KR20120078687A

KR20120078687A - 새로운 효소를 이용한 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법

Info

Publication number: KR20120078687A
Application number: KR1020120056983A
Authority: KR
Inventors: 오창현; 조정혁
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2012-07-10

Abstract

본 발명은 새로운 효소를 이용한 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 1); 염기로 pH를 조절하면서 신타 CLEC-PA 효소를 넣고 교반하여 아미노기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 2); 및 무기산으로 pH를 조절하여 세팔로스포린계 항생제 중간체를 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 아미노기 보호기의 탈보호화 단계에서 취급이 용이하고 안정한 신타 CLEC-PA 효소를 이용하여 고순도, 고효율의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물을 공업적으로 합성할 수 있어, 세팔로스포린계 항생제 개발시 유용하게 사용될 수 있다.

Description

새로운 효소를 이용한 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법{Process for the preparation of cephalosporin intermediate using new enzyme}

본 발명은 새로운 효소를 이용한 세팔로스포린계 항생제 중간체의 효율적인 대량생산 방법에 관한 것이다.

세팔로스포린계 항생제는 인체 및 동물에 있어서 병원성 박테리아로 인해 유발된 질병을 치료하는데 널리 사용되며, 특히 페니실린 화합물과 같은 다른 항생제에 대해 내성이 있는 박테리아로 인한 질병의 치료와 페니실린 과민성 환자의 치료에 유용하다. 여러 경우에 있어서 그람양성 및 그람음성 미생물들에 모두 활성을 나타내는 항생제를 사용하는 것이 바람직한 바, 따라서 여러가지 형태의 광범위한 세팔로스포린계 항생제의 개발에 관한 연구가 계속되어 왔다.

7-아미노-3-세펨-4-카르복실산(7-amino-3-cephem-4-carboxylic acid; 이하 7-ANCA), 7-아미노-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실산(7-amino-3-[propen-1-yl]-3-cephem-4-carboxylic acid; 이하 7-APRA), 7-아미노-3-[2-(4-메틸티아졸-5-일)비닐]-3-세펨-4-카르복실산(7-amino-3-[2-(4-methylthiazol-5-yl)vinyl]-3-cephem-4-carboxylic acid; 이하 7-ATVA) 등은 광범위한 항균력을 가지는 대표적인 3세대 세팔로스포린계 항생제인 Ceftizoxime, Ceftibutene 및 Cefprozil의 제조시 사용되는 핵심적인 중간체 화합물이다.

상기 7-ANCA, 7-APRA 및 7-ATVA는 주로 하기 화학식 1에 표시되는 바와 같이, 수화물로 존재한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R은 H, 프로페닐, (4-메틸티아졸-5-일)비닐이고,

x는 3~6이다)

이때, 상기 Ceftizoxime, Ceftibutene 및 Cefprozil은 광범위한 병원균에 대하여 탁월한 항균 작용을 나타내며, 생체 내에서의 안정성도 우수하기 때문에 가장 주목받고 있는 제3세대 세파계 항생제 중 하나로서, 인후두염, 급성기관지염, 편도염, 폐렴, 중이염 등에 뛰어난 효능을 나타내므로 인기 있는 세파계 항생제이다.

따라서 세팔로스포린계 항생제의 제조시 중간체로 사용되는 7-ANCA, 7-APRA 및 7-ATVA의 제조는 상기 세팔로스포린계 항생제의 순도 및 수율에 영향을 미치기 때문에 높은 안정성을 나타내고, 취급이 용이하며 고순도, 고수율로 7-ANCA, 7-APRA 및 7-ATVA를 제조하는 것은 매우 중요한 일이다.

일반적으로, 상기 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조는 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,

화학식 2의 화합물에서 카르복실기의 보호기 및 아미노기의 보호기를 제거하는 단계를 포함한다.

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서, R은 화학식 1에서 정의한 바와 같다)

이때, 카르복실기 보호기를 제거하기 위하여는 페닐 또는 크레졸(cresol)이 사용되고, 아미노기 보호기를 제거하기 위하여는 오염화인, 피리딘 등이 사용된다. 그러나, 상기 아미노기 보호기를 제거하기 위해 사용되는 오염화인, 피리딘 등은 강산 또는 강염기의 유독성 용매이므로 인체에 해롭고, 환경오염의 원인이 되며, 부산물이 많이 생성되어 수율이 저하되는 문제가 있다.

따라서, 상기 문제를 해결하기 위하여, 아미노 보호기를 제거할 수 있는 효소를 도입하는 방법이 고안되었으며, 상기 효소로써 페니시리아시라제 또는 페니시리아미다제가 사용되고 있다. 상기 효소들은 물에 반응시킬 수 있으며 재사용이 가능하므로 친환경적이다. 그러나, 대량생산에는 기존 화학적 방법에 비하여 경제성이 낮아 현장적용에 많은 문제점을 가지고 있다.

따라서 안정성이 높고, 재현성과 현장성이 있으며, 친환경적이고, 수율 및 순도가 높은 새로운 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 세팔로스포린계 항생제 중간체를 효율적으로 대량생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 신타(Syntha) CLEC-PA(Cross-Linked Enzyme Crystal-Penicillin G Amidase/Acylase) 효소를 사용하여 안정성이 높고, 재현성과 현장성이 있으며, 수율 및 순도가 높은 세팔로스포린계 항생제 중간체를 대량생산할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 안정성이 높고, 재현성과 현장성이 있으며, 수율 및 순도가 높고, 대량생산이 가능한 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 1);

염기로 pH를 조절하면서 신타 CLEC-PA 효소를 넣고 교반하여 아미노기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 2); 및

무기산으로 pH를 조절하여 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체를 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단계 3에서 생성된 세팔로스포린계 항생제 중간체에 메탄올 수용액 및 염기를 넣고 용해시킨 후, 산을 첨가하여 결정성 수화물을 제조하는 단계(단계 4)를 더 포함하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 아미노기 보호기의 탈보호화 단계에서 취급이 용이하고 안정한 신타 CLEC-PA 효소를 이용하여 고순도, 고효율의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물을 공업적으로 합성할 수 있어, 세팔로스포린계 항생제 개발시 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용되는 신타 CLEC-PA 효소의 결정모양을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 의한 7-APRA의 XRD 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 의한 결정성 7-APRA 수화물의 XRD 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 의한 7-ANCA의 XRD 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 의한 결정성 7-ANCA 수화물의 XRD 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 1);

무기산으로 pH를 조절하여 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체를 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 하기 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법을 제공한다.

[화학식 2]

[화학식 1]

(상기 화학식 1 및 2에 있어서, 상기 R은 H, 프로페닐, (4-메틸티아졸-5-일)비닐이고, x는 3~6이다)

먼저, 상기 단계 1은 화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 종래 기술의 방법에 의해 제조되거나 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 첨가하는 크레졸 또는 페놀의 양은 카르복실기의 보호기가 탈보호될 수 있는 적절한 양으로 사용될 수 있다.

다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 카르복실기의 보호기가 탈보호된 화합물에 염기로 pH를 조절하면서 신타 CLEC-PA 효소를 넣고 교반하여 아미노기의 보호기를 탈보호하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 사용되는 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 탄산알칼리금속; 탄산수소나트륨, 산화나트륨, 수산화칼륨 등의 수산화알칼리금속; 암모니아수; 트리메틸아민 등의 트리알킬아민 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 pH는 7.5~8.0으로 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 신타 CLEC-PA 효소는 도 1에 나타낸 바와 같이 유리 또는 결정화 형태로 되어 있기 때문에 취급하기 쉽고 반응의 효율성이 높아 공업적으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 신타 CLEC-PA 효소는 대장균으로부터 유도된다. 상기 효소의 사용량은 효소의 종류 ,기질, 반응, 온도, 형평 도달점, 반응 농도 등에 의하여 달라지나, 본 반응에서는 기질 1 g에 대해 0.01~20 g을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 신타 CLEC-PA 효소는 여과후, 동일 반응에 재사용될 수 있다.

다음으로, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 카르복실기 및 아미노기의 보호기가 탈보호된 중간체 화합물에 무기산으로 pH를 조절하여 상기 중간체를 결정화하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 무기산은 상기 중간체의 결정화를 방해하지 않는 산이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 염산, 질산, 황산 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 pH는 1.5~2.5로 유지하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 단계 3에서 생성된 세팔로스포린계 항생제 중간체에 메탄올 수용액 및 염기를 넣고 용해시킨 후, 산을 첨가하여 결정성 수화물을 제조하는 단계(단계 4)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 메탄올 수용액은 메탄올:물=5:1~1:2의 비율로 혼합되는 것이 바람직하며, 메탄올:물=4:1인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 메탄올 수용액 내의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 농도는 5~20%인 것이 바람직하며, 10%가 더욱 바람직하다

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 산은 염산, 황산, 질산 등을 사용할 수 있다.

상기 단계 4에서 산 처리된 후, 여과, 세척, 건조를 통해 결정성 중간체 수화물이 형성된다. 상기 제조방법으로 제조된 결정성 중간체 수화물은 도 2~5와 같은 XRD 피크를 나타내고, 수율은 최고 93%로 나타났으며, 순도 또한 99%로 나타났다.

또한, 상기 신타 CLEC-PA 효소는 아미노기 보호기의 탈보호 실험에서 종래 탈보호 효소로 사용되는 페니시린아미다제보다 반응시간을 1~4시간 단축시키며 수율을 약 10% 향상시키는 것으로 나타났다(표 1~3 참조).

따라서, 상기 신타 CLEC-PA 효소는 반응의 효율성이 높고, 취급하기 용이하며, 유독한 유기용매를 필요로 하지 않아 환경친화적이므로 결정성 수화물의 제조시 공업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 7-아미노-3-[ 프로펜 -1-일]-3- 세펨 -4- 카르복실산(7-APRA)의 제조

p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실레이트(200 g, 0.42 mol)를 크레졸 500 mL에 가하고 35-40 ℃에서 밤새 교반시켰다. TLC로 반응유무를 확인한 후 에틸아세테이트 2 L를 가한 뒤 탄산수소나트륨수용액(탄산수소나트륨 50 g을 물 1.5 L에 녹인 용액)을 천천히 가한 뒤 30분 동안 실온에서 교반시켰다. 다음으로 수용액층의 크레졸을 제거하기 위하여 에틸아세테이트(500mL)로 2회 세척하였다. 물층을 분리한 뒤 신타 CLEC-PA 효소 20 g을 가하고 25-30 ℃에서 탄산수소나트륨수용액을 사용하여 pH를 7.5-8.0을 유지하면서 3시간 동안 교반시켰다. TLC로 반응유무를 확인한 후 효소를 여과,분리하였다. 물층을 카본착콜을 가하고 1시간 교반한 다음 여과하였다. 메탄올 2 L를 가한 뒤 2N-HCl로 pH를 3으로 맞추어 백색 고체를 생성시켰다. 이 고체를 여과한 후 증류수, 아세톤으로 세척, 건조하여 목적화합물(93.8 g, 93%)을 얻었다.

¹H-NMR(D₂O+NaHCO₃, 300MHz): δ 1.68, 1.87 (3H, each, d, J = 6.0 Hz) 3.40 (d, 1H, J = 17.3 Hz), 3.69 (d, 1H, J = 17.3 Hz), 5.14 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 5.51 (d, 1H, J = 11.1 Hz), 5.77 (dd, 1H, J = 5.6, 4.5 Hz), 6.02 (d, 1H, J = 11.1).

< 실시예 2> 결정성 7- APRA 수화물 합성

상기 실시예 1에서 제조된 7-APRA 10 g에 H₂O 200 mL, MeOH 50 mL를 넣고, 2N-탄산나트륨 40 mL를 적가한 후 실온을 유지하며 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 이후, 반응용액에 2N-HCl 약 20-30 mL를 실온을 유지하면서 천천히 적가하여 완전히 녹인 후, 다시 실온에서 30분간 교반한 다음 여과하고 아세톤 소량으로 세척하여 50 ℃에서 1-2시간 동안 훈풍 건조하여 결정형의 7-APRA 수화물을 제조하였다.

수분 (칼피셔법) 2.2%.

< 실시예 3> 7-아미노-3-[2-(4- 메틸티아졸 -5일)비닐]-3- 세펨 -4-카르복실산(7-ATVA)의 제조

출발물질로서 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실레이트 대신에 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[2-(4-메틸티아졸-5일)비닐]-3-세펨-4-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 목적화합물(91%)을 얻었다.

¹H-NMR(D₂O+NaHCO₃, 300MHz): δ 2.50 (3H, s, CH3), 3.48 (d, 1H, J = 17.8 Hz), 3.77 (d, 1H, J = 17.8 Hz), 5.14 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 5.24 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 6.71 (s, 2H), 9.62 (s, 1H).

< 실시예 4> 결정성 7- ATVA 수화물 합성

상기 실시예 3에서 제조된 7-ATVA를 사용하여 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하여 결정형의 7-ATVA 수화물을 제조하였다.

수분 (칼피셔법) 1.9%.

< 실시예 5> 7-아미노-3- 세펨 -4- 카르복실산(7-ANCA)의 제조

출발물질로서 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실레이트 대신에 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-세펨-4-카르복실레이트를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 목적화합물(94%)을 얻었다.

¹H-NMR(D₂O+NaHCO₃, 300MHz): δ 3.55 (dd, 1H, J = 18.2, 5.5 Hz), 3.71 (dd, 1H, J = 18.2, 3.8 Hz), 5.11 (d, 1H, J = 5.5 Hz), 5.17 (d, 1H, J = 5.5 Hz), 6.55 (m, 1H).

< 실시예 6> 결정성 7- ANCA 수화물 합성

상기 실시예 5에서 제조된 7-ATVA를 사용하여 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하여 결정형의 7-ANCA 수화물을 제조하였다.

수분 (칼피셔법) 2.5%.

<분석>

실시예에서 제조된 화합물 및 결정형 수화물을 XRD를 이용하여 분석하였다.

XRD로 측정한 결과, 7-APRA 화합물은 도 2와 같은 피크가 나타났으며, 7-APRA 수화물은 도 3과 같은 피크가 나타남으로써 7-APRA 수화물은 7-APRA 화합물과 달리 결정형인 것을 알 수 있다. 또한, 7-ANCA 화합물은 도 4와 같은 피크가 나타났으며, 7-ANCA 수화물은 도 5와 같은 피크가 나타남으로써 7-ANCA 수화물은 결정형으로 제조됨을 알 수 있다.

< 비교예 1> 7-아미노-3-[ 프로펜 -1-일]-3- 세펨 -4- 카르복실산의 제조

종래의 화학적 합성방법을 이용하여 7-아미노-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실산을 제조하였다.

500 mL의 플라스크에 오염화인 22.8 g과 메틸렌클로라이드 150 mL, 피리딘 8.88 mL를 넣고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실레이트 30 g(62.6 mmol)를 적가한 후, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -10 ℃로 냉각한 다음, 1,2-프로판디올 30 mL를 넣고 2시간 동안 교반한 후, 크레졸 120 mL를 적가하고 2시간 동안 교반하였다.

반응혼합물에 증류수 200 mL를 적가하고 1시간 동안 교반한 다음, 층분리하여 물층은 결정조로 보내고, 유기층은 2N HCl 300 mL로 추출하여 결정조로 보냈다. 결정조에 30 % 수산화나트륨 용액 200 ㎖를 적가하여 결정화시킨 다음, 0 ℃로 냉각하고 석출된 고체를 여과한 후, 진공건조하여 미황색의 고체의 표제화합물 12 g(20 mmol, 수율 80%, Z/E=10.1/1)을 얻었다.

¹H-NMR (δ, D₂O+NaHCO₃) : 1.69과 1.88 (3H, each, d, J = 6.0 Hz, -CH=CH-CH3), 3.38 과 3.72 (2H, Abq, J = 17.0 Hz, H-2), 5.18 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-6), 5.51 (1H, d, H-7), 5.8 (1H, m, -CH=CH-CH₃), 6.06 (1H, d, J = 11Hz, -CH=CH-CH₃)

< 비교예 2> 7-아미노-3- 세펨 -4- 카르복실산의 제조

p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-세펨-4-카르복실레이트(100 g)를 45-50 ℃에서 페놀 500 mL에 첨가하였다. 혼합물을 45-50 ℃에서 7시간 동안 교반시킨 후에(HPLC로 실험 관찰) 35-40 ℃로 냉각시켰다. 35-40 ℃에서 n-부틸 아세테이트 1000 mL를 혼합물에 첨가하고 10-15 ℃로 냉각시켰다. 탄산수소나트륨(1500 mL, 1.5%)을 10-20 ℃에서 첨가하고, 10-15분 동안 교반시켰다. 물층을 추출한 후, 유기층을 탄산수소나트륨(1500 mL, 1.5%)을 10-20 ℃에서 다시 한번 추출하였다. 추출한 물층 내의 페놀을 제거하기 위하여 n-부틸 아세테이트로 세척하였다. 물층에 20-25 ℃에서 습윤(wet) 페니실린-G 아미다제 50 g을 넣고 효소 가수분해(matic hydrolysis)를 수행하였다. 혼합물을 교반하면서 pH 7.5-7.9가 유지되게 탄산수소나트륨 수용액(5%)을 20-30 ℃에서 첨가하고 HPLC로 관찰하였다. 다음으로 상기 효소를 여과하고, 남은 잔여물을 탈이온수(200 mL)로 8-10 ℃에서 세척하였다. 냉각시킨 용액의 pH를 10% 염산을 이용하여 2.4-2.5로 조절한다. 그렇게 해서 생긴 고체는 여과하고, 탈이온수와 아세톤으로 씻은 후 40-45 ℃에서 진공상태로 건조하여 목적화합물(수율 41.5 g, 81%)을 얻었다.

¹H-NMR(D₂O+NaHCO₃, 300MHz): δ 3.57 (dd, 1H, J = 18.2, 5.4 Hz), 3.71 (dd, 1H, J = 18.2, 3.8 Hz), 5.09 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 5.15 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 6.55 (m, 1H).

< 비교예 3> 7-아미노-3-[2-(4- 메틸티아졸 -5일)비닐]-3- 세펨 -4- 카르복실산의 제조

500 mL 4구 플라스크에 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[2-(4-메틸티아졸-5일)비닐]-3-세펨-4-카르복실레이트 10 g을 칭량하고, 페놀 55 mL를 50 내지 55 ℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸 100 mL 및 5% 탄산수소나트륨 수용액 200 mL를 가한 후, 10 ℃이하까지 냉각하였다. 유기층을 제거하고 물층을 취하고, 아세트산에틸 150 mL로 3회 세정하여 수용액을 얻었다. 이 수용액에 PGA-450 5 g을 첨가하고, 20-30 ℃에서 5 % 탄산나트륨 수용액을 이용하여 pH=7.5 내지 8.5의 범위내에서 제어하면서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 효소를 여과하여 제거하고, 화합물의 수용액을 플라스크 중에 얻었다. 이 수용액을 10 ℃ 이하로 냉각한 후, 활성탄 5 g을 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 활성탄을 여과하여 제거하고, 여액에 4N-염산을 가하여 pH를 4.0으로 조정하여 10 ℃이하의 온도에서 1시간 숙성하였다. 석출한 결정을 여과하여 취하고, 물 및 아세톤으로 결정을 세정하여 건조한 후, 목적 화합물(3.82 g, 수율 79.8%)을 얻었다.

¹H-NMR (0.2 mol/L-DCl/D₂O ppm from TSP) : δ 2.53 (3H, s, CH₃), 3.56~3.61 (1H, d, S-CH(H), 18.4Hz), 3.75~3.80 (1H, d, S-CH(H), 18.4Hz), 5.26~5.27 (1H, d, S-CH, 5.2Hz), 6.79 (2H, s, HC=CH), 9.79 (1H, s, S-CH=N)

< 실험예 > 효소에 따른 탈보호화 효율 실험

본 발명에 따른 7-ATVA, 7-APRA 및 ANCA 수화물 제조시 사용되는 효소에 따른 탈보호화 효율을 알아보기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

실시예에 사용된 신타 CLEC-PA 효소(Altus Biologics 제품) 또는 비교예에 사용된 페니실린 아미다제(Sigma 제품)을 각각 50 g을 넣고 출발물질(p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-세펨-4-카르복실레이트, p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[프로펜-1-일]-3-세펨-4-카르복실레이트 또는 p-메톡시벤질-7-페닐아세트아미도-3-[2-(4-메틸티아졸-5일)비닐]-3-세펨-4-카르복실레이트)을 100 g, 200 g, 400 g으로 변화시킨 후, 아미노기 보호기의 탈보호 반응을 수행하였다.

이후 반응시간과, 생성물의 수율을 측정하여 표 1~3에 나타내었다.

7- ATVA 합성

출발물질의 양(g)	신타 CLEC-PA 효소		페니실린 아미다제
출발물질의 양(g)	반응시간(시간)	수율(%)	반응시간(시간)	수율(%)
100	2	94	4	88
200	4	91	9	83
400	10	85	18	82

7- APRA 합성

출발물질의 양(g)	신타 CLEC-PA 효소		페니실린 아미다제
출발물질의 양(g)	반응시간(시간)	수율(%)	반응시간(시간)	수율(%)
100	3	93	4	85
200	6	92	10	85
400	12	84	26	72

7- ANCA 합성

출발물질의 양(g)	신타 CLEC-PA 효소		페니실린 아미다제
출발물질의 양(g)	반응시간(시간)	수율(%)	반응시간(시간)	수율(%)
100	3	93	4	90
200	6	89	7	87
400	11	82	22	76

표 1~3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용된 신타 CLEC-PA 효소는 종래 탈보호 효소로 사용되는 페니시린아미다제보다 반응시간을 1~4시간 단축시키며 수율을 약 10% 향상시키는 것으로 나타났다.

따라서, 상기 신타 CLEC-PA 효소는 반응의 효율성이 높고, 취급하기 용이하며, 유독한 유기용매를 필요로 하지 않아 환경친화적이므로 결정성 7-ATVA, 7-APRA 및 ANCA 수화물의 제조시 공업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 1);
염기로 pH를 조절하면서 신타 CLEC-PA(Syntha Cross-Linked Enzyme Crystal-Penicillin G Amidase/Acylase) 효소를 넣고 교반하여 아미노기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 2); 및
무기산으로 pH를 조절하여 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체를 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 하기 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
[화학식 2]

[화학식 1]

(상기 화학식 1 및 2에 있어서, 상기 R은 (4-메틸티아졸-5-일)비닐이고, x는 3~6이다)
제1항에 있어서, 상기 단계 2의 염기는 탄산알칼리금속, 수산화알칼리금속, 암모니아수 및 트리알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 탄산알칼리금속은 탄산나트륨 또는 탄산칼륨이고, 상기 수산화알킬리금속은 탄산수소나트륨, 산화나트륨 또는 수산화칼륨이고, 상기 트리알킬아민은 트리메틸아민인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2의 pH는 7.5~8.0으로 유지하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3의 무기산은 염산, 질산 또는 황산인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3의 pH는 1.5~2.5로 유지하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 제조방법.
하기 화학식 2의 화합물에 크레졸 또는 페놀을 넣고 교반하여 카르복실기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 1);
염기로 pH를 조절하면서 신타 CLEC-PA 효소를 넣고 교반하여 아미노기의 보호기를 탈보호하는 단계(단계 2);
무기산으로 pH를 조절하여 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체를 제조하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 생성된 세팔로스포린계 항생제 중간체에 메탄올 수용액 및 염기를 넣고 용해시킨 후, 산을 첨가하여 결정성 수화물을 제조하는 단계(단계 4)를 포함하는 하기 화학식 1의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
[화학식 2]

[화학식 1]

(상기 화학식 1 및 2에 있어서, 상기 R은 (4-메틸티아졸-5-일)비닐이고, x는 3~6이다)
제7항에 있어서, 상기 단계 2의 염기는 탄산알칼리금속, 수산화알칼리금속, 암모니아수 및 트리알킬아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 탄산알칼리금속은 탄산나트륨 또는 탄산칼륨이고, 상기 수산화알킬리금속은 탄산수소나트륨, 산화나트륨 또는 수산화칼륨이고, 상기 트리알킬아민은 트리메틸아민인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 2의 pH는 7.5~8.0으로 유지하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 3의 무기산은 염산, 질산 또는 황산인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 3의 pH는 1.5~2.5로 유지하는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 4의 메탄올 수용액은 메탄올:물=5:1~1:2의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 4의 메탄올 수용액 내의 세팔로스포린계 항생제 중간체의 농도는 5~20%인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 4의 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨 및 탄산수소나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 단계 4의 산은 염산, 황산 또는 질산인 것을 특징으로 하는 세팔로스포린계 항생제 중간체의 결정성 수화물의 제조방법.