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KR20120084303A - 약물 함유 미립자를 포함하는 의약 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

약물 함유 미립자를 포함하는 의약 조성물 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR20120084303A
KR20120084303A KR1020127011394A KR20127011394A KR20120084303A KR 20120084303 A KR20120084303 A KR 20120084303A KR 1020127011394 A KR1020127011394 A KR 1020127011394A KR 20127011394 A KR20127011394 A KR 20127011394A KR 20120084303 A KR20120084303 A KR 20120084303A
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KR
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particles
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insulin
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KR1020127011394A
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가츠유키 오쿠보
도시히코 오카자키
치에코 기타우라
겐지로 미노미
엘리자베스 피어슨
클리브 제이 로버츠
마틴 씨 데이비스
스녜자나 스톨닉-트렌킥
리스베스 일람
Original Assignee
닛토덴코 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 수용성의 고분자 약물을 주사 이외의 방법으로 효율적으로 투여하기 위해 사용될 수 있는 의약 조성물 및 이러한 의약 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 목적은, (a) 수용성의 약물과 (b) 실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있는 것을 특징으로 하는 상기 의약 조성물에 의해 달성된다.

Description

약물 함유 미립자를 포함하는 의약 조성물 및 그 제조 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT-CONTAINING FINE PARTICLES AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은, 수용성의 약물과 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 포함하는 의약 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
생물공학의 진보는, 펩티드, 단백질, 다당, 폴리핵산, siRNA, RNA, 항체, 항원 등의 많은 치료 화합물의 발견을 가져왔다. 이들 화합물의 물리 화학적인 특징(예, 큰 분자량, 친수성, 불안정성)은, 주사 이외의 수단에 의한 생체로의 투여를 어렵게 하고 있다. 이들 약물 중에는, 주사에 의한 1일 복수회의 투약이 필요한 것도 있어, 특히 청년 환자에서의 투약 불이행으로 이어지고 있다(비특허문헌 1 및 2).
경구, 경폐, 경구강(구강 점막), 경질 및 경비 등의 경점막 경로에 의한 투여에서, 이들 약물은 그 물리적 크기나 친수성 등에 기인하여 점막 표면을 통해 흡수되기 어렵다. 또한, 이들 약물은, 펩티다아제나 프로테아제 등의 효소에 의한 분해를 받기 쉽고, 특히 소화관에서 그것이 문제가 된다. 이들 약물의 점막 표면을 통한 수송을 개선하기 위해, 흡수 촉진제를 함유하는 제제가 사용되어 왔으나, 그와 같은 제제는 특히 경비 경로 및 경폐 경로에 의한 송달에서 어느 정도의 성공을 거두어 왔다. 그러나, 고분자량 화합물의 점막 표면을 통한 수송을 제공하기 위한 효과적인 방법 및 조성물의 개발이 필요하다.
그와 같은 수송을 제공하는 수단으로서, 약물을 내포하고 있는 나노 입자가 문헌에 기재되어 있다(비특허문헌 3). 그러나, 화합물의 사이즈가 큰 것 또는 나노 입자의 매트릭스 내가 통상 소수적 환경인 것 때문에, 펩티드나 단백질의 나노 입자 내로의 봉입은 어려워 통상 매우 낮은 담지 능력이 되고, 그 때문에 점막 표면에 투여해야 할 나노 입자의 양을 늘릴 필요가 생겨 버린다. 이것은, 나노 입자의 대부분이 순수한 약물인 나노 결정을 제조함으로써 어느 정도 해결되었다. 그러나, 나노 결정의 현탁액은 통상 결정이 안정화되지 않는 한, 결정의 단계적인 성장이 통상 일어나기 때문에 매우 불안정하다. 나노 결정을 안정화시키기 위한 통상의 처치로는, 가교 처리가 실시되어 왔다. 이것은, 약물 자체를 어느 정도 가교하기 때문에, 약물의 생리 활성의 저하나, 단백질 등의 약물에 대한 면역 원성의 부여를 초래하여 버린다. 또한, 점막을 통한 나노 입자의 수송을 용이하게는 달성할 수 없는 것은, 문헌에서의 발표에서 명백하다(비특허문헌 3).
나노 입자는, 경점막 약물 딜리버리를 위한 캐리어로서 널리 연구되어 왔다(비특허문헌 3-5). 상기에서 개설한 바와 같이, 나노 입자는 특히 펩티드 및 단백질 때문에 중요했다. 그러나, 나노 입자 시스템은, 충분한 양의 약물을 경점막으로 딜리버리하기 위해서는 유효하지 않다는 것, 약물의 담지율이 낮다는 것, 및 나노 입자의 매트릭스 내에 봉입되지 않은 경우에는 펩티드나 단백질의 약물의 안정성이 충분하지 않다는 것 등의 문제가 보고되어 왔다. 펩티드 또는 단백질의 나노 결정의 형태의 나노 입자는, 경점막 및 비경구적 딜리버리를 위한 약물 딜리버리 시스템으로서 문헌에 기재되어 왔다(비특허문헌 6 및 7). 그러나, 문헌에 기재된 나노 결정은, 종종 물리적으로 불안정하거나 또는 안정성을 향상시키기 위해 가교된 경우에 생리 활성의 일부가 상실된다. 또한, 나노 결정은 종종 1 ㎛를 상회하는 크기를 가지며, 따라서 나노 결정이라기 보다는 오히려 마이크로 결정이다.
특허문헌 1 : US2004/02192224 특허문헌 2 : WO98/46732 특허문헌 3 : US7087246 특허문헌 4 : WO02/072636 특허문헌 5 : WO99/55310
비특허문헌 1 : Drug Discovery Today. 7; 1184-1189 (2002) 비특허문헌 2 : J. Control. Rel. 87; 187-198 (2003) 비특허문헌 3 : J. Pharm. Sci. 96; 473-483 (2007) 비특허문헌 4 : Biomaterials 23; 3193-3201 (2002) 비특허문헌 5 : Int J Pharm. 342; 240-249 (2007) 비특허문헌 6 : J. Biotech. 113; 151-170 (2004) 비특허문헌 7 : Pharm. Res. 22(9); 1461-1470 (2005)
전술한 바와 같이, 펩티드나 단백질 등의 수용성의 고분자 약물을 미립자 내에 높은 효율로 봉입하는 것이나, 수용성의 고분자 약물을 포함하는 미립자를 적절한 사이즈로 조제하는 것은 용이하지 않다. 또, 건조된 미립자를 포함하는 조성물을 사용시에 물을 첨가하여 재현탁하는 경우에, 응집을 회피하여 미소한 사이즈의 입자로서 재분산시키는 것도 용이하지 않다.
본 발명의 목적은, 수용성의 약물을 주사 이외의 방법으로 효율적으로 투여하기 위해 사용될 수 있는 의약 조성물을 제공하는 것에 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적은, 수용성의 약물(예, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신 등)을 경점막 또는 경피적으로 효율적으로 투여하기 위해 사용될 수 있는 미립자 함유 의약 조성물로서, 종래의 미립자 함유 의약 조성물과 비교하여, 수용성의 약물을 미립자 내에 높은 효율로 봉입하는 것이나, 미립자를 적절한 사이즈로 조제하는 것을 가능하게 할 수 있는 미립자 함유 의약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 의약 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것도 그 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기와 같은 수용성의 약물을 주사 이외의 방법으로 효율적으로 투여하기 위한 방법으로서, 나노 입자 등의 미립자 시스템을 사용한 경점막 및 경피적인 투여에 착안하여 예의 검토를 거듭했다. 그 결과, 수용성의 약물과 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있는 미립자를 조제함으로써, 수용성의 약물을 미립자 내에 높은 효율로 봉입하는 것이나, 미립자를 적절한 사이즈로 조제하는 것이 가능해질 수 있는 것을 발견했다. 본 발명자들은 또한, 상기 미립자의 표면을 정전 상호 작용에 의해 적당한 폴리머로 피복함으로써, 미립자를 현탁액 중에서 안정화시키는 것이 가능해지는 것을 발견했다. 이러한 지견으로부터, 상기 미립자를 포함하는 의약 조성물을 사용함으로써, 종래법보다 우수한 약물 송달 시스템을 달성하는 것이 가능한 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] (a) 수용성의 약물과 (b) 실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있는 것을 특징으로 하는 상기 의약 조성물.
[2] 상기 미립자가 불가역적인 가교는 되지 않은 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 의약 조성물.
[3] 상기 미립자의 평균 입경이 10 ㎚ 이상 5000 ㎚ 이하인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 의약 조성물.
[4] 상기 수용성의 약물이, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신으로 이루어지는 군에서 선택되는 상기 [1]?[3] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[5] 상기 이온 결정성 화합물이, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 암모늄 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 양이온 전해질과, 염소 이온, 황산 이온, 젖산 이온, 아세트산 이온, 인산 이온, 글루콘산 이온, 탄산 이온, 중탄산 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 음이온 전해질을 구성 성분으로서 포함하는 상기 [1]?[4] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[6] 상기 이온 결정성 화합물에 대한 상기 수용성의 약물의 중량 비율이 0.001 이상 100 이하인 상기 [1]?[5] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[7] (c) 의약상 허용되는 폴리머를 더 포함하고,
상기 미립자가 소정의 pH에서 플러스 또는 마이너스의 전하를 가지며, 상기 폴리머가 상기 pH에서 상기 미립자와는 반대 부호의 전하를 가지며, 그것에 의해 상기 pH에서 상기 미립자와 상기 폴리머가 서로 정전 상호 작용하여 상기 폴리머가 상기 미립자의 표면에 부착된 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 상기 [1]?[6] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
[8] 상기 복합체의 평균 입경이 15 ㎚ 이상 6000 ㎚ 이하인 상기 [7]에 기재된 의약 조성물.
[9] 상기 [1]?[6] 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물의 제조 방법으로서,
상기 수용성의 약물과 상기 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을 감압하에서 비가열적으로 건조시키는 것을 포함하는 상기 제조 방법.
[10] 상기 건조가 동결 건조 또는 원심 농축 건조에 의한 것인 상기 [9]에 기재된 제조 방법.
[11] 상기 [7] 또는 [8]에 기재된 의약 조성물의 제조 방법으로서,
상기 수용성의 약물과 상기 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을 감압하에서 비가열적으로 건조시킴으로써 상기 미립자를 조제하는 것, 및,
상기 폴리머가 용해된 상기 pH를 갖는 용액과 상기 미립자를 혼합하는 것을 포함하는 상기 제조 방법.
[12] 상기 건조가 동결 건조 또는 원심 농축 건조에 의한 것인 상기 [11]에 기재된 제조 방법.
본 발명의 의약 조성물은, 상기 의약 조성물에 포함되는 미립자가, 적절한 입경을 가지며, 수용성의 약물(예, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신 등)을 미립자 내에서 집적화할 수 있으므로, 그와 같은 수용성의 약물을 포유동물에 대하여 경점막 또는 경피적으로 효율적으로 투여하는 것을 가능하게 할 수 있다.
또한, 미립자의 표면을 폴리머로 피복한 복합체를 포함하는 본 발명의 의약 조성물은, 상기 복합체가 높은 안정성(예, 보존 안정성, 효소에 대한 안정성 등)을 가지며, 또 조제 조건이나 폴리머의 종류에 따라서 약물의 방출 속도를 조절하는 것이 가능해지므로, 서방성 제제 용도 및 백신 용도를 위해 바람직한 방출 특성을 실현할 수 있다.
또, 본 발명의 제조 방법에 의하면, 수용성의 약물(예, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신 등)을 높은 수율로 미립자 내에 봉입할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하면, 동결 건조 등에 의해 수분을 제거한 건조 미립자를 용이하게 얻을 수 있고, 그것에 의해 수용성의 약물의 보존 안정성을 확보할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 2는 실시예 2에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 3은 비교예 1에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 4는 실시예 3에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 5는 비교예 2에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 6은 실시예 4에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 7은 실시예 5에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 8은 실시예 6에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 9는 실시예 7에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 10은 실시예 8에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 11은 실시예 9에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 12는 실시예 10에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 13은 실시예 11에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 직경으로 나타내고 있다.
도 14는 비교예 3에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 15는 비교예 4에서의 입경 측정 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은 입경치(㎚), 종축은 산란 강도 분포(인덱스치)를 나타낸다. 입경치를 입자의 반경으로 나타내고 있다.
도 16은 실시예 10의 미립자의 TEM 화상을 나타낸 도면이다.
도 17은 실시예 10의 TEM 화상의 미립자 내의 원소 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 실시예 11의 미립자의 TEM 화상을 나타낸 도면이다.
도 19는 실시예 11의 TEM 관찰 화상의 미립자 내의 원소 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 시험예 4에서의 키토산 피복 인슐린 미립자의 효소에 대한 안정성 시험의 결과를 나타낸 도면이다. 횡축은, 37℃에서의 30분간의 진탕 반응후의 인슐린 함유량의 초기 함유량에 대한 퍼센테이지를 나타낸다. 위로부터 순서대로, i) 표면 피복 미립자와 효소를 혼합한 시료, ii) 표면 피복 미립자와 버퍼를 혼합한 시료, iii) 인슐린 용액과 효소를 혼합한 시료, 그리고 iv) 인슐린 용액과 버퍼를 혼합한 시료에서의 결과를 나타내고 있다.
본 발명은, (a) 수용성의 약물과 (b) 실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있는 것을 특징으로 하는 의약 조성물을 제공한다.
상기 의약 조성물은, 예를 들어 경점막 또는 경피적인 투여를 위해 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물은, 처치(treatment) 및/또는 치료(therapy)를 필요로 하는 대상의 점막(예, 코, 구강, 눈, 질 및 위장관 등의 점막) 또는 피부에 대하여, 도포, 스프레이, 분무, 첩부 등 적절한 방법으로 투여할 수 있고, 약물이 점막 또는 피부 조직으로, 또는 점막 또는 피부 조직을 통하여 순환기계 또는 면역계로 송달되는 것에 의해 약효 또는 백신 효과 등을 가져올 수 있다.
상기 「수용성의 약물」은, 의약 조성물의 사용 목적에 따라서 적절하게 선택된다. 상기 약물은, 결정성이어도 좋고 비결정성이어도 좋다. 본 명세서에서 「수용성」이란, 물과 상온에서 상용성을 갖는 것을 의미하며, 상기 약물의 선택은, 상온의 물에 대하여 조금이라도 수용성을 나타내는 약물인 한 특별히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 의약 조성물에서 사용될 수 있는 수용성의 약물은 이하에 한정되지 않지만, 예를 들어, 25℃의 물(100 g)에 용해했을 때, 바람직하게는 0.0001 g 이상, 보다 바람직하게는 0.001 g 이상, 더욱 바람직하게는 0.01 g 이상 용해되는 것이다. 또, 상기 약물을 녹이는 용매로는, 단순한 물 이외에도, 유기 용매(에탄올 등)와 물의 혼합액, 또는 산 수용액, 알칼리 수용액을 이용할 수 있고, 약물의 화학적 특성에 따라서 적절한 용매를 적절하게 선택할 수 있다. 상기 약물로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 아세토니트릴 등의 물과 혼합 가능한 유기 용매에 녹는 약물, 또는 이들 유기 용매와 물의 혼합액에 녹는 약물이 바람직하다.
약물의 분자량에 관해서도 특별히 제한되지 않고, 저분자 화합물이어도 좋고, 고분자 화합물이어도 좋다. 또한, 본 명세서에서 말하는 저분자 화합물이란 분자량 500 D 미만의 화합물을 의미하며, 본 명세서에서 말하는 고분자 화합물이란, 분자량 500 D 이상의 화합물을 의미한다. 약물로는, 예를 들어, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신 등을 들 수 있다. 또는, 상기 약물로는, 예를 들어, 항고혈압제, 항저혈압제, 진통제, 항정신병제, 항울제, 항조제, 항불안제, 진정제, 최면제, 항전간제, 오피오이드 아고니스트, 천식 치료제, 마취제, 항부정맥제, 관절염 치료제, 진경제, ACE 인히비터, 울혈 제거제, 항생 물질, 항협심증제, 이뇨제, 항파킨슨병제, 기관지 확장제, 분만 촉진제, 항이뇨제, 항고지혈증제, 면역 억제제, 면역 조절제, 제토제, 항감염증제, 항신생물제, 항진균제, 항바이러스제, 항당뇨병제, 항알레르기제, 해열제, 항종양제, 항통풍제, 항히스타민제, 지양제, 골조절제, 심혈관제, 콜레스테롤 저하제, 항말라리아제, 흡연을 중지하기 위한 약제, 진해제, 거담제, 점액 용해제, 코막힘용 약제, 도파민 작동제, 소화관용 약제, 근이완제, 신경근 차단제, 부교감신경 작동제, 프로스타글란딘, 흥분약, 식욕 억제제, 갑상선제 또는 항갑상선제, 호르몬, 항편두통제, 항비만제 및 항염증제 등의 여러가지 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신 등을 들 수도 있다.
약물의 구체예로는, 이하에 한정되지 않지만, 인슐린, 글루카곤, 류프롤리드, 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 혈관 내피 성장 인자, 에리스로포이에틴, 헤파린, 시클로스포린, 옥시토신, 티로신, 엔케파린, 티로트로핀 방출 호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 바소프레신, 바소프레신 유사체, 카탈라아제, 수퍼옥시드 디스무타아제, 인터류킨 II, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 글루카곤형 펩티드-1, 글루카곤형 펩티드-2, 카타칼신, 콜레시스테키닌-12, 콜레시스테키닌-8, 엑센딘, 고나돌리베린 관련 펩티드, 인슐린형 단백질, 류신-엔케파린, 메티오닌-엔케파린, 로이모르핀(leumorphin), 뉴로피진, 코펩틴, 뉴로펩티드 Y, 뉴로펩티드 AF, PACAP 관련 펩티드, 췌장 호르몬, 펩티드 YY, 우로텐신, 장펩티드, 부신피질 자극 펩티드, 상피 성장 인자, 프로락틴, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 아고니스트, 성장 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 엔돌핀, 앤지오텐신, 티로트로핀 방출 호르몬, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-마크로퍼지 콜로니 자극 인자, 헤파리나제, 인플루엔자 백신용 항원, 파상풍 독소, 디프테리아 독소, 암항원 단백, 암항원 펩티드, β-아미로이드, 면역 글로불린, 간경변 치료용 siRNA, 암치료용 siRNA 및 브롬헥신, 그라니세트론, 졸미트립탄, 수마트립탄 등의 저분자 화합물 등, 그리고 이들의 약학적으로 허용되는 염 등을 들 수 있다. 또, 적절하게 2종류 이상의 약물을 공용하는 것도 가능하다.
상기 「실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물」의 선택은, 실온에서 고체이며 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물인 한 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 융점, 분해 온도 또는 승화 온도가 40℃ 이상인 화합물이 바람직하고, 100℃ 이상인 화합물이 보다 바람직하고, 200℃ 이상인 화합물이 더욱 바람직하다. 융점, 분해 온도 또는 승화 온도가 40℃ 미만인 것은 미립자 내에서 안정된 고체 결정이 될 수 없고, 수용성의 약물을 석출, 입자화시키는 능력도 작기 때문에 바람직하지 않다. 또, 상기 화합물의 융점, 분해 온도 또는 승화 온도의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 융점, 분해 온도 또는 승화 온도가 2000℃ 이하인 것이 바람직하고, 1800℃ 이하인 것이 보다 바람직하고, 1500℃ 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또, 전술한 바와 같이, 상기 미립자 내에서 상기 이온 결정성 화합물은 결정화하고 있다. 여기서 말하는 「결정화」는, 예를 들어 투과형 전자 현미경 등의 바람직한 장치에 의해 상기 수용성 화합물과 상기 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 관찰했을 때, 상기 미립자의 내부에, 상기 이온화 결정성 화합물의 결정이 산재하고 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 후술하는 실시예에서도 나타난 바와 같이, 예를 들어 XMA에 의해 결정의 원소 분석을 행하여, 결정이 상기 화합물에 의한 것인지의 여부를 확인할 수 있다. 미립자 내에서 이온 결정성 화합물이 결정화함으로써 염이 국소적으로 고농도로 포함되게 되고, 그것에 의해 염의 주위에 수용성의 약물이 효율적으로 석출되어 입자화할 수 있고, 약물끼리의 응집을 저해하여 미립자의 거대화를 방지하는 것도 가능하게 한다고 생각된다.
본 발명의 의약 조성물을 위해 사용될 수 있는 이온 결정성 화합물로는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들어, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 암모늄 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 양이온 전해질과, 염소 이온, 황산 이온, 젖산 이온, 아세트산 이온, 인산 이온, 글루콘산 이온, 탄산 이온, 중탄산 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 음이온 전해질을 구성 성분으로서 포함하는 이온 결정성 화합물을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 바람직한 이온 결정성 화합물의 예로서, 생체에 대한 안전성이 높고 염의 결정 형상의 규칙성이 높기 때문에 약물의 석출의 재현성을 양호하게 할 수 있다는 관점에서, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산암모늄, 황산나트륨을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에서의 상기 이온 결정성 화합물에 대한 상기 수용성 약물의 중량 비율은, 원하는 목적을 위해 바람직한 특성을 갖는 미립자를 얻을 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 전형적으로는 0.001 이상 100 이하, 바람직하게는 0.005 이상 50 이하, 보다 바람직하게는 0.01 이상 10 이하이다. 이러한 중량 비율을 선택함으로써, 효율적으로 약물의 석출 및 염결정의 생성을 실현할 수 있다.
상기 미립자 내의 수분 함량은 주위의 상태에 따라 변동하며, 예를 들어 건조 상태에서는 무시할 수 있는 함량이지만, 수중에서는 약간의 수분이 상기 미립자 내에 침투해 있다고 생각된다. 수중에서의 미립자 내의 수분 함량은, 미립자의 구조 및 특성에 본질적으로는 관계되지 않기 때문에, 미립자 내의 수분 함량의 범위도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.01?99.99 중량%이다.
또, 상기 미립자는, 전술한 바와 같이 생리 활성 및 면역 원성 등의 관점에서, 공유 결합과 같은 불가역적인 가교는 되지 않은 것이 바람직하다. 여기서 말하는 불가역적인 가교에는, 수분 첨가에 의해 가역적으로 해리할 수 있는 의사 가교(예를 들어, 정전 상호 작용)는 포함되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물에서의 미립자의 크기로는, 바람직하게는 10?5000 ㎚, 보다 바람직하게는 20?4000 ㎚, 더욱 바람직하게는 50?3000 ㎚의 평균 입경을 들 수 있다. 미립자의 크기가 5000 ㎚보다 커지면, 동량의 약물을 투여할 때, 미립자의 수가 적어지고, 미립자의 표면적의 합계가 작아지고, 약물의 방출 속도가 작아지기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 백신용 입자로서 사용하는 경우의 면역 담당 세포로의 흡수 효율이 나빠진다는 점에서도 바람직하지 않다. 또, 미립자의 크기가 10 ㎚보다 작아지면, 미립자 1개당 포함되는 약물의 양이 지나치게 적어, 투여한 후의 약리 효과 또는 백신 효과가 약해지기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 제조시나 사용시에, 미립자끼리 응집하기 쉬워져 취급이 어렵다는 점에서도 바람직하지 않다.
또한, 여기서 말하는 입경은, 미립자를 수중에 분산시켜 측정한 값이며, 미립자의 형상을 구라고 가정하여 산출한 직경을 말한다. 구체적으로는, 입경을 동적 광산란 측정 장치에 의해 측정하고, 산란 강도 분포로부터 구한 유체 역학적 직경의 평균치를 평균 입경으로서 채택한다. 여기서, 미립자의 평균 입경이 예를 들어 10 ㎚ 이상이라는 것은, 상기 동적 광산란 측정 장치의 산란 강도 분포의 각 입경 피크의 비율(총피크 누적 산란 강도에 대한 각 입경 피크의 누적 산란 강도의 비율)에서, 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 특히 바람직하게는 50% 이상의 피크의 평균 입경이 10 ㎚ 이상인 것을 말한다.
본 발명의 의약 조성물은 또한, 의약상 허용되는 폴리머를 포함할 수 있다. 그 경우, 상기 미립자를 소정의 pH에서 플러스 또는 마이너스의 전하를 갖는 것으로 하여 구성하고, 상기 폴리머로서 상기 pH에서 상기 미립자와는 반대 부호의 전하를 갖는 폴리머를 선택함으로써, 상기 pH에서 상기 미립자와 상기 폴리머를 서로 정전 상호 작용시켜 상기 폴리머가 상기 미립자의 표면에 부착된 복합체를 형성하는 것이 가능해질 수 있다.
즉, 본 발명은 또한, (a) 수용성의 약물과 (b) 실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있고,
또한, 상기 의약 조성물은, (c) 의약상 허용되는 폴리머를 포함하고,
상기 미립자가 소정의 pH에서 플러스 또는 마이너스의 전하를 가지며, 상기 폴리머가 상기 pH에서 상기 미립자와는 반대 부호의 전하를 가지며, 그것에 의해 상기 pH에서 상기 미립자와 상기 폴리머가 서로 정전 상호 작용하여 상기 폴리머가 상기 미립자의 표면에 부착된 복합체를 형성하고 있는 것인 상기 의약 조성물을 제공한다.
미립자가 소정의 pH에서 플러스 또는 마이너스의 전하를 갖는 것이 되는 한, 본 실시형태에서도 전술한 바와 같은 수용성 약물, 이온 결정성 화합물 및 미립자를 사용할 수 있다.
또한, 이하에서는, 미립자의 표면에 폴리머가 부착되어 있는 것을, 폴리머에 의해 미립자가 「피복」되어 있다는 등으로 표현하는 경우도 있고, 또 폴리머가 미립자의 표면에 부착된 복합체를 「표면 피복 미립자」로 부르는 경우도 있다. 또한, 폴리머에 의해 피복되지 않은 미립자를, 표면 피복 미립자와 명시적으로 구별하기 위해, 이하에서는「코어 미립자」 또는 단순히 「코어 입자」로 부르는 경우도 있다. 폴리머에 의한 코어 미립자의 피복은, 코어 미립자의 표면에 폴리머가, 미립자와 폴리머 사이의 정전 상호 작용에 의해 부착되어 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
표면 피복 미립자를 구성하는 의약상 허용되는 폴리머(이하, 「표면 피복 폴리머」로도 칭함)는 생체 적합성인 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 「생체 적합성」이란, 어떤 물질 및 그 분해 산물이, 생체 조직 또는 생체 시스템(예, 혈액 순환계, 신경계, 면역계 등)에 대하여 중독적 또는 손상적인 영향을 미치지 않는 것 및 과도한 면역적인 거부 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 생체 적합성의 폴리머는, 인간 또는 다른 동물에 투여하기에 적합한 것이다. 상기 폴리머는 또한 생체내 분해성인 것이 보다 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 「생체내 분해성」이란, 어떤 물질이 효소적, 화학적 또는 물리적 프로세스 등에 의해 생체내에서 허용되는 시간내에 분해되어, 보다 작은 화학종을 형성하는 것을 의미한다. 어떤 물질의 생체 적합성 및 생체내 분해성을 검사하는 방법은 상기 기술분야에서 주지되어 있다.
표면 피복 폴리머는, 천연 폴리머이어도 좋고 또는 합성 폴리머이어도 좋다. 표면 피복 폴리머는, 소정의 pH에서 미립자의 표면에서 미립자와 정전 상호 작용하기 때문에, 상기 pH에서 미립자와 반대 전하를 갖는 폴리머이어야 한다. 상기 pH에서 동일한 부호로 대전할 수 있는 폴리머끼리라면, 필요에 따라 2종류 이상의 폴리머를 표면 피복 폴리머를 위해 병용할 수도 있다.
표면 피복 미립자를 포함하는 본 발명의 의약 조성물은, 예를 들어 후술하는 제조법에 의해 제조될 수 있지만, 상기 제조법에 의해 제조하는 경우, 상기 소정의 pH에서 표면 피복 폴리머가 단독으로는 난수용성이라 하더라도, 표면 피복 폴리머가 이(易)수용성인 pH에서 미립자와 혼합한 후, 상기 혼합액의 pH를 상기 소정의 pH로 조정함으로써 제조가 가능하다. 따라서, 표면 피복 폴리머로는, 상기 소정의 pH에서 이수용성인 폴리머 뿐만 아니라, 상기 소정의 pH에서 난수용성인 폴리머도 사용될 수 있다.
표면 피복 폴리머에 사용될 수 있는 폴리머로는, 이하에 한정되지 않지만, 폴리 음이온성 또는 폴리 양이온성의 다당, 폴리아미노산 및 그 밖의 대전된 폴리머를 들 수 있고, 사용되는 약물의 종류나 전하 등에 따라서 적절하게 선택된다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리 음이온성의 다당이란, 카르복실기, 황산기 또는 인산기 등의 1개 이상의 산성 극성기를 구성 단위중에 갖는 다당류이다. 그와 같은 폴리 음이온성의 다당의 예로는, 이하에 한정되지 않지만, 콘드로이친황산, 덱스트란황산, 카르복시메틸셀루로오스, 알긴산, 펙틴, 히알루론산, 이들의 유도체나 염 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리 양이온성의 다당이란, 아미노기 등의 1개 이상의 염기성 극성기를 구성 단위 중에 갖는 다당류이다. 그와 같은 폴리 양이온성의 다당의 예로는, 이하에 한정되지 않지만, 키틴, 키토산, 이들의 유도체나 염 등을 들 수 있다. 키토산 및 키토산 유도체는, 여러가지 분자량 및 탈아세틸화의 정도의 것에서 선택할 수 있고, 또 키토산 유도체에 관해서는, 여러가지 치환의 정도의 것에서 선택할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리 음이온성의 폴리아미노산이란, 등전점이 생리적 pH보다 산성측에 있는 폴리아미노산이며, 그 예로는, 이하에 한정되지 않지만, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산, 이들의 유도체나 염 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리 양이온성의 폴리아미노산이란, 등전점이 생리적 pH보다 염기성측에 있는 폴리아미노산이며, 그 예로는, 이하에 한정되지 않지만, 폴리리신, 폴리아르기닌, 이들의 유도체나 염 등을 들 수 있다.
표면 피복 폴리머에 사용될 수 있는 폴리머로서, 상기 다당 및 폴리아미노산 이외에, 폴리에틸렌이민이나 폴리아크릴산, 이들의 유도체나 염 등도 들 수 있다.
표면 피복 폴리머는, 폴리에틸렌글리콜화(PEG화) 및/또는 글리코실화되어 있어도 좋다.
표면 피복 폴리머는, 점막 부착성이어도 좋고 및/또는 경점막 흡수 촉진 인자로서 기능해도 좋다. 점막 부착성 폴리머로는, 예를 들어, 키토산, 폴리아크릴산, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 등 외에, 이들의 PEG화된 폴리머류 등을 들 수 있다. 또, 경점막 흡수 촉진 인자로서 기능하는 폴리머로는, 예를 들어, 키토산, 폴리아크릴산, 폴리아르기닌, 이들의 염이나 유도체 등을 들 수 있다.
표면 피복 폴리머의 분자량은, 분해 속도, 기계 강도, 용해도, 표면 피복 폴리머와 함께 복합체를 형성하게 되는 미립자의 종류 등의 요소를 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 전형적으로는, 겔침투 크로마토그래피법에 의해 측정한 표면 피복 폴리머의 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 1,000 Da 이상, 보다 바람직하게는 2,000 Da 이상이어야 하고, 또 바람직하게는 1,000,000 Da 이하, 보다 바람직하게는 500,000 Da 이하이어야 한다. 따라서, 전형적으로는 표면 피복 폴리머의 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 1,000?1,000,000 Da이고, 보다 바람직하게는 2,000?500,000 Da이다. 또, 예를 들어 키틴 또는 키토산의 중량 평균 분자량은 1,000?1,000,000 Da일 수 있고, 키틴 또는 키토산의 탈아세틸화의 정도는 20?100%일 수 있다.
표면 피복 미립자의 크기로는, 바람직하게는 15?6000 ㎚, 보다 바람직하게는 25?5000 ㎚, 더욱 바람직하게는 55?4000 ㎚의 평균 입경을 들 수 있다. 표면 피복 미립자의 크기가 6000 ㎚보다 커지면, 백신용 미립자로서 사용하는 경우의 면역 담당 세포로의 흡수 효율이 나빠지기 때문에 바람직하지 않다. 또, 표면 피복 미립자의 크기가 15 ㎚보다 작아지면, 제조시나 사용시에 미립자끼리 응집하기 쉬워져 취급이 어렵기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 여기서 말하는 입경은, 표면 피복 미립자를 수중에 분산시켜 측정한 값이며, 표면 피복 미립자의 형상을 구라고 가정하여 산출한 직경을 말한다. 구체적으로는, 입경을 동적 광산란 측정 장치에 의해 측정하고, 산란 강도 분포로부터 구한 유체 역학적 직경의 평균치를 평균 입경으로서 채택한다. 여기서, 표면 피복 미립자의 평균 입경이 예를 들어 15 ㎚ 이상이라는 것은, 상기 동적 광산란 측정 장치의 산란 강도 분포의 각 입경 피크의 비율(총피크 누적 산란 강도에 대한 각 입경 피크의 누적 산란 강도의 비율)에서, 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 특히 바람직하게는 50% 이상의 피크의 평균 입경이 15 ㎚ 이상인 것을 말한다.
또, 표면 피복 미립자에서의 코어 미립자의 입경에 관해서는, TEM, SEM, AFM 등의 현미경으로 관찰한 입경치를 채택할 수도 있다.
표면 피복 미립자를 포함하는 본 발명의 의약 조성물에서, 약물, 이온 결정성 화합물 및 표면 피복 폴리머의 바람직한 조성비는, 사용하는 약물, 이온 결정성 화합물 및 표면 피복 폴리머의 종류, 그리고 코어 미립자의 사이즈 등에 따라서 변동하기 때문에 일률적으로는 말할 수 없지만, 상기 조성비는 의약 조성물 중의 중량비로서, 예를 들어 약물 : 이온 결정성 화합물 : 표면 피복 폴리머=1 : 0.01?1000 : 0.1?1000일 수 있다.
상기 소정의 pH는, 본 발명의 의약 조성물이 생체에 투여되었을 때 국소 자극을 회피하기 위해, 투여 부위의 바람직한 생리적 pH로 설정하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 의약 조성물은, 폐, 구강, 눈, 질, 장 및 코 등의 점막 또는 피부에 투여될 수 있지만, 이들 여러가지 점막 또는 피부의 생리적 pH는 다양하다. 예를 들어, 위장관의 생리적 pH는 그 길이에 따라서, 위에서의 약 pH 1부터 결장에서의 pH 8까지 상승한다; 구강은 6.8 부근의 pH를 갖는다; 코의 유체의 pH는 약 pH 5.5?6.5의 범위에 걸친다; 질의 pH는 4.5 부근이다. 예를 들어, 본 발명의 의약 조성물이 비(鼻)점막 투여용인 경우, 그 바람직한 pH값으로서 약 6.0을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 미립자(즉, 코어 미립자 또는 표면 피복 미립자)가 표적 부위에 직접 도달할 수 있는 제제 형태이면 되고, 경폐 투여제, 경구 투여제, 구강내 투여제, 안내 투여제, 질내 투여제, 비강내 투여제, 좌제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.
경폐 투여제로는, 임의의 폐용 흡입기에 의해 폐포에 송달되는 흡입제가 바람직하다.
경구 투여제로는, 통상의 경구 투여 제제, 예를 들어 정제, 과립제, 세립제, 캡슐제 등이지만, 소장내에서 약물이 방출되도록 고안된 제형, 예를 들어 장용성 정제, 장용성 과립제, 장용성 캡슐제, 장용성 세립제가 바람직하다.
구강내 투여제, 안내 투여제 및 비강내 투여제로는, 구강 정제, 구강 스프레이, 점안제, 점비제, 에어졸, 연고제, 겔제, 크림제, 액제, 현탁액제, 로션제, 드라이 파우더제, 시트제, 첩부제 등을 들 수 있다.
질내 투여제 및 좌제로는, 연고제, 겔제, 크림제, 액제, 현탁액제, 로션제, 드라이 파우더제, 시트제, 캡슐제 등을 들 수 있다.
경피 흡수제로는, 약물이 피부로부터 흡수되는 것을 가능하게 하는 제형이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 연고제, 겔제, 크림제, 겔형 크림제, 액제, 로션제, 에어졸제, 리니먼트제, 플라스터제, 습포제, 리저버형 패치 등을 들 수 있다. 이들 제형을 단독으로 비칩습적으로 이용해도 좋고, 마이크로니들이나 각질 박리 테이프, 어블레이션 등의 칩습적 디바이스와 조합하여 이용해도 좋다.
상기 제형으로 제조하는 방법으로는, 상기 분야에서 일반적으로 이용되고 있는 공지의 제조 방법을 적용할 수 있다. 또, 상기 제형으로 제조하는 경우에는, 필요에 따라 특정한 제형으로 제조할 때 통상 이용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등의 담체, 감미제, 계면활성제, 현탁화제, 유화제, 착색제, 보존제, 안정제 등의 각종 제제 첨가물 등을 적절하게 적량 함유시켜 제조할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 현탁액을 동결 건조시키거나 하여 드라이 파우더화한 상태로 보존하고, 사용시에 상기 드라이 파우더에 물을 첨가하여 재현탁할 수도 있다. 이러한 방법을 채택함으로써, 의약 조성물의 보존안정성을 향상시키기 위해 가수분해를 회피하는 것이 가능해진다.
본 발명의 의약 조성물에서의 미립자(즉, 코어 미립자 또는 표면 피복 미립자)의 비율은, 0.01?100 중량%인 것이 바람직하고, 0.1?100 중량%인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은, 안정적이며 저독성이어서 안전하게 사용할 수 있다. 그 투여 빈도 및 1회 투여량은, 사용하는 약물, 환자의 상태나 체중, 투여 경로, 치료 방침 등에 따라 상이하여 일률적으로는 말할 수 없지만, 예를 들어, 당뇨병 등의 환자에게 약물로서 인슐린을 사용한 본 발명의 의약 조성물을 경비 투여하는 경우에는, 하나의 치료 방침으로서, 성인(체중 약 60 kg)에 대하여 유효 성분(인슐린)으로서 약 2~약 6 ㎎을 매식사 전에 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 의약 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 단, 본 발명의 의약 조성물은, 이하에 설명하는 방법 이외의 제조 방법에 의해서도 제조될 수 있는 것에 유의해야 한다.
상기 코어 미립자의 조제는, 상기 수용성의 약물과 상기 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을 감압하에서 비가열적으로 건조시키는 것을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다.
약물과 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액에서의 약물의 농도는, 바람직하게는 0.01?30 중량%, 보다 바람직하게는 0.05?20 중량%이다. 약물의 농도가 0.01 중량%보다 낮은 경우, 제조되는 의약 조성물에서의 약물의 조성비가 작아지고, 제조의 수율이 낮다는 점에서 바람직하지 않다. 약물의 농도가 30 중량%보다 높은 경우, 건조에 의한 입자화에서 작은 사이즈의 입경으로 할 수 없다는 점에서 바람직하지 않다.
또, 약물과 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액에서의 이온 결정성 화합물의 농도는, 바람직하게는 0.1?50 중량%, 보다 바람직하게는 0.5?30 중량%이다. 이온 결정성 화합물의 농도가 0.1 중량%보다 낮은 경우, 약물의 석출 및 입자화를 효율적으로 일으킬 수 없다는 점에서 바람직하지 않다. 이온 결정성 화합물의 농도가 50 중량%보다 높은 경우, 건조를 행하기 전의 단계에서 약물의 석출이 시작하여, 작은 사이즈의 코어 미립자로 할 수 없다는 점에서 바람직하지 않다.
전술한 바와 같이, 상기 방법에서는 감압하에서의 비가열적인 건조가 행해진다. 여기서 말하는 「건조」란, 실질적으로 완전 또는 부분적으로 상기 수용액으로부터 수분을 제거하는 조작을 의미한다.
감압하에서의 건조는, 바람직하게는 0?10000 Pa, 보다 바람직하게는 0?600 Pa, 더욱 바람직하게는 0?200 Pa의 압력하에 행해진다. 10000 Pa보다 높은 압력에서는, 수분을 효율적으로 제거할 수 없기 때문에 바람직하지 않다.
또, 상기 방법에서의 비가열적인 건조는, 바람직하게는 -200℃?40℃, 보다 바람직하게는 -100℃?35℃의 온도 조건하에서 행해진다. 40℃보다 높은 온도에서 건조를 행한 경우, 약물의 용해성이 향상되고, 건조 조작에 의한 약물의 석출 및 입자화의 속도가 지연되어, 그 결과 입경이 커져 버리기 때문에 바람직하지 않다.
상기 건조를 행하기 위해, 동결 건조 또는 원심 농축 건조를 이용할 수 있다.
상기 제조 방법에서의 동결 건조는, 상기 약물과 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을, 냉동고 또는 액체 질소를 이용하여 급속하게 냉각시켜 동결하고, 동결된 것을 신속하게 동결 건조기에 셋팅하여 감압하에서 비가열적으로 수분을 제거함으로써 행할 수 있다. 상기 조작에 의해, 상기 코어 미립자를 조제하는 것이 가능하다. 동결 건조기로는, 상기 기술분야에서 사용되는 임의의 종류의 것을 적절하게 사용하면 되지만, 예를 들어 야마토카가쿠 제조의 프리즈 드라이어 DC400을 들 수 있다. 동결 건조를 이용한 제조 방법에서는, 상기 수용액을 냉동고 또는 액체 질소를 이용하여 급속하게 냉각시켜 동결함으로써, 급속하게 약물을 불용화시켜 석출시키는 것이 가능하고, 그 결과, 보다 입경이 작은 코어 미립자를 제조할 수 있다는 점에서 바람직하다. 또, 동결 건조를 이용함으로써, 스케일업 생산이 가능해지는 점에서도 바람직하다.
상기 제조 방법에서의 원심 농축 건조는, 상기 약물과 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을, 적당한 원심 농축 건조기를 이용하여, 원심 처리하면서 감압하에 비가열적으로 건조시키는 것에 의해 수분을 제거함으로써 행할 수 있다. 상기 조작에 의해 상기 코어 미립자를 조제하는 것이 가능하다. 원심 농축 건조기로는, 상기 기술분야에서 사용되는 임의의 것을 적절하게 사용하면 되지만, 예를 들어 Jouan concentrator evaporator system(RC10.22)이나 eppendorf사 제조 Concentrator 5301을 들 수 있다. 원심 농축 건조를 이용한 제조 방법은, 상온에서의 수분 제거에 의한 약물의 석출 및 입자화가 가능하므로, 동결 건조 조작이 약물의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 경우 등, 동결 건조를 피하고자 하는 경우의 대체 수단으로서 이용할 수 있다.
상기 표면 피복 미립자의 조제는, 상기와 같이 하여 얻어진 코어 미립자를, 표면 피복 폴리머가 용해된 상기 소정의 pH를 갖는 용액과 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 행할 수 있다. 또는, 표면 피복 폴리머가 상기 pH에서는 난용성인 경우, 표면 피복 폴리머가 이용성인 pH에서 용액 중에 표면 피복 폴리머를 용해시키고, 이어서 코어 미립자와 혼합한 후, 혼합액의 pH를 상기 소정의 pH로 조정하는 것을 포함하는 방법에 의해, 표면 피복 미립자를 조제하는 것도 가능하다. 이러한 방법에 의해, 표면 피복 미립자의 현탁액을 얻을 수 있다. 얻어진 현탁액을 투석해도 좋고, 또는 투석하지 않아도 좋다.
전술한 바와 같은 방법으로 얻어진 코어 미립자 또는 표면 피복 미립자의 현탁액으로부터, 상기와 같은 적당한 제형으로 제조하는 방법으로는, 상기 기술분야에서 일반적으로 이용되고 있는 공지의 방법을 사용할 수 있다. 또, 전술한 바와 같이, 상기 제형으로 제조하는 경우에는, 필요에 따라 특정한 제형으로 제조할 때 통상 이용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등의 담체, 감미제, 계면활성제, 현탁화제, 유화제, 착색제, 보존제, 안정제 등의 각종 제제 첨가물 등을 적절하게 적량 함유시켜 제조할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 현탁액을 동결 건조시키거나 하여 드라이 파우더화한 상태로 제조해도 좋다.
이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예 등에 의해 제한되지 않는다.
실시예
이하의 실시예 및 비교예에서, 현탁액 중의 입자의 입경의 측정은, DLS802(Viscotek) 또는 ELS-8000(오오츠카덴시)을 이용하여 동적 광산란법에 의해 행했다. 또, 각 시료의 입자의 제타 전위의 측정은 Zeta sizer nano(Malvern)를 이용하여 행했다.
실시예 1 : 원심 농축 건조에 의한 피복되지 않은 인슐린 코어 입자의 조제
본 실시예에서는, 단백질 약물로서 인슐린(등전점(pI)=5.3)을 사용하고, 원심 농축에 의해 이온 결정성 화합물을 함유하는 인슐린 용액으로부터 수분을 제거함으로써 인슐린을 석출시켜, 인슐린 코어 입자(피복 없음)를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 58 ㎎/㎖, 염화아연 1.4 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 2 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 물 2 ㎖를 첨가하여 입경 측정용 현탁액을 조제했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 730 ㎚이었다(도 1). 따라서, 상기 조제법에 의해, 작은 입경의 코어 입자를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6에서 -10 mV였다. pH 6에서의 인슐린의 마이너스 대전을 반영하여 코어 입자로서도 마이너스로 대전했다.
실시예 2 : 동결 건조에 의한 피복되지 않은 인슐린 코어 입자의 조제
본 실시예에서는, 단백질 약물로서 인슐린(pI=5.3)을 사용하고, 동결 건조에 의해 이온 결정성 화합물을 함유하는 인슐린 용액으로부터 수분을 제거함으로써 인슐린을 석출시켜, 인슐린 코어 입자(피복 없음)를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 58 ㎎/㎖, 염화아연 1.4 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 2 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮겨 액체 질소로 동결시킨 후, 동결 건조기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 물 2 ㎖를 첨가하여 입경 측정용 현탁액을 조제했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 180 ㎚이었다(도 2). 따라서, 상기 조제법에 의해서도, 작은 입경의 코어 입자를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
비교예 1 : 냉각에 의한 피복되지 않은 인슐린 코어 입자의 조제
본 비교예에서는, 단백질 약물로서 인슐린(pI=5.3)을 사용하고, 냉각에 의해 이온 결정성 화합물을 함유하는 인슐린 용액으로부터 인슐린을 석출시켜, 인슐린 코어 입자(피복 없음)의 조제를 시도했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 소량 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮겨 4℃에서 하룻밤 냉장함으로써 결정을 석출시켜, 인슐린 입자의 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 입자의 직경은, 인슐린 수 분자가 모인 것 뿐이라고 생각되는 6 ㎚부터 큰 응집물까지 입경이 다양하게 분포되어 있어, 입경의 제어가 충분히 행해지지 않는다는 것을 알 수 있다(도 3).
실시예 3 : 원심 농축 건조 및 냉각에 의한 피복되지 않은 인슐린 코어 입자의 조제
본 실시예에서는, 단백질 약물로서 인슐린(pI=5.3)을 사용하고, 원심 농축에 의해 이온 결정성 화합물을 함유하는 인슐린 용액으로부터 수분의 일부를 제거함으로써 인슐린을 석출시키고, 또한 냉각에 의해 석출을 촉진시켜 인슐린 코어 입자(피복 없음)를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 소량 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮겨 원심 농축기로 비가열, 감압하에 15분간만 건조 조작을 행하여, 수분의 일부만을 제거했다. 그 후, 4℃에서 하룻밤 냉장하여 결정의 석출을 계속하여, 인슐린 입자의 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 390 ㎚이었다(도 4). 따라서, 완전히 건고시키지 않더라도 조금이라도 비가열, 감압하에서의 건조 조작을 행함으로써, 입경이 일정한 양호한 입경의 인슐린 코어 입자를 얻을 수 있다는 것이 확인되었다.
비교예 2 : 이온 결정성 화합물을 함유하지 않는 인슐린 용액을 원심 농축 건조시키는 것에 의한 인슐린 코어 입자의 조제
본 비교예에서는, 단백질 약물로서 인슐린(pI=5.3)을 사용하고, 원심 농축 건조에 의해 이온 결정성 화합물을 함유하지 않는 인슐린 용액으로부터 수분을 제거함으로써 인슐린을 석출시켜, 인슐린 코어 입자(피복 없음)의 조제를 시도했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 첨가물 용액(시트르산삼나트륨이수화물 58 ㎎/㎖, 염화아연 1.4 ㎎/㎖) 2 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮겨 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 물 2 ㎖를 첨가하여 입경 측정용 현탁액을 조제했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 3200 ㎚이었다(도 5). 코어 입자의 표면을 피복한 경우에는 그 이상의 크기가 되므로, 입경이 여기까지 크면, 본 발명에서 목적으로 하는 사용법, 특히 백신 용도의 사용에는 적합하다고 할 수 없어 바람직하지 않다.
실시예 1?3 및 비교예 1?2의 결과에서, 인슐린 용액에 이온 결정성 화합물을 첨가해 두는 것과, 감압하 비가열에서의 건조에 의해 인슐린을 석출시키는 것이, 적절한 입경의 인슐린 코어 입자(피복 없음)를 조제하기 위해 유효하다는 것을 알 수 있다. 감압하 비가열에서의 건조에 의해, 인슐린의 석출과 동시 진행으로 이온 결정성 화합물이 석출되어, 석출된 인슐린의 과도한 응집 및 거대화를 방지하고 있다고 생각된다.
실시예 4 : 원심 농축 건조에 의해 조제된 인슐린 코어 입자를 키토산으로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제
본 실시예에서는, 원심 농축 건조에 의해 조제한 인슐린 코어 입자를 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 58 ㎎/㎖, 염화아연 1.4 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 2 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 1%(w/v)로 조제한 키토산 수용액(다이니치세이카코교 제조, 키토산 수용액)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시키고, 투석 튜브(분자량 컷오프값 10000)에 넣고, 500 ㎖의 5 mM MES 버퍼(pH 6.0)에 대하여 60분간 투석했다. 투석후의 현탁액을 시료로서 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 1800 ㎚이었다(도 6). 동일한 방법으로 조제된 실시예 1의 인슐린 코어 입자에 비해 입경이 커졌다.
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6에서 +19 mV였다. 실시예 1의 인슐린 코어 입자가, pH 6에서의 인슐린의 마이너스 대전을 반영하여 마이너스로 대전된 데 비해, 본 실시예에서 얻어진 미립자의 대전은, pH 6에서의 키토산의 플러스 대전에 유래하여 플러스 대전이 되었다.
이러한 점에서, 키토산에 의한 인슐린 코어 입자의 피복은 양호하다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 : 동결 건조에 의해 조제된 인슐린 코어 입자를 키토산으로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제
본 실시예에서는, 동결 건조에 의해 조제한 인슐린 코어 입자를 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 58 ㎎/㎖, 염화아연 1.4 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 2 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮겨 액체 질소로 동결시킨 후, 동결 건조기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 1%(w/v)로 조제한 키토산 수용액(다이니치세이카코교 제조, 키토산 수용액)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시키고, 투석 튜브(분자량 컷오프값 10000)에 넣고, 500 ㎖의 5 mM MES 버퍼(pH 6.0)에 대하여 60분간 투석했다. 투석후의 현탁액을 시료로서 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 1500 ㎚이었다(도 7). 동일한 방법으로 조제된 실시예 2의 인슐린 코어 입자에 비해 입경이 커졌다.
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6에서 +17 mV였다.
이러한 점에서, 동결 건조에 의한 방법으로도, 실시예 4와 마찬가지로 입경이 작은 표면 피복 미립자를 얻을 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 6 : 인슐린 코어 입자를 DMAEMA - PEG 로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제(투석 없음)
본 실시예에서는, 원심 농축 건조에 의해 조제한 인슐린 코어 입자를 DMAEMA-PEG로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다. 조제시에 투석은 행하지 않았다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산삼나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 소량 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 완전히 제거했다. 그 건고물에 0.1% w/v의 DMAEMA-stat-PEGMA 수용액(pH 6.0)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시켜 시료로 했다.
또한, DMAEMA-stat-PEGMA는 하기의 화학식
Figure pct00001
을 갖는 화합물이다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 260 ㎚이었다(도 8).
실시예 7 : 인슐린 코어 입자를 DMAEMA - PEG 로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제(투석 있음)
실시예 6과 동일하게 하여 조제한 현탁액을 투석 튜브(분자량 컷오프값 10000)에 넣고, 500 ㎖의 0.5 mM 시트르산 용액(pH 6.0)에 대하여 60분간 투석했다. 투석후의 현탁액을 시료로서 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 260 ㎚이었다(도 9).
실시예 6 및 7에서는, 표면 피복 폴리머로서 DMAEMA-PEG를 사용했지만, 그 경우도 투석의 유무에 상관없이, 입경이 작은 안정된 표면 피복 미립자를 조제할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 8 : 인슐린 코어 입자를 PEG 수식 키토산으로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제
본 실시예에서는, 원심 농축 건조에 의해 조제한 인슐린 코어 입자를 PEG 수식 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산삼나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 소량 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 완전히 제거했다. 그 건고물에 PEG 수식 키토산(Carbomer. Inc.사 제조)의 0.1% w/v 수용액(pH 6.0)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시켜 시료로 했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 510 ㎚이었다(도 10).
표면 피복 폴리머로서 PEG 수식 키토산을 사용한 경우도, 입경이 작은 안정된 표면 피복 미립자를 조제할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 9 : 난백 알부민 코어 입자를 키토산으로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제
본 실시예에서는, 원심 농축 건조에 의해 조제한 난백 알부민 코어 입자를 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
난백 알부민(Sigma) 24 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 2.4 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 59 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 1.6 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 1.5%(w/v)의 키토산 수용액(다이니치세이카코교 제조, 키토산 수용액)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시키고, 투석 튜브(분자량 컷오프값 10000)에 넣고, 500 ㎖의 5 mM MES 버퍼(pH 6.0)에 대하여 60분간 투석했다. 투석후의 현탁액을 시료로서 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 600 ㎚이었다(도 11).
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6에서 +12 mV였다.
본 실시예에서는, 단백질 약물로서 난백 알부민을 사용하고, 염화아연을 제거하여 원심 농축 건조에 의해 피복 입자를 조제했지만, 그 경우도 입경이 작은 표면 피복 미립자를 조제할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 10 : 난백 알부민 코어 입자를 양이온계 키토산 유도체로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제(투석 없음)
본 실시예에서는, 동결 건조에 의해 조제한 난백 알부민 코어 입자를 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다. 조제시에 투석은 행하지 않았다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
난백 알부민(Sigma) 24 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 2.4 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 59 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 1.6 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 액체 질소로 동결시킨 후, 동결 건조기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 1.1%(w/v)의 양이온계 키토산 유도체 수용액(다이니치세이카코교 제조, 양이온계 키토산 유도체)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시켜 표면 피복 미립자를 얻었다. 그 후 5 mM MES 버퍼(pH 6.5)를 첨가하고 희석하여 난백 알부민 농도 62.5 ㎍/㎖의 시료를 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 260 ㎚이었다(도 12).
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6.5에서 +21 mV였다.
실시예 11 : 난백 알부민 코어 입자를 양이온계 키토산 유도체로 피복하는 것에 의한 표면 피복 미립자의 조제(투석 있음)
본 실시예에서는, 동결 건조에 의해 조제한 난백 알부민 코어 입자를 키토산으로 피복함으로써, 표면 피복 미립자를 조제했다. 조제시에 투석을 행했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
난백 알부민(Sigma) 24 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 2.4 ㎖를 첨가하여 용해하고, 염용액(시트르산삼나트륨이수화물 59 ㎎/㎖, 염화나트륨 180 ㎎/㎖) 1.6 ㎖를 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 0.25 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 액체 질소로 동결시킨 후, 동결 건조기로 비가열, 감압하에 수분을 제거하여 건고시켰다. 그 건고물에 1.1%(w/v)의 양이온계 키토산 수용액(다이니치세이카코교 제조, 양이온계 키토산 유도체)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시키고, 투석 튜브(분자량 컷오프값 10000)에 넣고, 500 ㎖의 5 mM MES 버퍼(pH 6.5)에 대하여 30분간의 투석을 2회 반복했다. 투석후의 현탁액을 시료로서 얻었다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 484 ㎚이었다(도 13).
또, 얻어진 현탁액 중의 입자의 제타 전위를 측정한 바, 제타 전위는 pH 6.5에서 +21 mV였다.
실시예 10 및 11에서는, 단백질 약물로서 난백 알부민을, 표면 피복 폴리머로서 양이온계 키토산 유도체를 사용했지만, 그 경우도 투석의 유무에 상관없이, 입경이 작은 안정된 표면 피복 미립자를 조제할 수 있다는 것이 확인되었다.
비교예 3 : 폴리머 대신 Tween80 을 사용한 미립자의 조제
본 비교예에서는, DMAEMA-stat-PEGMA 수용액 대신 Tween80을 사용하는 것 외에는 실시예 6과 동일한 방법으로 표면 피복 미립자의 조제를 시도했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산삼나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, NaOH(0.1 M)를 소량 첨가하여 pH를 6.25로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 완전히 제거했다. 그 건고물에 Tween80의 0.1% w/v 수용액(pH 6.0)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시켜 시료로 했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 5000 ㎚를 상회하였다(도 14).
비교예 4 : 실시예 8과는 상이한 pH 설정에서의 미립자의 조제
본 실시예에서는, pH를 6.5 대신 4.0으로 한 것 외에는 실시예 8과 동일한 방법으로 미립자의 조제를 시도했다.
조제는 이하와 같이 하여 행했다.
소 인슐린(Sigma) 30 ㎎에 대하여 염산(0.02 M) 3 ㎖를 첨가하여 용해하고, 2 ㎖의 시트르산삼나트륨(0.2 M), 24 ㎕의 염화아연 용액(0.12 g/㎖), 0.36 g의 염화나트륨을 첨가 혼합했다. 그 후, HCl(0.1 M)을 소량 첨가하여 pH를 4.0으로 조정했다. 얻어진 용액 1 ㎖를 유리 바이알로 옮기고, 원심 농축기로 비가열, 감압하에 수분을 완전히 제거했다. 그 건고물에 PEG 수식 키토산(Carbomer. Inc사 제조)의 0.1% w/v 수용액(pH 4.0)의 1 ㎖를 첨가하여 재현탁시켜 시료로 했다.
얻어진 현탁액 중의 입자의 입경을 측정한 바, 주생성물의 입자의 직경은 5000 ㎚를 상회하였다(도 15).
시험예 1 : 미립자의 전자 현미경 관찰 및 원소 분석
실시예 10 및 11의 시료에 관해, 카본 지지막이 있는 Cu 메쉬 상에 분산시킨 FE-TEM(HITACHI, HF-2000, 가속 전압 200 kV)에 의한 관찰 및 XMA(Kevex, Sigma, 에너지 분산형)에 의한 미립자 내부의 원소 분석을 행했다.
도 16은, 실시예 10의 미립자의 TEM 화상이다. 실시예 10의 미립자에서는, 표면 피복 폴리머는 전자 밀도가 낮기 때문에 관찰할 수 없지만, 난백 알부민의 입자 그 자체는 관찰할 수 있다. 그 입자의 내부에는 네모난 결정이 관찰되어, 결정 부분을 XMA에 의해 원소 분석한 결과, Na와 Cl을 다량 포함하고 있기(도 17) 때문에 염화나트륨의 결정이라는 것을 알 수 있다. 투석에 의해 미립자 표면에 부착되어 있는 염화나트륨이 제거된 실시예 11의 미립자의 TEM 화상(도 18)에서도, 입자 내부에는 네모난 결정이 있어, 결정 부분의 XMA에 의한 원소 분석의 결과, Na와 Cl을 다량으로 포함하고 있기(도 19) 때문에 염화나트륨의 결정이라는 것을 알 수 있었다.
시험예 2 : 표면 피복 미립자에 대한 인슐린의 봉입 효율의 해석
실시예 4의 방법으로 조제한 키토산 피복 인슐린 입자에 관해, 원심 분리(10,000×G, 30분)에 의해 상청(유리 인슐린)을 제거하여 입자 분획을 얻었다. 입자 분획에 아세트산 33% 용액을 첨가하여 인슐린을 추출하고, HPLC로 인슐린 농도를 정량한 후, 하기의 계산식 :
배합한 인슐린의 봉입 효율(%)
=100×(조제한 표면 피복 미립자 현탁액의 인슐린 함유량 ㎎/㎖)
×(조제한 표면 피복 미립자 현탁액의 전량 ㎖)/(배합한 인슐린의 전량 ㎎);
에 의해 배합한 인슐린량과 비교하여 봉입 효율을 산출했다.
또한, 샘플의 HPLC 분석은 이하의 조건으로 행했다 :
C18 컬럼(Inertsil ODS-2, 5 ㎛, 250 mm×4.6 mm);
이동상 A : 0.1% TFA 수용액, 이동상 B : 0.1% TFA CH3CN 용액;
구배 조건(이동상 B 농도) : 0분일 때 : 30%, 10분일 때 : 50%, 컬럼 오븐 온도 : 40℃, 유속 : 1.0 ㎖/분, 주입량 : 50 ㎕, 검출 : UV 275 ㎚
그 결과, 배합한 인슐린의 봉입 효율은 88%로 산출되었다. 이러한 점에서, 투석 조작을 포함한 상기 조제법에서의 인슐린의 봉입 효율은 88%로 높아, 큰 손실없이 인슐린을 입자 내에 봉입할 수 있다는 것이 확인되었다.
시험예 3 : 실온 보존에서의 외관 변화의 관찰
실시예 1 및 실시예 4에서 얻어진 시료에 관해, 각 시료를 5 mM MES 버퍼로 희석한 액의 초기, 및 실온에서의 하루 방치후의 외관을 육안으로 관찰했다.
결과를 하기 표 1에 나타낸다.
외관 변화의 관찰
초기 실온에서의 1일 보존후
실시예 1 콜로이드 현탁액 완전히 용해
실시예 4 콜로이드 현탁액 콜로이드 현탁액
폴리머로 피복되지 않은 미립자는 콜로이드 입자로서의 안정성이 나쁘고, 한편, 표면 피복 미립자는 수중에서 장기간 방치하더라도 곧바로 용해되어 버리지는 않고 안정적이었다. 따라서, 폴리머로 피복함으로써 인슐린의 용해성을 지연시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, 본 발명의 표면 피복 미립자에 의한, 백신 용도나 DDS 용도에서의 천연 고분자의 서방성 부여의 가능성이 확인되었다.
시험예 4 : 키토산 피복 인슐린 미립자의 효소에 대한 안정성 시험
실시예 4의 키토산 피복 인슐린 미립자의 현탁액(인슐린 160 ㎍/㎖, 5 mM MES 버퍼(pH 6)) 또는 인슐린 용액(인슐린 160 ㎍/㎖, 5 mM MES 버퍼(pH 6))의 0.5 ㎖를 모델 효소 용액(α 키모트립신(시그마)을 40 ㎍/㎖의 농도로 5 mM MES 버퍼(pH 6)에 용해한 것) 0.5 ㎖와 혼합하여 37℃에서 30분간 진탕 반응시켰다. 반응후, 차게 식혀 놓은 아세트산 0.5 ㎖를 첨가하여 혼합함으로써, 효소 반응을 멈춤과 동시에 인슐린을 용해하여 HPLC에 의해 인슐린 농도를 정량함으로써, 키토산 피복 인슐린 미립자 내의 인슐린의 안정성 및 인슐린 용액 중의 인슐린의 안정성을 평가했다. 컨트롤 실험으로서, 모델 효소 용액 대신 5 mM MES 버퍼(pH 6)를 첨가하여 37℃에서의 30분간의 진탕 반응후에 동일하게 인슐린 농도의 정량을 행하는 시험도 행했다.
또한, 샘플의 HPLC 분석은 이하의 조건으로 행했다 :
C18 컬럼(Inertsil ODS-2, 5 ㎛, 250 mm×4.6 mm);
이동상 A : 0.1% TFA 수용액, 이동상 B : 0.1% TFA CH3CN 용액;
구배 조건(이동상 B 농도) : 0분일 때 : 30%, 10분일 때 : 50%, 컬럼 오븐 온도 : 40℃, 유속 : 1.0 ㎖/분, 주입량 : 50 ㎕, 검출 : UV 275 ㎚
결과를 도 20에 나타낸다. 인슐린과 효소를 혼합한 시료에서는, 30분간의 진탕 반응후에 인슐린 함유량이 50% 가까이 감소한 데 비해, 표면 피복 미립자와 효소를 혼합한 시료, 표면 피복 미립자와 버퍼를 혼합한 시료 및 인슐린 용액과 버퍼를 혼합한 시료에서는, 30분간의 진탕 반응에서도 거의 동등한 인슐린 함유량이었다.
이 결과로부터, 인슐린 코어 입자를 폴리머로 피복함으로써, 효소 분해에 대한 인슐린의 보호 효과를 얻을 수 있다는 것이 확인되었다.
시험예 5 : 실시예 10의 미립자의 면역 실험
실시예 10의 미립자(난백 알부민 농도 62.5 ㎍/㎖, pH 6.5) 또는 난백 알부민 용액(난백 알부민 농도 62.5 ㎍/㎖, pH 6.5)의 200 ㎕를 마우스(C57BL/6계통)의 등 부위에 피내 주사했다. 1주일마다의 주사를 2회 더 반복하여, 합계 3회 주사했다. 마지막 주사로부터 1주일후에 마우스의 액성 면역 레벨 및 세포성 면역 레벨을 평가했다. 액성 면역 레벨의 평가는, ELISA법의 흡광도에 의해, 혈청 중의 OVA에 대한 항체의 양을 측정함으로써 행했다. 세포성 면역 레벨의 평가는, 적출한 비장 세포를 OVA 펩티드로 자극하고, ELISPOT법의 스팟수를 계수함으로써, 분비되는 IFN-γ의 양을 측정하는 것에 의해 행했다.
결과를 하기 표 2에 나타낸다.
실시예 10의 미립자의 마우스 면역 실험 결과(N=2)
혈청의 액성 면역 레벨
(ELISA 분석의 450nm 흡광도)		 비장 세포의 세포성 면역 레벨
(ELISPOT 분석의 SPOT수)
실시예 10 0.56, 0.65 (평균 0.61) 160, 400 (평균 280)
OVA 용액 0.23, 0.40 (평균 0.32) 77, 46 (평균 62)
실시예 10의 미립자를 마우스에게 투여한 바, 액성 면역 및 세포성 면역의 양 면역에 관해, 비교 대상의 용액을 투여한 경우에 비해, 강하게 면역 유도되어 있는 것이 확인되었다. 이 결과는, 본 발명의 미립자가 백신 용도에 유용하다는 것을 나타내고 있다.
본 발명의 의약 조성물을 사용함으로써, 수용성의 약물을 경점막 또는 경피적으로 효율적으로 투여하는 것이 가능해진다. 또, 이러한 의약 조성물은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허 출원 제2009-231001호(출원일 : 2009년 10월 2일)를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (12)

  1. (a) 수용성의 약물과
    (b) 실온에서 고체인 의약상 허용되는 이온 결정성 화합물을 포함하는 미립자
    를 포함하는 의약 조성물로서, 상기 이온 결정성 화합물이 상기 미립자 중에서 결정화하고 있는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미립자가 불가역적인 가교는 되지 않은 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미립자의 평균 입경이 10 ㎚ 이상 5000 ㎚ 이하인 의약 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성의 약물이, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA, 다당, 리포펩티드, 리포단백질, 리포다당, 저분자 화합물, 항체, 항원, 독소 및 백신으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 결정성 화합물이, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 암모늄 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 양이온 전해질과, 염소 이온, 황산 이온, 젖산 이온, 아세트산 이온, 인산 이온, 글루콘산 이온, 탄산 이온, 중탄산 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 음이온 전해질을 구성 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온 결정성 화합물에 대한 상기 수용성의 약물의 중량 비율이 0.001 이상 100 이하인 의약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 의약상 허용되는 폴리머를 더 포함하고,
    상기 미립자가 소정의 pH에서 플러스 또는 마이너스의 전하를 가지며, 상기 폴리머가 상기 pH에서 상기 미립자와는 반대 부호의 전하를 가지며, 그것에 의해 상기 pH에서 상기 미립자와 상기 폴리머가 서로 정전 상호 작용하여 상기 폴리머가 상기 미립자의 표면에 부착된 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 복합체의 평균 입경이 15 ㎚ 이상 6000 ㎚ 이하인 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 수용성의 약물과 상기 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을 감압하에서 비가열적으로 건조시키는 것을 포함하는 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 건조가 동결 건조 또는 원심 농축 건조에 의한 것인 제조 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 기재된 의약 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 수용성의 약물과 상기 이온 결정성 화합물을 용해한 수용액을 감압하에서 비가열적으로 건조시킴으로써 상기 미립자를 조제하는 것, 및,
    상기 폴리머가 용해된 상기 pH를 갖는 용액과 상기 미립자를 혼합하는 것
    을 포함하는 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 건조가 동결 건조 또는 원심 농축 건조에 의한 것인 제조 방법.
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