KR20120105494A

KR20120105494A - 수식된 에리스로포이에틴

Info

Publication number: KR20120105494A
Application number: KR1020127016845A
Authority: KR
Inventors: 아브라함 아부초우스키; 리히싱 스탠포드 리
Original assignee: 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2012-09-25
Also published as: PT2054074E; IL232923A0; KR101304081B1; JP2013079258A; HK1131542A1; CA2659990A1; JP5802644B2; KR20090046923A; JP5723528B2; IL196866A; IL196866A0; PL2054074T3; JP2015231996A; CN105820231A; US8765924B2; SI2054074T1; DK2054074T3; EP2054074A1; EP2054074B8; IL232923A

Abstract

본 발명은 단백질 접합체, 상세하게는 페그화(pegylated) 단백질, 및 이의 제조 방법 그리고 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 특징은 현재의 에리스로포이에틴 제형보다 큰 임상 효능 및 운송과 저장시 안정성을 보유하는 페그화 에리스로포이에틴에 관한 것이다.

Description

수식된 에리스로포이에틴{MODIFIED ERYTHROPOIETIN}

본 출원은 2006년 8월 4일에 출원된, 미국 가출원 시리얼 번호 60/835,429의 이익을 청구하고, 이의 전문을 참고의 목적으로 본원에 인용한다.

본 발명은 단백질 접합체(conjugate), 특히 페그화(pegylated) 단백질 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 특징은 에리스로포이에틴 제형보다 더 높은 임상 효능 및 운송과 저장시 안정성을 보유하는 페그화-에리스로포이에틴에 관한 것이다.

최근 몇해, 폴리에틸렌 글리콜("PEG")과 같은 비항원성 수용성 중합체가 치료 및 진단상 중요한 폴리펩타이드의 공유 진단에 사용됐다. PEG는 비독성, 비면역성, 고수용성, 및 신체로부터 빨리 제거되는 중합체다. PEG는 여러가지로 적용될 수 있고, 음식, 화장품, 음료, 및 처방 의약품에 통상적으로 사용된다. 의약품 그레이드인 PEGs는 FDA에 의해 미국에서 사용이 승인되고, 높은 등급의 생체 적합성이 주어진다면 바이오 의약품의 담체로 널리 사용된다. 페그화(PEGylation)는 기능을 변경하는 것 없이 생의약품의 특정 특성을 개조해서 치료 효과를 개선할 수 있다.

일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 단백질 위에서 발견된 반응기를 통해 단백질에 연결된다. 라이신 잔기 또는 N-말단에서의 것과 같은 아미노기는 이러한 결합에 편리하다. PEG는 다양한 화학적인 방법으로 사슬 말단의 히드록실기를 통해 바이오 의약품을 활성화시키기 위해 커플링될 수 있다. 예컨대, 인터루킨(Knauf, M. J. et al., J. Biol.Chem. 1988, 263, 15,064; Tsutsumi, Y. et al., J. Controlled Realese 1995, 33, 447), 인터페론(Kite, Y. et al., Drug Des. Delivery 1990, 6, 157), 카탈라아제(Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 1977, 252, 3, 582), 과산소디스뮤다아제(Beauchamp, C. O. et al., Anal. Biochem. 1983, 131, 25), 및 아데노신데아미나아제(Chen, R. et al., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293)는 생체내에서 이들의 반감기를 연장하고/하거나 이들의 면역원성 및 항원성을 줄이기 위한 것으로 보고됐다.

PEG 분자는 다른 반응성 모이티를 보유하는 매톡시화 PEG("mPEG')를 사용해서 폴리펩타이드의 아미노기를 통해 결합됐다. 이러한 중합체는 mPEG-숙시니미딜 숙시네이트, mPEG-숙시니미딜 카보네이트, mPEG-이미데이트, 및 mPEG-시아누르 클로라이드를 포함한다. 대안적으로, N-말단에서의 부위 특이적 페그화, 곁사슬, 및 성장 호르몬 방출 인자의 강력한 아날로그의 C-말단이 고체상 합성을 통해 수행됐다(Felix, A. M. et al., Int, J. Peptide Protain Res. 1995, 46, 253). N-말단에서의 부위 특이적 페그화 또한 알데히드 활성화된 PEG로 수행됐으나; 이러한 반응들은 긴 반응 시간이 필요하고, pH에 크게 의존한다. 예컨대, 이 반응은 18 내지 36 시간이 걸리고, 일반적으로 산성 pH에만 특이적이며, 중성 또는 보다 높은 pH에서 랜덤화된다(예컨대, 미국 특허 번호 6,077,939 및 5,985,265를 참고하고, 각각의 전문은 본원에 참고인용된다). 이것이 장기간의 산성 조건을 견딜 수 있는 펩타이드로 제한시킨다.

사용된 추가적인 방법은 N-말단 트레오닌의 소듐 과요오드화염으로 인한 N-말단의 반응성 알데히드기를 통해 부위 특이적 방법으로 리포솜 표면에 접목된 PEG 사슬의 극치(extremities)에 펩타이드를 결합하는 것을 수반한다(Zalipsky, S. et al., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705). 그러나, 이 방법은 N-말단에 세린 또는 트레오닌 잔기를 보유하는 폴리펩타이드로 제한된다.

특히, 폴리펩타이드의 C-말단에 활성화기를 도입하기 위한 효소 보조법이 기술된다(Schwarz, A. et al., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose, K. et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaertner, H. F. et al., J. Biol. Chem.1994, 269, 7224). 전형적으로, 이러한 활성화기는 폴리펩타이드에 기능성 프로브(probe)를 순차적으로 결합하기 위한 하이드라자이드, 알데히드, 및 방향족 아미노기일 수 있다.

부위 특이적 돌연변이 유발은 추가로 부위 특이적 중합체 결합을 위해 폴리펩타이를 제조하는데 사용된 접근법이다. WO 90/12,874는 시스테인 잔기의 다른 잔기로의 치환 또는 시스테인 잔기의 삽입으로 개질된 단백질의 특정 부위 페그화를 기술한다. 이 공고는 또한 시스테인 특정 mPEG 유도체를 EPO에 소개된 시스테인 잔기와 재조합으로 반응시켜서 mPEG-에리스로포이에틴("m-PEG-EPO")을 제조하는 방법을 기술한다. 유사하게, 인터루킨-2는 특정 부위에서의 돌연변이 유발 후에 이의 당부가(glycosylation)부위에서 페그화됐다(Gooson, R. J. et al., Bio/Technology 1990,8,343).

당단백질은 수식을 위한 추가적인 목표 부위로 카보하이드레이트를 제공한다. 효소 페록시다아제는 이의 카보하이드레이트 모이티를 통해 PEG-디아민으로 개질됐다(Urrutiogoity, M. et al., Biocatalysis 1989, 2, 145). WO94/28,024는 과요오드화염-산화된 카보하이드레이트를 통해 mPEG-EPO를 제조하는 방법을 기술한다. 수반된 화학은 mPEG-하이드라지드를 EPO의 카보하이드레이트 모이티의 알데히드기와의 반응으로 인한 하이드라존 생성이었다. 이러한 종류의 수식은 산화 단계를 통해 반응성 알데히드기를 생성하고, 카보하이드레이트 모이티 중 다양한 종류의 당 잔기 및 매티오닌과 같은 폴리펩타이드 중 일부 아미노산을 잠재적으로 산화시킬 수 있다.

에리스로포이에틴

개선된 페그화 방법에 대한 요구를 증명하는 전형적인 단백질은 에리스로포이에틴이다. 에리스로포이에시스(erythropoiesis)는 세포 파괴를 상충시키기 위해 발생하는 적혈구 세포의 생성이다. 에리스로포이에시스는 충분한 적혈구 세포가 적합한 세포 산화(oxygenation)가 가능하도록 하는 조절된 생리적 매카니즘이다. 자연발생 인간 에리스로포이에틴(hEPO)은 신장에서 생산된 폴리펩타이드고, 적혈구 생성을 촉진하는 채액성 플라즈마 인자다(Carnot, P and Deflandre, C(1906)C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A J(1953 Blood 8: 349; Reissmann, K R(1950) Blood 5: 372; Jacobson, L O, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, L F(1957) Nature 179: 63331-4).

에리스로포이에틴은 재조합 DNA 기술[Egrie, J c, Strickland, T W, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224]을 사용해서 생합성으로 제조됐고, 중국 햄스터의 난소 조직 세포에서 발현되고, 삽입된 복제 인간 EPO 유전자의 생성물이다(CHO 세포). 우세하고 완전 처리된 형태의 hEPO의 1차 구조는 SEQ ID NO:1에 예증된다. Cys⁷-Cys¹⁶¹ 대 Cys²⁹-Cys³³ 사이에는 2개의 디설파이드 브리지(bridge)가 있다. 당 모이티가 없는 EPO의 폴리펩타이드 사슬의 분자량은 18,236 Da 이다. 천연 EPO 분자(약 33kD의 분자량)에서, 분자량의 약 40%가 단백질의 당부가 부위에서 단백질을 당부가하는 카보하이드레이트기에 해당한다(Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M(1987)J. Biol. Chem. 262: 12,059).

인간 에리스로포이에틴은 적혈구 세포 생성에 필수적이기 때문에, 이 호르몬은 낮거나 부족한 적혈구 생산으로 인한 혈액 장애 및 적혈구 세포 생성 과다가 환자에게 이로울 다른 질병들의 치료에 유용하다. 예컨대, EPO는 만성신부전 환자(CRF)(Eschbach, J W, Egri, J C, Downig, M R et al.(1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, J W, Abdulhadi, M H, Browne, J K et al.(1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, J C, Eschbach, J W, McGuire, T, Adamson, J W(1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, V S, Degowin, R L, Zavala, D et al.(1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) 및 AIDS 그리고 화학요법 치료 중인 암 환자의 빈혈 치료에 사용되어왔다(Danna, R P, Rudnick, S A, Abels, R I In: M B, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications--An International Perspective. New York, N Y.: Marcel Dekker; 1990: p. 301-324).

그러나, EPO와 같은 상업적으로 입수 가능한 단백질 치료제의 생체적합성은 이들의 짧은 플라즈마 반감기 및 프로테아제 분해에 대한 민감도로 인해 제한된다. 이러한 단점은 이들이 최대의 임상 효과를 획득하는 것을 방해하고, 일반적으로 보다 잦은 치료 또는 보다 많은 양의 약을 투여하는 것을 요구하기 때문에 보다 잦은 치료 및 부작용의 심화 그리고 치료 스케줄로 인한 환자의 불편을 초래할 수 있다. 고유 EPO 및 이의 유도체 그리고 수식(modified) 형태를 포함하는 단백질은 또한 일반적으로 알부민(HSA 또는 혈청)으로 제재화되고, 사용시 제품의 안정성을 유지하기 위해 저하된 온도에서 저장 및 수송된다. HSA 혈청을 보유하는 제형은 제약 등급인 HSA 및 관련된 생물 검정과 관련된 고비용 및 인간 감염체(infectious agents)로 인한 오염의 위험때문에 바람직하지 않다.

ARANESP®(다르베포이에틴 알파)는 상업적으로 입수 가능한 EPO 유도체다. 재조합 인간 에리스로포이에틴은 3개의 사슬을 보유하는 반면, 이것은 5 N-연쇄 올리고사카라이드 사슬을 보유하는, 재조합 인간 에리스로포이에틴과 다른 165-아미노산 단백질이다. 두 개의 추가적인 N-당부가 부위는 에리스로포이에틴 펩타이드 기본골격의 아미노산 치환체로부터 유래한다. 추가적인 카보하이드레이트 사슬은 당단백질의 근사 분자량을 30,000에서 37,000 달톤으로 증가시킨다. ARANESP®는 첨가물로, 폴리소르베이트 80을 보유하는 것과 인간 혈액 유도체, 알부민(HSA) 보유하는 것, 이렇게 두 개의 제형으로 공급된다.

페그화 단백질, 예컨대, EPO 유도체가 미국 공개 번호 제2002/0,115,833, 2003/0,120,045 및 2003/0,166,566에 개시됐다. 그러나, 이 조성물 제조에 사용된 공정은 수행 및 조절이 어렵고, 비싸고, 합성시 유해 화합물을 사용하거나, 다른 품질 조절 문제를 보유한다. 게다가, 비수식된 폴리펩타이드의 본래 기능보다 높은 생물학적 활성도를 보유하는 폴리펩타이드 접합체를 산출하는 것으로 공지되지 않는다.

그렇기 때문에, 실행하기 보다 쉽고 저렴하며, 가장 중요하게는 예측가능하고 일정한 생성물을 제조하기 위해 보다 쉽게 제어할 수 있는 페그화 조성물의 제조방법 및 페그화 조성물에 대한 요구가 있다.

특히 EPO에 관한 제형은 현재 입수 가능한 제형과 비교해서 개선된 플라즈마 반감기, 증가된 활성도, 및 프로테아제 분해에 대한 감소된 민감도를 보유하도록 요구된다. 게다가, 이러한 제형은 표준 조건 및/또는 무단백질 제형에서 포장, 선적 및 저장될 수 있어야 한다.

본원에 언급된 특허 문서를 포함하는 모든 과학 문헌의 전문은 본원에 참고 인용된다.

발명의 개요

본 발명은 예컨대, 에리스로포이에틴("EPO")과 같은 새로운 형태의 모노- 및 디-페그화 단백질 그리고 이의 혼합물의 놀라운 발견에 기반한다. EPO를 사용해서 증명된 바, 본 발명의 제형은 재조합 인간 EPO 및/또는 다른 상업적으로 입수 가능한 EPO 치료제와 비교해서 개선된 플라즈마 반감기 및 안정성을 포함하는 개선된 생체내 활성도를 나타낸다. 본 발명의 EPO 분자 및 조성물은 추가로 무단백질 제형에서 장기적인 안정성을 나타내고/나타내거나 표준 저장 조건, 즉 예컨대 약 25℃의 표준 온도에서의 저장으로 안정하게 유지된다.

특정 양태에서, 본 발명은 각각의 에리스로포이에틴 단백질이 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된, 적어도 하나의 에리스로포이에틴 단백질 개체군; 및 무단백질 제약 담체를 포함하는 제약 제형에 관한 것이다. 특정 양태에서, 각각의 에리스로포이에틴 단백질은 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된다. 또 다른 양태에서, 각각의 에리스로포이에틴 단백질은 두개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합된다. 추가적인 양태에서, 에리스로포이에틴 단백질의 적어도 하나의 개체군은 첫 번째 및 두 번째 개체군이고, 에리스로포이에틴 단백질의 첫 번째 개체군은 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결되고, 두 번째 개체군은 두개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결된다. 또 다른 양태에서, 첫 번째 대 두 번째 개체군의 비율은 약 1 미만 대 약 100, 약 10 대 약 90, 약 20 대 약 80, 약 30 대 약 70, 약 40 대 약 60, 약 50 대 약 50, 약 60 대 약 40, 약 70 대 약 30, 약 80 대 약 20, 약 90 대 약 10 또는 약 100 대 약 1 미만 범위일 수 있고, 약 1 미만은 당해 기술에서 공지된 표준방법을 사용해서 검출되지 않을 정도의 양을 포함한다.

추가적인 양태에서, 각각의 에리스로포이에틴 단백질은 특정 라이신 잔기를 통해 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된다. 특정 양태에서, 본 발명은 에리스로포이에틴 단백질의 아미노 말단을 통해 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된 적어도 하나의 에리스로포이에틴 분자를 보유하는 조성물을 포함하고, 상기 공유 결합은 알데히드 결합을 통하지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명은 특정 라이신 잔기, 라이신 116을 통해 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된 적어도 하나의 에리스로포이에틴 분자를 보유하는 조성물을 포함한다. 또 다른 양태에서, 이 제형은 무단백질인 담체 제형으로 에리스로포이에틴의 실질적인 감소없이 연장된 시간동안 저장될 수 있다.

본 발명은 페그화 단백질, 예컨대, EPO의 새로운 형태의 특히 제약 제형에서의 용도 및 제조방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 제조방법을 사용해서, 본 발명의 페그화 단백질은 접합체고, 이 단백질은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된다. 특정 양태에서, 본 발명의 페그화 단백질은 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 분자다. 본 발명의 이 측면에서의 또 다른 양태에서, 공유 결합은 단백질의 아미노 말단을 통해서다. 본 발명의 이 측면에서의 또 다른 양태에서, 공유 결합은 라이신 116과 같은 EPO 단백질의 라이신 잔기를 통한다. 따라서, 본 발명의 페그화 단백질은 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 접합된 단백질을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 한 개 또는 두 개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 접합된 EPO 단백질(즉, 각각 모노- 또는 디-페그화 단백질), 및/또는 이의 혼합물을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 페그화 단백질 접합체는 모노-페그화 단백질을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 본 발명의 페그화 단백질 접합체는 모노-페그화 단백질을 포함한다. 본 발명의 모노-페그화 단백질은 각각의 접합체에서 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 분자가 동일한 아미노산 잔기를 통해 단백질에 공유 결합됐기 때문에 균일할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 모노-페그화 단백질은 다수의 접합체를 포함하고, 각각의 접합체의 경우, 단일 PEG 분자가 단백질의 아미노산 잔기 또는 N-말단(즉, 단백질의 α-아미노기)을 바꾸는 것을 통해 EPO 단백질에 접합되고, 상기 아미노산 잔기는 본원에 기술된 PEG의 공유 접합에 적합한 아미노산 잔기 중 하나다. 본 발명의 다중 페그화 단백질은 각각의 접합체에서 두 개 이상의 PEG 접합체가 동일 부위에서 각각의 단백질에 공유 결합되기 때문에 균일할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 페그화 단백질 접합체는 디-페그화(di-pegylated) 단백질과 같은 다중 페그화 부위를 보유하는 단백질을 포함한다. 본 발명의 다중 페그화 단백질은 각각의 접합체에서 두 개 이상의 PEG 분자가 동일 부위에서 각각의 단백질에 공유 결합된다. 다른 양태에서, 본 발명의 다중 페그화된 단백질은 다수의 접합체를 포함하고, 각각의 접합체에서 두 개 이상의 PEG 분자가 본원에서 기술된 PEG로의 공유 접합에 적합한 임의의 두 개 이상의 적합한 아미노산 잔기 및/또는 단백질의 아미노 말단에서 단백질에 접합된다. 예컨대, 특정 양태에서, 본 발명의 EPO 접합체는 다수의 모노- 및 디- 페그화 EPO를 포함하고, EPO 단백질 및 PEG 분자(들) 사이의 접합 부위(들)은 균일하지 않다.

따라서, 특정 양태에서, 본원에 제시된 제조 방법은 다수의 EPO 접합체를 포함하는 조성물을 제조하고, EPO 단백질을 포함하는 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 대다수는 단백질의 아미노 말단에서 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 보유하는 접합체를 포함하고, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합은 알데히드 결합을 통한 것은 아니다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 대다수는 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 단백질의 아미노 말단에서 보유하며 이 결합이 알데히드 결합을 통한 것은 아닌 접합체; 및 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 116에서 보유하는 접합체, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 52에서 보유하는 접합체, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 154에서 보유하는 접합체 중 하나 이상 또는 이들 모두를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 단백질의 아미노 말단에서 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 보유하되, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합이 알데히드 결합을 통한 것은 아닌 접합체, 및 본원에서 기술되거나 당해 기술에 공지된 결합에 적합한 임의의 부위에서의 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합을 보유하는 접합체를 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하고, 상기 다수는 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 라이신 116에서 보유하는 접합체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 라이신 116에서 보유하는 접합체; 및 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 단백질의 아미노 말단에서 보유하되, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합이 알데히드 결합을 통한 것은 아닌 접합체, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 52에서 보유하는 접합체, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 154에서 보유하는 접합체 중 하나 이상 또는 이들 모두를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 단백질의 아미노 말단에서 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 라이신 116에서 보유하는 접합체 및 본원에서 기술되거나 당해 기술에 공지된 이러한 결합에 적합한 임의의 부위에서 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합을 보유하는 접합체를 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 라이신 116을 통해 EPO 단백질에 공유 결합된 PEG 분자를 보유하는 모노-페그화 EPO를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 라이신 116을 통해 EPO 단백질에 공유 결합된 PEG 분자를 보유하는 모노-페그화 EPO; 및 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO단백질의 아미노 말단에서 보유하되, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합이 알데히드 결합을 통한 것은 아닌 접합체, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 52에서 보유하는 접합체, 그리고 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 154에서 보유하는 접합체 중 하나 이상 또는 이들 모두를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 단백질의 아미노 말단을 통해 EPO 단백질에 공유 결합된 PEG 분자를 보유하되, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합이 알데히드 결합을 통해서는 아닌 모노-페그화 EPO를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 단백질의 아미노 말단을 통해 EPO 단백질에 공유 결합된 PEG 분자를 보유하되, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합이 알데히드 결합을 통해서는 아닌 모노-페그화 EPO; 및 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO단백질의 라이신 116에서 보유하는 접합체; 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 52에서 보유하는 접합체; 및 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 라이신 154에서 보유하는 접합체 중 하나 이상 또는 이들 모두를 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 다수의 단백질 접합체는 적어도 하나의 접합체 개체군을 포함하고, 상기 적어도 하나의 개체군은 적어도 하나의 PEG 분자에 공유 결합된 단백질을 포함한다. 다른 양태에서, 단백질 접합체 중 적어도 하나의 개체군은 첫 번째 및 두 번째 개체군이고, 상기 첫 번째 개체군은 하나의 PEG 분자에 결합되고, 두 번째 개체군은 두 개 이상의 PEG 분자에 결합된다. 특정 양태에서, 상기 공유 결합은 단백질의 아미노 말단에서의 비알데히드 결합을 포함한다. 특정 양태에서, 단백질 접합체 중 적어도 하나의 개체군은 첫 번째 및 두 번째 개체군인 EPO-접합체 중 적어도 하나의 개체군이고, 상기 첫 번째 개체군은 하나의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO-PEG이고, EPO-PEG의 두 번째 개체군은 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질이다. 특정 양태에서, 첫 번째 개체군 대 두 번째 개체군의 비율은 약 1 미만 대 약 100, 약 10 대 약 90, 약 20 대 약 80, 약 30 대 약 70, 약 40 대 약 60, 약 50 대 약 50, 약 60 대 약 40, 약 70 대 약 30, 약 80 대 약 20, 약 90 대 약 10 또는 약 100 대 약 1 미만 범위일 수 있고, 약 1 미만은 당해 기술에서 공지된 표준 방법으로 검출될 수 없는 양을 포함한다.

본 발명은 추가로 다수의 단백질 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 적어도 하나의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수를 대상(subject)에 투여하는 것은 상기 다수의 혈청 농도, 또는 상기 다수 중 하나 이상의 성분의 혈청 농도가 주입 24, 36 또는 48 시간 후에 대조군의 제형과 당량(예컨대, 단백질 농도에 기준하거나 활성도 단위, 예컨대 EPO 단위)을 투여해서 수득할 수 있는 것 보다 적어도 약 10%-700% 큰 값을 얻는다. 본 발명의 다수의 EPO 접합체에 관한 특정 양태에서, 대조군 제형은 예컨대, 재조합 인간 EPO(rhuEPO), 고유 EPO 또는 상업적인 EPO 제형, 예컨대, ARANESP®(다르보포이에틴 알파)일 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 다수의 EPO 접합체를 스프래그 다우리(Spragus-Dawley) 쥐로 투여(예컨대, 피하내, 정맥내)함으로써 대조군 EPO 제형의 투여 이후 약 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68 또는 72 시간 후에 수득할 수 있는 것보다 적어도 약 5% 내지 700% 높은 혈청 농도를 수득한다. 본 발명은 치료용 단백질, 예컨대, 치료용 페그화 단백질의 대상으로의 전달에 적합한 본원에 기술되고/되거나 당해 기술에서 공지된 임의의 투여 방법을 포함하고; 상기 방법은 근육내, 비경구, 폐, 코 및 경구를 포함하되, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 다수의 단백질 접합체는 또한 대상으로의 투여에 적합한, 본원에서 기술되고/되거나 당해기술에서 공지된 임의의 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 다양한 추가 물질을 포함할 수 있다.

또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수의 대상으로의 투여는 동일 당량(예컨대, EPO 단위에 기준)의 대조군 EPO 제형(예컨대, 재조합 인간 EPO(rhuEPO), 고유 EPO 또는 상업적인 EPO 제형, 예컨대, ARANESP®(다르보포이에틴 알파))의 투여 후 약 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18 또는 21일에 수득된 것보다 헤마토크릿(hematocrit)에서 적어도 5%-250%의 증가를 나타낸다.

본 발명은 추가로 본원에 기술된 다수의 단백질 접합체(예컨대, 하나의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 접합체 개체군 및/또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 결합체 개체군를 포함하고/하거나 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 접합체 개체군으로, 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나는 단백질의 아미노 말단이되, 상기 아미노 말단에서 공유 결합은 알데히드 결합을 통한 것은 아니다)를 포함하고/포함하거나 상기 다수 중 하나 이상의 성분 및 무단백질인(예컨대, 무혈청, 무알부틴, 무 인간 혈청 알부틴("무 hsa")) 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 제약 제형을 포함한다. 특정 양태에서, 무단백질인 약학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 본 발명의 제약 제형은 본원에 기술된 방법 및/또는 당해기술에서 공지된 방법으로 측정된 바, 실질적이고/이거나 검출가능한 양의 에리스로포이에틴의 분해없이 연장된 시간동안 저장될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 제약 제형은 약 -20℃ 또는 4℃에서 저장 적어도 15달 후에 측정할 때 이러한 무단백질 제형으로 안정하다(즉, 검출가능한 분해를 나타내지 않았고/않았거나 실질적인 분해를 나타내지 않는다). 다른 양태에서, 본 발명의 제약 제형은 약 25℃ 또는 약 37℃에서 저장한 적어도 10달 후에 측정한 바, 이러한 무단백질 제형으로 안정하다(즉, 검출가능한 분해를 나타내지 않았고/않았거나 실질적인 분해를 나타내지 않는다). 본 발명의 제약 제형의 안정성은 당해 기술에서 공지되고/되거나 본원에 기술된 임의의 방법으로 평가될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 제약 제형의 안정성은 비신초니닌산("BCA") 단백질 검정으로 측정된 바, 시간 대비 단백질 농도의 변화를 모니터함으로써 평가된다. 다른 양태에서, 본 발명의 제약 제형의 안정성은 SDS PAGE 분석으로 측정된 바, 시간 대비 단백질 분해의 지시로 평가된다(즉, EPO 접합체 분해). 상기 다른 양태에서, 본 발명의 제약 제형의 안정성은 상기 제형의 활성도를 시간 대비로 모니터함으로써 평가되고, 상기 활성도는 상기 제형(예컨대, EPO 제형)의 활성도의 측정에 관한 당해 기술에서 공지된 임의의 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 방법으로 측정된다. 본 양태에 따른 특정예에서 다수의 EPO-접합체를 포함하는 본 발명의 제약 제형의 활성도는 시험관내에서 줄기 세포를 적혈구 세포로의 분화를 유도하는 상기 제약 제형의 능력으로 평가된다.

본 발명의 또 다른 측면은 단백질을 반응 완충액에서 활성화된 수용성 중합체와 반응 시켜서 단백질을 활성화된 수용성 중합체와 공유 결합시키는 단계 및 실질적으로 모든 미결합된 수용성 중합체를 제거해서 상기 EPO 접합체를 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 단백질 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 이 측면에서의 바람직한 양태에서, 활성화된 수용성 중합체는 SC-PEG다. 또 다른 양태에서, 활성화된 수용성 중합체는 NHS-PEG다. 바람직한 양태에서, 반응 완충액은 알데히드-PEG를 포함하지 않고/않거나 활성화된 수용성 중합체는 알데히드-PEG가 아니다. 특정 양태에서, 반응 완충액은 약 6.5 내지 약 8.5의 pH를 보유한다. 다른 양태에서, 반응 완충액은 약 6.5 대 약 7.5, 약 6.6 대 약 7.3, 또는 약 6.7 대 약 7.1의 pH를 보유한다. 바람직한 양태에서, 반응 완충액은 약 7.0의 중성 pH를 보유한다. 특정 양태에서, 반응 완충액은 추가로 5%-80% DMSO(부피/부피), 및 바람직하게는 10%-40% DMSO(부피/부피)를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기 공지된 방법과 유사한 페그화 효율성(즉, 비페그화 생성물과 대비되는 페그화 생성물의 양으로 평가)을 유지하거나 개선하면서, 당해 기술에서 공지된 표준 방법과 관련해서 반응 완충액에 보다 낮은 양, 즉 보다 낮은 농도의 PEG를 사용할 수 있게 한다. 본 발명의 방법은 또한 당해 기술에서 공지된 다른 방법보다 높은 pH에서 반응될 수 있도록 한다(예컨대, 알데히드 PEG를 사용해서 단백질을 페그화(예컨대, 본원에 전문이 참고 인용된 미국 특허 번호 6,077,939 및 5,985,265를 참고)). 당해 기술에서 공지된 이러한 수식은 비용, 제조 효율성, 및/또는 공정의 용이함 관점에서 제조 이점을 제공할 수 있다. 상기 추가적인 양태에서, 반응 완충액은 약 1 대 약 3 내지 약 1 대 약 60의 단백질 대 활성화된 수용성 중합체의 몰 비율을 포함한다. 다른 양태에서, 반응 완충액은 약 1 대 약 4, 약 1 대 약 5, 약 1 대 약 6, 약 1 대 약 7, 약 1 대 약 8, 약 1 대 약 9, 약 1 대 약 10, 약 1 대 약 15, 약 1 대 약 20, 약 1 대 약 25, 약 1 대 약 30, 약 1 대 약 35, 약 1 대 약 40, 약 1 대 약 45, 약 1 대 약 50, 약 1 대 약 55, 약 1 대 약 60의 단백질 대 활성화된 수용성 중합체의 몰비율을 포함한다. 특정 양태에서, 반응 완충액은 약 1 대 약 7의 단백질 대 활성화된 수용성 중합체의 몰비율을 포함한다. 상기 추가적인 양태에서, 실질적으로 미반응된 수용성 중합체 전부를 제거하는 것은 당해 기술에서 공지된 방법으로 쉽게 달성될 수 있다(예컨대, 투석, 크로마토그래피).

본 발명의 또 다른 측면은 앞에 언급한 제형 또는 접합체의 약학적으로 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 것에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다수의 EPO 조성물 또는 상기 다수 중 하나 이상의 성분을 대상에서 적혈구 세포 생산을 증가시키는데 약학적으로 유효한 농도로 포함하는 조성물, 보다 상세하게는 제약 조성물의 용도를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 변종 또는 부족한 적혈구 생산과 관련된 질병이나 장애를 치료 또는 관리하거나 상기 대상에서의 이의 증상을 완화시키기 위해 투여된다. 특정 양태에서, 치료 대상은 비정상적이거나 부족한 적혈구 생산과 관련된 질병 또는 장애로 진단되지 않되, 상기 질병 또는 장애를 발병시키는 성질을 보유하는 것으로 평가된다. 다른 양태에서, 치료 대상은 비정상적이거나 부족한 적혈구 생산과 관련된 질병 또는 장애로 진단되지 않았지만, 상기 치료로부터 이득을 획득하는 것으로 당해 기술 표준에 의해 평가된다. 특정 양태에서, 환자는 일주일에 적어도 한 번 복용을 받는다. 다른 양태에서, 환자는 2주마다 적어도 한 번, 3주마다 적어도 한 번, 또는 매달마다 적어도 한 번 복용량을 받는다.

본 발명의 추가적인 이점은 하기 자세한 설명으로 당해 기술 숙련자에게 쉽게 명확해질 것이고, 여기에서는 본 발명의 바람직한 양태만이 도시되고 기술된다. 인식될 수 있는 바, 본 발명은 다른 양태일 수 있고, 이의 다양한 설명은 본 발명의 다양한 관점에서 본 발명의 범위를 크게 벗어나지 않고 형식적인 수정이 될 수 있다. 본 발명은 일부 또는 모든 특정 설명 없이 시행될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명을 제한하지 않고 예증으로 간주될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 야생형(wild type) 또는 고유(native) 형태의 비접합 폴리펩타이드에 임상적으로 우세한 폴리펩타이드 접합체(예컨대, EPO 접합체)를 제공하는 것이다. 게다가, 이러한 접합된 폴리펩타이드의 추가 이득은 소기의 치료 효과를 달성하기 위해 보다 적은 주기의 기준을 포함해서 적은 단백질(야생형 또는 고유 폴리펩타이드와 비교해서)이 투여될 수 있다. 결국 이것은 1회 분량 당 단백질의 양이 실질적으로 감소되기 때문에 보다 낮은 원료 비용 및 부작용이 발생한다. 특정 양태에서, 본 발명은 수용성 중합체에 접합된 에리스로포이에틴에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 가장 바람직하게, 이것은 PEG(EPEG)에 접합된 에리스로포이에틴에 관한 것이다.

특정 예에서, 고유 EPO와 비교해서(즉, PEG가 미결합된 EPO; 통상적으로 당부가된 에리스로포이에틴), 본 발명의 EPO 접합체, 즉 EPEG는 증가된 순환 반감기 및 플라즈마 체류 시간, 감소된 정화 속도(clearance rate), 및 생체내 증가된 임상 활성도를 보유한다. 본 발명의 접합체는 EPO와 동일 용도를 가진다. 상세하게는, 본 발명의 접합체는 EPO가 동일하거나 유사한 대상을 치료하기 위해 사용된 것과 동일한 방법으로 골수세포에서 적혈구 원종의 분열 및 분화를 자극함으로써 이의 필요로 하는 대상에서의 적혈구 세포 생성을 증가시키는 것에 유용하다. 더욱이, 발명자는 본 발명의 접합체가 저장시 안정성을 위해 인간 혈청 알부민(HSA)을 제형에 함유하지 않아도 된다는 것을 놀랍게도 발견했다. 이것으로 인해, 본 발명의 제형은 현재 입수 가능한 EPO계 치료제와 비교해서 장기적인 안정성, 보다 낮은 비용 및 단순화된 제조, 운송, 저장 그리고 품질 조절의 이점을 보유한다.

단백질의 또 다른 분자로의 공유 결합을 본원에서 사용될 때, "N-말단", "아미노-말단"이란 용어 또는 유사 용어는 단백질의 아미노-말단인 α-아미노기를 통한 공유 결합을 의미한다.

본원에서 사용된, "야생형" 또는 "고유"란 용어는 운영 또는 기능 형태인 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미하고, 이것이 신체에서 자연스럽게 작용하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 이 용어는 또한 인위적으로 수식되거나 교체되지 않은 형태의 단백질을 의미한다. 그러므로, 이 용어는 재조합 단백질에 관한 것일 수 있다. 따라서, 이 용어는 단백질의 핵산 및/또는 아미노산 서열이 본래 유래된 동물에서 생성된 것과 비례하는, 당부가 결함을 포함하여 교체된 당부가 패턴을 보유하는 단백질을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된, 폴리펩타이드의 "고유 기능"은 수용성 중합체와의 공유 수식 이전 기능을 의미한다. 고유 기능은 예컨대, 효소 활성도, 수용체 바인딩(binding)(예컨대, 항체), 리간드 바인딩, 및 면역원성을 포함한다. 바람직하게, 에리스로포이에틴의 고유 기능은 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구 세포의 생성을 증가시키도록 유도하는 생체내 생물학적 활성도를 의미한다.

본원에서 사용된, "에리스로포이에틴" 또는 "EPO" 용어는 SEQ ID NO:1(도 1) 또는 SEQ ID NO:2(도 2)인 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 보유하는 당단백질에 관한 것이고, 이의 생물학적 특성은 적혈구 세포 생성 자극 및/또는 골수에서 적혈구 원종의 분열 및 분화의 자극에 관한 것이다. 본원에 사용된, 이러한 용어는 예컨대, 특정부위의 돌연변이 유발 또는 의도치 않은 돌연변이로 인해 인위적으로 수식된 단백질을 포함하고; 고유 EPO에 대해 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 보유하도록 한다. 이 용어는 고유 및 재조합으로 생성된 인간 에리스로포이에틴을 모두 포함한다. EPO는 조직, 단백질 합성, 고유 또는 재조합 세포의 세포 배양과 같은 임의의 통상적인 급원으로 수득된, 바람직하게는 인간의 재조합 또는자연 발생 단백질을 의미한다.

EPO와 실질적으로 상동인 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1(도 1) 또는 SEQ ID NO: 2(도 2)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩타이드를 포함하는 기능성 등량물이다. 아미노산 서열에 관해서 "실질적으로 동일"이란 표현은 본원에서 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85, 2444-2448(1988)]에 따른 FASTA 써치법으로 측정해서 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 그리고 보다 바람직하게는 적어도 약 90%가 또 다른 아미노산 서열과 상동인 서열로 정의된다. 바람직하게, EPO 상동기관은 본원에 기술된 방법 및/또는 당해 기술에 공지된 방법으로 평가된 바, 고유 또는 야생형 EPO와 비교해서 동등하거나 보다 높은 활성도를 나타낸다.

뮤테인(muteins) 또는 달리 수식된 단백질과 같은 EPO 활성도를 보유하는 임의의 단백질이 또한 포함된다. 재조합 EPO는 재조합 DNA 기술 또는 내부 유전자 활성화로 인한 동물 또는 인간 장기의 다른 적합한 세포계 또는 CHO, BHK, COS, HeLa 또는 PER.C6 세포계에서의 발현을 통해 제조될 수 있다. 내부 유전자 활성화로 인한, EPO를 포함하는 단백질의 발현은 당해 기술에서 널리 공지되고, 예컨대, 미국 특허 번호 제5,733,761호, 제5,641,670호, 제5,733,746호, 제5,994,122호, 제5,733,761호, 제5,641,670호, 제5,981,214호 및 제5,272,071호 및 국제 특허 공개 번호 WO 90/11,354(각각의 전문은 본원에 참고 인용된다)에 기술된다. 이의 제조 및 치료상 적용은 예컨대 문헌[U.S. Pat. Nos. 5,547,933 and 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 and EP-B 0 411 678Q, Lai, P. H et al., J. Biol. Chem. 261(1986)3116-3121, an Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262(1987) 12059-12076]에 개시된다. 치료상 용도를 위한 에리스로포이에틴은 재조합 장치를 통해 제조될 수 있고(EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 and Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. et al.(1986) Immunobiol. 72: 213-224), 상기 참고문헌의 전문은 본원에 참고인용된다. 에리스로포이에틴 당단백 생성물의 제조를 위한 바람직한 EPO종은 인간 EPO종이다. 보다 바람직하게, EPO종은 SEQ ID NO:1(도 1) 또는 SEQ ID NO:2(도 2)인 아미노산 서열을 보유하는 인간 EPO이고, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:1(도 1)인 아미노산이다.

무혈청 배지에서 에리스로포이에틴의 발현 및 제조 방법은 1996년 11월 14일에 버그(Burg) 공개된 WO 96/35,718 및 1992년 6월 12일에 코치(Koch) 공개된 유럽 특허 공개 번호 513,738에 개시된다(이의 각각의 전문은 본원에 참고인용된다). 상기 언급된 문헌에 추가로, EPO 유전자를 보유하는 재조합 CHO의 무단백질 발효가 수행될 수 있다는 것이 공지된다. 이러한 방법은 예컨대 문헌[EP-A 0,513,738, EP-A 0,267,678 and, in general form, in Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130(1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J et al., Methods in Enzymology 421(1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271(1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 96/35718 and WO 88/00967]에 기술된다(이의 각각의 전문은 본원에 참고인용된다).

EP-A 0,267,678(본원에 전문이 참고인용된)에서, S-세파로즈(S-Separose) 이온 교환 크로마토그래피, C₈ 컬럼을 사용하는 예비 역상 HPLC 및 겔 투과 크로마토그래피가 투석 후에 무단백질 배양에서 생성된 EPO의 정제를 위한 것으로 기술된다. 이 때, 겔 투과 크로마토그래피 단계는 S-세파로즈 빠른 유동 이온 교환 크로마토그래피로 교체될 수 있다. 또한, 블루 트리사크릴 컬럼(Blue Trisacyl column)을 이용한 다이(dye) 크로마토그래피가 이온 교환 크로마토그래피 전에 수행되도록 제안된다.

재조합 EPO의 정제를 위한 공정이 또한 문헌[Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107(1990)352-359(본원에 전문이 참고인용된)]에 기술된다. 그러나, 이 공정에서, EPO는 정제 단계 이전에 트윈-20 용액, 페닐메틸설포닐 플로라이드, 에틸메일이미드, 펩스타틴 에이, 구리 설페이트 및 오삼산으로 처리된다.

본원에 사용된, 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 "접합체(conjugate)"란 용어는 공유 결합으로 연결된 하나 이상의 다른 화학그룹과 상호작용하는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 개체군이다. 바람직하게, 단백질은 에리스로포이에틴 또는 이의 상동기관이고, 화학그룹은 수용성 중합체다. 가장 바람직하게, 단백질은 에리스로포이에틴 또는 이의 상동기관이고, 수용성 중합체는 PEG다. 본 발명의 접합체는 각각의 EPO 단백질에 결합된 적어도 하나 또는 두 개의 PEG 단백질을 보유한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 접합체는 본원에 개시된 방법에 따라 제조된다.

바람직하게는 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 페그화 단백질은 일반적으로 "단백질 접합체"로 언급된다. 단백질이 에리스로포이에틴("EPO")인 특정예에서, 본 발명의 분자는 "EPO 접합체", "EPEG 접합체", 및/또는 유사 용어로 언급되고, 이 용어는 교대로 사용된다. "단백질 접합체" 및/또는 본 발명의 "단백질 접합체"란 용어도 접합된 단백질 혼합물, 즉, 예컨대, EPO인 접합된 단백질 다수를 의미한다. 예컨대, EPEG 접합체 및/또는 EPO 접합체는 한 개("1PEG-EPO;" 모노-페그화 EPO) 또는 두 개("2PEG-EPO;" 디-페그화 EPO)의 PEG 분자에 연결된 각각의 EPO 단백질을 보유하는 실질적으로 균일한 개체군인 EPO 단백질 또는 이의 혼합물을 의미할 수 있다.

대부분의 폴리펩타이드는 다수의 잠재적인 PEG 결합 부위를 보유한다. 그러므로, 1PEG-단백질 접합체의 균일 개체군이 각각의 단백질 분자에 결합된 하나의 PEG 분자를 보유할지라도, 이 연결은 개체군의 각각의 단백질의 동일 위치에 반드시 있을 수는 없다. 유사하게, 2PEG-단백질 접합체의 균일 개체군이 각각의 단백질 분자에 결합된 두 개의 PEG분자를 보유할지라도, 이러한 결합이 개체군 내 각각의 단백질의 동일 위치에 반드시 있을 수는 없다. 특정 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 PEG 분자(들)로의 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나가 라이신 116을 통한 것을 보유하는 EPO 접합체를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 상기 한 개 또는 두 개의 PEG 분자(들)로의 공유 결합 중 적어도 하나를 EPO 단백질의 아미노 말단을 통해 보유하며, 상기 아미노 말단에서의 공유 결합은 알데히드 결합을 통한 것은 아니다. 또한, 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 EPO 접합체를 포함하고, 각각의 접합체는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 EPO 단백질을 포함하며, 상기 다수는 PEG 분자(들)로의 상기 한 개 또는 두 개의 공유 결합 중 적어도 하나가 라이신 52 또는 라이신 154를 통한 것을 보유하는 EPO 접합체를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 상기 다수의 EPO 접합체, 및 상기 결합에 적합한 것으로 당해 기술에서 공지된 임의의 부위를 통해 상기 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 접합체를 포함한다.

특정 양태에서, 1PEG-단백질 및 2PEG-단백질 접합체를 포함하는 다수의 단백질 접합체(예컨대, EPEG 접합체의 불균질 혼합물)는 상기 언급한 개체군 혼합물을 의미하고, 각각의 개체군은 균질하거나, 그렇지 않을 수 있다. 특정 양태에서, 1PEG-단백질 접합체 대 2PEG-단백질 접합체 혼합물의 비율은 약 1 미만 대 약 100, 약 10 대 약 90, 약 20 대 약 80, 약 30 대 약 70, 약 40 대 약 60, 약 50 대 약 50, 약 60 대 약 40, 약 70 대 약 30, 약 80 대 약 20, 약 90 대 약 10, 또는 약 100 대 약 1 미만이고, 약 1 미만은 당해 기술에서 공지된 표준 방법을 사용해서 검출할 수 없는 양을 포함한다.

본 발명에 포함된 "수용성 중합체"는 PEG, 메톡시화된 PEG("mPEG"), PEG 단일중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하는 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체를 포함하되, 이에 제한되지는 않고, 상기 단일중합체 및 공중합체는 알킬기의 한 말단에서 비치환 또는 치환된 것이다. 바람직한 양태에서, 중합체는 mPEG이고, 가장 바람직하게는 모노-메톡시화된 PEG다. 수용성 중합체는 광범한 범위의 분자량을 보유하는 직쇄형, 측쇄형, 또는 방사형(star-shaped)일 수 있다. PEG의 크기는 10 내지 약 100 kD의 범위일 수 있다. 특정 양태에서, PEG의 크기는 약 10 내지 약 40 kD이다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 유사한 폴리(알킬렌 옥사이드)의 분자, 상세하게는 단백질로의 공유 결합을 달성하기 위해서는, 중합체의 히드록실기 말단기가 반응성 작용기로 먼저 전환되야한다. 이 공정을 본원에서는 "활성화" 단계로 언급하고, 이렇게 생성된 생성물은 "활성화된 PEG"로 지칭된다. 예컨대, 매톡시화된 PEG("mPEG")는 당해 기술에서 널리 공지된 방법으로 아미노기로의 순차적인 공유 결합으로 활성화될 수 있고, 즉, mPEG는 예컨대, 라이신 잔기와 같은 아미노 잔기를 보유하는 아미노산 잔기를 통해 단백질로의 순차적인 결합에 적합한 다양한 반응성 모이티를 보유하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 활성화된 mPEG 중합체는 mPEG-숙시니미딜 숙시네이트, mPEG-숙시니미딜 카보네이트, mPEG-이미데이트, 및 mPEG-시아누르 클로라이드를 포함한다. 예컨대, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜일 숙시니미딜 숙시네이트("SS-PEG")는 디사이클로헥실카보디이미드의 존재하에 히드록시숙시니미드와의 반응으로 mPEG 숙시네이트로부터 생성될 수 있다(문헌[Abuchowski et al.(1984), Cancer Biochem. biophys. 7:175-186] 참고, 본원에 전문이 참고인용됨). PEG는 당해 기술에서 공지된 임의의 방법 또는 본원에 기술된 방법으로 활성화될 수 있다. 특정 양태에서, N-히드록시-숙시니미딜-PEG가 활성화된 PEG로 사용된다. 바람직한 양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜)-숙시니미딜 카보네이트("SC-PEG")가 활성화된 PEG로 사용된다(예컨대, 본원에 전문이 참고 인용된 미국 특허 번호 제5,122,614호를 참고). 바람직한 양태에서, SC-PEG의 단백질과의 공유 결합을 위한 반응은 단백질의 아미노기를 통한 카바메이트 결합을 통해 폴리펩타이드에 부착된 N-히드록시숙시니딜기 및 PEG-사슬을 방출한다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,122,614호를 참고). 그러나, 당해 기술에서 공지된 상기 방법과는 달리, 본 발명의 방법을 사용해서 본원에서 증명된 바, 접합 반응은 페그화의 부위가 우선적으로 선택될 수 있도록 조절될 수 있다(예컨대, 아미노 말단 α-아미노기 및 라이신 잔기의 ε-아미노기간의 우선 선택).

특정 양태에서, 본 발명은 PEG를 활성화하는 방법을 포함하고, 포스겐으로 중합체(PEG)를 처리함으로서 PEG 클로로포메이트가 동일 공정에서 생성된다. 결과 클로로포메이트는 이후 N-히드록시숙시니미드(HOSu)와 반응시킨 후 트리에틸아민(TEA)과 반응시켜서 소기의 활성화된 PEG 유도체를 수득한다. 활성화된 중합체 제조는 이후 저분자량의 반응물로부터 정제될 수 있고, 이론량의 활성기의 존재를 확인하기 위해 평가될 수 있다.

임의의 단백질이 본원에 기술된 방법에 따라 페그화될 수 있지만, 본 발명은 특히, 치료용 폴리펩타이드의 페그화를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법에 따른 치료용 단백질은 예컨대, 프로테아제, 뇌하수체 호르몬 프로테아제 저해제, 포이에틴(poietin), 집락자극인자(colony stimulating factor), 호르몬, 응고 인자, 항-응고 인자, 향신경성 인자(neurotropic factor), 류머티즘 인자, CD 단백질, 골유도성 인자(osteoinductive factor), 인터루킨, 성장 인자, 인터페론, 사이토킨, 소마토메디안(somatomedian), 케모킨(chemokine), 면역 글로불린 항체, 생식샘자극 호르몬, 인터루킨, 케모텍틴(chemotactin), 인터페론, 지질 결합 단백질 알레르겐, 또는 상기의 혼합물일 수 있다. 이러한 치료용 단백질의 특정 비제한 예는 인터페론-α2A, 인터페론-α2B, 인터페론 β, 인터페론-γ, 인슐린계 성장 인자-1(IGF-1), 인슐린계 성장 인자-2(IGF-2), 인슐린, 인간 성장 호르몬(hGH), 형질전환 성장 인자(TGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬모 신경돌기 형질전환 인자(CNTF), 혈소판형성인자(TPO), 뇌 유래 신경돌기 인자(BDNF), IL-1, 인슐린트로핀(insulintropin), IL-2, 글리얼(grial) 유래 신경돌기 인자(GDNF), IL-1 RA, 조직 플라스미노젠 활성기(tPA), 수퍼옥사이드 뮤타아즈(dismutase)(SOD), 유로키나제(urokinase), 카탈라아제, 스트레토키나아제, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 헤모글로빈, 섬유돌기 성장 인자, 아데노신 데아미다아제(NGF), 과립구 대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 보빈(bovine) 성장 호르몬(BGH), 과립구 마이크로퍼지 집락자극인자(GM-CSF), 칼시토닌, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 살균/투과성 증가 단백질(BPI), L-아스파라기나아제, 아르기아나제, 우리카아제, γ-인터페론, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 폴리클(fallicle) 자극 호르몬, 프로인슐린, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자(NGF), 종양 괴사 인자, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬(PTH, 인간 PEH를 포함), 골형성 단백질, 조혈성장인자, 황체형성호르몬, 글루카곤, 글루카곤계 펩타이드-1(GLP-1), 펩타이드 YY(PYY), 인자 ⅧC, 인자 Ⅸ, 조직 인자, 및 본 웰레브랜드 인자(von Willebrand factor), 단백질 C, 아트리얼 나트리우레틱 인자(atrial natriuretic factor), 폐 계면활성제, 밤배신(bombesin), 트롬빈, 엔케파리나아즈(enkephalinase), 밀러관 저해제(mullerian-inhibiting agents), 릴랙신 에이 사슬, 릴랙신 비-사슬, 프로릴렉신, DNA 분해효소, 인히빈(inhibin), 엑티빈(activin), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor), 인테그린(integrin), 단백질 에이 또는 디, 골유래 신경영양인자(BDNF), 뉴로트로핀 -3(neurotrophin) -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), CD-3, CD-4, CD-8, CD-19, M-CSF, GM-CSF, G-CSF, 상기 중 임의의 생물학적으로 활성인 부분(fragment), 또는 상기의 혼합물일 수 있다. 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드의 단백질은 고유 EPO다.

바람직한 접합체는 천연 단백질 또는 폴리펩타이드를 활성화된 수용성 중합체와 반응함으로서 제조된다. 바람직하게, 수용성 중합체는 PEG다. 보다 바람직하게, 수용성 PEG는 mPEG다. 바람직하게, mPEG는 약 10 내지 약 100kD, 보다 바람직하게는 약 10 kD 내지 약 50 kD, 보다 바람직하게는 10 kD 내지 25 kD 그리고 가장 바람직하게는 약 12kD의 분자량을 보유한다. 특정 양태에서, 활성화된 PEG는 N-히드록시-숙시니미드-PEG("NHS-PEG")다. 바람직한 양태에서, 활성화된 PEG는 숙시니미딜 카보네이트 에스테르("SC-PEG")다. 바람직하게, 활성화된 PEG 및 고유 EPO는 반응 완충액에서 반응한다.

다양한 EPEG(즉, EPO 접합체) 제형은 다종의 활성화된 PEG를 사용해서 제조됐다. 40 kD 측쇄형 PEG를 사용해서 제조된 것을 제외한 시험된 모든 제형은 생체내 쥐 모델의 헤마토크릿 유도시 고유 EPO보다 높은 활성도를 증명했다. 이 결과는 SC-PEG 또는 NHS-PEG가 사용된 것인지, 또는 PEG의 분자량이 12kD 또는 20 kD인지, 또는 PEG의 형태가 직쇄형 또는 측쇄형인지와는 무관했다.

본원에서 사용된 "반응 완충액"은 아민 성분이 없는 표준 완충액이고, 예컨대, 포스페이트로 완충화된 살린(PBS)이다. 바람직하게, 반응 완충액은 염, 예컨대, Na을 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 가장 바람직하게는 약 1mM 내지 약 50 mM이고, 보다 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 20 mM 보유한다. 특정 양태에서, 폴리펩타이드는 교반하에 건조 활성화된 수용성 중합체와 혼합된다. 바람직하게, 반응 완충액은 약 6.5 내지 약 8.5 또는 약 6.6 내지 약 7.5의 pH를 보유한다. 바람직한 양태에서, 반응 완충액은 약 7.0의 중성 pH를 보유한다. 특정 양태에서, 반응 완충액에서 단백질(예컨대, EPO) 대 활성화된 수용성 중합체의 몰비는 약 1 대 약 3 내지 약 1 내지 약 60이다. 다른 양태에서, 반응 완충액은 약 1 대 약 6 내지 약 1 대 약 60의 단백질 대 활성화된 수용성 중합체의 몰비를 보유한다. 바람직한 양태에서, 반응 완충액은 약 1 내지 약 7의 에리스로포이에틴 단백질 대 활성화된 수용성 중합체의 몰비를 보유한다. 바람직한 반응 조건은 pH가 약 7.0인 중성 반응 완충액이고, 수용성 중합체 대 폴리펩타이드의 몰비는 약 7 대 약 1이다.

특정 다른 양태에서, 반응 완충액은 추가로 유기 용매를 포함할 수 있다. 이러한 양태에서, 바람직한 유기 용매는 디메틸 설폭사이드("DMSO")다. DMSO는 반응 혼합물에 5-80% 그리고 바람직하게는 10-40%(부피/부피)의 농도로 존재할 수 있다. DMSO는 일반적인 용매로 널리 사용되나, 페그화 반응에 영향을 미치지 않도록 하는 것은 아니며, 상세하게는 상기 반응의 페그화의 결과 부위에 우선적으로 영향을 미치지 않도록 하는 것은 아니다. 본원에 기술된 반응 조건은 특정 라이신 부위를 향한 활성화된 PEG의 공유 접합을 특별히 유도하는 것으로 나타난다. 더욱이, DMSO를 반응 완충액에 첨가하는 것은 페그화 부위를 변경하는 것으로 현재 밝혀졌다. 특히, 본원에 기술된, DMSO를 반응 완충액에 첨가하는 것은 단백질의 페그화가 이의 아미노 말단, 즉, 아미노 말단 α-아미노기에서 반응되도록 유도한다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심 단백질의 특정 아미노기의 선택적인 수식, 특히 단백질의 아미노 말단의 수식을 가능하게 한다. 이러한 단백질의 선택적인 수식은 수용성 중합체, 예컨대, PEG를 아미노기를 통해 단백질과 결합하는 것이 활성도의 손실을 초래하는 것으로 일반적으로 이해된다는 점에서 유익하다. 페그화와 연관된 활성도의 감소는 통상적으로 종래 기술의 랜덤(random) 라이신 타겟 반응때문인 것으로 믿어진다. 라이신 잔기의 랜덤 수식은 상기 단백질의 4차 구조 또는 모폴로지를 실질적으로 바꾸는 것으로 단백질 기능을 부주의하게 변경할 수 있다. 임의의 방법으로 임의의 이론에 국한되는 것을 원하지 않지만, 본원에 개시된 반응 조건은 선택적인 잔기 또는 이의 아미노 말단에서 단백질의 선택적인 수식이 가능하게 하는 것으로 나타나고, 일반적으로 단백질의 활성도에 영향을 미치지 않는 것으로 믿어진다. 특정예에서, 본 발명의 방법은 한 개 내지 두 개의 PEG 분자를 특히 EPO 라이신 잔기에 결합시키기 위해 사용되고, PEG로의 연결은 고유 EPO와 비교해서 생물학적 활성도의 감소를 초래하지 않을 뿐더러, 고유 EPO보다 놀랍게도 보다 임상적으로 효과적인 EPO 접합체를 만든다.

단백질의 아미노 말단에서의 특정 페그화는 알데히드 활성화된 PEG를 사용해서 이전에 보고됐다. 그러나, 이러한 반응은 낮은 pH에서만 특이하고, pH 7 또는 그 이상에서 특이성이 감소한다(예컨대, 미국 특허 번호 제6,077,939 및 5,985,265, 각각의 전문은 본원에 참고인용된다). 따라서, 본 발명의 방법은 pH 민감성 단백질의 페그화 및/또는 접합에의 특정 용도일 수 있다.

바람직한 반응에서, 활성화된 수용성 중합체는 몰 과량으로 존재할 것이고, 미반응된 과량의 활성화된 수용성 중합체는 새롭게 생성된 단백질 접합체로부터 제거되야할 것이다. 본원에 사용된, "실질적으로 모든 비결합된 수용성 중합체를 제거하는 것"은 일반적으로 예컨대, 투석을 통한 분리의 실시를 위한 공지된 방법을 의미한다. 일반적으로, 비결합된 수용성 중합체의 약 80%가 제거되고, 바람직하게는 약 90%가 제거되며, 보다 바람직하게는 약 95%가 제거되고, 가장 바람직하게는 약 99%가 제거된다.

본 발명은 단백질 접합체, 상세하게는 EPO 접합체를 제공하고, 상기 접합체는 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 유도하는 생체내 생물학적 활성도를 보유하는, 적어도 하나의 수용성 중합체가 연결된 에리스로포이에틴 당단백질을 포함한다. 바람직한 양태에서, EPO 당단백질은 인간 에리스로포이에틴 및/또는 인간 에리스로포이에틴의 서열을 보유하는 이의 상사기관(analogs)이다(예컨대, SEQ ID NO:1(도 1); SEQ ID NO:2(도 2) 또는 이와 거의 동일한 아미노산 서열).

EPO 또는 EPEG 접합체의 특정 활성도는 당해 기술에서 공지된 표준 검정 또는 본원에서 기술된 방법으로 측정될 수 있다. 본 발명의 정제된 EPO 접합체의 생물학적 활성도는 본 발명의 제형을 인간 환자에서 투여하는 것이 비주입되거나 대조군 그룹의 대상의 것과 비교해서 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구 세포의 생산을 증가시키도록 한다(예컨대, 본 발명의 다수의 EPO 접합체, 또는 이의 한 개 이상의 성분, 및 약학적으로 수용가능한 담체). 본 발명의 방법에 따라 수득 및 정제된 EPO 접합체 또는 이의 부분의 생물학적 활성도는 예컨대, 문헌[Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 and Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]에 따른 방법으로 시험될 수 있다.

본원에 사용된, "스프래그-다우리 쥐에 주입 약 36 시간 후에 고유 에리스로포이에틴보다 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 높은 혈청 레벨에 도달할 수 있다는 것"은 본 발명의 EPEG 접합체가 스프레그 다우리 쥐를 사용한 생체내 검정에서 고유 EPO 또는 상업적으로 입수 가능한 당부가 EPO보다 낮은 속도에서 대상으로부터 제거되고, 대조군 화합물과 비교해서 보다 높고 보다 넓은 PK 프로필(profile)을 생성한다는 사실을 의미한다. 본 발명의 EPEG 접합체의 혈청 레벨은 당해 기술, 예컨대, 식별용 방사선 동위 원소 및 면역 검정법을 사용해서 쉽게 측정될 수 있되, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게, 혈청 레벨은 실시예 4의 인프라(infra)에 기술된 방법에 따라 측정된다.

*실시예 4는 고유 EPO가 주입된 바루 직후에 가장 높은 혈청 농도(즉, 식별용 방사선 동위 원소 EPO 접합체의 가장 높은 블루드 본(blood borne activity) 활성도에 도달)에 도달한 다음 13시간내에 제거되는 것을 증명한다. 현재 가능한 당부가 EPO 치료제는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)(Amgen, Thousand Oaks, CA)는 주입 후 12-18 시간에 최대 블루드-본 방사능을 보유하고, 고유 EPO보다 긴 반감기를 나타낸다. 그러나, ARANESP®(다르보포이에틴 알파)는 고유 EPO보다 보다 높은 혈중 농도에 도달하지 못한다. 반대로, 본 발명의 EPEG 접합체의 블루드-본 활성도의 농도는 초기 약 12시간동안 EPO 및 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)와 유사하되; 약 12시간 후에 혈청에서 EPEG 접합체의 활성도 농도는 계속 증가해서 주입 36 시간 후에 EPO 또는 ARANESP®보다 약 50% 높은 최대 레벨에 도달했다. EPEG는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 약 26% 내지 약 38% 늦게 신체로부터 제거된다. 결과적으로, EPEG 접합체는 대조군 EPO 또는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 증가된 총 약물 노출을 제공한다. 사실상, EPEG는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 커브(AUC) 아래에 약 25% 내지 약 45% 보다 넓은 영역; 및 고유-EPO(실시예 4 참고)보다 4배 더 큰 AUC를 보유한다. 결과적으로, EPEG는 고유 EPO 또는 다른 당부가 에리스로포이에틴 제형, 예컨대, ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 자주 투여되지 않을 수 있고, 보다 높은 생물학적 활성도 레벨을 달성할 수 있다.

본원에 제공된 실례는 추가로 본 발명의 접합체가 비수식된 폴리펩타이드와 동일한 방법으로 사용될 수 있다는 것을 증명한다. 상세하게는, 본원에 개시된 EPEG 접합체가 고유 EPO와 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 접합체는 당해 기술에서 공지된 이전 페그화 폴리펩타이드와 비교해서 적어도 두 개의 예상치 못한 최고의 특성을 보유한다. 상세하게는, 본 발명의 EPEG 접합체는 대조군 제형과 비교해서 예상치 못한 높은 효능을 보유하고, (즉, 무단백질인 약학적으로 수용가능한 담체에 저장된) 무단백질 제형으로 연장된 시간동안 저장될 수 있다. 본원에 개시된 실험 결과는 본 발명의 접합체가 대조군 제형과 비교해서 증가된 순환 반감기 및 플라즈마 체류 시간을 보유하고, 감소된 정화 속도 및 증가된 생체내 임상 활성도를 보유한다.

특정 이론에 제한되기를 원하지는 않지만, 대조군 제형과 비교해서 본 발명의 EPEG 제형의 증가된 생체내 활성도는 증가된 플라즈마 반감기때문일 수 있는 것으로 이론화된다. 수용체 결합에 있어서, 고유 EPO 및 이의 수용체는 세포에 의해 처리되고 내화되는 것으로 공지된다. 모든 EPO 수용체가 결합된 후 내화(internalized)되면, EPO 신호가 최대화되고, 세포는 신체에 여전히 존재하는 임의의 과량의 고유 EPO를 무감각하게 한다. 본원의 일례에 증명된 바, 과량의 고유 EPO는 이후 신체에 의해 빠르게 방출된다. 본 발명의 다수의 EPO 접합체의 증가된 생물학적 활성도 또는 이의 하나 이상의 성분은 수용체 턴오버(turnover) 시간과 비교해서 증가된 생체적합성 및 증가된 반감기(즉, 증가된 순환 시간)의 함수일 수 있다고 믿어진다. EPO-수용체가 내화되면, 새로운 수용체가 자리잡을 시간이 필요하다. 본 발명의 다수의 EPO 접합체 또는 이의 하나 이상의 성분의 순환기는 제거(elimination) 전에 다세대의 수용체와 결합하기 위해 충분히 오래일 수 있다. 본 발명의 EPO 접합체는 그러므로 고유 EPO 또는 현재 가능한 당부가 EPO 제형의 것과 비교해서 생체내 활성도, 예컨대, 헤마토크릿 유도를 증가시킨다.

이러한 개선된 특성때문에, 본 발명의 접합체는 비수식된 EPO 또는 현재 입수 가능한 EPO계 제형의 것과 비교해서 감소된 복용량 및/또는 적은 스케줄, 예컨대, 각각 일주일에 3회 대신 일주일에 1회 투여될 수 있다. 본 발명의 EPO 접합체는 또한 일주일에 적어도 1회, 이주일에 적어도 1회 또는 삼주일에 적어도 1회, 이를 필요로 하는 대상에 공급될 수 있다. 그러나, 본 발명의 EPO 접합체 제형은 적어도 일주일에 1회는 환자에게 공급되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 본 발명의 EPO 접합체 제형은 이주일에 적어도 1회 환자에게 공급될 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명의 EPO 접합체 제형은 1개월에 적어도 1회 또는 6주 내지 2개월에 적어도 1회 환자에게 공급될 수 있다.

감소된 투여 빈도수는 개선된 환자의 삶의 질뿐 아니라, 개선된 치료 효과를 이끌며 환자에서 개선된 편의를 제공할 것으로 기대된다. 통상적인 당부가-EPO와 비교해서, 본 발명의 접합체의 분자량 및 결합(linker) 구조를 보유하는 접합체는 개선된 효능, 안정성, 순환 AUC, 순환 반감기, 및 상품 프로필 가격을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

예방 및 치료 방법

본 발명의 단백질 접합체는 고유 단백질이 사용될 때 사용될 수 있다. 예컨대, EPO가 신장병, 암 합병증, 화학테라피, 또는 HIV 테라피로 인한 빈혈 치료에 사용될 때, EPEG 제형이 사용될 수 있다. 본 발명의 이 측면에서의 다른 특정 잠재적인 적용은 적혈구 세포의 증가가 환자(예컨대, 빈혈)에게 유용할 모든 질병을 포함한다. 접합체의 적합한 양은 조성물에서의 다른 성분뿐 아니라 치료될 상태의 정확한 타입, 치료될 환자의 상태와 같은 인자에 영향을 받는다.

치료상 유효한 양은 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구 세포의 생성의 증가를 유도하는 생체내 생물학적 활성도에 필요한 접합체의 양이다. 접합체의 정확한 양은 조성물내 다른 성분뿐 아니라 치료될 상태의 정확한 타입, 치료될 환자의 상태와 같은 인자에 영향을 받는다. 접합체를 보유하는 제약 조성물은 낮거나 부족한 적혈구 세포 생성을 특징으로 하는 혈액 질환을 겪고 있는 환자에게 다양한 방법으로 투여하기에 효과적인 강도로 제형화될 수 있다. 접합체의 평균 치료상 유효량은 다양할 수 있고, 특히 자질이 있는 외과의사의 권고 및 처방에 따라야 한다. 예컨대, 0.01 내지 10 ㎍/kg 신체 무게, 바람직하게는 0.1 내지 3 ㎍/kg 신체 무게가 예컨대, 일주일에 한 번 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제약 조성물은 약 10 내지 약 1,000 ㎍/ml, 바람직하게는 50 ㎍/ml 내지 약 400 ㎍/ml의 다른양의 EPEG를 보유할 수 있다.

그러나, 숙련된 기능공은 본 발명의 접합체를 보유하는 제약 조성물이 낮거나 부족한 적혈구 세포 생성을 특징으로 하는 혈액 질환을 겪고 있는 환자에게 다양한 방법으로 투여하기에 효과적인 강도로 제형화될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 접합체의 평균 치료상 유효량은 다양할 수 있고, 자질이 있는 외과의사의 권고 및 처방에 따라야 한다.

제약 조성물

본 발명의 조성물, 예컨대, 본 발명에 따라 제조된 다수의 단백질 또는 에리스로포이에틴 당단백질 접합체, 또는 이의 하나 이상의 성분이 추가로 혼합물 또는당해 기술에서 공지된 방법으로 추가적인 약학적으로 수용가능한 담체 또는 운반체(vehicle)와 결합해서 주입에 적합하게 제공될 수 있다. 본 발명의 생성물을 제형화하기 위한 약학적으로 적용가능한 담체 중에는 살린, 인간 혈청 알부민, 인간 플라즈마 단백질 등이 있다. 본 발명은 또한 상기 기술된 접합체 및 약학적으로 적용가능한 첨가물 및/또는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학적으로 적용가능한 담체는 수성 또는 비수성 용액, 서스펜션, 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 야채 기름, 및 에틸 올리산염과 같은 주입 가능한 유기 에스테르일 수 있다. 수성 담체는 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 서스펜션을 포함하고, 살린 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 운반체는 소듐 클로라이드 용액, 링거'스(Ringer's) 포도당, 포도당 및 소듐 클라라이드, 유삼염 링거'스 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 운반체는 링거'스 포도당이나 이의 유사물과 같은 전해질 보충액, 유동체 및 영양소 보충액을 포함한다. 또한, 예컨대, 항균제, 산화방지제, 킬레이팅제, 불활성 기체 및 이의 유사물과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 단백질 접합체가 당해 기술에서 공지된 방법으로 약학적으로 수용가능한 담체 또는 운반체를 보유하는 주입 가능한 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 예컨대, WO97/09,996, WO97/40,850, WO98/58,660, 및 WO99/07,401(각각의 전문은 본원에 참고인용된다)를 참고. 본 발명의 조성물은 예컨대, 강장제인 소듐 클로라이드를 132 mM 보유하는 pH 7의 소듐/포타슘 포스페이트 완충액 10 mM에서 제형화될 수 있다. 선택적으로, 제형 조성물은 보존제를 보유할 수 있다.

바람직하게, 제약 조성물은 상기 정의된 EPO 접합체, 용액 pH를 약 5.5 내지 약 7.0의 범위로 유지하기에 적합한 약학적으로 수용가능한 완충액내 다가의 무기 음이온, 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 수용 가능한 담체 및/또는 첨가물(exipient)을 포함한다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 ml 당 약 10㎍ 내지 약 1,000 ㎍ 에리스로포이에틴 접합체, 10-200 mmol/l 설페이트, 약 10 내지 약 50 mmol/l pH 6.0 내지 6.5의 포스페이트, 선택적으로 약 최대 1mM CaCl₂, 및 선택적으로 약 1-5%의 폴리올을 포함할 수 있다.

본 발명의 EPEG 접합체는 무단백질 용액에서 저온(예컨대, -20℃, 4℃)에서 적어도 15달 저장 또는 승온(예컨대, 25℃, 37℃)하에서 적어도 10달 저장 후에 분해 또는 EPEG 활성도 감소에 내성을 나타냈고, 연장된 시간동안에도 이러한 안정도를 유지할 것으로 예상됐다. 이러한 무단백질 제형에서의 본 발명의 EPEG 접합체는 또한 상온과 같은 보통 조건하에서의 수송 및 저장에 적합할 수 있다. 비교적으로, 상업적으로 입수 가능한 EPO, 예컨대, EPREX®(에포이에틴 알파)는 보호를 위해 0.2%의 인간 혈청 알부민(HSA)이 필요하고, 감소된 온도에서 수송 및 저장된다. HSA와 같은 인간 생물학적 또는 혈청 유래 성분을 보유하는 제약 제형에는 보다 엄격한 제조 요구사항 및 규제 준수사항이 따르고; 결과적으로 실질적으로 보다 고비용이 든다. 그러나, 본 발명의 단백질 접합체, 예컨대, EPO 접합제를 무단백질 염 완충제에서 활성 제약 성분의 감소 없이 제형화하는 것이 가능하다. 그러한 것으로, 무단백질인 제약적으로 수용가능한 담체에 약물(에컨대, EPEG)을 전달하는 능력은 큰 경제적 이점이 된다.

그러므로, 가장 바람직한 양태에서, 제약 조성물은 EPEG 접합체 및 무단백질인 약학적으로 수용가능한 담체로 제조된다. 선택적으로, 무단백질인 약학적으로 수용가능한 담체는 추가로 EPEG 접합체의 약물학적 특성을 개선하기 위한 비단백질 첨가물을 포함할 수 있다. 이것은 마니톨과 같은 당, 히스티딘과 같은 아미노산, 또는 트윈-80과 같은 소량의 통상적인 계면활성제를 포함할 수 있되, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 하기 실시예를 참고로 보다 자세히 설명될 것이나, 이것이 본 발명을 제한하지는 않아야 한다.

본원발명의 제약 조성물은 적혈구 결핍 치료에 있어서, 종래의 EPO 분자에 비해서 보다 높은 활성을 기반으로 우수한 치료 효과를 제공한다.

도 1. 우세한, 완전 처리된 인간 에리스로포이에틴("hEPO")의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1).
도 2. 말단 Arg 잔기를 보유하는 에리스로포이에틴의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2).
도 3A-B. 도 3A: 레인 1은 분자량 표지다. 레인 2는 제형 완충액에서 4℃에서 5개월동안 저장한 시료다. 레인 3은 5개월동안 -20℃에서 냉동 상태로 저장된 대조군 시료이고, 레인 4는 비수식된 EPO다. 도 3B는 왼쪽부터 시작해서 레인 1: 제조 직후 시료, 시료 2: 고유 EPO, 레인 3: 분자량 표지.
도 4A-B. A: 고유 EPO의 전형적인 트립틱(triptic) 소화. B: 실시예 1에 따라 제조된 EPO 접합체의 전형적인 트립틱 소화.
도 5: 다양한 시간동안 고온에서 저장된 EPEG 접합체의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: kD 분자량 표준(200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31, 21.5 및 14.4); 레인 2: -20℃, 15개월; 레인 3: 4℃, 16개월; 레인 4: 25℃ 10.5개월; 레인 5: 37℃, 10.5개월.
도 6: MethCult^TM -4230(사이토킨 없음)에서 적혈구 원종 증식에 대한 표준물(EPREX®(에포에틴 알파)) 및 EPO 접합체('EPEG')의 활성도 비교.
도 7: 스프레그 다우리(Sprag Dawley) 쥐의 정맥내 주입에 대한 EPO, EPEG 및 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)의 약동학 프로필.
도 8: 본 발명의 EPO 접합체의 생체내 활성도 비교. 5㎍/쥐의 복용 후 세개의 PEG-EPO 시료의 시간 당 헤마토크릿(hematocrit) 레벨을 고유 EPO의 것과 비교했다. Y501P: 1PEG-EPO를 보유하는 측쇄형 사슬 NHS-PEG(20,000KD)로 수식된 EPO. Y502P: 2PEG-EPO를 보유하는 측쇄형 사슬 NHS-PEG(20,000KD)로 수식된 EPO. Y5012: 1PEG-EPO 및 2PEG-EPO를 보유하는 측쇄형 사슬 NHS-PEG(20,000KD)로 수식된 EPO.
도 9: 쥐의 헤마토크릿 증가를 유도하는 활성도에 대한 세개의 다른 EPEGs(L 33, Y5012 및 X6012) 및 고유 EPO를 비교한 시간 추이선.
도 10: EPEG 또는 rhu-EPO(2.5 ㎍ 또는 5 ㎍/동물) 또는 운반체(PBS)의 하기 볼루스(bolus) 주입으로 인한 스프래그-다우리 수컷 쥐의 헤마토크릿 증가에 대한 시간 추이선.
도 11: EPEG, rhu-EPO(2.5 ㎍ 또는 5 ㎍/동물) 또는 운반체(PBS)의 한 개 또는 두 개의(각각 "비주입" 또는 "주입") 볼루스 주입 후 스프래그-다우리 수컷 쥐의 헤마토크릿 증가에 대한 시간 추이선. EPEG 또는 대조군의 두 번째 투여는 첫 번째 투여 후 14일째에 발생했다.

실시예 1: SC - PEG -12K로 EPO 의 페그화

숙시니미딜 카보네이트 에스테르(SC-PEG-12K)로 활성화된 모노-메톡시화 PEG(분자량 12,000 KD)를 페그화 시제로 사용했다. CHO 세포에서 제조된 EPO를 폴리펩타이드로 사용했다. EPO-단백질(50 mg)를 0.15 mM NaCl, 및 10 mM 소듐 포스페이트를 보유하는 반응 완충액에서 pH 6.9, 0.61 mg/ml의 농도로 제조했다. 특정 실험에서, 반응 완충액은 또한 15% DMSO를 보유했다.

폴리펩타이드 용액을 건조 PEG 시제로 혼합한 후 7:1의 최종 PEG/EPO 몰비가 될 때까지 교반시켰다. DMSO, 및 미반응된 PEG 분자를 포함하는 반응 생성물을 25,000 KD의 분자량을 보유하는 막을 사용해서 투석 분리했다. DMSO가 있거나 없는 반응 완충액 조성물과 상관없이, 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(PAGE)(예컨대, 도 3B 참고)으로 측정된 바, 거의 동일한 비율의 모노-페그화 EPO 및 디-페그화 EPO 혼합물을 보유했다. 이러한 방법으로 제조된 생성물을 EPEG로 지칭한다.

실시예 2: 페그화 부위

SC-PEG(12 kD)를 실시예 1의 프로토콜에 따라 EPO를 페그화하는데 사용했고, 결과 EPEG 제형 또는 EPO(대조군)를 당해 기술 표준으로 트립신 소화시켰다: 단백질 100 피코몰을 18시간동안 37℃에서 100 mM의 소듐 포스페이트 pH 8,4에 4%의 기질 중량으로 TPCK-치료된 트립신(시그마, MO)으로 소화시켰다. 이 소화는 C18 역상 컬럼(아폴로 C-18, 5 u 입자, 4.6×100mm)으로 분석했다. 이 부분은 0.125%의 TFA(트리플루오로아세트산) 100% 내지 아세트로니트릴/0.125%의 TFA 50분의 선형 기울기를 사용해서 용출시켰다. 용출된 부분은 230 nm의 UV 파장으로 분석했다. 크로마토그램은 EPO 및 PEG-EPO에 대해 각각 도 3A 및 3B에 도시된다. EPO 크로마토그램에 존재하나, PEG-EPO 용출 프로파일에서 사라지거나 부재인 피크는 PEG 수식을 지시하고, 이들의 페그화 부위를 특징화한다.

PEG를 보유하는 분량은 ABI 프로사이즈 시스템(procise system)을 사용해서 표준 절차에 따라 단백질 서열화로 분석했다(ABI, CA). 페그화 부위는 측정된 서열을 EPO 아미노 서열과 맞춰봄으로서 측정됐다. 결과는 표 1에 제시된다.

반응 혼합물에서 DMSO를 보유하거나 보유하지 않은 경우의 실시예 1에 따른 다중 PEG-EPO 로트(lot)의 페그화 부위

PEG-EPO의 로트 번호	페그화 부위(총 수식 부위 중 % 로 표현)				DMSO의 존재
PEG-EPO의 로트 번호	N-말단	라이신-52	라이신-116	라이신-154	DMSO의 존재
5d29-ty	20	36.4	36.4	7.2	무
5012V	41	36	23		무
501P-c	16	54	30		무
x6012	22	68	5	5	무
L33	14	86			무
7517A	92	8			유
68291	87	13			유
6213V	81	19			유
6214Ty	79	7.5	10	3.5	유

놀랍게도, 반응 완충액에서 DMSO의 존재는 단백질의 N-말단(즉, α-아미노기)을 우선적으로 그리고 우세하게 페그화하기 위해 페그화 반응을 이동시켰다는 것을 발견했다. 특히, DMSO의 존재는 이 반응을 라이신 116에서의 페그화로부터 이동시켰다. 이전 보고는 알데히드 활성화된 PEG 및 산성 pH를 사용해서 단백질의 N-말단의 페그화를 증명했다(예컨대, 본원이 전문이 참고인용된 미국 특허 번호 제6,077,939 및 5,985,265 참고).

반응 완충액에 DMSO를 첨가함으로서 가능한 바람직한 페그화는 N-말단 서열화를 사용해서 수행했다. 비소화된 EPO 또는 실시예 1에 따라 제조된 EPEG를 표준 방법에 따라 N-말단 서열화를 시행했다. N 말단 알라닌의 예상량의 50% 이상과 비교할 때, EPEG 시료에서 검출되지 않아야 한다. 유사한 결과를 포도당구균 프로테아제 V8, 키모트립신, 또는 트립신과 같은 프로테아제를 사용해서 단백질 가수분해 보호 분석으로 달성했다.

예비 데이터는 또한 본 발명의 페그화 방법이 단백질의 N-말단의 선택적인 페그화를 포함해서 다른 단백질의 선택적인 페그화를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 예컨대, 단백질 과립구-집락자극인자(G-CSF)를 실시예 1의 방법을 통해 SC-PEG 및 DMSO를 사용해서 페그화한 후, SP 컬럼으로 정제할 때, 본 발명의 N-말단 수식종의 것과 같은 동일 시간, 즉 동일 구획에서 PEG-GCSF를 용출시켰고; DMSO의 부재하에 용출 시간이 이동됐다. 이 결과는 본 발명의 방법이 단백질의 선택적인 페그화를 가능하게 하고, 특히 α-아미노기의 목표 페그화를 가능하게 한다는 것을 암시한다.

실시예 3: PEG - EPO 의 제형 및 안정성

EPEG를 DMSO를 보유하는 반응 완충액을 사용해서 실시예 1의 방법을 통해 제조했다. 이 생성물을 바이오버든(bioburden)을 줄이기 위해 0.2uM의 막을 통해 필터시킨 후, 인프라(infra)에 기술된 BCA 단백질 측정법으로 측정된 바, 50 ㎍/ml의 최종 농도의 PBS(포스페이트로 완충된 살린, pH 6.9)로 희석시켰다. 이 생성물을 저장을 위해 1 ml의 바이얼로 멸균 필터시켰다. 필터된 생성물은 LAL 시험(리물루스 아메보사이트 리세이트 피로겐 분석, 켐브랙스, 엠디)으로 시험한 결과, ml 당 0.1 EU 미만의 내독소 수준을 보유했다. 이 바이얼을 이후 안정성 및/또는 활성도 시험시 37℃, 25℃, 4℃ 또는 -20℃에서 저장했다. 정기적으로, 시료를 BCA 단백질 분석에 의해 단백질 함량, 및 줄기 세포의 성장과 헤마토크릿 생성의 자극으로 인한 EPO 활성도에 대한 PAGE의 물리적 무결성을 시험했다(활성도 분석에 대한 실시예 3 참고).

SDS PAGE에 의한 -20℃ 또는 4℃에서 15달동안 저장 후에 EPEG의 분해 또는 감소의 증가가 없다(에컨대, 도 5의 레인 2 및 3). 놀랍게도, 약물을 보호하기 위한 첨가제로 HSA(인간 혈청 알부민)와 같은 담체 단백질이 없었음에도 불구하고, SDS PAGE 또한 25℃ 또는 37℃에서 적어도 10달동안 저장 후에 물리적 무결성에서 검출 가능한 감소를 나타내지 않았다. 대조적으로, 상업적인 EPO, EPREX®(에포이엔틴 알파)는 보호를 위한 0.2% HSA를 요구한다. 그러므로, 활성인 제약 성분, EPEG의 감소없이 무단백질 염 완충액에서 본 발명의 단백질 접합체를 제형화하는 것이 가능하다. 시료의 안정성을 또한 BCA 단백질 함량 측정으로 평가했다.

시료의 안정성을 또한 BCA 단백질 함량 분석으로 평가했다. 37℃, 25℃, 4℃ 또는 20℃에서 저장된 대표적인 시료를 총 단백질 농도를 정량하기 위해 BCA 단백질 측정을 위해 선택했다. 시료 또는 대조군의 50 ul를 37℃에서 2시간동안 175 ul의 작업 시약 용액(working reagent solution)에서 배양시키고, 650 nm의 흡수 파장에서 측정했다. A4 매개변수 퇴화를 단백질 농도를 측정하기 위해 수행했다. 표준 커브를 BSA(보빈 혈청 알부민)로 생성했고, 0.999의 상관 계수를 보유했다. 12주 저장 후에, 상기 측정법으로 37℃에서 저장된 시료는 50.5 ㎍/ml의 단백질 농도 및 25℃에서 저장된 시료는 51.3㎍/ml의 단백질 농도로 측정됐다. 47주의 저장 후, 상기 분석을 -20℃에서 저장된 시료에서는 51.3 ㎍/ml의 단백질 농도 및 4℃에서 저장된 시료는 49.5 ㎍/ml로 측정됐다. 실험 개시때, 이 시료는 BCA에 의해 측정된 약 50 ㎍/ml의 농도를 보유했다. 그러므로, 시간 당 단백질의 감소는 없었다. EPREX®(에포이에틴 알파)는 0.2%의 HSA를 보유하기 때문에, BCA 측정시 표준으로 사용될 수 없다는 것을 주의한다.

촉진 연구에서 시료를 줄기 세포 분화(실시예 4에 기술된)를 유도하는 효능으로 평가할 때, 시료의 안정성의 추가적인 증거가 관찰됐다. 활성도를 3 단위/ml 생성물로 평가했고, EPREX®(에포이에틴 알파)와 동일양으로 유도된 군락 생성 비율로 표현했다. 37℃에서 12주동안 저장된 시료는 76.3%의 대조군 활성도를 보유했고, 25℃에서 17주동안 저장된 시료는 76.5%를 보유했으며, 4℃에서 54주동안 저장된 시료는 85.3%를 보유했고, -20℃에서 47주동안 저장된 시료는 77.9%를 보유했다. 0 시간에서의 시료는 76.5%의 대조군 활성도를 보유했고; 본래 활성도의 약 100%는 무단백질인 담체 제형으로 저장시 보존됐다는 것을 지시했다.

실시예 4: 생체외 군락 분석에서 메틸셀룰로오즈계를 사용해서 적혈구 원종의 증식에 대한 PEG-EPO의 기능적 영향의 평가

EPEG를 DMSO가 없는 반응 완충액을 사용해서 실시예 1의 방법에 따라 제조했다. EPEG의 효능은 줄기 세포를 적혈구 세포로 분화를 촉진하는 능력으로 평가했다. 정상 인간 골수를 줄기 세포의 급원으로 사용했다. 저밀도 세포를 피콜(picoll) 분리 후에 수득했다(포이에틴 인코포레이트의 키트). 이 세포를 2%의 FBS를 보유하는 Iscove 배지 10 ml에서 재부유시키고, 트립신 블루와의 생존력을 체크했다. 50 ㎍/ml 및 대조군 시료에서 EPEG 시험 시료를 섹션 6.2에서 기술된, BCA 단백질 측정으로 단백질 농도의 측정 이후에 EPO의 표준 125,000 유닛/mg을 비교를 위해 유닛/ml으로 변환시켰다. 집락 생성 세포(CFC) 분석에서, 300 유닛/mL의 보존 용액을 제조한 후, 2%의 FBS를 보유하는 Iscove 배지에서 연속적인 희석액을 제조했다. 대조군으로서, EPREX®(에포이에틴 알파)의 유사한 보존 용액(20,000 IU/ml, 로트 번호 58B097)을 또한 피복을 위해 제조했다. 표준 EPO(EPREX®(에포이에틴 알파)) 및 EPEG를 3, 1, 0.3, 0.1 및 0.03 유닛/ml의 최종 농도에 추가했다. 헤마토포이에틱(Hematopoietic) 집락 분석을 배양액 당 20,000 골수 세포로 개시했다. 모든 배양액은 3배한 후 14일동안 배양시켰다. 14일째에, 집락 수를 세었다. 집락은 모폴로지 기준으로 하기 카테고리로 나눈 후, CFU-E, BFU-E 및 CFU-GM이 당해 기술에서 보편적이다. CFU-E는 200 미만의 적아세포를 보유하고, 보다 성숙한 원종 유래의 적혈구 집락이다. CFU-GM은 40 이상의 과립구 및/또는 대식 세포로 집락을 생성할 수 있는 집락 생성 세포(CFC) 유래의 집락이다. 총 CFC(총 적혈구 + CFU-GM)뿐 아니라 총 적혈구(CFU-E + BFU-E)를 정량했다. 배지를 사용한 분석은 검출가능한 적혈구 집락을 생성하지 않았다. 이것은 관찰된 집락이 시험 시료때문인 것을 실증하다. 이 결과는 원종 분석에서 대조군 EPREX®(에포이에틴 알파) 및 시험 EPEG에서 첨가된 사이토킨의 부재하에 적혈구 원종 성장에 투여량이 의존효과를 나타냈다. 3 마이크로/ml의 포화 농도에서, EPEG A, B, 및 C는 78-82%의 EPREX®(에포이에틴 알파) 대조군 성장을 포함한다. 이 레벨은 도 6에 도시된 바, 부분 포화 농도에서 보다 낮다(1 및 3 유닛/ml). 이 그래프는 3 리딩(readings)의 평균수를 나타낸다. 변화량의 평균 계수는 3 유닛/ml 당 11%, 1 유닛/ml 당 25%, 0.3 유닛/ml 당 30%, 0.1 유닛/ml 당 50%다. 신뢰 레벨의 p-수치는 P<0.01이었다. 무단백질 배지에서 5 달동안 저장 후에, EPEG 시료는 꽉찬 활성도를 유지했다. 분석 결과를 통계 분석했다. 표준 t-시험을 당량 농도에서 EPO 및 PEG-EPO로 시험된 배양액 사이에 생성된 집락 수 차이를 평가하기 위해 수행했다. 0.01 미만의 p 값이 현저한 것으로 간주됐다. 관찰된 데이터는 결과가 이 현저한 레벨 내에 있는 것을 지시했다. 유사한 결과를 DMSO를 보유하는 반응 완충액에서 제조된 EPEG를 사용해서 수득했다.

실시예 5: EPEG 의 약물동태학 연구( PEG - EPO )

EPEG(EPO-PEG201 및 EPO-PEG202)의 두 개의 다른 로트를 DMSO(즉, 고유 EPO를 라이신 부위에서 SC-PEG-12K로 수식시켰다)가 없는 반응 완충액 및 섹션 6.3에서 기술된 BCA 측정으로 측정된 시료의 결과 단백질 농도로 실시예 1의 방법론에 따라 제조했다. 이 EPEG 화합물을 고유, 비수식, 천연 기능성 EPO 및 FDA 승인 EPO 고당부가(hyperglycosylate)로 약물 동력학 프로필을 비교하기 위해 사용했다(ARANESP®(다르보포이에틴 알파), 암켄 인코포레이티드, 싸우젠드 오크, 씨에이). ARANESP®(다르보포이에틴 알파)가 FDA 승인된 생성물이고, 단백질의 고당부가때문에 장기적인 반감기를 보유하기 때문에 기준물로 사용했다. 혈액에서 단백질을 검출하기 위해, 네개의 시료를 당해 기술에서 공지된 방법으로 클로라민 T 방법을 사용해서 이의 티로신 부위에서 ¹²⁵I로 표지했다. 각각의 분자는 약 1-2개의 ¹²⁵I를 부착했다. 각각의 시료(80 ㎍)를 표지하고, 탈염 컬럼을 사용해서 ¹²⁵I로 분리시켰다. 단백질의 활성도는 폴리아크릴아미드 겔 및 역상 컬럼에서 검출한 후 증명했다. 페그화 시료를 하나의 PEG 분자에 접합된 EPO 계군 또는 2개의 PEG 분자(2PEG-EPO)에 접합된 EPO 계군으로 평가했다. 1PEG-EPO 내지 2PEG-EPO의 비율은 EPO-PEG201에서 54:46이었고; EPO-PEG202에서는 45:55였다. 4개의 라디오-표지(radio-labeled)의 단백질 회분의 약물 동태학 프로필을 분석하기 위해, 4 Ci/kg 신체 무게로 투입된 단백질 용액을 수컷 스프래그-다우리 쥐의 피하에 주입했다. 이 쥐는 각각의 동물에 3개 이상의 혈액 샘플링을 피하기 위해 5개의 소그룹으로 나눴다. 혈액 시료를 주입 후에 다른 시간대에서 측정했다(0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36, 48, 72, 96 및 120 시간). 혈액 시료에서 방사선 동위원소가 표지된 단백질의 양은 섬광 계수기를 사용해서 측정했고, 발생된 데이터는 통계학적으로 평가했다. 결과는 도 7의 EPO-PEG201에 도시되고, EPO-PEG202는 유사한 약물동력학 프로필을 보유했다. 놀랍게도, 발명자는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파) 또는 고유 EPO보다 보다 높고 넓은 PK 프로필을 보유하는 것을 발견했다. 도 2는 하나의 구획 모델 및 투입량 축척을 사용해서 PK 매개변수의 분석 결과를 도시했다.

4개의 EPREX®(에포이에틴 알파) 및 EPO-PEG의 약물동력학 매개변수

	Tmax(hr)	Cmax(pCi/ml)	AUC(pCi*h/ml)	반감기
EPO	8.84	3208	96,240	12.84
EPO-PEG201	21.69	4139	333,400	32.53
EPO-PEG202	20.02	5199	386,600	30.03
ARANESP®	15.8	4072	267,300	23.64

고유 EPO가 주입된 직후 고레벨에 도달했고, 13시간내에 제거됐다. 현재 승인된 EPO의 장기 활성 형태인 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)는 EPO보다 12-18 시간에 최고치를 기록했고, 긴 반감기를 나타냈지만, 혈액 내에서 현저하게 높은 농도에 도달하는 것은 실패했다. 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 EPEG의 혈액 레벨은 초기 12 시간안에 EPO 및 ARANESP®와 유사했고, 활성도 농도가 증가하기 시작해서 36 시간째에 EPO 또는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 약 50% 높은 최대 레벨에 도달했다. EPEG는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 약 26% 내지 약 38% 느린 신체로부터 제거됐다. 이 결과는 대조군 EPO 또는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 커브 아래 영역에서 최대 총 노출을 나타냈다. 사실상, EPEG는 ARANESP®(다르보포이에틴 알파)보다 커브(AUC) 아래에서 약 25% 내지 약 45% 넓은 영역을 보유했고; 고유 EPO보다 4배 넓었다.

실시예 6: PEG - EPO 의 다양한 형태 생산

EPEG의 다중 회분을 DMSO가 없는 반응 완충액 및 다른 종류의 활성화 PEG를 사용해서 실시예 1의 방법에 따라 제조했다. 페그화 반응에서 사용된 활성화 PEG의 양이 최종 생성물이 거의 동일양의 1PEG-EPO 및 2PEG-EPO를 보유하도록 조절했다. 1PEG-EPO 및 2PEG-EPO를 DEAE 컬럼 크로마토그래피를 사용해서 정제했다. 컬럼은 pH 6.75에서 75 mM NaCl, 5 mM 소듐 포스페이트를 보유하는 완충액으로 평형화시켰다. 반응 후에, 이 시료를 동일 완충액에 대해 투석한 후 정제를 위해 컬럼 위에 로딩시켰다. 소량의 고수식된 PEG-EPO이 컬럼에 결합되지 않아서, 워시(wash)로 용출시켰다. 이 시료를 97.5mM의 NaCl, 5mM의 소듐 포스페이트 pH 6.75로 변화를 주며 용출시켰다. 임의의 고유 EPO는 pH 6.75의 5mM의 소듐 포스페이트에 있는 150mM의 NaCl로 용출시켰다. 용출된 분량은 폴리아크릴아미드 겔 전기이동에 분석됐다. 이 분량은 세 그룹으로 분리된다: 1PEG-EPO, 2-PEG-EPO 및 이 둘을 동일 양으로 한 혼합물. 다섯개의 대표 시료를 제조했다: Y501P, 1PEG-EPO를 보유하는 분쇄형 사슬 NHS-PEG(20 kD)로 수식시킨 EPO; Y502P, 2PEG-EPO를 보유하는 분쇄형 사슬 NHS-PEG(20 kD)로 수식시킨 EPO; Y5012, 동일 양의 1PEG-EPO 및 2-PEG-EPO를 보유하는 분쇄형 사슬 NHS-PEG(20 kD)로 수식시킨 EPO; L33, 동일 양의 1PEG-EPO 및 2-PEG-EPO를 보유하는 직쇄형 사슬 NHS-PEG(20 kD)로 수식시킨 EPO; 및 X6012, 동일 양의 1PEG-EPO 및 2PEG-EPO를 보유하는 측쇄형 NHS-PEG(40 kD)롤 수식시킨 EPO. 최종 시료의 단백질 농도를 섹션 6.3에 기술된 것과 같이 결정했다.

실시예 7: PEG - EPO 변형체의 약력학 연구

실시예 6에 약술된 바대로 생성된 EPEG를 쥐에 투여해서 활성도를 비교하고 평가했다: Y501P(1PEG-EPO), Y502P(2PEG-EPO) 및 Y5012(1PEG-EPO 및 2PEG-EPO 혼합).

스프래그-다우리 쥐(특정 병원체 없음, 5주차, 수컷)를 에어-컨디션드 동물 수용소의 필터-탑(filter-top) 우리에서 보관했다. 물은 임의적으로 공급했다. 연구 전 쥐는 도착해서 1주일동안 적응시간을 가지게 했다. EPEG 시료를 주입하기 전에 PBS로 희석시켰다. 이 쥐(각각 약 250g)에 1 ml의 완충액(PBS) 또는 1ml의 PBS(대조군)에 넣은 5 ㎍ 총 단백질을 피하내로 주입시키고, 헤마토크릿을 25일동안 관찰했다. 헤마토크릿은 헤파린화된 모세관(메리언플드, 독일)에 미정맥(tail vein)으로 부터 채혈한 피를 넣어서 결정했다. 봉인 후에, 이 모세관을 헤마토크릿 모세관(한일 사이언스 인더스트리얼, 한국)에서 10분동안 최대 속도로 원심분리시켰다. 헤마토크릿의 레벨은 표준 방법(도 8)을 사용해서 침적 세포의 백분율 계산으로 결정했다. 놀랍게도, 2PEG-EPO는 1PEG-EPO와 유사한 활성도를 보유했다.

실시예 8: 다양한 형태의 PEG - EPO 로 헤마토크릿 유도

실시예 6에 기술된 대로 생성된 EPEG 변형체를 추가로 실시예 7에 약술된 헤마토크릿 유도 마우스 모델에 시험했다. 이 측정에 선택된 EPEG 제형은 거의 동일량의 1PEG-EPO 및 2PEG-EPO로 각각 구성됐다: L33, Y5012, 및 X6012(실시예 5 참고). 증가된 헤마토크릿의 생체내 활성도를 PBS 및 고유 EPO의 것과 비교했다. 수프라(supra)에 기술된 바, 각각의 동물에 대략 5 ㎍의 활성제, 즉 총 단백질이 투여됐다. 도 9에 도시된 바, L33 및 Y5012는 유사한 효과를 보유했고, Y5012는 약간 더 활성화됐다. 보다 높은 분자량의 PEG는 활성도를 추가로 증가시키지 않았다. 40k 측쇄형 PEG(X6012)로 수식된 PEG-PEO를 제외한, 시험된 모든 EPEG 제형은 고유 EPO보다 보다 높은 활성도를 증명했다. 고유 EPO와 비교할 때 관찰된 활성도의 증가는 SC-PEG 또는 NHS-PEG의 사용, 12kD 또는 20kD의 사용, 그리고 직쇄형 또는 측쇄형 PEG의 사용과는 무관했다.

실시예 8: PEG - EPO 는 고유 EPO 보다 고효능

L33 EPEG(즉, 활성화 PEG로 직쇄형 SC-PEG-12k)를 실시예 6에 따라 제조하고, 섹션 6.3에 기술된 대로 단백질 농도를 정량화했다. 이 EPEG 제형을 실시예 7 및 8에 따라 쥐 모델의 생체내 활성도를 평가했다. 헤마토크릿 레벨을 0, 2, 5, 7, 10 및 14일째에 평가했다. 대조군의 고유 EPO는 바큐로바이러스성 발현 시스템에서 생성된 재조합 인간 EPO(rhu-EPO)다(당해 기술에서 공지된 것처럼 Rhu-EPO는 본래 인간 EPO와 동일 아미노산 서열을 보유하되, 당부가 패턴은 다른다). EPEG 또는 rhu EPO를 동물 당 2.5 또는 5 ㎍의 용량의 단일 주입으로 쥐에 투여했다(각각 대략 250g).

14일의 주기동안의 헤마토크릿이 도 10에 도시된다. 쥐 당 2.5 ㎍의 단백질에 EPEG를 투여하는 것은 대조군, rhu-EPO의 5㎍ 용량과 동일 효과를 나타내고, 이것은 본 발명의 EPEG가 대조군보다 2배 효능이 좋다는 것을 암시한다. 5 ㎍의 용량으로, EPEG는 약 80%의 헤마토크릿 레벨을 유도했고, 이것은 비수식된, 즉 비페그화된 EPO에 의해 유도될 수 있는 것의 거의 2배다. 5 ㎍ 용량의 대조군, rhu-EPO는 2.5 ㎍ 용량과 유사한 래벨의 헤마토크릿 유도를 나타냄을 주의한다. 이 결과는 대조군 EPO가 시험된 용량에서의 헤마토크릿의 유도가 정체기에 이미 도달한 것을 암시한다. 이 결과는 이전 출원이 EPO 제형이 시험된 2.5 ㎍ 용량보다 높은 수준에서 용량 반응 효과를 나타내는데 실패한 것을 청구한 점에서 놀랍지 않았다. 반대로, 본 발명의 EPEG 제형은 보다 높은 용량에서 용량 반응 효과를 나타냈고, 대조군 화합물을 사용해서 달성할 수 있는 것보다 실질적으로 보다 높은 헤마토크릿 유도를 가능케 했다. 따라서, 본 발명의 EPEG 제형은 당해 기술에서 현재 용인될 수 있는 제약 특성 및 약물로의 잠재성을 동시에 제공한다.

실시예 10: EPEG 의 장기 지속 효과를 증명하기 위한 이중 주입

DMSO를 보유하는 반응 완충액을 사용하여 실시예 1에 따라 제조한 EPEG 제형의 연속 투여 효과를 실시예 7 및 8의 쥐 모델에 따라 생체내 활성도로 측정했다. 수컷 스프래그-다우리 쥐는 EPEG 제형을 한 번(0일째) 또는 연속 투여(0, 14일째)받은 그룹으로 분류했다. 헤마토크릿 레벨을 21일에 걸쳐 모니터했다(도 11). 단일 5 ㎍ 주입으로 수득가능한 헤마토크릿의 놀라운 수준과 비교해서, EPEG 제형의 활성도, 즉, 헤마토크릿 유도는 연속 주입 투여량 개략도(각각 5 ㎍)를 사용할 때 보다 두드러지고, 90%의 예상치 못한 레벨에 도달한 헤마토크릿 레벨은 대조군 화합물과 비교해서 개선된 활성도를 증명한다.

본 공개문은 본 발명의 바람직한 양태만을 기술하되, 이의 약간의 실시예를 함께 기술한다. 본 발명은 다양한 다른 결합 및 조건에서 사용될 수 있고, 본원에서 표현된 개념의 범주내에서 변화 또는 변형이 이루어질 수 있다. 그러므로, 예컨대, 당업자는 관례적인 실험, 본원에 기술된 특정 물질 및 절차와 동등한 것 이상의 것을 사용하지 않고도 인식되거나 확인될 수 있을 것이다. 상기 동등한 것은 본원의 범주내에 있는 것으로 간주된다.

<110> Abuchowski, Abraham Lee, Lihsyng Stanford <120> Modified Erythropoietin <130> 13939-105001 <150> US 60/835,429 <151> 2006-08-04 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims

a. 총 에리스로포이에틴 단백질의 79% 이상이 에리스로포이에틴(EPO) 단백질의 N 말단에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 접합 에리스로포이에틴 분자들의 혼합물; 및
b. 약학적으로 유효한 담체
를 포함하는,
적혈구 세포 결핍 치료용 제약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴 단백질이 하나 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 제약 조성물.
제2항에 있어서, 상기 PEG 분자가 상기 에리스로포이에틴 단백질의 α-아미노기에 카바메이트 결합을 통해 공유 결합된 제약 조성물.
제1항에 있어서, 상기 PEG 분자가 NHS-PEG 또는 SC-PEG인 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 분자가 10kD 내지 40kD의 분자량을 가지며, 직쇄형 또는 측쇄형인 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 유효한 담체가 무단백질인 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합의 79 내지 92%가 상기 단백질의 α-아미노기에 카바메이트 결합을 통해 공유 결합된 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합의 10% 미만이 상기 단백질의 라이신 116을 통한 것인 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합의 3.5% 미만이 상기 단백질의 라이신 154을 통한 것인 제약 조성물.
(a) 에리스로포이에틴(EPO) 단백질을 상기 단백질의 아미노 잔기와 접합하는 활성화된 수용성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 5%-80% DMSO를 포함하는 반응 완충액 내에서 반응시키는 단계; 및
(b) 미결합된 수용성 폴리에틸렌 글리콜을 제거하는 단계
를 포함하는,
제1항에 따른 제약 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 반응 완충액은 10%-40% DMSO를 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 반응 완충액은 DMSO를 포함하는, 아민 성분이 없는 표준 완충액인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 완충액이 6.5-8.5의 pH를 갖는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화된 수용성 폴리에틸렌 글리콜은 NHS-PEG, SC-PEG, SS-PEG, mPEG-이미데이트, 또는 mPEG-시아누르 클로라이드인 방법.