 알케닐에서 탄소 원자의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상술된 알킬에서와 같고, 바람직하게 2 내지 8 이다. 상술된 알케닐의 예에는 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐, 및 3-메틸-2-부테닐이 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 "알키닐" 은 예를 들어, 직쇄 및 분지쇄 알키닐을 포함한다. 상술된 알키닐의 예에는 하나 이상의 3중 결합을 갖는 상술된 알킬이 포함된다. 상술된 알키닐에서 탄소 원자의 개수는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 상술된 알킬에서와 동일하고, 바람직하게 2 내지 8 이다. 상술된 알키닐의 예는 에티닐, 프로피닐, 및 부티닐을 포함한다. 상술된 알키닐은 추가로 예를 들어 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "아릴"은 예를 들어, 모노시클릭 방향족 탄화수소 기 및 폴리시클릭 방향족 탄화수소 기를 포함한다. 상술된 모노시클릭 방향족 탄화수소기의 예에는 페닐이 포함된다. 상술된 폴리시클릭 방향족 탄화수소기의 예에는 1-나프틸, 2-나프틸, 1-안트릴, 2-안트릴, 9-안트릴, 1-페난트릴, 2-페난트릴, 3-페난트릴, 4-페난트릴, 및 9-페난트릴이 포함된다. 이들 중, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 예컨대 1-나프틸 및 2-나프틸, 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 용어 "헤테로아릴" 은 예를 들어, 모노시클릭 방향족 헤테시클릭기 및 축합된 방향족 헤테로시클릭기를 포함한다. 상술된 헤테로아릴 의 예에는 하기가 포함된다: 푸릴 (예를 들어, 2-푸릴, 3-푸릴), 티에닐 (예를 들어, 2-티에닐, 3-티에닐), 피롤릴 (예를 들어, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴), 이미다졸릴 (예를 들어, 1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴), 피라졸릴 (예를 들어, 1-피라졸릴, 3-피라졸릴, 4-피라졸릴), 트리아졸릴 (예를 들어, 1,2,4-트리아졸-1-일, 1,2,4-트리아졸-3-일, 1,2,4-트리아졸-4-일), 테트라졸릴 (예를 들어, 1-테트라졸릴, 2-테트라졸릴, 5-테트라졸릴), 옥사졸릴 (예를 들어, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴), 이속사졸릴 (예를 들어, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴), 티아졸릴 (예를 들어, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴), 티아디아졸릴, 이소티아졸릴 (예를 들어, 3-이소티아졸릴, 4-이소티아졸릴, 5-이소티아졸릴), 피리딜 (예를 들어, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜), 피리다지닐 (예를 들어, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐), 피리미디닐 (예를 들어, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐), 푸라자닐 (예를 들어, 3-푸라자닐), 피라지닐 (예를 들어, 2-피라지닐), 옥사디아졸릴 (예를 들어, 1,3,4-옥사디아졸-2-일), 벤조푸릴 (예를 들어, 2-벤조[b]푸릴, -벤조[b]푸릴, 4-벤조[b]푸릴, 5-벤조[b]푸릴, 6-벤조[b]푸릴, 7-벤조[b]푸릴), 벤조티에닐 (예를 들어, 2-벤조[b]티에닐, 3-벤조[b]티에닐, 4-벤조[b]티에닐, 5-벤조[b]티에닐, 6-벤조[b]티에닐, 7-벤조[b]티에닐), 벤즈이미다졸릴 (예를 들어, 1-벤즈이미다졸릴, 2-벤즈이미다졸릴, 4-벤즈이미다졸릴, 5-벤즈이미다졸릴), 디벤조푸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 퀴녹살리닐 (예를 들어, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 6-퀴녹살리닐), 신놀리닐 (예를 들어, 3-신놀리닐, 4-신놀리닐, 5-신놀리닐, 6-신놀리닐, 7-신놀리닐, 8-신놀리닐), 퀴나졸리닐 (예를 들어, 2-퀴나졸리닐, 4-퀴나졸리닐, 5-퀴나졸리닐, 6-퀴나졸리닐, 7-퀴나졸리닐, 8-퀴나졸리닐), 퀴놀릴 (예를 들어, 2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴), 프탈라지닐 (예를 들어, 1-프탈라지닐, 5-프탈라지닐, 6-프탈라지닐), 이소퀴놀릴 (예를 들어, 1-이소퀴놀릴, 3-이소퀴놀릴, 4-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 6-이소퀴놀릴, 7-이소퀴놀릴, 8-이소퀴놀릴), 퓨릴, 프테리디닐 (예를 들어, 2-프테리디닐, 4-프테리디닐, 6-프테리디닐, 7-프테리디닐), 카르바졸릴, 페난트리디닐, 아크리디닐 (예를 들어, 1-아크리디닐, 2-아크리디닐, 3-아크리디닐, 4-아크리디닐, 9-아크리디닐), 인돌릴 (예를 들어, 1-인돌릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴), 이소인돌릴, 페나지닐 (예를 들어, 1-페나지닐, 2-페나지닐), 및 페노티아지닐 (예를 들어, 1-페노티아지닐, 2-페노티아지닐, 3-페노티아지닐, 4-페노티아지닐).
본 발명에 있어서, 예를 들어, 용어 "시클로알킬"은, 시클릭 포화 탄화수소기를 지칭하고, 시클로알킬에서 탄소 원자의 개수는 예를 들어 3 내지 15 이다. 상술된 시클로알킬의 예에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 다리결합 (bridged) 시클릭 탄화수소기, 및 스피로 탄화수소 기가 포함된다. 이들 중, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 다리결합 시클릭 탄화수소 기, 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "다리결합 시클릭 탄화수소기" 의 예에는 바이시클로[2.1.0]펜틸, 바이시클로[2.2.1]헵틸, 바이시클로[2.2.2]옥틸, 및 바이시클로[3.2.1]옥틸, 트리시클로[2.2.1.0]헵틸, 바이시클로[3.3.1]노난, 1-아다만틸, 및 2-아다만틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, "스피로 탄화수소기" 의 예에는 스피로[3.4]옥틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 "시클로알케닐"은 예를 들어, 불포화 시클릭 지방족 탄화수소기를 포함하고, 시클로알케닐에서 탄소 원자의 개수는 예를 들어 3 내지 7 이다. 상술된 기의 예에는 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 및 시클로헵테닐이 포함된다. 이들 중, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 등이 바람직하다. 상술된 용어 "시클로알케닐"은 또한 예를 들어, 그들의 고리에 불포화 결합을 갖는 다리결합 시클릭 탄화수소기 및 스피로 탄화수소기가 포함된다.
본 발명에 있어서, "아릴알킬"의 예에는 벤질, 2-페네틸, 및 나프탈레닐메틸이 포함된다. "시클로알킬알킬" 및 "시클릴알킬"의 예에는 시클로헥실메틸 및 아다만틸메틸이 포함된다. "히드록시알킬"의 예에는 히드록시메틸 및 2-히드록시에틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, "알콕시"는 예를 들어, 상술된 알킬 및 산소 (알킬-O-기) 의 임의의 것으로 이루어진 기를 포함하고, 그의 예에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 및 n-부톡시가 포함된다. "알콕시알킬"의 예에는 메톡시메틸이 포함된다. "아미노알킬"의 예에는 2-아미노에틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, "헤테로시클릴"의 예에는 1-피롤리닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, 3-피롤리디닐, 피롤리디논, 1-이미다졸리닐, 2-이미다졸리닐, 4-이미다졸리닐, 1-이미다졸리디닐, 2-이미다졸리디닐, 4-이미다졸리디닐, 이미다졸리디논, 1-피라졸리닐, 3-피라졸리닐, 4-피라졸리닐, 1-피라졸리디닐, 3-피라졸리디닐, 4-피라졸리디닐, 피페리디논, 피페리디노, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-피페리디닐, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 피페라지논, 2-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 모르폴리노, 테트라히드로피라닐, 및 테트라히드로푸라닐이 포함된다.
본 발명에 있어서, "헤테로시클릴알킬"의 예에는 피페리디닐메틸 및 피페라지닐메틸이 포함된다. "헤테로시클릴알케닐"의 예에는 2-피페리디닐에테닐이 포함된다. "헤테로아릴알킬"의 예에는 피리딜메틸 및 퀴놀린-3-일메틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 "실릴"은 식 R3Si- (식 중, R 은 독립적으로 상술된 알킬, 아릴, 및 시클로알킬로부터 선택될 수 있음) 으로 나타낸 기를 포함한다. 실릴의 예에는 트리메틸실릴기 및 tert-부틸디메틸실릴기가 포함된다. "실릴옥시"의 예에는 트리메틸실릴옥시기가 포함된다. "실릴옥시알킬"의 예에는 트리메틸실릴옥시메틸이 포함된다.
본 발명에 있어서, "알킬렌"의 예에는 메틸렌, 에틸렌, 및 프로필렌이 포함된다.
본 발명에 있어서, 상술된 각종 기는 치환될 수 있다. 상술된 치환기의 예에는 하기가 포함된다: 히드록시, 카르복시, 술포, 할로겐, 알킬 할라이드 (할로알킬, 예를 들어, CF3, CH2CF3, CH2CCl3), 니트로, 니트로소, 시아노, 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸), 알케닐 (예를 들어, 비닐), 알키닐 (예를 들어, 에티닐), 시클로알킬 (예를 들어, 시클로프로필, 아다만틸), 시클로알킬알킬 (예를 들어, 시클로헥실메틸, 아다만틸메틸), 시클로알케닐 (예를 들어, 시클로프로페닐), 시클릴알킬, 히드록시알킬 (예를 들어, 히드록시메틸, 히드록시에틸), 알콕시알킬 (예를 들어, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 에톡시에틸), 아릴 (예를 들어, 페닐, 나프틸), 아릴알킬 (예를 들어, 벤질, 페네틸), 알킬아릴 (예를 들어, p-메틸페닐), 헤테로아릴 (예를 들어, 피리딜, 푸릴), 헤테로아릴알킬 (예를 들어, 피리딜메틸), 헤테로시클릴 (예를 들어, 피페리딜), 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬 (예를 들어, 모르폴릴메틸), 알콕시 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시), 할로겐화 알콕시 (예를 들어, OCF3), 알케닐옥시 (예를 들어, 비닐옥시, 알릴옥시), 아릴옥시 (예를 들어, 페닐옥시), 알킬옥시카르보닐 (예를 들어, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐), 아릴알킬옥시 (예를 들어, 벤질옥시), 아미노 [알킬아미노 (예를 들어, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노), 아실아미노 (예를 들어, 아세틸아미노, 벤조일아미노), 아릴알킬아미노 (예를 들어, 벤질아미노, 트리틸아미노), 히드록시아미노], 아미노알킬 (예를 들어, 아미노메틸), 알킬아미노알킬 (예를 들어, 디에틸아미노메틸), 카르바모일, 술파모일, 옥소, 실릴, 실릴옥시알킬 등.
2. 뉴클레오티드 잔기
상술된 뉴클레오티드 잔기에는, 예를 들어 구성 요소로서, 당, 염기 및 인산이 포함된다. 상술된 뉴클레오티드 잔기는 예를 들어, 리보뉴클레오티드 잔기 또는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 상술된 리보뉴클레오티드 잔기는 예를 들어, 당으로서 리보오스 잔기; 및 염기로서 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 또는 우라실 (U) 을 가진다. 상술된 데옥시리보오스 잔기는, 예를 들어, 당으로서 데옥시리보오스 잔기; 및 염기로서 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 또는 티민 (T) 을 가진다.
상술된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 비수식된 뉴클레오티드 잔기 및 수식된 뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 상술된 비수식된 뉴클레오티드 잔기의 상술된 구성 요소가, 예를 들면, 천연에 존재하는 것과 동일 또는 실질적으로 동일하다. 바람직하게는, 상기 성분은 인체에 있어서 천연에 존재하는 뉴클레오티드 잔기의 성분과 동일 또는 실질적으로 동일하다.
상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 상술된 비수식된 뉴클레오티드 잔기를 수식함으로써 수득된 뉴클레오티드 잔기이다. 상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들면, 상술된 비수식된 뉴클레오티드 잔기의 구성 요소 중 임의의 것이 수식되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "수식"은, 예를 들면, 상술된 구성 요소의 치환, 부가 및/또는 결실, 상술된 구성 요소에 있어서의 원자(들) 및/또는 관능기(들)의 치환, 부가 및/또는 결실이다. 이것은 또한 "변경"이라고 할 수 있다. 상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기의 예는 천연에 존재하는 뉴클레오티드 잔기, 및 인위적으로 수식된 뉴클레오티드 잔기를 들 수 있다. 상술된 천연-유래 수식된 뉴클레오티드 잔기와 관련해서, 예를 들어 문헌 [Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: pp. 2183 to 2196)] 이 인용될 수 있다. 상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기는 예를 들어 상술된 뉴클레오티드 잔기의 대체물의 잔기일 수 있다.
상술된 뉴클레오티드 잔기의 수식의 예에는 리보오스-인산 골격 (이하, "리보인산 (ribophosphate) 골격" 으로서 지칭됨) 의 수식이 포함된다.
상술된 리보인산 골격에서, 예를 들어, 리보오스 잔기가 수식될 수 있다. 상술된 리보오스 잔기에서, 예를 들어, 2'-위치 탄소가 수식될 수 있다. 구체적으로 예를 들어 2'-위티 찬소에 결합된 히드록실기가 수소 또는 플루오로로 치환될 수 있다. 상술된 2'-위치 탄소에 결합된 히드록실기를 수소로 치환함으로써, 리보오스 잔기를 데옥시리보오스 잔기로 치환 가능하다. 상술된 리보오스 잔기는 예를 들어 입체이성질체로 치환될 수 있고, 예를 들어 아라비노오스 잔기로 치환될 수 있다.
상술된 리보인산 골격은 예를 들어 비(非)리보오스 잔기 및/또는 비(非)인산을 가진 비(非)리보인산 골격으로 치환될 수 있다. 상술된 비리보인산 골격은 예를 들어 비(非)하전되게 수식된 상술된 리보인산 골격일 수 있다. 상술된 뉴클레오티드 잔기에서 상술된 비리보인산 골격으로 리보인산 골격을 치환함으로써 수득된 대체물의 예에는 모르폴리노, 시클로부틸, 및 피롤리딘이 포함된다. 상술된 대체물의 기타 예에는 인위적인 핵산 모노머 잔기가 포함된다. 이의 구체예에는 PNA (Peptide Nucleic Acid; 펩티드 핵산), LNA (Locked Nucleic Acid; 잠금형 핵산), 및 ENA (2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids; 2'-O,4'-C-에틸렌다리결합 핵산) 이 포함된다. 이들 중, PNA 가 바람직하다.
상술된 리보인산 골격에서, 예를 들어, 인산 기는 수식될 수 있다. 상술된 리보인산 골격에서, 당 잔기에 가장 가까운 인산 기는 "α-인산 기"로 불리운다. 상술된 α-인산 기는 음성으로 하전되고, 그 전하는 당 잔기에 결합되지 않은 2 개의 산소 원자에 걸쳐 균일하게 분포되어 있다. 상술된 α-인산 기에서 4 개의 산소 원자 중에서, 뉴클레오티드 잔기들 사이 포스포디에스테르 결합에 있어서 당 잔기에 결합되지 않은 2 개의 산소 원자는 이하 "비결합 산소" 로 지칭된다. 다른 한편, 상술된 뉴클레오티드 잔기들 사이 포스포디에스테르 결합에 있어서 당 잔기에 결합된 2 개의 산소 원자는 이하 "결합 산소"로서 지칭된다. 예를 들어, 상술된 α-인산 기는 바람직하게 비하전되도록 수식되거나 또는 상술된 비결합 원자들 사이 전하 분포가 비대칭형이 되게 수식된다.
상술된 인산 기에서, 예를 들어, 상술된 비결합 산소(들)는 치환될 수 있다. 상술된 산소(들)는 예를 들어 S (황), Se (셀레늄), B (붕소), C (탄소), H (수소), N (질소), 및 또는 OR (R 은 예를 들어, 알킬기 또는 아릴기임) 로부터 선택된 임의의 원자로 치환될 수 있고, S 로의 치환이 바람직하다. 상술된 비결합 산소 양자 모두가 치환되는 것이 바람직하고, 예를 들어 비결합된 산소 양자 모두가 S 로 치환되는 것이 더욱 바람직하다. 상술된 수식된 인산기의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 및 포스포트리에스테르가 포함된다. 특히, 상술된 2 개의 비결합 산소 중 양자 모두가 S 로 치환된 포스포로디티오에이트가 바람직하다.
상술된 인산기에서, 예를 들어, 상술된 결합 산소(들)가 치환될 수 있다. 상술된 산소(들)는 예를 들어 S (황), C (탄소), 및 N (질소) 로부터 선택된 임의의 원자로 치환될 수 있다. 상술된 수식 인산기의 예에는 하기가 포함된다: N 으로 치환된 다리결합된 포스포로아미데이트; S 치환의 다리결합된 포스포로티오에이트; 및 C 치환의 다리결합된 메틸렌포스포네이트. 바람직하게, 상술된 결합 산소(들)의 치환은 본 발명의 ssPN 분자의 5'말단 뉴클레오티드 잔기 및 3'말단 뉴클레오티드 잔기의 적어도 한 방향에 있어서 행해진다. 5'측에서 치환이 행해지는 경우, C 에 의한 치환이 바람직하다. 3'측에서 치환이 행해지는 경우, N에 의한 치환이 바람직하다.
상술된 인산기는 예를 들어, 상술된 인산-비(非)함유 링커로 치환될 수 있다. 상술된 링커에는 하기가 포함된다: 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥시드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조, 메틸렌옥시메틸이미노, 등. 바람직하게, 링커는 메틸렌카르보닐아미노 기 및 메틸렌메틸이미노 기를 포함할 수 있다.
본 발명의 ssPN 분자는, 예를 들면, 3'말단 및 5' 말단의 적어도 한 방향의 뉴클레오티드 잔기가 수식될 수 있다. 예를 들면, 3'말단 및 5'말단 중 어느 한쪽의 뉴클레오티드 잔기가 수식될 수 있거나, 또는 3' 말단 및 5'말단 양자 모두에서의 뉴클레오티드 잔기가 수득될 수 있다. 상술된 수식은 예를 들면, 전술한 대로이며, 바람직하게는, 말단의 인산기를 수식하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상술된 인산기의 전체가 수식될 수 있거나, 또는 상술된 인산기에서 1 이상의 원자가 수식될 수 있다. 전자의 경우, 예를 들어 전체 인산기가 치환되거나 또는 결실될 수 있다.
상술된 말단의 뉴클레오티드 잔기(들)의 수식은, 예를 들면, 다른 분자의 부가일 수 있다. 상술된 기타 분자에는 상술된 바와 같은 표지 물질 등의 관능성 분자 및 보호기가 포함된다. 상술된 보호기의 예에는 S (황), Si (규소), B (붕소), 및 에스테르포함기가 포함된다. 상술된 표지 물질 등의 관능성 분자는 예를 들어 본 발명의 ssPN 분자의 검출 등에서 사용될 수 있다.
상술된 기타 분자는, 예를 들면, 상술된 뉴클레오티드 잔기의 인산기로 부가될 수 있거나, 또는 스페이서 (spacer) 를 통해, 상술된 인산기 또는 상술된 당 잔 기로 부가될 수 있다. 예를 들어, 상술된 스페이서의 말단 원자는 상술된 인산 기의 상술된 결합 산소, 또는 당잔기의 O, N, S, 또는 C 중 하나에 부가 또는 치환할 수 있다. 상술된 당 잔기에서 결합 부위는 예를 들어 3'-위치에서 C, 5' 위치에서 C 또는 이에 결합하는 임의의 원자인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상술된 스페이서는 또한 PNA 등의 상술된 뉴클레오티드 대체물의 말단 원자에 부가 또는 치환될 수도 있다.
상술된 스페이서는 특별히 제한되지 않으며, 그의 예에는 -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH, 무염기 당, 아미드, 카르복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디술파이드, 티오우레아, 술폰아미드, 및 모르폴리노, 및 나아가 비오틴 시약 및 플루오레세인 시약이 있다. 상술된 식에 있어서, n 은 양의 정수이고, n = 3 또는 6 이 바람직하다.
상술된 말단에 부가되는 분자의 기타 예에는 하기가 포함된다: 색소, 개재 물질 (intercalating agent; 예를 들어 아크리딘), 가교제 (예를 들어, 프소랄렌, 마이토마이신 C), 포르피린스 (TPPC4, 텍사피린, 사프히린), 폴리시클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인위적 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EDTA), 친유성 담체 (예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O (헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사티인), 펩티드 복합체 (예를 들어, Antennapedia 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제s, 인산, 아미노, 메르캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선 표지 마커, 표소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 및 합성 리보뉴클레아제 (예, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터 (cluster), 아크리딘-이미다졸 복합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체).
본 발명의 ssPN 분자에서, 예를 들어 상술된 5' 말단은 인산기 또는 인산기 유사체 (analog) 로 수식될 수 있다. 상술된 인산화의 예에는 하기가 포함된다:
5'-모노인산 ((HO)2(O)P-O-5');
5'-디인산 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');
5'-트리인산 ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');
5'-구아노신 캡 (cap) (7-메틸화 또는 비(非)메틸화, 7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');
5'-아데노신 캡 (Appp);
임의의 수식되거나 또는 비수식된 뉴클레오티드 캡 구조 (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');
5'-모노티오인산 (포스포로티오에이트: (HO)2(S)P-O-5');
5'-모노디티오인산 (포스포로디티오에이트: (HO)(HS)(S)P-O-5');
5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5');
황 치환 모노인산, 디인산 및 트리인산 (예를 들어, 5'-α-티오트리인산, 5'-γ-티오트리인산, 등);
5'-포스포라미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5');
5'-알킬포스포네이트 (예를 들어, RP(OH)(O)-O-5', (OH)2(O)P-5'-CH2, 이때 R 은 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필, 등)임); 및
5'-알킬에테르포스포네이트 (예를 들어, RP(OH)(O)-O-5', 이때 R 은 알킬에테르 (예를 들어, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 등)임).
상술된 뉴클레오티드 잔기에서, 상술된 염기는, 특별히 제한되지 않는다. 상술된 염기는, 예를 들면, 천연의 염기 또는 비천연의 염기일 수 있다. 상술된 염기는, 예를 들면, 천연 유래 염기 또는 합성 염기일 수 있다. 상술된 염기로서, 예를 들면, 일반적인 염기, 그의 수식된 유사체 등을 사용할 수 있다.
상술된 염기의 예에는 하기가 포함된다: 퓨린 염기 예컨대 아데닌 및 구아닌; 및 피리미딘 염기, 예컨대 시토신, 우라실, 및 티민. 상술된 염기의 기타 예에는 이노신, 티민, 잔틴, 히포잔틴, 뉴불라린, 이소구아니신, 및 튜베르시딘이 있다. 상술된 염기의 예는 또한 하기를 포함한다: 2-아미노아데닌, 알킬 유도체, 예컨대 6-메틸화 퓨린; 알킬 유도체, 예컨대 2-프로필화 퓨린; 5-할로우라실 및 5-할로시토신; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 6-아자우라실, 6-아자시토신, 및 6-아자티민; 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실; 8-할로겐화, 아미노화 (aminated), 티올레이트화, 티오알킬화, 히드록실화 및 기타 8-치환된 퓨린; 5-트리플루오로메틸화 및 기타 5-치환된 피리미딘; 7-메틸구아닌; 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; N-2, N-6, 및 O-6 치환된 퓨린 (2-아미노프로필아데닌 포함); 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신; 디히드로우라실; 3-데아자-5-아자시토신; 2-아미노퓨린; 5-알킬우라실; 7-알킬구아닌; 5-알킬시토신; 7-데아자아데닌; N6,N6-디메틸아데닌; 2,6-디아미노퓨린; 5-아미노-알릴-우라실; N3-메틸우라실; 치환된 1,2,4-트리아졸; 2-피리디논; 5-니트로인돌; 3-니트로피롤; 5-메톡시우라실; 우라실-5-옥시아세트산; 5-메톡시카르보닐메틸우라실; 5-메틸-2-티오우라실; 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실; 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실; 3-메틸시토신; 5-메틸시토신; N4-아세틸시토신; 2-티오시토신; N6-메틸아데닌; N6-이소펜틸아데닌; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌; N-메틸구아닌; 및 O-알킬화 염기. 퓨린 및 피리미딘의 예는 [U.S. 특허 No. 3,687,808, "Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering", pp. 858 to 859, edited by Kroschwitz J. I, John Wiley & Sons, 1990, and Englisch et al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, vol. 30, p. 613] 에 개시된 것을 포함한다.
상술된 수식된 뉴클레오티드 잔기의 기타 예에는 염기를 갖지 않는 것, 즉 무염기성 리보인산 골격을 갖는 것이 포함된다. 나아가, 상술된 개질된 뉴클레오티드 잔기로서, 예를 들어 U.S. Provisional Application No. 60/465,665 (제출일: 2003 년 4 월 25 일) 및 International Application No. PCT/US04/07070 (제출일: 2004 년 3 월 8 일) 에 기재된 것이 사용될 수 있고 상기 문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
3. 본 발명의 ssPN 분자의 합성 방법
본 발명의 ssPN 분자의 합성 방법은 특별히 제한되지 않고, 통상 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상술된 합성 방법의 예는 유전자공학적 수법 및 화학합성법에 따른 합성법을 포함한다. 유전자공학적 수법의 예에는 하기가 포함된다: 시험관 내 전사를 이용한 합성법, 벡터를 이용한 방법, PCR 카세트를 이용해 실시한 방법 등. 상술된 벡터는, 특별히 제한되지 않고, 플러스미드 등의 비(非)바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 상술된 화학 합성법은 특별히 한정되지 않고, 그의 예에는 포스포라미다이트 방법 및 H-포스포네이트 방법이 포함된다. 상술된 화학합성법은 예를 들어 시판중인 자동화 핵산 합성기를 이용해 실시될 수 있다. 상술된 화학 합성 방법에서, 아미다이트가 일반적으로 사용된다. 상술된 아미다이트는 특별히 한정되지 않는다. 시판중인 아미다이트의 예에는 RNA 포스포르아미다이트 (2'-O-TBDMSi, 상표명, Samchully Pharm. Co., Ltd.), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, 및 TEM 아미다이트가 포함된다. 본 발명의 ssPN 분자의 합성에서, 예를 들어 상술된 식 (I) 으로 나타낸 링커 영역(들)의 합성 동안, 후술하는 본 발명의 모노머를 사용하는 것이 바람직하다.
4. 조성물
본 발명의 발현 억제용 조성물은 상술한 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물이며, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것이 특징이며, 그 밖의 구성은, 어떠한 식으로든 제한되지 않는다. 본 발명의 발현 억제용 조성물은, 예를 들면, 발현 억제용 시약으로서 지칭될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 예를 들면, 상술된 표적 유전자가 존재하는 대상에 투여하는 것으로, 상술된 표적 유전자의 발현 억제를 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같이, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 포함한다. 본 발명의 조성물은, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 포함하는 것이 특징이며, 그 밖의 구성은 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들면, 의약품으로서 지칭될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 예를 들면, 유전자가 원인이 되는 질환이 있는 환자에게 투여하는 것이, 상술된 유전자의 발현을 억제하고, 상술된 질환을 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서, "치료"는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 상술된 질환의 예방, 질환의 개선, 예후의 개선을 포함하고, 예를 들어 이것은 이들 중 어느 것이라도 의미할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 치료의 대상이 되는 질환은, 특별히 제한되지 않고, 그의 예에는 유전자의 발현이 원인이 되는 질환이 포함된다. 상술된 질환의 종류에 따라, 그 질환의 원인이 되는 유전자를 상술된 표적 유전자에 설정하고, 더욱이, 상술된 표적 유전자에 따라 상술된 발현 억제 서열을 적당히 설정할 수 있다.
구체예는 하기와 같다. 상술된 표적 유전자를 상술된 TGF-β1 유전자에 설정하고, 상술된 유전자에 대한 발현 억제 서열을 상술된 ssPN 분자에 혼입하면, ssPN 분자는 예를 들면, 염증성 질환, 구체적으로는, 급성 폐 상해 등의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 억제용 조성물 및 약학적 조성물 (이하, 양 조성물은 간단히 "조성물" 로서 지칭됨)의 사용 방법은, 특별히 제한되지 않고, 그의 예는 상술된 표적 유전자를 갖는 투여 대상에, 상술된 ssPN 분자를 투여하는 것을 포함한다.
상술된 투여 대상은, 예를 들면, 세포, 조직 또는 기관 등을 들 수 있다. 상술된 투여 대상은, 예를 들면, 인간, 인간을 제외하는 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상술된 투여는, 예를 들면, 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 상술된 세포는, 특별히 제한되지 않고, 그의 예는 하기를 포함한다: 각종 배양 세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포, NIH3T3 세포, 및 COS 세포; 줄기 세포, 예컨대 ES 세포 및 조혈 줄기 세포; 및 초기 배양 세포 등의 생체에서 단리된 세포.
상술된 투여 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 투여 대상에 따라서 적당히 결정할 수 있다. 상술된 투여 대상이 배양 세포의 경우, 예를 들면, 투여 방법은 트랜스펙션 시약을 사용하는 방법, 전기천공법 등일 수 있다. 상술된 투여가 생체 내에서 행해지는 경우, 투여는 예를 들면, 경구 투여 또는, 비경구 투여일 수 있다. 상술된 비경구 투여는, 예를 들면, 주사, 피하투여, 국소투여 등을 들 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물 각각은, 본 발명의 ssPN 분자만을 포함할 수 있거나, 또는 ssPN 분자 이외에 추가로 그 밖의 첨가물(들)을 포함할 수도 있다. 상술된 첨가물은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 약학적으로 허용된 첨가물이 바람직하다. 상술된 첨가물의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 투여 대상의 종류에 따라서 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상술된 ssPN 분자는, 예를 들면, 상술된 첨가물과 복합체를 형성할 수 있다. 상술된 첨가물은, 예를 들면, 복합화제로서 지칭될 수도 있다. 상술된 복합체에 의해, 예를 들면, 상술된 ssPN 분자를 효율적으로 전달시킬 수 있다. 상술된 ssPN 분자와 상술된 복합화제와의 결합은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 비공유결합 등을 들 수 있다. 상술된 복합체는, 예를 들면, 봉입 복합체 등일 수 있다.
상술된 복합화제는, 특별히 제한되지 않고, 그의 예에는 중합체, 시클로덱스트린, 및 아다만틴이 포함된다. 상술된 시클로덱스트린의 예에는 선형 시클로덱스트린 공중합체 및 선형 산화 시클로덱스트린 공중합체가 있다.
상술된 첨가물은, 이밖에, 예를 들면, 담체, 표적 세포와의 결합 물질, 축합제, 융합제 등을 포함한다.
예를 들어, 상술된 담체는 바람직하게 중합체, 더욱 바람직하게 생체중합체이다. 바람직하게, 상술된 담체는 예를 들어 생분해성이다. 상술된 담체의 예에는 하기가 포함된다: 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지질단백질 (LDL), 및 글로불린; 탄수화물, 예컨대, 예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이뉼린, 시클로덱스트린, 및 히알루론산; 및 지질. 상술된 담체로서, 예를 들어 합성 중합체, 예컨대 합성 폴리아미노산이 이용될 수도 있다. 상술된 포릴아미노산의 예에는 하기가 포함된다: 폴리리신 (PLL), 폴리-L-아스파르트산, 폴리-L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-co-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 및 폴리포스파진.
상술된 결합 물질의 예에는 하기가 포함된다: 갑상선자극 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-굴루코사민, 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙 산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, Neproxin, RGD 펩티드 및 RDG 펩티드 모사체.
상술된 융합제 및 축합제의 예에는 폴리아미노 사슬, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI) 이 포함된다. 예를 들어, PEI 는 선형 또는 분지형일 수 있고, 또한 합성물일 수 있거나 또는 천연 발생적일 수 있다. 상술된 PEI 는 예를 들어 알킬 또는 지질로 치환될 수 있다. 상술된 융합제로서, 또한 예를 들어 폴리히스티딘, 폴리이미다졸, 폴리피리딘, 폴리프로필렌이민, 멜리틴, 폴리아세탈 물질 (예를 들어, 양이온성 폴리아세탈 등), 등을 이용할 수 있다. 상술된 융합제는 예를 들어 α-헬릭스 구조를 가질 수 있다. 상술된 융합제는 예를 들어 멜리틴과 같은 막 붕괴제일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 상술된 복합체의 형성 등에 대해서 U.S. 특허 No. 6,509,323, U.S. 특허공보 2003/0008818, PCT/US04/07070, 등을 인용할 수 있다.
상술된 첨가물의 기타 예는 양쪽친매성 분자 등이 있다. 상술된 양쪽친매성 분자는, 예를 들어, 소수성 영역 및 친수성 영역을 갖는 분자다. 상술된 분자는 예를 들어, 바람직하게 중합체이다. 상술된 중합체는 예를 들어, 2 차 구조를 가질 수 있고, 바람직하게는 반복적인 2차 구조를 가질 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 폴리펩티드가 바람직하고, α-헬릭스 폴리펩티드 등이 더욱 바람직하다.
상술된 양쪽친매성 중합체는 2 개 이상의 양쪽친매성 서브유닛을 갖는 중합체일 수 있다. 상술된 서브유닛의 예는 적어도 1 개의 친수성기 및 1 개의 소수성 기를 갖는 시클릭 구조의 서브유닛 등을 들 수 있다. 상술된 서브유닛은 예를 들어 스테로이드, 예컨대 콜산, 방향족 구조 등을 포함할 수 있다. 상술된 중합체는 예를 들어 방향족 서브유닛 등의 시클릭 구조 서브유닛과 아미노산 모두를 포함할 수 있다.
5. 발현 억제 방법
본 발명의 발현 억제 방법은, 상술한 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이며, 이때 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 발현 억제 방법은, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은 결코 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 억제 방법에 있어서, 상술된 유전자 발현 억제의 메커니즘은 특별히 제한되지 않고, 그의 예는 RNA 간섭에 의한 발현 억제 등을 들 수 있다. 본 발명의 발현 억제 방법은, 예를 들면, 상술된 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭을 유도하는 방법이며, 이는 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것을 특징으로 하는 발현 유도 방법으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예를 들면, 상술된 표적 유전자가 존재하는 대상에, 상술된 ssPN 분자를 투여하는 공정을 포함한다. 상술된 투여 공정에 의해, 예를 들면, 상술된 투여 대상에 상술된 ssPN 분자를 접촉시킨다. 상술된 투여 대상은, 예를 들면, 세포, 조직 또는 기관 등을 들 수 있다. 상술된 투여 대상은, 예를 들면, 인간, 인간을 제외하는 비인간 포유류 등의 비인간 동물 등을 들 수 있다. 상술된 투여는, 예를 들면, 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 발현 억제 방법은, 예를 들면, 상술된 ssPN 분자를 단독으로서 또는 상술된 ssPN 분자를 포함하는 상술된 본 발명의 조성물을 투여하는 것일 수 있다. 상술된 투여 방법은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 투여 대상의 종류에 따라서 적당히 선택할 수 있다.
6. 치료 방법
본 발명의 질환의 치료 방법은, 상술한 바와 같이, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를, 환자에게 투여하는 공정을 포함하고, 상술된 ssPN 분자가, 상술된 발현 억제 서열로서, 상술된 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은, 상술된 본 발명의 ssPN 분자를 사용하는 것이 특징이며, 그 밖의 공정 및 조건은, 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 상술된 발현 억제 방법과 관련된 기재는 예를 들어 본 발명의 치료 방법에도 마찬가지로 적용된다.
7. ssPN 분자의 사용
본 발명에 따른 사용은, 상술된 표적 유전자의 발현 억제를 위한, 상술된 본 발명의 ssPN 분자의 사용이다. 또한, 본 발명의 사용은, RNA 간섭의 유도를 위한, 상술된 본 발명의 ssPN 분자의 사용이다.
본 발명의 핵산 분자는, 질환의 치료에 사용하기 위한 핵산 분자이다. 상술된 핵산 분자는, 상술된 본 발명의 ssPN 분자이며, 상술된 ssPN 분자가, 상술된 발현 억제 서열로서, 상술된 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함한다.
8. 모노머
본 발명의 모노머는, 핵산 합성용의 모노머이며, 하기식 (II) 의 구조를 갖는 것이다. 본 발명의 상술된 ssPN 분자와 관련된 기재는 또한 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 모노머에 적용된다.
Figure pct00012
본 발명의 모노머를 사용하면, 예를 들면, 상술된 본 발명의 ssPN 분자의 합성에 있어서, 상술된 식 (I) 로 나타낸 링커 영역 (Lx) 및 (Ly) 을 용이하게 합성할 수 있다. 본 발명의 모노머는, 예를 들면, 자동 핵산 합성용의 아미다이트로서 이용될 수 있고, 예를 들어 일반적인 자동화 핵산 합성기에 적용가능하다. 상술된 합성 방법의 예에는 포스포르아미다이트 방법 및 H-포스포네이트 방법이 포함된다.
상술된 식에서,
X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이고;
Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이고;
R11 및 R21 는 각각 독립적으로 H, 보호기 또는 인산-보호기이고;
L1 운 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
L1 은 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
단: Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리는 서로 인접하지 않고;
L2 는 m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
L2 는 상술된 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
단: Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR21 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들 끼리는 서로 인접되지 않고;
Ra, Rb, Rc, 및 Rd 는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고;
m 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
n 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
A 는 임의의 원자단이며, 하기의 식 (Ia) 는 펩티드가 아닌 아미노산이다.
Figure pct00013
상술된 식 (II) 및 상술된 식 (I) 사이에 공통적인 부분과 관련해, 상술된 식 (I) 에 관해 상기 언급된 기재가 또한 상술된 식 (II) 에 적용된다. 구체적으로, 상술된 식 (II) 에서, X1, X2, Y1, Y2, L1, L2, m, n, 및 고리 A 와 관련하여, 예를 들어, 상술된 식 (I) 에 관해 상기에 기재된 모든 설명을 적용한다.
상술된 식 (II) 에서, R11 및 R21 는 각각 독립적으로 상술된 바와 같이 H, 보호기, 또는 인산-보호기이다.
상술된 보호기는 예를 들어 상술된 식 (I) 과 관련해 상술된 바와 같다. 구체적으로, 예를 들어 보호기는 군 I 로부터 선택될 수 있다. 상술된 군 I 에는 예를 들어 하기가 포함된다: 디메톡시트리틸 (DMTr) 기, TBDMS 기, ACE 기, TOM 기, CEE 기, CEM 기, TEM 기, 및 하기 식 (P1) 또는 (P2) 로 나타낸 실릴-함유기. 특히, 보호기가 DMtr 기 또는 상술된 실릴-함유기 중 임의의 것인 것이 바람직하다.
Figure pct00014
상술된 인산-보호기는 예를 들어 하기 식으로써 나타낼 수 있다:
-P(OR6)(NR7R8)
상술된 식에서, R6 은 수소 원자 또는 임의의 치환기이다. 예를 들어, 치환기 R6 은 바람직하게 탄화수소 기이고, 및 상술된 탄화수소 기는 전자 끄는기로 치환될 수 있다. 치환기 R6 의 예에는 할로겐, 할로알킬, 헤테로아릴, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 및 탄화수소, 예컨대 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 및 시클릴알킬 (전자 끄는기로 치환 또는 비치환될 수 있음) 이 포함된다. 치환기 R6 의 구체예에는 β-시아노에틸기, 니트로페닐에틸기, 및 메틸기가 포함된다.
R7 및 R8 은 각각 수소 원자 또는 임의의 치환기이고, 이들은 상동 또는 상이할 수 있다. 치환기 R7 및 R8 은 바람직하게, 예를 들어, 탄화수소 기이고, 상술된 탄화수소 기는 추가로 임의의 치환기로 치환 또는 비치환될 수 있다. 상술된 탄화수소기의 예는 R6 과 관련한 상기 기재에 열거된 것과 동일하고, 탄화수소 기는 바람직하게 메틸기, 에틸기, 또는 이소프로필 기이다. 이 경우, -NR7R8 의 구체예는 디이소프로필아미노 기, 디에틸아미노 기, 및 에틸메틸아미노 기를 포함한다. 대안적으로, 치환기 R7 및 R8 이 결합되어 이들이 결합하는 질소 원자(들)과 함께 (즉, 전체로서 -NR7R8) 질소-함유 고리 (예를 들어, 피페리딜기, 모르폴리노기 등) 을 임의 형성한다.
구체적으로, 상술된 인산-보호기는 예를 들어 하기 군 II 로부터 선택될 수 있다. 군 II 는 예를 들어 -P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2) 및 -P(OCH3)(N(i-Pr)2) 을 포함한다. 상술된 식에서, i-Pr 는 이소프로필을 지시한다.
상술된 식 (II) 에서, 예를 들어, R1 및 R2 중 하나는 H 또는 보호기이고, 나머지 하나는 H 또는 인산-보호기이다. 예를 들어, R1 이 상술된 보호기인 경우, R2 는 H 또는 상술된 인산-보호기인 것이 바람직하다. 구체적으로, R1 이 상술된 군 I 로부터 선택되는 경우, R2 는 H 이거나 또는 상술된 군 II 로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들어 R1 이 상술된 인산-보호기인 경우, R2 이 H 또는 상술된 보호기인 것이 바람직하다. 구체적으로, R1 이 상술된 군 II 로부터 선택되는 경우, R2 은 H 이거나 또는 상술된 군 I 로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상술된 식 (II) 의 구조의 예에는 하기 식 (II-1) 내지 (II-4) 이 포함된다. 하기 식에서, n 및 m 은 상술된 식 (II) 에서와 동일하다.
Figure pct00015
Figure pct00016
상술된 식 (II-4) 에서, R101 은, R11 및 R21 과 독립적으로, H, 보호기 또는 인산-보호기이다. R101 에 있어서의 상술된 보호기 및 상술된 인산-보호기는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 예를 들어, R11 및 R21 와 동일할 수 있고, 퍼플루오로알카노일기, 예컨대 퍼플루오로알카노일기, 예컨대 Tfa (트리플루오로아세틸기) 등, Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 기) 등일 수 있다.
상술된 식 (II-1) - (II-4) 에서, n 및 m 은 특별히 한정되지 않고, 상술된 바와 같다. 그의 구체적인 예는 상술된 식 (II-1) (식 중, n = 11 및 m = 12) 이고, 그의 구조는 식 (II-1a) 로써 나타낸다. 또 다른 구체예는 상술된 식 (II-1) (식 중, n = 5 및 m = 4) 이고, 그의 구조는 하기 식 (II-1b) 로써 나타낸다. 또한 또 다른 구체예는 상술된 식 (II-4) (식 중, n = 5 및 m = 4) 이고, 그의 구조는 하기 식 (II-4a) 로써 나타낸다.
Figure pct00017
Figure pct00018
본 발명에서 모노머의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 하기 도식 1 로 나타낸 바와 같이 하기 화합물 (Ic) 를 화합물 (Ib) 로부터 제조될 수 있고, 이때 상술된 아미노산 (Ia) 의 아미노기는 보호기 R31 에 의해, 축합 반응에 의해 보호화되고, (IIa) 는 (Ic) 로부터 제조되고, (IIa) 는 (II) 로 변환된다. 하기 도식 1 은 예이며, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 하기 화학식 (Ib) 및 (Ic) 에서, 보호기 R31 는 예를 들어, Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 기), Z (벤질옥시카르보닐), BOC (t-부톡시카르보닐) 등이다. 하기의 화학식 (Ib), (Ic) 및 (IIa) 에서, Y1, Y2, L1, L2, R11 및 R21 는 상술된 식 (II) 에 대해 정의된 바와 같다. 하기 화합물 (IIa) 는 상술된 식 (II) (식 중, X1 는 O 이고, X2 는 O 임) 의 화합물이다. 하기 식 (II) 에서 카르보닐 산소는 상술된 식 (II) 에 있어서 적당히 X1 및 X2 로 변환될 수 있다. 변환이 필수적이지 않는 경우, 하기 화합물 (IIa) 는 직접 화합물 (II) 로서 이용될 수 있다.
Figure pct00019
본 발명의 모너머 및 제조 방법은 하기 도식 2 로 추가 구체적으로 예시된다. 그러나, 하기 도식 2 는 예이고, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 하기 도식 2 에서, "Fmoc" 는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 기이고, "iPr" 은 이소프로필기이고, "Tr"은 트리틸기 또는 트리페닐메틸기이고, "ODMTr" 는 4,4'-디메톡시트리틸옥시기이다. 이하 동일하다.
Figure pct00020
본 발명의 모노머는 바람직하게 예를 들어 상술된 표지 물질을 포함한다. 본 발명의 모노머가 상술된 안정한 동위체를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 상술된 표지 물질은 상술된 바와 같다.
본 발명의 모노머가, 상술된 안정한 동위체 등의 동위체를 포함할 경우, 예를 들면, 용이하게 상술된 본 발명의 ssPN 분자에 상술된 동위체를 도입할 수 있다. 동위체를 포함하는 상술된 모노머는, 예를 들면, 상술된 동위체를 도입한 아미노산 (Ia) 의 원료로부터 합성가능하다. 본 발명에 있어서, 동위체를 도입한 아미노산 (Ia) 의 입수 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 적당한 방법으로 제조할 수도 있고, 시판 제품을 이용할 수도 있다.
안정한 동위체가 도입된 아미노산으로서, 예를 들면, 중수소 (D) 이 도입된 아미노산은, 예를 들면, 하기 도식 3 에 가리킨 것 같이, 아미노산 (Ia) 을 LiAlD4 로 처리하고, 추가로 생성된 OH 기를 산화하는 것으로 제조할 수 있다.
Figure pct00021
기타 안정한 동위체가 도입된 아미노산으로서, 예를 들어 중 산소 (18O) 이 도입된 아미노산은 예를 들어 하기 식에 나타낸 바와 같이 염기성 조건 하에서, 아미노산 (Ia) 의 메틸 에스테르를 H2 18O 와 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure pct00022
나아가, 중 질소 (15N) 또는 중 탄소 (13C) 의 도입 등이 포함된 아미노산 (Ia) 의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 적절한 방법으로써 제조될 수 있다.
안정한 동위체가 도입된 모노머가 상술된 방식으로 합성될 수 있다. 상술된 모노머를 합성용 아미다이트로서 이용함으로써, 안정한 동위체가 상술된 링커 영역에 도입된 핵산 분자가 합성될 수 있다.
하기에서, 실시예 등에 의해 본 발명을 자세하게 설명할 것이다. 그러나, 본 발명이 이것들에 한정되는 것은 아닌 점에 주목해야 한다.
실시예
(실시예 A1)
하기 도식 5 에 따라, 도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미도 포스포르아미다이트 (6) 를 합성했다. 화합물 (6) 은 본 발명의 상술된 모노머의 한 예이다. 하기 도식 5 에서 "Gly" 는 하기 식으로 나타낸 구조이고, 즉 글리신으로부터 아미노기의 하나의 수소 원자 및 카르복시기의 OH 를 제거한 구조를 갖는 원자단이다. 이하, 달리 언급되지 않는 한, "Gly" 는 하기 식의 구조를 보인다. 이하 도식 5 에서, Gly 의 NH 측은 Fmoc 또는 카르보닐 탄소와 결합하고, Gly 의 카르보닐 탄소 (CO) 측은 OH 또는 N 원자에 결합한다.
(Gly)
-HN-CH2-CO-
Figure pct00023
(1) 12-트리플루오로아세트아미도도데칸올 (화합물 1)
12-아미노도데칸올 (4.81 g, 23.9 mmol) 및 에틸 트리플루오로아세테이트 (6.79 g, 47.8 mmol) 의 에탄올 중 용액 (100 mL) 을 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응 혼합물을 감압 하 농축해 12-트리플루오로아세트아미도도데칸올 (1) (6.98 g, q.) 을 무색 시럽으로서 수득했다.
(2) 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데칸아민 (화합물 2)
화합물 1 (3.00 g, 10.08 mmol) 을 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조했다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (4.32 g, 12.1 mmol) 및 무수 피리딘 (50 mL) 을 공비 (azeotropy) 로써 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반했다. 메탄올 (10 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 용매를 약 30 mL 로 감압 하 실온에서 증발시켰다. 이후, 디클로로메탄 (200 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨으로 3 회 세정하고, 포화 염수 (brine) 로 추가 세정했다. 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 하 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 잔류물의 메탄올 중의 용액 (100 mL) 에, 수산화나트륨 (2.02 g, 50.40 mmol) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응 혼합물을 약 30 mL 로 감압 하에 농축하고, 물 (100 mL) 및 디클로로메탄 (200 mL) 을 첨가하고, 유기층을 분리했다. 분리된 유기층을 포화 염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조했다. 그 후, 건조제 (황산나트륨) 를 여과로써 분리하고, 용매를 감압 하 증발시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (95:5) + 0.05% 피리딘) 에 적용해, 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데칸아민 (2) (5.19 g, q.) 를 수득했다. 이하에, 12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데칸아민 (2) 의 기기 분석값을 나타낸다.
12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데칸아민 (2);
Figure pct00024
(3) Fmoc-글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (화합물 3)
Fmoc-글리신 (Fmoc-Gly-OH, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 에서 구입) (2.00 g, 6.73 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (1.66 g, 8.07 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (2.31 g, 16.14 mmol) 의 무수 N,N-디메틸포름아미드 중 용액 (70 mL) 에, 화합물 2 (4.07 g, 8.07 mmol) 의 무수 N,N-디메틸포름아미드 중 용액 (30 mL) 을 실온에서 아르곤 분위기 하 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하 하룻밤 교반했다. 생성된 침전물을 여과로써 분리하고 여과물을 감압 하 35℃ 에서 농축했다. 디클로로메탄 (200 mL) 을 수득된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기층을 분별하고, 황산나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (95:5) + 0.05% 피리딘) 로 적용해 Fmoc-글리실글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부틸도데칸아미드 (3) (5.88 g, q.) 을 무색 시럽으로서 수득했다.
(4) 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (화합물 4)
화합물 3 (5.88 g, 6.73 mmol) 에, N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 및 피페리딘 (4.8 mL) 을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응 혼합물 중 용매를 감압 하 증발시키고, 수득된 잔기를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (9:1) + 0.05% 피리딘) 에 적용해, 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (4) (3.44 g, 91%) 를 수득했다. 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (4) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (4);
Figure pct00025
(5) 히드록시도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (화합물 5)
화합물 4 (3.15 g, 5.62 mmol) 를, 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조하고, 12-히드록시도데칸산 (3.41 g, 6.74 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (1.29 g, 6.74 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (2.06 g, 13.48 mmol), 및 무수 디클로로메탄 (50 mL) 를 실온에서 아르곤 분위기 하 첨가하고, 혼합물을 10 분간 교반했다. 트리에틸아민 (2.05 g, 20.22 mmol) 을 그에 따라 수득된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하 교반했다. 디클로로메탄 (200 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고 추가로 1 회 포화 염수로 세정했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (95:5) + 0.05% 피리딘) 로써 정제해 히드록시도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (5) (2.97 g, 70%) 를 무색 시럽으로서 수득했다. 히드록시도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (5) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
히드록시도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미드 (5);
Figure pct00026
(6) 도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미도 포스포르아미다이트 (화합물 6)
화합물 5 (2.78 g, 3.76 mmol) 를 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조했다. 이어서, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (772 mg, 4.51 mmol) 를 첨가하고, 혼합물을 감압 하에 탈기하고, 아르곤 기체로 충전하고, 무수 아세토니트릴 (3 mL) 을 첨가했다. 나아가, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (1.36 g, 4.51 mmol) 의 무수 아세토니트릴-디클로로메탄 중 용액 (3 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 아르곤 분위기 하 교반했다. 디클로로메탄 (150 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 2 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고, 및 포화 염수로 1 회 더 세정했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압 하 증발시켰다. 잔류물을 아미노 실리카를 이용한 컬럼 크로마토그래피 (용리액: n-헥산-아세톤 (7:3) + 0.05% 피리딘) 에 적용해 도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미도 포스포르아미다이트 (6) (2.72 g, 77%, HPLC 98.5%) 를 수득했다. 도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미도 포스포르아미다이트 (6) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
도데칸아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시도데칸아미도 포스포르아미다이트 (6);
Figure pct00027
(실시예 B1) RNA 의 고체 상 합성
본 발명의 링커를 갖는 RNA (본 발명의 단일-가닥 핵산 분자) 를 합성했다. RNA 는 포스포로아미다이트 방법에 기초하여 핵산 합성기 (상표명: ABI Expedite (등록 상표) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems) 에 의해 3' 측에서 5'측을 향해 합성했다. 상술된 합성을 위해, RNA 포스포르아미다이트 (2'-O-TBDMSi, 상표명, Samchully Pharm. Co., Ltd.) 를 RNA 아미다이트로서 이용했다 (이하 동일함). 상술된 아미다이트를 통상의 방법으로써 탈보호화하고, 합성된 RNA 를 HPLC 로써 정제했다. 하기의 실시예에서, RNA 를 달리 지시되지 않는 한 동일한 방식으로 합성했다.
구체적으로, 상술된 도식 5 의 상술된 화합물 (6) 을 본 발명의 모노머로서 이용함으로써, 본 실시예의 RNA (Ex) 로서, 링커 영역 (Lx) 및 (Ly) 의 구조가 각각 하기 화학식 Lg 로 나타내어진 단일-가닥 RNA (ssRNA) 을 합성했다.
(Lg [Lx 또는 Ly 의 구조])
-O(CH2)11CO-Gly-NH(CH2)12O-
우선, 하기 SEQ ID NO: 1 로써 나타낸 서열의 RNA 를 합성했다. 그리고, 상술된 RNA 의 5'말단에, 상술된 화합물 6 을 연결했다. 그 다음에, 상술된 SEQ ID NO: 1 로써 나타낸 RNA 의 5'측에, 상술된 화합물 6 을 통해, 하기 SEQ ID NO: 2 로써 나타낸 서열의 RNA 를 연결했다. 더욱이, 상술된 SEQ ID NO: 2 로써 나타낸 RNA 의 5' 말단에, 상술된 화합물 6 을 연결했다. 나아가, 상술된 SEQ ID NO: 2 로써 나타낸 RNA의 5'측에, 상술된 화합물 6 을 통해 하기 SEQ ID NO: 3 로써 나타낸 서열의 RNA 를 연결하고, 실시예의 ssRNA 를 합성했다.
Figure pct00028
상기 기술된 바와 같이 합성한 실시예의 ssRNA 를, 이하, PK-0054 로 지칭한다. 상술된 PK-0054 은, 하기 SEQ ID NO: 4 에 나타낸 바와 같이, 5'측에서, 상술된 SEQ ID NO: 3 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA, 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA 가 상술된 순서로 나란히 배열되어, 상술된 SEQ ID NO: 3 의 RNA (Xc 에 해당) 및 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 이 링커 Lx (상술된 구조 Lg) 을 통해 연결되어, 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA (Yc 에 해당) 이 링커 Ly (상술된 구조 Lg) 을 통해 연결되어 있는 구조다. 또한, 하기 서열에 나타낸 바와 같이, 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA 서열은 상술된 SEQ ID NO: 1 및 3 의 RNA 서열과 상보적이다. 이것 때문에, 상술된 PK-0054 은 하기식에 나타낸 것 같이, 자가-어닐링하여 줄기 구조를 취한다. 하기 서열에 있어서, 밑줄그은 부분 ""GUUGUCAUACUUCUCAUGG" (SEQ ID NO: 5) 은 GAPDH 유전자의 발현 억제에 관여하는 영역이다.
Figure pct00029
PK-0054 의 발현 억제 영역 (SEQ ID NO:5)
Figure pct00030
상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA 을 대신해 하기 SEQ ID NO: 6 의 RNA 를 사용하고, 상술된 SEQ ID NO: 3 의 RNA 을 대신해 하기 SEQ ID NO: 7 의 RNA 를 사용하는 것 이외에 PK-0054 과 동일한 방식으로, 실시예의 다른 ssRNA 를 합성했다. 이것을, 이하, PK-0055이라고 한다.
Figure pct00031
상술된 PK-0055 은, 하기 SEQ ID NO: 8 에 나타낸 바와 같이, 5' 측에서, 상술된 SEQ ID NO: 7 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 6 의 RNA, 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA 가 상술된 순서로 나란히 배열되어, 상술된 SEQ ID NO: 7 의 RNA (Xc 에 해당) 및 상술된 SEQ ID NO: 6 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 이 링커 Lx (상술된 구조 Lg) 을 통해 연결되고, 상술된 SEQ ID NO: 6 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA (Yc 에 해당) 이 링커 Ly (상술된 구조 Lg) 을 통해 연결되어 있는 구조다. 또한, 하기 서열에 나타낸 바와 같이, 상술된 SEQ ID NO: 6 의 RNA 서열은 상술된 SEQ ID NO: 1 및 7 의 RNA 서열과 상보적이다. 이것 때문에, 상술된 PK-0055 은, 하기 식에 나타낸 바와 같이, 자가-어닐링을 수행해 줄기 구조를 취한다.
Figure pct00032
(실시예 A2)
하기 도식 6 에 따라, 부탄아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미도 포스포르아미다이트 (11) 를 합성했다. 화합물 (11) 은 본 발명의 상술된 모노머의 한 예이다. 추가로, 화합물 (11) 은 화합물 (6) 에 상응하며 (도식 5, 실시예 A1), 여기서 -CO-Gly-NH- 의 양쪽 말단에 직접 결합된 메틸렌 사슬은 상이한 탄소수를 가진다.
Figure pct00033

(1) Fmoc-글리신-부탄아미드 (화합물 7)
Fmoc-글리신 (4.00 g, 13.45 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (3.33 g, 16.15 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (4.94 g, 32.29 mmol) 의 무수 N,N-디메틸포름아미드 중 용액 (100 mL) 에, 4-아미노부탄올 (1.44 g, 16.15 mmol) 의 무수 N,N-디메틸포름아미드 중 용액 (30 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 아르곤 분위기 하에서 교반했다. 생성 침전물을 여과로써 분리하고, 여과물을 감압 하 농축했다. 디클로로메탄 (200 mL) 을 수득된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고, 포화 염수로 추가 세정했다. 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (95:5)) 에 적용시켜 Fmoc-글리신-부탄아미드 (7) (4.30 g, 87%) 를 수득했다. Fmoc-글리신-부탄아미드 (7) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
Fmoc-글리신-부탄아미드 (7);
Figure pct00034
(2) Fmoc-글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (화합물 8)
화합물 7 (4.20 g, 11.40 mmol) 를, 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조했다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (5.80 g, 17.10 mmol) 및 무수 피리딘 (80 mL) 을 잔류물에 공비로써 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반했다. 메탄올 (20 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30 분 교반하고, 용매를 감압 하 증발시켰다. 이후, 디클로로메탄 (200 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고 포화 염수로 추가 세정했다. 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증발시켜 미정제 Fmoc-글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (8) (11.40 g) 를 수득했다.
(3) 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (화합물 9)
미정제 화합물 8 (11.40 g, 16.99 mmol) 에, N,N-디메틸포름아미드 (45 mL) 및 피페리딘 (11.7 mL) 을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반했다. 반응 혼합물 중 용매를 감압 하 증발시키고, 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (9:1) + 0.05% 피리딘) 에 적용해 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (9) (4.90 g, 96%, 2 단계) 를 수득했다. 글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (9) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (9);
Figure pct00035
(4) 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (화합물 10)
화합물 9 (4.80 g, 10.70 mmol) 를 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조하고, 6-히드록시헥산산 (1.70 g, 12.84 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (2.46 g, 12.84 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (3.93 g, 25.69 mmol), 및 무수 디클로로메탄 (60 mL) 을 실온에서 아르곤 분위기 하 첨가하고, 혼합물을 10 분동안 교반했다. 트리에틸아민 (3.90 g, 38.53 mmol) 을 이로써 수득된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 아르곤 분위기 하에서 교반했다. 디클로로메탄 (200 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고, 포화 염수로 추가 1 회 세정했다. 유기층을 분리하고 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄-메탄올 (95:5) + 0.05% 피리딘) 에 적용해 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (10) (4.80 g, 80%) 를 수득했다. 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (10) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미드 (10);
Figure pct00036
(5) 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미도 포스포르아미다이트 (화합물 11)
화합물 10 (4.70 g, 8.35 mmol) 을 무수 피리딘으로 3 회 공비 건조했다. 이후, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (1.72 g, 10.02 mmol) 를 첨가하고, 혼합물을 감압 하에서 탈기하고, 아르곤 기체로 충전하고, 무수 아세토니트릴 (5 mL) 을 첨가했다. 나아가, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (3.02 g, 10.02 mmol) 의 1:1 무수 아세토니트릴-디클로로메탄 혼합물 중의 용액 (4 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 아르곤 분위기 하에서 교반했다. 디클로로메탄 (150 mL) 을 수득된 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 2 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하고 추가로 1 회 포화 염수로 세정했다. 유기층을 분리하고 황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 아미노 실리카를 이용한 컬럼 크로마토그래피 (용리액: n-헥산-아세톤 (3:2) + 0.1% 트리에틸아민) 에 적용해 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미도 포스포르아미다이트 (11) (4.50 g, 71%, HPLC 98.2%) 를 수득했다. 히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미도 포스포르아미다이트 (11) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
히드록시헥산아미도글리신-4,4'-디메톡시트리틸옥시부탄아미도 포스포르아미다이트 (11);
Figure pct00037
(실시예 A3)
하기 도식 7 에 따라, 리신 유도체인 모노머 (11) 을 합성했다. 하기 도식 7 에서, "Tfa" 는 트리플루오로아세틸기이다.
Figure pct00038
(1) 화합물 (13) 의 합성
6-히드록시헥산산 (화합물 12) (6 g, 15.1 mmol) 의 피리딘 중 용액 (124 mL) 에, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (20 g, 1.3 eq.) 및 디메틸아미노피리딘 (0.5 g, 0.1 eq.) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반했다. 반응 완료 후, 메탄올 (10 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 10 분 동안 교반하고 용매를 증발시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 3 회 TEAA 버퍼 (pH 8-9) 로 세정하고, 포화 염수로 1 회 세정했다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증발시켜, 화합물 13 (31 g, 피리딘 함유) 을 담황색 오일성 물질로서 수득했다.
(2) 화합물 (15) 의 합성
화합물 14 (2.7 g, 7.9 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (1.9 g, 1.2 eq.), 및 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (2.6 g, 2.4 eq.) 의 아세토니트릴 중 용액 (45 mL) 에, 4-아미노-1-부탄올 (0.86 g, 1.2 eq.) 의 아세토니트릴 중 용액 (5 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반했다. 반응 완료 후, 침전물을 여과로써 수집하고, 여과물 중 용매를 증발기로써 증발시켰다. 디클로로메탄을 수득된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 아세테이트 버퍼 (pH 4) 로 세정하고 포화 수성 중탄산나트륨으로 3 회 세정했다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 = 10/1) 로써 정제해 화합물 (15) (2.8 g, 수율 85%) 을 백색 고체로서 수득했다. 화합물 (15) 의 기기 분석값은 하기에 나타낸다.
화합물 (15);
Figure pct00039
(3) 화합물 (16) 의 합성
화합물 15 (2.5 g, 6.1 mmol) 를 염산/테트라히드로푸란 용액 (4 M, 45 mL) 중 실온에서 2 시간 교반했다. 반응 완료 후, 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 에탄올 중에 용해하고 톨루엔으로 공비했다. 용매를 증발시켜 화합물 (16) (1.9 g) 을 백색 고체로서 수득했다. 화합물 (16) 의 기기 분석값은 하기에 나타낸다.
화합물 (16);
Figure pct00040
(4) 화합물 (17) 의 합성
화합물 13 (피리딘-함유, 24 g, 35.5 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (8.8 g, 1.2 eq.), 및 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트 (7.2 g, 1.5 eq.) 의 용액 (150 mL) 에, 트리에틸아민 (4.5 mL, 0.9 eq.) 을 첨가하고, 화합물 16 (10 g, 0.9 eq.) 의 N,N-디메틸포름아미드 중 용액 (30 mL) 을 추가로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반했다. 반응 완료 후, 침전물을 여과로써 수집하고, 여과물 중 용매를 증발기로써 증발시켰다. 디클로로메탄을 수득된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 3 회 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 = 20/1 + 0.05% 피리딘) 로써 정제해 화합물 (17) (16 g, 수율 70%) 을 담황색 고체로서 수득했다. 화합물 (17) 의 기기 분석값은 하기에 나타낸다.
화합물 (17);
Figure pct00041
(5) 화합물 (18) 의 합성
아세토니트릴에 의해 공비 건조된 화합물 (17) (1.26 g, 1.73 mmol) 의 무수 아세토니트릴 중의 용액 (3.5 mL) 에, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (394 mg, 1.3 eq.) 및 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (700 mg, 1.3 eq.) 를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5 시간 동안 교반했다. 디클로로메탄을 첨가하고, 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨 및 포화 염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하고 용매를 증발시켰다. 수득된 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (아미노 실리카, 용리액: n-헥산/에틸 아세테이트 = 2/3) 로써 정제해 화합물 (18) (1.3 g, 수율 78%) 을 백색 고체로서 수득했다. 화합물 (18) 의 기기 분석값을 하기에 나타낸다.
화합물 (18);
Figure pct00042
(실시예 B3) RNA 의 고체 상 합성
상술된 도식 5 의 상술된 화합물 (6) 대신에, 상술된 도식 7 의 상술된 화합물 (18) 을 본 발명의 모노머로서 사용하는 것, 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA 대신 구아노신을 사용하는 것, 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA 대신 하기 SEQ ID NO: 63 의 RNA 를 사용하는 것, 및 상술된 SEQ ID NO: 3 의 RNA 대신 하기 SEQ ID NO: 64 의 RNA 를 사용하는 것을 제외하고는 상술된 실시예 B1 과 동일한 방식으로 하여, 실시예의 RNA 를 고체 상 합성했다. 이렇게 하여 합성한 실시예의 RNA 는, 링커 영역 (Lx) 및 (Ly) 의 구조가 각각 하기 화학식 Ll 으로 나타내어진 단일-가닥 RNA (ssRNA) 이다. 본 실시예의 RNA 에 있어서의 링커 영역 (Lx) (하기 화학식 Ll 에 나타냄) 을 이하에 있어서, 상술된 실시예 B1 에 있어서의 링커 영역 (Lx) (상술된 화학식 Lg 로 나타냄) 과 구별하기 위해서 "Lx'" 라고 지칭한다. 마찬가지로, 본 실시예의 RNA 에 있어서의 링커 영역 (Ly) (하기 화학식 L1 에 나타냄) 은 이하에 있어서 상술된 실시예 B1 에 있어서의 링커 영역 (Ly) (상술된 화학식 Lg 로 나타냄) 과 구별하기 위해서 "Ly'" 라고 지칭한다.
Figure pct00043
(Ll [Lx' 또는 Ly' 의 구조])
-O(CH2)5CO-Lys-NH(CH2)4O-
상술된 링커의 구조 L1 에서, "Lys" 는 하기 화학식으로 나타낸 구조이다.
Figure pct00044
따라서, 상술된 링커의 구조 L1 은 하기 화학식으로 나타낸다.
Figure pct00045
상기 언급된 바와 같이 합성된 상기 실시예의 ssRNA 는 이하 PK-0100 로 지칭된다. 상술된 PK-0100 는, 하기 SEQ ID NO: 65 에 나타낸 바와 같이, 5'측에서, 상술된 SEQ ID NO: 64 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 63 의 RNA 및 구아노신이 상술된 순서로 나란히 정렬되어, 상술된 SEQ ID NO: 64 의 RNA (Xc 에 해당) 및 상술된 SEQ ID NO: 63 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 이 링커 Lx' (상술된 구조 L1) 을 통해 연결되고, 상술된 SEQ ID NO: 63 의 RNA (내부 영역 Z 에 해당) 및 구아노신 (Yc 에 해당) 가 링커 Ly'（상술된 구조 Ll) 을 통해 연결되어 있는 구조다. 또한, 하기 서열에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 63 로 나타낸 상술된 RNA 서열은 구아노신 및 SEQ ID NO: 64 로 나타낸 상술된 RNA 서열과 상보적이다. 이로써, 상술된 PK-0100 는 하기 식에 나타낸 바와 같이 자가-어닐링을 수행하여 줄기 구조를 취한다.
Figure pct00046
(참고예 A1)
하기 도식 8 에 따라, 프롤린 골격을 포함하는 단일-가닥 핵산의 합성 원료인 모노머를 제조했다.
Figure pct00047
(1) Fmoc-히드록시아미도-L-프롤린 (화합물 104)
상술된 도식 8 의 출발 물질인 화합물 102 (Fmoc-L-프롤린) 은, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd 에서 구입했다. 상기 화합물 102 (10.00 g, 29.64 mmol), 4-아미노-1-부탄올 (3.18 g, 35.56 mmol), 및 1-히드록시벤조트리아졸 (10.90 g, 70.72 mmol) 을 함께 혼합했다. 상술된 혼합물을 감압 하에서 탈기하고 아르곤 기체로 충전했다. 무수 아세토니트릴 (140 mL) 을 상술된 혼합물에 실온에서 첨가하고, 디시클로헥실카르보디이미드 (7.34 g, 35.56 mmol) 의 무수 아세토니트릴 중 용액 (70 mL) 를 여기에 추가로 첨가했다. 이후, 이를 15 시간 동안 실온에서 아르곤 분위기 하 교반했다. 반응 완료 후, 생성된 침전물을 여과로써 제거하고 수집된 여과물 중 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 디클로로메탄 (200 mL) 을 수득된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨 (200 mL) 으로 세정했다. 이어서, 유기층을 수집하고 황산마그네슘으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과하고, 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 디에틸 에테르 (200 mL) 를 잔류물에 첨가하여, 잔류물을 분말화했다. 이렇게 수득한 분말을 여과로써 수집했다. 따라서, 무색 분말 형태인 화합물 104 를 수득했다 (10.34 g, 수율 84%). 상술된 화합물 104 에 대한 기기 분석 결과는 하기에 나타낸다.
Fmoc-히드록시아미도-L-프롤린 (104);
Figure pct00048
(2) Fmoc-t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (화합물 118)
Fmoc-히드록시아미도-L-프롤린 (화합물 104) (2.00 g, 30 mmol), t-부틸-디메틸실릴 클로라이드 (1.11 g, 35 mmol), 및 이미다졸 (10.90 g, 71 mmol) 을 합께 혼합했다. 상술된 혼합물을 감압 하 탈기하고 아르곤 기체로 충전했다. 무수 아세토니트릴 (20 mL) 을 상술된 혼합물에 실온에서 첨가하고, 이를 하룻밤 실온에서 아르곤 분위기 하 교반했다. 반응 완료 후, 디클로로메탄 (150 mL) 을 상술된 혼합물에 첨가했다. 생성된 혼합물을 물로 3 회 세정한 다음 포화 염수로 세정했다. 유기층을 수집하고 황산마그네슘으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과하고, 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: CH2Cl2:CH3OH = 95:5) 에 적용했다. 이후, 무색 시럽 형태의 화합물 118 을 수득했다 (2.35 g, 수율 92%). 상술된 화합물 118 과 관련하여 기기 분석 결과를 하기에 나타낸다.
Fmoc-t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (118);
Figure pct00049
(3) t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (화합물 119)
상기 수득된 상술된 Fmoc-t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (화합물 118) (1.18 g, 2.5 mmol) 에, 무수 아세토니트릴 (5 mL) 및 피페리딘 (2.4 mL) 을 첨가하고, 이를 1 시간 동안 실온에서 교반했다. 반응 완료 후, 아세토니트릴 (50 mL) 을 상술된 혼합물에 첨가하고, 불용물을 여과로써 제거했다. 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: CH2Cl2:CH3OH = 9:1) 에 적용했다. 따라서, 무색 시럽 형태의 화합물 119 를 수득했다 (0.61 g, 수율 90%). 상술된 화합물 119 와 관련된 기기 분석 결과는 하기에 나타낸다.
t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (119);
Figure pct00050
(4) t-부틸-디메틸실록시아미도히드록시아미도-L-프롤린 (화합물 120)
상기 수득된 상술된 t-부틸-디메틸실록시아미도-L-프롤린 (화합물 119) (550 mg, 1.8 mmol), 6-히드록시헥산산 (300 mg, 2.3 mmol), EDC (434 mg, 2.3 mmol), 및 1-히드록시벤조트리아졸 (695 mg, 4.5 mmol) 의 무수 디클로로메탄 중 용액 (20 mL) 을 혼합했다. 트리에틸아민 (689 mg, 6.8 mmol) 을, 실온에서 아르곤 분위기 하 상술된 혼합물에 첨가한 다음, 이를 하룻밤 실온에서 아르곤 분위기 하에서 교반했다. 상술된 혼합물을 포화 염수로 세정했다. 유기층을 수집하고, 상술된 유기층을 황산나트륨으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과했다. 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: CH2Cl2:CH3OH = 9:1) 에 적용했다. 따라서, 무색 시럽 형태의 화합물 120 을 수득했다 (696 mg, 수율 92%). 상술된 화합물 120 과 관련하여 기기 분석 결과를 하기에 나타낸다.
t-부틸-디메틸실록시아미도히드록시아미도-L-프롤린 (120);
Figure pct00051
MS(FAB+): m/z 415(M++1).
(5) DMTr-히드록시디아미도-L-프롤린 (화합물 121)
상기 수득된 상술된 t-부틸-디메틸실록시아미도히드록시아미도-L-프롤린 (화합물 120) (640 mg, 1.54 mmol) 을, 무수 피리딘 (1 mL) 과 혼합하고, 이것을 실온에서 공비 건조시켰다. 수득된 잔류물에, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (657 mg, 1.85 mmol), DMAP (2 mg), 및 무수 피리딘 (5 mL) 을 첨가하고, 이를 4 시간 동안 실온에서 교반했다. 이후, 여기에 메탄올 (1 mL) 을 첨가하고, 이를 30 분 동안 실온에서 교반했다. 상술된 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 이를 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기층을 수집하고 황산나트륨으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과했다. 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물에, 무수 아세토니트릴 (5 mL) 및 1 mol/L 테트라부틸암모늄 플루오라이드-함유 테트라히드로푸란 용액 (1.42 mL, 테트라부틸암모늄 플루오라이드 1.42 mmol) 을 첨가하고, 이를 하룻밤 실온에서 교반했다. 반응 완료 후, 에틸 아세테이트 (100 mL) 를 상술된 혼합물에 첨가했다. 생성된 혼합물을 물로 세정한 다음 포화 염수로 세정했다. 유기층을 수집하고 황산나트륨으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과했다. 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용리액: CH2Cl2:CH3OH = 95:5, 0.05% 피리딘 함유) 에 적용했다. 따라서, 무색 시럽 형태의 화합물 121 을 수득했다 (680 mg, 수율 73%). 상술된 화합물 121 과 관련된 기기 분석 결과를 하기에 나타낸다.
DMTr-히드록시디아미도-L-프롤린 (121);
Figure pct00052
(6) DMTr-디아미도-L-프롤린 아미다이트 유형 B (화합물 122)
상기 수득된 상술된 DMTr-히드록시디아미도-L-프롤린 (화합물 121) (637 mg, 1.06 mmol) 을 무수 아세토니트릴과 혼합하고, 생성된 혼합물을 실온에서 공비 건조시켰다. 수득된 잔류물에, 디이소프로필암모늄 테트라졸리드 (201 mg, 1.16 mmol) 를 첨가하고, 생성된 혼합물을 감압 하 탈기하고 아르곤 기체로 충전했다. 무수 아세토니트릴 (1 mL) 을 상술된 혼합물에 첨가하고, 여기에, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (350 mg, 1.16 mmol) 의 무수 아세토니트릴 용액 (1 mL) 을 추가로 첨가했다. 상기 혼합물을 4 시간 동안 실온에서 아르곤 분위기 하 교반했다. 상술된 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 이를 포화 수성 중탄산나트륨 및 포화 염수로 세정했다. 유기층을 수집하고 황산나트륨으로 건조했다. 이후, 상술된 유기층을 여과했다. 수득된 여과물 중 용매를 감압 하 증발시켰다. 수득된 잔류물을 아미노 실리카 겔을 필터로서 이용한 컬럼 크로마토그래피 (용리액: 헥산:아세톤 = 7:3) 에 적용했다. 이에 따라, 무색 시럽 형태의 화합물 122 를 수득했다 (680 mg, 순도: 95%, 수율 76%). 상술된 화합물 122 에 관한 기기 분석 결과를 하기에 나타낸다.
DMTr-디아미도-L-프롤린 아미다이트 (122);
Figure pct00053
(참고예 B1) RNA 의 고체 상 합성
상술된 도식 5 의 상술된 화합물 6 (본 발명에서 모노머) 대신 상술된 화합물 122 을 이용하고, 링커 영역 (Lx) 및 (Ly) 에 상당하는 부분의 구조는 상술된 Lg 대신 하기 Lp 인 점을 제외하고는 상술된 실시예 B1 의 PK-0054 에서와 동일한 방식으로, 단일-가닥 RNA (ssRNA) 을 합성했다.
Figure pct00054
상기한 바와 같이 합성한 ssRNA 를, 이하, PK-0004이라고 한다. 상술된 PK-0004 은, 하기 SEQ ID NO: 9 에 나타낸 바와 같이, 5'측에서, 상술된 SEQ ID NO: 3 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 2 의 RNA, 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA 가 상술된 순서로 나란히 정렬되어, 각 RNA 가, 상술된 구조 Lp 을 통해 연결되어 있는 구조다. 또한, 상술된 실시예 B1 에서 설명한 바와 같이, 상술된 SEQ ID NO: 2의 RNA 서열은, 상술된 SEQ ID NO: 1 및 3 로 나타낸 RNA 서열과 상보적이다. 이것 때문에, 상술된 PK-0004 은, 하기 식에 나타낸 바와 같이, 자가-어닐링을 수행해 줄기 구조를 취한다. 상술된 PK-0054 와 같이, 밑줄 친 부분 GUUGUCAUACUUCUCAUGG (SEQ ID NO: 5) 은 GAPHD 유전자 발현의 억제에 관여된 영역이다.
Figure pct00055
PK-0004 의 발현 억제 영역 (SEQ ID NO: 5)
Figure pct00056
하기 SEQ ID NO: 6 의 RNA 를, SEQ ID NO: 2 로써 나타낸 상술된 RNA 대신에 사용하고, 하기 SEQ ID NO: 7 로 나타낸 RNA 를 SEQ ID NO: 3 로 나타낸 상술된 RNA 대신에 이용한 점을 제외하고는 PK-0004 에서와 동일한 방식으로, 참고예의 다른 ssRNA 를 합성했다. 이하, 이것을 PK-0003 으로서 지칭한다.
Figure pct00057
상술된 PK-0003 은, 하기 SEQ ID NO: 10 로써 나타낸 바와 같이, 5'측에서, 상술된 SEQ ID NO: 7 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 6 의 RNA, 및 상술된 SEQ ID NO: 1 의 RNA 가 상술된 순서로 나란히 정렬되어, 각 RNA 가, 상술된 구조 Lp 를 통해 연결되어 있는 구조다. 또한, 상술된 실시예 B1 에서의 PK-0055 와 같이, SEQ ID NO: 6 으로써 나타낸 상술된 RNA 서열은 SEQ ID NO: 1 및 7 로써 나타낸 상술된 RNA 서열과 상보적이다. 이 때문에, 상술된 PK-0003 는 하기 식에 나타낸 바와 같이 자가-어닐링을 수행하여 줄기 구조를 취한다.
Figure pct00058
(참고예 B2)
상술된 도식 7 의 상술된 화합물 18 (본 발명의 모노머) 대신 상술된 화합물 22 을 이용하고, 링커 영역 (Lx) 및 (Ly) 에 상당하는 부분의 구조가 상술된 Lｌ 대신, 상술된 Lp (상술된 참고예 B1) 인 점 이외는 상술된 실시예 B3 의 PL-0100 과 동일한 방식으로, 단일-가닥 RNA (ssRNA) 을 합성했다.
상기한 바와 같이 합성한 ssRNA 를, 이하, PK-0071 로 지칭한다. 상술된 PK-0061 은, 하기 SEQ ID NO: 66 로 나타낸 바와 같이, 5'측에서, 상술된 SEQ ID NO: 64 의 RNA, 상술된 SEQ ID NO: 63 의 RNA, 및 구아노신이 상술된 순서로 나란히 정렬되어, 각 RNA 및 구아노신이, 상술된 구조 Lp 을 통해 연결되어 있는 구조다. 나아가, 상술된 실시예 B3 에서 설명된 바와 같이, SEQ ID NO: 63 의 상술된 RNA 서열은 구아노신 및 SEQ ID NO: 64 의 상술된 RNA 서열과 상보적이다. 이것으로 인해, 상술된 PK-0071 는 하기 식에 나타낸 바와 같이 자가-어닐링을 수행하여 줄기 구조를 취한다.
Figure pct00059
(실시예 C1)
HCT116 세포에서 GAPDH 유전자 발현 상 억제 효과
본 발명의 RNA 를 이용하고, 시험관 내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 조사했다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA (Ex) 로서, 상술된 실시예 B1 의 ssRNA (PK-0054 및 PK-0055)을 사용했다. 또한, 참고예의 RNA 로서, 상술된 참고예 B1 의 ssRNA (PK-0004 및 PK-0003)도 사용했다. 상술된 각 RNA 를, 원하는 농도 (10 μmol/L) 에 달성되도록, 주사용 증류수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., 이하 동일) 에 용해하여, RNA 용액을 제조했다.
세포는, HCT116 세포 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) 을 사용하고, 배지는, 10% FBS-함유 McCoy's 5A (Invitrogen) 배지를 사용했다. 배양 조건은, 37℃ 및 5% CO2로 설정했다.
우선, HCT116 세포를, 상술된 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을, 24-웰 플레이트에, 400μL 씩, 2×104 세포/웰의 밀도가 달성되도록 배분했다. 상술된 웰 중의 세포를 또 다른 24 시간 배양하였다. 그 후, 세포를 상술된 RNA 로, 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 이용해, 상술된 트랜스펙션 시약의 첨부 프로토콜에 따라, 트랜스펙션 했다. 구체적으로는, 트랜스펙션을 웰 당 조성을 하기와 같이 설정하여 수행했다. 상술된 웰에 있어서, 상술된 RNA 의 최종 농도는, 1 nmol/L, 5 nmol/L, 또는 25 nmol/L 로 설정했다.
표 1
트랜스펙션 후, 상술된 웰 중의 세포를 48 시간 배양한 후, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Netherlands) 을, 이의 첨부된 프로토콜에 따라 이용해, RNA 를 회수했다. 후속해서, 역전사효소 (상표명: SuperScript III, Invitrogen) 을, 첨부의 프로토콜에 따라 이용하여 상술된 RNA 로부터 cDNA 를 합성했다. 이어서, 하기에 나타낸 바와 같이, 합성한 상술된 cDNA 를 주형으로서 이용해 PCR 를 행하고, GAPDH 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정했다. 상술된 GAPDH 유전자의 발현량은, 상술된 β-액틴 유전자의 발현량을 참조로 하여 정규화하였다.
상술된 PCR 는, 시약으로서 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (상표명, Roche), 기기로서 Light Cycler DX400 (상표명, Roche) 을 사용해 실시했다 (이하, 동일). 상술된 GAPDH 유전자 및 β-액틴 유전자의 증폭에는, 제 각기, 이하의 프라이머 세트를 사용했다.
GAPDH 유전자용 PCR 프라이머 세트
Figure pct00061
β -액틴 유전자용 프라이머 세트
Figure pct00062
대조군 1 로서, 상술된 (B) 액 100μL 만을 첨가한 세포에 대해서도, 유전자발현량을 측정했다 (-). 또한, 대조군 2 로서, 트랜스펙션에 있어서, 상술된 RNA 용액을 첨가하지 않고 상술된 (A) 1.5μL 과 상술된 (B) 를 합계 100μL 가 되도록 첨가한 점 이외에는, 상기와 동일하게 처리한 세포에 대해서도, 유전자 발현량을 측정했다 (mock).
정규화된 GAPDH 유전자 발현량에 대해서, 대조군 (-) 의 세포의 발현량을 1로서 설정한 것을 기초로, 각 RNA 를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 측정했다.
(2) 결과
이것들의 결과를 도 4 에 나타낸다. 도 4 는 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이며, 세로축은, 상대 유전자 발현량이다.
도 4 에 나타낸 바와 같이, PK-0004 및 PK-0054 은, 인간 GAPDH 를 표적하는 서열을 혼입하고 있기 때문에, 발현 억제 효과를 나타냈다. 이와 반대로, 서열이 다른 PK-0003 및 PK-0055 은, PK-0004 및 PK-0054 과 비교시 낮은 발현 억제 효과가를 나타냈다. 다시 말해, 이것들의 RNA는, 표적 염기 서열에 대한 반응 특이성이 뛰어났다.
또한, PK-0054 은 ssRNA (단일-가닥 RNA) 이기 때문에, siRNA (이중 가닥 RNA) 과 비교시, 이것은 용이하고 효율적으로 제조가능하므로, 또한 취급에 있어서 뛰어났다.
나아가, 실시예의 ssRNA 인 PK-0054 은, 참고예의 ssRNA 인 PK-0004 과도 동등한 발현 억제 효과를 나타냈다. 합성의 출발 원료가, PK-0004 에서는 L-프롤린인 것에 대해, PK-0054 에서는 글리신이며, PK-0054 의 원료가 훨씬 저렴해서 입수하기 쉽다. 따라서, 제조의 편리성 및 가격에 있어서, 이것이 압도적으로 유리하다.
(실시예 C2) 반딧불이 루시퍼라아제 유전자의 발현 억제 효과
본 발명의 RNA 를 사용하여, 시험관 내 반딧불이 루시퍼라아제 유전자의 발현 억제를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
실시예의 RNA (Ex) 로서, 상술된 실시예 B3 의 ssRNA (PK-0100) 을 사용했다. 참고예의 RNA 로서, 상술된 참고예 B2 의 ssRNA(PK-0071) 도 사용했다. 상술된 각 RNA 를, 원하는 농도 (10μmol/L) 에 도달하도록, 주사용 증류수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 이하 동일) 에 용해해, RNA 용액을 제조했다.
세포는, 반딧불이 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 (pGL3Luc) 을 사용하고, RPMI 1640 (Invitrogen) + 10% FCS 를 배지로서 사용하였다, 배양 조건은, 37℃ 및 5% CO2 로 설정했다.
반딧불이 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 (pGL3Luc) 의 배양은, 보다 구체적으로는, 하기와 같다.
[1] 상술된 세포를 배지 중에서 배양하고, 그 배양액을 96-웰 플레이트에 50μL 씩 1×104 세포/웰이 되도록 배분했다.
[2] 다음에, 웰 중의 상술된 세포를, 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 첨부 프로토콜에 따라 사용해, RNA 샘플로 트랜스펙션했다. 구체적으로는, 웰 당 상술된 RNA샘플과 상술된 트랜스펙션 시약과의 복합체 50μL 을 전량을 100μL 가 되게 첨가하고, 상술된 RNA 샘플의 최종 농도를 0.1, 1 또는 10 nmol/L 로 했다. 대조군 1 로서, 상술된 RNA 샘플 및 상술된 트랜스펙션 시약을 첨가하지 않은 세포 (-) 를 준비하고, 대조군 2 로서, 트랜스펙션에 있어서 상술된 RNA 샘플을 첨가하지 않았으나 상술된 트랜스펙션 시약을 단독으로 첨가한 세포 (mock) 을 준비했다.
[3] 상술된 트랜스펙션 후, 24 시간 동안 세포를 추가 배양했다.
루시퍼라아제 활성 측정은, 아래와 같이 측정했다. 상기 루시퍼라아제 활성 측정은, 반딧불이 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 (pGL3Luc) 을 보유하는 반딧불이 루시퍼라아제 유전자의 발현 억제 효과의 측정이다.
[1] 우선, Steady-Glo (상표명) Luciferase Assay System (Promega) 을 사용하고, 첨부의 프로토콜에 따라 루시퍼라아제에 의한 발광 강도를, 멀티라벨 리더 ARVO X2 (PerkinElmer) 로써 측정했다.
[2] 상술된 [1] 의 루시퍼라아제 활성 측정 결과는, RNA 샘플 및 트랜스펙션 시약을 첨가하지 않은 세포 (-) (상술된 대조군 1, 비첨가 세포군) 의 상대 활성을 1 로서 제시하였다.
(2) 결과
이것들의 결과를, 도 12 에 나타낸다. 도 12 는, 루시퍼라아제 활성의 상대값을 나타내는 그래프이다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, PK-0100 (실시예의 ssRNA) 에 따르면, 루시퍼라아제의 상대 활성을 약 0.7 ~ 약 0.3 까지 저감시킬 수 있었다. 다시 말해, PK-0100 은, 반딧불이 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 (pGL3Luc) 이 보유하는 반딧불이 루시퍼라아제 유전자에 대하여, 뛰어난 발현 억제 효과를 보였다. 또한, PK-0100 은 참고예의 ssRNA 인 PK-0071 에 대하여도 동등이상의 발현 억제 효과를 보였다.
(참고예 1)
쌍이 아닌 염기의 위치가 다른 ssRNA 를 사용해, 시험관 내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
RNA 로서, 도 5 로써 나타낸 ssRNA 를 사용했다. 도 5 에 있어서, 오른쪽 끝의 번호는, 서열 식변 번호를 지시한다. 도 5 에 있어서, 5'측에서, 소문자 밑줄의 영역은, 상술된 영역 (Xc) 을; 대문자 밑줄의 영역은 상술된 내부 영역 (Z) 을; 소문자 밑줄의 영역은, 상술된 영역 (Yc) 을 지시한다. 상술된 Xc 과 상술된 Z 와의 영역은 링커 영역 (Lx) 이며, 상술된 Z 와 상술된 Yc 와의 영역은, 링커 영역 (Ly) 이다. 또한, "Xc/Yc" 은, 상술된 영역 (Xc) 의 염기장 (Xc) 과 상술된 영역 (Yc) 의 염기장 (Yc) 과의 비율을 지시한다. 도 5 에 있어서, "＊" 는 쌍이 아닌 염기를 지시한다.
각 ssRNA 에서, 내부 영역 (Z) 의 염기장을 26 염기, 링커 영역 (Lx)의 염기장을 7 염기 및 링커 영역 (Ly) 의 염기장을 4 염기로 설정했다. NK-0036 및 NK-0040 에서, 상술된 영역 (Xc) 과 상술된 영역 (Yc) 과의 합계 염기수 (Xc+Yc) 는 26 염기로 설정했다. NK-0036 및 NK-0040 이외의 ssRNA 에서는, 상술된 영역 (Xc) 과 상술된 영역 (Yc) 과의 합계 염기수 (Xc+Yc) 을 25 염기로 설정했다. 이때, 이들 조건 하에서, 상술된 영역 (Xc) 및 상술된 영역 (Yc) 의 염기장을 변화시켰다. 그 결과, NK-0036 및 NK-0040 은, 쌍이 아닌 염기가 없는 분자가 되었다. 또한, NK-0036 및 NK-0040 이외의 각 ssRNA 는, 상술된 내부 영역 (Z) 이 이중 가닥을 형성하지 않는 단지 1 개의 쌍이 아닌 염기를 포함하고, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 상술된 쌍이 아닌 염기의 위치를 3'측에서 5'측으로 변동시킨 분자가 되었다.
상술된 RNA 각각을 사용한 것 이외는 상술된 실시예 C1 에서와 같은 방식으로, HCT116 세포로의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR 를 행하고, GAPDH 유전자의 상대적 발현량을 측정했다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 10 nmol/L 로 설정했다.
(2) 결과 및 고찰
이들의 결과를, 도 6 에 나타낸다. 도 6 은 마지막 농도 10 nmol/L 의 각 RNA 를 사용했을 경우에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 6 에서 볼 수 있는 바와 같이, 상술된 5'측 영역 (Xc) 및 상술된 3'측 영역 (Yc) 의 길이를 변화시킨 어느쪽의 ssRNA 에 대해서도, GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있었다.
특히, 상술된 영역 (Xc) 의 염기장과 상술된 영역 (Yc) 의 염기장의 차이가 커지는 것에 따라, 상대적으로 유전자의 발현량이 저하하고, 즉 발현 억제 활성이 증가한 것이 확인되었다. 다시 말해, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 쌍이 아닌 염기의 위치를 상술된 내부 영역의 중앙에서도, 5'측 또는 3'측에 더 가까이 배치한 만큼, 상술된 발현 억제 활성을 향상할 수 있는 것을 알았다.
(참고예 2)
쌍이 아닌 염기의 위치가 다른 ssRNA 를 사용하고, 시험관 내에 있어서의 TGF-β1 유전자의 발현 억제 효과를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
RNA 로서, 이하에 나타낸 ssRNA 를 사용했다. 하기 서열에 있어서,"＊"은, 쌍이 아닌 염기를 지시한다.
Figure pct00063
(1.2) 유전자의 발현 억제
동결 보존한 상술된 RNA 를, 20μmol/L 의 농도가 달성되도록, 주사용 증류수에 용해해 RNA 용액을 제조했다. 그리고, 상술된 RNA 용액을 사용한 점을 제외하고는 상술된 실시예 C1 에서와 동일한 방식으로, Hepal-6 세포로의 상술된 ssRNA 의 트랜스펙션, RNA 회수, cDNA합성 및 PCR 를 행했다. TGF-β1 유전자의 상대적 발현량을 측정했다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 1 nmol/L 로 설정했다.
(2) 결과
이것들의 결과를, 도 7 에 나타낸다. 도 7 은 TGF-β1 유전자 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 7 에서 볼 수 있는 바와 같이, 어느 쪽의 ssRNA 도, 유전자발현 억제 활성을 보였다. 또한, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3' 말단에서 2번째 및 3번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0055 및 NK-0062각각은, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3' 말단에서 4 번째 및 5 번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0033 및 NK-0061 각각 보다도 높은 발현 억제 활성을 보였다. 이 결과는, 상이한 표적 유전자를 타겟하는 상술된 참고예 1 에서 보인 거동과 일치했다.
(참고예 3)
쌍이 아닌 염기의 위치가 다른 ssRNA 를 사용하고, 시험관 내에 있어서의 LAMA1 유전자의 발현 억제를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
RNA 로서, 이하에서 나타낸 ssRNA 를 사용했다. 하기 서열에 있어서, "＊"은 쌍이 아닌 염기를 지시한다.
Figure pct00064
상술된 RNA 를 사용한 것 이외에는 상술된 실시예 C1 과 동일한 방식으로, 293 세포로의 트랜스펙션을 행하고, 상술된 세포를 48 시간 배양했다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 10 nmol/L 로 설정했다. 그리고, 프라이머로서, 이하의 LAMA1 유전자용 프라이머 세트를 사용한 것 이외에는 상술된 실시예 C1 과 동일한 방식으로, RNA 회수, cDNA합성 및 PCR 를 행하고, LAMA1 유전자의 발현량 및 내부표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정했다. 상술된 LAMA1 유전자의 발현량은, 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 참조하여 정규화했다.
LAMA1 유전자용 프라이머 세트
Figure pct00065
대조군 1 (-) 및 대조군 2 (mock) 의 발현량을 또한 상술된 실시예 C1 과 동일한 방식으로 측정했다. 정규화된 LAMA1 유전자 발현량에 대해서, 대조군 (-)의 세포의 발현량을 1 로서 한 점을 기초로, 각 RNA 를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구했다.
(2) 결과
이것들의 결과를 도 8 에 나타낸다. 도 8 은 293 세포에 있어서의 LAMA1유전자의 발현량의 상대값을 나타내는 그래프이다. 도 8 에서 볼 수 있는 바와 같이, 어느쪽의 ssRNA 도, 유전자 발현 억제 활성을 보였다. 또한 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3' 말단에서 2 번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0064 은, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3'말단에서 4 번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0043 보다도, 높은 발현 억제 활성을 나타냈다. 이 결과는, 상이한 표적 유전자를 타겟하는 상술된 참고예 1 및 2 에서 나타난 거동과 일치했다.
(참고예 4)
쌍이 아닌 염기의 위치가 다른 ssRNA 를 사용하고, 시험관 내에 있어서의 LMNA 유전자의 발현 억제를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
RNA 로서, 이하에 나타낸 ssRNA 를 사용했다. 하기 서열에 있어서,"＊"는 쌍이 아닌 염기를 지시한다.
Figure pct00066
상술된 RNA 를 사용한 점 이외에는, 상술된 실시예 C1 에서와 동일한 방식으로, A549 세포로의 트랜스펙션을 행하고, 상술된 세포를 48 시간 배양했다. 트랜스펙션 시의 RNA 농도는, 3 nmol/L 로 했다. 이어서, 프라이머로서, 이하의 LMNA 유전자용 프라이머 세트를 사용한 점 이외에는 상술된 실시예 C1 에서와 동일한 방식으로, RNA 회수, cDNA 합성 및 PCR 를 행하고, LMNA 유전자의 발현량 및 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 측정했다. 상술된 LMNA 유전자의 발현량은, 내부 표준인 β-액틴 유전자의 발현량을 참고로 정규화했다.
LMNA 유전자용 프라이머 세트
Figure pct00067
상술된 실시예 C1 에서와 동일한 방식으로, 대조군 1(-) 및 대조군 2 (mock)에 관해서도 발현량을 측정했다. 그리고, 정규화된 LMNA 유전자 발현량에 대해서, 대조군 (-) 의 세포의 발현량을 1 로서 설정한 점을 기초로 하여, 각 RNA 를 도입한 세포의 발현량의 상대값을 구했다.
(2) 결과
이것들의 결과를, 도 9 에 나타낸다. 도 9 은, A549 세포에 있어서의 LMNA 유전자의 발현량의 상대값을 보이는 그래프이다. 도 9 에서 볼 수 있는 바와 같이, 어느쪽의 ssRNA 도, 유전자발현 억제 활성을 보였다. 또한, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3'말단에서 2 번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0066은, 상술된 내부 영역 (Z) 에 있어서의 3' 말단에서 4 번째가 쌍이 아닌 염기 위치인 NK-0063 보다도, 높은 발현 억제 활성을 나타냈다. 이 결과는, 상이한 표적 유전자를 타겟하는 상술된 참고예 1 내지 3 에서 나타낸 거동과 일치한다.
참고예 1 ~ 참고예 4 의 결과로부터, 예를 들면, 쌍이 아닌 염기의 위치에 관해서는, 표적 유전자의 종류 및 표적 유전자에 대한 발현 억제 서열에 관계 없이, 유사한 거동을 보인다는 점이 명확해졌다. 또한, 상술된 실시예 C1 가 참고예의 것과 유사한 거동을 보인다는 점은 이미 상술된 바 있다.
(참고예 5)
상술된 내부 5'측 영역 (X), 상술된 5'측 영역 (Xc), 상술된 내부 3'측 영역 (Y) 및 상술된 3'측 영역 (Yc) 의 각 길이를 변화시킨 ssRNA 를 사용하고, 시험관 내에 있어서의 GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인했다.
(1) 재료 및 방법
RNA 로서, 도 10 에 나타낸 ssRNA 를 사용했다. 도 10 에 있어서, 오른쪽 끝의 번호는, 서열 식별 번호를 나타낸다. 도 10 에 있어서, 5' 측에서, 소문자 밑줄의 영역은 상술된 영역 (Xc) 을; 대문자 밑줄의 영역은 상술된 내부 영역 (Z) 를; 소문자 밑줄의 영역은 상술된 영역 (Yc) 을 나타낸다. 또한, "Xc+Yc/X+Y"는, 상술된 영역 (Xc) 과 상술된 영역 (Yc) 의 염기장의 합계와, 상술된 영역 (X) 과 상술된 영역 (Y) 의 염기장의 합계와의 비율을 나타낸다. 도 10 에 있어서, "＊"은 쌍이 아닌 염기를 나타낸다.
각 ssRNA 에 있어서, 링커 영역 (Lx) 의 염기장을 7 염기, 링커 영역 (Ly) 의 염기장을 4 염기, 상술된 영역 (Yc) 의 염기장을 1 염기로 설정하고, 상술된 내부 영역 (Z) 의 3'측에서 2 번째의 염기를 쌍이 아닌 염기로 설정했다. 그리고, 상술된 내부 영역 (Z) 의 염기장과 상술된 영역 (Xc) 의 염기장을 변동시켰다.
특히 달리 설명되지 않는 한, 상술된 실시예 C1 에서와 동일한 방식으로, 상술된 RNA 에 대해서, HCT116 세포로의 트랜스펙션, 배양, RNA 회수, cDNA합성 및 PCR 를 행하고, GAPDH 유전자의 발현량의 상대값을 산출했다. 상술된 트랜스펙션의 조건에서, 상술된 웰 당의 조성을 하기 표 2 와 동일하게 했다.
표 2
Figure pct00068
(2) 결과 및 고찰
이것들의 결과를 도 11 에 나타낸다. 도 11 은 최종 농도 1ｎmol/L 의 각 RNA 를 사용했을 경우에 있어서의 GAPDH 유전자 발현량의 상대값을 보이는 그래프이다. 도 11 에서 볼 수 있듯이, 상술된 영역 (X), 상술된 영역 (Xc), 상술된 영역 (Y) 및 상술된 영역 (Yc) 의 길이를 변화시킨 어느쪽의 ssRNA 에 대해서도, GAPDH 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있었다.
이상, 실시 형태를 참조해서 본 발명을 설명했지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 구성이나 상세한 설명들에 있어서, 본 발명의 영역 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러가지 변경을 가할 수 있다.
산업상의 이용 가능성
본 발명의 ssPN 분자는 유전자의 발현 억제가 가능하다. 이것은 환상이 아니기 때문에, 그 합성이 용이하다. 또한, 이것은 단일-가닥이기 때문에, 이중-가닥 어닐링 공정이 필요하지 않으므로, 이것은 효율적으로 제조가능하다. 더욱이, 상술된 링커 영역은 상술된 비뉴클레오티드 잔기를 포함하므로, 예를 들면, 종래와 같은 뉴클레오티드 잔기의 변경은 한정된 옵션이 아니고, 예를 들면, 상술된 링커 영역에 있어서의 수식 등의 변경도 가능해 진다. 이렇게, 본 발명의 ssPN 분자는, 상술한 바와 같이 표적 유전자의 발현을 억제 가능한 것부터, 예를 들면, 의약품, 진단 약 및 농약, 및 의학, 생명과학 등의 연구 도구로서 유용하다.
<110> BONAC CORPORATION <120> Single strand nucleic acid molecule having amino acid backbone <130> TF12064WO <150> JP 2012-001711 <151> 2012-01-07 <150> JP 2012-026745 <151> 2012-02-09 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 1 gaa 3 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 2 ggcuguuguc auacuucuca ugguuc 26 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 3 caugagaagu augacaacag cc 22 <210> 4 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 4 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibiting region <400> 5 guugucauac uucucaugg 19 <210> 6 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 6 ggcuuucacu uaucguugau ggcuuc 26 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 7 ccaucaacga uaagugaaag cc 22 <210> 8 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 8 ccaucaacga uaagugaaag ccggcuuuca cuuaucguug auggcuucga a 51 <210> 9 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 9 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51 <210> 10 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 10 ccaucaacga uaagugaaag ccggcuuuca cuuaucguug auggcuucga a 51 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggagaaggct ggggctcatt tgc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tggccagggg tgctaagcag ttg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gccacggctg cttccagctc ctc 23 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aggtctttgc ggatgtccac gtcac 25 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibiting sequence <400> 15 aaagucaaug uacagcugcu u 21 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibiting sequence <400> 16 auuguaacga gacaaacac 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression inhibiting sequence <400> 17 uugcgcuuuu uggugacgc 19 <210> 18 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 18 ccaugagaag uaugacaaca gccggcuguu gucauacuuc ucaugguu 48 <210> 19 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 19 cagcuguaca uugacuuuag ccggcuaaag ucaauguaca gcugcuucga a 51 <210> 20 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 20 agcuguacau ugacuuuagc cggcuaaagu caauguacag cugcuucgaa 50 <210> 21 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 21 agcagcugua cauugacuuu agccggcuaa agucaaugua cagcugcuuc g 51 <210> 22 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 22 gcagcuguac auugacuuua gccggcuaaa gucaauguac agcugcuucg 50 <210> 23 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 23 ugucagugcu cauuuacaag ccggcuugua aaugagcacu gacacuucga a 51 <210> 24 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 24 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 cg 62 <210> 25 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 25 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 26 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 26 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 ga 62 <210> 27 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 27 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 aa 62 <210> 28 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 28 augagaagua ugacaacagc cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga 60 ac 62 <210> 29 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 29 ugagaaguau gacaacagcc ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa 60 cc 62 <210> 30 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 30 agaaguauga caacagcccc acaccggcug uugucauacu ucucaugguu cuucggaacc 60 au 62 <210> 31 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 31 aaguaugaca acagccccac accggcuguu gucauacuuc ucaugguucu ucggaaccau 60 ga 62 <210> 32 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 32 guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga 60 ga 62 <210> 33 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 33 augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga 60 ag 62 <210> 34 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 34 acaacagccc cacaccggcu guugucauac uucucauggu ucuucggaac caugagaagu 60 au 62 <210> 35 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 35 aacagcccca caccggcugu ugucauacuu cucaugguuc uucggaacca ugagaaguau 60 ga 62 <210> 36 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 36 cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu cggaaccaug agaaguauga 60 ca 62 <210> 37 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 37 agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga gaaguaugac 60 aa 62 <210> 38 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 38 gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg gaaccaugag aaguaugaca 60 ac 62 <210> 39 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 39 ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga aguaugacaa 60 ca 62 <210> 40 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 40 cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga accaugagaa guaugacaac 60 ag 62 <210> 41 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 41 ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa ccaugagaag uaugacaaca 60 gc 62 <210> 42 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 42 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucuucgg 60 aa 62 <210> 43 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 43 agcuguacau ugacuuuagc cccacaccgg cuaaagucaa uguacagcug cuucuucgga 60 a 61 <210> 44 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 44 agcagcugua cauugacuuu agccccacac cggcuaaagu caauguacag cugcuucuuc 60 gg 62 <210> 45 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 45 gcagcuguac auugacuuua gccccacacc ggcuaaaguc aauguacagc ugcuucuucg 60 g 61 <210> 46 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 46 uguuugucuc guuacaauau ccccacaccg gauauuguaa cgagacaaac acuccuucgg 60 ga 62 <210> 47 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 47 aguguuuguc ucguuacaau auccccacac cggauauugu aacgagacaa acacuccuuc 60 gg 62 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 aaagctgcca atgcccctcg acc 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 taggtgggtg gccctcgtct tg 22 <210> 50 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 50 cgucaccaaa aagcgcaauu ccccacaccg gaauugcgcu uuuuggugac gcuucuucgg 60 aa 62 <210> 51 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 51 agcgucacca aaaagcgcaa uuccccacac cggaauugcg cuuuuuggug acgcuucuuc 60 gg 62 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ctggacatca agctggccct ggac 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 caccagcttg cgcatggcca cttc 24 <210> 54 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 54 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucgu 60 ucgc 64 <210> 55 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 55 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 56 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 56 accaugagaa guaugacaac agcccacacc gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 60 <210> 57 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 57 ccaugagaag uaugacaaca gcccacaccg cuguugucau acuucucaug guuuucga 58 <210> 58 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 58 accaugagaa guaugacaac agccacaccc uguugucaua cuucucaugg uucuucgg 58 <210> 59 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 59 ccaugagaag uaugacaaca gccacacccu guugucauac uucucauggu uuucga 56 <210> 60 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 60 caugagaagu augacaacag ccacacccug uugucauacu ucucaugguu ucga 54 <210> 61 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 61 ccaugagaag uaugacaaca ccacaccugu ugucauacuu cucaugguuu ucga 54 <210> 62 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 62 caugagaagu augacaacac cacaccuguu gucauacuuc ucaugguuuc ga 52 <210> 63 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 63 ggaaucgaag uacucagcgu aaguuc 26 <210> 64 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 64 acuuacgcug aguacuucga uucc 24 <210> 65 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 65 acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc g 51 <210> 66 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule <400> 66 acuuacgcug aguacuucga uuccggaauc gaaguacuca gcguaaguuc g 51

Claims (57)

  1. 표적 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 서열을 포함하고, 영역 (X), 링커 영역 (Lx) 및 영역 (Xc) 을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자로서, 이때
    링커 영역 (Lx) 이 영역 (X) 과 영역 (Xc) 과의 사이에 연결되고,
    영역 (Xc) 은 영역 (X) 과 상보적이며,
    영역 (X) 및 영역 (Xc) 중 하나 이상이, 상술된 발현 억제 서열을 포함하고,
    링커 영역 (Lx) 이 아미노산으로 유도되는 원자단을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 링커 영역 (Lx) 가 하기 식 (I) 로 나타내어지는 단일-가닥 핵산 분자:
    Figure pct00069

    식 중,
    X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이고;
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이고;
    L1 은 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자가 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는,
    L1 은 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단: Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리는 서로 인접하지 않고;
    L2 은 m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
    L2 는 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단: Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리는 서로 인접하지 않고;
    Ra, Rb, Rc, 및 Rd 은 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고;
    m 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    n 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    영역 (Xc) 및 영역 (X) 는 각각 -OR1- 또는 -OR2- 를 통해 링커 영역 (Lx) 에 결합하고;
    R1 및 R2 은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2 은 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 구조 (I) 이고; 및
    A 는 임의의 원자단이며, 하기 식 (Ia) 는 아미노산이고, 하기 식 (Ia) 는 펩티드 이외의 아미노산임:
    Figure pct00070
    .
  3. 제 2 항에 있어서, 식 (I) 에서,
    A 는 사슬 원자단, 지환식 원자단, 및 방향족 원자단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하고, 상기 원자단들 각각은 치환기 또는 보호기를 추가로 갖거나 또는 갖지 않을 수 있는 단일-가닥 핵산 분자.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 천연 아미노산 또는 인공 아미노산인 단일-가닥 핵산 분자.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 단백질을 구성하는 아미노산인 단일-가닥 핵산 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 글리신, α-알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 히드록시리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 트립토판, β-알라닌, 1-아미노-2-카르복시시클로펜탄, 또는 아미노벤조산이며, 임의로는 치환기 또는 보호기를 추가로 갖는 단일-가닥 핵산 분자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (X) 의 염기수 (X) 및 5'측 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 가 하기 식 (3) 또는 (5) 의 조건을 충족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    X > Xc … (3)
    X = Xc … (5).
  8. 제 7 항에 있어서, 영역 (X) 의 염기수 (X) 및 5'측 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 가 하기 식 (11) 의 조건을 충족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    X - Xc = 1, 2 또는 3 … (11).
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 가 19 내지 30 인 단일-가닥 핵산 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자가 영역 (Y) 및 영역 (Yc) 를 추가로 포함하고, 영역 (Yc) 는 영역 (Y) 와 상보적이며, 내부 영역 (Z) 는 서로 연결되는 영역 (X) 및 영역 (Y) 로 이루어지는 단일-가닥 핵산 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자가 링커 영역 (Ly) 을 추가로 포함하고, 링커 (Ly) 는 영역 (Y) 및 영역 (Yc) 사이에 연결되는 단일-가닥 핵산 분자.
  12. 제 11 항에 있어서, 링커 영역 (Ly) 는 하기 식 (I) 로 나타내어지는 단일-가닥 핵산 분자:
    Figure pct00071

    식 중,
    X1 및 X2 는 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이고;
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이고;
    L1 은 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
    L1 은 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단, Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, OR1 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리는 서로 인접하지 않고;
    L2 은 m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자는 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
    L2 은 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단: Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리는 서로 인접하지 않고;
    Ra, Rb, Rc, 및 Rd 은 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고;
    m 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    n 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    영역 (Yc) 및 영역 (Y) 은 각각 -OR1- 또는 -OR2- 를 통해 링커 영역 (Ly) 에 연결되고;
    R1 및 R2 은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 이들이 존재하는 경우, R1 및 R2 은 각각 독립적으로 뉴클레오티드 잔기 또는 구조 (I) 이고; 및
    A 는 임의의 원자단이고, 하기 식 (Ia) 는 펩티드 이외의 아미노산이고:
    Figure pct00072

    링커 영역 (Lx) 이 식 (I) 로 나타내어지는 경우, 링커 영역 (Lx) 및 링커 영역 (Ly) 에서 A, X1, X2, Y1, Y2, L1, L2, R1 및 R2 은 각각 상동 또는 상이할 수 있음.
  13. 제 12 항에 있어서,
    영역 (Xc) 및 영역 (X) 의, 식 (I) 로 나타낸 링커 영역 (Lx) 의 구조와의 결합, 및
    영역 (Yc) 및 영역 (Y) 의, 식 (I) 로 나타낸 링커 영역 (Ly) 의 구조와의 결합 각각이 하기 조건 (1) - (4) 중 어느 하나를 충족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    조건 (1):
    영역 (Xc) 및 (X) 은 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합하고;
    영역 (Yc) 및 (Y) 은 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합함;
    조건 (2):
    영역 (Xc) 및 (X) 은 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합하고;
    영역 (Yc) 및 (Y) 는 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합함;
    조건 (3):
    영역 (Xc) 및 (X) 은 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합하고;
    영역 (Yc) 및 (Y) 은 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합함;
    조건 (4):
    영역 (Xc) 및 (X) 은 각각 -OR1- 및 -OR2- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합하고;
    영역 (Yc) 및 (Y) 은 각각 -OR2- 및 -OR1- 을 통해 식 (I) 의 구조와 결합함.
  14. 제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (I) 에서, L1 은 폴리에테르 사슬이고, 폴리에테르 사슬은 폴리에틸렌 글리콜인 단일-가닥 핵산 분자.
  15. 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (I) 에서, L1 의 원자 개수 (n) 과 L2 의 원자 개수 (m) 과의 합계 (m + n) 이, 0~ 30 의 범위인 단일-가닥 핵산 분자.
  16. 제 2 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (I) 의 구조가 하기식 (I-1) ~ (I-4) 중 어느 하나이며, 하기 식에 있어서, n 은 0 ~ 30 의 정수이고, m 은 0 ~ 30 의 정수인 단일-가닥 핵산 분자:
    Figure pct00073
    .
  17. 제 16 항에 있어서, 식 (I-1) 에서, n = 11 및 m = 12 인 단일-가닥 핵산 분자.
  18. 제 16 항에 있어서, 식 (I-1) 에서, n = 5 및 m = 4 인 단일-가닥 핵산 분자.
  19. 제 16 항에 있어서, 식 (I-4) 에서, n = 5 및 m = 4 인 단일-가닥 핵산 분자.
  20. 제 7 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (X) 의 염기수 (X), 영역 (Y) 의 염기수 (Y), 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 및 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 이, 하기 식 (2) 의 조건을 충족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    Z ≥Xc + Yc … (2).
  21. 제 7 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (X) 의 염기수 (X), (Xc) 의 염기수 (Xc), 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 및 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 이, 하기 조건 (a) ~ (d) 중 임의의 것을 충족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    (a) 하기 식 (3) 및 (4) 의 조건이 충족됨;
    X > Xc … (3)
    Y = Yc … (4)
    (b) 하기 식 (5) 및 (6) 의 조건이 충족됨;
    X = Xc … (5)
    Y > Yc … (6)
    (c) 하기 식 (7) 및 (8) 의 조건이 충족됨;
    X > Xc … (7)
    Y > Yc … (8)
    (d) 하기 식 (9) 및 (10) 의 조건이 충족됨;
    X = Xc … (9)
    Y = Yc … (10).
  22. 제 21 항에 있어서, 조건 (a) ~ (d) 에 있어서, 영역 (X) 의 염기수 (X) 과 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 의 차이, 및 영역 (Y) 의 염기수 (Y) 과 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 의 차이가 하기 조건을 만족하는 단일-가닥 핵산 분자:
    (a) 하기 식 (11) 및 (12) 의 조건이 충족됨;
    X - Xc = 1, 2 또는 3 … (11)
    Y - Yc = 0 … (12)
    (b) 하기 식 (13) 및 (14) 의 조건이 충족됨;
    X - Xc = 0 … (13)
    Y - Yc = 1, 2 또는 3 … (14)
    (c) 하기 식 (15) 및 (16) 의 조건이 충족됨;
    X - Xc = 1, 2 또는 3 … (15)
    Y - Yc = 1, 2 또는 3 … (16)
    (d) 하기 식 (17) 및 (18) 의 조건이 충족됨;
    X - Xc = 0 … (17)
    Y - Yc = 0 … (18).
  23. 제 7 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 이 1 내지 11 인 단일-가닥 핵산 분자.
  24. 제 23 항에 있어서, 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 이 1 내지 7 인 단일-가닥 핵산 분자.
  25. 제 23 항에 있어서, 영역 (Xc) 의 염기수 (Xc) 이 1 내지 3 인 단일-가닥 핵산 분자.
  26. 제 7 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 이 1 내지 11 인 단일-가닥 핵산 분자.
  27. 제 26 항에 있어서, 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 이 1 내지 7 인 단일-가닥 핵산 분자.
  28. 제 26 항에 있어서, 영역 (Yc) 의 염기수 (Yc) 이 1 내지 3 인 단일-가닥 핵산 분자.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자가 하나 이상의 수식된 잔기를 포함하는 단일-가닥 핵산 분자.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 표지 물질을 추가로 포함하는 단일-가닥 핵산 분자.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 동위체를 추가로 포함하는 단일-가닥 핵산 분자.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 분자인 단일-가닥 핵산 분자.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자에서 염기수의 합계가 50 이상인 단일-가닥 핵산 분자.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 발현이 RNA 간섭에 의해 억제되는 단일-가닥 핵산 분자.
  35. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물로서, 상기 조성물이 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  36. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 염증 치료용의 약학적 조성물.
  38. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자를 이용하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현 억제 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자를 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 단일-가닥 핵산 분자가 생체 내 또는 시험관 내에 투여되는 방법.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 발현이 RNA 간섭에 의해 억제되는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자를 이용하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭을 유도하는 방법.
  43. 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한, 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자의 용도.
  44. RNA 간섭을 유도하기 위한, 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자의 용도.
  45. 질환 치료에 사용되기 위한 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일 가닥 핵산 분자이고,
    상기 단일-가닥 핵산 분자는 발현 억제 서열로서 질환의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
  46. 하기 식 (II) 의 구조를 갖는 핵산 분자 합성용 모노머:
    Figure pct00074

    식 중,
    X1 및 X2 은 각각 독립적으로 H2, O, S, 또는 NH 이고;
    Y1 및 Y2 는 각각 독립적으로 단일 결합, CH2, NH, O, 또는 S 이고;
    R11 및 R21 는 각각 독립적으로 H, 보호기 또는 인산-보호기이고;
    L1 는 n 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, 또는 SRa 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
    L1 은 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단: Y1 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y1 에 결합하는 L1 의 원자가 탄소이고, OR11 에 결합하는 L1 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리 서로 인접하지 않고;
    L2 는 m 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 사슬이고, 알킬렌 탄소 원자 상 수소 원자가 OH, ORc, NH2, NHRc, NRcRd, SH, 또는 SRc 로 치환 또는 비치환될 수 있거나, 또는
    L2 은 알킬렌 사슬 상 하나 이상의 탄소 원자를 산소 원자로 치환함으로써 수득된 폴리에테르 사슬이고,
    단: Y2 이 NH, O, 또는 S 인 경우, Y2 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, OR21 에 결합하는 L2 의 원자는 탄소이고, 산소 원자들끼리 서로 인접하지 않고;
    Ra, Rb, Rc, 및 Rd 는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고;
    m 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    n 은 0 내지 30 범위의 정수이고;
    A 는 임의의 원자단이며, 하기 식 (Ia) 는 펩티드가 아닌 아미노산임:
    Figure pct00075
    .
  47. 제 46 항에 있어서, 식 (II) 의 구조는 하기 식 (II-1) - 식 (II-4) 중 어느 하나이고, 하기 식에서, n 은 0 - 30 의 정수이고, m 은 0 - 30 의 정수인 모노머:
    Figure pct00076

    Figure pct00077

    이때, 식 (II-4) 에서, R101 은 R11 및 R21 과는 독립적으로, H, 보호기 또는 인산-보호기임.
  48. 제 47 항에 있어서, 식 (II-1) 에서, n = 11 및 m = 12 인 모노머.
  49. 제 47 항에 있어서, 식 (II-1) 에서, n = 5 및 m = 4 인 모노머.
  50. 제 47 항에 있어서, 식 (II-4) 에서, n = 5 및 m = 4 인 모노머.
  51. 제 46 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (II) 에서, L1 은 폴리에테르 사슬이고, 폴리에테르 사슬은 폴리에틸렌 글리콜인 모노머.
  52. 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (II) 에서, L1 의 원자개수 (n) 과 L2 의 원자 개수 (m) 과의 합계 (m + n) 이, 0 내지 30 범위인 모노머.
  53. 제 46 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 표지 물질을 추가로 포함하는 모노머.
  54. 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 동위체를 추가로 포함하는 모노머.
  55. 제 46 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 자동화 핵산 합성에서 사용되기 위한 모노머.
  56. 제 46 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 따른 모노머를 이용하는 것을 포함하는 핵산 분자의 제조 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 핵산 분자는 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 단일-가닥 핵산 분자인 제조 방법.
KR1020147021789A 2012-01-07 2012-12-29 아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자 KR101674778B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012001711 2012-01-07
JPJP-P-2012-001711 2012-01-07
JPJP-P-2012-026745 2012-02-09
JP2012026745 2012-02-09
PCT/JP2012/084247 WO2013103146A1 (ja) 2012-01-07 2012-12-29 アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140111688A true KR20140111688A (ko) 2014-09-19
KR101674778B1 KR101674778B1 (ko) 2016-11-09

Family

ID=48745204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147021789A KR101674778B1 (ko) 2012-01-07 2012-12-29 아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9528111B2 (ko)
EP (1) EP2801617B1 (ko)
JP (1) JP5876890B2 (ko)
KR (1) KR101674778B1 (ko)
CN (2) CN110055247A (ko)
ES (1) ES2645996T3 (ko)
HK (1) HK1202310A1 (ko)
WO (1) WO2013103146A1 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5536963B2 (ja) * 2012-03-04 2014-07-02 株式会社ボナック ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤
CN109810977A (zh) 2012-05-26 2019-05-28 株式会社博纳克 具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
JP6492014B2 (ja) * 2013-12-27 2019-03-27 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途
SG11201605247XA (en) * 2013-12-27 2016-08-30 Bonac Corp Artificial match-type mirna for controlling gene expression and use therefor
JP6471176B2 (ja) * 2014-12-27 2019-02-13 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途
ES2926369T3 (es) 2015-03-27 2022-10-25 Bonac Corp Molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene función de suministro y capacidad de control de la expresión génica
EP3369816B1 (en) 2015-10-30 2024-03-13 Toray Industries, Inc. Composition stably containing single-stranded nucleic acid molecule that suppresses expression of tgf-beta1 gene
CN108884462B (zh) 2016-01-26 2022-11-25 日产化学株式会社 单链寡核苷酸
AU2017213405B2 (en) * 2016-01-30 2021-02-04 Bonac Corporation Artificial single guide RNA and use thereof
EP3584319A4 (en) * 2017-02-06 2021-04-14 Nissan Chemical Corporation SINGLE-STRAND OLIGONUCLEOTIDE
JPWO2018182008A1 (ja) * 2017-03-31 2020-02-06 株式会社ボナック 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
AU2018307897B2 (en) 2017-07-28 2024-01-25 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for fibrosis
US20210188895A1 (en) * 2017-10-13 2021-06-24 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule, and production method therefor
TWI830718B (zh) 2018-02-09 2024-02-01 日商住友化學股份有限公司 核酸分子之製造方法
CN111868244A (zh) 2018-03-20 2020-10-30 国立大学法人东京工业大学 降低了毒性的反义寡核苷酸
JP6817493B2 (ja) * 2018-03-30 2021-01-20 住友化学株式会社 一本鎖ｒｎａの製造方法
AU2019242331A1 (en) 2018-03-30 2020-09-10 Toray Industries, Inc. Method for producing hairpin single-stranded RNA molecule
ES2981806T3 (es) 2018-10-02 2024-10-10 Toray Industries Método para producir moléculas de ARN monocatenario en horquilla
WO2020202952A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 住友化学株式会社 無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法
WO2020202953A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 住友化学株式会社 無機多孔質担体、及びこれを用いた核酸の製造方法
US20220153774A1 (en) 2019-03-29 2022-05-19 Sumitomo Chemical Company, Limited Inorganic porous carrier and method for producing nucleic acids using same
WO2020202949A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 住友化学株式会社 Ｒｎａの製造方法
EP3950125A4 (en) 2019-03-29 2023-01-04 Sumitomo Chemical Company Limited POROUS INORGANIC SUPPORT AND METHOD FOR PRODUCTION OF NUCLEIC ACID USING THE SAME
US20230167152A1 (en) * 2020-03-27 2023-06-01 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing nucleic acid oligomer
WO2021230293A1 (ja) 2020-05-13 2021-11-18 住友化学株式会社 無機多孔質基材、無機多孔質担体、および核酸の製造方法
WO2022045224A1 (ja) * 2020-08-25 2022-03-03 株式会社ボナック 標的遺伝子の発現を抑制する新規な核酸分子
CN116209668A (zh) 2020-09-24 2023-06-02 住友化学株式会社 核酸寡聚物的制造方法
CN118891269A (zh) 2022-03-23 2024-11-01 住友化学株式会社 核酸寡聚物的制造方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE873543C (de) * 1942-10-28 1953-04-16 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von hydroxyl- bzw. sulfhydryl-gruppenhaltigen Dicarbaminsaeureestern
US20060276421A1 (en) * 2003-09-30 2006-12-07 Anges Mg, Inc. Staple type oligonucleotide and drug comprising the same
WO2009074076A1 (fr) * 2007-11-29 2009-06-18 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Molécule complexe interférant avec l'expression de gènes cibles, et ses méthodes de préparation
WO2009076321A2 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 Halo-Bio Rnai Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating gene expression using asymmetrically-active precursor polynucleotides

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4550163A (en) 1979-02-05 1985-10-29 Abbott Laboratories Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates
US20030232355A1 (en) * 1992-05-22 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded peptide nucleic acids
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6852334B1 (en) * 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
TWI321054B (en) 2000-12-19 2010-03-01 California Inst Of Techn Compositions containing inclusion complexes
EP1748078B1 (en) * 2001-03-09 2011-01-19 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions of combination oligomers
WO2003037909A1 (en) * 2001-10-29 2003-05-08 Mcgill University Acyclic linker-containing oligonucleotides and uses thereof
WO2004015075A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Dharmacon, Inc. Short interfering rnas having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop
EP1641942A2 (en) 2003-06-12 2006-04-05 Applera Corporation Combinatorial nucleobase oligomers comprising universal base analogues and methods for making and using same
MX2007008065A (es) * 2004-12-30 2008-03-04 Todd M Hauser Composiciones y metodos para modular la expresion genica usando oligonucleotidos autoprotegidos.
US20120258104A1 (en) * 2009-07-22 2012-10-11 Cenix Bioscience Gmbh Delivery System and Conjugates For Compound Delivery Via Naturally Occurring Intracellular Transport Routes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE873543C (de) * 1942-10-28 1953-04-16 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von hydroxyl- bzw. sulfhydryl-gruppenhaltigen Dicarbaminsaeureestern
US20060276421A1 (en) * 2003-09-30 2006-12-07 Anges Mg, Inc. Staple type oligonucleotide and drug comprising the same
WO2009074076A1 (fr) * 2007-11-29 2009-06-18 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Molécule complexe interférant avec l'expression de gènes cibles, et ses méthodes de préparation
WO2009076321A2 (en) * 2007-12-07 2009-06-18 Halo-Bio Rnai Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating gene expression using asymmetrically-active precursor polynucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
HK1202310A1 (en) 2015-09-25
ES2645996T3 (es) 2017-12-11
KR101674778B1 (ko) 2016-11-09
US9528111B2 (en) 2016-12-27
JP5876890B2 (ja) 2016-03-02
EP2801617B1 (en) 2017-09-06
EP2801617A1 (en) 2014-11-12
CN110055247A (zh) 2019-07-26
JPWO2013103146A1 (ja) 2015-05-11
EP2801617A4 (en) 2015-09-30
CN104039961A (zh) 2014-09-10
WO2013103146A1 (ja) 2013-07-11
US20140329886A1 (en) 2014-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101674778B1 (ko) 아미노산 골격을 갖는 단일-가닥 핵산 분자
KR101849801B1 (ko) 함질소 지환식 골격을 갖는 일본쇄 핵산 분자
KR101849798B1 (ko) 유전자 발현 제어를 위한 일본쇄 핵산 분자
JP6883349B2 (ja) デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子
WO2018182008A1 (ja) 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
JP2013153736A (ja) ペプチド骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2013077446A1 (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
KR20170098914A (ko) 유전자 발현 제어를 위한 천연형 miRNA 및 그의 용도
JP2013055913A (ja) 遺伝子発現制御のための一本鎖ｒｎａ分子

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant