KR20120000056A - 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제, 및 뇌종양 치료제 - Google Patents
뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제, 및 뇌종양 치료제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 목적은 항암 약물과 방사선에 내성인 신경교종 줄기 세포의 종양원성을 감소시킬 수 있으며 또한 항암 약물과 방사선에 대한 감수성을 상승시킬 수 있는 의약을 제공하는 것이다. 본 발명은 신경교종 줄기 세포에서 TGF-β-Sox4-Sox2 경로, 즉, TGF-β는 Sox4 발현을 유도하고, Sox4가 Sox2의 발현을 촉진하는 경로를 억제하는 물질을 비롯한, 신경교종 줄기 세포를 위한 분화 촉진제를 제공한다.
Description
본 발명은 뇌종양 줄기세포를 위한 분화 촉진제에 관한 것이며, 이 촉진제는 뇌종양 줄기세포의 분화를 촉진시켜 종양원성(tumorigenicity)을 감소시킨다.
뇌종양은 두개하 조직에서 발생하는 종양에 대한 일반명칭이며, 뇌 세포에서 뿐만 아니라, 경뇌막, 거미막, 두개하 혈관, 및 말초 신경 등과 같은 모든 두개하 조직에서 발생한다.
뇌 내의 종양은 주변 정상 조직을 가능한 손상시키지 않는 치료를 요구한다. 그럼에도 불구하고, 많은 뇌 종양은 주변 뇌 조직과 척추 조직을 침윤하여 종양 세포와 정상 뇌 조직이 혼합되는 영역을 생성하여, 외과적 절제가 곤란해진다. 방사선요법도 주변 정상 조직을 쉽게 손상시킨다. 또한, 혈액-뇌 장벽이 혈액과 뇌 사이에 존재하므로, 점적 투여기가 적용된다 하더라도, 뇌에 도달하지 못하는 치료제가 있으며, 화학요법이 효과적이지 않을 수 있다. 이들 사실을 고려할 때, 뇌종양에 대해 특히 효과적인 새로운 치료가 요구된다.
뇌종양은 다양한 조직에서 발생하며, 그 표준으로서 기원 부위를 이용하는 세계 보건 기구(WHO)에 의한 분류가 세계적으로 사용된다. 거기에서는, 신경상피 조직 종양으로 분류되는 신경교종(glioma)이 신경교종 세포에서 발생하는 종양의 일반 명칭이다. 신경교종 세포는 뇌와 척수 내의 신경 세포와 신경 섬유 사이에 박힌 세포이며, 신경교종은 뇌에서 발생하는 종양의 대략 1/4을 차지한다.
신경교종은 기원이 되는 세포에 따라 성상세포 종양, 희돌기아교세포 종양(oligodendrocytic tumor), 및 상의세포 종양을 포함하며, 이들은 이어서 더 상세히 분류된다. 또한, WHO는 등급에 의해 임상적 악성도를 평가한다. IV 등급은 열등한 예후를 가진 매우 악성인 종양이며, I 등급은 최소의 악성이다. III 등급과 IV 등급 종양은 악성 신경교종으로 불린다.
신경교종 중에, 성상세포 종양으로 분류되는, 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytoma) (III 등급) 및 교아세포종(glioblastoma) (IV 등급)은 특히 매우 악성인 뇌 종양이다. 구체적으로, 교아세포종은 인간 암 중에서 가장 열등한 예후를 가진 것 중 하나이며, 5년 생존률이 10% 미만이라고 한다.
상기한 대로, 뇌 암의 치료는 일반적으로 어려우며, 특히 매우 악성인 교아세포종을 위한 효과적인 치료는 보이지 않는다.
최근에는, 줄기 세포-유사 특징을 가진 세포를 암을 형성하는 세포에 포함시키는 것이 명백해졌으며, "암 줄기 세포"("CSC" 또는 "암-시작(cancer-initiating) 세포")로 불린다. CSC는 종양 형성을 유도하며, 자기-재생 능력을 갖는다. 최근의 연구는 단지 매우 적은 CSC가 암의 생물학적 및 병리학적 특성을 결정함을 나타냈다.
다른 종양과 동일한 방식으로, 다수의 신경교종 줄기 세포(GSC) 주(strain)를 인간 신경교종 조직으로부터 분리한다. (비-특허 문헌 1 내지 3 참조.) GSC는 신경 줄기 세포 항원을 발현하며, 그리고 또한 상피 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 존재하에서 무혈청 배지에서 배양될 때 뉴로스피어(neurosphere) 또는 신경교종 스피어(sphere)로 불리는 비부착성 스피어를 형성함을 특징으로 한다. (비특허 문헌 4 참조.)
오늘날까지 암 치료는 종양 벌크(bulk)를 표적으로 하였으며, 암 줄기 세포에 대해 충분한 효과가 얻어지지 않았던 것이 가능하다. 실제로, 다른 암 줄기 세포와 동일한 방식으로 기존의 방사선 및 약물 치료에 대한 신경교종 줄기 세포 내성(resistance)의 보고가 있다. (비특허 문헌 5 및 6 참조.) 추가로, 암 줄기 세포는 또한 침윤 및 전이 능력을 갖는 것으로 보고되었다. 결과적으로, 뇌 종양 줄기 세포를 절제하는 것이 뇌 종양 치료에서 필요한 것으로 생각되지만, 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성이 어떻게 유지되는지는 아직 명확하지 않다.
그런데, 형질전환 성장 인자(TGF)-β는 일부 유형의 암 세포의 성장을 억제하는 암 억제자로서 잘 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, TGF-β는 PDGF-BB 유도를 통해 뇌 종양 및 골육종 등과 같은 비상피 세포로부터의 암 성장을 촉진한다.(비특허 문헌 7 및 8 참조.) TGF-β는 세린-트레오닌 키나아제 I 및 II 수용체에 결합하며, 주로 SMAD 단백질을 통해 세포 내에서 시그널을 전달한다. 수용체 I이 인산화되면, 수용체-조절된 SMAD (R-SMAD)가 공동-파트너 SMAD(co-SMAD)와 복합체를 형성하여 핵 내로 이동하고 다양한 마커 유전자의 발현을 조절한다. 성장을 유도하는 것에 더하여, TGF-β 시그널은 뇌 종양의 침윤 및 전이, 종양 내의 혈관신생, 및 면역억제와 관련되는 것으로 생각된다.
TGF-β 시그널을 차단하는 신경교종 치료제는 그러한 종양에서 TGF-β의 다수의 역할에 기초하여 개발되었다.(비특허 문헌 9 참조.) 또한, 임상 연구는 TGF-β2-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 고-등급 재발성 또는 불치성 신경교종을 표적화하여 진행되고 있다.(비특허 문헌 10 참조.)
비특허 문헌 1: Singh et al., Nature, 2004, 432: 396-401
비특허 문헌 2: Kondo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2004, 101: 781-786
비특허 문헌 3: Hirschmann-Jax et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2004, 101: 14228-14233
비특허 문헌 4: Vescovi et al., Cancer, 2006, 6: 425-436
비특허 문헌 5: Bao et al., Nature, 2006, 444: 756-760
비특허 문헌 6: Liu et al., Cancer, 2006, 5: 67
비특허 문헌 7: Bruna et al., Cancer Cell, 2007, 11: 147-160
비특허 문헌 8: Matsuyama et al., Cancer Research, 2003, 63: 7791-7798
비특허 문헌 9: Golestaneh and Mishra, Oncogene, 2005, 24: 5722-5730
비특허 문헌 10: Schlingensiepen et al., Cytokine Growth Factor Review, 2006, 17: 129-139
본 발명의 목적은 뇌 종양 줄기 세포의 종양원성을 감소시키고 또한 항암 약물과 방사선에 대한 감수성을 상승시킬 수 있는 의약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기에 개시한 문제점을 해결하기 위한 복합적 연구 결과, 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지함에 있어서, 지금까지 알려지지 않았던 TGF-β 경로의 중요한 효과를 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 TGF-β가 Sox4 발현 수준을 상승시키며, Sox4가 줄기세포성 유전자인 Sox2의 발현 수준을 상승시킴으로써 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성이 유지됨을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 TGF-β 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 Sox2, Sox4, TGF-β, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4의 기능 또는 발현을 방해함으로써 뇌 종양 줄기 세포 분화가 촉진되며, 따라서 세포 종양원성을 주목할만하게 감소시킬 뿐만 아니라, 또한 항암 약물과 방사선에 대한 감수성을 상승시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
(1) TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질을 비롯한, 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제;
(2) 상기에 개시한 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질이, Sox2, Sox4, TGF-β, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 물질의 발현 억제제 또는 기능 억제제인, 상기 (1)에서 개시된 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제;
(3) 상기에 개시된 발현 억제제 또는 기능 억제제가 TGF-β 수용체 길항제인, 상기 (2)에 개시된 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제;
(4) 상기에 개시된 발현 억제제 또는 기능 억제제가 하기의 (a) 내지 (d)를 포함하는 군으로부터 선택된 화합물인, 상기 (2)에 개시된 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제;
(a) Sox2, Sox4, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 위한 안티센스 핵산
(b) Sox2, Sox4, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 위한 리보자임 활성을 가진 핵산
(c) Sox2, Sox4, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 위한 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산
(d) 상기 (a) 또는 (c)에 개시된 핵산을 코딩하는 핵산
(5) 신경교종 줄기 세포 분화 촉진제인, 상기 (1) 또는 (4)에 개시된 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제;
(6) 상기 (1) 또는 (4)에 개시된 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제를 비롯한, 뇌 종양 치료제;
(7) 신경교종 치료제인, 상기 (6)에 개시된 뇌 종양 치료제;
(8) 하기 (i) 또는 (ii)에 개시된 두 개의 핵산 쇄를 포함하는, Sox2에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산;
(i) 서열 번호 1에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(ii) 서열 번호 2에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(9) 하기 (iii) 또는 (iv)에 개시된 이중쇄 핵산을 포함하는, Sox4에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산;
(iii) 서열 번호 3에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(iv) 서열 번호 4에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(10) 서열 번호 5에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열로부터의 핵산을 포함하며 SMAD2에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산;
(11) 서열 번호 6에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열로부터의 핵산을 포함하며 SMAD3에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산;
(12) 하기 (v) 또는 (vi)에 개시된 이중쇄 핵산을 포함하며 Oct-4에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산;
(v) 서열 번호 51에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(vi) 서열 번호 52에 개시된 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 상보성 염기 서열을 포함하는 핵산
(13) 환자의 뇌 종양 환부로부터 조직을 채취하여 관련 조직에서 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하는 과정, 및 만일 상기에 개시된 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준이 정상 조직에 비하여 상승되면, 상기 (6) 또는 (7)에 개시된 뇌 종양을 위한 치료제를 투여하는 과정을 포함하는 뇌 종양 치료 방법;
(14) 뇌 종양 환자를 위한 치료 방법을 결정하기 위한 스크리닝 방법으로서, 환자의 뇌 종양 환부로부터 조직을 채취하여 관련 조직에서 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하는 과정, 및 상기에 개시된 발현 수준을 정상 조직에서의 발현 수준에 비교하는 과정을 포함하는 방법.
본 발명에서 뇌 종양 줄기 세포의 분화 촉진제는 기존의 항암 약물과 방사선에 내성을 나타낸 것으로 보고된 뇌 종양 줄기 세포에 직접 작용함으로써 분화를 촉진하여 종양원성을 현저하게 감소시키고 항암 약물과 방사선에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 결과적으로, 뇌 종양 줄기 세포의 침윤 및 전이가 방지될 수 있으며, 암 재발과 전이가 억제된다. 또한, 주변 정상 뇌 조직에 대한 악 영향이 없으며, 따라서 기본적으로 뇌 종양만의 치료가 가능하다.
(도 1) 도 1a는 신경교종 스피어 및 분화된 세포의 사진이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 1b는 유동 세포 분석법을 이용하여 신경교종 스피어와 분화된 세포에서 CD133-양성 세포를 측정한 결과이다. 도 1c는 신경교종 스피어에서 신경 전구체 세포 마커 네스틴(Nestin)의 발현을 보여주는 사진이다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
(도 2) 도 2a와 도 2b는 TGF-β 억제제 SB431542의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 2c는 TGF-β 수용체 II/Fc 키메라의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 2d는 TGF-β 억제제 A-78-03 또는 LY364947의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 도 2e는 TGF-β 시그널-음성 조절 인자 SMAD7의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 도 2f는 일단 형성된 스피어가 SB431542가 첨가될 때 부착 세포가 됨을 보여주는 사진이다.
(도 3) 도 3a는 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 백분율에 대한 TGF-β 억제제의 영향을 조사한 결과이다. 도 3b는 TGF-β 억제제의 존재하에서 신경교종 스피어에서의 신경 전구체 세포 마커 또는 신경 세포 분화 마커의 발현을 조사한 결과이다.
(도 4) 도 4a는 정량적 실시간 RT-PCR을 이용하여 Sox2의 발현에 대한 TGF-β 또는 SB431542의 영향을 측정한 결과이다. 도 4b는 siRNA에 의한 SMAD2 및 SMAD3에 대한 영향, 그리고 TGF-β에 의한 Sox2 발현 유도에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 4c는 TGF-β 또는 SB431542의 존재하에서 단백질 수준에서 Sox2의 발현을 측정한 결과이다. 도 4d는 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운(knockdown)의 영향을 측정한 결과이다. 도 4e 및 도 4g는 한계 희석 분석을 이용하여 측정한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한 영향의 결과이다. 도 4f는 유동 세포 분석법을 이용하여 측정한, 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 영향의 결과이다. 도 4h는 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 5) 도 5a는 TGF-β 억제제의 존재 또는 부재하에서의 스피어 형성 능력 분석을 이용하여, 과량의 Sox2 를 발현하는 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력을 측정한 결과이다. 도 5b는 과량의 Sox2를 발현한 신경교종 스피어 내의 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 6) 도 6a는 시클로헥시미드(CHX)의 존재하에서 Sox2 발현에 대한 TGF-β의 영향을 조사한 결과이다. 도 6b는 신경교종 줄기 세포와 분화된 신경교종 세포에서 Sox4 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 6c는 TGF-β 또는 TGF-β 억제제의 존재하에서 Sox4의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 6d는 TGF-β 또는 TGF-β 억제제의 존재하에서 Sox4 단백질을 측정한 결과이다. 도 6e는 SMAD2 및 SMAD3 항체를 이용한 크로마틴 면역침전 분석의 결과이며, 이 분석은 TGF-β 시그널을 위한 DNA-결합 시그널 매개체인 SMAD 복합체가 Sox4 프로모터에 결합하는지 여부를 확인하기 위해 실시하였다. 도 6f는 시클로헥시미드의 존재하에서 Sox4의 발현에 대한 TGF-β의 영향을 조사한 결과이다.
(도 7) 도 7a는 과량의 Sox4를 발현한 세포에서 Sox2 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 7b는 siRNA로 인한 Sox4 넉다운의, Sox2 mRNA 발현 수준에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 7c는 Sox2 인핸서 영역에 sox4가 결합함을 확인하기 위한 크로마틴 면역침전 분석의 결과이다. 도 7d는 TGF-β에 의한 Sox2 발현 유도에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 8) 도 8a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포 스피어 형성 능력에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다. 도 8b는 한계 희석 분석을 이용하여, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의, 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 8c는 유동 세포 분석법을 이용하여, 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 비에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 8d는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 9) 도 9a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포에 대한 TGF-β 억제제에 의한 줄기 세포 유지에 대해 과량의 Sox4 발현이 미치는 영향을 조사한 결과이다. 도 9b는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한, 과량의 Sox4 발현의 영향을 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 10) 도 10a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 10b는 한계 희석 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 10c는 전체 세포 중에서 네스틴-양성 세포, 무사시(Musashi)-양성 세포, 및 GFAP-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 11) 도 11(좌측)은 TGF-β 억제제를 이용하여 전처리된 신경교종 줄기 세포(아데노(Adeno)-LacZ, SB431542), 및 미처리 신경교종 줄기 세포(아데노-LacZ, (-))를 마우스 두개골 내로 이식한 후 생존 기간을 조사한 결과이다. 동일한 조건하에서 과량의 Sox4를 발현하는 신경교종 줄기 세포(아데노-Sox4, SB431542 및 아데노-Sox4 (-))를 이용한 이식도 실시하였다. 우측의 다이아그램은 이식 후 30일에 조직병리학적 검사 결과를 보여준다. 좌측의 4개의 사진의 스케일 바는 50 ㎛(x20)이고, 우측의 사진의 스케일 바는 300 ㎛(x4)이다.
(도 12) 도 12는 TGF-β 시그널에 의한 신경교종 줄기 세포 세포성 유지의 기전을 설명하는 개념도이다. TGF-β는 Sox4 발현을 직접 유도하며, 이어서 Sox4는 Sox2 발현을 촉진하여, 신경교종 줄기 세포 세포성을 유지한다(좌측). TGF-β 억제제는 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하여, 신경교종 줄기 세포 분화를 촉진하고, 종양원성을 감소시킨다(우측). 점선 화살표는 다른 시그널 경로 관련 가능성을 보여준다.
(도 13) 도 13은 신경교종 줄기 세포 분화에 대한 헤지호그(Hedgehog)-길(Gil)1 경로 억제제 시클로파민의 영향을 조사하기 위해 실시된 스피어 형성 분석의 결과이다.
(도 14) 도 14는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한 백혈병 억제 인자(LIF)의 역할을 조사하기 위해 실시된 스피어 형성 분석의 결과이다.
(도 15) 도 15는 신경교종 줄기 세포에서 줄기 세포 마커(Oct-4, NANOG, 및 LIF)의 발현에 대한 TGF-β 자극의 영향을 조사한 결과이다. 플라스미노겐 활성자 억제제(PAI-1)를 양성 대조군으로 측정하였다.
(도 16) 도 16은 ELISA를 이용하여 세포 TGS-01 내지 TGS-05에서 TGF-β 서브타입의 발현을 측정한 결과이다.
(도 2) 도 2a와 도 2b는 TGF-β 억제제 SB431542의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 2c는 TGF-β 수용체 II/Fc 키메라의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 2d는 TGF-β 억제제 A-78-03 또는 LY364947의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 도 2e는 TGF-β 시그널-음성 조절 인자 SMAD7의 존재하에서의 스피어 형성 분석의 결과이다. 도 2f는 일단 형성된 스피어가 SB431542가 첨가될 때 부착 세포가 됨을 보여주는 사진이다.
(도 3) 도 3a는 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 백분율에 대한 TGF-β 억제제의 영향을 조사한 결과이다. 도 3b는 TGF-β 억제제의 존재하에서 신경교종 스피어에서의 신경 전구체 세포 마커 또는 신경 세포 분화 마커의 발현을 조사한 결과이다.
(도 4) 도 4a는 정량적 실시간 RT-PCR을 이용하여 Sox2의 발현에 대한 TGF-β 또는 SB431542의 영향을 측정한 결과이다. 도 4b는 siRNA에 의한 SMAD2 및 SMAD3에 대한 영향, 그리고 TGF-β에 의한 Sox2 발현 유도에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 4c는 TGF-β 또는 SB431542의 존재하에서 단백질 수준에서 Sox2의 발현을 측정한 결과이다. 도 4d는 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운(knockdown)의 영향을 측정한 결과이다. 도 4e 및 도 4g는 한계 희석 분석을 이용하여 측정한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한 영향의 결과이다. 도 4f는 유동 세포 분석법을 이용하여 측정한, 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 영향의 결과이다. 도 4h는 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA에 의한 Sox2 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 5) 도 5a는 TGF-β 억제제의 존재 또는 부재하에서의 스피어 형성 능력 분석을 이용하여, 과량의 Sox2 를 발현하는 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력을 측정한 결과이다. 도 5b는 과량의 Sox2를 발현한 신경교종 스피어 내의 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 6) 도 6a는 시클로헥시미드(CHX)의 존재하에서 Sox2 발현에 대한 TGF-β의 영향을 조사한 결과이다. 도 6b는 신경교종 줄기 세포와 분화된 신경교종 세포에서 Sox4 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 6c는 TGF-β 또는 TGF-β 억제제의 존재하에서 Sox4의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 6d는 TGF-β 또는 TGF-β 억제제의 존재하에서 Sox4 단백질을 측정한 결과이다. 도 6e는 SMAD2 및 SMAD3 항체를 이용한 크로마틴 면역침전 분석의 결과이며, 이 분석은 TGF-β 시그널을 위한 DNA-결합 시그널 매개체인 SMAD 복합체가 Sox4 프로모터에 결합하는지 여부를 확인하기 위해 실시하였다. 도 6f는 시클로헥시미드의 존재하에서 Sox4의 발현에 대한 TGF-β의 영향을 조사한 결과이다.
(도 7) 도 7a는 과량의 Sox4를 발현한 세포에서 Sox2 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 도 7b는 siRNA로 인한 Sox4 넉다운의, Sox2 mRNA 발현 수준에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 7c는 Sox2 인핸서 영역에 sox4가 결합함을 확인하기 위한 크로마틴 면역침전 분석의 결과이다. 도 7d는 TGF-β에 의한 Sox2 발현 유도에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 8) 도 8a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포 스피어 형성 능력에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다. 도 8b는 한계 희석 분석을 이용하여, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의, 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한 영향을 조사한 결과이다. 도 8c는 유동 세포 분석법을 이용하여, 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 비에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 8d는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 영향을 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 9) 도 9a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포에 대한 TGF-β 억제제에 의한 줄기 세포 유지에 대해 과량의 Sox4 발현이 미치는 영향을 조사한 결과이다. 도 9b는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한, 과량의 Sox4 발현의 영향을 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포 또는 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정한 결과이다.
(도 10) 도 10a는 스피어 형성 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포의 스피어 형성 능력에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 10b는 한계 희석 분석을 이용하여, 신경교종 줄기 세포 자기복제 능력에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 측정한 결과이다. 도 10c는 전체 세포 중에서 네스틴-양성 세포, 무사시(Musashi)-양성 세포, 및 GFAP-양성 세포의 백분율에 대한, siRNA로 인한 Oct-4 넉다운의 영향을 조사한 결과이다.
(도 11) 도 11(좌측)은 TGF-β 억제제를 이용하여 전처리된 신경교종 줄기 세포(아데노(Adeno)-LacZ, SB431542), 및 미처리 신경교종 줄기 세포(아데노-LacZ, (-))를 마우스 두개골 내로 이식한 후 생존 기간을 조사한 결과이다. 동일한 조건하에서 과량의 Sox4를 발현하는 신경교종 줄기 세포(아데노-Sox4, SB431542 및 아데노-Sox4 (-))를 이용한 이식도 실시하였다. 우측의 다이아그램은 이식 후 30일에 조직병리학적 검사 결과를 보여준다. 좌측의 4개의 사진의 스케일 바는 50 ㎛(x20)이고, 우측의 사진의 스케일 바는 300 ㎛(x4)이다.
(도 12) 도 12는 TGF-β 시그널에 의한 신경교종 줄기 세포 세포성 유지의 기전을 설명하는 개념도이다. TGF-β는 Sox4 발현을 직접 유도하며, 이어서 Sox4는 Sox2 발현을 촉진하여, 신경교종 줄기 세포 세포성을 유지한다(좌측). TGF-β 억제제는 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하여, 신경교종 줄기 세포 분화를 촉진하고, 종양원성을 감소시킨다(우측). 점선 화살표는 다른 시그널 경로 관련 가능성을 보여준다.
(도 13) 도 13은 신경교종 줄기 세포 분화에 대한 헤지호그(Hedgehog)-길(Gil)1 경로 억제제 시클로파민의 영향을 조사하기 위해 실시된 스피어 형성 분석의 결과이다.
(도 14) 도 14는 신경교종 줄기 세포 분화에 대한 백혈병 억제 인자(LIF)의 역할을 조사하기 위해 실시된 스피어 형성 분석의 결과이다.
(도 15) 도 15는 신경교종 줄기 세포에서 줄기 세포 마커(Oct-4, NANOG, 및 LIF)의 발현에 대한 TGF-β 자극의 영향을 조사한 결과이다. 플라스미노겐 활성자 억제제(PAI-1)를 양성 대조군으로 측정하였다.
(도 16) 도 16은 ELISA를 이용하여 세포 TGS-01 내지 TGS-05에서 TGF-β 서브타입의 발현을 측정한 결과이다.
뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제
본 발명을 위한 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제는 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질을 포함한다.
본 명세서에서, "뇌 종양"은 두개내 조직에서 발생하는 종양을 의미한다. 뇌 종양은 WHO 뇌 종양 조직 분류를 이용하여 신경상피 조직 종양(신경교종, 상의세포종, 신경세포종양, 태아형 신경외배엽 종양 등), 신경초 종양(신경초종, 신경섬유종 등), 뇌막 종양(뇌수막종 및 기타 간엽 종양 등), 림프 종양 및 조혈세포 신생물, 배 세포 종양(배세포종, 난황낭 종양, 기형종, 등), 터어키안 종양(sellar tumor), 및 전이성 종양으로 넓게 분류된다.
본 명세서에서, "뇌 종양 줄기 세포"는 뇌 종양 내의 암 줄기 세포이다. 뇌 종양 줄기 세포는 CD133을 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이는 마커로 사용된다.
분화시에, 뇌 종양 줄기 세포는 그들의 종양원성을 잃게 되며, 항암 약물과 방사선에 감수성을 갖게 된다. 결과적으로, 뇌 종양 줄기 세포 분화의 촉진은 항암 약물 치료 및 방사선요법의 효과를 개선하며, 뇌 종양 자체의 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 재발 및 전이의 위험을 억제할 수 있다.
본 발명에서 관련된 "뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제"는 뇌 종양 줄기 세포에 직접 작용하여 분화를 촉진한다. 뇌 종양 줄기 세포로부터 분화된 세포(이하에서는 때때로 "뇌 종양 분화 세포"로 불림)는 종양 형성 능력, 비대칭적 세포 분열 능력, 및 약물 내성 능력과 같은 그들의 전형적인 암 줄기 세포 특징을 잃어버린다.
상기에 개시한 대로, 신경교종 뇌 종양 줄기 세포(즉, 신경교종 줄기 세포)에 대한 많은 보고가 현재까지 있어 왔다. 본 발명에서 뇌 종양 줄기 세포 분화 촉진제는 자연적으로 또한 신경교종 줄기 세포 분화 촉진제로서 사용된다. "신경교종 줄기 세포"는 신경 줄기 세포 항원(줄기 세포 마커; 예를 들어, 네스틴 및 무사시, 등)의 발현, EGF 및 bFGF의 존재하에서 무혈청 배지에서 배양될 때 뉴로스피어(neurosphere) 또는 신경교종 스피어로 불리는 비부착성 구형 세포 덩어리의 형성, 및 자기복제 능력의 보유와 같은 특징을 가진 신경교종 내의 암 줄기 세포이다. 결과적으로, 신경교종 줄기 세포는 이들 특징 중 적어도 하나의 존재를 확인함으로써 분석될 수 있다. 신경교종 줄기 세포는 강한 종양원성을 가지며 또한 침윤 및 전이 능력을 갖는 한편, 그들은 항암 약물과 방사선요법에 대해 내성을 보유한 것으로 알려져 있다.
신경교종 줄기 세포로부터 분화된 세포(이하에서는 "분화된 신경교종 세포"로도 불림)는 EGF 및 bFGF의 존재하에서 무혈청 배지에서 배양되더라도 스피어 형성없이 부착성 세포가 되며, 자기복제 능력을 갖지 않으며, 줄기 세포 마커를 발현하지 않고 분화된 세포 마커(예를 들어, GFAP 및 Tuj1, 등)를 발현함을 특징으로 한다. 결과적으로, 신경교종 줄기 세포는 신경교종 줄기 세포에서 하기 중 적어도 하나를 확인함으로써 분화된 것으로 판단될 수 있다: 지정된 조건하에서 스피어 형성 능력의 감소, 자기복제 능력 감소, 줄기 세포 마커 발현의 감소, 및 분화된 세포 마커 발현의 상승. 추가로, 스피어 형성은 예를 들어, 세포를 적합한 배지에서 배양한 후, 형성되는 스피어의 수를 세어봄으로써 평가될 수 있다. 또한, 자기복제 능력은 예를 들어, 한계 희석 분석을 적용함으로써 평가될 수 있다. 줄기 세포 마커 또는 분화된 세포 마커의 발현은 공지 방법(예를 들어, 노던 블롯팅, RNase 보호 분석, 또는 RT-PCR, 등)에 따라 측정할 수 있다.
추가로, 본 명세서에서, "신경교종"은 신경교종 세포로부터 발생하는 종양의 일반 명칭이며, 성상세포 종양, 희돌기아교세포 종양, 상의세포 종양, 및 맥락막 종양, 등을 포함한다. 성상세포 종양은 모발세포 성상세포종(I 등급), 상의하 거대 세포 성상세포종(I 등급), 다형 황색성상세포종(II 등급), 확산 성상세포종(II 등급), 역형성 성상세포종(III 등급), 및 교아세포종(IV 등급)으로 분류된다. 희돌기아교세포 종양은 희돌기교종(II 등급) 및 역형성 희돌기교종(III 등급)으로 분류되며, 상의세포 종양은 상의세포종(II 등급) 및 역형성 상의세포종(III 등급)으로 분류되며, 맥락막 종양은 맥락막 총 유두종(I 등급) 및 맥락막 총 암종(III 등급)으로 분류된다.
본 명세서에서, "TGF-β-Sox4-Sox2 경로"는 TGF-β가 뇌 종양 줄기 세포에서 Sox4 발현을 유도하며, 이어서 Sox4가 Sox2를 촉진하는 경로의 명칭이다. 본 발명자들은 이 경로가 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지하기 위해 필요함을 발견하였다.
본 명세서에서, "TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질"은 그들이 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 있어서 경로의 기능을 감소시키거나 제거하는 물질이라면 특별히 제한되지 않으며, 만일 물질이 TGF-β,Sox4, 또는 Sox2에 작용한다면 직접적으로 또는 간접적으로 경로와 관련되는 다른 물질을 나타낼 수 있다. 경로와 간접적으로 관련되는 것으로 언급될 수 있는 물질은 예를 들어, SMAD2, SMAD3, Oct-4, 및 SMAD4이지만, 이들로 제한되지 않는다.
후술하는 실시예에 의해 나타내지는 바처럼, TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하면 뇌 종양 줄기 세포 분화를 촉진하여, 종양원성을 현저하게 감소시킨다.
이상적으로는, 본 발명에서 TGF-β-Sox4-Sox2 경로 억제제는 Sox2, Sox4, TGF-β, SMAD2, SMAD3, 및 Oct-4 군으로부터 선택된 적어도 하나를 위한 발현 억제제 또는 기능 억제제여야 한다. 실시예에서 개시된 대로, Sox2, Sox4, TGF-β, SMAD2, SMAD3, 또는 Oct-4의 억제는 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성이 손실되도록 하며, 분화를 촉진한다. 추가로, 본 명세서에서, "발현"은 전사 및 번역에 포함되는 개념을 이용하여 발현이 억제될 때 전사 수준 또는 번역 수준에서의 억제를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, "기능"은 유전자, 전사 생성물, 및 단백질의 기능 중 임의의 것을 포함하며, 기능의 억제는 이들 기능 중 임의의 것 전부 또는 일부를 억제하는 것을 의미한다.
Sox2 억제제
Sox2는 Oct-4와 NANOG와 동일한 방식으로 자기복제 유전자로 알려져 있으며, 배아 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, 인간 또는 마우스 섬유아세포가 Oct-4, KLF4, 및 c-Myc과 함께 도입될 경우, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)가 유도됨이 보고되었다.(Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007.) 현재까지, 비악성 조직에 비하여, mRNA-수준 Sox2의 발현이 신경교종 조직과 같은 뇌 종양 조직에서 상승됨이 보고되었지만, 뇌 종양의 성장에서 Sox2가 기능하는 방법은 명확하지 않다.
본 발명자들은 TGF-β에 의한 Sox2 발현의 유도가 뇌 종양 줄기 세포에서 줄기 세포성을 유지하기 위해 필요하며, 뇌 종양 줄기 세포 분화가 Sox2 기능 또는 발현을 억제함으로써 유도됨을 확인하였다.
저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩티드 또는 단백질 등과 같은 임의의 물질이 Sox2 발현 억제제 또는 기능 억제제로서 사용될 수 있으며, 그들이 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지할 수 있는 Sox2 기능을 억제할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, Sox2 활성화를 중화시키는 항-Sox2 항체, 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산이 언급될 수 있지만, 물질이 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, "항체"는 항체 단편을 포함하며, 본 발명에서 항-Sox2 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 항체, scFv, 이특이적 항체, 또는 합성 항체일 수 있다. 이들 항체는 당업자에 의해 공개된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 Sox2를 이용하여 면역된 비인간 포유류로부터 항체-생산 세포를 분리하고, 이들을 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성한 후, 하이브리도마에 의해 생산된 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다. 추가로, 폴리클로날 항체는 Sox2를 이용하여 면역된 동물 혈청으로부터 얻을 수 있다.
Sox2 활성화가 중화된 비인간 모노클로날 항체가 얻어지면, DNA 재조합 기술을 이용하여 항체를 생산하기 위하여 아미노산 서열이 특정될 수 있다. 또한, 인간화 항체 및 인간 항체는 이상적으로는 공지된 방법 또는 그들의 등가물을 이용하여 생성되어야 한다.
만일 본 발명에서 항-Sox2 항체가 Fab 단편, F(ab')2 항체, 또는 scFv, 등과 같은 저분자 항체이면, 그들은 저분자 항체를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 재조합에 의해 발현될 수 있으며, 추가로 파파인 또는 펩신, 등을 이용하는 항체 처리에 의해 생성될 수 있다.
또한, RNAi 효과를 가진, 이중쇄 핵산, 안티센스 핵산, 및 리보자임 등이 "Sox2 발현을 억제하는 핵산"으로 언급될 수 있다. RNAi 효과는 이중쇄 핵산에 의해 유도된 특정 서열에서의 유전자 발현을 억제하는 기전이다. 마커 특이성은 매우 높으며, 방법이 원래 인비보에서 존재하는 유전자 발현 억제 방법을 이용하므로, 매우 안전하다.
siRNA는 예를 들어, RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산으로 언급될 수 있다. siRNA는 포유동물 세포에서 사용될 경우, 보통 19 내지 30 염기, 그리고 이상적으로는 21 내지 25 염기를 가진 이중쇄 RNA이다. 하지만, 본 발명에서 Sox2 발현 억제제는 효소(다이서(Dicer))를 이용한 절단에 의해 siRNA로서 얻어질 수 있는 것보다 더 긴 이중쇄 RNA를 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산은 한편은 마커 핵산의 일부와 상보적인 염기 서열을 가지며, 다른 한편은 상응하는 상보성 서열을 갖는다. RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산은 일반적으로 3' 말단에서 두 개의 상호-돌출(protruding) 염기("오버행(overhang)")를 가지지만, 임의의 오버행이 없는 블런트(blunt)-말단을 가진 유형 또한 허용가능하다. 예를 들어, 25-염기 블런트-말단 RNA는 인터페론 응답 유전자의 활성화를 최소화하여, 센스 쇄로부터 생겨나는 오프-타겟(off-target) 효과를 방지하며, 혈청에서의 그 안정성이 극히 높은 이점이 있어서, 인비보에서 사용하기 적합하다.
RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산은 마커 DNA의 염기 서열에 따라 공지 방법을 이용하여 디자인될 수 있다. 추가로, RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산은 또한 이중쇄 RNA, DNA/RNA 키메라 이중쇄 핵산, 인공 핵산, 또는 수식된 임의의 핵산일 수 있다.
하기는 Sox2에 대한 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산의 예로서 언급될 수 있다: 서열 번호 1에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA 및 상보성 염기 서열을 가진 RNA, 및 서열 번호 2에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA 및 상보성 염기 서열을 가진 RNA.
안티센스 핵산은 마커 유전자(기본적으로는, 전사 산물인 mRNA)에 상보적인 염기 서열을 가지며, 일반적으로 10 내지 100 염기 길이, 또는 이상적으로는 15 내지 30 염기 길이의 단일쇄 핵산이다. 유전자 발현은 마커 유전자와의 하이브리드화를 야기하기 위해 안티센스 핵산을 세포 내로 도입함으로써 억제된다. 안티센스 핵산은, 마커 유전자 발현을 억제하는 효과가 얻어질 수만 있다면, 마커 유전자에 완전히 상보적일 필요는 없다. 안티센스 핵산은 공개적으로 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 당업자가 적합하게 디자인할 수 있다. 안티센스 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 키메라이거나, 또는 수식되었을 수 있다.
리보자임은 마커 DNA를 촉매적으로 가수분해하는 핵산 분자이며, 마커 RNA 및 그 상보적 서열을 가진 안티센스 영역, 및 절단 반응을 책임지는 중앙 촉매 영역으로 구성된다. 리보자임은 공개적으로 입수가능한 소프트웨어를 이용하여 당업자가 디자인할 수 있다. 리보자임은 일반적으로 RNA 분자이지만, DNA/RNA 키메라 분자가 사용될 수 있다.
추가로, 상기에 개시한 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산, 안티센스 핵산, 및 리보자임을 코딩하는 임의의 핵산이 또한 본 발명에서 Sox2 발현 억제제로서 사용될 수 있다. 걸린(hanging) DNA를 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하면 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산, 안티센스 핵산, 및 리보자임을 발현시킬 것이며, 이들의 각각은 Sox2 발현을 억제하는 효과를 나타낼 것이다.
이중쇄 중 어느 것을 코딩하는 DNA는 또한 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산을 코딩하는 핵산으로 사용될 수 있으며, 이중쇄 핵산 루프를 통해 결합할 수 있는 단일쇄 핵산을 코딩하는 DNA가 또한 사용될 수 있다. 후자의 경우에, 세포 내에서의 전사로부터 얻은 단일쇄 RNA는 분자 내의 그 상보적 부분과 하이브리드화하여 헤어핀 형태를 얻게 된다. 이 RNA는 shRNA(짧은 헤어핀 RNA)로 불린다. shRNA는 세포질로 이동할 때 효소(다이서)를 이용하여 루프에 의해 절단되며, 세포질에서는 이중쇄 RNA가 되어 RNAi 효과를 나타낸다.
Sox4 억제제
Sox2는 신경 줄기 세포의 줄기 세포성에서 중요한 분자로 알려져 있지만, 줄기 세포성에 관한 Sox4 기능에 대해서는 아직 보고가 없다. 정상 뇌 조직에 비하여, Sox4가 신경교종 조직 등과 같은 뇌 종양 조직에서 과다 발현된다는 보고가 있지만, 뇌 종양 성장에서 그것이 하는 역할은 명확하지 않다.
본 발명자들은 Sox2 인핸서 영역에 Sox4를 결합시켜 발현을 유도하였으며, 뇌 종양 줄기 세포의 종양원성을 유지함에 있어서 Sox4가 중요한 역할을 함을 확인하였다.
저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩티드, 및 단백질 등과 같은 임의의 Sox4 발현 억제제 또는 기능 억제제가 사용될 수 있으며, 그들이 Sox2 발현을 유도하는 Sox4 기능을 억제할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, Sox4 활성화를 중화시키는 항-Sox4 항원, 및 Sox4 발현을 억제하는 핵산이 언급될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
항-Sox4 항체 및 Sox4 발현을 억제하는 핵산이 상기한 대로 항-Sox2 항체 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산과 동일한 방식으로 생성되어 사용될 수 있다. 추가로, 하기가 Sox4에 대해 RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산의 예로서 언급될 수 있다: 서열 번호 3에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA 및 그들의 상보성 염기 서열을 가진 RNA, 및 서열 번호 4에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA 및 그들의 상보성 염기 서열을 가진 RNA.
TGF-β 억제제
TGF-β 시그널은 암 억제 효과와 암 촉진 효과를 함께 가진 것으로 알려져 있다. 즉, 일부 세포에서 그들은 암 세포 성장을 억제하며, 다른 세포에서는 그들은 암 세포 성장을 촉진한다. TGF-β에 기반한 암 치료는 이전에 조사되었으나, 이들 모순되는 작용을 포괄하는 방법은 어려움에 빠졌다.
본 발명자들은 뇌 종양 줄기 세포에서, TGF-β가 줄기 세포성을 유지하는 기능을 가짐을 확인하였다. 결과적으로, 뇌 종양 줄기 세포의 분화는 TGF-β의 기능 또는 발현을 억제함으로써 촉진될 수 있다.
저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩티드, 및 단백질 등을 비롯한 임의의 TGF-β 발현 억제제 또는 기능 억제제가 사용될 수 있으며, 그들이 Sox4 발현의 TGF-β 유도를 억제할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, TGF-β 활성화를 중화시키는 항-TGF-β 항체, TGF-β 수용체에의 TGF-β 결합을 억제하는 TGF-β 수용체 길항제, 및 TGF-β 발현을 억제하는 핵산(안티센스 핵산, RNAi 효과를 가진 이중쇄 핵산, 및 리보자임 등)이 언급될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
항-TGF-β 항체 및 TGF-β 발현을 억제하는 핵산이 항-Sox2 항체 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산과 동일한 방식으로 제조되어 사용될 수 있다. 추가로, TGF-β1 내지 TGF-β3의 세 가지 TGF-β 서브타입이 있으며, 이들 중 임의의 것이 TGF-βI 및 TGF-βII 수용체에의 결합에 의해 시그널을 전달하지만, 후술하는 참고예에 나타난 대로, 발현되는 서브타입은 환자에 의존한다. 결과적으로, TGF-β 발현 억제제 또는 기능 억제제로서 TGF-β 수용체 길항제를 이용할 경우, 서브타입 중 임의의 것을 발현하는 환자에서 효과적인 것이 이상적이다.
추가로, TGF-β 기능 억제제로서 TGF-β 수용체를 표적화하는 물질을 이용하는 것이 또한 바람직하며, TGF-β 수용체 발현 억제제(TGF-β 수용체의 발현을 억제하는 핵산), 우성-음성(dominant-negative)(우성 억제) TGF-β 수용체, 및 TGF-β 수용체에 대한 기능-억제 항체가 예로서 언급될 수 있다. TGF-β 수용체에 대한 기능-억제 항체 및 TGF-β 수용체 발현을 억제하는 핵산은 상기한 대로 항-Sox2 항체 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산과 동일한 방식으로 생성되어 사용될 수 있다. 공지된 우성-음성 TGF-β 수용체 및 그 등가물이 사용될 수 있다.
SB431542 (Inman et al ., 2002), A-78-03 (Tojo et al ., 2005), 및 LY364947 (Sawyer et al ., 2003)이 본 발명에서 뇌 종양 줄기 세포를 위한 분화 촉진제에서 이상적으로 사용될 수 있는 TGF-β 발현 억제제 또는 기능 억제제의 예로서 언급될 수 있다.
SMAD2 및 SMAD3 억제제
SMAD2 및 SMAD3는 TGF-β 또는 TGF-β 수퍼패밀리에 속하는 액티빈에 의해 세린-트레오닌 키나아제 수용체에 결합함으로써 세포 내에서 활성화되고 시그널을 전달하는 R-SMAD이다. R-SMAD는 co-SMAD인 SMAD4와 복합체를 형성하며, 핵 내로 이동하여 다양한 마커 유전자의 발현을 조절한다. 후술하는 실시예에서 나타난 대로, 본 발명자들은 SMAD2 및 SMAD3의 발현을 억제함으로써 Sox2 발현이 억제되었음을 확인하였다. 추가로, 그들은 SMAD2와 SMAD3에 대한 항체를 이용한 크로마틴 면역침전 분석에 의해, TGF-β 자극으로 인해 SMAD 복합체가 Sox4 프로모터에 직접 결합함을 확인하였다. 상기로부터, SMAD2 및 SMAD3 억제가 Sox2 또는 Sox4의 발현을 억제함으로써 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제한다고 말할 수 있다.
저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩티드, 또는 단백질 등과 같은 임의의 물질이 SMAD2 또는 SMAD3 발현 억제제로서 또는 기능 억제제로서 사용될 수 있으며, 그들이 그들의 투여 결과로서 뇌 종양 줄기 세포 분화가 유도되는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, SMAD2 활성화를 중화시키는 항-SMAD2 항체, 또는 SMAD3 활성화를 중화시키는 항-SMAD3 항체, 또는 SMAD2 또는 SMAD3 발현을 억제하는 핵산이 언급될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
항-SMAD2 및 항-SMAD3 항체, 및 SMAD2 및 SMAD3 발현을 억제하는 핵산은 상기한 대로 항-Sox2 항체 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산과 동일한 방식으로 생성되어 사용될 수 있다. 추가로, 서열 번호 5에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA, 및 그 상보적 염기 서열을 가진 RNA를 포함하는 이중쇄 RNA가 SMAD2에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산의 예로서 언급될 수 있다. 또한, 서열 번호 6에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA, 및 그 상보적 염기 서열을 가진 RNA를 포함하는 이중쇄 RNA가 SMAD3에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산의 예로서 언급될 수 있다.
Oct-4 억제제
Oct-4는 POU 패밀리의 전사 인자이며, 배아 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 자기복제 유전자 중 하나로 알려져 있으며, 또한 iPS 세포 유도에 사용될 수 있다. 하기의 실시예에서 개시된 대로, 본 발명자들은 Oct-4 발현을 억제함으로써 뇌 종양 줄기 세포 분화 또한 유도됨을 확인하였다.
저분자 화합물, 고분자 화합물, 핵산, 펩티드, 및 단백질과 같은 임의의 물질이 Oct-4 발현 억제제로서 또는 기능 억제제로서 사용될 수 있으며 그들이 그들의 투여 결과로서 뇌 종양 줄기 세포 분화가 유도되는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, Oct-4 활성화를 중화시키는 항-Oct-4 항체, 및 Oct-4 발현을 억제하는 핵산이 언급될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
항-Oct-4 항체, 및 Oct-4 발현을 억제하는 핵산은 상기한 대로 항-Sox2 항체 및 Sox2 발현을 억제하는 핵산과 동일한 방식으로 생성되어 사용될 수 있다. 추가로, 서열 번호 51에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA, 및 그 상보적 염기 서열을 가진 RNA를 포함하는 이중쇄 RNA, 및 서열 번호 52에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA, 및 그 상보적 염기 서열을 가진 RNA를 포함하는 이중쇄 RNA가 Oct-4에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산으로서 언급될 수 있다.
치료제
본 발명의 뇌 종양 치료제는 상기한 대로 본 발명과 관련된 뇌 종양 줄기 세포를 위한 분화 촉진제를 포함한다.
본 발명의 뇌 종양 치료제는 통상적인 치료제 형태의 제제로 제조되어, 경구로 또는 비경구로, 그리고 전신성으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 점적과 같은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 좌약, 장 주입, 및 경구용 장용 코팅된 캡슐이 선택될 수 있으며, 적합한 투여 방법은 환자의 연령과 증상에 따라 선택된다.
본 발명의 뇌 종양 치료제의 경우에는, 직접적인 두개내 투여가 바람직하다. 예를 들어, 정위뇌 수술(stereotaxy)을 이용하여 삽입된 캐뉼라를 통해 뇌의 환부에 약물을 직접 투여하는 것이 가능하다. 관련된 방법은 치료제가 환부에 직접 투여되도록 하기 때문뿐만 아니라, 다른 조직에 영향을 주지 않기 때문에 바람직하다. 약물은 캐뉼라가 제자리에 고정되어 있는 동안 일정 기간 동안 관류된다.
본 명세서에서, "통상적인 치료제"는 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 이용하여 적합하게 혼합된 의약이다. 치료제 형태에 특별한 제한은 없으며, 치료 목적에 따라 적절하게 선택되어 사용될 수 있다. 언급될 수 있는 전형적인 예는 정제, 알약, 파우더, 액체, 현탁액, 에멀젼, 과립, 캡슐, 좌약, 및 주사(액체, 현탁액, 및 에멀젼)를 포함한다. 이들 약물은 보통 이용되는 방법을 이용하여 제조되어야 한다.
본 명세서에서, "약학적으로 허용될 수 있는 담체"는 본 발명에서 뇌 종양 줄기 세포를 위한 분화 촉진제와 함께 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체는 약리학적으로 그리고 약학적으로 허용가능해야 하며, 특별한 제한을 갖지 않는다. 하기가 예로서 언급될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다: 물, 염수, 인산염 버퍼, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올과 같은 약리학적으로 허용되는 유기 용매, 및 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로오스 소듐, 소듐 폴리아크릴레이트, 소듐 알지네이트, 가용성 덱스트란, 카르복시메틸 전분 소듐, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄 검, 아라비아 검, 카세인, 한천, 폴리에틸렌 글리콜, 다이글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 바세린, 파라핀, 멸균 알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 계면활성제, 부형제, 착향료, 방부제, 안정제, 버퍼, 현탁액, 등장액, 결합제, 붕해제, 윤활제, 유동성 촉진제, 및 가리움제.
추가로, 만일 핵산이 본 발명의 치료제에 포함되면, 의약은 리보자임, 고분자 미셀, 또는 양이온 캐리어와 같은 캐리어 내에 핵산을 봉입시켜 제조될 수 있다. 또한, 프로타민과 같은 핵산 캐리어가 또한 사용될 수 있다. 이상적으로는, 항체는 이들 캐리어에 결합되어 환부를 표적화해야 한다. 더욱이, 콜레스테롤을 핵산에 결합시켜 체류성을 개선하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 약학 성분은 siRNA를 코딩하는 핵산을 포함하며, 만일 투여 후 세포 내에서 발현되면, 관련 핵산은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 센다이 바이러스와 같은 바이러스성 벡터, 또는 리보자임과 같은 비바이러스 벡터내로 삽입되어, 세포 내로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에서 치료제에 포함되는 활성 성분의 양은 제조자에 의해 사용되는 활성 성분의 유형에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 경우, 투여량은 1일 당 0.025 내지 1000 mg/m2, 이상적으로는 0.1 내지 500 mg/m2이며, 더욱 이상적으로는 10 내지 400 mg/m2으로 설정될 수 있지만 이것은 제한되지 않는다.
본 발명의 치료제는 이상적으로는 신경교종 줄기 세포에 작용하기 위하여 장기간 투여되어야 한다. 장기간 투여의 경우에는, 비투여 기간과 짧은 투여 기간의 반복적 교번이 또한 허용가능하며, 예를 들어, 투여 기간과 비투여 기간은 각각 1일 내지 10일 일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제는 이상적으로는 다른 항암 약물 및 암 치료 방법과 조합되어 사용되어야 한다.
본 발명의 치료제는 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성이 TGF-β-Sox4-Sox2 경로에 의해 유지되는 모든 뇌 종양에 대해 효과적이다.
예를 들어, 신경교종이 표적화될 수 있으며, 치료제가 예후가 열등하며 현재까지 효과적인 치료가 없는 역형성 성상 세포 종양 및 교아세포종을 위한 치료에서도 이상적으로 사용될 수 있다. 또한, 그 종양원성 능력을 위해 Sox2를 필요로 하는 수모세포종(Sutter, R, et al ., Oncogene (2010) doi: 10.1038/onc. 2009.472)은 또한 본 발명의 치료제가 바람직하게 사용될 수 있는 뇌 종양 중 하나이다.
추가로, 본 명세서에서, "치료"는 하기 중 적어도 하나를 야기하는 것을 설명한다: 종양 크기 감소(지연되거나 중단됨), 종양 전이의 억제(지연되거나 중단됨), 종양 성장의 억제(지연되거나 중단됨), 또는 뇌 종양에 관련된 단일 또는 다수 증상의 완화.
치료 방법
또한, 본 발명은 뇌 종양의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 뇌 종양 치료제를 투여하는 과정 및, 만일 발현 수준이 정상 조직에 비하여 상승되면, 환자로부터 채취한 뇌 종양 조직 내의 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하는 과정을 포함한다.
본 발명자들은 TGF-β-Sox4-Sox2 경로가 뇌 종양 줄기 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 필수불가결함을 보여주었지만, 살아있는 유기체에서, 또한 관련되는 다른 경로가 존재함을 부인할 수 없다. 예를 들어, 하기의 참고예에 개시된 대로, 적어도 두 가지의 신경교종 줄기 세포가 있어서, 헤지호그-길1 경로에 의존하는 것과 TGF-β-Sox4-Sox2 경로에 의존하는 것이 있으며, TGF-β 시그널 경로에 의존하는 것 중에는, Sox4-Sox2 보다는 LIF를 통해 작동하는 것이 있다.
본 발명의 치료제는 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하며, 따라서 조직을 환자의 뇌 종양의 환부로부터 채취하고, Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하며, 발현 수준이 상승될 때 유효할 가능성이 크다.
뇌 종양 조직은 예를 들어, 정위뇌 수술을 통해 캐뉼라를 이용하여 환자로부터 채취될 수 있다. 또한, 채취된 조직에서 Sox4 및 Sox2의 발현은 예를 들어, 노던 블롯팅, RNase 보호 분석, 또는 RT-PCR 등과 같은 표준 방법을 이용하여 실시될 수 있다.
스크리닝 방법
또한, 본 발명은 뇌 종양을 가진 환자를 위한 치료 방법을 결정하기 위한 스크리닝 방법을 제공하며, 이 방법은 환자로부터 채취한 뇌 종양 조직에서 Sox2 및/또는 Sox4 발현의 수준을 측정하는 과정, 및 정상 조직에서의 발현 수준과 관련 발현 수준을 비교하는 과정을 포함한다.
적용되는 방법에 따라, 본 발명의 치료제가 효과적일 가능성이 높은 환자를 특정하여 치료제를 투여하는 것이 가능하다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 비특허 문헌의 내용은 전체적으로 상세한 설명에 대해 참고로 포함된다.
실시예
본 발명의 실시예에 기초한 구체적인 설명이 하기에 개시되지만, 본 발명은 어떤 방식으로도 이들로 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 의의를 벗어나지 않고 다양한 형태로 본 발명을 변화시킬 수 있으며, 적용된 변화는 또한 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
실시예에 사용되는 재료 및 방법은 후술된다.
신경교종 샘플
하기 실시예에서, IV 등급 신경교종 샘플은 동경대학 병원의 임상 시험 심의 위원회로부터의 승인을 받은 후 동의를 얻은 환자로부터 수술 동안 채취하였다.(표 1 참조)
[표 1]
면역염색
신경교종-시작 세포(GIC)를 폴리-L-오르니틴(시그마사(Sigma)) 및 피브로넥틴(시그마사)을 이용하여 코딩된 유리 슬라이드에 접종한 후, 무혈청 배지에서 다양한 리간드 또는 억제제와 함께 7일 동안 배양하였다. 세포를 3.7% 파라포름알데히드를 이용하여 고정시킨 후, PBS를 포함하는 0.3% 트리톤 X-1000을 이용하여 세포막을 투과성으로 만든 후, 다양한 항체와 함께 항온처리하였다.
유동 세포 분석
세포를 단일 세포로 분리한 후, 피코에리트린 마커 CD133 항체를 이용하여 표지하였다. 벡크만(Beckman) C EPICS XL 유동 세포 분석기를 통해 EXPO32 ADC 소프트웨어를 이용하여 발현 수준을 측정하였다.
스피어 형성 분석
통기 캡을 가진 비조직 배양 처리된 플라스크(BD 바이오사이언스사(Bioscience))를 이용하여 GIC를 7일 동안 배양하였다. 현미경하에서 5개의 시야 내의 각 샘플에 대해 부유 스피어의 수를 세었다.
RNAi
하기 표에 개시된 siRNA를 인비트로겐사(Invitrogen)로부터 구매하였으며, 올리고펙타민 형질감염제(인비트로겐사)를 이용하여 설명서에 따라 세포에 도입하였다. siRNA는 한 쇄가 하기 표에 개시된 염기 서열을 포함하는 RNA인 블런트-말단 이중쇄 RNA이다. 음성 대조군으로서 스텔스(Stealth) siRNA 12935-400을 이용하였다.
[표 2]
아데노바이러스
FLAG-태그를 이용하여 라벨링된 Sox2 및 Sox4의 전체 cDNA 길이를 pENTR 벡터(인비트로겐사)에 클로닝하고, LR 클로나아제를 이용하여 pENTR 벡터와 pAd/CMV/V5-DEST 벡터 사이의 재조합을 통해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입하였다. Pac1을 이용한 리니어리제이션(linealization) 후, pAd/CMV/Sox2 또는 pAd/CMV/Sox4를 이용하여 HEK293A 세포를 감염시켰다. 3회의 동결 해동 사이클을 이용하여 바이러스 입자를 분리하고, 증폭을 위해 HEK293A 세포를 다시 감염시켰다.
세포용해 및 면역블롯팅
1% 노니데트(Nonidet) P-40, 20 mM 트리스-하이드로클로라이드 (pH 7.4), 150 mM 염화나트륨, 1 mM PMSF, 1% 아프로티닌, 및 5 mM EDTA를 포함하는 버퍼에서 세포를 용해시켰다. 세포용해된 산물로부터 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 제공하고, 플루오로 트랜스(Fluoro Trans) W 막(폴사(Pall))으로 옮겼다. 다양한 항체 유형을 이용하여 면역블롯팅을 실시하였다.
정량적 실시간 PCR
이쿠시마(Ikushima) 등(EMBO J. 2008, 27: 2955-2965)에 의한 방법에 따라 정량적 실시간 PCR을 실시하였다. 모든 샘플을 세벌씩 실시하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)를 이용하여 데이터를 정규화하였다. 추가로, 각 발현 분석에 사용된 프라이머는 하기에 개시된 바와 같다.
[표 3]
한계 희석 분석
스피어 세포를 단일 세포로 분리하고, 96-구멍 플레이트 상의 200 μL의 무혈청 배지에 두었다. 7일의 배양 후, 스피어를 포함하지 않는 웰의 백분율을 각각의 세포-도말 밀도에 대해 계산하고, 각 웰에 대해 세포 수에 대해 그렸다.
크로마틴 면역침전
코이누마(Koinuma) 등(Molecular and Cellular Biology, 2009, 29:172-186, 10.1128/MCB, 01038-08)에 의해 개시된 방법을 이용하여 크로마틴 면역침전을 실시하였다. 역 가교결합(reverse cross-linking) 후, 프로테이나아제 K를 이용하여 DNA를 처리하고, PCR 정제 키트(퀴아젠사(Qiagen))를 이용하여 정제하였다. DNA를 30 μL의 TE 내로 용출시키고, PCR 또는 정량적 실시간 PCR에서 사용하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기에 개시된 바와 같다.
[표 4]
두개내 증식 분석
신경교종-시작 세포(5 μL의 DMEM/F12 배지 중의 살아 있는 세포 5 X 104)를 5주령 암컷 BALB/c nu/nu 마우스의 우측 대뇌 반구 내로 3 mm 깊이에서 정위뇌 수술로 주사하였다. 모든 동물 시험은 동경대학 동물 시험 위원회의 정책에 따라 실시하였다.
마이크로어레이 데이터의 통계 분석
마이크로어레이 데이터를 GEO (http://www.ncbi.nim.nih.gov/geo/) 및 ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/microarray/)로부터 획득하였다. 통계 소프트웨어 R을 데이터 분석에 이용하였다.
실시예
1: 신경교종
스피어
및 분화된 신경교종 세포의 조절, 및 그들의 특징 평가
신경교종 줄기 세포성이 유지되는 기전을 밝히기 위하여, 스피어를 얻기 위해 상기에 개시한 대로 무혈청 배지에서 TGS-01 및 TGS-04 를 먼저 배양하였다.(도 1a 좌측 참조.) 둘 모두 자기복제 능력을 가졌으며, 면역억제된 마우스의 뇌 내로 이식되었을 때 원래의 암과 유사한 거동을 나타냈다. 한편, 동일한 샘플을 10% 태아 소 혈청에서 배양하였을 경우, 스피어는 형성되지 않았다.(도 1a 우측 참조.) 이 방식으로 배양된 세포는 때로는 하기에서 "분화된 신경교종 세포" 또는 "분화된 세포"로 불린다.
CD133(프로미닌-1)은 신경교종-시작 세포 마커로서 보고되었다.(비특허 문헌 1 참조.) 본 발명에서는, 세포를 단일 세포로 분리하고, 유동 세포 분석을 이용하여 CD133 발현 수준을 측정하였다. 결과가 도 1b에 나타난다. 신경교종 스피어에서 CD133-양성 세포의 백분율의 증가는 분화된 신경교종 세포와의 비교에 의해 확인되었다.(스피어 72.0%, 분화된 세포 1.6%.) 또한, 스피어는 연속적으로 계대 배양할 수 있었으며, 네스틴(신경 전구체 세포 마커)의 발현 및 세포가 클로닝할 수 있으며 자기복제할 수 있다는 사실이 확인되었다.(도 1c 참조.)
또한, 신경교종-시작 세포의 증가는 두개내 증식 분석을 이용하여 TGS-01 및 TGS-04 스피어에서 확인되었다.(데이터는 나타나지 않음.)
실시예
2: 신경교종-시작 세포의
종양원성에
대한
TGF
-β 시그널 억제의 효과
신경교종-시작 세포에서 TGF-β 시그널의 역할을 밝히기 위하여, 먼저 TGF-β 시그널 억제로 인한 효과를 조사하였다. TGF-β 또는 TGF-β 억제제(SB431542, 1 μM)의 존재하에서 스피어 형성 능력 분석을 실시하였다. SB431542는 TGF-β 타입 I 수용체(ALK5) 키나아제 억제제이다 (Inman et al ., Molecular Pharmacology, 2002, 62: 65-74). 결과는 도 2a와 도 2b에 나타난다. SB431542를 이용하여 처리될 경우, 신경교종-시작 세포의 스피어 형성 능력은 현저하게 감소되었다.
SB431542는 TGF-β 타입 I 수용체(ALK5) 뿐만 아니라, 액티빈/노달 타입 I 수용체 시그널을 억제할 수 있으며, TGF-β 시그널의 역할을 확인하기 위하여, 신경교종-시작 세포에 대한 TGF-β 수용체 II/Fc 키메라의 효과를 조사하였다. 신경교종-시작 세포를 단일 세포로 분리하고, 인간 TGF-βRII/Fc 키메라(1 ㎍/mL) 또는 대조군으로서 IgG1Fc (1 ㎍/mL)의 존재하에서 스피어 분석을 실시하였다. 결과는 도 2c에 나타난다. 스피어 형성에 있어서 TGF-βRII/Fc를 이용하여 처리된 신경교종-시작 세포의 효율은 낮았다.
또 다른 TGF-β 시그널 억제제인 A-78-03 (Tojo et al ., Cancer Science, 2005, 96: 791-800) 또는 LY364947 (Sawyer et al ., Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 46: 3953-3956)를 이용하거나, 또는 TGF-β 시그널에서 본래 음성 조절 인자인 SMAD7 cDNA를 이용한 아데노바이러스 감염을 이용하는 처리에서도 유사한 스피어 형성 분석 효과가 얻어졌다.(도 2e 참조.) 또한, SB431542의 존재하에서, 일단 형성된 스피어의 구형 성장 패턴이 손실되었으며, 그들은 부착 세포가 되었다.(도 2f 참조.) TGF-β 시그널 억제로 인한 신경교종-시작 세포에서의 스피어 형성 수의 감소는 자기복제 능력이 손실되었음을 시사한다.
다음에는, 유동 세포 분석을 이용하여 TGF-β(100 pM) 또는 SB431542(1 μM)의 효과를 조사하였다. TGF-β 억제제의 존재하에서, 신경교종 스피어 내의 CD133-양성 세포의 백분율은 감소하였다.(도 3a 참조.) 또한, 신경교종 스피어에서 신경 전구체 세포 마커 또는 신경 세포 분화 마커의 발현을 조사하기 위하여, 스피어(TGS-01)를 단일 무혈청 배지 내로 분리하고, 폴리-L-오르니틴(시그마사) 및 피브로넥틴(시그마사)을 이용하여 코딩된 유리 슬라이드에 접종한 후, TGF-β(100 pM) 또는 억제제 SB431542(1 μM)와 함께 7일 동안 배양하였다. 3.7% 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정시키고, PBS를 포함하는 0.3% 트리톤 X-1000을 이용하여 세포막을 투과성으로 만들고, 면역염색을 실시하기 전에 항체와 함께 항온처리하였다.
TGF-β 억제는 네스틴 및 무사시(신경 전구체 세포 마커)-양성 세포를 감소시켰으며, GFAP(성상세포 분화 마커) 또는 Tuj1(βIII-튜블린, 신경 세포 마커)를 증가시켰다.
상기에 개시된 결과는 TGF-β 시그널이 신경교종-시작 세포의 종양원성과 줄기 세포성을 유지함을 시사한다. 역으로, TGF-β 첨가는 신경교종-시작 세포 스피어 형성 능력, CD133-양성 비, 또는 마커 발현에 크게 영향을 주지 않았다.(도 2a, 도 3a, 및 도 3b 참조.) 이것은 신경교종-시작 세포가 TGF-β 시그널의 모든 주요 성분을 발현하기 때문이며 그리고 TGF-β1 및 TGF-β2를 분비함으로써 줄기 세포성을 유지하기 위해 충분한 분비성 TGF-β 시그널의 생산으로 인한 것으로 생각된다.
실시예
3:
Sox2
에 의한 신경교종-시작 세포에서의 줄기 세포성의 유지, 및 TGF-β로 인한
Sox2
발현의 유도
신경교종-시작 세포의 줄기 세포성이 TGF-β 시그널에 의해 유지되는 기전을 밝히기 위하여, 줄기 세포 마커의 발현에 대한 TGF-β 및 31542의 효과를 조사하였다.
결과는 도 4a에 나타난다. HMG-박스 인자인 Sox2 mRNA의 발현은 TGF-β(100 pM)을 이용한 처리 후 24시간에 유도되었으나, SB431542(1 ㎍)을 이용할 경우, Sox2 발현은 24 시간 후 억제되었으며, 낮은 발현 수준이 이어서 7일 동안 계속되었다.
대조적으로, Oct-4, NANOG, 및 LIF 등과 같은 다른 다능성 줄기 세포-관련 분자의 발현은 TGF-β 또는 억제제를 이용한 처리에 의해 크게 영향을 받지 않았다.(도 14 참조.) 추가로, TGF-β를 자극함으로써 NANOG 및 LIF가 많은 세포에서 유도됨이 보고되었다. (Xu et al ., Cell Stem Cell, 2008, 3: 206; Bruna et al ., Cancer Cell, 2007, 11: 147-160.)
또한, siRNA (siSMAD2 및 siSMAD3)를 TGS-01 세포 내의 SMAD2 및 SMAD3에 형질감염시키고, 24시간 동안 항온처리한 후, TGF-β(100 pM)에 대해 처리하고, 발현 수준을 측정하였다. 측정된 값을 GAPDH mRNA를 이용하여 정규화하였으며, 결과는 도 4b에 나타난다. TGF-β를 이용한 Sox2 유도는 SMAD2 및 SMAD3에 대한 siRNA가 존재할 경우 명백하게 억제되었다.(도 4b 참조.) 이 사실은 Sox2 발현이 TGF-β-SMAD 시그널에 의해 억제됨을 보여준다.
또한, TGF-β(100 pM) 또는 SB431542(1 μM)을 이용한 24시간 처리가 Sox2 단백질 수준의 발현을 억제하였음이 확인되었다.(도 4c 참조.) 도면에서, α-튜블린은 로딩 대조군이다.
추가로, 신경교종 스피어 형성 능력 및 자기복제 능력에 대한, siRNA로 인한 Sox2 발현 넉다운의 효과를 조사하기 위하여, TGS-01 세포를 단일 세포로 분리하고, 대조군(NC) 또는 Sox2에 대한 siRNA(siSox2 No.1 또는 siSox2 No.2)를 도입하고 7일 동안 배양한 후, 스피어 형성 분석 또는 한계 희석 분석을 실시하였다. 대조군의 결과가 도 4d에 나타나며, Sox2에 대한 siRNA(siSox2 No.1)의 결과는 도 4e에 나타나며, Sox2에 대한 siRNA(siSox2 No.2)의 결과는 도 4g에 각각 나타난다. 신경교종-시작 세포의 스피어 형성 능력 및 자기복제 능력은 Sox2 넉다운에 의해 현저하게 감소되었다.
또한, TGS-01 세포 중에서 CD133-양성 세포의 백분율에 대한 Sox2 넉다운의 효과를 유동 세포 분석을 이용하여 측정하였다. 결과가 도 4f에 나타난다. Sox2 넉다운은 CD133-양성 세포를 감소시켰다(75.1%에서 29.3% 또는 35.9%로).
또한, 신경교종-시작 세포 분화에 대한, siRNA를 이용한 Sox2 넉다운의 효과를 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정하였다. Sox2가 넉다운되었을 때, 네스틴-양성 세포의 백분율은 감소하였으며, GFAP-양성 세포의 백분율은 증가하였으며(도 4h 참조), 따라서 분화 촉진이 확인되었다.
상기로부터, 신경교종-시작 세포에서 줄기 세포성의 유지를 위해 Sox2가 필수적임이 이해될 수 있다. 추가로, SB431542 처리 24 시간 후 Sox2 발현의 하향조절은 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 잃게 한 결과에 의해서가 아니라, 오히려 원인에 의해 시사된다.
실시예
4:
Sox2
를 과다 발현하는 세포에 대한
TGF
-β 억제제의 효과
TGF-β로 인해 줄기 세포 세포성을 유지하는 데 있어서 Sox2의 역할을 더욱 깊이 조사하기 위하여, Sox2 cDNA로 코팅된 아데노바이러스를 감염시켰으며, Sox2를 과다 발현하도록 제조된 신경교종-시작 세포에 대한 TGF-β 억제의 효과를 조사하였다.
Sox2를 과다 발현하도록 만들어진 신경교종-시작 세포에 SB431542가 투여되었더라도, 스피어 형성 능력은 LacZ를 과다 발현하도록 만들어진 세포에 비하여 단지 약간 감소되었다.(도 5a 참조.) 또한, SB431542가 Sox2를 과다 발현하는 세포에 투여되었더라도, 네스틴-양성 세포의 백분율이 떨어지지 않았으며 GFAP-양성 세포의 백분율이 증가하지 않았다(도 5a 참조)는 사실로부터, 신경교종 세포가 줄기 세포성을 유지하는 것으로 결정되었다.
이들 결과로부터, TGF-β 억제제를 이용한 줄기 세포성의 손실은 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 유지하는 Sox2의 하향 조절로 인한 것으로 이해되었다.
실시예
5: 신경교종-시작 세포에서
Sox4
의 역할
TGF-β에 의한 Sox2 발현의 유도는 자극 후 24시간에 관찰되었으나, 3시간 후에는 관찰되지 않았다.(도 4a 참조) 추가로, 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드의 존재하에서 Sox2 발현에 대한 TGF-β의 효과를 조사하였다. TGF-β (100 pM) 처리를 24 시간 동안 실시하였으며, 30분 동안 TGF-β를 처리한 후, 시클로헥시미드 처리를 시작하였으며, Sox2 발현 수준을 측정하였다. 측정된 값은 GAPDH mRNA를 이용하여 정규화하였으며, 결과는 도 6a에 나타난다. 단백질 합성 억제제인 시클로헥시미드의 존재하에서, Sox2 발현의 유도는 감소되었다. 이들 사실로부터, Sox2 발현은 TGF-β에 의해 직접 유도되지 않으며, 오히려, TGF-β에 의해 유도되는 다른 인자에 의해 조절되는 것으로 생각된다.
여기서, TGF-β를 이용한 Sox2 발현 유도를 매개하는 후보 유전자를 조사하기 위하여, 하기 기준을 이용하여 공개된 마이크로어레이 데이터(Beier et al ., 2007; Bruna et al ., 2007; Guenther et al ., 2008; Lee et al ., 2006; Tso et al., 2006) 로부터 후보 유전자를 선택하였다.
(1) 종양 세포에 비하여 신경교종-시작 세포에서 그 발현이 상승되는 유전자
(2) 신경교종 세포에서 TGF-β에 의해 직접 유도되며, TGF-β 억제제에 의해 억제되는 유전자
(3) Sox2의 발현 수준에 상관된 신경교종 세포에서의 발현 수준을 가진 유전자
그 결과, 신경교종-시작 세포에서 높은 발현을 가진 유전자 중에서 전사 인자 Sox4가 TGF-β 마커 유전자로 확인되었다.
또한, TGS-01 및 TGS-04 세포(스피어)에서, 그리고 분화된 신경교종 세포에서, Sox4 mRNA 발현 수준을 측정하였을 때, 스피어에서의 발현 수준이 상승하였음이 확인되었다.(도 6b 참조.) 도면에서, α-튜블린은 로딩 대조군이다.
또한, Sox4 발현이 TGF-β 시그널에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위하여, TGF-β(100 pM) 또는 SB431542(1 μM)를 이용하여 3시간 및 24시간 동안 처리한 후 sox4 mRNA의 양을 측정하였으며(도 6c 참조), 처리 후 24시간에 Sox4 단백질의 양을 측정하였다(도 6d 참조.). TGS-01 및 TGS-04 세포에서 Sox4 mRNA 발현은 TGF-β 자극 후 즉시(즉, 3시간 후) 유도되었으며, 역으로, TGF-β 억제제에 의해 하향 조절되었다.
Sox4가 직접적인 TGF-β 마커임을 확인하기 위하여, TGF-β 시그널을 위한 DNA 결합 시그널 매개자인 SMAD2 및 SMAD3에 대한 항체를 이용하여 크로마틴 면역침전 분석을 실시하였다. 구체적으로, TGS-01 세포를 TGF-β(100 pM) 또는 SB431542(1 μM)를 이용하여 1.5 시간 동안 처리하였으며, 용출된 DNA를 실시간 PCR 또는 RT-PCR을 위해 공급하였다. 실시간 PCR에서는, 측정된 값을 하이포잔틴 포스포리보실트랜트퍼라제(HPRT)의 첫번째 인트론을 이용하여 정규화하였다. 결과는 도 6e에 나타난다. SMAD 복합체는 TGF-β 자극에 의해 Sox4 프로모터에 직접 결합되었으며, 이 결합은 SB431542에 의해 명백하게 조절되었다. 추가로, TGF-β에 의한 Sox4 유도는 시클로헥시미드에 의해 영향을 받지 않았다.(도 6f 참조.)
상기 결과로부터, sox4는 직접적인 TGF-β 시그널 마커 유전자임이 이해되었다.
실시예
6:
Sox2
인핸서
영역에의
Sox4
결합을 이용한
Sox2
발현의 촉진, 및 관련 결합
Sox2 발현에 대한 Sox4의 과다 발현의 효과를 조사하였다. 아데노바이러스-Sox4 또는 LacZ를 TGS-01 세포에서 감염시키고, 24시간 후에 회수하고, 그들의 각각의 발현양을 측정하였다. 측정된 값을 GAPDH mRNA를 이용하여 정규화하였다. 결과는 도 7a에 나타난다. 신경교종-시작 세포에서 Sox4의 과다발현은 Sox2 발현을 상향 조절하였다.
추가로, siRNA로 인한 Sox4 넉다운의 Sox2 발현에 대한 효과를 조사하였다. 결과는 도 7b에 나타난다. 상단은 Sox2 및 Sox4 mRNA의 발현 수준을 보여주며, 하단은 Sox4 단백질의 발현 수준을 보여준다. Sox2 발현은 Sox4 넉다운에 의해 조절되었다.(도 7b 참조.)
한편, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에서 Sox2 mRNA 발현은 siRNA로 인한 sox4 넉다운에 의해 하향 조절되었다. 이 사실은 Sox2 mRNA가 Sox4를 위한 직접적인 siRNA 마커가 아님을 보여준다.
상기로부터, Sox2 발현은 Sox4에 의해 전사 수준에서 상향 조절됨이 이해되었다.
이러한 조절이 직접적임을 확인하기 위하여, Sox4 항체를 이용하여 크로마틴 면역침전 분석을 실시하였다. Sox2 유전자의 3' 플랭킹 영역(flanking region)에 위치한 인핸서 영역이 Sox2 발현의 조절을 위해 중요함이 이전에 보고되었다.(Chew et al ., Molecular and Cellular Biology,2005, 25:6031-6046; Tomioka et al ., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 3202-3213.) 이 영역은 Sox4에의 컨센서스(consensus) 결합 모티프 CATTGTA를 포함한다.(Liao et al ., Oncogene, 2008, 27: 5578-5589.)
여기서, TGS-01 세포를 TGF-β(100 pM) 또는 SB431542(1 μM)을 이용하여 24 시간 동안 처리하였으며, 용출된 DNA를 정량적 실시간 PCR을 이용하여 분석하였다. 측정된 값은 HPRT 첫번째 인트론 양을 이용하여 정규화하였다. 결과는 도 7c에 나타난다. sox2 인핸서 영역으로의 Sox4 보충은 TGF-β에 의한 24시간의 자극으로 인해 증가하였으며, 보충은 SB431542에 의해 명백히 감소되었다. 이들 결과는 TGF-β 또는 TGF-β 억제제에 의한 Sox4 발현 조절에 기초한 것으로 생각된다. 추가로, TGF-β에 의한 sox2 발현 유도에 대한 Sox4 넉다운의 효과를 조사하기 위하여, siRNA를 감염시키고, 24 시간 후, TGF-β(100 pM)를 이용하여 추가 24 시간 동안 처리하였으며, 실시간 PCR을 이용하여 Sox2 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 결과는 도 7d에 나타난다. Sox4가 넉다운 되었을 때, Sox2 발현의 유도는 거의 없었다.
상기로부터, Sox4가 TGF-β에 의해 직접 유도되었으며, Sox2 인핸서 영역에 결합하여, 발현을 상향 조절하였음이 이해되었다.
실시예
7: 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성의 유지에서
Sox4
의 역할
지금까지, 줄기 세포성의 유지와 Sox4의 관련성에 대한 보고는 없었다. 신경교종-시작 세포에서 Sox4의 역할을 조사하기 위하여, 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성에 대한 Sox4 넉다운의 효과를 조사하였다.
신경교종-시작 세포(TGS-01)를 단일 세포로 분리하였으며, siRNA를 이용하여 Sox4를 넉다운시키고, 스피어 형성 분석 또는 한계 희석 분석에 제공하였다. 결과는 도 8a와 도 8b에 나타난다. Sox4를 넉다운시킴에 의해, 신경교종-시작 세포의 스피어 형성 능력과 자기복제 능력이 감소되었다. 또한, Sox4가 siRNA에 의해 넉다운된 신경교종-시작 세포 중에서 CD133-양성 세포의 백분율을 유동 세포 분석에 의해 측정한 결과는 도 8c에 나타난다. sox4의 넉다운은 CD133-양성 세포의 백분율을 감소시켰다(72.6%에서 41.5% 또는 41.1%로.)
또한, 신경교종-시작 세포 분화에 대한 Sox4 넉다운의 효과를 조사하기 위하여, 전체 세포 중에서 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율을, siRNA의 유도 후 7일 째에 측정하였다. 결과는 도 8d에 나타난다. Sox4의 넉다운은 네스틴-양성 세포를 감소시켰으며 GFAP-양성 세포를 증가시키고(도 8d 참조) 분화를 촉진하였음이 이해되었다.
상기 개시된 결과로부터, Sox4가 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성의 유지에서 매우 중요한 경로에 관련됨이 이해되었다.
실시예
8:
TGF
-β를 이용하여 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 있어서
Sox4
의 역할
TGF-β에 의해 직접 유도되는 Sox4 발현이 Sox2 발현을 촉진하며 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 유지한다는 가설을 확립하고 조사하기 위하여, Sox4가 과다 발현된 신경교종-시작 세포에 대한 TGF-β 억제제의 효과를 확인하였다. 구체적으로, TGS-01 세포를 단일 세포로 분리하고, 아데노바이러스-sox4 또는 아데노바이러스-LacZ를 이용하여 감염시키고, SB431542(1 μM)의 존재 또는 부재하에서 7일 동안 배양한 후, 스피어 형성 분석을 위해 제공하였다. 결과는 도 9a에 나타난다. Sox4가 신경교종-시작 세포에서 과다 발현되도록 야기되었을 경우, 그들은 SB431542에 대해 내성을 나타냈으며, 스피어 형성 능력의 감소가 완화되었다.
추가로, 신경교종-시작 세포 분화에 대한 sox4 과다 발현의 효과를 조사하기 위하여, 동일한 방식으로 7일 동안 배양된 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정하였다. 결과는 도 9b에 나타난다. TGF-β 억제제 SB431542의 투여에도, 네스틴-양성 세포와 GFAP-양성 세포의 백분율에서 주된 변화가 관찰되지 않았다. 이들 결과로부터, TGF-β에 의한 Sox4 발현의 직접 유도는 신경교종-시작 세포에서 줄기 세포성을 유지하는 데 필수적인 것으로 이해되엇다.
실시예
9: 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 유지하는 데 있어서
Oct
-4의 역할
ES 세포에서 줄기 세포성의 유지에서 중요한 역할을 하는 전사 인자인 Oct-4가 신경교종-시작 세포에서 줄기 세포성을 유지하는데 관련된다는 가설을 확립하고 확인하기 위하여, siRNA를 이용하여 Oct-4를 넉다운시켰다.
TGS-01 세포와 TGS-04 세포 둘 모두를 단일 세포로 분리하였으며, siRNA(siOct-4 No. 1 또는 siOct-4 No. 2)를 대조군(siNC) 또는 Oct-4에 형질감염시키고 7일 동안 배양한 후, 스피어 형성 분석 또는 한계 희석 분석을 실시하였다. 두 분석의 결과가 도 10a 및 도 10b에 각각 나타난다. Oct-4를 넉다운시킨 것은 신경교종-시작 세포의 스피어 형성 능력과 자기복제 능력을 현저하게 감소시켰다. 추가로, 신경교종-시작 세포 분화에 대한 Oct-4 넉다운의 효과를 조사하기 위하여, 모든 세포 중에서 네스틴-양성 세포, 무사시-양성 세포, 및 GFAP-양성 세포의 백분율을 측정하였다. 결과는 도 10c에 나타난다. 줄기 세포 마커인 네스틴-양성 세포 및 무사시-양성 세포의 백분율은 감소하였으며, 분화된 세포 마커인 GFAP-양성 세포의 백분율은 증가하여, 분화가 촉진되었음을 확인하였다.
실시예
10:
인비보에서
TGF
-β 시그널 억제의 효과
줄기 세포 성의 유지에서 인비보에서의 Sox4의 역할을 밝히기 위하여, 두개내에서의 신경교종-시작 세포의 성장에 대한 TGF-β 억제제와 Sox4의 효과를 두개내 증식 분석을 이용하여 조사하였다.
구체적으로, 아데노바이러스-Sox4 또는 아데노바이러스-LacZ 감염을 실시하였으며, 미처리되거나 TGF-β 억제제를 이용하여 24시간 처리한 후의 5 X 104 TGS-01 세포를 두개내에 이식하였다. TGF-β는 신경교종 세포 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 결과를 성장에 대한 효과와 분화에서의 효과로 분류하기 위하여, SB431542 처리를 전처리로서 실시하였으며 계속 실시하지는 않았다. 각 조건을 위해 6마리 마우스를 이용하였으며, 카프란-마이에르(Kaplan-Meier) 분석을 이용하여 평가하였다. 롱-랭크(long-rank) 시험을 이용하여 p 값을 결정하였다. 결과는 도 11(좌측)에 나타난다. SB431542를 이용하여 전처리된 신경교종-시작 세포가 이식된 마우스의 생존 기간은 대조군 신경교종-시작 세포가 이식된 마우스의 생존 기간 보다 상당히 길었다. 추가로, 두개내 이식 후 30일에 해부된 샘플의 조직학적 분석의 결과는 도 11(우측)에 나타난다. 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신(HE)으로 염색하였다. 대조군 신경교종-시작 세포가 이식된 마우스는 신경 증상을 나타냈으며, 그들의 종양 성장 또한 컸다. 대조적으로, SB431542를 이용하여 전처리된 신경교종-시작 세포가 이식된 마우스는 어떤 신경증상도 나타내지 않았으며, HE를 이용한 병리학적 검사는 어떤 종양도 나타내지 않았다. 또한, Sox4를 과다 발현한 신경교종-시작 세포는 SB431542를 이용한 생존 기간 연장에 대해 어떤 효과도 나타내지 않았다.
상기로부터, TGF-β가 Sox4의 직접 유도를 통해 Sox2의 발현을 상향 조절하며, 이것은 신경교종 세포의 줄기 세포성을 유지하며, TGF-β-Sox4-Sox2 경로의 억제가 신경교종-시작 세포 분화를 촉진하는 것으로 나타났다.(도 12 참조.)
참고예
1: 신경교종-시작 세포에서 줄기 세포성의 유지에 관련된 다른 경로
상기한 대로, 본 발명자들은 TGF-β-Sox4-Sox2 경로가 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성의 유지에서 필수적임을 보여주었으나, 여기에 관련된 다른 경로가 인비보에 존재함을 부정할 수는 없다. 예를 들어, 헤지호그-길1 경로가 신경교종-시작 세포의 줄기 세포성을 조절함이 보고되었으며, 헤지호그 억제제인 시클로파민이 신경교종 종양의 체적을 감소시킬 수 있음이 보고되었다. (Clement et al ., Current Biology, 2007, 17: 165-172). 하지만, 헤지호그-길1 경로의 억제가 신경교종-시작 세포 분화를 촉진하는 기전은 알려져 있지 않다.
본 발명에서는, 헤지호그 억제제인 시클로파민의 존재하에서 TGS-01 세포에 대해 스피어 형성 분석을 실시하였다. TGS-01 세포를 단일 세포로 분리하고, 시클로파민(2.5, 5, 및 10 μM; 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)) 및/또는 SB431542(1 μM)의 존재하에서 7일 동안 배양하였다. 결과는 도 13에 나타난다. 시클로파민은 TGS-01 세포의 스피어 형성 능력을 감소시켰으나, 그 효과는 SB431542의 효과보다 작았으며, 또한, 두 약물이 조합되어 함께 투여되더라도, 추가적이거나 상승적인 효과는 얻어지지 않았다. 이들 사실로부터, 신경교종-시작 세포는 적어도 두 가지 의존성을 가져, 하나는 헤지호그-길1 경로에의 의존성이고 다른 하나는 TGF-β-Sox4-Sox2 경로에의 의존성을 갖는 것으로 생각된다. 또한, TGF-β는 백혈병 억제 인자(LIF)의 유도를 통해 인간 교아세포종의 자기복제를 촉진하는 것으로 보고되었다. (Penuelas et al ., Cancer Cell, 2009, 5: 315-327.)
본 발명에서는, 신경교종-시작 세포에서 LIF의 역할을 조사하기 위하여, TGS-01 및 TGS-04 세포를 단일 세포로 분리하고, LIF(20 ng/mL; 케미콘사(Chemicon)), 대조군으로서 IgG1 Fc (10 ㎍/mL), 또는 항-LIF 중화 항체 (10 ㎍/mL; R&D 시스템즈사(Systems))의 존재하에서 7일 동안 배양하였다. 결과는 도 14에 나타난다. 항-LIF 중화 항체가 투여된 세포의 스피어 형성 능력은 감소하였다. 하지만, TGF-β 시그널은 TGS-01 또는 TGS-04 세포에서 LIF 발현을 유도하지 않았다.(도 15 참조.) 이들 사실로부터, TGF-β 시그널은 다수의 독립적인 경로를 통해 신경교종-시작 세포의 종양원성을 유지하는 것으로 생각된다.
참고예
2:
환자에서
TGF
-β 서브타입의 차이
TGS-01 내지 TGS-05 세포를 산성화한 후, 배양 배지에 분비된 TGF-β 단백질 수준을 ELISA(R&D 시스템즈사)를 이용하여 측정하였다. 결과는 도 16에 나타난다. TGF-β1이 많이 발현된 경우(TGS-05)와 TGF-β2가 많이 발현된 경우(TGS-01, TGS-03, 및 TGS-04)의 존재로부터, TGF-β 서브타입 중 단지 하나만을 표적화하는 치료는 환자에 따라 효과를 얻을 수 없음이 시사되었다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1은 siSox2 No.1을 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 2는 siSox2 No.2를 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 3은 siSox4 No.1을 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 4는 siSox4 No.1을 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 5는 siSMAD2를 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 6은 siSMAD3을 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 7은 GAPDH 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 8은 GAPDH 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 9는 Sox2 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 10은 Sox2 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 11은 Sox4 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 12는 Sox4 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 13은 Oct-4 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 14는 Oct-4 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 15는 NANOG 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 16은 NANOG 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 17은 LIF 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 18은 LIF 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 19는 PAI-1 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 20은 PAI-1 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 21은 p15INK4b 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 22는 p15INK4b 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 23은 p21WAF1 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 24는 p21WAF1 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 25는 p27KIP1 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 26은 p27KIP1 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 27은 c-Myc 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 28은 c-Myc 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 29는 TGF-β1 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 30은 TGF-β1 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 31은 TGF-β2 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 32는 TGF-β2 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 33은 TGF-β3 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 34는 TGF-β3 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 35는 TGF-β 타입 II 수용체 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 36은 TGF-β 타입 II 수용체 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 37은 ALK5 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 38은 ALK5 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 39는 SMAD2 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 40은 SMAD2 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 41은 SMAD3 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 42는 SMAD3 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 43은 SMAD4 발현 분석에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 44는 SMAD4 발현 분석에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 45는 면역침전 동안 HPRT1 PCR에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 46은 면역침전 동안 HPRT1 PCR에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 47은 면역침전 동안 Sox4 PCR에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 48은 면역침전 동안 Sox4 PCR에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 49는 면역침전 동안 Sox2 PCR에 사용된 전방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 50은 면역침전 동안 Sox2 PCR에 사용된 역방 프라이머 염기 서열이다.
서열 번호 51은 siOct-4 No.1을 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
서열 번호 52는 siOct-4 No.2를 구성하는 이중쇄 RNA 중에서 단일쇄 염기 서열이다.
SEQUENCE LISTING
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<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siSox4 #1
<400> 3
uuugcccagc cgcuuggaga ucucg 25
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siSox4 #2
<400> 4
uugucgcugu cuuugagcag cuucc 25
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siSmad2
<400> 5
aacaggccuu uacagcuucu c 21
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siSmad3
<400> 6
ccagagagua gagacaccag uucua 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of GAPDH
<400> 7
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of GAPDH
<400> 8
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Sox2
<400> 9
tgcgagcgct gcacat 16
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Sox2
<400> 10
tcatgagcgt cttggttttc c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Sox4
<400> 11
ctgcgcctca agcacatg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Sox4
<400> 12
ttcttcctgg gccggtact 19
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Oct4
<400> 13
ggaggaagct gacaacaatg aaa 23
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Oct4
<400> 14
ggcctgcacg agggttt 17
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Nanog
<400> 15
agaactctcc aacatcctga acct 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Nanog
<400> 16
tgccacctct tagatttcat tctct 25
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of LIF
<400> 17
tcttggcggc aggagttg 18
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of LIF
<400> 18
ccgccccatg tttcca 16
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of PAI-1
<400> 19
ggctgacttc acgagtcttt ca 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of PAI-1
<400> 20
atgcgggctg agactatgac a 21
<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of p15-INK4b
<400> 21
ggtaatgaag ctgagcccag gt 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of p15-INK4b
<400> 22
gataatccac cgttggccgt a 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of p21-WAF1
<400> 23
gcgactgtga tgcgctaatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of p21-WAF1
<400> 24
ccagtggtgt ctcggtgaca 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of p27-KIP1
<400> 25
ggacttggag aagcactgca ga 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of p27-KIP1
<400> 26
tccacctctt gccactcgta ct 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of c-myc
<400> 27
ccacacatca gcacaactac gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of c-myc
<400> 28
cggttgttgc tgatctgtct ca 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of TGF-beta1
<400> 29
gacttccgca aggacctcgg c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of TGF-beta1
<400> 30
gcgcacgatc atgttggaca g 21
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of TGF-beta2
<400> 31
cctgtctacc tgcagcacac tcga 24
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of TGF-beta2
<400> 32
ggcggcatgt ctattttgta aacctcc 27
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of TGF-beta3
<400> 33
tggctgttga gaagagagtc ca 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of TGF-beta3
<400> 34
caagttgcgg aagcagtaat tg 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of TGF-beta type
I
I receptor
<400> 35
ataaggccaa gctgaagcag 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of TGF-beta type
II receptor
<400> 36
cttctggagc catgtatctt g 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of ALK5
<400> 37
tcgccctttt atttcagagg gtact 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of ALK5
<400> 38
acagcaagtt ccattcttct ttacc 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Smad2
<400> 39
cccatcgaaa aggattgcca ca 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Smad2
<400> 40
tgcatggaag gtttctccaa cc 22
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Smad3
<400> 41
ggacgactac agccattcca 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Smad3
<400> 42
ttccgatgtg tctccgtgtc a 21
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR expression analysis of Smad4
<400> 43
ctttgaaatg gatgttcag 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR expression analysis of Smad4
<400> 44
catcctgata aggttaaggg 20
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR of HPRT1 in immunoprecipitation
<400> 45
tgtttgggct atttactagt tg 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR of HPRT1 in immunoprecipitation
<400> 46
ataaaatgac ttaagcccag ag 22
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR of Sox4 in immunoprecipitation
<400> 47
cctcttgaac aacatgcagc ttt 23
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR of Sox4 in immunoprecipitation
<400> 48
tgatgtattg taagccctca atgaa 25
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> foward primer used for PCR of Sox2 in immunoprecipitation
<400> 49
ggataacatt gtactgggaa gggaca 26
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer used for PCR of Sox2 in immunoprecipitation
<400> 50
caaagtttct tttattcgta tgtgtgagca 30
<210> 51
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siOct4 #1
<400> 51
ucaccuuccc uccaaccagu ugccc 25
<210> 52
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> one strand of siOct4 #2
<400> 52
aucugcugca guguggguuu cgggc 25
Claims (14)
- 뇌 종양 시작 세포에서 TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질을 포함하는 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제.
- 제1항에 있어서, TGF-β-Sox4-Sox2 경로를 억제하는 물질은 Sox2, Sox4, TGF-β, SMAd2, SMAd3, 및 Oct-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 발현 억제제 또는 기능 억제제인, 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제.
- 제2항에 있어서, 발현 억제제 또는 기능 억제제는 TGF-β 수용체 길항제인, 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제.
- 제2항에 있어서, 발현 억제제 또는 기능 억제제는
(a) Sox2, Sox4, SMAd2, SMAd3, 및 Oct-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 안티센스 핵산,
(b) Sox2, Sox4, SMAd2, SMAd3, 및 Oct-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대해 리보자임 활성을 갖는 핵산,
(c) Sox2, Sox4, SMAd2, SMAd3, 및 Oct-4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산, 및
(d) (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 개시된 핵산을 코딩하는 핵산
으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물인, 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제는 신경교종 시작 세포의 분화를 위한 촉진제인, 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 뇌 종양 시작 세포의 분화 촉진제를 포함하는 뇌 종양 치료제.
- 제6항에 있어서, 뇌 종양 치료제는 신경교종 치료제인 뇌 종양 치료제.
- (i) 서열 번호 1에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산; 또는
(ii) 서열 번호 2에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산
의 두 핵산으로 이루어지며, Sox2에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산. - (i) 서열 번호 3에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산; 또는
(ii) 서열 번호 4에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산
의 두 핵산으로 이루어지며, Sox4에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산. - 서열 번호 5에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산으로 이루어지며, Smad2에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산.
- 서열 번호 6에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산으로 이루어지며, Smad3에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산.
- (i) 서열 번호 51에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산; 또는
(ii) 서열 번호 52에 개시된 염기 서열로 이루어진 핵산 및 그러한 핵산에 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산
의 두 핵산으로 이루어지며, Oct4에 대해 RNAi 효과를 갖는 이중쇄 핵산. - 환자의 뇌 종양 환부로부터 조직을 수집하여 조직에서 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준이 정상 조직에서의 발현 수준에 비하여 증가될 때 제6항 또는 제7항의 뇌 종양 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 뇌 종양 치료 방법. - 환자의 뇌 종양 환부로부터 조직을 수집하여 조직에서 Sox2 및/또는 Sox4의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
발현 수준을 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌 종양 환자를 위한 치료 방법을 결정하는 스크리닝 방법.
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