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KR20140032394A - 형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 목적 항원 특이적인 항체의 제조 방법, 신규 단일 클론 항체 - Google Patents

형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 목적 항원 특이적인 항체의 제조 방법, 신규 단일 클론 항체 Download PDF

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KR20140032394A
KR20140032394A KR1020137028621A KR20137028621A KR20140032394A KR 20140032394 A KR20140032394 A KR 20140032394A KR 1020137028621 A KR1020137028621 A KR 1020137028621A KR 20137028621 A KR20137028621 A KR 20137028621A KR 20140032394 A KR20140032394 A KR 20140032394A
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KR
South Korea
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ser
cells
chain
antibody
thr
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Withdrawn
Application number
KR1020137028621A
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English (en)
Inventor
노부유키 쿠로사와
마사하루 이소베
Original Assignee
내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마 filed Critical 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브 토야마
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Abstract

폭넓은 동물종으로부터 효율적으로 항원 특이적 단일 클론 항체를 제작하는 기술을 제공하고, 상기 기술을 사용하여 새롭게 개발된 항원 특이적 단일 항체를 제공한다. 비인간 동물을 목적 항원으로 면역하고, 면역 성립 후의 비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직 등을 채취하고, 또는, 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 림프액, 림프액 조직 등을 채취해, 채취한 림프액, 림프액 조직 등과 (1)표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하여, 상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합한 세포를 선택한다. 상기의 방법으로 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한편의 세포를 선택하고, 선택된 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취하여, 그 염기 배열을 동정하고, 동정한 유전자의 염기 배열에 근거하여 상기 항체 또는 항체의 단편을 조제하는, 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법.

Description

형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 목적 항원 특이적인 항체의 제조 방법, 신규 단일 클론 항체 {Method for selecting plasma cells plasmablasts, method for porducing target antigen-specific antibody, and new monoclonal antibody}
본 출원은, 2011년 3월 30일자 출원된 일본 특원 2011－075135호의 우선권을 주장하고, 그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다.
본 발명은, 형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 목적 항원 특이적인 항체의 제조 방법, 신규 단일 클론 항체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 또는 형질아 세포의 선택 방법, 이 방법을 이용하여 얻어지는 형질 세포 또는 형질아 세포를 이용하여 목적 항원 특이적인 항체를 제조하는 방법, 또한, 이 항체 제조 방법에 의해 새롭게 얻어지는 신규 단일 클론 항체에 관한 것이다.
현재 항체 의약품 개발에 이용되는 단일 클론 항체의 상당수는, 마우스 항체를 인간화한 것이다. 이 이유는, 단일 클론 항체 제작법으로서 마우스 잡종 세포법이 확립되어 있기 때문이다. 그러나 항체 의약의 표적이 되는 인간 단백질의 기능적 항원 에피토프 (epitope)의 상당수는, 인간-마우스 간의 아미노산 배열 상동성이 높고, 이들 항원을 마우스에 면역하여도 면역 관용을 위해서 특이성이 높은 항체를 얻기 어렵다. 이 때문에 높은 능력을 갖는 항체를 손에 넣기까지는, 방대한 수의 잡종 세포의 제작과 이들의 스크리닝을 할 필요가 있다. 따라서, 새로운 항체 의약품 개발을 위해서는, 인간의 항원은 가능한 한 다른 아미노산 배열을 갖는 동물종에 면역을 실시하여, 면역 관용의 제한을 회피하는 것으로, 높은 능력을 갖는 단일 항체를 효율적으로 생산하기 위한 방법이 요구되고 있다.
종래의 단일 클론 항체 제작은, 항체생산 세포를 골수종 세포와 융합시키는 것으로 자율 증식능을 갖는 잡종 세포를 제작하고, 그 중에서 목적의 특이성을 갖는 항체 생산능을 갖는 클론을 스크리닝하는 방법이 널리 이용되어 왔다. 그러나 잡종 세포 방법에는 몇 개의 단점이 존재한다. 하나는, 잡종 세포 기술이 마우스 항체생산 세포로 한정된 방법이기 때문에, 다른 동물종으로의 응용이 어렵다. 또한, 잡종 세포의 스크리닝에 시간과 시간이 드는 것도 단점이다. 또 스크리닝을 하더라도, 항원 특이적 항체 생산능을 갖는 클론이 얻어진다는 보증이 없다 점도 문제이다.
상기의 결점을 극복하기 위하여, 앨리스 포트법 (ELISPOT)을 응용한 항원 특이적 항체생산능을 갖는 형질 세포 (항원 특이적 형질 세포)의 동정법이, 인간 단일 클론 항체 제작에 개발되었다 (특허 문헌 1; 이들 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다). 인간 임파구로 정제된 형질 세포를, 특수 가공이 실시된 마이크로 웰에 넣어 형질 세포로부터 다량으로 분비되는 항체를 형질 세포 주변의 기반으로 고정화시키고, 이것에 표식 항원을 반응시키는 것으로, 항원 특이적 형질 세포의 동정 (identification)을 실시하는 방법이다.
JP2009-34047A
Sanderson, R.D., Lalor, P., Bernfield, M.B lymphocytes express and lose syndecan at specific stages of differentiation:Cell Regulation 1: 27-35 (1989) Immunological Reviews, Sarah A.Oracki, Jennifer A.Walker, Margaret L.Hibbs, Lynn M.Corcoran, David M.Tarlinton, Special Issue:B-Lymphocyte Biology, Volume 237, Issue 1, pages 140-159, September 2010.
그러나 상기 특허 문헌 1에 기재된 방법에서는, 항원 특이적 형질 세포의 동정에 특수한 장치가 필요하고, 세포의 회수에도 매우 번잡한 조작을 필요로 한다. 또한, 이 방법에서는, 세포 표면 항원을 이용한 형질 세포의 순화 작업이 필요하기 때문에, 형질 세포 동정법이 확립되어 있지 않은 동물종에서 항원 특이적 단일 클론 항체를 제작할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은, 상기 결점을 극복하여, 폭넓은 동물종으로부터 효율적으로 항원 특이적 단일 클론 항체를 제작하는 기술을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명은, 상기 새롭게 개발된 항원 특이적 단일 클론 항체를 제작하는 기술을 이용하여, 새로운 항원 특이적 단일 클론 항체를 제공하는 것도 목적으로 한다.
B세포는 세포막상에 항체를 발현하고 있으며 (막형 항체), 이것에 항원이 결합하는 것으로 면역 글로블린 유전자의 클래스 스위치 및 체세포 고빈도 돌연변이가 일어나고, 그 결과 항원에 대해 친화성의 증대한 B세포가 선택된다. 이 고친화성 B세포의 일부가 형질 세포로 분화하여 항체생산 세포가 된다. 이 분화에 따라 형질 세포는, 면역 글로블린 유전자의 선택적 스프라이싱 (splicing)에 의해 막형 항체의 발현을 소실시켜서, 분비형 항체를 다량으로 발현시킨다는 것이 알려져 있다 (비특허 문헌 2, 그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다).
발명자는 랫트 (rat), 기니피그 (marmotte), 토끼의 형질 세포의 해석을 실시하는 과정에서, 이들 동물에서 얻어진 형질 세포 표면에는 항원 결합 해석이 가능한 양의 막형 항체 분자가 발현하고 있다는 것을 새롭게 발견하였다. 이것에 의해 형질 세포 표면에 발현하는 고친화성 막형 항체에 표식 항원을 직접 결합시키는 것으로, 항원 특이적 형질 세포를 동정할 수 있다는 가능성이 생각되었다. 그러나 형질 세포막상에 발현하는 항체 분자의 양은 적고, 이 때문에 비록 표식 항원에 특이적으로 결합한 형질 세포가 존재하더라도, 표식 항원의 비특이적 흡착에 의한 노이즈 때문에 항원 특이적 형질 세포를 동정하는 것은 곤란하였다.
발명자는, 소포체 특이적인 형광 색소를 이용하는 것으로 효율적으로 형질 세포를 동정하는 방법으로서 「형질 세포 동정 및 단리용 형광 프로브 및 이 프로브를 이용한 형질 세포의 동정 또는 단리방법」을 개발하여, 특허 출원하였다 (WO2011/118579 (그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다).
발명자는, 면역 동물로부터 조제한 세포 현탁 용액에, 형광 표식 항원과 소포체 친화성 형광 색소를 작용시킬 만한 단순한 조작으로, 항원 특이적 형질 세포를 동정할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 이하와 같다.
[1] 비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는, 비인간 동물을 목적 항원으로 면역시키고,
면역 성립 후의 비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하고,
상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함한, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택하는 방법.
[2] 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원과 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하고,
상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함하고,
목적 항원에 특이적으로 결합하는 인간의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택하는 방법.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법으로 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽 세포를 선택하고,
선택된 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취하여 그 염기 배열을 동정하고,
동정한 유전자의 염기 배열에 근거하여 상기 항체 또는 항체의 단편을 조제하는 것을 포함한 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법.
[4] 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질은, 세포의 소포체에 대한 염색 선택성이, 소포체 이외의 세포 소기관에 대한 염색 선택성에 비해 높은 형광 프로브에 있어서, 상기 형광 프로브에 의한 염색에 의해, 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 식별 가능한, 형질 세포 및/또는 형질아 세포의 동정 또는 단리에 이용하기 위한 형광 프로브인 상기 [1]∼[3]의 어느 하나에 기재된 방법.
[5] (1) 양친매로 양이온성이며, 또한 중간 정도의 지용성을 갖는 물질, 및 (2) 소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는 물질로 이루어진 군에서부터 선택되는 상기 [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 양친매는 양친매성 인덱스 (AI)가 +6> AI > 0이며, 중간 정도의 지용성은 소수성 인덱스 (logP)가, +6 > logP > 0이며, 일정 이상의 친화성은, 해리 정수가 0.1μM∼0.1nM의 범위인 상기 [5]에 기재된 방법.
[7] 상기 소포체 이외의 세포 소기관은 형질막, 미토콘드리아, 골지체, 리소좀, 퍼옥시좀, 핵, 중심체, 세포질 기질, 파고솜, 엔도솜, 또는 아그리솜인 상기 [ 4] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 상기 형광 프로브는 형광 표식 glibenclamide, 형광 표식 Brefeldin A, 형광 프로브, 및 형광 단백질로 이루어진 군에서부터 선택되는 상기 [4] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9] 배열표의 배열 번호 1로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
[10] 배열표의 배열 번호 2로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
[11] 배열표의 배열 번호 3으로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의λ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
[12] 배열표의 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
[13] 배열표의 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
[14] 배열표의 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
[15] 배열표의 배열 번호 7∼18 중 어느 하나로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 유전자 또는 배열 번호 19∼ 30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
[16] 배열표의 배열 번호 31∼42 중 어느 하나로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 유전자 또는 배열 번호 43∼ 54 및 86∼88 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
[17] 배열 번호 19∼30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
[18] 배열 번호 43∼54 및 86∼881 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
[19] 가변 영역으로서 배열 번호 19∼30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 γ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
[20] 가변 영역으로서 배열 번호 43∼54 및 86∼88 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 κ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
[21] 하기 κ쇠사슬 CDR1,κ쇠사슬 CDR2 및 κ쇠사슬 CDR3 중 한 개씩의 조합을 포함한 κ쇠사슬 또는 하기 γ쇠사슬 CDR1,γ쇠사슬 CDR2 및 γ쇠사슬 CDR3 중 어느 하나의 1개씩 조합을 포함한 γ쇠사슬을 포함한 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
Figure pct00001
본 발명을 이용함으로써, 폭넓은 동물종으로 항원 특이적 단일 클론 항체를 신속히 생산할 수 있기 때문에, 기존의 기술에서는 제작이 곤란하였던 표적 분자에 대한 항체 의약품의 개발에 새로운 가능성을 주는 것이다.
도 1은 실시예 1의 결과를 나타낸다. 장골 림프절 유래 랫트 임파구를, 항랫트 IgG 항체 (초록, 좌측 도면) 및 ER-tracker를 이용하여 세포 표면 항체 및 소포체를 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 사진이다. ER-tracker 강양성의 형질 세포 표면에 IgG의 발현이 관찰되었다 (화살표).
도 2는 실시예 1의 결과를 나타낸다. 장골 림프절 유래 랫트 임파구를 표식 GFP 및 ER-tracker를 이용하여 염색하고, 세포 분별장치 (cell sorter)를 이용하여 분리한 결과이다. A는, GFP (세로축)와 ER-tracker (횡축)의 형광 강도에 의한 장골 림프절 유래 랫트 임파구의 이차원 분석도이다. GFP양성으로 ER-tracker 양성 영역 (High)을 항원 특이적 형질 세포분획, GFP음성으로 ER-tracker 양성 영역 (Low)을 비특이적 형질 세포분획으로서 나타냈다. B는, 항원 특이적 형질 세포분획보다 분수된 세포를 고정 후 막가용화 처리를 실시하고, 이것에 FITC 표식항 랫트 IgG 항체를 작용시켜 세포 내 IgG를 염색한 형광 현미경 사진을 나타낸다. 분수된 세포는, 형질 세포의 특징인 세포내 멘역 글로블린을 발현하고 있었다.
도 3은 실시예 1의 결과를 나타낸다. 세포 분별장치로 분리된 세포로부터 cDNA를 합성하고, 이것을 주형으로서 5'-RACE PCR법에 의해 랫트γ쇠사슬 및 κ쇠사슬 가변 영역 유전자를 증폭하였다 (도면 상부 K chain, G chain). 증폭된 가변 영역을 선상화 발현 벡터에 넣고, 랫트 γ쇠사슬 및 κ쇠사슬 면역 글로블린 발현 unit을 제작하였다. 증폭된 DNA의 아가로스 전기 영동의 결과를 나타냈다 (도 하부 K expression unit, G expression unit).
도 4는 실시예 1의 결과를 나타낸다. 항원 특이적 형질 세포 (High), 및 비특이적 형질세포 (total)로부터 얻어진 재조합 항체의 GFP 결합능을 ELISA법으로 결정한 결과이다. 세로축은 항체 1ng 근처의 GFP 결합량을 나타낸다. 1에서 12가 항원 특이적 형질 세포분획으로 조제된 재조합 항체, 13에서 24가 비특이적 형질 세포 분획으로 조제된 재조합 항체, 25는 음성 대조구이다.
도 5는 실시예 2의 결과를 나타낸다. 장골 림프절 유래 기니피그 임파구를, 항기니피그 IgG 항체 (초록, 좌도) 및 ER-tracker를 이용하여 세포 표면 항체 및 소포체를 염색하여 형광 현미경으로 관찰한 사진이다. ER-tracker 강양성의 형질 세포 표면에 IgG의 발현이 관찰되었다 (화살표).
도 6은 실시예 2의 결과를 나타낸다. A는, 기니피그 장골 림프절에서 채취한 세포를 형광 표식 인간 인슐린 (세로축)과 ER-tracker (횡축)로 염색하고, 이것을 세포 분별장치에 의해 분리했을 때의 형광 강도에 의한 기니피그 임파구의 이차원 분석도이다. R1로 표시된 영역의 세포를 항원 특이적 형질 세포분획으로 하고, 단일 세포분별을 실시하였다. B는, 항원 특이적 형질 세포분획으로부터 얻어진 세포를 고정, 막가용화 처리를 실시하고, 이것에 FITC 표식 항기니피그 IgG 항체를 작용시켜 세포내 IgG를 염색하였다 (초록). 또 소포체를 소포체 친화성 형광 색소 ER-ID Red를 이용하여 염색하였다 (빨강). 세포핵은 Hechst33342를 이용하여 염색하였다 (파랑). 분수된 세포는, 형질 세포의 특징인 세포내 면역 글로블린 (초록), 발달한 소포체 (빨강) 및 세포의 한쪽으로 치우친 핵이 있었다.
도 7은 실시예 2의 결과를 나타낸다. 항원 특이적 형질 세포분획으로부터 단 리된 개개의 형질 세포로부터γ 및 κ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편을 증폭하였다. 전형적인 증폭 산물의 1% 아가로스 겔 전기 영동 사진을 나타낸다. G는 기니피그γ가변 영역 유전자 단편, K는 κ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편을 나타낸다.
도 8은 실시예 2의 결과를 나타낸다. 기니피그γ 및 κ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편을 각각의 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편에 결합시키는 것으로 얻어진, 선상화 γ쇄 및 κ쇠사슬 발현 unit의 1% 아가로스겔 전기 영동 사진을 나타낸다. G는 선상화 γ쇠사슬 발현 unit, K는 κ쇠사슬 발현 unit을 나타낸다.
도 9는 실시예 2의 결과를 나타낸다. 선상화 γ쇄 및 κ쇠사슬 또는 λ쇠사슬 발현 unit을 293 FT세포에 도입하는 것으로 배양기속에 분비된 재조합 항체의 인간 인슐린에 대한 결합을 나타낸다. 횡축은 재조합 항체 1㎍ 부근의 인간 인슐린 결합능을 나타낸다.
도 10은 실시예 3의 결과를 나타낸다. 흰자 알부민 양성으로 ER-tracker강양의 세포군이 존재한 것을 나타낸 결과이다.
도 11은 실시예 3의 결과를 나타낸다. 프라이머 (라)와 프라이머 (처)를 이용하여 토끼 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 한 결과이다.
도 12는 실시예 3의 결과를 나타낸다. 아가로스겔 전기 영동법에서 κ 및 γ 쇠사슬 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 unit로의 변환을 확인한 결과이다.
도 13은 실시예 3의 결과를 나타낸다. 항원 특이적 형질 세포 및 비특이적 형질 세포로부터 얻어진 재조합 토끼 단일 클론 항체의 항원 결합능에 대해 ELISA법을 이용하여 조사한 결과이다.
［목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포, 형질아 세포의 선택 방법］
본 발명의 제1 형태는 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한편을 선택하는 방법이다.
본 발명의 제1 형태는, 비인간 동물을 대상으로 하는 방법 (이하, NHA법이라함)과 인간을 대상으로 하는 방법 (이하, HU법이라고 함)의 2개의 방법으로 나눌 수 있다. 비인간 동물을 대상으로 하는 NHA법은,
비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는, 비인간 동물을 목적 항원으로 면역시키고,
면역 성립 후의 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하고,
상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함한다.
NHA법에 의해, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 비인간 동물의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택할 수 있다.
인간을 대상으로 하는 HU법은,
인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하고,
상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함한다.
HU법에 의해, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 인간의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택할 수 있다.
이하, NHA법에 대해 설명한다.
＜비인간 동물의 목적 항원으로의 면역＞
비인간 동물을 목적 항원으로 면역한다.
본 발명에서 「비인간 동물」은, 인간 이외의 면역계를 갖는 모든 동물을 의미한다. 이와 같은 동물의 예로서는, 포유동물, 조류 등을 들 수 있다. 포유동물의 예로서는, 유인원, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 당나귀, 낙타, 라마, 알파카 (alpaca), 순록, 물소, 야크, 기니피그, 토끼, 밍크, 마우스, 랫트, 모래 쥐, 햄스터, 골든 햄스터, 아르메니안햄스타, 페렛 (ferret), 미니 돼지, 아메리카너구리 (raccoon), 주머니쥐 (opossum), 사향쥐, 캥거루, 돌고래 등을 들 수 있다. 조류로서는, 닭, 메추리 또는 타조 등을 들 수 있다.
본 발명에서 「목적 항원」은, 바이러스, 마이코플라즈마, 세균, 곰팡이 등의 미생물, 조개류 등의 관륜동물, 곤충이나 갑각류 등의 탈피 동물, 척추동물 등의 신구동물 및 이들 구성물질, 단백질, 당, 지방질, 복합 당질, 핵산, 천연 저분자 유기 화합물, 천연 고분자 유기 화합물, 인공 저분자 유기 화합물, 인공 고분자 유기 화합물, 금속 착체 등이다. 단, 목적 항원의 종류를 한정하려는 의도가 아니고, 이들은 어디까지나 예시이다.
비인간 동물의 면역에 이용하는 목적 항원은, 목적 항원을 그대로 이용할 수도 있지만, 목적 항원을 포함한 생물 등을 그대로, 또는 사멸시킨 상태 또는 그 추출액으로서 이용할 수도 있고, 또는, 적당한 담체 결합 또는 혼합하여 이용할 수도 있다.
비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시킨다. 림프액 등에 대한 생체 밖에서의 목적 항원에 의한 감작은, 이하와 같이 실시할 수 있다. 비인간 동물보다 항원 제시 세포인 수장 세포, T세포, B세포를 채취한다. 이어서 시험관 중에서 항원을 수장 세포에 작용시켜 탐식·소화시키고 항원의 제시 능력을 구비한 성숙수장 세포를 제작한다. 이것에 T세포 및 B세포와 인타로이킨 2 등의 사이토카인이나 poly (dI-dC) 등의 면역 자극제를 첨가하여 항원에 대해 응답하는 B세포를 시험관 내에서 증식·분화시켜서 최종적으로 항체생산 세포인 형질 세포 및 형질아 세포를 얻는다.
본 발명에서 「비인간 동물을 목적 항원으로 면역한다」는, 비인간 동물에 목적 항원을 접촉시켜서, 비인간 동물에서, 목적 항원에 대한 면역을 발현시키는 것을 의미한다. 목적 항원에 대한 면역의 발현 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 비인간 동물에 목적 항원을 투여 또는 이식하는 것으로 비인간 동물을 면역할 수 있다. 목적 항원의 투여 방법이나 이식 방법에도 특별히 제한은 없지만, 투여 방법으로서는, 예를 들면, 경기투여, 경구투여, 피하 주사, 정맥주사, 근육주사, 또는 비인간 동물으로의 유전자 도입에 의해 항원을 동물체 내에서 발현시키는 방법 등을 들 수 있다. 또는, 비인간 동물의 피부에 목적 항원을 접촉시키는 것도 비인간 동물을 면역할 수 있다.
비인간 동물의 목적 항원으로의 면역은, 목적 항원에 의한 면역이 비인간 동물에서 성립할 때까지 실시한다. 따라서, 비인간 동물은, 목적 항원에 의한 면역이 성립할 때까지, 목적 항원을 접촉시킨다. 목적 항원의 비인간 동물으로의 접촉의 빈도, 기간, 1회의 접촉에 사용되는 목적 항원의 양은, 면역 성립의 용이함에 따라 적당 결정할 수 있다. 비인간 동물에서, 목적 항원에 의한 면역이 성립하고 있는지 아닌지는, 통상의 방법, 예를 들면, 비인간 동물보다 혈액을 채취하고 혈청 중에 포함되는 항체를 ELISA법에 의해 측정함으로써 확인할 수 있다.
＜면역 성립 후의 동물로부터의 림프절 등의 채취＞
면역 성립 후의 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취한다. 본 발명의 목적은, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 비인간 동물의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택하는 것이므로, 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 포함할 가능성이 높은, 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취한다.
형질 세포 및 형질아 세포는, B임파구가 최종 분화한 것으로, 항체생산에 특화한 세포이다. 친화도 성숙 (Affinity maturation)이라 불리는 항체 유전자의 체세포 돌연변이와 항원에 의한 선택이 이미 실시되고 있기 때문에, 결합능이 높은 항체단리에 이들 세포는 특히 유용하다. 그러나 형질 세포 및 형질아 세포는 몇 개의 부분집합으로 이루어진 불균일한 세포 집단이며, 림프액 조직 내의 존재율은 0.1% 이하로 적기 때문에 고순도의 단리는 어렵다. 종래의 방법에서는, 말초피나 림프절에서 형질 세포 및 형질아 세포를 동정·단리하려면, 최저 3종류 이상의 세포 표면 마커에 대한 항체를 조합한 수단 층의 포지티브·네가티브 선별 조작이 필요하였다 (비특허 문헌 1; 그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다).
림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수는, 예를 들면, 이하와 같이 조제할 수 있다. 피하, 근육 또는 풋 패드에 항원을 주사하여 약 1개월 이상 경과한 비인간 동물에서 종창한 림프액, 림프액 조직을 외과적으로 꺼낸다. 림프절에 부수 한 조직을 실체 현미경하에서 없앤 후, 핀셋을 이용하여 림프절의 피막을 찢음으로써 림프절 내부의 세포를 PBS 용액 (10mM phosphate buffer, 120mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.6) 중에 분산시킨다. 혈구 시료는, 면역 동물로부터 헤파린 채혈에 의해서 얻어진 혈액을 밀도 구배 원심법에 의해 분리된 단핵구를 이용한다. 골수는, 면역 동물에서 꺼낸 대퇴골의 양 뼈말단을 절단하고, 한쪽 뼈 말단에 삽입한 주사바늘로 PBS 용액을 골수에 유입시키는 것으로, 다른 쪽 뼈 말단에서 유출시킨 골수 세포를 이용한다.
＜세포의 선택＞
채취한 림프절로부터, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 비인간 동물의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택한다. 이 선택을 실시하기 위해서, (1) 표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질을 이용한다.
(1) 표식시킨 목적 항원
표식시킨 목적 항원은, 비인간 동물의 면역에 이용한 목적 항원과 동일한 에피토프를 포함한 물질이다. 따라서, 표식시킨 목적 항원과 면역에 이용한 목적 항원은 완전히 동일한 물질일 수도 있고, 공통되는 에피토프를 포함한 다른 물질일 수도 있다.
목적 항원의 표식에 이용하는 물질은 특별히 제한은 없다. 표식시킨 목적 항원이 결합한 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택할 수 있는 표식이라면 좋다. 그러한 표식으로서는, 예를 들면, 형광 표식, 자기 비즈 표식 등을 들 수 있다. 형광 표식의 종류에는 특별히 제한은 없다. 단, 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질은 표식으로 구별할 수 있는 것이, 목적 항원 및 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질이 결합한 세포를, 목적 항원에만 결합한 세포, 및 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질에만 결합한 세포로부터 구별할 수 있는 것이라면 좋다.
(2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질
형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질로서는, 예를 들면, 이하에 설명하는 형광 프로브 (1)를 들 수 있다.
<형광 프로브 (1)>
형광 프로브 (1)은 형질 세포 및 형질아 세포의 동정 또는 단리에 이용하기 위한 형광 프로브이며, 세포의 소포체에 대한 친화성이, 다른 소기관에 대한 친화성에 비해 높은, 환언하면, 세포의 소포체를 선택적으로 염색하는 형광 프로브이다. 형질 세포 및 형질아 세포는, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포에 비해, 소포체가 비정상으로 발달하고 있고, 그 결과, 형광 프로브 (1)로의 염색에 의해 얻어지는 형광 강도는, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포가 형광 프로브 (1)로 염색되었을 경우의 형광 강도에 비해, 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 식별 가능한 정도의 차이를 나타낸다. 형광 프로브 (1)가 표시되는 상기 형광 강도비 (형질 세포 및 형질아 세포의 형광 강도/형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 형광 강도)는, 예를 들면, 3배 이상이다.
형질 세포 및 형질아 세포의 소포체와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 소포체와는, 형광 프로브 (1)에 대한 친화성에 큰 차이는 없지만, 소포체의 발달의 정도의 차이에 의해 상기 형광 강도의 차이가 발생한다. 그 결과, 상기 형광 강도비에 근거하고, 형광 프로브 (1)에 의한 염색에 의해, 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 식별할 수 있다.
형광 프로브 (1)로 염색하는 것으로, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포가 공존하는 형질 세포 및 형질아 세포를, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포로부터의 형광 강도와 형질 세포 및 형질아 세포로부터의 형광 강도의 강약의 차이로 양자를 식별 가능하다. 이 때문에, 형광 프로브 (1)로 염색하는 것으로, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포가 공존하는 세포군중에서, 형질 세포 및 형질아 세포를 용이하게 동정할 수 있고, 또한 동정한 형질 세포 및 형질아 세포를 채취하는 것으로, 형질 세포 및 형질아 세포를 많이 포함한 세포군을 얻을 수 있다.
형광 프로브 (1)는 염색된 형질 세포 및 형질아 세포로부터의 형광 강도가, 염색된 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포로부터의 형광 강도의 3배 이상이면, 양자의 식별이 가능하고, 식별을 용이하게 한다는 관점에서는, 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상의 것이다. 단, 이 형광 강도비는, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 종류에 의해서 소포체의 발달의 정도가 다르므로, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 종류가 다르면 변화한다. 상기 형광 강도비가 높은 만큼, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 포함한 세포군 중에서 형질 세포 및 형질아 세포를 보다 효율 좋게 동정할 수 있다. 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포로서는, 예를 들면, 적혈구, 혈소판, T임파구, B임파구, 과립구, 호중구, 호염기구, 호산구, 매크로파지(macro phage) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 형광 프로브 (1)를 이용한 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포와의 판별은 이하와 같이 실시할 수 있다. 형광 프로브 (1)를 세포 현탁액에 첨가하여 37℃에서 30분간 염색을 실시한다. 염색에 적절한 형광 프로브 (1)의 농도는, 형광 프로브 (1)의 종류에 의해 다르지만, 예를 들면, 100nM∼1μM이다. 염색 후, 세포를 PBS로 세정한다. 세정한 세포는, 예를 들면, (1) 형광 현미경을 이용하여 세포에 있어서의 형광 프로브의 편재를 관찰하는 것, 또는 (2) 세포에서 일어나는 형광의 강도에 근거하여 형질 세포 및 형질아 세포인지, 또는 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포인지를 판별할 수 있다. 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포와의 판별 방법에 대해서는, 형질 세포 및 형질아 세포 동정·분리 방법에 대해 상세히 기술한다.
또한, 상기 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포와의 판별 방법을 응용하여 형질 세포 및 형질아 세포의 소포체 및 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 소포체에 대한 염색 선택성이 미지의 물질로부터 형광 프로브 (1)로서 이용 가능한 물질을 스크리닝할 수도 있다. 세포의 소포체에 대한 염색 선택성이 높은, 본 발명의 형광 프로브 (1)로서 적합한 형광 프로브의 스크리닝은 후술하는, 소포체에 편재하는 단백질의 면역 염색 (형질 세포 및 형질아 세포에서는 면역 글로블린)이나, 소포체 이행성의 재조합 형광 단백질을 배양 세포로 발현시키는 것으로, 세포의 소포체를 동정하는 방법을 이용한, 세포 전체의 형광 강도 A와 소포체로부터의 형광 강도 B의 비율 (B/A)을 구하는 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
형광 프로브 (1)로서 이용 가능한 물질을 스크리닝하는 방법에서는, 형질 세포 및 형질아 세포만을 이용하더라도, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포만을 이용하여도 실시할 수 있다. 단, 형질 세포 및 형질아 세포는 소포체가 발달하고 있어, 염색에 의해 높은 형광 강도를 얻기 때문에, 형질 세포 및 형질아 세포를 이용하는 것이, 세포의 소포체에 대한 물질의 염색 선택성의 평가가 보다 용이하다. 그러나 형질 세포 및 형질아 세포의 입수는 용이하지 않기 때문에, 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 이용하여 소포체에의 염색성 (염색력)을 평가하고, 형광 프로브 (1)로서 이용 가능한 물질을 스크리닝할 수도 있다. 예를 들면, 일반적인 배양 세포 (예를 들면 Hela 세포)를 이용한 염색 실험에 대하고, 상기 세포 전체의 형광 강도 A와 소포체로부터의 형광 강도 B의 비율 (B/A)을 구하는 것으로, 형광 프로브 (1)로서 이용 가능한 물질을 스크리닝할 수 있다. 단, 세포로서 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 이용하는 경우에는, 반응을 일으키는 최소의 물리량으로 해야 할 B/A의 값을, 세포에 있어서의 소포체의 발달의 정도에 따라, 형질 세포 및 형질아 세포를 이용하는 스크리닝법으로 채용하는 반응을 일으키는 최소의 물리량으로서의 B/A의 값보다는, 낮은 값, 예를 들면, 50% 정도로 적절히 설정하는 것이 적당하다.
형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 예로서는, 적혈구, 혈소판, T임파구, B임파구, 매크로 살균 바이러스, 호중구, 호산구, 호염기구 등을 다른 세포로서 들 수 있다. 또한, 상기 방법으로의 스크리닝에는, 형질 세포 및 형질아 세포 대신에, 잡종 세포, 형질 세포 및 형질아 세포 종양 세포, 또는 다발성 골수종 세포를 이용할 수도 있다. 이것은, 잡종 세포 세포, 형질 세포 및 형질아 세포 종양 세포, 및 다발성 골수종 세포도, 면역 글로블린을 생산하기 위한 소포체가 발달하고 있고, 이 때문에 염색에 의해 높은 형광 강도를 얻을 수 있어 세포의 소포체에 대한 물질의 염색 선택성의 평가가 보다 용이하기 때문이다.
형질 세포 및 형질아 세포 및 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 소포체에 대한 염색 선택성이 높은 형광 프로브 (1)는, 물질의 예로서는, (1) 양친매로 양이온성이며, 중간 정도의 지용성을 갖는 물질, 및 (2) 소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는 물질을 들 수 있다. 이와 같은 (1) 또는 (2)의 성질을 갖는 물질은, 형질 세포 및 형질아 세포의 소포체에 대한 염색성 및 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포의 소포체에 대한 염색성의 양쪽 모두가, 세포의 그 외의 소기관에 대한 염색성에 비해 높아진다.
상기 (1)에 있어서의 「양친매로 양이온성이다」는, 구체적으로는, 양친매성 인덱스 (AI)가, 예를 들면,+6 > AI> 0인 것을 의미한다. 다만 양친성 인덱스는 분자의 지용성 도메인의 외관상의 logP값을 산출하는 것으로 얻어지는 값이다. 구체적으로는, Hansch 등의 절편값에 근거하여, 탄소 쇠사슬의 길이와 그 위치 관계와 양이온성의 4급 암모늄기의 극성 효과를 고려하여 Morrall 등의 모델에 따라서 산출된 값이다. [Hansch C, Leo AJ. Exploring QSAR: Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, p.160, American Chemical Society: Washington, DC, 1995., Morrall SW, Herzog RR, Kloepper-Sams P, Rosen MJ.Octanol/water partitioning of surfactants and its relevance to toxicity and environmental behavior. Proc 4th World Surfactants Congress,vol. 3. AEPSAT: Barcelona, 1996; 220-227.
상기 (1)에 있어서의 「중간 정도의 지용성」은 소수성 인덱스 (logP)가, 예를 들면, +6 ＞ logP ＞ 0인 것을 의미한다. 소수성 인덱스는, Hansch 등의 절편 추산법에 의해 산출된 분자 전체의 소수성 값이다. 구체적으로는, AI로 표시된 소수기에 이것에 부수한 구조의 영향을 가산한 것이다.
상기 (2)에 있어서의 「소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는다」는, 구체적으로는 해리 정수가 0.1μM에서 0.1 nM의 친화성을 갖는 것을 의미한다. 소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는 물질도, 세포의 소포체를 선택적으로 염색하는 형광 프로브이다.
(1) 양친매로 양이온성이며, 또한 중간 정도의 지용성을 갖는 물질의 예로서는, 이하 A, B 또는 C로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
식 A로 표시되는 화합물은, DiOC6 (3) (3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide)이며, 저농도에서는 미토콘드리아에 집적하지만, 고농도에서는 소포체에 집적한다. 식 B로 표시되는 화합물은, rhodamine B hexyl ester이며, 저농도에서는 미토콘드리아에 집적하지만, 고농도에서는 소포체에 집적한다. 식 C로 표시되는 화합물은, ER-Tracker Blue white DPX이며, 주로 소포체에 집적하고, 고농도에서는 골지체도 염색한다. 실시예에서 사용한 형광 프로브이다. 이들 A, B 또는 C로 표시되는 화합물은 모두 양친매로 양이온성, 중간 정도의 지용성을 갖는다 (참고 문헌, Why fluorescent probes for endoplasmic reticulumare selective: an experimental and QSAR-modeling study를 참조).
A로 표시되는 화합물의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 4.5로 4.4이며, 1가의 양이온을 갖는다. B로 표시되는 화합물의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 4.8과 5.9이며, 1가의 양이온을 갖는다. C로 표시되는 화합물의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 5.1에서 0.7이며, 1가의 양이온을 갖는다. C로 표시되는 화합물은, 실시예에서 나타낸 바와 같이 형질 세포 및 형질아 세포를 염색했을 경우의 형광 강도가 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 염색했을 경우의 형광 강도의 4배 이상이다.
Figure pct00002
색소 (Dye) 1, 5, 7 및 10은, 양친매성 양이온성이며, 또한 중간 정도의 지용성을 갖는 물질이며, 형광 프로브 (1)의 예이다. 이들 색소는, 미국 출원 공개 US2010/0068752 A1 (그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다)에 기재된 색소이다. 이들 색소는, 상기 미국 출원 공개공보 기재에 근거하여 합성할 수 있는 것 이 외, 일부는 시판되고 있다. 색소 (Dye) 1의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 4.95와 3.77이며, 1가의 양이온을 갖는다. 색소 (Dye) 5의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 5.11과 4.32이며, 1가의 양이온을 갖는다. 색소 (Dye) 7의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 4.19와 3.29이며, 1가의 양이온을 갖는다. 색소 (Dye) 10의 양친매성 인덱스 (AI) 및 소수성 인덱스는, 각각 4.25와 5.71이며, 1가의 양이온을 갖는다. 색소 (Dye) 1, 5, 7 및 10의 소수성 인덱스는, CompuDrug사의 계산 소프트 Pallas를 이용하여 2종의 독립한 logP 산출 지표 (logP (annlogp), logP (atomic6))에, 실측치와의 일치성을 높이기 위한 계수를 곱한 수치의 합인 logP (combined)= 0.863 × logP (annlogp)+ 0.137 × logP (atomic6)의 값으로 해서 산출하였다. 양친매성 인덱스는, logP (annlogp)의 값으로부터 인산기 (P-0)를 제외한 것으로서 산출하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
(2) 소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는 물질의 예로서는, 예를 들면, 형광 표식 glibenclamide, 및 형광 표식 Brefeldin A를 들 수 있다.
glibenclamide는, 하기 식으로 표시되는 화합물이며, 상품명： ER-Tracker (등록상표) Green (BODIPY(R) FL glibenclamide, ER-Tracker (등록상표) Red, (BODIPY(R) TR glibenclamide)은, glibenclamide에 형광 색소 (BODIPY)를 결합시킨 화합물로서 시판되고 있다. glibenclamide 화합물은, 소포체에 많은 sulphonylurea receptors of ATP-sensitive K+ channels에 결합하고, 그 작용을 저해하는 것이 알려져 있으며, 당뇨병 치료약으로서 이용되고 있다. glibenclamide의 ATP-감수성 K+ channel로의 해리 정수는 0.1∼3.6nM이다.
Figure pct00005
Brefeldin A는, 하기 식으로 표시되는 화합물이며, 상품명：BODIPY-brefeldin A는 Brefeldin A에 형광 색소 (BODIPY)가 결합된 화합물로서 시판되고 있다. Brefeldin A는, 소포체로부터 골지체로의 소포수송에 작용하는 GTP-exchanging factor인 Arf1 단백질의 기능 저해를 나타낸다.
Figure pct00006
림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수에 대한 형광 프로브 (1)의 첨가량은, 검출기의 감도, 세포 현탁액의 조성, 염색 시간 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들면, ER-Tracker Blue white DPX의 경우 100nM∼1μM의 범위일 수 있다. 단, 이 범위로 한정되는 것은 아니다.
＜ (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합한 세포의 선택＞
(1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합한 세포의 선택은, 목적 항원의 표식 및 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 특이적으로 결합하는 표식 물질의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 목적 항원의 표식 및 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 특이적으로 결합하는 표식 물질의 모두가 형광 표식 (예를 들면, 형광 색소)의 경우에는, 이들 표식이 발생하는 형광을 이용하고, (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2)표식 물질이 결합한 세포를 선택할 수 있다. (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2)표식 물질이 결합한 세포의 선택 방법이나 이 방법으로 이용하는 장치에는 특별히 제한은 없다. 기존의 세포를 개개의 세포 레벨로 분리하는 방법도 장치를 그대로 이용할 수 있다.
형광 프로브 (1)를 이용하여 염색을 실시한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수는, 형광에 근거하여 형질 세포 및 형질아 세포 (또는 형질 세포 및 형질아 세포의 가능성이 높은 세포)를 동정한다. 형질 세포 및 형질아 세포를 동정하는 방법에는, 전술한 바와 같이, (1) 염색을 한 세포에 있어서의 형광 프로브의 편재를 형광 현미경하에서 관찰하는 방법과 (2) 염색을 한 세포로부터 발생하는 형광 강도에 근거하는 방법이 있다.
(1) 형광 현미경을 이용하여 세포에 있어서의 형광 프로브의 편재를 관찰하는 방법은, 세포에 포함되는 소포체의 영역이 강염색되고 있으나 (즉, 강한 형광을 발하고 있다), 관찰 대상인 1개의 세포에 대해서, 강염색되고 있는 소포체의 영역의 면적적인 비율이 약 65% 이상인 세포를 형질 세포 및 형질아 세포로 동정할 수 있다. 또, 면적적인 비율이 아니라, 그 1개의 세포에 대해서, 그 세포 전체의 형광 강도를 100%로 했을 때에, 소포체로부터의 형광 강도의 비율이 약 65% 이상인 세포를 형질 세포 및 형질아 세포로 동정할 수도 있다. 형질 세포 및 형질아 세포의 경우, 하나의 세포 전체로부터의 형광 강도 중소포체가 차지하는 형광 강도가 약 65%이며, 다른 세포 소기관 (미토콘드리아, 골지체, 형질막 등)에 35% 형광 색소가 이행한다.
세포 전체의 형광 강도와 소포체로부터의 형광 강도의 비율은, 소포체에 편재하는 단백질의 면역 염색 (형질 세포 및 형질아 세포에서는 면역 글로블린)이나, 소포체 이행성의 재조합 형광 단백질을 배양 세포로 발현시키는 것으로, 세포의 소포체를 동정하는 방법을 이용하여, 이하와 같이 구할 수 있다.
예를 들면 293 세포를 이용하여 재조합 형광 단백질 (빨강)을 배양 세포로 발현시키고, 이 세포를 형광 프로브 (1) (예를 들면 ER-Tracker Blue White)으로 염색한다. 형광 현미경의 화상 해석 장치를 이용하여 세포 전체에 차지하는 형광 프로브 (1)의 형광 강도를 계측하여 A라고 표시하고, 및 재조합 형광 단백질 (빨강)로 염색되고 있는 영역내 (소포체)의 형광 프로브 (1)의 형광 강도를 계측하여 B라고 표시한다. 형광 강도 B는 소포체에 편재하는 형광 프로브 (1)의 양에 상당한다. 이 때문에, 1개의 세포 전체로부터의 형광 강도 A에 대한 그 세포의 소포체로부터의 형광 강도 B의 비율은, B/A x 100 (%)으로서 표시할 수 있다. 실시예에 있어서의 결과에서는, 형질 세포 및 형질아 세포에서는, 1개의 세포 전체에 차지하는 ER-tracker Blue/white의 강도 A, 및 면역 글로블린 (초록)으로 염색되고 있는 영역내 (소포체)의 ER-tracker Blue/white의 형광 강도 B를 계측한바, B/A x 100의 값이 65% 이상이 되었다.
(2) 형광 강도에 근거하는 형질 세포 및 형질아 세포의 동정은, 예를 들면, 형광 스캐너, 형광 현미경, 플로우 사이토미터, 세포 분별장치 등에 의해 실시할 수 있다. 형광 프로브 (1)는, 전술한 바와 같이 형질 세포 및 형질아 세포로 얻어지는 형광 강도가 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포로 얻어지는 형광 강도에 비해, 예를 들면, 3배 이상, 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높다. 이 때문에, 형광 프로브 (1)에 염색된 세포로부터 형질 세포 및 형질아 세포의 후보를, 상기 형광 스캐너 등을 이용하여 형광 강도에 근거하여 용이하게 동정할 수 있다.
형질 세포 및 형질아 세포의 후보로서 선택하는 기준으로서의 형광 강도비 (형질 세포 및 형질아 세포/형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포)를 높게 설정하면 그만큼, 형질 세포 및 형질아 세포의 후보에 포함되는 진정한 형질 세포 및 형질아 세포의 비율은 높아진다. 그러나 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포에 비하면 높은 형광 강도를 나타내지만, 기준으로서의 형광 강도비 미만의 비교적 낮은 형광 강도밖에 나타내지 않는 형질 세포 및 형질아 세포에 대해서, 배제될 가능성이 있다. 따라서, 시료로 하는 림프액, 림프액 조직 또는 혈구 시료에 포함되는 형질 세포 및 형질아 세포의 특징, 특히 소포체의 발달의 정도를 고려하여, 형질 세포 및 형질아 세포의 후보로서 선택하는 기준으로서의 형광 강도비를 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은, 상기 방법으로 동정된 형질 세포 및 형질아 세포의 후보를 더욱 채취 (분취)하는 것이 바람직하다. 동정된 세포의 채취는, 예를 들면, 세포 분별장치에 의한 분취에 의해 실시할 수 있다. 형광에 근거하는 형질 세포 및 형질아 세포의 동정과 형광에 근거하여 형질 세포 및 형질아 세포 (또는 형질 세포 및 형질아 세포의 가능성이 크다)와 동정 또는 판단된 형질 세포 및 형질아 세포의 후보는, 세포 분별장치에 의해 분취된다.
세포의 선택은, 세포를 복수의 세포의 집단으로서 선택하여, 분리할 수도 있지만, 바람직하게는, 세포를 1개 1개씩 개별적으로 선택하여 분리한다. 여기서 선택되는 세포는 모두 목적 항원에 대한 결합성을 갖는 세포이지만, 각 세포가 갖는 목적 항원에 대한 항체는, 반드시 동일하지 않고, 각 항체의 항원 결합 부위의 아미노산 배열은 다른 것이 예상된다. 따라서, 세포를 1개씩 개별적으로 선택하고, 분리하여 후술하는 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법에, 각각의 세포를 1개씩 적용하는 것으로, 동일한 목적 항원에 대해서 특이적으로 결합하는 다른 단일 클론 항체를 얻는 것이 가능해진다.
이 방법으로 선택된 세포는, 목적 항원에 대해서 결합성을 표시되는 것이며, 또한, 형질 세포 및/형질아 세포일 가능성이 높은 세포이며, 이 방법에 의해, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 비인간 동물의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택할 수 있다.
이어서, 인간을 대상으로 하는 HU법에 대해 설명한다. HU법은, 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는 세포를 선택하기 위한 시료로서 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 제공을 받은 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 이용한다. 채취한 림프액 등의 목적 항원에 의한 생체 밖에서의 감작은, 상술한 바와 같은 방법으로 실시할 수 있다. 즉, 인간보다 항원 제시 세포인 수장 세포, T세포, B세포를 채취한다. 이어서 시험관 중에서 항원을 수장 세포에 작용시켜 탐식·소화시키고, 항원의 제시 능력을 구비한 성숙수장 세포를 제작한다. 이것에 T세포 및 B세포와 인타로이킨 2 등의 사이토카인이나 poly(dI-dC) 등의 면역 자극제를 첨가하여 항원에 대해 응답하는 B세포를 시험관 내에서 증식·분화시키고, 최종적으로 항체생산 세포인 형질 세포 및 형질아 세포를 얻는다.
항체를 갖는 인간으로부터 제공을 받은 림프액 등에 대해서는, 보다 구체적으로는, 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 제공을 받은 혈액, 또는 병의 치료 등의 목적에 의해 수술로 절제된 림프절 등을 이용한다. 또한, 구체적으로는, 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 제공된 혈액 또는 조직에서 혈구 또는 임파구를 분리하고, 이것과 (1) 표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합한다. 면역에 이용하는 목적 항원, (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질은, NHA법과 같다. 또한, (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질에 결합한 세포의 선택에 대해서도, NHA법과 동일하다.
HU법에서는, 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 제공을 받은 시료를 이용하기 위해, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 인간의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택할 수 있다.
［목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법］
본 발명의 제2 형태는 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법이다.
이 방법은, 상기 본 발명의 방법으로 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한편의 세포를 선택하고, 선택한 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취하여, 그 염기 배열을 동정하고, 동정한 유전자의 염기 배열에 근거하여 상기 항체 또는 항체의 단편을 조제하는 것을 포함한 방법이다. 이 방법에 의해, 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 방법으로의, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽 세포의 선택 방법은, 상술한 바와 같다.
＜항체 유전자의 염기 배열 동정＞
선택한 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취하고 그 염기 배열을 동정한다. 선택한 세포는, 목적 항원에 대한 결합성을 표시되는 세포이며, 또한 형질 세포 또는 형질아 세포이다. 본 발명에서는, 이들 선택한 세포의 복수로 이루어진 집단에서 취급하고, 항체 유전자의 채취와 동정을 실시할 수도 있지만, 바람직하게는, 개개의 세포에 대해서, 각각 항체 유전자를 채취하고 그 염기 배열을 동정한다. 이것에 의해, 동일한 목적 항원에 대해서 특이적으로 결합하는, 다른 단일 클론 항체를 얻는 것이 가능하게 된다.
선택한 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취하고 그 염기 배열을 동정하는 방법은 기존의 방법을 이용할 수 있다.
목적 항원에 대한 항체 유전자의 채취 및 채취한 항체 유전자로부터 cDNA를 합성하는 방법은, 예를 들면, WO2009/091048 (US2011/0020879 A1 (그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다)에 기재된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 또한, 합성한 cDNA를 클로닝 하는 방법은, 예를 들면, WO2009/110606, US2011/0117609 A1 (그 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다)에 기재된 상동 재조합 방법을 이용한 클로닝 방법으로 실시할 수 있다. 또한, 합성한 cDNA의 염기 배열의 동정은, 공지의 DNA의 염기 배열 결정 방법을 이용하여 실시할 수 있다. cDNA의 염기 배열을 동정하는 것으로, 목적 항원에 대한 항체 유전자를 동정할 수 있다.
[방법]
WO2009/091048에 기재된 방법은, 기판의 한쪽 표면에 복수의 돌기 형태 울타리가 정렬되어 설치되고 있으며, 상기 돌기 형태 울타리는, 적어도 1개의 노치부분을 가지며, 또한 내부에는 액적을 유지할 수 있는 공간을 갖고, 또한 상기 기판 표면의 적어도 상기 액적을 유지하는 면은, 순수한 물에 대한 접촉각이 90∼150°의 범위인 반응 지그를 이용하여 자기 비즈에 고정화한 물질을, 상기 돌기 형태 울타리의 액적 유지용 공간에 유지된 표면장력 저하 시약을 함유하는 용액의 액적 중에서, 상기 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면에서부터 자석을 이용하여, 차례대로 이동시키는 것으로, 반응 및/또는 세정을 실시하는 것을 포함한, 반응 방법이다. 이 반응 방법에 대해 자기 비즈에 고정화한 물질로서 선택한 세포 중의 mRNA와 결합성을 갖는다, 예를 들면, 올리고 dT를 이용하는 것으로, 실시할 수 있다.
또한, cDNA의 합성 방법은, 상기 반응 지그에 있어서, 1개의 종렬로 적어도 2개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하여 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액적 유지용 공간에는, 표면장력 저하 시약을 함유하는 세포 용해용 용액, 및 cDNA 합성용 용액의 액적을 이 순서대로 각각 유지하고, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 2개의 돌기 형태 울타리의 액적 유지용 공간에 유지된 용액에, 차례대로 기판의 돌기 형태 울타리를 갖는 표면과는 반대측의 표면으로부터 자석을 이용하여 이동시켜서 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻을 수 있다.
상기 cDNA의 합성 방법은, 예를 들면, 1개의 종렬로 적어도 4개의 돌기 형태 울타리가 설치된 반응 지그를 이용하는 것으로 실시할 수 있다. 상기 4개의 돌기 형태 울타리 (예를 들면, "八"자형 돌기)의 공간에는, 세포 용해용 용액, mRNA 세정용 용액, cDNA 합성용 용액 및 cDNA 세정용 용액의 액적을 이 순서대로 각각 유지하고, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 4개의 돌기 형태 울타리의 공간에 유지된 용액에, 차례대로 기판의 돌기를 설치한 것과는 반대측의 표면에서 자석을 이용하여 이동시킨다. 그것에 따라, 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻는다.
cDNA의 합성 방법으로 이용하는 반응 지그의 "八"자형 돌기의 공간의 용량은, 예를 들면, 0.5∼100㎕의 범위로 하는 것이 적당하다.
제1 "八"자형 돌기의 공간에 유지되는 세포 용해용 용액은, 예를 들면, 100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 리튬 5mM dithiothreitol를 포함한 전량 3㎕의 용액일 수 있다.
제2 "八"자형 돌기의 공간에 유지되는 mRNA 세정용 용액은, 10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% 도데실 황산 리튬을 포함한 전량 3㎕의 용액일 수 있다.
제3 "八"자형 돌기의 공간에 유지되는 역전사진 반응용 세정 용액은, 50mM Tris HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase 억제자 (inhibitor)를 포함한 전량 3㎕의 용액일 수 있다.
제4 "八"자형 돌기의 공간에 유지되는 역전사진 반응 용액은, 50mM Tris HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase 억제자, 8 unit SuperScript III Reverse transcriptase를 포함한 전량 3㎕의 용액일 수 있다. 단, 이들은 예시이며, 이러한 용액으로 한정되는 것은 아니다.
자기 비즈에 고정화한 mRNA를 준비한다. mRNA의 종류나 길이 등에는 특별히 제한은 없다. 여러 가지의 생물 유래의 mRNA를 이용할 수 있다. 자기 비즈로서는, 예를 들면, 입자계 2.8μm, 올리고 dT25가 표면에 공유결합된 것을 이용할 수 있다. mRNA의 자기 비즈로의 고정화는 이하와 같이 실시할 수 있다.
세포 용해용 용액에 자기 비즈를 농도 10㎎/㎖가 되도록 현탁하고, 이것에 세포 1에서부터 100개를 더한다. 상기의 조작에 의해, 세포 내의 mRNA는 그 poly A 테일을 통해 자기 비즈상에 고정화된 oligo dT25에 결합한다.
기판의 돌기를 설치한 표면과는 반대측의 표면에서 자석을 이용하여, 자기 비즈에 고정화한 mRNA를, 상기 4개의 "八"자형 돌기의 공간에 유지된 용액 (액적)에 차례대로 이동시킨다. 자석으로서는, 예를 들면, 소형 네오디뮴 자석을 이용할 수 있다. 각 액적 중에서는, 반응 또는 세정에 필요한 시간, 체류시킨다. 반응 또는 세정에 필요한 시간은, 반응 조건, 세정 조건에 따라 다르지만, 예를 들면, 1초∼1시간의 범위일 수 있다.
상기 반응 및 세정은, 상온 (실온)에서 실시할 수 있지만, 필요에 의해, 온도 조절을 할 수도 있다. 또한, 액적의 양이 소량인 경우, 용액 중의 용매가 증발하기도 하므로, 반응 지그를 밀폐 용기에 넣어 용기 중의 습도를 일정하게 유지하는 것으로, 용매의 증발을 막는 것이 바람직하다. 용기 중의 습도를 일정하게 유지하려면, 물 또는 적당한 수용액을 포함한 용기를 상기 밀폐 용기에 공존시킬 수 있다.
상기 4개의 "八"자형 돌기의 공간에 유지된 용액 (액적)에, 차례대로 자기 비즈에 고정화한 mRNA를 체류 및 통과시키는 것으로, 자기 비즈에 고정화한 cDNA를 얻을 수 있다. 얻어진 cDNA는, 자기 비즈로부터 잘라내지 않고, 후속 공정에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 얻어진 cDNA는, 후술의 클로닝 방법 등에 제공할 수 있다.
WO2009/110606에 기재된 상동 재조합 방법을 이용한 클로닝 방법은, 상동 재조합 방법으로서 증폭용 프라이머 배열 P1 및 P2를 양말단에 갖는 표적 유전자 (항체 유전자)의 배열을 포함한 PCR 산물과 이 PCR 산물의 증폭용 프라이머 배열 P1 및 P2에 상동적인 염기 배열로 이루어진 상동 재조합영역 VP1 및 VP2를 가지며, 또한, P1의 안쪽의 일부의 배열 T1에 상동적인 염기 배열로 이루어진 상동 재조합영역 VT1를 VP1의 말단 측에, 및/또는 P2의 안쪽의 일부의 배열 T2에 상동적인 염기 배열로 이루어진 상동 재조합영역 VT2를 VP2의 말단 측에 갖는 선상화된 벡터를 이용하여 (단, T1 및 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자에 특유의 염기 배열을 갖는다), 상기 PCR 산물을 상동 재조합 반응에 교부해 전기 벡터에 삽입하고, 목적으로 하는 PCR 산물을 특이적으로 벡터에 삽입한 조환 DNA 분자를 얻는 것을 포함한 방법을 이용하는 방법이다. 상기 증폭용 프라이머 배열 P1 및 P2를 양말단에 갖는 표적 유전자 (항체 유전자)의 배열을 포함한 PCR 산물은 상기에서 얻어진 cDNA로부터 WO2009/110606에 기재된 방법으로 얻을 수 있다. 또한, 상기 상동 재조합 방법에 의해, 목적으로 하는 PCR 산물을 특이적으로 벡터에 삽입한 조환 DNA 분자를 조제하고, 이어서 얻어지는 조환 DNA 분자를 갖는 재조합체를 증폭하는 것으로, 목적으로 하는 항체 유전자의 클로닝을 할 수 있다.
또, 증폭된 재조합 DNA 분자 (재조합 벡터)에 포함되는 표적 유전자 (항체 유전자)는, 예를 들면, 제한 효소 처리에 의해서 벡터로부터 잘라내고, 필요에 의해 정제된다. 표적 유전자의 분리 및 정제는, 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다. 표적 유전자의 분리 및 정제로서는, 예를 들면, 겔 추출이나 컬럼 정제 등을 들 수 있다. 분리 및 정제된 표적 유전자는, 예를 들면, 염기 배열의 결정, 발현 벡터에 넣어, 표적 유전자의 기능 해석 등에 이용할 수 있다.
＜항체 또는 항체의 단편의 조제＞
동정한 유전자의 염기 배열에 근거하여, 항체 또는 항체의 단편을 조제한다.
동정한 유전자의 염기 배열에 근거하는 항체 또는 항체의 단편의 조제는, WO2011/027808에 기재된 DNA 단편의 특이적 제작 방법을 이용하여 제작한 항체 유전자의 단편을 이용하여 실시할 수 있다.
WO2011/027808에 기재된 방법은 이하와 같다.
[1] 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법에 있어서, (1)∼(4)를 포함한 방법. 또한, 이하에 대해 표적 유전자는 항체 유전자이다.
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2개 쇠사슬 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을 가지며, 또한 한쪽 또는 다른 쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열이며, 양쪽회합 가능한 영역의 3＇단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편을 준비하고,
(2) 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 준비하고,
(3-1) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편의 한쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반응에 대해 쇠사슬 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편의 다른 쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편의 다른 쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편의 다른 쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편의 다른 쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반응에 대해 쇠사슬 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편 및 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 이용하여, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한, 연결 DNA 단편의 제조 방법.
[1] 에 기재된 제조 방법에서 구체적으로는 이하를 예시할 수 있다.
(a) 상기 한쪽 회합 가능한 영역을 「영역 1」이라고 하고, 다른 쪽 회합 가능한 영역을 「영역 2」라고 하면, 상기 연결 DNA 단편은, 모식적으로 영역 2-연결용 DNA 영역-영역 1-표적 유전자-영역 2-연결용 DNA 영역-영역 1로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편이다.
(b) 연결용 DNA 영역이 2개의 연결용 DNA 영역으로서 배열 A 및 배열 B를 포함하며,
상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 갖고, 다른 쪽이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 가지며, 배열 T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 VP1 및 VT1를 갖고, 다른 쪽이 말단측으로부터 배열 VP2 및 VT2를 가지며, 배열 VP1 및 VT1는, 배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 가지며, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기 배열을 갖는다.
(c) 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 나타내고, 상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은, VT2－VP2－배열 B－배열 A－VP1－VT1로 나타내고, 상기 연결 DNA 단편은, VT2－VP2 (T2－P2)－배열 B－배열 A－VP1－VT1 (P1－T1)－표적 유전자-VT2－VP2 (T2－P2)－배열 B－배열 A－VP1－VT1 (P1－T1)를 적어도 1개 갖는 DNA 단편이다, 단, VT2－VP2 (T2－P2)는, T2－P2와 상동적인 VT2－VP2인 것을 의미하며, VP1－VT1 (P1－T1)는, T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미한다.
(d) 배열 P2의 3＇단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 쇠사슬 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열 B의 VP2와 인접하는 배열과 비상동적인 배열이며, 배열 P1의 3＇단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 쇠사슬 신장 기능을 갖지 않는 배열은 전기 배열 A의 VP1와 인접하면 비상동적인 배열이다.
(e) 상기 돌출 말단은, 3＇단에 다이옥시뉴클레오티드를 포함한 배열이다.
[2] [1]에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로서 연결 DNA 단편에 포함되는 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 증폭하도록, 연결 DNA 단편에 포함되는 다른 연결용 DNA 영역에서 기능하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하고, 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 포함한 DNA 단편을 제조할 수 있다.
[1] 의 (b)에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로서 배열 A의 염기 배열의 일부를 표적 유전자로 향하도록 3＇단에 포함한 포워드 프라이머, 및 배열 B의 염기 배열의 일부를 표적 유전자를 향하도록 3＇단에 포함한 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하고, 배열 A, 표적 유전자의 배열 및 배열 B가 연결된 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 DNA 단편을 제조한다.
[3] (a) [1] (b) (c) 및 [2] (a) (b)에 기재된 제조 방법에서는, 표적 유전자의 배열을 포함한 2개 쇠사슬 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레오티드에, 데옥시뉴클레오티드 터미널 트랜스페라아제를 작용시켜서 표적 유전자의 배열을 포함한 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편을 얻는 것을 더욱 포함할 수 있다. (단, 상기 표적 유전자의 배열을 포함한 2개 쇠사슬 DNA 단편은, 배열 P1 및 배열 P2를 각 말단에 가지고, 상기 배열 P1의 안쪽의 일부에 배열 T1를 가지며, 상기 배열 P2의 안쪽의 일부에 배열 T2를 가지며, 또한 상기 배열 T1 및 T2의 한쪽 또는 양쪽은 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 갖는다.)
(b) 상기 배열 T1 및 배열 T2의 한쪽 또는 양쪽은 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 갖거나, 또는 상기 배열 P1 및 배열 P2의 한쪽 또는 양쪽은 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 갖는다.
(c) 상기 배열 P1 및 P2는, 독립적으로 10 염기 이상이다
[4]［1］∼［3］에서는, 상기 표적 유전자가 항체 유전자이며, 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편이 상기 항체 유전자에 유래하는 배열을 포함하고, 및, 상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편 또는 상기 배열 A를 갖는 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편에 있어서의 상기 영역 VP1 및 영역 VT1는, 항체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열을 가질 수 있다.
[5]［1］∼［3］에서는, 상기 표적 유전자가 항체 유전자이며, 상기 3＇단 돌출 2개 쇠사슬 유전자 단편이 상기 항체 유전자에 유래하는 배열을 포함하고, 및, 상기 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편 또는 전기 배열 B를 갖는 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편에 있어서의 전기 영역 VP2 및 영역 VT2는, 항체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열일 수 있다.
［6］[4］또는［5］에 기재된 방법으로 제조된 연결 DNA 단편을 이용하여 항체를 제조할 수 있다. 여기서 얻어진 연결 DNA 단편을 이용하여 항체를 제조하는 방법은, 예를 들면, 양이온성 리포솜법 등의 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 상기 연결 DNA 단편을 293 T세포주 등의 세포에 도입하고 이어서, 세포를 배양하는 것으로 항체 유전자를 발현시켜 항체를 제조할 수 있다.
［항체 유전자 및 펩티드］
본 발명은, 상기 본 발명의 방법을 이용하여 새롭게 얻어진 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 가변 영역 및 정상 영역의 유전자 및 펩티드, 또 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 항체를 포함한다.
(1) 배열표의 배열 번호 1로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 유전자, 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드하는 유전자, 및 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
(2) 배열표의 배열 번호 2로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 정상 영역의 유전자, 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자, 및 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
(3) 배열표의 배열 번호 3으로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 λ쇠사슬 정상 영역의 유전자, 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드하는 유전자 및 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
(4) 배열표의 배열 번호 7∼18로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정가변 영역의 유전자, 배열 번호 19∼30으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드하는 유전자 및 배열 번호 19∼30으로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
(5) 배열표 배열 번호 31∼42로 표시되는 염기 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 가변 영역의 유전자, 배열 번호 43∼54로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드하는 유전자 및 배열 번호 43∼54로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
(6) 가변 영역으로서 배열 번호 19∼30 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 γ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
(7) 가변 영역으로서 배열 번호 43∼54 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 κ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
(8) 하기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 어느 하나의 1개씩 조합을 포함한 κ쇠사슬 또는 γ쇠사슬을 포함한 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
Figure pct00007
상기 본 발명의 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 가변 영역 및 정상 영역의 유전자 및 펩티드, 또 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 항체는, 기존의 DNA 및 펩티드의 조제 방법을 이용하고, 후술하는 실시예의 기재를 참조하는 것으로 조제할 수 있다.
(실시예)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 한층 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 예시를 목적으로 하는 것이며 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1 랫트 단일 클론 항체의 제작
[재료와 방법]
면역 동물은 위스터계 랫트♀ 6주령을 이용하였다. 항원은 GFP. 면역은, 랫트 능선부의 양측에 GFP 50㎍를 1개월 간격으로 3회 근육 주사하였다. 면역 성립 후, 랫트로부터 장골 림프절을 채취하였다. GFP는 Alexafluor488에서 형광 표식하여, 겔 여과에 의해 정제하였다.
장골 림프절 유래 임파구를 PBS-0.5% 우혈청 알부민 용액에 현탁한 후, GFP (0.5㎍/㎖)를 첨가하여 4℃에서 30분간 교반시켜서 세포의 항원 표식을 실시하였다. 세포를 원심분리 후 DMEM 배양지에 현탁시키고, 이것에 ER-Tracker (1μM)를 첨가하여 5분간 실온에서 방치하는 것으로 소포체를 염색하였다. 세포를 PBS로 세정 후, 항원 특이적 형질 세포분획을 GFP양성으로 ER-tracker 강양성 세포로서, 또 항원 비특이적 형질 세포 분획을 GFP음성으로 ER-tracker 강양성 세포로서 세포 분별장치로 분리하였다.
[결과]
장골 림프절에서 조제한 임파구를, 항랫트 IgG (초록) 및 ER-tracker에 의해서 염색 후, 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, ER-tracker 강양성의 형질 세포 표면에 약하면서 IgG의 발현이 인정되었다 (도 1).
이어서, 이 막형 IgG에 GFP를 작용시키는 것으로 항원 특이적 형질 세포의 동정이 가능한지를 시도하였다. 장골 유래 랫트 임파구 현탁액을, Alexafluor 488 표식 GFP 및 ER-tracker로 염색하고, 이것을 플로우 사이토미터로 해석하였다. 그 결과, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이 GFP 양성의 세포군이 존재하였다. 이들 GFP 양성의 세포군의 상당수는 GFP의 비특이적 흡착, 저친화성막형 항체를 발현하는 B세포에 유래하는 시그널이다. 이 중에서 항원 특이적 형질 세포를 동정하기 위해 GFP강양성으로 ER-tracker 강양성의 세포를 항원 특이적 형질 세포로서 GFP음성으로 ER-tracker 강양성의 세포를 비특이적 형질 세포로서 세포 분별장치를 이용하여 분리하였다 (도 2의 A의 High와 Low). 분리된 세포를 고정화·세포막 가용화 처리를 실시하고, 항랫트 항체를 이용하여 염색을 실시한 결과, 분수된 세포는 그 세포질 내에 다량의 항체를 발현하고 있기 때문에 형질 세포인 것이 판명되었다 (도 2의 B).
cDNA 합성 cDNA 합성 및 면역 글로블린 유전자 증폭은, 「반응 지그 및 반응 방법, 및 cDNA의 합성 방법」 (WO2009/091048)에 기재의 방법에 준하여 실시하였다 (도 3). 세포 분별장치에 의해 분리된 개개의 랫트 플라스마 세포를 올리고 dT25가 결합한 자기 비즈 (다이나피즈) 3㎍가 들어간 세포 용해액 3㎕ (100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 Li (LiDS), 5mM dithiothreitol)에 첨가하여 세포 내의 mRNA를 자기 비즈에 결합시켰다. 이어서 자기 비즈를, 3㎕의 mRNA 세정용 용액 A (10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% LiDS), 이어서 3㎕의 mRNA 세정용 용액 B (75 mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X, 0.5 mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase 억제자)에서 1회 세정한 후, cDNA 합성을 실시하였다. 세정 후의 자기 비즈에, cDNA 합성용 용액 3㎕ (50mM Tris HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X－100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase 억제자, l0unit Super Scriptlll Reversetranscriptase (invitrogen)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이어서 자기 비즈를 3＇테일링 세정 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH7.0), 0.5mM dGTP, 0.1% Triton X－100, 4mM 염화 마그네슘)으로 세정하고, 새롭게 3＇테일링 반응 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1% Triton X－100, 4 mM 염화 마그네슘, terminaldeoxynucleotidyltransferase 10U)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응을 하였다.
랫트γ,κ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편의 증폭
자기 비즈를 3㎕의 TE용액 (10mM Tris HCl (pH7.5), 1mM EDTA, 0.1% Triton X－100)에서 세정 후, 5'－RACEPCR법을 이용하여 인간 면역 글로블린 γ쇠사슬 및 κ쇠사슬 유전자의 증폭을 하였다. 1회째의 PCR 반응은, 자기 비즈에 25㎕의 PCR 반응 용액 (프라이머를 각 0.2μM, dNTP0.2 mM, 다카라 바이오 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라아제 lU 함유)를 첨가하여 94℃ 30초 - 68℃ 40초의 반응을 35 사이클 실시하였다. 이용한 프라이머 (가)는, TdT에 의해 cDNA의 3＇단에 부가된 폴리 G에 어닐링한다. 프라이머 배열은 (나)은, 랫트 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다. 프라이머 배열은 (다)은, 랫트 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다.
반응 후 PCR 용액에 물 225㎕를 첨가하여 10배 희석한 용액 1㎕를 주형으로 하고, 프라이머 (라)와 프라이머 (마)를 이용하여 1회째의 PCR와 같은 조건으로 랫트 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다. 이와 같이 프라이머 (라)와 프라이머 (바)를 이용하여 랫트 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다.
이용한 프라이머는, 1회째 PCR 센스 프라이머
5-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3 (가) (배열 번호 55)
1회째 PCRγ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- GCAGGTGACGGTCTGGCTGGRCCAGGTGCTGGA-3 (나) (배열 번호 56)
1회째 PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- TCGTTCAGTGCCATCAATCTTCCACTTGAC-3 (다) (배열 번호 57)
2번째 PCR 증폭용 센스 프라이머 5-CGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCC-3 (라) (배열 번호 58)
2번째 PCRγ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- CTGCAGGACAGCTGGGAAGGTGTGCAC-3 (마) (배열 번호 59)
2번째 PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머 5- TAACTGTTCCGTGGATGGTGGGAAGAT-3 (바) (배열 번호 60)
반응 후, PCR 용액 각 1㎕를 취하고, 아가로스겔 전기 영동법으로 κ및 γ쇠사슬 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 unit로의 변환을 확인하였다 (도 3 위를 참조)
랫트 면역 글로블린 선상화 발현 벡터의 제작
랫트 γ쇠사슬 유전자,κ쇠사슬 유전자 발현 unit 제작은, 「표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 DNA 단편의 특이적 제작 방법」 (WO2011/027808) 방법으로 준해 조제하였다.
즉, 5＇-RACE-PCR법에 의해 증폭된 각 PCR 산물 1㎕에, 폴리 A 부가를 2 unit 첨가하고 37℃에서 30분 반응시켜서 그 후 94℃에서 5분간 가열하는 것으로 효소 반응을 정지시켰다.
상기에서 조제한 3＇단 폴리 뉴클레오티드 부가 랫트 γ쇠사슬 유전자 용액에, 랫트 γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 10ng, 프라이머 (사) (아)를 각 10 pmol, dNTP를 10 nmol를 첨가하여 다카라바이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리메라제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃을 4 분의 반응을 5 사이클, 이어서 94℃를 40초, 60℃를 40초, 72℃를 4분의 반응을 30 사이클 실시하는 것으로 랫트 γ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
동일하게 랫트 κ쇠사슬 유전자 용액에, 랫트 κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 첨가하여 반응을 실시하고, 랫트 κ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
5-AGAGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGC-3 (사) (배열 번호 61)
5-AGAGACCCTTTGACGTTGGAGTCCACG-3 (아) (배열 번호 62)
반응 후, PCR 용액 각 1㎕를 취해, 아가로스 겔 전기 영동법에서κ및γ쇠사슬 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 unit로의 변환을 확인하였다 (도 3 아래를 참조)
유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편
랫트 γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 랫트 γ쇠사슬 정상 영역 (1-873) 연결 배열 II (1-54), 폴리 A 부가 시그널 (1045-1051), CMV 프로모터 (1577-2172), 연결 배열 1 (2173-2201)로 이루어진다 (배열 번호 63).
Figure pct00008
Figure pct00009
유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편
랫트 κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 랫트κ쇠사슬 정상 영역 (1-325), 연결 배열 II (1-53), 폴리 A 부가 시그널 (507-513), CMV 프로모터 (1038-1633), 연결 배열 1 (1634-1662)로 이루어진다 (배열 번호 64).
Figure pct00010
Figure pct00011
상기의 실험으로 증폭된 전체 길이의 랫트 γ쇠사슬,κ쇠사슬 유전자 발현 unit을 293 FT세포에 유전를 도입하여 2일간 배양을 실시하는 것으로, 세포 배양액 중 재조합 랫트 항체를 분비시켰다. 항원 특이적 형질 세포 및 비특이적 형질 세포로 얻어진 재조합 랫트 단일 클론 항체의 항원 결합능에 대해 ELISA법을 이용하여 조사한바 (도 4), 항원 특이적 형질 세포로 얻어진 재조합 랫트 단일 클론 항체는, 12 클론중 9 클론이 GFP에 대해 강한 결합력을 나타냈다. 이것에 대해 전형질세포분획으로 얻어진 재조합 랫트 단일 클론 항체는 12 클론중 1 클론만이 GFP에 대한 강한 결합을 나타냈다. 이상의 결과로부터, 표식 항원과 ER-tracker를 임파구 현탁액에 작용시킬 만한 조작에 의해, 항원 특이적인 형질 세포를 동정하고, 이것에 의해 항원 특이적인 랫트 단일 클론 항체를 고효율로 제작하는 것이 가능하다는 것이 분명해졌다.
실시예 2
항인간 인슐린 기니피그 단일 클론 항체의 제작
인슐린은, 간장, 근육이나 지방조직의 세포 표면에 존재하는 인슐린 수용체와 결합하고, 포도당의 세포내에의 혼잡을 제어하는 것으로 체내의 에너지 대사를 조절하는 역할을 담당하는 중요한 호르몬이다. 혈중 인슐린 농도의 측정은 당뇨병, 비만 등의 병의 용태를 파악하는데 있어서도 매우 중요한 의미가 있다. 포유동물의 인슐린의 구조는, 기니피그를 제외하고는 높은 동성애 연구학을 갖고 있기 때문에, 마우스를 이용한 단일 클론 항체의 제작은 곤란하다. 이 때문에, 인간 인슐린의 피중농도 측정에는 기니피그 혈청으로 얻어진 폴리클로날 항체가 이용되어 왔다. 그러나 폴리크로날 항체는 면역 동물 개체간의 로트 차이가 크고, 일정한 품질을 유지하는 것이 곤란하며, 항인간 인슐린 기니피그 단일 클론 항체의 개발이 요구되고 있었다. 따라서, 본 발명을 이용하여 항인간 인슐린 기니피그 단일 클론 항체의 제작을 하였다.
[재료와 방법]
면역 동물은 기니피그 ♀ 6주령을 이용하였다. 항원은 인간 인슐린. 면역은, 기니피그 꼬리 부분의 양측으로 인간 인슐린 50㎍를 1개월 간격으로 4회 근육주사 하였다. 면역 성립 후, 기니피그보다 장골 림프절을 채취하였다. 인슐린은 Alexafluor 594에서 형광 표식하여, 겔 여과에 의해 정제하였다.
[결과]
장골 림프절로부터 임파구를 PBS-0.5% 우혈청 알부민 용액에 현탁한 후, 형광 색소 표식 항기니피그 항체를 첨가하여 4℃에서 30분간 교반시켰다. 세포를 원심분리 후 DMAM 배양지에 현탁하여 이것에 ER-Tracker (1μM)를 첨가하여 5분간 실온에서 방치하는 것으로 소포체를 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 ER-tracker 강양성의 형질 세포 표면에 IgG의 발현이 인정되었다 (도 5).
이어서, 이 막형 IgG에 형광 표식 항원을 작용시키는 것으로 항원 특이적인 형질 세포의 동정이 가능한지를 시험하였다. 장골 기니피그 임파구 현탁액을, Alexafluor 594 표식 인슐린 및 ER-tracker로 염색하고, 이것을 플로우 사이토미터로 해석하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 표식 인슐린 양성으로 ER-tracker 강양성의 세포군이 존재했다 (도 6의 R1). 이것을 항원 특이적 형질 세포분획으로 하였다.
cDNA 합성 cDNA 합성 및 면역 글로블린 유전자 증폭은, 「반응 지그 및 반응 방법, 및 cDNA의 합성 방법」 (WO2009/091048)에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 세포 분별장치에 의해 분리된 개개의 기니피그 플라스마 세포를 올리고 dT25가 결합한 자기 비즈 (다이나피즈) 3㎍가 들어간 세포 용해액 3㎕ (100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 Li (LiDS), 5 mM dithiothreitol)에 첨가하여 세포내의 mRNA를 자기 비즈에 결합시켰다. 이어서 자기 비즈를, 3㎕의 mRNA 세정용 용액 A (10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% LiDS), 이어서 3㎕의 mRNA 세정용 용액 B (75 mM KCl, 3mM Mg Cl2, 0.1% Triton X, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase 억제자)에서 1회 세정한 후, cDNA 합성을 실시하였다. 세정 후의 자기 비즈에, cDNA 합성용 용액 3㎕ (50mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X－100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2 unit RNase 억제자, l0unit Super Scriptlll Revrse transcriptase (invitrogen)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이어서 자기 비즈를 3＇테일링 세정 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH7.0), 0.5 mM dGTP, 0.1% Triton X－100, 4mM 염화 마그네슘)으로 세정하고, 새롭게 3＇테일링 반응 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH7.0), 0.5 mMdGTP, 0.1% Triton X－100, 4 mM염화 마그네슘, terminal deoxynucleotidyl transferase 10U)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응을 실시하였다.
기니피그γ,κ,λ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편의 증폭 자기 비즈를 3㎕의 TE용액 (10mM Tris HCl (pH7.5), 1m MEDTA, 0.1% Triton X－100)에서 세정 후, 5＇－RACEPCR법을 이용하여 인간 면역 글로블린 γ쇠사슬 및 κ쇠사슬 유전자의 증폭을 하였다. 1회째의 PCR 반응은, 자기 비즈에 25㎕의 PCR 반응 용액 (프라이머를 각 0.2μM, dNTP0.2 mM, 다카라 바이오 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라아제 lU 함유)를 첨가하여 94℃ 30초 - 68℃ 40초의 반응을 35사이클 실시하였다. 이용한 프라이머는 (가)이며, TdT에 의해 cDNA의 3＇단에 부가된 폴리 G에 어닐링한다. 프라이머 배열은 (자)이며, 기니피그 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다. 프라이머 배열은 (차)이며, 기니피그 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다. 프라이머 배열은 (카)이며, 기니피그 면역 글로블린 λ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다.
반응 후 PCR 용액에 물 225㎕를 첨가하여 10배 희석한 용액 1㎕를 주형으로 하고, 프라이머 (라)와 프라이머 (타)를 이용하여 1회째의 PCR와 같은 조건으로 랫트 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다. 이와 같이 프라이머 (라)와 프라이머 (파)를 이용하여 랫트 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다. 이와 같이 프라이머 (라)와 프라이머 (하)를 이용하여 랫트 면역 글로블린 λ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다 (도 7).
이용한 프라이머는,
1회째 PCRγ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-GGTGCTGCTGGCCGGGTGGGCTACATTGCA-3 (자) (배열 번호 65)
1회째 PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-CAGAGCCATCCACCTTCCACTTGACGG-3 (차) (배열 번호 66)
1회째 PCRλ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-CTGCTGGCCATGTATTTGTTGTCGCTCTG-3 (카) (배열 번호 67)
2번째 PCR 증폭용 센스 프라이머
5-CTGAAGGACGGCCGGGAAGGTGTGCAC-3 (타) (배열 번호 68)
2번째 PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-GGAAGAGGGAGATAGTTGGCTTCTGCACACTC-3 (파) (배열 번호 69)
2번째 PCRλ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-AGAAGGAATTCAGGAGACACACCACTGT-3 (하) (배열 번호 70)
기니피그의 항체 유전자의 구조는 아직도 분명하지 않기 때문에, 기니피그 비장 세포로부터 조제한 cDNA를 이용하여 기니피그 γ쇠사슬 유전자 정상 영역, κ쇠사슬 유전자 정상 영역 및 λ쇠사슬 유전자 정상 영역을 클론화하여, 이들 염기 배열을 결정하였다. 구체적으로는, 기니피그 비장 세포를, 올리고 dT25가 결합한 자기 비즈 (다이나피즈) 3㎍가 들어간 세포 용해액 3㎕ (100mM Tris HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실황산 Li (LiDS), 5mM dithiothreitol)에 첨가하여 세포내의 mRNA를 자기 비즈에 결합시켰다. 이어서 자기 비즈를, 3㎕의 mRNA 세정용 용액 A (10mM Tris HCl (pH7.5), 0.15M LiCl, 0.1% LiDS), 이어서 3㎕의 mRNA 세정용 용액 B (75 mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase 억제자)에서 1회 세정한 후, cDNA 합성을 실시하였다. 세정 후의 자기 비즈에, cDNA 합성용 용액 3㎕ (50mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X－100, 0.5 mM dNTP, 5 mM DTT, 2 unit RNase 억제자, l0unit SuperScriptlll Reversetranscriptase (invitrogen)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 상기에서 조제된 cDNA를 주형으로서 이용하여 프라이머 (거)와 (너)로 γ쇠사슬 정상 영역을, 프라이머 (더)와 (러)로 κ쇠사슬 정상 영역을, 프라이머 (머)와 (버)로 λ쇠사슬 정상 영역을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 pBlucscript SK벡터의 XhoI/NotI 사이트에 삽입한 후, 염기 배열을 결정하였다.
(거) 5-AGAGACTCGAGTGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGA-3 (배열 번호 71)
(너) 5-GAGAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGAT-3 (배열 번호 72)
(더) 5-AGAGACTCGAGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGA-3 (배열 번호 73)
(러) 5-GAGAGAGCGGCCGCCTAGCACTCGCTCCTGTTGATGGTCT-3 (배열 번호 74)
(머) 5-AGAGACTCGAGGAGGAGCTCCAGGACAACAAGGC-3 (배열 번호 75)
(버) 5-GAGAGAGCGGCCGCTAAGAACACTCTGACGGGGCCAC-3 (배열 번호 76)
γ쇠사슬 정상 영역 배열 (배열 번호 1)
Figure pct00012
γ쇠사슬 정상 영역 아미노산 배열 (배열 번호 4)
Figure pct00013
κ쇠사슬 정상 영역 배열 (배열 번호 2)
Figure pct00014
Figure pct00015
κ쇠사슬 정상 영역 아미노산 배열 (배열 번호 5)
Figure pct00016
λ쇠사슬 정상 영역 배열 (배열 번호 3)
Figure pct00017
λ쇠사슬 정상 영역 아미노산 배열 (배열 번호 6)
Figure pct00018
기니피그 γ쇠사슬 유전자,κ쇠사슬 유전자,λ쇠사슬 유전자 발현 unit 제작은, 「표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 DNA 단편의 특이적 제작 방법」 (WO2011/027808)에 기재된 방법에 준하여 조제하였다. 즉, 5＇-RACE-PCR법에 의해 증폭된 각 PCR 산물 1㎕에, terminal deoxynucleotidyl transferase를 2 unit 첨가하여 37℃에서 30분 반응시키고, 그 후 94℃에서 5분간 가열하는 것으로 효소 반응을 정지시켰다.
상기에서 조제한 3＇단 폴리 뉴클레오티드 부가 기니피그 γ쇠사슬 유전자 용액에, 기니피그 γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 10ng, 프라이머를 10pmol, dNTP를 10nmol를 첨가하여 다카라 바이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라아제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃을 4분의 반응을 5 사이클, 이어서 94℃를 40초, 60℃을 40초, 72℃를 4분의 반응을 30 사이클 실시하는 것으로, 기니피그 γ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
이와 같이 기니피그 κ쇠사슬 유전자 용액에, 기니피그 κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 더해 반응을 하고, 기니피그κ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
동일하게 기니피그 λ쇠사슬 유전자 용액에, 기니피그 λ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 첨가하여 반응을 하고, 기니피그 λ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
발현이득 니트 증폭에 이용한 프라이머는, (사) (아).
반응 후, PCR 용액 각 1㎕를 취하여, 아가로스겔 전기 영동법으로 κ 및 γ쇠사슬 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 unit로의 변환을 확인하였다 (도 8을 참조).
기니피그 γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 기니피그 γ쇠사슬 정상 영역 (1-911), 연결 배열 II (1-96), 폴리 A 부가 시그널 (912-1118), CMV 프로모터 (1628-2093), 연결 배열 1 (2094-2123)로 이루어진다 (배열 번호 77).
Figure pct00019
Figure pct00020
기니피그 κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 기니피그κ쇠사슬 정상 영역 (1-345),
연결 배열 II (1-55), 폴리 A 부가 시그널 (346-548), CMV 프로모터 (1058-1652), 연결 배열 1 (1653-1682)으로부터 된다 (배열 번호 78).
Figure pct00021
Figure pct00022
기니피그 λ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편 (배열)은 기니피그 λ쇠사슬 정상 영역 (1-272), 연결 배열 II (1-52), 폴리 A 부가 시그널 (53-410), CMV 프로모터 (985-1579), 연결 배열 1 (1580-1609)으로부터 된다 (배열 번호 79).
Figure pct00023
Figure pct00024
상기의 실험으로 증폭된 전체 길이의 기니피그γ쇄,κ쇠사슬,λ쇠사슬 유전자 발현 unit을 293 FT세포에 유전자 도입해 2일간 배양을 실시하는 것으로, 세포 배양액 중에 재조합 기니피그 항체를 분비시켰다. 항원 특이적 형질 세포 및 비특이적 형질 세포로부터 얻어진 재조합 기니피그 단일 클론 항체의 인간 인슐린 결합능을 ELISA법으로 조사하였다 (도 9). 그 결과, 항원 특이적 형질 세포로 얻어진 단일 클론 항체 241 종류 중 146 클론에 대해 음성 대조구의 10배의 인슐린 결합능이, 77 클론이 음성 대조구의 50배가 강한 결합력을 나타냈다. 이상의 결과로부터, 기니피그에 대해도, 표식 항원과 ER-tracker를 임파구 현탁액에 작용시킬 만한 조작에 의해, 항원 특이적인 형질 세포를 동정하고, 이것으로 항원 특이적인 단일 클론 항체를 제작하는 것이 가능한 것이 분명해졌다.
얻어진 241 종류의 재조합 항체 중에서 인간 인슐린에 대해 특히 결합능이 높은 클론 12종류를 선별하여 그 염기 배열을 결정하였다. 이와 같이 하여 얻어진 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정가변 영역의 유전자 배열을 배열표의 배열 번호 7∼18에 나타낸다. 또, 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드의 아미노산 배열은, 배열 번호 19∼30에 나타낸다. 또한, 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 유전자 배열을 배열표의 배열 번호 31∼42에 나타낸다. 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드의 아미노산 배열은, 배열 번호 43∼54에 나타낸다.
또한, 상기 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 및γ쇠사슬 정가변 영역의 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4는, 각각 인간 면역 글로블린 가변 영역과의 상동성을 이용하여서 결정하였다. 얻어진 기니피그의 단일 클론 항체 12류의 κ쇠사슬 및 γ쇠사슬의 FR1∼4 및 CDR1∼3의 아미노산 배열을 이하의 표에 나타낸다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 3
항 흰자 알부민 토끼 단일 클론 항체의 제작
토끼는 다른 동물에서는 얻을 수 없는 고친화성의 항체를 제작하는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명을 이용하여 토끼 단일 클론 항체의 제작을 하였다.
[재료와 방법]
면역 동물은 토끼 ♀ 6주령을 이용하였다.
항원은 흰자 알부민. 면역은, 토끼 꼬리 부분의 양측에 흰자 알부민 300㎍를 1개월 간격으로 4회 근육 주사하였다. 면역 성립 후, 장골 림프절을 채취하였다. 흰자 알부민은 Alexafluor 488로 형광 표식하여 겔 여과에 의해 정제하였다.
[결과]
장골 림프절에서 임파구를 PBS-0.5% 우혈청 알부민 용액에 현탁한 후, Alexafluor488 형광 표식 흰자 알부민을 첨가하여 4℃에서 30분간 교반시켰다. 세포를 원심분리 후 PBS에 재현탁하고, 이것에 ER-Tracker (1μM)를 첨가하여 5분간 실온으로 방치하는 것으로 소포체를 염색해 플로우 사이토미터로 해석하였다. 그 결과, 흰자 알부민 양성으로 ER-tracker 강양성의 세포군이 존재하였다 (도 10). 이것을 항원 특이적 형질 세포분획으로 하였다.
cDNA 합성
cDNA 합성 및 면역 글로블린 유전자 증폭은, 「반응 지그 및 반응 방법, 및 cDNA의 합성 방법」 (WO2009/091048)에 기재의 방법에 준하여 실시하였다. 세포 분별장치에 의해 분리된 개개의 토끼 플라스마 세포를 올리고 dT25가 결합한 자기 비즈 (다이나피즈) 3㎍가 들어간 세포 용해액 3㎕ (100mM Tris HCl (pH 7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산 Li (LiDS), 5 mM dithiothreitol)에 첨가하여 세포내의 mRNA를 자기 비즈에 결합시켰다. 이어서, 자기 비즈를, 3㎕의 mRNA 세정용 용액 A (10mM Tris HCl (pH 7.5), 0.15 MLiCl, 0.1% LiDS), 이어서 3㎕의 mRNA 세정용 용액 B (75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase 억제자)에서 1회 세정한 후, cDNA 합성을 실시하였다. 세정 후의 자기 비즈에, cDNA 합성용 용액 3㎕ (50mM Tris HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% Triton X－100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase 억제자, l0unit Super Scriptlll Reverse transcriptase (invitrogen)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이어서 자기 비즈를 3＇테일링세정 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH 7.0), 0.5mM dGTP, 0.1% Triton X－100, 4mM염화 마그네슘)으로 세정하고, 새롭게 3＇테일링 반응 용액 3㎕ (50mM 인산 칼륨 (pH 7.0), 0.5mM dGTP, 0.1% Triton X－100, 4mM 염화 마그네슘, terminal deoxynucleotidyl transferase 10U)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응을 실시하였다.
토끼γ, κ쇠사슬 가변 영역 유전자 단편의 증폭
자기 비즈를 3㎕의 TE 용액 (10mM Tris HCl (pH7.5), 1mM EDTA, 0.1% Triton X－100)에서 세정 후, 5＇-RACEPCR법을 이용하여 인간 면역 글로블린 γ쇠사슬 및 κ쇠사슬 유전자의 증폭을 하였다. 1회째의 PCR 반응은, 자기 비즈에 25㎕의 PCR 반응 용액 (프라이머를 각 0.2μM, dNTP 0.2mM, 다카라 바이오 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라아제 lU 함유)를 첨가하여 94℃ 30초 - 68℃ 40초의 반응을 35사이클 실시하였다. 이용한 프라이머는 (가)이며, TdT에 의해 cDNA의 3＇단에 부가된 폴리 G에 어닐링한다. 프라이머 배열은 (서))이며, 토끼 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다. 프라이머 배열은 (어)이며, 토끼 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 정상 영역에 유래한다.
반응 후 PCR 용액에 물 225㎕를 첨가하여 10배 희석한 용액 1㎕를 주형으로 하고, 프라이머 (라)와 프라이머 (저)를 이용하여 1회째의 PCR와 같은 조건으로 토끼 면역 글로블린 γ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다. 이와 같이 프라이머 (라)와 프라이머 (처)를 이용하여 토끼 면역 글로블린 κ쇠사슬 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다. (도 11).
이용한 프라이머는, 1회째 PCRγ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5-GCTGGCTGCTTGAGGTCACGCTCACCAC-3 (서) (배열 번호 80)
1회째 PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- CAGTTGTTTGGGTGGTGCCATCCAC-3 (어) (배열 번호 81)
2번째 PCRγ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- CTGCCGGACGGACGGGAAGGTGCGTAC-3 (저) (배열 번호 82) 2번째
PCRκ쇠사슬 증폭용 안티센스 프라이머
5- ACACACGATGGTGACTGTTCCAGTTG-3 (처) (배열 번호 83)
토끼 면역 글로블린 선상화 발현 벡터의 제작
토끼 γ쇠사슬 유전자,κ쇠사슬 유전자 발현 unit 제작은, 「표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 DNA 단편의 특이적 제작 방법」 (WO2011/027808) 방법에 준하여 조제하였다. 즉 5'-RACE-PCR법에 의해 증폭된 각 PCR 산물 1㎕에, terminal deoxynucleotidyl transferase를 2 unit 첨가하여 37℃에서 30분 반응시키고, 그 후 94℃에서 5분간 가열하는 것으로 효소 반응을 정지시켰다.
상기에서 조제한 3＇단 폴리 뉴클레오티드 부가 토끼 γ쇠사슬 유전자 용액에, 토끼γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 10ng, 프라이머 (사) (아)를 각 10pmol, dNTP를 10nmol를 첨가하여 다카라 바이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라아제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃을 4분의 반응을 5 사이클, 이어서 94℃를 40초, 60℃을 40초, 72℃를 4 분의 반응을 30 사이클 실시하는 것으로 토끼γ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
동일하게 토끼 κ쇠사슬 유전자 용액에, 토끼κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편을 첨가하여 반응을 하고, 토끼κ쇠사슬 유전자 발현 unit을 제작하였다.
발현 unit 증폭에 이용한 프라이머는, (사) (아).
반응 후, PCR 용액 각 1㎕를 취하여, 아가로스겔 전기 영동법으로 κ 및 γ쇠사슬 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 unit에의 변환을 확인하였다 (도 12).
유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편
토끼 γ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 토끼γ쇠사슬 정상 영역 (1-893) 연결 배열 II (1-93), 폴리 A 부가 시그널 (1065-1071), CMV 프로모터 (1606-2195), 연결 배열 1 (2196-2230)로 이루어진다 (배열 번호 84).
Figure pct00028
Figure pct00029
유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편
토끼 κ쇠사슬 유전자 연결용 2개 쇠사슬 DNA 단편은 토끼κ쇠사슬 정상 영역 (1-312), 연결 배열 II (1-95), 폴리 A 부가 시그널 (507-513), CMV 프로모터 (1050-1633), 연결 배열 1 (1640-1675)로 이루어진다 (배열 번호 85).
Figure pct00030
Figure pct00031
상기의 실험으로 증폭된 전체 길이의 토끼γ쇠사슬, κ쇠사슬 유전자 발현 unit을 293 FT 세포에 유전자 도입해 2일간 배양을 실시하는 것으로, 세포 배양액 중 재조합 토끼 항체를 분비시켰다. 항원 특이적 형질 세포 및 비특이적 형질 세포로 얻어진 재조합 토끼 단일 클론 항체의 항원 결합능에 대해 ELISA법을 이용하여 조사한바 (도 13), 항원 특이적 형질 세포로 얻어진 재조합 토끼 단일 클론 항체는, 흰자 알부민에 대해 강한 결합력을 나타냈다. 이상의 결과로부터, 표식 항원과 ER-tracker를 임파구 현탁액에 작용시킬 만한 조작에 의해, 항원 특이적인 형질 세포를 동정하고, 이것으로 항원 특이적인 토끼 단일 클론 항체를 고효율로 제작하는 것이 가능하다는 것이 분명해졌다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은, 항체 제조 관련의 분야에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Toyam University <120> Selection Method of Plasma Cell or Plasmablast, Preparation Method of Antibody Specific to Target Antigen, Novel Monoclonal Antibody <130> 125010H <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 911 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 1 tgcctggtca agggctactt ccctgagccg gtgactgtga aatggaactc aggggccctg 60 accagtggag tgcacacctt cccggccgtc cttcagtcag gcctgtactc actcaccagc 120 atggtaactg tgccctccag ccagaagaag gccacctgca atgtagccca cccggccagc 180 agcaccaagg tggacaagac tgttgagcct attcgaactc ctcaacccaa cccgtgtaca 240 tgtcccaagt gcccacctcc tgaaaacctg ggtggaccat ctgtcttcat ctttcccccg 300 aagcccaagg acacgctcat gatctccctg acccctaggg tcacatgtgt ggtggtagat 360 gtgagccaag atgagcctga agtccagttc acatggttcg tggacaacaa accggtcggc 420 aatgctgaga caaagccccg agtggagcaa tacaacacga cattccgcgt ggaaagtgtc 480 ctccccatcc agcaccagga ctggctgagg ggcaaggaat tcaagtgcaa ggtctacaac 540 aaagccctgc cagcccccat agagaagacc atctccaaaa ccaaaggggc tccccgcatg 600 ccagatgtgt acacccttcc cccgtcccga gacgagctat ccaagagcaa agtcagtgtg 660 acctgcctga tcatcaactt ctttcctgcc gacatccacg tggagtgggc cagcaatagg 720 gttccagtga gtgagaagga atacaagaac accccaccca ttgaggacgc tgacgggtcc 780 tacttcctct acagcaagct cactgtggat aagagcgcgt gggatcaggg aaccgtctac 840 acctgctccg tgatgcatga agccctgcac aatcatgtca ctcagaaggc catctcccgg 900 tctccgggta a 911 <210> 2 <211> 345 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 2 gggaccaagc tggaaatcaa acggagtgtg cagaagccaa ctatctccct cttccctcca 60 tcatctgagg aggtgacagc tggaagtgcc tcagttgtgt gcttcattaa tagcttctat 120 ccaagagaca tcaccgtcaa gtggaaggtg gatggctctg aacgctcaca aggcatcctg 180 aacagttaca cagatcagga cagcaaggac aacacctaca gcctcagtag caccctggcg 240 ctgacggctt cagagtacaa tcagcatgag aggtacacct gcgaggtctc ccacgctggc 300 ctgacctcac ccgctgccaa gaccatcaac aggagcgagt gctag 345 <210> 3 <211> 273 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 3 gaggagctcc aggacaacaa ggccacagtg gtgtgtctcc tgaattcctt ctaccccggc 60 tctgtgaatg tcagctggaa ggcagatggc accaccatca accagggcgt gcagaccaca 120 cagcctgcca aacagagcga caacaaatac atggccagca gctacctgac actgactccc 180 gaccagtgga ggtctcacca gagaatcagc tgccaggtca aacacgaggc aggcaatgtg 240 gagaagagtt tggccccgtc agagtgttct taa 273 <210> 4 <211> 303 <212> PRT <213> Guinea Pig <400> 4 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn 1 5 10 15 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 20 25 30 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Gln 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 50 55 60 Asp Lys Thr Val Glu Pro Ile Arg Thr Pro Gln Pro Asn Pro Cys Thr 65 70 75 80 Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Asn Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 85 90 95 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro 100 105 110 Arg Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Glu Pro Glu Val 115 120 125 Gln Phe Thr Trp Phe Val Asp Asn Lys Pro Val Gly Asn Ala Glu Thr 130 135 140 Lys Pro Arg Val Glu Gln Tyr Asn Thr Thr Phe Arg Val Glu Ser Val 145 150 155 160 Leu Pro Ile 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acataactca 180 gcctttcaat ctcgagtggg gatcagcagg gacacttcca acaacctagt ctcaggcacc 240 cagatcagta tgagcccgga ggacccgtcc attttttgtt gtgcaagcca tggcaatggc 300 tattaggata ta 312 <210> 17 <211> 309 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 17 caggtgcagc tgcaggagtc agggcctggc ctggtgaagc cttcagagac tctgtccctc 60 acttgcacgg tctctggatt ttctttgacc ggctatagtg tatcctggat ccgtcagact 120 ccagggaagg ggctggagtt acttggtggt atatggagtt ttggaagcac agaatataac 180 tcagccttta aatctcgaat gggaatcagc agggacactt ccaagaacca ggtctcactc 240 acactgagta gtctgagccc ggaggacacg gccgtatatt actgtgcaag acatggcggt 300 ggctatttt 309 <210> 18 <211> 315 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 18 caggtgcagc tacaggagtc aggacctggc ttggtgaagc cttcagagac tctgtccctc 60 acctgcgagg tctctggatt ttctttaacc ggctatagtg tatcctggat ccgtcagact 120 ccagagaagg ggctggaact aattggtggt atatggaatt ttggaggcac agaatataac 180 tcagccttta aatctcgagt gggaatcagc agggacactt ccaagaacca agtctcactc 240 acactgagaa atgtgagccc ggaggacacg gccatatatt attgtacaag acatggcagt 300 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ctatgggaca aacaatttgc agtctgggat cccatcgagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcatca tcagcagcct gcggcctgaa 240 gactttgcta cttattactg tcaacagagt aggagtagcc cattcact 288 <210> 32 <211> 288 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 32 gacatccaat tgacacagcc tgcatctaca tctgcatctg tgggagacac agtcaagatc 60 agttgccgga ccagtcagac tattagtagt tatttaaact ggtatcagca gaaaccaggg 120 caagctccta aactcctaat ctatgggaca aacaatttgc agtctgggat cccatcgagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcatca tcagcagcct gcggcctgaa 240 gactttgcta cttattactg tcaacagagt aacagtagcc cattcact 288 <210> 33 <211> 288 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 33 gacatccaat tgacacagcc tgcatctgca tctgcatctg tgggagacac agtcaagatc 60 agttgccggg tcagtcagag tgtcagtagt tacttaaact ggtatcagca gaaaccaggg 120 caagctccta aactcctgat ctattgggca accaatttgc agtctgggat cccatcgagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gaagcctgaa 240 gactttgcaa cttattactg tcaacaaagt aagactagcc cattcact 288 <210> 34 <211> 288 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 34 gacatccaat tgacacagcc tgcatctgca tctgcatctg tgggagacac agtcaagatc 60 agttgccggg ccagtcagac tattagtagt tatttaaact ggtatcagca gaaaccaggg 120 caagctccta caatcctgat ctatgggaca aacaatttgc agtctgggat cccatcgagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcatca tcagcagcct gcggcctgaa 240 gactttgcta cttattactg tcaacagagt aggagtagcc cattcact 288 <210> 35 <211> 334 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 35 caaattctcc ccattctact gctctgtgcc acagtgtcca atggacaaat tgtactcacc 60 cagtctccag catccctggc tgcttctcca gggcaaaagg tcaccatcac ctgcacagcc 120 agttccagtg taaacaataa cttcttccac tggtaccaac aaaagccagg agcctctcca 180 accctcctaa tttatcgaac atcaagactg gcctccggag tcccggctcg cttcagtggg 240 agtgggtcag ggacttctta ctctctcaca atcagcagca tggagggtga agatgttgca 300 acctattact gtctgcagtc taatagttac acct 334 <210> 36 <211> 306 <212> DNA <213> Guinea Pig <400> 36 gactttgtga tgactcagtc tccagcctcc ctgtcagtga cccctggaga gagcacaacc 60 atccgctgca agtccagcca gagtcttctg tcccgttata acaacaagaa caacttggcc 120 tggtaccagc 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Primer <400> 69 ggaagaggga gatagttggc ttctgcacac tc 32 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 70 agaaggaatt caggagacac accactgt 28 <210> 71 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 71 agagactcga gtgcctggtc aagggctact tccctga 37 <210> 72 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 72 gagagagcgg ccgctcattt acccggagac cgggagat 38 <210> 73 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 73 agagactcga ggggaccaag ctggaaatca aacgga 36 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 74 gagagagcgg ccgcctagca ctcgctcctg ttgatggtct 40 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 75 agagactcga ggaggagctc caggacaaca aggc 34 <210> 76 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 76 gagagagcgg ccgctaagaa cactctgacg gggccac 37 <210> 77 <211> 2123 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Combined sequence <400> 77 tgcctggtca agggctactt ccctgagccg gtgactgtga aatggaactc aggggccctg 60 accagtggag tgcacacctt cccggccgtc cttcagtcag gcctgtactc actcaccagc 120 atggtaactg tgccctccag ccagaagaag gccacctgca atgtagccca cccggccagc 180 agcaccaagg tggacaagac tgttgagcct attcgaactc ctcaacccaa cccgtgtaca 240 tgtcccaagt gcccacctcc tgaaaacctg ggtggaccat ctgtcttcat ctttcccccg 300 aagcccaagg acacgctcat gatctccctg acccctaggg tcacatgtgt ggtggtagat 360 gtgagccaag atgagcctga agtccagttc acatggttcg tggacaacaa accggtcggc 420 aatgctgaga caaagccccg agtggagcaa tacaacacga cattccgcgt ggaaagtgtc 480 ctccccatcc agcaccagga ctggctgagg ggcaaggaat tcaagtgcaa ggtctacaac 540 aaagccctgc cagcccccat agagaagacc atctccaaaa ccaaaggggc tccccgcatg 600 ccagatgtgt acacccttcc cccgtcccga gacgagctat ccaagagcaa agtcagtgtg 660 acctgcctga tcatcaactt ctttcctgcc gacatccacg tggagtgggc cagcaatagg 720 gttccagtga gtgagaagga atacaagaac accccaccca ttgaggacgc tgacgggtcc 780 tacttcctct acagcaagct cactgtggat aagagcgcgt gggatcaggg 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Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 83 acacacgatg gtgactgttc cagttg 26 <210> 84 <211> 2230 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Combined sequence <400> 84 ctggtcaaag gctacctccc ggagccagtg accgtgacct ggaactcggg caccctcacc 60 aatggggtac gcaccttccc gtccgtccgg cagtcctcag gcctctactc gctgagcagc 120 gtggtgagcg tgacctcaag cagccagccc gtcacctgca acgtggccca cccagccacc 180 aacaccaaag tggacaagac cgttgcgccc tcgacatgca gcaagcccac gtgcccaccc 240 cctgaactcc tggggggacc gtctgtcttc atcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 300 atgatctcac gcacccccga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca ggatgacccc 360 gaggtgcagt tcacatggta cataaacaac gagcaggtgc gcaccgcccg gccgccgcta 420 cgggagcagc agttcaacag cacgatccgc gtggtcagca ccctccccat cgcgcaccag 480 gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc aaagtccaca acaaggcact cccggccccc 540 atcgagaaaa ccatctccaa agccagaggg cagcccctgg agccgaaggt ctacaccatg 600 ggccctcccc gggaggagct gagcagcagg tcggtcagcc tgacctgcat gatcaacggc 660 ttctaccctt ccgacatctc ggtggagtgg gagaagaacg ggaaggcaga 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actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg 120 tggatggcac cacccaaaca actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag 180 attgtaccta caacctcagc agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca 240 aagagtacac ctgcaaggtg acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaacaggg 300 gtgactgcta gagcggccgc gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt 360 tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc 420 aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 480 cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 540 catcaatgta tcttaaggcg taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa 600 atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata 660 aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac 720 tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc 780 cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa 840 atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg 900 cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag 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Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Glu Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Ala Ile Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Asp Tyr Phe Cys Met Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Pro Gly Arg Ser Ala Leu Gly Gln Thr Gly Lys Lys 100 105 110 Phe <210> 89 <211> 114 <212> PRT <213> Guinea Pig <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Trp Ala Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Ala Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Val Gly Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Ser Glu Val Ser Leu 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ser Leu Ser Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Gln Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Val Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 90 <211> 128 <212> PRT <213> Guinea Pig <400> 90 Gln Leu Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Phe Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Phe Ser Ile Ala Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Gly Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Arg Gly Lys Thr Leu Glu 35 40 45 Leu Met Gly Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Ile Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Val Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Asp Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Pro Leu Tyr Ser Ile Gly Gly Val Trp Ser Asn Tyr 100 105 110 Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Ser Ser 115 120 125 <210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Guinea Pig <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ser His Ile Ser Asp Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Ser Leu Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Ser Val Gly Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser

Claims (21)

  1. 비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는, 비인간 동물을 목적 항원으로 면역시키고,
    면역 성립 후의 비인간 동물로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
    상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원, 및 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하며,
    상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함한, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택하는 방법.
  2. 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고, 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 목적 항원에 생체 밖에서 감작시키거나, 또는 목적 항원에 대한 항체를 갖는 인간으로부터 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포를 채취하고,
    상기 감작시킨, 또는 채취한 림프액, 림프액 조직, 혈구 시료 또는 골수 유래의 세포와 (1) 표식시킨 목적 항원과 (2) 형질 세포 및/또는 형질아 세포를 선택적으로 결합하는 표식 물질을 혼합하고,
    상기 (1) 표식시킨 목적 항원 및 (2) 표식 물질이 결합된 세포를 선택하는 것을 포함한 목적 항원에 특이적으로 결합하는 인간의 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽을 선택하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 기재된 방법으로 목적 항원에 특이적으로 결합하는 형질 세포 및 형질아 세포의 적어도 한쪽 세포를 선택하고,
    선택된 세포로부터 목적 항원에 대한 항체 유전자를 채취해, 그 염기 배열을 동정하고,
    동정한 유전자의 염기 배열에 근거하여 상기 항체 또는 항체의 단편을 조제하는 것을 포함한 목적 항원에 특이적인 항체 또는 항체의 단편의 제조 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    형질 세포 및/또는 형질아 세포에 선택적으로 결합하는 표식 물질은, 세포의 소포체에 대한 염색 선택성이, 소포체 이외의 세포 소기관에 대한 염색 선택성에 비해 높은 형광 프로브이며, 상기 형광 프로브에 의한 염색에 의해, 형질 세포 및 형질아 세포와 형질 세포 및 형질아 세포 이외의 세포를 식별 가능한, 형질 세포 및/또는 형질아 세포의 동정 또는 단리에 이용하기 위한 형광 프로브인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    (1) 양친매로 양이온성이며, 또한 중간 정도의 지용성을 갖는 물질, 및 (2) 소포체 편재를 표시되는 단백질에 대해서 일정 이상의 친화성을 갖는 물질로 이루어진 군에서부터 선택되는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 양친매는 양친매성 인덱스 (AI)가 +6> AI > 0이며, 중간 정도의 지용성은 소수성 인덱스 (logP)는 +6 > logP > 0이며, 일정 이상의 친화성은, 해리 정수가 0.1μM∼0.1nM의 범위인 방법.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소포체 이외의 세포 소기관은 형질막, 미토콘드리아, 골지체, 리소좀, 퍼옥시좀, 핵, 중심체, 세포질 기질, 파고솜, 엔도솜, 또는 아그리솜인 방법.
  8. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광 프로브는 형광 표식 glibenclamide, 형광 표식 Brefeldin A, 형광 프로브, 및 형광 단백질로 이루어진 군에서부터 선택되는 방법.
  9. 배열표의 배열 번호 1로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드하는 유전자.
  10. 배열표의 배열 번호 2로 표시되는인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드하는 유전자.
  11. 배열표의 배열 번호 3으로 표시되는인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의λ쇠사슬 정상 영역의 유전자 또는 배열표의 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
  12. 배열표의 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
  13. 배열표의 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
  14. 배열표의 배열 번호 6으로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 λ쇠사슬 정상 영역의 펩티드.
  15. 배열표의 배열 번호 7∼18 중 어느 하나로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 유전자 또는 배열 번호 19∼ 30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
  16. 배열표의 배열 번호 31∼42 중 어느 하나로 표시되는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 유전자 또는 배열 번호 43∼ 54 및 86∼88 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드를 코드 하는 유전자.
  17. 배열 번호 19∼30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 γ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
  18. 배열 번호 43∼54 및 86∼881 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 인간 인슐린에 대한 기니피그 항체의 κ쇠사슬 가변 영역의 펩티드.
  19. 가변 영역으로서 배열 번호 19∼30 및 89∼91 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 4로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 γ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
  20. 가변 영역으로서 배열 번호 43∼54 및 86∼88 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 배열을 가지며, 또한 정상 영역으로서 배열 번호 5로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 κ쇠사슬을 갖는, 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
  21. 하기 κ쇠사슬 CDR1,κ쇠사슬 CDR2 및 κ쇠사슬 CDR3 중 한 개씩의 조합을 포함한 κ쇠사슬 또는 하기 γ쇠사슬 CDR1,γ쇠사슬 CDR2 및 γ쇠사슬 CDR3 중 어느 하나의 1개씩 조합을 포함한 γ쇠사슬을 포함한 인간 인슐린에 대한 기니피그 단일 클론 항체.
    Figure pct00032


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