KR20120084681A

KR20120084681A - A method for the toxicity assessments of nano-materials using flow cytometry

Info

Publication number: KR20120084681A
Application number: KR1020120006052A
Authority: KR
Inventors: 윤태현; 유현주; 권동욱; 노현우; 이송희; 박민선; 최서연; 양누리
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2012-07-30
Also published as: KR20140071997A; KR101469703B1

Abstract

본 발명은 나노 물질 위해성 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유세포 분석을 통하여 세포의 나노 물질 흡수(uptake) 정도 및 상기 나노 물질의 직접적인 독성영향만을 선택적으로 평가하여, 종래 위해성 평가법을 나노 물질의 위해성 평가에 적용시 발생할 수 있는 오류를 개선한, 보다 정확한 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것이다.
본 발명은 나노물질의 위해성 평가에서 보다 정확하고 재현성 있는 평가결과를 얻어낼 수 있다.The present invention relates to a nanomaterial risk analysis method, and more specifically, through the flow cytometry, by selectively evaluating the degree of nanomaterial uptake of the cell and the direct toxicity effect of the nanomaterial, the conventional risk assessment method of the nanomaterial It relates to a more accurate method for assessing nanomaterial risk, which ameliorates the errors that may occur when applied to risk assessment.
The present invention can obtain more accurate and reproducible evaluation results in risk assessment of nanomaterials.

Description

A method for the Toxicity Assessments of Nano-Materials Using Flow Cytometry}

본 발명은 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유세포 분석을 통하여 세포의 나노 물질 흡수(uptake) 정도 및 상기 나노 물질의 직접적인 독성영향만을 선택적으로 평가하여, 종래 평가법의 오류를 개선한 정확한 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for assessing risk of nanomaterials, and more specifically, to selectively evaluate only the degree of uptake of a cell and the direct toxicity effect of the nanomaterial through flow cytometry, thereby improving the error of the conventional method. An accurate method for assessing nanomaterial risk.

나노 크기의 입자(이하 나노물질)에 인체가 노출될 때에 발생할 수 있는 나노물질의 위해성은 최근 나노기술의 급격한 발달에 따라 새로운 문제로 대두되고 있다. 호흡에 의한 흡입, 구강에 의한 흡입, 및 피부 노출의 빈도가 점차 증가하고 있는 점을 고려하여 볼 때, 나노기술 및 나노물질의 안정성에 대하여 정확하고 과학적인 정보가 시급히 요청되고 있다The risk of nanomaterials that can occur when the human body is exposed to nanoscale particles (hereinafter referred to as nanomaterials) is emerging as a new problem due to the recent rapid development of nanotechnology. Given the increasing frequency of inhalation by breath, inhalation by mouth, and skin exposure, accurate and scientific information on the stability of nanotechnology and nanomaterials is urgently required.

나노물질의 위해성은 매우 작은 크기와, 나노물질 특유의 벌크물질과 크게 다른 입자의 물리화학적 특성으로 인해 발생한다. 석면과 유리섬유와 같은 침상구조를 갖는 물질들의 암 유발 가능성과 같은 유해성에 대해서는 이미 오래전부터 잘 알려져 왔다. 나노물질의 경우 석면과 유리섬유와는 다르게 형상적 특성뿐만 아니라 매우 작은 크기로 인한 유해성이 더 주목을 받고 있다. 높은 표면 반응력과 세포막 투과능은 나노물질들이 쉽게 생체에 유입될 수 있도록 하고, 세포수준의 스트레스 유발가능성을 높이고 더 나아가 석면처럼 생체에 축적되어 지속적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되고 있다. 나노물질은 마이크로사이즈의 물질과는 달리 인체 내에 더욱 깊숙한 곳까지 침투하여 침착이 가능하므로 심혈관계 질환에 영향을 미칠 수 있고, 특히 코 신경을 통해 침투된 나노물질은 혈액에 의해 체내에서 이동가능하여 뇌 손상에까지 영향을 미칠 수 있는 것으로 판단된다. The risk of nanomaterials is due to their very small size and the physicochemical properties of particles that differ significantly from the bulk material specific to nanomaterials. Hazards such as the likelihood of causing cancer of needle-like materials such as asbestos and fiberglass have been known for a long time. Unlike asbestos and glass fibers, nanomaterials are attracting more attention because of their small size as well as their shape characteristics. It is reported that high surface reaction force and cell membrane permeability allow nanomaterials to easily enter the living body, increase the possibility of causing stress at the cellular level, and furthermore, accumulate in the living body like asbestos and have a lasting effect. Nanomaterials can affect cardiovascular disease because they can penetrate deeper into the body and deposit them, unlike micro-sized materials. Especially, nanomaterials penetrated through the nasal nerves can be moved in the body by blood. It may also affect brain damage.

생체를 대상으로 한 나노물질의 위해성 연구의 대부분은 주사로 인한 주입이나 세포배양을 통해 이루어지며 주로 금속, 금속산화물, 탄소 나노물질 등을 대상으로 한다. 일반적으로 나노입자는 주사보다는 호흡기, 구강, 피부에 의해서도 인체에 유입되는 것으로 알려져 있다. Most of the risk studies of nanomaterials in vivo are carried out through injection or cell culture, mainly targeting metals, metal oxides, and carbon nanomaterials. In general, nanoparticles are known to enter the human body by respiratory, oral, and skin rather than injection.

나노물질의 잠재적인 유해 영향을 미연에 방지하고 대비책을 마련하기 위한 국제협력활동이 적극적으로 추진되어야 하며, 무분별한 나노기술 개발 및 적용 그리고 부적절한 폐기 등 잠재적 위험성을 최소화 또는 감소하기 위한 제도적 장치 마련이 동시에 이루어져야 하는 시점에 와 있다. International cooperation activities should be actively promoted to prevent and prepare for potential harmful effects of nanomaterials, while at the same time institutional arrangements to minimize or reduce potential risks such as indiscriminate nanotechnology development and application and inappropriate disposal. It's time to get it done.

그러나, 나노입자 등이 인체나 환경에 미치는 위해성이 심각할 것으로 인식되고 있는 것과는 달리 실제 나노물질에 의한 인체와 생태계 노출, 독성 및 유해 영향평가 기법조차 제대로 구축되어 있지 않은 실정이다.However, contrary to the fact that nanoparticles and the like are considered to be seriously harmful to humans or the environment, even actual exposure of humans and ecosystems by nanomaterials, toxicity and harmful effects assessment methods are not properly established.

현재까지는, 일반적으로 기존 화학물질에 사용되고 있는 위해성 평가 방법을 나노물질에 적용하는 경우가 많다. 그러나, 작은 크기의 입자일수록 그 표면적이 넓어져 생체조직에 대한 반응성과 그에 따른 독성이 증가하므로 나노크기의 특성을 고려한 나노 물질의 새로운 물리화학적 성질과 이로 인한 독성에 대한 조사가 무엇보다도 중요하다. To date, risk assessment methods commonly used in conventional chemicals are often applied to nanomaterials. However, the smaller the size of the particles, the larger the surface area of the responsiveness and subsequent toxicity increases in biological tissues, it is important to investigate the new physicochemical properties of the nanomaterials and their toxicity considering the characteristics of the nano-size.

그러므로 나노 물질의 위험성 평가를 하기 위해서는 나노 입자의 독특한 특성과 문제점, 거동, 노출 및 독성의 잠재적인 영향에 대한 연구가 필요하다.
Therefore, the risk assessment of nanomaterials requires the study of the unique properties and problems of nanoparticles, their potential effects on behavior, exposure and toxicity.

이에, 본 발명자는 나노입자의 세포독성 평가 시 기존의 보고된 나노독성평가의 문제점들을 보완하기 위하여, 세포들을 나노 물질에 노출시켜 상기 나노 물질의 흡수(uptake)정도 및 나노 물질의 직접적인 독성영향만을 선택적으로 평가할 수 있도록 유세포 분석방법을 변형함으로써, 간접적인 독성요인들로 인한 방해를 제거하고 나노입자들에 의한 직접적인 세포의 사멸정도만을 정량화하여 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors exposed the cells to the nanomaterials to compensate for the problems of the previously reported nanotoxicity evaluations when assessing the cytotoxicity of the nanoparticles, and only the degree of uptake of the nanomaterials and the direct toxicity effects of the nanomaterials. By modifying the flow cytometry to selectively evaluate, it was confirmed that the interference caused by indirect toxicity factors can be eliminated and only the degree of direct cell death by nanoparticles can be quantified and analyzed, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 유세포 분석방법을 이용하여 in vitro에서 나노물질의 위해성을 평가하는 방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention using flow cytometry method in To provide a method for evaluating the risk of nanomaterials in vitro .

본 발명의 다른 목적은 유세포 분석방법을 이용하여 in vivo에서 나노물질의 위해성을 평가하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention using a flow cytometry method in To provide a method for evaluating the risk of nanomaterials in vivo .

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하기 위한, 나노 물질의 위해성 평가용 유세포 분석 플랫폼 또는 시스템을 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a flow cytometry platform or system for risk assessment of nanomaterials for using the method.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, The present invention to solve the above problems,

세포층을 나노 물질에 노출하고 형광염색하는 단계;Exposing the cell layer to nanomaterials and fluorescing;

상기 세포층에 대하여 유세포 분석을 수행하는 단계; 및Performing flow cytometry on the cell layer; And

상기 유세포 분석 결과에 의해 세포사멸 정도를 정량화하는 단계를 포함하는, in vitro 나노물질 위해성 평가방법을 제공한다.
Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in In vitro methods for risk assessment of nanomaterials are provided.

특히, 상기 유세포 분석결과는 산란광 데이터 및 형광신호 데이터인 것을 특징으로 하는데, 상기 산란광 데이터는 나노 물질을 흡수(uptake)한 세포를 구별하는데 이용되고, 상기 형광신호 데이터는 상기 나노 물질을 흡수한 세포에 대한 세포사멸 정도를 평가하는데 이용될 수 있다.In particular, the flow cytometry results are scattered light data and fluorescence signal data, wherein the scattered light data is used to distinguish cells that have taken up a nanomaterial, and the fluorescence signal data is a cell that has absorbed the nanomaterial. It can be used to assess the degree of apoptosis for.

또한, 상기 세포사멸 정도는 예를 들어, 활성산소종 발생 정도에 의해 정량화될 수 있다.
In addition, the degree of apoptosis can be quantified by, for example, the generation of reactive oxygen species.

상기 나노물질은 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon nanotube), MWCNT(multi-walled carbon nanotube),풀러린(fullerene, C₆₀), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 나노클레이 등으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 나노물질일 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 산화아연을 사용하였다.The nanomaterials are gold nano, silver nano, single-walled carbon nanotube (SWCNT), multi-walled carbon nanotube (MWCNT), fullerene (fullerene, C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide, aluminum oxide, cerium oxide It may be one or more nanomaterials selected from the group consisting of zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimer, nanoclay, etc. In one embodiment of the present invention, zinc oxide was used.

또한, 상기 방법에서, 세포층은 미세유체 세포칩, 멀티 웰 또는 슬라이드 글라스에 형성시켜 사용할 수 있고, 상기 형광염색은 유기형광 염료, 무기나노입자 또는 형광단백질을 이용하여 수행할 수 있다. 그리고, 상기 세포층의 나노 물질에의 노출은 화학물질 노출기구, 또는 정립 및 역립 노출기구를 이용하여 수행할 수 있다. 특히, 정립 및 역립 노출기구를 이용하여 나노 물질에 노출하는 경우, 상기 나노 물질의 수용액상에서의 물리화학적 특성 , 특히 콜로이드로서의 응집 또는 침전 정도에 따른 나노물질의 불균일성 및 이에 따른 오류를 보완, 평가하는 것을추가로 포함할 수도 있다.
In the above method, the cell layer may be formed on a microfluidic cell chip, a multi well or a slide glass, and the fluorescent dye may be performed using an organic fluorescent dye, an inorganic nanoparticle or a fluorescent protein. In addition, the cell layer may be exposed to the nanomaterial by using a chemical exposure mechanism, or upright and inverted exposure mechanisms. In particular, when exposed to nanomaterials using upright and inverted exposure mechanisms, the physical and chemical properties of the nanomaterials in aqueous solution, in particular, to compensate for and evaluate the nonuniformity of the nanomaterials according to the degree of aggregation or precipitation as colloids It may further include.

한편, 본 발명은 다른 관점에서,On the other hand, the present invention in another aspect,

나노 물질을 실험동물에 투여하는 단계;Administering the nanomaterial to the experimental animal;

상기 실험 동물로부터 생체시료를 채취하여 형광염색하는 단계;Collecting a biological sample from the experimental animal and fluorescing the same;

상기 생체시료에 대하여 유세포 분석을 수행하는 단계; 및Performing flow cytometry on the biological sample; And

상기 유세포 분석 결과에 의해 세포사멸 정도를 정량화하는 단계를 포함하는, in vivo 나노물질 위해성 평가방법을 제공한다.Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in It provides a method for evaluating the risk of nanomaterials in vivo .

이 때, 상기 투여는 구강, 피부, 또는 정맥을 통하여 이루어질 수 있고, 상기 생체시료는 혈액, 타액, 또는 뇨 등일 수 있다.At this time, the administration may be through the oral cavity, skin, or vein, the biological sample may be blood, saliva, urine and the like.

이 밖의 다른 사항은 앞서 설명한 in vitro 나노물질 위해성 평가방법에서와 동일하다.
Anything else is explained in Same as in vitro nanomaterial risk assessment method.

특히, 상기 in vitro 및 in vivo 나노물질 위해성 평가방법에 있어서,In particular, in in vitro and in vivo In the nanomaterial risk assessment method,

상기 유세포 분석은The flow cytometry is

광원장치; 산란광 및 형광신호를 검출하는 검출장치;세포 배양 플랫 폼; 및 세포사멸 정도를 정량화하는 데이터 처리장치를 포함하는 유세포 분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적인 유세포 분석의 모식도를 도 1에 나타내었다.Light source device; A detection device for detecting scattered light and a fluorescence signal; a cell culture platform; And it may be performed using a flow cytometer comprising a data processing device for quantifying the degree of cell death. A schematic diagram of a more specific flow cytometry is shown in FIG. 1.

본 발명의 방법에서, 상기 유세포 분석은 전면 산란광 및 측면 산란광의 강도를 이용하여 나노 물질을 흡수(uptake)한 세포를 구별하고, 상기 구별된 나노 물질을 흡수(uptake)한 세포들에 대하여, 형광 방출 신호를 연계하여 분석하는 것을 특징으로 한다.
In the method of the present invention, the flow cytometry distinguishes cells that take up the nanomaterial using the intensity of the front scattered light and the side scattered light, and fluoresces the cells uptake the distinguished nanomaterial. It is characterized by analyzing the emission signal.

본 발명은 나노물질의 위해성 평가에 있어서 기존의 화학물질 위해성 평가시 사용하던 평가법의 프로토콜을 그대로 사용함에 있어서 생길 수 있는 다양한 문제점 및 오류를 해결하고 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 기반한 나노물질 위해성 평가 플랫폼을 제작하여, 나노물질의 위해성 평가에서 보다 정확하고 재현성있는 평가를 가능하게 할 수 있을 것이다.
The present invention solves various problems and errors that may occur in using the protocol of the evaluation method used in the conventional chemical risk assessment in risk assessment of nanomaterials. Thus, by fabricating a nanomaterial risk assessment platform based on the method of the present invention, it will be possible to enable more accurate and reproducible assessment in risk assessment of nanomaterials.

도 1은 본 발명에 사용되는 유세포 분석기의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용한 Zn² ⁺ ion, 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO), 및 음전하를 띈 ZnO 나노입자 (^PAAZnO)에 노출된 HeLa 세포의 MTT assay결과이다.
도 3은 유세포 분석기를 이용한, Zn² ⁺ ion, 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO), 및 음전하를 띈 ZnO 나노입자 (^PAA ZnO)에 노출된 HeLa 세포의 전면 산란광과 측면 산란광의 그래프이다.
도 4는 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO)에 노출된 HeLa 세포의 시간에 따른 (1~3h) 전면산란광과 측면산란광의 변화 그래프이다.
도 5는 나노 입자의 직접적인 세포독성과 이온에 의한 간접적인 세포 독성을 확인하기 위해, 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO) 농도에 따른 (0~80ppm) HeLa 세포의 산란광과 활성산소종(ROS) 데이터를 분석한 결과이다.
도 6은 도 5에서 제시한 측정 및 분석결과를 이용하여 전체 세포에 대한 용량-반응(Dose-Response)관계와 나노입자에 의한 직접적인 용량-반응관계를 비교한 결과이다.
도 7은 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO) 30ppm 을 노출했을 때 정상 세포의 기준선을 중심으로 측면 산란광이 큰 부분과 작은 부분에서의 활성산소 발생정도만을 표시한 결과이다.
도 8은 Zn² ⁺ ion, 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO), 그리고 음전하를 띈 ZnO 나노입자 (^PAA ZnO) 에 노출된 Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrophage) cell의 유세포 측정 결과의 산란 분포도이다[X축은 전방산란, Y축은 측방산란세기].
도 9는 Zn² ⁺ ion, 양전하를 띈 ZnO 나노입자 (^PLLZnO), 그리고 음전하를 띈 ZnO 나노입자 (^PAAZnO) 에 노출된 Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrophage) cell의 유세포 측정 결과의 히스토그램이다[X축은 활성산소 발생세기, Y축은 각 세기에 해당하는 세포의 개수].
도 10은 서로 크기가 다르고 음전하의 SiO₂ 나노입자 (표면처리 하지 않은 SiO2 ; 30 nm, 100 nm, & 300nm) 와 양전하의 SiO₂ 나노입자 (^PLLSiO2 ; 30 nm, 100 nm, & 300nm) 에 노출된 HeLa cell의 유세포측정 결과의 산란분포도이다[X축은 전방산란, Y축은 측방산란세기].
도 11은 양전하를 띈 ZnO 나노 입자 (^PLLZnO) 농도에 따른 (0~80ppm) HeLa cell의 활성산소종(ROS) 발생 측정 사례를 통해, 본 발명의 세포 독성 평가법과 기존의 방법을 통한 세포 독성 평가법을 비교한 결과이다.
도 8은 도 7에서 제시한 측정 및 분석결과를 이용하여 전체 세포에 대한 용량-반응(Dose-Response)관계와 나노입자에 의한 직접적인 용량-반응관계를 비교한 결과이다.1 is a schematic diagram of a flow cytometer used in the present invention.
Figure 2 shows the results of MTT assay of HeLa cells exposed to Zn ² ⁺ ion, positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO), and negatively charged ZnO nanoparticles ( ^PAA ZnO) used in the present invention.
Figure 3 using flow cytometry, Zn ² ⁺ ion, ZnO nanoparticles ttuin a positive charge ^(PLL ZnO), and is a graph of front scattered light and side scattered light of HeLa cells exposed to ZnO nanoparticles ^(PAA ZnO) ttuin a negative charge.
Figure 4 is a graph of the change in front scattered light and side scattered light (1 ~ 3h) over time of HeLa cells exposed to positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO).
FIG. 5 shows scattered light and reactive oxygen species (ROS) of (0 to 80 ppm) HeLa cells according to positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO) concentrations to confirm direct cytotoxicity and indirect cytotoxicity by ions. ) This is the result of analyzing the data.
6 is a result of comparing the dose-response relationship with respect to the whole cells and the direct dose-response relationship by the nanoparticles using the measurement and analysis results shown in FIG. 5.
FIG. 7 shows the results of only the generation of active oxygen in the large and small lateral scattered light around the baseline of normal cells when 30 ppm of positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO) were exposed.
8 is a Zn ² ⁺ ion, ZnO nanoparticles ttuin a positive charge ^(PLL ZnO), and the Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrophage) exposed to the ZnO nanoparticles ttuin a negative charge ^(PAA ZnO) is the scattering distribution of the flow cytometric measurements of the cell [X axis is forward scattering, Y axis is lateral scattering intensity].
9 is a Zn ² ⁺ ion, ZnO nanoparticles ttuin a positive charge ^(PLL ZnO), and is a Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrophage) histogram of flow cytometric measurements of the cell exposed to ^(PAA ZnO) ZnO nanoparticles ttuin a negative charge - X-axis is the generation of free radicals, Y-axis is the number of cells corresponding to each intensity].
10 is SiO ₂ of different sizes and negative charges; Scattering distribution of flow cytometry results of HeLa cells exposed to nanoparticles (SiO2 without surface treatment; 30 nm, 100 nm, & 300 nm) and positively charged SiO ₂ nanoparticles ( ^PLL SiO2; 30 nm, 100 nm, & 300 nm) [X axis is forward scattering, Y axis is lateral scattering intensity].
11 is a cytotoxicity test through the cytotoxicity evaluation method of the present invention and the conventional method through the measurement of reactive oxygen species (ROS) generation of (0 ~ 80ppm) HeLa cells according to the positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO) concentration It is the result of comparing evaluation methods.
FIG. 8 is a result of comparing the dose-response relationship with respect to the whole cells and the direct dose-response relationship by the nanoparticles using the measurement and analysis results shown in FIG. 7.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
Definitions of terms used in the present invention are as follows.

"나노물질(Nano materials)”이란 입자의 크기가 3차원 중 적어도 1개의 차원 길이가 100 nm보다 작은 나노입자와 나노구조물질을 말한다. 본 발명에서는 특히, 상기 나노물질을 나노입자와 병용하여 사용하고 있다."Nano materials" refers to nanoparticles and nanostructured materials having a particle size of at least one dimension of less than 100 nm in three dimensions, in particular, the nanomaterial is used in combination with nanoparticles. Doing.

"나노입자(Nanoparticles)”란 1?100 nm 범위의 직경을 가진 입자를 말한다."Nanoparticles" refers to particles having a diameter in the range of 1-100 nm.

"나노구조물질(Nanostructured material)”이란 나노크기의 입자를 포함하는 구조의 물질 또는 나노 입자가 응집된 것을 말한다."Nanostructured material" refers to agglomerated materials or nanoparticles of a structure comprising nanoscale particles.

"나노 물질 위해성"이란 나노 크기의 입자상 또는 액상의 물질이 가지는 위험성, 리스크, 유해성, 독성 등을 총칭하여 일컫는 용어로서, 엄밀하게 설명하면, 유해성(hazard)이란 장해를 야기할 수 있는 물질이나 행동을 일컬으며 위해의 근원을 말하며, 위해도(risk)란 유해물질의 특정농도나 용량에 노출된 개인 혹은 집단에게 유해한 결과가 발생할 확률(probability) 또는 가능성(likelihood)으로 정의됩니다. OECD에서는 위해도를 「위해도(Risk) = 유해성(Hazard)×노출량(Exposure)」으로 정의하고 있다."Nano-material hazard" is a term used to collectively refer to the dangers, risks, hazards, and toxicities of nano-sized particulate or liquid substances. Strictly speaking, "hazards" are substances or behaviors that can cause obstacles. Refers to the source of a hazard, and risk is defined as the probability or likelihood of a harmful outcome to an individual or group exposed to a specific concentration or dose of a hazardous substance. The OECD defines risk as `` Risk = Hazard × Exposure ''.

일반적으로 작은 입자일수록, 비표면적이 넓어지면서 생체조직에 대한 반응성이 증가하고 그와 함께 독성도 증가할 수 있어 문제되고 있다. 특히, 동물세포에 침투 가능한 일부 나노물질은 세포막이나 뇌혈막을 통과할 수도 있다고, 이러한 성질은 의도하지 않은 세포나 조직에 영향을 미칠 수 있는 것이다. 따라서, 이러한 나노물질의 위해성을 연구하여 안전관리 지침 등의 마련이 요구되고 있는 실정이다. 문헌 보고에 의하면 탄소류, 실리카류, TiO2, 은나노 입자 등의 순서로 나노물질 위해성 검토가 이루어지고 있다.In general, the smaller the particles, the wider the specific surface area, the increased the responsiveness to the biological tissue and at the same time the toxicity is also a problem. In particular, some nanomaterials that can penetrate animal cells may pass through cell membranes or cerebrovascular membranes, which can affect unintended cells or tissues. Therefore, it is required to prepare safety management guidelines by studying the risks of these nanomaterials. According to the literature report, the risk of nanomaterials is examined in the order of carbons, silicas, TiO2, silver nanoparticles and the like.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. "Tissue or cell sample" means a collection of similar cells obtained from a tissue of a subject or patient. Sources of tissue or cell samples may include solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue samples or biopsies or aspirates; Blood or any blood component; Cells at any time of pregnancy or development in the subject. Tissue samples may also be primary or cultured cells or cell lines.

"세포사멸(apoptopsis)"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다."Apoptopsis" is used in a broad sense and is generally accompanied by one or more characteristic cellular alterations, including cytoplasmic compression, loss of plasma membrane microvilli, splitting of the nucleus, degradation of chromosomal DNA or loss of mitochondrial function. Cell death according to or regulated by mammalian rules.

"활성산소종(reactive oxygen species, ROS)"이란 free radical을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며, 자외선, 약물, 환경오염물질과 같은 여러 가지 외부 요인 및 그 외의 여러 가지 이유에 의해서 몸 안에 활성산소 종의 양이 크게 늘어날 경우 생명체는 산화적 스트레스를 받아 세포 사멸, 질병 발생 그리고 세포의 노화를 일으키게 된다. 즉, 활성산소 종의 생성과 세포의 항산화력 간의 균형이 산화적 스트레스를 결정하게 되고, 산화적 스트레스는 세포내 단백질, 지질 및 DNA에 손상을 입히게 되는 것이다. The term "reactive oxygen species" (ROS) refers to a condition that is unstable due to free radicals, and is caused by various external factors such as ultraviolet rays, drugs, and environmental pollutants, and for other reasons. Increasing amounts of living organisms are subject to oxidative stress, causing cell death, disease development, and cell aging. In other words, the balance between the production of reactive oxygen species and the antioxidant power of the cell determines the oxidative stress, and the oxidative stress causes damage to intracellular proteins, lipids and DNA.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
Throughout this specification, the terms “comprises” and “comprising”, unless otherwise indicated in the context, include a given step or element, or group of steps or elements, but any other step or element, or step or element It should be understood that this group is not excluded.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the meaning as commonly understood by those skilled in the art in the related field of the present invention. Also, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 유세포 분석(Flow Cytometry)을 이용하여 나노 물질에 일정 시간 노출된 in vivo 및 in vitro 세포들에 대한 나노 물질의 직접적인 독성영향만을 선택적으로 평가할 수 있는 세포기반 분석법이다.
The present invention is a cell-based assay capable of selectively evaluating the direct toxicity effects of nanomaterials on in vivo and in vitro cells exposed to nanomaterials for a certain period of time using flow cytometry.

기본적으로, 본 발명은 유세포 분석법(Flow Cytometry)을 이용하여 제조 나노 물질의 세포에 대한 위해성을 평가하는 방법에 관한 것이다.Basically, the present invention relates to a method for assessing the risk of cells of manufactured nanomaterials to cells using flow cytometry.

"유세포 분석법"의 일반적인 원리는 일정한 파장의 빛을 세포에 조사하였을 때 세포가 가진 성질 및 부착된 형광색소(fluorochrome)에 따라 방출(산란 또는 형광)할 수 있는 파장 및 크기가 다르다는 점을 이용하는 것이다. The general principle of "flow cytometry" is to take advantage of the fact that when a cell is irradiated with a certain wavelength of light, the wavelength and the size of the cell can be emitted (scattered or fluorescence) depending on the properties of the cell and the attached fluorochromes. .

예를 들어, 혈액 속의 백혈구를 대상으로, 크기에 따라 크게 임파구 (lymphocyte), 단핵구 (monocyte), 그리고 과립구 (granulocyte)등으로 구분할 수 있는데 이러한 세포를 대상으로 일정 파장 (예를 들어 488nm 파장의 blue laser)의 빛으로 세포를 비추게 되면 세포의 크기에 따라 전면으로 산란되는 빛의 각도가 다르게 나타난다. 즉 세포의 크기가 더 크면 빛이 더 많이 튕겨나가게 되어 전면 산란광 (Forward scatter; FS)으로 검출되는 광선의 양이 증가하여 세포의 크기에 대한 분석이 가능하며, 그리고 세포 표면이나 내부의 성질(예, 밀도, 세부 구조)에 따라 빛이 많이 굴절되는 경우 (예를 들어 granulocyte의 세포 내 granule들) 측면 산란광 (Side scatter; SS)으로 검출되는 빛의 양이 늘어난다. 이 두 가지 성질을 이용하여 기본적인 세포의 분류를 가능하게 한다For example, leukocytes in the blood can be classified into lymphocytes, monocytes, and granulocytes, depending on their size. These cells are targeted to a certain wavelength (for example, blue at 488 nm). When the cell is illuminated with the laser light, the angle of the light scattered to the front is different depending on the size of the cell. In other words, the larger the size of the cell, the more light is bounced off and the amount of rays detected by the forward scatter (FS) increases, allowing analysis of the size of the cell and the nature of the cell surface or interior (e.g., If the amount of light is refracted (eg, granules in granulocyte cells) increases, the amount of light detected by side scatter (SS) increases. These two properties allow for basic cell sorting.

특히, 나노입자에 노출된 세포의 변화를 유세포 분석기를 이용하여 측정 분석 할 때 아래와 같은 두 가지 주요한 문제점이 예상된다. In particular, two major problems are expected when measuring changes of cells exposed to nanoparticles using flow cytometry.

첫째는 나노입자의 또는 나노입자와 결합된 세포의 광학적 특성(예, 산란, 흡수, 형광 등)이 유세포 측정기의 측정 결과에 영향을 미치는 경우이고, 두 번째는 나노입자의 제조 및 시료 준비과정에서 발생되는 다양한 간접적인 독성 요인들(예, 시료준비과정에서의 나노입자의 불안정성으로 인한 금속이온 이온화, 표면 개질 등에 사용된 화학물질의 유리 및 이로 인한 세포독성 발현 등) 인한 세포의 변화가 나노입자로 인해 유발된 직접적인 세포 변화들과 혼재되어 관찰되는 경우이다. 따라서, 이러한 간섭요인들은 in vivo 및 in vitro 세포기반 시험법을 나노입자에 적용할 때 분석결과의 정확성 및 재현성을 확보하는데 커다란 장애 요인이 되어 왔다.The first is that the optical properties (eg scattering, absorption, fluorescence, etc.) of the nanoparticles or the cells bound to the nanoparticles affect the measurement results of the flow cytometer. The second is the process of preparing nanoparticles and preparing samples. Changes in cells caused by various indirect toxicity factors (e.g., ionization of metal ions due to nanoparticle instability in sample preparation, release of chemicals used for surface modification, and resulting cytotoxicity) This is the case when mixed with the direct cellular changes caused by. Therefore, these interference factors have been a major obstacle to ensuring the accuracy and reproducibility of assay results when applying in vivo and in vitro cell-based assays to nanoparticles.

이를 해결하기 위해서 본 발명은 나노 물질을 흡수(uptake)한 세포들만을 구별하고, 상기 결과에 형광신호 데이터를 결합하여 분석함으로써, 상기 나노 물질의 직접적인 독성 영향만을 선택적으로 평가할 수 있도록 하였다.
In order to solve this problem, the present invention distinguishes only cells that have taken up the nanomaterial, and combines the fluorescence signal data with the results to analyze only the direct toxic effects of the nanomaterial.

일 관점에서, 본 발명은 In one aspect, the invention

상기 유세포 분석 결과에 의해 세포사멸 정도를 정량화하는 단계를 포함하는, in vitro 나노물질 위해성 평가방법 및 시스템에 관한 것이다.
Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in A method and system for risk assessment of nanomaterials in vitro .

우선, 분석대상 세포를 배양하여 세포층을 형성한다. 예를 들어 단일 세포층을 배양하여 사용할 수 있다. 이러한 단일 세포층을 형성하기 위해서는 멀티 웰 플레이트, 슬라이드 글라스 또는 미세 유체 세포칩 등의 표면에 분석대상 세포를 배양하고 표면에 부착되지 못하고 배지에 부유하는 세포는 배지를 흘려주어 제거함으로써 단일 세포층을 형성할 수 있다. First, the cell to be analyzed is cultured to form a cell layer. For example, a single cell layer can be cultured and used. In order to form such a single cell layer, the cells to be analyzed are cultured on a surface of a multi-well plate, a slide glass, or a microfluidic cell chip. Can be.

이 때, 상기 세포 배양에 필요한 조건 및 방법 등은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다.At this time, the conditions and methods required for the cell culture can be used a conventional method known in the art.

특히, 미세 유체 세포칩을 사용하는 경우에는, 상기 미세 유체 세포칩 내로 배지 및 시약을 주입함으로써 세포배양과 동시에 다양한 세포기반 분석이 가능한 장점이 있다.
In particular, when using a microfluidic cell chip, by injecting a medium and a reagent into the microfluidic cell chip, there is an advantage that can be various cell-based analysis at the same time as cell culture.

다음으로, 본 발명에서는 유해 화학물질인 나노 물질에 상기 형성된 세포층을 노출시켜 세포사멸을 유도한다.Next, the present invention induces apoptosis by exposing the formed cell layer to nanomaterials that are harmful chemicals.

위해성이 염려되는 나노 물질(나노 입자)로는 표 1에 기재되어 있는 이하와 같은 물질을 예로 들 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 산화아연 나노입자를 사용하였다. 이러한 나노 물질의 노출에 따른 위험성(독성)를 파악하고 이해하기 위해서는 무엇보다도 나노 물질의 물리 화학적 특성의 이해와 물리적 거동을 파악하고 세포 생리학적인 생체 내 작용의 이해가 필요하다.Examples of nanomaterials (nanoparticles) of concern for risk include the following materials listed in Table 1, and zinc oxide nanoparticles were used in one embodiment of the present invention. In order to understand and understand the risks (toxicity) of exposure to these nanomaterials, it is necessary to understand the physical and chemical properties and physical behavior of nanomaterials, and to understand the cellular physiological in vivo.

이 때, 세포층의 상기 나노 물질로의 노출은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용할 수 있다. At this time, the exposure of the cell layer to the nanomaterial may be used a conventional method known in the art.

예를 들어, 일반적인 화학물질 노출기구를 사용할 수도 있고, 미세 유체칩을 이용할 수도 있으며, 또는 나노물질 노출용 정립 및 역립 노출장치를 이용하여 기판에 배양된 세포층에 나노 물질을 노출시킬 수 있다. 특히, 미세유체 세포칩을 사용하는 경우, 유체 채널 내로 나노 물질을 주입함으로써 세포 배양구간에서 배양되고 있는 세포를 나노물질에 노출시킬 수 있다. 또한, 정립 및 역립 노출기구를 사용하는 경우, 상기 나노입자의 응집 및 침전 정도 등 콜로이드로사의 특성에 따라 나노 물질의 불균질한 농도를 측정하는 방법을 추가로 포함할 수도 있다.
For example, a general chemical exposure apparatus may be used, a microfluidic chip may be used, or nanomaterials may be exposed to a cell layer cultured on a substrate using a sizing and inverting exposure apparatus for exposing nanomaterials. In particular, in the case of using a microfluidic cell chip, the cells being cultured in the cell culture section can be exposed to the nanomaterial by injecting the nanomaterial into the fluid channel. In addition, in the case of using the upright and inverted exposure mechanisms, the method may further include measuring a heterogeneous concentration of the nanomaterial according to the characteristics of the colloidal Rosa, such as the degree of aggregation and precipitation of the nanoparticles.

한편, 상기 나노 물질은 시간이 지남에 따라 세포 내에 확산(diffusion)되어 다양한 농도를 가지게 되고, 세포층 내의 세포들은 상기 나노 물질에 일정시간 노출됨으로써 세포사멸 과정을 거치게 된다,On the other hand, the nanomaterial is diffused into the cell over time (diffusion) to have a variety of concentrations, the cells in the cell layer is subjected to apoptosis process by being exposed to the nanomaterial for a certain time,

이러한 세포의 사멸과정은 세포고사, 괴사 등으로 나누어지는데 정상상태에서의 세포분열과 반대로 유해 물질에 의해 노출로 인한 손상 받은 세포는 퇴화하는 방향으로 변화가 일어나기 때문에, 정상세포와 대비하여 다른 대사과정 즉, 그 중에서도 세포가 퇴화되는 죽음의 과정을 알아보면서 세포의 유해성물질에 대한 반응 기작을 확인할 수 있다.여기서 세포의 죽음의 과정을 두 가지로 분류하면, 세포의 손상이 심해서 세포에서는 부종이 일어나고 용해가 일어나 세포 내용물이 밖으로 분출되는 '세포괴사(Necrosis)'라 불리는 세포 죽음의 과정이 일어난다. 또한 다른 세포의 죽음과정은 '세포고사(Apoptosis)'로 특징적으로 세포의 초기의 수축이며, 조직에서는 이웃하고 있는 세포들과 세포-세포 결합이 파괴되는 것을 의미한다. 세포고사 과정에서 세포의 부피는 작아지고 세포질 내의 내막, 리보솜, 사구체와 다른 세포 소기관 등은 수축된다.The process of cell death is divided into apoptosis and necrosis. In contrast to normal cell division, damaged cells caused by exposure to harmful substances change in the direction of degeneration, so that metabolic processes differ from normal cells. In other words, it is possible to check the reaction mechanism of the cell's harmful substances by examining the process of death in which the cell degenerates. If the process of cell death is classified into two types, the cell is severely damaged and edema occurs in the cell. Lysis occurs, leading to a process of cell death called 'necrosis', in which cell contents are ejected out. The death process of other cells is also called 'apoptosis', which is the initial contraction of cells, which means that cell-cell bonds are destroyed in neighboring cells. In the process of apoptosis, the cell volume becomes smaller and the lining, ribosomes, glomeruli and other cell organelles in the cytoplasm contract.

특히, 상기 세포 사멸과정은 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)에 의한 산화(oxidation)를 통해 유도된다는 사실은 이미 널리 알려진 내용이다.In particular, it is well known that the cell death process is induced through oxidation by Reactive Oxygen Species (ROS).

활성산소종은 자유 라디칼(free radical)을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며, 그로 인해 강한 활성을 가진다. 이 활성산소종은 생산이 과잉되면 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여, 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 거대한 분자(단백질, 지질 등)를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 사멸시키는 등의 작용으로 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발한다. 이러한 활성산소종에는 superoxide anion radical(O² ^-), 과산화수소(H2O2), hydroxyl radical(OH) 외에도 과산화지질(lipid peroxide), rlitric olride(NO), peroxinitrite(NO₃ ^2-), thiol peroxy radical(R-SO² ^-) 등이 있다.Free radical species refers to a state that is not stable because it has free radicals, thereby having a strong activity. This type of reactive oxygen species is sometimes referred to as a noxious oxygen because excessive production leads to toxicity to the living organism, that is, oxidative stress. By oxidizing huge molecules (proteins, lipids, etc.) in the cell, it destroys the homeostasis of the cell, kills the cell, and causes fatal damage in the tissue. Such reactive oxygen species include ^{^{superoxide anion radical (O 2 -)}} , hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (OH ) In addition to lipid peroxide (lipid peroxide), rlitric olride ( NO), peroxinitrite (NO 3 2-), thiol peroxy radical ( and the like) ^- R-SO ^2.

그러므로 본 발명에서는 특히, 나노 물질의 위해성(독성, 유해성) 평가를 위해, 이러한 활성산소종의 발생으로 인한 산화적 스트레스의 증가여부를 살펴본다. 즉, 나노입자를 노출해서 세포의 산화적 스트레스를 증가시킨 후, 나노입자가 흡수(uptake)된 세포를 따로 구별하여 산화적 스트레스를 분석한다.
Therefore, in the present invention, in particular, in order to evaluate the risk (toxicity, hazard) of nanomaterials, the increase in oxidative stress due to the generation of such reactive oxygen species is examined. That is, after exposing the nanoparticles to increase the oxidative stress of the cells, the oxidative stress is analyzed by separately identifying the cells uptake (nanoparticles) uptake.

다음으로, 본 발명의 방법에서는 상기 나노물질에 노출시킨 세포층에 형광염료를 주입하여 형광염색을 수행한다.Next, in the method of the present invention, a fluorescent dye is injected into the cell layer exposed to the nanomaterial to perform fluorescent staining.

이는 유세포 분석 방법 중 F.A.C.S(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 수행하기 위한 것으로, 형광신호 데이터를 수득할 수 있는 처리를 하는 단계에 해당한다.This is to perform Fluorescence Activated Cell Sorting (F.A.C.S) in the flow cytometry method, and corresponds to a step of obtaining a fluorescence signal data.

이를 위해, DCF, DiOC6, Hoechest 33432 등의 유기 형광염료; 또는 양자점(QD) 등의 무기나노입자; 또는 GFP, RFP, YFP 등의 형광단백질 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 유기 형광 염료를 사용할 수 있다.
For this purpose, organic fluorescent dyes such as DCF, DiOC6, Hoechest 33432, etc .; Or inorganic nanoparticles such as quantum dots (QD); Or fluorescent proteins such as GFP, RFP, and YFP. Preferably organic fluorescent dyes can be used.

그리고, 상기 나노물질에의 노출 및 형광염색이 이루어진 세포층에 대하여 유세포 분석을 수행한 후, 상기 유세포 분석 결과에 의해 세포사멸 정도를 정량화한다. 이 때, 유세포 분석을 통한 산란광 데이터 및 형광신호 데이터를 수집하여 활성산소종의 발생정도를 측정하여 분석한다. After performing flow cytometry on the cell layer subjected to exposure to the nanomaterials and fluorescence staining, the degree of cell death is quantified by the flow cytometry results. At this time, the scattered light data and fluorescence signal data through flow cytometry is collected and analyzed by measuring the incidence of reactive oxygen species.

본 발명은 이러한 유세포 분석을 통해 얻은 결과에서 체계적인 해석이나 분석을 통해 나노입자에 의한 직접적으로 영향을 받은 세포를 분리하여 변화만을 측정하는 분석법을 제공한다. 특히, 이하와 같은 변형된 유세포 분석 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다.
The present invention provides an assay that measures only changes by separating cells directly affected by nanoparticles through systematic interpretation or analysis from the results obtained through flow cytometry. In particular, it is characterized by using the following modified flow cytometry method.

(i) 산랑광 데이터 분석을 통해 나노물질(나노입자)가 부착된 세포를 구별한다. 전면 산란광 (Forward Scatter; FS) 및 측면 산란광 (Side Scatter; SS)을 통해 나노입자(NPs)가 부착된 세포를 구별한다(i) Analysis of scattered light data to identify cells to which nanomaterials (nanoparticles) are attached. Forward Scatter (FS) and Side Scatter (SS) Differentiate cells with nanoparticles (NPs) attached

종래 유세포 분석기를 통한 세포독성 평가 시 얻을 수 있는 여러 신호 중에서 전면 산란광 (Forward Scatter; FS), 측면 산란광 (Side Scatter; SS)을 이용하여 나노입자가 부착된 세포를 구별하였다. 여기서 전면 산란광 (Forward scatter; FS)은 세포의 크기와 관련된 변수이고 측면 산란광 (Side scatter; SS)은 밀도나 세부 구조를 나타내는 변수를 나타내는데, 이러한 변수들이 나노입자가 세포에 노출되었을 경우 변화가 생기게 된다.Among the various signals that can be obtained in the cytotoxicity evaluation by the conventional flow cytometer, forward scattered light (FS) and side scattered light (Side Scatter; SS) were used to distinguish the cells to which nanoparticles were attached. Here, forward scatter (FS) is a variable related to the size of the cell and side scatter (SS) is a variable representing density or detail structure, which causes changes when the nanoparticle is exposed to the cell. do.

한 종류의 세포를 기준으로 일정 범위에 존재하는 전면 산란광과 측면 산란광이 나노입자가 세포에 흡수(uptake)됨에 따라서 빛이 많이 굴절되어 측면 산란광 (Side scatter; SS)이 커진다는 점에서 나노입자가 부착된 세포와 그렇지 않은 세포의 분리가 가능하다.
The front scattered light and the side scattered light in a range of one type of cell are absorbed by the nanoparticles (uptake) in the cell, so the light is refracted a lot, so the side scattered light (Side scatter (SS)) increases Separation of adherent and non-attached cells is possible.

(ii) 그리고, 상기 산란광 데이터 분석 결과와 형광 신호의 결합을 통하여 오직 나노입자에 대한 세포변화를 측정, 분석한다. (ii) Then, the cell change of the nanoparticles is measured and analyzed by combining the scattered light data analysis result and the fluorescence signal.

이는 F.A.C.S(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 이용하는 과정으로, 상기 F.A.C.S(Fluorescence Activated Cell Sorting)는 유세포 분석의 한 기법으로서, 세포를 적당한 형광물질로 표지한 후 관을 통해 흘리면서 형광신호 유무 및 강도에 따라 세포를 분류하는 방법이다. This is a process using Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS), and Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is a technique of flow cytometry, in which cells are labeled with a suitable fluorescent substance and flowed through a tube, depending on the presence and intensity of fluorescence signals. How to classify.

즉, 전면 산란광 (Forward Scatter; FS) 및 측면 산란광 (Side Scatter; SS)을 통해 나노입자(NPs)가 부착된 세포만을 구별해 낸 다음, 그 세포에 대한 형광 신호 데이터를 따로 분리하여 분석한다. 특히, 유세포 분석기는 각각의 세포에 대한 산란광과 형광신호를 한번에 얻을 수 있다는 장점이 있다. That is, forward scatter (FS) and side scatter (SS) Only the cells to which nanoparticles (NPs) are attached are distinguished, and the fluorescence signal data for the cells is separated and analyzed. In particular, the flow cytometer has the advantage of being able to obtain scattered light and fluorescent signals for each cell at a time.

상기 유세포 분석 결과를 정량화함에 있어서, 세포의 측방산란(SS) 세기를 이용하여 나노입자를 포함한 세포와 포함하지 않은 세포를 구별하고 나노입자 노출농도(dose)와 세포에 의한 나노입자 흡수(uptake)정도 간의 상관관계를 측정한다.In quantifying the flow cytometry results, the lateral scattering (SS) intensity of the cells is used to distinguish between the cells containing the nanoparticles and the cells not containing the nanoparticles, and the nanoparticle uptake by the cells. Measure the correlation between degrees.

보다 구체적으로, 상기 유세포 분석기의 측정결과를 분석하는 과정에 있어서 세포의 측방산란(SS) 세기가 대조군(Control) 세포 대비 일정한 비율 이상으로 측정된 세포들의 전방산란(FS) 및 이하의 형광 방출 신호를 연계하여 세포 내 나노입자의 도입에 따라 유도된 세포 사멸 및 다양한 기전변화를 측정하고 이를 기반으로 나노입자 용량-반응 관계를 나노입자의 직접적인 유해성을 객관적으로 평가하는 것이다.More specifically, in the process of analyzing the measurement result of the flow cytometer, the scattered signal of forward scattering (FS) and the following fluorescence emission of the cells whose lateral scattering (SS) intensity is measured at a ratio higher than that of the control (Control) cell In this study, cell death induced by the introduction of nanoparticles into cells and various mechanism changes are measured, and based on this, the nanoparticle dose-response relationship is used to objectively assess the direct harmfulness of nanoparticles.

본 발명의 일 구체예에서는 세포의 사멸 정도를 평가하기 위하여, 독성 평가법 중 활성 산소종의 발생(ROS)으로 인한 산화적 스트레스의 증가여부를 살펴보았는데, 나노 입자를 노출해서 세포의 산화적 스트레스를 증가시킨 후, 나노입자가 부착되거나 흡수된 세포가 받는 스트레스를, 활성산소종(ROS) 발생에 따른 형광 방출 신호를 이용하여 정확하게 측정할 수 있다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 종래 방법에 의해 평가한 결과와 본 발명에 의한 평가 결과를 비교해 봄으로써 이를 확인할 수 있었다.
In one embodiment of the present invention, in order to evaluate the degree of cell death, we examined whether the oxidative stress caused by the generation of reactive oxygen species (ROS) in the toxicity assessment method, by exposing the nanoparticles to the cell oxidative stress After the increase, the stress of the cells to which the nanoparticles are attached or absorbed can be accurately measured using a fluorescence emission signal according to the generation of reactive oxygen species (ROS). In particular, in the embodiment of the present invention it was confirmed by comparing the results of the evaluation by the conventional method with the results of the present invention.

이처럼, 본 발명은 산란광의 변화를 이용한 나노입자의 흡수(uptake) 구별법과 형광 신호의 "조합"을 통해 직접적인 나노입자의 독성을 평가할 수 있는데, 이러한 방법에 의해서, 간접적인 요인을 제외하고 나노입자에 의해 유발된 직접적인 요인에 의한 세포 변화를 측정하여 in vitro에서 세포독성을 평가할 수 있다.
As such, the present invention can evaluate the toxicity of the nanoparticles directly through the uptake of the nanoparticles using the change of scattered light and the "combination" of the fluorescence signal. Cytotoxicity can be assessed in vitro by measuring cellular changes caused by direct factors induced by.

한편, 인체에 노출된 나노 물질은 입(섭취), 코(흡입), 피부와 눈 등의 신체 외부에서 유입되어 대상기관까지 운반되면서 흡수되고 분포하며 화학물질의 특성과 노출경로에 따라서 물질의 신진대사가 이루어진다. 그리고, 이러한 피부나 다른 기관의 세포독성, 장기간 노출에 따른 피부나 기관의 축적, 신진대사에 의해 증가된 독성 및 광 독성 등의 문제가 발생하게 된다. On the other hand, nanomaterials exposed to the human body are absorbed and distributed as they flow from the outside of the body such as mouth (intake), nose (inhalation), skin and eyes, and are transported to the target organs. Ambassadors take place. In addition, problems such as cytotoxicity of such skin or other organs, accumulation of skin or organs due to prolonged exposure, and increased toxicity and phototoxicity due to metabolism occur.

그러므로, 이러한 나노입자가 생체 내에서 어떠한 위해성을 끼치는지 정확하게 파악하기 위하여 물질정보(물질의 정의 및 물리 화학적 특성), 독성정보, 노출정보, 용량정보 및 반응정보를 통해 나노 물질마다의 인체 및 환경의 위해성(독성) 평가를 진행할 필요가 있다.
Therefore, the human body and environment for each nanomaterial can be identified through substance information (definition and physicochemical properties), toxicity information, exposure information, dose information, and reaction information in order to accurately understand the risks of these nanoparticles in vivo. There is a need to conduct a risk assessment.

그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, Therefore, in another aspect, the present invention

상기 유세포 분석 결과에 의해 세포사멸 정도를 정량화하는 단계를 포함하는, in vivo 나노물질 위해성 평가방법 및 시스템에 관한 것이다.Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in A method and system for evaluating in vivo nanomaterial risk.

이 때, 상기 나노입자의 투여는 콜로이드 분산액이나 젤(크림)에 분산된 형태로 구강, 피부, 또는 정맥을 통하여 이루어질 수 있고, 상기 생체시료는 혈액, 타액, 또는 뇨일 수 있다. 그 밖의 다른 사항에 관한 설명은 앞서 설명한 in vitro 나노물질 위해성 평가방법 및 시스템의 경우와 동일하다.
At this time, the administration of the nanoparticles may be through the oral cavity, skin, or vein in the form of dispersed in a colloidal dispersion or gel (cream), the biological sample may be blood, saliva, or urine. A description of all other matters can be found in Same as in vitro nanomaterial risk assessment methods and systems.

본 발명의 in vitro 및 in vivo 나노물질 위해성 평가방법 및 시스템에 사용되는 유세포 분석의 모식도를 도 1에 나타냈다. Of the present invention in vitro And in A schematic diagram of the flow cytometry used in the in vivo nanomaterial risk assessment method and system is shown in FIG. 1.

유세포 분석은 크게 일정한 파장의 광선을 쏘여주는 장치, 이 광선으로 검체가 세포 단위로 통과할 수 있는 노즐, 이 검체를 통과한 광선 및 산란된 광선을 검출하는 검출기의 세부분으로 이루어진 장치에서 수행될 수 있다.Flow cytometry can be performed in a device consisting of a device that shoots light of a substantially constant wavelength, a nozzle through which the sample can pass cell-by-cell, the details of a detector that detects the light passing through the sample, and the scattered light. Can be.

주로 단파장인 레이저 광선이 초점이 된 유체의 흐름에 향하게 되고 가시광선과 같은 방향으로 향하고 있으면 이것을 전면 산란광이라 하며 나머지는 이에 수직으로 향하게 되어 있는데 이들을 측면 산란광이라고 한다. 각각의 입자들은 광선을 어떠한 방식으로든 산란시키게 되며 입자에 위치하거나 혹은 붙어 있는 형광물질은 광원보다 낮은 주파수에서 빛을 방출하게 된다. 이러한 산란과 형광성의 빛의 조합이 검출기에 의해 검출되어 지고 각각의 입자의 물리적, 화학적 다양한 정보를 얻을 수 있게 된다.When the laser beam, which is mainly short-wavelength, is directed at the flow of the focused fluid, and is directed in the same direction as visible light, this is called front scattered light, and the remainder is perpendicular to it. These are called side scattered light. Each particle scatters light in some way, and the phosphors on or attached to the particles emit light at a lower frequency than the light source. This combination of scattering and fluorescent light can be detected by a detector and the physical and chemical information of each particle can be obtained.

이 때, 사용할 수 있는 유세포 분석 장치는, 상업적으로 판매되는 유세포 분석기 (Flow Cytometry 또는 Fluorescence Activated Cell Sorter)를 이용할 수도 있고, 미세유체 유세포 분석 기구 (microfluidic flow cytometry)를 이용할 수도 있다.At this time, the flow cytometry apparatus that can be used may use a commercially available flow cytometer (Flow Cytometry or Fluorescence Activated Cell Sorter), or may use a microfluidic flow cytometry.

특히, 미세유체 유세포 분석 기구는 일 예로써,In particular, the microfluidic flow cytometry instrument is one example.

자외선 및 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), 수은 및 할로젠 램프, LED 광원 및 레이저 광원 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; Light sources selected from the group consisting of tungsten lamps, mercury and halogen lamps, LED light sources, laser light sources, and the like as light sources in the ultraviolet and visible light region;

세포로부터 산란 또는 형광방출되는 광신호를 검출하는 PMT(photomultiplier tube) 또는 CCD(Charge Coupled Device) 로 이루어진 검출 장치; 세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; A detection device comprising a photomultiplier tube (PMT) or a charge coupled device (CCD) for detecting an optical signal scattered or fluoresced from a cell; A cell culture platform for placing a cell culture system comprising a cell layer;

사용되는 형광 염료에 적용되는 최대 흡광 또는 형광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치; A device for selectively passing wavelengths in the light source to obtain an image in the maximum absorption or fluorescent region applied to the fluorescent dye used;

상기 장치로부터 얻어진 Data를 분석하여 세포별 전방(FS) 및 측방(SS) 산란세기, 형광세기, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 Data처리 프로그램을 포함할 수 있다. 이러한 미세유체 유세포 분석 기구와 관련하여는 한국 특허출원 10-2009-0076436호를 참조할 수 있다.
Analyze the data obtained from the device to extract one or more apoptosis factors selected from the group consisting of cell forward (FS) and lateral (SS) scattering intensity, fluorescence intensity, number of cells and shape factor values, and apoptosis process It can include data processing programs that can be quantified. Regarding such microfluidic flow cytometry apparatus, reference may be made to Korean Patent Application No. 10-2009-0076436.

본 발명의 방법은, 나노 물질의 노출에 따른 위험성(독성)를 파악하고 이해할 수 있게 함으로써, 나노 물질의 생산, 환경, 건강에 미칠 수 있는 유해성에 대한 안전지침을 확보하는 등에 유용하다.
The method of the present invention is useful for securing safety guidelines for harmful effects on the production, environment, and health of nanomaterials by making it possible to identify and understand the risks (toxicities) of exposure to nanomaterials.

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예Example 1: One: HeLaHeLa 세포에 대한 For cells 나노물질Nanomaterial 위해성 평가 Risk assessment

실시예Example 1-1: 세포 배양 및 나노 물질 처리 1-1: Cell Culture and Nanomaterial Treatment

(1) 세포 배양(1) Cell culture

배양용기에 배양된 자궁경부암세포(HeLa)(ATCC CCL-2)를 바닥면으로부터 10⁴~10⁵ cell/mL을 갖는 현탁액으로 추출하여 petri dish에 세포를 옮겨 48시간 동안 배양하였다. Cervical cancer cells (HeLa) (ATCC CCL-2) cultured in a culture vessel were extracted with a suspension having 10 ⁴ ~ 10 ⁵ cells / mL from the bottom surface and the cells were transferred to a petri dish and incubated for 48 hours.

이 때, 10 % fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) a및 1 % Penicillin-Streptomcyin (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다.At this time, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Grand) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) a and 1% Penicillin-Streptomcyin (Gibco, Grand Island, NY, USA) Island, NY, USA).

(2) 나노 물질 처리(2) nano material processing

세포표면에 나노입자가 흡착 및 흡수되는지를 비교하기 위해 같은 농도의 아연 이온과 산화아연 나노입자를 사용하였다. The same concentration of zinc ions and zinc oxide nanoparticles were used to compare the adsorption and absorption of nanoparticles on the cell surface.

정상의 HeLa 세포에 나노입자의 흡착 여부에 따른 변화를 관찰하기 위한 나노물질, 양전하를 갖는 리간드로 표면을 바꿔준 산화아연 나노입자와 음전하를 갖는 리간드로 표면을 바꿔준 산화아연, 그리고 대조하기 위한 아연 이온을 아연 농도 기준으로 각각 10, 50, 80, 100 ppm을 주입하여 3시간 동안 배양하였다. Nanomaterials for observing changes in the adsorption of nanoparticles on normal HeLa cells, zinc oxide nanoparticles that have changed their surface with ligands with positive charges, zinc oxide nanoparticles with the negatively charged ligand, and for contrasting Zinc ions were incubated for 3 hours by injecting 10, 50, 80, and 100 ppm, respectively, based on the zinc concentration.

상기 전하가 다른 산화아연 나노입자 및 아연이온에 대한 MTT 분석 결과를 도 2에 도시하였다.
MTT analysis results of zinc oxide nanoparticles and zinc ions having different charges are shown in FIG. 2.

실시예Example 1-2: 활성 1-2: active 산소종에On oxygen species 의한 by 산화적Oxidative 스트레스 측정 Stress measurement

ROS 검색법에 따라 산화적 스트레스를 측정하였다. 세포를 petri dish에 적당한 양으로 배양시키고 상기 산화아연 나노 물질을 처리 한 후에 각 dish에 최종농도가 20uM이 되도록 DCF-DA시약을 처리한 후 20분간 암실에서 배양하였다. 그리고 20분이 지난 후 세포를 모두 모아 유세포 분석기를 통해 산란광과 형광을 측정하였다.Oxidative stress was measured according to the ROS screening method. Cells were incubated in an appropriate amount in a petri dish, and after treatment with the zinc oxide nanomaterials, each dish was incubated in a dark room for 20 minutes after treatment with DCF-DA reagents to a final concentration of 20 uM. After 20 minutes, the cells were collected and scattered light and fluorescence were measured by flow cytometry.

또한, 측면 산란광이 세포의 밀도와 나노입자의 흡수(uptake) 정도와 관련이 있는지 확인하기 위하여, 아연농도 100ppm을 기준으로 하여 아연 이온과 음전하 리간드를 입힌 산화 아연 그리고 양전하 리간드를 입힌 산화아연을 각각 노출시켰다.
In addition, to determine whether the side scattered light is related to the density of the cells and the degree of uptake of the nanoparticles, zinc ions, zinc oxide coated with a negatively charged ligand, and zinc oxide coated with a positively charged ligand, respectively, were determined based on the zinc concentration of 100 ppm. Exposed.

그 결과를 도 3에 도시하였다. 산화아연 나노입자와 아연 이온에 노출된 세포의 전면 산란광(x 축)과 측면 산란광(y 축)을 2차원 그래프로 나타내었다. The results are shown in Fig. Front scattered light (x-axis) and side scattered light (y-axis) of cells exposed to zinc oxide nanoparticles and zinc ions are shown in a two-dimensional graph.

여기서 (a)는 정상세포의 분포를 나태내고 (b)는 아연 이온, (c)는 음전하를 갖는 나노입자 그리고 (d)는 양전하를 갖는 나노입자에 노출된 세포의 유세포 분석 측정결과이다. 세포의 측방산란(SS) 세기가 Control 세포군 대비 기준 이하(SS(-)) 또는 이상 (SS(+))으로 측정된 세포들의 비율이 그림(e)에 표시하였다.Where (a) represents the distribution of normal cells, (b) is zinc ions, (c) is nanoparticles with negative charges, and (d) is flow cytometry measurements of cells exposed to nanoparticles with positive charges. The ratio of cells whose lateral scattering (SS) intensity is measured below the reference (SS (-)) or above (SS (+)) relative to the control cell group is shown in Fig. (E).

이를 통해, 리간드의 전하에 따라 확연한 세포의 흡수(uptake)정도를 알 수 있었고 uptake과 상관이 없는 이온의 노출에 의해 세포의 변화를 비교해 볼 수 있었다. Through this, it was possible to determine the extent of uptake of the cells according to the charge of the ligand and to compare the changes of the cells by the exposure of ions not related to the uptake.

먼저 모든 물질을 노출했을 때, 전면산란광이 증가되는 것을 확인되었는데, 이는 세포 표면의 수포나 세포고사 과정에서 생기는 아폽토시 소포체에 의해 본래의 부피보다 크게 인식되었기 때문으로 생각된다.First, when all the material was exposed, it was confirmed that the front scattered light was increased because it was recognized by the apoptotic vesicles generated by the vesicles on the surface of the cell or by the process of apoptosis.

반면, 측면 산란광은 물질에 따라 조금 다른 경향성을 보였다. 즉,양전하 리간드로 둘러 싸인 산화아연은 측면 산란광이 크게 증가하지만, 아연이온이나 음전하를 띄는 나노입자에 노출된 세포는 정상세포와 비교에서 큰 변화가 없었다. 이러한 결과는 양전하를 띄는 나노입자가 노출된 세포는 세포의 밀도가 커졌다는 것을 의미하고 다시 말해, 나노입자가 uptake이 되었음을 알 수 있다. 이처럼, 측면 산란광은 세포의 밀도와 나노입자의 흡수(uptake) 정도와 관련이 있었다.
On the other hand, the side scattered light tends to be slightly different depending on the material. In other words, the zinc oxide surrounded by the positively charged ligand greatly increased the side scattering light, but the cells exposed to the zinc ion or negatively charged nanoparticles did not show a significant change in comparison with the normal cells. These results indicate that the cells exposed to the positively charged nanoparticles had increased cell density, that is, the nanoparticles were uptake. As such, the side scattered light was related to the cell density and the degree of uptake of the nanoparticles.

상기 결과를 통해, 아연 이온이나 각각의 전하의 나노입자의 노출은 모두 아폽토시스 소포체형성을 포함한 세포 사멸과정을 유도함을 알 수 있고, 그 중 측면 산란광을 크게 증가시키는 양전하를 띄는 나노입자의 경우 표면차지가 세포 사멸에 더 큰 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 수 있었다.
These results indicate that exposure of zinc ions or nanoparticles of each charge induces cell death processes including apoptotic vesicle formation. Among them, surface charge is observed in the case of positively charged nanoparticles that greatly increase side scattered light. Was found to have a greater effect on cell death.

실시예Example 1-3: 세포에 나노입자가 흡수( 1-3: Nanoparticles are absorbed by cells ( uptakeuptake )되어가는 과정의 변화Changes in the process

실시예 1-2에서 결과를 토대로, 시간에 따라 나노입자가 uptake되어 가는 과정에서의 변화를 유세포 분석기를 통해 관찰하였다.
Based on the results in Example 1-2, changes in the process of uptake of the nanoparticles with time were observed by flow cytometry.

그 결과, 양전하를 띄는 나노입자를 80ppm노출했을 때 전면 산란광과 측면 산란광의 변화는 도 4에 나타내었다. As a result, the change of the front scattered light and the side scattered light is shown in FIG. 4 when 80 ppm of positively charged nanoparticles are exposed.

초반 30분에는 나노입자가 노출된 세포는 나노입자가 표면에 약간 부착하면서 측면 산란광이 증가하였지만, 전면 산란광의 분포는 정상세포와 같았다. 하지만 시간이 지날수록 전면 산란광의 분포는 점차 증가하는 방향으로 이동하고 측면 산란광 역시 증가하였다. In the first 30 minutes, the cells exposed to the nanoparticles had increased side scattered light as the nanoparticles slightly adhered to the surface, but the front scattered light distribution was the same as normal cells. However, as time passed, the distribution of front scattered light gradually increased and the side scattered light also increased.

이러한 변화를 이차원적으로 도 4(a)~(e)에 나타내었고, 이를 정량적으로 분석한 것을 도4 (f),(g)에 도시하였다. (a)는 정상세포의 분포이고 (b)는 표면에 양전하를 갖는 산화아연 나노입자 80ppm을 0.5h 노출했을 때, (c) 1h, (d) 2h 그리고 (e)는 3h를 노출했을 때의 유세포 분석 측정결과이다. 그리고 시간에 따라 나노입자가 도입된 세포들의 변화와 세포 사멸과정의 변화를 그래프 (f),(g)에 각각 나타내었다. These changes are shown two-dimensionally in Figures 4 (a) to (e), and the quantitative analysis thereof is shown in Figures 4 (f) and (g). (a) is the distribution of normal cells and (b) is the exposure of 80 ppm of zinc oxide nanoparticles with positive charges on the surface for 0.5h, and (c) 1h, (d) 2h and (e) are the exposure of 3h. Flow cytometry measurement results. In addition, the changes of the cells into which the nanoparticles were introduced and the changes in the cell death process were shown in the graphs (f) and (g), respectively.

이를 통해, 건강한 정상 세포는 낮은 전면 산란광과 측면 산란광(FS(-),SS(-))을 갖게 되고, 반면 나노입자가 노출이 되어 uptake이 되면 짧은 시간 안에 측면 산란광이 증가(FS(-),SS(+))함을 확인할 수 있다. As a result, healthy normal cells have low front scattered light and side scattered light (FS (-), SS (-)), whereas when the nanoparticles are exposed and uptake, the side scattered light increases in a short time (FS (-)). , SS (+)).

그리고, 이것이 더욱 진행이 되어 세포 사멸과정이 진행하게 되면 그때부터 전면 산란광이 증가 되는데 나노 입자가 uptake된 상태에서는 높은 전면 산란광과 측면 산란광(FS(+),SS(+))을 갖지만, 나노입자에 의한 간접적인 요인에 의한 사멸은 낮은 측면 산란광을 갖은 상태로 높은 전면 산란광(FS(+),SS(-))을 갖게 됨을 알 수 있다. And when this progresses further, the cell death process increases from then on, the front scattered light is increased. It can be seen that the killing caused by the indirect factor by the high front scattered light (FS (+), SS (-)) with low side scattered light.

이러한 변화 관찰을 통해 나노입자의 kinetics는 세포 사멸과정보다 빠르다는 점을 알 수 있고, 세포의 일부는 나노입자에 uptake이라는 직접적인 원인에 의해 세포 사멸과정이 진행되는(FS(+),SS(+)) 반면, 일부는 나노입자 없이 사멸과정이 진행되고 있음(예: FS(+),SS(-))을 알 수 있다. 이는 아마도 녹아 나온 아연 이온에 의한 간접적인 세포 사멸과정으로 생각된다.
Observation of these changes suggests that kinetics of nanoparticles are faster than apoptosis, and some of the cells undergo apoptosis due to the direct cause of uptake of nanoparticles (FS (+), SS (+). On the other hand, some of the killing process is progressing without nanoparticles (eg FS (+), SS (-)). This is probably thought to be an indirect cell death process by the dissolved zinc ions.

실시예Example 1-4: 나노입자와 관련된 세포독성 1-4: Cytotoxicity Associated with Nanoparticles

실시예 1-3에서 전면 산란광과 측면 산란광의 데이터 분석을 통해 나노입자가 uptake 된 세포의 직접적인 세포독성과 이온에 의한 간접적인 세포 독성의 구별하고자 하였다. In Example 1-3, the data of the front scattered light and the side scattered light were analyzed to distinguish between direct cytotoxicity of cells in which nanoparticles were uptaken and indirect cytotoxicity by ions.

이에, 나노입자와 관련된 세포독성 메카니즘 연구를 하고자 활성 산소종의 형성을 통한 세포 독성을 평가하였다. 활성 산소종 발생은 세포 사멸을 내재화하고 있는 나노입자의 초기 세포의 반응이다.
Thus, in order to study the cytotoxic mechanism related to nanoparticles, the cytotoxicity through the formation of reactive oxygen species was evaluated. Reactive oxygen species generation is the initial cellular response of nanoparticles internalizing cell death.

그 결과를 도 5에 도시하였다. The results are shown in FIG.

도 5(a)~(d)는 산란광에 대한 정보이고 (e)~(h)는 전체 세포에 대한 활성 산소종의 형성의 분포이다. 그리고, (i)~(l)은 각각의 농도에서 산란광의 데이터를 통해 나노입자를 uptake 한 세포를 구별하여 그에 해당하는 세포의 활성 산소종 형성을 따로 측정한 결과이다. 5 (a) to 5 (d) are information on scattered light and (e) to (h) are distributions of active oxygen species formation for whole cells. And, (i) ~ (l) is a result of measuring the formation of active oxygen species of the cells corresponding to the cells uptake the nanoparticles up through the scattered light data at each concentration.

즉, 나노입자를 많이 흡수한 세포들이 활성 산소종을 많이 발생하고 있음을 확인할 수 있고, 이러한 결과들을 전체 세포에 대한 용량-반응(Dose-Response)관계로 정량하여, 나노입자에 의한 직접적인 용량-반응 관계와 비교한 그래프를 도 6에 나타내었다. That is, it can be confirmed that cells that have absorbed a lot of nanoparticles are generating a lot of reactive oxygen species, and these results are quantified in a dose-response relationship to whole cells, and thus, direct dose by nanoparticles- The graph compared with the reaction relationship is shown in FIG.

이를 통해 알 수 있는 바와 같이, 두 경우의 용량-반응관계의 정량값은 명백히 그 차이가 존재한다. 따라서, 나노입자에 의한 직접적인 용량-반응 관계에 의해서 보다 정확한 나노입자 위해성 평가가 가능함을 알 수 있다.
As can be seen from this, there is clearly a difference in the quantitative value of the dose-response relationship in the two cases. Thus, direct dose-response relationships with nanoparticles suggest that more accurate nanoparticle risk assessments are possible.

또한, 양전하를 갖는 산화아연 나노입자 30 ppm을 노출했을 때 정상 세포의 기준선을 중심으로 측면 산란광이 큰 부분과 작은 부분에서의 활성산소 발생 정도를 측정하였다.In addition, when 30 ppm of zinc oxide nanoparticles having a positive charge were exposed, the degree of active oxygen generation in large and small portions of side scattered light was measured around the baseline of normal cells.

그 결과를 도 7에 나타내었다. 그림 (b)~(e)는 (a)에서 노란색 박스로 gate된 영역 안의 세포들에 대하여 전면 산란광이 증가하는 순서대로 활성산소 발생정도를 측정한 것이다. 이를 통해서 전면 산란광이 증가하고, 측면 산란광이 큰 부분에서 활성산소 발생도 증가함을 알 수 있었다.
The results are shown in Fig. Figures (b) to (e) show the generation of free radicals in the order of increasing front scattered light for the cells in the yellow gated area in (a). It was found that the front scattering light was increased and the active oxygen generation was increased in the part where the side scattering light was large.

실시예Example 2: 다른 세포주 2: other cell lines RawRaw 264.7에 대한 For 264.7 나노물질Nanomaterial 위해성 평가 Risk assessment

실시예 1의 HeLa 세포 외에도 다른 세포주에서의 독성 평가에 적합 여부를 연구하기 위하여, 이번에는 Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrphage)에 적용하여 세포 독성을 평가하였다. 공정은 상기 설명한 것과 거의 동일하게 수행하였다. 즉, 실시예 1-3과 1-4에서처럼, 나노 입자가 uptake된 세포의 직접적인 세포독성과 이온에 의한 간접적인 세포 독성을 전면 산란광과 측면 산란광, 활성 산소종의 발생을 통해 평가하고자 하였다.
In addition to the HeLa cells of Example 1 in order to study the suitability of the toxicity evaluation in other cell lines, this time was applied to Raw 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrphage) to evaluate the cytotoxicity. The process was carried out almost the same as described above. That is, as in Examples 1-3 and 1-4, direct cytotoxicity and indirect cytotoxicity by ions of the cells uptake of the nanoparticles were evaluated through the generation of front scattered light, side scattered light, and reactive oxygen species.

그 결과를 도 8과 도 9에 도시하였다. The results are shown in FIGS. 8 and 9.

도 8(a)~(d)는 Zn² ⁺ ion, (e)~(h)는 양전하를 띤 ZnO 나노입자 (^PLLZnO), (i)~(l)은 음전하를 띤 ZnO 나노입자 (^PAAZnO)에 노출된 Raw 264.7 세포의 유체포측정 결과의 산란분포도이다. Figure 8 (a) ~ (d) are ^{^{Zn 2 + ion, (e)}} ~ (h) are ZnO nanoparticles positively charged ^{(PLL ZnO), (i)} ~ (l) are ZnO nanoparticles negatively charged ^(PAA Scattering distribution diagram of fluid quantitative measurement results of Raw 264.7 cells exposed to ZnO).

이를 통해, HeLa 세포의 실험결과 (실시예 1-3) 와 유사하게 독성물질의 초기 농도에서 전면 산란광이 약간 증가하고, 농도가 증가함에 따라 측면 산란광의 분포가 많이 증가함을 확인하였다. Zn² ⁺ ion과 ZnO 나노입자 간의 차이를 비교하면, Zn²⁺ ion이 80ppm 3h 노출했을 때, 28.75% uptake이 일어난 반면 서로 다른 전하를 띤 ZnO 나노입자의 경우 98.91% (양전하), 98.03% (음전하) 의 uptake이 일어났다. 그리고, ion의 경우, 흡수가 일어나도 세포의 모양, 밀도의 변화가 나노입자의 변화보다 작기 때문에 측면 산란광의 변화가 상대적으로 작게 나타났다. Through this, similar to the experimental results of HeLa cells (Example 1-3), the front scattered light slightly increased at the initial concentration of the toxic substance, and it was confirmed that the distribution of the side scattered light increased as the concentration increased. Comparing the difference between Zn ² ⁺ and ZnO nanoparticles, 28.75% uptake occurs when 80 ppm 3h of Zn ²⁺ ion is exposed, whereas 98.91% (positive charge), 98.03% ( Uptake of negative charges occurred. In the case of ions, the change in side scattered light was relatively small because the change in cell shape and density was smaller than the change in nanoparticles even when absorption occurred.

한편, 도 9(a)~(d)는 Zn² ⁺ ion, (e)~(h)는 양전하를 띤 ZnO 나노입자 (^PLLZnO), (i)~(l)은 음전하를 띤 ZnO 나노입자 (^PAAZnO) 에 노출된 Raw 264.7 세포의 유체포측정 결과의 활성산소종 발생세기에 대한 히스토그램이다.On the other hand, Figure 9 (a) ~ (d) is Zn ² ⁺ ion, (e) ~ (h) is a positively charged ZnO nanoparticles ( ^PLL ZnO), (i) ~ (l) is a negatively charged ZnO nanoparticles Histogram of free radical species development in raw 264.7 cells exposed to ^PAA ZnO.

즉, HeLa 세포의 실험결과 (실시예 1-4) 와 유사하게 Raw 264.7 세포에서도 독성물질의 농도가 증가함에 따라 활성산소종이 많이 발생하고 있음을 확인할 수 있었다. Zn² ⁺ ion과 음전하를 띈 나노입자 (^PAAZnO) 는 약간의 활성산소종이 증가하였고, 이에 비해 양전하를 띈 나노입자 (^PLLZnO) 의 활성산소종은 많이 증가하였다. 세포 자체가 음전하인 것을 고려할 때, 같은 양의 나노입자가 흡수되더라도 세포에 더 큰 손상을 입히는 것을 알 수 있었다.
That is, similar to the experimental results of the HeLa cells (Example 1-4), it was confirmed that the active oxygen species in the Raw 264.7 cells as the concentration of the toxic substances increases. Zn ² ⁺ ion and negatively charged nanoparticles ( ^PAA ZnO) slightly increased the active oxygen species, whereas positively charged nanoparticles ( ^PLL ZnO) increased the active oxygen species. Considering that the cells themselves are negatively charged, even if the same amount of nanoparticles are absorbed, they can cause more damage to the cells.

상기의 결과를 통해, 독성물질을 많이 uptake할수록 측면 산란광이 증가하며, 이와 비례하여 활성산소종도 증가하는 독성 결과를 얻을 수 있었다. 즉, Zn² ⁺ ion, 양전하를 띈 나노입자 (^PLLZnO), 음전하를 띈 나노입자 (^PAAZnO) 에 대한 Raw 264.7 세포의 독성평가는 상기의 실시예 1-3, 1-4와 유사한 독성결과를 나타냄을 알 수 있었으며, 당해 방법이 HeLa 세포 뿐만 아니라 다양한 in vitro, in vivo 세포주들에 대하여 적용가능함을 확인시켜 주었다.
From the above results, it was found that the side scattering light increases with increasing uptake of toxic substances, and the toxic effect of increasing active oxygen species in proportion thereto is obtained. In other words, the toxicity of Raw 264.7 cells against Zn ² ⁺ ion, positively charged nanoparticles ( ^PLL ZnO), and negatively charged nanoparticles ( ^PAA ZnO) was similar to that of Examples 1-3 and 1-4. It was confirmed that the method is applicable to various in vitro and in vivo cell lines as well as HeLa cells.

실시예Example 3: 다른 종류의 나노입자 3: different kinds of nanoparticles SiOSiO ₂₂ 에 대한 위해성 평가Risk assessment for

실시예 1-2의 방법을 따르되, 나노입자로서 ZnO 나노입자가 아닌 다른 종류의 SiO₂가 HeLa 세포에 uptake 되어 나타나는 직접적인 세포독성을 관찰함으로써, 유세포 분석을 이용한 독성평가가 ZnO 나노입자 외 다른 나노입자에도 적용됨을 확인코자 하였다.By following the method of Example 1-2, the toxicity evaluation using flow cytometry was observed by observing the direct cytotoxicity of SiO ₂ other than ZnO nanoparticles as the nanoparticles uptake in HeLa cells. It was also intended to confirm the application to the particles.

크기가 다르고, 음전하를 띈 SiO₂ 나노입자 (표면처리하지 않은 SiO₂ : 30 nm, 100 nm, & 300 nm) 와 양전하를 띈 SiO₂ 나노입자 (^PLL(+)SiO₂ : 30 nm, 100 nm, & 300 nm) 를 uptake한 HeLa 세포의 유세포 측정을 하여 나노입자 크기와 표면전하에 따른 세포독성의 차이를 확인하였다.
Different sizes, SiO ₂ nanoparticles ttuin negatively charged (non-surface-treated _{SiO 2: 30 nm, 100 nm} , & 300 nm) SiO 2 nanoparticles ttuin to the positive charge ^{_{(PLL (+) SiO 2:}} 30 nm, 100 nm , & 300 nm) uptake of HeLa cells was confirmed by the flow cytometry of the cytotoxicity according to the nanoparticle size and surface charge.

그 결과를 도 10에 도시하였다. The results are shown in FIG.

도 10(a)~(d)은 음전하를 띤 SiO₂ 나노입자 (표면처리하지 않은 SiO₂ : 30 nm, 100 nm, & 300 nm), (e)~(h)는 양전하를 띈 SiO₂ 나노입자 (^PLL(+)SiO₂ : 30 nm, 100 nm, & 300 nm) 100ppm을 3h 노출한 HeLa 세포에 대한 산란분포도이다. 10 (a) to (d) show negatively charged SiO ₂ nanoparticles (SiO ₂ without surface treatment: 30 nm, 100 nm, & 300 nm), and (e) to (h) positively charged SiO ₂ nanoparticles. Scattering distribution diagram for HeLa cells exposed to 100 ppm of particles ( ^PLL (+) SiO ₂ : 30 nm, 100 nm, & 300 nm) 3h.

SiO₂ 의 크기가 증가할수록 세포내 흡수량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 크기가 작은 입자 (30 nm, 100 nm)에서 표면 전하에 따른 흡수량의 차이는 크지 않으나, 크기가 큰 입자 (300nm) 의 경우 양전하를 띈 SiO₂ 나노입자의 흡수량이 더 많음을 관찰하였다. 이를 통해, HeLa 세포는 크기가 큰 SiO₂ 나노입자, 양전하를 띈 SiO₂의 경우 더 많은 양을 uptake함을 알 수 있었다. As the size of SiO ₂ was increased, the intracellular uptake increased. In the small particles (30 nm, 100 nm), the difference in absorption amount according to the surface charge is not large, but the larger the particles (300 nm) were observed to have more absorption of positively charged SiO ₂ nanoparticles. This allows HeLa cells to grow in large SiO ₂ sizes. In the case of nanoparticles, positively charged SiO ₂ , the higher amount was taken up.

이와 같이, 본 발명의 유세포 분석을 통한 독성평가는 ZnO 나노입자 이외에도 SiO₂ 등 다른 나노입자의 독성평가에도 유효한 바, 본 발명을 이용하여 다양한 나노물질의 위해성을 보다 정확하고 재현성있게 할 수 있음을 알 수 있다.
As such, the toxicity evaluation through flow cytometry of the present invention is SiO _{2 in} addition to ZnO nanoparticles As it is also effective in the toxicity evaluation of other nanoparticles, it can be seen that the present invention can make the risk of various nanomaterials more accurate and reproducible.

비교예Comparative example 1: 종래 독성 평가 방법과의 비교 1: Comparison with conventional toxicity assessment methods

본 발명에서 제시한 나노입자에 의한 직접적인 세포 독성 평가법과 기존의 방법을 통한 세포 독성 평가법을, 활성산소종(ROS) 발생 측정 사례를 통해 비교하였다.Direct cytotoxicity evaluation method by the nanoparticles presented in the present invention and cytotoxicity evaluation method through the conventional method were compared through the case of measuring the generation of reactive oxygen species (ROS).

그 결과를 도 11에 도시하였다. (a)~(d)는 각 농도별 유세포 산란광 측정결과이고 (e)~(h)는 기존의 방법을 통해 측정된 모든 세포에 대한 활성산소 발생 결과이고, (i)~(l)은 나노입자가 도입된 세포들만의 활성산소종(ROS) 발생정도만을 측정하고 이에 따른 활성산소종(ROS) 발생이 Control 세포군 대비 일정한 비율 이상으로 측정된 세포들의 양을 표시한 결과이다.The results are shown in FIG. (a) ~ (d) is the flow cytometry scattering light measurement results for each concentration (e) ~ (h) is the result of free radical generation for all cells measured by the existing method, (i) ~ (l) is nano It is the result of measuring only the generation of reactive oxygen species (ROS) only in the cells in which the particles were introduced, and the amount of cells measured at a certain ratio or more relative to the control cell population according to the generation of reactive oxygen species (ROS).

그리고, 상기 측정 및 분석결과를 이용하여 전체 세포에 대한 용량-반응(Dose-Response)관계와 나노입자에 의한 직접적인 용량-반응관계를 비교한 그래프를 도 12에 도시하였다.In addition, FIG. 12 shows a graph comparing the dose-response relationship with respect to the whole cells and the direct dose-response relationship with the nanoparticles using the measurement and analysis results.

이러한 결과들은 전체에 대한 활성 산소종과 나노입자를 포함 세포의 활성 산소종의 분포가 차이가 분명히 존재하고 특히 후자에서 더 큰 활성 산소종 분포를 보인다는 점에서 나노입자가 세포 사멸과정의 kinetics나 경로를 다르게 할 수 있음을 보여준다. These results indicate that the distribution of reactive oxygen species and the active oxygen species in the cells including the nanoparticles with respect to the whole is clearly present, especially in the latter, the nanoparticles are kinetics of cell death process Demonstrates that the path can be different.

Claims

Exposing the cell layer to nanomaterials and fluorescing;
Performing flow cytometry on the cell layer; And
Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in In vitro nanomaterial risk assessment method.

The method of claim 1, wherein the flow cytometry results are scattered light data and fluorescence signal data.

The method of claim 2, wherein the scattered light data is used to distinguish the cells uptake the nanomaterials, and the fluorescence signal data is used to evaluate the degree of apoptosis for the cells that absorbed the nanomaterials. How to

The method of claim 1, wherein the degree of cell death is quantified by a degree of reactive oxygen species generation (ROS assay).

The method of claim 1, wherein the nanomaterial is gold nano, silver nano, single-walled carbon nanotube (SWCNT), multi-walled carbon nanotube (MWCNT), fullerene (fullerene, C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide And at least one nanomaterial selected from the group consisting of aluminum oxide, cerium oxide, zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimer, and nanoclays.

The method of claim 1, wherein the cell layer is formed on a microfluidic cell chip, a multi-well or a slide glass.

The method of claim 1, wherein the fluorescent dye is performed using an organic fluorescent dye, inorganic nanoparticles or fluorescent protein.

The method of claim 1, wherein the exposure to the nanomaterials uses chemical exposure mechanisms, or upright and inverted exposure mechanisms.

The method of claim 8, further comprising measuring non-uniform concentrations of the nanomaterials according to the degree of aggregation or precipitation of the nanomaterials when exposed to the nanomaterials using the upright and inverted exposure mechanisms. .

Administering the nanomaterial to the experimental animal;
Collecting a biological sample from the experimental animal and fluorescing the same;
Performing flow cytometry on the biological sample; And
Quantifying the degree of apoptosis by the flow cytometry result, in In vivo nanomaterial risk assessment method.

The method of claim 10, wherein said administration is through the mouth, skin, or vein.

The method of claim 10, wherein the biological sample is blood, saliva, or urine.

The method of claim 10, wherein the flow cytometry results are scattered light data and fluorescence signal data.

The method of claim 13, wherein the scattered light data is used to distinguish a biological sample from which the nanomaterial is taken up, and the fluorescence signal data is used to evaluate the degree of cell death of the biological sample to which the nanomaterial is absorbed. How to feature

The nanomaterial of claim 10, wherein the nanomaterial is gold nano, silver nano, single-walled carbon nanotube (SWCNT), multi-walled carbon nanotube (MWCNT), fullerene (C ₆₀ ), iron nanoparticles, carbon black, titanium dioxide. And at least one nanomaterial selected from the group consisting of aluminum oxide, cerium oxide, zinc oxide, silicon dioxide, polystyrene, dendrimer, and nanoclays.

The method of claim 10, wherein the fluorescent dye is performed using an organic fluorescent dye, an inorganic nanoparticle, or a fluorescent protein.

The method according to claim 1 or 10,
The flow cytometry is
Light source device; A detection device for detecting scattered light and a fluorescence signal; a cell culture platform; And a data processing device for quantifying the degree of cell death.

18. The method of claim 17, wherein the flow cytometry distinguishes cells that uptake nanomaterials using the intensities of front and side scattered light.

19. The method of claim 18, wherein the cells uptake the distinguished nanomaterial are analyzed in conjunction with a fluorescence emission signal.