KR20110128320A

KR20110128320A - 인간화 항-ｅｇｆｒｉｇｇ1 항체 및 이리노테칸으로의 암 치료

Info

Publication number: KR20110128320A
Application number: KR1020117022747A
Authority: KR
Inventors: 토마스 프리쓰; 에케하르트 뫼쓰너; 자무엘 모저; 파블로 우마나
Original assignee: 로슈 글리카트 아게
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-11-29
Also published as: US20100247533A1; CN102325549A; AR075981A1; EP2413965A1; MX2011009620A; AU2010230346A1; WO2010112413A1; IL213975A0; SG174963A1; CA2754646A1; JP2012518680A; TW201039845A

Abstract

본 발명은 다른 항암 약물 또는 방사선 치료법 등의 추가 제제 또는 치료법과 함께 또는 부재하에 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 제공한다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 중 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸의 조합물을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

Description

인간화 항-ＥＧＦＲＩＧＧ1 항체 및 이리노테칸으로의 암 치료 {TREATMENT OF CANCER WITH A HUMANIZED ANTI-EGFR IGG1 ANTIBODY AND IRINOTECAN}

본 발명은 암 치료에 사용되기 위한 약학적 조성물 및 제제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸 (irinotecan) 에 관한 것이다.

암은 비조절된 성장, 분화 결핍, 및 국소 조직으로의 침투 및 전이 능력을 특징으로 하는 광범위한 세포 악성종양의 총칭이다. 이들 신생물성 악성종양은 다양한 유병률로 신체의 모든 조직 및 기관에 영향을 미친다.

각종 유형의 암 치료를 위해 지난 수 십년간 다수의 치료제가 개발되어 왔다. 가장 흔히 사용된 유형의 항암제에는 하기가 포함된다: 미세관 장애물질 (예, 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴 (vinblastine) 또는 빈크리스틴 (vincristine), 탁산 (taxane), 예컨대 도세탁실 (docetaxel) 또는 파클리탁셀 (paclitaxel), 에포틸론 (epothilone), 예컨대 이속사베필론 (ixabepilone)), 항대사물질 (antimetabolite; 예, 항-폴레이트 (anti-folate), 예컨대 메토트렉세이트 (methotrexate) 또는 아미노프테린 (aminopterin), 항-퓨린, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 항-피리미딘, 예컨대 플루오로우라실 (fluorouracil), 카페시타빈 (capecitabine) 또는 젬시타빈 (gemcitabine)), 토포이소머라아제 억제제 (예, 캄프토테신 (camptothecin), 이리노테칸 (irinotecan) 또는 에토포시드 (etoposide)), DNA 삽입제 (intercalator) (예, 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 악티노마이신 (actinomycin), 블레오마이신 (bleomycin)), 알킬화제 (예, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 클로람부실 (chlorambucil), 카르무스틴 (carmustine), 니무스틴 (nimustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 부술판 (busulfan), 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 트리에틸렌멜라민 (triethylenemelamine), 다카르바진 (dacarbazine)) 및 호르몬 치료 (예, 글루코코르티코이드, 아로마타아제 억제제, 예컨대 타목시펜 (tamoxifene), 항안드로겐, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 유사체, 예컨대 류프롤라이드 (leuprolide)).

이리노테칸 (Campto®) 은 토포이소머라아제 I 억제제이다. 이 물질은 천연 알칼로이드인 캄프토테신의 반합성 유사체이다. 이는 보통 기타 화학치료제와 조합되어 상이한 유형들의 암, 예를 들어 결장 암의 치료에 사용된다.

더욱 최근에는, 암 치료에 있어서 표적화된 치료의 중요성이 커지고 있다. 이러한 물질 (소형 분자 또는 항체와 같은 생치료제 중 하나) 은 특정 표적물, 예컨대 암형성 및 종양 성장을 촉진하는 것으로 공지된 세포 표면 수용체를 방해한다.

상피 성장 인자 수용체 (Epidermal growth factor receptor; EGFR) 및 항-EGFR 항체

인간 상피 성장 인자 수용체 (HER-1 또는 Erb-B1 로도 공지됨, 본원에서는 "EGFR" 로 언급) 는 c-erbB 전암성유전자 (protooncogene) 에 의해 인코딩되는 170 kDa 트랜스멤브레인 수용체이고, 내재적 타이로신 키나아제 활성을 나타낸다 (Modjtahedi, 등, Br. J. Cancer 73 228-235 (1996); Herbst, 및 Shin, Cancer 94 1593-1611 (2002)). SwissProt 데이터베이스 엔트리 번호 P00533 는 EGFR 의 서열을 제공한다. 이에 제한되지 않으나, Swissprot 데이터베이스 엔트리 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4 으로 식별되는 것을 포함하는 EGFR 의 이소형 및 변이체 (예를 들어, 대안적 RNA 전사물, 절단된 버젼, 다형질상체 등) 도 있다. EGFR 은 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자-α (TGf-α), 앰피레굴린 (amphiregulin), 헤파린-결합 EGF (HB-EGF), 베타셀룰린 (betacellulin)및 에피레굴린 (epiregulin) 을 포함하는 리간드에 결합하는 것으로 공지되어 있다 (Herbst, 및 Shin, Cancer 94 1593-1611 (2002); Mendelsohn 및 Baselga, Oncogene 19, 6550-6565 (2000)). EGFR 은 이에 제한되지 않으나, 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스, 혈관형성, 유사분열 및 전이를 제어하는 신호 전달 경로의 활성화를 포함하는 타이로신 키나아제-매개의 신호 전달 경로를 통해 수많은 세포 프로세스를 조절한다 (Atalay 등, Ann Oncology 14, 1346-1363 (2003); Tsao 및 Herbst, Signal 4, 4-9 (2003); Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002); Modjtahedi 등, Br J Cancer 73, 228-235 (1996)).

EGFR 의 과발현이 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선, 및 신장의 암을 포함하여 많은 인간 악성 조건에서 보고되어 있다 (Atalay 등, Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst 및 Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73, 228-235 (1996)). 이러한 많은 조건에서, EGFR 의 과발현은 환자의 불량한 예후와 상호연관 또는 관련있다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002); Modjtahedi 등, Br. J. Cancer 73, 228-235 (1996)). EGFR 은 또한, 악성 세포에서보다, 정상 조직, 특히 피부, 간 및 위장관의 외피 조직 세포에서, 일반적으로 더 낮은 수준이더라도 발현된다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002)).

EGFR 를 표적으로 하고, EGFR 신호전달 경로를 차단하는 다양한 전략들이 보고된 바 있다. 게피티닙 (gefitinib), 엘로티닙 (erlotinib), 카네르티닙 (canertinib)/CI-1033, 펠리티닙 (pelitinib)/EKB-549, 네라티닙 (neratinib)/HKI-272, 라파티닙 (lapatinib)/GW572916 등과 같은 소분자 타이로신 키나아제 억제제는 세포내 타이로신 키나아제 영역에서의 EGFR 의 자가인산화를 차단함으로써, 하류방향 신호전달 사건들을 억제한다 (Tsao 및 Herbst, Signal 4, 4-9(2003)). 한편, 모노클로날 항체는 EGFR 의 세포외 부분을 표적으로 하여, 리간드 결합 차단을 초래하며, 이로써 세포 증식과 같은 하류방향 사건을 억제한다 (Tsao, 및 Herbst, Signal 4, 4-9 (2003)).

시험관 내에서 그러한 차단을 달성하고 마우스 이종이식 모델에서 종양 성장에 영향을 미치는 그의 능력을 평가한 몇 가지 쥐과동물 모노클로날 항체가 제조된 바 있다 (Masui 등, Cancer Res. 46, 5592-5598 (1986); Masui 등, Cancer Res 44, 1002-1007 (1984); Goldstein 등, Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995)). 예를 들어, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) 로, 이는 인간 표피 암종 세포주 A431 에 대항하여 만들어진 것으로, 후두 또는 하인두의 진행된 편평상피암종이 있는 환자의 임상 연구에서 시험되어진, 쥐과동물 항-EGFR 모노클로날 항체이다 (Bier 등, Eur Arch Otohinolaryngol 252, 433-9 (1995)). 또한, EGFR 의 세포외 도메인에 결합하는, 래트 모노클로날 항체 ICR16, ICR62 및 ICR80 가 EGF 및 TGF-α 수용체의 결합을 억제함에 있어 유효한 것을 보였다 (Modjtahedi 등, Int J Cancer 75, 310-316 (1998)). 쥐과동물 모노클로날 항체 (mAb) 425 는, 인간 A431 암종 세포주에 대항해 만들어낸 또 다른 mAb 로, 인간 상피 성장 인자 수용체의 외부 도메인 상의 폴리펩티드 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다 (Murthy 등, Arch BioChem Biophys 252, 549-560 (1987)). 치료에서의 쥐과동물 항체의 이용에 있어서의 잠재적인 문제점은 비-인간 모노클로날 항체가 인간 숙주에 의해 외래 단백질로서 인식될 수 있어; 상기 항체의 반복적인 주입하면, 면역 응답성의 유도가 초래되어, 해로운 과민감성 반응을 야기할 수 있다는 점이다. 쥐과동물 모노클로날 항체에 대해, 이를 종종 인간 항-마우스 항체 또는 "HAMA" 응답성, 또는 인간 항-래트 항체 또는 "HARA" 응답성으로 지칭한다. 추가로, 이러한 "외래" 항체들은 그들의 표적 부위에 도달하기 전에 사실상 중화될 정도로 숙주의 면역 시스템에 의해 공격당할 수 있다. 게다가, 비-인간 모노클로날 항체 (예를 들어, 쥐과동물 모노클로날 항체) 는, 일반적으로 인간 효과기 기능성이 결핍되어 있고, 다시 말해, 이들은 특히 보체 의존적 융해 (lysis) 를 매개하는 것 또는 항체 의존적 세포-매개 독성 또는 Fc-수용체 매개 식세포작용을 통해 인간 표적 세포를 융해시키는 것을 할 수 없다.

이러한 문제점을 피하기 위해, 단지 가변 도메인, 상보성 결정 영역 (CDR) 각각만이 쥐과동물 기원의 것이거나 또는 어떤 부분도 쥐과동물 기원이지 않은 반면에, 항체의 나머지 모든 부분, 특히 Fc 영역은 인간 기원의 것인, 키메라, 인간화 또는 심지어 완전한 인간 항체가 개발된 바 있다.

예를 들어, IMC-C225/세툭시마브 (cetuximab) (Erbitux®; ImClone) 가, 각종 인간 이종이식 모델에서 항종양 효능을 증명하는 것으로 보고된, 키메라 마우스/인간 항-EGFR mAb (마우스 M225 모노클로날 항체를 근간으로 함, 인간 임상 시도에서 HAMA 응답성을 결과로서 제공함) 이다 (Goldstein 등, Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995); Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002)). IMC-C225 의 효능은 EGFR 신호전달 경로에 의해 조절되고, 증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성에 의해서도 조절될 가능성이 있는 세포 사건의 억제를 포함하는, 몇가지 메커니즘에 기인한다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002)). IMC-C225 는 또한 방사요법 및 화학요법과의 조합을 포함하는, 임상 시도에 시용되었다 (Herbst 및 Shin, Cancer 94, 1593-1611 (2002)). 또한, U.S. 특허 제 5,891,996 호 (Mateo de Acosta del Rio 등) 에서, EGFR 에 대한 마우스/인간 키메라 항체, R3 이 논의되어 있다. 인간화, R3-기재 항체, h-R3/니모투주마브 (nimotuzumab) [Mateo 등, Immunotechnology 3, 71-81 (1997); Crombet-Ramos 등, Int J Cancer 101, 567-575 (2002), Boland & Bebb, Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206 (2009)] 이, 암 치료를 위해 Oncoscience (Wedel, Germany) 에 의해 개발되고 있다. U.S. 특허 제 5,558,864 호에서는 쥐과동물 항-EGFR 모노클로날 항체 (mAb) 425 의 키메라 및 인간화 형태, 및 인간화 mAb 425-기재 항체의 생성을 논의한다. EMD72000/마투주마브 (matuzumab) (Bier 등, Cancer Immunol Immunother 46, 167-173 (1998), Kim, Curr Opin Mol Ther 6, 96-103 (2004)) 가 암 치료를 위해 Merck (Darmstadt, Germany) 에 의해 개발되고 있다. Abgenix, Inc. (Fremont, CA) 는 암 치료를 위해 ABX-EGF/파니투마브 (panitumumab) 를 개발하고 있다. ABX-EGF 는 완전 인간 항-EGFR mAb 이다 (Yang 등, Crit Rev Oncol/Hematol 38; 17-23 (2001)). 또 다른 완전 인간 항-EGFR mAb, 2F8/잘루투무마브 (zalutumumab) 가 Genmab Inc. 에 의해 개발된 바 있다 (Princeton, NJ) (Bleeker 등, J Immunol 173, 4699-4707 (2004), Lammerts van Bueren, PNAS 105, 6109-6114 (2008)).

항체 당화

올리고당 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약물동력성, 및 특정 생물학적 활성을 포함하여 치료 당단백질의 효능과 관련된 특성에 유의하게 영향을 줄 수 있다. 상기 특성은 올리고당의 존재 또는 부재뿐만 아니라, 특정 구조에 따라 다를 수 있다. 올리고당 구조와 당단백질 기능 간의 일부 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고당 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터 당단백질의 빠른 소거를 매개하고, 한편, 다른 구조는 항체에 의해 결합되어 바람직하지 않은 면역 반응을 유도할 수 있다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).

암 면역치료에 가장 흔하게 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내 Asn297 에, 보존된 N-연결된 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 복합체 바이안테나리 (biantennary) 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀서 폴리펩티드 백본 (backbone) 과의 광범위한 접촉을 형성하며, 항체에 있어서, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능을 매개하기 위해서는 상기 올리고당의 존재가 필수적이다 (Lifely, 등, Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis 등, Immunol Rev 163, 59-16 (1998); Wright 및 Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)).

상술된 항-EFGR 항체와 같은 모노클로날 항체 (예, 세툭시마브, 니모투주마브, 파니투무마브) 의 세포-매개 효과기 기능은 문헌 [Umana 등, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)] 및 U.S. 특허 제 6,602,684 (WO 99/54342) 호에 기술된 바와 같이 그의 올리고당 성분 조작에 의해 증강될 수 있다. Umana 등은, 이등분 올리고당의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라아제인 β(1,4)-N-다세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III ("GnTIII") 의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 과발현이 이들 세포에서 생성된 항체의 시험관내 ADCC 활성을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여줬다. Asn297 탄수화물 조성의 변경 또는 그의 제거는 또한 항체 Fc-도메인의 FcγR 및 CIq 단백질의 결합에 영향을 준다 (Umana 등, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Davies 등, Biotechnol Bioeng 74, 288-294 (2001); Mimura 등, J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001); Radaev 등, J Biol Chem 276, 16478-16483 (2001); Shields 등, J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001); Shields 등, J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Simmons 등, J Immunol Methods 263, 133-147 (2002)).

항-신생물성 약물은, 이상적으로는, 그의 비(非)악성 세포를 향한 독성에 대한 광범위한 치료 지수로 암 세포를 선별하여 사멸시킬 것이다. 이는 또한 약물에 지속적으로 노출된 후에도 악성 세포에 대한 그의 효능을 보유할 것이다. 불행히도, 현재 항-암 치료법의 어떤 것도 이러한 이상적인 프로파일을 갖추고 있지 않다. 그 대신에, 대부분 매우 좁은 치료 지수를 지닌다. 게다가, 약간 준치사 농도의 항-신생물제에 노출된 암 세포에서는, 그 제제에 대한 내성이 매우 자주 발달될 것이고, 몇몇의 다른 항신생물제에 대한 교차-내성도 또한 꽤 자주 발달될 것이다.

따라서, 신생물 및 기타 증식성 장애에 대한 보다 효과적인 치료법이 요구된다. 기존의 약물의 치료 효능을 강화시키는 전략에는, 이의 투여 계획 변경 및 기타 항암제 또는 생화학 조절제와의 조합이 수반된다. 조합 치료는 치료에 적절한 투여량으로 하는 각 제제를 단독으로 이용하는 것과 비교해 효능이 더 크고 부작용을 감소시킬 수 있는 방법으로서 익히 공지되어 있다. 일부 경우, 약물 조합물의 효능은 부가적 (조합물의 효능은 각각의 약물 단독 효능들의 합계와 대략적으로 동일함) 이나, 나머지 경우에서는, 효능은 시너지적 (조합물의 효능이 단독으로 제공된 각각의 약물의 효능들의 합계보다 더 큼) 이다. 예를 들어, 5-플루오로우라실과 류코보린 (leucovorin) 의 조합의 경우, 옥살리플라틴은 결장직장암의 일선의 치료법으로서 25-40% 의 응답률을 보인다 (Raymond, E. 등, Semin Oncol 25(2 Suppl. 5), 4-12 (1998)).

마찬가지로, 암 세포의 표면에 대해 특이적으로 표적하는 항체들의 화학치료제와의 조합은 단일 제제로의 치료와 비교했을 때 항암 효능을 증진시킬 것이다.

본 발명의 기술

암 진행에 관여하는 암 세포의 표면 수용체를 표적하는 항체를 화학치료제와 조합하는 것의 커다란 치료적 잠재력을 인식하여, 본 발명은 암 치료에 있어서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 제공한다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 내 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 포함하는 약학적 조성물, 특히 암 치료에 사용되기 위한 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 나아가 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 필요로하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 치료적 유효량의 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물은, 환자에게, 동시 또는 순차적으로, 동일 또는 상이한 제형물 내에서, 기타 항암 약물 또는 방사선 요법과 같은 추가의 제제 또는 치료법과 함께 또는 부재하에 투여되는데 사용된다.

본 발명에 유용한 바람직한 인간화 항-EGFR IgG1 항체는 본원에서 그 전문이 참조 인용되고 있는 WO 2006/082515 및 WO 2008/017963 에 기술되어 있으며, 이에는 래트 모노클로날 항체 ICR62 의 결합 특이성을 갖는 키메라 항체인 점, 및 이의 효과기 기능이 변경된 당화에 의해 증강된다는 점을 특징으로 하는 항체가 포함된다.

바람직한 항-EGFR 항체는, 이들이 래트 ICR62 항체의 적어도 하나의 (즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의) 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 적어도 상기 CDR 에 대한 특이성-결정 잔기를 함유하고 이종 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 포함하는 그의 변이체 또는 절단된 (truncated) 형태를 포함하는 것을 특징으로 한다. "특이성-결정 잔기" 란, 항원과의 상호작용에 직접 관여하는 잔기를 의미한다. 구체적으로, 바람직한 항-EGFR 항체는 (a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, 및 SEQ ID NO:13; (b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, 및 SEQ ID NO:30; 및 (c) 중쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO:31 을 포함한다. 바람직한 항-EGFR 항체는 추가로 하기를 포함한다: (a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열: SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:33; (b) 경쇄 CDR2 서열 SEQ ID NO:34; 및 (c) 경쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO:35.

더욱 바람직한 항-EGFR 항체는, 이들이 래트 ICR62 항체의 적어도 3 개의 CDR, 또는 적어도 상기 CDR 에 대한 특이성 결정 잔기를 포함하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 유용한 가장 바람직한 항-EGRF 항체는 하기를 포함한다:

a) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:1 의 CDR1, SEQ ID NO:16 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:31 의 CDR3, 및

b) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:33 의 CDR1, SEQ ID NO:34 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:35 의 CDR3.

본 발명에 유용한 바람직한 항-EGFR 항체의 가능한 CDR 서열은 표 1 (중쇄 CDR) 및 표 2 (경쇄 CDR) 에 요약되어 있다.

표 1: 바람직한 항-EGFR 항체의 중쇄 CDR 아미노산 서열*

표 2. 바람직한 항-EGFR 항체의 경쇄 CDR 아미노산 서열.*

* "Kabat" 은 Kabat 등의 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda (1983) 에 의해 정의된 CDR 을 지칭하고,

"Chothia" 는 Chothia 등의 J Mol Biol 196, 901-917 (1987) 에 의해 정의된 CDR 을 지칭하고,

"AbM" 은 Oxford Molecular 의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR 을 지칭한다.

본 발명에 유용한 바람직한 항-EGFR 항체는, 인간화 면역글로불린으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 골격부 (framework) 서열을 갖는다.

본 발명에 유용한 기타 바람직한 항-EGFR 항체는, SEQ ID NO:36 에 따른 래트 ICR62 항체의 중쇄 가변 도메인 (V_H) 또는 이의 변이체; 및 비(非)쥐과동물 폴리펩티드를 포함한다. 추가로, 바람직한 항-EGFR 항체는 SEQ ID NO:37 에 따른 래트 ICR62 항체의 경쇄 가변 도메인 (V_L), 또는 그의 변이체; 및 비(非)쥐과동물 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에 유용한 더욱 바람직한 항-EGFR 항체는 SEQ ID NO:38 의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:39 의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

바람직한 항-EGFR 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 표 3 에 나타낸다. 본 발명에 유용한 바람직한 항-EGFR 항체는 보존성 아미노산 치환을 갖는 표 3 에 나타낸 아미노산 서열 또는 표 3 에 나타낸 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

표 3. 바람직한 항-EGFR 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열.

본 발명에서 유용한 바람직한 항-EGFR 항체는 영장류화 항체, 또는 더욱 바람직하게는 인간화 항체이다.

바람직하게, 본 발명에 유용한 항-EGFR 항체는 인간 Fc 영역을 포함한다. 더욱 바람직하게 인간 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO:40 로 나타낸 Ig 감마-1 이고, 즉 항체는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.

인간 중쇄 불변 영역 Ig 감마-1 아미노산 서열 (SEQ ID NO:40):

그러나, 인간 Fc 영역의 변이체 및 이소형태도 또한 고려된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적절한 변이체 Fc 영역은 U.S. 특허 제 6,737,056 호 내지 Presta 에서 교시된 방법 (하나 이상의 아미노산 개질로 인한 효과기 기능이 변경된 Fc 영역 변이체); 또는 U.S. 특허 출원 제 60/439,498 호; 제 60/456,041 호; 제 60/514,549 호; 또는 WO 2004/063351 에서 교시된 방법 (아미노산 개질로 인한 결합 친화도가 증가된 변이체 Fc 영역); 또는 U.S. 특허 출원 제 10/672,280 호 또는 WO 2004/099249 에서 교시된 방법 (아미노산 개질로 인한 FcγR 에 대한 결합이 변경된 Fc 변이체) 에 따라 제조될 수 있는데, 상기 문헌 각각의 내용은 본원에서 그 전문이 참조 인용된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 유용한 항-EGFR 항체는 Fc 영역에서 변경된 올리고당 구조를 갖도록 당조작 (glycoengineering) 되어져 있다.

구체적으로, 바람직한 항-EGFR 항체는 비(非)당조작 항체와 비교시 Fc 영역에서 증가된 비율의 비(非)푸코실화 올리고당을 갖는다. 바람직하게, 비푸코실화 올리고당의 퍼센트는 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 50-70%, 가장 바람직하게 적어도 75% 이다. 상기 퍼센트의 비푸코실화 올리고당을 갖는 본 발명에 유용한 항-EGFR 항체는, 부분 푸코실화된 것으로 추가로 칭해진다. 비푸코실화 올리고당은 하이브리드 또는 복합체 유형일 수 있다.

바람직한 항-EGFR 항체는 또한 Fc 영역에서 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 가질 수 있다. 바람직하게, 항체의 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 퍼센트는 총 올리고당의 적어도 50%, 더욱 바람직하게, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게 적어도 90-95% 이다.

특히 바람직한 항-EGFR 항체는 증가된 비율의 Fc 영역에서 이등분된, 비푸실화 올리고당을 갖는다. 이등분된, 비푸실화 올리고당은 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 구체적으로, 항체의 Fc 영역에서 적어도 15%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 25%, 더욱 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 35% 의 올리고당이 이등분된, 비푸코실화되어진 항-EGFR 항체가 바람직하다.

바람직한 항-EGFR 항체는 또한 이것이 증가된 효과기 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖도록 당조작되어진 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 증가된 효과기 기능이란 하기 중 하나 이상이다: 증가된 Fc-매개 세포성 (cellular) 세포독성 (증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 포함), 증가된 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제시 세포에 의한 증가된 면역-복합체-매개 항원 흡수, 자연 살해 (NK) 세포와의 증가된 결합, 대식세포와의 증가된 결합, 단핵구와의 증가된 결합, 다형핵 세포와의 증가된 결합, 아폽토시스를 유도하는 증가된 직접 신호전달, 표적-결합 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍 (priming). 증가된 Fc 수용체 결합 친화도란, 바람직하게 Fcν 활성화 수용체에 대한 증가된 결합, 가장 바람직하게 FcνRIIIa 에 대한 증가된 결합이다.

본 발명에 유용한 가장 바람직한 항-EGFR 항체는 SEQ ID NO:38 의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:39 의 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 인간화된 것이며, SEQ ID NO:40 에 나타낸 바와 같은 인간 중쇄 불변 영역 Ig 감마-1 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 항체는 "GlycArt-mAb" 로 칭해진다. GlycArt-mAb 는 부분적으로 푸코실화될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있으며, 다시 말해 상기에 기술된 바와 같이 비(非)당조작된 항체와 비교시 Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화 올리고당을 갖도록 당조작될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.

모노클로날 항체 및 항체 분절의 제조 및 단리 기술, 비(非)인간 항체의 인간화 방법, 및 항체의 재조합 생산 및 정제 절차가 당업계에 익히 공지되어 있다. 관련 문헌들을 포함해, 이러한 기술의 기재가 예를 들어 WO 2006/082515 에 제공되어 있다.

몇몇의 메카니즘이 EGFR 과 같은 성장 인자 수용체에 대한 항체의 치료 효능에 관여된다는 점이 공지되어 있다. 이들에는 수용체에 대한 리간드 (예, EGF, TGF-α 등) 결합의 차단 및 후속하여 신호전달 경로, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존적 세포독성 (CDC) 의 활성화 및 성장 정지, 아폽토시스 또는 말단 분화의 유도가 포함된다.

본 발명에 유용한 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 치료 효능은, WO 2006/082515 에 기술된 바와 같은 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 (GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 발현하는 숙주 세포에서 상기 항체를 제조함으로써 그 결과 항체가 Fc 영역에서 감소된 비율의 푸코실화 올리고당을 갖게 되어 ("부분 푸코실화" 항체로 지칭됨) 강화될 수 있다. 바람직한 측면에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII 의 촉매 도메인 및 이종 골지 (Golgi) 체류 폴리펩티드의 골지 위치화 도메인, 예컨대 만노시다아제 II, 만노시다아제 I, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 I (GnTI), β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 II (GnTII) 또는 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라아제, 바람직하게 만노시다아제 II 또는 GnTI 의 골지 위치화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 상기 융합 폴리펩티드의 제조 방법 및 증가된 효과기 기능을 갖는 항체를 제조하도록 상기 융합 폴리펩티드를 이용하는 방법은 U.S. 가특허 출원 60/495,142 및 U.S. 특허 출원 공보 2004/0241817 A1 에 개시되어 있으며, 이들 문헌 각각의 전문은 본원에 명백히 삽입되어 있다.

부분 푸코실화 인간화 항-EGFR IgG1 항체는, 올리고당 개질의 결과로서 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과기 기능을 보인다. 바람직하게, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는, FcγRIIIa 수용체와 같은 Fcγ 활성화 수용체와의 증가된 결합이다. 증가된 효과기 기능은 바람직하게 하기 중 하나 이상에서의 증가이다: 증가된 Fc-매개 세포의 세포독성 (증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 포함), 증가된 항체-의존적 세포 포식작용 (ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제시 세포에 의한 증가된 면역-복합체-매개 항원 흡수, NK 세포와의 증가된 결합, 대식세포와의 증가된 결합, 다형핵 세포 (PMN) 와의 증가된 결합, 단핵구와의 증가된 결합, 표적-결합 항체의 증가된 가교결합, 아폽토시스를 유도하는 증가된 직접 신호전달, 증가된 수지상 세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍.

부분 푸코실화 항체는 이 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 발현하는 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 상기 숙주 세포 내 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 제조는, 하기 단계를 포함한다: (a) 항체 제조를 허용하는 조건 하 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하는 단계, 이때 상기 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 항체의 Fc 영역에서 올리고당을 개질하기에 충분한 양으로 발현됨; 및 (b) 상기 항체를 단리하는 단계.

각종 숙주 세포 및 발현 벡터 시스템이 항체 생성에 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 익히 공지되어 있다. 본 발명에 유용한 인간화 EGFR IgG1 항체를 발현하기 위한 적합한 숙주 세포에는, 배양된 세포, 예를 들어 배양된 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK293-EBNA 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 대장균 (E. coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포가 포함되는데, 이는 오직 몇몇만 지칭한 것으로 또한 유전자이식 (transgenic) 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함된다. 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 생성에 대한 상세한 정보는 WO 2006/082515 및 이 문헌에서 인용된 참조문에서 찾을 수 있다.

본 발명은 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 상기된 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 제공한다. 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은 함께 또는 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로, 상동 또는 상이한 제형물 내에서, 동일한 또는 상이한 경로를 통해, 추가의 치료제 또는 치료법, 예컨대 기타 항암제 또는 방사선 요법과 함께 또는 이의 부재하에서 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서, 상기에 기재된 인간화 항-EGFR IgG1 항체, 및 이리노테칸, 약학적으로 허용가능한 담체 및 임의로는 하나 이상의 기타 치료적 활성 성분 또는 보조제 (adjuvant) 를 포함하는 특히 암 치료에 사용되기 위한 약학적 조성물을 포함한다. 기타 치료제에는 세포독성제, 화학치료제 또는 항암제 또는 이러한 제제의 효과를 강화하는 제제가 포함될 수 있다.

본원 하기의 실시예에 나타낸 데이타는 이리노테칸과 인간화 항-EGFR IgG1 항체와의 공동투여가 비소세포폐암 (Non Small Cell Lung Cancer; NSCLC) 과 같은 진행암 치료에 효과적이라는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명은 치료적 유효량의, 상기에서 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물을, 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다. 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물 (이하 "활성제"로 지칭함) 의 치료적 유효량은 활성제 각각의 치료적 유효량일 수 있다. 다르게는, 암 치료에 의해 야기되는 부작용을 감소시키기 위해서는, 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물의 치료적 유효량이, 이들을 단독으로 사용시에는 이들 활성제 중 하나가 또는 양자 모두가 치료함량 이하의 (sub-therapeutic) 함량일 수 있으나, 조합시에는 종양 성장을 억제하는데 효과적이고, 부가적, 또는 초부가적 또는 시너지적 항종양 효과를 나타내는데 효과적인 두 활성제들의 함량일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 암 치료 방법에서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은 함께 또는 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로, 상동 또는 상이한 제형물 내에서, 상동 또는 상이한 경로를 통해, 기타 항암 약물 또는 방사선 치료법과 같은 추가의 제제 또는 치료법과 함께 또는 이의 부재하에서 환자에게 투여하는데 사용된다.

본 발명은, 치료적 유효량의 상기에 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물이 사용되고, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 환자에게 함께 또는 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로, 상동 또는 상이한 제형물 내에서, 상동 또는 상이한 경로를 통해, 추가의 제제 또는 치료법과 함께 또는 부재하에서 투여하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제 제조 방법을 추가로 제공한다. 상기에 기술된 바와 같이, 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물의 치료적 유효량은, 활성제 각각의 치료적 유효량일 수 있거나, 또는 단독으로 사용할 경우에는 이들 활성제 중 하나 또는 양자 모두가 치료함량 이하의 함량일 수 있으나 조합시 종양 성장을 억제하는데 효과적이며, 부가 또는 초부가적 또는 시너지적 항종양 효과를 나타내는데 효과적인 두 활성제의 함량일 수 있다.

본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸 양자 모두를 포함하는 단일의 용기를 포함하는 암 치료에 유용한 키트를 추가로 제공한다. 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체를 포함하는 제 1 용기 및 이리노테칸을 포함하는 제 2 용기를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 바람직한 측면에서, 키트 용기는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 별도의 추가 용기에 저장되는 것이 바람직한 멸균 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 암 치료 방법으로서 조합 치료법의 사용을 지시하는 인쇄된 지시서를 포함하는 첨부 지침서 (package insert) 를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 암 치료에 사용된다. 이에 따라, 필요로 하는 대상자는 암, 또는 전암성 병태 또는 병터의 치료를 필요로 하는 인간, 말과, 돼지과, 소과, 마우스, 래트, 개과, 고양이과, 새과 또는 기타 온혈 동물, 바람직하게는 인간이다. 암은 바람직하게 상술된 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물의 투여에 의해 부분적으로 또는 완전히 치료가능한 임의의 암, 즉 EGFR 발현과 관련있는 장애, 특히 EGFR 이 발현되는 세포 증식 장애, 더욱 특히 EGFR 이 비정상적으로 발현되는 (예, 과발현되는) 세포 증식 장애이다. 암은 예를 들어, 폐암, 비소세포폐암 (NSCLC), 세기관지폐포암종, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 편평세포암종, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 결장직장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상샘 암, 부갑상샘암, 부신 암, 연조직 육종, 요도 암, 음경 암, 전립선암, 방광 암, 신장 또는 요관의 암, 콩팥세포암종, 콩팥 깔때기 암종, 중피종, 간세포암, 담낭 암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 중추신경계 (CNS) 의 신생물, 척추 종양, 뇌줄기신경아교종, 다형성아교모세포종, 별아교세포종, 신경초종, 뇌질피복 세포증, 속질모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체샘종, 상기 암 중 임의의 것의 난치성 버젼 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 또한 암 전이도 포함된다. 전암성 병태 또는 병터에는 예를 들어 하기로 이루어진 군이 포함된다: 구강 백반증, 광선각화증 (일광각화증), 결장 또는 직장의 전암성 폴립, 위 상피 형성이상, 샘종 형성이상, 유전성 비폴립 결장암 증후군 (HNPCC), 바렛 식도, 방광 형성이상, 및 전암성 자궁경부 병태. 바람직하게, 암은 폐암 또는 결장직장암, 및 가장 바람직하게 비소 세포 폐암 (NSCLC) 이다.

본 발명의 일부 측면에서, 상기에서 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체, 및 이리노테칸은 하나 이상의 항암제와 조합되어 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 항암제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 미세관 장애물질 (예, 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴 또는 빈크리스틴, 탁산, 예컨대 도세탁실 또는 파클리탁셀, 에포틸론, 예컨대 이속사베필론), 항대사물질 (예, 항-폴레이트, 예컨대 메토트렉세이트 또는 아미노프테린, 항-퓨린, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린 또는 6-티오구아닌, 항-피리미딘, 예컨대 5-플루오로우라실, 카페시타빈 또는 젬시타빈, 히드록시우레아), 토포이소머라아제 억제제 (예, 캄프토테신, 토포테칸, 또는 포도필로톡신, 예컨대 에토포시드), DNA 삽입제 (예, 독소루비신, 다우노루비신, 악티노마이신, 블레오마이신), 알킬화제 (예, 시클로포스파미드, 클로람부실, 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴 또는 니무스틴, 스트렙토조신, 부술판, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 트리에틸렌멜라민, 다카르바진), 호르몬 치료 (예, 글루코코르티코이드, 아로마타아제 억제제, 예컨대 타목시펜, 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 유사체, 예컨대 류프롤라이드), 항생물질, 키나아제 억제제 (예, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙 (imatinib)), 수용체 아고니스트, 효소 억제제 (예, 사이클린-의존적 키나아제 (CDK) 억제제), 아미노산-결핍 효소 (예, 아스파라기나아제), 류코보린, 레티노이드, 종양 세포 아폽토시스의 활성화제, 및 항혈관형성제.

본 발명에 유용한 인간화 항-EGFR IgG1 항체는, 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 독소 (예, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원, 또는 이의 분절의 효소 활성 독소), 방사성 동위원소에, 또는 세포독성제의 프로드러그에 콘쥬게이트될 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 당업계에 공지된 임의의 효과적인 방식으로, 예컨대 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 림프내, 근육내, 관절내, 피하, 비강내, 안구내, 질, 직장, 또는 진피내 경로를 통해, 또는 종양에 직접 주입함으로써 투여될 수 있다. 투여 경로의 선택은 예를 들어 공표된 임상 연구 결과를 기준으로 처방 의사의 의학적 판단 및 치료될 암 종류에 좌우된다. 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은 상동 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게, 본원에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체는 비경구 투여로 사용되고, 본 발명에서 사용되는 이리노테칸은 비경구 또는 경구 투여로 사용된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 본원에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은, 동일한 경로로 투여되는 경우에, 비경구, 가장 바람직하게는 정맥내 투여된다. 본원에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 제어된 방출 수단 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기에서 기술된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물은 치료적 유효량으로 투여되어야만 하는데, 이는 활성제들 각각이 치료적 유효량으로 제공되는 것을 의미하거나, 또는 두 활성제의 함량이 이들을 단독으로 사용시 치료함량 이하일 수 있으나, 조합시 종양 성장을 억제하는데 효과적이도록 부가적 또는 초부가적 또는 시너지적 항종양 효과를 나타내는데 효과적인 것을 의미한다.

본 발명의 조합물의 화합물에 대한 투여량 수준은 대략적으로 하기에 기술된 바와 같거나 또는 이들 화합물에 대한 당업계에 기술된 바와 같을 것이다. 본 발명에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 가장 효과적인 투여 방식 및 투여 계획 (dosage regimen) 은 질병의 중증도 및 질병 상태, 환자의 건강이력, 나이, 체중, 성별, 치료에 대한 응답성 및 음식, 투여 시간 및 경로, 배설 빈도, 기타 약물과의 조합, 치료 의사의 소견을 포함한 여러 인자에 좌우된다. 따라서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸, 또는 조성물의 투여량은, 각 환자에 맞추어 져야 한다. 그럼에도 불구하고, 본원에서 사용되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 치료적 유효량은 일반적으로 약 0.01 내지 약 2000 mg/kg 범위일 것이다. 전형적으로, 1 회 복용량 당 비경구 투여된 항체의 치료적 유효량은 1 일 당 환자 체중 1 kg 당 약 1 내지 25 mg 의 범위일 것이다. 한 측면에서, 투여량은 약 1.0 mg/kg 내지 약 25.0 mg/kg 범위이다. 보다 구체적인 측면에서, 투여량은 약 1.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 범위이다. 기타 측면에서, 투여량은 약 1.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg, 또는 약 4.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 이다. 본 발명의 투여량도 또한 이들 범위 내 임의의 투여량일 수 있으며, 이에는 이에 제한되는 것은 아니나 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, 또는 15.0 mg/kg 이 포함된다. 본 발명에서 사용된 이리노테칸의 치료적 유효량은 일반적으로 약 0.1 내지 약 2000 mg/kg 일 것이다. 전형적으로 복용량 당 비경구 투여되는 이리노테칸의 치료적 유효량은 1 일 당 환자 체중 1 kg 당 약 1 내지 25 mg 범위 또는 약 10 내지 약 1000 mg/m² 범위일 것이다. 더욱 구체적인 측면에서, 이리노테칸의 유효량은 약 1 내지 약 10 mg/kg 범위, 또는 약 20 내지 약 500 mg/m² 범위이다. 본 발명의 투여량은 또한 이들 범위 내 임의의 투여량일 수도 있고, 이에는 이에 제한되는 것은 아니나 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 또는 이에 제한되는 것은 아니나 25 mg/m², 50 mg/m², 75 mg/m², 100 mg/m², 125 mg/m², 150 mg/m², 175 mg/m², 200 mg/m², 225 mg/m², 250 mg/m², 275 mg/m², 300 mg/m², 325 mg/m², 350 mg/m², 375 mg/m², 400 mg/m², 425 mg/m², 450 mg/m², 475 mg/m², 500 mg/m² 이 포함된다.

그러나, 상기에서 주목되는 바와 같이, 상기 제안된 양의 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은 치료학적 측면으로 매우 신중해야 한다. 적절한 투여량을 선택하고 계확하는데 있어서 주요한 인자는 상기에 지시된 바와 같이 수득된 결과에 있다. 예를 들어, 진행중이고 급성인 질병 치료에서 비교적으로 고 투여량이 처음에 요구될 수 있다. 가장 효과적인 결과를 수득하기 위해서는, 질병 또는 장애에 따라, 안타고니스트가 질병 또는 장애의 첫 징후, 진단때, 출현 또는 발생 때에 가능한한 가깝게, 또는 질병 또는 장애의 차도가 있는 동안 투여된다.

종양 치료에 사용되는 항-EGFR 항체의 경우, 최적의 치료 결과가 일반적으로는 표적 세포 상 EGF 수용체를 완전히 포화시키는데 충분한 투여량으로 달성되어졌다. 포화 달성에 필요한 투여량은 종양 세포 당 발현된 EGF 수용체의 개수 (상이한 종양 유형들간에 유의하게 다양할 수 있음)에 좌우될 것이다. 30 nM 만큼 낮은 혈청 농도가 일부 종양을 치료하는데 있어서 유효한 바 있으나, 다른 종양에서 최적의 치료 효과를 달성하는데 있어서는 100 nM 초과의 농도가 필요할 수 있다. 제공된 종양에 대한 포화를 달성하는데 필수적인 투여량은 방사면역검정 또는 면역침전에 의해 시험관 내 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 투여량은, 일부 경우 예측 바이오마커 (biomarker) 의 사용에 의해 측정될 수 있다. 예측 바이오마커는 종양 관련 유전자 또는 단백질, 또는 종양-관련 신호전달 경로의 세포 성분의 발현 및/또는 활성화 패턴을 결정 (즉, 관찰 및/또는 정량화) 하는데 사용되는 분자 마커이다. 종양 조직 내 표적화된 치료의 생물학적 효과 및 이러한 효과와 임상 반응과의 상호작용을 해명하는 것은 종양에서 지배적인 성장 및 생존 경로를 규명하는데 도움을 주어서, 잘 반응하는 물질의 프로파일을 구축하고, 반대로 말하면 내성을 극복하게 하는 전략을 디자인하는 근본원리를 제공한다. 예를 들어, 항-EGFR 치료에 대한 바이오마커는 Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 증식 장애를 초래하는 EGFR 하위 신호전달 경로에 있는 분자를 포함할 수 있다 (Mitchell, Nature Biotech. 22, 363-364 (2004); Becker, Nat Biotech 22, 15-18 (2004); Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)). 항-EGFR 치료에 대한 바이오마커는 또한 EGFR, ErbB-2 (HER2/neu), 및 ErbB-3 (HER3) 와 같은 성장 인자 수용체를 포함할 수 있고, 항-EGFR 치료에 대한 환자의 반응의 양성 또는 음성 예측자일 수 있다. 예를 들어, 성장 인자 수용체 ErbB-3 (HER3) 을 항-EGFR 항체 ABX-EGF 에 대한 음성 예측 바이오마커로 결정하였다 (미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132097 A1).

예측 바이오마커는 실시간 역전사 PCR 또는 마이크로어레이-기재 전사 프로파일링에 의한 RNA 의 검출 및/또는 정량화, 면역조직화학법, 흐름세포측정법, 면역형광법, 캡처-및-검출 어세이, 웨스턴 블롯, ELISA, 역상 어세이, 및/또는 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132097 A1 에서 나타낸 어세이에 의한 단백질의 검출 및/또는 정량화를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 익히 공지된 어세이에 의해 측정될 수 있다. 항-EGFR 치료의 예측 바이오마커는 그 전체가 본원에 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0190689A1 에 나타낸 기술에 따라 규명될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 암과 같은 EGFR-관련 장애에 대한 예측 바이오마커의 발현 및/또는 활성화를 검출하는 하나 또는 다수의 시약으로 치료 이전에 인간 대상체로부터의 샘플을 어세이함으로써 치료가 필요한 인간 개체에 항-EGFR 치료에 대한 반응을 예측하고 ; 하나 이상의 예측 바이오마커의 발현 및/또는 활성화 패턴을 측정하고, 여기서, 패턴은 항-EGFR 치료에 대한 인간 대상체의 반응을 예측하며 ; 그리고, 치료적 유효량의 인간화 항-EGFR IgG1 항체를 포함하는 조성물을, 항-EGFR 치료에 대해 양성 반응하는 것으로 예측된 인간 대상체에 투여하는 것을 포함하는, EGFR-관여 장애의 치료 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항-EGFR 치료에 양성 반응하는 것으로 예측된 인간 대상체"는 항-EGFR 이 EGFR-관련 장애에 대해 측정가능한 효과 (예를 들어, 종양 퇴화/축소) 를 가질 것이고, 항-EGFR 치료의 이점이 부작용 (예를 들어, 독성) 에 의해 과중되지 않을 대상체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 샘플은 유방, 폐, 위장관로, 피부, 경부, 난소, 전립선, 신장, 뇌, 두경부, 또는 임의의 다른 생체 기관 또는 조직에서 제거된, 임의의 기원의 단일 세포, 조직 또는 생검 샘플을 포함하여, 하나 이상의 세포를 포함하는 개체, 특히 인간의 생물학적 샘플을 의미하며, 이에는 스미어 (smear), 객혈, 분비물, 뇌척수액, 담즙, 혈액, 림프액, 소변 및 배설물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸의 "공동투여", "공동투여하다", "조합물을 투여하다" 및 "조합하다" 란, 두 활성제들의 별도로 또는 함께하는 임의의 투여를 지칭하며, 여기서 두 활성제는 조합 치료의 효익을 수득하도록 설계된 적절한 투여 계획의 일부로서 투여된다. 따라서, 두 활성제는 동일한 약학적 조성물의 일부로서 또는 별도의 약학적 조성물 내에서 투여될 수 있다. 이리노테칸은 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 투여 이전, 동시 또는 이후에 투여될 수 있거나, 또는 이의 일부 조합물로 투여될 수 있다. 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 반복되는 간격을 두고, 예를 들어 표준 치료 과정 동안에 환자에게 투여되는 경우에, 이리노테칸이 인간화 항-EGFR IgG1 항체 각각의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있거나, 또는 인간화 항-EGFR IgG1 항체와의 일부 조합물로 투여될 수 있거나 또는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 치료에 대해 상이한 간격으로, 또는 인간화 항-EGFR IgG1 항체와의 치료 과정 이전에, 과정 동안 임의의 시간 때에, 후속해서 단일 투여로 투여될 수 있다.

인간화 항-EGFR IgG1 항체는 예를 들어 WO 2006/082515 에 개시된 바와 같은 당업계에 공지된 바와 같이 치료중인 환자의 암에 (효능 및 안전성 측면 양자 모두에서) 가장 유효한 치료법을 제공하는 투여 계획으로 환자에게 투여될 것이다

상기에서 논의된 바와 같이, 투여되는 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 양 및 항체 투여 타이밍은 치료받는 환자의 유형 (종, 성별, 연령, 체중, 등) 및 병태, 치료될 질병 또는 병태의 중증도, 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 예를 들어, 인간화 항-EGFR IgG1 항체는 1 일 당 또는 1 주일 당 단일 또는 분할 투여로, 또는 연속 주입에 의해 체중 1 kg 당 0.1 내지 100 mg 의 범위의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서는, 상술된 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 적절할 수 있는 반면에, 다른 경우에서는 더 큰 투여량이 임의의 해로운 부작용 없이 여전히 활용될 수 있으나, 단 이러한 더 큰 투여량은 1 일 동안 투여를 위해 먼저 수 가지의 소량의 투여량으로 나뉘어진다. 투여된 이리노테칸의 함량 및 이리노테칸 투여의 타이밍에 대해서도 동일하게 적용된다.

본 발명에 따라 사용된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸은 상동 또는 상이한 경로를 통해 광범위한 상이한 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸 양자 모두뿐 아니라 본 발명에 따른 약학적 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나 액체 용액 또는 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 당의정, 분말, 연고, 크림, 좌제 또는 임플란트를 포함하는 여러 투여 형태일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및/또는 이리노테칸 또는 본 발명에 따른 조성물은 또한 예컨대 액적형성 기술 또는 계면 중합으로써, 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 콜로이드성 약물전달계 (예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼 내의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐로 들어갈 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Mack Pub. Co. (1980)] 에 개시되어 있다. 바람직한 투여 형태는 투여 방식 및 치료 적용 방식에 따른다. 전형적으로 본 발명에서 사용되는 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 주입용 또는 투입용 용액 중에 투여될 것이다. 주입용 또는 투입용 제제는 멸균되어야 하는데, 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 완수된다.

예를 들어 막-제어된 서방성 시스템 또는 중합-기재 매트릭스 시스템과 같은 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 매트릭스의 예에는 하기가 포함된다: 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 특허 제 3,773,919 호), L-글루타민산 및 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비(非)분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT^TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산.

본 발명에서 사용된 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학 업계에서 익히 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 단위 투여 형태로 통상 제공되거나 또는 벌크로서 제공될 수 있다. 상기 단위 투여 형태는 예를 들어 경구 투여에 적합할 수 있고 (캡슐, 카세제, 정제 등) 각각은 소정량의 활성성분(들)을 포함한다.

본 발명에서 사용된 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸뿐 아니라 본 발명에 따른 약학적 조성물은 알맞은 의학 현장에 따른 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸뿐 아니라 본 발명에 따른 조성물의 최적의 제형물은 치료될 특정 질병 또는 장애, 치료될 특정 포유 동물, 개개 환자의 임상 상태, 질병 또는 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 경로 (예, 비경구, 경구, 국소, 직장), 투여 계획 및 의학 실행자에게 공지된 기타 인자에 좌우될 것이다.

모든 제형물은 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 생물학적 활성의 변형 및/또는 분해 및 손실을 피하고/피하거나 이리노테칸의 생물학적 활성 및 완결성을 보존하기 위해 선별되어야 한다.

실제로, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및/또는 이리노테칸은 활성 성분으로서 통상의 약학 화합 기술에 따라 약학적 담체와 긴밀한 혼합물로 조합될 수 있다. 담체는 투여에 바람직한 제제 형태 (예를 들면 비경구 (정맥내 포함)) 에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 활용된 약학적 담체는 예를 들어, 고체, 액체 또는 기체일 수 있다. 고체 담체의 예에는 락토오스, 테라알바, 수크로오스, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 및 스테아르산이 포함된다. 액체 담체의 예는 당 시럽, 피넛 오일, 올리브 오일 및 물이다. 기체 담체의 예에는 이산화탄소 및 질소가 포함된다. 담체 성분에 부가하여, 약학적 제형물은 또한 적절한 경우 다른 성분들, 예컨대 버퍼, 희석제, 용매, 안정화제, 항산화제, 제형물에 등장성을 부여하는 제제, 풍미제, 결합제, 표면활성제, 증점제, 윤활제, 보존제, 습윤제, 에멀젼화제, 분산제, 정제 등의 분해제를 포함할 수도 있다. 제형물은 약학의 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

주입하기에 적합한, 본 발명에 사용된 바와 같은 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및/또는 이리노테칸을 함유하는 약학적 제형물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 멸균의 수용액 또는 분산액을 포함한다. 더욱이, 활성제 및 조성물은 상기 멸균 주입용 용액 또는 분산액의 즉석의 제조를 위한 멸균 분말 형태일 수 있다. 모든 경우에서, 최종 주입가능 형태는 멸균이어야 하고, 용이한 주사능을 위해 효과적으로 유체여야 한다. 제형물은 제조 및 저장의 조건 하 안정적이어야 한다; 따라서, 바람직하게 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대항해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

활성제 중 하나 또는 양자 모두의 비경구 투여를 위해, 참깨 또는 피넛 오일 중 용액, 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액이 사용될 수 있고, 마찬가지로 활성제를 포함하는 멸균 수용액 또는 이의 상응하는 수성 염이 사용될 수 있다. 상기 멸균수용액은 적합하게 히스티딘, 아세테이트 또는 포스테이트 버퍼로 완충되는 것이 바람직하고, 또한 예를 들어 충분한 식염수 (saline) 또는 글루코오스로 등장성을 부여하는 것이 바람직하다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주입 목적에 적합하다. 오일 용액은 관절내, 근육내 및 피하 주입 목적에 적합하다. 멸균 조건 하 이러한 모든 용액의 제조는 당업자에게 익히 공지되어 있는 표준 약학 기술에 의해 용이하게 완수된다.

인간화 항-EGFR IgG1 항체 및/또는 이리노테칸을 함유하는 치료적 제형물은, 바람직한 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 용매, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Mack Pub. Co. (1980)). 이들은 동결건조된 제형물 또는 수용액의 형태로 저장될 수 있다. 허용가능한 담체, 용매, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 예를 들어 버퍼, 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘, 아세테이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔): 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당, 이당, 및 기타 탄수화물 (글루코오스, 만노오스 또는 엑스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르 (Tween™) 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (Pluronic™) 를 포함한다.

피하 투여를 위해 채용된 동결건조된 제형물은 WO 97/04801 에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형물은 적합한 희석제를 이용하여 고 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 상기 재구성된 제형물은 본원에서 치료될 포유 동물에 피하 투여될 수 있다.

항체 또는 이의 항원 결합 분절을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 WO 2006/082515 에 기재되어 있다. 이리노테칸을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법도 또한 당업계에 공지되어 있다 (예, Rothenberg 등, J Clin Oncol 11, 2194-2204 (1993). 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법은 상기에 인용된 문헌 및 기타 공지된 문헌 예컨대 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Pub. Co. (1990)] 을 보면 분명해질 것이다. 조합 조성물은 약학 방법 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 당업자가 더 분명하게 본 발명을 이해하고 실시할 수 있도록 하기 제조예 및 실시예를 제공한다. 그러나, 오로지 본 발명의 단일 측면을 예시하는 것으로 의도된 예시 측면에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않으며, 본 발명의 범위 내에는 기능적으로 동등한 방법도 포함된다. 실제로, 본원에서 기술된 것에 부가하여, 본 발명의 각종 변형은 앞선 기술 및 수반되는 도면을 살펴보면 당업자에게는 분명해질 것이다. 이러한 변경은 첨부된 청구항의 범위 내에 들어가는 것으로 의도된다.

하기와 같이 달리 정의되지 않는 한 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 용어가 본원에서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 는 모노클로날, 폴리클로날 및 다중특이적 (예를 들어, 이특이적) 항체를 포함하여 전체 항체 분자뿐만 아니라, Fc 영역을 갖고 결합 특이성을 갖는 항체 분절, 및 면역글로불린의 Fc 영역에 대응하는 영역을 포함하고 결합 특이성을 유지하는 융합 단백질을 포함하는 것이다. 또한, V_H 분절, V_L 분절, Fab 분절, F(ab')₂ 분절, scFv 분절, Fv 분절, 미니체, 이체 (diabodies), 삼체 (triabodies), 및 사체 (tetrabodies) 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 결합 특이성을 유지하는 항체 분절도 포함된다 (예를 들어, [Hudson 및 Souriau, Nat Med 9, 129-134 (2003)] 참조). 또한, 유전자 조작된, 재조합의, 인간화된, 영장류화된 및 키메라 항체뿐 아니라, 마우스 또는 인간과 같은 상이한 종 유래의 항체가 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조합물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자 제조물을 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"란, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 지칭한다. 한 구현예에서, 인간 모노클로날 항체는 무한증식 세포에 융합된, 인간 중쇄 이식유전자 (transgene) 및 인간 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 비인간 동물 (예, 유전자이식 마우스) 로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "인간화"란, 예를 들어 키메라 항체와 같이 모 분자의 항원-결합 특성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하나 인간에서 덜 면역원성인 비-인간 항원-결합 분자, 예를 들어, 쥐과동물 항체로부터 유래된 항원 결합 분자를 지칭한다. 면역원성의 감소는 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 생성하는 것, (b) 단지 비-인간 CDR 을 중요한 골격부 잔기 (예를 들어, 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 유지하는데 중요한 것) 가 있거나 또는 없는 인간 골격부 및 불변 영역에 이식하는 것, (c) 오직 비-인간 특이성-결정 영역 (SDR; 항체-항원 상호작용에 있어서 중요한 잔기) 를 인간 골격부 및 불변 영역에 이식하는 것, 또는 (d) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하나, 표면 잔기를 대체하여 인간-유사 부분으로 이들을 "가리는 것" 을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 본원에서 그 전문이 참조 인용되고 있는 문헌 [Morrison 등, Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855 (1984); Morrison 및 Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen 등, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 28, 489-498 (1991); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994), Kashmiri 등, Methods 36, 25-34 (2005)] 모두에 개시되어 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 각각에 일반적으로 3 개의 상보성 결정 영역 또는 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3) 이 있으며, 이는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 각각에 있는 4 개의 골격 하위 영역 (즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 에 인접하여 위치한다 : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 인간화된 항체에 관한 토의는 즉, 미국 특허 제 6,632,927 호에서 찾을 수 있고, 미국 출원 2003/0175269 에 개시되어 있으며, 이 둘 모두, 그 전문이 본원에 참조로써 삽입되어 있다.

마찬가지로, 본원에서 사용되는 바, 용어 "영장류화된" 이란, 모 분자의 항원-결합 특성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하나 영장류에서 면역원성이 덜한, 쥐과 동물 항체와 같은, 비-영장류 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" (경쇄의 가변 영역 (V_L), 중쇄의 가변 영역 (V_H)) 은, 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관련되는 각각의 경쇄 및 중쇄 도메인 한 쌍을 말한다. 인간 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 동일한 일반적인 구조를 가지며, 각 도메인은 서열이 광범위하게 보전되어 있으면서 3 개의 "고가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 골격부 (FR) 영역을 포함한다. 골격부 영역은 β-시트 입체형태를 취하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각 쇄에서의 CDR은 그의 3 차원 구조로 골격부 영역에 의해 유지되며, 다른 쇄에 있는 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 유용한 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로 이는 본 발명의 추가적인 대상이다.

본원에서 사용시, 용어 "고가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합부" 란, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 고가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격부" 또는 "FR" 영역은, 본원에서 정의된 바와 같은 고가변 영역 잔기 외의 상기 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 N- 내지 C-말단 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 는 항원 결합에 가장 많이 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 의 표준 정의 및/또는 "고가변 루프" 유래의 잔기에 따라 결정될 수 있다.

당 기술분야에 사용되고/거나 또는 허용되는 2 가지 이상의 정의가 있는 경우, 본원에 사용된 용어의 정의는 명백히 달리 언급되지 않는 한, 이러한 모든 의미를 포함하는 것으로 여긴다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견된 비(非)인접한 항원 결합 부위를 말하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR") 의 사용이다. 이러한 특별한 영역은 본원에 참조로써 삽입된 [Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda (1983)] 및 [Chothia 등, J Mol Biol 196, 901-917 (1987)] 에 의해 기술되었고, 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기를 오버랩하거나 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR 을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범주 내에 있다. 상기 인용된 참조문 각각에서 정의된 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 4 에 나타낸다. 특별한 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR 의 크기 및 서열에 따라 다양할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려해하여, 어떠한 잔기가 특정 CDR 을 포함하는지를 통상적으로 알아낼 수 있다.

표 4. CDR 정의 ¹

¹표 5 의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat 등 (하기 참조) 에 나와 있는 넘버링 규정에 따른 것이다.

²"AbM" 은 Oxford Molecular 의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR 을 말한다.

Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체의 범위를 넘어서는 임의 실험 데이타에 의존하지 않고 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의 가변 도메인 서열에 명백하게 지정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링" 은 [Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda (1983)] 에 나타낸 넘버링 시스템을 말한다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 것이다.

"불변 도메인" 은 가변 영역 이외의 항체 분자의 일부이다. 이들은 항체의 항원과의 결합에 직접 관여하지 않으나, 효과기 기능 (예, ADCC, CDC) 에 관여한다. 본 발명에 유용한 항체의 불변 도메인은 바람직하게 IgG1 이소타입의 것이다. 이들 특징을 갖는 인간 불변 도메인은 문헌 [Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda (1991), 및 Brueggemann 등, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987); Love 등, Methods Enzymol 178, 515-527 (1989)] 에 상세히 기술되어 있다. 본 발명에 유용한 불변 도메인은 보체 결합 및 Fc 수용체 결합을 제공한다. ADCC 및 임의로는 CDC 는 가변 및 불변 도메인의 조합에 의해 제공된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "Fc 영역"는 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다소 달라지지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys 226 위치에서의 아미노산 잔기에서 카르복실-말단까지의 구간 (stretch) 으로 정의되는 것이 통상적이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역"이란, 면역글로불린의 Fc 영역의 자연 발생 대립유전자 변이체 뿐만 아니라, 치환, 첨가, 또는 결실을 생성하나 효과기 기능 (예컨대 항체 의존적 세포-매개 세포독성)을 매개하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변형을 가진 변이체를 포함하는 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 그러한 변이체는 활성에 최소한의 효과를 갖도록 하기 위해, 당업계에 공지된 일반적인 법칙에 따라 선택될 수 있다 (예를 들어, [Bowie 등, Science 247, 1306-1310 (1990)] 참조).

본원에 사용된 바와 같이, "GnTIII 활성을 가진 폴리펩티드" 는 β-1,4 연결된 N-아세틸글루코사민 (GIcNAc) 잔기의 N-연결된 올리고당의 트리만노실 코어의 β-연결 만노시드로의 첨가를 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 여기에는, 투여량에 의존하거나 또는 그렇지 않은 특별한 생물학적 어세이에서 측정된 바와 같은, Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-β-N-아세틸글루코사미닐-트랜스퍼라아제 (EC 2.4.1.144) 로도 공지된 β(1,4)N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 III 의 활성과 유사하나, 반드시 동일한 것은 아닌 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 투여량 의존성이 존재하는 경우, GnTIII 의 것과 동일할 필요는 없으나, GnTIII 에 비해 주어진 활성에서 투여량-의존성과 실질적으로 유사하다 (즉, 후보 폴리펩티드는 GnTIII 와 비해 더 큰 활성을 나타내지만, 약 25-배를 초과하지 않고, 바람직하게는 10 배를 초과하지 않고, 가장 바람직하게는 약 3 배를 초과하지 않음).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "골지 국소화 도메인" 은 골지체 내 위치에 폴리펩티드를 고정하는 역할을 담당하고 있는 골지 상주 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 국소화 도메인은 효소의 아미노산 말단 "꼬리 (tail)" 를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 항체를 생산하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 개질된 당형태 (glycoform) 를 갖는 항체의 생성을 허용하도록 조작된다. 바람직하게, 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 증가된 수준으로 발현시키도록 추가 조작되었다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 배양된 포유 동물 세포, 예컨대 몇 가지만 언급하자면, CHO 세포, HEK293-EBNA 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하고, 또한 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효과기 기능" 은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역) 에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, Fc 수용체 결합 친화도, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포내 포식작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체의 하향-조절 등이 포함된다.

용어 "조작", "조작된", "조작화", "당화 조작", "당조작된" 은 자연 발생 또는 재조합 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 분절의 당화 패턴의 임의 조작을 포함한다. 당화 조작은 세포 내에서 발현되는 당단백질의 당화를 변경시키기 위한 올리고당 합성 경로의 유전적 조작을 포함하여, 세포의 당화 조직 (machinery) 의 대사 조작을 포함한다. 게다가, 당화 조작은 돌연변이 및 세포 환경의 당화에 대한 효과를 포함한다. 특히, 당화 조작은 글루코사미닐트랜스퍼라아제 및/또는 푸코실트랜스퍼라아제 활성 변경과 같은 글리코실트랜스퍼라아제의 활성 변경을 야기할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "Fc-매개 세포성 세포독성" 은, 항체-의존적 세포-매개 (종종 또한 "세포성") 세포독성 (ADCC) 및 인간 Fc-영역을 포함하는 가용성 Fc-융합 단백질에 의해 매개된 세포성 세포독성을 포함한다. 이는 "인간 면역 효과기 세포" 에 의한 "항체-표적화된 세포" 의 융해를 초래하는 면역 기작으로서, 여기서:

"인간 면역 효과기 세포"는 Fc-융합 단백질 또는 항체의 Fc-영역의 결합을 통해 세포 표면에서 Fc 수용체를 제시하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구 군이다. 그러한 군에는 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및/또는 자연 살해 (NK) 세포가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

"항체-표적화된 세포" 는 항체 또는 Fc-융합 단백질에 의해 결합된 세포이다. 항체 또는 Fc 융합-단백질은 Fc 영역에 대한 단백질 부분 N-말단을 통해 표적 세포에 결합한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가된 Fc-매개 세포성 세포독성" 은, 상기 정의된 Fc-매개 세포성 세포독성의 기작에 의해, 표적 세포를 둘러싼 배지 내에서 주어진 시간, 항체 또는 Fc-융합 단백질의 주어진 농도에서 융해되는 "항체-표적화된 세포" 수의 증가, 및/또는 Fc-매개 세포성 세포독성의 기작에 의해, 주어진 시간 내에 주어진 수의 "항체-표적화된 세포" 의 융해에 필요한, 표적 세포를 둘러싼 배지 내의 항체 또는 Fc-융합 단백질의 농도의 감소로서 정의된다. Fc-매개 세포성 세포독성의 증가는 당업자에게 공지된 동일한 표준 제조, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용해 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나, 본원에 기술된 방법에 의해 글리코실트랜스퍼라제 GnTIII 를 발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않는 동일한 항체 또는 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포성 세포독성과 비례한다.

"증가된 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 가진 항체" 는 본원에 정의된 용어처럼, 당업자에게 공지된 적합한 방법에 의해 측정되는 ADCC 가 증가된 항체를 의미한다. 허용된 시험관 내 ADCC 어세이의 한 예는 하기와 같다 :

1) 항체의 항원-결합 영역에 의해 인지되는 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용하는 어세이 ;

2) 무작위로 선별된 건강한 공여자의 혈액에서 단리한 인간 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로서 사용하는 어세이 ;

3) 하기 프로토콜에 따라 수행하는 어세이 :

i) PBMC 를 표준 밀도 원심분리 과정을 사용해 단리하고, RPMI 세포 배양 배지 내에서 5 x 10⁶ 세포/ml 로 현탁시킴 ;

ii) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법에 의해 성장시키고, 90% 초과의 생존성을 가진 지수생장기 (exponential growth phase) 에서 수합하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세정하고, 100 마이크로-큐리 (micro-Curies) 의 ⁵¹Cr 으로 표지하고, 세포 배양 배지로 2 회 세정하고, 세포 배양 배지 내에 10⁵ 세포/ml 의 밀도로 재현탁시킴 ;

iii) 상기에 기재된 바와 같이 제조된 최종 표적 세포 현탁액 중 100 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 옮김 ;

iv) 항체를 세포 배양 배지 내에서 4000 ng/ml 에서 0.04 ng/ml 로 단계희석시키고, 생성 항체 용액 중 50 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 있는 표적 세포에 첨가하고, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도에서 3 벌 중복 테스트함 ;

v) 최대 방출 (MR) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트에 있는 3 개의 추가의 웰에 항체 용액 (상기 iv 참조) 대신에 2% (V/V) 비-이온성 세제 (Nonidet, Sigma, St. Louis) 수용액 50 ㎕ 를 첨가함 ;

vi) 자발적 방출 (SR; Spontaneous release) 대조군을 위해, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트에 있는 3 개의 추가의 웰에 항체 용액 (상기 iv 참조) 대신에 RPMI 세포 배양 배지 50 ㎕ 를 첨가함 ;

vii) 다음, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 50 x g 에서 1 분 동안 원심분리하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시킴 ;

viii) PBMC 현탁액 (상기 i 참조) 50 ㎕ 를 효과기 : 표적 세포의 비가 25 : 1 이 되도록 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂ 분위기 하 37℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이터 내에 놔둠 ;

ix) 각 웰에서 무세포 상청액을 수합하고, 실험적 방출 방사능 (ER) 을 감마 계수기를 사용해 정량함 ;

x) 식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100 에 따라, 특정 융해의 % 를 각 항체 농도에 대해 산출함 (여기서, ER 은 해당 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사능 (상기 ix 참조) 이고, MR 은 MR 대조군 (상기 v 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사능 (상기 ix 참조) 이고, SR 은 SR 대조군 (상기 vi 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사능 (상기 ix 참조) 임) ;

4) "증가된 ADCC" 는 상기 테스트된 항체 농도 내에서 관찰된 특정 융해의 최대 % 의 증가, 및/또는 상기 테스트된 항체 농도 내에서 관찰된 특정 융해의 최대 % 의 절반을 달성하는데 필요한 항체 농도의 감소로서 정의된다. ADCC 의 증가는 당업자에게 공지된 동일한 표준 제조, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용해 동일한 숙주 세포에 의해 생성되나, GnTIII 을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않은 동일한 항체에 의해 매개되는, 상기 어세이에서 측정된 ADCC 에 비례한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체" (또는 "유사체") 는 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 형성된 아미노산 삽입, 결실, 및 치환에 의해 본 발명의 구체적으로 언급된 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 항체의 변이체는 키메라, 영장류화된 또는 인간화된 항체를 포함하는데, 이때 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기는 실질적으로 항원 (예, EGFR) 결합 친화도에 영향을 미치지 않는 방식으로 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 개질된다. 아미노산 잔기가 관심 활성을 없애지 않으면서 대체, 첨가 또는 결실될 수 있는지를 측정하는데 대한 지침은, 특정 폴리펩티드의 서열을 상동성 펩티드의 것과 비교하고 고도의 상동성 영역 (보존된 영역) 에서 형성되는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써, 또는 아미노산을 보존 서열로 대체함으로써 발견될 수 있다.

대안적으로, 이러한 동일 또는 유사한 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 변이체는 유전적 코드 내 "잉여부분 (redundancy)" 을 사용함으로써 합성 또는 선택될 수 있다. 다양한 제한 부위를 생성하는 침묵 변화와 같은 다양한 코돈 치환은 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로의 클로닝 또는 특정 원핵 또는 진핵 시스템 내에서의 발현을 최적화시키기 위해 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 내 돌연변이는 폴리펩티드의 임의 부분의 특성을 개질시키고, 리간드-결합 친화성, 내부사슬 친화성, 또는 분해/턴오버 비율과 같은 특징을 변화시키기 위해, 폴리펩티드에 첨가되는 다른 펩티드의 폴리펩티드 또는 도메인에서 반영될 수 있다.

바람직하게, 아미노산 "치환" 은 하나의 아미노산을, 유사한 구조 및/또는 화학 특성을 가진 또다른 아미노산으로 대체함, 즉 보존성 아미노산 대체의 결과이다. "보존성" 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 바탕으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함되고; 양전하성 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함되고; 음전하성 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. "삽입" 또는 "결실"은 바람직하게는 약 1 내지 20 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 범위에서 이루어진다. 변이는 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩티드 분자 내 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 시스템적으로 생성하고 생성된 재조합 변이체를 활성에 대해 어세이함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.

본 발명의 조회 (query) 아미노산 서열과 예를 들어 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 대상 폴리펩티드 서열이 조회 아미노산 서열의 각 100 개아미노산 당 5 개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 점을 제외하고는, 대상 폴리펩티드의 아미노산이 조회 서열과 동일한 것을 말한다. 즉, 조회 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해서는, 대상 서열 내 5% 이하의 아미노산 잔기가 삽입, 결실 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 기준 (reference) 서열의 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서, 또는 기준 서열 내 잔기들 중 각기에 배치되거나 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접기 중에 배치된 이 말단 위치 사이의 어느 곳에서도 발생될 수 있다.

현실적인 문제로서, 기준 폴리펩티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 임의의 특정 폴리펩티드는 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상적으로 측정될 수 있다. 글로벌 서열 배열로도 지칭되는, 조회 서열 (본 발명의 서열) 과 대상 서열간 최상의 전체적인 매치를 측정하는 바람직한 방법은 [Brutlag 등, Comp App Biosci 6, 237-245 (1990)] 의 알고리즘을 바탕으로 한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "EGFR" 은 인간 상피 성장 인자 수용체 (또한 HER-1 또는 ErbB-1 로도 공지됨) (Ulrich 등, Nature 309, 418-425 (1984); SwissProt 기탁 #P00533; 2 차 기탁 번호: O00688, O00732, P06268, Q14225, Q68GS5, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5) 뿐 아니라 그의 자연-발생 이소형태 및 변이체를 지칭한다. 이러한 이소형태 및 변이체는, 이로 제한되는 것은 아니지만 EGFRvIII 변이체, 대체 스플라이싱 생성물 (예, SwissProt 기탁 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4 에 의해 규명된 것), 변이체 GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962, 및 PRO-988 (Livingston 등, NIEHS-SNPs, environmental genome project, NIEHS ES15478, Department of Genome Sciences, Seattle, WA (2004)), 및 하기 기탁 번호: NM_005228.3, NM_201282.1, NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEQ mRNAs); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (MIPS 어셈블리); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT.100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224 (DOTS 어셈블리) 에 의해 규명되는 기타 물질을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "에피토프"란 특이적으로 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어, 통상 에피토프는 특이적인 3 가지의 3 차 구조 특성 및 특이적인 전하 특성을 지닌다. 입체형태적 및 비(非)입체형태적 에피토프는 후자가 아닌 전자로의 결합이 변성 용매의 존재하에서 사라지는 점으로 인해 구별된다.

본원에서 사용되는 바 "리간드" 란, EGFR 과 같은 수용체와 결합하고/하거나 활성화하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 막-결합 전구체 형태의 리간드 뿐만 아니라, 단백질분해 처리된 가용성 형태의 리간드를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "EGFR 의 리간드 활성화" 는 EGFR 리간드 결합에 의해 매개되는 신호 전달 (예를 들어, EGFR 또는 기질 폴리펩티드 내 타이로신 잔기를 인산화시키는 EGFR 수용체의 세포내 키나아제 도메인에 의해 야기되는 신호 전달) 을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "EGFR 또는 EGFR 리간드의 비정상 활성화 또는 생성을 특징으로 하는 질환 또는 장애, 또는 EGFR 발현과 관련된 장애" 는 악성종양 또는 암을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없는 상태를 말하며, 여기서, EGFR 및/또는 EGFR 리간드의 비정상 활성화 및/또는 생성은 질환 또는 장애를 갖는, 또는 질환 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상체의 세포 또는 조직에서 발생한다.

본원에 사용된 바와 같이, EGFR 을 발현하는 세포와 관련되어 사용되는 용어 "과발현", "과발현된", 및 "과발현화" 는 동일 조직 유형의 정상 세포와 비교해 그의 표면 상에 측정할만하게 더 높은 수준의 EGFR 을 갖는 세포를 말한다. 상기 과발현은 유전자 증폭에 의해, 또는 증가된 전사나 번역에 의해 야기될 수 있다. EGFR 발현 (및 심지어 과발현) 은 예를 들어, 면역조직화학 어세이, 면역형광 어세이, 면역효소 어세이, ELISA, 유세포 분석, 방사성면역어세이, 웨스턴 블롯, 리간드 결합, 키나아제 활성 등 (일반적으로, Cell Biology: A Laboratory Handbook, Celis, J., ed., Academic Press (2nd ed., 1998); Current Protocols in Protein Science, Coligan, J.E. 등, eds., John Wiley & Sons (1995-2003); 또한 Sumitomo 등, Clin Cancer Res 10, 794-801 (2004) 를 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로써 삽입됨) 을 통해, 당업계에 공지된 기술에 의해, 세포 표면 상에 또는 세포 융해물 내에 존재하는 EGFR 의 수준을 평가함으로써, 진단 또는 예후 어세이에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 당업자는 예를 들어, 형광 제자리 혼성화, 서던 블롯팅, 또는 PCR 기술을 통해, 세포 내 EGFR-인코딩 핵산 분자의 수준을 측정할 수 있다. 정상 세포의 EGFR 의 수준을 세포 증식 장애 (예를 들어, 암) 에 의해 영향받는 세포의 수준과 비교하여, EGFR 이 과발현되었는지를 결정한다.

동물에서 용어 "암" 은 암을 야기하는 세포에서 전형적인 특징들, 예컨대 제어되지 않는 증식, 불멸성, 전이 잠재력, 성장 및 증식의 급속, 및 특정의 특징적인 형태학적 특성을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 흔히, 암 세포는 종양 형태일 수 있으나, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있거나 또는 백혈병 세포와 같은 독립 세포로서 혈액 스트림에서 순환될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "비정상 세포 성장" 이란, 달리 지시되지 않는 한, 정상의 조절 기작과 관계 없는 세포 성장 (예, 접촉 억제의 손실) 을 지칭한다. 이에는 하기의 비정상 성장이 포함된다: (1) 돌연변이화 타이로신 키나아제의 발현 또는 수용체 타이로신 키나아제의 과발현에 의해 증식하는 종양 세포 (종양); (2) 이상 (aberrant) 타이로신 키나아제 활성이 발생하는 기타 증식성 질환의 양성 (benign) 및 악성 세포; (4) 수용체 타이로신 키나아제 발현 및/또는 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; (5) 이상 세린/트레오닌 키나아제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; 및 (6) 이상 세린/트레오닌 키나아제 활성화가 일어나는 기타 증식성 질환의 양성 및 악성 세포.

본원에서 사용되는 용어 "치료하기"는 달리 지시되지 않는 한, 환자에게서 종양 성장, 종양 전이 또는 기타 암을 유발하거나 또는 신생물성인 세포의 진행을 부분적으로 또는 완전히 역동, 격감, 억제하는 것을 의미한다. 환자는 인간 또는 동물일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 달리 지시되지 않는 한, 치료 행위를 지칭한다.

예를 들어 암에 적용시 표현 "치료 방법" 또는 이의 대응 표현은, 인간 또는 동물에서 암 세포의 개수를 감소 또는 제거, 암의 진행을 방지 또는 암의 증상을 경감시키도록 고안된 절차 또는 작용 과정을 지칭한다. 암 또는 기타 증식성 장애의 "치료 방법" 은, 암 세포 또는 기타 장애가 실제로 제거되어지는 것, 세포 개수 또는 장애가 실제로 감소되는 것, 또는 암 또는 기타 장애의 증상이 실제로 격감되는 것을 반드시 의미하지 않는다. 흔히, 암 치료 방법은 성공 가능성이 낮을지라도, 인간 또는 동물의 병력 및 추측되는 생존 수명을 고려할 때, 전반적으로 이로운 작용 과정이라고 여겨지면 수행될 것이다.

용어 "치료적 유효제 또는 치료제" 란, 연구자, 수의사, 의학 박사 또는 기타 임상학자에 의해 탐구되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 조성물을 의미한다.

용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량" 은, 연구자, 수의사, 의학 박사 또는 기타 임상학자에 의해 탐구되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 대상 화합물 또는 조합물의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이리노테칸"은 이리노테칸뿐 아니라 이의 약학적으로 허용가능한 염 (예, 이리노테칸 히드로클로라이드 트리히드레이트) 를 포함한다. 특정한, 특히 적합한 다형도 포함된다.

본 발명은 하기 실험 상세설명을 통해 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는, 논의된 구체적인 방법 및 결과가 이하에 뒤따르는 청구항에 더 완전히 기재되어진 본 발명을 단지 예시하는 것이며 어떠한 식으로든 이로써 제한되는 것으로 여겨서는 안된다는 점을 손쉽게 인지할 것이다.

본원에서 개시된 모든 특허, 공개특허출원 및 기타 이들 문헌에 개시된 참조문은 본원에 참조로써 명백히 삽입된다.

당업자는 일개 통상의 실험인 본원에서 구체적으로 기술된 본 발명의 특정 측면에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인지하거나 또는 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항의 범위에 포함되도록 의도된다.

도면의 간단한 설명
도 1 은 비히클 (실선), 25 mg/kg 부분 푸코실화 GlycArt-mAb 및 20 mg/kg CPT-11/이리노테칸 (대시 선) 또는 25 mg/kg 세툭시마브 (Erbitux™) 및 20 mg/kg CPT-11/이리노테칸 (점선) 으로 치료된, A549 폐 샘암종 이종이식편을 갖는 SCID 베이지 마우스의 생존도를 나타내는 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 곡선이다.

실시예

실시예 1

항-EGFR 항체와 이리노테칸의 조합물로 치료된, 폐 샘암좀 이종이식편을 갖는 마우스의 생존도

시험 제제

GlycArt-mAb 를 재조합 단백질 생산에서 일반적으로 공지된 기술로 제조한다. 당화 패턴이 변경된 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 생산을 위한 세포주 제조, 개질된 당화 패턴을 갖는 항체를 발현하는 트랜스펙션체 또는 형질전환체의 동정, 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 을 포함한 증가된 효과기 기능을 갖는 인간화 항-EGFR IgG1 항체의 제조는 WO 2006/082515 및 WO 2008/017963 에 상세히 기재되어 있다. 요약하면, 유전자 조작된 중국 햄스터 난소 세포주 (CHO) 를 마스터 세포 은행의 세포 배양물에서 증량시킨다. 항체를 MabSelect SuRe™ 컬럼 (GE) 상 단백질 A 친화 크로마토그래피 후, Capto S™ 컬럼 (GE) 상 양이온 교환 크로마토그래피 및 최종적으로 Capto Q™ 컬럼 (GE) 상 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용한 조건화 세포 배양 배지로부터 정제한다. 바이러스를 Viresolve®Pro membrane (Millipore) 를 이용한 나노여과로써 제거하고, 항체를 정용여과 (diafiltration) 를 통해 농축하고 원하는 버퍼로 옮긴다.

부분 푸코실화 GlycArt-mAb 의 제조를 위해, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III (GnTIII) 를 과발현하는 CHO 세포주를, US 7,517,670 에 기술되어 있는 바와 같이, 특히 WO 2006/082515 및 WO 2008/017963 에 기술되어 있는 바와 같이 사용한다.

부분 푸코실화 GlycArt-mAb 를 히스티딘, 트레할로오스 및 폴리소르베이트 20 을 함유하는 버퍼 중 스톡 용액 (c=11.3 mg/ml) 으로서 제공하였다. 항체 스톡 용액을 주입하기 전에 적절하게 PBS 중에 희석하였다.

항-EGFR 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 를 Merck Pharma GmbH, Darmstadt, Germany 로부터 임상 제형물 (5mg/ml) 로서 구입하였다. 항체 농도를, 주입 전에 재구성된 스톡 용액의 희석으로 조절하였다.

이리노테칸/CPT-11 (Campto®) 를 Pfizer Pharma GmbH, Karlsruhe, Germany 로부터 임상 제형물 (20 mg/ml) 로서 구입하였다. 항체 농도를, 주입 전에 재구성된 스톡 용액의 희석으로 조절하였다.

세포주 및 배양 조건

A549 인간 비소세포폐암 (NSCLC) 세포를 ATCC 로부터 입수하였다. 종양 세포주는, 10% 우태아 혈청 (PAA Laboratories, Austria) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지 (PAA Laboratories, Austria) 중, 37℃ 에서 물-포화 분위기에서 5% CO₂ 로 하여 통상적으로 배양하였다.

종양 세포 주입

A549 세포의 계대 (passage) 3 를 생체 내 주입을 위해 사용했다. PBS 중 2 x 10⁶ 세포를 정맥내 (i.v.) 주입했다.

동물

암컷 SCID 베이지 마우스; 도착 시 7-8 주령 (Charles River, Sulzfeld, Germany 에서 구입) 마우스를 수임된 가이드라인 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 에 따라 12 시간 명실/12 시간 암실의 1 일 주기로 특정한 병원체가 없는 조건하에서 유지하였다. 실험 연구 프로토콜은 지방 자치단체로부터 검수 및 승인되었다. 도착 후, 동물들은 새로운 환경에 적응 및 관찰을 위해 1 주일 동안 동물 시설의 격리부에서 유지되었다. 계속해서 건강 모니터링을 정기적으로 수행하였다. 다이어트 푸드 (Provimi Kliba 3337) 및 물 (산성화, pH 2.5-3) 를 무제한 급식하였다.

모니터링

동물들을 임상적 징후 및 부작용의 검출을 위해 매일 통제하였다. 실험 기간 내내 모니터링을 위해, 동물의 체중을 기록하였다.

동물의 처치

종양 세포 주입 후 7 일 후에 동물을 무작위로 추출하여 동물 처치를 개시하였다. GlycArt-mAb 또는 항 EGFR 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 를, 연구 제 7 일, 제 14 일, 제 21 일, 제 28 일, 제 35 일, 제 42 일, 제 49 일, 제 56 일, 제 63 일, 제 70 일, 제 77 일, 제 84 일, 제 91 일 및 마지막으로는 제 98 일에, 매 7 일 마다, 지시된 25mg/kg 투여량으로 복강내 (i.p) 투여하였다. 상응하는 비히클을 상기와 동일한 날에 투여하였다. 이리노테칸을 단일 제제로서 또는 항-EGFR 항체와 조합하여 연구 제 7 일, 제 10 일, 제 14 일 및 제 17 일에 20 mg/kg 의 투여량으로 4 회 i.p. 로 제공하였다.

생체 내 동물 생존도 연구

GlycArt-mAb 와 이리노테칸의 조합물의 생체 내 항-종양 효능을, A549 폐 샘암종 이종이식 모델에서, 시판중인 항-EGFR 항체 세툭시마브와 이리노테칸의 조합물, 및 단일 제제로서의 항-EGFR 항체 및 이리노테칸 양자 모두에서와 비교하여 분석하였다. 주 매개변수는 생존도였다. 데이타는 로그 랭크 테스트를 통해 통계학적으로 분석했다.

항-EGFR 항체들인 GlycArt-mAb 와 세툭시마브 양자 모두 또는 이리노테칸 (CPT-11) 을 단일 제제로서 (i.v. 주입 후) A549 이종이식편을 갖는 마우스를 치료하면, 비히클 대조군과 비교시 각각 p=0.0005, p=0.0031 및 p=0.017 로 유의하게 동물 생존도가 연장되었다. 또한, 항-EGFR 항체인 GlycArt-mAb 와 이리노테칸의 조합 치료, 또는 항-EGFR 항체인 세툭시마브와 이리노테칸의 조합 치료 양자 모두는, 대조군과 비교시, 동물 중앙 및 장기 기간의 생존도를 개선하였다 (p<0.0001 및 p=0.0003). GlycArt-mAb 에 있어서, 이리노테칸과의 조합물은, 단일 제제로서의 GlycArt-mAb 또는 이리노테칸과 비교시 훨씬 우수했다 (p=0.0116 및 p=0.0001). 이리노테칸과 항-EGFR 항체의 조합물들을 직접적으로 비교하면, GlycArt-mAb 과 이리노테칸의 조합물이 세툭시마브 (Erbitux®) 와 이리노테칸의 조합물보다 우수성이 더 크다는 것이 강조되었다 (p=0.246). 도 1 에 생존도 데이타를 카플란-메이어 곡선으로 나타내다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Treatment with a humanized anti-EGFR IgG1 antibody and Irinotecan <130> 26054 <150> EP 09156844.4 <151> 2009-03-31 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 1 Asp Tyr Lys Ile His 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 2 Asp Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 3 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Kabat <400> 4 Asp Tyr Lys Ile Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Chothia <400> 5 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Chothia <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR1 Chothia 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Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 15 Gly Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 16 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 17 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 18 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR2 Kabat <400> 19 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 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Kabat <400> 33 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR2 Kabat <400> 34 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain CDR3 Kabat <400> 35 Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> ICR62 VH <400> 36 Gln Val Asn Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> ICR62 VL <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr 100 105 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> I-HHD VH construct <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr 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220 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 225 230 235 240 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 245 250 255 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 260 265 270 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 275 280 285 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 290 295 300 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims

약학적으로 허용가능한 담체 중 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸을 포함하는 약학적 조성물, 특히 암 치료에 사용되기 위한 약학적 조성물로, 이때 상기 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 하기를 포함하는 약학적 조성물:
a) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:1 의 CDR1, SEQ ID NO:16 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:31 의 CDR3, 및
b) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:33 의 CDR1, SEQ ID NO:34 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:35 의 CDR3.
제 1 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 이의 Fc-영역에서 20% 이상의 비(非)푸코실화 또는 이등분 비푸코실화 올리고당을 갖는 약학적 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 SEQ ID NO:38 의 아미노산 서열 (I-HHD 중쇄 가변 영역 구축물) 및 SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열 (I-KC 경쇄 가변 영역 구축물) 을 포함하는 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 항암제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸으로서, 이때 상기 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 하기를 포함하는 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸:
a) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:1 의 CDR1, SEQ ID NO:16 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:31 의 CDR3, 및
b) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:33 의 CDR1, SEQ ID NO:34 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:35 의 CDR3.
제 5 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 이의 Fc-영역에서 20% 이상의 비푸코실화 또는 이등분 비푸코실화 올리고당을 갖는 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 SEQ ID NO:38 의 아미노산 서열 (I-HHD 중쇄 가변 영역 구축물) 및 SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열 (I-KC 경쇄 가변 영역 구축물) 을 포함하는 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 동일 제형물 내에 포함되는 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 상이한 제형물들 내에 포함되는 암 치료에서 조합되어 사용되기 위한 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸.
동일 또는 개별 용기 내, 이리노테칸 및 인간화 항-EGFR IgG1 항체를 포함하는 암 치료에 사용되기 위한 키트로서, 이때 상기 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 하기를 포함하는 키트:
a) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:1 의 CDR1, SEQ ID NO:16 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:31 의 CDR3, 및
b) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:33 의 CDR1, SEQ ID NO:34 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:35 의 CDR3.
제 10 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 이의 Fc-영역에서 20% 이상의 비푸코실화 또는 이등분 비코실화 올리고당을 갖는 키트.
암 치료를 필요로 하는 대상체에 치료적 유효량의 인간화 항-EGFR IgG1 항체와 이리노테칸의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로서, 이때 상기 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 하기를 포함하는 방법:
a) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:1 의 CDR1, SEQ ID NO:16 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:31 의 CDR3, 및
b) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:33 의 CDR1, SEQ ID NO:34 의 CDR2, 및 SEQ ID NO:35 의 CDR3.
제 12 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 이의 Fc-영역에서 20% 이상의 비푸코실화 또는 이등분 비푸코실화 올리고당을 갖는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체가 SEQ ID NO:38 의 아미노산 서열 (I-HHD 중쇄 가변 영역 구축물) 및 SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열 (I-KC 경쇄 가변 영역 구축물) 을 포함하는 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 동일 제형물 내에서 투여되는 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 상이한 제형물들 내에서 투여되는 방법.
제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항-EGFR IgG1 항체 및 이리노테칸이 동일 경로, 바람직하게는 비경구로 투여되는 방법.
제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 항암제가 추가로 사용되는 방법.
상기에 기재된 본 발명.