KR20140082796A - 항-HtrA1 항체 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-HtrA1 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-HtrA1 항체 및 사용 방법{ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2011년 10월 14일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/547,649를 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 2012년 10월 8일에 생성된 상기 ASCII 카피는 P4761R1WO_SequenceListing.TXT로 명명되고, 크기는 47,273 바이트이다.

발명의 분야

본 발명은 항-HtrA1 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

세린 프로테아제 HtrA1 (PRSS11; 클랜(Clan) PA, 패밀리 S1)은 HtrA 단백질의 진화적으로 보존된 패밀리에 속한다 (문헌 [Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol 12:152-62 (2011); Clausen, T., et al., Mol Cell 10:443-55 (2002)]). 인간에서, HtrA1, 3 및 4는 동일한 도메인 구조: N-말단 IGFBP-유사 모듈 및 카잘(Kazal)-유사 모듈, 트립신-유사 폴드를 갖는 프로테아제 도메인, 및 C-말단 PDZ 도메인을 공유한다. HtrA1의 생리학적 관련성은 가족성 허혈성 뇌 소혈관 질환을 야기하는 인간 기능 상실 돌연변이의 확인에 의해 확고하게 확립된 바 있다 (문헌 [Hara, K., et al., N Engl J Med 360:1729-39 (2009)]). 분자 메카니즘은 증가된 TGF-β 신호전달을 유발하는 HtrA1에 의한 TGF-β 억제 결핍을 포함한다 (문헌 [Hara et al., 2009]). 이상 HtrA1 발현에 의한 조절이상 TGF-β 신호전달은 또한, 아마도 다양한 세포외 매트릭스 성분의 HtrA1-매개 분해와 함께 (문헌 [Chamberland et al., J Biol Chem 284:27352-9 (2009); Grau, S., et al., J Biol Chem 281:6124-9 (2006); Hadfield, K.D., et al., J Biol Chem 283:5928-38 (2008); Tocharus, J., et al., Dev Growth Differ 46:257-74 (2004); Tsuchiya et al., 2005)]), 또는 매트릭스 메탈로프로테아제의 상향-조절을 통해 간접적으로 (문헌 [Grau et al., 2006]), 관절염성 질환의 원인이 될 수 있다 (문헌 [Oka, C., et al., Development 131:1041-53 (2004); Tsuchiya, A., et al., Bone 37:323-36 (2005)]). 또한, 인간 유전자 연구는 증가된 HtrA1 전사체 수준을 유발하는 HtrA1 프로모터 영역에서의 SNP와 연령-관련 황반 변성의 진행 사이의 강력한 상관관계를 확인하였다 (문헌 [Dewan, A., et al., Science 314:989-92 (2006); Yang, Z., et al., Science 314:992-3 (2006)]). 따라서, HtrA1 효소 기능의 억제는, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 및 관절염성 질환에서의 매력적인 치료적 접근법이다.

개요

본 발명은 항-HtrA1 항체 및 진단 및 치료 목적을 위한 그의 사용 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁적으로 HtrA1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 경쟁적 결합은, 예를 들어 ELISA 검정을 이용하여 결정될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 하기 특성: (i) 하나 이상의 HtrA1 기질에 대한 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 그 이하 값 미만의 IC₅₀; (ii) HtrA1 삼량체의 1개의 서브유닛에 대한 1개의 가변 도메인의 비로 HtrA1에 결합하는 것 (예를 들어, Fab는 1개의 HtrA1 삼량체에 대한 3개의 Fab의 비로 HtrA1 삼량체에 결합하고, IgG는 2개의 HtrA1 삼량체에 대한 3개의 IgG의 비로 HtrA1 삼량체에 결합함), (iii) 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체에 대해, 도 9에 나타낸 것과 유사한 "케이지" 형성을 유발하는 방식으로 HtrA1에 결합하는 것, (iv) HtrA1의 삼량체 형성을 막지 않는 것, (v) HtrA1 단백질의 루프 C 내의 하나 이상의 잔기에 결합하는 것, (vi) HtrA1의 프로테아제 도메인에 결합하는 것, (vii) 서열 13의 아미노산 N224 또는 K248 중 하나 또는 둘 다, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 아미노산 (예를 들어, 서열 14의 아미노산 N224 및 K248, 도 10a 및 b 참조)을 포함하는 에피토프에 결합하는 것; (viii) 서열 13의 N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 및 H220의 상기 잔기 중 하나 이상, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 것; (ix) 뮤린 HtrA1과 교차-반응하는 것; (x) HtrA2, HtrA3 및/또는 HtrA4와 교차-반응하지 않는 것; (xi) 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁적으로 HtrA1에 결합하는 것, (xii) 500 nM 이하의 해리 상수로 HtrA1에 결합하는 것, 또는 (xiii) HtrA1과 α1-항트립신 (A1AT) 사이의 복합체 형성을 억제하는 것 중 하나 이상을 갖는, HtrA1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 HtrA1에 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 항체는 (i) HtrA1의 N224, K248 또는 둘 다를 포함하는 에피토프에 결합하고, (ii) HtrA1을 30 nM 이하의 IC₅₀으로 억제한다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 HtrA1의 하기 잔기: V201, T223, K243, K225, E247및 H220 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 하기 특성: (i) HtrA1 삼량체의 1개의 서브유닛에 대한 1개의 가변 도메인의 비로 HtrA1에 결합하는 것, 또는 (ii) HtrA1의 삼량체 형성을 막지 않는 것 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, IC₅₀은, 예를 들어 본원에 기재된 FRET 검정과 같은, 서열 12를 갖는 기질을 사용한 세린 프로테아제 검정을 이용하여 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 HtrA2, HtrA3 및 HtrA4 중 하나 이상과 교차-반응하지 않는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 500 nM 이하의 해리 상수를 갖는다. 해리 상수는, 예를 들어 Fab를 이용하여 비아코어(BIAcore)에 의해 결정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 모노클로날 항체이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 HtrA1에 결합한 항체 단편이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3; (b) X_g가 S, V 또는 D 이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYYIH (서열 25)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA (서열 23)를 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 17의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 (FR2) 서열을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 32를 포함하는 VH 서열; (b) 서열 31을 포함하는 VL 서열; 또는 (c) 서열 32를 포함하는 VH 서열 및 서열 31을 포함하는 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 8의 VH 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 7의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 30의 VH 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 28의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 29의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 30의 VH 서열 및 서열 28의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열 30의 VH 서열 및 서열 29의 VL 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYYIH (서열 25)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2; (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3; (d) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I 이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA (서열 23)를 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 4, 20 및 47-51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21 및 33으로부터 선택한 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22 및 34-46으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHY (서열 89)를 포함하는 HVR-H3; (b) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 X_gX_hX_iX_jPX_k (서열 86)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_o (서열 88)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYY (서열 87)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_o (서열 88)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHY (서열 89)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 X_aX_bX_cX_dX_eX_f (서열 85)를 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (c) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 X_gX_hX_iX_jPX_k (서열 86)를 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYY (서열 87)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_o (서열 88)를 포함하는 HVR-H2; (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHY (서열 89)를 포함하는 HVR-H3; (d) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 X_aX_bX_cX_dX_eX_f (서열 85)를 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 X_gX_hX_iX_jPX_k (서열 86)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 전장 IgG1 또는 IgG4 항체이다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-HtrA1 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-HtrA1 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

또 다른 측면에서, 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 이 방법은 항-HtrA1 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 항-HtrA1 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 숙주 세포 배양물로부터 항-HtrA1 항체를 회수하거나, 항-HtrA1 항체를 정제하거나, 또는 제약상 허용되는 부형제와 함께 항-HtrA1 항체를 제제화하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 항-HtrA1 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다.

또 다른 측면에서, 항-HtrA1 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제가 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 의약으로 사용하기 위한, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 (습성 또는 건성), 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 치료하는데 사용하기 위한, 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위한, 또는 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 의약, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 (AMD, 습성 또는 건성), 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DR), 미숙아 망막병증 (ROP), 또는 폴립형 맥락막 혈관병증 (PCV)을 치료하기 위한, 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위한, 또는 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하기 위한 의약의 제조를 위한 항-HtrA1 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 바와 같은 항-HtrA1 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 연령-관련 황반 변성 (습성 또는 건성), 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 앓는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항-HtrA1 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 출원은 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항-HtrA1 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-b. 도 1a는 항-HtrA1 항체94 (YW505.94)의 경쇄 가변 도메인 서열 (서열 7)을 나타낸다. 도 1b는 항-HtrA1 항체94 (YW505.94)의 중쇄 가변 도메인 서열 (서열 8)을 나타낸다. 잔기는 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링하였다 (문헌 [Kabat, E.A., et al., 1991, In: Sequences of proteins of immunological interest, fifth edition. National Institutes of Health, Bethesda, MD]). YW505.94 경쇄 가변 도메인 서열은 인간 카파I (KappaI) 경쇄 컨센서스 서열 (서열 9)과 정렬하고, YW505.94 중쇄 가변 도메인 서열은 인간 하위군 III 중쇄 서열 (서열 10)과 정렬하였다. 상자표시된 서열은 카바트 정의에 따른 CDR이다. 항-HtrA1 (YW505.94)과 컨센서스 서열 사이의 서열 차이는 음영처리하였다.
도 2. 13개의 파지 유래 항체 (IgG) 패널 스크리닝. 단일 농도 (0.08 - 최종 0.28 mg/ml)의 IgG를 HuHtrA1 또는 HuHtrA1_PD와 함께 인큐베이션하고, FRET 검정에서 효소 활성을 측정하였다. 13개의 시험된 항체 중, 항체 YW503.57, YW504.57, YW504.61 및 YW505.94 (Ab94 또는 IgG94로도 지칭됨)는 HuHtrA1 및 HuHtrA1_PD 활성 둘 다를 강력하게 억제하였다.
도 3. IgG94 및 Fab94에 의한 HuHtrA1의 억제. HuHtrA1을 37℃에서 20분 동안 IgG94 및 Fab94와 함께 인큐베이션하였다. 펩티드 기질 H2-Opt에 대한 효소 활성을 측정하고, 결정된 선형 속도로부터 분획 활성 (v_i/v_o)을 계산하였다. 300 nM에서의 IgG94는 트립신 (1 nM) 또는 엘라스타제 (1 nM)에 의한 H2-Opt 가수분해를 억제하지 않았다.
도 4. IgG94는 HuHtrA1 및 MuHtrA1에 의한 형광 염료-표지된 카세인 (BODIPY FL)의 가수분해를 억제한다. HuHtrA1 및 MuHtrA1을 37℃에서 15분 동안 IgG94와 함께 인큐베이션하였다. 카세인 BODIPY FL 시약의 가수분해를 37℃에서 마이크로플레이트 판독기 상에서 측정하고, 형광 증가의 선형 속도를 결정하여 억제되지 않은 속도의 퍼센트 (대조군의 %)로서 표현하였다.
도 5. IgG94의 특이성. MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD를 증가하는 농도의 IgG94와 함께 인큐베이션하고, 펩티드 기질 H2-Opt (상단 패널) 또는 카세인 BODIPY FL 시약 (하단 패널)에 대한 효소 활성을 결정하여 억제되지 않은 효소 활성의 퍼센트 (대조군의 %)로서 표현하였다.
도 6. IgG94에 의한 HuHtrA1-매개 거대분자 기질 절단의 억제. 증가하는 농도의 IgG94 (β-카세인에 대해 2.3-150 nM; 데코린에 대해 2-125 nM; 비글리칸에 대해 2.3-150 nM)를 37℃에서 15분 동안 HuHtrA1 (β-카세인에 대해 10 nM; 데코린에 대해 125 nM; 비글리칸에 대해 75 nM)과 함께 인큐베이션하였다. 기질 β-카세인, 데코린 및 비글리칸 (50 μg/ml)을 첨가하고, 2-14시간 동안 인큐베이션하였다. SDS-샘플 완충제의 첨가 후에, 소화물을 SDS-PAGE (비-환원 조건)에 의해 분석하고, 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue Safestain)에 의해 염색하였다.
도 7a-c. HuHtrA1_PD 상 IgG94의 기능적 에피토프의 맵핑. 도 7a는 활성 부위 주위 잔기의 알라닌 치환을 갖는 HuHtrA1_PD 돌연변이체에 대한 IgG94의 결합을 측정한 ELISA의 결과를 나타낸다. 음영처리한 행은 결합에 있어서 5배 초과 감소를 유발하는 알라닌 치환을 가리킨다. 도 7b는 돌연변이된 잔기를 표시한 HuHtrA1_PD (PDB 3NWU)의 구조를 나타낸다 (문헌 [Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 12:152-62 (2011)]). 중간 회색 음영처리는 초기 실험에서 IgG94 결합의 손실이 없는 돌연변이를 나타내고; 암회색 음영처리는 결합 친화도에서 5배 초과의 손실을 갖는 잔기의 하위세트를 나타낸다. 표면 묘사에서 나타난, 프로테아제 도메인 삼량체를 형성하는 3개의 단량체는 담회색으로 음영처리하였다. 세작용기 촉매 잔기 D250 및 S328은 밑줄표시하였다. 도 7c는 HuHtrA1_PD (PDB 3NWU)의 단량체 상 에피토프 잔기 N224 및 K248을 보유하는 루프 (담회색, 카툰으로 표시)의 확대도를 나타낸다. 촉매 잔기 H220 또한 포함된다.
도 8a-b. Fab94:HuHtrA1_PD (S328A) 복합체 (도 8a) 및 IgG94:HuHtrA1_PD (S328A) 복합체 (도 8b)의 SEC-MALLS (크기 배제 크로마토그래피 - 다각도 레이저 광 산란). SEC에 의한 용리 피크 (x-축) 및 개별 단백질 및 복합체의 질량 (y-축; 용리 피크를 가로지르는 점선)을 나타냈다.
도 9. IgG:HuHtrA1-PD 복합체의 가설 '케이지 모델'
도 10a-b. 인간 HtrA1 (서열 13), 뮤린 HtrA1 (서열 14), 뮤린 HtrA3 (서열 15) 및 뮤린 HtrA4 (서열 16)의 정렬.
도 11. 일정한 광 노출의 마우스 모델 망막에서의 HtrA1 mRNA 발현 증가 (상단 좌측 패널). HtrA2 수준은 동일 모델에서 유의하게 달라지지 않았다 (상단 우측 패널). HtrA1 발현은 기준선에서 마우스 망막에서의 HtrA2, HtrA3 및 HtrA4 발현 수준보다 유의하게 높았다 (하단 패널).
도 12. 일정한 광 노출의 마우스 모델에서의 HtrA1 발현 부재 하의 증가된 양극성 세포/뮐러(Muller) 세포 반응.
도 13. 일정한 광 노출의 마우스 모델에서의 HtrA1 발현 부재 하의 망막의 보존성.
도 14. 일정한 광 노출의 마우스 모델에서의 HtrA1 발현 부재 하의 외과립층 (ONL) 광수용체 세포의 보존성.
도 15. 항-HtrA1 항체 YW505.94a의 친화도-개선 변이체에 대한 경쇄 HVR 서열.
도 16. 항-HtrA1 항체 YW505.94a의 친화도-개선 변이체에 대한 중쇄 HVR 서열.
도 17. HuHtrA1에 대한 YW505.94a 친화도-개선 변이체의 결합을 입증하는 파지 경쟁 검정의 결과.
도 18. MuHtrA1에 대한 YW505.94a 친화도-개선 변이체의 결합을 입증하는 파지 경쟁 검정의 결과.
도 19a-c. 래트 조직 (도 19a), 마우스 눈 유체 (도 19b) 및 마우스 망막 조직 (도 19c)에서의 HtrA1 단백질의 수준을 나타내는 ELISA 검정의 결과.

I. 정의

본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같은 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.

"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.

"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.

용어 "항-HtrA1 항체" 및 "HtrA1에 결합하는 항체"는 항체가 HtrA1의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 HtrA1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-HtrA1 단백질에 대한 항-HtrA1 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정 시 HtrA1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, HtrA1에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 상이한 종으로부터의 HtrA1 중에 보존된 HtrA1의 에피토프에 결합한다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.

"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포 기능의 억제 또는 저해 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단에 이른다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.

"프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4로 나타난다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래의 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 또는 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.

"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.

"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 본원에 사용된 바와 같은 HVR 영역은 위치 24-36 (L1에 대해), 46-56 (L2에 대해), 89-97 (L3에 대해), 26-35B (H1에 대해), 47-65 (H2에 대해) 및 93-102 (H3에 대해) 내에 위치한 임의 번호의 잔기를 포함한다. 따라서, HVR은 이전에 기재된 위치에서의 잔기를 포함한다:

A) 24-34 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);

B) L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]).

C) 30-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (H1), 47-58 (H2), 93-100a-j (H3) (문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]).

VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다 (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.

"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같은 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.

"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에, 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하거나, 또는 코딩 서열만을 함유한다.

"항-HtrA1 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 별개 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 집단에 포함된 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함), 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에 기재된다.

"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제 내에 존재할 수 있다.

"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 이와 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.

용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하는데 사용된다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않은 상태에서의, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 소스 코드는 20559 워싱턴 디.씨. 소재의 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 이용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B와 비교한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B와 비교한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:

X/Y의 분율 × 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬에서 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한 것이다.

용어 "제약 제제"는, 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"제약상 허용되는 담체"는 대상체에 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "고온 요건 연관 A" 또는 "HtrA1"은 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 HtrA1을 지칭한다. 상기 용어는 비프로세싱된 "전장" HtrA1 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 HtrA1를 포함한다. 상기 용어는 또한 HtrA1의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 HtrA1의 아미노산 서열은 서열 13에 나타낸다. 인간 HtrA1의 예시적인 단편은 아미노산 Q23-P480 또는 P161-K379를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 단편을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 회복 또는 향상된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합과 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

II. 조성물 및 방법

한 측면에서, 본 발명은 부분적으로, HtrA1 활성의 감소가 눈, 외과립층에서의 광수용체 세포, 및 망막전위도 기능성에 대한 보호 효과를 갖는다는 발견을 기초로 한다. 특정 실시양태에서, HtrA1에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 또는 지도형 위축과 같은 안구 장애를 포함하는 HtrA1 활성과 연관된 다양한 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.

A. 예시적인 항-HtrA1 항체

한 측면에서, 본 발명은 HtrA1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 하기 특성: (i) 하나 이상의 HtrA1 기질에 대해 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 그 이하 값 미만의 IC₅₀을 갖는 것; (ii) HtrA1 삼량체의 1개의 서브유닛에 대한 1개의 가변 도메인의 비로 HtrA1에 결합하는 것 (예를 들어, Fab는 1개의 HtrA1 삼량체에 대한 3개의 Fab의 비로 HtrA1 삼량체에 결합하고, IgG는 2개의 HtrA1 삼량체에 대한 3개의 IgG의 비로 HtrA1 삼량체에 결합함), (iii) 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체에 대해, 도 9에 나타낸 것과 유사한 "케이지" 형성을 유발하는 방식으로 HtrA1에 결합하는 것, (iv) HtrA1의 삼량체 형성을 막지 않는 것, (v) HtrA1 단백질의 루프 C 내의 하나 이상의 잔기에 결합하는 것, (vi) HtrA1의 프로테아제 도메인에 결합하는 것, (vii) 서열 13의 아미노산 N224 또는 K248 중 하나 또는 둘 다, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 아미노산 (예를 들어, 서열 14의 아미노산 N224 및 K248, 도 10a-b 참조)을 포함하는 에피토프에 결합하는 것; (viii) 서열 13의 잔기 N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 및 H220 중 하나 이상, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 것; (ix) 뮤린 HtrA1과 교차-반응하는 것; (x) HtrA2, HtrA3 및/또는 HtrA4와 교차-반응하지 않는 것; (xi) 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁적으로 HtrA1에 결합하는 것, 또는 (xii) 500 nM 이하의 해리 상수로 HtrA1에 결합하는 것, 또는 (xiii) HtrA1과 α1-항트립신 (A1AT) 사이의 복합체 형성을 억제하는 것 중 하나 이상을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HtrA1 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 6 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

임의의 상기 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 서열 17의 FR2 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 항-HtrA1 항체는 서열 8 또는 29 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-HtrA1 항체는 HtrA1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 8 또는 29에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-HtrA1 항체는 서열 8, 29 또는 32에서의 VH 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 4, 20, 25 및 47-51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 5, 26 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 6, 27 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.

또 다른 측면에서, 서열 7, 28 또는 30 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-HtrA1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-HtrA1 항체는 HtrA1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 7, 28 또는 30에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-HtrA1 항체는 서열 7, 28, 30 또는 31에서의 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 1, 18, 21, 23 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3, 19, 22, 24 및 34-36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-HtrA1 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 32 및 서열 31 각각에서의 VH 및 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 8 및 서열 7 각각에서의 VH 및 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 29 및 서열 28 각각에서의 VH 및 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 29 및 서열 30 각각에서의 VH 및 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-HtrA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항-HtrA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 13의 잔기 N224, K248 또는 둘 다, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 잔기를 함유하는 HtrA1의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, HtrA1의 에피토프는 서열 13의 하기 잔기 V201, T223, K243, K225, E247 및 H220 중 하나 이상, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 아미노산을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 13의 잔기 N224, K248 및 V201 중 하나 이상 또는 상기 모두, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 잔기를 함유하는 HtrA1의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 13의 잔기 N224, K248, V201, T223 및 K243 중 하나 이상 또는 상기 모두, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 잔기를 함유하는 HtrA1의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 13의 잔기 N224, K248, V201, T223, K243, K225, E247 및 H22A 중 하나 이상 또는 상기 모두, 또는 상이한 HtrA1 서열에서의 그와 동등한 잔기를 함유하는 HtrA1의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 선형 에피토프이다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 입체형태적 에피토프이다.

본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-HtrA1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.

특정 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-HtrA1 항체는 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 갖는 항체가 아니다.

추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-HtrA1 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:

1. 항체 친화도

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행되는 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 후속적으로 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수도 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.

또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.))을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에, 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 10⁶ M^-1 s^-1을 초과하는 경우, 회합률은 분광계, 예컨대 정지-유동 구비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같은 증가하는 농도의 항원 존재 하의 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

2. 항체 단편

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.

디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (매사추세츠주 월섬 소재의 도만티스, 인크.(Domantis, Inc.); 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).

항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

3. 키메라 및 인간화 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)은 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)은 인간 항체 서열로부터 유래된 것인 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("리서페이싱" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

4. 인간 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMAB® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; 케이-엠 마우스(K-M MOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.

5. 라이브러리-유래 항체

본 발명의 항체는 목적 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 목적 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이, 나이브 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.

6. 다중특이적 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 HtrA1에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 HtrA1의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 HtrA1을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 이용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.

"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).

본원의 항체 또는 단편은 HtrA1 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 또한 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).

7. 항체 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적 특징, 예를 들어 항원-결합을 보유한다면, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 대해 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 목적 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.

표 1

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류와 교환하는 것을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되면, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다.

변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪은 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조) 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어져, 결합 친화도에 대해 시험된 변이체 VH 또는 VL을 생성시킬 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 다양성을 도입한다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 목적 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 몇몇 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6개의 잔기)를 무작위화시키는 HVR-지정 접근법을 포함한다. 항원 결합과 관련된 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.

특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서는, 잔기 또는 표적 잔기들의 군 (예를 들어 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체의 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조로 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그것이 목적 특성을 함유하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 일반적으로 N-연결에 의해 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 내 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정되는 바와 같은 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한 Asn297에서의 당 쇄 내의 평균 푸코스 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서의 대략적인 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 소수의 서열 변이에 기인하여, 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (프레스타, 엘.(Presta, L.)); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. 탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, 프레스타, 엘; 및 WO　2004/056312 A1, 아담스 (Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.

이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (진-마이렛(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 번호 6,602,684 (우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 (우마나 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 1개 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 (라주, 에스.(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 (라주, 에스.)에 기재되어 있다.

c) Fc 영역 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입함으로써 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은, 이펙터 기능 모두가 아닌 일부 이펙터 기능을 보유하고 이는 생체내 항체의 반감기는 중요하나 특정 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 또는 해로운 적용에 대한 바람직한 후보를 만드는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체가 FcγR 결합은 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍됨), FcRn 결합 능력은 유지하고 있는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.)); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega)) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).

감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체, 예컨대 잔기 265 및 297에서의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "다나(DANA)" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).

FcR에 대한 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).

특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (EU 잔기 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.

증가된 반감기, 및 태아에게 모체 IgG를 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 그 안에서의 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).

Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이를 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링) 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

e) 항체 유도체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물에서의 안정성에 기인하여 제조에서 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 그들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체와 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 유해하지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포를 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-HtrA1 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터(Chinese Hamster) 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-HtrA1 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

항-HtrA1 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다.

항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아 내에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다 (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.

원핵생물 이외에도 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 항체의 생산을 유발하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.

글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와의 접합에, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.

식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR^- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.

C. 검정

본원에 제공된 항-HtrA1 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.

1. 결합 검정 및 다른 검정

한 측면에서, 본 발명의 항체를, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.

또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 HtrA1에 대한 결합에 대해 Fab94 또는 IgG94와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 Fab94 또는 IgG94 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ]에 제공된다.

예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 HtrA1을 HtrA1에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, Fab94 또는 IgG94) 및 HtrA1에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 내에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 HtrA1을 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션한다. HtrA1에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 HtrA1과 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 HtrA1과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 HtrA1에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.

2. 활성 검정

한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 그의 항-HtrA1 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 HtrA1의 하나 이상의 생물학적 활성의 차단, 길항, 억제, 간섭, 조정 및/또는 감소를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 HtrA1에 결합하고, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같은 H2-Opt 펩티드, β-카세인 또는 BODIPY FL 카세인 기질, 또는 임의의 다른 적합한 HtrA1 기질을 비롯한 하나 이상의 HtrA1 기질에 대한 그의 세린 프로테아제 활성을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 하나 이상의 HtrA1 기질에 대해 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 이하 값 미만의 IC₅₀으로 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 안구 질환 모델, 예컨대 하기 실시예에 기재된 일정한 광 노출 마우스 모델에서 광수용체 세포를 분해로부터 보호하거나, 외과립층의 두께를 보호하거나, 또는 망막전위도 기능적 활성을 보호한다.

D. 면역접합체

본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-HtrA1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 약물에 접합되는 항체-약물 접합체 (ADC)이다.

또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체를 생산하는데 이용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출용으로 사용되는 경우, 그것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.

항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)를 사용할 수 있다.

본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터의) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가교제 시약으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.

E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-HtrA1 항체는 생물학적 샘플에서 HtrA1의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 외과립층 세포, 내과립층 세포, 뮐러 세포, 섬모 상피 또는 망막 조직을 포함하는 샘플을 포함한다.

한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 HtrA1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 HtrA1에 대한 항-HtrA1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-HtrA1 항체와 접촉시키는 것, 및 항-HtrA1 항체와 HtrA1 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는, 예를 들어 HtrA1이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-HtrA1 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.

특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체로 치료하기에 적합한 환자는 HtrA1 유전자 또는 HtrA1 제어 서열에서의 하나 이상의 다형성, 예컨대 HtrA1 프로모터 다형성 rs11200638(G/A)을 검출함으로써 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [A. DeWan, et al., Science 314: 989-992 (2006)] 참조).

본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는, 예를 들어 습성 연령-관련 황반 변성 (AMD), 건성 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축 (GA), 당뇨병성 망막병증 (DA), 미숙아 망막병증 (ROP) 또는 폴립형 맥락막 혈관병증 (PCV)과 같은 안구 장애를 포함한다.

특정 실시양태에서, 표지된 항-HtrA1 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

F. 제약 제제

본원에 기재된 바와 같은 항-HtrA1 항체의 제약 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))를 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.

예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

본원의 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 습성 AMD와 같은 바람직하지 않은 신생혈관화와 연관된 안구 장애를 치료하기 위해 항혈관신생 요법, 예컨대 루센티스(LUCENTIS)™ (라니비주맙)와 같은 항-VEGF 요법을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. 다른 실시양태에서, 바람직하지 않은 안구 신생혈관화와 연관된 질환 또는 장애의 치료는 항-HtrA1 항체와 광역학 요법 (예를 들어, 마쿠젠(MACUGENTM)™ 또는 비수다인(VISUDYNETM)™)의 조합을 포함할 수 있다.

활성 성분은, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.

G. 치료 방법 및 조성물

본원에 제공된 임의의 항-HtrA1 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 안구 장애를 앓고 있거나 또는 안구 장애가 발병할 위험이 있는 환자 (예를 들어, HtrA1 다형성, 눈에서의 증가된 HtrA1 발현, 또는 적어도 한쪽 눈에서의 드루젠을 갖는 환자)의 눈에서 망막 세포 (예를 들어, 망막 색소 상피 (RPE) 세포와 같은 것) 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 치료할 눈에 드루젠을 갖는 환자의 눈에서 말기 지도형 위축 또는 건성 연령-관련 황반 변성으로의 진행을 둔화시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-HtrA1 항체로 치료하기에 적합한 환자는, 환자의 적어도 한쪽 눈에서 질환의 발병을 검출함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 특정 환자는 한쪽 눈에서 드루젠, 지도형 위축 또는 맥락막 신생혈관화를 검출함으로써 선택될 수 있는 한편, 다른쪽 눈은 증상이 없다. 이러한 환자는 증상이 없는 눈에서의 예방적 치료를 위한, 예를 들어 증상이 없는 눈에서 이러한 증상 (예를 들어, 드루젠, 지도형 위축, 및/또는 맥락막 신생혈관화)의 발병을 지연시키거나 또는 중중도를 감소시키기 위한 우수한 후보일 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 방법에 따라 증상이 있는 눈을 치료할 수 있거나, 또는 증상이 있는 눈 및 증상이 없는 눈 둘 다를 치료할 수 있다. 따라서, 항-HtrA1 항체는 다른쪽 눈에는 드루젠, 습성 AMD 또는 지도형 위축이 발병했으나, 치료할 눈에는 아직 증상이 없는 환자의 눈에서 안구 장애의 진행을 예방하거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 증상이 있는 눈을 치료하거나, 또는 증상이 있는 눈 및 증상이 없는 눈 둘 다를 치료한다.

또 다른 실시양태에서, 항-HtrA1 항체는 관절염을 치료하는데 유용하다.

한 측면에서, 의약으로 사용하기 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 예를 들어 AMD (습성 또는 건성), GA, DR, PCV 또는 ROP와 같은 안구 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-HtrA1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 환자의 눈에서 망막 세포 (예를 들어, RPE 세포와 같은 것) 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위해 유효량의 항-HtrA1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 환자의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하는데 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위해 유효량의 항-HtrA1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 항-HtrA1 항체를 필요로 하는 환자, 예를 들어 폴립-유사 동맥류성 확장에 의한 맥락막 혈관망을 갖는 환자에서 PCV를 억제하는데 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 조제에서의 항-HtrA1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은, 예를 들어 AMD (습성 또는 건성), GA, DR, PCV 또는 ROP와 같은 안구 장애를 치료하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 유효량의 의약을 안구 장애를 앓는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 안구 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체의 눈에서 망막 세포 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체에서 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위해 유효량의 의약을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 망막 세포 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위해 유효량의 의약을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 AMD (습성 또는 건성), GA, DR, PCV 또는 ROP와 같은 안구 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 유효량의 항-HtrA1 항체를 이러한 안구 장애를 앓는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 하기 기재된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 개체에서 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위해 유효량의 항-HtrA1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.

추가 측면에서, 본 발명은 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 개체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위해 유효량의 항-HtrA1 항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.

항-HtrA1 항체를 이용한 안구 장애 치료의 효능은, 예를 들어 눈 검사의 수행, 안내압의 측정, 시력의 평가, 세극등 압력의 측정, 안내 염증의 평가, CNV 크기의 측정, CNV 누출의 평가 (예를 들어, 플루오레세인 혈관조영에 의함), 드루젠 양의 측정, 드루젠 위치의 측정 등과 같은 안내 질환의 평가에서 통상적으로 사용되는 다양한 종점에 의해 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시각 상실은, 예를 들어 기준선으로부터 원하는 시점까지의 가장 우수한 교정 시력 (BCVA)의 평균 변화를 측정하는 것 (예를 들어, 여기서 BCVA는 4 미터의 검사 거리에서의 조기 치료 당뇨병성 망막병증 연구 (ETDRS) 시력 차트 및 평가를 기초로 함), 기준선과 비교하여 원하는 시점에서 시력이 15개 미만의 글자가 보이는 정도로 감소된 대상체의 비율을 측정하는 것, 기준선과 비교하여 원하는 시점에서 시력이 15개 이상의 글자가 보이는 정도로 회복된 대상체의 비율을 측정하는 것, 원하는 시점에서 20/2000의 시력 스넬렌(Snellen) 대응치를 나타내거나 또는 이보다 악화된 대상체의 비율을 측정하는 것, 또는 NEI 시각 기능 설문지를 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-HtrA1 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-HtrA1 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 항-HtrA1 항체 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.

본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는, 예를 들어 습성 AMD와 같은 눈에서의 바람직하지 않은 신생혈관화와 연관된 안구 장애의 치료에 적합한 치료제이다. 적합한 치료제는, 예를 들어 항혈관신생 요법, 예컨대 루센티스™ (라니비주맙)와 같은 항-VEGF 요법을 포함한다.

상기 나타낸 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제는 동일하거나 또는 별개의 제제 내에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 광역학 요법 (예를 들어, 마쿠젠™ 또는 비수다인™ 포함)과 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 유리체내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여가 단기간인지 또는 장기간인지의 여부에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내, 유리체내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록함). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다.

임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-HtrA1 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 이해된다.

H. 제조품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥 주사액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 제조품은 항-HtrA1 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

서열 키

표 A. 항-HtrA1 YW505.94 항체에 대한 HVR 및 가변 도메인 서열 및 그의 친화도-개선 변이체.

III. 실시예

다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.

실시예 1: 항-HtrA1 항체의 생성

파지 디스플레이. 합성 항체 라이브러리는 M13 파지 상에 2가 Fab 단편을 디스플레이하였고, 다양성은 중쇄의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 올리고-지정 돌연변이유발의 이용에 의해 생성하였다. Fab 라이브러리의 세부사항은 종래에 기재되어 있었다 (문헌 [Lee, C.V., et al., J Mol Biol. 340:1073-93 (2004); Lee, C.V., et al., J Immunol Methods. 284:119-32 (2004)]). 눈크 96-웰 맥시소르프(Maxisorp) 이뮤노플레이트를 밤새 4℃에서 MuHtrA1_PD (10 μg/ml)로 코팅하고, 이어서 1시간 동안 실온에서 파지 차단 완충제 (PBS, 1％ (w/v) BSA, 0.05％ (v/v) 트윈 20)로 차단하였다. 항체 파지 라이브러리를 MuHtrA1_PD-코팅된 플레이트에 첨가하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS, 0.05％ (v/v) 트윈-20 완충제로 세척하고, 결합된 파지를 50 mM HCl - 500 mM NaCl로 30분 동안 용리시키고, 동일한 부피의 1M 트리스-HCl, pH 7.5로 중화하였다. 회수된 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속적 선택 라운드 동안, 항원-코팅된 플레이트와 항체 파지의 인큐베이션을 2-3시간으로 감소시키고, 플레이트 세척의 엄격도를 서서히 증가시켰다. 13개의 확인된 클론을 IgG로 재포맷하고 (Fab94에 대해 하기 기재된 바와 같음), 293개 세포에서 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 결합 ELISA에서 13개의 정제된 IgG를 MuHtrA1_PD에 결합시켰다.

항-HtrA1 Fab94 및 IgG94 발현 및 정제. Fab94 (YW505.94)의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역을 이. 콜라이 Fab 발현 벡터 (AEP1) 내로 서브클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 이. 콜라이 균주 34B8로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 밤새 37℃에서 카르베니실린(Carbenicilin) 50 μg/ml로 보충된 LB 배지 30 ml 중에서 성장시켰다. 배양물 5 ml를 카르베니실린 (50 μg/ml)으로 보충된 500 ml의 완전 C.R.A.P. 배지 (문헌 [Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002)]) 내에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 성장시켰다. Fab94 단백질을 단백질 A 아가로스 수지를 이용하여 정제하였다.

Fab94의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 도메인을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 일시적 발현을 위해 인간 경쇄 또는 중쇄 (인간 IgG1) 불변 도메인을 갖는 pRK5-기반 플라스미드 내로 클로닝하였다. IgG94 단백질을 단백질 A 아가로스 크로마토그래피의 이용에 의해 정제하였다.

Fab94 (YW505.94)에 대한 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열을 도 1a 및 1b에 각각 나타냈다.

실시예 2: HtrA1 단백질의 생산

단백질 구축물. 전장 인간 HtrA1 (HuHtrA1) (Q23-P480) 및 전장 뮤린 HtrA1 (MuHtrA1) (P24-P480)을 Taq 폴리머라제를 사용하여 전장 클론으로부터 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 프라이머는 생성된 PCR 산물에 제한 부위 BamHI 및 EcoRI의 부분을 추가하는데 필요한 뉴클레오티드를 함유하였다. PCR 단편을 HtrA1 단백질 상에 N-말단 His₆ 태그 (서열 90)를 생성시키는 BamHI 제한 부위 상류의 His₆ 서열 (서열 90)을 함유하는 변형된 pAcGP67 바큘로바이러스 전달 벡터 (BD 파밍겐(BD Pharmingen)) 내에 라이게이션하였다.

N-도메인 및 PDZ 도메인이 결핍된 인간 HtrA1의 프로테아제 도메인 (HtrA1_PD) (예를 들어, 잔기 D161-K379 함유)을 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 증폭된 DNA를 N-말단 His₆ 태그 (서열 90)를 생성시키는 변형된 pET 벡터 내에 삽입하고, 트롬빈 절단 부위를 HtrA1의 D161 코돈의 상류에 융합하였다. 퀵체인지(QuikChange) XL 부위-지정 돌연변이유발 키트를 제조업체 (캘리포니아주 클라라 산타 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))의 프로토콜에 따라 사용하여 HtrA1_PD Ala 돌연변이체를 생성하였다. 구축물을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다. 뮤린 HtrA1 (MuHtrA1_PD) (G156-S367), 뮤린 HtrA3 (MuHtrA3_PD) (P133-F350) 및 뮤린 HtrA4 (MuHtrA4_PD) (E159-Y371)의 프로테아제 도메인을 Pfu (애질런트) 폴리머라제를 사용하여 전장 클론으로부터 클로닝하였다. 프라이머는 생성된 PCR 산물에 제한 부위 Not I 및 Stu I를 추가하는데 필요한 뉴클레오티드를 함유하였다. PCR 단편을 phoA 프로모터를 갖는 발현 벡터의 pST23 내에 라이게이션하였다. 이 발현 벡터는 프로테아제 도메인에 대한 유니자임 태그의 N-말단 융합을 생성시키는 Not I 제한 부위 상류의 아미노산 서열 MK(HQ)₆MHQSTAA (서열 11)를 함유하였다.

본원에 기재된 바와 같은 huHtrA1, muHtrA1, muHtrA3 및 muHtrA4의 아미노산 잔기는 서열 13-16을 각각 참조한다. 아미노산 위치는 한 글자의 아미노산 코드에 이어, 서열 13-16 중 하나 내에서의 그의 위치에 의해 특정한다. 예를 들어, 전장 huHtrA1은 서열 13의 위치 23에서의 글루타민으로 시작하여 서열 13의 위치 480에서의 프롤린으로 끝나는 서열, 예를 들어 Q23-P480을 포함한다. 이와 유사하게, HtrA 단백질 내의 특정한 위치에서의 돌연변이는 시작 아미노산에 이어, 서열 13-16 중 하나 내에서의 위치에 이어, 치환된 아미노산에 의해 지정한다. 예를 들어, HuHtrA1 (서열 13)의 위치 248에서의 리신의 알라닌으로의 돌연변이는 K248A로 지칭한다.

단백질 발현 및 정제. HuHtrA1 및 MuHtrA1을 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 곤충 세포 (캘리포니아주 우드랜드 소재의 익스프레션 시스템즈 엘엘씨(Expression Systems LLC))에서 발현시켰다. 수확된 곤충 세포 배지에 (pH를 6.8로 조정한 후) NiCl₂, CaCl₂ 및 NaCl을 각각 1.0, 2.5 및 150 mM의 최종 농도로 첨가하였다.

HuHtrA1_PD 구축물 (야생형 및 S328A 돌연변이체)을 이. 콜라이 BL21 (스트라타진(Stratagene))에서 발현시켰다. 이. 콜라이 배양물을 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 배지에서 A₆₀₀이 0.8 내지 1.0에 도달할 때까지 37℃에서 성장시키고, 이어서 0.4 mM IPTG로 유도시키고, 16℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 박테리아 세포 펠릿을 1/10 배양 부피의 50 mM 트리스 pH 8.0, 500 mM NaCl 중에 재현탁하고, 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)를 사용하여 파괴하였다. 용해물을 30,000 x g에서 30분 동안 원심분리하였다.

HuHtrA1, MuHtrA1, HuHtrA1_PD 및 HuHtrA1_PD(S328A)를 니켈-니트릴로-트리아세트산 수지 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 정제하였다. 곤충 세포 배지 또는 이. 콜라이 용해물을 로딩한 후, 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 50 mM 트리스 pH 8.0, 500 mM NaCl에 이어, 10 CV의 50 mM 트리스 pH 8.0, 1 M NaCl, 20 mM 이미다졸로 세척하였다. 단백질을 50 mM 트리스 pH 8.0, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.25% CHAPS, 300 mM 이미다졸로 용리시켰다. 합한 분획을 S-200 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하고, 삼량체 단백질 형성에 상응하는 피크 분획을 수집하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가 시 90% 초과였고, 단백질 농도는 BCA™ 단백질 검정 (일리노이주 록포드 소재의 피어스)을 이용하여 결정하였다.

HuHtrA1_PD Ala 돌연변이체 (S328A를 제외한 15개 돌연변이체의 패널)를 HuHtrA1_PD의 야생형 형태에 대해 기재된 바와 같이 발현시켰다 (상기 참조). 용해 완충제 (팝컬쳐(PopCulture), 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이엠디 케미칼(EMD Chemical))를 박테리아 세포 펠릿에 50 ml 용해 완충제/500 ml 펠릿으로 첨가하였다. 펠릿을 폴리트론으로 용해 완충제에 완전히 현탁하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 세포 용해물을 33,700 x g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하고 (베크만(Beckman), LA-16.250 로터), 생성된 상청액을 0.22μm 필터 유닛 (날진(Nalgene))을 통해 여과하였다. 여과된 상청액을 50 mM 트리스, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤 pH 8.0 (완충제 A)으로 예비-평형화된 Ni-NTA 칼럼 (3 ml, 퀴아젠) 상에 로딩하였다. 로딩하였으면, 칼럼을 12 CV의 완충제 A에 이어 20 CV의 완충제 A + 0.1% 트리톤 X-114로 세척하였다. 칼럼을 15 CV의 완충제 A로 다시 세척하여 세제를 제거하였다. 단백질을 완충제 A + 200 mM 이미다졸, 0.25% CHAPS로 용리시켰다. 합한 분획을 50 mM 트리스 pH 8.0, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.25% CHAPS로 평형화된 슈퍼덱스 200 (하이 로드(Hi load) 16/60, 120 ml, 지이 헬스케어)에 의해 추가로 정제하였다. HtrA1_PD 삼량체 피크에 상응하는 분획을 합하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가 시 90% 초과였고, 단백질 농도는 BCA™ 단백질 검정 (일리노이주 록포드 소재의 피어스)을 이용하여 결정하였다.

MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD를 이. 콜라이 58F3에서 발현시켰다 (문헌 [Szeto, W., et al., Cancer Res. 61:4197-205 (2001)]). 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 배지에서 이. 콜라이 배양물을 밤새 30℃에서 성장시키고, 50 μg/ml 카르베니실린으로 보충된 C.R.A.P. 배지 (문헌 [Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002)])를 함유하는 보다 큰 배양물로 희석하였다 (1/100 부피). 접종 후 이. 콜라이를 대략 20시간 동안 30℃에서 성장시켰다. MuHtrA1_PD를 HuHtrA1_PD에 대해 기재된 바와 같이 정제하였다 (상기 참조). MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD의 정제를 위해, 용해 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.5, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤)를 박테리아 세포 펠릿에 첨가하였다. 펠릿을 폴리트론으로 용해 완충제 내에서 균질화하고, 세포를 마이크로플루이다이저로 파괴하였다. 세포 용해물을 원심분리하고, 생성된 상청액을 0.22μm 필터 유닛 (날진)을 통해 여과하였다. 여과된 상청액을 25 mM 트리스 pH 8.5, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 10% 글리세롤 (완충제 B)로 예비-평형화된 3 ml Ni-NTA 칼럼 (퀴아젠(Qiagen)) 상에 로딩하였다. 로딩 후, 칼럼을 12 CV의 완충제 B에 이어 20 CV의 완충제 B + 0.1% 트리톤 X-114로 세척하였다. 칼럼을 15 CV의 완충제 B로 다시 세척하여 세제를 제거하였다. 단백질을 25 mM 트리스 pH 8.5, 500 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.25% CHAPS로 용리시켰다. 합한 분획을 25 mM 트리스 pH 8.5, 10% 글리세롤, 0.5 mM TCEP, 0.25% CHAPS로 평형화된 120 ml 슈퍼덱스 75 (지이 헬스케어) 상에서 추가로 정제하였다. 프로테아제 삼량체 피크에 상응하는 분획을 합하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가 시 90% 초과였다.

실시예 3: FRET 검정을 이용한 항-HtrA1 항체의 억제 활성의 결정

펩티드 기질의 합성. 본래 HtrA2에 대한 기질로 기재된 펩티드 H2-Opt (Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK) (서열 12), (문헌 [Martins, L.M., et al., J Biol Chem. 278:49417-27 (2003)])을 HBTU를 사용한 표준 커플링 절차를 이용하여 Fmoc-Lys(Boc)-왕 수지 상에서 합성하였다. Fmoc-Lys(DNP)-OH (아나스펙(Anaspec))를 P5' 위치에 혼입하였다. 펩티드를 P5까지 합성하고 (Mca, 7-메톡시-쿠마린, 알드리치(Aldrich)), 이어서 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물을 사용하여 2시간 동안 실온에서 고체 지지체로부터 절단하였다. 펩티드를 에틸 에테르로부터 침전시키고, 아세트산, 아세토니트릴, 물로 추출하고, 동결건조시켰다. 표지된 조 펩티드를 용해시키고, 정제용 역상 C18 칼럼 상에서 아세토니트릴/물을 사용하여 정제하였다. 정제된 분획을 합하고, 동결건조시키고, 액체 크로마토그래피/질량 분광측정법 (PE/사이엑스(Sciex))에 의해 분석하여 그의 계산된 질량과 일치함을 밝혀냈다.

펩티드 기질을 사용한 효소적 검정. HtrA1을 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.25% CHAPS (검정 완충제) 중에 연속 희석된 IgG94 또는 Fab94를 갖는 96-웰 흑색 광학 바닥 플레이트 (뉴욕주 로체스터 소재의 날지 눈크 인터내셔널(Nalge Nunc Int.))에서 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 13개의 파지 유래 항-HtrA1 항체 패널의 초기 시험을 위해, 단일 농도의 IgG (최종 농도 0.16 mg/ml - 0.28 mg/ml)를 HuHtrA1 또는 HuHtrA1_PD와 함께 인큐베이션하였다. DMSO 중 펩티드 기질 Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK (서열 12) (H2-Opt)의 10 mM 원액을 물 중 12.5 μM로 희석하고, 37℃에서 예비-가온시키고, 이어서 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응물의 최종 농도는 5 nM HuHtrA1 또는 MuHtrA1, 0.005 - 300 nM IgG94, 0.02 - 900 nM Fab94, 2.5 μM H2-Opt였다. 형광 신호 (여기 328 nm, 방출 393 nm)의 증가를 스펙트라맥스(SPECTRAmax) M5 마이크로플레이트 판독기 (캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 측정하고, H2-Opt 절단의 선형 속도 (mRFU/분)를 결정하였다. 트립신 (로슈(Roche)) 및 엘라스타제 (MP 바이오메디칼즈(MP Biomedicals))의 IgG94 억제를 이용한 실험을, 최종 효소 농도가 1 nM, IgG94 농도가 300 nM이고 인큐베이션 시간이 15분인 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 13개의 파지 유래 항체 (IgG)의 패널을 HuHtrA1 또는 HuHtrA1_PD와 함께 인큐베이션하고, 효소 활성을 측정하였다. 시험된 13개의 항체 중, 항체 YW503.57, YW504.57, YW504.61 및 YW505.94 (Fab94, 항체 94, Ab94 또는 IgG94로도 지칭됨)는 HuHtrA1 및 HuHtrA1_PD 활성 둘 다를 강력하게 억제하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, IgG94는 H2-Opt 기질에 대한 HuHtrA1의 효소적 활성을 1.8 nM의 IC₅₀ 값으로 농도-의존성 방식으로 억제하였다. 완전한 억제는 30 nM 초과의 IgG94에서 달성되었다. 이와는 대조적으로, 트립신-유사 세린 프로테아제 패밀리의 2개의 다른 구성원인 트립신 및 엘라스타제는 300 nM에서의 IgG94에 의해 억제되지 않았으며, 이는 IgG94가 HuHtrA1에 대해 특이성을 갖는다는 것을 나타낸다. Fab94는 또한 농도-의존성 방식으로 HuHtrA1을 억제하였지만, 29.1 nM의 IC₅₀ 값에 의해 나타나는 바와 같이 IgG94보다는 덜 강력하였다. 이들 결과는 표면 플라즈몬 공명 실험에 의해 결정되는 31.1 nM의 K_D 값과 탁월하게 일치한다 (하기 표 1 참조). 결과는 IgG94 및 Fab94가 작은 합성 펩티드 기질에 대한 HuHtrA1의 효소적 활성을 완전히 중화시킬 수 있고, 이 활성은 특이적이라는 것을 나타낸다. 또한, IgG94 대 Fab94의 효력에서의 약 16배 증가는 질량 분석에 기초한 '케이지-유사' IgG94:HtrA1 복합체로부터 예측된 결합력 효과와 일치한다 (예를 들어, 표 2 및 도 9 참조).

친화도-개선 변이체 항체 YW505.94a.28의 억제 효력을 또한 형광 켄칭된 펩티드 기질 H2-Opt 및 1.0 nM의 HuHtrA1 또는 1.5 nM의 HuHtrA1_PD를 사용한 상기 기재된 검정을 이용하여 결정하였다. 그 결과를 하기에 나타냈다.

실시예 4: 거대분자 기질을 사용한 항-HtrA1 항체의 억제 활성의 결정

소 β-카세인 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 모노큐(MonoQ) 이온 교환 칼럼 상에서 재정제하여 고도로 정제된 물질을 수득하였다. HuHtrA1을 에펜도프(Eppendorf) 튜브에서 검정 완충제 중 증가하는 농도의 IgG94와 함께 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 그 후 거대분자 기질을 첨가하였다. β-카세인 소화에 대한 반응물의 최종 농도는 10 nM HuHtrA1, 50 μg/ml β-카세인, 2.3-150 nM IgG94였다. 데코린에 대한 최종 농도는 125 nM HuHtrA1, 50 μg/ml 데코린 (R & D 시스템즈), 2 - 125 nM IgG94였다. 비글리칸에 대한 최종 농도는 75 nM HuHtrA1, 50 μg/ml 비글리칸 (R & D 시스템즈), 2.3 - 150 nM IgG94였다. 37℃에서의 인큐베이션 후 (β-카세인에 대해 2시간, 데코린에 대해 14시간, 비글리칸에 대해 6시간), SDS 샘플 완충제를 첨가하고, 샘플을 비등시키고, SDS-PAGE (비-환원)에 의해 분석하였다.

형광 염료-표지된 카세인인 BODIPY FL 카세인 (인비트로젠)의 가수분해를 96-웰 흑색 광학 바닥 플레이트 (뉴욕주 로체스터 소재의 날지 눈크 인터내셔널)에서 수행하였다. HuHtrA1 또는 MuHtrA1를 검정 완충제 중 연속 희석된 IgG94와 함께 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 검정 완충제에 BODIPY FL을 첨가한 후, 반응물 농도는 하기와 같았다: 30 nM HuHtrA1, 30 nM MuHtrA1, 5 μg/ml BODIPY FL, 0.24-250 nM IgG94. 형광 신호 (여기 484 nm, 방출 535 nm)의 증가를 스펙트라맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이시스) 상에서 측정하고, BODIPY FL 절단의 선형 속도 (mRFU/분)를 결정하여 억제되지 않은 속도 (대조군)의 백분율로서 표현하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, HuHtrA1은 거대분자 기질 β-카세인, 데코린 및 비글리칸을 분해하였다 (레인 2). HuHtrA1의 부재 하에, 실험 기간 동안 기질은 무손상으로 남았다 (도 6, 레인 1). HuHtrA1의 증가하는 농도의 IgG94와의 예비인큐베이션 (도 6, 레인 9 - 레인 3)은 기질 분해의 농도-의존성 억제를 유발하였다. 시험된 가장 높은 IgG94 농도에서는, β-카세인, 데코린 및 비글리칸의 분해를 완전히 막았다 (도 6, 레인 3). 결과는 IgG94가 3개의 거대분자 기질에 대한 HuHtrA1 활성을 강력하고 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, IgG94는 각각 8.3 nM 및 5.4 nM의 IC₅₀ 값으로 HuHtrA1 및 MuHtrA1 둘 다에 의한 BODIPY FL 가수분해를 농도-의존적으로 억제하였다. 결과는 IgG94가 거대분자 기질 BODIPY FL에 대한 HuHtrA1 및 MuHtrA1 둘 다의 효소적 활성을 인식하여 완전히 중화시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 5: HtrA1에 대한 항-HtrA1 항체의 특이성의 결정

IgG94의 특이성을 구조적으로 관련된 프로테아제 MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD를 억제하는 그의 능력과 비교하여 muHtrA1_PD를 억제하는 그의 활성을 측정함으로써 평가하였다 (도 5 참조). MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD의 농도가 각각 6nM, 20nM 및 20nM이고, IgG94의 농도 범위가 0.2 - 400 nM인 것을 제외하고는, 실시예 3에서 상기 기재된 바와 같은 FRET 검정을 이용하여 특이성을 결정하였다. 또한, MuHtrA1_PD, MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD 농도가 50 nM이고, IgG94의 농도 범위가 1.4 - 1000 nM인 것을 제외하고는, 실시예 4에서 상기 기재된 것과 같은 BODIPY FL 카세인 기질을 이용하여 특이성을 분석하였다. IgG94는 H2-Opt (도 5, 상단 패널) 및 BODIPY FL (도 5, 하단 패널)의 MuHtrA1_PD 절단은 억제하였지만, MuHtrA3_PD 및 MuHtrA4_PD에 의한 동일한 기질의 절단은 H2-Opt 및 BODIPY FL 기질 각각에 대해 400 nM 및 1000 nM의 농도까지 억제하지 않았다. 결과는 IgG94가 탁월한 특이성을 가지며 관련된 프로테아제의 활성은 손상시키지 않는다는 것을 시사한다.

실시예 6: 비아코어에 의한 항체 친화도의 결정

단일-사이클 동역학에 의해 Fab94의 결합 친화도를 결정하기 위해, 비아코어™ T100 기기를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SRP) 측정을 이용하였다. 간략하게, 시리즈 S 센서 칩 CM5를 공급업체의 지침에 따라 EDC 및 NHS 시약으로 활성화시키고, 스트렙타비딘 (피어스)을 대략 2000 반응 유닛 (RU)을 달성하도록 커플링시키고, 이어서 1M 에탄올아민으로 미반응 기를 차단하였다.

동역학 측정을 위해, 먼저 비오티닐화 HuHtrA1_PD 또는 MuHtrA1_PD를 10 μl/분 유량으로 주입하여 FC1 (참조 세포)을 제외한 3개의 상이한 유동 세포 (FC)에서 대략 100 RU를 포획하고, 이어서 0.01 M 헤페스 pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20 중 Fab94의 5배 연속 희석물 (0.48 nM - 300 nM)을 주입 사이의 재생없이 주입하였다 (유량: 30 μl/분). 센서그램을 기록하고, 참조 세포 신호의 감산 후 비아코어™ T100 평가 소프트웨어 (버전 2.0)에 의해 평가하였다. 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (K_D)를 k_off/k_on의 비로 계산하였다 (하기 표 1 참조). HuHtrA1_PD 및 MuHtrA1_PD에 대한 Fab94의 결합 동역학은 매우 유사하였다. K_D 값은 각각 31.1 nM 및 28.9 nM였다.

표 1. 표면 플라즈몬 공명에 의한 HuHtrA1_PD 및 MuHtrA1_PD에 대한 Fab94의 결합 친화도.

실시예 7: HuHtrA1_PD 상 IgG94의 에피토프 맵핑

IgG94의 기능적 결합 에피토프를 확인하기 위해, 개별 알라닌 돌연변이를 갖는 HuHtrA1_PD 돌연변이체의 패널을 결합 실험을 위해 생성하였다. 대부분의 돌연변이된 잔기는 활성 부위를 둘러싸는 표면 루프에 위치하였고, 또한 촉매 세린 (S328) 및 아스파르테이트 (D250)를 포함하였다. 돌연변이체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 내에서 발현시키고 삼량체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 1시간 동안 PBS 중 2 μg/ml의 HuHtrA1_PD 돌연변이체로 코팅한 후 1시간 동안 실온에서 PBST 완충제 (PBS 중 0.5% BSA 및 0.05% 트윈 20)로 차단한 맥시소르프™ 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 수행하는 ELISA 검정을 이용하여 결합을 결정하였다. PBST 완충제 중 5배 연속 희석된 Ig94 (50 nM 내지 0.0006 nM)를 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBT 완충제 (PBS 중 0.05% 트윈 20)로 세척하고, HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (인비트로젠)를 첨가하고 (PBST 완충제 중 1:5000), 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBT 완충제로 세척하고, 테트라메틸벤지딘 기질 (매릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories))을 첨가함으로써 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 용액 중 항체 농도의 함수로서 플로팅하여 EC₅₀ 값을 결정하였다. 이어서 결합에 영향을 주는 돌연변이체의 위치를 HtrA1의 구조 상에 맵핑하였다.

결합 ELISA에서, IgG94는 돌연변이체 HuHtrA1_PD(N224A) 및 HuHtrA1_PD(K248A)에 대한 결합에서 가장 큰 감소를 나타냈다 (도 7a 참조). 플레이트를 코팅하는데 더 낮은 농도의 HtrA1 (1 μg/ml)을 사용하고 더 짧아진 인큐베이션 시간 (1시간에서 20분의 인큐베이션으로 감소)을 이용한 실험의 반복 시, IgG94는 또한 HuHtrA1 돌연변이체 V201A, H220A, T223A, K225A, K243A 및 E247A에 대한 결합에서 5배 이상의 감소를 나타냈다 (도 7a 참조). 결과는 IgG94가 루프 B 및 루프 C 상에 위치하는 잔기 N224 및 K248을 포함하는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다 (도 7b 및 7c 참조). 트립신-유사 세린 프로테아제에서 이들 루프는 기질과 상호작용하는 특이성 결정 영역의 부분으로 공지되어 있다. K248 (루프 C)은 촉매 D250에 매우 근접하고, N224는 촉매 H220에 매우 근접한다. 따라서, 이들 잔기에 대한 IgG94의 결합은 직접적 입체 장애에 의해 또는 루프 C 내의 잔기도 인식하는 항-HGFA 항체를 중화시키는 것으로 밝혀진 바와 같은 간접적 알로스테릭 메커니즘에 의해 촉매 틈에 대한 기질 접근을 손상시킬 수 있다 (문헌 [Ganesan, R., et al., Structure 17:1614-1624 (2009); Wu, Y., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:19784-9 (2007)]). 다르게는, 항체 결합은 세작용기 촉매 잔기 D250 및/또는 H220에 직접적으로 영향을 미침으로써 촉매작용을 억제할 수 있다.

실시예 8: 크기 배제 크로마토그래피 - 다각도 광 산란 (SEC-MALLS)에 의한 Fab94 및 IgG94와 HtrA1_PD의 복합체의 화학량론

촉매 불활성 형태 HuHtrA1_PD(S328A)를 복합체 형성에 사용하였다. Fab94:HuHtrA1_PD(S328A) 및 IgG94:HuHtrA1_PD(S328A) 복합체를 트리스 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.25% CHAPS) 중에서 형성하였다. 복합체 및 개별 성분 단독을 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 0.5 mL/분의 유량으로 트리스 완충제 중에서 S200 슈퍼덱스 10/300 GL 칼럼 (지이 헬스케어) 상에 주입하여 용해하였다. 와이어트 테크놀로지스(Wyatt Technologies)로부터의 18-각 광 산란 검출기 (QELS을 이용하는 던 헬리오스(Dawn Helios) II) 및 굴절률 검출기 (옵티랩 렉스(Optilab reX))를 사용하여 데이터를 수집하였다. 아스트라(Astra) 5 소프트웨어로 분석을 행하여 용리 시간에 독립적인 몰 질량을 얻었다. 대조 IgG를 사용하여 정규화를 수행하였다.

SEC-MALLS 실험은 Fab94 및 IgG94가 구별되는 질량을 갖는 HuHtrA1_PD(S328A)와의 복합체를 형성함을 나타냈다. 복합체의 결정된 질량 및 추정된 화학량론을 표 2에 나타냈다.

표 2. SEC-MALLS에 의해 결정된 Fab94 및 IgG94와 복합체를 형성한 HuHtrA1_PD(S328A)의 화학량론.

^* HuHtrA1_PD는 알라닌으로 돌연변이된 촉매 세린을 갖는 HuHtrA1_PD (HuHtrA1_PD(S328A))임; 질량은 삼량체를 나타냄

^** 2개의 독립적 실험의 평균

^& 항체:프로테아제 삼량체의 비

210,100 Da의 Fab94:HtrA1_PD(S328A) 복합체의 결정된 질량은 1개의 HuHtrA1_PD(S328A) 삼량체에 결합한 3개의 Fab의 복합체 (3:1 복합체)와 일치한다. 이러한 3:1 복합체의 실험적 질량과 이론적 질량 사이의 차이는 단지 4.2%이다. 따라서, 1개의 Fab는 1개의 HtrA1 동종-삼량체 내 각각의 HuHtrA1_PD(S328A) 단량체에 결합할 수 있다.

618,600 Da의 IgG94:HtrA1_PD(S328A) 복합체의 결정된 질량은 3개의 IgG 분자가 2개의 HuHtrA1_PD(S328A) 삼량체에 결합한다는 점에서, 3:2 화학량론에 잘 맞는다. 이러한 3:2 복합체의 실험적 질량과 이론적 질량 사이의 차이는 단지 1.9%이다.

설명된 화학량론은 HtrA1 삼량체 내 각각의 단량체가 1개의 Fab 또는 IgG의 1개의 Fab 아암에 결합한다는 점에서, Fab94 및 IgG94가 HtrA1 활성을 완전히 억제할 수 있다는 발견과 일치한다. 따라서, 이들 복합체에는 이용가능한 '유리' HtrA1 단량체가 존재하지 않는데, 이는 Fab94 및 IgG94에 의한 HtrA1 효소 활성의 완전한 억제와 일치한다. 본 발명자들은 3개의 IgG의 Fab 아암이 2개의 삼량체와 가교결합하는 (각 Fab 아암은 1개의 단량체에 결합함) IgG94:HtrA1_PD(S328A) 복합체에 대한 '케이지' 모델을 제안한다 (도 9 참조). 모델은 또한 IgG94가 HtrA1_PD 삼량체에 대한 그의 결합에서의 결합력 효과로부터 크게 이익을 얻는다는 점에서, 효소적 검정에서의 Fab94보다 약 16배 증가된 IgG94의 효력을 설명한다 (예를 들어, 도 3 참조).

실시예 9: YW505.94의 친화도 성숙

항-HtrA1 친화도 성숙에 대한 구축물 라이브러리. 잠재적 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하기 위해 CDR H1 내의 카바트 잔기 N28을 세린으로 변경함으로써 YW505.94 [Ab94]로부터 클론 YW505.94a를 유도하였다. 모든 CDR-L3 위치에서 정지 코돈 (TAA)을 함유하고, M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이하는, 파지미드 pV0350-2b로부터 유도된 파지미드 pW0703 (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)])을 친화도 성숙에 대한 클론 YW505.94a의 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 이식하기 위한 라이브러리 주형으로서 사용하였다. 하드 및 소프트 무작위화 전략 둘 다를 친화도 성숙에 이용하였다. 하드 무작위화의 경우에, 3개의 경쇄 CDR에서 선택된 위치를 갖는 1개의 경쇄 라이브러리 (L1/L2/L3하드)를 천연 인간 항체를 모방하도록 설계된 아미노산을 이용하여 무작위화하였고, 설계된 DNA 축중성은 문헌 [Lee et al., 2004]에 기재된 바와 같았다. 소프트 무작위화의 경우에, 카바트 위치 CDR-L3의 91, 92, 93, 94 및 96, CDR-H1의 28-35, CDR-H2의 50-58, 및 CDR-H3의 95-100에서의 선택된 잔기와 CDR 루프의 2개의 상이한 조합, L3/H1소프트, L3/H2소프트 및 L3/H3소프트를 무작위화를 위해 표적화하였다. 선택된 위치에서 대략 50%의 돌연변이 비율을 도입하는 소프트 무작위화 조건을 달성하기 위해, 돌연변이유발 DNA를 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기의 70-10-10-10 혼합물로 합성하였다 (문헌 [Gallop et al., J. of Med. Chem. 37, 1233-1251 (1994)]).

친화도-개선 변이체를 단리하기 위한 파지 분류 전략. 친화도 개선 선택을 위해, 파지 라이브러리를 제1 라운드를 위한 플레이트 분류에 이어, 4개 라운드의 용액 분류에 적용하였다. 플레이트 분류의 제1 라운드를 위해, 4개의 라이브러리 (L1/L2/L3하드, L3/H1소프트, L3/H2소프트 및 L3/H3소프트)를 1시간 동안 실온 (RT)에서 1% BSA 및 0.05% 트윈 20 중 약 3 O.D./ml으로의 파지 주입에 의해 개별적으로 인간 HtrA1 (HuHtrA1) 코팅된 플레이트 (눈크 맥시소르프 플레이트)에 대해 분류하였다. 플레이트 분류의 제1 라운드 후, 4개 라운드의 용액 분류를 수행하여 선택의 엄격도를 증가시켰다. 용액 분류를 위해, 플레이트 분류의 제1 라운드로부터 증식된 1 O.D./ml의 파지를 1% 슈퍼블록(Superblock) (피어스 바이오테크놀로지) 및 0.05% 트윈20을 함유하는 100 ul 완충제 중 500nM의 비오티닐화 HuHtrA1과 함께 1시간 이상 실온 (RT)에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 1% 슈퍼블록으로 10배 추가로 희석하고, 부드럽게 진탕하면서 15분 동안 실온에서 뉴트라비딘-코팅된 웰 (10 ug/ml)에 100 ul/웰로 적용하여 비오티닐화 HuHtrA1이 파지와 결합할 수 있도록 하였다. 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 10회 세척하였다. 배경 결합을 결정하기 위해, 비오티닐화 HuHtrA1 선택 없이 파지를 함유하는 대조군 웰을 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획하였다. 결합된 파지를 0.1 N HCl에 의해 20분 동안 용리시키고, 1/10 부피의 1M 트리스 pH 11로 중화시키고, 적정하고, 다음 라운드를 위해 증식시켰다. 그 다음, 선택 엄격도를 증가시키는 2가지 방법을 동시에 이용하여 용액 분류를 3 라운드 더 수행하였다. 회합률 선택을 위한 제1 방법은 비오티닐화 표적 단백질 농도를 10 nM에서 0.1 nM로 감소시켰다. 해리율 선택을 위한 제2 방법은 과량의 비-비오티닐화 HuHtrA1 단백질 (100~1000배 더)을 첨가하여 더 약한 결합제를 경쟁하여 떨어지게 하였다. 또한, 파지 주입을 감소시켜 (0.1~0.5 O.D/ml) 배경 파지 결합을 낮추었다.

고 처리량 친화도 스크리닝 ELISA (단일 스팟 경쟁). 콜로니를 제5 라운드 스크리닝으로부터 선택하고, 96-웰 블록 (퀴아진) 내 50 ug/ml 카르베니실린 및 1e 10/ml KO7을 갖는 350 ul/웰의 2YT 배지에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 동일한 플레이트로부터, XL-1 감염된 모 파지의 콜로니를 대조군으로 선택하였다. 96-웰 눈크 맥시소르프 플레이트를 PBS 중 100 ul/웰의 HuHtrA1 단백질 (2ug/ml)로 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 100 ul의 0.5% BSA 및 0.05% 트윈 (PBST 완충제)으로 1시간 동안 차단하였다.

파지 상청액을 100 ul 총 부피로 5 nM HuHtrA1이 있거나 없는 PBST 완충제 중에 1:5로 희석하고, 1시간 이상 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 75 ul의 혼합물을 HuHtrA1 코팅된 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 15분 동안 부드럽게 진탕하여 HuHtrA1-코팅된 플레이트에 결합하지 않은 파지가 포획되도록 하였다. 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈20 (PBT 완충제)으로 5회 세척하였다. 결합을 ELISA 완충제 중 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체 (1:5000)를 첨가하여 정량화하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBT 완충제로 5회 세척하였다. 그 다음, 웰에 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) (키르케가드-페리-래보러토리즈 (메릴랜드주 게이더스버그)) 100 μl/웰을 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 각 웰에 100 ul의 1M 인산 (H₃PO₄)을 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션되도록 하였다. 각 웰의 OD를 450 nm에서 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. OD 감소 (%)를 하기 식에 의해 계산하였다:

OD_450nm 감소 (%) = [(경쟁자를 갖는 웰의 OD_450nm) / (경쟁자를 갖지 않는 웰의 OD_450nm)]*100

모 파지의 웰의 OD_450nm 감소 (%) (100%)와 비교하여, 50% 미만의 OD_450nm 감소 (%)를 갖는 클론을 서열 분석을 위해 선택하였다 (도 15 및 16 참조). 특유의 클론을 파지 제조를 위해 선택하여 결합 친화도 (파지 IC₅₀)를 파지 경쟁 ELISA에 의해 결정하였다 (도 17 및 18 참조). 이어서, 가장 친화도가 개선된 클론 (YW505.94a.28 & YW505.94a.54)을 항체 생산 및 추가의 비아코어 결합 동역학 분석을 위해 인간 IgG1로 재포맷하였다.

IC₅₀을 결정하기 위한 파지 경쟁 ELISA. 맥시소르프™ 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중 2 μg/ml의 HuHtrA1로 2시간 동안 실온에서 코팅하고, 이어서 PBST 완충제로 추가 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 배양 상청액으로부터 정제된 파지를 조직-배양 마이크로타이터 플레이트에서 PBST 완충제 중 연속 희석된 HuHtrA1 또는 MuHtrA1과 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 80 μl의 혼합물을 HuHtrA1-코팅된 웰로 15분 동안 옮겨 미결합 파지를 포획하였다. 플레이트를 PBT 완충제로 세척하고, HRP-접합된 항-M13 (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 1시간 동안 첨가하였다 (PBST 완충제 중 1:5000). 플레이트를 PBT 완충제로 세척하고, 테트라메틸벤지딘 기질 (매릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드 앤드 페리 래보러토리즈)을 첨가함으로써 발색시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 용액 중 HuHtrA1 또는 MuHtrA1 농도의 함수로서 플로팅하여 파지 IC₅₀을 결정하였다. 이를 파지의 표면 상에 디스플레이된 Fab 클론에 대한 친화도 추정치로 사용하였다. 도 17은 HuHtrA1에 대한 YW505.94a 친화도-개선 변이체의 결합을 입증하는 파지 경쟁 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 18은 MuHtrA1에 대한 YW505.94a 친화도-개선 변이체의 결합을 입증하는 파지 경쟁 검정으로부터의 결과를 나타낸다.

비아코어에 의한 항체 친화도 결정. 단일 사이클 동역학에 의해 HtrA1 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해, 비아코어™ T100 기기를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SRP) 측정을 이용하였다. 간략하게, 시리즈 S 센서 칩 CM5를 공급업체의 지침에 따라 EDC 및 NHS 시약으로 활성화시키고, 스트렙타비딘 (피어스)을 대략 2000 반응 유닛 (RU)을 달성하도록 커플링시키고, 이어서 1M 에탄올아민으로 미반응 기를 차단하였다.

동역학 측정을 위해, 먼저 비오티닐화 인간 또는 뮤린 HtrA1을 10 ul/분 유량으로 주입하여 FC1 (참조)를 제외한 3개의 상이한 유동 세포 (FC)에서 대략 100 RU를 포획하고, 이어서 HBS-P 완충제 (0.01M 헤페스 pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중 낮은 농도 (0.48 nM)에서 높은 농도 (300 nM)까지의 [5 지점] 항-HtrA1 Fab의 5배 연속 희석물을 주입 사이의 재생없이 번갈아 주입하였다 (유량: 30 μl/분). 센서그램을 기록하고, 참조물 및 완충제 감산 적용 후 비아코어™ T100 평가 소프트웨어 (버전 2.0)에 의해 평가하였다. 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)를 k_off/k_on의 비로 계산하였다. 결과를 하기 표 3에 나타냈다.

표 3. 모 Fab와 비교 시의 친화도 성숙 Fab의 결합 친화도.

실시예 10: 일정한 광 노출 후 HtrA1 부재 하의 광수용체, 외과립층 (ONL) 및 기능적 반응의 보존성

HtrA1 녹아웃 마우스의 구축. HtrA1(+/-) 배아 줄기 세포를 생성하기 위해, 선형화된 표적 벡터 DNA를 Balb/c 배경의 ES 세포 내로 전기천공하여 엑손 1의 영역 5' 및 엑손 1의 영역 3'에 플록스(Flox) 부위를 도입하고, 네오마이신-내성 유전자 (네오(Neo))를 도입하였다. 네오마이신에 내성인 ES 클론을 선택하고, ES 세포를 cre-레콤비나제를 발현하는 발현 플라스미드로 전기천공함으로써 엑손 1 + 네오마이신 카세트를 제거하였다. 표적화된 ES 세포에서의 전체 HtrA1 유전자좌 및 상류 프로모터 영역을 서열분석함으로써 상동 재조합을 확인하였다. 표적화된 클론을 C57BL/6 배반포 내에 주입하여 배선 전달의 수컷 키메라 마우스를 생성하였다. +/- 암컷 및 +/- 수컷 마우스의 상호교배를 수행하여 Balb/c 배경 상의 -/- 암컷 또는 -/- 수컷 HtrA1 마우스를 생성하였다. HtrA1 wt 및 ko 마우스로부터의 난소의 RT-PCR에 의해 HtrA1의 성공적 결실을 확인하였다.

일정한 광 노출 모델. 8-13 주령의 수컷 Balb/c Htra1 wt/wt 또는 ko/ko 마우스를 일정한 광 노출 (CLE)의 시작 전까지 정상 수용하였다 (100 룩스 미만의 케이지 내). CLE의 시작을 위해, 마우스를 필터 상부 없이 와이어 랙으로만 덮인 정상 케이지에 단독으로 수용하였다. 케이지에 광이 들어오는 것을 방해하지 않고 영양을 공급하기 위해, 식품 펠릿 및 히드로겔을 케이지의 바닥에 두고, 와이어 상부에는 두지 않았다. 10개의 케이지를 형광 광이 장착되고 백색 패널로 둘러싸인 메트로(Metro) 랙에 넣어 ~1200 룩스를 마우스에 14일까지 전달하였다. 케이지를 CLE 동안 매일 랙 주위에서 시계반대 방향으로 회전시켜 동등한 광 노출을 확실히 하였다. 다중 선반을 사용하는 경우, 케이지를 또한 선반 사이에서 회전시켜 동등한 광 노출을 확실히 하였다.

광 간섭 단층촬영. 광 간섭 단층촬영 (OCT)을 광 노출 4-7일 전에 수행하여 망막 두께 기준선 측정값을 제공하였다. OCT는 하이델베르크 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis) HRA+OCT 카메라를 사용하여 수행하였다. 동물을 150-300 ul 멸균 염수 중 70-80 mg/kg 케타민/15 mg/kg 크실라진으로 마취시키고, 눈을 1% 트로픽아미드 점안제로 확장시키고, 망막 두께를 OCT에 의해 측정하였다. 인공 누액을 사용하여 눈 수분을 유지함으로써 백내장을 방지하였다. OCT 후, 동물을 마취에서 회복되도록 하고, 그의 케이지 및 광 랙에 돌려보냈다.

망막전위도. 망막전위도 (ERG) ERG를 광 노출 7일 전 및 CLE 후 15일째에 수행하였다. ERG는 디아그노시스 엘엘씨(Diagnosys LLC) 에스피온 2(Espion 2) 시각 전기생리학 시스템 및 광원으로서의 컬러돔 데스크톱 간츠펠트(Colordome desktop Ganzfeld)를 사용하여 수행하고 기록하였다. 마우스를 암실에서 밤새 암 순응시켜 광수용체를 평형화시켰다. 일단 암순응되었으면, 모든 후속 절차는 조명용 적색 광만 사용하는 암실에서 수행하였다. 동물을 200-300 ul PBS 중 케타민 75-80 mg/kg 및 크실라진 7.5-15 mg/kg으로 복강내 마취시켰다. 마우스 체온을 그의 제어 유닛에 연결된 항온 플레이트를 사용하여 37℃로 유지시켰다. 동공을 1% 트로픽아미드로 확장시켰다. 양쪽 눈으로부터의 ERG는 부리안-알렌(Burian-Allen) 은 또는 백금 와이어 루프 전극으로 동시에 기록될 것이다. 마우스를 플랫폼 상에 두고, 기준 전극은 이마를 통해 피하 삽입하고, 접지 전극은 꼬리의 기저부에 피하 삽입하였다. 고낙 하이퍼멜로스(Gonak hypermellose) 용액을 각막 상에 넣어 각막과 백금 전극 사이의 전기적 접촉을 확립하고, 실험 동안 눈이 건조되지 않도록 하였다. 전극을 좌안 및 우안에 위치시키고, 마우스를 컬러돔 광 자극기 안에 넣었다. 눈은 백색 광 (7개 플래쉬 강도 4e-5, 2e-5, 0.5, 2, 5, 10, 20 cd.s/m²)으로 자극될 것이고, 신호는 0.15-1000 Hz에서 대역통과-필터링하고 2 kHz에서 샘플링하였다.

마우스 망막 및 난소에서의 HtrA mRNA 수준의 결정. 전체 눈을 적출하고, 망막을 제거하여 RLT 완충제 (퀴아젠)에 넣고, 균질화 시까지 -80℃에서 동결시켰다. 망막을 젠틀맥스(gentleMACS) M 튜브 (밀티나이 바이오텍(Miltinyi Biotec))에 의해 균질화하고 분쇄하였다. 망막과 유사하게, 난소를 암컷 HtrA1 wt, het 및 ko 마우스로부터 단리하고, 망막에 대해 기재된 바와 같이 균질화하였다. RNA를 퀴아젠 플러스(Qiagen Plus) RNeasy 키트를 사용하여 단리하고; cDNA를 고 용량 cDNA 키트 (어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem))를 사용하여 생성시키고; 택맨(Taqman) qPCR을 20 ug cDNA, 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템) 및 택맨 유전자 발현 검정 프라이머 (어플라이드 바이오시스템)를 사용하여 엑손 1-2 (망막 및 난소), 엑손 3-4 (난소) 및 엑손 5-6 (난소)에 대해 수행하고, ABI 7500 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템) 상에서 실행하였다. HtrA 발현을 18s 발현 (어플라이드 바이오시스템으로부터의 프라이머)에 대해 정상화하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, HtrA1 mRNA 발현은 일정한 광 노출의 마우스 모델에서 증가하였다. 그러나, 동일한 모델에서, 망막에서의 HtrA2 수준은 증가하지 않았다. 또한, HtrA1 수준은 비-노출 마우스의 망막에서의 HtrA2, HtrA3 및 HtrA4 수준보다 현저하게 높았다.

또한, 본 발명자들은 HtrA1 발현이 결핍된 마우스는 광-유도 변성의 마우스 모델에서 광수용체 (도 13), 외과립층 (ONL) (도 14) 및 기능적 반응 (ERG) (도 12)의 보존성을 나타낸다는 것을 밝혀냈다.

실시예 11: 일정한 광 노출의 래트 모델에서의 항-HtrA1 항체의 효과

래트는 마우스에 대해 상기 기재된 바와 같이 일정한 광 노출에 적용될 것이다. 광 노출에 의해 야기되는 변성으로부터 래트 눈을 보호하는 항-HtrA1 항체의 효능이 평가될 것이다. 래트 눈은 실험 과정 동안 눈에서의 항-HtrA1 항체의 유효 농도를 유지하기에 적합한 용량 및 빈도의 항-HtrA1 항체의 유리체내 주입에 적용될 것이다. 래트 눈은 마우스 모델에 대해 상기 기재된 바와 같이, OCT에 의해 망막 두께를 결정하고 ERG에 의해 기능성을 결정하기 위해 광 노출 후 모니터링될 것이다.

실시예 12: HtrA1 발현은 래트 유리체에서 풍부하고 광 스트레스 시 마우스 눈 유체 및 눈 조직 내에 축적된다

ELISA 검정. 래트 조직의 분석을 위해 항-muHtrA1 토끼 폴리클로날 항체 (제넨테크)를 125 ng/ml로 희석한 한편, 마우스 눈 유체 및 망막 조직의 분석을 위해 항-huHtrA1 마우스 모노클로날 항체 (제넨테크)를 250 ng/ml로 희석하고 (둘 다 PBS 중에 희석함), 밤새 4℃에서 인큐베이션하는 동안 384-웰 ELISA 플레이트 (뉴저지주 넵튠 소재의 눈크) 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈-20으로 세척하고, 2시간의 인큐베이션 동안 PBS + 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하였다. 상기 및 모든 후속 인큐베이션은 실온에서 부드럽게 교반하면서 수행하였다. 재조합 뮤린 HtrA1 표준물 (제넨테크) 및 래트 또는 뮤린 조직으로부터의 샘플을 샘플/표준물 희석 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 15 ppm 프로클린, 0.05% 트윈 20, 0.25% CHAPS, 0.2% BgG, 5 mM EDTA, 0.35M NaCl, (pH 7.4)) 중에 희석하고, 세척 플레이트에 첨가하고, 1.5 - 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트-결합 HtrA1를 래트 조직에 대해서는 100 ng/ml로 희석한 비오티닐화 항-muHtrA1 토끼 폴리클로날 항체 (제넨테크), 마우스 눈 유체 및 망막 조직에 대해서는 200 ng/ml로 희석한 비오티닐화 항-huHtrA1 마우스 모노클로날 항체 (제넨테크) (둘 다 검정 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 15 ppm 프로클린, 0.05% 트윈 20) 중에 희석함)로 1시간 인큐베이션 동안 검출하고, 이어서 세척 단계 및 또한 검정 완충제 중에 희석한 스트렙타비딘-HRP (뉴저지 주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어) (1:20,000)와의 30분 인큐베이션을 행하였다. 최종 세척 후, 테트라메틸 벤지딘 (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL)을 첨가하고, 10-15분 동안 발색시키고, 반응을 1 M 인산으로 정지시켰다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 참조물과 함께 450 nm에서 판독하였다. 래트 또는 뮤린 HtrA1의 농도를 muHtrA1 표준 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 계산하였다.

도 19a에 나타낸 바와 같이, HtrA1의 발현은 래트 유리체에서의 HtrA1의 발현 수준과 비교하였을 때 래트 난소, 뇌, 비장 및 전체 눈 조직에서 낮았다. 도 19b에 나타낸 바와 같이, 마우스 눈 유체에서의 HtrA1의 수준은 대조군과 비교하였을 때 일정한 광 노출의 모델에서 증가하였다. 도 19c에 나타낸 바와 같이, 마우스 망막 조직에서 HtrA1의 수준은 대조군과 비교하였을 때 일정한 광 노출의 모델에서 증가하였다.

상기 본 발명은 이해를 명확하게 하려는 목적으로 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.

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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Gln Gln Ser Asp Asp Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Phe Ser Ile Ser Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Arg Ala Ser Gln Val Val Gly Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Gln Ser Asp Asp His Pro Pro Thr 1 5 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Asn or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ala or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Val or Leu <400> 23 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser, Val or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Thr, Ser, Ala, Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Thr, His, Asn, Ser, Ala, Leu or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Pro, Thr, Ala or Ser <400> 24 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Asn, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Asp, Tyr or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or Asp <400> 25 Gly Phe Xaa Ile Xaa Xaa Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Asn or Asp <400> 26 Trp Ile Asp Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Thr <400> 27 Gly Thr Phe Leu Thr Xaa Trp Gly His Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 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(92)..(92) <223> Tyr, Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Thr, Ser, Ala, Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> Thr, His, Asn, Ser, Ala, Leu or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (96)..(96) <223> Pro, Thr, Ala or Ser <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 32 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Consensus polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Asn, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Ser, Asp, 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Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Gln Gln Val Tyr Ser His Pro Pro Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Gln Gln Ser Tyr Thr Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Gln Gln Ser Tyr Ala Thr Pro Thr Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ala Thr 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gln Gln Val Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gln Gln Val Tyr Ala Thr Pro Ser Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro Ala Thr 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ala Thr 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gln Gln Ser Tyr Thr Ala Pro Thr Thr 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gln Gln Asp Ser Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gln Gln Ser Asp Ala Ala Pro Pro Thr 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Gln Gln Ser Tyr Thr Arg Pro Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Phe Ser Ile Ser Asp Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gly Phe Ser Ile Asp Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gly Phe Thr Ile Tyr Asp Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Gly Phe Ser Ile Ala Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 52 <211> 17 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ser Tyr Ser Ser Pro Ala 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Val Tyr Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Val Tyr Ala Thr Pro Ser 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Ser Tyr Asn Ser Pro Ala 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Ser Tyr Ser Thr Pro Ala 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Ser Tyr Thr Ala Pro Thr 1 5 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 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MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser or Thr <400> 89 Gly Thr Phe Leu Thr Xaa Trp Gly His Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 90 His His His His His His 1 5

Claims (90)

1. 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체와 경쟁적으로 HtrA1에 결합하는 단리된 항체.
2. 제1항에 있어서, 경쟁적 결합이 ELISA 검정을 이용하여 결정된 것인 항체.
3. (i) HtrA1의 N224, K248 또는 둘 다를 포함하는 에피토프에 결합하고, (ii) HtrA1을 30 nM 이하의 IC₅₀으로 억제하는, HtrA1에 결합하는 단리된 항체.
4. 제3항에 있어서, 하기 특성: (i) HtrA1 삼량체의 1개의 서브유닛에 대한 1개의 가변 도메인의 비로 HtrA1에 결합하는 것, 또는 (ii) HtrA1의 삼량체 형성을 막지 않는 것 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체.
5. 제3항에 있어서, IC₅₀이 서열 12를 갖는 기질을 사용한 세린 프로테아제 검정을 이용하여 결정된 것인 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HtrA2, HtrA3 및 HtrA4 중 하나 이상과 교차-반응하지 않는 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 500 nM 이하의 해리 상수를 갖는 항체.
8. 제6항에 있어서, 해리 상수가 25℃에서 Fab를 이용하여 비아코어(BIAcore)에 의해 결정된 것인 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, HtrA1에 결합하는 항체 단편인 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (a) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3; (b) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3; 및 (c) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (b) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYYIH (서열 25)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2; 및 (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
17. 제1항 내지 제12항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA (서열 23)를 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) X_g가 S, V 또는 D 이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
18. 제1항 내지 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
19. 제18항에 있어서, (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
20. 제1항 내지 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
21. 제20항에 있어서, (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
22. 제20항에 있어서, (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
23. 제1항 내지 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
24. 제1항 내지 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
25. 제1항, 제2항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 17의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 (FR2) 서열을 추가로 포함하는 항체.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 항체.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 32를 포함하는 VH 서열; (b) 서열 31을 포함하는 VL 서열; 또는 (c) 서열 32를 포함하는 VH 서열 및 서열 31을 포함하는 VL 서열을 포함하는 항체.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열 8의 VH 서열을 포함하는 항체.
30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체.
31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열 30의 VL 서열을 포함하는 항체.
32. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열 28의 VL 서열을 포함하는 항체.
33. 제27항 또는 제28항에 있어서, 서열 29의 VH 서열을 포함하는 항체.
34. 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항체.
35. 서열 29의 VH 서열 및 서열 28의 VL 서열을 포함하는 항체.
36. 서열 30의 VL 서열 및 서열 29의 VH 서열을 포함하는 항체.
37. (a) 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는, HtrA1에 결합하는 항체.
38. (a) 서열 32를 포함하는 VH 서열; (b) 서열 31을 포함하는 VL 서열; 또는 (c) 서열 32를 포함하는 VH 서열 및 서열 31을 포함하는 VL 서열을 포함하는, HtrA1에 결합하는 항체.
39. (a) X_l이 N, S 또는 T이고; X_m이 S, D, Y 또는 A이고; X_n이 G 또는 D인 아미노산 서열 GFX_lIX_mX_nYYIH (서열 25)를 포함하는 HVR-H1; (b) X_o가 N 또는 D인 아미노산 서열 WIDPYGGDTX_oYADSVKG (서열 26)를 포함하는 HVR-H2; (c) X_p가 S 또는 T인 아미노산 서열 GTFLTX_pWGHYFDY (서열 27)를 포함하는 HVR-H3; (d) X_a가 D, S 또는 V이고; X_b가 V 또는 I이고; X_c가 S, N 또는 G이고; X_d가 T 또는 N이고; X_e가 A 또는 Y 이고; X_f가 V 또는 L인 아미노산 서열 RASQX_aX_bX_cX_dX_eX_fA (서열 23)를 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) X_g가 S, V 또는 D이고; X_h가 Y, D 또는 S이고; X_i가 T, S, A, D 또는 N이고; X_j가 T, H, N, S, A, L 또는 R이고; X_k가 P, T, A 또는 S인 아미노산 서열 QQX_gX_hX_iX_jPX_kT (서열 24)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
40. 제39항에 있어서, (a) 서열 4, 20 및 47-51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5 및 52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6 및 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21 및 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22 및 34-46으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
41. 제40항에 있어서, (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
42. 제40항에 있어서, (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
43. 제40항에 있어서, (a) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 IgG1 또는 IgG4 항체인 항체.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
46. 제45항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
47. 항-HtrA1 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 제46항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
48. 제47항에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 항-HtrA1 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
49. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
50. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제.
51. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
52. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
53. 제52항에 있어서, 건성 연령-관련 황반 변성을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
54. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 항체.
55. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하는데 사용하기 위한 항체.
56. 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
57. 제56항에 있어서, 의약이 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 치료하는 치료를 위한 것인 용도.
58. 제57항에 있어서, 연령-관련 황반 변성이 건성 연령-관련 황반 변성인 용도.
59. 제56항에 있어서, 의약이 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위한 것인 용도.
60. 제56항에 있어서, 의약이 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하기 위한 것인 용도.
61. 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 앓는 개체를 치료하는 방법.
62. 제61항에 있어서, 연령-관련 황반 변성이 건성 연령-관련 황반 변성인 방법.
63. 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하기 위해 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하는 방법.
64. 눈에서 HtrA1 활성을 억제하기 위해 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 눈에서 HtrA1 활성을 억제하는 방법.
65. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c)서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
66. 제1항 내지 제12항 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는 항체.
67. (a) 서열 87의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 88의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 89의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 85의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 86의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
68. 제67항에 있어서, (a) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체.
69. 제67항 또는 제68항에 있어서, (a) 서열 4, 20, 47-51 및 75-80으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 5, 52 및 81-82로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6, 53 및 83-84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 1, 18, 21, 33 및 54-57로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 2 및 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3, 19, 22, 34-46 및 59-74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 IgG1 또는 IgG4 항체인 항체.
71. 제65항 내지 제70항 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
72. 제71항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
73. 항-HtrA1 항체를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 제72항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
74. 제73항에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 항-HtrA1 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
75. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
76. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제.
77. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
78. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
79. 제78항에 있어서, 건성 연령-관련 황반 변성을 치료하는데 사용하기 위한 항체.
80. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 항체.
81. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하는데 사용하기 위한 항체.
82. 의약의 제조에서의, 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
83. 제82항에 있어서, 의약이 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 치료하는 치료를 위한 것인 용도.
84. 제83항에 있어서, 연령-관련 황반 변성이 건성 연령-관련 황반 변성인 용도.
85. 제82항에 있어서, 의약이 망막 또는 광수용체 세포의 변성을 억제하기 위한 것인 용도.
86. 제82항에 있어서, 의약이 눈에서 HtrA1 프로테아제 활성을 억제하기 위한 것인 용도.
87. 유효량의 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 연령-관련 황반 변성, 지도형 위축, 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 또는 폴립형 맥락막 혈관병증을 앓는 개체를 치료하는 방법.
88. 제87항에 있어서, 연령-관련 황반 변성이 건성 연령-관련 황반 변성인 방법.
89. 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하기 위해 유효량의 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 망막 또는 광수용체 세포 변성을 억제하는 방법.
90. 눈에서 HtrA1 활성을 억제하기 위해 유효량의 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 눈에서 HtrA1 활성을 억제하는 방법.

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