KR20120057563A - Ｉｌ-１２ 수용체 베타ｌ 서부유닛에 대해 특이적인 치료용 항체를 사용하는 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이종이량체성 IL12 수용체 (IL12Rβ2 쇄와 함께) 뿐만 아니라 IL23 수용체 (IL23Rα 쇄와 함께)의 비-신호 변환 쇄인 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로는 T 세포의 IL12/IL18 유도된 IFNγ 생성을 억제할 수 있는 IL12 및 IL23 수용체 길항제인 특이적 항체, 및 IFNγ 생성을 억제함으로써 치료될 수 있는 병적 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 또는 염증성 장 질환 또는 다른 자가면역 및 염증성 장애의 치료를 위해 상기 항체를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

ＩＬ-１２ 수용체 베타Ｌ 서부유닛에 대해 특이적인 치료용 항체를 사용하는 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHODS OF USE FOR THERAPEUTIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR THE IL-12 RECEPTORE BETAL SUBUNIT}

본 발명은 이종이량체성 IL12 수용체 (IL12Rβ2 쇄와 함께) 뿐만 아니라 IL23 수용체 (IL23Rα 쇄와 함께)의 비-신호 변환 쇄인 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로는 혈액 세포의 IL12/IL18 유도된 IFNγ 생성을 억제할 수 있는 IL12 및 IL23 수용체 길항제인 특이적 항체, 및 IFNγ 생성을 억제함으로써 치료될 수 있는 병적 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 또는 염증성 장 질환 또는 다른 자가면역 및 염증성 장애의 치료를 위해 상기 항체를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

IL12 수용체 베타 1 (IL12Rβ1) 쇄는 Th1/Th17 매개된 장애, 예컨대 건선 및 다른 자가면역 및 염증성 장애의 치료를 위한 잠재적인 치료 표적으로 공지되어 있다. 건선은 표피 층의 과다증식, 및 수지상 세포 및 T 세포의 현저한 침윤을 특징으로 하는 일반적인 만성 염증성 피부 질환이다. T 세포는 유형 1 시토카인 (예컨대 IFN-γ 및 TNF-α)을 분비함으로써 피부에서 발생하는 병적 반응에서 주요한 역할을 하여, 각질세포 과다증식, 혈관신생 및 호중구 침투를 유도한다.

건선에서 Th1 면역 반응의 진행에 중요한 것으로 생각되는 2가지 시토카인은 인터류킨-12 (IL12) 및 인터류킨-23 (IL23)이다. 두 시토카인은 항원-제시 세포, 예컨대 대식세포 및 수지상 세포에 의해 생성되어, T 세포 및 천연 킬러 세포를 활성화시킴으로써 기능한다. IL12 및 IL23은 IL12의 p35/p40 단백질 서브유닛 및 IL23의 p19/p40 단백질 서브유닛으로 이루어진 가용성 시토카인의 이종이량체 패밀리의 구성원이다. 상기 시토카인의 IL12 p40 서브유닛은 면역 세포의 표면 상에서 발견되는 막횡단 IL12 수용체 β 1 (IL12Rβ1)에 결합한다. IL12 p40/IL12Rβ1 상호작용의 중단은 IL12 및 IL23 둘 다의 생물학적 활성을 방지할 수 있다.

건선을 비롯한 몇몇 염증성 및 자가면역 질환은 과도한 Th1 및/또는 Th17 반응으로 이어진다. 이들 중 여러 것은 현재 모든 환자에서 효과적이지는 않은 일반적 면역-억제제 또는 매우 선택적으로 작용하는 생물학제, 예컨대 항-TNF-α 항체로 치료된다. 이들은 감염 위험을 증가시키고, 반복 치료 후에는 효과가 없게 되는 것으로 확인되었다. 따라서, 증가된 안전성 프로파일 및 동시에 질환의 장기간 완화 또는 치유를 유도하는 능력을 갖는 치료에 대한 의학적 요구가 충적되지 않고 있다.

심지어 건선-유사 상태를 유도하는 T 세포 하위집합의 전달 후에 투여될 때에도, IL12p40에 대한 중화 항체가 마우스의 건선 병변을 성공적으로 제거하였다 (문헌 [Hong et al., J.Immunol. 162.12 (1999): 7480-91]). IL12 및 IL23 둘 다를 표적으로 하는 항-IL12p40 항체가 현재 건선 (문헌 [Kauffman et al., J.Invest Dermatol. 123.6 (2004): 1037-44], [Papp et al., Lancet. 371.9625 (2008): 1675-84], [Kimball et al., Arch.Dermatol. 144.2 (2008): 200-07]), 크론 질환 (문헌 [(Sandborn et al., Gastroenterology. 135.4 (2008): 1130-41]) 및 다발성 경화증 (문헌 [(Segal et al., Lancet Neurol. 7.9 (2008): 796-804])에 대해 임상 시험 하에 있다. IL12Rβ1의 표적화, 따라서 Th1 및 Th17 세포 집단의 분화 및 유지 뿐만 아니라, 이들 세포에 의한 IL12 및 IL23 매개된 염증성 시토카인 생성은 개선된 치료제에 대한 기회를 제공한다.

미국 특허 6,046,012는 일반적으로 IL12Rβ1 및 항-IL12Rβ1에 결합하는 항체에 관한 것이다. 항-마우스 IL12Rβ1 모노클로날 항체는 또한 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson, 카탈로그 번호 551455)에 의해 시판된다.

그러나, 현재까지, 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 건선 또는 크론병의 치료에 사용하기 위한, IL12Rβ1 길항작용 활성을 나타내는 인간 IL12Rβ1에 대한 결합 분자가 당업계에 기재되지 않았다. 각각의 상호작용 파트너 (IL12p40)를 표적으로 하는 간접적인 증거만이 상기 경로를 유효화한다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 IL12Rβ1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, IL12Rβ1 폴리펩티드 (서열 41)의 표적에 대한 항체의 항원-결합 부분을 포함하는, 항체 또는 결합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 또는 낙타류와 같은 기원을 갖는 포유동물로부터의 것이거나 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-IL12Rβ1 항체는 표적 단백질 IL12Rβ1에 특이적이며 IL12Rβ1 또는 IL12Rβ1의 단편에 결합하는 항원-결합 영역을 갖는 것을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 효능작용 활성이 없거나 낮은 IL12Rβ1 길항제이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 표적 단백질 IL12Rβ1과 결합하고, 인간 혈액 세포에서 IL12 의존성 IFN-γ 생성을 억제한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 경쟁적으로 억제한다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 효능작용 활성이 없는 IL12Rβ1 길항제이다.

상기 결합은 항체에 의한 길항작용 또는 효능작용인 활성을 측정하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 검정에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 검정은 인간 혈액 세포에서 IL12 의존성 IFN-γ 생성, 인간 혈액 세포에서 IL23/IL17 의존성 IFN-γ 생성, 영장류 혈액 세포에서 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 포함하는, IL12Rβ1에 대한 항체의 하나 이상의 효과를 측정한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IL12Rβ1의 공통 IL12/IL23 p40 리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또 다른 특정한 실시양태에 따르면, 상기 항체는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 K_D로 IL12Rβ1에 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정으로 측정시 대략 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하의 IC₅₀으로 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제한다.

또 다른 대안적 실시양태에서, 상기 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정으로 측정시 대략 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하의 IC₅₀으로 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 IL12를 선택적으로 억제하지만, IL23 결합은 억제하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 대략 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 100 pM 이하의 IC₅₀으로 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제한다.

또 다른 관련된 실시양태에서, 상기 항체는 비처리 대조군 동물과 비교하여 IBD 마우스 모델에서 질환을 개선시킬 수 있다. 또 다른 관련된 실시양태에서, 상기 항체는 단일 용량으로 처리된 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 단핵 세포에서 연장된 시간 동안 IFNγ 반응을 완전히 차단할 수 있다. PK/PD 연구에서, 10 ㎍/ml 초과의 항-IL12Rβ1 mAb 혈장 수준은 생체외 IL12 유도된 IFNγ 생성의 완전한 억제를 나타내었다.

또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 IL12Rβ1과 그의 서브유닛 IL12Rβ2 및/또는 IL23R의 이종이량체화를 차단한다.

일부 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 시토카인 수용체와 교차 반응하지 않는다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 IL4Rα 수용체와 교차 반응하지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 설치류 또는 영장류 IL12Rβ1 수용체와 교차 반응한다.

또 다른 관련된 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 활성이 없는 완전 인간 또는 인간화 IgG4 항체 또는 침묵 돌연변이체 IgG1 항체이고, 대략 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 100 pM 이하의 IC₅₀으로 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제한다.

본 발명은 또한 IL12Rβ1 폴리펩티드 (서열 41)에서 표적에 대한 상기 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 항원-결합 부분은 PEG화된 것이다. 관련된 실시양태에서, PEG화 항원-결합 부분은 PEG화 Fab이다.

본 발명은 단리된 항체, 특히 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하고 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제하는 인간 또는 인간화 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정한 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되고/되거나 특정한 구조적 특징, 예컨대 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역을 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, 상기 항체의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 다가 또는 다중특이적 분자, 및 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 IL12, IL23 및/또는 IL12Rβ1에 의해 매개되는 장애 또는 상태의 진행을 억제하기 위해, 예를 들어 IL12Rβ1에 의해 매개되거나 혈액 세포에서 IFNγ 생성을 억제함으로써 치료될 수 있는 병적 장애, 예를 들어 Th1/Th17 매개 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 및 염증성 장 질환의 치료를 위해, IL12Rβ1의 기능을 억제하는, 즉 길항시키는 항체의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.

용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 감소를 초래하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (예컨대 항체, 시토카인 및 보체)의 작용을 지칭한다.

"신호 변환 경로" 또는 "신호전달 활성"은 단백질-단백질 상호작용, 예를 들어 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되어, 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전송시켜 주는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 전달을 유발시키는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기를 특이적으로 인산화시키는 것을 포함한다. 끝에서 두 번째 과정에는 전형적으로, 유전자 발현을 변화시켜 주는 핵 사건이 포함된다.

용어 IL12Rβ1 또는 IL12 수용체 베타 1은 서열 41에 정의된 바와 같은 인간 IL12Rβ1을 지칭한다.

본원에서 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 포함한다. 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 결합 단백질은 또한 용어 "항체" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 특히, 용어 "IL12Rβ1에 결합하는 항체"는 항체의 IL12Rβ1-결합 부분을 포함하는 IL12Rβ1 결합 단백질을 포함하는 것으로 의도된다.

천연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, V_H라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, V_L이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 C_L로 이루어진다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항원 부분")은 본원에서 사용될 때 전장 항체, 또는 항원 (예를 들어, IL12Rβ1의 일부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편); F(ab)₂ 단편 (힌지 영역에서 디술피드 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); V_H 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; V_H 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있고, 여기서 V_L 및 V_H 영역은 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체 역시 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하고, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IL12Rβ1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 IL12Rβ1 분자에 대한 교차 반응성을 지닐 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 그러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 버전, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al., 2000. J Mol Biol 296, 57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.

본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"가 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 의도는 아니다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이 유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이 유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다.

문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 "IL12Rβ1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 K_D로 인간 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. "IL12Rβ1 이외의 항원과 교차 반응하는" 항체는 0.5 x 10^-8 M 이하, 5 x 10^-9 M 이하, 또는 2 x 10^-9 M 이하의 K_D로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. "특정 항원과 교차 반응하지 않는" 항체는 1.5 x 10^-8 M 이상의 K_D, 또는 5-10 x 10^-8 M 또는 1 x 10^-7 M 이상의 K_D로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 항원과 교차 반응하지 않는 항체는 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "길항제"는 인간 혈액 세포에서의 인간 세포 검정, 예컨대 IL12 의존성 IFNγ 생성 검정에서 IL12의 존재 하에 IL12Rβ1 유도된 신호전달 활성을 억제하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성 검정 및 인간 혈액 세포에서의 IL23 의존성 IFNγ 생성 검정의 예는 하기 실시예에서 보다 상세하게 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 혈액 세포 검정으로 측정시 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 100 pM 이하의 IC₅₀으로 IFNγ 생성을 억제한다.

본원에 사용된 "효능작용 활성이 없는" 항체는 세포-기반 검정, 예컨대 인간 혈액 세포 IFNγ 생성 검정에서 IL12의 부재하에 IL12Rβ1 매개 신호전달 활성을 유의하게 증가시키지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다. 이러한 검정은 하기 실시예에서 보다 상세히 기재된다.

본원에 사용된 바와 같이, IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하는 항체 또는 결합 단백질은 시험관내 경쟁적 결합 검정, 예컨대 바이오베리스(Bioveris™) 검정으로 측정시 10 nM 이하의 EC₅₀, 바람직하게는 1 nM 이하의 EC₅₀, 보다 바람직하게는 100 pM 이하의 EC₅₀으로 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 이러한 검정은 하기 실시예에서 보다 상세히 기재된다.

본원에 사용된 바와 같이, 영장류 혈액 세포에서 IL12 생체외 IFNγ 생성을 억제하는 항체 또는 결합 단백질은 10 ㎍/ml 초과의 항-IL12Rβ1 mAb 혈장 수준으로 대조군 수준의 10％ 미만의 수준으로 IL12 생체외 IFNγ 생성을 감소시키는 항체를 지칭하도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 이는 10 ㎍/ml 초과의 항-IL12Rβ1 mAb 혈장 수준으로 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFNγ 생성을 완전히 제거하는 항체를 지칭한다. 이러한 검정은 하기 실시예에서 보다 상세히 기재된다.

본원에 사용된 용어 "K_회합" 또는 "K_a"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것으로 의도되고, 본원에 사용된 용어 "K_해리" 또는 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 해리 상수를 지칭하고, K_a에 대한 K_d의 비율 (즉, K_d/K_a)로부터 구하며 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 K_D 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore^®) 시스템을 이용하는 것이다.

본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원성 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.

본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유용한 척도를 지칭한다. 이는 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.

보다 고결합력의 프로브를 얻기 위해서, 이량체성 접합체 (FACS 마커에 커플링된 항체 단백질의 2개 분자)를 구성하여 FACS에 의해 (예를 들어, 생식계열 항체와의) 저친화도 상호작용이 보다 쉽게 검출되도록 할 수 있다. 또한, 항원 결합의 결합력을 증가시키는 또 다른 수단은 항-IL12Rβ1 항체의 본원에 기재된 임의의 구조체의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 다량체는 예를 들어, 천연 C→N-말단 결합을 모방함으로써 또는 그의 불변 영역을 통해 함께 유지되는 항체 이량체를 모방함으로써 개별 모듈들 사이의 공유 결합을 통해 생성할 수 있다. Fc/Fc 계면 내로 공학처리된 결합은 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 또한, Fc 이외의 이량체화 또는 다량체화 파트너가 그러한 보다 고차의 구조를 생성하기 위해 IL12Rβ1 하이브리드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인, 예를 들어 Borean (WO2004039841)에 기재된 삼량체화 도메인을 사용하는 것이 가능하다.

본원에 사용된 용어 항체에 대한 "선택성"은 특정 표적 폴리펩티드에 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 항체에 대한 "고친화도"는 표적 항원에 대해 1 nM 이하의 K_D를 갖는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.

용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아(Pichia)의 세포 또는 트리코더마(Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 공학처리된다. 최적화된 서열은 본원에서 CHO 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 공학처리되었지만, 다른 진핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 역시 최적화된 것으로 지칭된다.

예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 비롯한, 다양한 종의 IL12Rβ1을 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 당업계에 공지되어 있다. 적합한 분석이 실시예에 상세히 기재되어 있다. 항체의 결합 역학 (예를 들어, 결합 친화도)는 또한 당업계에 공지된 표준 검정에 의해, 예를 들어 비아코어 분석에 의해 평가할 수 있다. IL12Rβ1의 기능적 특성 (예를 들어, 수용체 결합, IL12 또는 IL23 리간드 결합 억제, IL12 유도된 IFNγ 생성의 억제)에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정이 실시예에서 보다 상세히 기재되어 있다.

따라서, 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법에 따라 측정된 바와 같은 하나 이상의 이들 IL12Rβ1의 기능적 특성 (예를 들어, 생화학, 면역화학, 세포성, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등)을 "억제하는" 항체는 항체의 부재 하에 (또는, 예를 들어 비관련 특이성의 대조군 항체가 존재할 때) 보이는 것에 비해 특정 활성이 통계적으로 유의하게 감소되는 것과 관련되는 것으로 이해될 것이다. IL12Rβ1 활성을 억제하는 항체는 측정된 파라미터의 적어도 10％, 적어도 50％, 80％ 또는 90％로 그러한 통계적으로 유의한 감소를 일으키고, 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IL12Rβ1 기능적 활성을 95％, 98％ 또는 99％ 초과로 억제할 수 있다.

용어 "교차 차단", "교차 차단된" 및 "교차 차단성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 표준 경쟁적 결합 검정에서 다른 항체 또는 결합제가 IL12Rβ1에 결합하는 것을 방해하는 항체 또는 다른 결합제의 능력을 의미한다.

항체 또는 다른 결합제가 IL12Rβ1에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 본 발명에 따라 교차 차단하는 것으로 말해질 수 있는지 여부는 표준 경쟁적 결합 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 적합한 검정 중 하나는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어 비아코어 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 사용함)의 이용을 포함한다. 교차 차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 이용한다.

이러한 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 실시예에서 주어진다.

본 발명에 따라, 본 발명에 따른 교차 차단 항체 또는 다른 결합제는, 항체 또는 결합제의 조합물 (혼합물)의 기록된 결합이 조합된 2개의 항체 또는 결합제의 최대 이론적 결합 (상기 규정된 바와 같음)의 80％ 내지 0.1％ (예를 들어 80％ 내지 4％), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75％ 내지 0.1％ (예를 들어 75％ 내지 4％), 보다 구체적으로 70％ 내지 0.1％ (예를 들어 70％ 내지 4％), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 65％ 내지 0.1％ (예를 들어 65％ 내지 4％)가 되도록 기재된 비아코어 교차 차단 검정에서 IL12Rβ1에 결합한다.

용액상 항-IL12Rβ1 항체가 용액상 항-IL12Rβ1 항체의 부재 하에 (즉, 양성 대조군 웰) 수득한 IL12Rβ1 검출 신호 (즉, 코팅된 항체에 의해 결합된 IL12Rβ1의 양)에 비해 IL12Rβ1 검출 신호의 60％ 내지 100％, 구체적으로 70％ 내지 100％, 보다 구체적으로 80％ 내지 100％의 감소를 일으킬 수 있는 경우, 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 검정에서 교차 차단성으로 정의된다.

재조합 항체

본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특성화되는 인간 재조합 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 항체의 V_H 아미노산 서열은 서열 29-32에서 나타난다. 본 발명에 따른 단리된 항체의 V_L 아미노산 서열은 각각 서열 25-28에서 나타난다. 본 발명의 다른 항체는 CDR 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되지만, 상기 기재된 서열에 제시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95％의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 상기 기재된 서열에 나타낸 CDR 영역과 비교시에 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.

가변 경쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 33-36에서 나타난다. 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 37-40에서 나타난다. 본 발명의 항체를 코딩하는 다른 핵산에는 돌연변이되었지만 상기 기재된 서열과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95％ 동일성을 갖는 핵산이 포함된다. 일부 실시양태에서, 이는 상기 기재된 서열에 나타낸 가변 영역과 비교하여 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 변이체 핵산을 포함한다.

동일한 에피토프에 결합하는 항체의 경우, V_H, V_L, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 항-IL12Rβ1 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 IL12Rβ1 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예컨대, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_H 서열은 구조적으로 유사한 V_H 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_L 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 29-32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 25-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 29-32로 이루어진 군으로부터 선택된 V_H 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 서열 25-28로 이루어진 군으로부터 선택된 V_L 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 가지며, IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 37-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 전장 중쇄; 및 서열 33-36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 전장 경쇄를 가지며, IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항체의 V_H CDR1의 아미노산 서열의 예는 서열 1-4에서 나타난다. 본 발명에 따른 항체의 V_H CDR2의 아미노산 서열의 예는 서열 5-8에서 나타난다. 본 발명에 따른 항체의 V_H CDR3의 아미노산 서열의 예는 서열 8-12에서 나타난다. 본 발명에 따른 항체의 V_L CDR1의 아미노산 서열의 예는 서열 13-16에서 나타난다. 본 발명에 따른 항체의 V_L CDR2의 아미노산 서열의 예는 서열 17-20에서 나타난다. 본 발명에 따른 항체의 V_L CDR3의 아미노산 서열은 서열 21-24에서 나타난다. CDR 영역은 카바트(Kabat) 시스템 (문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])를 사용하여 도시된다.

각각의 이들 항체가 IL12Rβ1에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공되면, V_H CDR1, 2 및 3 서열 및 V_L CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있으며 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음), V_H CDR1, 2 및 3, 및 V_L CDR1, 2 및 3을 함유하는 각각의 항체는 본 발명의 다른 항-IL12Rβ1 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 IL12Rβ1 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 분석 (예컨대, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. V_H CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 V_H 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, V_L CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 V_L 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 당업자에게는, 1개 이상의 V_H 및/또는 V_L CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 나타낸 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 V_H 및 V_L 서열이 생성될 수 있음이 매우 명확할 것이다.

일부 실시양태에서, 단리된 재조합 항체 또는 그의 항원 결합 영역은 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 9-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 13-16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 21-24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 가지며, 상기 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합한다.

특정 실시양태에서, 상기 항체는 다음을 포함한다: 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 13의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 17의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR3.

특정 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 6의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 14의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 18의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR3.

특정 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 7의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 11의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 15의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 23의 경쇄 가변 영역 CDR3.

특정 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: 서열 4의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 12의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 16의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 24의 경쇄 가변 영역 CDR3.

본원에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 생식계열 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 (즉, 동일성(％)이 가장 큰 것)인 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 생식계열 서열에 비해, 예를 들어 자연 발생하는 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로, 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 90％ 이상이고, 기타 종의 생식계열 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린 생식계열 서열)과 비교시 인간 항체가 인간의 것임을 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 적어도 95％ 또는 심지어는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％일 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

상동성 항체

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 상동성인 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; 전장 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 가변 영역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 가지며, 상기 항체는 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.

예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 재조합 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질)를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 29-32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일성이고; 경쇄 가변 영역은 서열 25-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일성이며; 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL23 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 또는 이는 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 억제한다.

또 다른 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 재조합 항체를 제공하며, 여기서 가변 중쇄는 서열 37-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 80％ 이상 또는 90％ 이상 동일성인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고; 가변 경쇄는 서열 33-36으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 80％ 이상 또는 90％ 이상 동일성인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고; 상기 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: 이는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL23 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 또는 이는 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 억제한다.

다양한 실시양태에서, 상기 항체는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 완전 인간 침묵 IgG1 항체이다.

다른 실시양태에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 각각 서열 29-32 및 서열 25-28의 V_H 및 V_L 영역에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 V_H 및 V_L 영역을 갖는 항체는 각각 서열 37-40 및 33-36을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에서 설명되는 기능성 검정을 이용하여 보유된 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험함으로써 얻을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 두 서열 사이의 동일성 백분율은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 상기 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 ％ = (동일한 위치의 수/위치의 총 수) X 100). 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 하기하는 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.

두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된, 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 블로썸(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능함)에 도입된, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체는 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 항원-결합 부분을 포함하는 단리된 재조합 항체를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1-4 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 5-8 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 9-12 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 13-16 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 17-20 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 21-24 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL23 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 또는 이는 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 억제한다.

다양한 실시양태에서, 상기 항체는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 29-32 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택되는 가변 아미노산 서열을 포함하고; 전장 경쇄는 서열 25-28 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택되는 가변 아미노산 서열을 포함하고; 상기 항체는 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL12 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 이는 인간 혈액 세포에서의 IL23 의존성 IFNγ 생성을 억제하거나, 또는 이는 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 억제한다.

다양한 실시양태에서, 항체는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

본원에서 사용할 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 의도된다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다.

보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유된 기능에 대해 시험될 수 있다.

변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다.

본 발명의 항-IL12Rβ1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특이적 항-IL12Rβ1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.

따라서, 추가의 항체는 표준 IL12Rβ1 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체와 통계적으로 유의한 방식으로 교차-경쟁하는 (예를 들어, 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 인간 IL12Rβ1에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 인간 IL12Rβ1에 대한 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고; 그러한 항체는 비-제한적인 이론에 따라 그가 경쟁하는 항체로서 인간 IL12Rβ1 상의 동일한 또는 관련 (예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 같이 인간 IL12Rβ1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 재조합 항체이다. 이러한 인간 재조합 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고 단리할 수 있다.

공학처리되고 변형된 항체

추가로, 본 발명의 항체는, 변형된 항체를 공학처리하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 두 가변 영역 (즉, V_H 및/또는 V_L), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 공학처리될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 공학처리되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 공학처리의 유형 중 하나는 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이로한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 이식된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter) 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen 등) 참조).

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 9-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 13-16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 21-24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항-IL12Rβ1 항체에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 V_H 및 V_L CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase로부터 입수가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. V_H CDR1, 2 및 3 서열, 및 V_L CDR1, 2 및 3 서열을 프레임워크 서열이 유래되는 생식계열 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수도 있거나, 또는 CDR 서열을 생식계열 서열과 비교해서 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역으로 이식시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 예에서는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen 등) 참조).

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_L CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜서 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다 ("친화도 성숙"이라 공지됨). 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-4, 또는 서열 1-4와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 V_H CDR1 영역; 서열 5-8, 또는 서열 5-8과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_H CDR2 영역; 서열 9-12, 또는 서열 9-12와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_H CDR3 영역; 서열 13-16, 또는 서열 13-16과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_L CDR1 영역; 서열 17-20, 또는 서열 17-20과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_L CDR2 영역; 및 서열 21-24, 또는 서열 21-24와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_L CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-IL12Rβ1 모노클로날 항체를 제공한다.

대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인의 이식

생성된 폴리펩티드가 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 영역을 포함하는 한, 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이같은 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입, 또는 그의 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 기술된 것들)을 포함하고, 다른 동물 종 (바람직하게는 인간화 측면을 갖는 종)의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 단일 중쇄 항체, 예컨대 낙타류에서 확인된 것들에 특별한 관심이 있다. 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 당업자에 의해 계속 발견되고 개발된다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기재의 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 서열 41의 표적 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 미래의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드를 사용할 수 있다. 그러한 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"로서 지칭된다. 비-이뮤노글로불린 프레임워크의 예는 다음 섹션 (낙타류 항체 및 비-항체 스캐폴드)에서 추가로 설명한다.

낙타류 항체

신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉 낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 부류의 구성원으로부터 얻은 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 특성화하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같이 이러한 부류의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 없어서, 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일자로 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.

V_HH로서 확인된 작은 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"라고 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성시키는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 작은 단백질을 얻도록 하는 유전자 조작으로 수득할 수 있다. 1998년 6월 2일자로 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고, 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; [Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; [Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 [Lauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 공학처리된 라이브러리는 시판되고 있으며, 예를 들어 아블린크스(Ablynx, 벨기에 겐트)가 시판한다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합 방식으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉, 나노바디를 "인간화"할 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.

낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기가 갖는 결과 중 하나는 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 고전적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기가 갖는 또 다른 결과는, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있기 때문에 고전적인 항체의 기능보다 고전적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.

이러한 저분자량 및 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고 극한 pH 및 단백질분해 소화에 대해서도 안정적이고 낮은 항원성을 갖는 낙타류 나노바디가 추가로 생성된다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환 시스템으로부터 조직 내로 쉽게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일자로 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이러한 특징은 높은 치료 가능성을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.

따라서, 본 발명의 특징은 IL12Rβ1에 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 천연적으로 생성되는데, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 이용하여 IL12Rβ1 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생성된다. 대안적으로, 항-IL12Rβ1 낙타류 나노바디는 공학처리되는데, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 IL12Rβ1을 사용하는 패닝 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 예를 들어, 항-IL12Rβ1 낙타류 나노바디는 IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하고/하거나 인간 혈액 세포에서의 IL12 유도된 IFNγ 생성을 억제하고/하거나 인간 혈액 세포에서의 IL23 유도된 IFNγ 생성을 억제하는 것들로부터 선택되며, 상응하는 검정은 실시예에서 기재되어 있다.

공학처리된 나노바디는 수여 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 이식하여 수득된다.

비-항체 스캐폴드

공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드에는 애드넥틴 (피브로넥틴) (컴파운드 쎄라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월담), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지) 및 아블린크스 엔브이 (벨기에 즈비나아르데), 리포칼린 (안티칼린) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역-의약품 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmeceuticals Inc.), 워싱톤주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스킬 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 리미티드(Polyphor Ltd.), 스위스 알슈빌)가 포함되나, 여기에 제한되지는 않는다.

(i) 피브로넥틴 스캐폴드

피브로넥틴 스캐폴드는 바람직하게는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기반한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 3개 이상의 그러한 루프가 존재하고, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418).

이러한 피브로넥틴-기재의 스캐폴드는 이뮤노글로불린은 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 항체의 것과 성질 및 친화도에서 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기재의 분자는 표준 클로닝 기술을 이용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.

(ii) 안키린 - 분자 파트너

이 기술은 다양한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 지니기 위해 안키린 유래 반복 모듈이 있는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역-평행 α-나선 및 β-턴으로 이루어지는 33개 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.

(iii) 맥시바디/아비머 - 아비디아

아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1에서 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 수많은 상이한 "A-도메인" 단량체들 (2개 내지 10개)로 이루어진다. 예를 들어 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기술된 방법을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.

(vi) 단백질 A - 아피바디

아피바디(Affibody^®) 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 3개의 나선 다발로 이루어진 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디^® 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디^® 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 분자량은 6 kDa이다. 아피바디^® 분자는 작은 크기에도 불구하고 이것의 결합 부분이 항체의 결합 부분와 유사하다.

(v) 안티칼린스 - 피에리스

안티칼린스(Anticalins^®)는 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris ProteoLab AG) 회사에 의해 개발된 제품이다. 이들은 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리적인 수송 또는 저장과 일반적으로 관련있는 광범위한 군의 작고 강한 단백질인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다.

단백질 구조는 초가변 루프가 단단한 프레임워크의 최상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이것의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160개 내지 180개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져서 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간만 더 크다.

결합 포켓을 이루는, 4개 루프의 집합은 두드러진 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 독점적인 방법에서는 상이한 형태의 규정된 표적 분자들을 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 결합 부분을 재성형시킬 수 있다.

리포칼린 패밀리의 한 단백질인, 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)은 4개 루프의 집합을 돌연변이 유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용되었다. "안티칼린"을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT WO 199916873이다.

(vi) 아필린 - Scil 단백질

아필린(Affilin™) 분자는 단백질 및 소분자를 향한 특이적 친화도를 위해 설계된 작은 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 새로운 아필린™ 분자는 그 각각이 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질에 기초하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다.

아필린™ 분자는 이뮤노글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. Scil 단백질은 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 감마 크리스탈린이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 상위패밀리 단백질인 2개의 아필린™ 스캐폴드를 사용한다. 두 인간 스캐폴드 모두 매우 작고, 높은 온도 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO 200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO 2004106368에 기재되어 있다.

(vii) 단백질 에피토프 모방체 (PEM)

PEM은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.

프레임워크 또는 Fc 공학처리

본 발명의 공학처리된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 V_H 및/또는 V_L 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 더욱 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 생식계열 구조로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해, 체세포 돌연변이를 생식계열 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체 역시 본 발명에 포함된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜서 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화"라고도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 공학처리될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있고 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 잔기를 항체에 부착시킬 수 있음), 이것의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 번호매김은 카바트의 EU 지수의 번호매김이다.

한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer 등)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜서 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 구체적으로, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여 항체가 본래의 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward 등)에 보다 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta 등)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하게 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜서 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 제거된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie 등)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (Bodmer 등)에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부분이 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재된 바 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).

특정 실시양태에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적인 실시양태에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어 융합 폴리펩티드가 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/하거나 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 감소시키거나 제거한 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예는 문헌 [J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 by Hezareh et al.]에 기재된 바와 같이 아미노산 위치 234 및 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체된 것이다.

특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297의 잔기에서의 글리코실화를 저해하는 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297의 아스파라긴 잔기의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N297의 글리신 또는 알라닌으로의 대체이다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 1개 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co 등)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang 등)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 저푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생성된다. PCT 공보 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고, 이로 인해 상기 숙주 세포 내에서 발현된 항체에서 저푸코실화가 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (Umana 등)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 공학처리된 세포주를 기재하며, 이와 같이 공학처리된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 본 발명의 항체는, 포유동물-유사 글리코실화 패턴을 위해 공학처리되고, 글리코실화 패턴으로서 항체 결여 푸코스를 생성할 수 있는 효모 또는 사상균에서 생성될 수 있다 (예를 들어, EP1297172B1 참조).

본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 PEG화가 있다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예컨대, 혈청) 반감기를 증가시키도록 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 기타 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용된 모든 형태의 임의의 PEG를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura 등) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa 등)를 참조한다.

본 발명에서 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다. 상기 접근법은 예를 들어 EP0322094 (Ballance 등)에 기재되어 있다.

다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 EP 0 486 525 (Nygren 등)에 기재되어 있다.

변경된 항체의 공학처리 방법

상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 V_H 및 V_L 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-IL12Rβ1 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, V_H 및/또는 V_L 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시켜서 새로운 항-IL12Rβ1 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체의 구조적 특징을 이용하여 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 인간 IL12Rβ1에 대한 결합 및 또한 IL12Rβ1의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, IL12Rβ1에 결합하는 IL12 및/또는 IL23의 억제, 혈액 세포에서의 IL12 유도된 IFNγ 생성의 억제 등) 특성을 보유하는, 구조적으로 관련이 있는 항-IL12Rβ1 항체를 생성한다.

예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-공학처리된 항-IL12Rβ1 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 공학처리 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 공학처리된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L 서열 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 후에 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 9-12로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 13-16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 21-24로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어지는 항-IL12Rβ1 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 29-32의 군으로부터 선택되는 가변 서열을 포함하는 전장 중쇄 항체 서열; 및 25-28의 군으로부터 선택되는 가변 서열을 포함하는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어지는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 항-IL12Rβ1 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.

변경된 항체 서열은 또한 각각 서열 9-12 및 서열 21-24로 이루어진 군으로부터 선택되는 특유의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열 또는 US20050255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정인자, 및 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터의 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.

표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는, 인간 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하고/거나, IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 IL12 및 IL23을 억제하고/거나 인간 혈액 세포에서의 IL12 유도된 IFNγ 생성을 억제하고/거나 인간 혈액 세포에서의 IL23 유도된 IFNγ 생성을 억제하고/거나 영장류 혈액 세포에서의 IL12 생체외 IFN-γ 생성을 억제하는 것을 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 본원에 기재된 항-IL12Rβ1 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이다.

변경된 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다.

변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체의 공학처리 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-IL12Rβ1 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-IL12Rβ1 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이 유발, 합성 라이게이션 조립, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공보 WO 03/074679 (Lazar 등)는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용한 방법을 기재한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 33-36에서 나타난다. 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 37-40에서 나타난다. 본 발명은 또한 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포주에서 단백질 발현을 위해 최적화된 서열 33-40의 후자 서열에서 유래된 핵산 분자에 적합하다.

핵산은 온전한 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수도 있고, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수도 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 세포의 다른 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수해진" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예컨대 파지 디스플레이 벡터 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.

본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 아래에 더욱 설명하는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리의 구성원인 각종 파지 클론으로부터 회수할 수 있다.

일단 V_H 및 V_L 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전당 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, V_L- 또는 V_H-코딩 DNA 단편을 또 다른 DNA 분자와 작동가능하게 연결시키거나, 또는 또 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편과 작동가능하게 연결시킨다. 이와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 프레임에 맞게 유지되도록, 또는 상기 단백질이 목적하는 프로모터의 제어하에 발현되도록 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다.

V_H 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 V_H-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, V_H-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

V_L 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 V_L-코딩 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위해서는, V_H- 및 V_L-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)₃을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜서, V_H 및 V_L 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 V_L 및 V_H 영역을 갖는 인접 단일 쇄 단백질로 발현될 수 있게 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).

본 발명의 모노클로날 항체의 생성

모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술로 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하는 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 이용할 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이것을 공학처리하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly 등) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해서, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5225539 (Winter) 및 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen 등)을 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. IL12Rβ1에 직접 대항하는 상기 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 각각 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서는 이들을 통칭하여 "인간 Ig 마우스"라고 지칭한다.

HuMAb 마우스^® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께 재배열되지 않는 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌(miniloci)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 대한 반응시에 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (문헌 [Lonberg, N. et al., 1994 supra]; [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 고찰). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851] (상기 모든 문헌의 내용은 그의 전문에 본원에 구체적으로 포함됨). 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani 등); PCT 공보 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (Korman 등)를 참조한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스염색체 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라 지칭되며, PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida 등)에 상세하게 기재되어 있다.

추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (압제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))라고 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati 등)에 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스염색체 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 암소가 당업계에 보고되었고 (문헌 [Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 이를 사용하여 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 인간 재조합 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있거나 하기 실시예에서 기재된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner 등); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower 등); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty 등); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths 등)을 참조한다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson 등)에 기재되어 있다.

인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 약 2 x 145로 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마(Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가)을 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 특성화를 위해 조직 배양 배지 중에서 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.

인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 ℓ의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화도 크로마토그래피 처리할 수 있다. 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 보관할 수 있다.

모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).

예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포에 적합성인 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 원하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 V_H 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 하고 V_L 절편이 벡터 내의 CL 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990]에 기재되어 있다. 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 고안이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 좌우될 수 있음이 당업자에게는 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스성 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열로 이루어진 조절 요소, 예컨대 SRa 프로모터 시스템은 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 장쇄 말단 반복부의 서열을 함유한다 (문헌 [Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).

항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel 등) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택하기 위함)가 포함된다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비시키는 데에 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13]).

본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선택가능한 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우의 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 포유동물 숙주 세포는, 예를 들어 US6,946,292B2에 기재된 바와 같은 FUT8 유전자 발현이 결핍된 포유동물 세포주를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서의 항체 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

면역접합체

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 모이어티, 예를 들어 세포독소, 약물 (예컨대, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-IL12Rβ1 항체, 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 이같은 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 모든 작용제가 포함된다. 예로는 탁손, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 티. 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 그의 유사체 또는 상동체가 포함된다. 치료제에는 또한, 예로서 항대사물 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오르우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴, 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)이 포함된다.

본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료용 세포독소의 다른 예에는 두오카르마이신, 칼리케아마이신, 마이탄신 및 아우리스타틴, 및 이들의 유도체가 포함된다. 칼리케아마이신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다 (밀로타르그(Mylotarg™; 와이어스-아이어스트(Wyeth-Ayerst)).

세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용된 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예를 들어 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.

세포독소의 유형, 링커, 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 관한 추가적인 논의를 위해, 또한 문헌 [Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G., 2003 Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]를 참조한다.

본 발명의 항체는 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성약제를 생성하기 위하여 방사성 동위원소에 접합될 수도 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예에는 요오드¹³¹, 인듐¹¹¹, 이트륨⁹⁰ 및 루테튬¹⁷⁷이 포함되지만 여기에 제한되지는 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin™) (DEC 파마슈티컬스(DEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르(Bexxar™) (코릭사 파마슈티컬즈(Corixa Pharmaceuticals))을 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변형시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제에 한정하여 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질에는, 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자가 포함될 수 있다.

이같은 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982)]를 참조한다.

이중특이적 분자

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체는 유도체화되거나 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부분 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부분 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자 역시 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 1개 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.

따라서, 본 발명은 IL12Rβ1에 대한 제1 결합 특이체 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 적어도 하나 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 IL12Rβ1의 또 다른 에피토프이다. 또 다른 예는 적어도 하나가 IL12Rβ1에 대한 제1 결합 특이체, 및 IL12Rβ2 또는 IL23Rα 내의 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 적어도 하나 포함하는 이중특이적 분자이다.

추가로, 본 발명에서 이중특이적 분자가 다중특이적인 경우, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 대한 것 이외의 제3 결합 특이체를 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner 등)에 기재된 바와 같이, 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.

본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.

본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132]; [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)], 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 캄파니(Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드)가 시판함)이다.

결합 특이체가 항체인 경우, 이들을 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술피드릴 결합시켜 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합시키기 전에 홀수의, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

대안적으로, 두 결합 특이체 모두가 동일 벡터에서 코딩되어 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.

이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심이 있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.

다가 항체

또 다른 측면에서, 본 발명은 IL12Rβ1에 결합하는 본 발명의 항체의 2개 이상의 동일하거나 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 항체의 2, 3 또는 4개 이상의 항원-결합 부분을 제공한다. 항원-결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 기술되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜서 4가 화합물을 수득할 수 있다.

제약 조성물

또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 항체 중 하나 또는 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보성 활성을 갖는 항체의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉, 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 1종의 다른 항염증제 또는 또 다른 화학요법제와 조합된 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 아래 섹션에서 보다 상세히 설명한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 한 실시양태에서, 담체는 피하 경로에 적합하여야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자는 산의 작용으로부터 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질에 코팅될 수 있다.

본 발명의 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고, 임의의 원치않는 독성 효과는 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가염에는 무독성 무기 산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인산 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 무독성 유기 산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산으로부터 유래된 염 등이 포함된다. 염기 부가 염은 알칼리성 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 및 또한 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.

본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기한 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 유도될 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 유도될 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 미세여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.

담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 100％ 중에서 약 0.01％ 내지 약 99％의 활성 성분, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％의 활성 성분의 범위일 것이다.

투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 관한 상세사항은, 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체에서의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 제한에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존적이다.

항체의 투여에 대해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 ㎎/kg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 ㎎/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수도 있고, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위일 수도 있다. 예시적인 치료법은 1주 당 1회 투여, 2주 당 1회 투여, 3주 당 1회 투여, 4주 당 1회 투여, 1개월 당 1회 투여, 3개월 당 1회 투여, 또는 3개월 내지 6개월 당 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 항-IL12Rβ1 항체에 대한 투여법에는 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 정맥내 투여하는 것이 포함되고, 여기서 항체는 다음 투여 스케쥴 중 하나를 사용하여 주어진다: 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; 3주마다; 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 1 mg/kg 체중으로 3주마다.

일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러회 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 1주일, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서의 투여량은 약 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 약 25 내지 300 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다.

대안적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료를 위해 적용하는 경우에는 질환의 진행이 저하되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지 비교적 높은 투여량을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.

본 발명의 항-IL12Rβ1의 "치료 유효량"은 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 활동제한의 예방을 유도할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용된 어구 "비경구 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 투여를 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

대안적으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로에 의해, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여할 수 있다.

활성 화합물은 예를 들어 제어 방출 제제, 예컨대 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 기재된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 임플란트 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 제시하는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하는 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능 주입 기기를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해서는, 이들을 예를 들어 리포좀 내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예를 들어 미국 특허 4,522,811, 5,374,548 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 1개 이상의 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 잔기는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low 등) 참조); 만노시드 ([Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 ([P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 ([Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134]); p120 ([Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090])를 포함하며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273]을 참조한다.

본 발명의 용도 및 방법

본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 효용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 배양된 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 세포에게 투여될 수도 있고, 또는 대상체에게 예를 들어 생체내 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수도 있다.

상기 방법은 IL12Rβ1-관련 장애 및/또는 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어, 건선 또는 염증성 장 질환의 치료, 예방 또는 진단에 특히 적합하다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 인간 혈액 세포에서 IL12 또는 IL23 유도된 신호전달 반응을 감소 또는 억제하기 위한 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, "IL12Rβ1-관련 장애"는 비정상 IL12 및/또는 IL23과 관련있거나 그를 특징으로 하는 상태, 및/또는 인간 혈액 세포에서 IL12 및/또는 IL23 유도된 신호전달 반응, 예를 들어 혈장에서 측정되는 IFNγ 또는 IL17의 생성 또는 유세포 방법 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 STAT4 단백질의 인산화 정도를 감소 또는 억제함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 상태가 포함된다. 이들은 염증성 상태 및 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 및 염증성 장 질환을 포함한다. 이들은 또한 알레르기 및 알레르기 상태, 과민 반응 및 기관 또는 조직 이식 거부반응을 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 항체는 동종이식 거부반응 또는 이종이식 거부반응을 포함하여 심장, 폐, 조합 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식의 수용자의 치료를 위해, 및 골수 이식 이후의 이식편-대-숙주 질환, 및 장기 이식과 관련된 동맥경화증의 예방을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는, 자가면역 질환 및 염증성 상태, 특히 자가면역 성분을 포함하는 병인을 갖는 염증성 상태, 예컨대 관절염 (예를 들어 류마티스양 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 및 류마티스 질환, 예컨대 골 손실, 염증성 통증과 관련된 염증성 질병 및 류마티스 질환, 척추관절증, 예컨대 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염 및 장병성 관절염, 과민증 (예를 들어 기도 과민증 및 피부 과민증 둘 다) 및 알레르기의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 본 발명의 항체가 사용될 수 있는 특정한 자가면역 질환은 자가면역 혈액계 장애 (예를 들어, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론 질환 및 과민성 장 증후군), 내분비 눈병증, 그레이브스 잘환, 사르코이드증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 연소성 당뇨병 (진성 당뇨병 유형 I), 포도막염 (전포도막염 및 후포도막염), 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염 (신 증후군을 수반하는 것 및 수반하지 않는 것 - 예를 들어, 특발성 신 증후군 또는 미소 변화형 신장병증), 종양, 다발성 경화증, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 임플란트의 해리, 대사 장애, 예컨대 아테롬성동맥경화증, 당뇨병 및 이상지혈증을 포함한다.

본 발명의 항체는 또한 천식, 기관지염, 진폐증, 폐 기종, 및 기도의 다른 폐쇄성 또는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 완화에 유용하다.

본 발명의 항체는 또한 골 대사 질환, 예를 들어 골관절염, 골다공증 및 다른 염증성 관절염, 및 골 손실, 일반적으로 예를 들어 노화-관련 골 손실, 및 특히 치주 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 항체는 단독 활성 성분으로서, 또는 다른 약물 (예를 들어, 보조제로서 또는 조합물로), 예를 들어 면역억제제, 면역 조절제, 또는 다른 항염증제, 다른 세포독성제 또는 항암제 (예를 들어, 상기 언급한 질환의 치료 또는 예방용)와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 DMARD, 예를 들면 금 염, 술파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 미코페놀산, 시클로스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미노시클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시네우린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환의 조절제, 예를 들면 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들면 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들면 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 그의 면역억제성 동족체, 유사체 또는 유도체; 면역억제성 모노클로날 항체, 예를 들면 백혈구 수용체에 대한 모노클로날 항체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이들의 리간드; 다른 면역조절 화합물, 예를 들면 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부분을 갖는 재조합 결합 분자 또는 그의 돌연변이체, 예를 들면 CTLA4의 적어도 세포외 일부분 또는 비-CTLA4 단백질 서열에 연결된 그의 돌연변이체, 예를 들면 CTLA4Ig (예를 들어, ATCC 68629로 지정됨) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들면 LEA29Y; 부착 분자 억제제, 예를 들면 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학요법제, 예를 들면 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라틴, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항-TNF 작용제, 예를 들면 TNF에 대한 모노클로날 항체, 예를 들면 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구축물, 예를 들면 에타너셉트, PEG-TNF-RI; 전-염증성 시토카인의 차단제, IL1 차단제, 예를 들면 아나킨라 또는 IL1 트랩, AAL160, IL17 차단제, IL13 차단제, IL4 차단제, IL6 차단제; 케모카인 차단제, 예를 들어 프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 예를 들면 메탈로프로테아제, 항-IL15 항체, 항-IL6 항체, 항-IL17 항체, 항-IL4 항체, 항-IL13 항체, 항-CD20 항체, 항-Blys 또는 항-BAFFR 항체, NSAID, 예컨대 아스피린 또는 항감염제 (상기 언급된 작용제로 제한되지 않음)와 조합되어 사용될 수 있다.

상기 내용에 따라, 본 발명은 하기 추가의 측면을 제공한다:

치료 유효량의 IL12Rβ1 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체, 및 하나 이상의 제2 약물 물질을 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 공동 투여하는 것을 포함하고, 상기 제2 약물 물질이 예를 들어 상기 나타낸 것과 같은 면역억제성/면역조절성, 항염증성 화학요법성 또는 항감염성 약물인 상기 정의된 방법.

또는, 치료 유효량의 a) IL12Rβ1 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체 및 b) 예를 들어 상기 나타낸 것과 같은 면역억제성/면역조절성, 항염증성 화학요법성 또는 항감염성 약물로부터 선택되는 하나 이상의 제2 물질을 포함하는 치료용 조합물, 예를 들어 키트. 키트는 투여 지침서를 포함할 수 있다.

본 발명의 항체가 다른 면역억제성/면역조절성, 항염증성 화학요법성 또는 항감염성 치료제와 함께 투여되는 경우에, 공동 투여된 조합 화합물의 투여량은 물론 사용되어지는 공동 약물의 유형, 예를 들어 그것이 DMARD, 항-TNF, IL-1 차단제 또는 다른 것인지의 여부, 사용되는 특정한 약물, 치료되어지는 질병 등에 따라 달라질 것이다.

한 구체적 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-TNF 작용제와 조합되어 투여될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 SLE 또는 RA로 고통받고 있고, 혈액 세포에서 각각의 IL12 IFNγ 또는 IL17의 비정상 혈청 수준 또는 포스포STAT4의 상승된 수준 및 빈도를 나타내는 환자 중에서 선택된 환자 집단에만 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-IL12 또는 항-p40 치료에 반응하는 환자의 군 중에서 선택된 환자 집단에만 투여된다. 항-IL12 (또는 항-p40) 치료에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 바이오마커는 하기 중 임의의 것일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다: 혈청 IL12의 상승된 수준, 특정 T 세포 하위집합의 상승된 수준, 단리되 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 IFNγ, TNFα, IL12Rβ2 또는 STAT4의 mRNA 수준, 각각의 피부 생검 PBMC에서 포스포STAT4 발현.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IL12Rβ1의 수준 또는 IL12Rβ1을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 항체와 IL12Rβ1 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 샘플 (예를 들어 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항-IL12Rβ1 항체와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체와 IL12Rβ1 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, 당업계에 공지된 표준 검출 방법, 예를 들어 ELISA 및 유세포측정 검정이 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 항체 또는 그의 일부와 IL12Rβ1 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 샘플 및 대조군 샘플을 IL12Rβ1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 영역과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 IL12Rβ1 (예를 들어, 인간 IL12Rβ1 항원)의 존재를 검출하거나 IL12Rβ1의 양을 측정하는 방법을 또한 제공한다. 이후, 복합체의 형성을 검출하고, 이때 대조군 샘플과 비교하여 이것과 샘플 사이의 복합체 형성의 차이는 샘플 중 IL12Rβ1의 존재를 나타낸다.

본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 인간 항체 및 이중특이적 분자) 및 사용을 위한 설명서로 이루어지는 키트가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가의 항체 (예를 들어, 제1 항체와 별개로 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 지닌 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 전형적으로, 키트는 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 표지를 포함한다. 용어 표지는 키트상에 또는 키트와 함께 제공되는 임의의 기입물 또는 기록물 또는 기타 방식으로 키트에 수반되는 물질을 포함한다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같은 처치에 반응할 군에 속하는지 여부를 진단하는 도구를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 하기하는 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적인 것이지 추가의 제한을 의미하는 것이 아니다.

<실시예>

방법

1. 스크리닝 검정

HuCAL^® 골드 파지미드 라이브러리가 본 발명의 스크리닝 항체를 위해 사용되었다. 상기 라이브러리는 HuCAL^® 개념을 기반으로 하며 (문헌 [Knappik, A. et al., 2000, J Mol Biol 296, 57-86]), 필라멘트형 파지의 표면 상에 Fab 항체 단편을 디스플레이하기 위한 CysDisplay™ 기술을 이용한다 (Lohning, C. 2001. WO 01/05950). 이후 기재되는 스크리닝 전략은 비-이뮤노글로불린 스캐폴드의 라이브러리를 비롯한 다른 유형의 라이브러리 및 스캐폴드에 적합할 수 있으며, 따라서 본 발명의 항체는 본 발명의 항체와 유사한 현저한 특성을 갖지만 상이한 스캐폴드를 갖는 IL12Rβ1 결합제를 확인하는 것을 허용한다.

1.1 직접 코팅된 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 상에서 IL12Rβ1에 대한 표준 고체 상 패닝

항체 선택을 위해, HuCAL 골드^® 항체-파지를 맥시소르프(Maxisorp^®) 플레이트 (F96 Nunc-이뮤노플레이트)에 직접 코팅된 인간 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 상에서 3회 라운드의 고체 상 패닝에 적용하였다. 구체적으로, 맥시소르프^® 플레이트 상의 2개의 웰을 각각 22℃에서 밤새 300 ㎕의 10 ㎍/ml 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질로 코팅하였다. 코팅된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 (RT) 2 시간 동안 350 ㎕ 5％ MPBS로 차단하였다. 각각의 패닝을 위해 약 2x10¹³ HuCAL 골드^® 파지를 1％ 최종 농도의 인간 γ-글로불린을 포함하는 동일한 부피의 PBST/5％ 밀크 분말 (MP)로 실온에서 2 시간 동안 차단하였다. 차단시킨 후, 코팅된 웰을 350 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 300 ㎕의 사전-차단된 HuCAL 골드^® 파지를 각각의 항원 코팅된 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 350 ㎕ PBS/0.05％ 트윈-20 (시그마, 미국 세인트 루이스주)의 5회 첨가에 의해 세척한 후, PBS로 5회 세척하였다. 플레이트로부터 파지의 용리는 웰당 10 mM 트리스/HCl pH 8 중 300 ㎕ 20 mM DTT에 의해 10 분 동안 수행하였다. DTT 파지 용리물을 15 mL의 이.콜라이 TG1에 첨가하고, 이를 37℃에서 2xYT 배지에서 0.6-0.8의 OD₆₀₀으로 성장시키고, 50 ml 플라스틱 튜브에서 37℃에서 45 분 동안 파지 감염을 위해 진탕시키지 않고 인큐베이션하였다. 파지에 의해 감염된 이.콜라이 TG1의 적정을 수행하여 파지 출력 적정을 측정하고, 후속적으로 5000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 박테리아 펠릿을 각각 500 ㎕ 2xYT 배지에 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 콜로니를 플레이트로부터 제거하고, 파지를 구조하여, 상기 기재된 바와 같이 증폭시켰다. 직접 코팅된 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 상에서 고체 상 패닝의 제2 및 제3 라운드를 세척 절차의 엄격성을 증가시킨 것을 제외하고는 제1 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.

1.2 항-인간 Fc 코팅된 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질을 통해 포획된 고체 상 패닝

항원의 코팅 조건을 제외하고는 고체 상 패닝에 대해 상기 기재된 것과 동일한 절차이다. 여기서, 2.5 ㎍/ml 항원을 10 ㎍/ml 어피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-인간 IgG (Fc 감마 단편 특이적)에 의해 포획하였다. 패닝당 2개의 웰을 맥시소르프^® 플레이트 (F96 Nunc-이뮤노플레이트) 상에 코팅하였다. 파지를 1％ 마우스 또는 염소 감마 글로불린에 의해 1％ 최종 농도로 (어떠한 포획 항체가 사용되는가에 따라, 제1 및 제3 라운드의 패닝의 경우 염소 및 제2 라운드의 패닝의 경우 마우스 항-인간 IgG를 사용하였음) 및 1％ 인간 감마 글로불린 최종 농도로 추가로 차단하였다. 사전-차단된 파지 믹스를 실온에서 2 시간 동안 포획된 항체에 첨가하기 전에, 포획 항체를 실온에서 1 시간 동안 350 ㎕의 5％ MPBS로 차단하고, 후속적으로 PBS로 2회 세척하였다. 모든 후속 단계는 직접 코팅된 항원에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

1.3 Ba/F3 부모 세포 상에서의 흡착 단계를 비롯한, Ba/F3/IL12Rβ1 발현 세포에 의한 전세포 패닝

항체 선택을 위해, HuCAL 골드^® 항체-파지를 Ba/F3/IL12Rβ1 발현 세포 상에서 3회 라운드의 전세포 패닝에 개별적으로 적용하였다. 구체적으로, 5x10⁶ 내지 1x10⁷ 세포를 1 ml 2％ PBS/BSA (= 차단 완충제)로 사전-차단하고, 5x10⁶ 세포를 각각의 패닝에 사용하였다. 각각의 패닝을 위해, 약 2x10¹³ HuCAL 골드^® 파지를 동일한 부피의 PBS/4％ BSA로 4℃에서 1.5 시간 동안 차단시켰다. 사전-차단된 HuCAL 골드^® 파지를 사전-차단된 표적 세포에 첨가하고, 4℃에서 2 시간 동안 회전 휠 상에서 인큐베이션하였다. 회전 휠 상에서 1.5 ml 2％ PBS/BSA로 4℃에서 5 분 동안 3회 세척한 후, PBS로 4℃에서 5 분 동안 1회 세척하였다. 세포를 2000 rpm에서 4℃에서 1 분 사이에 원심분리하였다. 파지의 용리는 실온에서 10 분 동안 1 mL의 0.1M 글리신, 0.5M NaCl, pH 2.2로의 산성 용리에 의해 수행하였다. 원심분리된 파지 용리물에 완충되지 않은 30 ㎕ 2M 트리스를 첨가하여 상기 용리물을 중화시켰다. 후속적으로, Ba/F3 부모 세포로의 후속-흡착을 회전 휠 상에서 4℃에서 20 분 동안 패닝 용리물당 1E+7 세포로 3회 수행하였다. 세포를 4℃에서 1 분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 9 mL의 이.콜라이 TG1의 첨가에 의해 이.콜라이 TG1의 감염을 위해 최종 SN을 사용하였고, 이를 37℃에서 2xYT 배지에서 0.6-0.8의 OD₆₀₀으로 성장시키고, 파지 감염을 위해 진탕시키지 않고 수조에서 50 ml 플라스틱 튜브에서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 감염된 파지를 적정하고, 후속적으로 10 분 동안 5000 rpm에서 원심분리하고, 박테리아 펠릿을 각각 500 ㎕ 2xYT 배지에 재현탁시키고, 2xYT-CG 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 콜로니를 플레이트로부터 제거하고, 파지를 구조하고, 상기 기재된 바와 같이 증폭시켰다. Ba/F3/IL12Rβ1 발현 세포에 의한 전세포 패닝의 제2 및 제3 라운드를 세척 절차의 엄격성을 증가시킨 것을 제외하고는 제1 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.

1.4 Ba/F3/IL12Rβ1 발현 세포 및 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc에 의한 상이한 세포 패닝

세포 표면 발현을 마우스 모노클로날 항-인간 IL12Rβ1 대조군 항체 (알앤디 시스템즈(R&D Systems))의 도움으로 FACS 분석에 의해 체크하였다. 세포 패닝 동안에 Ba/F3 부모 세포 상에서의 흡착 단계를 비롯하여 제1 및 제3 라운드 패닝에 대한 전세포 패닝에 대해 상기 기재된 바와 같이 패닝을 수행하였다. 제2 라운드는 직접 코팅된 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 (rh IL12Rβ1) 상에서 IL12Rβ1에 대한 표준 고체 상 패닝에 대해 상기 기재된 바와 같이 직접 코팅된 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 상에서 수행하였다.

1.5 ELISA에 의한 IL12Rβ1-특이적 Fab에 대한 일차 스크리닝 (직접 또는 포획 방식)

PBS 중 10 ㎍/mL의 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)을 직접 스크리닝 방식으로 22℃에서 밤새 384 웰 맥시소르프^® 플레이트 상에 코팅하였다. 포획 방식의 스크리닝을 위해, 384 웰 맥시소르프^® 플레이트의 웰을 PBS 중에서 4℃에서 밤새 20 ㎕의 10 ㎍/ml Fcγ 특이적 어피니퓨어 염소 항-인간 IgG로 코팅하였다. 코팅 후, 웰을 PBST로 5회 세척하였다. 이어서, 상기 웰을 5％ MPBST로 실온에서 2 시간 동안 차단하였다. 그와 동시에, 15 ㎕ BEL 추출물을 15 ㎕ 12.5％ MPBST로 22℃에서 차단하였다. 직접 스크리닝 방식을 위해, 20 ㎕의 차단된 BEL 추출물을 웰에 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하기 전에, 차단된 맥시소르프^® 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 포획 방식을 위해, 2.5 ㎍/ml 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 후속적으로 차단된 BEL 추출물과 함께 인큐베이션하였다. 일차 Fab 항체의 검출을 위해, 하기 이차 항체를 적용하였다: 알칼리성 포스파타제 (AP)-접합된 어피니퓨어 F(ab')₂ 단편, 염소 항-인간 및 -항-마우스 또는 -항-양 IgG (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))를 상응하는 대조군 항체에 첨가하였다. AP-접합체의 검출을 위해, 형광 기질 AttoPhos (로쉐(Roche))를 제조자의 지침에 따라 사용하였다. 이차 항체와의 최종 인큐베이션 단계 이후, 모든 인큐베이션 단계 사이에 마이크로타이터 플레이트의 웰을 PBST (3회) 및 TBST (3회)로 세척하였다. 형광을 테칸 제니오스 프로(Tecan GENios Pro) 플레이트 판독기로 측정하였다.

2. 스크리닝 검정으로부터 확인된 항체의 친화도 측정

2.1 표면 플라즈몬 공명을 이용한 친화도 측정

항-인간-Fc-포획 (디아노바(Dianova)) 검정을 수립하였다. 포획된 Fc-융합체를 리간드로서 사용하고, Fab를 분석물로서 사용하였다.

상세: CM5 칩 (비아코어, 스웨덴)을 모든 4개의 유동 세포 상에서 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 이용하여 5000-6000 RU 항-Fc (디아노바, 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적; 10 mM 아세테이트 완충제, pH 4.5 중 80 ug/ml)로 코팅하였다. 유동 세포 2를 IL12R1-/Fc 융합체 (유속 5 ㎕/ml의 20 ㎕의 100 nM 리간드, 300-400RU)로 포획하였다. 후속적으로, 분석물을 15.6 nM 내지 500 nM의 농도 범위에서 주사하였다 (20 ㎕, 유속 20 ㎕/분). 작동 조건: PBS pH 7.2. 각각의 주기 이후, 유동 세포를 10 mM 글리신 pH 1.5에 의해 재생시켰다. 생성된 완충제 센서그램을 이중 참조 (완충제 주사)에 대한 특이적 신호로부터 수동적으로 차감하였다. 모든 센서그램을 플롯팅하고, BIA 평가 소프트웨어 3.1 (비아코어)을 이용하여 평가하였다. 상기 방법에 의해 측정된 인간 IL12Rβ1에 대한 부모 Fab 항체의 요약된 친화도는 2 - 450 nM의 범위이었다.

2.2 박테리아 용해물 중에서 IL12Rβ1 결합 Fab의 검출을 위한 전기화학발광 (바이오베리스) 기반 결합 분석

이.콜라이 용해물 (BEL 추출물) 중에서 친화도-개선된 IL12Rβ1-특이적 항체 단편의 검출을 위해, 바이오베리스 M-384 시리즈^® 워크스테이션에 의해 결합을 분석하였다. 바이오베리스 스크리닝을 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에서 수행하였다. BEL 추출물을 검정 완충제 (0.5％ BSA 및 0.05％ 트윈-20으로 보충된 PBS)로 희석하였다. 비오티닐화 IL12Rβ1을 제조자의 지침에 따라 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 (M-280, 다이날(Dynal))에 커플링시켰다. BEL 추출물 및 비오티닐화 IL12Rβ1로 코팅된 스트렙타비딘 비드를 실온에서 밤새 하이돌프(Heidolph)-진탕기 (1000 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 검출을 위해, 루테늄 착체 (BV-태그™)로 표지된 항-인간 (Fab)'₂ (디아노바)를 사용하였다.

2.3 용액 평형 적정 (SET)을 이용한 피코몰 친화도의 측정

용액 평형 적정 (SET)에 의한 K_D 측정을 위해, Fab 단백질의 단량체 분획 (90％ 이상의 단량체 함량, 분석용 SEC로 분석함, 수퍼덱스75(Superdex75), 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia))을 사용하였다. 적용된 Fab 농도는 예상되는 K_D와 유사하거나 그보다 낮은 값이었다.

용액 중에서의 전기화학발광 (ECL) 기반 친화도 측정 및 데이터 평가를 기본적으로 용액 중 재조합 인간 IL12Rβ1/Fc (1 nM 출발 농도)에 대해 상기 기재된 바와 같이 (문헌 [Haenel, C., (2005) et al., Anal Biochem 339, 182-184]) 수행하였다. 상자성 비드 (M-280 스트렙타비딘, 다이날) 및 루비듐-함유 BV-태그™ (바이오베리스 유럽) 표지된 항-인간 (Fab)'₂ (디아노바)에 커플링된 비오티닐화 인간 IL12Rβ1/Fc를 첨가하고, 30 분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 결합되지 않은 Fab의 농도를 ECL 검출을 통해 M-시리즈^® 384 분석기 (바이오베리스 유럽)를 사용하여 정량화하였다.

Fab 분자의 K_D 측정에 대한 데이터 평가를 위해, 하기 대입 모델을 사용하였다 (문헌 [Abraham et al., J Mol Recognit. 9, 456-461 (1996)]에 따라 변형됨):

cFab: 적용된 Fab 농도

cIgG: 적용된 IgG 농도, 완전한 분자 (결합 부분 아님)

x: 적용된 전체 가용성 항원 농도 (결합 부분)

sqrt: 제곱근

상기 기재된 검정 조건을 이용하여 친화도-최적화된 항-IL12Rβ1 Fab에 대한 (단량체성) 친화도를 용액 중에서 측정하였다.

2.4 IL12Rβ1 - IL12/IL23 시험관내 경쟁적 결합 억제 검정

IL12 및 IL23 결합 억제 검정을 위해, 25 ㎍ 재조합 인간 IL12 및 20 ㎍ IL23 (알앤디 시스템즈)을 250 ㎕ 카르복실산 M-270 다이날 자기 비드 (2 x 10⁹ 비드/ml)에 직접 커플링 (NHS/EDC 커플링)시켰다. 1:4 희석 단계 중 50 ㎕ Fab 항체/웰 (20 nM 원액) (Fab 농도: 0.6 pM - 10 nM)을 96 웰 플레이트 (Nunc)에서 50 ㎕의 40 - 100 pM IL12Rβ1/Fc 융합체와 함께 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 25 ㎕ IL12 또는 IL23 코팅된 비드, 및 공급자 (바이오베리스 유럽)의 지침에 따라 BV-태그™로 표지된 1:500 희석된 스트렙타비딘 검출 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 바이오베리스 M-384 시리즈^® 워크스테이션 (바이오베리스 유럽)에 의해 검출을 수행하였다. EC₅₀ 측정은 4-변수 로지스틱 대입 모델 (XLfit, IDBS)에 의해 생성된 데이터를 평가함으로써 수행하였다.

3. 세포-기반 기능적 검정을 비롯한 항체의 시험관내 특성화

3.1 인간 혈액 세포의 IL12-의존성 IFNγ 생성의 억제

공여자 혈액으로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 상기 기재된 바와 같이 히스토파크(Histopaque) 구배를 통해 단리하였다. 세포를 X-Vivo 15 배지 중에서 2E+6 세포/ml로 조정하였다. 50 ㎕ 세포 (1E+5)를 96 웰 U 바닥 플레이트로 옮기고, 억제성 항체, 예를 들어 항-인간 IL12Rβ1 Fab 또는 IgG4 또는 대조군 mAb 또는 대조군과 함께 목적하는 농도에서 인큐베이션하고, 진탕기 상에서 실온에서 30 분 동안 사전 인큐베이션하였다. 2 ㎍/ml 항-CD3 및 항-CD28 mAb 및 2 ng/ml 재조합 인간 시토카인 IL12에 의한 자극을 밤새 20 시간 동안 37℃에서 5％ CO₂ 인큐베이터에서 수행하였다. 다음 날, 상청액을 실온에서 5 분 동안 250 g에서 세포의 원심분리에 의해 수집하고, 새로운 96 웰 플레이트로 옮기고, ELISA 측정을 위해 사용하거나 또는 검정을 수행할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

IFNγ ELISA를 위해, 상기 수집된 상청액을 X-Vivo15 배지로 희석하고, ELISA를 제조자 프로토콜 벤더메드 시스템즈(BenderMed Systems) #BMS228HS 또는 바이오졸/바이오레전드(Biozol/Biolegend) #BLD-430105에 따라 수행하였다. IFNγ 생성을 IFNγ 표준 적정 곡선에 따라 측정하였다.

3.2 인간 혈액 세포의 IL23-의존성 IFNγ 생성의 억제

또다른 검정 시스템을 PHA-자극된 PBMC를 사용하여 연구하였다. 이 세포 집단에서, T 세포는 렉틴 노출시에 증식하였고, 따라서 상기 집단에서 T 세포의 비율이 증가하였다. 예비 실험에서, 이들 세포의 IL-12, IL-23, IL-18 및 LPS의 단독 또는 조합에 대한 반응성을 평가하여, 최적 자극 조건을 수립하였다. IFN-γ 분비에 대한 IL-12 + IL-18 및 IL-23 + IL-18의 효과는 각각 대략 7 ng/ml 및 800 pg/ml의 유도이었다.

3.3 전혈에서 IL12-의존성 IFNγ 생성의 억제

200 ㎕의 항-응고 혈액의 분취액을 상단 및 바닥 열이 PBS로 충전된 U-바닥 96 웰 플레이트 (코스타(Costar), 3799)의 개별 웰에 분배하였다. 화합물을 제조하고, X-Vivo 15 배지 (바이오-휘태커(Bio-Whitaker), BE04-418F)에서 목적하는 최종 농도의 20배로 적정하고, 조건당 3벌식으로 웰에 첨가하였다 (10 ㎕). 시토카인 IL-12 (알앤디 시스템즈, 219-IL) 및 IL-18 (알앤디, B001-5)을 개별적으로 및 조합으로 20배 농도로 제조하고, 상단으로 첨가하여 (10 ㎕), 220 ㎕의 전체 배양 부피를 생성하였다. 자극 또는 억제성 화합물이 없는 3벌식의 웰을 적절한 경우에만 배지로 충전하였다.

37℃, 5％ CO₂에서 20-24 시간의 인큐베이션 이후, 전혈을 함유하는 플레이트를 650 g에서 10 분 동안 원심분리하고, 혈장을 상단으로부터 주의해서 수집하였다. 표준 곡선의 선형 범위 내에서 측정치를 수득하기 위해, 혈장을 PBS/2 mM EDTA에 의해 1:5로 희석하였다. 유도가 더 강력한 경우에는, 보다 높은 희석률 1:10-1:20에서 추가의 측정을 수행하였다.

3.4 FACS 분석에 의해 측정된 IL12Rβ1 발현 Ba/F3 세포의 특이적 세포 결합

각각의 세포주의 세포 (시노 및 인간 IL12Rβ1로 안정적으로 형질감염된 BaF3 세포; 시노 IL12Rβ1로 안정적으로 형질감염된 HEK EBNA 및 Jurkat 세포)를 계수하고, PBS/3％ FCS/0.02％ NaN₃ (FACS 완충제) 중에서 2x10⁷ 세포/ml로 조정하였다. FACS 염색을 V-바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (NUNC™, 독일 비스바덴)에서 수행하고, 1x10⁵ 세포/웰을 a) 정제된 Fab 단편 또는 b) 정제된 IgG4 또는 c) 양성 대조군 항체 (마우스 항-IL12Rβ1, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호:MAB839)와 혼합하고, FACS 완충제로 희석하고, 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 200 ㎕ FACS 완충제/웰로 2회 세척하고, FACS 완충제로 1:200 희석된 100 ㎕ 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치)에 녹였다. 4℃에서 45 분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 100 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁시키고, IL12Rβ1 특이적 항체의 세포 표면 결합을 FACSCalibur™ (벡톤 딕킨슨)에서 세포의 FL2 형광 강도를 통해 측정하였다.

4. 생체내/생체외 기능적 검정

4.1. 시노몰구스 원숭이 약력학 (PD) 검정

헤파린첨가 혈액 샘플을 96-U 웰 플레이트 (190 ㎕/웰)에 분배하였다. 재조합 인간 IL-12 (알앤디 시스템즈; 100 ng/ml 최종) 및 IL-18 (MBL; 50 ng/ml 최종)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 3 분 동안 부드럽게 혼합하였다. 37℃, 6％ CO₂에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 2000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 혈장을 수집하고, 추가로 가공할 때까지 -80℃에서 유지시켰다.

IL-2, TNFα 및 INFγ의 평가를 제조자 (유시테크 바이오사이언시즈(UcyTech Biosciences), 유트레흐트)에 의해 기재된 바와 같이 NHP 특이적 ELISA-키트 (CT711, CT148 및 CT141)에 의해 수행하였다.

PD 판독을 위해, pg INFγ/ml의 결과를 각각의 샘플에서 발견되는 림프구의 수에 의해 보정하여, 최종적으로 pg/10⁶ 림프구로 표현하였다.

순환 IL-2/TNFα/INFγ 수준을 모니터링하기 위해, 결과를 pg 시토카인/ml로 표현하였다.

4.2. 래트 생체내 적합성 검정

래트를 규정된 용량의 mAb로 주사하고, 혈장 반감기 시간을 측정하기 위해 피크 혈장 농도 및 제거 속도를 모니터링하도록 혈액 샘플을 몇몇 간격에서 취하였다. 래트 표적에 대한 교차-반응성이 예상되지 않았기 때문에, 표적-관련 효과 (내재화, 턴오버) 또한 결과에 영향을 미치지 않을 것으로 예상될 수 있다.

4.3 CD45RBhi 전달 염증성 장 질환 마우스 모델

중량 손실을 특징으로 하는 질환을 유도하기 위해, CD4+CD45RBHi T 림프구를 FACS-분류에 의해 BALB/c 마우스 비장으로부터 단리하고, 10 주령의 암컷 SCID 마우스에게 주사하였다 (2 x 10⁵ 세포/마우스, i.p.) (제0일). 음성 대조군 마우스에게 PBS i.p.를 제공하고, 이 면역결핍 콜로니에서 가능한 감염을 모니터링하기 위해 이러한 한 마우스를 센티넬로서 각각의 케이지에 두었다. 마우스 군은 제1일, 제7일, 제14일 및 제21일에 mAb (항-IL12p40 클론 C17.8 또는 항-IL12Rβ1 항체 또는 이소형 대조군) 또는 PBS의 피하 주사에 의한 처리를 제공받았다. 각각의 마우스의 체중을 연구하는 내내 및 연구 종료시에 모니터링하였다.

결과

실시예 1: 길항제 항-인간 IL12Rβ1 항체 후보의 확인

1.1 직접 코팅된 IL12Rβ1/Fc 상에서의 파지 패닝

맥시소르프 상에 직접 코팅된 IL12Rβ1/Fc 상에서의 패닝에 의해 직접 코팅된 IL12Rβ1/Fc 상에서의 스크리닝에서 353의 일차 히트(hit)가 생성되었다. 서열 분석에 의해 30개의 독특한 Fab 서열이 나타났다. 한 Fab는 HCDR2, LCDR1 및 LCDR2에서 몇몇 잠재적인 N-글리코실화 부위를 가졌고, 따라서 추가의 분석으로부터 제외되었다.

1.2 항-Fc 항체를 통해 포획된 IL12Rβ1 상에서의 패닝

염소 항-인간 IgG Fc 감마 특이적 항체를 통해 포획된 IL12Rβ1/Fc 상에서의 패닝 및 IL12Rβ1/Fc 포획된 항원 상에서의 후속적인 일차 스크리닝에 의해 75의 일차 히트가 생성되었다. 서열 분석에 의해 8개의 독특한 Fab 서열이 나타났다.

1.3 Baf3/IL12Rβ1 발현 세포 상에서의 전세포 패닝

Baf3/IL12Rβ1 발현 세포에 대한 3회 선택 라운드를 포함하는 전세포 패닝 (WCP)은 Baf3 부모 세포에 대한 흡착 단계를 포함하였다. 112의 일차 히트가 직접 코팅된 항원에 대해 확인되었고, 122의 일차 히트가 포획된 항원에 대해 확인되었다. 상이한 세포 패닝 (DCP)의 경우, 제1 패닝 라운드는 세포에 대한 것인 반면에, 제2 라운드는 맥시소르프에 직접 코팅된 IL12Rβ1/Fc에 대한 것이며, 그 후 제3 라운드는 다시 세포에 대한 것이다. DCP의 일차 스크리닝에 의해 직접 코팅된 항원에서 50의 히트 및 포획된 항원에서 51의 히트가 나타났다. 총 14개의 추가의 독특한 Fab가 확인되었고, WCP로부터 11개 및 DCP로부터 3개가 확인되었다. IL12Rβ1/Fc (직접 및 포획)에 대한 이전의 패닝으로부터 4개의 Fab가 세포 패닝에서 다시 확인되었다.

ELISA에서 인간 IL12Rβ1/Fc를 인식하는 총 52개의 Fab가 확인되었다.

1.4 인간 IL4Rα/Fc에 대한 교차-반응성을 비롯하여 ELISA에서 Fab의 특성화

인간 IL12Rβ1/Fc 및 인간 IL4Rα/Fc에 대한 결합을 ELISA로 시험하였다. 1 및 10 ㎍/mL의 각각의 Fc 융합 단백질을 맥시소르프 상에 직접 코팅하고, 동시에 각각 1 및 10 ㎍/ml를 항-Fc를 통해 포획하였다. 한 Fab는 항원 포획 방식에서 IL4Rα/Fc에 대해 일부 교차-반응성을 나타내었지만, 직접 코팅된 IL4Rα/Fc에 대한 결합은 나타내지 않았다 (데이터는 도시하지 않음). 이 Fab는 추가의 분석으로부터 제외되었다. 모든 다른 시험된 Fab는 직접 코팅된 및 포획된 항원 둘 다에서 인간 IL12Rβ1/Fc에 대해 특이적 결합을 나타내었고, 인간 IL4Rα/Fc에 대해서는 결합을 나타내지 않았다.

1.5 IL12Rβ1 형질감염된 Baf3 세포에 대한 Fab의 FACS 분석

Baf3 세포 상에서 발현된 인간 IL12Rβ1/Fc에 대한 결합을 FACS에 의해 분석하였다. 초기에, 인간 IL12Rβ1의 상이한 발현 수준을 갖는 인간 IL12Rβ1 형질감염된 세포의 두 세포 집단을 검출하였다. FACS 분류의 2회 라운드에 의해 균일한 세포 집단의 검출이 나타났다. 52개의 ELISA 양성 Fab 중 48개는 인간 IL12Rβ1 형질감염된 BaF3 세포에 대한 FACS 결합을 나타내었고, 추가의 분석에 적용하였다.

1.6 Fab 항체를 이용한 IL12 및 IL23 결합 억제 검정 (바이오베리스)

FACS 양성 Fab를 IL12 및 IL23 수용체 결합 억제에 대해 분석하였다. 26개이 Fab는 바이오베리스™에서 IL12/IL12Rβ1 결합 억제를 나타낸 반면에, 14개의 Fab만이 바이오베리스™에서 IL23/IL12Rβ1 결합 억제를 나타내었다. 상이한 크기에서 약간 상이한 결합 에피토프 또는 약간 상이한 리간드 수용체 친화도는 이러한 불일치를 초래할 수 있었다. 주목할 만하게는, IL12 및 IL23/IL12Rβ1 결합 억제는 동시에 12개의 Fab에 대해 검출가능하였다. 일반적으로, IL12 억제로부터 수득된 EC₅₀ 값은 IL23 억제와 비교해서 약간 낮았다 (표 1). 12개의 Fab 중 하나는 ELISA에서 rh IL4Ra/Fc에 대한 교차 반응성 결합으로 인해 제외되었다. 최종적으로, 52개의 Fab 중 11개를 추가의 평가를 위해 선택하였다. 11개의 Fab 중 3개는 세포 패닝으로부터 및 8개는 IL12Rβ1/Fc에 대한 패닝으로부터 직접 및 포획 방식으로 유래되었다. EC₅₀ 값은 낮은 nM 내지 수백 nM의 범위였다 (표 1 참조).

<표 1>

1.7 항-인간 Fc-포획된 IL12Rβ1/Fc에 대한 비아코어 친화도 측정

부모 Fab의 경우, 친화도를 비아코어에서 포획된 IL12Rβ1/Fc에 대해 측정하였다. 11개의 사전-선택된 Fab의 친화도는 2 - 450 nM의 범위였다 (표 2).

<표 2>

1.8 모든 11개의 사전-선택된 후보의 IgG4 전환

모든 11개의 사전-선택된 Fab 후보를 IgG4 포맷으로 전환시켰다. 모든 11개의 IgG4가 발현되었고, 이를 ≤ 1 mg 규모로 정제하였다. MOR04580 및 MOR04581은 낮은 IgG4 발현 수준을 나타내었다.

1.9 항-IL12Rβ1 항체의 길항작용 잠재력을 측정하기 위한 일차 인간 T 세포

PBMC 내의 인간 일차 T 세포를 항-CD3/항-CD28로 자극하여 IFN-γ의 IL12 의존성 유도를 가능하게 하였다. 선택된 IgG4 항체를 IL12 유도된 IFN-γ 생성의 용량 의존성 억제에 대해 시험하였다. 폴리클로날 양성 대조군 항-IL12Rβ1 항체 AF839 (알앤디 시스템즈)는 용량-의존성 방식으로 IFN-γ 생성을 억제한 반면에, 모노클로날 Mab839는 명백한 억제를 나타내지 않았다. MOR04557, 04559 및 04580은 이 검정에서 가장 활성이었다 (표 3).

표 3은 친화도 성숙에 대해 선택된 항체의 데이터를 요약한다.

<표 3>

1.10 친화도 성숙

성숙을 위해 선택된 7가지 항체를 3가지 상이한 집단으로 나누었다.

집단 1: MOR04557; MOR04559 (동시에 H-CDR2 및 L-CDR3 최적화)

집단 2: MOR04558; MOR04715 (동시에 H-CDR2 및 L-CDR3 최적화)

집단 3: MOR04561; MOR04580; MOR04601 (동시에 H-CDR2 및 L-CDR3)

1.11 라이브러리 클로닝, 파지 제조 및 선택

8개의 상이한 Fab 성숙 라이브러리를 클로닝하였고, 무작위로 선택된 클론의 서열분석은 대략 100％의 다양성을 나타내었다. 8개의 라이브러리로부터의 파지 제제를 부분적으로 모아서, 최종적으로 성숙 패닝을 위한 투입으로서 6개의 파지 집단을 수득하였다. 총 3가지 상이한 성숙 전략을 적용하여 최적화된 항체를 선택하였다. 비오티닐화 인간 IL-12Rβ1/Fc에 대한 용액 패닝을 위해, 항원 및 IL12Rβ1/Fc 경쟁의 감소 (감소율 선택)를 이용하여 선택하는 동안 엄격성을 증가시켰다. IL12Rβ1/Fc 포획 패닝으로도 불리는 제2 전략으로서 반용액을 사용하였다. 여기서, 항원의 감소 및 연장된 세척을 수행하였다 최종적으로, 세포 수의 감소 및 연장된 세척을 포함하는 전세포 패닝을 적용하였다. 각각의 선택 방법에 대해 3회 라운드의 성숙 패능을 수행하였다.

1.12 친화도 스크리닝

친화도 스크리닝을 바이오베리스에서 수행하고, 모든 패닝으로부터 유래된 총 2790개의 단일 클론을 IL12Rβ1/Fc에 대한 개선된 친화도에 대해 스크리닝하였다. 모든 패닝으로부터 수득된 264의 일차 히트를 이차 스크리닝을 위해 선택하였고, 최상의 히트를 서열분석하였다. 32개의 결합제를 주로 H-CDR3의 다양성에 기초하여 발현 및 정제를 위해 선택하였다.

실시예 2: 본 발명의 Fab 및 IgG의 특성화

2.1 SET (바이오베리스)에서 친화도 측정

선택된 친화도-최적화된 항-IL12Rβ1 Fab에 대한 단량체성 친화도를 용액 중에서 측정하였고, 이를 표 4에 요약하였다.

<표 4>

몇몇 최적화된 Fab는 그들의 부모 Fab에 비해 700배 이하의 친화도 개선을 나타내었다. 바이오베리스에서 측정된 SET 친화도는 1 - 1200 pM의 범위였고 (표 4), 대부분의 친화도는 1 - 100 pM의 범위였다.

2.2 ELISA에서 IL4Rα/Fc에 대한 교차-반응성

직접 코팅된 IL4Rα/Fc에 대한 교차-반응성이 ELISA에서 검출되지 않았다. Fc 포획 ELISA에서, 대부분의 Fab는 특이적이었지만, MOR05291 및 MOR05292는 IL4Rα/Fc 및 CD28/Fc에 대한 결합을 나타낸 반면에, 이들 두 결합제는 IgG 전환을 위해 사용된 것은 아니었다 (데이터는 도시하지 않음).

2.3 인간 IL12Rβ1 형질감염된 Baf3 세포에 대한 FACS 결합

모든 최적화된 Fab는 인간 IL12Rβ1 형질감염된 Baf3 세포에 대해 양호한 FACS 결합을 나타내었다 (요약 데이터 표 5 참조)

2.4 요약 Fab 데이터 및 IgG4 전환에 대한 선택

20개의 Fab를 IgG4 전환 및 발현을 위해 선택하였고, 이중 16개의 IgG4는 성숙으로부터 직접적으로 유래되고, 4개의 IgG4는 MOR04561 유도체의 교차-클로닝으로부터 유래되었다 (표 5). 선택된 IgG4는 7개의 부모 결합제 중 5개를 커버하였고, 각각의 3개의 집단으로부터 1개 이상의 IgG4는 높은 다양성을 유지하기 위해 선택되었다.

<표 5>

2.5 20개의 사전-선택된 후보의 IgG4 전환

20개의 IgG4를 전환시키고, 발현시키고, 정제하였다. 일반적으로, IgG는 양호한 발현을 나타내었지만 (데이터는 도시하지 않음), MOR05286 및 MOR05287은 최종 완충제 PBS pH 6.5에 대해 투석되어야 하였고, 이는 표준 PBS pH 7.2로의 완충제 교환으로 인해 단백질의 침전 및 유의한 손실이 발생하였기 때문이다. MOR05286 및 MOR05287의 등전점은 pH 7.2에서의 침전에 대한 원인일 수 있다. MOR05273은 매우 낮은 발현율을 나타내었고, 따라서 추가의 분석으로부터 제외되었다.

2.6 최적화된 IgG의 특성화

ELISA에서 IL4Rα/Fc에 대한 IgG 교차-반응성

모든 19개의 IgG4는 ELISA에서 직접 코팅된 IL4Rα/Fc에 대해 교차-반응성을 나타내지 않았고, MOR05358은 IL12Rβ1에 결합하지 않았고, 추가의 평가로부터 제외되었다 (데이터는 도시하지 않음).

2.7 인간 및 시노 IL12Rβ1 형질감염된 Baf3 세포에 대한 IgG의 FACS 결합

19개의 IgG4를 인간 및 시노몰구스 IL12Rβ1 형질감염된 Baf3 세포에 대한 FACS 결합에 대해 분석하였고, 모두 시노몰구스 IL12Rβ1에 비해 인간에 대해 거의 동일한 EC₅₀ 값을 나타내었다. 포화 상에서 최대 결합 신호의 차이는 아마도 거의, 항-인간 Fab 검출 항체가 상이한 프레임워크를 구별한다는 공지된 사실로 인한 것이었다 (표 6). 1가 친화도와 FACS 결합 EC₅₀ 값 사이의 차이는 수용체 항원의 상이한 형태 또는 글리코실화로 인한 것일 수 있다. IgG의 상이한 결합력 효과 또한 소정의 역할을 할 수 있다. 또한, 시노몰구스 IL12Rβ1이 또한 인간 HEK293 및 인간 Jurkat 세포 (인간, 말초 혈액, 백혈병, T 세포)에서 발현되었다. MOR05286은 인간 세포에서 발현된 시노몰구스 IL12Rβ1에 대한 명백한 FACS 결합을 나타내었다. MFI (평균 형광 강도) 값을 표 7에 나타내었다.

<표 6>

<표 7>

실시예 3: 선두 후보의 선택 및 특성화

3.1 선두 후보의 서열

최종적으로, 4개의 선두 IgG4를 상이한 바이오-검정에서 그들의 친화도 및 활성에 따라 선택하였다: MOR05271, MOR05286, MOR05278, MOR05281.

하기 표 8은 본 발명의 선택된 항체의 상응하는 CDR에 대한 서열을 기재한다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타내고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타낸다.

<표 8>

3.2 MOR05286의 시험관내 효능작용 잠재력

일련의 실험을 수행하여, MOR5286 단독의 또는 가교 시약의 존재 하에서의 잠재적인 효능작용 활성을 평가하였다. 이들 검정은 인간 IgG 불변 영역에 대해 지정된 모노클로날 또는 폴리클로날 Ab를 사용하였고, T 세포의 표면 상의 활성화 마커 뿐만 아니라, 시토카인 생성 및 증식 반응을 모니터링하는 것에 대한 것이다.

효능작용 항-CD28 mAb를 양성 대조군으로서 사용하였다. 이 mAb는 대조군 샘플에 비해 대략 10배의 CD25 및 CD69 형광 강도의 평균 증가 및 CD69를 발현하는 인간 CD4+ T 세포의 >80％를 갖는 활성화 마커의 명백한 유도를 나타내었다 (데이터는 도시하지 않음). 대조적으로, MOR05286은 IL-12+IL-18 자극과 무관하게 어떠한 일반적인 활성화 반응도 나타내지 않았다.

일부 실험에서, 소량의 IFN-γ 생성이 가교 mAb 항-IgG4 A의 존재 하에 MOR05286을 갖는 인간 PBMC의 활성화 이후 관찰되었다 (데이터는 도시하지 않음). 그러나, 이 효과는 IL-12 + IL-18의 IFN-γ-유도 칵테일로 추가로 보충된 세포 배양물에서 재현되지 않았다. 이들 조건 하에, 상기 반응은 예상한 대로 대조군 IgG4에 의해 관찰된 것보다 훨씬 낮았다. 게다가, IFN-γ 생성은 IL-12 + IL-18로 자극 또는 비자극된 인간 전혈 또는 레서스 PBMC 배양물에서 유도되지 않은 반면에, 시토카인 매개 IFN-γ 생성에 대한 MOR05286의 억제 효과는 두 종에서 일치하였다. 이들 데이터는 함께, MOR05286이 인간 T 세포에 대한 활성화 마커의 발현을 유도하지 않고, 인간 및 NHP T 세포에 의한 시토카인 생성을 촉진시키는 잠재력을 갖지 않음을 나타낸다.

실시예 4: 본 발명의 IL12Rβ1 결합 항체를 교차 차단하는 스크리닝 항체

4.1 비아코어 교차 차단 검정

하기에 항체 또는 다른 결합제가 본 발명에 따른 항체를 교차 차단하는지 또는 교차 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 적합한 비아코어 검정을 일반적으로 기재하였다. 본원에 기재된 임의의 IL12Rβ1 결합제와 함께 분석을 이용할 수 있음을 인지할 것이다.

비아코어 기기 (예를 들어 비아코어 3000)는 제조자의 권장사항에 일치하게 작동하였다.

IL12R베타1 세포외 도메인을 통상적으로 사용되는 아민 커플링 화학, 예를 들어 EDC-NHS 아민 커플링에 의해, 예를 들어 CM5 비아코어 칩에 커플링시켜 IL12Rβ1-코팅된 표면을 생성할 수 있었다. 측정가능한 수준의 결합을 얻기 위해, 전형적으로는 200-800 공명 단위의 IL12Rβ1을 칩에 커플링시킬 수 있었다 (상기 양은 측정가능한 수준의 결합을 제공하고, 동시에 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 쉽게 포화가능함).

IL12Rβ1을 비아코어 칩에 부착시키는 대안적인 방법은 "태그가 부착된" 버전의 IL12Rβ1, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단 His-태그가 부착된 IL12Rβ1을 사용함에 의한 것이다. 상기 형식에서, 항-His 항체가 비아코어 칩에 커플링될 것이고, 이어서 His-태그가 부착된 IL12Rβ1이 칩의 표면 위로 통과되어 항-His 항체에 의해 포획될 것이다.

서로 교차 차단하는 능력에 대해 평가할 2개의 항체를, 시험 혼합물을 생성하기에 적합한 완충액 내에서 결합 부위의 화학양론적 양으로, 예를 들어 1:1 몰비로 혼합하였다. 사용된 완충액은 전형적으로는 단백질 화학에서 통상적으로 사용되는 완충액, 예를 들어 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.76 mM KH₂PO₄ (pH 7.4))였다. 결합 부위를 기준으로 농도를 계산할 때, 항체의 분자량은 항체의 총 분자량을 그 항체 상의 표적 (즉, IL12Rβ1) 결합 부위의 수로 나눈 값으로 가정하였다.

시험 혼합물 내의 각각의 항체의 농도는 비아코어 칩 상에 결합되는 IL12Rβ1 분자 상에서 그 항체에 대한 결합 부위의 포화를 보장하기에 충분히 높아야 한다. 혼합물 내의 항체는 동일한 몰 농도 (결합 기초)이고, 그 농도는 전형적으로 1.0 mM 내지 1.5 mM (결합 부위 기초)일 것이다.

독립적으로 별도의 항체를 함유하는 별도의 용액을 또한 제조하였다. 이들 별도의 용액에 사용된 완충액은 시험 혼합물에 대해 사용된 것과 동일한 농도의 동일한 완충액이어야 한다.

시험 혼합물을 IL12Rβ1-코팅된 비아코어 칩 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 결합된 항체를 칩을 예를 들어 산, 예를 들어 30 mM HCl로 약 1분 동안 처리함으로써 제거하였다. 칩에 결합된 IL12Rβ1 분자가 손상되지 않도록 하는 것이 중요하다.

이어서, 제1 항체 단독의 용액을 IL12Rβ1-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 칩-결합 IL12Rβ1을 손상시키지 않으면서 모든 결합 항체를 제거하기 위해 칩을, 예를 들어 상기 언급된 산 처리에 의해 처리하였다.

이어서, 제2 항체 단독의 용액을 IL12Rβ1-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합의 양을 기록하였다.

최대 이론적 결합은 각각의 항체의 IL12Rβ1에 대한 개별적인 결합의 합으로서 정의할 수 있다. 이어서, 이를 측정된 항체들의 혼합물의 실제 결합과 비교하였다. 실제 결합이 이론적 결합보다 더 낮으면, 2개의 항체는 서로 교차 차단성이다.

4.2 Elisa-기반 교차 차단 검정

항-IL12Rβ1 항체 또는 또 다른 IL12Rβ1 결합제의 교차 차단을 또한 ELISA 검정에 의해 검출할 수 있었다.

ELISA-검정의 일반적인 원리는 항-IL12Rβ1 항체를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅하는 것을 포함한다. 이어서, 과량의 제2의 잠재적으로 교차 차단성인 항-IL12Rβ1 항체를 용액 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않은 용액)에 첨가하였다. 이어서, 제한된 양의 IL12Rβ1-Fc를 웰에 첨가하였다.

웰 상에 코팅된 항체 및 용액 내의 항체는 제한된 수의 IL12Rβ1 분자의 결합에 대해 경쟁할 것이다. 이어서, 플레이트를 세척하여 코팅된 항체에 결합되지 않은 IL12Rβ1-Fc를 제거하고, 또한 제2 용액상 항체, 뿐만 아니라 제2 용액상 항체와 IL12Rβ1-Fc 사이에 형성되는 임의의 복합체를 제거하였다. 이어서, 적절한 IL12Rβ1 검출 시약을 사용하여 결합 IL12Rβ1의 양을 측정하였다. 코팅된 항체를 교차 차단할 수 있는 용액 내의 항체는 제2 용액상 항체의 부재 하에 코팅된 항체가 결합할 수 있는 IL12Rβ1 분자의 수에 비해 코팅된 항체가 결합할 수 있는 IL12Rβ1 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다.

상기 검정을 Ab-X 및 Ab-Y로 불리는 2개의 항체에 대하여 하기에 추가로 보다 상세히 기재하였다. Ab-X가 고정되는 항체가 되도록 선택되는 경우, 이를 ELISA 플레이트의 웰 상에서 코팅하고, 그 후 플레이트를 적합한 차단 용액으로 차단시켜 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화시켰다. 이어서, 웰당 Ab-Y IL12Rβ1 결합 부위의 몰이 ELISA 플레이트의 코팅 동안 웰당 사용된 Ab-X IL12Rβ1 결합 부위의 몰보다 10배 이상 높도록, 과량의 Ab-Y를 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 웰당 첨가되는 IL12Rβ1-Fc의 몰이 각각의 웰을 코팅하기 위해 사용된 Ab-X IL12Rβ1 결합 부위의 몰보다 적어도 25배 더 낮도록 IL12Rβ1-Fc를 첨가하였다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, ELISA 플레이트를 세척하고, IL12Rβ1 검출 시약을 첨가하여 코팅된 항-IL12Rβ1 항체 (이 경우에 Ab-X)가 특이적으로 결합하는 IL12Rβ1의 양을 측정하였다. 검정에 대한 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 (이 경우에 Ab-Y), 시에로스틴 완충제 단독 (즉, IL12Rβ1 비함유) 및 IL12Rβ1 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의한다. 분석에 대한 양성 조절 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 완충액 단독 (즉, 제2 용액상 항체 비함유), IL12Rβ1 및 IL12Rβ1 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의하였다. ELISA 검정은 양성 대조군 신호가 배경 신호의 적어도 6배가 되도록 하는 방식으로 실행할 필요가 있다.

항체를 코팅 항체로서 사용하는가 및 제2 (경쟁자) 항체로서 사용하는가의 선택으로 인한 임의의 인위성 (예를 들면 IL12Rβ1에 대한 Ab-X와 Ab-Y 사이의 유의하게 상이한 친화도)을 피하기 위해, 교차 차단 검정은 2가지 포맷으로 작동될 필요가 있다: 1) 포맷 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-Y가 용액 중에 있는 경쟁자 항체인 경우이고, 2) 포맷 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트 상에 코팅된 항체이고, Ab-X가 용액 중에 있는 경쟁자 항체인 경우이다.

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Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Thr Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Val Gly Lys Gly Leu Tyr Arg Val Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Glu Pro Lys Leu Phe Trp Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asn Asp Phe Met Glu Pro Ala Tyr Phe Ala Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly 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acaagcggcc cagcggcgtg 180 tccaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggactg 240 caggccgagg acgaggccga ctactactgc ggcagctacg acgaagagga caacgtgttt 300 ggcggcggaa caaagcttac cgtcctaggt cag 333 <210> 34 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 34 gacatcgagc tgacccagcc ccccagcgtg tctgtggccc ctggccagac cgcccggatc 60 agctgcagcg gcgacaacct gggcagcaag ttcgcctact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac agcaagcggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ccagagctgg gacagcagct ccggcaacga cgtgtttggc 300 ggcggaacaa agcttaccgt cctaggtcag 330 <210> 35 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 35 gacatcgagc tgacccagcc ccccagcgtg tctgtggccc ctggccagac cgcccggatc 60 agctgcagcg gcgacaacct gggcagctac tacgcctact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccctg tgggcgtgat ctacgacgac agcgagcggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg cagcagctac acctacagca agaacaacgt gtttggcggc 300 ggaacaaagc ttaccgtcct aggtcag 327 <210> 36 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 36 gatatccaga tgacccagag cccgtctagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgtgtgacc 60 attacctgca gagcgagcca gtctatttct tcttggctga attggtacca gcagaaacca 120 ggtaaagcac cgaaactatt aatttatgct gcttcttctt tgcaaagcgg ggtcccgtcc 180 cgttttagcg gctctggatc cggcactgat tttaccctga ccattagcag cctgcaacct 240 gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tattatgctt ttcctcatac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327 <210> 37 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 37 caggtgcagc tgaaagagag cggccctgcc ctggtcaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acatgcacct tcagcggctt cagcctgagc accagcacca tgggcgtgtc ctggatccgg 120 cagccccctg gcaaggccct ggaatggctg gcctggatct actgggacga cgacaaggac 180 tacagcacca gcctgaagag ccggctgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccagagcc 300 aaccccgacc tgggctactt cgactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 38 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 38 caggtgcagc tgaaagagag cggccctgcc ctggtcaagc ccacccagac cctgaccctg 60 acatgcacct tcagcggctt cagcctgagc accagcggca tgggcgtgtc ctggatccgg 120 cagccccctg gcaaggccct ggaatggctg gccctgatcg actggaccga cgacaagtac 180 tacagcacca gcctgaaaac ccggctgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240 gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgcccggaca 300 gtgggcaagg gcctgtaccg ggtggacaac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 39 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 39 caggtgcagc tggtcgagag cggcggaggg ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggca tgagctgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcgagccca agctgttctg gtacgccacc 180 ttctacgccg cctccgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcccgg 300 aacgacttca tggaacccgc ctacttcgcc ctgtggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 40 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial antibody fragment <400> 40 caggtgcaat tgaaagaaag cggcccggcc ctggtgaaac cgacccaaac cctgaccctg 60 acctgtacct tttccggatt tagcctgtct actcgtggtg ttggtgtgtc ttggattcgc 120 cagccgcctg ggaaagccct cgagtggctg gctcttatct attgggatga ggataagtat 180 tatagcacca gcctgaaaac gcgtctgacc attagcaaag atacttcgaa aaatcaggtg 240 gtgctgacta tgaccaacat ggacccggtg gatacggcca cctattattg cgcgcgttat 300 cagtctggtt attattataa taatgatggt tggggtgttg atatttgggg ccaaggcacc 360 ctggtgacgg ttagctca 378 <210> 41 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Glu Pro Leu Val Thr Trp Val Val Pro Leu Leu Phe Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Ser Arg Gln Gly Ala Ala Cys Arg Thr Ser Glu Cys Cys Phe Gln 20 25 30 Asp Pro Pro Tyr Pro Asp Ala Asp Ser Gly Ser Ala Ser Gly Pro Arg 35 40 45 Asp Leu Arg Cys Tyr Arg Ile Ser Ser Asp Arg Tyr Glu Cys Ser Trp 50 55 60 Gln Tyr Glu Gly Pro Thr Ala Gly Val Ser His Phe Leu Arg Cys Cys 65 70 75 80 Leu Ser Ser Gly Arg Cys Cys Tyr Phe Ala Ala Gly Ser Ala Thr Arg 85 90 95 Leu Gln Phe Ser Asp Gln Ala Gly Val Ser Val Leu Tyr Thr Val Thr 100 105 110 Leu Trp Val Glu Ser Trp Ala Arg Asn Gln Thr Glu Lys Ser Pro Glu 115 120 125 Val Thr Leu Gln Leu Tyr Asn Ser Val Lys Tyr Glu Pro Pro Leu Gly 130 135 140 Asp Ile Lys Val Ser Lys Leu Ala Gly Gln Leu Arg Met Glu Trp Glu 145 150 155 160 Thr Pro Asp Asn Gln Val Gly Ala Glu Val Gln Phe Arg His Arg Thr 165 170 175 Pro Ser Ser Pro Trp Lys Leu Gly Asp Cys Gly Pro Gln Asp Asp Asp 180 185 190 Thr Glu Ser Cys Leu Cys Pro Leu Glu Met Asn Val Ala Gln Glu Phe 195 200 205 Gln Leu Arg Arg Arg Gln Leu Gly Ser Gln Gly Ser Ser Trp Ser Lys 210 215 220 Trp Ser Ser Pro Val Cys Val Pro Pro Glu Asn Pro Pro Gln Pro Gln 225 230 235 240 Val Arg Phe Ser Val Glu Gln Leu Gly Gln Asp Gly Arg Arg Arg Leu 245 250 255 Thr Leu Lys Glu Gln Pro Thr Gln Leu Glu Leu Pro Glu Gly Cys Gln 260 265 270 Gly Leu Ala Pro Gly Thr Glu Val Thr Tyr Arg Leu Gln Leu His Met 275 280 285 Leu Ser Cys Pro Cys Lys Ala Lys Ala Thr Arg Thr Leu His Leu Gly 290 295 300 Lys Met Pro Tyr Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Asn Val Ala Val Ile Ser 305 310 315 320 Ser Asn Gln Phe Gly Pro Gly Leu Asn Gln Thr Trp His Ile Pro Ala 325 330 335 Asp Thr His Thr Glu Pro Val Ala Leu Asn Ile Ser Val Gly Thr Asn 340 345 350 Gly Thr Thr Met Tyr Trp Pro Ala Arg Ala Gln Ser Met Thr Tyr Cys 355 360 365 Ile Glu Trp Gln Pro Val Gly Gln Asp Gly Gly Leu Ala Thr Cys Ser 370 375 380 Leu Thr Ala Pro Gln Asp Pro Asp Pro Ala Gly Met Ala Thr Tyr Ser 385 390 395 400 Trp Ser Arg Glu Ser Gly Ala Met Gly Gln Glu Lys Cys Tyr Tyr Ile 405 410 415 Thr Ile Phe Ala Ser Ala His Pro Glu Lys Leu Thr Leu Trp Ser Thr 420 425 430 Val Leu Ser Thr Tyr His Phe Gly Gly Asn Ala Ser Ala Ala Gly Thr 435 440 445 Pro His His Val Ser Val Lys Asn His Ser Leu Asp Ser Val Ser Val 450 455 460 Asp Trp Ala Pro Ser Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Val Leu Lys Glu 465 470 475 480 Tyr Val Val Arg Cys Arg Asp Glu Asp Ser Lys Gln Val Ser Glu His 485 490 495 Pro Val Gln Pro Thr Glu Thr Gln Val Thr Leu Ser Gly Leu Arg Ala 500 505 510 Gly Val Ala Tyr Thr Val Gln Val Arg Ala Asp Thr Ala Trp Leu Arg 515 520 525 Gly Val Trp Ser Gln Pro Gln Arg Phe Ser Ile Glu Val Gln Val Ser 530 535 540 Asp Trp Leu Ile Phe Phe Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Ile Leu 545 550 555 560 Leu Val Gly Val Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Asn Arg Ala Ala Arg His 565 570 575 Leu Cys Pro Pro Leu Pro Thr Pro Cys Ala Ser Ser Ala Ile Glu Phe 580 585 590 Pro Gly Gly Lys Glu Thr Trp Gln Trp Ile Asn Pro Val Asp Phe Gln 595 600 605 Glu Glu Ala Ser Leu Gln Glu Ala Leu Val Val Glu Met Ser Trp Asp 610 615 620 Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys Thr Glu Leu Pro Glu Gly 625 630 635 640 Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu Ser Leu Glu Asp Gly Asp 645 650 655 Arg Cys Lys Ala Lys Met 660

Claims (24)

100 nM 이하의 K_D로 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정으로 측정시 IL12 및/또는 IL23이 IL12Rβ1 폴리펩티드에 결합하는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 표적 IL12Rβ1 폴리펩티드 (서열 41)에 대한 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단리된 항체 또는 단백질.

제1항에 있어서, 추가로 인간 혈액 세포에서 IL12 의존성 IFN-γ 생성을 대략 1 nM 이하의 IC₅₀으로 억제하는 단리된 항체 또는 단백질.

제1항 또는 제2항에 있어서, 완전 인간 또는 인간화 항체인 항체.

제1항 또는 제2항에 있어서, 야생형 Fc 영역과 비교하여 ADCC 활성을 제공하지 않거나 감소된 ADCC 활성을 제공하는 돌연변이된 또는 화학적으로 변형된 아미노산 Fc 영역을 포함하는 항체.

제4항에 있어서, 돌연변이된 또는 화학적으로 변형된 아미노산 Fc 영역이 침묵 IgG1 Fc 영역인 항체.

제1항 또는 제2항에 있어서, IL12Rβ1 폴리펩티드 (서열 41)에 대한 항체의 PEG화 항원-결합 부분으로 본질적으로 이루어진 단백질.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9-12로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 영역 CDR3 서열과 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 중쇄 영역 CDR3을 적어도 포함하는 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 29-32 중 하나 이상과 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 V_H 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 25-28 중 하나 이상과 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 V_L 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단백질.

(a) 서열 29의 중쇄 서열 및 서열 25의 경쇄 서열;
(b) 서열 30의 중쇄 서열 및 서열 26의 경쇄 서열;
(c) 서열 31의 중쇄 서열 및 서열 27의 경쇄 서열; 또는
(d) 서열 32의 중쇄 서열 및 서열 28의 경쇄 서열
을 포함하는 항체.

제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제10항의 하나 이상의 항체의 상응하는 V_H 및 V_L 서열과 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100％ 서열 동일성을 갖는 V_H 및 V_L 서열을 포함하는 항체 또는 결합 단백질.

제11항에 있어서, 서열 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 9-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 13-16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 21-24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제10항의 하나 이상의 항체에 의한 IL12Rβ1로의 결합이 교차 차단되는 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제10항의 하나 이상의 항체에 의한 IL12Rβ1로의 결합을 교차 차단하거나 또는 상기 결합이 교차 차단되는 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IL12Rβ1에 의해 매개되거나 또는 IFNγ 생성을 억제함으로써 치료될 수 있는 병적 장애의 치료를 위한 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 또는 염증성 장 질환의 치료를 위한 항체 또는 결합 단백질.

제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 결합 단백질을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.

제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.

제19항에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.

제20항에 있어서, 서열 33-40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산, 또는 하나 이상의 CDR 영역을 코딩하는 단편을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.

제20항 또는 제21항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.

제22항의 숙주 세포를 배양하고, 항체 또는 기능적 단백질을 단리하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 결합 단백질의 생성 방법.

자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선 또는 염증성 장 질환의 치료에 유용한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.