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KR20140015127A - 폴리머 입자 및 이의 용도 - Google Patents

폴리머 입자 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
KR20140015127A
KR20140015127A KR1020127005296A KR20127005296A KR20140015127A KR 20140015127 A KR20140015127 A KR 20140015127A KR 1020127005296 A KR1020127005296 A KR 1020127005296A KR 20127005296 A KR20127005296 A KR 20127005296A KR 20140015127 A KR20140015127 A KR 20140015127A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
particle
tuberculosis
subject
immune response
Prior art date
Application number
KR1020127005296A
Other languages
English (en)
Inventor
베른드 헬무트 아담 렘
나탈리 앤 파레인
데이비드 닐 웨드록
브라이스 말콤 버들
Original Assignee
베른드 헬무트 아담 렘
브라이스 말콤 버들
데이비드 닐 웨드록
나탈리 앤 파레인
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베른드 헬무트 아담 렘, 브라이스 말콤 버들, 데이비드 닐 웨드록, 나탈리 앤 파레인 filed Critical 베른드 헬무트 아담 렘
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Abstract

본 발명은 폴리머 입자 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관능화된 폴리머 입자, 제조 방법 및 세포내 병원체에 의해 야기되는 질병 또는 증상의 치료 또는 예방 및 세포-매개 면역 반응을 유도하는데 사용되는 이의 용도에 관한 것이다.

Description

폴리머 입자 및 이의 용도{POLYMER PARTICLES AND USES THEREOF}
본 발명은 재조합 단백질 및 관련 구조물 및 방법, 및 폴리머 입자 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관능화 폴리머 입자, 이의 제조방법 및 면역반응을 유도하고, 세포내 또는 세포외 병원체에 의해 야기된 것을 포함하는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
이하의 내용은 본 발명을 이해하는데 유용한 정보를 포함한다. 본 명세서에 제공된 정보들 중 어느 것도 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 대한 선행 기술 또는 관련 기술이거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 모든 공보 또는 문서가 종래 기술이라고 인정되지 않는다.
세포내 및 세포외 병원체를 포함한 병원체는 예를 들면 그중에서 결핵, 간염, 인플루엔자, 나병, 리스테리아 증, 장티푸스, 이질, 페스트, 폐렴, 발진티푸스, 클라미디아, 탄저병 질환, 뇌수막염을 포함하는 인간에 해로운 여러 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 전통적인 예방접종 전략에 의해 유도되는, 강력한 세포-매개 면역 반응 및 체액성 반응을 일으킬 수 있는 능력은 모두 본 명세서에 포함되어 있다.
결핵(Tb)은 예를 들어, 매년 2 만명 이상이 죽는 것으로 추정된다. 결핵의 치료 또는 예방을 위한 현재 방법은 마이코박테리움(Mycobacterium) 결핵 박테리아의 다중 약물 내성 변종의 출현에 의해 도전받고 있다(Anderson, 2007; Mustafa, 2001). 결핵의 치료 또는 예방은 숙주의 면역 시스템에 대한 세포내 박테리아의 비접근성에 의해 복잡하게 된다.
기존의 백신 전달 시스템의 단점을 많이 극복하는 대상 예방접종을 제공하기 위한 안전하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 단점은 종종, 시간이 경과함께 따라 감소된 효능으로 인해, 투여를 반복할 필요성 및 비용이 증가한다는 점을 포함한다. 면역반응, 특히 세포-매개 면역반응을 발생시키는 것은 예를 들면 암을 포함하는 여러 다른 질병 또는 상태를 치료하는 방법으로 제안되고 있다. 따라서, 강력한 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 조성물, 및 특히 세포-매개 면역반응 또는 체액성 반응 또는 둘다를 유도할 수 있는 조성물이 필요하다.
폴리히드록시알킬 카르복실레이트, 특히 폴리히드록시 알카노에이트(PHAs)의 특성들은 의료, 제약 및 식품 산업 용도에서 약물 및 기타 활성제를 수송하기 위한 매트릭스로서의 용도 이외에, 바이오플라스틱에서의 용도에 대하여 조사되었다. PHA 분자의 생명공학을 통해, PHA 분자의 조성 및 발현은 특정 기능에 맞게 조정될 수 있다.
본 발명의 목적은 면역반응 또는 예방접종에 의해 다양한 질병 및 조건들을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 폴리머 입자들을 제공하는 것, 필요로 하는 대상에 효과적인 면역반응을 유도하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것, 또는 대중에게 적어도 유용한 선택을 제공하는 것이다.
간단한 요약
본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 기재된 발명은 많은 특성들 및 실시양태들을 포함하지만, 본 간단한 요약에 설정 또는 기재 또는 참조된 것에 국한되지 않는다. 본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 기재된 발명 및 여기에 포함된 것들은 모두 간단한 요약에서 확인된 특징들 또는 비제한적인 실시양태들에 국한되지 않으며, 이는 설명을 위한 목적일뿐, 제한을 위한 목적은 아니다.
폴리머 입자들을 제조하기 위한 방법들은 본 발명의 상세한 설명에 개시되어 있으며, 상기 방법은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 또는
면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
상기 발견 구조물의 발현에 적당한 조건하에서 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자들을 분리하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자의 제조 방법은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 또는
예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
상기 발현 구조물의 발현에 적당한 조건하에서 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자들을 분리하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질은 폴리머 신타제이다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 높은 복제수 벡터(high copy number vector)에 있다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 강한 프로모터에 조작가능하게 연결된다.
한 실시양태에서, 강한 프로모터는 바이러스 프로모터 또는 파아지 프로모터이다.
한 실시양태에서, 프로모터는 파아지 프로모터, 예를 들면 T7 파아지 프로모터이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리머 신타제의 기제(substrate), 바람직하게는, 존재하는 경우 폴리머 신타제의 기제 또는 기제 혼합물(모노머 기제를 포함), 또는 입자-형성 단백질의 기제를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해서 대사될 수 있는 전구물질 기제의 존재하에 유지된다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 2 이상의 다른 발현 구조물을 포함한다.
숙주 세포가 2 이상의 다른 발현 구조물들을 포함하는 일부 실시양태에서, 1 이상의 발현 구조물은 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
예를 들면, 세포-매개 면역 반응을 포함하는 면역-반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 및 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원 및 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 및 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제(adjuvant)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
숙주 세포가 2 이상의 다른 발현 구조물들을 포함하는 다른 실시양태에서, 발현 구조물 중 하나는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-크기 결정 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
폴리머 조절제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
숙주 세포가 2 이상의 다른 발현 구조물들을 포함하고, 발현 구조물 중 하나는 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열 및 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 다른 실시양태에서, 1 이상의 발현 구조물은 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 구조물들의 혼합 집단을 포함하며, 각 발현 구조물은 융합(fusion) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
1 이상의 입자-형성 단백질, 및
면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역.
다양한 실시양태에서, 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
본 발명의 다른 측면은,
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함하는 발현 구조물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 핵산은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩한다.
본 발명의 다른 측면은,
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함하는 발현 구조물에 관한 것이다.
다양한 실시양태에서, 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있으며, 또는 결합 영역은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 존재한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 강한 프로모터에 조작가능하게 연결된다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
융합 폴리펩티드의 면역 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역에 결합하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다:
(i) 1 이상의 티올라제(thiolase), 또는
(ii). 1 이상의 리덕타제(reductase), 또는
(iii) 상기 (i)와 (ii) 모두.
한 실시양태에서, 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함한다:
(i) 1 이상의 티올라제,
(ii) 1 이상의 리덕타제,
(iii) 1 이상의 폴리머 신타제(polymer synthase),
(iv) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
(v) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역,
(vi) 상기 (i) 내지 (v) 중 1 이상을 포함하는 융합 단백질,
(vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 조합.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질, 및 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질, 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질, 및 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 발현 구조물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 벡터는 높은 복제수 벡터이다.
한 실시양태에서, 벡터는 낮은 복제수 벡터이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 정의된 발현 구조물 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 발현 구조물을 포함한다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
본 발명의 다른 측면은 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 다른 융합 폴리펩티드들을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자 표면 상에 2 이상의 다른 융합 폴리펩티드들을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자 표면 상에 3 이상의 다른 융합 폴리펩티드들과 같은 3 이상의 다른 융합 폴리펩티드들을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2 이상의 다른 항원들을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2 이상의 다른 항원들의 결합 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자에 결합되거나 혼입되는 1 이상의 물질, 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 물질은 항원, 또는 보조제, 또는 면역자극 분자이다.
한 실시양태에서, 물질은 가교에 의해 결합된다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원(M. tuberculosis antigen), C형 간염 항원, 인플루엔자 항원, 프란시셀라 튤라렌시스 항원(Francisella tularensis antigen), 브루셀라 아보르투스 항원(Brucella abortus antigen), 수막구균 항원(Neisseria meningitidis antigen), 바실루스 안트라시스 항원(Bacillus anthracis antigen), 뎅기 바이러스 항원(dengue virus antigen), 에볼라 바이러스 항원(ebola virus antigen), 웨스트 나일 바이러스 항원(West Nile virus antigen)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항원을 포함하며, 상기 항원들 중 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 방법에 따라 제조된 폴리머 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자들은 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합되는 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 폴리머 입자들은 상기 정의된 방법에 따라 제조된다.
여러 실시양태에서, 조성물은 백신 조성물이다. 여러 실시양태에서, 백신 조성물은 1 이상의 보조제 또는 면역자극 분자들을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 정의된 폴리머 입자들의 조성물을 포함하는 진단 제제에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 정의된 폴리머 입자의 조성물을 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 조성물은 폴리머 입자의 균일한 군집을 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 폴리머 입자의 혼합 군집을 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 하기 중 1 이상을 추가로 포함한다:
면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원들,
면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원들의 1 이상의 결합 영역,
1 이상의 보조제, 또는
1 이상의 면역조절제 또는 분자들.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험체에 1 이상의 융합(fusion) 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
상기 융합 폴리펩티드의 1 이상은 피험체에 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질(particle-forming protein)을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 항원은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 피험체에 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 면역반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 피험자 또는 투여된 피험자에게 투여된다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 결합 영역은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 투버쿨로시스에 대하여 피험자를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 투버쿨로시스에 대하여 피험자를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 피험자에게 또는 투여되는 피험자에게 결합된다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 피험자에게 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 조성물과 같이, 피험자에게 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 투버쿨로시스로 감염된 피험자에게 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 예를 들면 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 예를 들면, 내인성 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 피험자에게 유도하는 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 피험자에 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함한다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 항원은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
본 발명의 다른 측면은 이를 필요로 하는 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 1 이상의 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 피험자에 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 결합된, 항원을 포함하는 피험자에게 결합한다.
한 실시양태에서, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응이다. 한 실시양태에서, 항원은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 면역 반응, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 예를 들면, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 실시예에 의해, 1 이상의 폴리머 입자는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원, C형 간염 항원, 인플루엔자 항원, 프란시셀라 튤라렌시스 항원, 브루셀라 아보르투스 항원, 수막구균 항원, 바실루스 안트라시스 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 웨스트 나일 바이러스 항원을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항원을 포함하며, 상기 항원들 중 하나를 포함한다.
한 실시양태에서, 피험자는 세포내 병원체로 감염되거나, 또는 예를 들면 세포내 병원체에 의해 감염될 위험이 있다. 다른 실시양태에서, 피험자는 예를 들면 우선적으로 세포내 생명주기를 갖는 병원체에 의해 감염되거나 또는 감염될 위험에 있다.
여러 실시양태에서, 피험체는 간염, 인플루엔자 또는 투버쿨로시스에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험체는 예를 들면, 세포내 병원체에 대하여 예방접종받았다. 예를 들면, 피험체는 바실루스 칼메트-게렝(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)에 의해 예방접종받았다.
한 실시양태에서, 피험체는 예를 들면 세포외 병원체에 의해 감염되거나, 또는 세포외 병원체에 의해 감염될 위험에 있다. 다른 실시양태에서, 피험체는 예를 들면 우선적으로 세포외 생명주기를 갖는 병원체에 의해 감염되거나, 또는 감염될 위험에 있다.
본 발명의 다른 측면은 세포내 병원체에 의해 감염되거나 또는 예방접종받은 피험체에서 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 1 이상의 폴리머 입자는 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함한다.
세포내 병원체에 대하여 피험체를 예방접종하기 위한, 또는 세포내 병원체에 의해 감염된 또는 예방접종된 피험체를 포함하는 피험체에 면역반응을 유도하기 위한 약제를 제조하는데 상기 설명된 폴리머 입자를 사용하는 것도 또한 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 예를 들면 세포외 병원체에 의해 감염되거나 또는 이에 대하여 예방접종된 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 1 이상의 폴리머 입자는 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함한다.
예를 들면 세포외 병원체에 대하여 피험체를 예방접종하기 위한, 또는 예를 들면 세포외 병원체에 의해 감염되거나 또는 이에 대하여 예방접종된 피험체를 포함하는 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 상기 설명된 폴리머 입자의 용도가 또한 고려된다.
본 발명은 필요로 하는 피험체를 백신화하기 위해 본 명세서에 설명된 폴리머 입자를 추가로 제공한다. 따라서, 필요로 하는 피험체를 백신화하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 상기 설명된 폴리머 입자의 용도가 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 병원체로부터의 감염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 피험체에 투여하는 단계 및 병원체 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 병원체는 세포내 병원체이다. 다른 실시양태에서, 병원체는 세포외 병원체이다.
한 실시양태에서, 세포내 병원체와 같은 병원체 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응(delayed-type hypersensitivity response)이다.
본 발명의 다른 측면은 병원체로부터의 감염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피험체로부터 얻은 시료를 본 발명의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계 및 병원체 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
다시, 특정 실시양태에서, 병원체는 세포내 병원체, 세포외 병원체, 예를 들면 우선적으로 세포내 생명-주기를 갖는 병원체, 또는 예를 들면 우선적으로 세포외 생명-주기를 갖는 병원체이다.
한 실시양태에서, 병원체 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 병원체에 대한 항체가 존재함을 검출하는 것이다.
한 실시양태에서, 병원체 존재를 나타내는 반응은 상기 시료에서 병원체에 반응하는 면역 세포의 존재를 검출하는 것이다.
한 실시양태에서, 병원체에 대한 항체 존재의 검출은 면역분석법(immunoassay)에 의해 행한다.
한 실시양태에서, 병원체에 대한 항체 존재의 검출은 ELISA, 방사면역측정법(radioimmunoassay-assay) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 행한다.
한 실시양태에서, 병원체 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 병원체에 반응하는 면역 세포의 존재를 검출하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자를 제조하는 방법을 제공하며,
상기 방법은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는, 1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계,
발현 구조물의 발현 및 폴리머 입자의 형성에 적당한 조건하에 상기 숙주 세포를 유지하는 단계, 및
상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자를 분리하는 단계.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발견 구조물을 포함하는 일부 실시양태에서, 1 이상의 발현 구조물은 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된다:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발현 구조물을 포함하는 다른 실시양태에서, 발현 구조물 중 하나는 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하며, 1 이상의 발현 구조물은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 구조물의 혼성 군집을 포함하며, 상기 각 발현 구조물은 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며,
융합 폴리펩티드는 1 이상의 입자-형성 단백질 및
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 발현 구조물에 관한 것으로,
발현 구조물은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 발현 구조물에 관한 것으로,
발현 구조물은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 존재한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 존재한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
융합 폴리펩티드의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 결합하는 1 이상의 폴리펩티드를 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원이거나, 또는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 다른 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 다른 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자들의 조성물에 관한 것으로, 폴리머 입자들은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자들의 조성물에 관한 것으로, 폴리머 입자들은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은:
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원,
1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역,
1 이상의 보조제, 또는
1 이상의 면역조절제 또는 분자들 중 1 이상을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 대하여 피험체를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 대하여 피험체를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합되어, 피험체가 포함하거나, 또는 피험체에 투여된다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합되어 피험자가 포함하거나, 또는 피험자에 투여된다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험자는 투버쿨로시스에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험자는 투버쿨로시스에 대하여 예방접종되었다. 일례로, 피험자는 바실루스 칼메트-게렝(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)에 의해 백신화되었다(세계보건기구 - http://www.who.int).
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 의해 감염된 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 내인성 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 대하여 피험자를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 대하여 피험자를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험자는 투버쿨로시스에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험자는 투버쿨로시스에 대하여 예방접종되었다. 예를 들면, 피험자는 바실루스 칼메트-게렝(BCG)에 의해 백신화되었다.
본 발명의 다른 측면은 투버쿨로시스에 의해 감염되거나 또는 이에 대하여 예방접종된 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
투버쿨로시스에 대하여 피험자를 예방접종하거나, 또는 투버쿨로시스에 의해 감염되거나 또는 예방접종된 피험자를 포함하는 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 상기 폴리머 입자의 용도가 또한 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에서 투버쿨로시스를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 피험자에 투여하는 단계 및 마이코박테리움 투버쿨로시스의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스의 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응(delayed-type hypersensitivity response)이다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에서 투버쿨로시스를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피험자로부터 얻은 시료를 본 발명의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계 및 마이코박테리움 투버쿨로시스의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대한 항체의 존재를 나타낸다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대한 항체의 존재는 면역분석법에 의해 검출된다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대한 항체의 존재를 검출하는 것은 ELISA, 방사면역분석법 또는 웨스턴 블롯에 의해 행한다.
한 실시양태에서, 세포내 병원체의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대하여 반응하는 면역 세포가 존재함을 나타내는 반응이다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대하여 반응하는 면역 세포의 존재는 세포증식 분석법, FACS를 포함하는 세포분류 분석법 또는 인시츄 동소교합 분석법(in situ hybridisation assay)에 의해 검출된다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자들을 제조하는 방법을 제공하며,
상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및 간염 항원 또는 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계;
발현 구조물의 발현 및 폴리머 입자의 형성에 적당한 조건하에 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
숙주 세포들로부터 폴리머 입자들을 분리하는 단계.
숙주 세포가 2 이상의 다른 발현 구조물을 포함하는 일부 실시양태에서, 1 이상의 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발현 구조물을 포함하는 다른 실시양태에서, 발현 구조물 중 하나는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 1 이상의 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 구조물의 혼성 군집을 포함하며, 각 발현 구조물들은 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 융합 폴리펩티드는:
1 이상의 입자-형성 단백질 및
1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 간염 항원 결합 영역
을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 발현 구조물에 관한 것으로, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
간염 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 발현 구조물에 관한 것으로, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
간염 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 간염 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 간염 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 간염 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
융합 폴리펩티드의 간염 항원 결합 영역에 결합하는 1 이상의 폴리펩티드를 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 간염 항원이거나, 또는 1 이상의 간염 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
1 이상의 간염 항원 결합 영역에 결합하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 간염 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 발현 구조물을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 간염 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 간염 항원 결합 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은:
하기 중 1 이상을 추가로 포함한다:
1 이상의 간염 항원,
1 이상의 간염 항원 결합 영역,
1 이상의 보조제, 또는
1 이상의 면역조절제 또는 분자들.
본 발명의 다른 측면은 간염에 대하여 피험자에 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 간염에 대하여 피험자에 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 간염 항원 결합 영역은 1 이상의 간염 항원에 결합하여 피험자가 포함하거나 피험자에 투여된다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 간염 항원 결합 영역은 1 이상의 간염 항원에 결합하여, 피험자가 포함하거나, 피험자에 투여된다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험자는 간염에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험자는 간염에 대하여 예방접종되었다.
본 발명의 다른 측면은 간염에 의해 감염된 피험자에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 간염 항원 결합 영역은 내인성 간염 항원에 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 간염에 대하여 피험자를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 간염에 대하여 피험자를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험자에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험체는 간염에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험체는 간염에 대하여 예방접종되었다.
본 발명의 다른 측면은 간염에 의해 감염되거나, 또는 예방접종된 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
간염에 의해 감염되거나 또는 예방접종된 피험체를 포함하는 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한, 또는 간염에 대하여 피험체를 예방접종하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 상기 설명된 폴리머 입자의 용도도 또한 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 간염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 피험체에 투여하는 단계 및 바이러스성 간염이 존재함을 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 바이러스성 간염의 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응(delayed-type hypersensitivity response)이다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 간염을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피험체로부터 얻은 시료를 본 발명의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계 및 바이러스성 간염의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 바이러스성 간염의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 바이러스성 간염 항원에 대한 항체가 존재한다는 것이다.
한 실시양태에서, 간염 항원에 대한 항체의 존재는 면역분석법에 의해 검출된다.
한 실시양태에서, 바이러스성 간염 항원에 대한 항체의 존재를 검출하는 것은 ELISA, 방사면역측정-분석법, 또는 웨스턴 블롯에 의해 실시한다.
한 실시양태에서, 세포내 병원체의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 간염 항원에 대하여 반응하는 면역 세포가 존재한다는 것이다.
한 실시양태에서, 바이러스성 간염 항원에 대하여 반응하는 면역 세포의 존재는 세포증식 분석법, FACS를 포함하는 세포분류 분석법 또는 인시츄 교잡 분석법에 의해 검출된다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자를 제조하는 방법을 제공하며,
상기 방법은:
입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계;
발현 구조물을 발현하고, 폴리머 입자를 형성하기에 적당한 조건하에 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
숙주 세포로부터 폴리머 입자들을 분리하는 단계
를 포함한다.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발현 구조물들을 포함하는 일부 실시양태에서, 1 이상의 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발현 구조물들을 포함하는 다른 실시양태에서, 발현 구조물 중 하나는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 1 이상의 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
숙주 세포가 발현 구조물의 혼성 군집을 포함하는 한 실시양태에서, 각 발현 구조물은 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 융합 폴리펩티드는 1 이상의 입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및 인플루엔자 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 인플루엔자 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재한다.
한 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재한다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
융합 폴리펩티드의 인플루엔자 항원 결합 영역에 결합하는 1 이상의 폴리펩티드를 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 인플루엔자 항원이거나, 또는 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 발현 구조물은:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 추가의 폴리펩티드는 입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는:
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-형성 단백질 및 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
1 이상의 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 발현 구조물을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 인플루엔자 항원들을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 인플루엔자 항원 결합 영역들을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 폴리머 입자의 조성물에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 인플루엔자 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은:
1 이상의 인플루엔자 항원들,
1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역들,
1 이상의 보조제들, 또는
1 이상의 면역조절제 또는 분자들 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 대하여 피험체를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 대하여 피험체를 예방접종하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드들은 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 인플루엔자 항원 결합 영역은 1 이상의 인플루엔자 항원에 결합되어 피험체가 포함하거나, 또는 피험체에 투여된다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하며, 인플루엔자 항원 결합 영역은 1 이상의 인플루엔자 항원에 결합되어, 피험체가 포함하거나, 또는 피험체에 투여된다.
한 실시양태에서, 1 이상의 폴리머 입자는 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험체는 인플루엔자에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험체는 인플루엔자에 대하여 예방접종받았다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 의해 감염된 피험체에 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 항원 결합 영역은 내인성 인플루엔자 항원에 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 대하여 피험체를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 대하여 피험체를 예방접종하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 폴리머 입자는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 1 이상의 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리머 입자는 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물내에 존재한다.
한 실시양태에서, 피험체는 인플루엔자에 의해 감염된다.
다른 실시양태에서, 피험체는 인플루엔자에 대하여 예방접종받았다.
본 발명의 다른 측면은 인플루엔자에 의해 감염되거나, 또는 예방접종받은 피험체에 면역 반응을 유도하기 위한 폴리머 입자에 관한 것으로, 상기 폴리머 입자는 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함한다.
인플루엔자에 대하여 피험체를 예방접종하기 위해, 또는 인플루엔자에 의해 감염되거나 또는 예방접종받은 피험체를 포함하는 피험체에 면역 반응을 유도하기 위해 약제를 제조하는데 있어서 상기 폴리머 입자의 용도가 또한 고려된다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에서 인플루엔자를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 피험체에 투여하는 단계 및 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응이다.
본 발명의 다른 측면은 피험체에서 인플루엔자를 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피험체로부터 얻은 시료를 본 발명의 폴리머 입자와 접촉시키는 단계 및 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내에 인플루엔자 항원에 대한 항체가 존재함을 나타낸다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 항원에 대한 항체의 존재는 면역분석법에 의해 검출된다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 항원에 대한 항체의 존재를 검출하는 것은 ELISA, 방사면역분석-분석법, 또는 웨스턴 블롯에 의해 수행된다.
한 실시양태에서, 세포내 병원체의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료내 인플루엔자 항원에 대하여 반응하는 면역 세포의 존재를 나타낸다.
한 실시양태에서, 인플루엔자 항원에 대하여 반응하는 면역 세포의 존재는 세포 증식 분석법, FACS를 포함하는 세포분류 분석법, 또는 인시츄 교잡 분석법에 의해 검출된다.
하기 실시양태들은 상기 측면들 중 어느 하나에 관한 것이다.
여러 실시양태들에서, 입자-형성 단백질은 폴리머 신타제이다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리-베타-아미노산, 폴리락테이트, 폴리티오에스테르 및 폴리에스테르로부터 선택되는 폴리머를 포함한다. 가장 바람직하게는, 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트(PHA), 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트(PHB)를 포함한다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 인지질 단일층에 의해 피막된(encapsulated) 폴리머 입자를 포함한다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드들을 포함한다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자 표면상에 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자 표면상에 3 이상의 상이한 융합 폴리펩티드와 같은 3 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함한다.
여러 실시양태에서, 폴리머 입자는 폴리머 입자에 결합된 1 이상의 물질, 또는 통합된 물질, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
여러 실시양태에서, 물질은 항원, 보조제 또는 면역조절 분자이다.
여러 실시양태에서, 물질은 가교에 의해 폴리머 입자에 결합된다.
여러 실시양태에서, 폴리머 신타제는 폴리머 입자에 결합되거나, 또는 인지질 단일층에 결합되거나, 또는 둘다에 결합된다.
여러 실시양태에서, 폴리머 신타제는 이를 형성하는 폴리머 입자에 공유결합되거나 또는 비공유결합된다.
여러 실시양태에서, 폴리머 신타제는 클래스 1 아시네토박터속(class 1 genera Acinetobacter), 비브리오속(Vibrio ), 에어로모나스속( Aeromonas ), 클로로박테리움 슈도모나스속( Chromobacterium , Pseudomonas ), 주글레아속( Zoogloea ), 알칼리게네스속( Alcaligenes ), 델프티아속( Delftia ), 버크홀데리아속( Burkholderia ), 랄스토니아속( Ralstonia ), 로도코쿠스속(Rhodococcus ), 고도니아속( Gordonia ), 로도박터속( Rhodobacter ), 파라코쿠스속( Paracoccus ), 리켓시아속( Rickettsia ), 카울로박터속( Caulobacter ), 메틸로박테리움속( Methylobacterium ), 아조리조비움속( Azorhizobium ), 아그로박테리움속( Agrobacterium ), 라이조븀속( Rhizobium ), 시노리조븀속( Sinorhizobium ), 리켓시아속( Rickettsia ), 크레나캐오타속( Crenarchaeota ), 시네코사이스티스속( Synechocystis ), 엑토티오호도스피라속( Ectothiorhodospira ), 티오캡사속( Thiocapsa ), 티오사이스티스속( Thyocystis ) 및 알로크로마티움속( Allochromatium ), 클래스 2 버크홀데리아속( Burkholderia ) 및 슈도모나스속( Pseudomonas ), 또는 클래스 4 바실루스속(Bacillus)으로부터의 PHA 신타제, 보다 바람직하게는 클래스 1 아시네토박터(Acinetobacter ) sp . RA3849 , 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ), 장염비브리오균( Vibrio parahaemolyticus ), 지느러미적병( Aeromonas punctata ) FA440 , 솔방울병( Aeromonas hydrophila ), 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp . 61-3, 주글레아 라미제라( Zoogloea ramigera ), 알칼리게네스 라투스( Alcaligenes latus), 알칼리게네스( Alcaligenes ) sp . SH-69, 델프티아 아시도보란스( Delftia acidovorans), 버크홀데리아( Burkholderia ) sp . DSMZ9242, 랄스토니아 유트로피아( Ralstonia eutrophia ) Hl 6, 버크홀데리아 세파시아( Burkholderia cepacia ), 로도코쿠스 루버( Rhodococcus rubber ) PP2 , 고르도니아 루브리퍼팅쿠스( Gordonia rubripertinctus), 리켓시아 프로와제키( Rickettsia prowazekii ), 시네코사이스티스( Synechocystis ) sp . PCC6803 , 엑토티오호도스피라 샤포쉬니코비(( Ectothiorhodospira shaposhnikovii ) Nl , 티오캡사 페니기( Thiocapsa pfennigii) 9111, 알로크로마티움 비노숨( Allochromatium vinosum ) D, 티오사이스티스 비올라세아( Thyocystis violacea ) 2311, 로도박터 스패로이데스( Rhodobacter sphaeroides), 파라코쿠스 데니트리피칸스( Paracoccus denitri β cans ), 로도박터 캡슐라투스( Rhodobacter capsulatus ), 카울로박터 크레센투스( Caulobacter crescentus), 메틸로박테리움 엑스토퀸스( Methylobacterium extorquens ), 아조리조븀 카울리노단스( Azorhizobium caulinodans ), 아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ), 시노리조븀 멜리로티( Sinorhizobium meliloti ) 41, 로도스피릴륨 루브룸( Rhodospirillum rubrum ) HA , 및 로도스피릴륨 루브룸( Rhodospirillum rubrum ) ATCC25903, 클래스 2 버크홀데리아 캐리오필리( Burkholderia caryophylli ), 슈도모나스 클로라피스( Pseudomonas chloraphis ), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 61-3, 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida ) U, 슈도모나스 올레오보란스( Pseudomonas oleovorans ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 레지노보란스( Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스 스투트제리( Pseudomonas stutzeri ), 슈도모나스 멘도시나( Pseudomonas mendocina ), 슈도모나스 슈돌칼리게네스( Pseudomonas pseudolcaligenes), 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida ) BMOl, 슈도모나스 니트로레듀신스( Pseudomonas nitroreducins ), 슈도모나스 클로라피스( Pseudomonas chloraphis), 및 클래스 4 바실루스 메가테리움( Bacillus megaterium ) 및 바실루스( Bacillus ) sp. INT005를 포함하는 그룹으로부터의 PHA 신타제이다.
다른 실시양태에서, 폴리머 신타제는 그람-음성 및 그람-양성 유박테리아(eubacteria)로부터의 PHA 폴리머 신타제 또는 원시세균류(archaea)로부터의 PHA 폴리머 신타제이다.
여러 실시예에서, 폴리머 신타제는 각각 쿠프리아비두스 네카토(C. necator), 녹농균(P. aeruginosa ), 에이. 비노숨 (A. vinosum ), 바실루스 메가테리움(B. megaterium ), 할로아르쿨라 마리스모르투이 (H. marismortui ), 슈도모나스 아우레오파시엔스(P. aureofaciens ), 또는 슈도모나스 푸티다(P. putida )(등록번호 AY836680, AE004091, AB205104, AF109909, YP137339, AB049413 및 AF150670)로부터의 PHA 폴리머 신타제를 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적당한 다른 폴리머 신타제로는 각각이 하기 유기체들로부터 등록번호로 확인되는 폴리머 신타제가 포함된다: 알. 유트로파(R. eutropha) (A34341), 티. 프페니기(T. pfennigii ) (X93599), 에이. 펑타타(A. punctata) (032472), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 61-3 (AB014757 및 AB014758), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides ) (AAA72004), 시. 비올라세움(C. violaceum ) (AAC69615), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis ) SK2 (CAL17662), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis) SK2 (CAL16866), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides ) KD131 (ACM01571 및 YP002526072), 알. 오파쿠스(R. opacus ) B4 (BAH51880 및 YP002780825), 비. 멀티보란스(B. multivorans ) ATCC 17616 (YP001946215 및 BAG43679), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis ) SK2(YP693934 및 YP693138), 알 루브룸(R. rubrum ) (AAD53179), 감마 프로테오박테리움( gamma proteobacterium ) HTCC5015 (ZP05061661 및 EDY86606), 아조아르쿠스( Azoarcus ) sp. BH72 (YP932525), 시. 비올라세움(C. violaceum ) ATCC 12472 (NP902459), 림노박터( Limnobacter ) sp. MED105 (ZP01915838 및 EDM82867), 엠. 알기콜라(M. algicola) DG893 (ZP01895922 및 EDM46004), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides ) (CAA65833), 시. 비올라세움(C. violaceum ) ATCC 12472 (AAQ60457), 에이. 라투스(A. latus ) (AAD10274, AAD01209 및 AAC83658), 에스. 말토필라(S. maltophilia ) K279a (CAQ46418 및 YP001972712), 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum ) IPO1609 (CAQ59975 및 YP002258080), 비. 멀티보란스(B. multivorans ) ATCC 17616 (YP001941448 및 BAG47458), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. gll3 (ACJ02400), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. glO6 (ACJ02399), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. glO1 (ACJ02398), R. sp. gl32 (ACJ02397), 알. 레구미노사룸(R. leguminosarum ) bv. 비시애(viciae) 3841 (CAK10329 및 YP770390), 아조아르쿠스( Azoarcus ) sp. BH72 (CAL93638), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. LDC-5 (AAV36510), 엘. 니트로페룸(L. nitroferrum) 2002 (ZP03698179), 타우에라( Thauera ) sp. MZlT (YP002890098 및 ACR01721), 엠. 라디오톨레란스(M. radiotolerans ) JCM 2831 (YP001755078 및 ACB24395), 메틸로박테리움( Methylobacterium ) sp. 4-46 (YP001767769 및 ACA15335), 엘. 니트로페룸(L. nitroferrum ) 2002 (EEG08921), 피. 데니트리피칸스(P. denitrificans ) (BAA77257), 엠. 그리피스발덴세(M. gryphiswaldense ) (ABG23018), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. USM4-55 (ABX64435 및 ABX64434), 에이. 하이드로필라(A. hydrophila ) (AAT77261 및 AAT77258), 바실루스( Bacillus ) sp. INT005 (BAC45232 및 BAC45230), 피. 푸티다(P. putida ) (AAM63409 및 AAM63407), 지. 루브리페르틴투스(G. rubripertinctus) (AAB94058), 비. 메가테리움(B. megaterium) (AAD05260), 디. 아시도보란스(D. acidovorans ) (BAA33155), 피. 세리니필루스(P. seriniphilus ) (ACM68662), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 14-3 (CAKl 8904), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. LDC-5 (AAXl 8690), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. PC17 (ABV25706), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 3Y2 (AAV35431, AAV35429 및 AAV35426), 피. 멘도시나(P. mendocina ) (AAM10546 및 AAM10544), 피. 니트로레두센스(P. nitroreducens ) (AAK19608), 피. 슈도알칼리게네스(P. pseudoalcaligenes ) (AAKl 9605), 피. 레지노보란스 (P. resinovorans ) (AAD26367 및 AAD26365), 슈도모나스(Pseudomonas ) sp. USM7-7 (ACM90523 및 ACM90522), 피. 플루오레세스(P. fluoresces) (AAP58480) 및 다른 미배양 박테리아 (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE0286, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 및 BAE06852).
여러 실시양태에서, 폴리머 신타제는 기질 (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르 또는 이들의 유도체들을 중합하거나 또는 이들 중합을 용이하게 함으로써, 폴리머 입자들의 시험관내 제조에 사용될 수 있다.
여러 실시양태에서, 기질 또는 기질 혼합물들은 1 이상의 선택적으로 치환된 아미노산, 락테이트, 에스테르 또는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 아세틸-CoA를 포함한다.
여러 실시양태에서, 발현 구조물은 높은 복제수에 있다.
여러 실시양태에서, 발현 구조물은 추가의 폴리펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함한다.
여러 실시양태에서, 상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다:
(i) 1 이상의 티올라제, 또는
(ii) 1 이상의 리덕타제, 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘다.
여러 실시양태에서, 상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함한다:
(i) 1 이상의 티올라제,
(ii) 1 이상의 리덕타제,
(iii) 1 이상의 폴리머 신타제;
(iv) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
(v) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역,
(vi) 1 이상의 상기 (i) 내지 (v)를 포함하는 융합 단백질,
(vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 조합.
여러 실시양태에서, 상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함한다:
(i) 1 이상의 티올라제,
(ii) 1 이상의 리덕타제,
(iii) 1 이상의 폴리머 신타제,
(iv) 세포-매개 변역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
(v) 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역,
(vi) 1 이상의 상기 (i) 내지 (v)를 포함하는 융합 단백질,
(vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 조합.
여러 실시양태에서, 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 강한 프로모터에 조작가능하게 연결된다.
여러 실시양태에서, 강한 프로모터는 바이러스성 프로모터 또는 파아지 프로모터이다.
여러 실시양태에서, 프로모터는 파아지 프로모터, 예를 들면 T7 파아지 프로모터이다.
여러 실시양태에서, 숙주 세포는 입자-형성 단백질의 기질, 바람직하게는 폴리머 신타제의 기질(존재하는 경우), 또는 기질 혼합물(모노머 기질 포함), 또는 입자-형성 단백질의 기질을 형성하기 위해 숙주세포에 의해 대사작용될 수 있는 전구체 기질의 존재하에 유지된다.
여러 실시양태에서, 숙주 세포는 2 이상의 상이한 발현 구조물들을 포함한다.
숙주 세포가 2 이상의 상이한 발현 구조물들을 포함하는, 여러 실시양태에서, 발현 구조물 중 하나는:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
입자-크기 결정 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
폴리머 조절제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물
을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
여러 실시양태에서, 융합 폴리펩티드에 대하여 코딩하는 핵산 서열은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단과 인접한, 피험체에 세포-매개 반응을 유도하거나, 또는 피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열; 또는
원하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단과 간접적으로 융합된, 피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산 서열; 또는
선택적으로 원하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해, 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 삽입된 피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산 서열; 또는
피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 피험체에 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산 서열과 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열 사이에 개재된 프로테아제 분해 부위를 코딩하는 핵산 서열; 또는
세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산 서열과 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열 사이에 개재된 자가-스플라이싱 요소를 코딩하는 핵산 서열; 또는
이들 중 2 이상의 조합.
여러 실시양태에서, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단과 인접한, 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하고, 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원과 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 아미노산 서열; 또는
원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단과 간접적으로 융합된, 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 아미노산 서열; 또는
원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산서열에 삽입된, 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 아미노산 서열; 또는
세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 아미노산 서열과 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 개재된 프로테아제 분해 부위를 포함하는 아미노산 서열; 또는
세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원에 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 아미노산 서열과, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 개재된 자가-스플라이싱 요소를 포함하는 아미노산 서열; 또는
이들 중 2 이상의 조합.
여러 실시양태에서, 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단과 인접한 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열; 또는
원하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서를 통해 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단과 간접적으로 융합된 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열; 또는
원하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해 선택적으로 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 삽입된 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열; 또는
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열과 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이에 개재된 프로테아제 분해 부위를 코딩하는 핵산 서열; 또는
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열과 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이에 개재된 자가-스플라이싱 요소를 코딩하는 핵산 서열; 또는
이들 중 2 이상의 조합.
여러 실시양태에서, 1 이상의 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단과 인접한 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 아미노산 서열; 또는
원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단과 간접적으로 융합된 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 핵산 서열; 또는
원하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열에 삽입된 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 아미노산 서열; 또는
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 아미노산 서열과 입자-형성 단백질을 코딩하는 아미노산 서열 사이에 개재된 프로테아제 분해 부위를 포함하는 아미노산 서열; 또는
마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 아미노산 서열과 입자-형성 단백질을 코딩하는 아미노산 서열 사이에 개재된 자가-스플라이싱 요소를 포함하는 아미노산 서열; 또는
이들 중 2 이상의 조합.
여러 실시양태에서, 발현 구조물은 구성적 또는 조절가능한 프로모터 시스템을 포함한다.
여러 실시양태에서, 조절가능한 프로모터 시스템은 유도성 또는 억제가능한 프로모터 시스템이다.
여러 실시양태에서, 조절가능한 프로모터 시스템은 Lad, Trp, 파아지 γ 및 파아지 RNA 폴리머라제로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 프로모터는 당 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 강한 프로모터이다. 적당한 강한 프로모터는 아데노바이러스 프로모터, 예를 들면 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(adenoviral major late promoter); 또는 이종 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 프로모터; 시미안 바이러스(simian virus) 40 (SV40) 프로모터; 유도성 프로모터, 예를 들면 MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter); 열충격 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스성 티미딘 키나제 프로모터, 예를 들면 단순포진 티미딘 키나제 프로모터(Herpes simplex thymidine kinase promoter); 레트로바이러스성(retroviral) LTRs; b-액틴(actin) 프로모터; 인간성장호르몬 프로모터; 파아지 프로모터, 예를 들면 T7, SP6 및 T3 RNA 폴리머라제 프로모터 및 꽃양배추 모자이크(cauliflower mosaic) 35 S (CaMV 35S) 프로모터를 포함한다.
여러 실시양태에서, 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터, 예를 들면, WO 2007/037706로 공개된 PCT/NZ2006/000251에 개시되어 있는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터이다.
여러 실시양태에서, 세포는 상이한 융합 폴리펩티드를 각각 코딩하는 2 이상의 상이한 발현 구조물들을 포함한다.
여러 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원은 세포내 병원체로부터 유도된 항원이다.
여러 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원은,
마이코박테리움(Mycobacterium)[예컨대, 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(M. leprae), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 아비움 파라투버쿨로시스(M. avium paratuberculosis), 마이코박테리움종], 리스테리아(Listeria)[예컨대, 리스테리아 모노사이토겐스(L. monocytogenes), 리스테리아종), 살모넬라(Salmonella)[예컨대, 살모넬라 티파이(S. typhi)], 여시니아(Yersinia)[예컨대, 여시니아 페스티스(Y. pestis), 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 여시니아 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)], 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레지오넬라(Legionella)[예컨대, 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila), 레지오넬라 롱베아캐(L. longbeachae), 레지오넬라 보제마니이(L. bozemanii), 레지오넬라종], 리케치아(Rickettsia)[예컨대, 리케치아 리케치이(R. rickettsii), 리케치아 아카리(R. akari), 리케치아 코노리이(R. conorii), 리케치아 시베리카(R. siberica), 리케치아 아우랄리스(R. australis), 리케치아 자포니카(R. japonica), 리케치아 아프라캐(R. africae), 리케치아 프로와제키이(R. prowazekii), 리케치아 티파이(R. typhi), 리케치아종], 클라미디아(Chlamydia)[예컨대, 클라미디아 뉴모니애(C. pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미디아종], 클라미도필라(Clamydophila)[예컨대, 클라미도필라 시타시(C. psittaci), 클라미도필라 아보르투스(C. abortus)], 스트렙토코커스(Streptococcus)[예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 표게네스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)], 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)를 포함하는 스타필로코커스(Staphylococcus)[스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)], 에를리키아(Ehrlichia)[예컨대, 에를리키아 차프펜시스(E. chaffeensis), 에를리키아파고사이토필라 제노군(Ehrlichia phagocytophila geno group), 에를리키아종), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 리슈마니아종(Leishmania sp.), 톡스폴라스마 곤디이(Toxpolasma gondii), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 히스토플라즈마종(Histoplasma sp.), 프란시셀라 튤라렌시스(Francisella tularensis), 및 C형 간염 바이러스, 아데노바이러스(Adenoviruses), 콕사키바이러스(coxsackievirus), A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus)를 포함하는 피코르나바이러스(Picornaviruses), 에프스테인-바 바이러스(epstein-barr virus), 헤르페스 심플렉스 타입 1, 헤르페스 심플렉스 타입 2, 사람 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus), 사람 헤르페스바이러스 타입 8, 바리셀라-조스테르 바이러스(varicella-zoster virus)를 포함하는 헤르페스바이러스(Herpesviruses), B형 간염 바이러스를 포함하는 헤파드나바이러스(Hepadnaviruses), C형 간염 바이러스, 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기 바이러스(dengue virus)를 포함하는 플라비바이러스(Flaviviruses), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 사람 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함하는 레트로바이러스(Retroviruses), 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 포함하는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses), 홍역 바이러스(measles virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 포함하는 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses), 파필로마바이러스(papillomavirus)를 포함하는 파필로마바이러스(Papillomaviruses), 라비에스 바이러스(rabies virus)를 포함하는 랍도바이러스(Rhabdoviruses), 루벨라 바이러스(Rubella virus)를 포함하는 토가바이러스(Togaviruses) 및 백시니아(vaccinia), 아비폭스(avipox), 아데노-결합 바이러스(adeno-associated virus), 변형된 백시니아 스트레인 안카라(modified Vaccinia Strain Ankara), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 폭스바이러스(poxvirus), 코로나 바이러스를 포함하는 기타 바이러스를 포함하는 병원체 그룹으로부터 유래된 항원으로부터 선택되거나, 또는 상기 기술된 항원의 1 이상의 항원성 일부 또는 T-세포 에피토프(epitope)이다.
여러 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원은 조기 분비항원 타겟(ESAT)-6, Ag85A, Ag85B (MPT59), Ag85B, Ag85C, MPT32, MPT51, MPT59, MPT63, MPT64, MPT83, MPB5, MPB59, MPB64, MTC28, Mtb2, Mtb8.4, Mtb9.9, Mtb32A, Mtb39, Mtb41, TB10.4, TBlOC, TBI lB, TB12.5, TB13A, TB14, TB15, TB15A, TB16, TB16A, TB17, TB18, TB21, TB20.6, TB24, TB27B, TB32, TB32A, TB33, TB38, TB40.8, TB51, TB54, TB64, CFP6, CFP7, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP1O, CFP11, CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B, CFP25, CFP25A, CFP27, CFP28, CFP28B, CFP29, CFP30A, CFP30B, CFP50, CWP32, hspX (알파-결정성), APA, 투버쿨린 정제된 단백질 유도체(PPD), ST-CF, PPE68, LppX, PstS-1, PstS-2, PstS-3, HBHA, GroEL, GroEL2, GrpES, LHP, 19kDa 리포단백질, 71kDa, RD1-ORF2, RD1-ORF3, RD1-ORF4, RD1-ORF5, RD1-ORF8, RD1-ORF9A, RD1-ORF9B, Rv1984c, RvO577, Rv1827, BfrB, Tpx. Rv1352, Rv1810, PpiA, Cut2, FbpB, FbpA, FbpC, DnaK, FecB, Ssb, RplL, FixA, FixB, AhpC2, Rv2626c, Rvl211, Mdh, Rvl626, Adk, ClpP, SucD (Belisle et al, 2005; US 7,037,510; US 2004/0057963; US 2008/0199493; US 2008/0267990)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 항원, 또는 상기 기술된 항원의 1 이상의 항원성 일부 또는 T-세포 에피토프(epitope)이다.
한 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원은 조기분비 항원 타겟(ESAT)-6, Ag85A, ESAT-6의 1 이상의 항원성 일부, Ag85A의 1 이상의 항원성 일부, 또는 이들 중 2 이상의 조합, 예를 들면 ESAT-6 및 Ag85A 둘다이다.
여러 실시양태에서, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 단백질, 단백질 단편, 결합 영역, 타겟-결합 영역, 결합 단백질, 결합 단백질 단편, 항체, 항체 단편, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 단일쇄 항체, 단일-영역 항체(예를 들면, VHH), Fab 항체 단편, Fc 항체 단편, Fv 항체 단편, F(ab')2 항체 단편, Fab' 항체 단편, 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편, T-세포 수용체, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 결합체로부터 선택된다.
예를 들면, 여러 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 단백질, 단백질 단편, 결합 영역, 타겟-결합 영역, 결합 단백질, 결합 단백질 단편, 항체, 항체 단편, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 단일쇄 항체, 단일-영역 항체(예를 들면, VHH), Fab 항체 단편, Fc 항체 단편, Fv 항체 단편, F(ab')2 항체 단편, Fab' 항체 단편, 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편, T-세포 수용체, MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, 또는 이들의 결합체로부터 선택된다.
여러 실시양태에서, 조성물은 폴리머 입자들의 균일한 군집을 포함한다.
여러 실시양태에서, 조성물은 폴리머 입자들의 혼합 군집을 포함한다.
면역 반응은 세포-매개 면역 반응이거나, 또는 체액성 면역 반응이거나, 또는 세포-매개 면역 반응과 체액성 면역 반응 둘다의 결합체이다.
예를 들면, 면역 반응은 큰 체액성 반응없는 세포-매개 면역 반응이다. 예를 들면, 면역 반응은 세포-매개 면역 반응, 예를 들면 큰 IgA 반응의 부재하에, 또는 큰 IgE 반응의 부재하에, 또는 큰 IgG 반응(큰 IgG1 반응, 또는 큰 IgG2 반응 포함), 또는 큰 IgM 반응의 부재하에, IFN-γ 반응으로 표시되는 반응이다.
다른 예에서, 면역 반응은 큰 세포-매개 반응없는 체액성 반응이다.
질병들 또는 여기에 기재된 증상의 치료 또는 예방에 효과적이 되도록 면역 반응을 유도하는 것이 본 발명의 초점이라는 것을 알 것이다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법에 대한 피험체의 반응이 실제로 세포-매개 면역 반응과 체액성 면역 반응의 결합체가 되도록, 세포-매개 면역 반응을 유도하는 면역 반응의 주어진 성질이 도한 체액성 반응을 유도할 수도 있다는 것을 알 것이다.
본 명세서에 개시된 숫자 범위(예를 들면 1 ~ 10)에 대한 참조번호는 그 범위내의 모든 유리수 범위(예를 들면, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 그 범위내의 특정 유리수 범위(예를 들면, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 참조번호를 통합하며, 그러므로, 본 명세서에 개시된 모든 범위의 모든 하위범위들은 여기에 명확하게 개시되어 있다. 이들은 특별히 정해진 것의 예들일뿐, 단지 열거된 최저값과 최고값 사이의 모든 가능한 수치조합들은 유사한 방법으로 본 명세서에서 특별히 기술될 것으로 고려된다.
본 발명의 또다른 측면 및 이점들은 단지 실시예의 방법에 의해 주어진 설명들을 설명하게 함으로써 분명해질 것이다.
참고문헌이 특허 명세서, 다른 외부 문서 또는 다른 정보원인 본 명세서에서, 이는 일반적으로 본 발명의 특징들을 설명하기 위해 문맥을 제공하기 위한 것이다. 특별히 다르게 지정하지 않는 한, 상기 외부 문서에 대한 참고는 관할내의 상기 문서들 또는 상기 정보원들이 선행 기술이거나 또는 당 분야의 통상적인 일반지식의 일부를 형성한다고 인정되는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명의 또다른 측면은 실시예의 방법에 의해서 주어진 하기 설명들로부터, 및 첨부된 도면들을 참조하여, 분명해질 것이다.
도 1은 Hep C 폴리머 입자들에 대한 항-Hep C 항체의 결합을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 4를 참조한다.
도 2는 간염 C에 대한 여러 폴리머 입자 백신에 의해 예방접종된 마우스내 IgG1 항체 반응을 나타낸다. EC50은 반-최대 광학밀도를 제공하는 상호혈청역가를 의미한다. 검출수준은 25이다. *는 다른 그룹에 대한 큰 차이를 나타낸다. (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 4를 참조한다.
도 3은 간염 C에 대한 여러 폴리머 입자 백신에 의해 예방접종된 마우스내 IgG2c 항체 반응을 나타낸다. EC50은 반-최대 광학밀도를 제공하는 상호혈청역가를 의미한다. 검출수준은 25이다. *는 다른 그룹에 대한 큰 차이를 나타낸다. (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 4를 참조한다.
도 4는 간염에 대한 여러 폴리머 입자 백신에 의해 예방접종된 마우스내 IFN-γ 반응을 나타낸다. *는 다른 그룹에 대한 큰 차이를 나타낸다. (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 4를 참조한다.
도 5는 Ag85A-ESAT-6을 나타내는 폴리머 입자 0-90μg 또는 재조합 Ag85A-ESAT-6 30μg에 의해 3회 예방접종받은 마우스내 항체 반응을 나타낸다. *는 PBS 예방접종된 대조군보다 매우 큰 반응을 나타낸다. (p<0.01). **는 다른 모든 백신군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). 본 명세서의 실시예 5를 참조한다.
도 6은 30μg의 야생형 폴리머 입자들, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자들, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자들(Emulsigen 가짐)에 의해 3회 예방접종되거나 또는 예방접종되지 않은 마우스내의 항체 반응을 나타낸다. *는 PBS 예방접종된 대조군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). **는 다른 모든 백신군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). 본 명세서의 실시예 5를 참조한다.
도 7은 Ag85A-ESAT-6을 표시하는 0-90μg 폴리머 입자들 또는 30μg 재조합 Ag85A-ESAT-6에 의해 3회 예방접종된 마우스내의 IFN-γ 반응을 나타낸다. *는 PBS 예방접종된 대조군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). **는 다른 모든 백신군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). 본 명세서의 실시예 5를 참조한다.
도 8은 30μg의 야생형 폴리머 입자들, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자들, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자들(Emulsigen 가짐)에 의해 3회 예방접종되거나 또는 예방접종되지 않은 마우스내의 IFN-γ 반응을 나타낸다. *는 PBS 예방접종된 대조군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). **는 다른 모든 백신군보다 매우 큰 반응을 나타낸다 (p<0.01). 본 명세서의 실시예 6을 참조한다.
도 9는 Ag85a-ESAT-6 폴리머 입자들에 대한 항-ESAT-6 항체의 결합을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 5를 참조한다.
도 10은 여러 폴리머 입자 백신들에 의해 마우스를 백신화한후 마이크로박테리움 보비스(M. bovis)로 도전된 폐 배양 결과를 나타낸다. *는 비백신화군과 통계적인 차이를 나타낸다 (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 6을 참조한다.
도 11은 여러 폴리머 입자 백신들에 의해 마우스를 백신화한후의 비장 배양 결과를 나타낸다. *는 비백신화군과 통계적인 차이를 나타낸다 (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 6을 참조한다.
도 12는 여러 폴리머 입자 백신들에 의해 마우스를 백신화한후 마이크로박테리움 보비스(M. bovis)로 도전된 IgG1 항체 반응을 나타낸다. EC50은 반-최대 광학밀도를 제공하는 상호 혈청 역가를 의미한다. 검출 수준은 25이다. *는 다른 군들과 큰 차이를 나타낸다 (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 6을 참조한다.
도 13은 여러 폴리머 입자 백신들에 의해 마우스를 백신화한후 마이크로박테리움 보비스(M. bovis)로 도전된 IgG2c 항체 반응을 나타낸다. EC50은 반-최대 광학밀도를 제공하는 상호 혈청 역가를 의미한다. 검출 수준은 25이다. *는 다른 군들과 큰 차이를 나타낸다 (p<0.05). 막대들은 SEM을 나타낸다. 본 명세서의 실시예 6을 참조한다.
본 발명은 폴리머 입자들 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 관능화된 폴리머 입자, 예를 들면 관능화 폴리머 입자들의 제조 방법 및, 본 명세서에서 확인되거나 설명된 것들을 포함하는 병원체에 의해 야기되는 또는 병원체와 관련된 여러 질병 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용되는 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 관능화된 폴리머 입자들은 1 이상의 표면-결합된 융합 폴리펩티드들을 포함하며, 또한 폴리머 입자 코어로 통합 또는 흡수된 1 이상의 물질들, 표면 결합된 융합 폴리펩티드들에 결합된 1 이상의 물질들, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
1. 정의
용어 "코딩 영역" 또는 "오픈 리딩 프레임(ORF)"은 적당한 조절서열의 조절하에 전사 생성물 및/또는 폴리펩티드를 생성할 수 있는 게놈 DNA 서열 또는 cDNA 서열의 센스 가닥을 의미한다. 코딩 서열은 5' 해독 개시 코돈 및 3' 해독 정지 코돈의 존재에 의해 확인된다. 유전자 구조물에 삽입될때, "코딩 서열"은 프로모터 및 종결 서열들에 조작가능하게 결합될 때 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는"은 "적어도 일부 포함하는"을 의미한다. 용어 "포함하는"을 포함하는 본 명세서에서 각 설명을 해석할때, 상기 용어의 특징과 다른 특징들도 또한 존재할 수 있다. 관련 용어, 예를 들면 "포함하다" 및 "포함한다"는 같은 방법으로 해석된다.
본 명세서에 사용된 용어 "결합 제제"는 한 쪽에 결합 제제를, 다른 한 쪽에 1 이상의 물질을 결합시키기에 적당한 추가의 결합 제제 또는 1 이상의 물질을 결합시키기에 적당한 무기 또는 유기 화합물을 의미한다. 적당한 결합 제제의 예 뿐만 아니라, 본 발명의 입자들 또는 융합 단백질들의 화학적 변형에 적당한 방법들을 포함한 이들의 용도를 위한 예시방법들은 PCT/DE2003/002799(WO 2004/020623으로 공개됨 (Bernd Rehm), 이후 참고문헌으로 통합됨)에 개시되어 있다.
용어 "발현 구조물"은 삽입 폴리누클레오티드 분자를 전사하고, 선택적으로 전사물을 폴리펩티드로 해독하는 것을 허용하는 요소들을 포함하는 유전자 구조물을 의미한다. 발현 구조물은 통상적으로 5' 내지 3' 방향으로 하기를 포함한다:
(1) 구조물이 도입될 숙주 세포내에서 작용하는 프로모터,
(2) 발현될 폴리누클레오티드, 및
(3) 구조물이 도입될 숙주 세포에서 작용하는 종결자.
본 발명의 발현 구조물은 클로닝 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터로 삽입되거나, 또는 숙주 게놈으로 통합된다.
본 발명에 사용하기 위해 개작되기 위해 처리할 수 있는 발현 구조물들의 예는 PCT/DE2003/002799 (WO 2004/020623 (Bernd Rehm)로 공개됨) 및 PCT/NZ2006/000251 (WO 2007/037706 (Bernd Rehm)으로 공개됨)(각각 이후에 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리머 입자를 형성" 및 "폴리머 입자의 형상"은 설명된 바와 같이 입자-형성 단백질의 활성을 의미한다.
폴리펩티드의 "단편"은 효소적 또는 결합 활성에 필요한 기능을 수행하고/하거나 폴리펩티드의 3차원 구조를 제공하는 폴리펩티드의 물질이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합 폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 각 아미노 및 카르복실 잔기를 통해 융합되어, 단일의 연속 폴리펩티드를 형성하는 2 이상의 아미노산 서열, 예를 들면 2 이상의 폴리펩티드 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 2 이상의 아미노산 서열은 링커 또는 스페이커 또는 추가의 폴리펩티드를 통해 이들의 각 아미노 및 카르복실 말단을 통해 직접 융합 또는 간접 융합될 수 있다고 이해되어야 한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열들 중 하나는 입자-형성 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열들 중 하나는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원, 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역 또는 융합 인자(fusion partner)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "융합 인자"는 폴리펩티드 예를 들면, 단백질 단편, 결합 영역, 타겟-결합 영역, 결합 단백질, 결합 단백질 단편, 항체, 항체 단편, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 단일쇄 항체, 단일-영역 항체(예를 들면, VHH), Fab 항체 단편, Fc 항체 단편, Fv 항체 단편, F(ab')2 항체 단편, Fab' 항체 단편, 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편, 항체 결합 영역(예를 들면, ZZ 영역), 항원, 항원성 결정요인, 에피토프, 합텐, 면역원, 면역원 단편, 비오틴, 비오틴 유도체, 아비딘, 스트렙타비딘, 기질, 효소, 항체효소, 보조인자, 수용체, 수용체 단편, 수용체 서브유닛, 수용체 서브유닛 단편, 리간드, 억제제, 호르몬, 렉틴, 폴리히스티딘, 결합 영역, DNA 결합 영역, FLAG 에피토프, 시스테인 잔기, 라이브러리 펩티드, 리포터 펩티드, 친화도 정제 펩티드 또는 이들 중 2 이상의 조합을 의미한다.
상기 열거된 2 이상의 폴리펩티드들은 융합 인자를 형성할 수 있다고 이해되어야 한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산서열은 링커 또는 스페이서를 통해 간접 융합되며, 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제-링커-면역반응을 유도할 수 있는 항원, 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원-링커-폴리머 신타제, 또는 폴리머 신타제-링커-면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역, 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역-링커-폴리머 신타제 순서로 배열된다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제-추가의 폴리펩티드-면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 또는 폴리머 신타제-추가의 폴리펩티드-면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역, 또는 폴리머 신타제-링커-면역 반응을 유도할 수 있는 항원-추가의 폴리펩티드, 또는 폴리머 신타제-링커-면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역-추가의 폴리펩티드 순서로 배열된 추가의 폴리펩티드를 통해 간접 융합되거나, 이를 포함한다. 다시, 폴리머 신타제의 N-말단 확장은 본 명세서에 분명하게 고려된다.
면역 반응은 세포-매개 면역 반응 및 체액성 면역 반응을 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 링커 또는 스페이서를 통해 간접적으로 융합되며, 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예를 들면, 폴리머 신타제-링커-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원, 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원-링커-폴리머 신타제, 또는 폴리머 신타제-링커-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역, 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역-링커-폴리머 신타제 순서로 배열된다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제-추가의 폴리펩티드-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원, 또는 폴리머 신타제-추가의 폴리펩티드-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역, 또는 폴리머 신타제-링커-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원-추가의 폴리펩티드 또는 폴리머 신타제-링커-마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역-추가의 폴리펩티드 순서로 배열된 추가의 폴리펩티드를 통해 간접 융합되거나, 또는 이를 포함한다. 다시, 폴리머 신타제의 N-말단 확장은 본 명세서에 분명하게 고려된다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드의 서열내에 삽입된 1 이상의 폴리펩티드 서열들을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 서열, 예를 들면 프로테아제 인지 서열은 입자 결합 영역을 포함하는 단백질의 가변영역으로 삽입된다.
편리하게도, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 단일 핵산 서열에 의해 코딩되며, 상기 핵산 서열은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 각각 코딩하는 2 이상의 서열들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2 이상의 서브서열들은 단일의 오픈 리딩 프레임으로서 "프레임으로(in frame)" 존재할 것이며, 따라서, 본 명세서에서 고려된 융합 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 다른 실시양태에서, 2 이상의 서브서열들은 "프레임 밖에" 존재하며, 해독시에 융합 폴리펩티드가 형성되도록 리딩 프레임에서 시프트를 촉진하는 리보좀 프레임-시프트 부위 또는 다른 서열에 의해 분리된다. 다른 실시양태에서, 상기 설명된 바와 같이, 2 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역은 추가의 폴리펩티드를 통해 간접 융합되는 곳에서, 2 이상의 서브서열들은 연속적이지 않다.
"결합 영역" 또는 "결합할 수 있는 영역"에 대한 참고는 상보결합짝의 1/2을 의미하며, 상기 리스트로부터의 결합짝들을 포함한다. 예를 들면, 항체-항원, 항체-항체 결합 영역, 비오틴-스트렙타비딘, 수용체-리간드, 효소-억제제 짝들이 있다. 타겟-결합 영역은 시료내 타겟 분자를 결합할 것이며, 예를 들면 항체, 또는 항체 단편이다. 폴리펩티드-결합 영역은 폴리펩티드를 결합할 것이며, 예를 들면 항체 또는 항체 단편, 또는 수용체 또는 신호 단백질로부터의 결합 영역이다.
결합 영역에 의해 결합되는 물질들의 예로는 단백질, 단백질 단편, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 항체, 항체 단편, 항체 결합 영역, 항원, 항원 단편, 항원성 결정체, 에피토프, 합텐, 면역원, 면역원 단편, 약학적으로 활성인 제제, 생물학적으로 활성인 제제, 보조제 또는 이들의 2 이상의 결합체가 포함된다. 상기 물질들은 본 발명에 따라 분석된 시료내 "타겟 성분들"이다.
따라서, "면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 영역" 및 문법적 균등물은 상보적 결합짝의 한 성분을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 다른 성분은 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다.
마찬가지로, "세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 영역" 및 문법적 균등물은 상보적 결합짝의 한 성분을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 다른 성분은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다. 예를 들면, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 결합할 수 있는 영역(마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역이라고도 함)은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합될 수 있는 영역이다.
따라서, "마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역"은 2 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 결합시킬 수 있는 영역이다.
본 명세서에 사용된 "마이코박테리움 투버쿨로시스 항원"은 마이코박테리움 투버쿨로시스로부터 유도된 항원이다. 마찬가지로, 다른 항원들은 이들이 유도된 유기체에 의해 확인된다.
"면역 반응을 유도할 수 있는 항원"이라는 구절은 1 이상의 항체들 또는 1 이상의 세포들과 같은 면역 시스템의 1 이상의 제제들과 접촉될때, 면역 시스템의 반응을 유도 또는 상향조절, 예를 들면 1 이상의 T 세포 군집에서 상향조절(예를 들면, CD8+ T-세포 또는 CD4+ T 세포 활성 또는 수 증가), 또는 항원에 대하여 특이적인 항체들을 제조할 수 있거나, 또는 항원에 결합할 수 있는 1 이상의 1 이상의 B 세포 군집에서 상향조절, 또는 1 이상의 항체 군집들의 양 또는 활성을 증가시킬 수 있다.
구절 "세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원"은 면역계의 1 이상의 세포들과 접촉될때, 면역계의 반응을 유도 또는 상향조절, 예를 들면, 증가된 CD8+ T-세포 또는 CD4+ T 세포 활성 또는 수와 같은 1 이상의 T 세포 군집을 상향조절할 수 있는 항원을 의미한다.
용어 "유전자 구조물"은 폴리누클레오티드 분자, 보통 이중가닥 DNA를 의미하며, 이는 cDNA 분자와 같은(여기에 국한되지 않음) 다른 폴리누클레오티드 분자(삽입 폴리누클레오티드 분자)에 삽입될 수 있다. 유전자 구조물은 삽입 폴리누클레오티드 분자를 전사하고, 선택적으로 전사물을 폴리펩티드로 해독하는 것을 허용하는 필수 요소들을 포함할 수 있다. 삽입 폴리누클레오티드 분자는 숙주세포로부터 유도되거나, 또는 다른 세포 또는 유기체로부터 유도되고/되거나 재조합 폴리누클레오티드이다. 숙주 세포에 일단 들어가면, 유전자 구조물은 숙주 염색체 DNA에 통합된다. 한 예로, 유전자 구조물은 벡터에 결합된다.
용어 "숙주 세포"는 박테리아 세포, 균류 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포, 예를 들면 1)천연 PHA 입자생성 숙주세포, 또는 2)티올라제 및 리덕타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물 및 파신을 운반하는 숙주 세포인, 포유동물 숙주세포를 의미한다. 폴리머 입자 형성에 부족한 숙주 세포를 증가시키기 위해 어떤 유전자들이 필요한 지는 숙주 세포의 유전적 형성 및 배양배지에 어떤 기질들이 제공되는지에 따라 다를 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "링커 또는 스페이서"는 2 이상의 폴리펩티드들을 코딩하는 2 이상의 핵산 서열 또는 2 이상의 폴리펩티드들에 간접 융합하는 누클레오티드 서열 또는 아미노산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 길이가 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100개의 아미노산 또는 누클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 길이가 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 약 1000개의 아미노산 또는 누클레오티드이다. 또다른 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 1000개의 아미노산 또는 누클레오티드, 약 10 내지 약 1000개, 약 50 내지 약 1000개, 약 100 내지 약 1000개, 약 200 내지 1000개, 약 300 내지 약 1000개, 약 400 내지 약 1000개, 약 500 내지 약 1000개, 약 600 내지 약 1000개, 약 700 내지 약 1000개, 약 800 내지 약 1000개, 또는 약 900 내지 약 1000개의 아미노산 또는 누클레오티드이다.
한 실시양태에서, 링커 또는 스페이커는 제한효소 인지부위를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 프로테아제 제거 인지 서열, 예를 들면, 엔테로키나제, 트롬빈 또는 요소 Xa 인지 서열, 또는 자가-스플라이싱 요소, 예를 들면 루테인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커 또는 스페이서는 융합 폴리펩티드의 독립적인 중첩을 용이하게 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "혼합 군집"은 2 이상의 성분들의 군집들을 의미하며, 혼합 군집내 각 성분들의 군들은 어떤 측면에서, 혼합된 군집내 다른 성분들의 군집과 상이하다. 예를 들면, 발현 구조물의 혼합된 군집을 참고하여 사용될때, 이는 발현 구조물의 각 군집이 그 군집의 구성원들에 의해 코딩된 융합 폴리펩티드와 관련해, 또는 구조물내에 존재하는 프로모터의 동일성과 같은 구조물의 다른 측면과 관련해 상이한 2 이상의 발현 구조물의 군집들을 의미한다. 선택적으로, 융합 폴리펩티드의 혼합된 군집을 참고하여 사용될때, 이는 융합 폴리펩티드의 각 군집이 폴리머 신타제와 같은 폴리펩티드와 관련하여, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 군집이 포함하는 구성원들과 상이한 2 이상의 융합 폴리펩티드의 군집들을 의미한다. 예를 들면, 투버쿨로시스를 처리하는데 있어서의 용도 문맥에서, 융합 폴리펩티드의 혼합된 군집은 각 융합 폴리펩티드의 군집이 폴리머 신타제, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역, 군집이 포함하는 구성원들과 같은 폴리펩티드의 측면에서 상이한, 2 이상의 융합 폴리펩티드의 군집을 의미한다. 이와 유사하게, 간염 또는 인플루엔자의 문맥에서, 융합 폴리펩티드의 혼합된 군집은 융합 폴리펩티드의 각 군집이 폴리펩티드, 예를 들면 폴리머 신타제, 간염 항원, 간염 항원 결합 영역, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 영역, 군집이 포함하는 구성원들의 측면에서 상이한 2 이상의 융합 폴리펩티드 군집들을 의미한다. 또한, 폴리머 입자들의 혼합 군집을 참고로 사용할때, 이는 군집의 구성원들이 운반하는 융합 폴리펩티드 및 융합 폴리펩티드의 측면에서 각 폴리머 입자들의 군집이 상이한 2 이상의 폴리머 입자들의 군집 또는 융합 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보누클레오티드, 리보누클레오티드 염기 또는 천연 누클레오티드의 천연 유사물 또는 이의 혼합물들의 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리머를 의미한다. 상기 용어들은 특별히 지시하지 않는한, 특정 서열 뿐만 아니라 이 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 용어 "핵산" 및 "폴리누클레오티드"는 서로 교환하며 사용된다.
"조작가능하게-결합된"은 발현되는 서열이 프로모터, 조직-특이적 조절요소들, 일시적인 조절 요소들, 개선제, 억제제 및 종결제를 포함하는 조절 요소들의 조절하에, 위치되는 것을 의미한다.
용어 "과잉-발현"은 보통 정상 또는 비-형질전환된 숙주 세포내 제조수준을 넘어서는 숙주 세포내 유전자 생성물의 제조를 의미한다. 전령 RNA의 수준과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "과잉발현"은 바람직하게는, 대조군 또는 비-형질전환 세포내 숙주세포에서 통상적으로 발견된 것보다 적어도 약 3배 이상의 발현 수준을 가리킨다. 보다 바람직하게는, 발현 수준은 대조군 숙주 세포 또는 비-형질전환 세포에서 통상적으로 발견된 것보다 적어도 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상, 약 30배 이상, 약 35배 이상, 약 40배 이상, 약 45배 이상, 약 50배 이상, 약 55배 이상, 약 60배 이상, 약 65배 이상, 약 70배 이상, 약 75배 이상, 약 80배 이상, 약 85배 이상, 약 90배 이상, 약 95배 이상, 또는 약 100배 이상이다.
mRNA 수준은 노던 블롯 분석법 및 RT-PCR(정량적 RT-PCR 포함)을 포함하는 당 분야에 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 여러 기술들을 사용하여 측정되며, 여기에 국한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "입자-형성 단백질"은 입자 형성에 관여되는 단백질들을 의미한다. 예를 들면, 폴리머 디폴리머라제, 폴리머 조절제, 폴리머 신타제 및 입자크기-결정 단백질을 포함하는 단백질 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 입자-형성 단백질은 티올라제, 리덕타제, 폴리머 신타제 및 파신을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 신타제와 같은 입자-형성 단백질은 기질 또는 기질의 유도체를 중합시켜, 폴리머 입자를 형성킴으로써 폴리머 입자의 형성을 촉매할 수 있다. 선택적으로, 티올라제, 리덕타제 또는 파신과 같은 입자-형성 단백질은 중합을 용이하게 함으로써 폴리머 입자의 형성을 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 티올라제 또는 리덕타제는 폴리머라제에 적당한 기질의 제조를 촉매할 수 있다. 파신은 형성된 폴리머 입자의 크기를 조절할 수 있다. 바람직하게는, 입자-형성 단백질은 입자 결합 영역 및 입자 형성 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "입자-형성 반응 혼합물"은, 숙주 세포 또는 발현 구조물이 신타제 촉매성 영역 또는 폴리머 신타제를 포함하는 경우 적어도 폴리머 신타제 기질, 숙주 세포 또는 발현 구조물이 폴리머 신타제 촉매성 영역이 아닌 입자 결합 영역 또는 다른 입자-형성 단백질을 포함하는 경우 이의 기질을 의미한다.
"입자크기-결정 단백질"은 폴리머 입자의 크기를 조절하는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 바람직하게는 랄스토니아속(Ralstonia), 알칼리게네스속(Alcaligenes) 및 슈도모나스속(Pseudomonas), 보다 바람직하게는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 파신 유전자 phaP 및 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)로부터의 파신 유전자 phaF로부터 선택되는 파신-류 단백질 과(family)로부터 유래될 수 있다. 파신은 폴리머 입자들의 소수성 표면에 단단하게 결합하는 분자량 14~28kDa의 양쪽성 단백질이다. 이는 또한, 입자와 결합하여, 입자 크기에 영향을 미치는 다른 숙주 세포 단백질들을 포함할 수도 있다.
용어 "병원체" 또는 "세포내 병원체" 또는 "미생물"은 이의 재생주기 또는 생명주기의 적어도 일부동안 세포질내에 또는 액포내에, 숙주 세포에 존재하는 유기체를 의미한다. 세포내 병원체로는 바이러스(예를 들면, CMV, HIV), 박테리아(마이코박테리움(Mycobacterium), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 여시니아(Yersinia), 브루셀라(Brucella), 바실루스(Bacillus), 레지오넬라(Legionella), 리켓시애(Rickettsiae), 클라미디아(Clamydia), 클라미도필라(Clamydophilia), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 에르리키아(Ehrlichia), 프란시셀라(Francisella), 장관병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli), 장출혈성 대장균(enterohaemorrhagic Escherichia coli)), 원생동물(예를 들면, 톡소플라즈마(Toxoplasma)), 균류 및 세포내 기생동물(예를 들면, 플라스모디움(Plasmodium))가 포함된다.
병원체들이 통상적으로 숙주-특이적이라는 것은 알려져 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 방법들 및 조성물은 종-특이적 병원체를 포함한 특정 병원체에 대한 특정 숙주 종류들을 예방접종하는데 변형(사용)하기 위해 처리될 수 있다. 예를 들면, 인간은 인간-특이적 병원체, 예를 들면, 마이코박테리움(Mycobacterium)[예컨대, 마이코박테리움 보비스(M. bovis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(M. leprae), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 아비움 파라투버쿨로시스(M. avium paratuberculosis), 마이코박테리움종], 리스테리아(Listeria)[예컨대, 리스테리아 모노사이토겐스(L. monocytogenes), 리스테리아종), 살모넬라(Salmonella)[예컨대, 살모넬라 티파이(S. typhi)], 여시니아(Yersinia)[예컨대, 여시니아 페스티스(Y. pestis), 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 여시니아 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)], 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레지오넬라(Legionella)[예컨대, 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila), 레지오넬라 롱베아캐(L. longbeachae), 레지오넬라 보제마니이(L. bozemanii), 레지오넬라종], 리케치아(Rickettsia)[예컨대, 리케치아 리케치이(R. rickettsii), 리케치아 아카리(R. akari), 리케치아 코노리이(R. conorii), 리케치아 시베리카(R. siberica), 리케치아 아우랄리스(R. australis), 리케치아 자포니카(R. japonica), 리케치아 아프라캐(R. africae), 리케치아 프로와제키이(R. prowazekii), 리케치아 티파이(R. typhi), 리케치아종], 클라미디아(Chlamydia)[예컨대, 클라미디아 뉴모니애(C. pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미디아종], 클라미도필라(Clamydophila)[예컨대, 클라미도필라 시타시(C. psittaci), 클라미도필라 아보르투스(C. abortus)], 스트렙토코커스(Streptococcus)[예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 표게네스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)], 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)를 포함하는 스타필로코커스(Staphylococcus)[스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)], 에를리키아(Ehrlichia)[예컨대, 에를리키아 차프펜시스(E. chaffeensis), 에를리키아파고사이토필라 제노군(Ehrlichia phagocytophila geno group), 에를리키아종), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 리슈마니아종(Leishmania sp .), 톡스폴라스마 곤디이(Toxpolasma gondii), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 히스토플라즈마종(Histoplasma sp .), 프란시셀라 튤라렌시스(Francisella tularensis) 및 아데노바이러스(Adenoviruses), 백시니아(vaccinia), 아비폭스(avipox), 아데노-결합 바이러스(adeno - associated virus), 변형된 백시니아 스트레인 안카라(modified Vaccinia Strain Ankara), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 헤르페스 바이러스를 포함하는 병원체에 대하여 예방접종된다.
세포내 병원체의 다른 유전자는 넓은 숙주 특이성을 가지며, 예를 들어 브루셀라종(Brucella species)을 포함한다. 블루셀라(Brucella)는 그람-음성 비-운동성 비-피포 구간균(coccobacilli)의 속이다. 브루셀라는 블루셀라증의 원인이 된다. 다른 브루셀라종들의 예로는 브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis), 브루셀라 아보르투스(B. abortus), 브루셀라 수이스(B. suis), 브루셀라 오비스(B. ovis), 브루셀라 핀니페디애(B. pinnipediae) 및 브루셀라 네오토매(B. neotomae)가 있다.
다른 실시예에서, 비-인간 피험체는 종-특이적 병원체를 포함하는 병원체들에 대하여 예방접종된다. 예를 들면, 소, 까마귀 및 양 피험체들은 예를 들면, 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(M. leprae), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 아비움 파라투버쿨로시스(M. avium paratuberculosis) 및 다른 마이코박테리움종(Macobacterium spp.)을 포함하는 마이코박테리움종(Mycobacterium spp.)에 대하여 예방접종된다.
따라서, "피험체"는 포유동물 동반 동물 또는 인간을 포함하는 포유류와 같은 동물이다. 대표적인 동반 동물들로는 고양이, 말 및 개가 포함된다. 대표적인 농장 가축들로는 소, 양, 사슴 및 돼지가 포함된다. 한 실시양태에서, 인간은 성인, 어린이 또는 유아이며, 면역이 저하된 성인, 어린이 또는 유아, 또는 병원체에 대하여 예방접종받은 성인, 어린이 또는 유아, 병원체에 감염된 성인, 어린이 또는 유아, 병원체에 감염될 위험 또는 병원체에 노출되는 성인, 어린이 또는 유아가 포함된다.
용어 "치료" 및 ("치료"를 포함하는) 이의 파생어는 이들의 가장 넓은 가능한 문맥으로 해석되어야 한다. 상기 용어는 피험체가 완전히 회복될때까지 처리되는 것을 암시하는 것으로 간주되어서는 안된다. 따라서, "치료"는 넓은 의미로 증상 개시 또는 특정 증상의 심각성의 개선 및/또는 예방을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "폴리머 조절제"는 폴리머 입자들의 형성에 관여되는 유전자 phaA, phaB 및 phaC의 전사를 조절하는 단백질을 의미한다. 입자 표면에 결합함으로써 전사 조절이 취소된다. 상기 조절제의 한 예로는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) YP 725943으로부터의 파신 억제물질(phaR)이 있으며, 이는 형성된 폴리머 입자의 크기를 조절하고 유전자가 해독되는 것을 방지하는 발현 구조물인 파신류 유전자의 프로모터에 결합한다. 파신 억제물질은 형성된 폴리머 입자들의 표면에 결합되기 때문에, 프로모터 위의 상기 부위가 풀어져서 기본 유전자의 전사가 개시될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "폴리머 신타제"는 기질 또는 기질 유도체를 중합하여 폴리머 입자를 형성함으로써 폴리머 입자의 형성을 촉매할 수 있는 단백질을 의미한다. >45의 다른 박테리아로부터, 1차 구조, 기질 특이성 및 서브유닛 조성(Rehm, 2007)이 상이한, 88 PHA 신타제 유전자들의 누클레오티드 서열이 얻어졌다.
폴리머 신타제는 폴리머 중합과 입자 코어에 대한 신타제 단백질의 부착을 매개하는 신타제 단백질의 C-말단에서 적어도 신타제 촉매성 영역을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 폴리머 신타제는 Rehm, 2003에 상세히 설명되어 있으며, 이는 이후에 참고문헌으로 전문통합된다. 예를 들면, 폴리머 신타제는 클래스 1 아시네토박터속(class 1 genera Acinetobacter), 비브리오속(Vibrio ), 에어로모나스속( Aeromonas ), 크로모박테리움(Chromobacterium), 슈도모나스속(Pseudomonas ), 주글레아속( Zoogloea ), 알칼리게네스속( Alcaligenes ), 델프티아속( Delftia ), 버크홀데리아속( Burkholderia ), 랄스토니아속( Ralstonia ), 로도코쿠스속(Rhodococcus ), 고도니아속( Gordonia ), 로도박터속( Rhodobacter ), 파라코쿠스속( Paracoccus ), 리켓시아속( Rickettsia ), 카울로박터속( Caulobacter ), 메틸로박테리움속( Methylobacterium ), 아조리조비움속( Azorhizobium ), 아그로박테리움속( Agrobacterium ), 라이조븀속( Rhizobium ), 시노리조븀속( Sinorhizobium ), 리켓시아속( Rickettsia ), 크레나캐오타속( Crenarchaeota ), 시네코사이스티스속( Synechocystis ), 엑토티오호도스피라속( Ectothiorhodospira ), 티오캡사속( Thiocapsa ), 티오사이스티스속( Thyocystis ) 및 알로크로마티움속( Allochromatium ), 클래스 2 버크홀데리아속( Burkholderia ) 및 슈도모나스속( Pseudomonas ), 또는 클래스 4 바실루스속(Bacillus)으로부터의 PHA 신타제, 보다 바람직하게는 클래스 1 아시네토박터(Acinetobacter ) sp. RA3849, 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ), 장염비브리오균( Vibrio parahaemolyticus ), 지느러미적병( Aeromonas punctata ) FA440 , 솔방울병( Aeromonas hydrophila ), 크로모박테리움 비올라세움( Chromobacterium violaceum ), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 61-3, 주글레아 라미제라( Zoogloea ramigera ), 알칼리게네스 라투스( Alcaligenes latus ), 알칼리게네스( Alcaligenes ) sp . SH-69, 델프티아 아시도보란스( Delftia acidovorans), 버크홀데리아( Burkholderia ) sp . DSMZ9242, 랄스토니아 유트로피아( Ralstonia eutrophia ) Hl6, 버크홀데리아 세파시아( Burkholderia cepacia ), 로도코쿠스 루버( Rhodococcus rubber ) PP2, 고르도니아 루브리퍼팅쿠스( Gordonia rubripertinctus), 리켓시아 프로와제키( Rickettsia prowazekii ), 시네코사이스티스( Synechocystis ) sp. PCC6803, 엑토티오호도스피라 샤포쉬니코비(( Ectothiorhodospira shaposhnikovii ) Nl, 티오캡사 페니기( Thiocapsa pfennigii) 9111, 알로크로마티움 비노숨( Allochromatium vinosum ) D, 티오사이스티스 비올라세아( Thyocystis violacea ) 2311, 로도박터 스패로이데스( Rhodobacter sphaeroides), 파라코쿠스 데니트리피칸스( Paracoccus denitri β cans ), 로도박터 캡슐라투스( Rhodobacter capsulatus ), 카울로박터 크레센투스( Caulobacter crescentus), 메틸로박테리움 엑스토퀸스( Methylobacterium extorquens ), 아조리조븀 카울리노단스( Azorhizobium caulinodans ), 아그로박테리움 투메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ), 시노리조븀 멜리로티( Sinorhizobium meliloti ) 41, 로도스피릴륨 루브룸( Rhodospirillum rubrum ) HA , 및 로도스피릴륨 루브룸( Rhodospirillum rubrum ) ATCC25903, 클래스 2 버크홀데리아 캐리오필리( Burkholderia caryophylli ), 슈도모나스 클로라피스( Pseudomonas chloraphis ), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 61-3, 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida ) U, 슈도모나스 올레오보란스( Pseudomonas oleovorans ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 레지노보란스( Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스 스투트제리( Pseudomonas stutzeri ), 슈도모나스 멘도시나( Pseudomonas mendocina ), 슈도모나스 슈돌칼리게네스( Pseudomonas pseudolcaligenes), 슈도모나스 푸티다( Pseudomonas putida ) BMOl, 슈도모나스 니트로레듀신스( Pseudomonas nitroreducins ), 슈도모나스 클로라피스( Pseudomonas chloraphis), 및 클래스 4 바실루스 메가테리움( Bacillus megaterium ) 및 바실루스( Bacillus ) sp. INT005를 포함하는 그룹으로부터의 PHA 신타제이다.
본 발명에 사용하기에 적당한 다른 폴리머 신타제로는 각각이 하기 유기체들로부터 등록번호로 확인되는 폴리머 신타제가 포함된다: 쿠프리아비두스 네카토(C. necator)(AY836680), 녹농균(P. aeruginosa )(AE004091), 에이. 비노숨(A. vinosum)(AB205104), 바실루스 메가테리움(B. megaterium )(AF109909), 할로아르쿨라 마리스모르투이(H. marismortui )(YP137339), 슈도모나스 아우레오파시엔스(P. aureofaciens)(AB049413), 또는 슈도모나스 푸티다(P. putida )(AF150670), 알. 유트로파(R. eutropha ) (A34341), 티. 프페니기(T. pfennigii ) (X93599), 에이. 펑타타(A. punctata ) (032472), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 61-3 (AB014757 및 AB014758), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides ) (AAA72004), 시. 비올라세움(C. violaceum) (AAC69615), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis ) SK2 (CAL17662), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis) SK2 (CAL16866), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides) KD131 (ACM01571 및 YP002526072), 알. 오파쿠스(R. opacus ) B4 (BAH51880 및 YP002780825), 비. 멀티보란스(B. multivorans ) ATCC 17616 (YP001946215 및 BAG43679), 에이. 보르쿠멘시스(A. borkumensis ) SK2(YP693934 및 YP693138), 알 루브룸(R. rubrum ) (AAD53179), 감마 프로테오박테리움( gamma proteobacterium) HTCC5015 (ZP05061661 및 EDY86606), 아조아르쿠스( Azoarcus ) sp. BH72 (YP932525), 시. 비올라세움(C. violaceum ) ATCC 12472 (NP902459), 림노박터( Limnobacter ) sp. MED105 (ZP01915838 및 EDM82867), 엠. 알기콜라(M. algicola) DG893 (ZP01895922 및 EDM46004), 알. 스패로이데스(R. sphaeroides ) (CAA65833), 시. 비올라세움(C. violaceum ) ATCC 12472 (AAQ60457), 에이. 라투스(A. latus ) (AAD10274, AAD01209 및 AAC83658), 에스. 말토필라(S. maltophilia ) K279a (CAQ46418 및 YP001972712), 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum ) IPO1609 (CAQ59975 및 YP002258080), 비. 멀티보란스(B. multivorans ) ATCC 17616 (YP001941448 및 BAG47458), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. gll3 (ACJ02400), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. glO6 (ACJ02399), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. glOl (ACJ02398), R. sp. gl32 (ACJ02397), 알. 레구미노사룸(R. leguminosarum ) bv. 비시애(viciae) 3841 (CAK10329 및 YP770390), 아조아르쿠스( Azoarcus ) sp. BH72 (CAL93638), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. LDC-5 (AAV36510), 엘. 니트로페룸(L. nitroferrum) 2002 (ZP03698179), 타우에라( Thauera ) sp. MZlT (YP002890098 및 ACR01721), 엠. 라디오톨레란스(M. radiotolerans ) JCM 2831 (YP001755078 및 ACB24395), 메틸로박테리움( Methylobacterium ) sp. 4-46 (YP001767769 및 ACA15335), 엘. 니트로페룸(L. nitroferrum ) 2002 (EEG08921), 피. 데니트리피칸스(P. denitrificans ) (BAA77257), 엠. 그리피스발덴세(M. gryphiswaldense ) (ABG23018), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. USM4-55 (ABX64435 및 ABX64434), 에이. 하이드로필라(A. hydrophila ) (AAT77261 및 AAT77258), 바실루스( Bacillus ) sp. INT005 (BAC45232 및 BAC45230), 피. 푸티다(P. putida ) (AAM63409 및 AAM63407), 지. 루브리페르틴투스(G. rubripertinctus) (AAB94058), 비. 메가테리움(B. megaterium) (AAD05260), 디. 아시도보란스(D. acidovorans ) (BAA33155), 피. 세리니필루스(P. seriniphilus ) (ACM68662), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 14-3 (CAKl 8904), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. LDC-5 (AAXl 8690), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. PC17 (ABV25706), 슈도모나스( Pseudomonas ) sp. 3Y2 (AAV35431, AAV35429 및 AAV35426), 피. 멘도시나(P. mendocina ) (AAM10546 및 AAM10544), 피. 니트로레두센스(P. nitroreducens ) (AAK19608), 피. 슈도알칼리게네스(P. pseudoalcaligenes ) (AAKl 9605), 피. 레지노보란스 (P. resinovorans ) (AAD26367 및 AAD26365), 슈도모나스(Pseudomonas ) sp. USM7-7 (ACM90523 및 ACM90522), 피. 플루오레세스(P. fluoresces) (AAP58480) 및 다른 미배양 박테리아 (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE0286, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 및 BAE06852).
PHA 신타제 단백질의 N-말단 단편(약 아미노산 1 ~ 200, 또는 1 ~ 150, 또는 1 ~ 100)은 매우 가변적이며, 어떤 실시예에서는 폴리머 입자 결합 영역(즉, C-말단 단편)을 통해 폴리머 코어에 공유결합하는 것을 막거나, 또는 효소를 불활성화시키지 않으면서 다른 융합 인자 또는 항원, 항원 결합 영역에 의해 결실 또는 치환된다. 신타제를 결합할 수 있는 결합 영역을 갖는 폴리머 입자는 폴리머 코어의 중합 및 폴리머 입자들의 형성을 매개하는 신타제 단백질의 촉매 영역을 적어도 포함한다.
일부 실시양태에서, PHA 신타제 단백질의 C-말단 단편은 면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 효소를 불활성화시키거나, 또는 폴리머 입자에 신타제를 공유결합하는 것을 막지 않는 다른 융합 인자에 의해 변형, 부분적으로 결실 또는 부분적으로 치환된다.
특정 경우, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 면역 반응을 결합시킬 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 다른 융합 인자는 효소의 불활성화 없이, 또는 폴리머 입자의 신타제의 공유결합을 막지 않으면서 PHA 신타제 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 이와 유사하게, 다른 경우에 면역 반응을 유도할 수 있는 항원, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 다른 융합 인자는 PHA 신타제 단백질내에 삽입되거나, 또는 입자-형성 단백질내에 삽입된다. PhaC 융합의 예는 당 분야에 공지되어 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다.
한 실시예에서, PHA 신타제 단백질의 N-말단 단편(약 아미노산 1 ~ 200, 또는 1 ~ 150, 또는 1 ~ 100)은 매우 가변적이며, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역, 간염 항원, 간염 항원 결합 영역, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 영역 또는, 폴리머 입자에 대한 폴리머 입자 결합 영역(즉, C-말단 단편(이 영역은 소수성 상호작용을 통해 결합함))을 통한 신타제의 공유결합(공유결합은 인접한 폴리에스테르 돌출부로부터의 활성부를 통해 일어남)을 막지 않거나, 또는 효소 불활성화 없이 다른 융합 인자에 의해 결실 또는 치환된다. 신타제의 폴리머 입자 결합 영역은 폴리머 입자의 중합 및 폴리머 입자의 형성을 매개하는 신타제 단백질의 촉매성 영역을 포함한다.
PHA 신타제 단백질의 C-말단 단편은 또한 변형될 수 있으며, 효소 불활성화없이 또는 폴리머 입자에 대한 신타제의 공유결합을 막지 않으면서, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역, 간염 항원, 간염 항원 결합 영역, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 또는 다른 융합 인자에 의해 부분적으로 결실 또는 부분적으로 치환될 수 있다.
특정 경우, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역, 간염 항원, 간염 항원 결합 영역, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 또는 다른 융합 인자는 효소 불활성화없이 또는 폴리머 입자에 대한 신타제의 공유결합을 막지 않으면서, PHA 신타제 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 이와 유사하게, 다른 경우에, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역, 간염 항원, 간염 항원 결합 영역, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 또는 다른 융합 인자는 PHA 신타제 단백질내에 삽입되거나, 또는 입자-형성 단백질내에서 확인된다. PhaC 융합의 예는 당 분야에 공지되어 있으며, 본 명세서에 개시되어 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리머 디폴리머라제"는 폴리머 입자에서 발견된 것과 같은 기존의 폴리머를 수용성 모노머 및 올리고머로 가수분해시킬 수 있는 단백질을 의미한다. 폴리머 디폴리머라제의 예들은 매우 다양한 PHA-분해 박테리아 및 균에 존재하며, 퍼시모나스 레모이그네이(Paucimonas lemoignei)로부터의 PhaZl - PhaZ7 세포외 디폴리머라제, 에이. 시도보락스 종(A. cidovorax sp)., 에이. 패칼리스(A. faecalis) (균주 AE122 및 Tl), 델프티아(Delftia) (코마모나스(Comamonas)) 아시도보란스(acidovorans) 균주 YM 1069, 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 코마모나스종(Comamonas sp .), 렙토트릭스종(Leptothrix sp .) 균주 HS, 슈도모나스종(Pseudomonas sp .) 균주 GMlOl (수탁번호 AF293347), 피.플루오레센스(P. fluorescens) 균주 GK13, 피.스투체리(P. stutzeri), 알. 피켓티(R. pickettii) (균주 Al 및 Kl, 수탁번호. JO4223, D25315), 에스. 엑스폴리아투스(S. exfoliatus) KlO 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터의 PhaZ 디폴리머라제를 포함한다(Jendrossek D., and Handrick, R., Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates, Annual Review of Microbiology, 2002, 56:403-32 참조).
본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 전장 단백질을 포함하는 5 이상의 아미노산의 특정 길이의 아미노산 사슬들을 포함하며, 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 결합에 의해 결합된다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연 생성물로부터 정제되거나, 또는 재조합기술 또는 합성기술을 사용하여 부분적으로 또는 전체적으로 생성된다. 상기 용어는 다이머 또는 다른 멀티머, 융합 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체 또는 이들의 유도체와 같은 폴리펩티드의 응집체, 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
용어 "프로모터"는 유전자 전사를 조절하는 코딩 영역의 상류의 전사되지 않은 cis-조절 요소들을 의미한다. 프로모터는 TATA 박스와 같은 컨서브 박스 및 전사 개시 부위를 특정하는 cis-개시제 요소들, 및 전사요소들에 의해 결합되는 모티프를 포함한다.
용어 "종결자"는 전사를 종결시키는 서열을 의미하며, 이는 해독된 서열의 하류의 유전자들의 3' 해독되지 않은 단부에서 발견된다. 종결자는 mRNA 안정성의 중요한 결정요인이며, 일부 경우 공간적인 조절 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
폴리머 입자내에 결합된, 또는 흡수된, 또는 통합된 것과 관련하여 의미할 경우, 용어 "물질"은 폴리머 입자내에 흡수 또는 통합될 수 있는 융합 인자 또는 물질에 의해 결합된 물질을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "변이체"는 특별히 확인된 서열들과 상이한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미하며, 1 이상의 누클레오티드 또는 아미노산 잔기는 결실, 치환 또는 부가된다. 변이체는 자연발생 대립유전자 변이체, 또는 비-자연발생 변이체이다. 변이체들은 동일한 또는 다른 종류로부터 유래되며, 호모로고스, 파라로고스 및 오르토로고스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 누클레오티드 및 폴리펩티드의 변이체들은 야생형 폴리투클레오티드 또는 폴리펩티드의 활성과 같거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진다. 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드와 연관된 용어 "변이체"는 본 명세서에서 정의된 모든 형태의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다.
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 변이체
본 명세서에 사용된 용어 "폴리누클레오티드(들)"은 특정 길이의 단일 또는 이중-가닥 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 폴리머, 바람직하게는 15 이상의 누클레오티드를 의미하며, 유전자의 코딩 및 비-코딩 서열, 센스 및 안티센스 서열 보체, 엑손, 인트론, 게놈 DNA, cDNA, 프리-mRNA, mRNA, rRNA, siRNA, miRNA, tRNA, 리보좀, 재조합 폴리펩티드, 분리된 및 정제된 자연발생 DNA 또는 RNA 서열, 합성 RNA 및 DNA 서열, 핵산 프로브, 프라이머 및 단편들을 포함하며, 여기에 국한되지는 않는다. 여러 핵산 유사체들은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 또한 고려된다.
본 명세서에 개시된 폴리누클레오티드 서열의 "단편"은 길이 15 이상의 누클레오티드인 것이 바람직한 인접한 누클레오티드의 서브서열이다. 본 발명의 단편은 바람직하게는 본 발명의 폴리누클레오티드의 20 이상의 누클레오티드, 보다 바람직하게는 30 이상의 누클레오티드, 보다 바람직하게는 40 이상의 누클레오티드, 보다 바람직하게는 50 이상의 누클레오티드 및 가장 바람직하게는 60 이상의 인접한 누클레오티드를 포함한다. 폴리누클레오티드 서열의 단편은 안티센스, 유전자 침묵(gene silencing), 트리플 헬릭스 또는 리보자임 기술에, 또는 마이크로어레이에 포함된 프라이머, 프로브로서, 또는 폴리누클레오티드계 선택방법에 사용될 수 있다.
프로모터 폴리누클레오티드 서열에 관한 용어 "단편"은 단편이 조작가능하게 결합된 폴리누클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 프로모터 폴리누클레오티드 서열의 영역들 및 cis-요소들을 포함하는 서열들을 포함하는 것으로 의도된다.
바람직하게는, 본 발명의 프로모터 폴리누클레오티드 서열의 단편은 본 발명의 프로모터 폴리누클레오티드의 20 이상, 보다 바람직하게는 30 이상, 보다 바람직하게는 40 이상, 보다 바람직하게는 50 이상, 보다 바람직하게는 100 이상, 보다 바람직하게는 200 이상, 보다 바람직하게는 300 이상, 보다 바람직하게는 400 이상, 보다 바람직하게는 500 이상, 보다 바람직하게는 600 이상, 보다 바람직하게는 700 이상, 보다 바람직하게는 800 이상, 보다 바람직하게는 900 및 가장 바람직하게는 1000 이상의 인접한 누클레오티드들을 포함한다.
용어 "프라이머"는 주형에 교잡되고, 주형에 상보적인 폴리누클레오티드의 중합을 프라이밍하기 위해 사용되는, 자유 3'OH기를 갖는 짧은 폴리누클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 길이가 바람직하게는 5 이상, 보다 바람직하게는 6 이상, 보다 바람직하게는 7 이상, 보다 바람직하게는 9 이상, 보다 바람직하게는 10 이상, 보다 바람직하게는 11 이상, 보다 바람직하게는 12 이상, 보다 바람직하게는 13 이상, 보다 바람직하게는 14 이상, 보다 바람직하게는 15 이상, 보다 바람직하게는 16 이상, 보다 바람직하게는 17 이상, 보다 바람직하게는 18 이상, 보다 바람직하게는 19 이상, 보다 바람직하게는 20 이상의 누클레오티드이다.
용어 "프로브"는 교잡-기반 분석법에서, 프로브에 상보적인 폴리누클레오티드 서열을 검출하기 위해 사용되는 짧은 폴리누클레오티드를 의미한다. 프로브는 본 명세서에 정의된 폴리누클레오티드의 "단편"으로 구성될 수 있다. 바람직하게는 상기 프로브는 길이가 5 이상, 보다 바람직하게는 10 이상, 보다 바람직하게는 20 이상, 보다 바람직하게는 30 이상, 보다 바람직하게는 40 이상, 보다 바람직하게는 50 이상, 보다 바람직하게는 100 이상, 보다 바람직하게는 200 이상, 보다 바람직하게는 300 이상, 보다 바람직하게는 400 이상, 및 가장 바람직하게는 500 이상의 누클레오티드이다.
본 명세서에 사용된 용어 "변이체"는 특별히 확인된 서열들과 상이한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미하며, 1 이상의 누클레오티드 또는 아미노산 잔기는 결실, 치환 또는 부가된다. 변이체들은 자연발생 대립유전자 변이체, 또는 비-자연발생 변이체들이다. 변이체들은 같은 종으로부터 또는 다른 종으로부터 유래되며, 호모로고스, 파라로고스 및 오르토로고스를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 변이체들은 야생형 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성과 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진다. 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드와 관련된 용어 "변이체"는 본 명세서에 정의된 모든 형태의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드들을 포함한다.
폴리누클레오티드 변이체
변이체 폴리누클레오티드 서열은, 바람직하게 특정 폴리누클레오티드 서열에 대하여, 50% 이상, 보다 바람직하게는 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 나타낸다. 동일성은 20 이상의 누클레오티드 위치, 바람직하게는 50 이상의 누클레오티드 위치, 100 이상의 누클레오티드 위치의 대조창에 대하여 또는 특정 폴리누클레오티드 서열의 전장에 대하여 발견된다.
폴리누클레오티드 서열 동일성을 하기 방법으로 측정될 수 있다. 피험체 폴리누클레오티드 서열은 bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)에서, BLASTN(from the BLAST suite of programs, version 2.2.10 [Oct 2004])을 사용하여, 후보의 폴리누클레오티드 서열에 대조되며, 이는 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)에서 공개적으로 사용가능하다. bl2seq의 디폴트 파라미터는 낮은 복잡도 부분의 필터링이 꺼져야 하는 것을 제외하고 사용된다.
폴리누클레오티드 서열의 동일성은 하기 유닉스 커맨드 라인 파라미터(unix command line parameters)를 사용하여 조사될 수 있다:
bl2seq -i 누클레오티드 서열l -j 누클레오티드 서열2 -F F -p 블라스튼
변수 -F F는 낮은 복잡도 섹션의 필터링을 끈다. 변수 -p는 한 쌍의 서열로부터 적당한 알고리즘을 선택한다. bl2seq 프로그램은 라인 "동일성="에 있어서 동일한 누클레오티드의 수와 비율로 서열 동일성을 보고한다.
폴리누클레오티드 서열 동일성은 광역 서열 정렬 프로그램을 사용하여 후보체와 피험체 사이의 겹치는 부분의 전체 길이에 대하여 계산될 수 있다(예를 들면, Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453).
Needleman-Wunsch 광역 정렬 알고리즘의 완전 구현은 http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/에서 얻을 수 있는 EMBOSS 패키지 (Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277)의 니들 프로그램(needle program)에서 얻어진다. 유럽 바이오인포메틱스 인스티튜트(The European Bioinformatics Institute) 서버는 또한, http:/www.ebi. ac.uk/emboss/align/에서 온라인에서 두 서열간의 EMBOSS-니들 광역 정렬을 수행하기 위한 기능을 제공한다.
선택적으로, 터미널 갭(terminal gap)을 페널라이징하지 않으면서 두 서열들의 최적의 광역 정렬을 계산하는 GAP 프로그램이 사용될 수 있다. GAP은 하기 논문: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235에 설명되어 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 변이체는 상기 서열의 기능적 균등물을 보호하기 쉬운 특이적으로 확인된 1 이상의 서열들에 대하여 유사성을 나타내고, 랜덤한 기회에 의해 발생될 것으로 합리적으로 기대될 수 없는 것들도 포함한다. 폴리펩티드에 대한 상기 서열의 유사성은 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터의 프로그램(버전 2.2.10 [Oct 2004])의 BLAST 슈트(suite)로부터의 공용으로 사용가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 측정된다.
폴리누클레오티드 서열의 유사성은 하기 유닉스 커맨드 라인 변수들을 사용하여 시험될 수 있다:
bl2seq -i 누클레오티드 서열l -j 누클레오티드 서열2 -F F -p tblastx
변수 -F F는 낮은 복잡도 영역의 필터링을 끈다. 변수 -p는 서열 쌍에 대하여 적당한 알고리즘을 선택한다. 본 프로그램은 무작위 서열들을 포함하는 고정된 참고크기의 데이터베이스에서 우연히 상기 매치를 볼 것으로 기대하는 시간의 기대횟수인 "E 값"을 각 상기 영역에 대하여 보고하고, 서열들 사이의 유사성의 영역을 발견한다. 상기 데이터베이스의 크기는 bl2seq 프로그램에서 디폴트로 설정된다. 1 보다 훨씬 작은 E 값에 대하여, E 값은 상기 랜덤 매치의 대략적인 확률이다.
변이체 폴리누클레오티드 서열은 특이적으로 확인된 서열들 중 어느 하나와 비교할때, 바람직하게는, 1 x 10-10 미만, 보다 바람직하게는 1 x 10-20 미만, 1 x 10-30 미만, 1 x 10-40 미만, 1 x 10-50 미만, 1 x 10-60 미만, 1 x 10-70 미만, 1 x 10-80 미만, 1 x 10-90 미만, 1 x 10-100 미만, 1 x 10-110 미만, 1 x 10-120 또는 1 x 10-123 미만의 E 값을 나타낸다.
선택적으로, 본 발명의 변이체 폴리누클레오티드는 엄격한 조건하에서 특정 폴리누클레오티드 서열, 또는 이들의 보체로 교잡한다.
용어 "엄격한 조건하에서 교잡하는" 및 이의 문법적인 동일어는 정해진 온도 및 염 농도의 조건하에서, 타겟 폴리누클레오티드 분자(예를 들면, 서던 블롯 또는 노던 블롯과 같은 DNA 또는 RNA 블롯상에서 부동화된 타겟 폴리누클레오티드 분자)에 교잡할 수 있는 폴리누클레오티드 분자의 능력을 의미한다. 엄격한 교잡 조건하에서 교잡할 수 있는 능력은 덜 엄격한 조건에서 초기에 교잡한후, 원하는 엄격성으로 엄격성을 높임으로써 측정될 수 있다.
길이가 약 100 염기 이상인 폴리누클레오티드 분자와 관련하여, 전형적인 엄격한 교잡 조건들은 네이티브 듀플렉스(native duplex)의 용융 온도(Tm) 이하의 25~30 ℃(예를 들면, 10℃) 이하이다.(일반적으로, Sambrook et al, Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 참조). 약 100염기 이상의 폴리누클레오티드 분자들을 위한 Tm은 식 Tm = 81. 5 + 0. 41% (G + C-log (Na+)에 의해 계산될 수 있다. (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). 길이가 약 100 염기 이상인 폴리누클레오티드를 위한 전형적인 엄격한 조건은 6X SSC, 0.2% SDS 용액에서 프리세척하고; 65 ℃, 6X SSC, 0.2% SDS에서 밤새 교잡하고; IX SSC, 0.1% SDS at 65℃에서 각각 30분간 2회 세척하고, 0.2X SSC, 0.1% SDS at 65℃에서 각각 30분간 2회 세척하는 것과 같은 교잡조건이다.
100 염기 미만의 길이를 갖는 폴리누클레오티드 분자들과 관련하여, 예시적인 엄격한 교잡 조건은 5 ~ 10℃ 이하의 Tm이다. 평균, 길이가 100 bp 미만인 폴리누클레오티드 분자의 Tm은 약 (500/올리고누클레오티드 길이)℃에 의해 감소된다.
펩티드 핵산(PNAs)으로 공지된 DNA 모방물과 관련하여(Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254(5037): 1497-500), Tm 값은 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드에 대한 값보다 높으며, Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1998 Nov l;26(21):5004-6에 기술된 식을 사용하여 계산될 수 있다. 100 염기 미만의 길이를 갖는 DNA-PNA 하이브리드에 대한 예시적인 엄격한 교잡 조건은 5 ~ 10 ℃ 이하의 Tm이다.
본 발명의 변이체 폴리누클레오티드는 또한, 본 발명의 서열과 상이하지만, 유전자 코드의 퇴보 결과로서, 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 서열 변형은 "침묵 변이(silien variation)"이다. ATG (메티오닌) 및 TGG (트립토판)에 대한 것 외에, 일부 실시예에서, 같은 아미노산에 대한 다른 코돈들은 특정 숙주 유기체의 코돈 발현을 최적화하는 것과 같은 당 분야의 공지기술에 의해 변경된다.
폴리누클레오티드 서열 변형은 서열의 생물학적 활성을 크게 변경시키지 않으면서 상기 코딩된 폴리펩티드 서열내에서 1개의 또는 여러 아미노산들을 보전적 치환하게 되며, 이는 본 발명에 포함된다. 당업자는 표현형적으로 침묵의 아미노산 치환을 형성하기 위한 방법들을 알 것이다(예를 들면, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306 참조).
코딩된 폴리펩티드 서열에서 침묵 변이 및 보존적 치환으로 인한 다양한 폴리누클레오티드들은 상기 설명된 tblastx 알고리즘을 통해 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터의 프로그램(버전 2.2.10 [Oct 2004])의 BLAST 슈트(suite)로부터의 공용으로 사용가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다.
폴리펩티드 변이체
폴리펩티드와 관련된, 용어 "변이체"는 자연발생 재조합적으로 및 합성 제조된 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 폴리펩티드 서열은, 본 발명의 서열에 대하여 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 동일성을 나타낸다. 동일성은 20 이상의 아미노산 위치들, 바람직하게는 50 이상의 아미노산 위치들, 100 이상의 아미노산 위치들의 대조창에 대하여, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전장에 대하여 확인된다.
폴리펩티드 서열 동일성은 하기 방법으로 측정될 수 있다. 피험체 폴리펩티드 서열은 bl2seq에서 BLASTP (from the BLAST suite of programs, version 2.2.10 [Oct 2004])를 사용하여 후보 폴리펩티드 서열과 대조되며, 이는 NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터 공용으로 사용된다. 낮은 복잡도 영역들의 필터링이 꺼져야 하는 것 외에는 bl2seq의 디폴트 변수들이 사용된다.
폴리펩티드 서열 동일성은 또한, 광역 서열 정렬 프로그램을 사용하여 후보체 및 피험체 폴리누클레오티드 서열들 사이의 겹치는 부분의 전체 길이에 대하여 계산될 수 있다. 상기 설명된, EMBOSS-니들 (http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/에서 사용가능) 및 GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.)이 폴리펩티드 서열 동일성을 계산하기 위한 적당한 광역 서열 정렬 프로그램이다.
본 발명의 폴리펩티드 변이체들은 상기 서열들의 기능적 균등물을 보존하기 쉬운 특이적으로 확인된 1 이상의 서열들에 대하여 유사성을 나타내고 무작위 우연으로 발생될 것으로 타당하게 기대되지 않는 것들을 포함한다. 폴리펩티드와 관련된 상기 서열 유사성은 프로그램의 BLAST 슈트(version 2.2.10 [Oct 2004]) from NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)로부터의 공용으로 사용가능한 bl2seq 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 폴리펩티드 서열의 유사성은 하기 유닉스 커맨드 라인 변수들을 사용하여 조사될 수 있다:
bl2seq -i 펩티드서열l -j 펩티드서열2 -F F -p blastp
변이체 폴리펩티드 서열은 특이적으로 확인된 서열들 중 하나와 비교할때, 바람직하게, 1 x 10-10 미만, 보다 바람직하게는 1 x 10-20 미만, 1 x 10-30 미만, 1 x 10-40 미만, 1 x 10-50 미만, 1 x 10-60 미만, 1 x 10-70 미만, 1 x 10-80 미만, 1 x 10-90 미만, 1 xlO-100 미만, 1 x 10-110 미만, 1 x 10-120 미만 또는 1 x 10-123 미만의 E 값을 나타낸다.
변수 -F F는 복잡도가 낮은 섹션의 필터링을 벗어난다. 변수 -p는 서열 쌍들을 위한 적당한 알고리즘을 선택한다. 이 프로그램은 서열들 간의 유사성의 영역들을 발견하며, 상기 각 영역에 대하여, 무작위 서열들을 함유하는 고정된 참고크기의 데이터베이스에서 우연히 정합(match)을 볼 것으로 기대하는 기대횟수인 "E 값"을 보고한다. 1보다 훨씬 작은, 작은 E 값들에 대하여, 이는 대략 상기 무작위 정합 가능성이다.
생물학적 활성을 크게 변형시키지 않으면서 폴리펩티드 서열의 1 이상의 아미노산들을 보존적 치환하는 것도 또한 본 발명에 포함된다. 당업자는 표현형적으로 침묵의 아미노산 치환을 형성하기 위한 방법을 알 것이다(예를 들면, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306 참조).
본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로부터 제조되지만, 변형된 아미노산 서열을 갖도록 다르게 처리되는 야생형 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드 변이체들도 포함한다. 예를 들면, 야생형 폴리펩티드를 생성하기 위한 1차 RNA 전사물의 패턴을 선택적으로 스플라이싱함으로써 변이체가 생성된다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에 유전자 구조물을 수송하기 위해 사용되는, 통상적으로 이중가닥인 DNA인 폴리누클레오티드 분자를 의미한다. 특정 실시예에서, 벡터는 추가의 이. 콜리와 같은 1 이상의 숙주 시스템에서 복제할 수 있다.
2. 병원체
본 발명의 폴리머 입자, 방법 및 조성물은 세포내 병원체들을 포함하는 병원체들에 의해 야기되는 질병들을 예방 또는 치료하는 것에 일부 관한 것임을 알 것이다. 따라서, 세포내 병원체로부터 유도된 항원들은 본 발명에 사용하기에 적당하며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 대표적인 세포내 병원체들은 이하에 보다 상세히 설명되지만, 당업자는 본 발명이 타겟 세포내 병원체로부터 1 이상의 항원들, 또는 세포내 병원체로부터의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 선택함으로써, 본 명세서에 기술된 방법들에 따라 세포내 병원체와 관련된 질병 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 용도를 가짐을 알 것이다.
마이코박테리움(Mycobacterium)은 악티노박테리아속(Actinobacteria)이다. 상기 속은 결핵 및 한센병을 포함한, 포유동물에 심각한 질병을 유발하는 것으로 알려진 병원체들을 포함한다. 병원체 종들의 예로는 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 마이크로티(M. microti); 마이코박테리움 레프래(M. leprae 레프로시(leprosy)), 마이코박테리움 아비움 파라투버쿨로시스(M. avium paratuberculosis)(사람의 크론병 및 양의 요네병과 연관됨)가 포함된다.
리스테리아(Listeria)종은 그람-양성 바실러스이다. 본 속에서 가장 알려진 병원체는 리스테리아증의 원인 제제인 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)이다. 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii)는 반추동물의 병원체이며, 인간 질병의 원인으로는 드물다.
쉬겔라(Shigella)는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella)와 밀접하게 관련된 그람-음성, 비-스포어 형성 막대형 박테리아의 속이다. 쉬겔라(Shigella)는 다른 포유류를 제외하고, 오직 영장류만 감염시키는 인간 세균성 이질(이질)의 원인 제제이다.
여시니아(Yersinia)는 그람-음성 막대형 박테리아이다. 특정 인간 병원체들로는 여시니아증을 유발하는 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 역병의 원인제제인 여시니아 페스티스(Y. pestis), 및 가장 덜 흔한 병원체인 여시니아 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)가 포함된다. 여시니아는 반응성 관절염의 원인인 병원체 중 하나로 관련되어 있다.
브루셀라(Brucella)는 그람-음성 비-운동성 비-피포된 코코바실러스의 속이다. 브루셀라는 블루셀라증의 원인이다. 다른 블루셀라 종의 예로는 양 종류를 감염시키는 블루셀라 멜리텐시스(B. melitensis) 및 브루셀라 오비스(B. ovis), 소를 감염시키는 브루셀라 아보르투스(B. abortus), 돼지 종류를 감염시키는 브루셀라 수이스(B. suis), 바다 포유동물로부터 분리된 브루셀라 핀니페디애(B. pinnipediae) 및 브루셀라 네오토매(B. neotomae)가 포함된다. 인간은 전형적으로 저온살균되지 않은 우유와 치즈와 같은 유도성 식품 또는 감염된 동물들(양, 소 또는 돼지)로부터의 체액과 접촉함으로써 감염된다.
레지오넬라(Legionella)는 그람-음성 박테리아이다. 가장 주목할만한 종류인 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila)는 레지오넬라증 또는 재향군인병을 유발한다.
리켓시아(Rickettsia)는 운동성, 그람-음성, 비-스포어 형성 박테리아이다. 리켓시아종은 많은 진드기, 벼룩 및 이에 의해 기생동물로 전달되며, 록키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever)(리켓시아 리켓시이(R. rickettsii)), 리켓시아성 두창(Rickettsialpox)(리켓시아 아카리(R. akari)), 부톤네즈 열(Boutonneuse fever)(리켓시아 코노리이(R. conorii)), 시베리아 진드기 티푸스(Siberian tick typhus)(리켓시아 시베리카(R. siberica)), 오스트랄리아 진드기 티푸스(Australian tick typhus)리켓시아 오스트랄리스(R. australis)), 동양반점열(Oriental spotted fever)리켓시아 자포니카(R. japonica)), 남아프리카 진드기열(African tick bite fever)리켓시아 아프리캐(R. africae)), 발진티푸스(Epidemic typhus)리켓시아 프로와제키(R. prowazekii)), 및 지방병 티푸스(Endemic typhus)리켓시아 티피(R. typhi))와 같은 질병들을 유발한다.
살모넬라(Salmonella)는 장티푸스, 파라티푸스 및 살로넬라증을 포함하여 인간 및 많은 동물들에 질병을 야기하는 막대형 그람-음성, 비-스포어 형성, 운동성 장내세균의 속이다.
클라미디아(Chlamydia)는 인간 병원체 클라미디아 트라코마티스를 포함하는, 박테리아속을 의미한다. 클라미도필라는 폐렴을 유발하는 인간 병원체 클라미도필라 뉴모니애(Chlamydophila pneumoniae), 호흡기 앵무새병을 유발하는 클라미도필라 시타키(Chlamydophila psittaci) 및 인간에게 유산과 연관된 클라미도필라 아보르투스(Chlamydophila abortus)를 포함하는, 관련 박테리아이다.
스트렙토코커스(Streptococcus)는 뇌막염, 세균성 폐렴(스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae)), 심내막염, 단독 및 괴사성 근막염(스트렙토코커스 파이오게네스(S. pyogenes))을 포함하는 여러 인간 질병들을 유발하는 것으로 알려진 구형 그람-양성 박테리아의 속이다.
스타필로코커스(Staphylococcus)는 그람-양성 박테리아의 속이며, 식중독의 주요 원인이다.
플라스모디움(Plasmodium)은 원충의 속이다. 상기 원충에 의한 감염은 말라리아를 유발하는 것으로 알려져 있다(플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum)).
2.1 결핵( Tuberculosis )
결핵은 연간 2백만명 이상이 사망하는 심각한 세계적인 건강질병이다. 이 질병은 박테리아 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis)에 의해 유발된다. 박테리아는 통상적으로 흡입을 통해 폐에 침입하여, 폐 감염을 일으켜서, 결국 신체의 다른 부분, 중추신경계, 림프계, 순환계, 비뇨생식기계, 위장관계, 뼈, 관절 및 피부로 번질 수 있다(Dietrich, 2006; Mustafa, 2001). 농가 가축들의 여러 형태의 결핵들, 예를 들면 소결핵병 및 요네병은 제품에 큰 부정적인 효과를 가진다.
마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis)에 의한 감염 확산은 면역계에 의해 제한된다. 많은 개체들은 감기 및 열외에 드문 증상들을 나타낸다. 그러나, 개체들의 약 30%는 감염을 충분히 조절할 수 없어 1차 질병을 전개시킨다. 그럼에도 불구하고, 상기 질병은 휴면으로 개체에 정착하고, 수십년후 다시 감염시킬 수 있다. 이 때문에, 마이코박테리움 투버쿨로시스는 면역 반응을 피할 수 있고, 긴 시간동안 난치의 비-복제 또는 느린 복제 시기로 생존할 수 있으므로, 감염성 박테리아중 독특하다.
결핵 감염은 그 자체로 3단계로 발현한다. 제1 급성 단계는 신체기간내 박테리아 증식에 의해 확인된다. 면역 반응이 신속하게 뒤따라, 감염을 조절하고, 결국 박테리아 로딩을 감소시킨다. 급성단계후, 제2 잠복단계가 수행된다. 제2 단계중에, 박테리아 로딩은 안정적이고 낮은 수준으로 유지된다. 마이코박테리움 투버쿨로시스는 급성 단계에서의 활성 다중복제 단계로부터 잠복기간에서 휴면 상태로 변경한다. 제3 재활성화 단계는 박테리아가 다시 복제를 시작함으로써 일어날 수 있다. 상기 제3 단계에 영향을 미치는 요소는 여전히 주로 알려져 있지 않다(Barnes and Cave, 2003).
박테리아는 활성 복제에서 휴면으로 전이하는 중에 유전자 발현을 조절할 수 있으므로, 면역 반응의 항원 특이성 변화는 감염의 다른 단계 내내 일어나는 것으로 생각된다.
2.2 간염
간염은 여러 간염 바이러스들에 의해 통상적으로 야기되는 질병에 대한 총칭이다. 간염에 기여하는 다른 원인들은 알콜, 독소, 약물, 및 자가면역 질환을 포함한다.
간염은 불안, 근육통 및 관절통, 식용감소 및 황달 및 어떤 경우 궁극적인 간부전을 포함한 증상을 동반하는, 간의 염증이다. 간염은 질병의 만성 환자들에게서 관찰되는 간경변과 함께 급성 및 만성 둘다일 수 있다.
2.3 인플루엔자
인플루엔자(보통, '플루(flu)'라고 함)는 오르토믹소바이러스과의 RNA 바이러스에 의해 야기된다. 인플루엔자는 연간 250,000명 내지 500,000명이 사망한다. 일반적인 증상으로는 오한, 열, 인후염, 근육통 및 통증, 두통, 기침, 무기력, 및 피로가 포함된다. 심각한 경우, 인플루엔자는 노약자에게서 잠재적으로 치명적인 증상인 폐렴을 유발할 수 있다. 인플루엔자는 공기중을 통해, 또는 감염된 새의 똥 또는 코 분비물과의 직접 접촉을 통해 전염될 수 있다.
3 계층의 인플루엔자 바이러스가 존재하며(A, B 및 C), 모두 유사한 구조를 공유한다. 두 큰 글리코단백질들인 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제는 바이러스 입자의 표면상에 나타나며, 바이러스를 타겟 세포에 결합시키고 타겟 세포에 바이러스 게놈을 전달하여, 감염된 세포로부터 바이러스 프로게니를 방출하는데 관여된다. 16가지의 공지된 헤마글루티닌 서브타입들(H1~H16) 및 9가지의 뉴라미니다제의 서브타입들(N1~N9)이 있다.
2.4 현행 치료전략
세포내 병원체들에 대하여 보호하기 위한 현행 치료전략들은 세포내 박테리아 병원체들에 의해 감염된 환자들의 항생 치료 또는 공지된 항원들에 대한 특정 백신들을 포함한다.
감염되기 전에 예방적으로, 또는 감염개시후 치료적으로, 세포내 병원체에 대한 재활성화에 대하여 보호하기 위하여 적당한 백신들이 없으므로, 세포내 병원체들에 대한 새롭고 개선된 치료전략들의 필요하다.
예를 들면, 결핵에 대하여 유일하게 현재 사용가능한 백신은 바실루스 칼메트-게렝(Bacille Calmette-Geurin)(BCG)이며, 이는 마이코박테리움 보비스의 약독균주를 함유한다. 결핵감염을 조절하는데 있어서 BCG의 효능은 제한되어 있다. 백신이 1차 질병에 대하여 어린이를 보호하지만, 성인에 대한 질병보호효능(잠복후 재활성화)은 감소된다(세계보건기구 - http://www.who.int). 또한, 결핵이 일반적인 많은 제3세계 국가들에서 BCG의 효능은 제한된다고 보고되어 있다. 그리고, BCG 백신이 생백신이므로, 면역-저하된 환자에게 투여하기에는 적당하지 않다. 보고에 의하면, BCG 백신은 마이코박테리움 투버쿨로시스가 비장(및 다른 기관들)으로 퍼지는 것을 감소시키는 반면, 폐에서의 박테리아 성장을 막지 못한다.
생백신과 관련된 다른 문제들과 함께, 감염전에 예방적으로 또는 감염개시후 치료적으로, 재활성에 대하여 보호하기 위한 적당한 백신이 없으므로, 결핵, 간염 또는 인플루엔자를 포함한 세포내 병원체들에 대하여 새롭고 개선된 치료전략들의 필요가 촉구되고 있다.
3. 면역 반응
3.1. 세포-매개 반응
세포-매개 면역력은 T-림프구에 의해 1차적으로 매개된다. 병원성 항원은, 주요 조직친화성 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자들 상에 결합된 항원존재세포들(예를 들면, 대식세포, B-림프구 및 수지상세포)의 표면상에 발현된다. MHC 클래스 II에 결합된 병원성 항원의 존재는 헬퍼 (CD4+) T-세포 반응을 활성화시킨다. 항원-MHC II 복합체에 T-세포를 결합할때, CD4+ T-세포는 증식하고, 인터페론-감마 (IFN-γ) 및 인터류킨 2 (IL-2), IL-4, IL-7, 및 IL-12를 포함하는 사이토킨을 방출한다.
MHC 클래스 I 분자들에 결합된 병원성 항원들의 존재는 세포독성 (CD8+) T-세포 반응을 활성화시킨다. 항원-MHC I 복합체에 T-세포를 결합할때, CD8+ 세포 분비가 수행하여, 병원체 세포분해, 팽창 및 사망을 일으킨다. 선택적으로, CD8+ 세포들은 프로그램된 세포사 또는 세포소멸을 유도한다. CD8+ T-세포의 활성화는 CD4+ T-세포에 의한 특정 사이토킨 방출에 의해 증폭된다.
세포-매개 면역 반응은 마이코박테리움 투버쿨로시스와 같은 세포내 병원체를 포함하는 여러 병원체들에 대한 면역력에 중요한 것으로 고려된다.
피험체에서 세포-매개 반응을 개시 또는 진행하는 것을 평가 및 모니터하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 편리한 예시방법들로는 본 명세서에 확인된 것과 같은 세포-매개 반응과 연관된 1 이상의 사이토킨의 수준 또는 존재를 평가하는 방법이 포함된다. 이와 유사하게, 세포-매개 반응의 개시 및 진행을 평가 또는 모니터하기 위한 세포-기반 방법들은 본 발명에 사용하기에 적합하며, T-림프구와 같은, 면역세포의 1 이상의 군집들의 활성화 또는 확장을 확인하는데 타겟팅된 분석법을 포함하는, 세포 증식 또는 활성화 분석법이 포함된다.
특정 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응 및 체액성 반응을 모두 유도하는 본 발명의 방법이 바람직하다.
다른 실시양태에서, 세포-매개 반응을 우선적으로 유도하는 본 발명의 방법이 바람직하다. 상기 방법들은 큰 체액성 반응 또는 검출가능한 체액성 반응없이 세포-매개 면역 반응을 유도하는 방법들을 포함한다. 한 실시예에서, 면역 반응은 세포-매개 면역반응, 예를 들면 중요한 IgA 반응의 부재하에, 또는 중요한 IgE 반응의 부재하에, 또는 중요한 IgG 반응의 부재(중요한 IgG1 반응의 부재 또는 중요한 IgG2 반응의 부재)하에, 또는 중요한 IgM 반응의 부재하에, IFN-γ 반응에 의해 표시되는 것과 같은 세포-매개 면역반응이다.
3.2. 체액성 반응
체액성 면역 반응은 B 세포에 의해 생성된 분비 항체들에 의해 매개된다. 항원들에 결합하는 분비 항체들은 구별을 위해 이들을 플래깅하여, 침입 병원체의 표면상에 존재한다.
결합된 세포-매개 및 체액성 반응(개시된 세포-매개 반응의 결과와 같음)은 더욱더 민감한 면역 반응을 얻거나, 또는 세포내 병원체에 대한 보호수준을 개선시키기에 유리하다는 것이 제시되고 있다.
다시, 체액성 반응의 개시 또는 진행을 평가 및 모니터하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 이들은 항체결합 분석법, ELISA, 피부단자시험(skin-prick test) 등을 포함한다.
4. 항원
여러 병원성 생물체들로부터의 많은 항원들은 본 발명에 사용하기 위해 특성화되고, 적당하다고 알고 있을 것이다. 현재 특성화되어 있든지 아니던지 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 항원들이 고려된다.
4.1 결핵 항원
많은 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원들은 본 발명에서 특성화되고 사용하기에 적당한 것으로 알고 있을 것이다. 현재 특성화되어 있든지 아니던지, 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원들이 고려된다.
본 발명에 사용하기에 적당한 예시적인 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원들은 조기분비항원 타겟(ESAT)-6, Ag85A, Ag85B (MPT59), Ag85B, Ag85C, MPT32, MPT51, MPT59, MPT63, MPT64, MPT83, MPB5, MPB59, MPB64, MTC28, Mtb2, Mtb8.4, Mtb9.9, Mtb32A, Mtb39, Mtb41, TB10.4, TBlOC, TBI lB, TB12.5, TB13A, TB14, TB15, TB15A, TB16, TB16A, TB17, TB18, TB21, TB20.6, TB24, TB27B, TB32, TB32A, TB33, TB38, TB40.8, TB51, TB54, TB64, CFP6, CFP7, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP1O, CFP1l, CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B, CFP25, CFP25A, CFP27, CFP28, CFP28B, CFP29, CFP30A, CFP30B, CFP50, CWP32, hspX (α-결정성), APA, 투버쿨린 정제단백질 유도체(Tuberculin purified protein derivative, PPD), ST-CF, PPE68, LppX, PstS-1, PstS-2, PstS-3, HBHA, GroEL, GroEL2, GrpES, LHP, 19kDa 리포단백질, 71kDa, RD1-ORF2, RD1-ORF3, RD1-ORF4, RD1-ORF5, RD1-ORF8, RDl-ORF9A, RD1-ORF9B, Rv1984c, RvO577, Rv1827, BfrB, Tpx. Rv1352, Rv1810, PpiA, Cut2, FbpB, FbpA, FbpC, DnaK, FecB, Ssb, RplL, FixA, FixB, AhpC2, Rv2626c, Rvl211, Mdh, Rvl626, Adk, ClpP, SucD (Belisle et al, 2005; US 7,037,510; US 2004/0057963; US 2008/0199493; US 2008/0267990), 또는 상기 항원의 어느 하나의 1 이상의 항원성 부분 또는 T-세포 에피토프를 포함한다.
본 발명은 단일의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원의 용도를 고려한다. 그러나, 2 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원의 용도과 관련된 실시양태들도 또한 구체적으로 고려된다.
여러 실시예에서, 2 이상의 항원들은 상기 항원들로부터 선택된 2 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원들을 포함하는 2 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원들을 포함하는 융합 단백질로서 생성된다.
4.2 간염 항원
여러 간염 항원들은 특성되어, 본 발명에 사용하기에 적당하다. 예시적인 간염 C 항원들로는 C - p22, E1 - gp35, E2 - gp70, NS1 -p7, NS2 - p23, NS3 - p70, NS4A - p8, NS4B - p27, NS5A - p56/58, 및 NS5B - p68이 포함되며, 각각(단독 또는 결합하던지)은 본 발명에 적용하기에 적당하다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 간염 항원들은, 현재 특성화되어있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.3 인플루엔자 항원
매우 많은 인플루엔자 항원들이 특성화되어, 본 발명에 사용하기에 적당하다. 본 발명에 사용하기에 적당한 예시적인 인플루엔자 항원들로는 PB, PB2, PA, 헤마글루티닌(HA) 또는 뉴라미미다제(NA) 단백질, NP, M, 및 NS 중 어느 하나가 포함되며, 각각(단독 또는 결합하던지)은 본 발명에 적용하기에 적당하다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 인플루엔자 항원들은, 현재 특성화되어있는지의 여부와 상관없이, 고려된다.
4.4 탄저병 항원
여러 탄저균(B. anthracis) 항원들은 백신개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되었으며, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, PA83은 백신개발을 위한 항원이다. 현재, 탄저균을 위해 유일한 FDA 허가받은 백신은 "Anthrax Vaccine Adsorbed" (AVA) 또는 BioThrax?이다. 이 백신은 알루미늄 보조제에 흡착된 탄저균의 비-피포 균주의 세포-유리 상층액으로부터 유도된다. PA는 AVA에서 1차 면역원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 탄저병 항원으로는 보호성 항원(PA 또는 PA63), LF 및 EF(단백질), 폴리-감마-(D-글루타메이트) 캡슐, 포자 항원(내포자 특이성분들), BcIA(외포자 특이단백질), BxpB(포자-관련 단백질), 및 분비단백질들이 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 탄저병 항원들은 특성화되어있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.5 야토병 항원
여러 야토병(F. tularensis) 항원들이 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, AcpA 및 IgIC는 백신 개발에 적당한 항원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 야토병 항원들로는 O-항원, CPS, 외막 단백질(예를 들면, FopA), 리포단백질(예를 들면, TuW), 분비 단백질 및 리포다당류가 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 야토병 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.6 브루셀라병 항원
여러 브루셀라병(B. abortusis) 항원들이 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, Omplβ는 백신 개발에 적당한 항원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 브루셀라병 항원들로는 -항원, 리포다당류, 외막 단백질(예를 들면, Omplβ), 분비 단백질, 리보좀 항원(예를 들면, L7 및 L12), 박테리오페리틴, p39(추정 주변세포질 결합 단백질), groEL(열활성 단백질), 루마진 신타제, BCSP31 표면 단백질, PAL 16.5 OM 리포단백질, 카탈라제, 26 kDa 주변세포질 단백질, 31 kDa 0mp31, 28 kDa Omp, 25 kDa Omp, 및 10 kDA Om 리포단백질이 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 브루셀라병 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.7 뇌수막염 항원
여러 뇌수막염(N. meningitidis) 항원들이 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, Cys6, PorA, PorB, FetA, 및 ZnuD는 백신 개발에 적당한 항원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 뇌수막염 항원들로는 O-항원, H인자 결합 단백질(fHbp), TbpB, NspA, NadA, 외막단백질, B군 CPS, 분비 단백질 및 리포다당류가 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 뇌수막염 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.8 뎅기열 항원
여러 뎅기열(Flavivirus) 항원들이 뎅기열 치료용 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, 뎅기열 바이러스 엔벨로프 단백질 El - E4 및 막단백질 Ml - M4는 백신 개발에 적당한 항원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 뎅기열 항원들로는 C, preM, 1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B 및 5가 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 뎅기열 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.9 에볼라 바이러스 항원
여러 에볼라 바이러스(ebola virus) 항원들이 에볼라 감염 치료용 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, 필로비리대 자이레 에볼라바이러스(Filoviridae Zaire ebolavirus) 및 수단 에볼라바이러스 비리온 스파이크 당단백질 전구물질 항원(Sudan ebolavirus virion spike glycoprotein precursor antigens) ZEBOV-GP, 및 SEBOV-GP는 각각 백신 개발에 적당한 항원이다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 에볼라 바이러스 항원들로는 NP, vp35, vp40, GP, vp30, vp24 및 L이 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 에볼라 바이러스 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
4.10 웨스트 나일 항원
여러 웨스트 나일(West Nile) 항원들이 감염 치료용 백신 개발을 위한 잠재적 후보물로서 확인되고, 본 발명에 사용가능하다. 예를 들면, 웨스트 나일 바이러스(WNV)로부터의 플라비바이러스 엔벨로프 항원(E)가 WNV 비리온(WNVE)의 표면상에서 발현된 비독성 단백질이며, 백신 개발에 적당하다. 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 예시적인 WNV 항원들로는 Cp, Prm, NSl, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5가 포함된다. 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 웨스트 나일 항원들은 현재 특성화되어 있는지의 여부와 상관없이 고려된다.
상기 항원 또는 참고 항원들은 예시적일뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.
5. 발현 구조물
미생물, 식물세포 또는 동물세포(세포성 발현시스템)에서, 또는 세포유리 발현시스템에서, 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 구조물을 제조하고 사용하는 방법, 및 본 발명에 사용하기 위한 7개의 폴리머 입자들을 형성하기 위해 사용가능한 발현 구조물들을 포함하는 숙주 세포들은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, Sambrook et al., 1987; Ausubel et al, 1987).
하나의 실시양태에서 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 발현 구조물은 발현 또는 클로닝을 위한 복제가능한 벡터로 삽입되거나 또는 또 다른 실시양태에서는 숙주 게놈으로 혼입된다. 다양한 벡터가 공공연히 이용가능하다. 예를 들면 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파아지의 형태이다. 적당한 핵산 서열을 다양한 절차에 의해서 벡터에 삽입할 수 있다. 일반적으로 DNA는 당업에 공지되어 있는 기술을 사용하여 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입될 된다. 벡터 성분은 일반적으로 이에 제한되지는 않지만 하나 이상의 신호 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자, 인헨서 인자, 프로모터 및 전사 말단 서열을 포함한다. 하나 이상의 상기 성분들을 함유하는 적당한 벡터의 구성은 당업에 공지되어 있는 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
발현 및 클로닝 벡터 둘 다는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 적당한 서열이 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스 용으로 잘 알려져 있다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조물은 높은 복제수 벡터 상에 존재한다.
하나의 실시양태에서, 높은 복제수 벡터는 숙주 세포 당 20 내지 3000 복제수로 존재하는 것들로 부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 높은 복제수 벡터는 복제의 높은 복제수 기원(ori), 예컨대 복제의 ColE1 또는 ColE1-유래 기원을 함유한다. 예를 들면, 복제의 ColE1-유래 기원은 복제의 pUC19 기원을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터에 사용하기에 적당한 복제의 다수의 높은 복제수 기원이 당업에 통상의 기술을 가진 사람들에게 알려져 있다. 상기는 복제의 다른 높은 복제수 기원, 예컨대 M13 FR ori 또는 p15A ori 뿐만 아니라 pBR322로부터의 복제의 ColE1-유래 기원 및 이의 유도체를 포함한다. 2μ 플라스미드 기원은 효모에 적당하며, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다.
바람직하게, 복제의 높은 복제수 기원은 복제의 ColE1-유래 pUC19 기원을 포함한다.
제한 부위는 복제의 기원에 위치하여 제한 부위로의 삽입 클로닝이 기원을 불활성화시켜 벡터의 복제를 지시하지 못하도록 한다. 대안적으로, 하나 이상의 제한 부위는 기원내에 위치하여 제한 부위로의 삽입 클로닝으로 벡터의 복제가 단지 낮거나 또는 하나의 복제수로 하도록 할 수 있을 것이다.
발현 및 클로닝 벡터는 또한 형질전환된 숙주 세포에서 벡테의 존재를 검출하기 위한 적당한 마커라고도 하는 선택 유전자를 함유하는 것이 통상적이다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 다른 독성, 예를 들면 암피실린, 네오마이신, 메토트렉사트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하고, (b) 옥소트로픽(auxotrophic) 결함을 보충하고, 또는 (c) 바실러스용 D-알라닌 라세마제(racemase)를 암호화하는 유전자와 같이 복합 배지로부터 이용가능하지 않는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 암호화한다.
식물 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택가능한 마커는 카나마이신 저항성을 부여하는 네오마이신 포포트랜스퍼라아제 II 유전자(NPT II), 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 저항성을 부여하는 aadA 유전자, Ignite(AgrEvo) 및 Basta(Hoechst) 저항성용의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(bar 유전자) 및 하이그로마이신 저항성 용의 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(hpt)을 포함한다.
포유동물 세포용으로 적당한 선택가능한 마커의 예로는 발현 구조물, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나아제를 취할 수 있는 세포 성분을 규명할 수 있는 것들이 있다. 야생형 DHFR을 이용하는 경우의 적당한 숙주 세포는 Urlaub 등, 1980이 기재하는 것과 같이 제조되고 번식되는 DHFR 활성이 결손된 CHO 세포주이다. 효모에 사용하기 위한 적당한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). 상기 trp1 유전자는 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1로서 트립토판 중에 성장할 수 있는 능력이 없는 효모의 변주용 선택 마커를 제공한다[Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
폴리머 입자를 형성하기에 유용한 발현 구조물은 폴리머 신타제를 암호화하는 하나 이상의 핵산, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드의 발현을 제어하는 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다.
다양한 잠재 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 잘 알려져 있다. 원핵생물 숙주 세포와 함께 사용하기 적당한 프포모터는 β-락타마제 또는 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979), 알카라인 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터[deBoer et al., 1983)를 포함한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 폴리머 신타제를 암호화하는 핵산, 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드와 연결되어 작동가능한 Shine-Dalgarno(S.D.) 서열을 포함할 것이다.
효모 숙주와 사용하기 위한 적당한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세라이트 키나아제[Hitzeman et al., 1980) 또는 다른 글리콜리틱 효소[Hess et al., 1968; Holland, 1978), 예컨대 에놀라아제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복시라아제, 포스포프락토키아네제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라아제, 3-포스포글리세라트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리세포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코스 아이소머라아제 및 글루코키나아제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가적 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 디하이드로게나아제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 및 말토스 및 갈락토스 이용의 원인이 되는 효소를 위한 프로모터 구역이다.
모노코트 또는 다이코트 식물의 조직 또는 기관을 포함하는 식물 숙주 세포에 사용하기 위한 적당한 프로모터의 예로는 세포-, 조직- 및 기관-특이적 프로모터, 세포 주기 특이적 프로모터, 템포랄 프로모터, 유도가능한 프로모터, 대부분의 식물 조직에서 활성이 있는 구성 프로모터 및 재조합 프로모터를 포함한다. 프로모터의 선택은 목적한다면 클론형 폴리뉴클레오티드의 일시적 및 공간적 발현에 따라 달라질 것이다. 프로모터들은 다른 식물, 바이러스 및 식물 병원성 박테리아 및 곰팡이의 유전자로부터 유래된 프로모터 또는 숙주 세포로부터의 것들이다. 당업에 통상의 지식을 가진 자들은 실험을 하지 않아도 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적 구조물을 사용하여 발현 구조물을 변형 및 조작하는데 사용하기에 적당한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 구성 식물 프로모터의 예로는 CaMV 35S 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터 및 옥토파인 신타제 프로모터, 및 메이쓰로부터의 Ubi 1 프로모터를 포함한다. 내부 발생 신호 또는 외부 비생물적 또는 생물적 스트레스에 반응하는 특이적인 조직에서 활성이 있는 식물 프로모터는 과학 문헌에 기재되어 있다. 대표적인 프로모터는 예를 들면 참고문헌으로 여기에 포함되어 있는 WO 02/00894에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에 사용하기 위해 적당한 프로모터의 예로는 숙주 세포 시스템과 양립되는 프로모터로서 제공되며, 이종기원의 포유동물 프로모터, 예를 들면 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터의 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 보바인 파필로마 바이러스, 아비앙 사르코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B-간염 바이러스 및 Simian Virus 40(SV40)와 같은 바이러스 게놈으로부터 수득된 것들을 포함한다.
고등 진핵생물에 의한 발현 구조물의 전사는 몇몇 실시예에서 벡터로의 인헨서 서열을 삽입에 의해서 증가된다. 인헨서는 이의 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 활성을 갖는 일반적으로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용 요소이다. 현재 많은 인헨서 서열은 포유동물 유전자로부터 알려진 것이다(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린). 그러나 통상적으로 진핵 생물 세포 바이러스로부터의 인헨서를 사용할 것이다. 예로는 복제 기원의 후면 상의 SV40 인헨서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 프로모터 인헨서, 복제 기원의 후면 상의 폴리오마 인헨서 및 아데노바이러스 인헨서를 포함한다. 통상적으로, 인헨서는 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드 코딩 서얼인 폴리머 신타제의 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱되지만, 프로모터로부터의 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터의 핵 세포)에 사용하는 발현 벡터는 또한 전사의 종료 및 mRNA의 안정화를 위해 필수적인 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비전사 구역, 5' 및 간혹 3'으로부터 이용가능하다. 이러한 부위는 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드, 폴리머 신타제를 코딩하는 mRNA의 비전사 위치에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조물은 업스트림 유도 프로모터, 예컨대 아라비노스에 의해 유도되는 BAD 프로모터를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조물은 구성 또는 조절가능한 프로모터 시스템을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 조절가능한 프로모터 시스템은 유도 또는 억제할 수 있는 프로모터 시스템이다.
재조합 단백질의 제조에서 강한 프로모터로 사용하기에 바람직한 반면에, 이들 프로모터의 조절은 이종 단백질의 구성 과잉제조로 성장 속도, 플라스미드 안정성 및 배양 생존능력을 감소시키므로 필수적이다.
다수의 프로모터가 오퍼레이터(프로모터의 다운스트림 부위)와 리프레서 단백질의 상호작용으로 조절된다. 가장 잘 알려진 오퍼레이터는 락토오스 오페론 및 박테리오파아지 A로부터의 것이다. 대장균에서의 조절 프로모터의 개요는 Friehs & Reardon, 1991의 표 1에서 제공된다.
표준 박테리아 배양과 재조합 대장균과 관련된 것 사이의 주요한 차이는 성장의 분리 및 제조 또는 유도 상의 분리이다. 재조합 단백질 제조는 흔히 조절 프로모터의 이점을 취해서 (프로모터가 "오프"이고, 숙주 세포 상의 대사적 부담이 약한 경우) 성장 상에서의 높은 세포 밀도를 획득한 다음에 (이후에 유도로 프로모터가 "온"됨) 유도 상에서 이종 단백질 제조의 높은 비율을 획득한다.
하나의 실시양태에서, 조절가능한 프로모터 시스템은 LacI, Trp, 파아지 γ, 및 파아지 RNA 폴리머라아제로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 프로모터 시스템은 lac 또는 Ptac 프로모터 및 lacI 리프레서, 또는 trp 프로모터 및 TrpR 리프레서로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, LacI 리프레서는 발현시키는 오퍼레이터로부터의 분리를 야기하는 활성 리프레서와 결합하는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의해서 불활성화된다.
하나의 실시양태에서, trp 프로모터 시스템은 규정된 트립토판 농도로 합성 배지를 사용하여 농도가 역가 수준 이하로 떨어지면 시스템의 스스로 유도될 수 있게 된다. 하나의 실시양태에서, 3-β-인돌-아크릴산을 첨가하여 TrpR 리프레서를 불활성화시킨다.
하나의 실시양태에서, 프로모터 시스템은 박테리오파아지 리프레서 cI를 사용할 수 있게 한다. 상기 리프레서는 OL 및 OR이라고 하는 두 개의 오퍼레이터와의 상호작용하여 모든 용해 유전자의 발현을 막고, γ 프로파아지를 사용할 수 있게 한다. 이러한 오퍼레이터는 각각 두 개의 강한 프로모터 PL 및 PR과 겹친다. cI 리프레서의 존재하에 RNA 폴리머라아제의 결합이 방지된다. cI 리프레서는 미토마이신 C로 세포를 처리하거나 또는 UV-조사에 의해서 불활성화시킬 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 보다 편리한 방법은 cI 리프레서 cI857의 온도-민감성 버젼의 사용이다. γ-계 발현 시스템을 실행하는 숙수 세포는 저온에서 중기로 성장할 수 있으며, 고온으로 옮겨 재조합 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있다.
광범위하게 사용되는 발현 시스템은 T7 DNA 상에서 발견되지만 숙주 세포 크로모좀 상에는 존재하지 않는 프로모터를 인식하는 파아지 T7 RNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 따라서, 발현 구조물은 재조합 유전자와 융합될 하나의 T7 프로모터(일반적으로 유전자 10의 앞쪽에 존재하는 프로모터)를 함유할 수 있다. T7 폴리머라아제를 코딩하는 유전자는 발현 구조물 상에 존재하거나, 두번째 양립가능한 발현 구조물 상에 존재하거나 또는 숙주 세포 크로모좀에 통합될 수 있다. 상기 모든 세 가지의 경우에, 유전자는 발현 상 중에 이의 전사 및 해독이 가능하도록 유도가능한 프로모터와 융합된다.
대장균 균주 BL21(DE3) 및 BL21(DE3) pLysS(Invitrogen, CA)는 T7 RNA 폴리머라아제 유전자[T7RNA 폴리머라아제 유전자, 예컨대 예를 들면 KRX 및 XJ(자가용해)를 품는 몇몇 매우 적당하고 상업적으로 이용가능한 대장균 균주가 있음]를 운반하는 숙주 세포의 예이다. T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 운반하는 다른 세포 균주는 당업에 잘 알려져 있으며, 예컨대 게놈에 통합된 T7 RNA 폴리머라아제를 품는 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ) ADD1976 (Brunschwig & Darzins, 1992) 및 phaP 프로모터 제어 하에 게놈에 통합된 T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 품는 쿠프리아비두스 네카[Cupriavidus necator , 이전에는 Ralstonia eutropha)가 있다(Barnard et al., 2004).
T7 RNA 폴리머라제는 숙주 세포 효소에 대해 3가지 이점을 제공한다: 첫번째 상기는 오직 하나의 서브유닛(subunit)으로 구성되었고, 두번째 높은 공정성(processivity)을 발휘하며, 세번째는 리팜피신에 대한 반응을 나타내지 않는다. 후자의 특성은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자 코딩을 유도하여 약 10분 후에 상기 항생제를 첨가함으로써 융합 폴리펩티드의 양을 특별히 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 시간 동안, 충분한 폴리머라제가 합성되어 융합 폴리펩티드의 고수준의 발현을 유도하고, 숙주 세포 효소의 저해는 플라스미드 및 크로모좀에 존재하는 모든 다른 유전자의 발현을 추가로 억제한다. 박테리아성 RNA 폴리머라제를 저해하지만 T7 RNA 폴리머라제는 저해하지 않는 다른 항생제로 예를 들면 스트렙토리디긴(streptolydigin) 및 스트렙토바리신(streptovaricin)이 당분야에 알려져 있다.
모든 프로모터 시스템이 믿을 수 없기 때문에, T7 RNA 폴리머라제는 재조합 폴리펩티드가 독성 단백질을 코딩하는 경우에 세포로 해로운 영향을 줄 수 있다. 성장 단계 중에 존재하는 상기 폴리머라제 분자는 리소자임에 대한 T7-코딩 유전자를 발현시킴으로써 저해될 수 있다. 상기 효소는 숙주 세포의 세포벽에서 결합을 끊고 T7 RNA 폴리머라제에 결합함으로써 T7 RNA 폴리머라제를 선택적으로 저해하는 2관능성 단백질이고, T7 감염 중에 전사가 조절되게 갑자기 시작되는 피드백 기작(feed-back mechanism)이다. 이. 콜리 균주 BL21 (DE3) pLysS는 T7 리소자임을 본질적으로 발현하는 플라스미드 pLysS를 운반하는 숙주 세포의 예이다.
하나의 실시양태에서, 프로모터 시스템(promoter system)은 유도 사이클을 개시하기 위해서 약 30-37 ℃에서 42 ℃로 온도를 상승시키는 것과 같은 온도 전이에 의한 유도 사이클을 개시하도록 유도 또는 "스위치 온(switched on)"하는 API 또는 APR과 같은 프로모터를 사용한다.
강한 프로모터는 생체내 제조 중에 입자의 표면에서 융합 폴리펩티드 밀도를 향상시킬 수 있다.
바람직한 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
폴리머 신타제, 및
(i) 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원, 또는
(ii) 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘다를 포함하는 융합 인자.
본 명세서에서 사용하는 (i)와 (ii)를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산과, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산, 또는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열과 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일단 발현되면, 융합 폴리펩티드는 폴리머 입자를 형성하거나 또는 폴리머 입자의 형성을 실시할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 적어도 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열은 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산 또는 본 명세서에서 사용하는 (i)와 (ii)를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산과, 세포-매개 면역 반응 또는 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 핵산, 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 핵산과 목적하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해서 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩(folding)을 실시하는 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통한 폴리머 신타제 절편을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제, 또는 C-말단 신타제 절편을 포함하는 아미노산 서열의 N- 말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 코딩하는 융합 단백질의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하기 위해서 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통해서 N-말단 폴리머 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단에 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 디폴리머라제를 코딩하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단 디폴리머라제 절편과 접촉한다.
결핵의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 실례의 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
폴리머 신타제, 및
(i) 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 또는
(ii) 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역, 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘다를 포함하는 융합 인자.
본 명세서에 사용되는 (i)와 (ii)를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산, 엠. 투버쿨로시스 항원을 코딩하는 핵산, 또는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열과 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일단 발현되면, 융합 폴리펩티드는 폴리머 입자를 형성하거나 또는 폴리머 입자의 형성을 실시할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 적어도 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열은 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산, 및 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산과 목적하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해서 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하는 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통한 폴리머 신타제 절편을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 단백질의 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하기 위해서 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통해서 N-말단 폴리머 신타제 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 디폴리머라제(depolymerase) 절편 또는 디폴리머라제를 코딩하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
간염의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 실례의 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
폴리머 신타제, 및
(i) 적어도 하나의 간염 항원, 또는
(ii) 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역, 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘다를 포함하는 융합 인자.
본 명세서에 사용되는 (i)와 (ii)를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산, 간염 항원을 코딩하는 핵산, 또는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열과 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일단 발현되면, 융합 폴리펩티드는 폴리머 입자를 형성하거나 또는 폴리머 입자의 형성을 실시할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 적어도 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열은 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 간염 항원 또는 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산, 및 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산과 목적하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해서 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하는 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통한 폴리머 신타제 절편을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 단백질의 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하기 위해서 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통해서 N-말단 폴리머 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 디폴리머라제 절편 또는 디폴리머라제를 코딩하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
인플루엔자의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 실례의 융합 폴리펩티드는 하기를 포함한다:
폴리머 신타제, 및
(i) 적어도 하나의 인플루엔자 항원, 또는
(ii) 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역, 또는
(iii) (i)와 (ii) 둘다를 포함하는 융합 인자.
본 명세서에 사용되는 (i)와 (ii)를 코딩하는 핵산 서열은 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산, 인플루엔자 항원을 코딩하는 핵산, 또는 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열과 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일단 발현되면, 융합 폴리펩티드는 폴리머 입자를 형성하거나 또는 폴리머 입자의 형성을 실시할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 적어도 폴리머 신타제를 코딩하는 핵산 서열은 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 인플루엔자 항원 또는 입자-형성 단백질을 코딩하는 핵산, 및 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산과 목적하는 길이의 폴리누클레오티드 링커 또는 스페이서 서열을 통해서 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리머 신타제를 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하는 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통한 폴리머 신타제 절편을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 단백질의 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하기 위해서 목적하는 길이의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통해서 N-말단 폴리머 신타제 절편 또는 입자-형성 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 C-말단과 간접적으로 융합된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 코딩하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 C-말단 디폴리머라제 절편 또는 디폴리머라제를 코딩하는 아미노산 서열의 N-말단과 접촉한다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 하나의 이점은 폴리머 입자의 표면에 결합된 단백질의 변형이 폴리머 입자의 형성에 관여하는 단백질의 관능성에 영향을 주지 않는다는 것이다. 예를 들면, 폴리머 신타제의 관능성은 재조합 폴리펩티드가 이의 N-말단에 융합된 것을 보유함으로써 입자의 표면에서 재조합 폴리펩티드를 생성한다. 단백질의 관능성이 융합에 의해서 손상되면, 동일한 기능을 수행하고 활성 상태로 존재하는 부가의 입자-형성 단백질의 존재에 의해서 상기 단점이 오프셋(offset)된다.
상기 방식에서, 입자-형성 단백질을 통해서 폴리머 입자에 결합된 재조합 폴리펩티드의 안정한 결합을 유지할 수 있다.
융합 폴리펩티드에서 단백질의 배열은 플라스미드에 포함된 핵산에서 유전자 서열의 순서에 좌우되는 것을 이해해야 한다.
예를 들면, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 폴리머 신타제에 간접적으로 융합되는 융합 폴리펩티드를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "간접적으로 융합된(indirectly fused)"은 융합 폴리펩티드에서 발현되는 것이 바람직한 단백질일 수 있는 부가의 단백질에 의해서 분리되는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원 및, 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 나타낸다.
결핵의 치료에 사용되는 입자와 관련하여 사용될 때, 엠. 투버쿨로시스 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역이 폴리머 신타제에 간접적으로 융합되는 융합 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게, 간염 항원 또는 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역이 폴리머 신타제에 간접적으로 융합되는 융합 폴리펩티드를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "간접적으로 융합된(indirectly fused)"은 융합 폴리펩티드에서 발현되는 것이 바람직한 단백질일 수 있는 부가의 단백질에 의해서 분리되는 입자-형성 단백질 및 적어도 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 나타낸다. 유사하게, 상기 용어는 융합 폴리펩티드에서 발현되는 것이 바람직한 단백질일 수 있는 부가의 단백질에 의해서 분리된 입자-형성 단백질 및 적어도 하나의 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 나타낸다. 선택적으로, 상기 용어는 융합 폴리펩티드에서 발현되는 것이 바람직한 단백질일 수 있는 부가의 단백질에 의해서 분리된 입자-형성 단백질 및 적어도 하나의 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 나타낼 수 있다.
하나의 실시양태에서, 부가의 단백질은 상기에 기술된 바와 같이 융합 폴리펩티드의 독립적인 폴딩을 실시하기 위해서 입자-형성 단백질 또는 융합 폴리펩티드, 또는 링커 또는 스페이서로부터 선택된다. 상기 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 목적하는 배열을 반영하기 위해서 플라스미드내 유전자의 서열을 결정하는 것이 필수적이다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 폴리머 신타제에 직접적으로 융합될 수 있다. 상기 용어 "직접적으로 융합된(directly fused)"은 2개 이상의 펩티드가 펩티드 결합을 통해서 연결되는 것을 나타내는데 본 명세서에서 사용된다.
결핵의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 예를 들면 엠. 투버 쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 폴리머 신타제에 직접적으로 융합될 수 있다.
용어 "직접적으로 융합된(directly fused)"은 2개 이상의 펩티드가 펩티드 결합을 통해서 연결되는 것을 나타내는데 본 명세서에서 사용된다.
간염의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역은 폴리머 신타제에 직접적으로 융합될 수 있다.
인플루엔자의 치료 또는 예방과 관련된 다양한 실시양태에서, 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역은 폴리머 신타제에 직접적으로 융합된다.
용어 "직접적으로 융합된(directly fused)"은 2개 이상의 펩티드가 펩티드 결합을 통해서 연결되는 것을 나타내는데 본 명세서에서 사용된다.
입자는 폴리머 입자에 결합되는 적어도 2개의 구별되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 입자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 폴리머 신타제에 융합되는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드는 폴리머 입자에 결합할 수 있다. 결핵의 치료에 사용되는 입자와 관련하여 사용될 때, 상기 입자는 폴리머 입자에 결합될 수 있는 폴리머 신타제에 융합된 엠. 투 버쿨로시스 항원, 예를 들면 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드를 포함한다. 간염의 치료에 사용되는 입자와 관련하여 사용될 때, 입자는 폴리머 입자에 결합될 수 있는 폴리머 신타제에 융합된 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드를 포함한다. 인플루엔자의 치료에 사용하기 위한 입자와 관련하여 사용될 때, 입자는 폴리머 입자에 결합될 수 있는 폴리머 신타제에 융합된 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 제1 융합 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 생체내에서 발현된다. 바람직하게, 발현 구조는 미생물, 바람직하게는 에스케리치아 콜리에서 발현되는 플라스미드이다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 생체내에서 발현된다. 바람직하게, 발현 구조는 세포 유리 발현 시스템을 사용하여 시험관내에서 발현된다.
하나의 실시양태에서, 1 이상의 유전자는 단일 발현 구조로 삽입될 수 있거나, 또는 하나 이상의 유전자는 숙주 세포 게놈으로 포함될 수 있다. 모든 경우에, 발현은 상기에 기술된 바와 같이 프로모터를 통해서 조절될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 상기에 기술된 바와 같이 세포-매개 면역을 유도할 수 있는 항원, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역 및 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는 적어도 하나의 부가의 융합 폴리펩티드를 추가로 코딩한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 상기에 기술된 바와 같이 입자-형성 단백질 및 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 적어도 하나의 부가의 융합 폴리펩티드를 추가로 코딩한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 상기에 기술된 바와 같이 입자-형성 단백질 및 간염 항원 또는 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 적어도 하나의 부가의 융합 폴리펩티드를 추가로 코딩한다.
하나의 실시양태에서, 발현 구조는 상기에 기술된 바와 같이 입자-형성 단백질 및 인플루엔자 항원 또는 적어도 하나의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 적어도 하나의 부가의 융합 폴리펩티드를 추가로 코딩한다.
본 명세서에서 사용하는 플라스미드가 실시예에 개시되었으며, PCT/DE2003/002799(WO 2004/020623(Bernd Rehm)으로 공개됨) 및 PCT/NZ2006/000251(WO 2007/037706(Bernd Rehm)으로 공개됨)에 상세하게 기술되었으며, 이들은 본 명세서에서 이의 전문이 참고문으로 포함된다.
세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원, 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역이 투여되거나 또는 면역 반응이 유도될 수 있는 피험체내에 존재하는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
결핵의 치료에 있어서 용도와 관련하여, 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역은 적어도 하나의 엠. 투버쿨로시스 항원, 예를 들면 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역이 투여되거나 또는 면역 반응이 유도되는 피험체내에 존재하는 엠. 투버쿨로시 스 항원을 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, 간염의 치료에 있어서 용도와 관련하여, 간염 항원 결합 영역은 적어도 하나의 간염 항원, 예를 들면 간염 항원 결합 영역이 투여되거나 또는 면역 반응이 유도되는 피험체내에 존재하는 간염 항원을 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 인플루엔자의 치료에 있어서 용도와 관련하여, 인플루엔자 항원 결합 영역은 적어도 하나의 인플루엔자 항원, 예를 들면 인플루엔자 항원 결합 영역이 투여되거나 또는 면역 반응이 유도되는 피험체내에 존재하는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
6. 입자 생성을 위한 숙주
본 발명의 입자는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 1 이상의 발현 구조를 사용하여 숙주 세포에서 편리하게 생성된다. 본 발명의 폴리머 입자는 숙주 세포에서 발현 구조물을 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 상기는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상(progenitor)으로 발현 구조물을 첫번째로 도입하는, 예를 들면 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상을 발현 구조물로 형질전환 또는 감염시키거나, 또는 다른 방법으로 발현 구조물이 숙주 세포내에 존재하도록 함으로써 수득될 수 있다.
형질 전환 이후에, 형질 전환된 숙주 세포가 폴리머 입자의 형성 및 발현 구조물로부터 융합 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에서 유지된다. 상기 조건은 예컨대 당분야에 알려져 있는 바와 같이 적당한 생물체내 플라스미드와 같이 선택된 발현 구조물의 발현에 적당한 것을 포함한다. 예를 들면, 특히 고수득율 또는 과잉 발현이 요구되는 경우, 배양 배지내 적당한 기제의 제공으로 융합 폴리펩티드의 입자-형성 단백질 성분이 폴리머 입자를 형성하도록 한다.
따라서, 본 발명은 폴리머 입자를 제조하는 방법을 제공하며,
적어도 하나의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계(상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함함);
발현 구조물의 발현 및 폴리머 입자의 형성에 적당한 조건하에서 상기 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 상기 폴리머 입자를 분리하는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 폴리머 입자를 제조하는 방법을 제공하며,
적어도 하나의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계(상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 엠. 투버 쿨로시스 항원 또는 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함함);
상기 폴리머 신타제에 의해서 발현 구조물의 발현 및 폴리머 입자의 형성에 적당한 조건하에서 상기 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 상기 폴리머 입자를 분리하여 폴리머 입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 폴리머 입자를 제조하는 방법을 제공하며,
적어도 하나의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계(상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 간염 항원 또는 간염 항원 결합 영역 또는 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자-항원 결합 영역을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함함);
상기 폴리머 신타제에 의해서 발현 구조물의 발현 및 폴리머 입자의 형성에 적당한 조건하에서 상기 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 상기 폴리머 입자를 분리하여 폴리머 입자를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 숙주 세포는 예를 들면 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포, 바람직하게는 분리되거나 또는 비(非)인간의 숙주 세포이다. 재조합 폴리머 입자의 생성에 있어서 당분야에 잘 공지된 방법에서 유용한 숙주 세포(예를 들면, Sambrook et al., 1987; Ausubel et al., 1987)는 본 명세서에서 토의된 고찰을 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기에 종종 적당하다.
적당한 원시생물 숙주 세포는 예를 들면 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들면 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜리(E. coli)를 포함한다. 다양한 이. 콜리 균주는 예컨대 이. 콜리 K12 균주 MM294(ATCC 31,446); 이. 콜리 X1776(ATCC 31,537); 이. 콜리 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635)로 공개적으로 이용가능하다. 다른 적당한 원핵생물 숙주 세포는 다른 엔테로박테라아새(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아 종(Escherichia spp .), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로터 스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 박실리(Bacilli), 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 악티노마이세테스(Actinomycetes), 예컨대, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 로도코커스(Rhodococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 마이코박테리움(Mycobaterium)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들면 이. 콜리 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상의 숙주 균주이기 때문에 사용될 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 단백질분해 효소의 최소량을 분비한다. 예를 들면 균주 W3110은 변형되어 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에서 유전자 변이를 일으킬 수 있으며, 상기 숙주의 예로는 이. 콜리 W3110 균주 1A2(완전한 유전형 tonA를 가짐); 이. 콜리 W3110 균주 9E4(완전한 유전형 tonA ptr3을 가짐); 이. 콜리 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244)(완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr을 가짐); 이. 콜리 W3110 균주 37D6(완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr을 가짐); 이. 콜리 W3110 균주 40B4(비(非)카나마이신 내성 degP 결실 변이를 갖는 균주 37D6임)를 포함한다.
몇가지 바람직한 실시양태에서, 예를 들면 리포폴리사카라이드 엔도톡신을 생성하지 않는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주가 사용될 수 있다. 락토코커스 락티스 균주의 예로는 MG1363 및 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 NZ9000를 포함한다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵생물 미생물, 예컨대 필라멘토스 진균 또는 효모는 예를 들면 본 발명의 방법에 사용하는데 적당한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 예로는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 통상 사용되는 하등한 진핵생물 숙주 미생물을 포함한다. 다른 예로는 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse, 1981; EP 139,383), 크루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주(U.S. 특허 제4,943,529호; Fleer et al, 1991), 가령 예를 들면 케이 . 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., 1983), 케이 . 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이 . 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이 . 월티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이 . 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al, 1990), 케이 . 서모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이 . 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., 1988); 칸디다(Candida); 트리코데마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (Case et al., 1979); 시완니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면 시완 니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (EP 394,538, 1990년 10월 31일 공개); 및 필라멘토스 진균(filamentous fungi), 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 펜실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357, 1991년 1월 10일 공개됨), 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면 에이. 니둘란스(A. nidulans) (Ballance et al., 1983; Tilburn et al., 1983; Yelton et al., 1984) 및 에이. 니거(A. niger) (Kelly and Hynes, 1985)를 포함한다. 메틸로트로픽 효모(methylotropic yeasts)는 본 명세서에서 적당하며, 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성된 종으로부터 선택된 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함한다. 효모 부류의 예인 특정 종의 목록은 Anthony, 1982에서 찾을 수 있다.
무척추동물 숙주 세포의 예로는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9, 뿐만 아니라 식물 세포, 예컨대 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양액을 포함한다. 스포돕테라 멜라노가스터(Spodoptera frugiperda) (쇄기벌레), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터 유래되는 다수의 바쿨바이랄 균주 및 변이체 및 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질 감염에 대한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅 스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공공연하게 이용가능하며, 상기 바이러스는 본 발명에 따른 명세서에서 특히 스포돕테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질 감염을 위해 바이러스로서 사용될 수 있다.
유용한 포유류 숙주 세포의 예로는 SV40으로 형질감염된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람의 배아 신장 라인(human embryonic kidney line) (현탁 배양에서 성장을 위해서 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., 1980); 마우스 고환 세포(TM4, Mather, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경구암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 헤마토마(hepatoma) 라인(Hep G2)이 있다.
진핵 세포 라인, 특히 포유류 세포 라인은 예를 들면 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역, 또는 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역 또는 간염 항원 또는 간염 항원 결합 영역 또는 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 영역은 예를 들면 당화(glycation)와 같은 1 이상의 해독후 변형(post-translational modifications)을 요구할 때 바람직할 것이다. 예를 들면, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원은 면역성 또는 선택적 면역성인 해독후 변형을 요구할 수 있으므로, 상기 해독후 변형할 수 있는 발현 숙주에서 유용하게 발현될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 산화 사이토졸(oxidising cytosol)을 갖는 세포, 예를 들면 이. 콜리 오리가미(Origami) 균주(Novagen)이다.
또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 환원 사이토졸(reducing cytosol)을 갖는 세포, 바람직하게는 이. 콜리이다.
숙주 세포, 예를 들면 랄스토니아(Ralstonia), 아칼리게네스(Acaligenes), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 할로비포르마(Halobiforma)를 포함하는 종으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 사용된 미생물은 예를 들면 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 할로비포르마 할로테레스트리스(Halobiforma haloterrestris)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 상기 그룹은 생체적합성, 생분해성 입자를 자연적으로 제조할 수 있는 미생물과, 이들의 유전적 메이크업(genetic makeup)에 의해서 상기와 같이 하지 않는 이. 콜리와 같은 미생물을 포함한다. 입자를 생성할 수 있는 후자 상태의 미생물이 요구하는 유전자가 상기에 기술된 바와 같이 도입된다.
극도의 호염성 고세균(extremely halophilic archaea)은 낮은 수준의 비특이성 단백질 결합을 갖는 폴리머 입자를 생성하여 세포로부터 입자가 용이하게 분리 및 정제될 수 있다.
본래, 배양가능한 숙주 세포는 숙주 세포가 상이한 대사작용으로 인해 폴리머 입자를 형성하기에 요구되는 기재를 생성할 수 없을지라도 상기에 기술된 방법에 의해서 폴리머 입자의 생성에 사용될 수 있다. 상기 경우에, 필요한 기제가 배양 배지로 첨가된 후에, 세포로 도입되어진 유전자에 의해서 발현된 단백질에 의해서 폴리머 입자로 전환된다.
폴리머 입자를 제조하기 위한 후자-상태의 숙주 세포를 사용하는 유전자는 예를 들면 티올라제, 리덕타제 또는 폴리머 신타제, 예컨대 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터 유래된 phaA 티올라제, phaB 케토아실 리덕타제 또는 phaC 신타제를 포함한다. 숙주 세포가 폴리머 입자 형성을 위해 부족한 것을 증가시키기 위해 사용된 유전자는 숙주 세포의 유전적 메이크업에 좌우되며 기제가 배양 배지로 공급된다.
입자 형성을 위한 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 입자의 형성에 관여하는 유전자 및 단백질, 및 입자 형성을 위한 일반적인 고려 사항은 Madison, et al, 1999; published PCT International Application WO 2004/020623 (Bernd Rehm); and Rehm, 2003; Brockelbank JA. et al., 2006; Peters and Rehm, 2006; Backstrom et al, (2006) 및 Rehm, (2006)에 보고되었으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참고문으로 포함된다.
폴리머 신타제 단독은 기제로서 (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르 또는 이의 유도체를 갖는 숙주 세포에서 사용될 수 있다.
폴리머 입자는 또한 시험관내에서 형성될 수 있다. 바람직하게, 예를 들면, 세포 유리 발현 시스템이 사용된다. 상기 시스템에서, 폴리머 신타제가 제공된다. 정제된 폴리머 신타제, 예컨대 재조합 생성에서 수득가능한 것, 또는 폴리머 신타제를 코딩하는 발현 구조물의 도입에 의해서 세포 유리 시스템에서 수득가능한 단백질 해독할 수 있는 세포 유리 시스템이 바람직할 것이다. 시험관내에서 입자 형성할 수 있는 환경을 생성하기 위해서, 폴리머 입자 형성을 위해 필요한 기제가 배지에 포함될 수 있다.
폴리머 신타제가 예를 들면 기제로서 (R)-히드록시아실-CoA 또는 다른 CoA 티오에스테르를 사용하여 관능화된 폴리머 입자의 시험관내 제조에 사용될 수 있다.
융합 폴리펩티드는 시험관내 폴리머 입자 생성에 사용하기 이전에 셀 소터(cell sorter), 원심분리, 여과 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 분해된 세포로부터 정제될 수 있다.
시험관내 폴리머 입자 형성은 융합 폴리펩티드 피복의 수준, 포스포리피드 조성물 등의 수준을 포함하는 표면 조성물의 최적으로 조절할 수 있다.
폴리머 입자의 특성은 폴리머 입자가 생성되는 조건을 조절함으로써 영향을 받거나 또는 조절될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기는 예를 들면 숙주 세포의 유전적 메이크업, 예를 들면 Peters and Rehm, 2005에서 토의된 바와 같이 큰 과립을 생성하는 세포 분할 변이체(cell division mutants)를 포함한다. 숙주 세포가 유지되는 조건, 예를 들면 온도, 기제의 존재, 1 이상의 입자-형성 단백질의 존재, 가령, 입자 크기-결정 단백질, 폴리머 조절제의 존재 등이 있다.
하나의 실시양태에서, 폴리머 입자의 목적하는 특성은 지속성에 있다. 용어 "지속성(persistent)"은 선택된 환경에서 분해에 저항하는 폴리머 입자의 역량을 나타낸다. 폴리머 입자의 부가의 바람직한 특성은 폴리머 신타제 또는 입자-형성 단백질로부터 형성되고 입자 조합 중에 폴리머 신타제 또는 입자-형성 단백질의 C- 또는 N-말단에 결합하는 것이다.
본 발명의 몇가지 실시양태에서, 숙주 세포에서 발현 구조물의 과잉발현을 달성하는 것이 바람직하다. 특정 발현 구조물의 과잉발현 기작이 당분야에 잘 알려져 있으며, 상기 구조물 자체, 발현된 숙주 및 목적하거나 요구되는 과잉발현 정도에 좌우될 것이다. 예를 들면, 과잉발현은 (i) 강한 프로모터 시스템, 예를 들면 원핵생물 숙주에서 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 시스템의 사용; (ii) 높은 카피수 플라스미드, 예를 들면 복제의 colE1 기원을 포함하는 플라스미드의 사용; 또는 (iii) 예를 들면 융합 서열의 사용을 통한 메신저 RNA의 안정화; 또는 (iv) 코돈 사용의 최적화를 통한 리보좀 결합 부위 또는 말단 부위 등의 해독의 최적화에 의해서 달성될 수 있다. 과잉 발현의 이점은 목적하는 더 작은 입자를 생성하고 더 많은 수의 폴리머 입자를 생성할 수 있다.
폴리머 입자를 형성하는 폴리머의 조성은 폴리머 입자의 기계적 또는 물리화학적 특성에 영향을 줄 것이다. 예를 들면, 이들 폴리머 조성물과 다른 폴리머 입자는 반감기가 다르거나, 또는 상이한 수준으로 생물학적 활성 물질, 특히 약학적 활성 성분을 분비할 것이다. 예를 들면, C6-C14 3-히드록시 지방산을 포함하는 폴리머 입자는 폴리머의 낮은 결정성에 의해서 높은 수준의 폴리머 분해를 나타낸다. 폴리머 백본에서 상대적으로 큰 곁사슬을 갖는 폴리머 구성성분의 몰 비율에서 증가는 통상 결정성을 감소시키므로 현저한 탄성 특성을 나타낸다. 본 발명에 기술된 방법에 따라 폴리머 조성물을 조절함에 의해서, 폴리머 입자의 생분해성에 영향을 줄 수 있으므로 폴리머 입자의 지속에 영향을 주며, 상기 입자에서 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원 또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역, 또는 상기 입자에서 1 이상의 엠. 투버쿨로시스 항원 또는 엠. 투버쿨로시스 항원 결합 영역, 또는 간염 항원 또는 간염 항원 결합 영역, 또는 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원 결합 영역이 존재할 때 예를 들면 투여되는 피험체에서 유지되거나, 또는 상기 폴리머 입자상에서 또는 폴리머 입자에 존재하는 생물학적 활성 물질, 특히 약학적 활성제 또는 스킨-케어 성분의 분비율에 영향을 준다.
관능성 측기(functional side groups )를 갖는 적어도 하나의 지방산이 폴리머 입자의 형성을 위한 기제로서 배양 배지로 도입되는 것이 바람직하며, 여기서 적어도 하나의 히드록시 지방산 및/또는 적어도 하나의 머캅토 지방산 및/또는 적어도 하나의 β-아미노 지방산이 도입되는 것이 특히 바람직하다. "관능성 측기를 갖는 지방산(Fatty acids with functional side groups)"은 포화 또는 불포화 지방산을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 상기는 메틸기, 알킬기, 히드록실기, 페닐기, 설프히드릴(sulfhydryl)기, 1차, 2차 및 3차 아미노기, 알데히드기, 케토기, 에테르기, 카르복실기, O-에스테르기, 티오에스테르기, 카르복실산 아미드기, 헤미아세탈기, 아세탈기, 포스페이트 모노에스테르기 및 포스페이트 디에스테르기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 관능성 측리를 포함하는 지방산을 또한 포함한다. 기제의 사용이 폴리머 입자의 목적하는 특성 및 목적하는 조성에 의해서 결정된다.
상기 기제 또는 기제 혼합물은 적어도 하나의 선택적으로 치환된 아미노산, 락테이트, 에스테르 또는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 아세틸-CoA를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 보조제(adjuvant), 면역조정제(immunomodulatory agent) 또는 분자, 예컨대 면역자극제 또는 분자, 또는 백신 제조에 유용한 다른 화합물이 기재 혼합물에 제공되고 폴리머 입자 형성 중에 폴리머 입자로 혼입되거나, 또는 폴리머 입자에 확산시킨다.
상기 폴리머 입자는 예를 들면 폴리-베타-아미노산, 폴리아세테이트, 폴리티오에스테르 및 폴리에스테르로부터 선택된 폴리머를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트(PHA), 바람직하게는 폴리(3-히드록시부티레이트)(PHB)를 포함한다.
상기 폴리머 신타제(synthase) 또는 폴리머 입자는 바람직하게는 폴리머 입자를 캡슐화(encapsulates)하는 포스포리피드 모노레이어(monolayer)를 포함한다. 바람직하게, 상기 입자-형성 단백질은 상기 리피드 모노레이어(lipid monolayer)에 이른다.
폴리머 신타제 또는 입자-형성 단백질은 폴리머 입자 또는 포스포리피드 모노레이어에 결합되거나 또는 상기 둘다에 결합되는 것이 바람직하다.
상기 입자-형성 단백질은 이를 형성하는 폴리머 입자에 공유 결합하거나 또는 비(非)공유 결합되는 것이 바람직하다.
바람직하게 상기 폴리머 입자의 표면적의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%가 융합 폴리펩티드에 의해서 피복된다.
특정 상황에서, 예를 들면 주어진 용도에 특히 적합한 입자를 제조하기 위해서 본 발명에서 제조된 입자의 크기를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 강력한 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위해, 상대적으로 큰 크기를 갖는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 폴리머 입자를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 결핵 치료에 사용하기 위한 입자와 관련하여, 강력한 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위해, 상대적으로 큰 크기를 갖는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 포함하는 폴리머 입자를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 유사한 조건이 간염 또는 인플루엔자의 치료에 적용할 수 있으며, 여기서 강력한 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위해, 상대적으로 큰 크기를 갖는 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함하는 폴리머 입자를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리머 입자의 크기를 조절하기 위한 방법은 PCT/DE2003/002799(WO 2004/020623으로 공개) 및 PCT/NZ2006/000251(WO 2007/037706으로 공개)에 기재되어 있다.
몇가지 실시양태에서, 입자 크기가 입자-형성 단백질의 발현을 조절함으로써 또는 예를 들면 존재하는 경우 입자 크기-결정 단백질의 발현을 조절함으로써 조절된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 예를 들면 입자 크기 조절은 기제의 이용가능성, 예를 들면 배양 배지에서 기제의 이용가능성을 조절함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 기제는 폴리머 입자의 크기를 조절하기에 충분한 양으로 배양 배지로 첨가될 수 있다.
상기 방법의 조합은 입자 크기에 대해서 더 효과적인 제어를 발휘하기 위해서 사용될 수 있다고 이해될 것이다.
다양한 실시양태에서, 예를 들면 입자 크기는 약 약 10 nm 내지 3 μm, 바람직하게는 약 10 nm 내지 약 900 nm, 약 10 nm 내지 약 800 nm, 약 10 nm 내지 약 700 nm, 약 10 nm 내지 약 600 nm, 약 10 nm 내지 약 500 nm, 약 10 nm 내지 약 400 nm, 약 10 nm 내지 약 300 nm, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 특히 바람직하게, 약 10 nm 내지 약 100 nm의 직경을 갖는 입자를 제조하기 위해서 조절될 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들면 입자 크기는 약 10 nm 내지 약 90 nm, 약 10 nm 내지 약 80 nm, 약 10 nm 내지 약 70 nm, 약 10 nm 내지 약 60 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 40 nm, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 20 nm의 직경을 갖는 입자를 제조하기 위해서 조절될 수 있다.
상기에 기술된 범위내의 범위를 포함하는 평균 입자 크기의 다른 범위가 특별히 의도되며, 예를 들면 폴리머 입자는 약 50 내지 약 500 nm, 약 150 내지 약 250 nm, 또는 약 100 내지 약 500 nm, 등의 직경을 갖는다.
다양한 실시양태에서, 예를 들면, 제조된 입자의 90%는 약 200 nm 이하의 직경을 가지며, 80 %는 약 150 nm 이하의 직경을 가지고, 60 %는 약 100 nm 이하의 직경을 가지며, 45 %는 약 80 nm 이하의 직경을 가지고, 40 %는 약 60 nm 이하의 직경을 가지며, 25 %는 약 50 nm 이하의 직경을 가지고, 5 %는 약 35 nm 이하의 직경을 갖는다.
다양한 실시양태에서, 예를 들면 상기 방법은 약 200 nm 미만, 약 150 nm 미만, 또는 약 110 nm 미만의 평균 직경을 갖는 폴리머 입자를 제조한다.
7. 조성 및 조제
본 발명의 폴리머 입자는 다양한 상이한 적용을 위해 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당한 조성으로서 조제되며, 예를 들면 특별한 경로를 통한 투여를 위해 조제되거나 또는 보관을 위해서 조제되며, 상기를 제조하는 숙주 세포 외부에서 입자로서 안정하게 유지될 수 있으며, 상기 입자는 다양한 적용에 적합하도록 디자인될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면 본 명세서에서 유용한 조성이 이에 한정되는 것은 아니지만 경구 또는 비경구(국소, 피하, 근육내 또는 정맥내를 포함)를 포함하는 선택된 경로에 의해서 피험체에게 투여되도록 조제된다.
그러므로, 예를 들면 본 발명에 따른 유용한 약학적 조성물은 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 실시와 관련하여 선택된 적당한 약학적 허용가능한 담체(부형제, 희석제, 보조제 및 이의 조합체)와 조제될 수 있다. 예를 들면, 백신용 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 알려진 바와 같은 1 이상의 보조제 또는 면역자극제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 유용한 조성물은 분말, 액체, 태블릿(tablet) 또는 캡슐(capsule)과 같은 경구용, 연고, 크림 또는 로션과 같은 비경구용으로 투여될 수 있다. 적당한 조제는 요구되는 추가 제제(유화제, 항산화제, 풍미제 또는 착색제를 포함함)를 포함할 수 있으며, 즉시, 지연, 변형, 지속, 펄스 또는 제어된 방출에서 적당할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 사람 및 기타 포유류에서 질병, 질환 및/또는 증상 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 기타 질환의 치료에 유용한, 본 명세서에 기술된 것을 포함하는 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 투여량(doses), 투여 형태(dosage forms), 조제(formulations), 조성 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 상기 투여 형태, 조제, 조성 및/또는 장치의 사용으로 상기 증상을 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 예를 들면 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 투여 형태, 조제, 장치 및/또는 조성을 제공하며, 상기 1 이상의 폴리머 입자는 Tb 항원을 포함한다. 본 발명의 투여 형태, 조제, 장치 및/또는 조성은 연장된 기간 동안 생체이용성, 면역원성을 최적화하거나, 또는 면역학적 또는 치료적 범위내에서 혈장, 혈액 또는 조직 농도를 유지하도록 조제될 수 있다. 예를 들면 조절된 송달 조제는 작용 부위에서 항원 농도를 최적화하기 위해서 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 투여 형태, 조제, 장치 및/또는 조성은 예를 들면 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자에 계속된 노출을 제공하기 위해서 주기적 투여를 위해서 조제될 수 있다. 유익한 면역학적 반응, 예를 들면 1 이상의 "부스터(booster)" 백신화를 사용하는 것을 유도하기 위한 전략이 당 분야에 잘 알려져 있으며, 상기 전략은 본 발명의 실시에서 채택될 수 있다.
약학적 조성물 및 투여 형태가 비경구 경로를 통해 투여될 수 있으며, 상기 경로는 본 명세서에 기술된 것과 같은 면역 반응을 유도하는 방법의 특정 실시양태에서 바람직할 것이다. 비경구 투여 형태의 예로는 활성제의 수용액, 등장성 식염수(isotonic saline) 또는 5% 글루코스, 또는 다른 잘 알려져 있는 약학적 허용가능한 부형제를 포함한다. 예를 들면 시클로덱스트린 또는 당 분야에 친숙한 것으로 잘 알려져 있는 다른 가용화제가 치료제의 송달을 위한 약학적 부형제로서 이용할 수 있다.
경구 투여를 위해 적당한 투여 형태의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 폴리머 입자의 치료적 유효량을 제공할 수 있는, 태블릿, 캡슐, 로젠지(lozenges) 또는 유사 형태, 또는 시럽, 수용액, 에멀젼 등과 같은 액체 형태를 포함한다. 캡슐은 표준 약학적 허용가능한 물질, 예컨대 젤라틴 또는 셀룰로스를 포함할 수 있다. 태블릿은 고형 담체 및 윤활제와 활성 성분의 혼합물을 압축함으로써 종래 방법에 따라 조제될 수 있다. 고형 담체의 예로는 전분 및 슈거 벤토나이트를 포함한다. 활성 성분은 또한 결합제, 예를 들면 락토스 또는 만니톨, 종래 필러(filler) 및 정제화 제제(tabletting agent)를 포함하는 경질 쉘의 태블릿 또는 캡슐의 형태로 투여될 수 있다.
경피(transdermal) 투여에 적당한 투여의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 경피성 패치, 경피성 붕대 등을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 조제의 국소 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 로션, 스틱, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 겔 등이 있으며, 피부에 직접 도포되거나 또는 패드(pad), 패치 등과 같은 매개물(intermediary)을 통해서 도포될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 조제의 좌약 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 몸의 구멍, 특히 직장, 질 및 요도로 삽입되는 고형 투여 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물 및 조제의 주사에 적당한 투여 형태의 예로는 정맥내 주사, 피하, 진피 및 근육내 투여 또는 경구 투여에 의해서 한번 또는 다수 투여와 같은 볼러스(bolus)를 통한 송달을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 조제의 데봇(depot) 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 본 발명의 폴리머 입자의 펠렛 또는 작은 실린더(cylinders) 또는 고체 형태를 포함하며, 본 발명의 폴리머 입자는 생분해성 폴리머의 매트릭스, 마이크로에멀젼, 리포좀에 트래핑되거나 또는 마이크로캡슐화된다.
본 발명의 조성물 및 조제를 위한 주입(infusion) 장치의 예로는 목적하는 투여 회수 또는 정상 상태 투여를 위한 목적하는 양으로 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 주입 펌프를 포함하며, 이식성(implantable) 약물 펌프를 포함한다.
본 발명의 조성물 및 조제용 이식성 주입 장치의 예로는 고체 형태를 포함하며, 본 발명의 폴리머 입자가 생분해성 폴리머 또는 합성, 폴리머, 예컨대 실리콘, 실리콘 고무, 실라스틱(silastic) 또는 유사한 폴리머내에 캡슐화되거나 또는 통해서 분산된다.
본 발명의 조성물 및 조제의 경점막(transmucosal) 송달에 적당한 투여 형태의 예로는 활성 성분 뿐만 아니라 당 분야에 알려져 있는 적당한 담체에 포함된 관장제(enemas), 페서리(pessaries), 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼(foams), 분무형 용액, 분말 및 유사한 제제를 위한 보관 용액(depositories solution)을 포함한다. 특히, 약학적으로 허용가능한 용액 및/또는 현탁액, 수용액 또는 유기 용매, 또는 이의 혼합물 및/또는 분말을 포함하는 조성물을 포함하는, 본 발명의 조성물 및 조제의 흡입(inhalation) 또는 통기(insufflation)에 적당한 투여 형태가 의도된다. 본 발명의 조성물 및 조제의 경점막 투여는 점막을 이용할 수 있지만, 통상 코(nasal), 볼(buccal), 질 및 직장 조직을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 조제의 비강 투여에 적당한 조제는 액체 형태, 예를 들면 코 스프레이, 코 드롭(drops)으로 투여될 수 있거나, 또는 폴리머 입자의 수성 또는 유성 용액을 포함하는 네뷸라이저에 의한 에어로졸 투여에 의해서 투여될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여용 조제는 예를 들면 약 약 100 마이크론 이하, 가장 바람직하게는 약 50 이하의 마이크론의 입자 크기를 갖는 거친 분말을 포함하며, 코로 들여마셔 섭취하는 방식으로 투여되며, 예를 들면 코에 가깝게 유지하여 분말 용기에서부터 비강을 통해서 빠르게 흡입되는 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조제는 벤질 알콜 또는 다른 적당한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 당 분야에 잘 알려져 있는 다른 가용화제 또는 분산제를 사용하는 식염수, 용액에 수용액의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 조제의 구강(buccal) 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 로젠지, 태블릿 등을 포함하며, 상기 조성물은 약학적 허용가능한 용액 및/또는 현탁액, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 및/또는 분말을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 조제의 설하(sublingual) 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 로젠지, 태블릿 등을 포함하며, 상기 조성물은 약학적 허용가능한 용액 및/또는 현탁액, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 및/또는 분말을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 조제의 눈(opthalmic) 투여에 적당한 투여 형태의 예로는 약학적 허용가능한 용액 및/또는 현탁액, 수성 또는 유기 용매를 포함하는 삽입물 및/또는 조성물을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 조제의 송달에 유용한 백식 및 조절된 약물 조제를 포함하는 조성물의 조제의 예로는 예를 들면, Sweetman, S. C. (Ed.). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago, 2002, 2483 pp.; Aulton, M. E. (Ed.) Pharmaceutics. The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone, Edinburgh, 2000, 734 pp.; and, Ansel, H. C, Allen, L. V. and Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 pp.에서 발견할 수 있다. 약물 송달 시스템의 제조에 사용된 부형제는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있는 다양한 공보에 기술되어 있으며, 예를 들면 Kibbe, E. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665 pp.를 포함한다. USP는 변형-방출(modified-release) 경구 투여 형태의 예를 제공하며, 태블릿 또는 캡슐로 조제된 것을 포함한다. 예를 들면, The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995 (이후에, "USP")를 참고하며, 연장된-방출 및 지연된-방출 태블릿 및 캡슐의 약물 방출 역량을 측정하기 위한 특정 시험을 또한 기술하였다. 연장된-방출 및 지연된-방출 논문에 대한 약물 방출에 대한 USP 시험은 경과된 시험 시간에 대한 투여 유닛으로부터 약물 용해도에 기초한다. 다양한 시험 장치 및 절차에 대한 상세를 USP에서 찾을 수 있다. 연장된 방출 투여 형태의 분석에 관련된 부가의 안내가 F.D.A.에 의해서 제공된다(참고 Guidance for Industry. Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations. Rockville, MD: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration, 1997).
본 발명의 투여 형태의 추가의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 지연된-방출(DR) 형태; 연장된-작용(PA) 형태; 조절된-방출(CR) 형태; 연장된-방출(ER) 형태; 정기적-방출(TR) 형태; 및 장기-작용(LA) 형태를 포함하는 변형된 방출(MR) 투여 형태를 포함한다. 대부분에서, 상기 용어는 경구 투여되는 투여 형태를 기술하기 위해서 사용되지만, 그러나 상기 용어는 본 명세서에 기술된 투여 형태, 조제, 조성물 및/또는 장치에 적용가능할 수 있다. 상기 조제는 약물 투여 이후에 어떤 시간 동안 지연된 전체 약물 방출, 및/또는 투여후 일시적으로 소량의 분취량(aliquot)으로 약물 방출, 및/또는 송달 시스템에 의해 좌우되는 조절율에 느린 약물 방출, 및/또는 가변되지 않는 일정 속도로 약물 방출, 및/또는 통상의 조제보다 상당히 긴 시간 동안 약물 방출을 달성한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자 또는 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 1 이상의 항원의 치료적 유효량은 약 1 ug/kg 내지 약 1 g/kg이다. 실례의 치료적 유효량 범위는 예를 들면 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 400 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 300 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 90 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 80 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 70 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 1 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 5 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 50 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 200 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 300 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 400 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 500 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 600 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 700 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 800 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 900 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 25 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 30 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 35 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 45 mg/kg 내지 약 50 mg/kg을 포함한다.
다른 치료적 유효량은 예를 들면 약 1 mg/kg 내지 약 1 g/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 950 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 900 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 850 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 800 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 750 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 700 mg/kg, 5 mg/kg 내지 약 600 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 400 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 75 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 15 mg/kg 내지 약 35 mg/kg을 포함한다.
사람 피험체를 표적으로 하는 본 발명의 몇가지 실시양태에서, 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자의 치료적 유효량 또는 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 1 이상의 항원의 치료적 유효량은 예를 들면 도스(dose)당 약 10 mg 내지 약 1O g이다. 다른 치료적 유료량 범위는 예를 들면 도스당 약 20 mg 내지 약 9 g, 약 30 mg 내지 약 8 g, 약 40 mg 내지 약 7 g, 약 50 mg 내지 약 6 g, 약 60 mg 내지 약 5 g, 약 70 mg 내지 약 4 g, 약 80 mg 내지 약 3 g, 약 100 mg 내지 약 2 g, 약 100 mg 내지 약 1.5 g, 약 200 mg 내지 약 1400 mg, 약 200 mg 내지 약 1300 mg, 약 200 mg 내지 약 1200 mg, 약 200 mg 내지 약 1100 mg, 약 200 mg 내지 약 1000 mg, 약 300 mg 내지 약 900 mg, 약 300 mg 내지 약 800, 약 300 mg 내지 약 700 mg 또는 약 300 mg 내지 약 600 mg을 포함한다.
본 발명은 또한 파트로서 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 저투여량의 조성물, 조제 및 장치를 제공한다. 예를 들면, 저투여량의 조성물, 조제 등은 예를 들면 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자 또는 본 발명의 1 이상의 폴리머 입자를 포함하는 1 이상의 항원의 약 0.001 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 0.02 내지 약 3.5 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 0.05-0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.05-0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 0.05-0.1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 0.05-0.1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 0.05-0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 및/또는 본 명세서에 제시된 범위내의 다른 투여량 또는 투여 범위를 제공하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 명세서에 기술된 투여량은 일회 투여 또는 수회 투여 또는 분할 투여로 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여량은 면역학 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 치료 기간에 대해서 1회, 2회, 3회, 4회 이상 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 유용한 조성물의 유효성(efficacy)은 시험관내 및 생체내 양쪽에서 평가될 수 있다. 예를 들면 하기 실시예를 참조한다. 간단하게, 상기 조성물은 세포-매개 면역 반응을 유도하기 위한 이의 역량을 시험관내 또는 생체내에서 시험될 수 있다. 생체내 연구에 있어서, 상기 조성물이 동물(예컨대, 마우스)로 먹이거나 또는 주사될 수 있고, 그후 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 효과가 평가된다. 결과에 기초하여, 적당한 투여 범위 및 투여 경로가 결정될 수 있다.
본 발명의 몇가지 실시양태에서, 치료적 유효량은 면역 반응을 유도하는데 유효한 양이며, 예를 들면 약 0.5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 9 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 8 ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 7 ng/mL 또는 약 3 ng/mL 내지 약 6 ng/mL의 혈중 IFN-감마의 농도이다.
감염 후 또는 연장된 감염 동안을 포함하는 몇가지 상황에서, 향상된 IFN-감마 혈중 농도가 관찰되며, 상기 높은 농도는 본 발명의 폴리머 입자에 의한 효과적인 면역 반응의 유도가 평가될 수 있는 기준선을 평가에서 설명되어야 한다.
8. 폴리머 입자에 의한 치료
폴리머 입자, 예컨대 폴리히드록시알킬 폴리머 입자는 이를 제조하는 숙주 세포 밖에서 입자로서 안정하게 유지되며, 상기 입자는 다양한 적용에 적합하게 디자인될 수 있다는 것이 발견되었다.
관능성 폴리머 입자는 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 표면-결합 항원, 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 결합 영역에 결합된 1 이상의 물질, 또는 이의 결합체를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면 물질은 입자 형성 중에 입자 표면에 고정되거나, 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 결합되거나, 또는 부하(loading), 확산(diffusion) 또는 혼입(incorporation)에 의해서 입자로 통합된다.
결핵 치료에 사용과 관련하여, 예를 들면 폴리머 입자는 1 이상의 표면-결합된 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 마이코박테리움 투버쿨로 시스 항원 결합 영역에 결합된 1 이상의 물질, 또는 이의 결합체를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 물질은 입자 형성 중에 입자 표면에 고정되거나, 예를 들면 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 결합되거나, 또는 부하, 확산 또는 혼입에 의해서 입자로 통합될 수 있다. 예를 들면 가교에 의한 폴리머 입자의 표면으로의 공유 결합이 또한 특별하게 의도된다.
하나의 실시양태에서, 상기 물질은 예를 들면 단백질 또는 단백질 절편, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 항체 절편, 항체 결합 영역, 항원, 항원 결정기(antigenic determinant), 에피토프(epitope), 면역원 또는 이의 절편, 또는 이의 2 이상의 결합체를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 세포내 병원체로부터의 DNA는 절편화되어 폴리머 신타제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구조물로 삽입된다. 상기 방법에서, 세포내 병원체 항원 결정기를 나타내는 폴리머 입자가 제조되고 감염된 질환자로부터의 혈청을 사용하여 스크리닝하여, 항원을 나타내는 입자를 확인하고, 분리하여, 잘 알려진 스케일가능한 박테리아 제조 시스템을 사용하여 재현된다.
하나의 실시양태에서, 세포-매개(또는 다른) 면역 반응을 유도할 수 있는 다수의 항원이 폴리머 입자의 표면에서 고정된다.
하나의 실시양태에서, 마이코박테리움 투버쿨로시스 박테리아로부터의 DNA가 예를 들면 절편화되고, 폴리머 신타제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구조물로 삽입된다. 상기 방법으로, 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결정기를 나타내는 폴리머 입자가 제조되고, 감염된 질환자로부터의 혈청을 사용하여 스크리닝하여 항원을 나타내는 입자가 확인되고, 분리되어 잘 알려진 스케일가능한 박테리아 제조 시스템을 사용하여 재현된다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면 다수의 마이코박테리움 투버쿨로시스 또는 다른 항원이 폴리머 입자의 표면에서 고정된다.
유사하게, 다양한 실시양태에서, 간염 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로부터의 DNA가 예를 들면 절편화되고, 폴리머 신타제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구조물로 삽입된다. 상기 방법으로, 간염 항원 결정기 또는 인플루엔자 항원 결정기를 나타내는 폴리머 입자가 제조되고, 감염된 질환자로부터의 혈청을 사용하여 스크리닝하여 항원을 나타내는 입자가 확인되고, 분리되어, 잘 알려진 스케일가능한 박테리아 제조 시스템을 사용하여 재현된다.
하나의 실시양태에서, 다수의 간염 또는 인플루엔자 항원이 예를 들면 폴리머 입자의 표면에서 고정된다.
본 발명의 하나의 측면은 면역 반응을 유도하기 위한 1 이상의 항원을 운반하는 폴리머 입자의 역량에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 상기 폴리머 입자는 폴리머 비드에 융합된 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함한다. 상기 폴리머 입자는 항원성 성분에 최적의 면역 반응을 자극하기 위해 이의 표면에서 세포-매개 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 1 이상의 항원을 운반하는 폴리머 입자는 면역 반응을 유도한다. 하나의 실시양태에서, 폴리머 입자는 예를 들면 상기 폴리머 비드에 융합된 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함한다. 상기 폴리머 입자는 예를 들면 항원성 성분에 최적의 면역 반응을 자극하기 위해 이들 표면에서 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 1 이상의 항원을 운반하는 폴리머 입자는 간염에 대한 면역 반응을 유도한다. 하나의 실시양태에서, 폴리머 입자는 예를 들면 상기 폴리머 비드에 융합된 1 이상의 간염 항원을 포함한다. 상기 폴리머 입자는 예를 들면 항원성 성분에 최적의 면역 반응을 자극하기 위해 이들 표면에서 1 이상의 간염 항원을 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 폴리머 입자는 예를 들면 상기 폴리머 비드에 융합된 1 이상의 인플루엔자 항원을 포함한다. 상기 폴리머 입자는 예를 들면 항원성 성분에 최적의 면역 반응을 자극하기 위해 이들 표면에서 1 이상의 인플루엔자 항원을 나타낸다. 다른 항원이 본 명세서에서 기술된 바와 같이 의도된다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면 1 이상의 항원 또는 항원 및 보조제 또는 다른 면역조절제 또는 분자, 예컨대 면역자극제 또는 분자의 조합체가 입자내에 또는 입자상에 존재하거나 또는 조성물내에 존재한다. 전형적으로, 항원, 보조제, 또는 다른 면역조절제 또는 분자의 결합체의 존재는 면역 반응을 추가로 향상시키기위해서 존재할 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 예를 들면 다상(multiphase)의 백신 조성물을 제공한다. 상기 하이브리드(hybrid) 백신은 결핵 감염의 다양한 단계에 특이적인 상이한 항원을 나타낸다. 예를 들면, 초기 단계 항원은 잠재 단계 항원과 함께 발현된다. 세포내 항원을 포함하는 다양한 항원에 특이적인 항원은 당분야에 잘 알려져 있으며, 실례의 병원체에 대한 대표적인 항원이 본 명세서에 기술되었다.
본 발명은 피험체에서 세포-매개(및/또는 다른) 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험체에게 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 폴리머 입자, 바람직하게는 폴리머 신타제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시양태에서, 상기 피험체에 투여시에 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 내인성 항원에 결합될 수 있다. 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 내인성 항원에 대해 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 폴리머 입자의 결합은 피험체의 면역 반응을 유도하거나 또는 항상시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들면, 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 입자의 투여 전에 피험체에서 존재하는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원은 예를 들면 피험체에서 효과적인 면역 반응을 유도할 수 없고, 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 입자에 결합할 수 있거나, 또는 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 효과적이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 결핵에 감염되거나, 또는 결핵에 대해서 면역화된 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험체에서 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시양태에서, 예를 들면 피험체에 투여시에 마이코박테리움 투버쿨로시 스 항원 결합 영역이 내인성 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 결합될 수 있다. 예를 들면 내인성 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원에 대한 마이코박테리움 투버 쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 폴리머 입자의 결합은 피험체의 면역 반응을 유도하거나 또는 향상시킬 수 있는 것을 이해할 것이다.
예를 들면, 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 결합 영역을 포함하는 입자의 투여 전에 피험체에 존재하는 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원은 피험체에서 효과적인 면역 반응을 유도할 수 없고, 입자에 결합시에 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있거나 또는 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 효과적이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 간염에 감염되거나 또는 간염에 대해 이미 면역화된 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험체에 간염 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함한다.
본 실시양태에서, 피험체에 투여시에, 간염 항원 결합 영역은 예를 들면 내인성 간염 항원에 결합할 수 있다. 내인성 간염 항원으로의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 폴리머 입자의 결합은 피험체의 면역 반응을 유도하거나 또는 향상시킬 수 있는 것을 이해할 것이다.
예를 들면, 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 입자의 투여 전에 피험체에 존재하는 간염 항원은 피험체에서 효과적인 면역 반응을 유도할 수 없거나, 입자에 결합시에 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있거나, 또는 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 효과적이다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면 본 발명은 인플루엔자에 감염된거나 또는 인플루엔자에 이미 면역화된 피험체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험체에 인플루엔자 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 방법을 제공한다.
본 실시양태에서, 예를 들면 피험체에 투여시에 인플루엔자 항원 결합 영역은 내인성 인플루엔자 항원에 결합될 수 있다. 내인성 인플루엔자 항원으로의 인플루엔자 항원 결합 영역을 포함하는 폴리머 입자의 결합은 피험체의 면역 반응을 유도하거나 또는 향상시키는 것을 이해할 것이다.
예를 들면, 적어도 하나의 간염 항원 결합 영역을 포함하는 입자의 투여 전에 피험체에 존재하는 인플루엔자 항원은 피험체에서 효과적인 면역 반응을 유도할 수 없거나, 입자에 결합시에 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있거나, 또는 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 효과적이다.
본 발명은 피험체에 투여되어 피험체에서 면역 반응을 유도하는 입자, 조성물 및 방법을 제공하는 것을 이해할 것이다. 바람직하게, 본 발명의 입자, 조성물 및 방법을 사용하여 피험체에 존재하는 1 이상의 항원에 대한 반응으로 유도되는 면역 반응의 크기는 항원 단독에 대한 반응에서 유도되는 것보다 크다(즉, 본 발명의 입자 또는 조성물의 부재시에, 또는 본 명세서에 제공된 것 이외의 방법에 의해서 제공됨), 면역 반응, 특히 세포-매개 면역 반응의 크기를 정량화하는 방법이 당분야에 잘 알려져 있다.
9. 면역 반응의 조절제
특정 상황에서, 세포-매개 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 포함하는 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제공하는 것이 유익할 것이다. 선택적으로, 면역 반응의 보조제 또는 다른 조절제와 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질은 면역 반응을 유도하는데 유익하다.
특정 상황에서, 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 항원을 포함하는 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제조하는 것이 유익할 것이다. 선택적으로, 면역 반응의 보조제 또는 다른 조절제와 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질은 면역 반응을 유도하는데 유익하다.
예를 들면, 결합 치료시에 적어도 하나의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원을 포함하는 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제조하는 것이 유익하며, 상기 폴리머 입자가 면역 시스템의 1 이상의 보조제 또는 다른 조절제와 함께 투여된다. 선택적으로, 예를 들면 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원 및 면역 반응의 보조제 또는 다른 조절제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 폴리머 입자는 면역 반응을 유도하는데 유익할 수 있다. 간염의 치료시에. 적어도 하나의 간염 항원을 포함하는 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제조하는데 유익하며, 상기 폴리머 입자는 면역 시스템의 1 이상의 보조제 또는 다른 조절제와 함께 투여된다. 선택적으로 1 이상의 간염 항원 및 면역 반응의 보조제 또는 다른 조절제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 폴리머 입자는 면역 반응을 유도하는데 유익할 것이다. 인플루엔자 치료시에, 적어도 하나의 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제조하는데 유익하며, 상기 폴리머 입자가 상기 면역 시스템의 1 이상의 보조제 또는 다른 조절제와 함께 투여된다. 선택적으로, 1 이상의 인플루엔자 항원 및 면역 반응의 보조제 또는 다른 조절제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 폴리머 입자는 면역 반응을 유도하는데 유익할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 폴리머 입자는 1 이상의 톨(toll)형 수용체와 함께 1 이상의 항원을 포함할 수 있으며, LPS, 리포프로테인, 리포펩티드, 플라겔린(flagellin), 이중가닥 RNA, 비(非)메틸화 CpG 아일랜드, 또는 박테리아 또는 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함하는 리간드 그룹의 1 이상을 결합할 수 있는 1 이상의 톨형 수용체를 포함한다. 유사하게, 본 발명의 조성물은 1 이상의 Tb 항원을 포함하는 폴리머 입자의 개체, 및 1 이상의 면역조절 분자를 포함하는 폴리머 입자의 개체, 예컨대 1 이상의 톨형 수용체를 포함할 수 있다.
1 이상의 면역조절 분자의 존재는 체액-특이적 면역 반응, 또는 세포-매개-특이적 면역 반응을 유도하거나, 또는 체액과 세포-매개 반응 모두의 결합체를 포함하는 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
특정 항원은 상기에 기술된 것과 본 명세서에 언급된 문헌에 기술된 것을 포함하는 공지된 마이코박테리움 투버쿨로시스 항원으로부터 선택될 수 있다. 항원은 초기 단계 감염을 치료하거나 또는 면역화하기에 적당한 백신을 제조하기 위해서 선택될 수 있다. 선택적으로, 감염 초기 및 잠재 단계로부터의 항원을 포함하는 다단계 백신이 제공된다. 예를 들면, Ag85A-ESAT-6 융합 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 포함하는 백신 송달 시스템이 제공된다. 두번째 실시예는 결핵에 대한 면역 반응을 자극하는데 적당한 공지된 보조제와 Ag85A 항원을 나타내는 폴리머 입자를 포함할 수 있다.
특정 항원은 상기에 기술된 것 및 본 명세서에 언급된 문헌에 기술된 것을 포함하는 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 공지된 항원으로부터 선택될 수 있다. 항원은 초기 단계 감염을 치료하거나 또는 면역화하기에 적당한 백신을 제조하기 위해서 선택될 수 있다. 선택적으로, 감염의 초기 및 잠재 단계로부터의 항원을 포함하는 다단계 백신이 제공된다.
본 발명은 상기와 이후에 실시예를 제공하는 고찰된 구성에 있다.
실시예
실시예 1 - 이. 콜리 에서 PHA 폴리머 입자의 제조 및 플라스미드의 구조
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 결핵 항원 Ag-85A 및 ESAT-6, C형 간염 코어 항원 및 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원의 H1 서브타입을 나타내는 폴리머 입자의 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 기술하였다.
물질 및 방법
1. 에스케리치아 콜리 균주의 성장
에스케리치아 콜리 DH5α(Invitrogen)가 1%(w/w) 글루코스 및 75 μg/mL의 암피실린이 보충된 Difco™ 루리아 배양액(Luria Broth)(표 1 참조)에서 배양한다. 에스케리치아 콜리 BL21(Invitrogen)은 1%(w/w) 글루코스, 75 μg/mL의 암피실린 및 30 μg/mL의 클로람페니콜이 보충된 Difco™ 루리아 배양액에서 배양한다.
Figure pct00001
2. 플라스미드의 구조
본 실시예에서 사용된 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 하기 표 2에 기술되었다.
PhaA 및 PhaB 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다. 결핵 항원 폴리머 입자에 있어서, 플라스미드 DK1.2-Ag85A-ESAT-6은 Ag85A의 코딩 영역(분비 시그날 서열은 없음)(N-말단 성분) 및 ESAT-6의 코딩 영역(C-말단 성분)을 포함하는 하이브리드 유전자를 포함한다. Ag85A-ESAT-6 융합 단백질을 코딩하고 해독 개시 부위 및 개시 코돈을 포함하는 DNA 절편이 상기 플라스미드로부터 PCR에 의해서 프라이머 Ag85A-SpeI[서열 번호 3] 및 ESAT-6-SpeI[서열 번호 4]를 사용하여 분리되고, XbaI, ClaI-엔도누클레이즈된 pHAS 벡터로 결찰되어 플라스미드 pHAS-Ag85A-ESAT-6을 생성한다.
Ag85A-ESAT6 융합의 3'OH 말단 절편으로부터의 코딩 서열이 서열 번호 1에 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 2에 개시하였다.
C형 간염 항원 폴리머 입자에 있어서, SpeI/NotI 절편으로서 DNA 2.0에 의해서 합성된 Hep C DNA가 pET-14b-scFv-PhaC 벡터로 서브클로닝되어 pET-14b Hep-PhaC를 형성한다.
HepC-PhaC 융합의 3'OH 말단 절편으로부터의 코딩 서열은 서열 번호 7에 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 8에 개시되었다.
HA 항원 폴리머 입자에 있어서, 전체 lemgth 헤마글루티닌 서열은 SpeI/NotI 절편으로서 GenScript에 의해서 합성된다. 상기 절편은 pET-14b-scFv-PhaC 벡터로 서브클로닝되어 pET-14b 헤마글루티닌-PhaC를 형성한다. 헤마글루티닌 항원의 더 짧은 H1 부분을 생성하기 위해서, H1 서열은 주형으로서 pET-14b 헤마글루티닌-PhaC를 사용하여 하기 표 2에 기술된 프라이머에 의해서 증폭된다. SpeI/SunI 절편이 pET-14b 헤마글루티닌-PhaC로 서브클로닝되어 H3-PhaC의 pET-14b HA1을 형성한다. XhoI/BamHI 절편이 pET-14b PhaC-링커-MalE로 서브클로닝되어 H3의 pET-14b PhaC-링커-HA1을 형성한다.
H3-PhaC 융합의 HA1의 3'OH 말단 절편으로부터의 코딩 서열은 서열 번호 11에 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 12에 개시되었다.
Figure pct00002
3. 폴리머 입자를 나타내는 Ag85A - ESAT -6의 제조
플라스미드 pHAS-Ag85 A-ESAT-6 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69을 갖는 이. 콜 리 BL21(DE3) 세포로 도입된다. 상기 형질전환체는 상기에 기술된 바와 같은 바이오폴리에스테르 폴리머 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다. 그 후, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 또는 야생형 폴리머 입자를 제조하는 역량은 각각 하기에 기술된 바와 같이 평가된다.
4. 기체 크로마토그래피 질량 분석( GC - MS )
다양한 플라스미드를 갖는 박테리아 세포의 폴리에스테르 함유량은 생체내 PhaC 신타제의 활성에 상응한다. 축적된 폴리에스테르의 양이 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석에 의해서 평가하여 PhaC 신타제 활성을 측정하고, 특히 PhaC-Tb 항원 융합이 폴리에스테르 합성을 촉매화하고 세포내 과립 형성을 매개하는지를 평가한다. 폴리에스테르 함유량은 산-촉매화 메타노라이시스(methanolysis)에 의해서 폴리에스테르가 3-히드록시메틸 에스테르로의 전환 이후에 GC-MS에 의해서 정량적으로 측정된다.
결과
pHAS-Ag85A-ESAT-6 및 pMCS69, 또는 pHAS 및 pMCS69를 운반하는 세포의 GC-MS 분석은 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인한다. 세포내 폴리에스테르 함입의 존재가 나일 레드 염색(Nile Red staining)을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인한다.
토의
pHAS-Ag85A-ESAT-6 및 pMCS69를 운반하는 세포내 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 3중(tripartite) 융합 단백질로 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
실시예 2 - 엘. 락티스 에서 PHA 폴리머 입자의 제조 및 플라스미드의 구조
본 실시예는 엘. 락티스에서 결핵 항원 Ag-85A 및 ESAT-6을 나타내는 폴리머 입자의 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다.
물질 및 방법
1. 플라스미드의 구조
본 실시예에서 사용된 엘. 락티스의 모든 플라스미드 및 균주가 표 3에 기술되었다. 항원(들) Ag85A/ESAT6을 코딩하는 유전자가 GeneScript Corporation (Piscataway, NJ)에 의해서 합성된다. 코돈 사용은 엘. 락티스의 코돈 사용 바이어스(codon usage bias)에 적합하게 한다.
nisA 프로모터(P nisA )의 일부를 포함하는 pUC57-ZZ의 절편이 pUC57-ZZ의 NdeI 분해물(digest)에 의해서 수득되어 NdeI-분해된 pUC57-ESAT6으로 결찰되어 pUC57-nisESAT6을 수득한다. 그 후, Ag85A/ESAT6 유전자 및 P nisA 의 일부를 포함하는 pUC57-nisESAT6의 BstBI-BamHI 절편이 pNZ-AB의 해당하는 부위에서 phaB의 업스트림으로 삽입되어 pNZ-ESAT6-B를 수득한다. pNZ-ESAT6-B로 pNZ-CAB의 절편을 포함하는 phaC 및 phaA를 도입하기 위해서, 두개의 플라스미드가 NheI 및 BamHI으로 가수분해하고 pNZ-CAB의 phaCA 절편가 pNZ-ESAT6-B로 삽입되어 pNZ-ESAT6-CAB를 수득한다.
nisA 프로모터(P nisA )dnk 3'OH 말단 절편으로부터의 코딩 서열이 서열 번호 3에 개시되어 있고, 유래된 아미노산 서열이 서열 번호 4에 개시되었다.
C형 간염 항원 폴리머 입자에 있어서, Hep C DNA 서열은 엘. 락티스에서 발현하기에 최적인 코돈이며, GenScript에 의해서 NcoI/NheI 절편으로서 합성된다. 상기 절편이 표 3에 기술된 바와 같이 pNZ-CAB 플라스미드로 서브클로닝되어 pNZ-HepC-PhaCAB를 형성한다.
HepC-PhaC(pNZ) 융합의 3'OH 말단 절편으로부터의 코딩 서열은 서열 번호 9에 개시되어 있고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 10에 개시되었다.
Figure pct00003
실시예 3 - 폴리에스테르 폴리머 입자의 분리 및 융합 단백질의 특성
본 실시예는 이들 표면에서 Ag85A-ESAT-6을 나타내는 바이오폴리에스테르 폴리머 입자의 특성을 기술하였다.
물질 및 방법
1. 폴리에스테르 폴리머 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리하고 전체 세포 용해물(lysates)이 4000 g에서 15분 동안 4 ℃에서 원리분리되어 폴리에스테르 폴리머 입자를 침전시킨다. 상기 폴리머 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리(gradient ultracentrifugation)에 의해서 정제된다.
2. 단백질 농도 측정
폴리머 입자에 부착된 단백질의 농도가 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다(Bio-Rad). 농도 측정 이후에, 단백질이 SDS-PAGE에 의해서 분리되어 SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)으로 염색된다.
폴리머 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 Ag85A-ESAT-6 PhaC 융합 단백질의 양은 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석된다. 목적하는 단백질이 겔로부터 잘라내어 MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight spectrometry)를 사용하여 트립틱 펩타이드(tryptic peptide) 핑거프린팅(fingerprinting)한다.
3. ELISA
Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 또는 야생형 폴리머 입자로 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다(표 4 참조).
그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, ESAT-6(Abcam)에 대한 마우스 항체로 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(peroxidase conjugate)(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다.
반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도(absorbance)가 495 nm에서 기록된다.
4. 유세포 분석
정제된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 또는 야생형 폴리머 입자의 25 ㎍이 빙냉(ice-cold)한 유세포 분석 완충액(표 4 참조)으로 2번 세척하고, 마우스 항-ESAT-6 항체(Abcam)와 배양한다. 세척한 후에, 폴리머 입자가 래트(rat) 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-레이블된 항체(BD Pharmingen, CA, USA)로 염색하고, 어두운 빙냉한 상태에서 30분동안 배양하고, 다시 세척한다. A BD FACScalibur(BD Biosciences, CA, USA)가 사용되어 각 시료에 대해서 적어도 10,000 경우를 수집하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
Figure pct00004
결과
상기 폴리머 입자는 주요 단백질 밴드에 의해서 측정되는 바와 같이 Ag85A-ESAT-6-PhaC 및 PhaC 각각에 있어서 102 kDa 및 63 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 높은 단백질 수준을 나타낸다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하여 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA는 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자가 투여량-의존성 방식(dose-dependent manner)에서 항-ESAT-6 항체에 결합되고, 야생형 폴리머 입자는 항체에 결합되지 않은 것을 나타낸다. 유세포 분석은 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자의 >98%가 항-ESAT-6 항체와 결합하는 것을 보여준다.
토의
본 실시예의 결과는 삼중 융합 단백질 Ag85A-ESAT-6-PhaC를 코딩하는 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현이 성공적이므로 이들 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 폴리머 입자의 과잉생성이 수득되는 것을 나타낸다.
실시예 4 - 인플루엔자 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성(immunogenecity)의 분석과 함께, 인플루엔자 항원 뉴라미니다제(neuraminidase), M1 인플루엔자 코트 단백질 및 헤마글루티닌을 동시에 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 기술하였다.
물질 및 방법
모든 동물 실험이 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Animal Ethics Committee)(Palmerston North, New Zealand)에 의해서 승인되었다.
1. 에스케리치아 콜리 균주의 성장
에스케리치아 콜리 DH5α(Invitrogen)가 실시예 1의 표 1에 기술된 바와 같이 1%(w/w) 글루코스 및 75 μg/mL의 암피실린이 보충된 Difco™ 루리아 배양액에서 배양된다. 에스케리치아 콜리 BL21(Invitrogen)가 1%(w/w) 글루코스, 75 μg/mL의 암피실린 및 30 μg/mL의 클로람페니콜이 보충된 Difco™ 루리아 배양액 또는 정의된 배지에서 배양한다.
2. 플라스미드의 구조
본 실시예에서 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 표 5에 기술되었다. PhaA 및 PhaB 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다.
뉴라미니다제 항원을 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 뉴라미니다제를 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, GenScript Inc에 의해서 SpeI/SunI 및 XhoI/BamHI 절편으로서 합성된다. SpeI/SunI 절편이 H3-PhaC 플라스미드의 pET-14b HA1으로 삽입되어 플라스미드 pET-14b-NA-PhaC를 나타낸다. XhoI/BamHI 절편이 pET-14b-PhaC-링커-MalE로 서브클로닝되어 플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-NA를 수득한다.
M1 인플루엔자 코트 단백질을 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, M1 유전자 서열은 최적화된 코돈이며, GenScript에 의해 SpeI/SunI 및 XhoI/BamHI 절편으로 합성된다. SpeI/SunI 절편이 H3-PhaC 플라스미드의 pET-14b HA1로 삽입되어 플라스미드 pET-14b-M1-PhaC를 수득한다. XhoI/BamHI 절편이 pET-14b-PhaC-링커-MalE로 서브클로닝되어 플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-M1을 수득한다.
모두 3개의 인플루엔자 항원을 동시에 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 플라스미드 pET-14b-NA-PhaC에서 유래된 XbaI/NotI 절편이 플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-M1으로 서브클로닝하여 pET-Hb-NA-PhaC-링커-M1을 수득한다. 헤마글루티닌-PhaC는 실시예 1의 표 2에서 기술된 바와 같이 BamH1 H3 프라이머를 사용하여 PCR 증폭된다. 각각의 BamH1/BlpI 절편이 플라스미드 pET-14b-NA-PhaC-링커-M1으로 서브클로닝되어 플라스미드 pET-14b-NA-PhaC-링커-M1/헤마글루티닌-PhaC를 수득한다.
NA-PhaC 융합 및 PhaC-링커-NA 융합에 대한 구조는 서열 번호 17 및 서열 번호 19에서 각각 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 18 및 서열 번호 20에 각각 개시되었다. M1-PhaC 융합 및 PhaC-링커-M1 융합에 대한 구조는 서열 번호 21 및 서열 번호 23에 각각 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 22 및 서열 번호 24에 각각 개시되었다. NA-PhaC-링커-M1 융합에 대한 구조는 서열 번호 25에 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 26에 개시되었다. 헤마글루티닌-PhaC 융합에 대한 구조는 서열 번호 27에 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 28에 개시되었다.
Figure pct00005
3. AcpA - IglC 를 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-NA, pET-14b-PhaC-링커-M1, pET-14b-NA-PhaC-링커-M1/헤마글루티닌-PhaC 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 BL21(DE3) 세포로 도입된다. 상기 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다. NA, M1 또는 NA-M1-헤마글루티닌 입자 또는 야생형 입자를 제조하는 역량은 하기에 기술된 바와 같이 평가된다.
4. 기체 크로마토그래피 질량 분석( GC - MS )
다양한 플라스미드를 갖는 박테리아 세포의 폴리에스테르 함유량은 생체내 PhaC 신타제의 활성에 상응한다. 축적된 폴리에스테르의 양이 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석에 의해서 평가하여 PhaC 신타제 활성을 측정하고, 특히 PhaC-NA, Pha-M1 및 PhaC-NA-M1-HA 융합이 폴리에스테르 합성을 촉매화하고 세포내 과립 형성을 매개하는 것을 확인한다. 폴리에스테르 함유량은 산-촉매화 메타노라이시스(methanolysis)에 의해서 폴리에스테르가 3-히드록시메틸 에스테르로의 전환 이후에 GC-MS에 의해서 정량적으로 측정된다.
5. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리되고, 전체 세포 용해물이 4000 g에서 15분동안 4 ℃에서 원심분리하여 폴리에스테르 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다.
6. 단백질 농도 측정
입자에 부착된 단백질의 농도가 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다(Bio-Rad). 농도 측정 이후에, 단백질이 SDS-PAGE에 의해서 분리되어 SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)으로 염색된다.
입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 PhaC-NA, PhaC-M1 및 PhaC-NA-M1-HA 융합 단백질의 양은 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석된다. 목적하는 단백질을 겔로부터 잘라내어 MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight spectrometry)를 사용하여 트립틱 펩타이드(tryptic peptide) 핑거프린팅(fingerprinting)하여, 융합 단백질 영역을 확인한다.
7. ELISA
Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 PorA-C-PorB 입자 또는 HA, M1, NA-M1-HA 입자 또는 야생형 입자로 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다(표 4 참조).
그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, 다양한 항원에 대한 생성된 마우스 항체와 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(peroxidase conjugate)(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다.
반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도가 495 nm에서 기록된다.
8. 유세포 분석
다양한 정제된 항원-표시 입자 또는 야생형 입자의 25㎍이 실시예 3의 표 4에 기술된 바와 같이 빙냉한 유세포 분석 완충액으로 2번 세척하고, 마우스 항-항원 항체와 배양한다. 세척한 후에, 입자가 래트(rat) 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-레이블된 항체(BD Pharmingen, CA, USA)로 염색하고, 어두운 빙냉한 상태에서 30분동안 배양하고, 다시 세척한다. A BD FACScalibur(BD Biosciences, CA, USA)가 사용되어 각 시료에 대해서 적어도 10,000 경우를 수집하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
9. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화;
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
10. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체(gauge wire mesh sieve)를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 17 mM TRIS-HCl 및 140 mM NH4C1의 용액을 사용하여 용해시킨다. 세척한 후에, 상기 RBCs가 2 mM의 글루타민(Invitrogen), 100 U/mL의 페니실린(Invitrogen), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen), 5x 10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 5%(w/w) 소태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco 변형된 이글 배지(Modified Eagle media, DMEM)에서 배양된다.
상기 세포가 배지 단독, 또는 각각의 항원을 포함하는 배지에서 10% CO2에서 37 ℃에서 배양된다.
11. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
12. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 항체 캡쳐를 위한 고정된 항원 표시된 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
13. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
다양한 항원-PhaC 융합 단백질을 코딩하는 개별의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현으로 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자를 제조한다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-NA, pET-14b-PhaC-링커-M1, pET-14b-NA-PhaC-링커-M1/헤마글루티닌-PhaC 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET-14b-PhaC-링커-NA, pET-14b-PhaC-링커-M1, pET-14b-NA-PhaC-링커-M1/헤마글루티닌-PhaC 및 pHAS (야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 phaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
폴리머 입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >98%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다. 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 일반적으로 농양이나 화농이 없으며, 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 10-100 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 최적이다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 10-100 μg 투여량과 비교할 때 상당히 더 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군을 포함하는 2번째 시험에서, 마우스는 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하고, 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 백신 그룹에 대한 상당히 더 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가하였다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 전형적으로 더 강할 것이다.
10-100 μg 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
10-100 μg의 야생형 입자(인플루엔자 항원이 없음)로 3번 면역화된 마우스에서 각 항원에 대한 IFN-γ 반응은 전형적으로 PBS-면역화된 대조군 마우스의 반응과 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 IFN-γ 반응이 항원 입자로 3번 면역화된 마우스, 및 항원 입자와 Emulsigen으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응이 기대된다.
뉴로아미니다제, M1 코트 단백질 또는 헤마글루티닌 항원을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 제조를 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 제조할 수 있다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 프란시셀라 툴라렌시스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 항원 AcpA 및 IglC를 동시에 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다. 상기 항원을 갖는 입자는 야토병(Tularemia)에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 이. 콜리 에서 PHA 입자의 제조 및 플라스미드의 구조
본 실시예에서 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 표 6에 기술되었다. PhaA 및 PhaB 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다.
2개의 에프. 툴라렌시스 항원을 동시에 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 항원 AcpA 및 IglC를 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해서 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 대한 N-말단 융합에 대한 pET-14b M-PhaC-링커-MalE Xbal-Spel 부위 및 C-말단 융합에 대한 XhoI-BamHI 부위로 서브클로닝된다. AcpA 코딩 유전자가 XbaI-SpeI 부위로 삽입되고, 동일한 플라스미드에서 IglC 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 두 유전자 삽입은 치환된 원래 플라스미드의 M 및 MalE 코딩 영역과 프레임에 있으며, 플라스미드 pET14B-AcpA-C-IglC를 수득한다.
AcpA-C-IglC 융합에 대한 구조는 서열 번호 29에서 개시되었으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 30에 개시하였다.
Figure pct00006
플라스미드 pET14B-AcpA-C-IgIC 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 가진 이. 콜 리 BL21 (DE3) 세포로 도입된다. 상기 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다. AcpA-IglC 입자 또는 야생형 입자 각각을 제조하기 위한 역량은 하기에 기술된 바와 같이 평가된다.
2. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리되고, 전체 세포 용해물이 4000 g에서 15분동안 4 ℃에서 원심분리하여 폴리에스테르 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다.
입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다.
입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 AcpA-PhaC-IglC 융합 단백질의 양은 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석되고, 목적하는 단백질이 실시예 3에 개시된 바와 같이 확인되었다.
3. ELISA
에프. 툴라렌시스 폴리머 입자의 면역-반응성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 측정된다. 간단하게, Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 PorA-C-PorB 입자 또는 AcpA-IglC 입자 또는 야생형 입자로 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다.
그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, 다양한 항원에 대해 생성된 마우스 항체와 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(peroxidase conjugate)(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다.
반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도가 495 nm에서 기록된다.
4. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화;
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
5. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리된다.
6. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
7. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 항체 캡쳐를 위한 고정된 항원 표시된 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
8. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-AcpA-C-IglC 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-AcpA-C-IglC 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 phaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >98%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다.
다양한 항원-PhaC 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자의 제조를 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다. 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 일반적으로 농양이나 화농이 없으며, 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 10-100 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 최적이다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 10-100 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군을 포함하는 2번째 시험에서, 마우스는 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하고, 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 백신 그룹에 대한 상당히 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가하였다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 전형적으로 더 강할 것이다.
10-100 μg 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
10-100 μg의 야생형 입자(에프. 툴라렌시스 항원이 없음)로 3번 면역화된 마우스에서 각 항원에 대한 IFN-γ 반응은 전형적으로 PBS-면역화된 대조군 마우스의 반응과 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 IFN-γ 반응이 항원 입자로 3번 면역화된 마우스, 및 항원 입자와 Emulsigen으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응이 기대된다.
항원 AcpA 및 IglC를 동시에 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - 브루셀라 아보르투스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 항원 Omp16, 면역성 외부막 단백질을 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다. 본 실시예에서 제조되는 상기 항원을 나타내는 폴리머 입자는 브루셀라증(brucellosis)에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 과잉발현 플라스미드 구조
본 실시예에서 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 표 7에 기술되었다. 베타-케토티올라제 및 아세토아세틸-코엔자임 A 환원효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩되고, 아세틸 CoA를 3-히드록시부티릴-코엔자임 A로의 촉매적 전환에 의해서 기제에 폴리머 신타제를 제공한다.
비. 아보르투스 Omp16을 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 항원 Omp16을 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대한 pET-14b PhaC-링커-GFP XhoI-BamHI 부위로 서브클로닝된다. omp16을 코딩하는 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 상기 유전자 삽입은 치환된 원래 플라스미드의 GFP 코딩 영역과 프레임에 있고, 플라스미드 pET14B-C-omp16을 수득한다.
PhaC-omp16 융합에 대한 구조는 서열 번호 31에 개시되어 있으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 32에 개시되어 있다.
Figure pct00007
2. Omp16 을 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET14B-C-omp16 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 KRX 세포로 도입된다. 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 생성에 적당한 조건에서 배양된다.
3. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 실시예 3에 기재된 바와 같이 분리된다. 입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정되고, 목적하는 단백질이 실시예 3에 기술된 바와 같이 MALDI-TOF-MS를 사용하여 확인된다.
4. ELISA
비. 아보르투스 폴리머 입자의 면역-반응성이 다양한 항원에 대해서 생성된 마우스 항체를 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다.
5. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 2번 복강내(i.p.)로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화;
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
6. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다. 상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 17 mM TRIS-HCl 및 140 mM NH4C1의 용액을 사용하여 용해된다. 세척 후에, 상기 RBCs가 2 mM의 글루타민(Invitrogen), 100 U/mL의 페니실린(Invitrogen), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen), 5x 10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 5%(w/w) 소태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco 변형된 이글 배지(Modified Eagle media, DMEM)에서 배양된다. 상기 세포가 배지 단독, 또는 각각의 항원을 포함하는 배지에서 10% CO2에서 37 ℃에서 배양된다.
7. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
8. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 항체 캡쳐를 위한 고정된 항원 표시된 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
9. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-ompl6 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-ompl6 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >95%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다. PhaC -항원 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자의 생성을 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다(데이터가 개시되지 않음). 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 10-50 μg의 투여량 범위는 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생한다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 10-50 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 예를들면 50-500 μg이 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군을 포함하는 2번째 시험에서, 마우스는 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하고, 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 백신 그룹에 대한 상당히 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가하였다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 전형적으로 더 강할 것이다.
10-50 μg 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
10-50 μg의 야생형 입자(비. 아보르투스 항원이 없음)로 2번 면역화된 마우스에서 각 항원에 대한 IFN-γ 반응은 전형적으로 PBS-면역화된 대조군 마우스의 반응과 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 IFN-γ 반응이 항원 입자로 2번 면역화된 마우스, 및 항원 입자와 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 2번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응이 기대된다.
항원 Omp16을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 7 - 나이세리아 메닌기티디스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 화학적으로 가교 또는 비공유결합된 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) B 캡슐러 폴리사카라이드(CPS) 뿐만 아니라 나이세리아 메닌기티디스 항원 PorA, PorB, FetA, ZnuD를 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다. 상기 항원을 갖는 입자는 뇌막염(meningitis)에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 플라스미드의 구조
본 실시예에 대한 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 하기 표 8에 기술되었다.
PhaA 및 PhaB 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다. 6개의 시스테인-PhaC 융합 단백질을 코딩하고 해독 개시 부위 및 개시 코돈을 포함하는 DNA 절편은 주형으로서 프라이머 Cys6-XbaI[서열 번호 55] 및 PhaC-C-BamHI[서열 번호 56]을 사용하여 PCR에 의해서 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) H16으로부터 분리된 게놈성 DNA로부터 수득된다. 상기 PCR 생성물이 XbaI, BamHI-엔도누클레이즈된 pET14B 벡터로 결찰되어 플라스미드 pET-14b-Cys6-PhaC를 생성한다.
2개의 나이세리아 메닌기티디스 항원들을 동시에 나타내는 폴리머 입자를 제조하기위해서, 항원들 PorA, PorB, FetA, ZnuD를 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해서 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대해 XhoI-BamHI 부위 및 N -말단에 대해 pET-14b M-PhaC-링커-MalE XbaI-SpeI 부위로 서브클로닝한다. PorA 코딩 유전자가 XbaI-SpeI 부위로 삽입되고, 동일한 플라스미드에서 PorB 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 두 유전자 삽입이 치환된 원래 플라스미드의 M 및 MalE 코딩 영역과 프레임에 있으며, 플라스미드 pET14B-PorA-C-PorB를 수득한다.
FetA 코딩 유전자가 XbaI-SpeI 부위로 삽입되고, 동일한 플라스미드에서 ZnuD 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 두 유전자 삽입이 치환된 원래 플라스미드의 M 및 MalE 코딩 영역과 프레임에 있으며, 플라스미드 pET14B-FetA-C-ZnuD를 수득한다.
Cys6-PhaC 융합에 대한 구조가 서열 번호 33에 개시되어 있으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 34에 개시되어 있다. PorA-C-PorB 융합에 대한 구조는 서열 번호 35에 개시되어 있고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 36에 개시되어 있다. FetA-C-ZnuD 융합에 대한 구조는 서열 번호 37에 개시되어 있으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 38에 개시되어 있다.
Figure pct00008
2. Cys -6, PorA /B 및 FetA / ZnuD 를 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET-14b-Cys6-PhaC, pET14B-PorA-C-PorB, pET14B-FetA-C-ZnuD 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 BL21(DE3) 세포로 도입된다. 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다.
3. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리되고, 전체 세포 용해물이 4000 g에서 15분동안 4 ℃에서 원심분리하여 폴리에스테르 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다.
입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다. 농도 측정 이후에, 상기 단백질은 SDS-PAGE에 의해서 분리되고, SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)으로 염색된다.
입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 Cys6-C, PorA-C-PorB 또는 FetA-C-ZnuD 융합 단백질의 양은 각각 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석되고, 목적하는 단백질은 MALDI-TOF-MS를 사용하여 확인한다. Cys6-C의 경우에 N-말단 서열화가 사용되어 PhaC의 N-말단에서 6개의 시스테인 잔기의 존재를 확인한다.
4. Cys6 폴리에스테르 입자로 엔. 메닌기티디스 CPS 의 화학적 가교
Cys6 입자로의 캡슐러 폴리사카라이드(CPS)의 화학적 가교가 Annunziato 등에 의해서 이미 기술된 바와 같이 정제된 엔. 메닌기티디스 CPS 및 화학적 가교제 PMPI(N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트)를 사용하여 수득된다. PMPI는 랄스토 니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 폴리머 입자 형성 효소인 PHA 신타제의 N 말단으로 설계된 6개의 시스테인 잔기를 나타내는 폴리머 입자로 엔. 메닌기 티디스 CPS의 공유 결합하는 티올 결합에 대한 히드록실에 대한 헤테로이관능성 링커이다.
5. 특이성 항체를 나타내는 폴리에스테르 입자로 엔. 메닌기티디스 CPS 의 비 공유 결합
CPS 특이성 항체가 토끼를 면역화함으로써 생성한다. 단일특이성 폴리클로날 세라(monospecific polyclonal sera)가 단백질 A 친화도 정제를 실시한다. 수득된 정제된 IgG가 폴리에스테르 입자를 나타내는 ZZ 영역으로 결합된다. 그 후, 상기 입자들은 건조 중량 기준으로 1:1의 비율을 사용하여 엔. 메닌기티디스 CPS와 30분동안 배양한다. 상기는 폴리에스테르 입자로의 CPS의 특이적이지만 비공유 결합을 나타낸다.
6. ELISA
엔. 메닌기티디스 폴리머 입자의 면역-반응성이 다양한 항원에 대해서 생성된 마우스 항체를 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다.
7. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화;
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
8. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리된다.
9. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 실시예 4에 기술된 바와 같이 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
10. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 항체 캡쳐를 위한 고정된 항원 표시된 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
11. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET-14b-Cys6-PhaC, pET14B-PorA-C-PorB, pET14B-FetA-C-ZnuD 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET-14b-Cys6-PhaC, pET14B-PorA-C-PorB, pET14B-FetA-C-ZnuD 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >98%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다.
다양한 항원-PhaC 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자의 생성을 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다. 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 일반적으로 농양이나 화농이 없으며, 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 5-50 μg의 투여량 범위는 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생한다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 5-50 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군을 포함하는 2번째 시험에서, 마우스는 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하고, 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 백신 그룹에 대한 상당히 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가하였다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 전형적으로 더 강할 것이다.
5-50 μg 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
40 μg의 야생형 입자(엔. 메닌기티디스 항원이 없음)로 3번 면역화된 마우스에서 각 항원에 대한 IFN-γ 반응은 PBS-면역화된 대조군 마우스의 반응과 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 IFN-γ 반응이 항원 입자로 3번 면역화된 마우스, 및 항원 입자와 Emulsigen으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응이 기대된다.
항원들 PorA, PorB, FetA, ZnuD 및 CPS를 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - 바실러스 안트라시스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 항원 PA83, 탄저병(anthrax) 독소의 비독성 서브유닛을 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다. 본 실시예에서 제조된 바와 같이 상기 항원을 나타내는 폴리머 입자는 탄저병에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 플라스미드의 구조
본 실시예에 대한 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 하기 표 9에 기술되었다. PhaA 및 PhaB 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다.
비. 안트라시스 PA83 항원, 탄저병 독소의 비독성 서브유닛 PA의 절단형 변이체(truncated variant)를 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 항원 PA83을 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해서 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대해 pET-14b PhaC-링커-GFP XhoI-BamHI 부위로 서브클로닝한다. PA83을 코딩하는 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 상기 유전자 삽입이 치환된 원래 플라스미드의 GFP 코딩 영역과 프레임에 있으며, 플라스미드 pET14B-PhaC-PA83을 수득한다.
PhaC-PA83 융합에 대한 구조가 서열 번호 39에 개시되어 있으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 40에 개시되어 있다.
Figure pct00009
2. PA83 을 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET14B-C-PA83 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 BL21(DE3) 세포로 도입된다. 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 생성에 적당한 조건에서 배양된다.
3. 기체 크로마토그래피 질량 분석( GC - MS )
다양한 플라스미드를 갖는 박테리아 세포의 폴리에스테르 함유량은 생체내 PhaC 신타제의 활성에 상응한다. 축적된 폴리에스테르의 양이 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석에 의해서 평가하여 PhaC 신타제 활성을 측정하고 특히 폴리에스테르 합성의 PhaC-비. 안트라시스 항원 융합에 의해서 촉매화하고 세포내 과립 형성을 매개하는지를 측정한다. 폴리에스테르 함유량은 산-촉매화 메타노라이시스(methanolysis)에 의해서 폴리에스테르가 3-히드록시메틸 에스테르로의 전환 이후에 GC-MS에 의해서 정량적으로 측정된다.
4. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 실시예 3에 기재된 바와 같이 분리되고 입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다.
5. ELISA
비. 안트라시스 폴리머 입자의 면역-반응성이 다양한 항원에 대해서 생성된 마우스 항체를 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다.
6. 유세포 분석
다양한 정제된 항원-표시 입자 또는 야생형 폴리머 입자의 25㎍이 실시예 3의 표 4에 기술된 바와 같이 빙냉(ice-cold)한 유세포 분석 완충액으로 2번 세척하고, 마우스 항-항원 항체와 배양한다. 세척한 후에, 입자가 래트(rat) 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-레이블된 항체(BD Pharmingen, CA, USA)로 염색하고, 어두운 빙냉한 상태에서 30분동안 배양하고, 다시 세척한다. A BD FACScalibur(BD Biosciences, CA, USA)가 사용되어 각 시료에 대해서 적어도 10,000 경우를 수집하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
7. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화;
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
8. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 17 mM TRIS-HCl 및 140 mM NH4C1의 용액을 사용하여 용해시킨다. 세척한 후에, 상기 RBCs가 2 mM의 글루타민(Invitrogen), 100 U/mL의 페니실린(Invitrogen), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen), 5x 10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 5%(w/w) 소태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco 변형된 이글 배지(Modified Eagle media, DMEM)에서 배양된다.
9. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
10. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 항체 캡쳐를 위한 고정된 항원 표시된 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
11. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-PA83 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-PA83 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >96%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다.
PhaC-항원 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자의 생성을 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다(데이터는 개시되지 않음). 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 일반적으로 농양이나 화농이 없으며, 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 40 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 충분하다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 40 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군을 포함하는 2번째 시험에서, 마우스는 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하고, 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 백신 그룹에 대한 상당히 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가하였다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 전형적으로 더 강할 것이다.
10 μg 또는 40 μg의 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
40 μg의 야생형 입자(비. 안트라시스 항원이 없음)로 3번 면역화된 마우스에서 각 항원에 대한 IFN-γ 반응은 PBS-면역화된 대조군 마우스의 반응과 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 IFN-γ 반응이 항원 입자로 3번 면역화된 마우스, 및 항원 입자와 Emulsigen으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응이 기대된다.
항원 PA83을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 9 - 마우스에서 생체내 C형 간염 폴리머 입자의 면역원성
본 실시예는 Hep-C 항원을 포함하는 폴리머 입자에 의해서 포유류 모델의 면역화를 기술하였다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 폴리에스테르 폴리머 입자의 분리 및 플라스미드의 구조
플라스미드가 실시예 1에 기술된 바와 같이 숙주로서 이. 콜리를 사용하여 C형 간염 코어 항원을 나타내는 폴리머 입자의 제조를 위해서 제조된다.
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리되고, 전체 세포 용해물이 6000 g에서 15분동안 4 ℃에서 원심분리하여 폴리에스테르 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다. 단백질의 농도가 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다. 폴리머 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 Hep C:PhaC 융합 단백질의 양은 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석된다. 상기 Hep C 항원은 이. 콜리에서 폴리머 입자의 전체 단백질의 약 6.7% 및 엘. 락티스에서 폴리머 입자의 전체 단백질의 25%를 설명한다. 목적하는 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하여 확인된다.
2. ELISA
Hep C 폴리머 입자의 면역-반응성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. 세척 후에, 플레이트가 Hep C(Devatal, USA)에 대한 마우스 항체와 배양되고, PBST로 세척되고, PBS에서 1% (w/v) BSA에 희석된 바이오티닐화(biotinylated) 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 배양된다. 실온에서 1시간동안 추가로 배양된 후에, 플레이트가 PBST로 세척되고, 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP 콘쥬게이트가 첨가되고, 추가로 1시간동안 배양된다. 추가로 세척된 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다.
흡광도는 VERSAax 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 490 nm에서 기록된다.
3. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 시판의 재조합 Hep C 항원 치료 그룹을 제외하고, 매주 간격으로 3번 피하로 면역화한다. 시판의 재조합 Hep C 항원(유래된 이. 콜리)이 Devatal Inc.(USA)로부터 얻어지며, C형 간염 바이러스의 누클레오캅시드 면역우성 영역(nucleocapsid immunodominant regions)을 포함한다. 항원은 공급자가 나타내는 10% PAGE (Coomassie staining)에 의해서 측정되는 바와 같이 >95% 순도이다.
6개의 치료 그룹(그룹당 n=6)은 하기와 같다:
(a) 각자는 CFA(Complete Freund's adjuvant)내 시판의 Hep C 항원(30 μg)으로 면역화 - 한번만 백신화됨.
(b) 각자는 시판의 Hep C 항원(30 μg) 및 Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)로 면역화 - 한번만 백신화됨.
(c) 각자는 PBS 및 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)로 면역화.
(d) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 Hep C 폴리머 입자(10 μg)로 면역화.
(e) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 Hep C 폴리머 입자(30 μg)로 면역화.
(f) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 야생형 폴리머 입자(이. 콜리 숙주)로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
4. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 체중 1g당 87 μg 케타민(Parnell Laboratories, Australia) 및 2.6 μg 크실라진 히드로클로라이드(Bayer, Germany)를 사용하여 복강으로 마취한다. 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체(gauge wire mesh sieve)를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포가 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리된다. 상기 세포가 배지 단독, 또는 5 μg/mL 재조합 Hep C 항원을 포함하는 배지에서 10% CO2에서 37 ℃에서 배양된다.
5. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
6. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 모노클로날 항-Hep C 항체(Devatal)를 사용하여 제조자의 추천에 따라 ELISA에 의해서 측정된다. 간단하게, Maxisorb(Nunc) 플레이트가 3 μg/mL의 재조합 Hep C로 한밤동안 코팅되고, 1% BSA로 차단하고, PBST에서 세척한다. 혈청의 희석물(1:50 내지 1:156250)이 첨가되고 배양된다. 세척한 후에, 항-마우스 IgG1:HRP 또는 IgG2c:HRP(ICL, USA)가 첨가되고, 플레이트가 배양된다. 플레이트가 세척되고 기제로서 TMB가 사용되고, VERSAmax 마이크로플레이트 리더에서 450 nm에서 판독한다.
모노클로날 항-Hep C 항체가 적정되고, IgG1 플레이트에 대한 포지티브 대조군으로 포함된다. 결과는 1:50으로 희석된 혈청에 대해서 450 nm에서 광학 밀도로서 표시된다.
7. 통계 분석
IFN-γ 및 항체 반응의 분석이 가변의 Fisher's one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시되며, 유의도(level of significance)는 P < 0.05이다.
결과
Hep C 폴리머 입자의 반응성은 도 1에 도시된 바와 같이 Hep C 항체에 대한 투여량-의존성 반응을 나타낸다.
10 μg/mL Hep C 폴리머 입자의 투여량은 30 μg/mL Hep C 폴리머 입자와 비교하여 큰 IgG1 항체 반응 및 큰 IgG2 항체 반응을 나타낸다(각각 도 2 및 도 3 참조). Hep C 폴리머 입자의 두 투여량은 재조합 Hep C 항원 단독과 비교하여 IgG1 및 IgG2 항체 반응이 상당히 감소된 것을 나타낸다(각각 도 2 및 도 3 참조).
도 4에 개시된 바와 같이, 30 μg Hep C 폴리머 입자로 면역화된 마우스의 Hep C 코어 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 폴리머 입자(P<0.05), 재조합 Hep C 항원 단독(P<0.05), 또는 PBS 단독(p<0.05)으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었다. 실제로, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 항원 단독으로 면역화된 마우스이 세포-매개 반응에서 상당한 차이는 없었다.
토의
이. 콜리에서 생성된 Hep C 코어 항원을 나타내는 설계된 폴리머 입자는 Hep C 항원 유발(antigen challenge)에 대한 표적된 세포-매개 반응을 생성할 수 있다. 특히, 항원 단독(예컨대, 본 발명의 폴리머 입자를 포함하지 않는 항원)에 의한 면역화는 강한 체액 반응을 유도할 수 있음에도 불구하고 세포-매개 반응을 유도하는데 비효과적이다.
본 발명의 Hep C 폴리머 입자는 IgG1 반응과 비교하여 더 강한 IgG2 체액 반응을 유도할 수 있다. IgG2 항체는 항체-의존성, 세포-매개 세포독성(ADCC)의 자극에 관련되고, 상기 데이터는 Hep C 폴리머 입자가 세포-매개 반응의 보충적 측면에서 직접 및 간접적으로 효과적으로 자극할 수 있다는 아이디어를 지지한다.
상기 결과는 면역 반응의 상이한 측면을 유도하기 위해 상기 백신-송달 시스템의 다면성 및 가능성을 입증하였으며, 이로 인해 세포-매개 면역 반응은 효과적으로 유도되며, 비효과적인 체액 반응의 자극이 떨어진다.
중량 손실과 같은 부작용 및 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 폴리머 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 뎅기 바이러스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 뎅기 바이러스 엔벨로프 단백질(E)과 멤브레인 단백질(M) 둘다, 비리온(virion)의 표면에서 발현된 두 면역성 단백질들을 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에는 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 나타낸다. 본 실시예에서 제조된 바와 같이 상기 항원을 나타내는 폴리머 입자는 뎅기 바이러스에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 과잉발현 플라스미드 구조
본 실시예에서 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 표 10에 기술되었다. 베타-케토티올라제 및 아세토아세틸-코엔자임 A 환원효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩되고, 아세틸 CoA를 3-히드록시부티릴-코엔자임 A로의 전환을 촉매화함에 의해서 기제에 폴리머 신타제를 제공한다.
뎅기 바이러스 혈청형 1 -4 E 및 M을 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 항원 E 및 M을 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대한 XhoI-BamHI 부위 및 N-말단에 대한 pET-14b M-PhaC-링커-MalE XbaI-SpeI 부위로 서브클로닝된다. omp16을 코딩하는 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 상기 유전자 삽입은 치환된 원래 플라스미드의 GFP 코딩 영역과 프레임에 있고, 플라스미드 pET14B-C-omp16을 수득한다.
E1-PhaC-M1 융합에 대한 구조는 서열 번호 41에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 42에 개시되었다. E2-PhaC-M2 융합에 대한 구조는 서열 번호 43에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 44에 개시되었다. E3-PhaC-M3 융합에 대한 구조는 서열 번호 45에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 46에 개시되었다. E4-PhaC-M1 융합에 대한 구조는 서열 번호 47에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 48에 개시되었다.
Figure pct00010
2. 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E 및 M을 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET14B-E1-C-M1, pET14B-E2-C-M2, pET14B-E3-C-M3 또는 pET14B-E4-C-M4 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 BL21(DE3) 세포로 도입된다. 상기 형질전환체는 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 폴리머 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다. 뎅기 바이러스 E-PhaC-M 입자 또는 야생형 입자 각각의 제조는 하기에 기술된 바와 같이 평가된다.
3. 기체 크로마토그래피 질량 분석( GC - MS )
다양한 플라스미드를 갖는 박테리아 세포의 폴리에스테르 함유량은 생체내 PhaC 신타제의 활성에 상응한다. 축적된 폴리에스테르의 양이 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석에 의해서 평가하여 PhaC 신타제 활성을 측정하고, PhaC-뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E 및 M 항원 융합이 폴리에스테르 합성을 촉매화하고 세포내 과립 형성을 매개하는 것을 확인했다. 폴리에스테르 함유량은 산-촉매화 메타노라이시스(methanolysis)에 의해서 폴리에스테르가 3-히드록시메틸 에스테르로의 전환 이후에 GC-MS에 의해서 정량적으로 측정된다.
4. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리되고, 전체 세포 용해물이 4000 g에서 15분동안 4 ℃에서 원심분리하여 폴리에스테르 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다.
입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다. 농도 측정 이후에, 단백질이 SDS-PAGE에 의해서 분리되고, SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)에 의해서 염색된다. 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 E-PhaC-M 융합 단백질의 양이 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석된다. 목적하는 단백질이 겔로부터 잘라내어, MALDI-TOF-MS을 사용하여 트립틱 펩티드 핑거프린팅하여 융합 단백질 영역을 확인한다.
5. ELISA
뎅기 바이러스 폴리머 입자의 면역-반응성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. 간단하게, Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 E-PhaC-M 입자 또는 야생형 입자로 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다(표 4 참조). 그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, 다양한 항원에 대해 생성된 마우스 항체와 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(peroxidase conjugate)(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다. 상기 반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도가 495 nm에서 기록된다.
6. 유세포 분석
다양한 정제된 항원을 나타내는 입자 또는 야생형 입자의 30㎍이 실시예 3의 표 4에 기술된 바와 같이 빙냉한 유세포 분석 완충액으로 2번 세척하고, 마우스 항-항원 항체와 배양한다. 세척한 후에, 입자가 래트(rat) 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-레이블된 항체(BD Pharmingen, CA, USA)로 염색하고, 어두운 빙냉한 상태에서 30분동안 배양하고, 다시 세척한다. A BD FACScalibur(BD Biosciences, CA, USA)가 사용되어 각 시료에 대해서 적어도 15,000 경우를 수집하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석한다.
7. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 2번 복강내(i.p.)으로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화; 및
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화. 백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
8. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다. 상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리된다.
9. 플라크 감소 중화 분석( plaque reduction neutralization assay )
면역화된 마우스로부터 유래된 혈청이 플라크 감소 중화 분석에 의해서 항체를 중화하는 뎅기 바이러스의 존재에 대해서 조사되었다. 일련의 희석된 혈청이 가열로 불활성화되고, 동종 및 이종 혈청형 바이러스의 100 플라크 형성 유닛과 혼합되어 1시간동안 37 ℃에서 배양된다. 상기 혈청 바이러스 혼합물이 베로(Vero) 세포 단일층과 1시간동안 배양하고 아가로스 함유 배지로 덮는다. 바이러스 플라크가 분석 5일에 염색된다. 플라크 수가 80% 감소된 최고 희석물이 플라크 감소 중화 80(Plaque reduction neutralization 80, PRNT80)이다.
10. 사이토킨 및 케모킨의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고, 분석될 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 사이토킨 및 케모킨의 수준은 상업적으로 이용할 수 있는 항체 및 표준(EBiosciene)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA 및/또는 FACS(EBioscience)에 의해서 측정된다.
11. 마우스 바이러스 방어 분석
마우스 면역성 모델(mouse challenge model)이 사용되어 보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 뎅기 바이러스 E 및 M 항원의 조제들의 유효성을 확인하였다. 13일된 젖을 갓 뗀 마우스가 상기 물질 및 방법의 (1)섹션에서 기술된 바와 같이 1, 5 및 10 μg 투여량을 사용하여 면역화된다. 면역화 이후에, 뎅기 바이러스 적응된 마우스의 100 LD50으로 마우스가 두개내(intracranially, IC) 면역성 검사한다. 이환률(morbidity) 및 사망률(mortality)이 면역성 이후 21일동안 모니터된다.
12. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체기 항체 캡쳐에 대한 고정된 항원을 나타내는 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
13. 통계학적 분석
사이토킨, 케모킨 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-E1-C-M1, pET14B-E2-C-M2, pET14B-E3-C-M3 또는 pET14B-E4-C-M4 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다. pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-E1-C-M1, pET14B-E2-C-M2, pET14B-E3-C-M3 또는 pET14B-E4-C-M4 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
입자에 의한 고수준의 단백질 표시는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >97%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다. PhaC-항원 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자의 생성을 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았으며, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다(데이터는 개시되지 않음). 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 약 10 내지 약 50 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 충분하다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 10-50 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다. 다른 투여량이 또한 시험되고, 예를 들면 각 항원을 표시하는 비드(E1-C-M1, E2-C-M2, E3-C-M3 및 E4-C-M4)의 50-100 μg이 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 대조군 마우스를 포함하고, 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하는 2번째 시험에서, 항원-특이성 혈청 항체 반응은 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 두 백신 그룹에 대해 상당히 높았다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰되었다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 더 강하다.
10-50 μg의 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었으며, PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이가 없어야 한다.
야생형 입자로 면역화된 마우스에서 혈청은 플라크 감소 중화 분석에서 PBS-면역화 대조군 마우스와 상당한 차이는 없을 것이다. 플라크 감소 중화 분석에서 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E - M 입자의 1:1:1:1 혼합물을 포함하는 조제로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 혈청과 비교하여 상당히 더 높을 것이다. 플라크 감소 중화 분석에서 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E - M 입자의 1:1:1:1 혼합물을 포함하는 조제로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 오직 하나의 뎅기 바이러스 혈청형 E 및 M을 나타내는 비드를 포함하는 조제보다 이종 뎅기 바이러스 혈청형에 대해서 상당히 높을 것이다.
10-50 μg의 야생형 입자로 2번 면역화된 마우스에서 항원에 대한 케모킨 및 사이토킨은 PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 전형적으로 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 케모킨 및 사이토킨이 항원 입자로 2번 면역화된 마우스와 항원 입자 및 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen로 2번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 사이토킨 및 케모킨 반응이 기대된다. 항원 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4E 및 M 단백질을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
PBS 또는 야생형 입자로 면역화된 마우스는 2개 그룹들 사이에서 상당한 차이 없이 바이러스 면역시에 죽을 것으로 기대된다. 보조제를 갖는 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E 및 M을 나타내는 입자와 보조제를 갖지 않는 뎅기 바이러스 혈청형 1 - 4 E 및 M을 나타내는 입자로 면역화된 마우스는 방어될 것으로 기대되며, 보조제를 포함하는 조제로부터 유래된 것이 방어가 더 양호하다.
체액 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자가 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 11 - 에볼라 바이러스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 필로비리대 자이레 에볼라바이러스(Filoviridae Zaire ebolavirus) 및 수단 에볼라바이러스 비리온 스파크 글리코프로테인 전구물질 항원(Sudan ebolavirus virion spike glycoprotein precursor antigens)(각각 ZEBOV-GP 및 SEBOV-GP)을 개별적으로 또는 동시에 나타내는 폴리머 입자의 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 기술하였다. 두 항원은 백신 개발에 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 융합 단백질 과잉생성 및 폴리머 비드 형성을 매개하는 플라스미드의 구조
본 실시예에서 사용된 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 표 11에 기술되었다.
폴리히드록시부티레이트 생합성 효소, 베타-케토티올라제 및 R-특이성 아세토아세틸-코엔자임 환원효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다. 2개의 에볼라 비리온 스파이크 글리코프로테인 전구물질 항원을 동시에 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 자이레 에볼라 바이러스 및 수단 에볼라 바이러스로부터 비리온 스파이크 글리코프로테인 전구물질 항원들을 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, Genscript Inc.에 의해서 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대해서 XhoI-BamHI 부위 및 N-말단에 대해서 pET-14b M-PhaC-링커-MalE XbaI-SpeI 부위로 서브클로닝된다. ZEBOV-GP 코딩 유전자가 XbaI-SpeI 부위로 삽입되고, 동일 플라스미드에서 SEBOV-GP 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 두개의 유전자 삽입이 프레임에 있으며 원래 플라스미드의 M 및 MalE 코딩 영역의 치환을 요구한다. 상기는 플라스미드 pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP를 수득한다. 선택적으로 동일한 플라스미드에서 ZEBOV-GP 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입되고 SEBOV-GP 코딩 유전자가 XbaI-SpeI 부위로 삽입되어, 플라스미드 pET14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP를 생성한다.
ZEBOVGP-C-SEBOVGP 융합에 대한 구조는 서열 번호 49에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 50에 개시되었다. SEBOVGP-C-ZEBOVGP 융합에 대한 구조는 서열 번호 51에 개시되었고, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 52에 개시되었다.
Figure pct00011
2. ZEBOVGP - SEBOVGP 를 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET14B-ZEB0VGP-C-SEBOVGP 또는 pET14B-ZEB0VGP-C-SEBOVGP 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 KRX로 도입된다. 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다. ZEBOVGP-SEBOVGP 입자 또는 야생형 입자 각각을 제조하는 역량은 하기에 기술된 바와 같이 평가된다.
3. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 실시예 3에 기술된 바와 같이 분리된다. 입자에 부착된 단백질의 농도가 실시예 3에서 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다. 농도 측정 이후에, 단백질이 SDS-PAGE에 의해서 분리되고, SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)에 의해서 염색된다. 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 ZEBOVGP-PhaC-SEBOVGP 또는 SEBOVGP-PhaC-ZEBOVGP 융합 단백질 각각의 양이 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석된다.
목적하는 단백질이 MALDI-TOF-MS을 사용하여 확인되고, 융합 단백질 영역을 확인한다.
4. ELISA
에볼라 바이러스 폴리머 입자의 면역-반응성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. 간단하게, Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 ZEBOVGP-PhaC-SEBOVGP 입자, SEBOVGP-PhaC-ZEBOVGP 입자 또는 야생형 입자와 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다(표 4 참조). 그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, 다양한 항원에 대해 생성된 마우스 항체와 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다. 상기 반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도가 495 nm에서 기록된다.
5. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화; 및
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
6. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다. 상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 17 mM TRIS-HCl 및 140 mM NH4C1의 용액을 사용하여 용해된다. 세척 후에, 상기 RBCs가 2 mM의 글루타민(Invitrogen), 100 U/mL의 페니실린(Invitrogen), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen), 5x 10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 5%(w/w) 소태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양된다.
7. 플라크 감소 중화 분석
면역화된 마우스로부터 유래된 혈청이 플라크 감소 중화 시험에 의해 항체를 중화하는 에볼라 바이러스의 존재에 대해서 조사되었다. 일련의 희석된 혈청이 가열로 불활성화되고, 동종 및 이종 바이러스의 100 플라크 형성 유닛과 혼합되어 1시간동안 37 ℃에서 배양된다. 상기 혈청 바이러스 혼합물이 베로(Vero) 세포 단일층과 1시간동안 배양하고 아가로스 함유 배지로 덮는다. 바이러스 플라크가 분석 10-12일에 염색된다. 플라크 수가 80% 감소된 최고 희석물이 플라크 감소 중화 80(PRNT80)이다.
8. 사이토킨 및 케모킨의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고, 분석될 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 사이토킨 및 케모킨의 수준은 상업적으로 이용할 수 있는 항체 및 표준(EBiosciene)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA 및/또는 FACS(EBioscience)에 의해서 측정된다.
9. 마우스 바이러스 방어 분석
마우스 면역성 모델(mouse challenge model)이 사용되어 보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 ZEBOVGP 및 SEBOVGP 항원의 조제들의 유효성을 확인하였다. B10.BR 마우스(MHE H-2K), The Jackson Laboratory, ME)5가 상기 물질 및 방법의 (1)섹션에서 기술된 바와 같이 1, 5 및 10 μg 투여량을 사용하여 면역화된다. 면역화 이후에, ZEBOV 적응된 마우스의 1000xLD50으로 복강내 주사(IP)에 의해 면역성 검사한다. 이환률 및 사망률이 면역성 이후 12-16일동안 모니터된다.
보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 ZEBOVGP 및 SEBOVGP 항원의 조제들의 유효성이 1000xLD50의 30분후 IP 주사에 의해 백신 조제의 투여를 통해서 확인된다. 이환률 및 사망률이 면역성 이후 12-16일동안 모니터된다.
10. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체기 항체 캡쳐에 대한 고정된 항원을 나타내는 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
11. 통계학적 분석
사이토킨, 케모킨 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP 또는 pET14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인한다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다. pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-ZEBOVGP-C-SEBOVGP 또는 pET14B-SEBOVGP-C-ZEBOVGP 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
상기 입자는 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 개시된 바와 같이 고수준의 단백질을 나타낸다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA는 다양한 항원 표시 입자는 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것으로 보이는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >98%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다. 결과는 다양한 항원-PhaC 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자를 생성하는 것을 나타낸다.
면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았다. 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다. 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 전형적으로 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 농양이나 화농이 관찰되지 않았다. 모든 마우스는 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다.
항원 입자의 5-100 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 최적이다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 5-100 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 포함한다. 면역화되지 않은 대조군 마우스를 포함하고 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하는 2번째 시험에서, 항원-특이성 혈청 항체 반응은 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 항원 입자가 주어진 두 백신 그룹에 대해 상당히 높았다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰되었다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 IgG2에 대한 반응보다 더 강하다.
5-100 μg의 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 단독, 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었다. PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이는 없다. 10-50 μg의 야생형 입자로 2번 면역화된 마우스에서 항원에 대한 케모킨 및 사이토킨은 PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 전형적으로 상당한 차이는 없을 것이다. 대조적으로, 각 항원에 대한 상당히 더 큰 케모킨 및 사이토킨 반응이 항원 입자로 2번 면역화된 마우스와 항원 입자 및 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 모든 다른 백신군에서보다 항원 입자와 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대한 상당히 큰 사이토킨 및 케모킨 반응이 기대된다. 항원 ZEBOVGP 및 SEBOVGP 단백질을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
야생형 입자로 면역화된 마우스에서 혈청은 플라크 감소 중화 분석에서 PBS-면역화 대조군 마우스와 상당한 차이는 없을 것이다. 플라크 감소 중화 분석에서 조제 ZEBOVGP 및 SEBOVGP로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 혈청과 비교하여 상당히 더 높을 것이다. 플라크 감소 중화 분석에서 ZEBOVGP 및 SEBOVGP 입자를 포함하는 조제로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 동종 및 이종 바이러스에서와 유사할 것이다.
PBS 또는 야생형 입자로 면역화된 마우스는 면역화 시간 및 순서와 상관없이 2개 그룹들 사이에서 상당한 차이 없이 바이러스 면역시에 죽을 것으로 기대된다. 바이러스 접종 전에 보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 ZEBOVGP 및 SEBOVGP로 면역화된 마우스는 방어될 것으로 기대되며, 보조제를 포함하는 조제로부터 유래된 것이 방어가 더 양호하다. 또한, 보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 ZEBOVGP 및 SEBOVGP로 면역화된 마우스는 방어될 것으로 기대된다.
ZEBOV-GP 및 SEBOV-GP 항원을 동시에 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다. 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자가 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 12 - 웨스트 나일 바이러스 폴리머 입자 백신의 면역원성
본 실시예는 폴리머 입자의 면역원성의 분석과 함께, 웨스트 나일 바이러스(WNV)로부터 유래된 플라비바이러스 엔벨로프 항원(Flavivirus envelope antigen) (E), WNV 비리온의 표면에서 발현되는 비독성 단백질을 나타내는 폴리머 입자의 형질전환된 숙주, 본 경우에 이. 콜리에서 제조를 위한 플라스미드의 구조를 기술하였다. 상기 항원은 백신 개발에 대한 선도 후보물질로 고려된다. 몇가지 백신 조제가 현재 시험되고 있으며, 승인된 WNV 백신은 아니다. 본 실시예에서 제조되는 바와 같은 상기 항원을 나타내는 폴리머 입자는 WNV에 대한 예방 및 치료 백신으로서 유용하다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 플라스미드의 구조
본 실시예에서 사용된 모든 플라스미드 및 올리고누클레오티드가 하기 표 12에 기술되었다. 3-히드록시부티릴-코엔자임 A의 합성을 매개하는 효소가 플라스미드 pMCS69에 의해서 코딩된다.
WNVE 항원을 나타내는 폴리머 입자를 제조하기 위해서, 엔벨로프(E)를 코딩하는 유전자는 최적화된 코돈이며, 조화시키고, Genscript Inc.에 의해서 합성되어 PhaC 폴리머 비드 형성 효소에 융합된 C-말단에 대해 pET-14b PhaC-링커-GFP XhoI-BamHI 부위로 서브클로닝한다. 상기 E 코딩 유전자가 XhoI-BamHI 부위로 삽입된다. 상기 유전자 삽입이 치환된 원래 플라스미드의 GFP 코딩 영역과 프레임에 있으며, 플라스미드 pET14B-C-WNVE를 수득한다.
PhaC-WNVE 융합에 대한 구조가 서열 번호 53에 개시되어 있으며, 유래된 아미노산 서열은 서열 번호 54에 개시되어 있다.
Figure pct00012
2. WNVE 를 나타내는 입자의 제조
플라스미드 pET14B-C-WNVE 및 pHAS가 플라스미드 pMCS69를 갖는 이. 콜리 BL21 스타(DE3)로 도입된다. 형질전환체가 실시예 1에 기술된 바와 같이 바이오폴리에스테르 입자의 제조에 적당한 조건에서 배양된다.
3. 기체 크로마토그래피 질량 분석( GC - MS )
다양한 플라스미드를 갖는 박테리아 세포의 폴리에스테르 함유량은 생체내 PhaC 신타제의 활성에 상응한다. 축적된 폴리에스테르의 양이 기체 크로마토그래피-질량 분석기(GC-MS) 분석에 의해서 평가하여 PhaC 신타제 활성을 측정하고 특히 PhaC-WNVE 항원 융합이 폴리에스테르 합성을 촉매화하고 세포내 과립 형성을 매개하는지를 평가한다. 폴리에스테르 함유량은 산-촉매화 메타노라이시스(methanolysis)에 의해서 폴리에스테르가 3-히드록시메틸 에스테르로의 전환 이후에 GC-MS에 의해서 정량적으로 측정된다.
4. 폴리에스테르 입자의 분리
폴리에스테르 과립이 실시예 3에 기술된 바와 같이 분리된다.
5. 단백질 농도 측정
입자에 부착된 단백질의 농도는 실시예 3에 기술된 바와 같이 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다.
6. ELISA
웨스트 나일 바이러스 폴리머 입자의 면역-반응성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. Maxisorb 플레이트(Nunc)가 카보네이트-비카보네이트 코팅 완충액(pH 9.6)(Sigma-Aldrich)에서 희석된 정제된 PhaC-WNVE 입자 또는 야생형 입자와 4 ℃에서 한밤동안 코팅된다. 상기 완충액의 일련의 희석이 1 mg/ml에서 0.015 mg/ml 단백질 농도의 범위로 사용된다. 플레이트가 세척되고 25 ℃에서 2시간동안 차단된다.
그 후, 플레이트가 PBS-트윈 20으로 세척되고, 다양한 항원에 대해 생성된 마우스 항체와 배양되며, 세척되고, PBS에서 1%(w/v) BSA에서 희석된 항-마우스 IgG:서양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트(Sigma-Aldrich)와 실온에서 1시간동안 추가로 배양된다. 추가로 세척한 후에, o-페닐렌디아민(OPD) 기제(Sigma-Aldrich)가 첨가되고 플레이트가 실온에서 30분동안 배양된다.
상기 반응은 0.5 M H2SO4로 정지시키고, 흡광도가 495 nm에서 기록된다.
7. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 2주 간격으로 3번 근육내로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)로 면역화;
(b) 각자는 항원 입자 단독(예를 들면, 다양한 항원-PhaC 융합 단백질 및 pMCS69를 코딩하는 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 입자)으로 면역화; 및
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 다양한 항원 입자로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
8. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 실시예 4에 기술된 바와 같이 처리된다.
9. 플라크 감소 중화 분석
면역화된 마우스로부터 유래된 혈청이 플라크 감소 중화 시험에 의해 항체를 중화하는 웨스트 나일 바이러스의 존재에 대해서 조사되었다. 일련의 희석된 혈청이 가열로 불활성화되고, 동종 및 이종 혈청형 바이러스의 100 플라크 형성 유닛(PFU)과 혼합되어 1시간동안 37 ℃에서 배양된다. 상기 혈청-바이러스 혼합물이 베로(Vero) 세포 단일층과 1시간동안 배양하고 아가로스 함유 배지로 덮는다. 바이러스 플라크가 분석 5일에 염색된다. 플라크 수가 80% 감소된 최고 희석물이 플라크 감소 중화 80(PRNT80)이다.
10. 사이토킨 및 케모킨의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고, 분석될 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 사이토킨 및 케모킨의 수준은 상업적으로 이용할 수 있는 항체 및 표준(EBiosciene)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA 및/또는 FACS(EBioscience)에 의해서 측정된다.
11. 마우스 바이러스 방어 분석
마우스 면역성 모델(mouse challenge model)이 사용되어 보조제를 갖는 입자와 보조제를 갖지 않는 입자를 나타내는 웨스트 나일 E 항원의 조제들의 유효성을 확인하였다. 13일된 젖을 갓 뗀 마우스가 상기 물질 및 방법의 (1)섹션에서 기술된 바와 같이 1, 5 및 10 μg 투여량을 사용하여 면역화된다. 면역화 이후에, 웨스트 나일 바이러스 적응된 마우스의 100 LD50으로 두개내(IC)로 면역성 검사한다. 이환률 및 사망률이 면역성 이후 21일동안 모니터된다.
12. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체기 항체 캡쳐에 대한 고정된 항원을 나타내는 입자를 사용하여 ELISA에 의해서 측정된다.
13. 통계학적 분석
사이토킨, 케모킨 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-WNVE 및 pHAS를 운반하는 세포의 GC-MS 분석으로 폴리에스테르 폴리히드록시부티레이트의 존재를 확인할 것이다. 세포내 폴리에스테르 함입물의 존재는 Nile Red 염색을 사용하여 형광 현미경에 의해서 추가로 확인될 수 있다.
pMCS69의 존재하에 플라스미드 pET14B-C-WNVE 및 pHAS(야생형 대조군)를 운반하는 세포에서 폴리히드록시부티레이트의 존재는 PhaC 폴리에스테르 신타제 영역이 단일 또는 3중 융합 단백질로서 존재할 때 폴리머 신타제 활성을 보유하는 것을 나타낸다.
상기 입자에 의한 고수준의 단백질은 각각 융합 단백질 서열로부터 제외된 분자량과 직접 관련된 겉보기 분자량을 갖는 우세한 단백질 밴드에 의해서 측정된다. 상기 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS를 사용하는 트립틱 펩티드 핑거프린팅에 의해서 확인된다. ELISA 결과는 다양한 항원 표시 입자가 투여량-의존성 방식으로 각각의 항-항원 항체에 결합되고, 야생형 입자는 항체 결합이 상당히 떨어지는 것을 나타낸다. 유세포 분석 결과는 항원 입자의 >97%가 항-항원 항체와 결합하는 것을 보여준다.
PhaC-항원 융합 단백질을 코딩하는 각각의 하이브리드 유전자의 재조합 이. 콜리에서 발현은 이의 표면에서 융합 단백질을 나타내는 폴리에스테르 입자를 생성하는 것을 나타낸다.
바람직하게, 면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았고, 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다(데이터가 개시되지 않음). 폴리에스테르 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 농양이나 화농이 없고, 전형적으로 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다. 항원 입자의 5-100 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생한다. 상기 투여량은 야생형 입자 단독의 5-100 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 포함한다. 다른 투여량이 또한 시험되고 사용될 수 있다. 면역화되지 않은 마우스(대조군)를 포함하는 2번째 실험에서, 마우스가 보조제를 갖거나 또는 갖지 않고 조제된 WNVE를 나타내는 입자(시험군)과 대조군 야생형 입자(비드 대조군)으로 면역화된다. 마우스는 백신화되지 않거나 또는 야생형 비드 면역화된 마우스와 비교하여 항원을 나타내는 입자가 주어진 두 마우스 그룹에 대해서 상당히 더 높은 항원-특이성 혈청 항체 반응에 대해서 평가되었다. 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 제조된 항원 입자로 면역화된 마우스에서 관찰될 수 있다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 더 강할 것이다.
5-100 μg의 항원 입자로 면역화된 마우스의 항원에 대한 세포-매개 반응이 야생형 입자 또는 PBS 단독으로 면역화된 마우스와 비교하여 또한 상당히 향상되었다. PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 전형적으로 상당한 차이는 없다.
야생형 입자로 면역화된 마우스에서 혈청은 플라크 감소 중화 분석에서 PBS-면역화 대조군 마우스와 상당한 차이는 없을 것이다. 플라크 감소 중화 분석에서 WNVE 입자를 포함하는 조제로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 야생형 입자 단독으로 면역화된 마우스의 혈청과 비교하여 상당히 더 높을 것이다. 바람직하게, WNVE 입자를 포함하는 조제로 면역화된 마우스로부터 혈청의 중화 역가는 동종 및 이종 웨스트 나일 바이러스 사이에서 유사할 것이다.
야생형 입자의 5-100 μg으로 2회 면역화된 마우스에서 항원에 대한 케모킨 및 사이토킨 반응은 PBS-면역화된 대조군 마우스와 전형적으로 상당히 다르지 않을 것이다. 대조적으로, 상당히 큰 케모킨 및 사이토킨 반응이 항원 입자로 2번 면역화된 마우스 및 항원 입자와 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 모든 다른 백신 그룹에서보다 항원 입자와 Emulsigen으로 2번 면역화된 마우스에서 관찰된 각 항원에 대해 상당히 큰 사이토킨 및 케모킨 반응이 기대된다. WNVE 항원을 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다.
PBS 또는 야생형 입자로 면역화된 마우스는 2개 그룹들 사이의 상당한 차이 없이 바이러스 면역성 시에 죽을 것으로 기대된다. 보조제를 갖는 것과 보조제를 갖지 않는 WNVE를 나타내는 입자로 면역화된 마우스는 방어될 것으로 기대되며, 보조제를 포함하는 조제로부터 유래된 것이 더 잘 방어한다.
WNVE를 나타내는 설계된 폴리에스테르 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 생성을 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 생성할 수 있다. 체액성 및 세포-매개 면역 반응의 생성 뿐만 아니라, 중량 손실과 같은 부작용이 없고 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 입자가 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 13 - 마우스에서 생체내 면역 연구
본 실시예는 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자로 포유류 모델 생물체의 면역화를 기술하였다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 이. 콜리 및 엘. 락티스 에서 폴리머 입자의 제조 및 플라스미드의 구조
플라스미드가 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 엘. 락티스 및 이. 콜리에서 결핵 항원 Ag-85A 및 ESAT-6을 나타내는 폴리머 입자의 생성을 위해 제조된다.
폴리머 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리하고 전체 세포 용해물이 6000 g에서 15분 동안 4 ℃에서 원리분리되어 폴리머 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다. 단백질의 농도가 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다(Bio-Rad). 폴리머 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 Ag85A-ESAT-6:PhaC 융합 단백질의 양이 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad)를 사용하여 분석된다. Tb 항원은 폴리머 입자의 전체 단백질의 약 20%를 설명한다. 목적하는 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS을 사용하여 확인된다.
2. ELISA
폴리머 입자의 활성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. 흡광도가 VERSAax 마이크로플레이트 리더에서 490 nm에서 기록된다.
3. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 실시예 1, 2 및 3에 기술된 바와 같이 제조되고 분리된 결핵 폴리머 입자 백신으로 2주 간격으로 3번 피하로 면역화한다. 3개의 치료 그룹은 하기와 같다:
(a) 각자는 야생형 폴리머 입자(예를 들면, pHAS 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 폴리머 입자)로 면역화;
(b) 각자는 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 단독(예를 들면, pHAS-Ag85A-ESAT-6 및 pMCS69를 운반하는 박테리아 세포로부터 제조된 폴리머 입자)으로 면역화; 및
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제와 혼합된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자(MVP Laboratories)로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
4. 면역학적 분석
마우스가 최종 면역화하고 3주 후에 마취하고, 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장을 제거하고, 단일 세포 현탁액이 80 게이지 와이어 메시 체를 통과시킴으로써 제조된다. 비장 적혈구 세포(RBCs)가 17 mM TRIS-HCl 및 140 mM NH4C1의 용액을 사용하여 용해된다. 세척 후에, 상기 RBCs가 2 mM의 글루타민(Invitrogen), 100 U/mL의 페니실린(Invitrogen), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen), 5x 10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma) 및 5%(w/w) 소태아 혈청(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양된다.
상기 세포가 배지 단독, 또는 Ag85A, ESAT-6, 또는 이들 항원의 조합을 포함하는 배지에서 10% CO2에서 37 ℃에서 배양된다.
5. IFN -γ의 정량화
배양 상청액이 배양 4일 후에 제거되고 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결된다. 상기 상청액에서 IFN-γ의 수준이 상업적으로 입수가능한 항체 및 표준(BD Pharmingen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA(BD Biosciences)에 의해서 측정된다.
6. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 모노클로날 항-ESAT-6 또는 항-Ag85A 항체(Abcam)를 사용하여 제조자의 추천에 따라 ELISA에 의해서 측정된다.
7. 통계 분석
IFN-γ 반응 및 항체 반응의 분석이 가변의 Kruskal-Wallis one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시된다.
결과
면역화 이후에 동물에서 명백한 독성이 관찰되지 않았다. 마우스 체중은 실험 기간 동안의 그룹들 사이에서 상당히 다르지 않으며, 모든 그룹에서 마우스가 체중이 증가되었다(데이터가 개시되지 않음). 폴리에스테르 폴리머 입자로 면역화된 마우스는 면역화 부위에서 작은 혹(직경 2.5 mm)이 발생되었지만, 농양이나 화농이 관찰되지 않았다. 모든 마우스는 실험을 통해서 정상의 거동 및 양호한 품질의 털 상태를 갖는 건강한 상태이다(데이터가 개시되지 않음).
Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자의 30 μg의 투여량은 마우스에서 상당한 항체 반응을 발생하는데 최적인 것을 나타낸다(도 5 참조). 상기 투여량은 재조합 Ag85A-ESAT-6 단백질 단독의 30 μg 투여량과 비교할 때 상당히 높은 항체 역가를 유도한다(P<0.01). 면역화되지 않은 대조군을 포함하고 보조제를 갖는 비드 조제와 보조제를 갖지 않는 비드 조제를 비교하는 2번째 시험에서, 항원-특이성 혈청 항체 반응은 백신화되지 않은 마이스와 비교하여 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자가 주어진 백신 그룹에 대해 상당히 높다(P<0.01, 도 6 참조). 최대 항체 반응은 Emulsigen에서 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자로 면역화된 마우스에서 관찰된다. IgG1 이소타입에 대한 항체 반응은 두 실험에서 IgG2에 대한 반응보다 더 강할 것이다.
도 7에 개시된 바와 같이, 10 μg 또는 30 μg의 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자로 면역화된 마우스의 ESAT-6 및 Ag85A에 대한 세포-매개 반응은 재조합 ESAT-6-Ag85A 항원 단독(P<0.01) 또는 PBS 단독(p<0.01)으로 면역화된 마우스와 비교하여 상당히 향상되었다. PBS-면역화된 대조군 마우스와 비교하여 항원 단독으로 면역화된 마우스의 세포-매개 반응에서 상당한 차이는 없다.
도 8에 개시된 바와 같이, 30 μg의 야생형 폴리머 입자(Tb 항원은 없음)로 3번 면역화된 마우스에서 ESAT-6 또는 Ag85A 항원에 대한 IFN-γ 반응은 PBS-면역화된 대조군 마우스와 상당히 다르지 않다. 대조적으로 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응은 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자(p<0.01)로 3번 면역화된 마우스 및 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 및 Emulsigen(p<0.01)으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된다. 실제로, 각 항원에 대한 상당히 큰 IFN-γ 반응은 모든 다른 백신 그룹(p<0.01, **)보다 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자 및 Emulsigen으로 3번 면역화된 마우스에서 관찰된다.
토의
Ag85A-ESAT-6 항원 융합을 나타내는 설계된 폴리에스테르 폴리머 입자는 IgG1 및 IgG2 항체의 제조를 상당히 증가시킬 뿐만 아니라 항원-특이성 세포-매개 반응을 제조할 수 있다. 특히, 항원 단독(예컨대, 본 발명의 폴리머 입자를 포함하지 않는 항원)으로 면역화는 세포-매개 반응을 유도하는데 비효과적이다.
상기 결과는 또한 면역 반응의 보충적 측면을 유도하는 백신-송달 시스템의 다면성 및 가능성을 입증하였으며, 이로 인해 체액성 및 세포-매개 면역 반응 모두가 유도되었다.
중량 손실과 같은 부작용 및 주사 부위에서 농양과 화농이 없다는 것은 폴리에스테르 폴리머 입자는 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 14 - 생체내 면역화된 마우스에서 병원성 유발
본 실시예는 엠. 보비스로 병원성 유발(pathogenic challenge)에 노출된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 포유류 모델의 면역화의 유효성을 기술하였다.
물질 및 방법
모든 동물 실험은 AgResearch Grasslands 동물 윤리 위원회(Palmerston North, New Zealand)에 의해 승인되었다.
1. 폴리에스테르 폴리머 입자의 분리 및 플라스미드의 구조
플라스미드가 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 엘. 락티스 및 이. 콜리에서 결핵 항원 Ag-85A 및 ESAT-6을 나타내는 폴리머 입자의 생성을 위해 제조된다.
폴리머 과립이 박테리아를 파괴함으로써 분리하고 전체 세포 용해물이 6000 g에서 15분 동안 4 ℃에서 원리분리되어 폴리머 입자를 침전시킨다. 상기 입자가 글리세롤 그라디언트 초원심분리에 의해서 정제된다. 단백질의 농도가 제조자의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 측정된다(Bio-Rad). 폴리머 입자에 부착된 전체 단백질의 양에 대한 Ag85A-ESAT-6:PhaC 융합 단백질의 양이 Gel Doc™ XR을 사용하여 검출되며, Quantity One 소프트웨어(버전 4.6.2, Bio-Rad)를 사용하여 분석된다. Tb 항원은 폴리머 입자의 전체 단백질의 약 20%를 설명한다. 목적하는 단백질의 확인은 MALDI-TOF-MS을 사용하여 확인된다.
2. ELISA
폴리머 입자의 활성이 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된다. 흡광도가 VERSAax 마이크로플레이트 리더에서 490 nm에서 기록된다.
3. 마우스의 면역화
6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Malaghan Institute, Wellington, NZ)가 매주 간격으로 3번 피하로 면역화된다. 7개의 치료 그룹(그룹당 n=6)은 하기와 같다:
(a) 각자는 PBS 및 Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)로 면역화.
(b) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자(이. 콜리 숙주)로 면역화.
(c) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 야생형 폴리머 입자(이. 콜리 숙주)로 면역화.
(d) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자(엘. 락티스 숙주)로 면역화.
(e) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 야생형 폴리머 입자(엘. 락티스 숙주)로 면역화.
(f) 각자는 20% Emulsigen™ 보조제(MVP Laboratories)와 혼합된 재조합 Ag85A-ESAT-6 항원으로 면역화.
(g) 각자는 BCG 106 CFU 투여량으로 면역화.
백신화되지 않은 대조군 동물은 각 실험 세트에 대해서 포함된다.
4. 병원성 면역검사( pathogenic challenge )
첫번째 백신화하고 15주 후에, 모든 마우스가 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에 의해서 면역검사한다. 엠. 보비스가 트윈 알부민 배양액(트윈 80, 두보스(Dubos) 배양액 베이스 및 올레산-알부민-덱스트로스, Difco)에서 로-패시지 시드 로트(low-passage seed lot)로부터 초기 미드-로그 페이스(early mid-log phase)까지 배양한다. 상기 배양의 분취량을 필요할 때까지 -70 ℃에서 동결시킨다.
저투여량의 에어로졸 노출에 의한 상기 마우스의 감염에 의해서, 희석된 엠. 보비스 원료가 약 50 박테리아를 각 마우스의 폐로 송달되도록 보정된 Madison 챔버 에어로졸 생성 장치를 사용하여 투여된다.
5. 면역학적 분석
마우스가 체중의 1g 당 87 μg 케타민(Parnell Laboratories, Australia) 및 2.6 μg 크실라진 히드로클로라이드를 사용하여 병원성 면역검사하고 5주 후에 복강으로 마취한다. 혈액을 수집하고, 원심분리하여, 혈청을 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 동결시킨다.
상기 마우스는 그후 안락사시키고, 이의 비장 및 폐를 제거한다. 첨단의 폐엽이 폐로부터 제거되고, 10% 완충된 포르말린에서 보존되고, 연이어 조직학적 처리한다. 섹션은 Ziehl-Neelson 및 해마톡실린 및 에로신 염색으로 염색된다.
비장 및 남아있는 폐 시료가 Seward Stomacher? 80(Seward, UK)을 사용하여 0.5% 트윈 80을 갖는 3 mL의 PBS에서 기계적으로 균질화하고, 10% 올레산-알루민-덱스트로스-카탈라제 농축물(BD)이 보충된 선택적 Middlebrook 7H11 아가에서 10배 희석에서 플레이팅한다. 플레이트가 카운팅하기 전에 3주 동안 습윤된 공기에서 37 ℃에서 배양된다.
6. 혈청 항체의 정량화
혈청 항체가 모노클로날 항-ESAT-6 항체(Abcam)를 사용하여 제조자의 추천에 따라 ELISA에 의해서 측정된다. 간단하게, 마이크롤론 고-결합 플레이트(Greiner)가 5 μg/mL의 recAg85A-ESAT-6으로 한밤동안 코팅되고, 1% BSA로 블로킹하며, PBST에서 세척된다. 혈청의 5배 희석물(1:50 내지 1:6250)이 첨가되고 배양된다. 세척한 후에, 항-마우스 IgG1:HRP 또는 IgG2c:HRP(ICL, USA)가 첨가되고, 플레이트가 배양된다. 플레이트가 세척되고, VERSAmax 마이크로플레이트 리더에서 450 nm에에서 판독하기 전에 TMB가 기제로서 사용된다.
모노클로날 항-ESAT6 항체가 적정되고, IgG1 플레이트에 대한 포지티브 대조군으로서 포함된다.
7. 통계 분석
엠. 보비스 병원성 면역 검사 및 항체 반응으로부터 박테리아 카운트의 분석은 가변의 Fisher's one-way 분석(ANOVA)에 의해서 실시되며, 유의도 수준은 P<0.05이다.
결과
엘. 락티스에서 생성된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자의 반응성은 ESAT-6 항체에 대한 투여량-의존성 반응을 나타내며, 항체 결합은 야생형 폴리머 입자에 대해서 관찰되지 않았다(도 9).
폐 배양에서, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 백신화는 PBS-면역화 네가티브 대조군과 비교하여 감염에 대한 상당히 향상된 저항성을 제공한다(도 10, *=p<0.05). 상기 향상된 저항성은 이. 콜리 또는 엘. 락티스 숙주에서 합성된 입자에 의해서 제공된다. 또한, 이. 콜리 숙주에서 합성된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 백신화는 항원 단독으로 제공된 것과 비교하여 상당히 좋은 방어를 제공한다. 실제로, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자는 금 표준 BCG 백신에 대한 상당한 방어를 보여준다(도 10).
중요하게, 재조합 Ag85A-ESAT-6 항원 단독(예컨대, 본 발명의 폴리머 입자를 포함하지 않는 항원)에 의한 백신화는 PBS-면역화 대조군과 비교하여 감염에 대한 향상된 저항성을 제공하지 않는다.
비장 배양에서, Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 백신화는 PBS-면역화 네가티브 대조군과 비교하여 감염에 대한 상당히 향상된 저항성을 제공한다(도 11, *=p<0.05). 또한, 이. 콜리 숙주에서 합성된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 백신화는 항원 단독으로 제공된 것과 비교하여 상당히 좋은 방어를 제공한다. 야생형 폴리머 입자(예컨대, Tb 항원이 없는 폴리머 입자)에 의한 면역화도, 재조합 Ag85A-ESAT-6 항원 단독에 의한 면역화도 방어 반응을 제공하지 않는다.
도 12 및 13은 특이적 세포-매개 반응 뿐만 아니라, 체액성 반응이 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자에 의한 백신화된 마우스에서 또한 유도된다. BCG 백신과 비교하여, IgG2c 항체 반응은 이. 콜리에서 생성된 Ag85A-ESAT-6 폴리머 입자가 더 크다.
토의
이. 콜리 및 엘. 락티스 둘 다에서 생성된 Ag85A-ESAT-6 항원 융합을 나타내는 폴리머 입자에 의한 면역화는 엠. 보비스에 의한 면역화된 동물에 대해서 면역학적 방어를 제공할 수 있다.
폐에서, Ag85A-ESAT-6 항원 융합을 나타내는 폴리머 입자로 면역화에 의해서 제공된 감염은 BCG 백신에 상응한다. 상기는 본 발명의 폴리머 입자가 초기 감염 및 콜로니화(colonisation)를 포함하는 Tb 감염에 대한 방어 면역학적 반응을 유도할 수 있다.
대조군 포유류와 비교하여 Ag85A-ESAT-6 항원 융합을 나타내는 폴리머 입자로 면역화된 포유류의 비장에서 관찰된 감염의 감소는 본 발명의 폴리머 입자에 의한 면역화가 Tb 침투(infiltration) 및 질병 진행에 대한 방어를 제공한다.
다시, 부작용의 결여는 본 발명의 폴리머 입자가 내성이 있고, 안전하며, 독성이 없다는 것을 나타낸다.
방법, 폴리머 입자 및 융합 단백질을 포함하는 본 명세서에 기술된 본 발명의 측면은 질병, 진단, 단백질 제조, 생촉매 부동화(biocatalyst immobilisation) 및 약물 송달의 치료 및 예방에 유용하다.
당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 상기 명세서는 설명을 위해서만 제공되며 본 발명은 이에 제한되지 않는 것을 이해할 것이다.
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본 명세서에 참고되거나 또는 언급된 모든 특허, 공보, 과학 문헌, 웹 사이트 및 기타 문헌 및 물질은 본 발명이 관련된 당분야의 통상의 지식을 가진 사람의 수준의 지표이며, 상기 참고된 문헌 및 물질은 개별적으로 전문에 포함되거나 또는 본원에 전문이 개시될 수 있는 경우 동일한 정도로 포함된다. 출원인은 상기 특허, 공보, 과학 문헌, 웹 사이트, 전자적으로 이용가능한 정보, 및 다른 참고 물질 또는 문헌으로부터의 모든 물질 및 정보를 본 명세서에 물리적으로 포함할 수 있다.
본 특허의 명세서 부분은 모든 청구범위를 포함한다. 또한, 모든 우선권 서류에서의 청구범위 뿐만 아니라 모든 원 청구범위를 포함하는 모든 청구범위는 이의 전문이 명세서로 참고문으로 포함되며, 출원인은 명세서 또는 모든 청구범위로 물리적으로 포함된다. 그러므로, 예를 들면 어떤 환경하에서도 청구범위 중 정확한 단어는 특허의 명세서에서 이러한 말로서 나타나는 않는다는 주장에서 청구범위에 대한 서면을 제공하는 것은 아니라고 해석될 수 없다.
본 명세서에 기술된 모든 특징은 조합 형태로 조합될 수 있다. 그러므로, 달리 언급하지 않는다면, 기술된 각 특징은 일련의 균등하거나 또는 유사한 특징의 예에 불과하다.
본 발명은 이의 상세한 설명과 결합하여 기술되며, 상기 설명은 본원의 범위를 설명하기 위한 것으로 한정하는 것은 아니며, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해된다. 그러므로, 상기로부터 본 발명의 특정 비제한적인 실시양태가 설명을 목적으로 하는 본 명세서에 기술되었음에도 불과하고, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 다른 측면, 이점 및 변형이 하기 청구범위안에 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 특정 방법 및 조성물은 바람직한 비제한적인 실시양태를 대표하며, 예시하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다. 기타 목적, 측면 및 실시양태가 본 명세서를 고려하여 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 이해될 수 있으며, 청구의 범위에 의해서 정의된 바와 같이 본 발명의 사상안에 포함된다. 다양한 치환 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 방법으로 제조될 수 있다는 것은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게는 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 설명적 발명은 요소 또는 요소들, 또는 제한 또는 제한들의 부재하에 실시할 수 있으며, 본질적으로 본원에 명시적으로 개시하지 않았다. 그러므로, 예를들면 본 명세서의 예에서, 본 발명의 비제한적인 실시양태 또는 실시예에서, 용어인 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "포함하는(containing)" 등은 제한되지 않고 광범위하게 해석된다. 본 명세서에 설명적으로 기술된 방법 및 과정은 단계의 다른 순서로 실시될 수 있으며, 본 명세서 또는 청구범위에 기술된 단계 순서에 반드시 한정되는 것은 아니다.
사용된 용어 및 표현은 설명을 위해 사용되며 한정하지 않으며, 개시되고 기술된 특정의 균등물 또는 이의 일부를 제외하는 상기 용어 및 표현의 사용에 의도하지 않지만, 다양한 변형이 청구된 바와 같은 본 발명의 범위안에서 가능한 것이 인정된다. 그러므로, 본 발명은 다양한 비제한적인 실시양태 및/또는 바람직한 비제한적인 실시양태 및 선택적 특징에 의해서 특별히 기술되지만 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 이해될 수 있는 본 명세서에 기술된 개념의 변형 및 변화의 일부와 전부는 첨부된 청구범위에 의해서 한정된 본 발명의 범위안에 있는 것으로 고려된다.
본 발명은 명세서에서 넓고 포괄적으로 기술되었다. 일반적인 기술안에 포함된 더 좁은 종 및 아종 그룹은 본 발명의 일부를 또한 형성한다. 상기는 삭제된 물질이 명세서에 특별이 인용되었는지의 여부와 관계없이 종으로부터 유래된 물질을 네가티브 한정적으로 제외하는 본 발명의 일반적 기재를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 달리 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함하며, 용어 "X 및/또는 Y"는 "X" 또는 "Y" 또는 "X"와 "Y" 둘 다를 의미하며, 명사뒤에 붙은 "s"는 그 명사의 복수형과 단수형 모두를 나타낸다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면은 마쿠시(Markush) 그룹을 기초로 기술되었고, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 본 발명은 마쿠시 그룹의 멤버의 서브그룹 및 개별 멤버에 기초하여 기술되고 포함되며 출원인은 마쿠시 그룹의 멤버의 서브그룹 또는 개별 멤버에 특별히 언급되는 출원 또는 청구범위를 포함하는 것을 인정할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Rehm, Bernd H.A. Parlane, Natalie A. Wedlock, David N. Buddle, Bryce M. <120> POLYMER PARTICLES AND USES THEREOF <130> 626249 <150> US 61/229,318 <151> 2009-07-29 <150> US 61/229,348 <151> 2009-07-29 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2949 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic - M.tb antigen-PhaC fusion <220> <221> CDS <222> (1)..(870) <223> Ag85A antigen <220> <221> CDS <222> (871)..(1176) <223> ESAT6 antigen <220> <221> CDS <222> (1177)..(1182) <223> Linker <220> <221> CDS <222> (1183)..(2946) <223> PhaC synthase <400> 1 atg ttt tcc cgg ccg ggc ttg ccg gtg gag tac ctg cag gtg ccg tcg 48 Met Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser 1 5 10 15 ccg tcg atg ggc cgt gac atc aag gtc caa ttc caa agt ggt ggt gcc 96 Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala 20 25 30 aac tcg ccc gcc ctg tac ctg ctc gac ggc ctg cgc gcg cag gac gac 144 Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp 35 40 45 ttc agc ggc tgg gac atc aac acc ccg gcg ttc gag tgg tac gac cag 192 Phe Ser 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aga ttt gca gct 1539 Phe Ala Gly Asp Ala Trp Arg Thr Asn Leu Pro Tyr Arg Phe Ala Ala 495 500 505 510 gct ttt tat tta tta aat gct cgt gct tta aca gaa ttg gca gat gct 1587 Ala Phe Tyr Leu Leu Asn Ala Arg Ala Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala 515 520 525 gtg gaa gct gat gct aaa act cgt caa cgt att aga ttt gca att agt 1635 Val Glu Ala Asp Ala Lys Thr Arg Gln Arg Ile Arg Phe Ala Ile Ser 530 535 540 caa tgg gtt gat gct atg agt cct gca aat ttc ttg gca acc aat cct 1683 Gln Trp Val Asp Ala Met Ser Pro Ala Asn Phe Leu Ala Thr Asn Pro 545 550 555 gaa gca caa cga tta ctt atc gaa tca ggc ggt gaa tca ctt cgt gct 1731 Glu Ala Gln Arg Leu Leu Ile Glu Ser Gly Gly Glu Ser Leu Arg Ala 560 565 570 ggt gtt aga aat atg atg gaa gat tta act cga ggt aaa att agt caa 1779 Gly Val Arg Asn Met Met Glu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Ile Ser Gln 575 580 585 590 acc gat gaa tca gca ttt gaa gtg ggt cga aat gta gct gtt acg gaa 1827 Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val Gly Arg Asn Val Ala Val Thr Glu 595 600 605 ggt gct gtt gtt ttc gaa aat gaa tat ttt caa ttg tta caa tat aaa 1875 Gly Ala Val Val Phe Glu Asn Glu Tyr Phe Gln Leu Leu Gln Tyr Lys 610 615 620 cct tta aca gat aaa gtt cat gcc cgt cct ttg ctt atg gtt cct cct 1923 Pro Leu Thr Asp Lys Val His Ala Arg Pro Leu Leu Met Val Pro Pro 625 630 635 tgt att aat aaa tat tac att ttg gat ctt caa cca gaa agc tca ctt 1971 Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Gln Pro Glu Ser Ser Leu 640 645 650 gtt cga cat gtt gtc gaa caa ggt cat acc gtc ttt ttg gtt agt tgg 2019 Val Arg His Val Val Glu Gln Gly His Thr Val Phe Leu Val Ser Trp 655 660 665 670 cga aat cct gac gct agt atg gca ggt agt acg tgg gat gat tat att 2067 Arg Asn Pro Asp Ala Ser Met Ala Gly Ser Thr Trp Asp Asp Tyr Ile 675 680 685 gaa cac gct gcc att cga gca att gaa gtt gca cga gat att tct ggt 2115 Glu His Ala Ala Ile Arg Ala Ile Glu Val Ala Arg Asp Ile Ser Gly 690 695 700 caa gac aaa att aat gta ctt ggc ttt tgt gtt ggt ggt aca att gtt 2163 Gln Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Phe Cys Val Gly Gly Thr Ile Val 705 710 715 tct acg gca tta gct gtc ctt gct gct cga gga gaa cat cct gcc gct 2211 Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly Glu His Pro Ala Ala 720 725 730 tct gtc aca ttg ttg aca aca tta tta gat ttt gct gat act ggc att 2259 Ser Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asp Phe Ala Asp Thr Gly Ile 735 740 745 750 ctt gat gtg ttt gtc gat gaa ggt cac gta caa tta aga gaa gca acc 2307 Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Gly His Val Gln Leu Arg Glu Ala Thr 755 760 765 tta ggt gga gga gct ggc gct cca tgt gct ttg tta aga ggt ttg gaa 2355 Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro Cys Ala Leu Leu Arg Gly Leu Glu 770 775 780 ctt gct aat aca ttt agc ttt ctt cga cca aat gat ttg gtc tgg aac 2403 Leu Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg Pro Asn Asp Leu Val Trp Asn 785 790 795 tac gtg gtt gac aat tat tta aaa ggt aat acg cca gtt cct ttc gat 2451 Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Thr Pro Val Pro Phe Asp 800 805 810 tta ttg ttc tgg aac ggt gat gca act aat tta cca gga cct tgg tac 2499 Leu Leu Phe Trp Asn Gly Asp Ala Thr Asn Leu Pro Gly Pro Trp 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catggtggcc agattggact gcatggttgg ctggtcaagc cggtgcaaaa 2280 cgtgcagcac cagccaatta tggcaatgct cgatatagag ctattgaacc tgcaccaggc 2340 cgttatgtca aagcaaaagc a 2361 <210> 10 <211> 787 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HepC-PhaC fusion polypeptide encoded by pNZ-HepC-PhaCAB <400> 10 Met Ala Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr 1 5 10 15 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 85 90 95 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro 130 135 140 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val 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Leu Arg Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala Gly Val 500 505 510 Ile Asn Pro Pro Ala Lys Asn Lys Arg Ser His Trp Thr Asn Asp Ala 515 520 525 Leu Pro Glu Ser Pro Gln Gln Trp Leu Ala Gly Ala Ile Glu His His 530 535 540 Gly Ser Trp Trp Pro Asp Trp Thr Ala Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly 545 550 555 560 Ala Lys Arg Ala Ala Pro Ala Asn Tyr Gly Asn Ala Arg Tyr Arg Ala 565 570 575 Ile Glu Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Val Lys Ala Lys Ala His Met Val 580 585 590 Leu Ala Val Ala Ile Asp Lys Arg Gly Gly Gly Gly Gly Leu Glu Phe 595 600 605 Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser Gly 610 615 620 Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr Ile 625 630 635 640 Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met Glu 645 650 655 Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr Val 660 665 670 Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala His 675 680 685 Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val Val 690 695 700 Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile 705 710 715 720 Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg Thr 725 730 735 Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly 740 745 750 Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly Ala 755 760 765 Thr Gln Ala Gly Arg Leu Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr 770 775 780 Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg 785 790 795 800 Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys 805 810 815 Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp 820 825 830 Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met Glu 835 840 845 Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly Ser 850 855 860 Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val Glu 865 870 875 880 Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg 885 890 895 Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys 900 905 910 Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly 915 920 925 Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys 930 935 940 Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly 945 950 955 960 Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala 965 970 975 Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val 980 985 990 Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly 995 1000 1005 Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 1010 1015 1020 Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val 1025 1030 1035 Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe 1040 1045 1050 Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr 1055 1060 1065 Gln Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala 1070 1075 1080 Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val 1085 1090 1095 Leu Leu Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala 1100 1105 <210> 55 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer - synthesised in laboratory <400> 55 cgcctttgcc ggtcgcacaa caacaacaac aacacatact agtatctcct tatttctaga 60 ggga 64 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer - synethsised in laboratory <400> 56 gatacgtcaa agccaaggca tgtagggatc cggctgctaa caaag 45

Claims (120)

  1. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 피험체에 1 이상의 융합(fusion) 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드의 1 이상은 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질(particle-forming protein)을 포함하는, 방법.
  2. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 피험체에 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드의 1 이상은 상기 피험체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역(binding domain)에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  3. 병원체(pathogen)에 대해 피험체를 면역화하는(immunising) 방법으로서,
    이를 필요로 하는 피험체에 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드의 1 이상은 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  4. 병원체에 대해 피험체를 면역화하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 피험체에 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 융합 폴리펩티드의 1 이상은 상기 피험체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 반응은 세포-매개(cell-mediated) 면역 반응을 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 반응은 체액성(humoral) 반응을 포함하는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체는 병원체에 감염되거나 또는 병원체에 대해 면역화되어 있는, 방법.
  8. 제 2 항 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역이 내인성 항원(endogenous antigen)에 결합하는, 방법.
  9. 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  10. 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는, 폴리머 입자.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는, 폴리머 입자.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는, 폴리머 입자.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 항원, 또는 항원을 결합할 수 있는 2 이상의 상이한 결합 영역을 포함하는, 폴리머 입자.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원 및 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 포함하는, 폴리머 입자.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 폴리머 입자에 결합되거나 또는 혼입되는 1 이상의 물질을 추가로 포함하는, 폴리머 입자.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 물질은 항원, 보조제(adjuvant) 또는 면역자극 분자, 또는 이의 2 이상의 조합인, 폴리머 입자.
  18. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 다가(multivalent)인, 폴리머 입자.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질은 가교(cross-linking)에 의해 폴리머 입자에 결합되는, 폴리머 입자.
  20. 피험체에서 면역 반응을 유도하거나, 또는 병원체에 대해 피험체를 면역화하거나, 또는 피험체에서 병원체로부터의 감염을 진단하기 위해서, 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  21. 피험체에서 면역 반응을 유도하거나, 또는 병원체에 대해 피험체를 면역화하거나, 또는 피험체에서 병원체로부터의 감염을 진단하기 위해서, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 마이코박테리움(Mycobacterium)[예컨대, 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 레프래(M. leprae), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 아비움 파라투버쿨로시스(M. avium paratuberculosis), 마이코박테리움종], 리스테리아(Listeria)[예컨대, 리스테리아 모노사이토겐스(L. monocytogenes), 리스테리아종), 살모넬라(Salmonella)[예컨대, 살모넬라 티파이(S. typhi)], 여시니아(Yersinia)[예컨대, 여시니아 페스티스(Y. pestis), 여시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 여시니아 슈도투버쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)], 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 레지오넬라(Legionella)[예컨대, 레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila), 레지오넬라 롱베아캐(L. longbeachae), 레지오넬라 보제마니이(L. bozemanii), 레지오넬라종], 리케치아(Rickettsia)[예컨대, 리케치아 리케치이(R. rickettsii), 리케치아 아카리(R. akari), 리케치아 코노리이(R. conorii), 리케치아 시베리카(R. siberica), 리케치아 아우스트랄리스(R. australis), 리케치아 자포니카(R. japonica), 리케치아 아프리캐(R. africae), 리케치아 프로와제키이(R. prowazekii), 리케치아 티파이(R. typhi), 리케치아종], 클라미디아(Chlamydia)[예컨대, 클라미디아 뉴모니애(C. pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미디아종], 클라미도필라(Clamydophila)[예컨대, 클라미도필라 시타시(C. psittaci), 클라미도필라 아보르투스(C. abortus)], 스트렙토코커스(Streptococcus)[예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 표게네스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)], 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)를 포함하는 스타필로코커스(Staphylococcus)[스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)], 에를리키아(Ehrlichia)[예컨대, 에를리키아 차프펜시스(E. chaffeensis), 에를리키아파고사이토필라 제노군(Ehrlichia phagocytophila geno group), 에를리키아종), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 리슈마니아종(Leishmania sp.), 톡스폴라스마 곤디이(Toxpolasma gondii), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 히스토플라즈마종(Histoplasma sp.), 프란시셀라 튤라렌시스(Francisella tularensis)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 생물체 및
    C형 간염 바이러스, 아데노바이러스(Adenoviruses), 콕사키바이러스(coxsackievirus), A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus)를 포함하는 피코르나바이러스(Picornaviruses), 에프스테인-바 바이러스(epstein-barr virus), 헤르페스 심플렉스 타입 1, 헤르페스 심플렉스 타입 2, 사람 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus), 사람 헤르페스바이러스 타입 8, 바리셀라-조스테르 바이러스(varicella-zoster virus)를 포함하는 헤르페스바이러스(Herpesviruses), B형 간염 바이러스를 포함하는 헤파드나바이러스(Hepadnaviruses), C형 간염 바이러스, 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기 바이러스(dengue virus)를 포함하는 플라비바이러스(Flaviviruses), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 사람 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함하는 레트로바이러스(Retroviruses), 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 포함하는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses), 홍역 바이러스(measles virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 포함하는 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses), 파필로마바이러스(papillomavirus)를 포함하는 파필로마바이러스(Papillomaviruses), 라비에스 바이러스(rabies virus)를 포함하는 랍도바이러스(Rhabdoviruses), 루벨라 바이러스(Rubella virus)를 포함하는 토가바이러스(Togaviruses)를 포함하는 바이러스 및 백시니아(vaccinia), 아비폭스(avipox), 아데노-결합 바이러스(adeno-associated virus), 변형된 백시니아 스트레인 안카라(modified Vaccinia Strain Ankara), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 코로나 바이러스(coronaviruses)를 포함하는 기타 바이러스로부터 유래된 항원, 또는 상기 기술된 항원의 1 이상의 항원성 일부(antigenic portion) 또는 T-세포 에피토프(epitope)인, 폴리머 입자.
  23. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 이상의 폴리머 입자는 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 폴리머 입자인, 방법.
  24. 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 폴리머 입자를 포함하는 조성물.
  25. 제 25 항에 있어서,
    피험체에서 면역 반응을 유도하거나, 또는 피험체를 백신화(vaccinating)하거나, 또는 병원체에 대해 피험체를 면역화하거나, 또는 피험체에서 병원체로부터의 감염을 진단하기 위한 조성물.
  26. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    상기 조성물은 백신(vaccine)인 조성물.
  27. 피험체에서 면역 반응을 유도하거나, 또는 피험체를 백신화하거나, 또는 병원체에 대해 피험체를 면역화하거나, 또는 피험체에서 병원체로부터의 감염을 진단하는데 적당한 약제(medicament)를 제조하는데 사용되는, 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 폴리머 입자의 용도.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 약제는 백신인, 용도.
  29. 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
    면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는, 발현 구조물(expression construct).
  30. 제 29 항에 있어서,
    입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열이 단일의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 존재하는, 발현 구조물.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는, 발현 구조물.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제(thiolase), 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제(reductase), 또는
    (iii) 상기 (i)와 (ii) 모두.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제, 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제, 또는
    (iii) 1 이상의 폴리머 신타제(polymer synthase), 또는
    (iv) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
    (v) 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역, 또는
    (vi) 상기 (i) 내지 (v) 중 1 이상을 포함하는 융합 단백질, 또는
    (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 모든 조합.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원인, 발현 구조물.
  35. 폴리머 입자의 제조 방법으로서,
    1 이상의 발현 구조물, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 구조물, 또는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계,
    상기 발현 구조물의 발현에 적당한 조건하에 상기 숙주 세포를 유지하는 단계, 및
    상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 병원체로부터의 감염을 진단하는 방법으로서,
    제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 폴리머 입자를 피험체에게 투여하는 단계, 및
    병원체 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    병원체 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응(delayed-type hypersensitivity response)인, 방법.
  38. 제 36 항에 있어서,
    병원체 존재를 나타내는 반응은 피험체로부터 수득된 시료에서 병원체에 대한 항체의 존재를 검출하는 것인, 방법.
  39. 제 36 항에 있어서,
    병원체 존재를 나타내는 반응은 상기 시료에서 병원체에 반응하는 면역 세포의 존재를 검출하는 것인, 방법.
  40. 폴리머 입자의 제조 방법으로서,
    1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계,
    상기 발현 구조물의 발현에 적당한 조건하에 상기 숙주 세포를 유지하는 단계, 및
    상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자를 분리하는 단계를 포함하며,
    상기 1 이상의 발현 구조물은
    입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 발현 구조물은 높은 복제수 벡터(high copy number vector)에 있는, 방법.
  42. 제 40 항에 있어서,
    입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 강한 프로모터에 조작가능하게 연결되는, 방법.
  43. 제 40 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 폴리머 신타제의 기제(substrate) 또는 기재 혼합물(모노머 기제를 포함), 또는 폴리머 신타제의 기제를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해서 대사될 수 있는 전구물질 기제의 존재하에 유지되는, 방법.
  44. 제 40 항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 2 이상의 상이한 발현 구조물을 포함하는, 방법:
    입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
    입자-형성 단백질 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
    보조제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물, 또는
    1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
  45. 제 40 항에 있어서,
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 ESAT-6을 코딩하는, 방법.
  46. 제 40 항에 있어서,
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 Ag85A를 코딩하는, 방법.
  47. 제 40 항에 있어서,
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 ESAT-6 및 Ag85A를 코딩하는, 방법.
  48. 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  49. 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는, 폴리머 입자.
  51. 제 50 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 또는 2 이상의 상이한 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 포함하는, 폴리머 입자.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 포함하는 폴리머 입자.
  53. 제 48 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 상기 폴리머 입자에 결합되거나 또는 혼입된 1 이상의 물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 폴리머 입자.
  54. 제 53 항에 있어서,
    상기 물질은 항원, 보조제 또는 면역자극 분자인 폴리머 입자.
  55. 제 48 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 다가(multivalent)인, 폴리머 입자.
  56. 제 53 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 가교에 의해서 폴리머 입자에 결합되는, 폴리머 입자.
  57. 제 48 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) ESAT-6 항원을 포함하는, 폴리머 입자.
  58. 제 48 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) Ag85A 항원을 포함하는, 폴리머 입자.
  59. 제 58 항에 있어서,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 ESAT-6 항원 및 Ag85A 항원을 포함하는, 폴리머 입자.
  60. 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
    마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물.
  61. 제 60 항에 있어서,
    입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열, 및 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 마이코박테 리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열은 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재하는, 발현 구조물.
  62. 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서,
    상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는, 발현 구조물.
  63. 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제(thiolase), 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제(reductase), 또는
    (iii) 상기 (i)와 (ii) 모두.
  64. 제 60 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제, 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제, 또는
    (iii) 1 이상의 폴리머 신타제, 또는
    (iv) 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원, 또는
    (v) 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역, 또는
    (vi) 상기 (i) 내지 (v) 중 1 이상을 포함하는 융합 단백질, 또는
    (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 모든 조합.
  65. 결핵(tuberculosis)에 대한 피험체의 면역 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  66. 결핵에 대한 피험체의 면역 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  67. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  68. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는, 방법.
  69. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체가 결핵에 감염된, 방법.
  70. 제 65 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체가 결핵에 면역화되어 있는, 방법.
  71. 제 66 항 또는 제 68 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역은 내인성 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원에 결합하는, 방법.
  72. 제 65 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  73. 제 65 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 2 이상의 상이한 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 또는 2 이상의 상이한 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 포함하는, 방법.
  74. 제 65 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 및 1 이상의 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 결합 영역을 포함하는, 방법.
  75. 제 65 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 상기 폴리머 입자에 결합되거나 또는 혼입된 1 이상의 물질, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제 75 항에 있어서,
    상기 물질은 항원, 보조제 또는 면역자극 분자인, 방법.
  77. 제 65 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 다가인, 방법.
  78. 제 75 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질은 가교에 의해 상기 폴리머 입자에 결합되는, 방법.
  79. 제 65 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) ESAT-6 항원을 포함하는, 방법.
  80. 제 65 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) Ag85A 항원을 포함하는, 방법.
  81. 제 65 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 ESAT-6 항원 및 Ag85A 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드의 1 이상을 포함하는, 방법.
  82. 제 65 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 Ag85B (MPT59), Ag85B, Ag85C, MPT32, MPT51, MPT59, MPT63, MPT64, MPT83, MPB5, MPB59, MPB64, MTC28, Mtb2, Mtb8.4, Mtb9.9, Mtb32A, Mtb39, Mtb41, TB10.4, TBlOC, TB11B, TB12.5, TB13A, TB14, TB15, TB15A, TB16, TB16A, TB17, TB18, TB21, TB20.6, TB24, TB27B, TB32, TB32A, TB33, TB38, TB40.8, TB51, TB54, TB64, CFP6, CFP7, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP1O, CFP11, CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B, CFP25, CFP25A, CFP27, CFP28, CFP28B, CFP29, CFP30A, CFP30B, CFP50, CWP32, hspX(알파-결정성), APA, 투버쿨린 정제 단백질 유도체(Tuberculin purified protein derivative, PPD), ST-CF, PPE68, LppX, PstS-1, PstS-2, PstS-3, HBHA, GroEL, GroEL2, GrpES, LHP, 19kDa lipoprotein, 71kDa, RD1-ORF2, RD1-ORF3, RD1-ORF4, RD1-ORF5, RD1-ORF8, RDl- ORF9A, RD1-ORF9B, Rv1984c, RvO577, Rv1827, BfrB, Tpx. Rv1352, Rv1810, PpiA, Cut2, FbpB, FbpA, FbpC, DnaK, FecB, Ssb, RplL, FixA, FixB, AhpC2, Rv2626c, Rvl211, Mdh, Rvl626, Adk, ClpP, SucD(Belisle 등, 2005; US 7,037,510; US 2004/0057963; US 2008/0199493; US 2008/0267990)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 마이코박테리움 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 항원, 또는 상기 항원의 1 이상의 항원성 부분 또는 T-세포 에피토프를 포함하는, 방법.
  83. 간염(hepatitis) 또는 인플루엔자(influenza)에 대한 피험체의 면역 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는, 방법.
  84. 간염 또는 인플루엔자에 대한 피험체의 면역 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 1 이상의 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는, 방법.
  85. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는, 방법.
  86. 피험체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    융합 폴리펩티드의 1 이상은 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 결합할 수 있는 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질, 바람직하게는 폴리머 신타제를 포함하는, 방법.
  87. 제 83 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 반응은 세포-매개 면역 반응인, 방법.
  88. 간염 또는 인플루엔자로부터의 감염을 진단하는 방법으로서,
    제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 폴리머 입자를 피험체에 투여하는 단계 및 간염 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제 88 항에 있어서,
    상기 간염 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응은 지연성 과민 반응인, 방법.
  90. 제 88 항에 있어서,
    상기 간염 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료에서 간염 항원 또는 인플루엔자 항원에 대한 항체의 존재를 검출하는 단계인, 방법.
  91. 제 88 항에 있어서,
    상기 간염 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 나타내는 반응은 상기 시료에서 간염 또는 인플루엔자 바이러스에 반응하는 면역 세포의 존재를 검출하는 단계인, 방법.
  92. 제 88 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체가 간염 또는 인플루엔자에 감염되는, 방법.
  93. 제 88 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체가 간염 또는 인플루엔자에 대해 면역화되어 있는, 방법.
  94. 제 89 항, 또는 제 91 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서,
    간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 결합 영역은 내인성 간염 항원 또는 인플루엔자 항원에 결합하는, 방법.
  95. 제 88 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리머 입자의 1 이상은 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  96. 제 88 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 2 이상의 상이한 간염 항원 또는 2 이상의 인플루엔자 항원, 또는 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 2 이상의 상이한 결합 영역을 포함하는, 방법.
  97. 제 88 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원, 및 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 포함하는, 방법.
  98. 제 88 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 상기 폴리머 입자에 결합되거나 또는 혼입된 1 이상의 물질을 추가로 포함하는, 방법.
  99. 제 98 항에 있어서,
    상기 물질은 항원, 보조제 또는 면역자극 분자인, 방법.
  100. 제 88 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 다가인, 방법,
  101. 제 98 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 가교에 의해 상기 폴리머 입자에 결합되는, 방법.
  102. 제 88 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자의 1 이상은 1 이상의 항원, 또는 1 이상의 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 포함하며, 상기 항원은 C형 간염 바이러스, 아데노바이러스(Adenoviruses), 콕사키바이러스(coxsackievirus), A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus)를 포함하는 피코르나바이러스(Picornaviruses), 에프스테인-바 바이러스(epstein-barr virus), 헤르페스 심플렉스 타입 1, 헤르페스 심플렉스 타입 2, 사람 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus), 사람 헤르페스바이러스 타입 8, 바리셀라-조스테르 바이러스(varicella-zoster virus)를 포함하는 헤르페스바이러스(Herpesviruses), B형 간염 바이러스를 포함하는 헤파드나바이러스(Hepadnaviruses), C형 간염 바이러스를 포함하는 플라비바이러스(Flaviviruses), 인플루엔자 바이러스(influenza virus)를 포함하는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses)로 구성된 그룹으로부터 선택된 생물체로부터 유래하거나, 또는 상기 항원의 1 이상의 항원성 일부 또는 T-세포 에피토프인, 방법.
  103. 폴리머 입자를 제조하는 방법으로서,
    1 이상의 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 준비하는 단계,
    상기 발현 구조물의 발현에 적당한 조건하에 상기 숙주 세포를 유지하는 단계, 및
    상기 숙주 세포로부터 폴리머 입자를 분리하는 단계를 포함하며,
    상기 1 이상의 발현 구조물은
    간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열, 또는
    간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  104. 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는, 폴리머 입자.
  105. 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  106. 제 104 항 또는 제 105 항에 있어서,
    폴리머 입자는 2 이상의 상이한 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  107. 제 106 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 2 이상의 상이한 간염 항원 또는 2 이상의 상이한 인플루엔자 항원, 또는 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 2 이상의 상이한 결합 영역을 포함하는, 폴리머 입자.
  108. 제 106 항 또는 제 107 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원 및 간염 항원 또는 인플루엔자 항원에 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역을 포함하는, 폴리머 입자.
  109. 제 104 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 상기 폴리머 입자에 결합되거나 또는 혼입되는 1 이상의 물질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 폴리머 입자.
  110. 제 109 항에 있어서,
    상기 물질은 항원, 보조제 또는 면역자극 분자인, 폴리머 입자.
  111. 제 104 항 내지 제 110 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리머 입자는 다가인, 폴리머 입자.
  112. 제 109 항 내지 제 111 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질은 가교에 의해서 상기 폴리머 입자에 결합되는, 폴리머 입자.
  113. 세포-매개 면역 반응을 이를 필요로 하는 피험체에서 유도하기 위해서, 또는 간염 또는 인플루엔자에 대해 피험체를 면역화하기 위해서, 또는 이를 필요로 하는 피험체에서 간염 또는 인플루엔자로부터의 감염을 진단하기 위해서, 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  114. 세포-매개 면역 반응을 이를 필요로 하는 피험체에서 유도하기 위해서, 또는 간염 또는 인플루엔자에 대해 피험체를 면역화하기 위해서, 또는 이를 필요로 하는 피험체에서 간염 또는 인플루엔자로부터의 감염을 진단하기 위해서, 간염 항원 또는 인플루엔자 항원에 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역에 융합된 입자-형성 단백질을 포함하는 1 이상의 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리머 입자.
  115. 제 104 항 내지 제 114 항 중 어느 한 항에 따른 폴리머 입자를, 세포-매개 면역 반응을 이를 필요로 하는 피험체에서 유도하기 위해서, 또는 간염 또는 인플루엔자에 대해 피험체를 면역화하기 위해서, 또는 이를 필요로 하는 피험체에서 간염 또는 인플루엔자로부터의 감염을 진단하기 위해서 적당한 약제의 제조에 사용되는, 폴리머 입자의 용도.
  116. 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열; 및
    간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 포함하는, 발현 구조물.
  117. 제 116 항에 있어서,
    상기 입자-형성 단백질을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 및 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열 또는 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 코딩하는 1 이상의 핵산 서열이 단일의 오픈 리딩 프레임으로 존재하는, 발현 구조물.
  118. 제 116 항 또는 제 117 항에 있어서,
    상기 발현 구조물은 입자-형성 단백질 및 간염 항원 또는 인플루엔자 항원, 또는 간염 항원 또는 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는, 발현 구조물.
  119. 제 116 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제, 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제, 또는
    (iii) 상기 (i)와 (ii) 모두.
  120. 제 116 항 내지 제 119 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 구조물은 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는, 발현 구조물:
    (i) 1 이상의 티올라제, 또는
    (ii) 1 이상의 리덕타제, 또는
    (iii) 1 이상의 폴리머 신타제, 또는
    (iv) 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원, 또는
    (v) 1 이상의 간염 항원 또는 1 이상의 인플루엔자 항원을 결합할 수 있는 1 이상의 결합 영역, 또는
    (vi) 상기 (i) 내지 (v) 중 1 이상을 포함하는 융합 단백질, 또는
    (vii) 상기 (i) 내지 (vi)의 모든 조합.
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