KR20130011056A

KR20130011056A - 염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체

Info

Publication number: KR20130011056A
Application number: KR1020110071937A
Authority: KR
Inventors: 유석호; 윤선하; 김동진; 박재은; 장명희; 김혜난
Original assignee: 주식회사에이앤알쎄라퓨틱스
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2013-01-30
Also published as: WO2013012138A1

Abstract

본 발명은 염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL2RG, IL10RB 단백질 또는 상기 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편을 유효성분으로 포함하는 염증표적 수용체 등에 관한 것이다.
본 발명의 염증표적 수용성 수용체, 융합 단백질 또는 융합 항체는 대표적인 항 염증 수용체 약물인 TNFR2-Fc 융합단백질(Enbrel)에 비하여 현저히 우수한 염증 타겟팅 효과를 가지며, 따라서 염증 부위로 약물을 전달하는 운반체(carrier)로서 사용될 수 있다.

Description

염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체{Receptors targeting inflammation and drug carriers for treatment of inflammatory diseases}

본 발명은 염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL2RG, IL10RB 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물 등에 관한 것이다.

면역체계는 해로운 외부물질인 항원(antigen)으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포와 다른 사람 혹은 동물로의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질들을 파괴하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체의 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응을 자가 면역 질환(autoimmune disease)라고 부른다. 이러한 반응은 알레르기하게 과민반응(hypersensitivity reaction)을 보이는 것으로서, 알레르기의 경우 신체에 해가 되지 않는 외부 물질에 대해서 반응을 하지만, 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다.

인터루킨(Interleukin, IL)은 사이토카인의 한 종류로서, 적혈구 세포 사이의 화학신호의 역할을 수행한다. IL-2가 FDA에 의해서 1992년 말기간암의 치료에 승인되었을 때, 암을 치료하는데 사용된 최초의 단일 면역치료제였다. 그 후로, IL-2의 경우 전이된 흑생종(metastatic melanoma)에도 사용되었다. IL-2 하나로 암을 치료하는 데에 사용되기도 하였으며, 백신과 함께 치료되기도 하였다. IL-2는 면역체계를 도와서 세포가 빨리 자라고 분열하게 만든다. 그러나 IL-2를 이용한 치료는 감기와 비슷한 오한, 열, 피로 및 착란증상(confusion)과 같은 부작용을 나타내었다. IL-2 패밀리(family)에 속하는 IL-15과 IL-21 역시 암 치료제로서 단일제 혹은 보조제로서 연구되고 있다.

IL-21은 알파-헬릭스(α-helix) 구조를 갖는 사이토카인의 한 종류로서, IL-21의 수용체와 감마쇄(γ-chain)를 이용한 신호전달과정을 통해서 염증성 반응을 일으킨다. IL-21은 골수로부터의 NK세포 전구체의 성숙을 유도하는 것으로 보고되었으며 (Parrish-Novak J., et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 특히 NK세포의 사이토카인 생성능과 세포사멸능과 같은 효과 기능(effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었고 (Strengell M, et al., J Immunol., 170: 5464-5469, 2003;Brady J, et al., J Immunol., 172: 2048-2058, 2004), CD8+ T 세포의 효과 기능도 증가시킴으로써 내재, 적응면역계의 항암반응을 촉진시키는 것으로 보고되었다 (Takaki R., et al., J Immunol., 175: 2167-2173, 2005; Moroz A., et al., J Immunol, 173: 900-909, 2004). 또한, 인간의 말초혈액에서 분리한 NK세포를 활성화시키며 (Parrish-Novak J., et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 제대혈에서 분리한 조혈줄기세포로부터 성숙한 NK세포를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다 (Sonia A. P, et al., Int. immunol., 18: 49-58, 2006).

VcamI은 CD106으로도 알려져 있으며, 세포 부착분자로써 기능을 가지고 있다 (Cybulsky M., et al., Cytogenet. Cell Genet. 58: 1852, 1991). 구조는 6~7개의 면역글로불린 도메인(immunoglobulin doamin)으로 구성되어 있으며, 여러 사이토카인들에 의해 자극된 내피세포의 크고 작은 혈관에서 발현된다고 보고되었다 (Barreiro,. et al,. J. Cell Biol. (United States) 157 (7): 1233-45. 2002). 그리고, 림프구, 단핵세포, 호산 백혈구, 호염기성 세포가 혈관내피세포조직에 부착하는데 기여를 하고, 백혈구의 내피세포에 대한 신호형질도입기능을 한다고 보고되었으며, 아테롬성 동맥경화증이나 류마티즘성 관절염의 발달에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다 (Yonekawa K,. et al,. J. Leukoc. Biol. 77 (2): 129-40. 2005).

IL-2(Interleukin-2)는 면역반응을 일으키는 세포인 림프구에 의해서 발현되는 IL-2 수용체와 결합을 하여 면역반응을 중재하고, 병원성 세균 침입으로부터 반응을 하는 면역계 신호분자 형태인 인터루킨으로 면역반응을 하는 동안 신체에서 정상적으로 생산된다는 보고가 있다 (Smith KA,. Science. 240 (4856): 1169-76. 1988. Stern J,. et al,. Science. 233 (4760): 203-6. 1986). IL-2의 분비와 IL-2 수용체의 발현은 T세포에 결합하는 항원의 자극에 의해서 이루어진다. 그리고, 이 둘의 상호작용은 항원선택성 세포독성 T세포(antigen-selected cytotoxic T cell)의 생존, 분화, 성장을 자극하게 한다는 보고 (Beadling C,. et al,. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 90 (7): 2719-23. 1993. Beadling CB,. et al,. Med. Immunol. 1 (1): 2. 2002.)가 있으며, 조절유전자 T세포의 성숙분열을 위해 흉선에서 T세포의 분화에 필수적이라는 보고가 있다 (Sakaguchi S,. et al,. J. Immunol. 155 (3): 1151-64. 1995. Shevach EM,. et al,. J. Exp. Med. 188 (2): 287-96. 1998). IL-2는 IL-15와 유사한 기능을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 자연 살해 세포의 분화와 증식을 유도하고 B세포에 의해 만들어지는 면역글로불린의 생산을 촉진시키는 사이토카인으로 보고되고 있다 (Waldmann TA,. Nature Rev. Immun. 6 (8): 595-601. 2006).

IL-10(Interleukin-10)은 인체에서 사이토카인 합성을 저해하는 것으로 잘 알려진 항 염증사이토카인이며, IL-10 유전자에 의해 암호화 된다 (Eskdale J,. et al,. Immunogenetics 46 (2): 120-8. 1997). 그리고, 면역조절과 염증반응에서 다면발현적 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, Th1 사이토카인들, MHC ClassⅡ 항원들, 대식세포의 자극분자들의 발현을 하향 조절 하며, B세포의 생존, 분화, 항체생산을 향상시키며, JAK-STAT 신호전달 경로에서 NF-kB의 활동을 차단한다. 또한, 인체에서 과도하게 일어나는 면역반응을 중화하는데 중요한 작용을 한다는 보고가 있으며 (Braat H,. et al,. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 4 (6): 754-9. 2006), IFN-γ, IL-2, IL-3, TNF-alpha, GM-CSF와 같은 염증사이토카인들의 합성을 저해하는 것으로 보고되어 있다 (Grimbaldeston MA,. et al,. Nat. Immunol. 8 (10): 1095-104. 2007).

염증관련 면역세포들이 염증부위를 인지하여 염증이 일어난 병변부위로 찾아갈 수 있는 능력을 갖고 있는 사실은 잘 알려져 있다. 면역세포의 이러한 염증부위의 타겟팅 능력은 면역세포의 세포막에 존재하는 수용체와 이 수용체의 리간드에 의해서 일어날 수 있다.

이에 본 발명자들은 이러한 면역세포의 세포막에 존재하는 수용체의 염증부위 타겟팅 능력에 착안하여 주요 염증관련 인간세포에 존재하는 수용체들의 리간드 결합부위를 수용성 수용체(soluble receptor)로 발현한 뒤 이들을 Quantum dot으로 표지함으로써 염증이 유도된 마우스에서 가장 우수한 염증 타겟팅 능력을 갖는 수용성 수용체를 발굴하고, 또한 발굴된 수용성 수용체를 다양한 약물과 결합시켜 염증부위로의 약물전달을 위한 운반체(carrier)로 사용하고자 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL2RG, IL10RB에 대한 염증 부위 타겟팅 효과를 확인하였으며, 염증 타겟팅 능력이 가장 우수한 IL21R의 기존의 염증억제 약물 운반체(carrier)로서의 가능성을 알아보기 위하여, IL21R-TNFR2-Fc 융합 수용체 및 Humira-IL21R 융합 항체를 제조하였으며, 상기 융합 수용체 및 융합 항체에 Quantum-dot을 표지한 후 생체 내 염증 타겟팅 능력을 확인한 결과, IL21R가 염증 질환 치료용 약물의 운반체로 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL2RG, IL10RB 단백질 또는 상기 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편을 유효성분으로 포함하는 염증표적 수용체 및 염증 질환 치료용 약물 운반체 등을 제공하고자 하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편에 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편, 및 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

본 발명의 융합 단백질 또는 융합 항체는 염증 표적 능력이 우수하며, 대표적인 항 염증 수용체 약물인 TNFR2-Fc 융합단백질(Enbrel)에 비하여 현저히 우수한 염증 타겟팅 효과를 가지며, 따라서 염증 부위로 약물을 전달하는 운반체(carrier)로서 사용될 수 있는바, 융합된 염증 질환 억제제 또는 면역 증강제의 염증 질환 치료 또는 면역조절 치료 효과를 상승시키는 효과를 갖는다.

도 1은 IL21R의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 IL21R 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL21R)의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 발현된 IL21R의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 4는 IL21R 세포외 도메인Ⅰ(IL21R-D1)을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL21R-D1)의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 IL21R-D1의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 6은 IL21R 세포외 도메인Ⅱ(IL21R-D2)를 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL21R-D2)의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 발현된 IL21R-D2의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 8은 VcamI 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::VcamI)의 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 발현된 VcamI의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 10은 IL2RB 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL2RB)의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 발현된 IL2RB의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 12는 IL3RA 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL3RA)의 구조를 나타낸 것이다.
도 13은 발현된 IL3RA의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 14는 IL13RA1 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL13RA1)의 구조를 나타낸 것이다.
도 15는 발현된 IL13RA1의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 16은 CRLF1 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::CRLF1)의 구조를 나타낸 것이다.
도 17은 발현된 CRLF1의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 18은 IL17RA 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL17RA)의 구조를 나타낸 것이다.
도 19는 발현된 IL17RA의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 20은 IL2RG 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL2RG)의 구조를 나타낸 것이다.
도 21은 발현된 IL2RG의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 22는 IL10RB 세포외 도메인을 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL10RB)의 구조를 나타낸 것이다.
도 23은 발현된 IL10RB의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 24는 Humira 항체의 경쇄 영역(light chain)을 클로닝한 발현벡터(pNATABL)의 구조를 나타낸 것이다.
도 25는 Humira 항체의 중쇄 영역(heavy chain)을 클로닝한 발현벡터(pNATABH)의 구조를 나타낸 것이다.
도 26은 발현된 Humira 항체의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 27은 Humira HC/IL21R를 클로닝한 발현벡터(pNATABH::Humira HC/IL21R)의 구조를 나타낸 것이다.
도 28은 발현된 Humira HC/IL21R의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 29는 IL21R/Humira HC을 클로닝한 발현벡터(pNATABH::IL21R/Humira HC)의 구조를 나타낸 것이다.
도 30은 발현된 IL21R/Humira HC의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 31은 IL21R과 TNFR2의 융합 구조(IL21R/TNFR2)이다.
도 32는 IL21R/TNFR2 융합 수용체를 클로닝한 발현벡터(pYK602-His-Fc::IL21R+TNFR2)의 구조를 나타낸 것이다.
도 33은 발현된 IL21R/TNFR2의 웨스턴 블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)이다.
도 34는 Quantum Dot의 나노결정 구조를 나타낸 그림이다.
도 35는 Quantum Dot의 나노결정의 상대적인 크기를 비교한 것이다.
도 36은 Qdot과 biomolecule의 결합하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 37은 CIA 동물 모델을 만드는 과정을 나타낸 것이다.
도 38은 Control 실험으로 Q-dot을 붙인 Enbrel과 Fc control을 in vivo imaging 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 CIA 동물 모델을 이용한 생체 영상 진단 결과(A), 생체 내 이미징(in vivo imaging)을 확인하기 위해 사용한 Q-DOT 800의 파장을 나타낸 그래프(B) 및 미정맥내 주사한 5일 후엔 QDs이 체외로 배출되는 것(C)을 나타낸 것이다.
도 40은 도 39의 결과를 표로 나타낸 것으로 염증 타겟팅이 강할수록 +를 많이 부여하였다.
도 41은 Qdot 표지된 IL21R, IL21R-DomainI 및 IL21R-DomainⅡ 가 생체 내에서 염증 타겟팅 능력이 있음을 나타내는 생체 이미징 결과이다.
도 42는 Qdot 표지된 IL21R/TNFR2가 생체 내에서 염증 타겟팅 능력이 있음을 나타내는 생체 이미징 결과이다.
도 43은 Qdot 표지된 Humira, Humira/IL21R 및 IL21R/Humira가 생체 내에서 염증 타겟팅 능력이 있음을 나타내는 생체 이미징 결과이다.

본 발명은 IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편에 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 IL21R(Interlukin 21 receptor)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 4, VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 14, IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 18, IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 22, IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 26, CRLF1(Cytokine receptor like factor 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 30, IL17RA(Interleukin 17 receptor A)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 34, IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 38, IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 염증 질환 억제제는 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2)의 세포외 영역, CTLA-4(Orencia)의 세포외 영역, IL-1 길항제(antagonist), Humira 항체, 항 CXCL10 항체, 항 IL6R 항체 또는 항 IL6 항체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편은 염증 질환 억제제 또는 면역 증강제의 C-term 방향 또는 N-term 방향으로 융합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편, 및 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편은 상기와 같이 각각 서열번호 4, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 38 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 염증 질환 억제제는 상기 기재한 바와 같으며, 상기 단백질의 세포외 영역을 포함하는 단편은 염증 질환 억제제 또는 면역 증강제의 C-term 방향 또는 N-term 방향으로 융합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL2RG, IL10RB에 대한 염증 타겟팅 효과를 확인하였다. IL21R을 비롯한 여러 사이토카인들이 염증부위를 타겟팅함으로써 발생하는 능력을 Enbrel의 염증 타겟팅 능력과 비교하여 염증 타겟팅 정도를 나타낸 결과 IL21R, VcamI, IL21RB, IL2RG, IL10RB가 염증 부위에 특이적 결합력이 매우 우수하였고, IL13RA1, IL17RA는 우수하였으며, IL3RA, CRLF1는 보통인 것을 확인하였다. 따라서, 이 결과를 통해 우리가 선별한 염증관련 수용체들인 IL21R, VcamI, IL2RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA 모두 염증부위를 타겟팅 하는 것을 관찰 하였으며, 이중에서 Enbrel과 비교하였을 때 염증 타겟팅 능력이 Enbrel과 비슷하거나 매우 강하게 나타내는 염증관련 수용성 수용체인 IL21R, VcamI, IL21RB, IL2RG, IL10RB를 확인하였다. 특히, 염증 타겟팅 능력이 가장 우수한 IL21R을 기존의 염증억제 약물의 케리어로서의 가능성을 알아보기 위하여, 먼저 대표적인 항 염증 수용체 약물인 TNFR2-Fc 융합단백질(Enbrel)과 융합 하여 IL21R-TNFR2-Fc를 제조하였으며, 이 융합수용체에 Quantum-dot을 표지한 후 생체 내 염증 타겟팅 능력을 확인해 본 결과, Enbrel의 염증 타겟팅 능력보다 IL21R/TNFR2 융합수용체의 염증 타겟팅 능력이 훨씬 강한 것을 확인하였으며, 이러한 IL21R의 염증부위 타겟팅 을 위한 케리어로서의 능력은 TNF-알파의 중화 항체인 Humira에서도 검증되었다. 즉 humira 항체의 중쇄의 N-말단(IL21R-Humira) 및 humira 항체의 중쇄의 C-말단(Humira-IL21R)의 융합 단백질에 Quantum-dot을 표지한 후 in-vivo 염증 타겟팅 능력을 확인해 본 결과 Humira-IL21R이 humira 대비 우수한 염증 타겟팅 능력을 확인함으로써, IL21R의 염증부위 타겟팅의 케리어로 사용할수 있음을 함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 염증성 사이토카인의 수용성 수용체 제조

본 발명자들은 IL21R을 비롯한 염증관련 수용체인 VcamI, IL2RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA를 수용성 수용체로 얻기 위하여, 아래와 같이 사이토카인 각각의 세포외 도메인(extracellular domain)만을 취하여 발현시켰다.

위의 여러 유전자들의 세포외 도메인(extracellular domain)을 확보하기 위해 적절한 프라이머(primer)를 디자인한 후, cDNA Library mix (Kidney, placenta, pancrease, liver)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction)을 함으로써 증폭된 산물을 얻었다.

PCR 반응 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, Korea) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃에서 2분 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클을 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.

다음으로, SfiI(#R033S, Enzynomics, Korea) 제한효소로 자르고, 아가로스 겔 (#9002-18-0, BIO BASIC INC, USA)에 로딩(loading) 한 다음, 겔 정제 키트(Gel Purification kit)(#1014876, QIAGEN, USA)를 이용하여 벡터에 삽입할 인서트(insert)를 확보하였다.

제한효소 절단 반응은 1 ㎍ DNA를 자르는데, SfiI(10 unit) 1 ㎕와 10x 반응버퍼(reaction buffer) 5 ㎕를 혼합한 후 멸균증류수를 넣어 총 부피가 50 ㎕ 되게 하고, 37℃ 온탕기에서 6시간 동안 반응을 시킨 다음 아가로스 겔(agarose gel)로부터 분리 정제를 수행하였다.

그런 다음, 상기 인서트를 포유류(mammalian) 발현 벡터인 pYK602-Fc 벡터에 삽입하기 위해, T4 DNA ligase(#M001S, Enzynomics, korea)를 이용하여 라이게이션(ligation)을 수행하였다. 라이게이션(ligation) 반응은 벡터와 인서트(insert)를 1(50 ng) : 3(150 ng) 비로 하여, 리가아제(ligase, 10 unit) 1 ㎕와 10x 반응버퍼(reaction buffer) 1 ㎕를 혼합한 후, 16℃에서 16시간 이상 라이게이션 과정을 거쳐 유전자가 삽입된 발현 벡터를 확보하였다.

이하 본 발명의 실시예에서 제한효소 절단 반응과 라이게이션(ligation) 반응은 상기와 같은 조건하에서 동일하게 수행하였다.

상기 확보된 유전자가 삽입된 벡터(ligates)를 E.coli 세포에 형질전환 시킨 후, 형성된 콜로니(colony)를 서열분석(sequencing)함으로써 pYK602-Fc 발현 벡터에 올바르게 삽입된 클론(clone)을 확보하였다. 상기 확보된 클론으로 midi prep (#740 410.100, MACHERY-NAGEL, Germany)을 수행한 후, 동물세포(mammalian cell)인 293E 세포에 형질주입(transfection)함으로써 염증관련 수용성 수용체들의 발현률을 확인하고, 대량 배양하여 각각의 염증관련 수용성 수용체 단백질들을 확보하였다.

그리고, IL21R/TNFR2와 같은 융합 수용성 수용체는 분자생물학적인 방법인 overlapping PCR로 융합을 하여 위의 동일한 방법으로 발현 및 배양과 정체를 수행하여 융합 단백질을 확보하였다. 항체인 Humira와 융합항체인 Humira/IL21R, IL21R/Humira는 유전자 합성을 통하여 합성을 통해 확보하였고, 융합항체 단백질도 위와 같은 동일한 방법을 이용하여 확보하였다.

이하 실시예2 내지 실시예14는 벡터에 삽입할 IL21R, VcamI, IL2RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA, IL21R/TNFR2, IL2RG, IL10RB 및 Humira, Humira/IL21R, IL21R/Humira에 대한 구조(construction)와 PCR 증폭, 정제 과정 및 QC 과정을 나타낸 것으로 모든 과정은 동일한 조건하에서 수행하였다.

실시예 2. IL21R ( Interlukin 21 receptor ) 수용성 수용체 제조

IL21R(Interlukin 21 receptor)은 2개의 도메인(domain)으로 이루어져 있으며, IL21R의 구조를 도 1에 간략히 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, IL21R의 세포외 도메인(Domain)은 도메인I과 도메인Ⅱ로 구성된 사이토카인이다. IL21R의 세포외 도메인의 전체 길이는 636bp로 212 amino acid로 되어 있으며, 도메인I은 300bp로 100 amino acid, 그리고, 도메인Ⅱ는 411bp로 137 amino acid로 되어 있다.

본 발명에서는 IL21R의 세포외 도메인 전체 부분(extra-cellular domain full length), IL21R의 세포외 도메인I 및 IL21R의 세포외 도메인Ⅱ를 각각 pYK602-His Fc에 클로닝 하였다.

2-1. IL21R-Fc의 제조 (IL21R extra-cellular domain full length)

IL21R의 세포외 도메인 전체 부분 (extra-cellular domain full length)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 2에 나타내었으며, 구체적으로 도 2는 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL21R을 삽입한 도면으로 벡터와 IL21R을 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL21R을 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조를 나타낸다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 2) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인은 서열번호 3의 DNA 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-F(SfiI) : agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac

IL21R-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact

PCR 반응은 상기 실시예 1에서와 동일한 조건에서 실시하였으며, PCR로 수득된 DNA를 아래와 같은 방법으로 트랜스펙션(transfection), 정제(purification)하였다.

293E 세포를 150 mm 플레이트(#430599 Corning USA)에 70~80% 면적을 차지할 정도로 심은(plating) 후, DNA 20 ㎍과 PEI(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1 : 2 비율로 혼합하여 상온에서 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지(Serum Free Media, No FBS DMEM(#SH30243.01 Hyclone Thermo. USA))로 교환해 주며, 2~3일마다 한 번씩 세포의 상층액을 수득하였다.

20개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일, 9일 때에 걷은 상층액 총 0.6 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL21R)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 배양 상층액 600 ㎖에서 IL21R을 총 1.0 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL21R을 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2일 후, 5일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL21R의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL21R의 순수도는 98%로 확인되었으며, IL21R의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 3에 나타내었다.

2-2. IL21R-D1-Fc의 제조 (IL21R extra-cellular domain Ⅰ)

IL21R의 세포외 도메인 Ⅰ(extra-cellular domain Ⅰ:D1)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 4에 나타내었다. 구체적으로 도 4는 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL21R-D1을 삽입한 도면으로 벡터와 IL21R-D1을 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL21R-D1을 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 5) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인Ⅰ은 서열번호 6의 DNA 서열 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-F(SfiI) : agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac

IL21R-D1-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaacttgatgctctcagccagga

293E 세포를 150 mm 플레이트(# 430599 Corning USA)에 70~80% 면적을 차지할 정도로 심은(plating) 후, DNA 20 ㎍과 PEI(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1 : 2 비율로 혼합하여 상온에서 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지(Serum Free Media, No FBS DMEM(#SH30243.01 Hyclone Thermo. USA))로 교환해 주며, 2~3일마다 한 번씩 세포의 상층액을 수득하였다.

20개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일 때에 걷은 상층액 총 1.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL21R-D1)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 배양 상층액 1.0 ℓ에서 IL21R-D1를 총 1.6 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL21R-D1을 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL21R-D1의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL21R-D1의 순수도는 96%로 확인되었으며, IL21R-D1의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 5에 나타내었다.

2-3. IL21R-D2-Fc의 제조 (IL21R extra-cellular domain Ⅱ)

IL21R의 세포외 도메인 Ⅱ(extra-cellular domain Ⅱ:D2)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 6에 나타내었다. 구체적으로 도 6은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL21R-D2를 삽입한 도면으로 벡터와 IL21R-D2를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL21R-D2를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 8) 및 역방향 프라이머(서열번호 2) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인Ⅰ은 서열번호 9의 DNA 서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-D2-F(SfiI) : agggggccgtgggggccgtcaacatcacagaccagtct

IL21R-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL21R-D2)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL21R-D2를 총 2.0 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL21R-D2를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL21R-D2의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL21R-D2의 순수도는 92%로 확인되었으며, IL21R-D2의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 7에 나타내었다.

실시예 3. VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1)-Fc 제조

VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 8에 나타내었다. 구체적으로 도 8은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 VcamI을 삽입한 도면으로 벡터와 VcamI을 제한효소 SfiI으로 자른 다음, VcamI을 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 11) 및 역방향 프라이머(서열번호 12) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인Ⅰ은 서열번호 13의 DNA 서열 또는 서열번호 14의 아미노산 서열로 기재된다.

VcamI-F(SfiI) : agggggccgtgggggccccagaatctagatatcttgct

VcamI-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaatccttgaacatcaagtgttaa

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 8일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(VcamI)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 VcamI을 2.0 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 VcamI을 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 4, 6, 8일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 VcamI의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. VcamI의 순수도는 97.5%로 확인되었으며, VcamI의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 9에 나타내었다.

실시예 4. IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta)-Fc 제조

IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 10에 나타내었다. 구체적으로 도 10은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL2RB를 삽입한 도면으로 벡터와 IL2RB를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL2RB1를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 15) 및 역방향 프라이머(서열번호 16) 서열은 아래와 같다. IL2RB의 세포 외 도메인은 서열번호 17의 DNA 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열로 기재된다.

IL2RB-F(SfiI) : agggggccgtgggggccgcagcggtgaatggcacttcc

IL2RB-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaacctgaaggccaggggctg

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL2RB)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL2RB를 1.6 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL2RB를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 4, 6, 9일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL2RB의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL2RB의 순수도는 98%로 확인되었으며, IL2RB의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 11에 나타내었다.

실시예 5. IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha)-Fc 제조

IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 12에 나타내었다. 구체적으로 도 12는 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL3RA를 삽입한 도면으로 벡터와 IL3RA를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL3RA를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 19) 및 역방향 프라이머(서열번호 20) 서열은 아래와 같다. IL3RA의 세포 외 도메인은 서열번호 21의 DNA 서열 또는 서열번호 22의 아미노산 서열로 기재된다.

IL3RA-F(SfiI) : agggggccgtgggggccaaggaagatccaaacccacca

IL3RA-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaagcgctggggggtgctccag

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL3RA)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL3RA를 1.2 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL3RA를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL3RA의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL3RA의 순수도는 95.3%로 확인되었으며, IL3RA의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 13에 나타내었다.

실시예 6. IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1)-Fc 제조

IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 14에 나타내었다. 구체적으로 도 14는 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL13RA1을 삽입한 도면으로 벡터와 IL13RA1을 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL13RA1을 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 23) 및 역방향 프라이머(서열번호 24) 서열은 아래와 같다. IL13RA1의 세포 외 도메인은 서열번호 25의 DNA 서열 또는 서열번호 26의 아미노산 서열로 기재된다.

IL13RA1-F(SfiI) : agggggccgtgggggccgacaccgagataaaagttaa

IL13RA1-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaagcattgtttatcactccact

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 8일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL13RA1)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL13RA1를 1.1 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL13RA1을 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 4, 6, 8일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL13RA1의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL13RA1의 순수도는 95.4%로 확인되었으며, IL13RA1의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 15에 나타내었다.

실시예 7. CRLF1(Cytokine receptor like factor 1)-Fc 제조

CRLF1(Cytokine receptor like factor 1)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 16에 나타내었다. 구체적으로 도 16은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 CRLF1을 삽입한 도면으로 벡터와 CRLF1을 제한효소 SfiI으로 자른 다음, CRLF1을 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 27) 및 역방향 프라이머(서열번호 28) 서열은 아래와 같다. CRLF1의 세포 외 도메인은 서열번호 29의 DNA 서열 또는 서열번호 30의 아미노산 서열로 기재된다.

CRLF1-F(SfiI) : agggggccgtgggggccgcccacacagctgtgatcag

CRAF1-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaaactgcggggagtggaggcg

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 8일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(CRLF1)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 17에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 CRLF1를 1.8 ㎎를 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 CRLF1을 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7, 9일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 CRLF1의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. CRLF1의 순수도는 94.4%로 확인되었으며, CRLF12의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 17에 나타내었다.

실시예 8. IL17RA(Interleukin 17 receptor A)-Fc 제조

IL17RA(Interleukin 17 receptor A)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 18에 나타내었다. 구체적으로 도 18은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL17RA를 삽입한 도면으로 벡터와 IL17RA를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL17RA를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 31) 및 역방향 프라이머(서열번호 32) 서열은 아래와 같다. IL17RA의 세포 외 도메인은 서열번호 33의 DNA 서열 또는 서열번호 34의 아미노산 서열로 기재된다.

IL17RA-F(SfiI) : agggggccgtgggggccctgcgactcctggaccaccg

IL17RA-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaatggagtgtctggcatttctg

50개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL17RA)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 19에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL17RA를 1.8 ㎎를 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL17RA를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7, 9일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL17RA의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL17RA의 순수도는 89.4%로 확인되었으며, IL17RA의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 19에 나타내었다.

실시예 9. IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma)-Fc 제조

IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 20에 나타내었다. 구체적으로 도 20은 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL2RG를 삽입한 도면으로 벡터와 IL2RG를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL2RG를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 35) 및 역방향 프라이머(서열번호 36) 서열은 아래와 같다. IL2RG의 세포 외 도메인은 서열번호 37의 DNA 서열 또는 서열번호 38의 아미노산 서열로 기재된다.

IL2RG-F(SfiI) : agggggccgtgggggccaacacgacaattctgacgcccaa

IL2RG-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaaagtattgctcccccagtggatt

293E 세포를 100 mm 플레이트(# 430599 Corning USA)에 80~90% 면적을 차지할 정도로 심은(plating) 후, DNA 13 ㎍과 PEI(#23966, Polysciences, USA) 26 ㎍을 1 : 2 비율로 혼합하여 상온에서 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지(Serum Free Media, No FBS DMEM(#SH30243.01 Hyclone Thermo. USA))로 교환해 주며, 2~3일마다 한 번씩 세포의 상층액을 수득하였다.

50개의 100 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0 L를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL2RG)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 21에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL2RG를 2.2 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL2RG를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 4, 6, 9일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL2RG의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL2RG의 순수도는 93.6%로 확인되었으며, IL2RG의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 21에 나타내었다.

실시예 10. IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)-Fc 제조

IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)의 세포외 도메인(extra-cellular domain)을 pYK602-His-Fc에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 22에 나타내었다. 구체적으로 도 22는 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL10RB를 삽입한 도면으로 벡터와 IL10RB를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL10RB를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 39) 및 역방향 프라이머(서열번호 40) 서열은 아래와 같다. IL10RB의 세포 외 도메인은 서열번호 41의 DNA 서열 또는 서열번호 42의 아미노산 서열로 기재된다.

IL10RB-F(SfiI) : agggggccgtgggggcccatgggacagagctgcccag

IL10RB-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaaatactgcctggtgagggagat

50개의 100 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0L를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL10RB)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 23에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL10RB를 1.5 ㎎을 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL10RB를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 4, 6, 8일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL10RB의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL10RB의 순수도는 95%로 확인되었으며, IL10RB의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 23에 나타내었다.

실시예 11. Humira 항체의 제조

11-1.Humira light chain

Humira 항체의 경쇄 영역을 pNATABL에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 24에 나타내었다. 구체적으로 도 24는 동물세포 발현벡터인 pNATABL에 Humira 경쇄를 삽입한 도면으로 벡터와 Humira 경쇄를 제한효소 SfiI, BglⅡ으로 자른 다음, Humira 경쇄를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI(#R033S, enzynomic, korea) 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 43) 및 BglⅡ(#R010s, enzynomics, Korea) 제한효소 셔열을 포함하는 역방향 프라이머(서열번호 44) 서열은 아래와 같다. Humira 항체 경쇄 영역은 서열번호 45의 DNA 서열 또는 서열번호 46의 아미노산 서열로 기재된다.

NATVK1-1(SfiI) : ttggtggccacagcggccgatgtccactcggacatccagatgacccagtc

NATJK-R4(BglⅡ) : gaggagagatcttttgatttccaccttggt

11-2.Humira heavy chain

Humira 항체의 중쇄 영역을 pNATABL에 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 25에 나타내었다. 구체적으로 도 25는 동물세포 발현벡터인 pNATABL에 Humira 중쇄를 삽입한 도면으로 벡터와 Humira 중쇄를 제한효소 SfiI, NheI으로 자른 다음, Humira 중쇄를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI(#R033S, enzynomic, korea) 제한효소 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 47) 및 NheI(#R016s, enzynomics, Korea) 제한효소 셔열을 포함하는 역방향 프라이머(서열번호 48) 서열은 아래와 같다. Humira 항체 중쇄 영역은 서열번호 49의 DNA 서열 또는 서열번호 50의 아미노산 서열로 기재된다.

NATVH3-4(SfiI) : TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTC

NATJH-all(NheI) : GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA

293E 세포를 100 mm 플레이트에 80~90% 면적을 차지할 정도로 심은(plating) 후, DNA(중쇄 : 경쇄 = 4 : 6) 13 ㎍과 PEI(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1 : 2 비율로 혼합하여 상온에서 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지(Serum Free Media, No FBS DMEM(#SH30243.01 Hyclone Thermo. USA))로 교환해 주며, 2~3일마다 한 번씩 세포의 상층액을 수득하였다.

50개의 100 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일, 9일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(Humira 항체)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 26에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 Humira 항체를 8.7 ㎎을 얻었다.

중쇄발현 벡터와 경쇄발현 벡터에 삽입된 Humira의 경쇄와 중쇄를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 3, 5일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 Humira 항체의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. Humira 항체의 순수도는 96.8%로 확인되었으며, Humira 항체의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 26에 나타내었다.

실시예 12. Humira/IL21R 융합 항체의 제조

Humira 항체의 중쇄 영역이 삽입된 pNATABL에 C-term 방향으로 IL21R을 삽입함으로써 Humira와 IL21R의 융합 항체를 제작하였으며, 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 27에 나타내었다. 구체적으로 도 27은 동물세포 항체의 중쇄 발현벡터 pNATABH에 Humira 중쇄와 IL21R의 C-말단 융합체를 삽입한 도면으로 벡터와 Humira 중쇄와 IL21R의 C-말단 융합체를 제한효소인 SfiI, NheI으로 자른 다음, Humira 중쇄와 IL21R의 C-말단 융합체를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 IL21R 정방향 프라이머(서열번호 51) 및 XhoI(#R007S, enzynomics, korea) 제한효소 서열을 포함하는 역방향 프라이머(서열번호 52) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인은 서열번호 3의 DNA 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-F : tgccccgacctcgtctgctaca

IL21R-R(XhoI) : ccagctcgagcggccgtcgcactcattcctttaactcctct

50개의 100 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 8일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(Humira/IL21R 융합항체)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 28에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 Humira/IL21R 융합 항체를 4.3 ㎎ 얻었다.

중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터에 삽입된 Humira 중쇄와 IL21R의 C-말단 융합체와 Humira 경쇄를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 4일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 Humira와 IL21R의 융합 항체의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. Humira와 IL21R의 융합 항체의 순수도는 95.1%로 확인되었으며, Humira와 IL21R의 융합 항체의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 28에 나타내었다. Humira/IL21R 항체의 상등액 시료 수득은 2, 4, 6, 8일에 하였으며 웨스턴 블롯은 4일 후에 거둔 상등액 시료로만 한 것인데, 항체의 경우 다른 단백질과 융합하였을 때 변성이 되어 침전되는 경우가 많기 때문에 용해성이 있는지 확인하기 위하여 상등액을 침전시킨 것과 그렇지 않은 것을 같이 걸었다.

실시예 13. IL21R/Humira 융합 항체의 제조

Humira 항체의 중쇄 영역이 삽입된 pNATABL에 N-term 방향으로 IL21R을 삽입함으로써 Humira와 IL21R의 융합 항체를 제작하였으며, 클로닝한 발현 벡터의 구조를 도 29에 나타내었다. 구체적으로 도 29는 동물세포 항체의 중쇄 발현벡터 pNATABH에 Humira 중쇄와 IL21R의 N-말단 융합체를 삽입한 도면으로 벡터와 Humira 중쇄와 IL21R의 N-말단 융합체를 제한효소인 SfiI, NheI으로 자른 다음, Humira 중쇄와 IL21R의 N-말단 융합체를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조이다.

PCR 반응에 사용된 SfiI(#R033S, enzynomics, korea) 제한효소 서열을 포함하는 IL21R 정방향 프라이머(서열번호 53) 및 역방향 프라이머(서열번호 54) 서열은 아래와 같다. IL21R의 세포 외 도메인은 서열번호 3의 DNA 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-F(SfiI) : tggtggccacagcggcctgccccgacctcgtctgctac

IL21R-R : agctgcacctgcgagtggacatcttcctttaactcc

50개의 100 mm 플레이트에서 2일, 4일, 6일, 8일 때에 걷은 상층액 총 2.0 ℓ를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL21R/Humira 융합항체 )을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 30에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 2.0 ℓ에서 IL21R/Humira 융합 항체를 2.9 ㎎을 얻었다.

중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터에 삽입된 Humira 중쇄와 IL21R의 N-말단 융합체와 Humira 경쇄를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 4일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 Humira와 IL21R의 융합 항체의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. Humira와 IL21R의 융합 항체의 순수도는 97%로 확인되었으며, Humira와 IL21R의 융합 항체의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 30에 나타내었다. IL21R/Humira 항체의 상등액 시료 수득은 2, 4, 6, 8일에 하였으며 웨스턴 블롯은 4일 후에 거둔 상등액 시료로만 한 것인데, 항체의 경우 다른 단백질과 융합하였을 때 변성이 되어 침전되는 경우가 많기 때문에 용해성이 있는지 확인하기 위하여 상등액을 침전시킨 것과 그렇지 않은 것을 같이 걸었다.

실시예 14. IL21R / TNFR2 융합 수용체의 제조

오버랩핑 PCR을 수행함으로써 IL21R과 TNFR2를 융합한 DNA 구조를 제작한 후, 이를 pYK602-Fc에 삽입하여 융합 수용체를 제작하였다.

구체적으로 IL21R과 TNFR2 두 사이토카인의 융합 단백질을 만들기 위해 오버랩핑 PCR(overlapping PCR) 기법을 수행을 한 것으로 IL21R의 C-말단과 TNFR2의 N-말단을 30mer정도 오버랩(overlap) 되도록 프라이머(primer)를 디자인하여 IL21R-SfiI과 overlap IL21R primer로 IL21R을 증폭하고, overlap TNFR2와 TNFR2-SfiI primer로 TNFR2를 증폭하한 후, 각각 증폭된 IL21R과 TNFR2 단편을 합하여 주형으로 하고 이를 IL21R-SfiI과 TNFR2-SfiI primer로 두 단편을 융합하여 IL21R/TNFR2 융합구조를 만들었으며, IL21R과 TNFR2의 융합 구조는 도 31에 나태내었다.

또한, 동물세포 발현벡터인 pYK602-His-Fc에 IL21R/TNFR2를 삽입한 도면으로 벡터와 IL21R/TNFR2를 제한효소 SfiI으로 자른 다음, IL21R/TNFR2를 삽입 했을 때 예상되는 벡터 구조를 도 32에 나타내었다.

PCR 반응에 사용된 SfiI(#R033S, enzynomics, korea) 제한효소 서열을 포함하는 IL21R 정방향 프라이머(서열번호 55), 역방향 프라이머(서열번호 56), TNFR2 정방향 프라이머(서열번호 57) 및 역방향 프라이머(서열번호 58) 서열은 아래와 같다. IL21R/TNFR2 융합 수용체는 서열번호 59의 DNA 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열로 기재된다.

IL21R-F(SfiI) : cagggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac

IL21R-R : tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact

TNFR2-F : cagggggccgtgggggccttgcccgcccaggtggcatt

TNFR2-R(SfiI) : tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc

PCR 반응은 상기 실시예 1에서와 동일한 조건에서 실시하되, IL21R과 TNFR2를 각각 94℃에서 2분 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클을 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.

그 다음 같은 조건에서 IL21R PCR 산물과 TNFR2 PCR 산물을 아가로스 겔로 정제한 다음 주형을 1 : 1로 혼합하고, IL21R-F(StifI)와 TNFR2(StifI)을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR로 수득된 DNA를 아래와 같은 방법으로 트랜스펙션(transfection), 정제(purification)하였다.

293E 세포를 150 mm 플레이트에 70~80% 면적을 차지할 정도로 심은(plating) 후, DNA 20 ㎍과 PEI(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1 : 2 비율로 혼합하여 상온에서 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16~20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지(Serum Free Media, No FBS DMEM(#SH30243.01 Hyclone Thermo. USA))로 교환해 주며, 2~3일마다 한 번씩 세포의 상층액을 수득하였다.

20개의 150 mm 플레이트에서 2일, 5일, 7일 때에 걷은 상층액 총 600 ㎖를 정제하였다. 먼저 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터링한 후, 5 ㎖ 칼럼(column)에 패킹(packing) 되어 있는 500 ㎕의 protein A bead (#17-1279-03, GE healthcare, Sweden)에 결합(binding)시켜준다. Peri-start pump를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS(#70011 Gibco USA)로 칼럼을 세척하고, 0.1 M 글리신-염산(Glycine-HCl, #G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획(fraction)으로 나누어 용리(elution)하고, 1M Tris(#T-1503-5KG, Sigma, USA)(pH 9.0)로 중화시켜준다. 그 다음 단백질(IL21R/TNFR2-Fc)을 정량하고 단백질의 발현이 있는 분획 2~3개를 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10번 정도 버퍼를 교환하였다.

그 결과, 도 33에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 600 ㎖에서 IL21R/TNFR2-Fc 융합 수용체를 1.0 ㎎ 얻었다.

pYK602-His-Fc에 삽입된 IL21R/TNFR2를 동물세포인 293E세포에 형질주입(transfection)시킨 후 단백질 발현율을 확인하기 위해 2, 5, 7, 9일 후에 확보한 배지(media)에서 western으로 test를 하고, 단백질 비드(protein bead)를 이용해 정제를 한 다음, Agilent 230 kit assay를 통해 확보된 IL21R/TNFR2의 단백질 순수도와 정량을 측정하였다. IL21R/TNFR2의 순수도는 97%로 확인되었으며, IL21R/TNFR2의 웨스턴블롯 결과(a) 및 QC 테스트 결과(b)를 도 33에 나타내었다.

실시예 15. IL21R 및 VcamI, IL2RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA 단백질에 Quantum dot 표지

위에서 동물 세포(mammalian cell)인 293E 세포에서 순간적으로(transient) 형질주입(transfection) 시킨 뒤 확보한 단백질들 중 순도가 90%이상 되는 것만 선택하여 Quantum dot을 표지하였다.

자가 면역 관절염 조직에서 과발현하는 IL-21의 수용체에 결합하는 IL-21R 수용체 결합체에 QD 나노입자(Quantum dot nanocrystals)(도 34 및 35 참조)를 표지하였다. 표지 방법은 Qdot 800 ITK carbosylquantum dots(Invitrogen, #MOP-Q21371MP)과 16종의 단백질(IL21R, IL21R-DomainI(D1), IL21R-DomainⅡ(D2), VcamI, IL2RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, 및 IL17RA를 포함하는 염증 관련 수용성 수용체 11종; IL21R과 염증치료 약물인 TNFR2(Enbrel)을 융합시킨 IL21R/TNFR2; 염증치료약물인 Enbrel; 염증치료 항체인 Humira; IL21R과 Humira 항체를 융합시킨 IL21R/Humira 및 Humira/IL21R)에 대해, 10 mM borate buffer(pH7.4)를 이용하여 활성화시켜 혼합하고, QDs을 각각의 수용성 수용체, 융합수용체, 융합항체에 연결시켜주기 위한 링커(linker)로 EDC (N-ehyl-N-dimethylaminopropyl-carbodiimide, Sigma, #424331)를 첨가한 후, 2시간 동안 상온에서 혼탁 반응시켜 QDs이 표지된 수용체와 융합수용체 및 융합항체를 합성하였다.

각 반응물인 수용성 수용체, 융합수용체, 융합항체의 EDC는 1 : 40 : 1500의 몰비로 반응시켰으며, QD와 바이오분자의 결합 과정을 도 36에서 간략히 나타내었다. 다음으로 한외여과막(Urafiltration filter 100kDa, Millipore, #UFC910024)을 이용하여 표지되지 않은 단백질은 50 mM borate buffer(pH 8.3)로 수 회 세척하여 정제하였다.

실시예 16. CIA(Collagen Induced Arthritis) 동물 모델 확립

CIA 동물 모델을 만들기 위해 7주령의 male DBA/1J를 구입하여 3~4일간 동물사육실에서 적응을 시켰다.

콜라겐(collagen) 1차 주입은 2 mg/ml Type Ⅱ collagen(Chondrex, #20022, USA)과 2 mg/ml CFA(Chondrex, #7009, USA)를 1 : 1의 비율로 3-way stopcock를 연결한 glass syringe(Hamilton, #1010, USA)에 넣어 4℃를 유지하면서 섞어 혼합액을 제조한 후, 미리 차갑게 식힌 1 ml glass syringe(Hamilton, #1001, USA)로 7주령, male, DBA/1J NCrljOri 마우스(오리엔트바이오) 꼬리에 준비한 혼합액을 마우스 당 100 ㎕씩 피하 주사하였다.

콜라겐 2차 주입은 콜라겐 1차 주입 18일 후, 1차 주입 시와 동일한 방법으로 콜라겐 혼합액을 만들어 1차 면역화(immunization) 위치보다 꼬리 상단 부위에 booster 주사하였다. 초기 면역화(immunization) 후, 18일째부터 관절염의 진행 정도를 0에서 3등급으로 표준 관절염 지표(criteria arthritic index)에 의해 평가하였다(표 1 참조). 그리고, 염증수치가 최고점에 도달 하였을 때, IL21R을 비롯한 여러 염증 관련 수용체 약물들에 대한 염증 타겟팅 in-vivo 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 37에 나타내었다.

도 37에서, A는 콜라겐을 1, 2차 주입한 후 18일 경과했을 때 염증이 생겨나서 28일에는 염증 수치가 최고점에 도달하는 것을 보여주고 있으며, B는 염증 발생시 염증의 정도에 0에서 3점까지 점수를 부여하여 나타낸 것으로 점수가 높을 수록 염증이 심한 것을 나타낸다.

[표 1]

시예 17. Qutum dot 이 표지된 Enbrel 과 Fc 에 대한 CIA 동물 모델에서 염증 타겟팅 능력 관찰 (비교실험)

본 발명자들은 CIA 동물모델에 Qdot을 표지한 IL21R, IL21R-Domain I, IL21R-Domain Ⅱ 수용체, 염증관련 수용체(VcamI, IL2RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA), IL21R/TNFR2(Enbrel) 융합수용체, Humira, 및 융합체인 IL21R/Humira, Humira/IL21R에 대해 염증 타겟팅 능력을 관찰하기 위해 in vivo imaging system을 도입하여 수행하였다. Imaging 장비는 Maestro 2 In-vivo imaging system(한국기초지원과학연구원)을 사용하였다.

우선, Qdot conjugation에 의한 In vivo imaging system을 이용한 염증 타겟팅이 잘 되는지 확인하기 위한 대조(control) 실험으로 현재 류마티스 관절염 치료제로 판매가 되고 있는 Enbrel을 이용하여 실험을 수행하였다. 이때, Enbrel은 양성 대조군(positive control)으로 사용하고, 음성 대조군(negative control)으로는 Fc 만을 사용하였다.

Enbrel과 Fc only에 상기 실시예 15와 같은 방법으로 Qdot을 표지하고, 상기 실시예 16에서 만든 CIA 동물모델에서 염증반응이 최고점(arthritis score=15)에 도달했을 때, 동물의 꼬리 부위 정맥에 100 ㎍씩 주입하였다. 주입 한지 30분 후 maestro in vivo imaging 장비로 염증 타겟팅 능력을 관찰하였으며, 그 결과를 도 38에 나타내었다.

도 38에 나타난 결과를 보면, Enbrel 경우 주입한 후 30분에 정확히 염증이 생긴 부위를 표적하는 것을 볼 수 있었다. 무릎, 발목, 발가락 등 염증이 발생한 부위에서 염증 타겟팅 신호(signal)가 강하게 나타나는 것을 볼 수 있다. 반면에, Fc only control은 염증부위에서는 발견되지 않고 간에서만 발견되는 것으로 보아 염증부위를 전혀 표적하지 못하는 것을 알 수 있다. Enbrel이나 Fc only가 모두 공통적으로 간에서 발견되는데, 이것은 Qdot의 독성(toxic) 때문에 간에서 해독 대사되는 과정이 공통적으로 일어나는 것으로 생각된다.

실시예 18. CIA 동물 모델을 이용한 생체 영상 진단

본 발명자들은 60 nmol의 Qdot conjugation시킨 IL21R 수용체 및 염증관련 수용체(VcamI, IL21RB, IL2RG, IL10RB, IL3RA, IL13RA1, CRLF1, IL17RA)을 관절염 지표 3등급(arthritis score=15)에 도달했을 때 정맥 내 주입하여 30분 후, 형광 이미징 시스템인 MAESTRO(한국기초지원과학연구원)를 이용하여 염증 타겟팅 능력을 생체 영상 진단하였다. 그 결과 모두 염증부위를 정확하게 타겟팅 하는 것을 확인하였고, 그 결과를 도 39 및 40에 나타내었다.

도 39의 A 및 도 40에 나타난 바와 같이, QDs을 표지한 IL21R, VACM1, IL21RB, IL2RG, IL10RB가 가장 염증 타겟팅 능력이 매우 우수하였고, IL13RA1, IL17RA는 우수하였으며, IL3RA, CRLF1는 보통인 것을 확인하였다. 본 발명자들은 생체 내 이미징(in vivo imaging)을 확인하기 위해 사용한 Q-DOT 800의 파장을 도 39의 B에서 빨간색 그래프로 나타내었으며, 또한 도 39의 C에 미정맥 내 주사한 5일 후엔 QDs이 체외로 배출된 것을 확인하였다.

실시예 19. IL21R, IL21R-DomainI, IL21R-DomainⅡ에 대한 CIA 동물 모델을 이용한 생체 영상 진단

본 발명자들은 염증 타겟팅 능력이 우수한 염증관련 수용성 수용체 중에서 IL21R 경우 관절염 치료제인 Enbrel보다 염증 타겟팅 능력이 우수하게 나타나기 때문에, IL21R을 이루고 있는 2개의 도메인을 분리하였을 때, IL21R과 IL21R-Domain I, IL21R-Domain Ⅱ에 대하여 염증 타겟팅 능력이 어느 정도 되는지를 확인하고자 하였다. 60 nmol Qdot conjugation시킨 IL21R, IL21R-Domain I, IL21R-Domain Ⅱ 수용체를 관절염 지표에 3등급(arthritis score=15)에 도달했을 때 정맥 내 주입하여 30분 후, 형광 이미징 시스템인 MAESTRO(한국기초지원과학연구원)를 이용하여 염증 타겟팅 능력을 생체 영상 진단하였다.

그 결과를 도 41에 나타내었으며, IL21R domain I과 IL21R domain Ⅱ 모두 IL21R처럼 염증부위에 정확하게 타겟팅하는 것을 확인하였다. 특히, IL21R-Domain I은 IL21R과 IL21R-Domain Ⅱ보다도 염증부위 타겟팅 능력이 가장 강함을 볼 수 있었다. 상기 결과로부터 IL21R 단백질을 인체에 투여하였을 경우 부작용을 최소화할 수 있으므로, 이를 저분자 약물 (small molecule drug)로서 이용할 때 더욱 효과적인 장점을 가지고 있는 것을 알 수 있다.

실시예 20. IL21R과 관절염 치료제 약물과의 융합단백질에 대한 CIA 동물 모델을 이용한 생체 영상 진단

본 발명자들은 염증 타겟팅 능력이 가장 우수한 IL21R을 기존의 염증억제 약물의 케리어로서의 가능성을 알아보기 위하여, 먼저 대표적인 항 염증 수용체 약물인 TNFR2-Fc 융합단백질(Enbrel)과 융합 하여 IL21R-TNFR2-Fc를 제조하였으며, CIA 동물모델에 60 nmol의 Qdot conjugation시킨 IL21R/TNFR2(Enbrel) 융합수용체를 관절염 지표에 3등급(arthritis score=15)에 도달했을 때 정맥 내 주입하여 30분 후, 형광 이미징 시스템인 MAESTRO(한국기초지원과학연구원)를 이용하여 염증 타겟팅 능력을 생체 영상 진단하였으며 그 결과를 도 42에 나타내었다.

도 42에 나타난 바와 같이, Enbrel의 염증 타겟팅 능력보다 IL21R/TNFR2 융합 수용체의 염증 타겟팅 능력이 훨씬 강한 것을 확인하였으며, IL21R의 염증부위 타겟팅의 케리어로 사용할 수 있음을 확인하였다. 이것은, IL21R 자체가 가지고 있는 염증 타겟팅 능력에 TNFR2가 가지고 있는 염증 타겟팅 능력이 더해지면서, 더 강력한 염증 타겟팅 능력을 보여주는 것으로 판단된다.

또한 IL21R의 염증 부위 타겟팅을 위한 케리어로서의 능력은 TNF-알파의 중화 항체인 Humira에서도 검증되었다. 도 43에 나타난 바와 같이, Humira 항체 중쇄의 N-말단(IL21R/Humira) 및 Humira 항체 중쇄의 C-말단(Humira/IL21R)의 융합 단백질에 Quantum-dot을 표지한 후 in-vivo 염증 타겟팅 능력을 확인해 본 결과 Humira/IL21R이 Humira에 비해 염증 타겟팅 능력이 우수함을 확인하였으며, IL21R/Humira는 Humira와 비슷한 수준인 것을 알 수 있었다. Humira항체에 IL21R을 융합시킬 때 Humira 중쇄의 N-말단에 융합하는 것보다 중쇄의 C-말단에 융합하는 것이 염증 타겟팅에 더 효과적인 것을 알 수 있으며, 이는 IL21R 자체가 가지고 있는 염증타깃팅 능력에 Humira가 가지고 있는 염증타깃팅 능력이 더해지면서, 더 강력한 염증타깃팅 능력을 보여주는 것으로 판단된다.

술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> A&R therapeutics co., ltd. <120> Receptors targeting inflammation and drug carriers for treatment of inflammatory diseases <130> PB11-09289 <160> 60 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-F(SfiI) <400> 1 agggggccgt gggggccccc gacctcgtct gctacac 37 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-R(SfiI) <400> 2 tagcggccga cgcggccaat tcctttaact cctctgact 39 <210> 3 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interlukin 21 receptor DNA sequence <400> 3 cccgacctcg tctgctacac cgattacctc cagacggtca tctgcatcct ggaaatgtgg 60 aacctccacc ccagcacgct cacccttacc tggcaagacc agtatgaaga gctgaaggac 120 gaggccacct cctgcagcct ccacaggtcg gcccacaatg ccacgcatgc cacctacacc 180 tgccacatgg atgtattcca cttcatggcc gacgacattt tcagtgtcaa catcacagac 240 cagtctggca actactccca ggagtgtggc agctttctcc tggctgagag catcaagccg 300 gctccccctt tcaacgtgac tgtgaccttc tcaggacagt ataatatctc ctggcgctca 360 gattacgaag 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Phe Tyr 115 120 125 Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly 130 135 140 Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser 145 150 155 160 Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr 165 170 175 Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly 180 185 190 Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu 195 200 205 Glu Leu Lys Glu 210 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-D1R(SfiI) <400> 5 tagcggccga cgcggccaac ttgatgctct cagccagga 39 <210> 6 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interlukin 21 receptor domain I DNA sequence <400> 6 tgccccgacc tcgtctgcta caccgattac ctccagacgg tcatctgcat cctggaaatg 60 tggaacctcc accccagcac gctcaccctt acctggcaag accagtatga agagctgaag 120 gacgaggcca cctcctgcag cctccacagg tcggcccaca atgccacgca tgccacctac 180 acctgccaca tggatgtatt ccacttcatg gccgacgaca ttttcagtgt caacatcaca 240 gaccagtctg gcaactactc ccaggagtgt ggcagctttc tcctggctga gagcatcaag 300 300 <210> 7 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interlukin 21 receptor domain I protein sequence <400> 7 Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys 1 5 10 15 Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp 20 25 30 Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu 35 40 45 His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met 50 55 60 Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr 65 70 75 80 Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala 85 90 95 Glu Ser Ile Lys 100 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-D2F(SfiI) <400> 8 agggggccgt gggggccgtc aacatcacag accagtct 38 <210> 9 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interlukin 21 receptor domain II DNA sequence <400> 9 gtcaacatca cagaccagtc tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct 60 gagagcatca agccggctcc ccctttcaac 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Leu Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Ser Arg Val Leu Asn Ala Ser Thr Leu Ala Leu Ala Leu Ala 50 55 60 Asn Leu Asn Gly Ser Arg Gln Arg Ser Gly Asp Asn Leu Val Cys His 65 70 75 80 Ala Arg Asp Gly Ser Ile Leu Ala Gly Ser Cys Leu Tyr Val Gly Leu 85 90 95 Pro Pro Glu Lys Pro Val Asn Ile Ser Cys Trp Ser Lys Asn Met Lys 100 105 110 Asp Leu Thr Cys Arg Trp Thr Pro Gly Ala His Gly Glu Thr Phe Leu 115 120 125 His Thr Asn Tyr Ser Leu Lys Tyr Lys Leu Arg Trp Tyr Gly Gln Asp 130 135 140 Asn Thr Cys Glu Glu Tyr His Thr Val Gly Pro His Ser Cys His Ile 145 150 155 160 Pro Lys Asp Leu Ala Leu Phe Thr Pro Tyr Glu Ile Trp Val Glu Ala 165 170 175 Thr Asn Arg Leu Gly Ser Ala Arg Ser Asp Val Leu Thr Leu Asp Ile 180 185 190 Leu Asp Val Val Thr Thr Asp Pro Pro Pro Asp Val His Val Ser Arg 195 200 205 Val Gly Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ser Val Arg Trp Val Ser Pro Pro 210 215 220 Ala Leu Lys Asp Phe Leu Phe Gln Ala Lys Tyr Gln Ile Arg Tyr Arg 225 230 235 240 Val Glu Asp Ser Val Asp Trp Lys Val Val Asp Asp Val Ser Asn Gln 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tccaaactga ggcatcacca caggcggtgg cgttttacct tcagccactt tgtggttgac 360 cctgaccagg aatatgaggt gaccgttcac cacctgccca agcccatccc tgatggggac 420 ccaaaccacc agtccaagaa tttccttgtg cctgactgtg agcacgccag gatgaaggta 480 accacgccat gcatgagctc aggcagcctg tgggacccca acatcaccgt ggagaccctg 540 gaggcccacc agctgcgtgt gagcttcacc ctgtggaacg aatctaccca ttaccagatc 600 ctgctgacca gttttccgca catggagaac cacagttgct ttgagcacat gcaccacata 660 cctgcgccca gaccagaaga gttccaccag cgatccaacg tcacactcac tctacgcaac 720 cttaaagggt gctgtcgcca ccaagtgcag atccagccct tcttcagcag ctgcctcaat 780 gactgcctca gacactccgc gactgtttcc tgcccagaaa tgccagacac tcca 834 <210> 34 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 17 receptor A protein sequence <400> 34 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 20 25 30 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 35 40 45 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 50 55 60 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 65 70 75 80 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg 85 90 95 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 100 105 110 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 115 120 125 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 130 135 140 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 145 150 155 160 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr 165 170 175 Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp 180 185 190 Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 195 200 205 Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg 210 215 220 Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn 225 230 235 240 Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser 245 250 255 Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro 260 265 270 Glu Met Pro Asp Thr Pro 275 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL2RG-F(SfiI) <400> 35 agggggccgt gggggccaac acgacaattc tgacgcccaa 40 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL2RG-R(SfiI) <400> 36 tagcggccga cgcggccaaa gtattgctcc cccagtggat t 41 <210> 37 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-2 receptor subunit gamma DNA sequence <400> 37 aacacgacaa ttctgacgcc caatgggaat gaagacacca cagctgattt cttcctgacc 60 actatgccca ctgactccct cagtgtttcc actctgcccc tcccagaggt tcagtgtttt 120 gtgttcaatg tcgagtacat gaattgcact tggaacagca gctctgagcc ccagcctacc 180 aacctcactc tgcattattg gtacaagaac tcggataatg ataaagtcca gaagtgcagc 240 cactatctat tctctgaaga aatcacttct ggctgtcagt tgcaaaaaaa ggagatccac 300 ctctaccaaa catttgttgt tcagctccag gacccacggg aacccaggag acaggccaca 360 cagatgctaa aactgcagaa tctggtgatc ccctgggctc cagagaacct aacacttcac 420 aaactgagtg aatcccagct agaactgaac tggaacaaca gattcttgaa ccactgtttg 480 gagcacttgg tgcagtaccg gactgactgg gaccacagct ggactgaaca atcagtggat 540 tatagacata agttctcctt gcctagtgtg gatgggcaga aacgctacac gtttcgtgtt 600 cggagccgct ttaacccact ctgtggaagt gctcagcatt ggagtgaatg gagccaccca 660 atccactggg ggagcaatac t 681 <210> 38 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-2 receptor subunit gamma protein sequence <400> 38 Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp 1 5 10 15 Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu 20 25 30 Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn 35 40 45 Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu 50 55 60 His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser 65 70 75 80 His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys 85 90 95 Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu 115 120 125 Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser Glu 130 135 140 Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys Leu 145 150 155 160 Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr Glu 165 170 175 Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly 180 185 190 Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys 195 200 205 Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp Gly 210 215 220 Ser Asn Thr 225 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL10RB-F(SfiI) <400> 39 agggggccgt gggggcccat gggacagagc tgcccag 37 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL10RB-R(SfiI) <400> 40 tagcggccga cgcggccaaa tactgcctgg tgagggagat 40 <210> 41 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 10 receptor beta DNA sequence <400> 41 catgggacag agctgcccag ccctccgtct gtgtggtttg aagcagaatt tttccaccac 60 atcctccact ggacacccat cccaaatcag tctgaaagta cctgctatga agtggcgctc 120 ctgaggtatg gaatagagtc ctggaactcc atctccaact gtagccagac cctgtcctat 180 gaccttaccg cagtgacctt ggacctgtac cacagcaatg gctaccgggc cagagtgcgg 240 gctgtggacg gcagccggca ctccaactgg accgtcacca acacccgctt ctctgtggat 300 gaagtgactc tgacagttgg cagtgtgaac ctagagatcc acaatggctt catcctcggg 360 aagattcagc tacccaggcc caagatggcc cccgcaaatg acacatatga aagcatcttc 420 agtcacttcc gagagtatga gattgccatt cgcaaggtgc cgggaaactt cacgttcaca 480 cacaagaaag taaaacatga aaacttcagc ctcctaacct ctggagaagt gggagagttc 540 tgtgtccagg tgaaaccatc tgtcgcttcc cgaagtaaca aggggatgtg gtctaaagag 600 gagtgcatct ccctcaccag gcagtat 627 <210> 42 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin 10 receptor beta DNA sequence <400> 42 His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe Glu Ala Glu 1 5 10 15 Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn Gln Ser Glu 20 25 30 Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile Glu Ser Trp 35 40 45 Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp Leu Thr Ala 50 55 60 Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala Arg Val Arg 65 70 75 80 Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr Asn Thr Arg 85 90 95 Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val Asn Leu Glu 100 105 110 Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro Arg Pro Lys 115 120 125 Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser His Phe Arg 130 135 140 Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe Thr Phe Thr 145 150 155 160 His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr Ser Gly Glu 165 170 175 Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala Ser Arg Ser 180 185 190 Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu Thr Arg Gln 195 200 205 Tyr <210> 43 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of NATVK1-1(SfiI) <400> 43 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gacatccaga tgacccagtc 50 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of NATJK-R4(BglII) <400> 44 gaggagagat cttttgattt ccaccttggt 30 <210> 45 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humira light chain DNA sequence <400> 45 gatgtccact cggacatcca gatgacccag agccccagca gcctgagcgc cagcgtgggc 60 gaccgggtga ccatcacctg ccgggccagc cagggcatcc ggaactacct ggcctggtac 120 cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcac cctgcagagc 180 ggcgtgccca gccggttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240 agcctgcagc ccgaggacgt ggccacctac tactgccagc ggtacaaccg ggccccctac 300 accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aaa 333 <210> 46 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humira light chain protein sequence <400> 46 Asp Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 20 25 30 Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn 85 90 95 Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of NATVH3-4(SfiI) <400> 47 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gaggtgcagc tggtgcagtc 50 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of NATJH-all(NheI) <400> 48 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 49 <211> 394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humira Heavy chain DNA sequence <400> 49 ggccacagcg gccgatgtcc actcgcaggt gcagctggtg gagagcggcg gcggcctggt 60 gcagcccggc cggagcctgc ggctgagctg cgccgccagc ggcttcacct tcgacgacta 120 cgccatgcac tgggtgcggc aggcccccgg caagggcctg gagtgggtga gcgccatcac 180 ctggaacagc ggccacatcg actacgccga cagcgtggag ggccggttca ccatcagccg 240 ggacaacgcc aagaacagcc tgtacctgca gatgaacagc ctgcgggccg aggacaccgc 300 cgtgtactac tgcgccaagg tgagctacct gagcaccgcc agcagcctgg actactgggg 360 ccagggcacc ctggtcaccg tctctgcagc tagc 394 <210> 50 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humira Heavy chain protein sequence <400> 50 Gly His Ser Gly Arg Cys Pro Leu Ala Gly Ala Ala Gly Gly Glu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gly Ala Ala Arg Pro Glu Pro Ala Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Gln Arg Leu His Leu Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Gly Ala Ala Gly 35 40 45 Pro Arg Gln Gly Pro Gly Val Gly Glu Arg His His Leu Glu Gln Arg 50 55 60 Pro His Arg Leu Arg Arg Gln Arg Gly Gly Pro Val His His Gln Pro 65 70 75 80 Gly Gln Arg Gln Glu Gln Pro Val Pro Ala Asp Glu Gln Pro Ala Gly 85 90 95 Arg Gly His Arg Arg Val Leu Leu Arg Gln Gly Glu Leu Pro Glu His 100 105 110 Arg Gln Gln Pro Gly Leu Leu Gly Pro Gly His Pro Gly His Arg Leu 115 120 125 Cys Ser 130 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-F <400> 51 tgccccgacc tcgtctgcta ca 22 <210> 52 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-R(XhoI) <400> 52 ccagctcgag cggccgtcgc actcattcct ttaactcctc t 41 <210> 53 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-F(SfiI) <400> 53 tggtggccac agcggcctgc cccgacctcg tctgctac 38 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-R <400> 54 agctgcacct gcgagtggac atcttccttt aactcc 36 <210> 55 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-F(SfiI) <400> 55 cagggggccg tgggggcccc cgacctcgtc tgctacac 38 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of IL21R-R <400> 56 tagcggccga cgcggccaat tcctttaact cctctgact 39 <210> 57 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of TNFR2-F <400> 57 cagggggccg tgggggcctt gcccgcccag gtggcatt 38 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer of TNFR2-R(SfiI) <400> 58 tagcggccga cgcggccaac gtgcagactg catccatgc 39 <210> 59 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL21R/TNFR2 Fusion DNA sequence <400> 59 cccgacctcg tctgctacac cgattacctc cagacggtca tctgcatcct ggaaatgtgg 60 aacctccacc ccagcacgct cacccttacc tggcaagacc agtatgaaga gctgaaggac 120 gaggccacct cctgcagcct ccacaggtcg gcccacaatg ccacgcatgc cacctacacc 180 tgccacatgg atgtattcca cttcatggcc gacgacattt tcagtgtcaa catcacagac 240 cagtctggca actactccca ggagtgtggc agctttctcc tggctgagag catcaagccg 300 gctccccctt tcaacgtgac tgtgaccttc tcaggacagt ataatatctc ctggcgctca 360 gattacgaag accctgcctt ctacatgctg aagggcaagc ttcagtatga gctgcagtac 420 aggaaccggg gagacccctg ggctgtgagt ccgaggagaa agctgatctc agtggactca 480 agaagtgtct ccctcctccc cctggagttc cgcaaagact cgagctatga gctgcaggtg 540 cgggcagggc ccatgcctgg ctcctcctac caggggacct ggagtgaatg gagtgacccg 600 gtcatctttc agacccagtc agaggagtta aaggaattgc ccgcccaggt ggcatttaca 660 ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc cggctcagag aatactatga ccagacagct 720 cagatgtgct gcagcaagtg ctcgccgggc caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc 780 tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac agcacataca cccagctctg gaactgggtt 840 cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc 900 actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag 960 caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc 1020 agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc 1080 aacacgactt catccacgga tatttgcagg ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc 1140 cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc acg 1173 <210> 60 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL21R/TNFR2 Fusion protein sequence <400> 60 Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile 1 5 10 15 Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln 20 25 30 Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His 35 40 45 Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp 50 55 60 Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp 65 70 75 80 Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu 85 90 95 Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly 100 105 110 Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr 115 120 125 Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly 130 135 140 Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser 145 150 155 160 Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr 165 170 175 Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly 180 185 190 Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu 195 200 205 Glu Leu Lys Glu Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro 210 215 220 Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala 225 230 235 240 Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe 245 250 255 Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr 260 265 270 Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser 275 280 285 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln 290 295 300 Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys 305 310 315 320 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly 325 330 335 Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys 340 345 350 Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile 355 360 365 Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala 370 375 380 Ser Met Asp Ala Val Cys Thr 385 390

Claims

IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편에 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL21R(Interlukin 21 receptor)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
CRLF1(Cytokine receptor like factor 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL17RA(Interleukin 17 receptor A)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 염증 질환 억제제는 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2)의 세포외 영역, CTLA-4(Orencia)의 세포외 영역, IL-1 길항제(antagonist), Humira 항체, 항 CXCL10 항체, 항 IL6R 항체, 및 항 IL6 항체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편을 염증 질환 억제제 또는 면역 증강제의 C-term 방향 또는 N-term 방향으로 융합하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편, 및 염증질환 억제제 또는 면역 증강제가 연결된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL21R(Interlukin 21 receptor)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
CRLF1(Cytokine receptor like factor 1)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL17RA(Interleukin 17 receptor A)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 치료용 또는 면역조절 치료용 약학 조성물.
제 13항에 있어서,
IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
상기 염증 질환 억제제는 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2)의 세포외 영역, CTLA-4(Orencia)의 세포외 영역, IL-1 길항제(antagonist), Humira 항체, 항 CXCL10 항체, 항 IL6R 항체, 및 항 IL6 항체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.
제 13항에 있어서,
상기 융합 단백질은 IL21R(Interlukin 21 receptor), VcamI(Vascular cell adhesion molecule 1), IL2RB(Interleukin-2 receptor subunit beta), IL3RA(Interleukin 3 receptor, alpha), IL13RA1(Interleukin 13 receptor, alpha 1), CRLF1(Cytokine receptor like factor 1), IL17RA(Interleukin 17 receptor A), IL2RG(Interleukin-2 receptor subunit gamma), 및 IL10RB(Interleukin 10 receptor, beta)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 세포 외 영역을 포함하는 단편을 염증 질환 억제제 또는 면역 증강제의 C-term 방향 또는 N-term 방향으로 융합하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환 또는 면역조절 치료 효과를 높이는 방법.