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KR20140032346A - 암의 치료/전이의 억제 - Google Patents

암의 치료/전이의 억제 Download PDF

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KR20140032346A
KR20140032346A KR1020137012365A KR20137012365A KR20140032346A KR 20140032346 A KR20140032346 A KR 20140032346A KR 1020137012365 A KR1020137012365 A KR 1020137012365A KR 20137012365 A KR20137012365 A KR 20137012365A KR 20140032346 A KR20140032346 A KR 20140032346A
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KR
South Korea
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ranolazine
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KR1020137012365A
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무스타파 빌진 알리 잠고즈
Original Assignee
무스타파 빌진 알리 잠고즈
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Publication date
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Abstract

트랜션트 부분을 제거하지 않고 적어도 전압 개폐 나트륨 채널 전류의 지속 부분을 감소시키는 효과에 의해 VGSC 발현 암 내에서 전이 행동을 방지하거나 감소시키는, 물질들 및 방법들이 설명된다. 분리가능성(detachability), 측면 운동성, 수직 이동 및 침습성과 같은 전이성 세포 행동들의 억제는 라놀라진 및 릴루졸과 같은 알려진 약물을 사용하여 설명된다.

Description

암의 치료/전이의 억제{TREATMENT OF CANCER/INHIBITION OF METASTASIS}
본 발명은 암의 치료에 관한 것이고, 특히, 유방암 또는 전립선암과 같은 전이성 암(metastatic cancer)의 치료에 관련 있으며, 이로 제한되지 않는다.
유방암 및 전립선암과 같은 전이성 암의 진행은, 일반적으로 다음과 같은 다섯 단계들(phases)을 포함하는 것으로 간주된다:
1. 발생(Genesis), 즉 정상 세포의 암 세포로의 초기 변환(transformation).
2. 증식, 즉 암 세포들의 숫자를 증가시켜 크기가 증가하는 1차 종양(primary tumour)을 형성.
3. 전환(Switching), 발생 또는 증식 단계 동안, 암 세포들이 전이 행동(metastatic behaviour)의 가능성을 갖지 않는 상태에서 전이 행동의 가능성을 갖는 상태로 전환.
4. 1차 종양으로부터의 암 세포들의 분리(Detachment), 이후에 이러한 분리된 세포들의 움직임은 동일한 장기 내의 조직의 주변부(surrounding region)들 내에서 순환계로 향함.
5. 전이, 즉 순환(혈액 또는 림프)을 통하여 분리된 세포들의 움직임이 여타 장기들로 향함으로써 여타 장기들 내에서 2차 종양을 생성함.
세포 내에서 발생하고 상기의 단계 3의 상태에서 전환을 야기하는 중요한 변화는, 기능성 전압-개폐 나트륨 채널(voltage-gated sodium channels: VGSCs)의 발현이다. 유방암의 경우, Nav1.5 채널이 발현되고, 전립선암의 경우, Nav1.7 채널이다. VGSCs는 신생 형태(neonatal form) 및/또는 성체 형태(adult form)로 발현될 수 있다. 유방암의 경우, Nav1.5 채널의 신생 형태(nNav1.5)가 발현된다. 전립선암의 경우, 발현되는 형태가 현재 알려지지 않았다. 이러한 채널들이 없으면, 세포들은 침습(invasion)에 대한 가능성을 갖지 않으므로, 전이 행동을 갖지 않는다.
일부 경우들에서, 발생 단계는 처음부터 전이 가능성을 갖는 암 세포들의 성장을 포함한다.
전이를 방지하기 위한 이전 제안들
본원 발명 이전에, 본 분야의 중점은 하나 이상의 하기에 의해 전이를 방지하기 위한 치료법을 찾아내려고 노력해 왔다:
(a) 기능성 VGSCs의 발현 방지;
(b) 발현된 기능성 VGSCs의 활성화를 완전히 차단(blocking); 또는
(c) 세포들을 사멸(killing the cells).
본원 발명은 상이한 접근법을 제안한다.
전류가 VGSCs를 통하여 간헐적으로 흐른다, 다시 말해서 전류가 펄스로 흐른다. 이는 각각의 펄스가 낮은-레벨의 DC 부분이 뒤따르는 트랜션트(transient)[또는 피크(peak)]를 포함하는 것으로 알려져 있고, 레이트(late) 전류 또는 지속(persistent) 전류로 알려져 있다. 또한, 알려진 약물인 라놀라진(ranolazine) 또는 릴루졸(riluzole)의 적절한 복용량은 전류의 지속 부분을 억제하여, 트랜션트 부분이 영향을 받지 않거나 단지 부분적으로 감소되도록 한다고 알려졌다.
하기에서 좀 더 자세하게 설명되는, 본 발명과 관련되어 수행되는 실험 작업은 하기를 증명한다:
(i) 각각, 유방암 및 전립선암에서의 Nav1.5 및 Nav1.7 전류의 지속 부분을 억제하는 것은 전이 행동을 억제함;
(ii) 전이 행동을 억제하기 위하여 이러한 전류의 트랜션트 부분을 억제할 필요 없음;
(iii) 라놀라진 또는 릴루졸의 적절한 복용량은 증식의 방지 또는 종양의 세포들의 파괴 없이 전이 행동을 억제할 것임; 및
(iv) 전류의 지속 부분에 대한 라놀라진 및 릴루졸의 억제 효과는 저산소 상태(hypoxia)에 노출되기 이전 세포들에서 더 좋고, 이는 종양들이 성장하고 전이 과정에 대단히 중요한 결정적인(critical positive) 기여를 하는 조건이다.
라놀라진 및 릴루졸은 모두 심장 질환(cardiac condition)들의 치료용으로 알려져 있다. 더욱더, 이들의 각각은 VGSC 전류들의 트랜션트 부분과 지속 부분의 크기(magnitude)에 상이하게 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 영향은 복용량-의존 방식이다. 이러한 약물들의 고 복용량은 VGSC 전류를 완전히 차단한다. 심장 조직 내에서 VGSC 전류를 완전히 차단하는 효과를 가지는 이들, 또는 여하한의 여타 약물의 복용량은 환자에게 치명적인데, 이는 심장이 제 기능을 수행하기 위하여 이러한 전류를 필요로 하기 때문이다.
그러나, 본 발명의 측면에 따르면, 전이 행동은 트랜션트 부분의 차단 없이 또는 적어도 완전한 차단 없이, VGSC 전류의 지속 부분을 억제하거나 감소시키기 위하여, 라놀라진이나 릴루졸, 또는 또 다른 물질을 적절한 복용량으로 투여하여 암 내에서 억제되거나 감소된다. 따라서, 암 내에서의 전이는 치명적일 수 있는 약물들의 복용량을 투여하지 않고 이러한 방식으로 억제되거나 감소시킬 수 있다.
릴루졸은 이미 여하한 암들, 특히 전립선암 및 흑색종의 치료에 제안되어 왔다. 두 경우 모두에서, 릴루졸은 암 세포들을 사멸시키는 것과 같은 방식으로 투여 되어야 한다고 제안되었다.
하기에서 좀 더 자세하게 설명될 본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 트랜션트 부분의 차단 또는 완전한 차단 없이, 그리고 직접적으로 세포 죽음을 야기하지 않고, VGSC 전류의 지속 부분을 억제할 복용량 수치(dosage level)로 릴루졸 또는 라놀라진이 투여된다.
세포 죽음을 야기하지 않고 전이 행동이 억제되거나 감소시킬 수 있다는 사실은 상당한 이점일 수 있는데, 이는 최근의 연구가 적어도 몇몇 경우에, 세포들을 사멸시킴으로써 암을 치료하는 것은 단기간 동안 이익이 있을 것이나, 그럼에도 불구하고 암은 재발 및 확산될 것이라는 점에서 역효과를 낳을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명은 실질적으로 암 세포들을 사멸시킴으로써 야기될 수 있는 잠재적인 문제점들 없이, 전이 행동을 억제하거나 방지할 가능성을 제공한다.
전이 행동은 몇몇의 단계들을 포함한다, 즉:
(a) 종양으로부터 세포들의 분리;
(b) 분리된 세포들의 주변 조직으로의 움직임;
(c) 주변 조직을 통하여 순환계 쪽으로 움직임; 및
(d) (궁극적으로 2차 종양들을 형성하기 위하여 세포들이 빠져나올 수 있는 점에서부터) 순환계 내로의 움직임.
그러므로, 하나 이상의 이러한 단계들에서 세포들의 활성의 억제 또는 감소는 적어도 전이 감소에 기여할 것이다. 수많은 실험들에 의해, 하기에 좀 더 자세하게 설명되는 바와 같이, 각각의 이러한 하위-단계들에서 약물들의 효과가 결정될 수 있다, 즉:
(a) 세포들의 접착성에 대한 약물의 효과를 시험;
(b) 세포들의 측면 운동성(lateral motility)에 대한 약물의 효과를 시험;
(c) 세포들의 수직 이동에 대한 약물의 효과를 시험; 및
(d) 세포들의 침습성(invasiveness)에 대한 약물의 효과를 시험, 즉 세포들에 의해 소비되는 매질을 통하여 나아갈 수 있는 세포의 능력.
하기에서 좀 더 자세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명과 관련 있는 수행되는 실험들은, 다양한 복용량 수치로 라놀라진 또는 릴루졸을 투여하는 것이 세포들의 접착성을 증가시킬 수 있고, 및/또는 세포들의 하나 이상의 측면 운동성, 수직 이동 및 침습성을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전이를 억제하거나 감소시키기 위하여, 바람직하게는 세포 죽음을 야기하지 않고, 트랜션트 부분이 영향을 받지 않거나 단지 부분적으로 감소되도록 남겨두는 동안 전이성 암 세포들 내에 VGSC의 지속 부분을 억제하거나 감소시키기 위하여, 화합물, 조성물 또는 여타의 물질이 적절한 복용량으로 사용되도록 의도되거나 사용되도록 제공된다.
본 발명, 적어도 여하한 측면들 또는 형태들로부터 나온 이점들은:
(a) 유방암 및 전립선암(그리고 VGSCs가 발현되는 여타의 암들)은 환자가 심각한 손상 없이 이러한 암을 감수해 낼 수 있도록 포함될 수 있음;
(b) 결과적으로, 암 세포들을 파괴하기 위해, 화학 요법 또는 방사선 요법과 같은, 공격적인 치료들을 환자가 겪을 필요가 방지될 수 있음;
(c) 만약 환자가 유방암 또는 전립선암 또는 여타의 전이성 암을 앓고 있다고 의심되면, 라놀라진 또는 릴루졸 (또는 관련된 성질들을 가지는 여타의 물질)의 적합한 복용량에 의한 즉각적인 치료가, 최종적인 시험들의 결과들을 기다리는 동안 전이를 억제하거나 방지하기 위하여 제공될 수 있음;
(d) 오직 이를 성취하기 위하여 필요한 복용량은 VGSC 전류의 지속 부분을 억제하는데 충분히 많아(high)야 함;
(e) 라놀라진 또는 릴루졸의 치료적으로 수용가능한 복용량은 트랜션트 부분이 실질적으로 영향을 받지 않으면서, 이러한 전류의 지속 부분의 억제를 얻는데 성공할 것임; 및
(f) 라놀라진 및 릴루졸이 다년간 인체용으로 승인되었고 시중에서 판매되어 왔기 때문에, 본 발명은 부작용 등에 대한 모든 장황한 시험을 통과해야할 것 없이 임상적인 사용에 적용될 수 있는 것이다.
더욱더, 본 발명은 하기에 착수된 실험 데이타 및 첨부된 도면들에 관하여 설명된다.
도면들에서:
도 1은 1차 종양발생에서 2차 종양들의 형성까지의 암 진행(전이)에 대한 시간표(timeline)의 개략적인 대표도이고;
도 2는 발암(cancer initiation) 및 전이로의 진행 동안 일어나는 세포 과정들의 개략적인 도이며;
도 3(a)는 전류의 트랜션트 부분 및 지속 부분 모두를 나타내고, 또한 정상산소 상태(normoxic) 조건 및 저산소 상태(hypoxic) 조건 둘 모두 하에서의 전류를 나타내는, VGSC's를 통한 전류를 예시하는 스케치(sketch)이고;
도 3(b)는 VGSC 전류 구성요소들에 대한 상이한 농도의 라놀라진의 효과를 예시하는 스케치이며;
도 3(c)는 VGSC 전류 구성요소들에 대한 상이한 농도의 릴루졸의 효과를 예시하는 스케치이고;
도 4는 개별적으로 세포들의 접착력(adhesion)을 측정하기 위한 세포 접착력 측정 장치의 개략적인 도이며;
도 5는 세포들의 측면 운동성을 측정하기 위하여 사용된 장치의 개략적인 도이고, 도(view) (a)는 세포들의 반-융합성 층(semi-confluent layer)을 함유하는 세포 배양 접시의 상부로부터의 평면도이며, 도 (b)는 평판 배양(plated)된 세포들의 개략적인 측면도(side sectional view)이고, 도 (c)는 세포들의 층을 통하여 상흔이 생성되는 경우에 시간 t = 0에서의 평판 배양된 세포들의 평면도이며, 그리고 도 (d)는 세포들이 이동되고 상처가 부분적으로 아물은 후에 후속 시간(later time)[t = 24 시간]에서의 평판 배양된 세포들의 평면도이고;
도 6은 세포들의 수직 이동을 측정하기 위하여 사용된 장치의 개략적인 측면도이며;
도 7은 세포들의 침습성을 측정하기 위하여 사용된 장치의 개략적인 측면도이고;
도 8은 사람의 전이성 유방암 MDA-MB-231 세포들의 단일-세포 접착력에 대한 유도된 화학적 저산소 상태의 농도 의존 효과를 나타내는 그래프이며;
도 9는 정상 산소 상태(normoxia) 및 화학적으로 유도된 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 단일-세포 접착력에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 그래프이고;
도 10은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 측면 운동성에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 11은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 수직 이동에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 12는 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 침습성에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 13은 저산소 상태 하에서 상이한 기간 동안 라놀라진에 의해 사전-처리된 MDA-MB-231 세포들의 침습성에 대하여 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 일련의 막대 그래프이고, 도 (a)는 어세이 동안 24시간만 처리된(즉, 사전-처리 없음) 세포들에 대한 5 μM 라놀라진의 효과를 나타내는 막대 그래프이며, 도 (b)는 72시간 동안 약물로 사전-처리된 세포들에 대한 5 μM 라놀라진의 효과를 나타내는 막대 그래프이고, 도 (c)는 어세이 동안 24시간만 처리된(즉, 사전-처리 없음) 세포들에 대한 5 μM 라놀라진의 효과를 나타내는 막대 그래프이며, 도 (d)는 48시간 동안 약물로 사전-처리된 세포들에 대한 5 μM 라놀라진의 효과를 나타내는 막대 그래프이고, 그리고 도 (e)는 72시간 동안 약물로 사전-처리된 세포들에 대한 5 μM의 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 14는 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 성장에 대한 라놀라진의 효과의 부족을 나타내는 일련의 막대 그래프이고;
도 15는 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 생존도(viability)에 대한 라놀라진의 효과의 부족을 나타내는 일련의 막대 그래프이며;
도 16은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 쥐의 강한 전이성 전립선암 Mat-LyLu 세포들의 수직 이동에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 17은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 침습성에 대한 라놀라진의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 18은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 증식에 대한 라놀라진의 효과의 부족을 나타내는 막대 그래프이고;
도 19는 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 생존도에 대한 라놀라진의 효과의 부족을 나타내는 막대 그래프이며;
도 20은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 측면 운동성에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 21은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 수직 이동에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 22는 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 침습성에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 23은 저산소 상태 하에서 72시간 초과 동안 5 μM 릴루졸로 사전-처리된 MDA-MB-231의 침습성에 대한 비교 효과를 나타내는 한 쌍의 막대 그래프이며, 도 (a)는 어세이 동안 24시간만 처리된(즉, 사전-처리 없음) 세포들에 대한 5 μM 릴루졸의 효과를 나타내는 막대 그래프이고, 도 (b)는 72시간 동안 약물로 사전-처리된 세포들에 대한 5 μM 릴루졸의 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 24는 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 성장에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 25는 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 생존도에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며;
도 26은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 침습성에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이고;
도 27은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 성장에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이며; 그리고
도 28은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 생존도에 대한 릴루졸의 복용량-의존 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 1을 참조로 하여, 시간표(101)는 종양의 발달에 대한 세 개의 연속적인 단계들, 즉 암 세포들의 발달 이전 단계(102), 암 세포들의 발생이 일어나는 동안 단계(102)를 뒤따르는 단계(103), 및 종양의 성장을 위하여 암 세포들이 증식하는 동안 단계(103)을 뒤따르는 단계(104)의 대표도이다. 증식 단계(104)는 발생 단계(103)이 시작된 후 곧 시작될 수 있다.
사람의 유방암 또는 사람의 전립선암 세포들은 초기에 여하한 기능성 VGSCs을 포함하지 않을 수 있고, 만약 이러한 채널들이 종양 내에서 발현되지 않는다면, 종양 세포들은 침습적이지 않을 것이라는 것이 규명되어 왔다. 그러나, 많은 이러한 종양들에서, 초기에 VGSC's가 없을지라도, 어느 시점에서 기능성 VGSC's가 발현할 것이다. 이는 종양이 확산될 수 있는 조건으로의 변화를 유발한다. 도 1은 초기에 세포들이 여하한 기능성 VGSC's를 함유하지 않지만 시간(105)의 어느 시점에서 기능성 VGSC의 발현이 시작되는 상황을 나타낸다. 이는 발생 단계(103)의 개시 후에 언제라도 일어날 수 있다.
도 1의 시간표(106)은 암이 전이되는 경우, 시간(105)에 뒤따라서 발생하는 단계를 설명한다.
시간(105)을 뒤따르는 첫번째 단계(107)에서, 전이성 세포들은 종양으로부터 스스로 분리된다. 그 후에, 단계(108)에서, 이들은 동일한 장기 내에 주변 조직을 통하여 순환계, 특히 혈관 및/또는 림프계 쪽으로 침입하거나 이동한다. 단계(109)에서, 전이성 세포들은 순환계에 들어가고, 이는 이후에 이들을 인체 내의 여타 장기들로 이동시킬 수 있으며, 여기서 2차 종양들의 형성을 야기할 수 있다. 상기 단계들은 도 2에서 그림을 넣어 나타내고, 여기서 참고 번호(200)는 유방 또는 전립선과 같은 장기의 일부를 나타낸다. 유방 또는 전립선의 건강한 세포(201)들은 기저막(202) 및 주변의 암성 종양(203)을 지지하고 있는 것으로 나타내고, 이는 발생 단계(103)을 겪어야 증식 단계(104)로 진행된다고 추정된다.
암성 종양(202)의 여하한 세포(204)들은 종양(203)으로부터 분리되고 기저막(202)의 퇴화 부위(degraded region)[202a]을 통하여 종양(203)을 함유하는 장기의 인접한 부위(205) 내로 통과하는 것으로 나타나고, 이 부위는 주로 콜라겐 섬유를 포함할 수 있다. 종양으로부터 분리되고 기저막(202)을 통하여 통과한, 암 세포(206)들은 인접한 부위(205)를 통하여 혈관(207) 쪽으로 통과하는 것으로 나타난다. 암 세포(cancerous cell)[208]는 혈관(207)의 벽을 통하여 혈류(209) 내로 이동하는 것으로 나타난다.
혈류로 이미 들어간 세포(210)들은 혈류 내에서 부위(211)로 운반되는 것으로 나타나고, 여기서 세포(212)들은 표면상으로 혈관(207)의 벽을 통하여, 2차 종양(도시하지 않음)을 형성할 수 있는 림프샘 또는 간과 같은 또 다른 장기(213) 쪽으로 이동하는 것으로 나타난다.
참고 번호(214)는 단순히 혈관(207)의 벽 내에 정착되거나 인접한, 휴면기의 암 세포들을 나타낸다.
하기에 좀 더 자세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명은 설명된 다양한 단계들로 발생하는 암 세포들의 하나 이상의 전이 행동을 방지하거나 감소시키기 위한 수단 또는 치료법을 제공한다. 특히, 본 발명은:
(a) 세포들이 분리될 가능성이 작도록 종양 내에서 세포들의 접착성의 증가; 및/또는
(b) 분리된 세포들의 운동성을 감소시켜, 이들이 기적막을 통하여 주변 조직 내로 이동할 가능성이 더 적도록 함; 및/또는
(c) 주변 조직을 통하여 순환계 쪽으로 이동하는 세포들의 능력을 감소시킴으로써 주변 조직으로 들어간 세포들의 침습성의 감소; 및/또는
(d) 주변 조직으로부터 조직의 벽들을 통하여 순환계 내로 이동하는 세포들의 능력의 감소
를 위한 수단 또는 치료법을 제공한다.
암 세포들 내에서 발현되는 기능성 VGSCs를 갖지 않는 암 세포들은 침습적으로 행동하지 않는다고 상기에 설명되었다. 더욱더, 이는 전류가 펄스로 VGSCs를 통하여 통과한다고 알려졌고, 각각의 펄스는 훨씬 더 낮은 레벨의 지속 부분 또는 레이트(late) 부분이 뒤따르는 트랜션트 부분 또는 피크 부분을 포함한다. 본 발명의 측면에 따르면, 피크 부분을 제거하지 않으나 전류의 지속 부분을 억제하거나 감소시킴으로써 하나 이상의 상기의 전이 행동이 억제되거나 감소하여, 이는 우선적으로 전류의 지속 부분을 감소시킬 약물을 사용할 수 있게 한다.
이러한 약물들의 일부는 부정맥 또는 협심증과 같은 심장 질환들을 치료하는데 알려져 있다. 심장을 치료하는 경우에, 전류의 피크 파트가 제거되지 않는 것을 보장하는 것이 필수적인데, 이는 심장의 기능 및 이의 리듬을 유지하는데 필수적이기 때문이다. 따라서, 본 발명의 측면에 따라서, 피크 부분을 제거하지 않고 VGSC 전류의 지속 부분을 억제하거나 감소시키는데 이전에 사용된, 라놀라진 또는 릴루졸과 같은 알려진 약물은 암, 특히 유방암 또는 전립선암에서 전이 행동을 억제하거나 감소시키는데 사용된다.
VGSC 전류의 성질, 및 라놀라진 또는 릴루졸에 의한 치료에 대한 효과가 도 3(a), 도 3(b) 및 도 3(c)를 참고로 하여 더욱더 설명될 것이다.
도 3(a)에 관련하여, 연속선(unbroken line)으로 나타낸 커브(301)는 정상 산소 상태 하에서 기능성 VGSC을 통하여 흐르는 전류 펄스를 나타내고, 가로축은 시간을 나타내며, 세로축은 전류의 진폭 또는 크기를 나타낸다. 보이는 바와 같이, 이 전류 펄스는 피크 또는 트랜션트 부분(302), 지속 부분 또는 레이트(late) 부분(303)을 포함한다. 실제로, 지속 부분(303)이 계속되는 시간의 기간은 트랜션트 부분(302)의 시간의 기간보다 매우 훨씬 더 클지라도, 이는 도 3(a)가 도에는 나타내지 않은 실험 데이타로부터 얻어지는 실질적인 커브보다는 개략적인 스케치이기 때문이다.
1점 쇄선(chain dotted lines)으로 그려진 커브(304)는 저산소 상태 하에서 VGSC 전류의 펄스를 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 저산소 상태 하에서의 전류의 피크 부분(305)은 정상 산소 조건 하에서의 피크 파트(301) 보다 더 작으나, 저산소 상태 하에서의 지속 부분(306)은 정상 산소 조건 하에서의 지속 부분(303) 보다 더 크다. 하기에 설명되는 실험 결과들을 고려하면 분명해 지는 것과 같이, 저산소 상태와 정상 산소 상태 하에서 이러한 커브들 간의 차이는 관련이 있는데, 이는 암성 종양 내에 대부분의 세포들이 여타의 암 세포들에 의해, 혈액 순환계로부터 이들이 부분적으로 고립되므로 저산소 상태이기 때문이다.
도 3(b)는 개별적으로 VGSC 전류의 트랜션트 부분 및 지속 부분에 대한 라놀라진의 증가하는 복용량의 효과를 나타내는 스케치이다. 볼 수 있는 바와 같이, 가로축은 라놀라진의 복용량 수치를 나타내고, 세로축은 표준화된(normalised) VGSC 전류를 나타낸다. 실선 커브(305)는 증가하는 복용량에 대하여 곡선으로 그려진(plotted) 전류의 트래션트 부분의 크기를 나타내고, 파선(broken line) 커브(306)는 라놀라진의 증가하는 복용량에 대하여 전류의 지속 부분의 크기를 나타내고, 복용량 수치들은 가로축 상에 나타난다.
사람이 치료적으로 수용가능한 1 내지 10 μM의 범위 내에 복용량 수치들에서, 전류의 지속 부분이 트랜션트 부분 보다 더 상당히 크게(significantly) 감소한다는 것을 도 3(b)에서 더욱더 볼 수 있다. 두 가지의 감소 간에 차이를 이중 화살표(307)로 도 3(b)에 나타낸다.
릴루졸의 증가하는 복용량에 의한 유사한 효과를 도 3(c)에서 볼 수 있고, 여기서 실선 커브(308)은 릴루졸의 증가하는 복용량에 대하여 곡선으로 그려진(plotted) 전류의 트랜션트 부분의 크기를 나타내며, 파선 커브(310)는 전류의 지속 부분의 크기를 나타낸다. 사람에 대한 릴루졸의 치료적으로 수용가능한 복용량은 1 μM 내지 10 μM의 범위를 포함한다. 도 3(c)에서 볼 수 있고 이중 화살표(311)로 나타낸 바와 같이, 전류의 지속 부분의 크기의 감소가 트랜션트 부분의 크기의 감소 보다 더 상당히 크다.
도 3(a)와 마찬가지로, 도 3(b) 및 도 3(c)의 커브들은 상세한 실험 결과들을 기반으로 했다기 보다는 전류들을 설명하기 위한 스케치들이다.
하기에서 더 자세하게 설명되는 실험들은 여하한 암 세포 라인(line)들의 하나 이상의 전이 행동들에 대하여 라놀라진 및 릴루졸의 다양한 복용량 수치들에 대한 효과를 측정하기 위하여 실시되었다. 구체적으로 말하면, 세포들의 접착성, 이들의 측면 운동성, 이들의 침습성 및 이들의 수직 이동에 대한 하나 이상의 실험 측정들에서는, 다양한 복용량 수치들로 각각의 이러한 약물들에 대하여 이루어진다. 더욱더, 실험들은 세포들의 증식 활성도 및 세포들의 생존도에 대한 일부의 이러한 복용량의 효과(즉, 약물들이 세포들을 사멸시킬지에 대한 여부)를 결정하기 위하여 실시되었다.
실험들, 및 이들로부터 얻어진 정량적인 결과들을 설명하기 전에, 하기의 표들은 얻어지는 결과들을 정량적으로 요약한다. 이러한 표들, 및 실험들의 후속적인 상세한 논의 및 얻어지는 결과들로부터, 다양한 전이 행동들의 감소가 세포들의 증식에 영향을 미치지 않고 세포들을 사멸시키지 않으며 치료적으로 수용가능한 수치들에서 성취될 수 있다는 것을 볼 수 있다. 후자가 특히 중요할 수 있는데, 이는 사멸 치료가 중단된 후에 암이 더 공격적인 형태로 재발하므로, 세포들을 사멸시켜 암을 치료하는 것은 역효과를 낳을 수 있다고 최근 제안되어 왔기 때문이다. 그러므로, 암 세포들의 사멸 없이 암 세포들의 침습성을 방지하거나 감소시키는 것이, 세포들을 사멸시키는 통상적인 치료들보다 상당히 유리한 치료일 수 있다.
표 1 및 표 2는 인간의 유방암 세포들 및 쥐의 전립선암 세포들(쥐의 전립선 세포들은 인간의 전립선 세포들과 유사함)에 대하여 다양한 복용량 수치들의 라놀라진에 의한 실험들의 결과들을 요약한다. 표 3 및 표 4는 다양한 복용량 수치들의 릴루졸에 의해 동일한 세포 라인(line)들의 세포들을 치료함으로써 얻어지는 결과들을 요약한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
단일-세포 접착력 어세이 ( assay )
도 4는 Palmer et al.(2008)에 의한 논문에 첫번째로 설명된 단일-세포 접착력 측정 장치(single-cell adhesion measurement apparatus: SCAMA)의 개략적인 도이다.
MDA-MB-231 세포 라인(line)으로부터의 인간 유방암 세포들이 2.5 x 104 세포들/ml의 밀도로 평판 배양되었고, 측정 이전에 48시간 동안 세포 배양 접시(401) 내에 놓아두었다. 배지가 제거되었고, 연구 중에 2 ml의 약물이 10분 동안 적용되었다. 접착력은 플라스틱관(404)을 통하여 진공 펌프(403)에 연결된 유리 마이크로피펫(402)을 사용하여 측정되었다. 마이크로피펫의 선단(tip)은 약 20 ㎛(범위, 17 내지 24 ㎛) 선단 직경까지 길게 늘였다. 진공 펌프는 밀봉가능한 T-피스(piece)[406]의 오픈 엔드(open end)까지 썸(thumb)을 가압함으로써 마이크로피펫의 선단까지 부압(negative pressure)이 적용될 수 있도록, 리저버(reservoir)[405] 내부에 부압을 생성하기 위하여 사용되었다. 세포들은 램프(408)의 조명 하에서 20x 현미경 대물렌즈(microscope objective)를 사용하여 관찰되었다. 압력은 RS232 케이블(411)을 통하여 컴퓨터(410)와 연결된 디지털 압력계(digital manometer)[409]를 사용하여 측정되었다.
미세조작기(micromanipulator)[412]를 사용하여, 마이크로피펫(402)은 단일 세포의 주변부 상에 위치되었다. T-피스(406)를 폐쇄함으로써, 연구 하에서, 그리고 세포들이 배양 접시(401)로부터 분리된 것으로 관찰되는 그 순간에 세포에 부압이 적용되고, 상기 압력은 T-피스(406)를 개방함으로써 방출되었다. 세포를 분리하기 위하여 요구되는 부압은 압력 스파이크(pressure spike)로 컴퓨터에 기록되었다. 스파이크의 피크["분리 부압(detachment negative pressure: DNP)"]가 세포의 접착성의 척도로서 사용되었다. 이런 기술을 사용하여, 몇몇의 기록들이 수 분 내로 단일 접시로부터 얻어질 수 있었다.
세포들에 대하여 저산소 상태를 가정하기 위하여, 저산소 상태는 시험 전 마지막 24시간 동안 과산화수소(1 내지 500 μM)를 적용함으로써 화학적으로 유도된다.
주어진 효과의 가역성에 대하여 시험하기 위하여, 약리학적 작용제(pharmacological agent)가 세척되었고, 새로운 배지가 첨가되었으며, 플레이트가 재-측정 이전에 추가적으로 10분 동안 배양되었다. 각각의 처리가 2개 이상의 세포들의 접시들에서 실행되었고, 접시 당 100 이상의 세포들이 측정되었으며, 실험은 (대응되는 대조구들을 포함하여) 세 번 반복되었다.
측면 운동성 어세이
이 어세이는 국부적으로 확산되는 동안의 암 세포들의 "자유(free)" 운동성을 나타내기 위하여 사용되었다. 도 5(a)는 접시 표면 상에 세포들의 반-융합성 층(502)을 가지는 세포 배양 접시(501)의 상부로부터의 평면도이고, 세포들은 수상 배지(503) 내에 위치한다.
측면 운동성을 결정하기 위하여, "상처-회복(wound-heal)["스크래치"]" 시험이 실행되었고, 세포 배양 접시의 측면도인 도 5(b)에 나타낸 바와 같이, ~0.5 mm의 스크래치(504)가 세포들의 층을 통하여 만들어졌다. 스크래치의 형성 다음에 24시간의 기간 동안, 세포들이 간격(gap) 내로 이동하였다.
도 5(c) 및 도 5(d)는, 각각 스크래치(504)의 너비가 w0일 때에 시간 t = 0에서의 세포 배양 접시(501)의 개략적인 평면도, 그리고 스크래치(504)의 너비가 w24일 때에 시간 t = 24시간에서의 세포 배양 접시(501)의 개략적인 평면도이다.
수직 이동 어세이
이 어세이는 세포들이 관내/관외로 흘러나오게 하는 것처럼 세포들의 이동 능력을 나타내기 위하여 사용되었다. 도 6은 두 개의 구획(section)들로 챔버(chamber)를 분리시키는 트랜스웰 삽입물(Transwell® insert)[602]을 가지는 이동 챔버(migration chamber)[601]의 개략적인 측면도를 나타내고, 편의상 상기 삽입물은 챔버의 상부(upper) 구획(603)과 하부(lower) 구획(604)으로 언급될 것이다. 삽입물(602)은 이동 필터막(migration filter membrane)[605]을 가지며, 삽입물의 기저에는 8 ㎛ 구멍(606)들을 포함하며 이를 통하여 확산된다(extending).
세포(607)들이 필터막(605) 상에 2 x 104 세포들/ml의 밀도로 평판 배양되었고, 1 % 우태혈청(foetal bovine serum: FBS)을 함유하는 성장 배지(608) 하에 평판 배양되었다. 화학주화성 구배(chemotactic gradient)가 챔버의 하부 구획(604) 내에 10 % FBS를 함유하는 성장 배지(609)를 놓아둠으로써 필터막(605)을 가로질러 생성되었다.
세포들이 24시간의 기간 동안 필터막(605)을 가로질러 이동할 수 있게 하여, 세포들이 이동하여 필터막(605)의 아랫면에 부착되었다.
각각의 어세이의 마지막에, 이동하지-않은 세포들은 두 개의 상이한 면봉에 의해 삽입물(602)의 상부 표면에서 제거되었다.
삽입물(602)의 아랫면으로 이동한 세포들의 숫자는 크리스탈 바이올렛 염색(crystal violet staining)을 사용하여 결정되었다. 이동된 세포들은 얼음처럼 차가운(ice-cold) 메탄올로 15분 동안 고정되었다. 이후에, (25 % 메탄올 내의) 0.5 % 크리스탈 바이올렛이 15분 동안 첨가되었다. 삽입물들이 다시 닦아졌고, 이후에 물로 세정되었으며, 건조되도록 하였다. 이후에, 세포들은 삽입물 당 12개로 분리된 관측 시야(fields of view)[x 200 배율]를 사용하여 계수되었다.
침습성 어세이
이 어세이는 상기에 설명된 수직 이동 어세이의 연장이다. "침습(invade)"하기 위하여, 세포들은 (i) 수직 이동 어세이에서와 같이 이동하고 (ii) 이들의 주변들을 소화시키기 위한 단백질 분해 효소를 분비할 필요가 있다. 그러므로, 효소 분비에 의하여 주변 조직들을 침습하는 세포들의 능력은 트랜스웰® 삽입물의 다공성 막을 가로질러 확산되는 Matrigel™ (BD Biosciences 사)의 층을 사용함으로써 평가되었다. Matrigel™은 라미닌, 콜라겐 IV, 니도겐/에낙틴(enactin), 및 프로테오글리칸 - 기저막 단백질과 비슷한 조성물로 이루어진다.
도 7은 상부 구획(703) 및 하부 구획(704)으로 챔버를 분리시키는 트랜스웰® 삽입물(702)을 가지는 침습 챔버(invasion chamber)[701]의 개략적인 측면도이다. 삽입물(702)은 이동 필터막(705)을 가지며, 삽입물의 기저에는 8 ㎛ 구멍(706)들을 포함하며 이를 통하여 확산된다. Matrigel™의 층(707)은 필터막(705)을 코팅하는 것으로 나타낸다.
세포(708)들은 제조업자의 지시에 따라서 24-홈 판(well plate)들(Becton-Dickinson 사) 내에 Matrigel™ 층(707) 상에 2 x 104 세포들/ml의 밀도로 평판 배양되었다. 50 ㎕ Matrigel™이 삽입물들 상에 1:7 희석액(dilution)[10 mg/ml 저장용액(stock)]으로 파종(seeded)되었고, 하룻밤 동안 놓아두었다. 세포들의 파종 이전에, Matrigel™은 첨가물이 없는 배지를 사용하여 다시 수화시켰다. 이 배지는 세포들의 파종 이전에 제거되었다.
세포들은 하룻밤 동안(12 시간) 1 내지 5 % FBS 화학주화성 구배 내에서 평판 배양되었다. 챔버의 상부 구획(703) 내에 배지(709)의 영양소 농도는 하부 구획(704) 내에 배지(710) 내의 영양소의 농도 보다 더 낮게 하여, Matrigel™ 층(707) 및 구멍(706)들을 통하여 필터막(705)의 아랫면 쪽으로 세포들의 움직임을 유도하였다. 각각의 어세이의 마지막에, 비-침습된/이동되지-않은 세포들은 두 개의 상이한 면봉에 의해 삽입물(702)의 상부 표면에서 제거되었다.
삽입물(702)의 아랫면까지 침습한 세포들의 숫자는 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 결정되었다. 침습된 세포들은 얼음처럼 차가운 메탄올로 15분 동안 고정되었다. 이후에, (25 % 메탄올 내의) 0.5 % 크리스탈 바이올렛이 15분 동안 첨가되었다. 삽입물들이 다시 닦아졌고, 이후에 물로 세정되었으며, 건조되도록 하였다. 이후에, 세포들은 삽입물 당 12개로 분리된 관측 시야(x 200 배율)를 사용하여 계수되었다. 만약 두 개의 대조구 삽입물들에서 침습한 세포들의 평균 숫자의 차이가 40 %이상이라면, 그 실험은 폐기되었다.
세포 생존도 어세이
세포들이 Falcon사의 35 mm 조직 배양 접시들 내에 5 x 104 세포들/ml의 밀도로 파종되었다. 주어진 약물들로 처리한 후, 배지는 제거되었고, 800 ㎕의 성장 배지 및 200 ㎕ 0.4 % 트리판 블루(trypan blue)[Sigma, Dorset, UK]로 교체되었으며, 배양기 내에서 10분 동안 배양되었다. 트리판 블루가 제거되었고, 세포들은 3 ml 성장 배지와 함께 한 번 세정되었다. 각각의 처리에 대하여, 30개의 무작위 관측 시야로부터의 세포들이 1OOx 배율 하에서 계수되었다. 청색으로 염색된 죽은 세포들의 숫자는 각각의 관측 시야에서 계수되었다. 데이타는 주어진 관측 시야 내 세포들의 총 숫자 중에서 살아있는 세포들의 백분율로 표현되었다. 백분율은 평균을 내었고, 대조구와 실험구 사이의 차이들은 세 개 이상의 독립적인 실험들에서 비교되었다.
세포 성장(증식) 어세이
세포들은 24-홈 판들(Becton-Dickinson 사) 내에 2 x 104 세포들/ml로 평판 배양되었고, 하룻밤 동안 놓아두었다. 이후에, 세포들은 매 24시간 마다 배지를 교체하면서, 배양하기 위하여 요구되는 시간(24시간 +) 동안 처리되었다. 처리의 마지막에, 배지가 제거되었고, 비색분석(colorimetric) 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 어세이(Grimes et al., 1995)가 뒤이어졌다. 간단하게, 0.1 ml MTT(성장 배지 내에서 5 mg/ml로 구성됨) 및 0.4 ml 성장 배지가 각각의 홈에 첨가되고, 플레이트는 37 ℃에서 3 내지 4시간 동안 배양되었다. 이후에, 배지는 챔버들에서 제거되었고, 0.5 ml 디메틸 술폭사이드(DMSO) 및 0.063 ml 글리신 완충용액(0.1 M 글리신 및 0.1 M NaCl; pH 10.5)으로 교체되었다. 570 nm에서의 흡광도는 글리신 완충용액의 첨가 후에 15분 동안 결정되었다. 결과들은 개별적인 침습 홈들로부터 9번 반복한 각각의 실험구 vs. 대조구 분광광도계 판독의 평균으로 계산되었다.
조직 배양
실험들은 두 개의 강한 전이성 세포 라인들 상에서 실시되었다:
(i) 인간의 전이성 유방암 MDA-MB-231, 및
(ii) 쥐의 강한 전이성 전립선암 Mat-LyLu.
세포들은 알려진 방법들(예를 들어, Grimes et al, 1995; Fraser et al., 2005)을 사용하여 배양되었다.
정상 산소 상태 및 저산소 상태
단일 세포 접착력 시험들을 제외하고, 하기의 단락에서 논의되는, 실험들은:
(i) 정상 산소 상태(95 % 산소, 5 % 이산화탄소), 또는
(ii) 후속하는 24시간 동안 저산소 상태로 전-처리(2 % 02, 5 % C02, 93 % N2)가 어세이 동안 지속됨
중 하나의 하에서 수행되었다.
단일 세포 접착력 실험들에서, 저산소 상태는 24시간 동안 과산화수소(1 내지 500 μM)를 적용함으로써 화학적으로 유도되었다.
실시예들
실시예 1 - MDA - MB -231 세포들의 단일-세포 접착력에 대한 화학적 저산소 상태의 효과들
화학적 저산소 상태는 24시간 동안 상이한 농도들의 과산화수소로 세포들을 처리함으로써 유도되었다. 단일-세포 접착력은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 4에 도시되었다. 분리 부압의 변화(ΔDNP)는 처리되지 않은 세포들의 대조구 개체군에 대한 백분율로 표현되었다. 저산소 상태는 세포 접착력을 감소시키고, 과산화수소의 농도가 증가하는 것, 즉 저산소 상태의 정도가 증가하는 것은 도 8에 나타낸 것과 같이 세포 접착력에 대한 더 큰 감소에 이르게 한다. 상기 도에서, 세로축은 분리 부압의 변화(ΔDNP)를 나타내고, 아래쪽으로 내려갈수록 더 높은 부압 수치는 세포들의 더 낮은 접착력, 따라서 이의 분리의 경향을 나타낸다. 가로축은 과산화수소 농도의 대수 눈금(logarithmic scale)이고, 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
MDA-MB-231 세포 라인로부터의 인간의 유방암 세포들은 2.5 x 104 세포들/ml의 밀도로 세포 배양 접시 내에 평판 배양되었고, 측정 이전에 48시간 동안 놓아두었다. 세포들은 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 과산화수소 농도들로 적용되었고, 세포 배양 접시의 바닥에서부터 세포들이 분리되기 위하여 요구되는 부압이 측정되었다. 각각의 과산화수소 농도에서, 측정들은 접시 당 100개 이상의 세포들에 대하여 두 개 이상의 세포들의 접시들 상에서 이루어졌다. 실험은 세 번 반복되었고, 분리 부압의 측정들은 평균 ± SEM으로 도 8에 나타내었다.
도 8에서, 측정점(801)은 1 μM의 농도로 과산화수소에 노출된 세포들이 대략 -9 %의 평균 분리 부압을 가지는 것을 나타내고, 측정점(802)은 10 μM의 농도로 과산화수소에 노출된 세포들이 대략 -14 %의 평균 분리 부압을 가지는 것을 나타내며, 측정점(803)은 100 μM의 농도로 과산화수소에 노출된 세포들이 대략 -20 %의 평균 분리 부압을 가지는 것을 나타낸다. 따라서, 과산화수소의 농도가 증가하는 것은 세포들의 접착력을 감소시키고, 이는 세포들을 분리되기 쉽게 하였다. 다시 말해서, 저산소 상태의 강도(severity)가 증가하는 것이 세포들의 분리 가능성(detachability)의 증가로 이어졌다.
실시예 2 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 단일-세포 접착력에 대한 라놀라진의 효과들
단일-세포 접착력은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 4에 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 라놀라진의 상이한 농도들에 노출된 인간의 MDA-MB-231 세포들에 대하여 도시되었다. 라놀라진은 복용량 의존 방식으로 정상 산소 상태 하에서 세포들의 기질 접착력을 증가시켰다. 세포들의 접착력에 대한 복용량-의존 증가는 저산소 상태 하에서 훨씬 더 뚜렷하였다 - 도 9 참조. 상기 도에서, 세로축은 세포들의 접착력의 측정을 나타낸다. 가로축은 라놀라진 농도의 대수 눈금이고, 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다. 데이타는 각각의 상태에 대한 n = 7 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM로 도 9에 나타내었다.
MDA-MB-231 세포 라인으로부터의 인간의 유방암 세포들은 2.5 x 104 세포들/ml의 밀도로 세포 배양 접시들 내에 평판 배양되었고, 측정 이전에 48시간 동안 놓아두었다.
정상 산소 상태에서의 실험[커브(901)]에서, 상이한 접시들에 평판 배양된 세포들은 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM 및 100 μM의 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 가장 낮은 농도인 0.1 μM에서, 라놀라진은 세포들의 접착력에 대하여 효과를 갖지 않았다. 라놀라진의 0.5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM 및 100 μM의 농도들에서, 접착력은 복용량 의존 방식으로 증가하였고; 접착력에 대한 양의 증가는 100 μM 라놀라진의 농도에서 수평을 유지하는 것으로 나타났다.
저산소 상태에서의 실험[커브(902)]에서, 저산소 상태는 24시간 동안 과산화수소(50 μmol)로 세포들을 처리함으로써 화학적으로 유도되었다. 상이한 접시들에 평판 배양된 세포들은 0.1 μM, 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 라놀라진의 가장 낮은 농도인 0.1 μM에서 조차도, 저산소 상태의 세포들의 접착력이 증가하고, 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도의 라놀라진에 대하여 복용량 의존 방식으로 증가가 지속되었다. 접착력에 대한 양의 증가는 100 μM의 농도에서 수평을 유지하는 것으로 나타났다. 정상 산소 상태 및 저산소 상태에서의 실험들에 대한 커브들 및 라놀라진은 이러한 농도 주변에서 수렴하는 것으로 나타났다.
정상 산소 상태[커브(901)] 및 저산소 상태[커브(902)] 하에서 세포들의 접착력에 대한 라놀라진의 효과들의 비교하면, 라놀라진의 효과는 높은 약물 농도들에서 수렴하기 전에, 저산소 상태에서 대략 10배 더 컸다.
실시예 3 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 측면 운동성에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 측면 운동성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 5에 도시되었다.
도 10을 참조하면, 세로축은 측정된 세포들의 운동성 지표를 나타내고, 정상적인 운동성에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플[막대 그래프의 블록(1001)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
블록(1005)은 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들에 대하여 대조구 샘플(약물 없음)로부터 얻어진 결과이다. 블록(1001)과 블록(1005)을 비교하면, 저산소 상태에서 운동성이 증가한다는 것을 볼 수 있다.
MDA-MB-231 세포 라인으로부터의 인간의 유방암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 운동성은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1001), 블록(1002), 블록(1003) 및 블록(1004)으로 도 10에 나타냈다. 라놀라진의 농도 증가는 세포들의 측면 운동성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 100 μM 농도의 라놀라진에서의 감소가 통계적으로 상당히 컸다.
유사하게, 저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 운동성은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1005), 블록(1006), 블록(1007) 및 블록(1008)로 도 10에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 세포들의 측면 운동성을 감소켰고, 시험된 각각의 라놀라진의 농도는 세포들의 측면 운동성에 대하여 통계적으로 상당한 감소를 가져왔다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성(significance)을 나타내며; (**)는 P < 0.01에서 유의성을 나타낸다.
실시예 4 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 수직 이동에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 수직 이동은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 6에 도시하였다.
도 11을 참고하면, 세로축은 측정된 세포들의 수직 이동에 대한 상대적인 수치들을 나타내고, 정상적인 수직 이동에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플[블록(1101)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
블록(1105)은 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들에 대하여 대조구 샘플(약물 없음)로부터 얻어진 결과이다. 블록(1101)과 블록(1105)을 비교하면, 저산소 상태에서 수직 이동이 증가한다는 것을 볼 수 있다.
MDA-MB-231 세포 라인으로부터의 인간의 유방암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1101), 블록(1102), 블록(1103) 및 블록(1104)으로 도 11에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 세포들의 수직 이동을 아주 조금 감소시켰고, 결과들은 통계적으로 상당히 크지 않았다.
저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1105), 블록(1106), 블록(1107) 및 블록(1108)로 도 11에 나타냈다. 1 μM 및 10 μM의 농도에서의 라놀라진은 세포들의 수직 이동을 통계적으로 상당히 크게(significant way) 감소시켰고; 100 μM의 농도에서의 라놀라진도 세포의 수직 이동을 감소시켰으나, 이 감소는 통계적으로 상당히 크지 않았다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성을 나타낸다.
실시예 5 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태(사전-처리 없음) 하에서 MDA - MB -231 세포들의 침습성에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 침습성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 7에 도시하였다.
도 12를 참고하면, 세로축은 측정된 세포들의 침습성에 대한 상대적인 수치들을 나타내고, 정상적인 침습성에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플[블록(1201)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
또한, 도 12는 추가적인 한 쌍의 대조구에 대한 결과들을 포함하며, 도면에서 블럭(1202) 및 블럭(1208)로 표시하였다. 이러한 추가적인 대조구들에서, 세포들은 독소인 테트로도톡신(tetrodotoxin: TTX)에 노출되었고, 이의 결합 부위는 VGSC의 개방된 구멍에 위치된다. TTX 측정은 나트륨 채널 활성화가 실험 하에서 전이성 세포 행동에 정말로 기여(강화)하는지 확인하는 결정적인(positive) 대조구이다. 이는 여기서 사용된 TTX의 농도들(10 μmol)에서, TTX의 차단이 전부가 아니라는 것에 주목해야 한다. 따라서, 특히 시험된 고농도들에서, 약물(라놀라진)이 독소(TTX)보다 더 효능이 있는 것으로 나타났다.
블록(1207)은 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들에 대하여 대조구 샘플(약물 없음)로부터 얻어진 결과이다. 블록(1201)과 블록(1207)을 비교하면, 저산소 상태에서 침습성이 증가한다는 것을 볼 수 있다.
MDA-MB-231 세포 라인으로부터의 인간의 유방암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 침습성은 이들을 약물 없이(대조구), 그리고 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1201), 블록(1203), 블록(1204), 블록(1205) 및 블록(1206)으로 도 12에 나타냈다. 라놀라진으로의 처리는 10 μM, 20 μM 및 300μM의 농도에서 세포들의 이동이 감소하였으나, 농도 50 μM의 라놀라진의 효과는 통계적으로 대단히 크지 않았다.
저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 이들을 약물 없이(대조구), 그리고 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1207), 블록(1209), 블록(1210), 블록(1211), 블록(1212) 및 블록(1213)으로 도 12에 나타냈다. 라놀라진으로의 처리는 20 μM, 50 μM 및 300μM의 농도들에서 세포들의 이동이 감소하였으나, 농도 5 μM 및 10 μM의 라놀라진의 효과는 통계적으로 대단히 크지 않았다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성을 나타내며; (**)는 P < 0.01에서 유의성을 나타낸다.
실시예 6 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태(세포들의 사전-처리 포함) 하에서 MDA - MB -231 세포들의 침습성에 대한 라놀라진의 효과들
저산소 상태 하에서 낮은 농도의 라놀라진에 대한 침습성의 감소로서는 통계적으로 상당히 크지 않았으며, 수정된 형태(version)의 침습성 어세이가 실시되었고, 여기서 세포들은 대응되는 대조구 상태들(즉, 라놀라진이 적용되지 않음)과 비교하여 상이한 기간들 동안 라놀라진으로 사전-처리되었다.
도 13(a) 및 도 13(b)는 생체 외 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 침습에 대한 5 μM 라놀라진(ran)의 효과를 나타낸다. 막대 그래프는 대응되는 대조구 상태들(즉, 라놀라진이 적용되지 않음)과 비교하여 상이한 기간들 동안 5 μM 라놀라진으로의 처리가 뒤따르는 침습된 MDA-MB-231 세포들의 숫자를 나타낸다.
도 13(a)에서, 블록(1301)은 어세이 중 24시간 동안 세포들의 침습에 대한 대조구 상태들(약물 없음) 하에서 얻어진 침습성을 나타낸다. 블록(1302)는 어세이 중(사전-처리 없음) 5 μM 라놀라진으로 처리되고 24시간 동안 침습된 세포들에 대한 침습성 결과를 나타낸다. 5 μM 라놀라진으로 처리된 세포들의 침습성에 대한 효과는 통계적으로 상당히 크지 않았다.
도 13(b)에서, 블록(1303)은 어세이 중 24시간 동안 세포들에 대한 대조구 상태들(약물 없음)[즉, 사실상 사전-처리가 사용되지 않음] 하에서 얻어진 침습성 결과를 나타낸다. 블록(1304)는 어세이 중 72시간 동안 5 μM 라놀라진으로 사전-처리되고 24시간 동안 침습된 세포들에 대한 침습성 결과를 나타낸다. 여기서 72시간 동안 5 μM 라놀라진으로 처리된 세포들에 대한 침습성에 매우 상당히 큰 감소가 있었다.
각각의 도 13(a) 및 도 13(b)에서, "세포들의 침습(cells invading)"의 숫자는 두 개의 분리된 삽입물들(실험들)로부터 24개의 무작위로 선택된 시야 내에서 계수된 세포 숫자의 평균을 나타낸다.
도 13(c) 내지 도 13(e)는 생체 외 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 침습에 대한 25 μM 라놀라진(ran)의 효과를 나타낸다. 막대 그래프는 대응되는 대조구 상태들(즉, 라놀라진이 적용되지 않음)과 비교하여 상이한 기간들 동안 25 μM 라놀라진으로의 처리가 뒤따르는 침습된 MDA-MB-231 세포들의 숫자를 나타낸다.
도 13(c)에서, 블록(1305)는 어세이 중 24시간 동안 세포들의 침습에 대한 대조구 상태들(약물 없음)[즉, 사실상 사전-처리가 사용되지 않음] 하에서 얻어진 침습성 결과를 나타낸다. 블록(1306)은 어세이 중 25 μM 라놀라진으로 처리되고 24시간 동안 침습된 세포들에 대한 침습성 결과를 나타낸다. 5 μM 라놀라진으로 처리된 세포들은 처리되지 않은 세포들보다 통계적으로 상당히 덜 침습적이었다.
도 13(d)에서, 블록(1307)은 24시간 동안 약물 없이 유지되고, 측정 이전까지 후속하는 24시간 동안 침습되는 세포들에 대한 대조구 상태들 하에서 얻어진 침습성 결과를 나타낸다. 블록(1308)은 24시간 동안 25 μM 라놀라진으로 사전-처리되고, 측정 이전까지 후속하는 24시간 동안 침습되는 세포들에 대한 침습성 결과를 나타낸다. 24시간의 긴 어세이가 시작되기 전에 24시간 동안 25 μM 라놀라진으로 사전-처리된 세포들은 처리되지 않은 세포들보다 상당히 덜 침습적이었다.
도 13(e)에서, 블럭(1309)는 48시간 동안 약물 없이 유지되고, 측정 이전까지 후속하는 24시간 동안 침습되는 세포들에 대한 대조구 상태들 하에서 얻어진 침습성 결과를 나타낸다. 블럭(1310)은 48시간 동안 25 μM 라놀라진으로 사전-처리되고, 측정 이전까지 후속하는 24시간 동안 침습되는 세포들에 대한 침습성 결과를 나타낸다. 또한, 24시간의 긴 어세이가 시작되기 전에 48시간 동안 25 μM 라놀라진으로 사전-처리된 세포들은 처리되지 않은 세포들보다 상당히 덜 침습적이었다.
상기에서와 같이, 각각의 도 13(c) 내지 도 13(e)에서, "세포들의 침습"의 숫자는 두 개의 개별적인 실험들로부터 24개의 무작위로 선택된 시야 내에서 계수된 세포 숫자의 평균을 나타낸다.
시험된 농도들(5 μM 및 25 μmol) 둘 모두에서, 라놀라진으로의 세포들의 사전-처리는 이들의 침습성에 있어서 통계적으로 상당히 큰 감소를 야기하였다. 생체 외 시험에 있어서 약물에 의한 이러한 세포들의 사전-처리는, 환자가 지속적으로 치료 용량(therapeutic dose)의 약물을 받아들이는 생체 내 치료를 대표하는 것으로 간주된다.
실시예 7 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 성장에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 성장은 "세포 성장(증식) 어세이"라는 표제로 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었다.
도 14를 참고하면, 세로축은 평판 배양된 샘플 내에 총 세포수(total cell number)를 나타내고, 정상적인 성장에 대한 기준점은 각각 시작 단계(commencement), 24시간 후 및 48시간 후에서의, 약물 없이 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플들[블록(1401), 블록(1405) 및 블록(1409)]로 나타낸다. 가로축을 가로질러, 세 개의 결과의 세트들은 성장의 시작, 24시간 후 및 48시간 후에 실시된 측정들에 대하여 나타난다. 여기서, "성장"이라는 용어는 세포 증식 및 세포 죽음을 포함하고, 이 어세이 내에서, 약물의 유무 모두, 시간이 흐르면서 세포들의 숫자의 전반적인 증가가 있었다. 각각의 세 개의 결과의 세트들에서, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
MDA-MB-231 세포 라인의 인간의 유방암 세포들은 정상 산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다.
시작 단계(0 시간)에서, 세포들의 숫자는 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블럭(1401), 블럭(1402), 블럭(1403) 및 블럭(1404)으로 도 14에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 시작 단계에서 세포 숫자에 영향을 미치지 않았다.
24시간 후, 각각의 라놀라진 농도에서 세포들의 숫자가 다시 계수되었다. 결과들은 각각 블럭(1405), 블럭(1406), 블럭(1407) 및 블럭(1408)로 도 14에 나타냈다. 여기에서, 대조구 샘플의 세포들의 숫자[블록(1405)]와, 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리된 샘플들의 세포들의 숫자[각각, 블럭(1406), 블럭(1407) 및 블럭(1408)] 간에 상당히 큰 차이는 없었다.
후속하는 24시간 후(총 48시간), 각각의 라놀라진 농도에서 세포들의 숫자가 다시 계수되었다. 결과들은 각각 블럭(1409), 블럭(1410), 블럭(1411) 및 블럭(1412)로 도 14에 나타냈다. 여기에서, 대조구 샘플의 세포들의 숫자[블록(1409)]와, 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리된 샘플들의 세포들의 숫자[각각, 블럭(1410), 블럭(1411) 및 블럭(1412)] 간에 통계적으로 상당히 큰 차이는 없었다.
유사하게, 저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 운동성은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1005), 블록(1006), 블록(1007) 및 블록(1008)로 도 10에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 세포들의 측면 운동성을 감소켰고, 각각의 라놀라진의 농도가 통계적으로 상당한 크다는 결과를 가졌다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다.
또한, 저산소 상태 하에서 동일한 농도의 라놀라진은 MDA-MB-231 세포들의 성장에 영향을 미치지 않았다(결과들을 도 14에 나타내지 않음).
실시예 8 - 정상 산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 생존도에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 생존도는 "세포 생존도 어세이"라는 표제로 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었다.
도 15를 참고하면, 세로축은 평판 배양된 샘플 내에 세포들의 상대적인 생존도를 나타내고, 정상적인 생존도에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플[블록(1501)]로 나타낸다. 세포들의 상이한 샘플들을 처리한 라놀라진의 농도는 가로축에 나타냈고, 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
MDA-MB-231 세포 라인으로부터의 인간의 유방암 세포들은 정상 산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 세포들의 생존도는 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 1 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도들로의 라놀라진으로 48시간 동안 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1501), 블록(1502), 블록(1503) 및 블록(1504)로 도 15에 나타냈다. 세포 생존도에 대한 라놀라진의 효과는 없었다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다.
실시예 9 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat - LyLu 세포들의 수직 이동에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 수직 이동은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 6에 도시하였다.
도 16을 참고하면, 세로축은 측정된 세포들의 수직 이동에 대한 상대적인 수치들을 나타내고, 정상적인 수직 이동에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 Mat-LyLu 세포들의 대조구 샘플[블록(1601)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
또한, 도 16은 추가적인 한 쌍의 대조구에 대한 결과들을 포함하며, 도면에서 블럭(1602) 및 블럭(1607)로 표시하였다. 이러한 추가적인 대조구들에서, 세포들은 독소인 테트로도톡신(TTX)에 노출되었고, 이의 결합 부위는 VGSC의 개방된 구멍에 위치된다. TTX 측정은 나트륨 채널 활성화가 정말로 실험 하에서 전이성 세포 행동에 기여(내지 강화)하는지 확인하는 결정적인 대조구이다. 이는 여기서 사용된 TTX의 농도(1 μmol)에서, TTX의 차단이 전부가 아니라는 것에 주목해야 한다. 따라서, 특히 시험된 고농도들에서, 약물(라놀라진)이 독소(TTX)보다 더 효능이 있는 것으로 나타났다.
블록(1606)은 저산소 상태 하에서의 Mat-LyLu 세포들에 대하여 대조구 샘플(약물 없음)로부터 얻어진 결과이다. 블록(1601)과 블록(1606)을 비교하면, 저산소 상태에서 수직 이동이 증가한다는 것을 볼 수 있다.
Mat-LyLu 세포 라인으로부터의 쥐의 전립선암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1601), 블록(1603), 블록(1604) 및 블록(1605)로 도 16에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 라놀라진 20 μM 및 50 μ의 농도들에서 세포들의 수직 이동을 감소시켰다. 농도 300 μM에서의 수직 이동에 대한 라놀라진의 효과는 통계적으로 상당히 크지 않았다.
저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 이들을 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1606), 블록(1608), 블록(1609) 및 블록(1610)으로 도 16에 나타냈다. 각각, 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들에서의 라놀라진은 세포들의 수직 이동을 통계적으로 상당히 크게(significant way) 감소시켰다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n ≥ 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 대조구와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타낸다.
실시예 10 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 Mat - LyLu 세포들의 침습성에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 침습성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 7에 도시하였다.
도 17을 참고하면, 세로축은 측정된 세포들의 침습성에 대한 상대적인 수치들을 나타내고, 정상적인 침습성에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 Mat-LyLu 세포들의 대조구 샘플[블록(1701)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다.
또한, 도 17은 추가적인 한 쌍의 대조구에 대한 결과들을 포함하며, 도면에서 블럭(1702) 및 블럭(1707)로 표시하였다. 이러한 추가적인 대조구들에서, 세포들은 독소인 테트로도톡신(TTX)에 노출되었고, 이의 결합 부위는 VGSC의 개방된 구멍에 위치된다. TTX 측정은 나트륨 채널 활성화가 실험 하에서 전이성 세포 행동에 정말로 기여(강화)하는지 확인하는 결정적인 대조구이다. 이는 여기서 사용된 TTX의 농도(1 μM)에서, TTX의 차단이 전부가 아니라는 것에 주목해야 한다. 따라서, 특히 시험된 고농도들에서, 약물(라놀라진)이 독소(TTX)보다 더 효능이 있는 것으로 나타났다.
블록(1706)은 저산소 상태 하에서의 Mat-LyLu 세포들에 대하여 대조구 샘플(약물 없음)로부터 얻어진 결과이다. 블록(1701)과 블록(1706)을 비교하면, 저산소 상태가 세포들의 침습성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않는다.
Mat-LyLu 세포 라인으로부터의 쥐의 전립선암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 침습성은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1701), 블록(1703), 블록(1704) 및 블록(1705)로 도 17에 나타냈다. 라놀라진의 처리는 세포들의 이동을 각각의 시험된 라놀라진의 농도들에서 통계적으로 상당히 크게(significant way) 감소시켰다.
저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 이동은 세포들을 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1706), 블록(1708), 블록(1709) 및 블록(1710)으로 도 17에 나타냈다. 라놀라진의 처리는 세포들의 이동을 각각의 시험된 라놀라진의 농도들에서 통계적으로 상당히 크게(significant way) 감소시켰다.
데이타는 각각의 상태에 대하여 n ≥ 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 정상 산소 상태의 대조구와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타내고; (*)는 정상 산소 상태 및 저산소 상태 둘 모두와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타낸다.
실시예 11 - Mat - LyLu 세포들의 성장에 대한 라놀라진의 효과들
세포들의 성장은 "세포 성장(증식) 어세이"라는 표제로 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었다.
도 18을 참고하면, 세로축은 평판 배양된 샘플 내에 총 세포수(total cell number)를 나타내고, 정상적인 성장에 대한 기준점은 약물 없이 정상 산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들의 대조구 샘플[블록(1801)]로 나타내며, 100 %로 표준화되었다. 가로축을 가로질러, 정상 산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트는 왼쪽편 상에 나타냈고, 저산소 상태 하에서 실행된 실험들에 대한 결과들의 세트들은 오른쪽편 상에 나타냈다. 각각의 결과들의 세트에 대하여, 사용된 라놀라진의 농도는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다. "성장"이라는 용어는 세포 증식 및 세포 죽음을 포함한다는 것에 주목한다.
Mat-LyLu 세포 라인으로부터의 쥐의 전립선암 세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 정상 산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 숫자는 세포들을 24시간 동안 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1801), 블록(1802), 블록(1803) 및 블록(1804)로 도 18에 나타냈다. 라놀라진의 농도 증가는 세포들의 숫자에 대하여 여하한 통계적으로 상당히 큰 효과를 가져 오지(result) 않았다.
유사하게, 저산소 상태에서의 실험들에서, 세포들의 숫자는 이들을 약물 없이(대조구), 그리고 20 μM, 50 μM 및 300 μM의 농도들로의 라놀라진으로 24시간 동안 처리한 후에 측정되었다. 결과들은 각각 블록(1805), 블록(1806), 블록(1807) 및 블록(1808)로 도 18에 나타냈다. 라놀라진의 농도의 증가는 라놀라진 20 μM 및 50 μ의 농도들에서 세포들의 숫자에 여하한 통계적으로 상당히 큰 영향을 가져 오지 않았다. 농도 300 μM에서, 세포들의 숫자에 감소가 있었다.
요약하면, Mat-LyLu 세포들의 성장은 저산소 상태 하에서 300 μΜ 라놀라진을 제외하고 시험된 모든 상태들에서 변하지 않았다. 데이타는 각가의 상태에 대한 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 정상 산소 상태의 대조구 및 저산소 상태의 대조구 둘 모두와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타내는 동시에, (x)는 통계적인 차이가 없음을 나타낸다.
실시예 12 - Mat - LyLu 세포들의 생존도에 대한 라놀라진의 효과들
세포들은 정상 산소 상태 또는 저산소 상태(2 % 02) 하에서 24시간 동안 [20 μM], [50 μM] 및 [300 μM]로의 상이한 농도들의 라놀라진으로 처리되었다. 얻어진 결과들은 도 19에 나타냈다. 정상 산소 상태 또는 저산소 상태 하에 세포들이 있었는지의 여부, 및 농도에 상관없이 세포 생존도에 대한 라놀라진의 효과는 없었다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다.
실시예 13 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 측면 운동성에 대한 릴루졸의 효과들
세포들의 측면 운동성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 5에 도시되었다. 도 20을 참조하면, 막대 그래프의 블록(2001)은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플에 대한 운동성 지표를 나타내고, 100 %로 표준화되었다. 블록(2005)는 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들에 대한 대응되는 대조구 샘플(약물 없음)이다. 블록(2001)과 블록(2005)을 비교하면, 저산소 상태가 운동성을 상당히 크게 증가시킨다는 것을 볼 수 있다.
세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 릴루졸([1 μM], [10 μM] 및 [100 μM])로 처리되었다. 릴루졸 농도의 증가는 세포들의 측면 운동성을 감소시켰고; 효과는 저산소 상태 하에서 더 컸다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 5 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성을 나타내며; (**)는 P < 0.01에서 유의성을 나타낸다.
실시예 14 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 수직 이동에 대한 릴루졸의 효과들
세포들의 수직 이동은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 6에 도시되었다. 도 21을 참조하면, 블록(2101)은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 MDA-MB-231 세포들의 대조구 샘플에 대하여 관찰된 수직 이동의 비율을 나타내고, 100 %로 표준화되었다. 블록(2105)는 저산소 상태 하에서 MDA-MB-231 세포들에 대한 대응되는 대조구 샘플(약물 없음)이다. 블록(2101)과 블록(2105)을 비교하면, 저산소 상태는 수직 이동을 증가시켰으나, 증가는 완료된 시험의 숫자에 대해서 통계적으로 상당히 크지 않았다.
세포들은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 상이한 농도들의 릴루졸([1 μM], [10 μM] 및 [100 μM])로 처리되었다. 정상 산소 상태 하에서, 릴루졸에 의한 처리는 1 μM 및 100 μ의 농도들에서 세포들의 수직 이동에 통계적으로 상당히 크게 감소시켰다. 저산소 상태 하에서, 릴루졸 농도의 증가는 수직 이동을 통계적으로 상당히 크게 감소시켰다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성을 나타낸다.
실시예 15 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태(사전-처리 없음) 하에서 MDA -MB-231 세포들의 침습성에 대한 릴루졸의 효과들
세포들의 침습성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 7에 도시되었다. 결과들은 도 22에 나타낸다. 5 μM의 농도에서의 릴루졸은 사전-처리하지 않았음에도 불구하고 상당히 크게 침습성을 억제하였다. "세포들의 침습"의 숫자는 두 개의 개별적인 삽입물들(실험들)에서 24개의 무작위로 선택된 시야 내에서 계수된 세포 숫자의 평균을 나타낸다.
실시예 16 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태(72시간 사전-처리) 하에서 MDA -MB-231 세포들의 침습성에 대한 릴루졸의 효과들
세포들의 침습성은 도 6에 대하여 상기에 설명된 바와 같은 동일한 기술을 사용하여 측정되었고, 세포들은 농도 5 μM의 릴루졸로 72시간 동안 사전-처리되었다. 결과들은 도 23에 나타낸다. 또한, 5 μM의 농도로 72시간 동안 릴루졸에 의해 사전-처리된 세포들은 침습성을 상당히 크게 억제하였다. 상기에서와 같이, "세포들의 침습"의 숫자는 두 개의 개별적인 삽입물들에서 24개의 무작위로 선택된 시야 내에서 계수된 세포 숫자의 평균을 나타낸다.
실시예 18 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 성장에 대한 릴루졸의 효과들
세포들은 48시간 동안 [1 μM], [10 μM] 및 [100 μM]로의 상이한 농도들의 릴루졸로 처리되었다. 얻어진 결과들은 도 24에 나타냈다. 100 μM의 농도에서의 릴루졸은 24시간에서 및 48시간 후에 통계적으로 상당히 크게 세포들의 증식을 억제하였다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성 있는 수치(significant level)를 나타낸다.
실시예 19 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 MDA - MB -231 세포들의 생존도에 대한 릴루졸의 효과들
세포들은 48시간 동안 [1 μM], [10 μM] 및 [100 μM]로의 상이한 농도들의 릴루졸로 처리되었다. 얻어진 결과들은 도 25에 나타냈다. 10 μM 및 100 μM의 농도에서의 릴루졸은 세포 생존도를 감소시켰다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 P < 0.05에서 유의성 있는 수치를 나타낸다.
또한, 저산소 상태 하에서 동일한 농도의 라놀라진은 MDA-MB-231 세포들의 성장에 영향을 미치지 않았다(결과들을 도 25에 나타내지 않음).
실시예 20 - 정상 산소 상태 및 저산소 상태(사전-처리 없음) 하에서 Mat -LyLu 세포들의 Matrigel ™ 침습성(invasion)에 대한 릴루졸의 효과들
세포들의 침습성은 상기에 설명된 기술을 사용하여 측정되었고, 도 7에 도시되었다. 도 26을 참조하면, 블록(2601)은 약물 없이 정상 산소 조건 하에서의 Mat-LyLu 세포들의 대조구 샘플에 대하여 관찰된 침습성 표지를 나타내고, 100 %로 표준화되었다. 블록(2604)는 저산소 상태 하에서 Mat-LyLu 세포들에 대한 대응되는 대조구 샘플(약물 없음)이다. 블록(2601)과 블록(2604)를 비교하면, 저산소 상태가 통계적으로 상당히 크게 침습성을 증가시키는 것을 볼 수 있다.
1 μM의 농도에서의 릴루졸은 사전-처리하지 않았음에도 불구하고 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 침습성을 상당히 크게 억제하였다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n ≥ 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 대조구와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타낸다.
실시예 21 - Mat - LyLu 세포들의 성장에 대한 릴루졸의 효과들
세포들은 정상 산소 상태 또는 저산소 상태(2 % 02) 하에서 24시간 동안 [3 μM], [5 μM], [10 μM] 및 [30 μM]로의 상이한 농도들의 릴루졸로 처리되었다. 얻어진 결과들은 도 27에 나타냈다. 릴루졸은 정상 산소 상태 및 저산소 상태 하에서 복용량에 의존적으로 세포 증식을 감소시켰고; 효과는 저산소 상태 하에서 더 컸다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 얻어졌고, 평균 ± SEM으로 나타내었다. (*)는 대조구와 비교하여 P < 0.05에서 유의성을 나타내고; (x)는 통계적인 차이가 없음을 나타낸다.
실시예 22 - Mat - LyLu 세포들의 생존도에 대한 릴루졸의 효과들
세포들은 정상 산소 상태 또는 저산소 상태(2 % 02) 하에서 24시간 동안 [10 μM], [30 μM] 및 [100 μM]로의 상이한 농도들의 릴루졸로 처리되었다. 결과들은 도 28에 나타냈다. 세포 생존도에 대한 릴루졸(10 내지 100 μM)의 효과는 없었다. 데이타는 각각의 상태에 대하여 n = 3 독립적인 실험들로부터 수집되었고, 평균 ± SEM으로 나타내었다.
본 발명은 주로 라놀라진 및 릴루졸에 관하여 설명되었으나, 트랜션트 전류를 제거하지 않고 지속적인(persistent) VGSC 전류를 감소시키는 효과가 없는 여타의 물질들, 예를 들어 발포레이트(valporate), 플레카나이드(flecainide), 리도카인(lidocaine), 멕시레틴(mexiletine) 또는 F15845가 사용될 수 있다.
더욱더, 본 발명은 주로 유방암 및 전립선암에 관하여 설명되었으나, 전압 개폐 나트륨 채널들을 발현하는 모든 전이성 암들에 적용할 수 있다.
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Claims (26)

  1. 암을 발현하는 VGSC에서 전이 행동(metastatic behaviour)을 감소시키거나 방지하기 위한 라놀라진(Ranolazine).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암이 유방암인 라놀라진.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 암이 전립선암인 라놀라진.
  4. 직접적으로 암 세포들을 사멸시키지 않고, 암을 발현하는 VGSC에서 전이 행동을 감소시키거나 방지하기 위한 릴루졸(Riluzole).
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 암이 유방암인 릴루졸.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 암이 전립선암인 릴루졸.
  7. 트랜션트 부분(transient part)을 제거하지 않고 전압 개폐 나트륨 채널(voltage gated sodium channel) 전류의 지속 부분(persistent part)을 적어도 감소시키는 효과에 의해 VGSC 발현 암 내에서의 전이 행동을 방지하거나 감소시키는 물질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    유방암인 경우에 상기 효과를 가지는 물질.
  9. 제 7 항에 있어서,
    전립선암인 경우에 상기 효과를 가지는 물질.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효과가 세포들을 사멸시키지 않는 물질.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효과가 실질적으로 증식에 영향을 미치지 않는 물질.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복용량 수치가 1 μmol 내지 10 μmol의 범위에 대응되는 라놀라진.
  13. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복용량 수치가 1 μmol 내지 10 μmol의 범위에 대응되는 릴루졸.
  14. 라놀라진을 투여하는 단계를 포함하는 VGSC 발현 암 내에서 전이 행동을 방지하거나 감소시키는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 암이 유방암인 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 암이 전립선암인 방법.
  17. 직접적으로 암 세포들을 사멸시키기 않고 릴루졸을 투여하는 방법을 포함하는, VGSC 발현 암 내에서 전이 행동을 방지하거나 감소시키는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 암이 유방암인 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 암이 전립선암이 방법.
  20. 트랜션트 부분을 제거하지 않고 적어도 전압 개폐 나트륨 채널 전류의 지속 부분을 감소시키는 효과를 가지는 약물을 투여함으로써, VGSC 발현 암 내에서 전이 행동을 방지하거나 감소시키는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 암이 유방암인 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 암이 전립선암인 방법.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포들을 사멸시키지 않고 수행되는 방법.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 증식에 영향을 미치지 않고 수행되는 방법.
  25. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 라놀라진이 1 μmol 내지 10 μmol의 범위에 대응되는 복용량 수치로 투여되는 방법.
  26. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 릴루졸이 1 μmol 내지 10 μmol의 범위에 대응되는 복용량 수치로 투여되는 방법.
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