KR20140018798A - 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제 - Google Patents
지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 액상 제제는 또한 다회 사용시 미생물 오염 방지를 목적으로 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 액상 제제는 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없이 저농도 및 고농도의 인슐린분비 펩타이드 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 나타낸다.
Description
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것이다.
당뇨병은 다수의 병인 인자로부터 유래된 질환으로서 일반적으로 2가지 유형의 당뇨병이 인식되어 있다. I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)에서, 환자는 당 이용을 조절하는 호르몬인 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 못한다. II형 당뇨병 또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 (NIDDM)에서, 환자는 비당뇨병 환자와 동일한 또는 비당뇨병 환자에 비해 상승된 혈장 인슐린 농도를 보인다. 그러나 상기 환자는 주요 인슐린-감수성 조직, 즉 근육, 간 및 지방 조직에서 당 및 지질 대사에 대한 인슐린 자극 효과에 대한 내성을 발달시킨다. 혈장 인슐린 농도는 상승되지만 현저한 인슐린 내성을 극복하기에 불충분하여 고혈당증을 야기한다. 지속되는 또는 조절되지 않은 고혈당증은 증가한 조기 이환률 및 사망률과 관련되어 있다. 종종 비정상적인 당항상성은 지질, 지단백질 및 아포지단백질 대사 및 다른 대사적 혈역학적 질환의 변화와 직접적으로 및 간접적으로 관련되어 있다. 예를 들어, II형 진성 당뇨병을 앓는 환자는 특히 관상 심장 질환, 졸중, 말초 혈관 질환, 고혈압, 신장병증 및 신경병증을 비롯한 거대혈관 및 미세혈관 합병증을 앓을 위험이 높다.
II형 당뇨병에 대한 현행 치료법은 외래 인슐린의 투여, 약물의 경구 투여, 식이 요법 및 운동 요법을 포함한다. 2005년, 엑세나티드(exenatide)(엑센딘-4: 바이에타(Byetta®)가 메트포민 및/또는 설포닐우레아를 섭취하나 적절한 혈당 조절을 달성하지 못한 II형 당뇨병 환자에 대한 보조 요법으로서 FDA에 의해 승인되었다.
엑세나티드는 엑센딘-4, 즉 도마뱀 침샘의 내생 생성물인 강력한 GLP-1 수용체 작용제이다. 엑센딘-4는 인슐린친화성을 나타내고, 음식 섭취 및 위 배출을 억제하며 설치류에서 β-세포에 대한 친화성을 나타낸다 (Parks et al., Metabolism. 50: 583-589, 2001; Aziz and Anderson, J. Nutr. 132: 990-995, 2002; and Egan et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1282-1290, 2002). 뿐만 아니라, 그의 N-말단의 2 위치에 글리신이 존재하기 때문에 GLP-1처럼 DPPIV에 대한 기질이 아니다. 엑세나티드의 사용에 있어서 단점은 엑세나티드의 반감기, 즉 t1/2이 2 내지 4시간 뿐이기 때문에 매일 2회씩 주사되어야 한다는 점이다 (Kolterman et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3082-3089, 2003 and Fineman et al.,Diabetes Care. 26: 2370-2377, 2003).
위에서 언급한 엑세나티드(exenatide)와 같은 펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하게 되는데, 이는 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 있어 왔으며, 그 중 하나로 펩타이드 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 현저히 낮으며 따라서 펩타이드 약물의 체내 활성을, 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다.
한편, 펩타이드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔는데, 이러한 펩타이드 약물의 지속형 제제는 펩타이드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
펩타이드를 안정화시키고 단백질 가수분해 효소에 의한 분해를 억제하기 위한 방법으로, 단백질 가수분해효소에 민감한 특정 아미노산 서열을 변경하는 시도가 있어왔다. 예를 들어 혈중 글루코스 농도를 감소시키는 작용을 하여 제2형 당뇨병 치료 효능을 가지고 있는 GLP-1(7-37 또는 7-36 amide) 의 경우 생리 활성 반감기가 4분 이하로(Kreymann et al., 1987) 매우 짧은데, 이는 디펩티딜 펩티데이즈(Dipeptidyl pepdidase IV, DPP IV) 에 의한 GLP-1 의 아미노산 8번(Ala)와 9번(Asp) 사이의 절단에 의한 GLP-1의 역가 상실에 기인하며, 따라서 DPP IV 에 저항성을 갖는 GLP-1 유사체에 대한 여러 연구가 수행되었는데, Ala8를 Gly로 치환하거나(Deacon et al., 1998; Burcelin et al., 1999) 또는 Leu, D-Ala로 치환하여(Xiao et al., 2001) DPP IV 에 대한 저항성을 증가시키면서 활성을 유지하는 시도가 있었다. 또한 GLP-1의 N 말단 아미노산 His7은 GLP-1 의 활성에 매우 중요함과 동시에 DPP IV의 타겟이며, 따라서 US 5,545,618에서는 N 말단을 alkyl 또는acyl group 변형하였으며, Gallwitz 등은 7번 His를 N-메틸화 (N-methylation), 알파-메틸화(alpha-metylaltion) 시키거나 His 전체를 이미다졸로 치환하여 DPP IV 저항성을 증가시키고 생리활성을 유지하였다 (Baptist Gallwitz, et al., Regulatory Peptides 86, 103-111, 2000).
이러한 변형체 이외에 글리아 몬스터 도마뱀(glia monster)의 침샘으로부터 정제된 GLP-1 유사체인 엑세나티드 (엑센딘-4, US 5,424,686)는 DPP IV 에 대한 저항성과 함께 GLP-1 보다 높은 생리 활성을 가지며 따라서 체내 반감기가 2-4시간으로 GLP-1에 비해 길어졌다. 그러나 DPP IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리 활성의 지속시간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고 있는 엑센딘-4 (엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며 이는 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다.
이러한 인슐린분비 펩타이드의 문제점은 펩타이드의 크기가 작아 신장에서 회수되지 못하고 체외로 소실되는 것에서 기인하는 바가 크며 따라서 신장 소실을
억제하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG) 과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩타이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어왔다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비 특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 예를 들어, WO2006/076471은 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시키며 따라서 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨배설증가펩타이드(B-type natriuretic 펩타이드, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이러한 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 펩타이드의 생체 내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 펩타이드 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질 전환된 세포 등을 배양하여 융합 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커를 통해 트랜스페린(Tf)에 융합된 엑센딘 -4를 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다 (대한민국 특허공개 제10-2009-0033906호). 또한, 면역글로불린을 이용하는 방법으로서, GLP-1 유사체에 IgG4 Fc를 융합한 GLP-1 유사체 융합 단백질 역시 보고되어 있다 (대한민국 특허공개 제10-2007-0089187호).
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 및 펩타이드 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 대한민국 등록특허 10-0567902 (생체내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체) 및 대한민국 등록특허 10-0725315 (면역글로불린단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법)에 개시되었다.
위의 특허 방법으로 생리활성 펩타이드로서 인슐린분비 펩타이드를 적용시켜 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조할 수 있는데 (대한민국 등록특허 10-2008-0001479), 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 특히 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 자체 인슐린분비 펩타이드에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 안정화하는데 매우 어려움이 있다.
일반적으로, 단백질 및 펩타이드는 그 반감기가 무척 짧으며 적당하지 않은 온도, 물-공기의 계면에의 노출, 고압, 물리적/기계적 스트레스, 유기용매, 미생물에 의한 오염 등에 노출 시, 단량체의 응집, 응집에 의한 침전 및 용기 표면에의 흡착 등의 변성 현상을 나타낸다. 변성된 단백질 및 펩타이드는 원래의 물리화학적 성질 및 생리활성 효과를 소실하게 되는데, 이러한 변성 현상은 비가역적이기 때문에, 한번 변성된 단백질 및 펩타이드는 원래의 특성을 거의 회복할 수 없다. 또한 불안정하고 온도, 습도, 산소 및 자외선 등의 외부 요소에 쉽게 영향을 받는 경향이 있어 응집, 중합 또는 산화를 포함하는 물리적 또는 화학적 변화를 거쳐 활성이 크게 손실되는 결과를 초래한다.
또한, 흡착된 단백질 및 펩타이드는 변성 과정에 의하여 쉽게 응집되며, 이렇게 응집된 변성 단백질 및 펩타이드는 인체에 투여 시, 인체 내에서 항체 형성의 원인으로 작용하게 되므로, 단백질 및 펩타이드가 충분히 안정한 상태가 되도록 투여하여야 한다. 따라서, 용액 중의 단백질 및 펩타이드의 변성을 막기 위한 여러 가지 방법들이 연구되어 왔다(John Geigert, J.Parenteral Sci. Tech., 43, No5, 220-224, 1989, David Wong, Pharm.Tech. october, 34-48, 1997, Wei Wang., Int.J.Pharm.,185, 129-188, 1999, Willem Norde, Adv.Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986, Michelle et al., Int.J.Pharm. 120, 179-188, 1995).
일부 단백질 및 펩타이드 약품은 동결 건조방법으로 안정성 문제를 해결하고 있으나, 동결 건조 제품은 사용할 때 다시 주사용수에 녹여야 하는 불편이 있고, 동결 건조과정이 생산 공정에 포함되어 있어서, 대용량의 동결 건조기를 사용해야만 하는 등 대규모의 투자가 필요하다. 분무 건조기를 사용하여 분말화 하는 방법도 사용되고 있는데, 이 경우 낮은 수율로 인하여 경제성이 떨어지는 단점이 있고, 고온에 노출되기 때문에 안정성에 악영향을 미칠 수도 있다.
이러한 한계를 해결하는 대안으로, 용액 상태인 단백질 및 펩타이드에 안정화제를 첨가하여 약물의 물리화학적 변화를 억제하면서, 장기간 저장을 하는 경우에도 약물의 생체 내 효력을 유지시키는 연구를 수행하였다. 단백질의 일종인 인간 혈청 알부민은 여러 단백질 약물의 안정화제로서 폭 넓게 사용되고 있으며 그 성능을 입증 받아왔다(Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346).
그러나, 인간 혈청 알부민은 정제 과정에서 미코플라스마, 프리온, 박테리아 및 바이러스 등의 생물학적 오염물에 대한 불활성 공정 또는 하나 이상의 생물학적 오염물 또는 병원체에 대한 생물학적 물질을 스크린 하거나 검사하는 방법들을 포함하고 있지만, 이들이 완전히 제거 또는 불활성 되지 않은 채 환자에게 노출될 위험이 존재한다. 예를 들어, 스크린 공정은 혈액 기증자로부터의 인간 혈액에서 특정 바이러스에 대한 검사를 포함하지만, 이러한 공정은 항상 신뢰할 수 있는 것은 아니며, 특히 매우 적은 수로 존재하는 특정 바이러스를 검출할 수 없다.
상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 적합한 비율, 농도 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 용액중의 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
특히, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인슐린분비 펩타이드와 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc영역은 각각 물리 화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하여야 한다. 그러나, 상기 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다. 따라서, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 있다.
한편, 최근에는 환자의 편의성을 높인 반복 사용 가능한 단백질 및 펩타이드 제형이 개발되고 있다. 하지만 이 다회 사용 제형은, 반복 투여 후 버리기 전까지 미생물의 오염을 방지하기 위하여 반드시 보존제가 포함되어야 한다. 보존제가 포함된 다회 사용 제형은 단회 사용 제형에 비해 몇 가지 장점이 있다. 예를 들어, 단회 사용 제형의 경우 투여량의 차이에 따라 낭비되는 약물의 양이 많은데, 다회 사용 제형의 경우 버려지는 제품의 양을 줄일 수 있다. 게다가 일정 기간 동안 미생물의 성장의 걱정 없이 여러 번 사용 할 수 있으며, 하나의 용기로 제공할 수 있어 포장을 최소화할 수 있어 경제적이다.
하지만, 보존제의 사용은 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 보존제를 사용하는 경우 가장 많이 알려진 문제는 침전 형성이다. 단백질 침전은 약물의 효과를 감소시키고 체내 투여시 예기치 않은 면역반응을 초래할 수 있다. 따라서 보존제의 미생물 방지력을 유지하면서 단백질의 안정성에 문제가 되지 않는 보존제의 종류 및 농도의 선택이 중요하다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 보관할 수 있는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정한 액상 제제를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 완충용액, 당알코올, 등장화제 및 비이온성 계면활성제, 또는 추가적으로 메티오닌을 포함하는 안정화제를 이용함으로써 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성을 증대시켜 경제적이고 안정한 액상 제형을 제공할 수 있음을 확인하였으며, 또한 상기 액상 제형이 추가로 보존제를 포함하는 경우 다회 사용이 가능한 액상 제제를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 알부민-비함유 안정화제에 더하여, 보존제를 추가로 포함하는, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 다회투여용 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 포함하는, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 다회투여용 액상 제제를 제공한다.
본 발명의 용어 "지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체"는 유도체, 변이체, 전구물질, 그리고 단편 등을 포함하는 생리활성 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 결합체로서, 천연형 인슐린분비 펩타이드에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명에서 사용한 인슐린분비 펩타이드는 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드로서 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 및 발현을 자극한다. 이러한 펩타이드는 전구물질 (precursor), 아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함하며, 바람직하게는 GLP (Glucagon like 펩타이드)-1, GLP (Glucagon like 펩타이드)-2, 엑센딘-3 (exendin-3), 엑센딘-4 (exendin-4) 및 이미다조-아세틸 엑센딘-4 (Imidazoacetyl (CA) exendin-4) 등이다. 바람직하게는 이미다조-아세틸 엑센딘-4 일 수 있다. 인슐린분비 펩타이드는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 것이나 모두 가능하며, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 이용하여 제조한 재조합 인슐린분비 펩타이드이며, 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산의 치환, 제거, 삽입에 의한 유도체도 가능하다.
상기 인슐린분비 펩타이드의 서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 인슐린분비 펩타이드의 활성을 나타내는 한, 재조합 인슐린분비 펩타이드는 천연형과 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 더욱더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 유용한 면역글로불린 Fc는 인간 면역글로불린 Fc, 그의 밀접하게 관련된 유사체의 서열을 갖는 것, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체일 수 있다. 면역글로불린 Fc는 천연 IgG를 특정 단백질 분해 효소로 처리하여 제조할 수 있으며, 재조합 기술을 이용하여 형질 전환된 세포로부터도 제조할 수 있다. 바람직하게는 E. coli에서 제조한 재조합 인간 면역글로불린 Fc 이다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성 (CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능 (effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 합성하여 제조한 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조한다. 이 때 이용되는 결합 방법으로, 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
교차 결합 시 사용되는 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA (폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA (폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이나 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제조를 위해 대한민국 등록특허 10-0725315, 공개특허 10-2009-0008151, 등록특허 10-1058290 등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌들에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 포함한다. 일반적으로, 인슐린분비 펩타이드, 그 중에서도 엑세나티드 (Exendin-4, Byetta )의 치료학적 유효량은 펜 인젝터 (pen-injector) 내에 250 mcg 가 함유된 양이다. 본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이고, 바람직하게는 0.5 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖이다. 상기 인슐린분비 펩타이드는 바람직하게는 지속형 CA Exendin-4 결합체일 수 있다. 본 발명의 상기 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제는 인슐린분비 펩타이드 결합체가 저농도로 존재할 경우뿐만 아니라 고농도로 존재할 경우에도 결합체를 침전없이 안정적으로 저장할 수 있어, 안정적으로 생체 내로 고농도의 인슐린분비 펩타이드를 공급할 수 있다.
본 발명의 용어 "안정화제"는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미하는데, "안정화"는 일정한 시간 동안 특정 저장 조건하에서 활성 성분의 손실이 특정량 미만, 일반적으로 10% 미만임을 의미한다. 보통, 5±3℃에서 2년, 25±2℃에서 6개월 또는 40±2℃에서 1 내지 2주 동안 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 92-95% 정도의 잔존율을 유지하는 경우 이러한 제제는 안정한 것으로 이해된다. 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서 뿐만 아니라, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 저장 동안 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 10% 정도의 손실을 나타내는 것은 조성물 내에서 응집체나 단편 등을 야기하여 항원성 화합물로 전환되지 않는 한 실질적인 투여 시 허용할 만한 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 상기 안정화제는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 안정성을 부여하기 위해 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하고, 추가적으로 메티오닌을 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
완충용액은 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 한다. 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 나트륨 시트레이트/시트르산, 나트륨 아세테이트/아세트산, 히스티딘/염산 히스티딘을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 그러한 완충용액의 바람직한 예로는 구연산 완충용액(Citrate buffer), 아세트산 완충용액(Acetate buffer), 히스티딘 완충용액(Histidine buffer) 등을 들 수 있으며, 그 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 50mM이다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 5.2 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 5.2 내지 6.0이다.
당 알코올은 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 하는데, 본 발명에 사용되는 당 알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1 내지 20%(w/v), 더욱 바람직하게는 3 내지 10%(w/v)이다. 당 알코올로서, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
등장화제는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 용액 상에서 체내에 투여할 때에 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하며, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 제형의 삼투압은 혈액과 등장이 되도록 조절한다. 이러한 등장 액상제형의 삼투압은 일반적으로 약 300 mOsm/kg 이다. 등장화제의 대표적인 예로는 당 알코올 및 수용성 무기염, 아미노산 등을 들 수 있으며, 바람직한 예로는, 수용성 무기염인 염화나트륨을 들 수 있다. 등장화제로서의 염화나트륨의 농도는 바람직하게 0 내지 150 mM 이며, 제형에 포함된 성분들의 종류 및 양 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
비이온 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착하거나 응집되는 것을 방지하여 준다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제 및 폴록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 20이 바람직하다.
상기 비이온 계면활성제를 용액 제형에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 못한데, 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.2%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.05%(w/v) 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제 존재 하에서, 등장화제로서의 염화나트륨을 포함시키는 경우 저농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 저장 안정성을 현저히 증가시키는 결과가 나타났다. 이는 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제와 등장화제로서의 염화나트륨의 동시 사용이 시너지 효과를 나타내어 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 특별한 안정성을 부여한다는 것을 의미한다. 하지만 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 경우 염화나트륨을 제외하는 것이 침전 발생을 예방하고 단백질의 용해도를 개선시키는 것으로 결과가 나타났다. 즉, 등장화제로서 염화나트륨의 경우 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 농도에 따라 적절한 함량으로 조절할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 완충용액의 pH는 저농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 경우 약 5.2의 pH가 안정화 효과가 큰 반면, 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 경우에는 5.4 또는 5.6의 pH가 안정화 효과가 큰 것으로 확인되어, 완충용액의 ph는 결합체의 농도에 따라 적절히 조절할 수 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 안정화제에 포함되는 메티오닌은 용액 상태에서 단백질의 산화 반응 등에 의해 일어날 수 있는 불순물 생성을 억제시켜 대상 단백질을 더욱 안정화시키는 효과가 있다. 메티오닌의 농도는 전체 용액 대비 0.005 내지 0.1%(w/v)이며, 바람직하게는 0.01 내지 0.1%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
또한, 본 발명의 상기 안정화제는 당류 또는 다가 알코올 또는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스 ,푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제는 상기 설명한 결합체, 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제, 또는 추가적으로 메티오닌 이외에, 다회투여용 제제의 미생물 오염 방지를 목적으로 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 ?망망?란 항균제로서 작용하기 위해 제약 제제에 첨가되는 화합물을 의미하며, 이러한 보존제로는 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, ο-크레졸, ρ-크레졸, 클로로크레졸, 염화 벤잘코늄, 페닐수은산 질산염, 티메로살, 벤조산 등을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 보존제는 1종 단독으로 사용하거나 2종 이상을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 액상 제제는 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 및 벤질알코올 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 액상 제제에 있어서, 보존제는 0.001 내지 1 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 0.5 %(w/v) 의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 액상제제에 보존제로서 m-크레졸을 0.22%(w/v) 포함시켜 크레졸이 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성에 미치는 영향을 평가한 결과, 결합체의 침전이 일어나지 않고 결합체의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기한 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 포함하는 본 발명의 인슐린분비 펩타이드 결합체의 액상제제는 다회 투여를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제, 또는 추가적으로 메티오닌 및 보존제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당 업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 안정성을 제공하는 본 발명에 따른 알부민-비함유 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제는 바이러스 감염의 우려가 없을 뿐만 아니라, 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다.
또한, 본 발명의 액상 제제는 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 포함하고 있으므로 통상적인 인슐린분비 펩타이드 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있으며, 저농도 뿐만 아니라 고농도의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 대해서도 우수한 안정성을 제공하는 제제이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 액상 제제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 액상 제제는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조하는 단계, 및 상기 단계에서 제조된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 통하여 제조할 수 있다. 또한 상기 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 혼합함으로써 다회 사용을 위한 안정한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 액상 제제는 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제, 또는 추가적으로 메티오닌을 포함하고 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아, 바이러스 감염의 우려가 없고, 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 제공한다. 이와 같은 본 발명의 액상 제제는 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능하며, 또한 보존제를 추가로 포함할 경우 다회 사용이 가능하다. 또한, 통상적인 인슐린분비 펩타이드 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있다.
도 1은 최종 선택한 pH 5.2의 액상제제(액상제제 #1), 시판 중인 인슐린분비 펩타이드 약물 Exenatide (Exendin-4, Byetta) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상제제 (액상제제 #2), 그리고 면역글로불린 융합 단백질 약물 Etanercept (TNFR-Fc 융합단백질, ENBREL) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상제제(액상제제 #3) 및 대조군(액상제제#4)을 25±2℃에서 8주간 보관하면서 안정성을 RP-HPLC를 통해 분석한 그래프이다.
도 2는 최종 선택한 메티오닌 불포함 pH 5.2 액상제제(액상제제 #1)와 메티오닌 포함 pH 5.2 액상제제(액상제제 #2)를 적용한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 25±2℃및 40±2℃에서 4주간 보관하면서 산화된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 변화량을 RP-HPLC를 통해 분석한 그래프이다.
도 3은 표 18의 조성에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40℃에서 48시간 동안 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다. 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
도 4는 표 19의 조성에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40℃에서 7일간 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다. 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
도 2는 최종 선택한 메티오닌 불포함 pH 5.2 액상제제(액상제제 #1)와 메티오닌 포함 pH 5.2 액상제제(액상제제 #2)를 적용한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 25±2℃및 40±2℃에서 4주간 보관하면서 산화된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 변화량을 RP-HPLC를 통해 분석한 그래프이다.
도 3은 표 18의 조성에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40℃에서 48시간 동안 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다. 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
도 4는 표 19의 조성에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40℃에서 7일간 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다. 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1:
등장화제인
염의 유무에 따른 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
본 발명에서 안정화제로서 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제를 함유하는 제형, 및 안정화제로서 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 메티오닌을 함유하는 제형에 등장화제로서의 염화나트륨의 유무에 따라 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체(15.41 ㎍/mL CA 엑센딘-4, Nominal Conc.)의 안정성을 확인하기 위해 하기의 표 1과 같은 조성으로 25℃ 및 40℃에서 0 내지 4주 동안 보관 후 역상 크로마토그래피법(Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)와 크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion - High Performance Liquid Chromatography, SE-HPLC)을 이용해 분석하였다. 완충용액으로는 구연산 완충용액, 당알코올로는 만니톨, 비이온성 계면활성제로는 폴리솔베이트 20을 사용하였다. 표 2 및 표 3의 RP-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다. 표 2는 25℃에서 보관 후 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율이고, 표 3은 40℃에서 보관 후 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
상기 표 2 및 3에서, 번호 1과 2, 및 3과 4를 비교한 결과에서 보듯이, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제를 25℃ 및 40℃에서, 특히 40℃에서 4주간 보관하였을 때, 등장화제로서의 염화나트륨, 특히 150 mM NaCl이 존재할 때 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성이 현저히 높게 유지되는 것으로 나타났다 (표 2 및 3).
실시예
2: 완충용액의
pH
따른 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 분석
시판 액상 단백질 약물의 일반적인 pH 범위는 5-7 정도인 반면, 인슐린분비 펩타이드 약물인 엑세나티드 (Exendin-4, Byetta)의 액상 제제 pH는 이보다 낮은 4.5 이다. 따라서 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 단백질을 모두 포함하고 있는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 더욱 바람직하게 지속형 이미다조-아세틸 엑센딘-4 (Imidazoacetyl (CA) exendin-4) 결합체의 경우, 완충용액의 pH가 안정성에 미치는 영향을 분석하였다.
완충용액은 구연산 나트륨 완충용액를 이용하였으며, 당 알코올로서 만니톨, 등장화제로서 염화나트륨, 비이온성 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80을 이용하였다. 하기의 표 4와 같은 조성을 각각 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정화제로 사용하여 25±2℃에서 4주 동안 보관 후 크기 배제 크로마토그래피법 (Size exclusion chromatography, SE-HPLC) 및 역상 크로마토그래피법 (Reverse phase chromatography, RP-HPLC)을 이용해 분석하였다. 표 5의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 4]
[표 5]
상기 결과에서 보듯이, 위의 액상 제제 조건에서 pH가 5.2 일 때 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체가 가장 안정한 것으로 나타났다 (표 5).
실시예
3:
비이온
계면활성제 종류 및 농도에 따른 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 분석
본 발명에 따른 안정화제로서 비이온성 계면 활성제인 폴리소르베이트의 종류 및 농도가 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성에 미치는 영향을 분석하였다.
폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제의 하나인 폴리소르베이트 80과 폴리소르베이트 20을 각각 0.005% 및 0.01% 농도에서 비교하였다. 계면활성제 이외의 안정화제 조성은 상기 실시예에서 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체에 안정성을 부여했던 조성으로서 완충용액, 당알코올, 등장화제를 적절히 조합하였다. 완충용액은 실시예 2에서 높은 안정성을 나타낸 pH 5.2 구연산 나트륨 완충용액을 사용하였고, 당알코올로서 만니톨, 등장화제로서 염화나트륨을 사용하였다.
하기 표 6과 같은 조성으로 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 더욱 바람직하게 지속형 CA 엑센딘-4 결합체의 안정화제로 사용하여, 25±2℃에서 8주간 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC 이용하여 분석하였다. 표 7의 RP-HPLC (%) 및 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 6]
[표 7]
상기 결과에서 볼 수 있듯이, SE-HPLC 결과에서는 폴리소르베이트 종류 및 농도에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성에 차이가 거의 없었으나, RP-HPLC 결과에서는 폴리소르베이트 20이 같은 농도의 폴리소르베이트 80에 비해 유사하거나 더욱 안정했다. 또한 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하는 액상 제제보다 낮은 농도인 0.005% 폴리소르베이트 20을 포함하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제의 안정성이 더 뛰어났다 (표 7).
실시예
4: 최종 선택한 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 액상 제제와 시판되어 있는
펩타이드
또는 단백질 약물의 액상 제제에 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체를 적용한 액상 제제와의 안정성 비교 평가
실시예 1 내지 3의 안정성 실험을 통해 선택한 pH 5.2의 구연산 완충용액과 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리소르베이트 20으로 이루어진 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성을 확인하기 위해, 시판 중인 인슐린분비 펩타이드 약물 엑세나티드 (Exendin-4, Byetta ) 액상 제제의 안정화제 조성 및 면역글로불린 융합 단백질 약물 Etanercept (TNFR-Fc 융합단백질, ENBREL ) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상 제제의 안정성 비교 실험을 진행하였다.
하기 표 8과 같은 조성으로 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 더욱 바람직하게 지속형 CA 엑센딘-4 결합체의 액상 제제 (액상제제 #1)를 조제하고, 인슐린분비 펩타이드 약물 엑세나티드 (Exendin-4, Byetta ) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상제제 (액상제제 #2) 및 면역글로불린 융합 단백질 약물 Etanercept (TNFR-Fc 융합단백질, ENBREL ) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상제제 (액상제제 #3)를 조제하였다. 대조군으로 PBS만 포함하는 안정화제 조성에 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 적용한 액상제제 (액상제제 #4)를 조제하였다. 그 후, 25±2℃에서 8주간 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC 이용하여 분석하였다. 표 9의 RP-HPLC (%) 및 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 8]
[표 9]
안정성 시험 결과, 도 1 및 표 9에 나타난 바와 같이, 시판 중인 인슐린분비 펩타이드 약물 엑세나티드 (Exendin-4, Byetta) 및 면역글로불린 융합 단백질 약물 Etanercept (TNFR-Fc 융합단백질, ENBREL)의 액상 제제의 안정화제 조성을 적용한 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체보다 본 발명의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 액상 제제가 더 안정한 조성임을 확인할 수 있었다.
실시예
5: 메티오닌 추가에 따른 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
기존 실시예를 통해 선택한 pH 5.2의 구연산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리소르베이트 20 외에 산화반응 방지를 위해 메티오닌을 추가한 액상 제제의 가속 및 가혹 안정성을 확인하기 위해 25±2℃에서 4주, 40±2℃에서 4주간 보관한 시료의 안정성을 분석하였다.
하기 표 10과 같은 조성으로 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 더욱 바람직하게 지속형 CA 엑센딘-4 결합체의 액상 제제를 조제하여 분석하였으며. 표 11 내지 14의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 각 시점의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 불순물의 함량을 나타낸다. 표 11은 가속 안정성 시험 (25±2℃)의 RP-HPLC 결과, 표 12는 가속 안정성 시험 (25±2℃)의 SE-HPLC 결과, 표 13은 가혹 안정성 시험 (40±2℃)의 RP-HPLC 결과, 표 14는 가혹 안정성 시험 (40±2℃)의 SE-HPLC 결과를 나타내고, 불순물 #3가 산화된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체이다. 다만, SE-HPLC 는 시료의 분자량을 이용하여 분리하는 방법이고, 산화된 형태와 산화되지 않은 형태는 분자량의 차이가 매우 작기 때문에, SE-HPLC를 통해서는 산화된 형태의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 분리할 수 없었다.
[표 10]
[표 11]
[표 12]
[표 13]
[표 14]
가속 및 가혹 안정성 시험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 메티오닌이 포함되지 않은 액상 제제에서는 산화된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 (RP-HPLC에서의 불순물 #3)가 증가하는 것을 확인하였고, 0.01% 메티오닌이 포함된 액상 제제에서는 증가하지 않는 것을 확인하였다 (도 2). 따라서 메티오닌이 포함된 액상 제제가 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성을 더욱 효과적으로 제공한다는 것을 확인하였다.
실시예
6: 최종 선택한 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체 액상 제제의 장기 보존 안정성 시험
실시예를 통해 최종 선택한 pH 5.2의 구연산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨, 폴리소르베이트 20, 그리고 메티오닌으로 이루어진 액상 제제의 장기 보존 및 가속 안정성을 확인하기 위해 5±3℃에서 6개월, 25±2℃에서 6개월 보관한 시료의 안정성을 분석하였다. 그 결과를 표 15 및 표 16에 나타냈으며, RP-HPLC(%), SE-HPLC(%), 단백질 함량(%), 생물학적 비활성 시험(%) 등은 초기 결과 값에 대비한 잔존율을 나타낸다. 표 15는 5±3℃에서 보관하여 장기보존 안정성을 시험한 결과를 나타내고, 표 16은 25±2℃에서 보관하여 가속 안정성을 시험한 결과를 나타낸다.
[표 15]
[표 16]
장기 보존 안정성 시험 결과, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 본 발명의 액상제제에서 6개월 이상 안정하다는 것을 확인하였다. 또한 가속 조건에서 6개월 동안 보관하여도 RP-HPLC에서 95.4% 이상 잔존하는 등 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상제제의 효과적인 저장 안정성을 재차 확인할 수 있다.
실시예
7: 단백질 농도에 따른 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
기존 실시예를 통해 선택한 pH 5.2의 구연산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리소르베이트 20 외에 산화반응 방지를 위해 메티오닌을 추가한 액상 제제의 고농도 적용을 위하여, 표 17과 같은 농도로 40℃에서 침전발생 정도를 육안으로 관찰 하였다. 72시간 관찰 결과 현재 제제 조성의 고농도 (4 ㎎/㎖ 이상)에서 모두 침전이 발생하였고, 농도가 높을수록 침전의 발생량이 많은 것을 확인할 수 있었다.
[표 17]
실시예
8: 염 및
당알코올
농도, 메티오닌 유무에 따른 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성 평가
기존 선택한 실시예를 통해 선택한 제형을 기준으로 염화나트륨 및 당알코올로의 만니톨의 농도에 따른 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 침전 억제 효과를 확인하기 위하여 표 18과 같은 조성으로 40℃, 48시간 동안 침전 발생정도를 육안으로 확인하였다. 도 3의 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다.
[표 18]
상기 결과에서 볼 수 있듯이, 육안 관찰 결과 염화나트륨의 농도는 고농도 인슐린분비 펩타이드 결합체의 침전 억제 및 안정성에 큰 효과를 주지 못하였다. 하지만 당알코올인 만니톨의 농도는, 기존 5%에서 10%로 증가시켰을 때 침전 억제능력이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 메티오닌의 경우 첨가하지 않는 경우에서 침전 억제 능력이 증가하였다.
실시예
9: 염의 유무 및
pH
에 따른 고농도 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
실시예 8을 통해 선택한 10% 만니톨을 기준으로 하여 pH가 고농도 지속형 인슐린펩타이드 결합체의 침전 억제 및 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. 완충용액은 구연산 완충제, 비이온성 계면활성제로서 폴리소르베이트 20을 사용하였다. 실시예 8에 따르면 메티오닌을 첨가하지 않는 것이 침전 억제에 효과적이나, 산화반응 방지를 목적으로 추가하였다. 또, pH에 따른 염화나트륨 유무의 시너지 효과를 확인하기 150mM 농도의 염화나트륨을 첨가하거나 제외하였다. 하기 표 19와 같은 조성으로 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 40℃에서 7일간 침전 생성 여부를 육안으로 확인하였고, 7일 동안 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4의 침전 저해 지속 기간은 보관 후 단백 침전이 발생하지 않은 기간을 의미한다. 표 20의 RP-HPLC (%) 및 표 21의 SE-HPLC (%) 는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 19]
[표 20]
[표 21]
상기 결과에서 보듯이, pH 5.2 보다 pH 5.4, pH 5.6의 높은 pH에서 침전 억제 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 7일이 지난 후 모든 제형에서 침전이 발생하였지만 pH 5.6, 10% 만니톨 및 150mM 염화나트륨 조성 (6번 조성) 의 경우 이물 발생량이 가장 적었다. pH 5.4, pH 5.6과 이 pH에서의 염화나트륨의 유무는 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 침전 발생을 제외한 안정성은 큰 차이가 없었다 (표 20 및 21, 도 4).
실시예
10:
당알코올의
농도 및
pH
에 따른 고농도 지속형 인슐린분비
펩타이
드 결합체의 안정성 평가
기존 실시예를 기준으로 하여 당알코올의 농도와 pH가 고농도 지속형 인슐린펩타이드 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. 완충용액은 구연산 완충제, 비이온성 계면활성제로서 폴리솔베이트 20을 사용하였다. 메티오닌을 산화반응 방지를 목적으로 추가하였다. 또, 실시예 9의 결과를 토대로 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제형에 염화나트륨을 제외하였다. 하기 표 22과 같은 조성으로 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 5일간 40℃에서 보관 한 뒤 25℃에 옮겨 4주간 보관, 1주 간격으로 SE-HPLC, IE-HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 23의 SE-HPLC (%), 표 24의 IE-HPLC (%) 및 표 25의 RP-HPLC (%)는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 22]
[표 23]
[표 24]
[표 25]
상기 결과에서 보듯이, pH가 낮은 경우는 pH가 높은 경우에 비하여 안정성이 다소 떨어졌다. 당알코올인 만니톨의 농도에 따른 안정성은, 10% 에서 가장 좋았으나, 2%, 및 5%에서도 고농도 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 안정성에는 큰 영향이 없었다.
실시예
11:
당알코올
종류와 농도에 따른 고농도 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
등장 액상 제형의 개발을 목적으로 이전 실시예의 조건에서 삼투압에 가장 큰 영향을 주는 당알코올의 종류를 수크로오스로 변경, 농도에 따른 인슐린펩타이드 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. 실시예 10의 1번 제형을 기준으로 10% 만니톨을 5% 수크로오스 및 7% 수크로오스로 변경하였다 (표 26). 25℃에서 4주간 보관, 1주 간격으로 SE-HPLC, IE-HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 27의 SE-HPLC (%), 표 28의 IE-HPLC (%) 및 표 29의 RP-HPLC (%)는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 26]
[표 27]
[표 28]
[표 29]
상기 결과에서 보듯이, 수크로오스를 사용하는 경우에도 만니톨을 사용한 경우와 마찬가지로 결합체의 안정성이 유지됨을 확인하였으며, 수크로오스의 농도가 5%인 경우보다 7%인 경우에 안정성이 약간 더 우수하였으나, 큰 차이를 보이지는 않았다.
실시예
12: 완충용액의 종류 및 삼투압 조절 및 보존제의 첨가에 따른 고농도 지속형 인슐린분비
펩타이드
결합체의 안정성 평가
등장 액상 제형의 개발을 목적으로 이전 실시예의 조건에서 삼투압에 가장 큰 영향을 주는 당알코올의 농도를 조절하고, 완충용액의 종류에 따른 안정성을 시험하였다. 그리고 같은 조건에서, 보존제로서 m-크레졸을 0.22% 첨가하여 m-크레졸이 안성성에 미치는 영향을 시험하였다. 하기 표 30와 같은 조성으로 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 25℃에서 2주간 보관, 1주 간격으로 SE-HPLC, IE-HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 31의 SE-HPLC (%), 표 32의 IE-HPLC (%) 및 표 33의 RP-HPLC (%)는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타낸다.
[표 30]
[표 31]
[표 32]
[표 33]
상기 결과에서 보듯이, 완충용액의 종류를 변경하여도 안정성에 영향이 없었다. 그리고 m-크레졸도 안정성에 영향을 주지 않았다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 액상제제의 조성이 인슐린분비 펩타이드 결합체의 농도가 고농도일 때도 높은 안정성을 유지시킬 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예 들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (30)
- 생리활성 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 인슐린분비 펩타이드는 GLP (Glucagon like 펩타이드)-1, GLP (Glucagon like 펩타이드)-2, 엑센딘-3 (exendin-3), 엑센딘-4 (exendin-4), 이들의 전구물질 (precursor), 아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragment), 변이체 (variants) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 것인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제2항에 있어서, 상기 인슐린 분비펩타이드 변이체는 이미다조-아세틸 엑센딘-4 (Imidazoacetyl excendin-4)인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제4항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제4항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제4항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 결합체의 결합 방법이 비펩타이드성 중합체를 이용하거나, 재조합기술을 이용하여 결합된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제9항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제10항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 당알코올이 만니톨 및 소르비톨, 수크로오스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 당알코올의 농도가 전체 용액 대비 3%(w/v) 내지 15%(w/v)인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 완충용액이 구연산, 아세트산 또는 히스티딘 완충용액인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 4 내지 7인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제16항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 5 내지 7인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨이고, 농도가 0mM 내지 200mM인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제19항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 메티오닌을 추가로 포함하는 것인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제21항에 있어서, 상기 메티오닌의 농도가 전체 용액 대비 0.005%(w/v) 내지 0.1%(w/v)인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 안정화제가 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 단편이 폴리에틸렌 글리콜에 의해 결합된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하되, 상기 안정화제가 구연산 완충용액, 만니톨, 폴리소르베이트 20, 및 염화나트륨을 포함하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제1항에 있어서, m-크레졸, 페놀, 벤질알코올로 구성되는 군중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 보존제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제25항에 있어서, 상기 보존제의 농도가 전체 용액 대비 0.001 내지 1%(w/v) 인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제25항에 있어서, 상기 보존제가 m-크레졸인 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- 제25항에 있어서, 다회 투여용인 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제.
- a) 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조하는 단계; 및b) a) 단계에서 제조된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 등장화제로서의 염화나트륨 및 메티오닌을 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제의 제조 방법.
- a) 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조하는 단계; 및b) a) 단계에서 제조된 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 등장화제로서의 염화나트륨, 및 메티오닌을 포함하는 안정화제 및 보존제와 혼합하는 단계를 포함하는 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 액상 제제의 제조 방법.
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