KR20130080005A

KR20130080005A - 식물 세포 내로의 생체분자의 전달을 위한 식물 펩티드 감마-제인

Info

Publication number: KR20130080005A
Application number: KR1020127028364A
Authority: KR
Inventors: 나라시므하 차리 삼보주; 제야쿠마르 폰 새뮤얼; 가오펑 린; 스티븐 알 웨브; 프랭크 지 버로우스
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-07-11
Also published as: WO2011126644A3; NZ602139A; AU2011238826A1; US8581036B2; CA2794082C; CA2794082A1; CN102933073B; AR080742A1; WO2011126644A2; EP2552191A2; BR112012024589A2; AU2011238826B2; RU2012146320A; IL222200A; IL222200A0; CN102933073A; RU2563805C2; EP2552191A4; US20110247100A1; JP2013523121A

Abstract

세포 벽이 있는 식물 세포 내로 관심 분자를 도입하는 방법은 감마-제인(zein) 펩티드를 관심 분자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 것을 포함한다. 그 후, 감마-제인 연결된 구조물을 세포 벽이 있는 식물 세포와 접촉시키고, 감마-제인 연결된 구조물이 식물 세포 내로 흡수(uptake)되게 한다. 별법적으로, 감마-제인 펩티드를 관심 유전자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 유전자 구조물을 형성시키는 단계, 감마-제인 연결된 유전자 구조물이 식물 세포 내로 흡수되게 하는 단계, 및 관심 유전자를 식물 세포 및 그의 자손에서 발현시키는 단계에 의해 관심 유전자를 무손상 세포 벽이 있는 식물 세포에서 발현시킬 수 있다.

Description

식물 세포 내로의 생체분자의 전달을 위한 식물 펩티드 감마-제인{PLANT PEPTIDE GAMMA-ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS}

우선권 주장

본 출원은 발명의 명칭이 "PLANT PEPTIDE GAMMA-ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS"인 미국 가특허 출원 일련 번호 61/319,764 (2010년 3월 31일 출원)의 출원일을 우선일로 청구한다.

배경

특정 형질을 나타내는 새로운 식물 계통을 발달시키기 위한 전통적인 식물 육종 전략은 시간 소비적이고, 때때로 예측이 불가능하다. 기존의 전략, 예컨대 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 및 입자 충격(bombardment)은 조직 및 유전자형에 크게 의존적이다. 세포 투과 펩티드 (CPP)는 포유동물 및 인간 세포주에서의 DNA, RNA 및 단백질이 포함되는 광범위한 화물 복합체의 세포 막을 가로지르는 전좌(translocation)에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지된, 새롭고 빠르게 성장 중인 짧은 펩티드 부류이다 (문헌 [Schwartz and Zhang, 2000]; [Langel, 2002]; [Vives, 2002]).

CPP가 포유동물 세포에서 화물 전달을 용이하게 하는 것으로 나타났지만, 형질감염 연구를 위한 식물 세포에서의 CPP의 사용은 다수의 요인에 의해 제한되었다. 이러한 기술을 식물에 적합하게 하는 것에 대한 주요 장애물은 식물 세포가 동물 세포와는 달리 CPP 및 그의 화물의 내재화에 이중 장벽 시스템 (세포 벽 및 형질 막)을 제시한다는 것이다. 따라서, 무손상 식물 세포 내로의 화물 분자의 효율적인 전좌를 위해 CPP가 이러한 2개의 장벽을 극복하여야 한다. CPP가 식물 세포에서 사용되었지만, 무손상 식물 세포 내로의 화물 분자의 전달을 일으키기 위해 투과제의 사용에 의존한다. 무손상 식물 세포 내로의 소형 분자, 핵산 및 단백질의 CPP-매개 전달은 여전히 많이 탐구되지 않았고, 식물 시스템에서의 시험관내 및 생체내 유전적 및 생화학적 조작에 유리하다.

나노입자는 세포 내로의 DNA 전달에서의 사용을 위해 활용된 독특한 성질이 있다. 금속 나노입자, 예컨대 금 (Au) 나노입자가 그의 낮은 세포독성 및 생물학적으로 유의한 다양한 리간드로의 관능화의 용이함으로 인해 DNA 전달에 사용되었다. 금속 나노입자에 더하여, 크기 범위가 3-5 nm 이내인 반도체 나노입자 (예를 들어, 양자 점) ("QD")가 분자를 세포 내로 전달하기 위한 담체로서 또한 사용되었다. DNA 및 단백질이 다양한 표면 관능화를 통해 QD에 부착된 리간드에 연결될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Patolsky, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)] 참조).

플라스미드 DNA를 다양한 동물 세포 내로 전달하는데 나노입자가 사용되었다. DNA로 코팅된 나노입자가 세포 벽이 없는 세포와 함께 인큐베이션될 때, 세포가 나노입자를 흡수하고 DNA 상에 코딩된 임의의 유전자를 발현하기 시작하는 것이 발견되었다. 그러나, 현대의 식물 유전자 전달은 식물 세포 벽의 존재로 인해 난제이고, 이는 식물의 유전적 형질전환을 위해 침습성 전달 수단에 통상적으로 의존하는 것에 이른다. 일반적으로 세포 벽이 있는 세포로의 나노입자 전달을 원하는 경우, 식물의 원형질체에 입자를 첨가하기 전에 이러한 세포의 벽을 벗겨낸다 (문헌 [Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007)] 참조). 식물 세포에서, 세포 벽은 외인성으로 적용되는 분자의 전달에 대한 곤란한 장벽을 제시한다. 다수의 침습성 방법, 예컨대 유전자 총 (생체탄도(biolistics)), 미세주입, 전기천공, 및 아그로박테리움이 벽이 있는 식물 세포 내로의 유전자 및 소형 분자 전달을 달성하는데 사용되었지만, 단백질의 전달은 오직 미세주입에 의해서 달성되었다.

식물 게놈 서열분석 프로젝트로부터 정보가 점점 늘어나면서, 광범위한 유전자의 기능적 게놈 연구 및 중요한 작물학 형질을 나타내는 트랜스제닉 식물의 개발을 위한 식물에서의 신속하고 보편적인 (조직/유전자형에 의존적이지 않은) 방법이 긴급하게 요구된다.

발명의 개시내용

하기의 실시양태들은 시스템, 도구 및 방법과 관련하여 기술되고, 이는 예시적이고 설명적이지만 범주를 제한하지 않는 것으로 의도된다.

본 발명의 한 실시양태는 세포 벽이 있는 식물 세포 내로 관심 분자를 도입하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 세포 벽이 있는 식물 세포를 제공하는 단계 및 감마-제인(zein) 펩티드를 관심 분자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 단계를 포함한다. 그 후, 세포 벽이 있는 세포와 감마-제인 연결된 구조물을 서로 접촉시키고, 감마-제인 연결된 관심 분자가 세포 벽이 있는 세포 내로 흡수(uptake)되게 한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 세포 벽이 있는 식물 세포를 제공하는 단계 및 감마-제인 펩티드를 관심 유전자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 유전자 구조물을 형성시키는 단계를 포함하는, 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 세포 벽이 있는 식물 세포와 감마-제인 연결된 구조물을 서로 접촉시키고, 세포 벽을 포함하는 식물 세포 내로 감마-제인 펩티드 및 유전자가 흡수되게 한다. 그 후, 이러한 식물 세포를 갖는 식물의 자손 내의 유전자가 발현된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 분자성 물질을 식물 세포 내로 전달한다. 이러한 방법은 감마-제인 펩티드를 플라스미드 DNA와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 단계를 포함한다. 감마-제인 펩티드 및 플라스미드 DNA로부터의 유전자가 식물 세포 내로 흡수되는 것을 허용하는 조건 하에 감마-제인 연결된 구조물을 무손상 벽을 보유하는 식물 세포와 접촉시킨다.

상기 기술된 예시적인 측면 및 실시양태에 더하여, 추가적인 측면 및 실시양태가 하기의 설명을 고려하여 명백해질 것이다.

도 1은 감마-제인 / YFP 융합 유전자의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 감마-제인 / YFP 융합 펩티드 정제에 대한 Ni 킬레이팅 크로마토그래피를 나타낸다.
도 3은 감마-제인 / YFP 용리 프로파일의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 4는 감마-제인 / YFP의 말디-토프(Maldi-TOF) 펩티드 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 융합 펩티드의 세포 흡수 및 내재화를 도해하는 공초점 현미경 영상을 나타낸다: A. 핵을 나타내는 훽스트(Hoechst) 33342로 염색된 당근 단일 세포; B. 핵 및 세포질 내의 감마-제인 / YFP 형광 국소화를 나타내는 당근 단일 세포; C. 핵을 나타내는 훽스트 33342로 염색된 담배 JTNTI 세포; D. 훽스트 33342로의 청색의 핵 염색과 함께 핵 및 세포질 내의 감마-제인 / YFP 형광을 나타내는 담배 JTNT1 세포; E. JTNT1 세포의 형질 막 및 핵 둘 모두에 표적화된 감마-제인 / YFP 융합 펩티드를 나타내는 공초점 영상; 및 F 및 G. 각각 상응하는 명시야 영상, 및 공초점 / 명시야 영상의 오버레이(overlay)를 나타냄.
도 6은 pDAB3831의 플라스미드 지도를 나타낸다.

발명을 수행하기 위한 양식(들)

하기의 설명 및 표에서, 다수의 용어가 사용된다. 이같은 용어들에 주어지는 범주를 포함하여 명세서 및 청구항의 명확하고 일관적인 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다:

역교배. 역교배는 육종자가 잡종 자손을 반복적으로 양친 중 하나에 역으로 교배시키는, 예를 들어, 제1 세대 잡종 F₁을 이러한 F₁ 잡종의 양친 유전자형 중 하나와 교배시키는 프로세스이다.

배아. 배아는 성숙 종자 내에 함유된 소형 식물일 수 있다.

제인. 제인은 옥수수 글루텐 가루로부터 생산된 메이즈 단백질이다. 이는 리신 및 트립토판 아미노산이 결여되고, 따라서 식이 단백질의 단독 공급원으로서 적절하지 않다. 이는 물 및 알콜에 불용성이지만, 수성 알콜, 글리콜, 및 글리콜 에테르에 가용성이다. 이는 견과 및 곡물 제품에 대한 수분 장벽을 제공하는 필름 및 코팅제의 기능을 한다. 이는 또한 당과용 코팅제 및 제과 제품 글레이즈(glaze)의 기능을 한다.

나노입자. 적어도 1 나노규모 크기, 일반적으로는 100 nm 미만의 미세한 입자. 본 발명에서 사용하기에 적절한 나노입자는 크기 범위가 1 nm - 0.4 um일 수 있다. 양자 점은 중앙값 직경 범위가 1 nm - 10 nm, 바람직하게는 2 - 4 nm일 수 있다. 나노입자는 금 나노입자, 금으로 코팅된 나노입자, 다공성 나노입자, 메조다공성(mesoporous) 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노입자, 텅스텐 나노입자, 젤라틴 나노입자, 나노쉘(nanoshell), 나노코어(nanocore), 나노스피어(nanosphere), 나노막대(nanorod), 자기 나노입자, 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다.

양자 점. 양자 점은 3개의 모든 공간 방향에서 전도대 전자, 가전자대 정공 또는 엑시톤(exciton) (전도대 전자와 가전자대 정공의 결합된 쌍)의 움직임을 한정하는 반도체 나노구조물이다. 이러한 한정은 정전기 전위 (외부 전극, 도핑(doping), 스트레인(strain), 불순물에 의해 생성됨), 상이한 반도체 물질들 간의 계면의 존재 (예를 들어, 코어(core)-쉘(shell) 나노결정 시스템), 반도체 표면의 존재 (예를 들어, 반도체 나노결정), 또는 그의 조합에 기인할 수 있다. 양자 점은 분리된 양자화 에너지 스펙트럼을 가질 수 있다. 상응하는 파동 함수가 이러한 양자점 내에 공간적으로 국소화되지만, 다수의 결정 격자 기간에 걸쳐 확장된다. 양자 점은 적은 유한 개수 (대략 1-100)의 전도대 전자, 가전자대 정공, 또는 엑시톤 (즉, 유한 개수의 기본 전하량)을 함유한다.

안정화된 또는 안정적인 형질전환체. 안정화된 또는 안정적인 형질전환체는 게놈이 재생가능하게 한 세대에서 다음 세대로 전해지는 식물을 지칭한다

흡수. 흡수는 세포 벽 또는 세포 막을 가로지르는 입자, 예컨대 감마-제인의 전좌를 지칭하고, 이때 이러한 전좌는 입자가 흡수되는 세포 이외의 어떤 것에 의해 입자에 부여되는 운동량의 결과로서만 발생하는 것이 아니다. 비교의 목적을 위해, 입자에 부여되는 운동량의 결과로서만 세포 벽 또는 세포 막을 가로지르는 입자의 전좌를 야기하는 장치 또는 방법의 예는 생체탄도, 유전자 총, 미세주사 및/또는 임페일펙션(impalefection) 기술이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 식물 시스템에서의 소형 분자 전달, 생체분자 전달, 유전자 전달, 영상화, 및 다양한 생물공학적 진단 및 센싱(sensing) 기능에서의 용도를 위해 무손상 식물 세포 내로 탑재물을 효율적으로 전달하는 CPP로서 감마-제인을 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, "첨가된" 또는 "게스트(guest)" 분자가 감마-제인 분자에 커플링될 수 있다. 이러한 성질은, 예를 들어, 생체모방기술(biomimetics)과 같은 분야를 위한 세포 내의 분자성 부위의 특이적 표적화 및 편집, 표적화된 전달, 비-유전자 변형 생물 선택사항, 및 형질 및 질환 저항성 용도를 위한 다양한 나무, 채소 및 줄뿌림 작물(row crop)에서의 일시적인 형질전환 선택사항에 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태들은 식물에서 적절한 바이오-센서(bio-sensor)를 개발하는데 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 실시양태에 따르면, 관심 분자를 함유하는 감마-제인을 식물 세포와 접촉시키는 단계 및 식물 세포 벽을 가로질러 감마-제인이 흡수되게 하는 단계를 포함하는, 세포 벽을 포함하는 식물 세포 내로 관심 분자를 도입하는 방법이 제공될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 감마-제인은 가역적으로 또는 비가역적으로 관심 분자를 함유할 수 있거나, 관심 분자와 상호작용할 수 있거나, 또는 다른 방식으로 관심 분자에 결합되고/되거나 이를 보유할 수 있다.

본 발명의 실시양태에 따르면, 세포 벽이 있는 식물 세포는 전체적인 무손상 세포 벽을 포함하는 임의의 식물 세포일 수 있다. 세포 벽이 있는 세포의 예로는 조류, 담배, 당근, 메이즈, 카놀라, 평지씨, 목화, 야자, 땅콩, 대두, 사탕수수, 오리자(Oryza) 종, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종, 및 리시누스(Ricinus) 종, 바람직하게는 담배, 당근, 메이즈, 목화, 카놀라, 대두 및 사탕수수, 더욱 바람직하게는 담배 및 당근이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 실시양태는 배아, 분열조직 세포, 캘러스(callus), 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리, 줄기, 조직 배양물 및 무손상 단일 식물 세포의 현탁액 내를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 조직 또는 어디든 세포 벽을 포함하는 세포가 발견되는 곳으로부터의 세포 벽을 포함하는 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 관심 분자는 본 발명에 따라 식물 세포에 전달될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 관심 분자, 또는 관심 분자의 성분은 임의의 소형 분자, 핵산, DNA, RNA, RNAi, miRNA 분자, 유전자, 플라스미드, 코스미드, YAC, BAC, 폴리펩티드, 효소, 호르몬, 글리코-펩티드, 당, 지방, 신호전달 펩티드, 항체, 비타민, 메신저, 2차 메신저, 아미노산, cAMP, 약물, 제초제, 살진균제, 항생제, 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 실시양태는 질환의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 비-제한적인 예시적인 실시양태에는 본 발명의 방법을 사용하여 살진균제, 항생제 및/또는 기타 약물을 이를 필요로 하는 세포에 전달하는 것이 포함된다.

본 발명의 측면에서, 감마-제인 연결된 구조물이 다양한 식물 세포 소기관 내로 흡수될 수 있다. 감마-제인 연결된 구조물이 흡수될 수 있는 위치의 예로는 시토졸, 핵, 액포막(tonoplast), 색소체, 황색체(etioplast), 유색체(chromoplast), 백색체(leucoplast), 유지방체(elaioplast), 단백질체(proteinoplast), 녹말체(amyloplast), 엽록체, 및 이중막의 내강이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 세포 벽을 포함하는 세포 내로 감마-제인 연결된 구조물이 흡수되는 것은 심플라스트(symplast) 또는 아포플라스트(apoplast) 경로를 통해 발생할 수 있다.

본 발명의 추가적인 실시양태는 하나 이상의 핵산이 본 발명의 방법을 통해 세포 내에 도입된 유전자 변형 식물 세포 및 이를 생성시키는 방법을 포함한다. 실시양태의 한 예에서, 관심 유전자 및 선택 마커를 포함하는 플라스미드가 본 발명에 따라 감마-제인을 통해 세포 벽이 있는 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 관심 유전자 및/또는 선택 마커가 안정적으로 통합된 안정적인 형질전환체를 선택할 수 있다. 별법적인 실시양태에서, 이제 관심 유전자를 포함하는 식물 세포를 관심 분자를 포함하는 다른 세포를 생산하도록 번식시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 이제 관심 분자를 포함하는 식물 세포는 관심 분자를 포함하는 전체 식물을 재생시키는데 사용될 수 있는 재생가능한 세포일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조직 배양물에서 사용하기 위한 관심 분자를 포함하는 재생가능한 식물 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 조직 배양물은 재생가능한 세포와 실질적으로 동일한 유전자형의 식물을 재생시킬 수 있다. 이같은 조직 배양물 내의 재생가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리 또는 줄기일 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 조직 배양물로부터 재생된 식물을 제공한다.

별법적으로, 본 발명은 감마-제인 연결된, 원하는 형질을 제공할 수 있는 관심 유전자를 세포 벽이 있는 식물 세포 내에 두는 단계 및 감마-제인 연결된 관심 유전자가 세포 벽을 가로질러 흡수되게 하는 단계를 포함하는, 세포 벽이 있는 식물 세포 내로 원하는 형질을 도입하는 방법을 제공한다. 원하는 형질의 예로는 웅성 불임, 제초제 저항성, 곤충 저항성, 박테리아, 진균 및/또는 바이러스 질환에 대한 저항성, 및 최종 사용자에 대한 이익 예컨대 변형된 오일 프로파일, 변경된 전분 및 섬유 함량, 증대된 비타민 및 아미노산 함량 등을 부여하는 형질로부터 선택된 형질이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 추가적인 측면은 식물 세포 벽을 가로지르는, 감마-제인 매개된 전좌에 의해 원하는 관심 분자 또는 유전자가 최초로 도입될 수 있는, 원하는 관심 분자 또는 유전자를 포함하는 안정적인 식물 계통을 생성시키는 방법을 제공한다. 유전학적으로 또는 다른 방식으로 변경된 식물 계통을 안정화시키는 방법은 당업자에게 주지되어 있으며, 자가수정, 역교배, 잡종 생산, 안정적인 집단에 대한 교배 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 기법이 이에 포함된다. 세포 벽을 가로지르는, 감마-제인 매개된 전달에 의해 식물 세포 (또는 그의 선조) 내로 최초로 도입된 원하는 관심 분자 또는 유전자를 포함하는 모든 식물 및 식물 세포가 본 발명의 범주 내에 속한다. 유리하게는, 세포 벽을 가로지르는, 감마-제인 매개된 전달에 의해 식물 또는 세포 (또는 그의 선조) 내로 최초로 도입된 관심 분자 또는 유전자를 포함하는 식물 세포는 우수한 특징 및 표현형의 제1 세대 (F₁) 잡종 세포, 종자 및/또는 식물을 생산하기 위해 다른 상이한 식물과의 교배물을 육종하는데 사용될 수 있다.

관심 분자가 하나 이상의 유전자(들)을 포함하는 실시양태에서, 이러한 유전자(들)은 우성 또는 열성 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 유전자(들)는 제초제 저항성, 곤충 저항성, 박테리아 저항성, 진균 저항성, 바이러스 질환 저항성, 웅성 가임, 웅성 불임, 강화된 영양 품질, 및 산업 용법과 같은 형질을 부여할 수 있다.

특정 단백질 또는 RNA 생성물 (예를 들어, RNAi)을 코딩하는 유전자의 단리 및 특성화를 허용한 분자 생물학 기법이 도래하면서, 식물 생물학 분야의 과학자들은 세포의 형질을 특정 방식으로 변경하기 위해 외래 유전자 또는 추가적이거나 변형된 버전(version)의 천연 또는 내인성 유전자 (아마도 상이한 프로모터에 의해 추진될 것임)를 함유 및 발현하도록 세포 게놈을 조작하는 것에 강한 관심을 나타냈다. 이같은 외래의 추가적 및/또는 변형 유전자는 본원에서 총괄적으로 "트랜스진(transgene)"으로 지칭된다. 최근 15-20년에 걸쳐, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 여러 방법이 개발되었고, 특정 실시양태에서, 본 발명은 감마-제인 연결된 구조물의 식물 세포 벽 및 막을 가로지르는 흡수를 통해 세포 벽이 있는 식물 세포 내로 트랜스진을 도입하는 것을 통한 형질전환된 버전의 세포 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시양태에서, 이러한 트랜스진이 발현 벡터 내에 함유될 수 있다.

세포 형질전환은 특정 세포에서 기능할 구축물을 코딩하는 발현 벡터의 구축을 수반할 수 있다. 이같은 벡터는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 있거나 또는 이에 작동적으로 연결된 유전자를 포함하는 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 하나 이상의 이같은 작동가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합물을 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드의 형태일 수 있고, 세포 벽을 포함하는 식물 세포의 유전 물질 내로 트랜스진(들)을 혼입시키기 위해 본원에 기술된 바와 같은 형질전환 방법을 사용하여 형질전환된 세포를 생산하도록 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합되어 사용될 수 있다.

감마-제인을 통한 흡수를 위한 발현 벡터: 마커 또는 리포터 유전자

발현 벡터는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 유전 마커를 포함할 수 있고, 이는 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선택 (즉, 선택 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 억제함)에 의해 또는 양성 선택 (즉, 유전 마커에 의해 코딩되는 생성물에 대해 스크리닝함)에 의해 회수되도록 한다. 형질전환에 대한 다수의 선택 마커 유전자가 형질전환 업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학 작용제를 대사적으로 해독하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 억제제에 대해 불감성일 수 있는 변경된 표적을 코딩하는 유전자가 이에 포함된다. 몇몇 양성 선택 방법이 또한 업계에 공지되어 있다.

식물 형질전환에 적절한 한가지 통상적으로 사용되는 선택 마커 유전자에는 식물 조절 신호의 제어 하의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (nptII) 유전자가 포함될 수 있고, 이는 카나마이신에 대한 저항성을 부여한다. 예를 들어, 문헌 [Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983)] 참조. 또 다른 통상적으로 사용되는 선택 마커 유전자는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자일 수 있고, 이는 히그로마이신 항생제에 대한 저항성을 부여한다. 예를 들어, 문헌 [Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985)] 참조.

항생제에 대한 저항성을 부여하는 박테리아 기원의 추가적인 선택 마커 유전자에는 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제, 아미노글리코시드-3'-아데닐 트랜스퍼라제, 및 블레오마이신 저항성 결정인자가 포함된다. 문헌 [Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988)], [Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987)], [Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990)], [Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986)] 참조. 또 다른 선택 마커 유전자는 제초제 예컨대 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐에 대한 저항성을 부여한다. 문헌 [Comai et al., Nature 317:741-744 (1985)], [Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)] 및 [Stalker et al., Science 242:419-423 (1988)] 참조. 제초제에 대한 내성을 부여하는 선택 마커에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT)가 포함된다.

식물 형질전환에 적절한 또 다른 선택 마커 유전자는 박테리아 기원이 아니다. 이러한 유전자에는, 예를 들어, 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제, 식물 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 및 식물 아세토락테이트 신타제가 포함된다. 문헌 [Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987)], [Shah et al., Science 233:478 (1986)], [Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990)] 참조.

식물 형질전환에 적절한 또 다른 마커 유전자 부류는 독성 물질, 예컨대 항생제에 대한 저항성에 대한 형질전환된 세포의 직접적인 유전학적 선택보다는 형질전환된 것으로 추정되는 식물 세포의 스크리닝을 필요로 한다. 이러한 유전자들은 특정 조직 내에서의 유전자의 공간적인 발현 패턴을 정량 또는 가시화하는데 특히 유용하고, 종종 리포터 유전자로 지칭되는데, 이는 이들이 유전자 발현의 조사를 위해 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문이다. 형질전환된 세포를 스크리닝하기 위한 통상적으로 사용되는 유전자에는 β-글루쿠로니다제 (GUS), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제가 포함된다. 문헌 [Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987)], [Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989)], [Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131 (1987)], [DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984)] 참조.

최근, 식물 조직의 파괴를 필요로 하지 않는 GUS 활성을 가시화하기 위한 생체내 방법이 이용가능하게 되었다. 문헌 [Molecular Probes publication 2908, Imagene Green.TM., p. 1-4(1993)] 및 [Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991)]. 그러나, GUS 활성을 가시화하기 위한 이러한 생체내 방법은 낮은 감도, 높은 형광 배경, 및 루시퍼라제 유전자를 선택 마커로 사용하는 것과 연관된 제한으로 인해 형질전환된 세포의 회수에 유용한 것으로 입증되지 않았다.

더욱 최근에는, 형광 단백질 (예를 들어 GFP, EGFP, EBFP, ECFP, 및 YFP)을 코딩하는 유전자들이 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 유전자 발현에 대한 마커로서 이용되었다. 문헌 [Chalfie et al., Science 263:802 (1994)] 참조. 형광 단백질 및 형광 단백질의 돌연변이를 스크리닝가능 마커로서 사용할 수 있다.

감마-제인을 통한 흡수를 위한 발현 벡터: 프로모터

발현 벡터 내에 포함된 유전자는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 구동되어야 한다. 여러 유형의 프로모터가 형질전환 업계에 현재 주지되어 있고, 단독으로 또는 프로모터와 함께 사용될 수 있는 다른 조절 요소도 마찬가지이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "프로모터"는 전사 시작부로부터 상류일 수 있고 RNA 폴리머라제 및 기타 단백질의 인식 및 결합에서 수반되어 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 영역에 대한 언급을 포함한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서의 전사를 개시시킬 수 있는 프로모터일 수 있다. 발달에 따른 제어 하의 프로모터의 예로는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 우선적으로 전사를 개시시키는 프로모터가 포함된다. 이같은 프로모터는 "조직 선호형"으로 지칭된다. 특정 조직에서만 전사를 개시시키는 프로모터는 "조직 특이적"으로 지칭된다. "세포 유형" 특이적 프로모터는 주로 하나 이상의 기관 내의 특정 세포 유형, 예를 들어, 뿌리 또는 잎 내의 관 세포에서 발현을 구동시킨다. "유도성" 프로모터는 환경적 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의한 전사를 초래할 수 있는 환경적 조건의 예로는 혐기성 조건 또는 빛의 존재가 포함된다. 조직 특이적, 조직 선호형, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경적 조건 하에 활성일 수 있는 프로모터일 수 있다.

A. 유도성 프로모터

유도성 프로모터가 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 임의적으로, 유도성 프로모터가 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유도성 프로모터를 이용할 경우, 유도제에 반응하여 전사율이 증가한다.

임의의 유도성 프로모터를 본 발명에서 사용할 수 있다. 문헌 [Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)] 참조. 예시적인 유도성 프로모터에는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 것 (문헌 [Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)]); 벤젠술폰아미드 제초제 독성완화제(safener)에 반응하는 메이즈로부터의 In2 유전자 (문헌 [Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991)] 및 [Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)]); 및 Tn10으로부터의 Tet 리프레서(repressor) (문헌 [Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)])가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특히 유용한 유도성 프로모터는 식물이 정상적으로는 반응하지 않는 유도제에 반응하는 프로모터일 수 있다. 예시적인 유도성 프로모터는 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터일 수 있다. 문헌 [Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991)].

B. 구성적 프로모터

구성적 프로모터가 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 구성적 프로모터가 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

여러 구성적 프로모터를 본 발명에서 사용할 수 있다. 예시적인 구성적 프로모터에는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 CaMV로부터의 35S 프로모터 (문헌 [Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)]) 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 7,053,205 및 6,664,384 참조); 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터 (문헌 [McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)]); 유비퀴틴 (문헌 [Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)] 및 [Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)]); pEMU (문헌 [Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)]); MAS (문헌 [Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)]); 및 메이즈 H3 히스톤 (문헌 [Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992)] 및 [Atanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992)]이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자에 대해 5'인 Xba1/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열)가 특히 유용한 구성적 프로모터를 나타낸다. PCT 출원 WO 96/30530 참조.

C. 조직 특이적 또는 조직 선호형 프로모터

조직 특이적 프로모터가 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 임의적으로, 조직 특이적 프로모터가 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 세포 내에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자로 형질전환된 식물은 특정 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 이러한 트랜스진의 단백질 생성물을 생산할 수 있다.

임의의 조직 특이적 또는 조직 선호형 프로모터를 본 발명에서 이용할 수 있다. 예시적인 조직 특이적 또는 조직 선호형 프로모터에는 뿌리 선호형 프로모터, 예컨대 파세올린(phaseolin) 유전자로부터의 것 (문헌 [Murai et al., Science 23:476-482 (1983)] 및 [Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)]); 잎 특이적 및 광 유도형 프로모터 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것 (문헌 [Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985)] 및 [Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)]); 꽃밥 특이적 프로모터 예컨대 LAT52로부터의 것 (문헌 [Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)]); 화분 특이적 프로모터 예컨대 Zm13으로부터의 것 (문헌 [Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)]) 또는 소포자 선호형 프로모터 예컨대 apg로부터의 것 (문헌 [Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)])이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

트랜스진에 의해 생산된 단백질을 세포하(subcellular) 구획, 예컨대 엽록체, 액포, 퍼록시솜, 글리옥시솜, 세포 벽 또는 미토콘드리아로 또는 분비를 위해 아포플라스트 내로 수송하는 것은 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 관심 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 및/또는 3' 영역에 작동가능하게 연결시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 구조 유전자의 5' 및/또는 3' 말단의 표적화 서열은, 단백질 합성 및 프로세싱 동안, 코딩되는 단백질이 궁극적으로 구획화될 수 있는 곳을 결정할 수 있다. 별법적으로, 이같은 세포하 구획 표적화 단백질이 감마-제인에 직접적으로 연결되어, 관심 분자를 원하는 세포하 구획에 지시할 수 있다.

신호 서열의 존재는 폴리펩티드를 세포내 소기관 또는 세포하 구획으로, 또는 분비를 위해 아포플라스트로 지시한다. 다수의 신호 서열이 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992)], [Close, P. S., Master's Thesis, Iowa State University (1993)], [Knox, C. et al., "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley", Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987)], [Lerner et al., Plant Physiol. 91:124-129 (1989)], [Fontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991)], [Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991)], [Gould et al., J. Cell. Biol. 108:1657 (1989)], [Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991)], [Kalderon et al., A short amino acid sequence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509 (1984)], [Steifel et al., Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation, Plant Cell 2:785-793 (1990)] 참조.

외래 단백질 유전자 및 작물학 유전자

본 발명에 따른 트랜스제닉 식물을 이용하면, 외래 단백질을 상업적인 양으로 생산할 수 있다. 따라서, 업계에서 잘 이해되는, 형질전환된 식물의 선택 및 번식을 위한 기법으로 다수의 트랜스제닉 식물이 산출되고, 통상적인 방식으로 이를 수확한 후, 외래 단백질을 관심 조직으로부터 또는 전체 바이오매스(biomass)로부터 추출할 수 있다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은 공지된 방법에 의해 달성될 수 있고, 이는, 예를 들어, 문헌 [Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)]에 논의되어 있다.

본 발명의 측면에서, 외래 단백질의 상업적인 생산용으로 제공되는 트랜스제닉 식물은 세포 또는 식물일 수 있다. 다른 측면에서, 관심 바이오매스가 종자일 수 있다. 더 높은 수준의 발현을 나타내는 비교적 적은 개수의 트랜스제닉 식물을 위해, 주로 통상적인 RFLP, PCR 및 SSR 분석을 통해 유전자 지도가 생성될 수 있고, 이는 통합된 DNA 분자의 대략적인 염색체 위치를 식별한다. 이와 관련된 예시적인 방법에 대해, 문헌 [Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993)]을 참조한다. 염색체 위치에 관한 지도 정보는 대상 트랜스제닉 식물의 소유권 보호에 유용할 수 있다. 허가되지 않은 번식이 착수되거나 다른 생식 세포질과의 교배가 이루어졌을 수 있으면, 통합 영역의 지도를 의심되는 식물에 대한 유사한 지도와 비교하여 후자가 대상 식물과 공통적인 태생인지를 결정할 수 있다. 지도 비교는 혼성화, RFLP, PCR, SSR 및 서열분석을 수반할 것이고, 이들 모두는 통상적인 기법이다.

마찬가지로, 작물학 유전자가 형질전환된 세포 또는 그의 자손에서 발현될 수 있다. 더욱 특히, 작물학적으로 관심이 있는 다양한 표현형을 발현하도록 식물이 본 발명의 방법을 통해 유전자 조작될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 예시적인 유전자에는 하기에 분류된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

1. 해충 또는 질환에 대한 저항성을 부여하고 하기를 코딩하는 유전자:

A) 식물 질환 저항성 유전자. 식물 내의 질환 저항성 유전자 (R)와 병원체 내의 상응하는 비-병원성(avirulence) (Avr) 유전자의 생성물 간의 특이적 상호작용에 의해 식물 방어가 종종 활성화된다. 특정 병원체 균주에 대해 저항성인 식물을 조작하기 위해 식물 변종이 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Science 266:789 (1994)] (클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성을 위한 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); [Martin et al., Science 262:1432 (1993)] (슈도모나스 시린가에 병원성변종 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato)에 대한 저항성을 위한 토마토 Pto 유전자가 단백질 키나제를 코딩한다); [Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994)] (슈도모나스 시린가에에 대한 저항성을 위한 아라비돕스(Arabidops) RSP2 유전자) 참조.

B) 해충, 예컨대 대두 시스트(cyst) 선충에 대한 저항성을 부여하는 유전자. 예를 들어, PCT 출원 WO 96/30517; PCT 출원 WO 93/19181 참조.

C) 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체 또는 이를 모델로 하는 합성 폴리펩티드. 예를 들어, Bt δ-내독소 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열이 개시된 문헌 [Geiser et al., Gene 48:109 (1986)] 참조. 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자를, 예를 들어, ATCC 등록 번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection) (버지니아주 마나사스)로부터 구입할 수 있다.

D) 렉틴. 예를 들어, 여러 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시된 문헌 [Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)]의 개시내용 참조.

E) 비타민-결합 단백질, 예컨대 아비딘. PCT 출원 US93/06487 참조. 이 출원은 곤충 해충에 대한 살유충제로서의 아비딘 및 아비딘 상동체의 용도를 교시한다.

F) 효소 억제제, 예를 들어, 프로테아제 또는 프로테이나제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 예를 들어, 문헌 [Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987)] (벼 시스테인 프로테이나제 억제제의 뉴클레오티드 서열), [Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993)] (담배 프로테이나제 억제제 I을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열), [Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993)] (스트렙토미세스 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) α-아밀라제 억제제의 뉴클레오티드 서열) 및 미국 특허 번호 5,494,813 (헤퍼(Hepher) 및 앳킨슨(Atkinson), 1996년 2월 27일 등록) 참조.

G) 곤충 특이적 호르몬 또는 페로몬 예컨대 엑디스테로이드(ecdysteroid) 또는 유충 호르몬, 그의 변이체, 그를 기초로 하는 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제. 예를 들어, 유충 호르몬의 불활성화제인 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바큘로바이러스 발현에 대한 문헌 [Hammock et al., Nature 344:458 (1990)]의 개시내용 참조.

H) 발현 시, 영향을 받는 해충의 생리학을 파괴하는 곤충 특이적 펩티드 또는 신경펩티드. 예를 들어, 문헌 [Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994)] (발현 클로닝으로 곤충 이뇨 호르몬 수용체를 코딩하는 DNA가 산출된다), 및 [Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989)] (디플로프테라 푼타타(Diploptera puntata)에서 알로스타틴(allostatin)이 동정될 수 있다)의 개시내용 참조. 곤충 특이적인 마비성 신경독소를 코딩하는 유전자가 개시된 미국 특허 번호 5,266,317 (토말스키(Tomalski) 등)을 또한 참조한다.

I) 뱀, 말벌 또는 임의의 기타 유기체에 의해 천연적으로 생산된 곤충 특이적 독. 예를 들어, 전갈의 곤충 독성 펩티드를 코딩하는 유전자의 식물에서의 이종성 발현의 개시에 대해 문헌 [Pang et al., Gene 116:165 (1992)] 참조.

J) 모노테르펜(monoterpene), 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살충 활성이 있는 또 다른 비-단백질 분자의 과다축적을 초래하는 효소.

K) 생물학적으로 활성인 분자의 변형 (번역후 변형 포함)에서 수반되는 효소; 예를 들어, 천연 또는 합성의, 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지방분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제(chitinase) 및 글루카나제. 칼라제(callase) 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시된 PCT 출원 WO 93/02197 (스콧(Scott) 등) 참조. 키티나제를 코딩하는 서열을 함유하는 DNA 분자는, 예를 들어, ATCC로부터 등록 번호 39637 및 67152 하에 수득할 수 있다. 담배 박각시 유충 키티나제를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 교시된 문헌 [Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)], 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 문헌 [Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21:673 (1993)]을 또한 참조한다.

L) 신호 전달을 자극하는 분자. 예를 들어, 녹두 칼모듈린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 문헌 [Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)]의 개시내용, 및 메이즈 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 문헌 [Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994)] 참조.

M) 소수성 모멘트 펩티드. PCT 출원 WO 95/16776 (진균성 식물 병원체를 억제하는 타키플레신(Tachyplesin)의 펩티드 유도체가 개시됨) 및 PCT 출원 WO 95/18855 (질환 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드가 교시됨) 참조.

N) 막 투과효소(permease), 채널 형성제 또는 채널 차단제. 예를 들어, 트랜스제닉 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성이게 하는 세크로핀(cecropin)-β 용해성 펩티드 유사체의 이종성 발현에 대한 문헌 [Jaynes et al., Plant Sci 89:43 (1993)]의 개시내용 참조.

O) 바이러스 침습성 단백질 또는 이로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포 내의 바이러스 코트 단백질의 축적은 코트 단백질 유전자가 유래될 수 있는 바이러스, 뿐만 아니라 관련된 바이러스에 의해 초래되는 바이러스 감염 및/또는 질환 발달에 대한 저항성을 제공한다. 문헌 [Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)] 참조. 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대해 코트 단백질-매개 저항성이 형질전환된 식물에 부여되었다. 상동.

P) 곤충 특이적 항체 또는 이로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충의 장 내의 결정적인 대사 기능을 표적으로 하는 항체가 영향을 받는 효소를 불활성화시켜 곤충을 사망시킬 것이다. 문헌 [Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)] (단일쇄 항체 단편의 생산을 통한 트랜스제닉 담배에서의 효소에 의한 불활성화) 참조.

Q) 바이러스 특이적 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호되는 것을 나타내는 문헌 [Tavladoraki et al., Nature 366:469 (1993)] 참조.

R) 병원체 또는 기생충에 의해 천연적으로 생산되는 발달 저지 단백질. 예를 들어, 진균의 엔도 α-1,4-D-폴리갈락투로나제(polygalacturonase)는 식물 세포 벽의 호모-α-1,4-D-갈락투로나제(galacturonase)를 용해시킴으로써 진균 집락화 및 식물 영양소 방출을 용이하게 한다. 문헌 [Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992)] 참조. 콩 엔도폴리갈락투로나제(endopolygalacturonase) 억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화가 문헌 [Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)]에서 기술되어 있을 것이다.

S) 식물에 의해 천연적으로 생산되는 발달 저지 단백질. 예를 들어, 문헌 [Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)]은 보리 리보솜-불활성화 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 진균 질환에 대한 저항성이 증가되었음을 제시했다.

2. 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자:

A) 성장점 또는 분열 조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아. 이러한 카테고리의 예시적인 유전자는 예를 들어 문헌 [Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)] 및 [Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)]에 각각 기술된 바와 같은 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩한다.

B) 글리포세이트 (예를 들어, 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발에 의해), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자 각각에 의해 저항성이 부여됨), 기타 포스포노 화합물 예컨대 글루포시네이트 (스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)가 포함되는 스트렙토미세스(Streptomyces) 종으로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제를 코딩하는 유전자). 예를 들어, 식물에 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP 형태들의 뉴클레오티드 서열이 개시된 미국 특허 번호 4,940,835 (샤(Shah) 등), 및 미국 특허 6,248,876 (베리(Barry) 등) 참조. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자를 ATCC 등록 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 이러한 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열이 미국 특허 번호 4,769,061 (코마이(Comai))에 개시되어 있을 수 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 (쿠마다(Kumada) 등), 및 미국 특허 번호 4,975,374 (굿맨(Goodman) 등)에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 신테타제(synthetase) 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열이 유럽 출원 번호 0 242 246 (리만스(Leemans) 등)에서 제공될 수 있고, 문헌 [DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)]에는 PAT 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기술되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손, 예컨대 세톡시딤(sethoxydim) 및 할록시폽(haloxyfop)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예로는 문헌 [Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)]에 기술된 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자가 포함된다. 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 GAT 유전자가 WO 2005012515 (캐슬(Castle) 등)에 기술되어 있다. 2,4-D, 페녹시 프로프리온산 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 WO 2005107437 (다우 아그로사이언시즈 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)에게 양도됨)에 기술되어 있다.

C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제(nitrilase) 유전자). 문헌 [Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)]에, 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드로의 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환이 기술되어 있다. 니트릴라제 유전자들에 대한 뉴클레오티드 서열이 미국 특허 번호 4,810,648 (스톨커(Stalker))에 개시되어 있고, 이러한 유전자들을 함유하는 DNA 분자가 ATCC 등록 번호 53435, 67441, 및 67442 하에 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현이 문헌 [Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에서 기술될 수 있다.

3. 부가 가치가 있는 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자, 예컨대:

A) 예를 들어, 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위해 스테아릴-ACP 데새투라제(desaturase)의 안티센스 유전자로 식물을 형질전환시키는 것에 의한, 변형된 지방산 대사. 문헌 [Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992)] 참조.

B) 감소된 파이테이트(phytate) 함량 -- 1) 파이타제(phytase)를 코딩하는 유전자의 도입이 파이테이트의 분해를 강화하여, 형질전환된 식물에 더 많은 유리 포스페이트를 부가할 것이다. 예를 들어, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 파이타제 유전자의 뉴클레오티드 서열의 개시에 대해 문헌 [Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)] 참조. 2) 파이테이트 함량을 감소시킨 유전자를 도입할 수 있다. 예를 들어 메이즈에서, 이는 낮은 파이트산 수준을 특징으로 하는 메이즈 돌연변이체를 초래할 수 있는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 후 재도입함으로써 달성될 수 있다. 문헌 [Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)] 참조.

C) 예를 들어 전분의 분지 패턴을 변경하는 효소를 코딩하는 유전자로 식물을 형질전환시킴으로써 실행되는, 변형된 탄수화물 조성. 문헌 [Shiroza et al., J. Bacteol. 170:810 (1988)] (스트렙토코쿠스(Streptococcus) 돌연변이체 프룩토실트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열), [Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985)] (바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 뉴클레오티드 서열이 레반수크라제(levansucrase) 유전자일 수 있다), [Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992)] (바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산), [Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21:515 (1993)] (토마토 인버타제(invertase) 유전자의 뉴클레오티드 서열), [Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268:22480 (1993)] (부위 지정 돌연변이유발이 보리 α-아밀라제 유전자의 것일 수 있다), 및 [Fisher et al., Plant Physiol. 102:1045 (1993)] (메이즈 배유 전분 분지 효소 II) 참조.

본 발명의 특정 실시양태에서, 감마-제인이 나노입자에 융합될 수 있다. 나노입자의 표면이 관능화될 수 있고, 이는, 예를 들어, 표적화된 흡수를 허용하거나 또는 나노입자의 표면에 대한 다른 물질의 가역적 또는 비가역적 결합을 허용한다. 비-제한적인 예로서, 나노입자 (예를 들어, 금 나노입자 또는 양자 점)의 표면이 예를 들어 알칸티올레이트의 자가-조립 단층으로 관능화될 수 있고, 이러한 단층이 추가로 관능화 또는 유도체화될 수 있다. 추가적인 비-제한적인 예에서, 나노입자의 표면이 링커로 유도체화될 수 있고, 이러한 링커 자체가 추가로 관능화 또는 유도체화될 수 있다. 한 실시양태에서, 나노입자가 PEG화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노입자가 코어 (활성 또는 불활성), 입체 코트(steric coat) (활성 또는 불활성), 절단가능한 결합, 및/또는 표적화 분자 또는 리간드 중 하나 이상을 포함할 수 있거나 또는 이들 중 하나 이상으로 다중관능화될 수 있다. 나노입자는 금 나노입자, 금으로 코팅된 나노입자, 다공성 나노입자, 메조다공성 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노입자, 텅스텐 나노입자, 젤라틴 나노입자, 나노쉘, 나노코어, 나노스피어, 나노막대, 자기 나노입자, 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 실시양태에서, 감마-제인이 양자 점에 융합될 수 있다.

본 발명의 측면에서, 감마-제인 및 나노입자가 세포의 다양한 부분 내로 흡수될 수 있다. 나노입자가 흡수될 수 있는 위치의 예로는 시토졸, 핵, 액포막, 색소체, 황색체, 유색체, 백색체, 유지방체, 단백질체, 녹말체, 엽록체, 및 이중막의 내강이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 세포 벽을 포함하는 세포 내로의 나노입자 흡수는 심플라스트 또는 아포플라스트 경로를 통해 발생할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 감마-제인 및 양자 점이 세포의 상기 언급된 다양한 부분 내로 흡수될 수 있다.

실시예

본 발명이 하기의 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 예시를 위해 제공되고 본 발명을 어떠한 방식으로도 한정하도록 의도되지 않는다.

실시예 1

감마-제인 / YFP 융합 단백질의 구축

감마-제인 단백질 (진뱅크(GenBank) 등록 # AAL16977.1, GI:16305109)의 변형된 제아 메이스(Zea mays) N-말단 영역을 코딩하는 DNA 서열을 필라디움(Philadium) 황색 형광 단백질 (YFP) (에브로젠(Evrogen), 러시아 모스크바)의 N-말단에 융합시켰다. 아미노산 6개의 감마-제인 모티프가 변형되었고, 이때 두번째 잔기가 히스티딘에서 아르기닌으로 변화되었다. 이러한 변형은 융합 서열을 핵에 지시하기 위해 이루어졌다. 아르기닌은 세포의 시토졸 및 핵 내로의 단백질 전좌의 효율을 개선하는 것으로 나타났다. (문헌 [Mitchell, et al., (2000), The Journal of Peptide Research, 56 (5): 318-325]). 감마-제인의 N-말단 영역의 변형된 아미노산 6개 (VRLPPP)의 삼량체를 YFP에 융합시켰다. 추가적으로, 6×-His 태그(tag)를 감마-제인 삼량체와 YFP 코딩 서열 사이에 놓았다. 6×-His 모티프는 단백질 정제를 용이하게 하기 위해 첨가되었다. 이러한 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열 1로 제시된다.

융합 유전자 서열 (서열 2)을 자동 DNA 합성기를 통해 포스포르아미디트 화학을 사용하여 화학적으로 합성하였다. 이러한 서열의 화학적 합성을 DNA2.0 (캘리포니아주 멘로 파크)에 외주하였다. 이러한 서열은 "이. 콜라이(E. coli) 최적화" 뉴클레오티드 서열을 생산하기 위해 DNA2.0의 소유권이 있는 알고리즘을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 발현에 대해 코돈이 최적화되었다. 이러한 알고리즘은 원하는 숙주 생물에서 드물게 사용되는 코돈을 확인하고, 이러한 코돈을 더욱 빈번하게 사용되는 코돈으로 교체한다. 또한, 이러한 알고리즘은 시스(cis)-조절 서열 (예를 들어 RNase 부위, RNA 2차 구조, 전사 종결 부위) 및 과잉된 제한 효소를 제거한다. 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위해 감마-제인 / YFP 융합 유전자의 끝부분에 추가적인 서열을 부가하였다. 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 (문헌 [Shine J, Dalgarno L (1975). Nature 254 (5495): 34-8]) 및 독특한 SpeI 제한 효소 부위를 이러한 유전자 서열의 5' 끝부분에 부가하였다. 독특한 XhoI 제한 효소 부위를 이러한 유전자 서열의 3' 끝부분에 부가하였다. 생성된 벡터를 pJ201:18056 (도 1)로 표지하였다.

1.1 pET 발현 벡터의 구축

감마-제인 / YFP 융합 서열을 표준 클로닝 기법을 통해 이. 콜라이 발현 벡터 pET280 내로 클로닝하였다. pET280은 pET28 플라스미드 (노바젠(Novagen), 뉴저지주 깁스타운)의 변형 버전이다. 다중 클로닝 부위 및 리보솜 결합 부위를 pET28로부터 제거함으로써 pET280이 생성되었다. 감마-제인 / YFP 코딩 서열을 함유하는 SpeI - XhoI 단편을 pJ201:18056 벡터로부터 절제하고, pET280 발현 벡터의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 제한 효소 소화 및 서열분석을 통해 확인하였다. 플라스미드를 BL21 (DE3) 에스케리키아 콜라이 적격 세포 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 단리하고, 추후 사용까지 글리세롤 스톡(stock)으로 보관하였다.

1.2 감마-제인 / YFP 융합 단백질의 발현 및 단리

하기의 조건을 사용하여 감마-제인 /YFP 융합 단백질을 유도하였다: pET280 / 감마-제인 / YFP 발현 구축물을 함유하는 배양물을 25℃에서 2 리터 (L)의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 브로스(broth) 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신에서 O.D.₆₀₀ 0.6으로 성장시켰다. 원하는 O.D.₆₀₀에 도달한 후, 배양물을 16시간 동안 25℃에서 0.1 mM IPTG (이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드)로 유도하였다.

발현된 감마-제인 / YFP 융합 단백질을 단리하고, 정제하였다. 2L 세포 배양물을 24,000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 5 g의 감마-제인 / YFP를 함유하는 세포 페이스트를 100 ㎖ 저온 추출 용액 (PBS 내의 0.5 M NaCl, 5％ 글리세롤, 및 0.5 ㎖ 시그마 프로테아제 억제제(Sigma Protease Inhibitor) 칵테일 (카탈로그# P8849))에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 15분 동안 초음파처리 (브랜슨 초음파파쇄기(Branson Sonifier) 모델 450)를 사용하여 세포를 파괴시켰다. 샘플을 24,000×g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 0.45 ㎛ 밀리포어(Millipore)® 여과 기구로 여과하였다. 이미다졸을 10 mM의 최종 농도로 샘플에 첨가하였다. 감마-제인 / YFP를 함유하는 용해물을 Akt™ 익스플로러(Akt™ Explorer) 100 시스템 (GE/파마시아(Pharmacia))를 사용하여 직렬식 2 × 5 ㎖ 히스트랩(HisTrap)™ 칼럼 (GE/파마시아, 카탈로그# 17-5248-02) 상에 5 ㎖/분으로 로딩하였다. A280 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 칼럼을 완충제 A (PBS 내의 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸)로 세척하였다. 그 후, 칼럼을 순차적으로 약 4× 칼럼 부피 (CV)인 부피의 10％ 및 20％ 완충제 B (완충제 A 내의 0.2 M 이미다졸)로 세척하였다. 샘플을 10-15 CV에 걸쳐 20-100％ 완충제 B로 용리시키고, 4 ㎖ 분획을 수집하였다 (도 2).

1.3 SDS-PAGE 분석

분획화된 단백질을 가시화하기 위해 단백질 겔을 러닝하였다. 엑스셀 슈어록™ 미니-셀(XCell SureLock™ Mini-Cell) (인비트로젠, 카탈로그# EI0001)을 사용하여 전기영동하기 위해 10-20 ㎕의 각각의 샘플을 미리 성형된 10％ 비스-트리스(Bis-Tris) SDS-PAGE 겔 (인비트로젠, 카탈로그# NP0302BOX) 상에 로딩하였다. 샘플을 MES-SDS 러닝 완충제 (인비트로젠, 카탈로그# NP0002)에서 35분 동안 200V에서 러닝시켰다. 도 3에 도해된 바와 같이, 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) R-250 (바이오-래드(Bio-Rad), 카탈로그# 161-0436)으로 염색하였다. 감마-제인 / YFP 샘플을 함유하는 분획을 풀링(pooling)하고, 10 kDa MWCO의 밀리포어 스핀(Millipore Spin) 칼럼 내로 옮기고, 탁상용 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 (모델 5810R)를 사용하여 4,000 rpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 완충제 교환을 위해 멸균 PBS 용액을 15 ㎖까지 첨가하였다. 이러한 스핀 및 투석여과 공정을 3회 반복하였다. 풀링된 감마-제인 / YFP 샘플을 10 kDa MWCO의 스네이크스킨(SnakeSkin)™ 주름 투석 튜빙 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그# 68100)으로 옮기고, 4℃에서 밤새 2 L의 PBS에 대해 투석하여 이미다졸 잔류물을 제거하였다. 소 혈청 알부민 (BSA) 표준물과 함께 브래드포드(Bradford) 검정 (바이오-래드, 카탈로그# 500-0006)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다 (도 3).

1.4 말디-토프 펩티드 질량 핑거프린팅(fingerprinting)

SDS-PAGE 겔로부터의 1 ㎍ 단백질 밴드 (약 1 ㎍)를 절제하고, 스피드-백(Speed-Vac) 내에서 25％ 아세토니트릴 + 12.5 mM 중탄산암모늄에서 건조시켰다. 단백질을 밤새 인큐베이션 동안 37℃에서 트립신 (12.5 ng/㎕)으로 소화시켰다. 펩티드를 제조사의 설명서에 따라 C18 집 팁(Zip Tip) (밀리포어, 카탈로그# 2TC18S096)을 사용하여 정제하였다. 보이저 생체분광측정법(Voyager Biospectrometry) (퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems), 모델 DE STR)을 사용하여 질량 스펙트럼 분석을 수행하였고, 질량 스펙트럼을 양성 이온 반사기 양식으로 수집하였다 (도 4). 데이터를 분석 프로그램인 PAWS (프로테오메트릭스 인크.(Proteometrics Inc.))에 입력하여, 펩티드 동일성을 검색하였다.

실시예 2

단일 세포 식물 물질의 제조

2.1 JTNT1 세포

JTNT1 세포는 담배로부터 단리된 광독립영양성(photoautotrophic) 세포이다. 형질전환 3일 내지 4일 전에, 2 ㎖의 JTN1 세포를 250 ㎖ 플라스크 내의 50 nM DAS-PMTI-1 (미세소관 억제제) 및 0.5 - 0.1％ (v/v) DMSO를 함유하는 40 ㎖의 NT1B 또는 LSBY2 배지 내로 옮김으로써 현탁 배양물을 신선한 배지에 계대 배양하였다. 단일 세포를 미세소관 억제제 처리 4일 후 또는 7일 후에 수집하였다 (예를 들어, WO 2008/083233에 기술된 바와 같이). 세포를 최소 배지 및 5％ 이산화탄소에서 유지시켰다. O.D.₆₀₀ 3.0의 현탁액 1 ㎖를 옮김으로써 세포를 14일 마다 계대 배양하였다. 이러한 세포 유형을 감마-제인 / YFP 융합 펩티드의 전달 및 국소화를 위한 표적 세포로 사용하였다.

2.2 당근 세포

재생가능한 당근 동결보존된 세포주 (D2-40-018)를 해동시키고, 린스마이어-스쿠그(Linsmeier-Skoog) (LS) 배지 (문헌 [Nagata, T., Nemoto, Y., and Hasezawa, S. (1992) Int. Rev. Cyto 132, 1-30]에 기술됨)에서 배양하였다. 배지 염은 파이토테크놀러지 래버러토리즈(PhytoTechnology Laboratories)의 카탈로그 #L689로부터 구입하였다. 활발하게 성장하는 현탁 세포주가 1주일 내에 확립되었고, 7일 배양 주기로 확산광 하에 125 rpm의 궤도 진탕기 (이노바(Innova)-3300) 상에서 28℃의 58 ㎖의 LSBY2 현탁액 20 배지로 2 ㎖ PCV (충전 세포 부피)를 옮김으로써 유지 세포주를 계대 배양하였다. 단일 세포 생산을 위해, 정지기의 1 ㎖ PCV의 당근 현탁액을 30 ㎖의 LS 현탁 배지 + 1 mM 콜히친 (시그마(Sigma), 카탈로그 # C3915)에 첨가하고, 7일 동안 배양하였다. 단일 세포가 3-7일의 배양물로부터 생산되었고, 형질전환 실험용으로 준비되었다. 60 ㎖의 신선한 LS BY2 액체 배지를 첨가함으로써 14일에 배양물을 희석하는 것에 의해 당근의 단일 세포를 28일까지 정지기에서 유지시킬 수 있었다.

실시예 3

세포의 감마-제인 / YFP 융합 단백질 처리

세포를 15 ㎍ 훽스트로 10분 동안 37℃에서 예비-염색하였다. 인큐베이션 기간 후, 과량의 염색을 제거하였다. 세포를 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 세포를 3％ 수크로스를 함유하는 PBS 용액 1 ㎖로 3회 세척하였다.

감마-제인 / YFP 융합 단백질을 에펜도르프 튜브 내의 1 ㎖의 당근 단일 세포 또는 JTNT1 세포에 50 μM 농도로 첨가하였다. 튜브를 60분 동안 25℃에서 100 rpm의 진탕기 상에 놓았다.

실시예 4

식물 세포 내의 감마-제인 / YFP 융합 단백질 축적

100 ㎕의 융합 단백질 / 세포 혼합물 분취량을 영상화를 위해 10분, 30분, 및 60분에 제거하였다. 세포를 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 3회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 100 ㎕ PBS에 재현탁시켰다.

융합 펩티드의 식물 세포의 세포하 구획 및 조직 내로 내재화 및 국소화되는 효율을 모니터링하였다. 세포를 LSM-라이카(Leica)™ TCS SP2/UV 또는 짜이스(Zeiss)™ LSM 상에서 영상화하였다. 높은 개구수 (1.2-1.3)의 침수형 대물 렌즈 (63×), 및 YFP를 여기시키기 위한 아르곤 이온으로부터의 488 nm 또는 514 nm 레이저 선을 사용하였다.

공초점 및 차등 간섭 대비 (DIC) 영상을 각각 430-480 nm 및 LP560 nm 필터로 405 nm 및 488 nm 레이저를 사용하여 포착하였다. 10분 후, 감마-제인 황색 형광 신호가 당근 및 JTNT1 단일 세포 둘 모두의 핵소체 및 세포질에 국소화되는 것으로 나타났다 (도 5에 도해됨).

실시예 5

펩티드 및 플라스미드 DNA의 꽃 침지(floral dip)에 의한 아라비돕시스의 식물내(in planta) 형질전환

정제된 감마-제인 펩티드를 도 6에 도해된 플라스미드 DNA pDAB3831과 혼합하였다. 0.25 ㎎의 감마-제인 펩티드를 .5 ㎎의 플라스미드 DNA와 혼합하였고, 물에서 30분 동안 인큐베이션하여 펩티드/DNA 복합체를 형성시켰다. pDAB3831은 아라비돕시스 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10)에 의해 구동되는 PAT 선택 마커 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV)에 의해 추진되는 필라디움 황색 형광 단백질 유전자 (PhiYFP)를 함유한다. 감마-제인 펩티드 / pDAB3831 복합체 및 pDAB3831 플라스미드 DNA 단독의 별도의 실험 대조군을 아라비돕시스 탈리아나 재배종 컬럼비아(Arabidopsis thaliana cv Columbia)의 4주령 꽃봉오리에 투여하였다. 20 ㎖의 펩티드/DNA 복합체 및 20 ㎖의 DNA 대조군을 30초 동안 유리 수조에서 침윤 배지 (5％ 수크로스 및 0.04％ 실?(Silwet)-77)와 혼합하였다. 펩티드/DNA 용액을 함유하는 침윤배지를 변형된 클러프(Clough) & 벤트(Bent) 프로토콜을 사용하여 아라비돕시스 식물을 형질전환시키는데 사용하였다. (문헌 [Clough SJ and Bent AF, 1998. Plant J 16:735-43]). 침지 후, 침윤 복합체를 4℃에 보관하였고, 이어서 2일 후에 동일한 프로토콜을 사용하여 동일한 식물을 침지시키는데 사용하였다. 형질전환 빈도를 증가시키기 위해 형질전환 단계 반복이 실행되었다.

식물을 플라스틱 돔으로 덮어 24시간 동안 습도를 유지시켰다. 24시간 후, 돔을 제거하고, 식물을 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50％) 하에 120-150 μmol/㎡/초의 광 강도의 장일 조건 (16시간 명/8시간 암) 하에 컨비론(Conviron)® (CMP4030 및 CMP3244 모델, 컨트롤드 인바이런먼츠 리미티드(Controlled Environments Limited), 캐나다 마니토바주 위니펙)에서 정상적으로 성장시켰고, 성숙되고 종자를 생산하게 하였다. T0 종자를 수집하고 멸균시켰다. 추가적으로, 종자를 2일 동안 4℃에서 춘화 처리하였다. 양성 형질전환체를 선택하기 위해, 종자를 10 ㎍/㎖ BASTA를 함유하는 MS 배지 (0.43％ 무라시게(Murashige) 및 스쿠그(Skoog) 염 혼합물, 2.5 mM 2-[N-모르폴리노]에탄술폰산, 1× 갬보르그(Gamborg) 비타민 용액, 0.9％ 박토-한천(bacto-agar), pH 5.7-5.9)에 플레이팅하고, 인큐베이터 (22℃, 100 μmole 양자/㎡/초)에서 7-10일 동안 성장시켰다. 추정 형질전환체를 확인하고, 토양으로 옮기고, 성숙되도록 성장시켰다.

실시예 6

PAT 및 YFP 트랜스진에 대한 분자적 분석

트랜스제닉 아라비돕시스 식물로부터의 gDNA 및 대조군인 야생형의 아라비돕시스 생태형 컬럼비아로부터의 gDNA를 식물 DNAZOL(Plant DNAZOL) 키트 (인비트로젠 인크)를 사용하여 6주령 식물의 잎 물질로부터 추출하였다. PAT 및 YFP 유전자 단편이 트랜스제닉 식물로부터만 PCR에 의해 증폭되었다. 50 ㎕ PCR 반응 혼합물은 100 ng의 주형 DNA, 1× ExTaq 반응 완충제 (다카라 바이오(TaKaRa Bio)), 0.2 mM dNTP, 10 pM의 각각의 프라이머, 및 0.025 유닛/㎕의 ExTaq을 함유하였다. YFP 프라이머가 서열 3 및 서열 4로 제시된다. PAT 프라이머가 서열 5 및 서열 6으로 제시된다. 96℃에서 5분의 사이클 1회, 94℃, 15초; 65℃, 30초; 72℃, 1분의 PCR 프로그램의 사이클 31회의 PCR 사이클 조건을 사용하였고, 최종 연장을 72℃에서 7분 동안 수행하여 생성물 합성을 완료하였다. 증폭된 단편을 퀴아퀵(QIAquick)™ 겔 추출 키트 (퀴아젠 인크(Qiagen Inc))를 사용하여 겔-정제하였다. PCR 단편을 진보형 생어(Sanger) 서열분석 기술 (MWG 바이오테크놀러지즈, 인크(MWG Biotechnologies, Inc))을 사용하여 PAT 전방향 프라이머 (서열 5) 및 YFP 전방향 프라이머 (서열 3)를 사용하여 서열분석하였고, 서열을 시퀀처(Sequencher)™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

실시예 7

개선된 단백질 전좌 효율을 위한 감마-제인 서열의 상동성 모티프의 확인 및 돌연변이유발

감마-제인 도메인에 대해 상동성인 추가적인 모티프를 확인하고, 세포내 단백질 전좌에 대해 시험하였다. 현재의 공공 데이터베이스, 예컨대 NCBI (미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information))로부터 이러한 서열들을 확인하였다. 감마-제인 서열을 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (문헌 [Altschul et al., 1997]) 알고리즘에 대한 입력물로 사용하였다. 디폴트 설정을 사용하여, 이러한 서열을 기탁된 NCBI 단백질 서열들에 대해 비교하였다. 이러한 검색은 여러 상동성 단백질 서열을 보고하였다. 확인된 감마-제인 모티프를 세포내 단백질 전좌 효율을 강화하도록 변형시켰다. VRLPPP 서열의 다양한 잔기를 부위 지정 돌연변이유발 프로토콜을 통해 변화시켰다. 변형된 감마-제인 서열을 상기 기술된 프로토콜을 사용하여 단백질 및 DNA를 식물 세포 내로 전달하는데 사용하였다.

실시예 8

키메라 감마-제인 서열을 사용한 세포 소기관 표적화

추가적인 실험을 수행하여 키메라 감마-제인 / 세포 소기관 표적화 모티프를 통해 세포 소기관에 펩티드를 표적화하는 것을 시험하였다. 특정 예에서, 감마-제인 및 엽록체 표적화 서열을 형광 단백질, 예컨대 YFP의 N-말단에 융합시켰다. YFP 단백질의 엽록체 표적화를 형광 현미경을 통해 영상화하였다. 당업계에 공지된 다양한 기타 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아, 소포체, 핵 등)에 대한 추가적인 표적화 서열을 감마-제인 서열과 함께 융합하여, 특정 세포 소기관을 표적화하는데 사용하였다. 확인된 세포 소기관에 단백질 또는 DNA가 표적화되었다.

본 발명이 특정 실시양태에서 기술되었지만, 본 발명은 이러한 개시내용의 취지 및 범주 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원은 본 발명의 그의 일반적인 원리를 사용하는 임의의 변동, 사용 또는 개조를 포함하도록 의도된다. 추가로, 본 출원은 본 발명이 속하는 업계의 공지된 또는 통상적인 관행 내에 있고 첨부된 청구항 및 그의 등가물의 한계 내에 속하는 것과 같은 본 개시내용으로부터의 변경을 포함하도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Samboju, Narasimha C Samuel, Jayakumar P Lin, Gaofeng Webb, Steven R Burroughs, Frank <120> Plant Peptide Gamma-Zein for Delivery of Biomolecules into Plant Cells <130> 2971-9405.1PC <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trimer of (VRLPPP) fused to YFP with 6x-His tag <400> 1 Met Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu 1 5 10 15 Pro Pro Pro His His His His His His Gly Ser Ser Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Phe His Gly Lys Ile Pro Tyr Val Val Glu Met Glu Gly Asn Val Asp 35 40 45 Gly His Thr Phe Ser Ile Arg Gly Lys Gly Tyr Gly Asp Ala Ser Val 50 55 60 Gly Lys Val Asp Ala Gln Phe Ile Cys Thr Thr Gly Asp Val Pro Val 65 70 75 80 Pro Trp Ser Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Ala Gln Cys Phe 85 90 95 Ala Lys Tyr Gly Pro Glu Leu Lys Asp Phe Tyr Lys Ser Cys Met Pro 100 105 110 Asp Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Thr Phe Glu Gly Asp Gly Asn 115 120 125 Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val Thr Phe Glu Asn Gly Ser Val Tyr Asn 130 135 140 Arg Val Lys Leu Asn Gly Gln Gly Phe Lys Lys Asp Gly His Val Leu 145 150 155 160 Gly Lys Asn Leu Glu Phe Asn Phe Thr Pro His Cys Leu Tyr Ile Trp 165 170 175 Gly Asp Gln Ala Asn His Gly Leu Lys Ser Ala Phe Lys Ile Cys His 180 185 190 Glu Ile Thr Gly Ser Lys Gly Asp Phe Ile Val Ala Asp His Thr Gln 195 200 205 Met Asn Thr Pro Ile Gly Gly Gly Pro Val His Val Pro Glu Tyr His 210 215 220 His Met Ser Tyr His Val Lys Leu Ser Lys Asp Val Thr Asp His Arg 225 230 235 240 Asp Asn Met Ser Leu Lys Glu Thr Val Arg Ala Val Asp Cys Arg Lys 245 250 255 Thr Tyr Leu <210> 2 <211> 811 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gamma-zein/YFP fusion gene <400> 2 gaactagtaa aaaggagaaa tccatggtgc gtctgcctcc tccagttcgt ctgccacctc 60 ctgtacgtct gccgccaccg caccatcacc accaccacgg ctcctctggt gcgctgctgt 120 tccacggcaa aatcccgtac gtggtggaga tggaaggcaa cgttgatggt catactttta 180 gcatccgtgg caaaggctat ggcgatgcct ctgtcggcaa ggttgatgcg cagttcatct 240 gcaccactgg tgatgttccg gttccatggt ctaccctggt tactaccctg acgtacggtg 300 cgcagtgttt cgctaaatac ggcccggagc tgaaagactt ctacaaatct tgtatgccgg 360 atggttatgt acaggaacgt accatcactt tcgagggtga tggtaacttc aaaacccgtg 420 cggaggttac cttcgaaaac ggcagcgtgt ataaccgtgt taaactgaac ggccagggtt 480 tcaagaaaga cggccatgtc ctgggtaaaa acctggaatt caacttcacc ccgcactgtc 540 tgtacatttg gggcgaccaa gctaaccatg gcctgaaatc cgctttcaaa atctgccacg 600 aaatcactgg ttccaaaggt gacttcattg tagcagatca cacccagatg aatactccaa 660 tcggtggcgg tccagttcat gtaccggagt atcatcatat gagctatcac gtgaaactga 720 gcaaggatgt taccgatcac cgcgataata tgagcctgaa agagactgtg cgtgcggtgg 780 actgccgtaa aacgtatctg taactcgagc g 811 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP forward primer <400> 3 tgttccacgg caagatcccc tacg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP reverse primer <400> 4 tattcatctg ggtgtgatcg gcca 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAT forward primer <400> 5 ggagaggaga ccagttgaga ttag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAT reverse primer <400> 6 agatctgggt aactggccta actg 24

Claims

세포 벽이 있는 식물 세포를 제공하는 단계;
감마-제인(zein) 펩티드를 관심 분자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 단계;
세포 벽이 있는 세포와 감마-제인 연결된 구조물을 서로 접촉시키는 단계; 및
세포 벽이 있는 세포 내로 감마-제인 연결된 구조물이 흡수(uptake)되게 하는 단계
를 포함하는, 세포 벽이 있는 식물 세포 내로 관심 분자를 도입하는 방법.
제1항에 있어서, 감마-제인 펩티드를 관심 분자와 접촉시키는 단계가 관심 분자를 감마-제인 펩티드와 융합시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 세포 벽을 포함하는 식물 세포의 구획 내로 감마-제인 연결된 구조물이 흡수되게 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 구획이 시토졸, 핵, 액포막(tonoplast), 색소체, 황색체(etioplast), 유색체(chromoplast), 백색체(leucoplast), 유지방체(elaioplast), 단백질체(proteinoplast), 녹말체(amyloplast), 엽록체, 및 이중막의 내강으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 세포 벽을 포함하는 식물 세포가 담배, 당근, 메이즈(maize), 카놀라, 평지씨, 목화, 야자, 땅콩, 대두, 오리자(Oryza) 종, 아라비돕시스(Arabidopsis) 종, 리시누스(Ricinus) 종, 및 사탕수수 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 식물 세포가 배아, 분열 조직, 캘러스(callus), 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리 및 줄기로 이루어진 군으로부터 선택된 조직으로부터의 것인 방법.
제1항에 있어서, 감마-제인 펩티드가 서열 1을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 관심 분자가 핵산, DNA, RNA, RNAi 분자, 유전자, 플라스미드, 코스미드, YAC, BAC, 폴리펩티드, 효소, 호르몬, 글리코-펩티드, 당, 지방, 신호전달 펩티드, 항체, 비타민, 메신저, 2차 메신저, 아미노산, cAMP, 약물, 제초제, 살진균제, 항생제, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 관심 분자가 유전자를 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 유전자가 외래 단백질 유전자, 작물학 유전자, 또는 마커 유전자인 방법.
제9항에 있어서, 유전자가 안정적으로 통합된 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 선택된 세포가 재생가능한 세포인 방법.
제12항에 있어서, 재생가능한 세포로부터 가임 식물을 재생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
세포 벽이 있는 식물 세포를 제공하는 단계;
감마-제인 펩티드를 유전자와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 단계;
세포 벽이 있는 식물 세포와 감마-제인 연결된 구조물을 서로 접촉시키는 단계;
감마-제인 펩티드 및 유전자가 세포 벽을 포함하는 식물 세포 내로 흡수되게 하는 단계; 및
식물 세포를 갖는 식물의 자손에서 유전자를 발현시키는 단계
를 포함하는, 유전자를 발현시키는 방법.
제14항에 있어서, 유전자가 엽록체 내에서 발현되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 유전자를 안정적으로 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 감마-제인 펩티드가 서열 1을 포함하는 것인 방법.
감마-제인 펩티드를 플라스미드 DNA와 상호작용시켜 감마-제인 연결된 구조물을 형성시키는 단계; 및
감마-제인 펩티드 및 플라스미드 DNA로부터의 유전자가 식물 세포 내로 흡수되는 것을 허용하는 조건 하에 감마-제인 연결된 구조물을 무손상 벽을 보유하는 식물 세포와 접촉시키는 단계
를 포함하는, 식물 세포 내로 분자성 물질을 전달하는 방법.
제18항에 있어서, 식물 세포를 갖는 식물의 자손에서 유전자를 안정적으로 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 감마-제인 펩티드가 서열 1을 포함하는 것인 방법.