KR20140098713A - 혈액응고인자 ⅶ를 포함하는 조성물에서 바이러스의 불활성화 방법 - Google Patents
혈액응고인자 ⅶ를 포함하는 조성물에서 바이러스의 불활성화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ를 포함하는 조성물에서 바이러스의 불활성화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 가하는 단계를 포함하는 바이러스의 불활성화 방법 및 바이러스가 불활성화된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ를 포함하는 조성물에서 바이러스의 불활성화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 가하는 단계를 포함하는 바이러스의 불활성화 방법 및 바이러스가 불활성화된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
현재 세계 혈우병 환자는 14만 명으로 추정하고 있으며 매년 20%의 증가 추세를 보이고 있다. 유전적으로 만 명당 한 명의 비율로 혈우병이 발생되고 있지만 전체 환자의 25% 내외만이 진단 또는 치료를 받고 있다. 상기 혈우병은 발병원인에 따라 크게 두 가지로 구분하는데, 하나는 혈액응고인자 Ⅶ(Factor Ⅶ, FacⅦ)이 결핍되어 발병하는 A형 혈우병으로서 전체 혈우병 환자의 80%를 차지하고, 다른 하나는 혈액응고인자 XI(Factor XI)가 결핍되어 발병하는 B형 혈우병으로서 전체 환자의 20%를 차지한다. 이러한 혈우병을 치료하는 방법으로는 외부에서 혈액인자를 투여하는 방법이 이용되고 있는데, 이 같은 방법을 사용할 경우, A형 혈우병 환자의 10-15%에서 투여된 혈액인자에 대한 항체가 생성되고, B형 혈우병 환자의 1-3%에서 투여된 혈액인자에 대한 항체가 생성되는 문제점이 보고되어 있다.
한편, 혈우병 환자의 절반이상을 차지하는 A형 혈우병의 원인인 FacⅦ은 주로 간에서 생산되는 406개의 아미노산으로 구성된 효소로서, 10번 아미노산인 글루탐산이 감마-카르복실화 되고, 145번 및 322번 아미노산인 아스파라진이 N-글리코실화되며, 52번 및 60번 아미노산인 세린이 O-글리코실화되어 있다. 또한, FacⅦ은 두 개의 EGF-유사 도메인과 하나의 세린 프로테아제 도메인을 가지며, 152번째 아르기닌과 153번째 이소류신 사이가 절단되면서 중쇄의 활성부위가 노출되고, 이에 의하여 하나의 아미노산 서열로 구성된 FacⅦ가 두개의 아미노산 서열(경쇄 및 중쇄)로 구성된 이량체의 FacⅦa 형태로 활성화된다. 활성화된 FacⅦa는 다른 혈액응고인자와는 다른 보조적인 혈액응고 기작을 통하여 작용하기 때문에 고용량으로 투여하여도 항체가 생성되지 않는다. 따라서, A형 혈우병 환자뿐만 아니라, 종래의 치료방법으로 인하여 FacⅦ에 대한 항체가 형성된 환자를 치료하는데 사용될 수 있어, 상술한 문제점을 해결할 수 있는 수단으로 알려져 있다.
그러나, 동물세포를 사용하여 FacⅦ를 재조합적으로 생산하고자 하는 경우, 바이러스 오염의 위험성이 존재하여, FacⅦ를 생산하기 위한 제조 공정은 잠재적인 바이러스에 대한 제거 공정을 포함할 필요가 있으나, 바이러스 오염을 불활성화시키는 과정을 거친 조성물의 경우, 불활성화 이전의 조성물에 비하여 FacⅦ 역가가 감소하는 문제점이 종종 발생하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 FacⅦ 또는 그 아미노산 서열을 포함하는 FacⅦ 유도체를 포함한 조성물에서 바이러스를 효과적으로 불활성화시키면서도 FacⅦ의 역가가 저하되지 않은 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, FacⅦ를 포함하는 조성물에 계면활성제를 첨가하는 경우, FacⅦ 또는 그 유도체의 활성에 영향을 미치지 않으면서도 오염된 바이러스를 불활성화 시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈액응고인자 Ⅶ(Factor Ⅶ, FacⅦ) 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에서 바이러스를 불활성화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하고, 바이러스가 불활성화된 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ(Factor Ⅶ, FacⅦ) 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 가하는 단계를 포함하는 바이러스의 불활성화 방법을 제공한다.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 포함된 활성화된 혈액응고인자 Ⅶ의 함량은, 상기 조성물에 포함된 전체 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체에 대하여 5% 미만인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물은 액상 조성물인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 액상 조성물의 pH는 pH 5.0 내지 8.0인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 액상 조성물의 pH는 pH 5.5인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 액상 조성물은 4 내지 25℃의 온도를 갖는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 포함된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체의 농도는 0.01 mg/mL 내지 5.0 mg/mL인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 계면활성제는 Tween, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, ploxamer188, Triton X-100 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 계면활성제의 부가량은 조성물에 대하여 최종 농도가 0.01 내지 1.00 중량%인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 계면활성제의 부가량은 조성물에 대하여 최종 농도가 0.1 내지 0.5 중량%인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 혈액응고인자 Ⅶ의 유도체는 혈액응고인자 Ⅶ의 C-말단에 펩타이드 링커가 연결된 것인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 혈액응고인자 Ⅶ의 유도체는 혈액응고인자 Ⅶ의 C-말단에, C-말단의 마지막 아미노산 잔기가 시스테인인 것을 특징으로 하는 펩타이드 링커가 연결된 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 혈액응고인자 Ⅶ의 유도체는 혈액응고인자 Ⅶ의 C-말단에, 서열번호 3 및 6 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 링커가 연결된 것을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 부가하는 단계를 포함하는, 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 바이러스가 불활성화된 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 바이러스의 불활성화 방법을 이용하면, FacⅦ 또는 FacⅦ 유도체의 활성을 그대로 유지하면서도, FacⅦ 및 그 아미노산 서열을 포함하는 유도체가 함유된 용액 상에서 바이러스 불활성화를 시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 혈우병 예방 또는 치료제의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 유도체 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 전, 후 순도를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 1에서 사이즈 마커를 기준으로 좌측은 비환원 조건에서 바이러스 불활성화 공정 처리 전, 후의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이고, 우측은 환원 조건에서 바이러스 불활성화 공정 처리 전, 후의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이다.
도 2는 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 유도체 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 공정 전, 후 활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 본 그래프에서 푸른색 선은 바이러스 불활성화 처리 이전의 FacⅦ 유도체의 활성을, 붉은색 선은 바이러스 불활성화 처리 이후의 FacⅦ 유도체의 활성을 나타낸다.
도 3은 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 전, 후 순도를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 3에서 사이즈 마커를 기준으로 좌측은 비환원 조건에서 바이러스 불활성화 공정 처리 전의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이고, 우측은 바이러스 불활성화 공정 처리 후의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이다. 도 3에서, 점선으로 된 박스 표시는 생성된 FacⅦa의 위치를 나타낸다.
도 2는 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 유도체 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 공정 전, 후 활성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 본 그래프에서 푸른색 선은 바이러스 불활성화 처리 이전의 FacⅦ 유도체의 활성을, 붉은색 선은 바이러스 불활성화 처리 이후의 FacⅦ 유도체의 활성을 나타낸다.
도 3은 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 전, 후 순도를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 3에서 사이즈 마커를 기준으로 좌측은 비환원 조건에서 바이러스 불활성화 공정 처리 전의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이고, 우측은 바이러스 불활성화 공정 처리 후의 FacⅦ의 순도를 나타내는 것이다. 도 3에서, 점선으로 된 박스 표시는 생성된 FacⅦa의 위치를 나타낸다.
본 발명은 혈액응고인자 Ⅶ(Factor Ⅶ, FacⅦ) 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 가하는 단계를 포함하는 바이러스의 불활성화 방법 또는 바이러스가 불활성화된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "혈액응고인자 Ⅶ(Factor Ⅶ, FacⅦ)"란 프로콘버틴(proconvertin)이라고도 하는데, 혈액응고반응에 관여하는 인자 중의 하나로서 48kDa의 크기를 나타내고, 12.8kb 크기의 유전자에 의하여 코딩되며, 주로 간에서 생성되고, 비타민K 의존성을 나타내는 혈장단백질의 일종을 의미한다. 상기 FacⅦ은 세린단백질가수분해효소 전구단백질, 평활근세포 등의 혈관외조직, 종양조직, 활성화백혈구 등의 표면에 있는 조직인자(혈액응고 제Ⅲ인자)에 결합하여, 혈액응고 제Ⅸ인자 및 제Ⅹ인자를 활성화시킴으로써, 외인계 혈액응고반응을 개시하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 FacⅦ는 천연형 FacⅦ 뿐만 아니라 그의 활성을 정상적으로 나타내면서도 화학적으로 변형된 FacⅦ 또는 그의 활성을 정상적으로 나타내면서도 천연형 FacⅦ와 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 폴리펩타이드 서열로 구성된 변형체가 될 수도 있으나, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 단백질이라면 특별히 상기 서열 상동성이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "혈액응고인자 Ⅶa(Factor Ⅶa, FacⅦa)"란 상기 혈액응고인자 Ⅶ의 활성화된 형태를 의미한다. FacⅦ의 활성화는, FacⅦ의 152번째 아르기닌과 153번째 이소류신 사이가 절단되면서 중쇄의 활성부위가 노출되고, 이에 의하여 하나의 아미노산 서열로 구성된 FacⅦ가 두 개의 아미노산 서열(경쇄 및 중쇄)로 구성된 이량체 형태가 됨으로써 수행된다. 여기서, 152번째 아르기닌 및 153번째 이소류신 잔기는, 최초 발현된 FacⅦ 폴리펩타이드에서 프로세스 과정(processing)에서 제거되는 신호펩타이드 및 프로-펩타이드 (혹은 pre-pro leader sequence로 명명) 부위를 제외하고, FacⅦ 경쇄 체인에 해당되는 첫 번째 아미노산을 1번 아미노산으로 하여 순서를 매긴 것이다. 활성화된 FacⅦa는 다른 혈액응고 인자와는 다른 보조적인 혈액응고 기작을 통하여 작용하기 때문에 고용량으로 투여하여도 항체가 생성되지 않는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "FacⅦ 유도체"란, FacⅦ의 C-말단에 펩타이드 링커가 결합된 폴리펩타이드 서열로 구성된 변형된 FacⅦ를 의미한다. 상기 FacⅦ 유도체는 FacⅦ의 C-말단에 펩타이드 링커가 펩타이드 결합을 통하여 연결된 형태일 수 있으며, 이러한 형태인 경우에는 융합 단백질의 형태를 가진다. 본 발명에서 상기 FacⅦ 유도체는 특정 방법에 의하여 상기 설명한 바와 같이 이량체를 형성하여 활성화될 수 있다.
본 발명에서 용어, “펩타이드 링커”는 FacⅦ의 C-말단에 결합하는 펩타이드로서, 혈중 반감기를 연장시킬 수 있는 캐리어를 연결하는 역할을 수행할 수 있다. 특히, 상기 펩타이드 링커는 C-말단이 시스테인인 펩타이드 링커가 될 수 있다.
이러한 펩타이드 링커의 예로는, ATKAVC(서열번호 3), GGGGSC(서열번호 6), SOD1(superoxide dismutase 1)의 1번 내지 149번 아미노산 서열(서열번호 7), 변이된 SOD1의 1번 내지 149번 아미노산서열(서열번호 8), SOD1의 1번 내지 90번 아미노산 서열(서열번호 9), 변이된 SOD1의 1번 내지 90번 아미노산서열(서열번호 10), SOD1의 1번 내지 25번 서열(서열번호 11) 또는 변이된 SOD1의 1번 내지 25번 아미노산 서열(서열번호 12)를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 FacⅦ 유도체는 FacⅦ 유도체의 C-말단에 ATKAVC(서열번호 3)가 결합된 폴리펩타이드(서열번호 13); FacⅦ 유도체의 C-말단에 GGGGSC(서열번호 6)가 결합된 폴리펩타이드(서열번호 14); FacⅦ 유도체의 C-말단에 SOD1의 1번 내지 149번 아미노산 서열(서열번호 7)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 15); FacⅦ 유도체의 C-말단에 변이된 SOD1의 1번 내지 149번 아미노산 서열(서열번호 8)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 16); FacⅦ 유도체의 C-말단에 SOD1의 1번 내지 90번 아미노산 서열(서열번호 9)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 17); FacⅦ 유도체의 C-말단에 변이된 SOD1의 1번 내지 90번 아미노산 서열(서열번호 10)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 18); FacⅦ 유도체의 C-말단에 SOD1의 1번 내지 25번 아미노산 서열(서열번호 11)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 19); 또는 FacⅦ 유도체의 C-말단에 변이된 SOD1의 1번 내지 25번 아미노산 서열(서열번호 12)이 결합된 폴리펩타이드(서열번호 20) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 FacⅦ 또는 그의 유도체 등에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-2013-0037659호 명세서 전체가 참고자료로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기와 같은 FacⅦ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화된 FacⅦ의 함량이 전체 FacⅦ 또는 그의 유도체에 대하여 적은 양, 바람직하게는 5% 미만으로 포함하는 조성물에 계면활성제를 적용하는 경우에, 상기 조성물에 포함된 바이러스를 효과적으로 불활성화시키면서도, 공정 후에 FacⅦa의 불순물 생성되는 것을 막고, FacⅦa 역가를 바이러스 불활성화 이전과 거의 대응하게 유지시킬 수 있는 효과를 가진다.
본 발명에서 용어, “FacⅦ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물”은, 계면활성제를 처리하는 대상이 되는, FacⅦ 또는 그의 유도체를 포함하는 물질을 의미한다. 상기 조성물은 바람직하게는 액상 조성물일 수 있다.
본 발명자들은 FacⅦ의 활성화에 대한 특성을 고찰하여, FacⅦ의 활성을 저하시키지 않으면서도, 이를 포함하는 용액 내의 바이러스 제거 공정을 개발하고자 하였다. 활성화되지 않은 FacⅦ은 경쇄와 중쇄가 연결된 단쇄 구조로서, 경쇄의 N-말단만이 노출되어 있으나, FacⅦa의 형태가 되면 FacⅦ의 152번째 아르기닌과 153번째 이소류신 사이가 절단되면서 중쇄의 활성부위가 노출되며, 이때 노출되는 153번째 이소류신이 중쇄의 N-말단이 된다. 상기 경쇄와 중쇄의 N-말단은 FacⅦa의 활성에 중요한 역할을 하는 부분이므로, N-말단이 외부의 영향을 받는 경우에는 FacⅦ의 활성이 천연형 FacⅦ에 비하여 감소될 수 있다. 또한, 활성형인 경우 세린 단백질 분해 효소(serine protease)로서 활성을 강하게 나타내므로 활성형인 FacⅦa 상태에서는 액상에서 취급 도중 원치 않게 활성에 영향을 주는 위치가 절단되어 불순물이 생성되는 등의 자가-절단된 형태가 쉽게 생성될 위험성이 있다.
이에, 본 발명자들은 FacⅦ의 활성화 형태인 FacⅦa가 아닌, 비활성화 형태인 FacⅦ에 대하여 바이러스 불활성화 공정을 적용함으로써, 이 공정에 의하여 발생될 수 있는 FacⅦa의 불순물 생성 및 역가저하 가능성에 대한 단점을 보완할 수 있음을 확인하였다.
따라서, FacⅦ을 포함하는 조성물에 계면활성제를 처리하여 불활성화시키는 경우에 있어, 활성화되지 않은 형태의 FacⅦ 또는 그의 유도체가 활성화된 FacⅦ 또는 그의 유도체에 비하여 높은 비율, 바람직하게는 95%를 초과하여 존재하는 조성물에 계면활성제를 처리하는 것이 바이러스 불활성화 과정 수행 후 조성물의 역가를 유지하는 것에 유리하다. 이에 본 발명의 방법에 있어 상기 조성물에 존재하는 활성화된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체는 5% 미만으로 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조성물은 의도되지 않은 활성화에 의하여 FacⅦ가 FacⅦa로 전환되는 것을 방지하기 위하여, pH 8.0 이하, 바람직하게는 pH 5.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 pH 5.0 내지 5.5를 가지도록 하고, 온도는 25℃ 이하, 바람직하게는 4 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 4 내지 10℃의 온도를 유지하도록 함이 바람직하다.
또한, 상기 조성물은 FacⅦ 또는 그의 유도체를 0.01 내지 5.0 mg/mL, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다.
상기와 같은 FacⅦ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물은, FacⅦ 또는 그의 유도체를 생산하는 세포, 예컨대 FacⅦ 또는 그의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체 또는/및 이의 배양물로부터 배양 상등액을 수득하고, 이를 여과 과정 또는/및 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등) 등 하나 이상의 정제 단계를 수행하여 정제하여 수득할 수 있다. 한편, 상기 세포는 FacⅦ 또는 그의 유도체를 생산할 수 있는 세포라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며 당업계에 알려진 적절한 세포를 이용할 수 있으나, 예를 들면 동물 세포, 식물 세포, 원핵 세포, 곤충 세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 동물 세포이며, 그 예로 CHO 세포 등이 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “바이러스 불활성화”는 FacⅦ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물 내에 포함되어 있는 바이러스의 감염력, 즉 감수성이 있는 세포와 접촉하여 이 세포 내에서 증식하게 되는 능력을 없애거나 약화시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 바이러스 불활성화는 계면활성제의 처리를 통하여 효과적으로 수행된다.
본 발명에서 용어 "계면활성제"란, 표면활성제라고도 하고, 일반적으로 1분자 속에 친유기와 친수기가 함께 들어 있는 양쪽 친매성(親媒性)인 물질로서, 묽은 용액 속에서 계면에 흡착하여 그 표면장력을 감소시키는 물질을 의미한다. 상기 계면활성제는 수용액에서 이온화 여부에 따라 이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 구분되고, 상기 이온성 계면활성제는 수용액에서 이온화하여 활성제의 주체가 음이온이 되는 음이온 계면활성제, 상기 활성제의 주체가 양이온이 되는 양이온 계면활성제 및 상기 활성제의 주체가 음이온 및 양이온 둘 다 되는 양쪽성 계면활성제로 구분되는데, 상기 비이온성 계면활성제로는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함하고, 상기 음이온 계면활성제로는 비누, 알킬벤젠설폰산염 등을 포함하며, 상기 양이온 계면활성제로는 고급아민할로젠화물, 제사암모늄염, 알킬피리디늄염 등을 포함하고, 상기 양쪽성 계면활성제로는 아미노산 등을 포함한다. 상기 계면활성제는 일반적으로 세척력·에멀션화력·분산력·삼투력·기포력(起泡力) 등을 지니고 있어, 각기 그 특성에 따라 세척제, 섬유처리제, 에멀션화제, 부유선광제(浮遊選鑛劑), 시멘트용 기포제, 윤활유 첨가제, 살균제, 도료분산제(塗料分散劑) 등으로 널리 이용되고 있다. 본 발명의 목적상 상기 계면활성제는 바이러스를 제거하는 살균제의 용도로서 사용되며, 이에 적절한 계면활성제로는 Tween, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, ploxamer188, Triton X-100 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 Triton X-100이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
바이러스 불활성화를 위하여 상기 계면활성제는 최종 조성물의 총 부피에 대하여 0.01 내지 1.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량%이 되도록 첨가됨이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는, 대표적으로 FacⅦ 유도체인 FacⅦ의 C-말단에 ATKAVC 펩타이드가 연결된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 CHO 세포에서 FacⅦ 유도체를 생산하고, 상기 세포 배양물로부터 배양 상등액을 수득하고 이를 정제하여 FacⅦ를 포함하는 조성물을 제조하였다(실시예 1). 또한, pH 5.5를 가지는 상기 조성물에 계면활성제인 Triton X-100을 0.2%(w/v)의 농도로 가하고, 이를 4℃ 온도에서 반응시켜 바이러스 불활성화 과정을 수행하였다(실시예 2). 그 다음, 상기 바이러스 불활성화 과정에 따라 FacⅦ 유도체의 순도가 변화하였는지 확인한 결과, 불활성화 과정 전후 모두 활성화된 FacⅦa를 나타내는 밴드는 나타나지 않았고, 특히 불활성화 과정을 수행하였음에도 자가-절단된 형태도 나타나지 않았다. 또한, 불활성화 전후 조성물의 역가도 거의 유지되는 결과를 나타내었다(실시예 3 및 4). 또한, pH가 5.5인 FacⅦ를 포함하는 용액에 계면활성제인 Triton X-100을 0.1 내지 0.5%(w/v)의 농도로 가하고, 이를 4℃ 온도에서 반응시켜 바이러스 불활성화 과정을 수행하였고, 그 결과, 상기 농도 범위 전체에서 활성화된 형태나 자가-절단된 형태가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, pH가 8.0인 FacⅦ를 포함하는 용액에서도 계면활성제인 Triton X-100을 0.1 내지 0.5%(w/v)의 농도로 가하고, 이를 4℃ 온도에서 반응시켜 바이러스 불활성화 과정을 수행하였고, 이 경우에는 Triton X-100이 0.5%의 고농도 조건으로 첨가되는 경우에 활성화된 형태가 일부 형성되나, 0.1 내지 0.2%의 저농도에서는 활성화된 형태나 자가-절단된 형태가 나타나지 않음을 확인하였다(실시예 5 및 6).
상기와 같은 결과는 모두 FacⅦ 또는 이의 유도체를 포함하는 용액에 계면 활성제를 첨가하는 본 발명의 방법을 수행하는 경우, 바이러스 불활성화 전후의 조성물의 역가가 거의 유사함을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은 분해 또는 변형이 쉽게 일어나는 것으로 알려진 FacⅦ 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물에 적용하여도 효과적인 바이러스 불활성화 효과를 나타내면서도, 상기 단백질의 구조를 손상시키지 않으며 역가 또한 감소시키지 않는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
Fac
Ⅶ 유도체의 제조
실시예
1-1:
Fac
Ⅶ 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제조
먼저 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 기법을 이용하여 신호 서열을 포함하는 인간의 Factor Ⅶ 유전자를 획득 하였다. Factor Ⅶ (FacⅦ) 유전자 증폭을 위하여, 인간 태아의 간(fetal liver) cDNA 라이브러리(TAKARA BIO USA)를 주형으로 하고, 하기의 서열번호 1 및 2의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(95℃ 1분 변성; 30회(95℃ 30초, 60℃ 30초 및 68℃ 90초); 68℃ 5분). 이때, 클로닝 작업을 용이하게 하기 위하여 상기 서열번호 1의 프라이머에는 제한 효소 BamHI 인식 부위를 삽입하였고, 서열번호 2의 프라이머에는 제한 효소 XhoI 인식부위를 삽입하였다. 이어, 상기 PCR을 통하여 수득한 약 1.3kb의 PCR 산물의 염기서열을 확인하였다.
ⅦBHISS F: 5'-cccggatccatggtctcccaggccctcaggctcc-3'(서열번호 1)
ⅦXhoIAS R: 5'-gggctcgagctagggaaatggggctcgcagg-3'(서열번호 2)
상기 수득한 PCR 산물을 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 동물 세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터에 클로닝하였다. 상기 pX0GC 벡터는 하나 이상의 CCGCCC 반복서열이 제거된 DHFR 프로모터의 염기서열 및 이에 작동가능하게 연결된 DHFR을 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터(대한민국 등록특허 제880509호)이다. 구체적으로, 상기 PCR 산물을 제한효소 BamHI과 XhoI으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, PCR 정제 키트(Qiagen, USA)에 적용하여 절단된 DNA 절편을 수득하였으며, 이를 제한효소 BamHI과 XhoI으로 처리된 pX0GC 벡터와 혼합하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 클로닝함으로써, FacⅦ 유전자를 포함하는 발현 벡터(pX0GC-FⅦ)를 제조하였다.
실시예
1-2: 재조합
Fac
Ⅶ 유도체 발현벡터
pX0GC
-FⅦ-
ATKAVC
의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 발현 벡터 pX0GC-FⅦ에 포함된 FacⅦ 유전자의 3'-말단에 SOD1의 1번 내지 6번 서열(ATKAVC, 서열번호 3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 추가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 FacⅦ 유도체 발현벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 제조하였다. 구체적으로, 상기 발현 벡터 pX0GC-FⅦ를 주형으로 하고, 하기의 서열번호 4 및 5의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(95℃ 1분 변성; 30회(95℃ 60초, 60℃ 60초 및 68℃ 90초); 68℃ 5분). 이때, 클로닝 작업을 용이하게 하기 위하여 상기 서열번호 4의 프라이머에는 제한 효소 EcoRI 인식 부위를 삽입하였고, 서열번호 5의 프라이머에는 제한 효소 XhoI 인식부위를 삽입하였다. 이어, 상기 PCR을 통하여 수득한 약 1.4kb의 PCR 산물의 염기서열을 확인하였다.
FⅦEcoRISS F(서열번호 4):
5'-ccggaattcatggccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggc-3'
FⅦ#1XhoIAS R(서열번호 5):
5'-ccgctcgagtcagcacacggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggaggactcctgggc-3'
상기 수득한 PCR 산물을 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있도록 하기 위하여, 동물 세포 발현 벡터인 pX0GC 벡터에 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 PCR 산물을 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, PCR 정제 키트에 적용하여 절단된 DNA 절편을 수득하였으며, 이를 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 처리된 pX0GC 벡터와 혼합하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 클로닝함으로써, FacⅦ 유전자의 3'-말단에 SOD1의 1번 내지 6번 서열인 ATKAVC(서열번호 3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된, FacⅦ 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터(pX0GC-FⅦ-ATKAVC)를 제조하였다.
실시예
1-3:
CHO
세포주를 이용한
Fac
Ⅶ 유도체(
pX0GC
-FⅦ-
ATKAVC
)의 발현
상기 실시예 2-1에서 제조한 발현 벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 DG44/CHO 세포주(CHO/dhfr-)(Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555-566, 1986)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체로부터 FacⅦ-ATKAVC 유도체를 발현시켰다.
구체적으로, 상기 DG44/CHO 세포주를 배양 용기 바닥의 80 내지 90% 정도를 덮을 정도로 배양시킨 다음, 상기 세포를 Opti-MEM(Gibco사, cat. No. 51985034)으로 3회 세척하였다.
한편, 3㎖의 Opti-MEM과 5㎍의 발현 벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC의 혼합물과, 3㎖의 Opti-MEM과 20㎕의 리포펙타민(Gibco사, cat. no. 18324-012)의 혼합물을 각각 상온에서 30분동안 정치시켰다. 이어, 상기 각 혼합물을 혼합하고 상기 배양된 DG44/CHO 세포주에 가한 다음, 37℃ 및 5% CO2 조건으로 약 18시간 동안 배양함으로써, 상기 발현 벡터 pX0GC-FⅦ-ATKAVC를 DG44/CHO 세포주에 도입하였다. 이어, 상기 배양된 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM-F12(Gibco사, cat. no. 11330) 배지로 3회 세척한 다음, 상기 배지를 가하고 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양된 세포에 트립신을 가하여 배양된 세포들을 각각 분리하고, 이들을 선별배지(HT 보충제(Hypoxanthine-Thymidine)가 없고, 10% FBS 및 1㎎/㎖의 G418(Cellgro사, cat. no. 61-234 -RG)를 포함하는 MEM-α 배지(WELGENE사, cat. no. LM008-02))에 접종하였다. 형질전환된 세포들만이 생존하여 콜로니를 형성할 때까지, 상기 선별배지를 2일 또는 3일 간격으로 교환하며 배양함으로써, 상기 분리된 세포들로부터 형질전환체를 선발하였다. 이때, 상기 선발된 형질전환체에서 FacⅦ-ATKAVC 유도체의 발현수준을 향상시키기 위하여, 10nM MTX(Sigma사, cat. no. M8407)를 선별배지에 가하여 점차로 농도를 향상시켜서, 2 내지 3주후에는 30nM까지 MTX의 함량을 증가시켰디.
실시예
1-4:
Fac
Ⅶ-
ATKAVC
의 정제
상기 실시예 1-3에서 제조한 형질전환체를 배양하여 FacⅦ-ATKAVC를 발현시키고, 배양물을 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 배양 상등액을 수득하였다.
상기 배양 상등액을 0.2 ㎛ 미세여과막으로 여과하고, 0.6 M 암모늄설페이트를 가한 다음, Butyl HP 컬럼에 적용하였으며, 0.6-0 M 암모늄설페이트를 포함하는 농도구배 완충액(20 mM Tris-HCl pH7.5)으로 용출하여 FacⅦ-ATKAVC를 포함하는 활성분획을 수득하였다.
상기 수득한 활성분획의 완충액 조건을 10 mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 교체하고, Heparin HP 컬럼에 적용한 다음, 0-1.0 M NaCl 농도구배 완충액(10 mM 소디움 포스페이트, pH 7.0)으로 용출하여 FacⅦ-ATKAVC를 포함하는 활성분획을 수득하였다.
상기 활성분획을 농축하고, Superdex75 컬럼에 적용한 다음, 150mM NaCl 20mM Tris-HCl(pH7.5) 완충액으로 용출하여 FacⅦ-ATKAVC를 포함하는 활성분획을 수득하였다. 상기 수득한 활성분획의 완충액 조건을 2 mM 벤자미딘 20 mM Tris-HCl(pH7.5) 완충액으로 교체하고, Q FF 컬럼에 적용한 다음, 세척(2mM 벤자미딘 0.2M NaCl 20mM Tris-HCl(pH8.0) 완충액), 재평형화(2 mM 벤자미딘 0.1M NaCl 20 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충액) 및 농도구배 용출(2 mM 벤자미딘 25 mM NaCl 35 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl(pH8.0) 완충액)을 수행하여 FacⅦ-ATKAVC를 정제하였다.
실시예
2:
Fac
Ⅶ 유도체를 포함하는 용액의 바이러스 불활성화
상기 실시예 1에서 정제된 FacⅦ 유도체는 한외여과(Pellicon XL, PLCGC 10 50㎠, Millipore) 및 정용여과를 통해 최종완충액(10mM NaAc (pH 5.5), 0.02% Pluronic F-68, 5% Mannitol, 0.01% L-Methionine, 50mM NaCl)에 최종 0.46mg/ml의 농도로 용해시켰다. 바이러스 불활성화를 위해 크기 배제 크로마토 그래피 순도 97% 이상의 FacⅦ 유도체를 포함하는 용액에 계면활성제인 Triton X-100를 0.2%(w/v)가 되도록 가하고, 4℃에서 30분 동안 천천히 교반하였다. 이후 다시 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 상기 최종완충액에 용해시켰다.
실시예
3: 바이러스 불활성화 공정을 거친
Fac
Ⅶ 유도체의 순도 분석
상기 실시예 2에서 바이러스 불활성화 공정을 거친 FacⅦ 유도체의 순도는 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)을 통하여 분석하였다(도 1). 도 1은 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 유도체 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 전, 후 순도를 분석결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 1에서 보듯이, 바이러스 불활성화 공정 처리 전 시료와 비교하여 동일한 크기의 분자량 및 순도를 보였으며 FacⅦa 유도체와 같이 활성화된 형태나 자가-절단된 형태도 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예
4: 바이러스 불활성화 공정을 거친
Fac
Ⅶ 유도체의
역가
분석
FacⅦ 유도체와 바이러스 불활성화 공정을 거친 FacⅦ 유도체는 COASET Chromogenic assay kit(Chromogenix, Italy)를 이용하여 Effective concentration 50(EC50)를 측정하였다. 바이러스 불활성화 공정을 거치지 않은 FacⅦ 유도체와 바이러스 불활성화 공정을 거친 FacⅦ 유도체를 상기 kit에 포함되어 있는 working buffer로 60 ng/ml부터 0.03ng/ml까지 2배 연속 희석법으로 희석하고, 이를 96 well plate의 각 웰에 50ul 씩 분주하였다. 그런다음, FacX, CaCl2 및 트롬보플라스틴(thromboplastin)이 포함된 조합시약(combined reagent)을 각 웰에 50ul씩 분주하고 37℃에서 7분간 반응시킨 후, 기질을 각 웰에 50ul씩 분주하였다. 끝으로, 405nm에서 흡광도를 측정하여 각 FacⅦ 유도체의 EC50를 비교분석 하였다(도 2 및 표 1). 도 2는 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 유도체 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 공정 전, 후 활성 분석결과를 나타내는 그래프로서, 푸른색 선은 바이러스를 불활성화하기 이전의 FacⅦ 유도체의 활성을 나타내고 붉은색 선은 바이러스를 불활성화한 이후의 FacⅦ 유도체의 활성을 나타낸다.
상기 도 2 및 표 1에서 보듯이, 바이러스 불활성화 공정을 거치지 않은 FacⅦ 유도체와 바이러스 불활성화 공정을 거친 FacⅦ 유도체의 EC50은 0.961ng/ml 과 1.024ng/ml 으로 각각 측정되어 바이러스 불활성화 공정을 거친 후에도 EC50 값은 크게 변화하지 않음을 알 수 있었다.
실시예
5:
Fac
Ⅶ 을 포함하는 용액의 바이러스 불활성화
상기 실시예 1과 유사한 방법으로 정제된 FacⅦ를 용출 완충액(2 mM 벤자미딘 25 mM NaCl 35 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl(pH8.0)) 상태와 한외여과(Pellicon XL, PLCGC 10 50㎠, Millipore) 및 정용여과를 통해 최종 완충액 10mM Tris(pH 8.0) 및 50 mM Photassium phosphate (pH5.5)에 최종 1.0 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 바이러스 불활성화를 위해 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 순도 97% 이상의 FacⅦ 유도체를 포함하는 용액에 계면활성제인 Triton X-100를 0.1 ~0.5%(w/v)가 되도록 가하고, 4℃에서 30~60분 동안 천천히 교반하였다. 이후 다시 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 상기 최종 완충액에 용해시켰다.
실시예
6: 바이러스 불활성화 공정을 거친
Fac
Ⅶ 의 순도 분석
상기 실시예 5에서 바이러스 불활성화 공정을 거친 FacⅦ의 순도는 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석하였다(도 3). 도 3은 CHO 세포주를 이용하여 발현 및 정제된 FacⅦ 용액에 계면활성제를 사용한 바이러스 불활성화 전, 후 순도를 분석결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 3에서 보듯이, 바이러스 불활성화 공정 처리 전 시료와 비교하여 pH 5.5 조건의 경우 Triton X-100의 0.1~0.5%(w/v) 범위에서는 FacⅦa 와 같이 활성화된 형태나 자가-절단된 형태도 나타나지 않는 동일한 크기의 분자량 및 순도를 보였으며, pH 8.0 조건 경우 Triton X-100의 0.1~0.5%(w/v) 범위에서는 0.5% 같은 고농도 조건 경우만 FacⅦa 유도체와 같이 활성화된 형태가 일부 형성됨을 확인하였으며 (점선박스 표시), 0.1%, 0.2% 농도에서는 FacⅦa 유도체와 같이 활성화된 형태나 자가-절단된 형태도 나타나지 않음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.
<120> A method of virus inactivation in composition comprising Factor
VII
<130> PA130035-KR-P1
<150> KR 10-2013-0011472
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<160> 20
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
cccggatcca tggtctccca ggccctcagg ctcc 34
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gggctcgagc tagggaaatg gggctcgcag g 31
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker
<400> 3
Ala Thr Lys Ala Val Cys
1 5
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ccggaattca tggccaacgc gttcctggag gagctgcggc cgggc 45
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccgctcgagt cagcacacgg ccttcgtcgc gggaaatggg gctcgcagga ggactcctgg 60
gc 62
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Cys
1 5
<210> 7
<211> 149
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human SOD1 1-149
<400> 7
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp
20 25 30
Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His
35 40 45
Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp
85 90 95
Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile
100 105 110
Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu
130 135 140
Ala Cys Gly Val Ile
145
<210> 8
<211> 149
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified Human SOD1 1-149
<400> 8
Ala Thr Lys Ala Val Cys Ile Pro Arg Ile Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp
20 25 30
Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His
35 40 45
Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp
85 90 95
Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile
100 105 110
Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu
130 135 140
Ala Cys Gly Val Ile
145
<210> 9
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human SOD1 1-90
<400> 9
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp
20 25 30
Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His
35 40 45
Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp
85 90
<210> 10
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified Human SOD1 1-90
<400> 10
Ala Thr Lys Ala Val Cys Ile Pro Arg Ile Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp
20 25 30
Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His
35 40 45
Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp
85 90
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human SOD1 1-25
<400> 11
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser
20 25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> modified Human SOD1 1-25
<400> 12
Ala Thr Lys Ala Val Cys Ile Pro Arg Ile Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser
20 25
<210> 13
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FactorVII-ATKAVC
<400> 13
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ala Thr Lys Ala
435 440 445
Val Cys
450
<210> 14
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FactorVII-GGGGSC
<400> 14
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Cys
450
<210> 15
<211> 593
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FactorVII-SOD1 1~149
<400> 15
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ala Thr Lys Ala
435 440 445
Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe
450 455 460
Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys
465 470 475 480
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
485 490 495
Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser
500 505 510
Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu
515 520 525
Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu
530 535 540
Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr
545 550 555 560
Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu
565 570 575
Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val
580 585 590
Ile
<210> 16
<211> 593
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FactorVII-SOD1 IPRI
<400> 16
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ala Thr Lys Ala
435 440 445
Val Cys Ile Pro Arg Ile Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe
450 455 460
Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys
465 470 475 480
Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp
485 490 495
Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser
500 505 510
Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu
515 520 525
Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu
530 535 540
Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr
545 550 555 560
Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu
565 570 575
Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val
580 585 590
Ile
<210> 17
<211> 534
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVII-SOD1 1-90
<400> 17
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Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
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Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
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<220>
<223> FVII-SOD1 1-25
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<220>
<223> FactorVII-SOD1 1~25 IPRI
<400> 20
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450 455 460
Glu Gln Lys Glu Ser
465
Claims (13)
- 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 부가하는 단계를 포함하는 바이러스의 불활성화 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물에 포함된 활성화된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체의 함량이 조성물에 포함된 전체 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체에 대하여 5% 미만인 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 액상 조성물인 것인 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 액상 조성물은 pH 5.0 내지 8.0인 것인 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 액상 조성물은 4 내지 25℃의 온도를 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물에 포함된 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체의 농도는 0.01mg/mL 내지 5.0 mg/mL인 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 Tween, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, ploxamer188, Triton X-100 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 조성물 내의 최종 농도가 0.01 내지 1.00 중량%가 되도록 부가되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 계면활성제는 조성물 내의 최종 농도가 0.1 내지 0.5 중량%가 되도록 부가되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 혈액응고인자 Ⅶ의 유도체는 혈액응고인자 Ⅶ의 C-말단에 펩타이드 링커가 연결된 것인 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 펩타이드 링커는 C-말단의 마지막 아미노산 잔기가 시스테인(cysteine)인 것인 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 펩타이드 링커는 서열번호 3 및 6 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 하나의 펩타이드 서열을 가지는 것인 방법.
- 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물에 계면활성제를 부가하는 단계를 포함하는, 혈액응고인자 Ⅶ 또는 그의 유도체를 포함하는 바이러스가 불활성화된 조성물의 제조방법.
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| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20200824 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20200527 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |