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KR20130133648A - 변형된 베타-락타마아제 및 이와 관련된 방법 및 용도 - Google Patents

변형된 베타-락타마아제 및 이와 관련된 방법 및 용도 Download PDF

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KR20130133648A
KR20130133648A KR1020127033615A KR20127033615A KR20130133648A KR 20130133648 A KR20130133648 A KR 20130133648A KR 1020127033615 A KR1020127033615 A KR 1020127033615A KR 20127033615 A KR20127033615 A KR 20127033615A KR 20130133648 A KR20130133648 A KR 20130133648A
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seq
hydrophilic amino
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울라 아이락시넨
카띠야 발리마키
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프레바브 알 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 약제 및 변형된 베타-락타마아제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신규 재조합 베타-락타마아제 및 이 베타-락타마아제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 베타-락타마아제를 변형시키는 방법, 베타-락타마아제를 생산하는 방법 및 베타-락탐 항생제에 의해 유도된 부작용을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 약제로서 사용되는 베타-락타마아제 및 베타-락탐 항생제에 의해 유도된 부작용을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 사용되는 베타-락타마아제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

변형된 베타-락타마아제 및 이와 관련된 방법 및 용도{MODIFIED BETA-LACTAMASES AND METHODS AND USES RELATED THERETO}
본 발명은 약제 및 변형된 베타-락타마아제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신규 재조합 베타-락타마아제 및 이 베타-락타마아제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 베타-락타마아제를 변형시키는 방법, 베타-락타마아제를 생산하는 방법 및 베타-락탐 항생제에 의해 유도된 부작용을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 약제로서 사용되는 베타-락타마아제 및 베타-락탐 항생제에 의해 유도된 부작용을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 사용되는 베타-락타마아제의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
베타-락탐 항생제는 분자 구조 중의 베타-락탐 고리를 특징으로 한다. 베타-락탐 고리의 무결성(integrity)은 펩타이도글리칸 합성의 최종 가교 반응을 촉매하는 트란스펩티다제 세트를 불활성화시키는 생물학적 활성에 필수적이다. 베타-락탐 항생제 패밀리의 구성원으로는 페니실린, 세팔로스포린, 클라밤(또는 옥사페남), 세파마이신 및 카바페넴을 포함한다.
베타-락타마아제는 베타-락탐 항생제를 가수분해하는 세균 방어 효소이다. 베타-락타마아제의 생산은 그람음성균에서 베타-락탐 내성을 부여하는 주요 기전이다. 베타-락타마아제는 베타-락탐 고리의 아미드 결합의 비가역적 가수분해를 매우 효과적으로 촉매하여 생물학적 불활성 산물(들)을 생산한다.
여러 베타-락타마아제 유형의 다양한 효소 특성으로 인해, 이 락타마아제의 카테고리화에는 여러 분류 시스템이 제안되었다. 2가지 주요 접근법을 기반으로 하는 분류가 있으며, 기능적 분류와 분자적 분류가 있다.
부시 등(Bush et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1211-1233)에 의해 제안된 베타-락타마아제의 기능적 분류 방식은 기질 및 억제제 프로필을 기초로 하는 4가지 베타-락타마아제 그룹을 정의한다. 그룹 1은 클라불란산에 의해 잘 억제되지 않는 세팔로스포리나제로 이루어진다. 그룹 2는 활성 부위-지시성 베타-락타마아제 억제제에 의해 일반적으로 억제되는 페니실리나제, 세팔로스포리나제 및 광범위-스펙트럼 베타-락타마아제로 이루어진다. 그룹 3은 페니실린, 세팔로스포린 및 카바페넴을 가수분해하고 거의 모든 베타-락탐-포함 분자에 의해 약하게 억제되는 금속-베타-락타마아제로 이루어진다. 그룹 4는 클라불란산에 의해 잘 억제되지 않는 페니실리나제로 이루어진다. 또한, 서브그룹은 그룹 2 페니실리나제에 의한 카르베니실린 또는 클록사실린(옥사실린)의 가수분해 속도에 따라 정의되었다.
가장 널리 사용되는 분류는 앰블러 분류(Ambler classification)인데, 이에 따르면 아미노산 서열에 기초하여 베타-락타마아제를 4가지 클래스(A, B, C, D)로 분류한다(Ambler 1980, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 289: 321-331). 클래스 A, C 및 D는 세린 베타-락타마아제 효소들의 진화론적으로 구별되는 그룹들이고, 클래스 B는 아연-의존적("EDTA-억제성") 베타-락타마아제 효소들이다(Ambler R.P. et al., 1991, Biochem J. 276: 269-270). 클래스 A, C 및 D는 세린 베타-락타마아제에 속하고, 베타-락탐의 가수분해는 활성 부위에 있는 세린에 의해 매개된다. 세린 베타-락타마아제는 베타-락탐의 표적 효소인 DD 펩티다제(D-알라닐-D-알라닌 카르복시펩티다제)와 관련이 있다. 세린 베타-락타마아제가 베타-락탐 항생물질을 가수분해하는 기전은 비공유 헨리-미카엘리스(Henri-Michaelis) 착물, 공유 아실-효소 중간체 및 탈아실화를 수반하는 3단계 경로를 따르는 것으로 여겨진다(Matagne et al., 1998, Biochem J 330: 581-598). 아실화 기전은 모든 세린 베타-락타마아제 그룹들의 공통적인 기전인 것으로 간주되는 반면에, 이론적 통계에 따르면 클래스 A, C 및 D의 세린 베타-락타마아제의 기질 탈아실화 기전은 서로 상이한 것으로 보인다. 탈아실화 기전은 공통의 기본 공정과 그룹 특이적 기본 공정을 모두 보유한다(Hata M et al., 2006, Biol Pharm Bull. 29: 2151-2159).
바실러스 속 세린 베타-락타마아제 및 TEM-1, SHV-1 및 CTX-M 패밀리는 본래 페니실린 및 앰피실린 등을 가수분해하는 능력이 양호한 페니실리나제 및 클래스 A 베타-락타마아제로서 분류되었다. 클래스 A 베타-락타마아제는 1940년대에 페니실린 내성 스타필로코커스 아우레우스에서 최초로 동정되었다. 플라즈미드-유래의 페니실린 내성 유전자, TEM-1은 20년 후에 이.콜리에서 발견되었다. 이후에, 세린 베타-락타마아제는 또한 대부분의 세팔로스포린을 가수분해하는 능력을 발전시키고 나아가 세팔로스포린의 특정 서브세트의 가수분해를 전문으로 하는 것으로 관찰되었다. 이러한 범위-확장된 베타-락타마아제(ESBL)의 대부분은 TEM-1, TEM-2 또는 SHV-1 효소의 파생체이다. 최근 클래스 A ESBL의 신규 그룹인 CTX-M 효소의 방대한 출현을 기술한 보고서의 수가 증가하고 있다. 현재, CTX-M 효소는 가장 흔하게 관찰되는 ESBL로서, 5가지 주요 패밀리로 하위분류된다. CTX-M 효소는 페니실린 및 제1, 제2 및 제3 세대 세팔로스포린을 비롯해서 기질 범위가 광범위하다(Bonnet, R. 2004, Antimicrob Agents Chemother. 48: 1-14).
클래스 A 베타-락타마아제(TEM, SHV, CTX-M, 바실러스 속 베타-락타마아제) 간에 서열 유사성은 중간 정도이지만, 모든 세린 베타-락타마아제의 결정 구조는 유사성이 특히 높다(Matagne et al., 1998, Biochem J 330: 581-598; Tranier S. et al., 2000, J Biol Chem, 275: 28075-28082; Santillana E. et al., 2007, Proc Natl Acad Sci. USA, 104: 5354-5359). 효소는 2개의 도메인으로 구성되어 있다. 한 도메인은 3개의 알파 나선에 대하여 5가닥의 베타 시트가 충전되어 있는 반면, 알파 도메인인 제2 도메인은 8개의 알파 나선으로 구성되어 있다. 활성 부위 포켓은 이러한 두 도메인 사이의 계면 부분이고, 오메가 루프에 의해 제한되어 있다. 오메가 루프는 모든 클래스 A 베타-락타마아제의 보존적 구조 요소로서, 촉매 반응에 본질적으로 관여한다(도 1).
촉매작용 또는 기질 인식과 관련이 있는 여러 보존적 펩타이드 서열(요소)은 클래스 A 베타-락타마아제에서 동정되었다. 제1 보존적 요소 70-Ser-X-X-Lys-73(앰블러 분류)은 알파 나선2의 위치 70에 활성 세린 잔기 및 위치 73에 리신을 포함한다. 제2 보존적 요소는 알파 도메인(앰블러 분류에 따른 130 내지 132 사이의 위치)에 있는 SXN 루프이며, 이곳은 촉매 공동의 한 면을 형성한다. 제3 보존 요소(앰블러 분류에 따라 234 내지 236 사이의 위치)는 베타-시트3의 가장 내부에 존재하고 촉매 공동의 다른 면을 형성한다. 제3 보존 요소는 보통 KTG이다. 하지만, 일부 예외적인 경우에, 리신(K)은 히스티딘(H) 또는 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고, 여러 베타-락타마아제에서는 트리오닌(T)이 세린(S)으로 치환될 수 있다(Matagne et al., 1998. Biochem J 330: 581-598).
베타-락타마아제를 매개로 한 베타-락탐에 대한 내성은 최근 수십년 동안 베타-락탐의 광대한 사용으로 인해 병원균 및 공생 미생물총 중에 널리 분포되어 있다. 실제, 항생제 내성은 사람 및 수의용 의약에서 잘 알려진 임상 문제로, 그램 양성균 및 그램음성균 유래의 수백 가지 다른 베타-락타마아제가 정제되어 과학 문헌에서 특성규명되어 있다. 항미생물제의 사용은 줄지 않고 있고 게다가 항미생물 내성은 일상생활의 일부가 되었기 때문에, 이러한 의학 문제를 해결하기 위한 새로운 접근법은 변함없이 절실히 필요로 되고 있다.
사람의 장 미생물총(microbiota)은 예컨대 면역 반응계를 자극하여, 식품의 소화를 도와서, 그리고 잠재적 병원균의 과다증식을 방지하여, 사람 건강에 중요한 역할을 하는 복잡한 세균 집단이다. 항미생물제, 예컨대 베타-락탐은 정상 미생물총에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 정상 장 미생물총의 변화를 촉진하는 항미생물제의 효능은 투약량, 투여 경로 및 약력학/약동학 및 항생제 성질을 비롯한 여러 요인과 관련이 있다(Sullivan A. et al., 2001, Lancet 1: 101-114). 장 미생물총은 항생제 치료가 끝난 후 정상으로 회귀하는 경향이 있지만, 선택된 내성의 공생균의 장기 지속성도 보고되어 있다(Sjolund M. et al., 2003, Ann Intern Med. 139: 483-487). 이러한 지속성과 항생제 내성 유전자의 교환은 공생 미생물총을 항생제 내성 유전자의 추정 저장소로 만든다.
앰피실린, 세프트리악손, 세포페라존 및 피페라실린과 같은 특정한 비경구 투여된 베타-락탐은 부분적으로 담즙 분비를 통해 소장의 근접부(십이지장)로 제거된다. 장관에 남은 비흡수된 베타-락탐은 정상 장 미생물총의 생태학적 균형에 바람직하지 않은 효과를 유발하여 항생제-관련 설사, 반코마이산 내성 장구균(VRE), 연장된 베타-락타마아제 생산성 그램-음성 바실러스(ESBL), 클로스트리듐 디피실 및 진균과 같은 병원균의 과도증식 및 정상 장 미생물총과 잠재적 병원균 간에 항생제 내성 균주 선택을 초래할 수 있다.
베타-락타마아제의 치료 목적은 위장관(GIT)에서 흡수되지 않은 항생제를 불활성화시켜, 정상 장 미생물총을 유지하고 잠재적 병원성 미생물과 함께 과도증식을 방지하는 것이다(WO 93/13795).
GIT 표적 치료에 적합한 베타-락타마아제 약물 제품에는 3가지 이상의 필요 조건이 있다. 제1 조건은 GIT에 일반적인 조건 하에 효소 활성을 보존하는 것이다. 다양한 선으로부터 GIT로 분비되는 다양한 프로테아제에 의한 단백분해적 붕괴에 대한 내성은 베타-락타마아제 요법의 실현가능성을 위한 전형적인 전제조건이다. 또 다른 중요한 고려사항은 소장의 여러 구획에서 우세한 pH 값 범위이다. 이러한 pH 값은 보통 5(십이지장)와 7.5(회장) 사이에서 달라진다. 따라서, 의도한 치료 목적에 후보로서 부합하기 위해, 베타-락타마아제는 pH 범위 5 내지 7.5에서 높은 효소 활성을 나타내야 할 필요가 있다.
베타-락타마아제 또는 이의 산물의 제2 조건은 베타-락탐을 효율적으로 가수분해하는 것이다. 항생제 치료 기간 동안 소장 유즙에 존재하는 베타-락탐 항생제 농도는 대부분 담즙 분비를 통한 특정 베타-락탐의 제거와 관련이 있다. 적당한 베타-락타마아제는 하위 GIT 베타-락탐 농도를 장 미생물총의 변경을 유발하는 수준 이하로 효과적으로 가수분해할 수 있는 동역학 파라미터를 가질 필요가 있다. 동역학 파라미터의 이상적인 세트는 미하엘리스 상수 KM의 낮은 수치 값과 최대 반응 속도 Vmax의 높은 수치 값으로 이루어진다. 높은 Vmax 값은 충분한 붕괴능 정도를 제공하는데 필요한 반면, 낮은 KM 값은 낮은 기질 농도에서 베타-락탐 분해 활성을 확보하는데 필요하다.
베타-락타마아제 또는 이의 산물의 제3 조건은 약제학적 조성물 제조 시에, 비교적 고온과 같은 조건을 견디는 것이다. 더욱이, 생산 공정에서, 수성 부형제 및 약물 재료의 혼합 분산은 적당한 pH에서 고도 용해성을 필요로 한다.
Ipsat P1A라 불리는 효소 요법은 위 내에서 β-락탐 항생제의 부작용을 방지하기 위해 개발되고 있다. Ipsat P1A 전달계는 비경구 제공된 페니실린 그룹 베타-락탐(예, 페니실린, 아목시실린, 앰피실린 및 피페라실린)을 담즙계를 통해 분비된 베타-락타마아제 억제제(예, 타조박탐, 설박탐, 클라불란산)를 이용하거나 이용함이 없이 불활성화시키도록 설계되었다(WO 2008065247; Tarkkanen, A.M. et al., 2009, Antimicrob Agents Chemother. 53: 2455-2462). P1A 효소는 클래스 A에 속하고 기능적 분류에서 서브그룹 2a로 그룹화되는 바실러스 리체니포미스 749/C 작은 엑소 베타-락타마아제의 재조합 형태이다(WO 2008065247). B. 리체니포미스 베타-락타마아제 및 이의 P1A 파생체는 예컨대 페니실린, 앰피실린, 아목시실린 또는 피페라실린을 분해하는 높은 가수분해능이 있는 페니실리나제로 생각되며(표 1), 일반적으로 활성 부위-지향성 베타-락타마아제 억제제, 예컨대 클라불란산, 설박탐 또는 타조박탐에 의해 억제된다(Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother 39: 1211-1233).
하지만, P1A 효소는 세팔로스포린 또는 카바페넴 그룹에 속하는 베타-락탐 항생제를 불활성화시키는 능력이 매우 제한적이다. 사용된 베타-락타마아제는 세팔로스포린에 대한 활성이 불량하기 때문에, 소장관에 흡수되지 않은 베타-락탐을 불활성화시키기 위해 비경구 세팔로스포린 요법과 함께 이용될 수 없다.
따라서, 금속-베타-락타마아제에서 관찰되는 바와 같이 기질 프로필이 확대된 신규 베타-락타마아제 또는 P1A 파생체는 꼭 필요하다.
본 발명은 P1A 베타-락타마아제의 신규한 유전적으로 조정된(genetically tailored) 파생체, 및 나아가 베타-락타마아제를 변형 및 생산하는 신규 방법을 제공한다.
본 발명의 P1A 베타-락타마아제의 신규 재조합 파생체(derivate)는 적당한 베타-락타마아제에 필요한 전술한 3가지 요건(즉, 효소 활성을 보존하는 능력, 베타-락탐을 효율적으로 가수분해하는 능력 및 약제학적 조성물의 제조 조건을 견디는 능력)을 충족시키고, 나아가 확대된 기질 프로필을 나타낸다. 또한, 본 발명의 베타-락타마아제는 소장관에서 담즙 제거된 베타-락탐을 불활성화시키기 위한 비경구 세팔로스포린 요법과 함께 사용될 수도 있다.
본 발명은 신규 Ipsat P3A 약제학적 단백질(P1A의 D276N 치환 파생체)의 예비 임상전 연구를 강조하며 단일 약물 용량을 제시한다.
본 발명은 베타-락타마아제를 변형시키고 이를 생산하는 빠르고 효과적인 방법을 가능하게 한다. 나아가, 본 발명에 따라 더욱 효과적이고 특별한 치료가 가능해진다.
본 발명의 효소는 다양한 그룹의 베타-락탐 항생제에 의해 유도된 부작용을 치료하거나 예방하기 위한 약물의 대량 제조에 적합한다.
본 발명의 목적은 신규 베타-락타마아제, 특히 비.리체니포미스의 베타-락타마아제를 제공하고, 이 베타-락타마아제와 관련된 산물, 방법 및 용도를 제공하는 것이다. 또한, 약제 산업을 더욱 발달시키기 위한 도구도 본 발명에 의해 제시된다.
본 발명은 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성이 있고 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 친수성 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열 또는 이의 변형체 또는 단편을 포함하는 베타-락타마아제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 베타-락타마아제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성이 있고 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산이 친수성 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제를 변형시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 베타-락타마아제를 생산하는 방법으로서,
i) 본 발명의 베타-락타마아제를 암호화하는 유전자를 제공하는 단계;
ii) 이 유전자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
iii) 베타-락타마아제를 생산하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
iv) 베타-락타마아제를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 베타-락타마아제를 베타-락탐 항생제와 동시에 또는 연속해서 피검체(subject)에게 투여하여 위장관에서의 베타-락탐 항생제 유도성 부작용을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용되는 베타-락타마아제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 위장관에서의 베타-락탐 항생제 유도 부작용을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 사용되는 베타-락타마아제의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 4 중 어느 하나의 서열 또는 이의 축퇴물(degenerate)을 포함하거나, 또는 본 발명의 베타-락타마아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
도 1은 바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제(PenP의 작은 엑소 형태)의 3D 구조를 도시한 것이다. R-244 및 D-278의 보존적 아미노산 잔기와 측쇄 잔기가 표시되어 있다. 이 도면은 MolSof-Browser 프로그램을 사용하여 만들어졌다.
도 2는 바실러스 리체니포미스(P1A 파생체)의 D276N 베타-락타마아제 유전자의 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 이 아미노산 서열은 서열번호 3에 해당하고, 여기서 Xaa는 아스파라긴(Asn)이다. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 해당하고, 여기서 뉴클레오타이드 3중자 nnn은 aat이다. 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 pKTH141 분비 벡터에서 유래된 amyQ 유전자의 31개 아미노산 롱 시그널 서열(밑줄친 부분)을 보유하는 299개 아미노산 폴리펩타이드를 암호화한다(WO 2008/065247). 예상된 시그널 펩티다제 절단 부위는 위치 -1에 있는 알라닌(A) 다음이다. NH2 - QAS 연장부를 암호화하는 HindIII 클로닝 부위는 진하게 표시되어 있다. 성숙 D276N 돌연변이 효소는 +1 위치에 있는 글루타민(Q)부터 시작한다. 따라서, 성숙 D276N 돌연변이 베타-락타마아제는 HindIII에 의해 암호화된 NH2-QAS를 비롯해서 268개 아미노산 잔기를 포함한다. 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 단일 아미노산 치환은 앰블러 분류계에서 위치 276에 해당하고 서열번호 3의 아미노산 위치 249에 해당하는 위치 280에 위치한다(진한 글자로 표시).
정제된 D276N 돌연변이 효소의 NH2-말단 서열은 자동 에드만 분해로 단백질 서열분석기에서 측정했다. 분석 결과, D276N 돌연변이 효소는 이의 모체인 P1A 효소와 유사한 방식으로 추론된 아민 말단에서 NH2-QASKT-펜타펩타이드가 없는 것으로 증명되었다(WO 2008/065247). 본 출원의 실시예 4와 6에서 사용된 정제된 D276N 돌연변이 효소의 주요 분획은 위치 +6에서 글루탐산부터 시작하고 분자량이 29272인 263개 아미노산 잔기로 구성되어 있다.
도 3은 바실러스 리체니포미스에서 유래된 P1A의 D276R 치환된 베타-락타마아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 추론된 아미노산 서열을 보여준다. 이 아미노산 서열은 서열번호 3의 서열에 해당하고, 여기서 Xaa는 아르기닌(Arg)이다. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 서열에 해당하고; 이때 뉴클레오타이드 삼중자 nnn은 cgc이다.
도 4는 세프트리악손(체중 kg당 세프트리악손 30mg)을 정맥내 투여한 후 비글(n=5)의 공장 미즙(jejunal chyme)에 존재하는 세프트리악손의 농도에 대한 경구 투여된 장용 코팅된 D276N 치환된 베타-락타마아제(P3A) 펠릿의 효과를 보여준다(검은 사각형). 베타-락타마아제 펠릿은 세프트리악손 주사 10분 전에 투약했다. 검은 마름모는 베타-락타마아제 처리 없이 세프트리악손의 1회 용량(i.v.) 후 얻어지는 공장의 세프트리악손 농도를 나타낸다.
베타-락타마아제는 장의 정상 미생물총의 변경 및 베타-락탐 내성균의 과도증식을 비롯한 베타-락탐 유도 부작용을 방지하기 위해 위장관 중의 비흡수된 베타-락탐을 불활성화시키는데 사용되고 있다(WO 9313795, WO 2008065247, WO 2007147945). 이제 본 발명은 놀랍게 변경된 기질 프로필을 보여주는 바실러스 리체니포미스의 변형된 베타-락타마아제를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 베타-락타마아제는 베타-락탐을 가수분해하는 효소를 의미한다. 베타-락탐 고리의 아미드 결합의 가수분해는 항미생물제를 생물학적 불활성화시킨다. 본원에 사용된, 클래스 A 베타-락타마아제(앰블러 분류)는 베타-락탐의 가수분해가 보통 알파 나선2의 아미노산 위치 70에 있는 활성 부위 중의 세린에 의해 매개되는 세린 베타-락타마아제를 의미한다. 클래스 A 베타-락타마아제는 Len-1, SHV-1, TEM-1, PSE-3/PSE-3, ROB-1, 바실러스 세레우스, 예컨대 5/B 타입 1, 569/H 타입 1 및 569/H 타입 3, 바실러스 안트라시스 종, 바실러스 리체니포미스, 예컨대 PenP, 바실러스 웨이헨스테파넨시스, 바실러스 클라우시, 스타필로코커스 아우레우스, PC1, Sme-1, NmcA, IMI-, PER-, VEB-, GES-, KPC-, CME- 및 CTX-M 타입 베타-락타마아제를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 서열 동일성
본 발명의 돌연변이 베타-락타마아제(D276X, P1A 파생체)의 아미노산 서열은 서열번호 1과 서열번호 3에 제시된다. 이에 대응하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 서열번호 4에 제시된다. 서열번호 1은 베타-락타마아제의 2차 구조의 형성을 담당하는 아미노산 서열을 제시한다. 서열번호 3은 31개 아미노산 롱 시그널 서열을 비롯한 단백질의 아미노산 서열 전 길이를 나타낸다.
본 발명의 베타-락타마아제는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 또는 100% 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 양태에 따르면, 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8, 99.9 또는 100% 동일성이 있다.
본 발명의 바람직한 한 양태에 따르면, 본 발명의 베타-락타마아제는 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 베타-락타마아제는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 60% 이상의 서열 동일성이 있다.
본 발명의 한 양태에서, 서열번호 1과 앞서 언급한 임의의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제는 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열 번호 1의 위치에 아르기닌(R), 히스티딘(H), 리신(K), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 친수성 아미노산을 보유한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 보유한다. 본 발명의 한 양태에서, 베타-락타마아제는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열로서, 이때 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치의 친수성 아미노산 잔기(서열번호 1 또는 3에서 Xaa로 표시된 것)가 아르기닌(R, Arg)인 서열을 보유한다. 본 발명의 다른 양태에서, 베타-락타마아제는 서열번호 1 또는 3에 제시된 서열로서, 이때 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치의 친수성 아미노산 잔기(서열번호 1 또는 서열번호 3에서 Xaa로 표시된 것)가 아스파라긴(N, Asn)인 서열을 보유한다.
본 발명의 서열과 임의의 서열의 동일성은 본 발명의 전체 서열과의 동일성을 의미한다. 서열 동일성은 임의의 통상적인 생물정보학적 방법, 예컨대 BLAST(Basic Local Alignment Search Tools) 또는 FASTA(FAST-AII)를 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 신규 베타-락타마아제의 임의의 변형체 또는 단편에 관한 것이다. 본원에 사용된, 베타-락타마아제의 단편 또는 변형체는 생물학적 기능, 즉 효소적 활성이 있는 임의의 부분 또는 변형체를 의미한다. 변형체는 펩타이드 서열에 작은 변경, 예컨대 돌연변이, 작은 결실 또는 삽입이 있는 펩타이드를 의미한다. 단편 및 변형체는 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치에 친수성 아미노산을 포함해야 한다. 친수성 아미노산은 일반적으로 아스파르트산(D)이 아닌 다른 아미노산이다.
베타-락타마아제에는 서열번호 3으로부터 수득될 수 있고 세포 외로 분비되는 다양한 짧은 형태가 있다. 이 형태는 엑소폼(exoform)이라 불린다. 이 엑소폼은 세포벽이나 배양 배지에 존재하는 프로테아제의 가수분해 활성의 결과이다.
본원에 사용된 D276X, D276N, D276R, 돌연변이 형태, P1A 파생체 또는 P3A는 서열번호 3의 임의의 베타-락타마아제 활성 단편 및/또는 변형체 또는 분명하게 제시된 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 변형체를 포함한다. 특히, 본 발명의 베타-락타마아제는 아미노말단이 절두되었음을 의미하는 NH2-절두형이다. NH2-절두 외에도, 베타-락타마아제 활성을 갖고 있는 한, 하나 이상의 추가 아미노산 결실, 치환 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 이 변형은 자연 발생의 변형 또는 돌연변이체일 수 있고, 유전자 기술 등에 의해 도입된 인공 변형일 수도 있다.
다르게 아미노말단 절두된 엑소폼이 비.리체니포미스의 성장 배지에서 발견되었다. 이러한 엑소폼도 본원에 포함된다. 마타인(Matagne) 등은 천연 숙주 비.리체니포미스 749/C에 의해 생산된 세포외 형태들에 다양한 정도의 미세불균일에 대해 설명한 바 있다(Matagne A. et al., 1991, Biochem J. 273: 503-510). 다음과 같은 N-말단 아미노산 잔기가 다른 5가지 다른 분비형 엑소폼이 식별되었다:
Figure pct00001
처음 아미노산 잔기는 진하게 표시했다. C-말단 아미노산 잔기는 오른쪽에 제시된다. 세린(S)으로 시작하는 엑소폼은 비. 리체니포미스 베타-락타마아제의 "대(大) 분비형"이라 부르고, 리신(K)으로 시작하는 엑소폼은 "소(小) 분비형"이라 부른다.
제1 알파 나선(α1-나선)은 아스파르트산(D)(이탤릭체로 표시)에서 시작하고, 마지막 알파 나선(α11-나선)의 마지막은 아스파라긴(N)(이탤릭체로 표시)으로 끝난다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 베타-락타마아제는 서열번호 1의 아미노산 1-258 또는 서열번호 3의 아미노산 7-264를 최소한 포함하는데, 이들은 단백질의 2차 구조에 참여한다(Knox J.R. et al., 1991. J. Mol Biol. 220: 435-455). 본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 상기 아미노산 1-258 또는 서열번호 3의 아미노산 7-264 중 하나 이상이 결실되거나 치환되었다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 베타-락타마아제의 아미노 말단은 NH2-KTEMKDD(서열번호 3의 아미노산 4 내지 10)로 시작한다. 이러한 소위 ES-베타L 엑소폼은 추가로 제브하드(Gebhard) 등(Gebhard L.G. et al., 2006, J. Mol. Biol. 21: 358(1) 280-288)에 기술된 바와 같이 최고 21개의 인접 잔기가 없을 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 아미노 말단은 서열번호 3의 글루탐산(E)으로 시작하고, 특히 NH2-EMKDD(서열번호 3의 아미노산 6-10)로 시작하거나, 또는 대안적으로 NH2-MKDD(서열번호 3의 아미노산 7-10 또는 서열번호 1의 아미노산 1-4)로 시작한다.
베타-락타마아제의 아미노 말단 서열에 있는 가변 영역에는 다양한 베타 락타마아제 형태의 효소적 파라미터의 항상성을 설명하는 고정(rigid) 구조가 없다.
베타-락타마아제의 카르복시 말단에 있는 4개의 마지막 아미노산, MNGK-COOH(서열번호 3의 아미노산 265-268)는 2차 구조의 일부가 아니며, 따라서 활성 상실 없이 결실될 수도 있다. 다른 양태에 따르면, 최고 9개의 C-말단 아미노산이 결실될 수 있다. 단백질의 C-절두형은 산토스(Santos) 등(Santos J. et al., 2004. Biochemistry 43: 1715-1723)에 의해 기술된 바 있다.
전술한 베타-락타마아제의 여러 형태는 베타-락타마아제 활성이 있는 단백질의 다른 형태와 함께 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 4 중 어느 하나 또는 이의 축퇴물의 서열을 포함하거나 보유할 수 있다. 서열번호 2 또는 서열번호 4 중 어느 하나에 제시된 서열의 축퇴물인 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 4와 비교했을 때 하나 이상의 다른 뉴클레오타이드를 보유하되, 동일한 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 바람직하게는, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 삼중자 nnn은 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 N 또는 R을 암호화한다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 서열과 같은 뉴클레오타이드 서열이고, 단일가닥 또는 이중가닥 폴리핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드란 용어는 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 적어도 30, 35, 40, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8 또는 99.9% 동일성이 있다.
본 발명의 하나의 구체적 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는다.
클래스 A 베타- 락타마아제의 위치 276( 앰블러 )에 있는 아미노산
아미노산 위치 276의 아스파라긴(Asn, N)은 매우 다양한 클래스 A 베타-락타마아제에 존재한다. Asn276의 기능은 Asn276이 아르기닌(Arg, R) 244의 구아니듐 기와 수소 결합을 형성하여 Arg244 측쇄의 이동성을 제한하는 TEM 및 SHV 베타-락타마아제에서 집중적으로 연구되었다.
TEM 또는 SHV 효소에서 아스파라긴(Asn, N)의 치환은 클라불란산 설박탐 또는 타조박탐과 같은 세린 베타-락타마아제 억제제들에 대한 내성에 기여하는 하나의 주요 공헌자로 인식되었다. TEM-1 베타-락타마아제의 N276D(Asp) 치환 변형체는 억제제 내성 베타-락타마아제(IRT 효소, 예컨대 TEM-35 및 TEM-36)에 존재한다. N276D 변형체는 야생형 TEM-1 효소보다 클라불란산 및 타조박탐에 더 내성이 있으나, 동시에 다양한 페니실린에 대한 N276D 변형체의 촉매 효율(kcat/Km)은 TEM-1 야생형 효소 효율의 50% 미만이다. N276D 변형체의 세팔로스포린에 대한 촉매 효율은 야생형 TEM-1에 비해 감소된다(Saves I et al., 1995, J Biol Chem. 270: 18240-18245).
TEM-1과 유사하게, SHV-1 또는 SHV-5 베타-락타마아제에서의 N276D 치환은 세린 베타-락타마아제 억제제에 대한 내성을 향상시키지만, 대부분의 베타-락탐에 대한 가수분해 효율은 감소시킨다(Giakkoupi P. et al., 1999, J Antimicrobiol Chemother, 43: 23-29). 또한, SHV-1 또는 SHV-5 효소에서 N276D 치환은 "제4 세대" 세팔로스포린 세프피롬 및 세페핌을 분해하는 능력을 적당히 향상시킨다.
SHV 타입 베타-락타마아제 OHIO-1에서, N276G(Gly) 돌연변이체는 클라불란산에 매우 내성이 있는 것으로 밝혀져 있는 반면, TEM-1 유래 N276G 돌연변이체는 클라불란산에 대해 중간 정도의 내성만을 보유한다(Bonomo RA et al., 1995, Biochim Biophys Acta. 1247: 121-125).
CTX-M 효소 계열에서, 아르기닌(Arg, R)은 일반적으로 위치 276에 존재하고(Bonnet R., 2004, Antimicrob Agents Chemother, 48: 1-14), Arg276의 돌연변이는 효소 활성의 연장에 영향을 미친다. CTX-M 효소의 세포탁심에 대한 상대적 가수분해 속도는 Arg276의 치환에 의해 적당히 감소된다. 또한, Arg276Trp, Arg276Cys, Arg276Ser 및 Arg276Gly CTX-M 돌연변이체 효소는 베타-락타마아제 억제제 내성 수준에 영향을 미치지 않는다(Bonnet R., 2004, Antimicrob Agents Chemother, 48: 1-14; Perez-Llarena F.J. et al., 2008, J Antimicrobiol Chemother, 61: 792-797).
클래스 A 베타-락타마아제 중에서 위치 276(앰블러 분류)에 위치한 아미노산 잔기(Matagne A et al., 1998, Biochem J 330: 581-598; Tranier S. et al., 2000, J Biol Chem, 275: 28075-28082)
전형적인 베타-락타마아제 위치 276에 전형적인 아미노산 잔기
Len-1, SHV-1, TEM-1, PSE-3/PSE-3, ROB-1
바실러스 세레우스 5/B 타입 1
바실러스 세레우스 569/H 타입 1
바실러스 안트라시스 종		 Asn(N)
바실러스 리체니포미스 PenP 베타-락타마아제
바실러스 세레우스 569/H 타입 3 베타-락타마아제
바실러스 웨이헨스테파넨시스 베타-락타마아제
바실러스 클라우시 베타. 락타마아제
스타필로코커스 아우레우스 PC1 베타-락타마아제
Sme-1 NmcA IMI-1 베타-락타마아제 		Asp(D)
CTX-M 효소 Arg(R)
PER-1, VEB-1, CME-1 베타-락타마아제 Glu(E)
이제 본 발명에서 서열번호 1(바실러스 리체니포미스 PenP 파생체, 즉 P1A 파생체)과 60% 이상의 서열 동일성이 있고 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 친수성 아미노산 서열이 있는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제는 베타-락탐에 대한 향상된 촉매 효과뿐 아니라 확대된 베타-락탐 스펙트럼을 나타낸다.
이전에, 세린 베타-락타마아제 억제제에 대한 내성 또는 다양한 베타-락탐에 대한 촉매 성질에서, 위치 276의 아스파르트산(D)의 아미노산 치환 역할은 바실러스 종 베타-락타마아제, 구체적으로, 비. 리체니포미스 베타-락타마아제 중에서 연구된 적이 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 앰블러 분류에 따른 아미노산 잔기 276은 서열번호 1에서의 아미노산 위치 243 및 서열번호 3에서의 아미노산 위치 249에 해당한다.
일반적으로, 본 발명의 베타-락타마아제는 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치에 아스파르트산(D)이 아닌 다른 친수성 아미노산을 보유한다. 아미노산은 측쇄의 화학적 성질 및/또는 구조적 성질을 기반으로 하여 분류한다. 아미노산 분류 그룹은 다음과 같은 그룹으로 나뉘는 친수성 아미노산, 즉 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산; 극성 및 중성 하전을 띤 친수성 아미노산; 극성 및 음하전을 띤 친수성 아미노산; 방향족, 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산을 포함한다. 본원에 사용된 "친수성 아미노산"은 전술한 모든 그룹의 친수성 아미노산을 포함하고, 즉 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산, 극성 및 중성 하전을 띤 친수성 아미노산, 극성 및 음하전을 띤 친수성 아미노산 및/또는 방향족, 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산을 의미한다 (http://www.biomed.curtin.edu.au/biochem/tutorials/AAs/AA.html). "극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산"은 아르기닌(R) 또는 리신(K)을 의미한다. "극성 및 중선 하전을 띤 친수성 아미노산"은 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 또는 트레오닌(T)을 의미한다. "극성 및 음하전을 띤 친수성 아미노산"은 아스파테이트(D) 또는 글루타메이트(E)를 의미한다. "방향족, 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산"은 히스티딘(H)을 의미한다.
본 발명의 한 양태에서, 친수성 아미노산은 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에서 아르기닌(R), 히스티딘(H), 리신(K), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 중성 또는 양하전을 띤 아미노산이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 베타-락타마아제의 친수성 아미노산은 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 리신(K)으로 이루어진 그룹의 극성 및 양하전을 띤 친수성 아미노산 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 친수성 아미노산은 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 그룹의 극성 및 중성 하전을 띤 친수성 아미노산 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산은 아스파라긴이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 친수성 아미노산은 알파 나선에 위치한다. 알파 나선은 코일형 입체구조를 닮은 단백질 2차 구조의 모티브이다. 알파 나선은 DNA 결합 모티브에 특별한 유효성이 있을 수 있다(예컨대, 나선-턴-나선, 류신 지퍼 및 아연 핑거 모티브). 본 발명의 바람직한 양태에서, 아미노산 잔기 276은 마지막 알파 나선11에 위치한다(도 1). 이 알파 나선11은 클래스 A 베타-락타마아제 중에서 보존적인 것은 아니다.
클래스 A 베타- 락타마아제의 특이적 특징
클래스 A 베타-락타마아제의 한가지 특이적 특징은 Arg278의 구아니디늄 기(guanidinium group)이다. CTX-M 효소는 3차원 구조의 동등한 위치에 있는 Arg278, Arg244 또는 Arg220을 보유한다. 위치 220 또는 244에 있는 아르기닌은 TEM-1(Leu220 및 Arg244) 및 스트렙토코커스 알버스 G 베타-락타마아제(Arg220 및 Asn244)의 촉매적 성질에 필수적인 것으로 보인다. 아르기닌 244 또는 아르기닌 220의 염기성 구아니디늄 기는 베타-락탐의 결합 또는 클라불란산과 같은 "자살" 억제제의 불활성화 화학에 기여하는 것으로 제안되어 있다(Matagne et al., 1998, Biochem J. 330: 582-598; Perez-Llarena et al., 2008, J Antimicrobiol Chemother. 61: 792-797). 비. 리체니포미스 PenP에서, Arg-244 잔기는 아스파르트산 276과 염 결합을 형성한다(Herzberg, O. 1991, J Mol Biol. 217: 701-719; Knox, J.R., and P.C. Moews, 1991, J Mol Biol 220: 435-555).
본 발명의 바람직한 양태에서, 베타-락타마아제는 추가로 앰블러 분류에 따른 Leu220 및 Arg244(각각 서열번호 1의 Leu189 및 Arg212에 해당)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산을 하나 이상 포함한다.
바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제( PenP , P1A )
본 발명의 베타-락타마아제는 바실러스 리체니포미스 749/C 균주에서 유래된 것이다. 비.리체니포미스 749/C 베타-락타마아제(PenP; 페니실린 아미도-베타-락탐하이드롤라제, EC3.5.2.6)는 클래스 A 베타-락타마아제의 기능적 분류에서 서브그룹 2a에 속한다(Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother 39: 1211-1233). 비. 리체니포미스 베타-락타마아제는 예컨대 페니실린, 앰피실린, 아목시실린 또는 피페라실린을 분해하는 높은 가수분해능이 있는 페니실리나제로 생각될 수 있고, 일반적으로 클라불란산, 설박탐 또는 타조박탐과 같은 활성 부위 지시성 베타-락타마아제 억제제에 의해 억제된다(Bush K. et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother. 39: 1211-1233).
바실러스 리체니포미스 749/C 베타-락타마아제는 307개 아미노산 잔기의 전구단백질(preprotein)로 표현된다. 이의 26개 아미노산 잔기 롱 시그널 서열이 전위 및 제거된 후, 아미노말단 시스테인(C27)이 디아실글리세라이드와 티오에테르 결합을 형성하는 막-고착된 지단백질이 된다. 비. 리체니포미스 베타-락타마아제는 또한 지단백질 형태의 단백분해 산물인 분비된(세포외) 형태로도 발견된다(Izui K. et al., 1980, Biochemistry 19: 1882-1886l Matagne A. et al., 1991, Biochem J. 273: 503-510). 아미노산 잔기 43-307의 작은 분비형(작은 엑소형; P1A)을 암호화하는 바실러스 리체니포미스 749/C 베타-락타마아제 유전자 영역은 숙주-벡터 바실러스 서브틸리스 생산계의 맞춤제작을 위한 DNA 단편으로서 선택되었다(WO 2008065247).
기능
베타-락타마아제는 페니실린, 세팔로스폴니, 클라밤(또는 옥사페남), 세파마이신 및 카르바페넴과 같은 베타-락탐 고리를 포함하는 베타-락탐 항생제를 가수분해한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 베타-락타마아제는 페니실린 및/또는 세팔로스포린을 가수분해한다. "페니실린"은 페니실륨에서 기원하는 페니실린의 여러 천연 또는 반합성 변형체를 의미한다. 페니실린은 아목시실린, 앰피실린, 아즐로실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 헤타실린, 옥사실린, 메즐로실린, 페니실린 G, 페니실린 V 및 피페라실린을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
세팔로스포린에서, 베타-락탐 고리는 페니실린에서 발견되는 5원 티아졸리딘 고리보다는 6원의 디하이드로티아진 고리에 융합된다. 생물학적 활성에 기초하여, 세팔로스포린은 6 세대로 분류되지만, 일부 세팔로스포린은 특정 세대로 그룹화되지 않았다. 본 발명의 구체적 한 양태에 따르면, 베타-락타마아제는 야생형 베타-락타마아제에 비해 세팔로스포린에 대한 향상된 촉매 효율을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 앰블러 분류에 따라 넘버링 시 위치 276에 있는 아스파르트산(Asp, D)이 아스파라긴(N) 또는 아르기닌(R)과 같은 친수성 아미노산 잔기로 치환된 바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제는 세팔로스포린과 같은 베타-락탐 항생제에 확대된 활성을 나타낸다.
본 발명의 한 양태에서, 세팔로스포린은 세포페라존, 세프트리악손 및 세파졸린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 베타-락타마아제의 촉매 효율은 베타-락탐 항생제를 가수분해하는 능력을 의미한다. 향상된 촉매 효율은 임의의 생물학적 샘플 또는 피검체로부터 임의의 통상적인 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법으로 측정할 수 있다.
베타- 락타마아제를 생산 및 변형시키는 방법
본 발명의 베타-락타마아제는 효소를 유전자 공학의 임의의 통상적인 방법으로 변형시켜 생산할 수 있다. 이성적 설계(rational design), 랜덤 돌연변이유발, DNA 셔플링(랜덤 재조합), 파지 디스플레이, 전체-게놈 셔플링, 이형이중가닥법(heteroduplex), 설계된 올리고뉴클레오타이드의 일시적 주형 조립에 대한 랜덤 돌연변이유발법, 돌연변이성 및 일방향성 재조립법, 엑손 셔플링, Y-결찰-기반 블록 셔플링, 비상동성 재조합, 지향적 진화와 복합된 이성적 설계와 같은 방법이 생산에 활용될 수 있다. 또한, 돌연변이 효소는 부위 지시성 돌연변이유발을 이용하고 오버랩 연장 기술에 의한 스플라이싱을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 베타-락타마아제를 변형시키는 방법은 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환하여 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제를 변형시키는 단계를 포함한다. 친수성 아미노산은 임의의 친수성 아미노산, 예컨대 아르기닌(R), 히스티딘(H), 리신(K), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 비친수성 아미노산은 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에서 친수성 아미노산으로 치환된다.
또한, 본 발명의 베타-락타마아제는 예컨대 합성법, 예컨대 펩타이드 합성 또는 숙주 세포에서의 재조합 생산에 의해 생산할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 효소는 재조합 효소이다. 본원에 사용된, "재조합" 유전자 물질은 일반적으로 유전자 물질, 예컨대 다양한 기원의 DNA 가닥의 조합인 물질을 의미하고, 서열을 조합하거나 삽입하여 생산하고 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 임의의 내인성 또는 외인성 조절인자, 예컨대 프로모터의 조절 하에 삽입될 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 DNA에서 유래된다.
당해의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 단편 중 적어도 하나는 세포에서 분리되거나 또는 합성 생산될 수 있다. 이 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 단편은 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 임의의 펩타이드를 생산하기에 적당한 숙주 세포는 임의의 진핵생물 또는 원핵생물의 세포, 바람직하게는 세균, 가장 바람직하게는 바실러스 속 균주, 예컨대 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 푸밀리스 또는 바실러스 아밀로리쿼페이션스일 수 있다.
본원에 사용된, "형질전환"은 이종 유전자 물질, 바람직하게는 DNA에 의한 세포의 유전자 변경을 의미하는 것으로, 결과적으로 상기 유전자 물질의 발현을 초래한다. 이종 유전자 물질은 그대로 도입될 수도 있고, 또는 벡터, 플라스미드 등과 같은 임의의 다른 유전자 물질에 혼입된 상태로 도입될 수도 있다. 임의의 유전자 조작법 또는 임의의 분자 클로닝법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 이종 물질을 진핵생물 세포로 도입시키는 방법에는 다양한 방법이 있다. 중합체(예, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 리포좀 및 나노입자(예, 금)와 같은 물질은 형질전환의 운반체로서 사용되고 있다. 유전자 물질은 또한 예컨대 바이러스 또는 벡터를 운반체로서 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다. 이종 물질을 세포 내로 도입시키는 다른 방법으로는 뉴클레오펙션(nucleofection), 일렉트로포레이션(electroporation), 접합(conjugation), 형질감염(transfection), 소노포레이션(sonoporation), 열충격 및 마그네토펙션(magnetofection)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
숙주 세포가 적당한 조건에서 본 발명의 펩타이드를 생산한 후, 펩타이드는 예컨대 세포로부터 정제할 수 있고, 또는 분비형 펩타이드를 예컨대 배양 배지에서 회수할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 베타-락타마아제는 분비된다.
약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 베타-락타마아제를 포함한다. 이 조성물은 하나의 베타-락타마아제만을 포함하거나, 또는 그 이상, 예컨대 적어도 2종, 3종, 4종 등의 다른 베타-락타마아제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 본 발명의 베타-락타마아제 외에 다른 임의의 활성 성분을 포함할 수도 있다.
약제학적 조성물은 예컨대 고체, 반고체 또는 액체 형태, 예를 들어 정제, 펠릿, 캡슐, 용액제, 유탁제 또는 현탁제 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 경구 투여용 또는 장 적용용일 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 베타-락타메이스 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포 외에, 약제학적 조성물은 약제학적 허용성 운반체(들), 보강제(들), 부형제(들), 보조 부형제(들), 방부제(들), 안정제(들), 결합제(들), 충전제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 가소제, 착색제, 막 형성제, 당, 알코올, 활택제 및 희석제 및/또는 해당 산물에서 보통 발견되는 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 산물 또는 약제학적 조성물은 원하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 베타-락타마아제를 포함한다.
산물 또는 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 베타-락타마아제는 임의의 약제학적 산물에 첨가할 수 있거나, 또는 임의의 제조 단계 동안 임의의 제제와 혼합할 수도 있다. 또한, 본 발명의 베타-락타마아제는 예컨대 약제학적 산물에서 또는 약제학적 산물이 분해한 후 표적 조직에서 적당한 조건 하에 베타-락타마아제 유전자를 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 양태에 따르면, 베타-락타마아제(들) 및 베타-락탐 항생제는 장용 코팅된 펠릿 형태로 피검체에게 함께 투여한다. 수성계 코팅 형태는 친수성 P1A 단백질의 코팅법에 가장 바람직한 물질인 것으로 나타난다. 장용 성질을 달성하기 위해 일반적으로 사용되고 본 발명에서도 사용할 수 있는 수성 중합체는 폴리메타크릴레이트, 예컨대 Eudragit®, 셀룰로오스계 중합체, 예컨대 셀룰로오스 에테르, 예컨대 Duodcell®, 또는 셀룰로오스 에스테르, 예컨대 Aquateric® 또는 폴리비닐 아세테이트 공중합체, 예컨대 Opadry®이다.
본 발명의 베타-락타마아제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 피검체에게 베타-락탐 항생제와 동시에 또는 연속해서 투여할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 베타-락타마아제 또는 약제학적 조성물은 베타-락탐 항생제 전에, 예컨대 베타-락탐 항생제 투여 5 내지 30분 전에 투여한다. 베타-락타마아제 또는 베타-락탐 항생제/항생제들은 같은 포뮬레이션에 존재하거나 또는 다른 포뮬레이션들에 존재할 수 있다.
베타-락탐의 부작용 및 치료
베타-락탐 항생제의 부작용, 즉 역 약물반응은 설사, 구역질, 발진, 두드러기, 중복감염, 고열, 구토, 홍반, 피부염, 혈관신경부종 및 위막성 대장염을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 치료되거나 예방될 부작용은 위장관(GIT)에서 나타난다. 본원에 사용된, 위장관은 입에서 항문까지 뻗어 있는 소화 구조를 의미한다. 위장관은 입, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 소장, 결장, 맹장, 직장 및 항문을 포함한다.
본 발명의 베타-락타마아제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 피검체에게 경구로 또는 위장관에 직접 투여할 수 있다. 효소 조합의 약물(들)은 GIT에서 또는 피부 또는 질강과 같은 바람직하지 않은 다른 신체 부위에서 비흡수된 베타-락탐을 불활성화시키기 위한 것이다. 약제학적 조성물은 경구 투여된 약물, 피부학적 포뮬레이션 또는 질 좌약일 수 있고, 액체형, 즉시형, 지연형 또는 지속 방출형 투약 포뮬레이션을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 양태에서, 베타-락타마아제(들)는 경구 투여된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 베타-락타마아제는 환자의 위장에 직접 투여된다.
치료된 피검체는 사람 또는 동물, 예컨대 애완동물 또는 축산 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 돼지, 병아리 또는 말일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 피검체는 사람이다.
본 발명은 다음과 같은 실시예로 예시되는데, 이 실시예는 어떠한 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. D276N 및 D276R 돌연변이 효소의 작제
바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제 D276N 및 D276R 돌연변이체는 종래 공개된 절차(Horton R.M. et al., 1989, Gene 77: 61-68)에 따라 초기 PCR 반응의 주형으로서 P1A 베타-락타마아제를 암호화하는 pRSH10 플라스미드를 사용하여, 오버랩에 의한 스플라이싱 연장 돌연변이유발(SOE)에 의해 작제했다. 프라이머는 공통 서열 영역을 가진 2개의 다른 PCR 산물을 제공하도록 설계했다. 그 다음 단편을 오버래핑 영역의 도움을 받아 후속 PCR 증폭에서 융합시켰다. 초기 PCR에서 돌연변이 프라이머를 사용하여 원하는 돌연변이를 달성했다.
D276N 돌연변이체를 위해, 야생형 유전자의 원하는 위치에 GAT 코돈을 AAT 코돈으로 변환시키는 돌연변이를 만들었다. 1차 PCR 증폭에서 사용된 프라이머는 표 2에 제시했다. 1차 PCR에서 증폭된 단편의 크기는 21nt의 긴 오버래핑 영역을 가진 800nt와 220nt였다.
올리고뉴클레오타이드 PCR 프라이머. 상보성 영역은 음영을 주고, 돌연변이 코돈은 진하게 표시했다. 전방향(Forward)-1 및 역방향(Reverse)-1 프라이머는 2차 PCR에서 융합 단편의 증폭에 사용했다.
PCR 단편의 크기(nt) 올리고뉴클레오타이드 프라이머
800 Forward-1: 5'-CGA TTG TTT GAG AAA AGA-3'
(서열번호 4)
Reverse-D276N: 5'-AAT AAG TTT ATT ATC ATA CTT GGC GTC CT-3'
(서열번호 5)
Reverse-D276R: 5'-AAT AAG TTT GCG ATC ATA CTT GGC GTC CT-3'
(서열번호 6)
220 Forward-D276N: 5'-AAG TAT GAT AAT AAA CTT ATT GCA GAG G-3'
(서열번호 7)
Forward-D276R: 5'-AAG TAT GAT CGC AAA CTT ATT GCA GAG G-3'
(서열번호 8)
Reverse-1: 5'-GTA TTT GTC ACA CCT GAT G-3'
(서열번호 9)
2차 PCT 반응(SOE 반응)에서, 2개의 오버래핑 단편을 후속 연장 반응 시에 함께 융합시켰다. 연장 반응 시에 외부 프라이머(전방향-1 및 역방향-1)의 포함은 융합 산물을 PCR에 의해 증폭시킨다. 정제한 SOE 산물은 HindIII 제한효소로 분해하고 WO 2008/065247에 기술된 바와 같이 HindIII 절단된 pKTH141 분비 벡터에 결찰시켰다.
바실러스 서브틸리스 RS303의 컴피턴트 세포는 결찰 혼합물로 형질전환시켰다. 루리아-가나마이신 평판 위의 양성 클론은 단일 콜로니의 세균 덩어리를 니트로세핀 용액에 현탁시켜 선별했다. 양성 클론은 니트로세핀을 효과적으로 가수분해하여 니트로세핀 용액의 색을 황색에서 적색으로 변화시켰다. 하이브리드 플라스미드는 단일 클론의 세포로부터 정제했다. PCR로 생성된 영역의 정확한 서열은 DNA 서열분석으로 입증했다.
D276R 돌연변이체를 위해, GAT 코돈을 CGC 코돈으로 변환시켜 원하는 위치에 돌연변이를 만들었다. D276R 돌연변이 균주의 작제는 초기 PCR에 역방향-D276R-프라이머와 전방향-D276R-프라이머를 사용한 것을 제외하고는 D276N 돌연변이체의 작제와 유사하게 수행했다(표 2 참조).
실시예 2. D276N 돌연변이 베타- 락타마아제 유전자( penP )의 뉴클레오타이드 서열
발현 작제물은 양성 클론으로부터 분리하고, 삽입물은 DNA 서열분석으로 처리했다. D276R 돌연변이 베타-락타마아제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열은 원하는 코돈에서 Asp 대신에 Asn으로의 대체가 정확하게 일어났음을 보여주었다(도 2). 더욱이, D276N 돌연변이 베타-락타마아제 유전자의 DNA 서열은 바실러스 아밀로리쿼페이션스 알파 아밀라제의 31개 아미노산 롱 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, HindIII 클로닝 부위 및 D276N 돌연변이 유전자의 전체 서열 사이에 인프레임(in frame) 융합을 나타냈다. 시그널 펩티다제는 -1 위치의 알라닌(A)과 +1 위치의 글루타민(Q) 사이의 펩타이드 결합을 절단하는 것으로 추정된다. 성숙 D276N 베타-락타마아제는 발현 작제물에서 HindIII 클로닝 부위 유래의 NH2-QAS-트리펩타이드의 NH2-말단 연장부를 보유한다. 따라서, 추론된 아미노산 서열을 기반으로 할 때, 성숙 D276N 돌연변이 베타-락타마아제는 268개 아미노산 잔기를 포함한다.
실시예 3. D276R 돌연변이 베타- 락타마아제 유전자( penP )의 뉴클레오타이드 서열
바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제 유전자에서 위치 276(앰블러 분류)의 아스파르트산의 아르기닌으로의 원하는 치환을 확인하기 위해, 발현 작제물은 양성 클론으로부터 분리하고, 삽입물의 뉴클레오타이드 서열은 실시예 2와 유사하게 서열분석했다. 수득된 뉴클레오타이드 서열에 따르면, 추론된 아미노산 서열은 원하는 D276R 치환을 포함하며, 성숙 D276R 돌연변이 효소는 268개 아미노산 잔기로 구성된다(도 3).
실시예 4. D276N 돌연변이 베타- 락타마아제(P3A)의 생화학적 분석
효소 제제의 순도는 SDS-PAGE 분석에 의해 95%보다 높은 것으로 추정되었다(데이터는 미제시).
야생형(P1A) 및 D276N(P3A) 돌연변이 비.리체니포미스 베타-락타마아제의 동역학 파라미터는 다양한 종류의 베타-락탐의 가수분해에서 측정했고, 표 3에 정리했다. 효소 반응은 적당한 농도의 효소와 다양한 농도의 페니실린 또는 세팔로스포린 기질을 사용하여 20mM 인산염 완충액(pH 7)에서 30℃ 하에 수행했다. kcat 및 Km 값은 하인즈 선형화법의 도움을 받아 수득했다. 주요 결과는 이하에 설명한다.
(i) 페니실린
페니실린(앰피실린, 아목시실린 또는 피페라실린)의 가수분해에 미치는 D276N 치환 효과는 야생형 효소의 51 내지 80% 효소 효율로 급감하지 않았다. 결과적으로, 페니실린에 대한 D276N 돌연변이 효소의 kcat/Km 값은 최대 2배 이하만큼 감소했다.
( ii ) 세팔로스포린
페니실린에 관하여 예상한 바와 같이, 야생형 베타-락타마아제는 제1 세대(카파졸린), 제2 세대(세푸록심) 및 제3 세대(세프트리악손, 세포탁심, 세프타디짐, 세포페라존 및 세페핌) 세팔로스포린을 비롯한 다양한 세팔로스포린에 대해 불량한 효소 효율을 나타냈다(표 1). 놀랍게도, 특정 세팔로스포린, 바람직하게는 세포페라존, 더욱 바람직하게는 세프트리악손에 대한 D276N 돌연변이 효소의 효소 효율은 야생형 효소에 의해 수득되는 것에 비해 본질적으로 향상되었다. 세프트리악손 및 세포페라존의 Km 상수는 감소했고, 동시에 세프트리악손 및 세포페라존에 대한 턴오버 수(kcat)는 야생형 효소(P1A)에 비해 증가했다. 따라서, 바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제의 위치 276에서의 아스파르트산-아스파라긴 치환은 바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제의 베타-락탐 기질 프로필의 확대에 기여한다.
바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제의 야생형(P1A) 및 D276N 돌연변이 효소에 의한 베타-락탐 기질 가수분해의 동역학적 파라미터
야생형 베타-락타마아제(P1A) D276N 돌연변이체
베타-락탐 Km (μM) kcat (s-1) kcat/ Km
(μM-1 s-1)		 Km (μM) kcat (s-1) kcat/ Km
(μM-1 s-1)		 상대적 촉매 효율(%)(1
앰피실린 157 3369 21.45 161 2160 13.42 63
피페라실린 49 939 19.16 53 816 15.40 80
아목시실린 119 2956 24.84 219 2789 12.74 51
세프트리악손 400 0.045 0.00013 38 83 2.18 1676923
세포탁심 363 246 0.67 213 36 0.17 25
세프타디짐 0 0 0 1505 2.74 0.0018
세페핌 0 0 0 1357 133 0.1
세파졸린 22 93 4.22 37 192 5.19 123
세포페라존 7 10 1.43 2 17 8.2 573
세푸록심 107 233 2.18 277 35 0.13 6
(1 야생형 효소(P1A)와 비교한 D276N의 상대적 촉매 효율(kcat/Km)
실시예 5. D276R 돌연변이 효소의 생화학적 특성
D276R 돌연변이 효소는 Asp276이 치환 허용성인지, 그리고 D276N 효소에서 관찰되는 베타-락타마아제 활성의 확대에 대한 D276R 치환의 기여도를 평가하기 위해 작제했다.
배양 상청액에서 수득되는 D276R 및 D276N의 미정제 효소 샘플을 시험 물질로 사용했다. 효소 샘플의 순도와 정량은 SDS-PAGE 분석을 수행하여 추산했다. 다양한 베타-락탐에 대한 D276R 및 D276N 돌연변이 효소의 가수분해 속도는 Vmax 값을 측정하여 수행했다. 수득된 결과는 표 4의 D276N 효소와 비교하여 상대적 활성(%)으로 나타냈다.
일반적으로, 페니실린과 세팔로스포린 둘 모두에 대한 D276R 베타-락타마아제의 촉매 효율은 D276N 효소와 비슷하다. D276N 효소에 비해, D276R 효소는 세프트리악손에 대해서는 감소된 활성을 나타내고 세포페라존에 대해서는 향상된 활성을 나타낸다. 본 연구는 베타-락탐에 대한 확대된 스펙트럼이 바실러스 리체니포미스 베타-락타마아제의 위치 276에 있는 아스파르트산을 아르기닌 또는 아스파라긴과 같은 친수성 아미노산 잔기로 치환하여 달성할 수 있음을 보여주었다. 또한, 원하는 효소 변형은 위치 276의 아스파르트산 대신에 글루타민(Q), 리신(K), 세린(S) 또는 트레오닌(T)과 같은 다른 친수성 아미노산 잔기로 치환하여 달성할 수도 있음을 시사한다.
D276N 돌연변이 효소에 비해 D276R 돌연변이 효소의 상대적 활성(%)
베타-락탐 상대적 활성
앰피실린 82
피페라실린 84
아목시실린 71
세프트리악손 50
세포탁심 105
세프타디짐 -
세페핌 74
세파졸린 84
세포페라존 232
세푸록심 99
실시예 6. D276N 베타- 락타마아제의 생체내 연구
비경구 치료법 동안 위장관으로 분비된 세프트리악손(CRO)을 불활성화시키는 바실러스 리체니포미스 D276N 돌연변이 베타-락타마아제 효소의 능력은 개 모델에서 조사했다. 본 연구의 실험실용 비글은 분석용 샘플을 수집할 수 있는 유문에 대해 약 170cm 떨어진 공장(jejunum)에 니플 밸브(nipple valve)가 수술로 삽입되어 있다. 장 수술은 장 운동성을 바꾸지 않았다. 5마리 비글을 각 실험에 사용했다.
본 연구는 2회의 연속 치료로 수행했다: 1차 치료(베타-락타마아제 치료법 없는 대조 실험)에서는 세프트리악손의 1회 용량(사람에서 CRO 약 1g 용량에 해당하는 체중 kg당 약 30mg 세프트리악손(CRO))을 개에게 1차 급식 후 20분 후에 정맥내로 투여했다. 개에게 다시 세프트리악손 투여 후 5시간 40분 후에 다시 급식을 주어, 방광에 축적된 세프트리악손의 담즙 분비를 유도했다.
공장 미즙 샘플은 즉시 동결시켜 분석 시까지 -20℃에서 보관했다. 미즙 샘플은 방해 물질을 침전시키기 위해 퍼클로릭-시트르산으로 전처리했다. 침전물은 원심분리로 제거했다. 상청액 중의 세프트리악손을 정량분석하기 위해 UV 검출을 구비한 역상 고압 크로마토그래피법을 사용했다.
2차 치료에서는 D276N 돌연변이 베타-락타마아제를 세프트리악손 주입 10분 전에 경질 젤라틴 캡슐에 충전된 장용 코팅된 펠릿으로 제공했다. 장용 코팅 투약 형태는 약제 산업에서 경구 제품 중에 일반적인 것이다. 장용 코팅 약물은 무손상 형태로 위를 우회하고 소장에서 투약 형태의 내용물을 방출하도록 설계된다. 장용 고체 제형을 적용하는 이유는 효소의 파괴 작용 또는 위의 낮은 pH 환경으로부터 약물을 보호하거나, 또는 위점막의 약물 유도 자극, 구역질 또는 출혈을 예방하거나, 또는 약물을 미희석된 형태로 소장의 표적 부위에 전달하기 위한 것이다. 이러한 기준을 기반으로 할 때, 장용 코팅된 약물은 지연식 투약 형태의 한 종류로 간주될 수 있다. pH 의존적인 장용 코팅된 투약 형태를 달성하기 위해 폴리메타크릴산 공중합체 Eudragit® L 30 D-55를 이용했다. 활성 D276N 베타-락타마아제를 체중 kg당 약 0.44mg 포함하는 장용 코팅 펠릿의 1회 용량을 2차 치료에 사용했다.
2회 치료로부터 수득된 결과는 도 4에 제시했다. 치료 1은 고농도의 세프트리악손이 비경구 세프트리악손 치료법 동안 소장 내로 분비된다는 것을 보여주었다. 최고의 공장 농도(공장 미즙 g당 약 1500㎍)는 세프트리악손 주입 후 60분 후에 관찰되었다. 증가된 공장의 세프트리악손 수준은 개의 2차 급식(340분 시점) 후 관찰되었고, 이것은 방광에서 음식에 의해 자극된, 세프트리악손 포함 담즙 분비 축적이 일어났음을 시사한다.
치료 2는 경구 투여된 D276N 돌연변이 베타-락타마아제가 공장의 세프트리악손 수준을 정량 한계(공장 미즙 ㎍당 세프트리악손 10 ㎍)에 가까운 수준으로 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 이 발견은 D276N 돌연변이 베타-락타마아제가 비경구 세프트리악손의 사용과 관련된 부작용을 감소시키기 위한 강력한 약물 후보라는 것을 보여준다. 더욱이, 앰피실린, 아목시실린 및 피페라실린과 같은 페니실린에 대한 높은 활성을 기반으로 할 때, D276N 또는 D276R 돌연변이 효소는 WO 2008065247에 기술된 베타-락타마아제 치료법에서 대체 약물로 사용될 수 있다.
<110> PREVAB R LLC <120> Modified beta-lactamases and methods and uses related thereto <130> PFK19757 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln Phe Asp Ala Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala Tyr Arg 20 25 30 Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile Lys Ala Leu Thr Val 35 40 45 Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp Leu Asn Gln Arg Ile 50 55 60 Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn Pro Ile Thr Glu Lys 65 70 75 80 His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu Ala Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile Leu Lys Gln Ile Gly 100 105 110 Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Ile Gly Asp Glu Val 115 120 125 Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn Glu Val Asn Pro Gly 130 135 140 Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu Val Thr Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu Lys Arg Glu Leu Leu 165 170 175 Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp Ala Leu Ile Arg Ala 180 185 190 Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys Thr Gly Ala Ala Ser 195 200 205 Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp Pro Pro Lys Gly Asp 210 215 220 Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp Lys Lys Asp Ala Lys 225 230 235 240 Tyr Asp Xaa Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Val Val Met Lys Ala 245 250 255 Leu Asn <210> 2 <211> 774 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> <221> misc_feature <222> (727)..(729) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 atgaaagatg attttgcaaa acttgaggaa caatttgatg caaaactcgg gatctttgca 60 ttggatacag gtacaaaccg gacggtagcg tatcggccgg atgagcgttt tgcttttgct 120 tcgacgatta aggctttaac tgtaggcgtg cttttgcaac agaaatcaat agaagatctg 180 aaccagagaa taacatatac acgtgatgat cttgtaaact acaacccgat tacggaaaag 240 cacgttgata cgggaatgac gctcaaagag cttgcggatg cttcgcttcg atatagtgac 300 aatgcggcac agaatctcat tcttaaacaa attggcggac ctgaaagttt gaaaaaggaa 360 ctgaggaaga ttggtgatga ggttacaaat cccgaacgat tcgaaccaga gttaaatgaa 420 gtgaatccgg gtgaaactca ggataccagt acagcaagag cacttgtcac aagccttcga 480 gcctttgctc ttgaagataa acttccaagt gaaaaacgcg agcttttaat cgattggatg 540 aaacgaaata ccactggaga cgccttaatc cgtgccggtg tgccggacgg ttgggaagtg 600 gctgataaaa ctggagcggc atcatatgga acccggaatg acattgccat catttggccg 660 ccaaaaggag atcctgtcgt tcttgcagta ttatccagca gggataaaaa ggacgccaag 720 tatgatnnna aacttattgc agaggcaaca aaggtggtaa tgaaagcctt aaac 774 <210> 3 <211> 299 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> mat_peptide <222> (32)..(299) <400> 3 Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met -30 -25 -20 Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Gln -15 -10 -5 -1 1 Ala Ser Lys Thr Glu Met Lys Asp Asp Phe Ala Lys Leu Glu Glu Gln 5 10 15 Phe Asp Ala Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg 20 25 30 Thr Val Ala Tyr Arg Pro Asp Glu Arg Phe Ala Phe Ala Ser Thr Ile 35 40 45 Lys Ala Leu Thr Val Gly Val Leu Leu Gln Gln Lys Ser Ile Glu Asp 50 55 60 65 Leu Asn Gln Arg Ile Thr Tyr Thr Arg Asp Asp Leu Val Asn Tyr Asn 70 75 80 Pro Ile Thr Glu Lys His Val Asp Thr Gly Met Thr Leu Lys Glu Leu 85 90 95 Ala Asp Ala Ser Leu Arg Tyr Ser Asp Asn Ala Ala Gln Asn Leu Ile 100 105 110 Leu Lys Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ser Leu Lys Lys Glu Leu Arg Lys 115 120 125 Ile Gly Asp Glu Val Thr Asn Pro Glu Arg Phe Glu Pro Glu Leu Asn 130 135 140 145 Glu Val Asn Pro Gly Glu Thr Gln Asp Thr Ser Thr Ala Arg Ala Leu 150 155 160 Val Thr Ser Leu Arg Ala Phe Ala Leu Glu Asp Lys Leu Pro Ser Glu 165 170 175 Lys Arg Glu Leu Leu Ile Asp Trp Met Lys Arg Asn Thr Thr Gly Asp 180 185 190 Ala Leu Ile Arg Ala Gly Val Pro Asp Gly Trp Glu Val Ala Asp Lys 195 200 205 Thr Gly Ala Ala Ser Tyr Gly Thr Arg Asn Asp Ile Ala Ile Ile Trp 210 215 220 225 Pro Pro Lys Gly Asp Pro Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Arg Asp 230 235 240 Lys Lys Asp Ala Lys Tyr Asp Xaa Lys Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys 245 250 255 Val Val Met Lys Ala Leu Asn Met Asn Gly Lys 260 265 <210> 4 <211> 900 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> <221> misc_feature <222> (838)..(840) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60 tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcgcaagctt ccaagacgga gatgaaagat 120 gattttgcaa aacttgagga acaatttgat gcaaaactcg ggatctttgc attggataca 180 ggtacaaacc ggacggtagc gtatcggccg gatgagcgtt ttgcttttgc ttcgacgatt 240 aaggctttaa ctgtaggcgt gcttttgcaa cagaaatcaa tagaagatct gaaccagaga 300 ataacatata cacgtgatga tcttgtaaac tacaacccga ttacggaaaa gcacgttgat 360 acgggaatga cgctcaaaga gcttgcggat gcttcgcttc gatatagtga caatgcggca 420 cagaatctca ttcttaaaca aattggcgga cctgaaagtt tgaaaaagga actgaggaag 480 attggtgatg aggttacaaa tcccgaacga ttcgaaccag agttaaatga agtgaatccg 540 ggtgaaactc aggataccag tacagcaaga gcacttgtca caagccttcg agcctttgct 600 cttgaagata aacttccaag tgaaaaacgc gagcttttaa tcgattggat gaaacgaaat 660 accactggag acgccttaat ccgtgccggt gtgccggacg gttgggaagt ggctgataaa 720 actggagcgg catcatatgg aacccggaat gacattgcca tcatttggcc gccaaaagga 780 gatcctgtcg ttcttgcagt attatccagc agggataaaa aggacgccaa gtatgatnnn 840 aaacttattg cagaggcaac aaaggtggta atgaaagcct taaacatgaa cggcaaataa 900 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 5 cgattgtttg agaaaaga 18 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 6 aataagttta ttatcatact tggcgtcct 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 7 aataagtttg cgatcatact tggcgtcct 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 8 aagtatgata ataaacttat tgcagagg 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 9 aagtatgatc gcaaacttat tgcagagg 28 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 10 gtatttgtca cacctgatg 19

Claims (23)

  1. 서열번호 1과 적어도 60%의 서열 동일성을 가지고, 앰블러(Ambler) 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 친수성 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열, 또는 이의 변형체 또는 단편을 포함하는 베타-락타마아제.
  2. 서열번호 1과 적어도 60%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 베타-락타마아제를 변형시키는 방법으로서, 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 서열번호 1의 위치에 있는 베타-락타마아제의 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 변형 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 베타-락타마아제는 서열번호 1과 적어도 68%의 서열 동일성을 가지며, 베타-락타마아제 활성이 있으며, 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치에 아스파르트산(D)이 아닌 다른 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 이의 변형체 또는 단편을 포함하는 것인 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 베타-락타마아제가 서열번호 1과 적어도 60%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 앰블러 분류에 따른 위치 276에 해당하는 위치의 친수성 아미노산 잔기가 아스파르트산(D)이 아닌 다른 것인 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 친수성 아미노산이 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 리신(K)으로 이루어진 그룹의 극성 및 양하전 친수성 아미노산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 친수성 아미노산이 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 이루어진 그룹의 극성 및 중성 하전의 친수성 아미노산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산이 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 아미노산이 아르기닌인 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 276에 해당하는 서열번호 1에서의 위치에 있는 친수성 아미노산이 알파 나선에 위치하는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-락타마아제가 앰블러 분류에 따른 Leu220 및 Arg244로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-락타마아제가 페니실린 및/또는 세팔로스포린을 가수분해하는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-락타마아제가 야생형 베타-락타마아제에 비해 세팔로스포린에 향상된 촉매 효율을 나타내는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 세팔로스포린이 세포페라존(cefoperazone), 세프트리악손(ceftriaxone) 및 세파졸린(cefazoline)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-락타마아제 또는 베타-락타마아제 변형 방법.
  14. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제를 생산하는 방법으로서,
    v) 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제를 암호화하는 유전자를 제공하는 단계;
    vi) 상기 유전자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    vii) 베타-락타마아제를 생산하는 숙주 세포를 수득하는 단계;
    viii) 베타-락타마아제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-락타마아제 생산 방법.
  15. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제를 베타-락탐 항생제와 동시에 또는 연속해서 피검체에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 위장관 중의 베타-락탐 항생제 유도 부작용을 치료하거나 예방하는 방법.
  16. 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열 또는 이의 축퇴물을 포함하거나, 또는 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제 16 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용되는 베타-락타마아제.
  20. 위장관 중의 베타-락탐 항생제 유도 부작용을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 사용되는, 제1항 및 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 베타-락타마아제의 용도.
  21. 제 15 항 또는 제 20 항에 있어서, 베타-락타마아제(들)가 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  22. 제 15 항 또는 제 20 항에 있어서, 베타-락타마아제(들)가 환자의 위장에 직접 투여되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  23. 제 15 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-락타마아제(들) 및 베타-락탐 항생제가 장용 코팅된 펠릿의 형태로 피검체에게 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
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