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KR20110081222A - 비복제성 벡터화된 백신의 점막 투여에 의한 조류의 면역화 - Google Patents

비복제성 벡터화된 백신의 점막 투여에 의한 조류의 면역화 Download PDF

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KR20110081222A
KR20110081222A KR1020117009431A KR20117009431A KR20110081222A KR 20110081222 A KR20110081222 A KR 20110081222A KR 1020117009431 A KR1020117009431 A KR 1020117009431A KR 20117009431 A KR20117009431 A KR 20117009431A KR 20110081222 A KR20110081222 A KR 20110081222A
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KR
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virus
asn
leu
adenovirus
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KR1020117009431A
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하롤도 토로
데-츄 씨 탕
켐펜 켄트 알 반
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어번 유니버시티
박신 인크.
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Filing date
Publication date
Application filed by 어번 유니버시티, 박신 인크. filed Critical 어번 유니버시티
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Abstract

본 발명은 일반적으로 면역학 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스를 암호화하는 유전자와 같은 조류 면역원 또는 항원을 암호화하는 유전자를 전달하기 위한 재조합 인간 아데노바이러스 벡터를 포함하는 것을 포함하는, 면역원성 및 백신 조성물을 조류에게 에어로졸 분무를 통해 점막 투여하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 투여에 사용하기 위한 기구 및 방법을 제공한다.

Description

비복제성 벡터화된 백신의 점막 투여에 의한 조류의 면역화{IMMUNIZATION OF AVIANS BY MUCOSAL ADMINISTRATION OF NON-REPLICATING VECTORED VACCINES}
관련 출원에 대한 교차참조
본 출원은 본원에 참고 인용된 2008 년 9 월 26 일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/100,623 에 대해 우선권을 주장한다.
2006 년 8 월 15 일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 11/504,152; 2005 년 8 월 15 일에 출원된 60/708,524; 2002 년 1 월 18 일에 출원된 10/052,323; 2002 년 4 월 5 일에 출원된 10/116,963; 2003 년 1 월 16 일에 출원된 10/346,021 및 미국 특허 번호 6,706,693; 6,716,823; 6,348,450, 및 1998 년 8 월 13 일에 출원된 PCT/US98/16739 이 언급되어 있고, 이는 본원에서 전문이 참고 인용된다.
상기 출원들, 및 그안에서 또는 출원 계속 중에 인용된 모든 문헌 ("출원에 인용된 문헌") 및 출원에 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌, 및 본원에서 인용되거나 참조된 모든 문헌 ("본원에서 인용된 문헌"), 및 본원에서 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에서 또는 본원에 참고 인용된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 제조사의 지침, 설명, 제품 설명서, 및 제품 시트와 함께, 본원에 참고 인용되고, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 백신 기술 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 유전자와 같은 조류 면역원 또는 항원을 암호화하는 유전자를 조류에게 전달하기 위한 E1-결손성 인간 아데노바이러스 벡터와 같은 재조합 비복제성 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조류 배아를 포함하는 조류 대상에 조류 면역원을 도입하여 발현시키는 방법, 및 조류 대상에 면역원에 대한 면역 반응을 유발시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 에어로졸 분무 또는 점안액을 포함하는 점막 경로를 통한 투여를 포함한다.
발명의 배경
조류 인플루엔자 (AI) 는 조류 종, 다른 동물 및 인간을 감염시키는 전염성이 높은 병원균이다. 1997 년 이래, AI 바이러스가 인간에게 전염된 사건이 여러번 있었다 (Subbarao et al., 1998; Ungchusak et al., 2005). 의학적 역사에서 다수의 경우에 조류와 인간 인플루엔자 바이러스 사이에 유전자 재조합이 발생했음을 보여주는 증거가 있다 (Kawaoka et al., 1989). 조류 가축 종과 인간은 밀접하게 접촉하므로, 잠재적으로 종 장벽을 넘어 인간 집단에 유입될 수 있는 새로운 AI 바이러스 균주의 발생이 계속 공중 보건 문제가 될 것으로 여겨진다.
AI 바이러스의 전염을 예방하고 인간 유행병의 위험을 감소시키기 위한 가장 유망한 시도는 조류의 집단 백신접종으로 보인다. 지난 수년 간 일부 국가에서 불활성화된 전체 바이러스 백신에 의한 조류의 백신접종이 수행되었다. 이러한 AI 백신은 감염된 알에서 수확된 양막요막액으로부터 제조되고, 이어서 포르말린 또는 β-프로피오락톤에 의해 불활성화된다 (Tollis and Di Trani, 2002). 그러나, 새로운 AI 바이러스 균주의 예측불가능한 출현, AI 바이러스의 닭 배아에 매우 치명적인 형태로의 진화 (Wood et al., 2002), 불활성화된 백신의 개별적 비경구적 전달의 필요, 및 바이오테러리스트에 의해 가능한 치명적 AI 균주의 전염은 안전하고 효과적인 AI 백신의 신속한 개발과 적시 공급을 중요하지만 매우 어려운 임무로 만든다. 또한, 야생에서 감염된 닭을 동일한 균주의 불활성화된 AI 바이러스에 의해 이전에 백신접종한 닭과 구별하는 것은 불가능하다 (Normile, 2004).
AI 바이러스의 헤마글루티닌 (HA) 을 암호화하는 실험적 재조합 계두 (fowlpox) 바이러스는 날개 웨브 천자 (wing-web puncture) 후 H5N2 AI 바이러스 공격 (challenge) 에 대해 닭을 방어했고, 적혈구응집 억제 (HI) 혈청 반응은 무시해도 될 정도였다 (Beard et al., 1992). HA 를 발현하는 살아있는 재조합 우두 바이러스를 날개 웨브를 통해 접종한 닭은 또한 치명적인 AI 바이러스 공격에 대해 방어 면역을 발달시켰고 낮은 수준의 혈청 HI 항체가 탐지되었다 (Chambers et al., 1988). 소화관에 대한 향성이 있는 물새 기원의 AI 단리물이 경구 AI 백신으로서 닭에게 접종되었지만 (Crawford et al., 1998), 이러한 단리물은 이러한 바이러스 유형의 고유한 동적 진화로 인해, 새로운 AI 바이러스 균주에 대해 광범위하게 효과적일 것으로 기대되지 않는다.
또한 조류는 바큘로바이러스 벡터로부터 발현된 HA 단백질의 피하 주사 (Crawford et al., 1999), 및 유전자 총을 이용한 HA 를 암호화하는 발현 플라스미드의 피부로의 접종 (Fynan et al., 1993) 에 의해 면역화되기도 했다. 이러한 AI 백신들은 조류가 임상적 징후 및 사망을 나타내지 않도록 방어할 수 있고, 동종 HA 를 함유하는 공격 바이러스의 호흡기 및 장내 복제를 감소시킬 수 있다. 또한 뉴캣슬병 바이러스 벡터로부터 HA 를 발현하는 저가 에어로졸 AI 백신 (Swayne, 2003) 또는 비병원성 인플루엔자 바이러스 백본을 함유하는 재조합 인플루엔자 바이러스가 효과적일 수 있다는 증거도 존재한다 (Lee et al., 2004; Webby et al., 2004).
상기 AI 백신의 대부분은 노동 집약적인 비경구 전달에 의존한다. 경구 및 에어로졸 AI 백신은 집단 접종시 각 조류에게 균일한 용량을 전달할 때 불일치를 겪는다. 또한 일부 백신에 이용되는 복제성 벡터는 비천연 미생물 형태를 환경에 도입함으로써 생물학적 위험을 야기한다. 재조합된 인플루엔자바이러스 백신은 심지어 환경에서 동시에 순환하는 야생형 AI 바이러스와 재편성 인플루엔자 바이러스 사이의 재조합을 통해 유해한 재편성 (reassortment) 을 생성할 수 있다 (Hilleman, 2002).
재조합 아데노바이러스 ("Ad") 벡터를 백신 담체로서 이용하는 몇가지 주목할 만한 이유가 있다. Ad 벡터는 유사분열 세포와 유사분열후 세포를 모두 제자리에서 형질도입시킬 수 있다. 또한, 고 역가의 바이러스를 함유하는 Ad 스톡 (즉, 1 ㎖ 당 1012 pfu [플라크 형성 단위] 초과) 의 제제는 생성하기 용이하여, 세포를 높은 감염다중도 (MOI) 로 제자리에서 형질도입시키는 것을 가능하게 한다. 또한 Ad 벡터는 백신으로서 장기적인 이용의 기초가 되는 입증된 안전성 기록도 갖고 있다. 더욱이, Ad 벡터는 높은 유전자 발현 수준을 유도할 수 있고 (적어도 초기 방출물로서), 복제 결손성 Ad 벡터는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 생물학적조작되고, 제조되고, 저장될 수 있다.
Ad 계 백신은 특정 수용체에 대한 Ad 벡터의 높은 친화도와 엔도솜 경로를 회피하는 능력으로 인해 DNA 백신보다 더욱 강력하다 (Curiel, 1994). Ad 벡터는 닭 세포 표면에서 발견되는 콕사키에 및 아데노바이러스 수용체 (CAR) 에 대한 섬유의 결합을 통해 닭 배아의 일부를 형질도입시킬 수 있다 (Tan et al., 2001). 또한, Ad 성분 중 적어도 하나인 헥손은 고도로 면역원성이어서, 외인성 항원에 대한 보강제 활성을 부여할 수 있다 (Molinier-Frenkel et al., 2002).
Ad 계 백신은 주조직적합복합체 (MHC) 클래스 I 제한된 T 세포 반응을 유도하는 능력에 있어서 자연 감염의 효과를 모방하지만, 이 벡터로부터 병원체 게놈의 아분절만이 발현되기 때문에 다시 독성으로 복귀할 가능성은 없다. 이러한 "선택적 발현" 은 백신접종된 비감염 동물과 감염된 동물을 구별하는 문제를 해결할 수 있는데, 이는 상기 벡터에 의해 암호화되지 않는 병원체의 특정 마커가 두 동물을 구별하는데 이용될 수 있기 때문이다. 특히, 자연 시료로부터 관련 항원 유전자를 직접 증폭 및 클로닝할 수 있기 때문에 벡터화된 백신의 제조에 병원체의 증식이 필요하지 않다 (Rajakumar et al., 1990). 이는 H5N1 과 같은 고도로 독성인 AI 균주로부터 백신을 생산하는데 특히 중요한데, 그 이유는 이 균주가 증식하는 것이 너무 위험하고 어렵기 때문이다 (Wood et al., 2002). 상기 기준 외에도, 상업적 문제점은 가금류 산업에서 중대한 요인이다. 현행 AI 백신만의 가격은 달리는 새에게 주사하는 노동을 계산하지 않을 때 새 1 마리당 약 7 센트이다 (Normile, 2004).
복제 무능성 El/E3-결손성 인간 Ad 혈청형 5 (Ad5) 유래의 벡터는 포유류에서 심층적으로 연구되었다 (Graham and Prevec, 1995). 항원을 암호화하는 조류 Ad 닭 배아 치명적 고아 (CELO) 바이러스 벡터를 피하 또는 피내 주사하여 닭을 면역화시켰지만 (Francois et al., 2004), CELO 벡터는 순응도율이 낮고 닭 세포에서 복제하는 능력 때문에 잠재적으로 유해할 수 있다. CELO 는 식별가능한 E1, E3 및 E4 영역을 갖지 않으므로 (Chiocca et al., 1996), 복제 무능성 CELO 벡터는 현재 면역화를 위한 담체로 이용할 수 없다. 본 발명은 다양한 질병 환경에서 조류를 방어하고, 결과적으로 조류 병원체가 인간에게 전염되는 것을 방지하기 위한 안전하고 효과적인 유전자 전달 방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.
하르더샘 (덧눈물샘) (HG) 은 1694 년에 Johann Jacob Harder (1656-1711) 에 의해 최초로 기술되었고, 대부분의 육상 척추동물에서 발견된다 (Payne, 1994). HG 는 닭의 안구 뒤 안와 내에 위치한 대롱꽈리샘이고, 그의 분비관은 형태학상 독특하여 샘몸통이 순막의 표면으로 이어지게 한다 (Payne, 1994). 하르더샘의 기능은 다양하고, a) 눈 및 순막의 윤활, b) 새의 면역 반응, c) 설치류의 광수용, d) 망막-송과체 축의 일부 형성, e) 페로몬의 생산, f) 설치류의 체온조절성 지질 생산, g) 일부 파충류의 삼투조절, h) 성장 인자의 생산 및 i) 일부 거북류의 타액 생산을 포함한다 (Payne 1994; Chieffi 1996). HG 는 미생물 병원체 또는 벡터화된 백신에 안구 노출시 후천성 면역 반응을 생성하기에 완벽한 위치에 있다.
닭은 이전에 인간 Ad5 벡터화된 백신의 근육내 주사 (Gao, 2006) 또는 난내 투여 (Toro, 2007) 에 의해 조류 병원체에 대해 면역화되기도 했다. 본원에 기술된 바와 같이, HG 가 닭에서 후천성 점막 면역을 생성하는 능력을 평가하기 위해 추가 연구가 필요했다. A/turkey/Wisconson/68 (AdTW68.H5ck) 의 코돈 최적화된 H5 HA 유전자를 발현하는 RCA-프리 인간 Ad5 벡터에 의한 이전의 연구는 단일 난내 면역화 이후 고병원성 AI (HPAI) H5N2 A/Chicken/Quer/95 및 H5N1 A/swan/Mongolia/244L/2005 균주에 의한 공격에 대한 방어 면역을 유도했다 (Toro, 2007). 현존하는 닭 집단을 AI 로부터 방어하기 위해, 난내 면역화에 대안적인 면역화 프로토콜이 필요하다. 인플루엔자 바이러스는 점막 표면에 노출된 후 전염되므로, 닭에서 안구 적용 후 이 AdTW68.H5ck 벡터가 H5 HA 에 대한 점막 및 전신 면역을 유도하는 능력이 시험되었다. AdTW68.H5ck 벡터는 닭에서 HG 연관 안구 면역화 이후 점막 면역 뿐만 아니라 전신 면역을 유도할 수 있다. 이전 발견에 기초하면, HG 가 점막 효과기 부위로서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역능 조직일 수 있다고 생각할 수 있다 (Toro, 1996). 또한, J-사슬이 HG 의 B 세포에서 발현됨을 관찰했는데 이는 HG 가 방어 메카니즘에 있어서 핵심 조직임을 추가로 입증한다. 닭 J-사슬 유전자는 다른 종의 유전자와 고도의 상동성을 나타냈고, 닭 면역계 발달의 조기 단계에서 발현된다 (Takahashi 2000). 게다가, J-사슬은 IgA 및 IgM 의 중합 및 이들의 점막 상피를 통한 수송에서 중요한 역할을 했으므로, 점막 상피를 통한 중합체성 IgA (pIgA) 의 수송에 필요할 것이다 (Johansen 2000). 닭 (갈루스 갈루스(Gallus gallus)) 의 중합체성 면역글로불린 수용체 (pIgR) 가 최근에 클로닝되었고 (Wieland 2004), 조류 종에서 상기 점막 수송계의 보존 및 이의 방어적 점막 면역에 있어서의 중요성을 확인했다.
본 출원에서 임의의 문헌을 인용 또는 식별하는 것은 그 문헌을 본 발명의 선행 기술로서 이용할 수 있음을 인정하는 것이 아니다.
발명의 요약
놀랍게도 이제, 인간 아데노바이러스 벡터화된 백신의 난내 전달 및 에어로졸 분무를 포함하는 경로를 통해 조류를 신속, 안전하고 효과적으로 면역화할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 여러 조류 병원체에 대한 조류의 집단 면역화는 막대한 경제적 손실을 방지하고, 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 조류 병원체가 인간 집단에 전염되지 않게 하는데 중요하다. 기계식 주사기에 의한 백신 또는 면역원성 조성물의 난내 전달은 적시에 조류를 집단 면역화하기 위한 비노동집약적 방법이다. 대안적으로, 백신 또는 면역원성 조성물의 점막 (안구 또는 에어로졸 분무) 전달은 가금업에서 일상적으로 수행된다. 또한 굵은 (coarse) 분무 전달은 적시에 조류를 집단 면역화하기 위한 비노동집약적 방법이다. 점막 경로를 통한 백신접종은 전신 면역 반응 뿐만 아니라 병원체의 진입구에서의 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 다른 조류 백신과는 달리, 인간 아데노바이러스 벡터화된 백신 또는 면역원성 조성물의 생산에는 치명적인 병원체의 증식이 필요하지 않고, 조류에서 복제할 수 있는 벡터에 의한 항원 또는 면역원의 전염을 수반하지 않는다. 게다가, 이러한 유형의 백신 또는 면역원성 조성물에 의한 면역화는 백신접종된 동물과 자연적으로 감염된 동물을 구별할 수 있게 한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현할 수 있는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.
또다른 구현예에서, 인간 아데노바이러스 서열은 인간 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래될 수 있다. 인간 아데노바이러스 서열은 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래될 수 있다.
프로모터 서열은 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, EF1-α 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은, 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 헤르페스바이러스류 예컨대 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스 (avipox), 계두, 카나리폭스, 피전폭스 (pigeonpox), 메추라기폭스 및 도브폭스 (dovepox) 를 포함하는 폭스바이러스류, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자, 즉, 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 및 뉴라미니다제에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 에서 유래될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현할 수 있는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터 및, 수의학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제를 포함하는, 조류 대상에게 생체내 전달하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다.
하나의 구현예에서, 아데노바이러스 DNA 서열은 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 인간 아데노바이러스 서열은 인간 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래될 수 있다. 인간 아데노바이러스 서열은 복제 결손성 아데노바이러스에서 유래될 수 있다.
프로모터 서열은 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, EF1-α 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은, 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 헤르페스바이러스류 예컨대 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스를 포함하는 폭스바이러스류, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래될 수 있다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자, 즉, 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 및 뉴라미니다제에서 유래될 수 있다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 에서 유래될 수 있다.
면역원성 조성물 또는 백신은 보강제를 추가로 포함할 수 있다.
면역원성 조성물 또는 백신은 부가적 백신을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터와 세포를 접촉시키는 단계, 및 세포 내에서 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현시키기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포 내에 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 도입하여 발현시키는 방법을 제공한다.
세포는 293 세포 또는 PER.C6 세포일 수 있다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 조류 인플루엔자에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 또는 뉴라미니다제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
추가의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터와 조류 배아를 접촉시킴으로써, 조류 배아 내에서 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원의 발현을 수득하는 단계를 포함하는, 조류 배아 내에 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원을 도입하여 발현시키는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 비구조 단백질 예컨대 효소 또는 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
조류 배아에서 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원을 도입하여 발현시키는 방법은 난내 전달에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 조류 배아에서 하나 이상의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원을 도입하여 발현시키는 방법은 바람직하게는 에어로졸 분무 전달에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 조성물의 면역학적 유효량을 조류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상에서 면역원성 반응을 유발시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역학적 유효량의 면역원성 조성물로 조류 대상을 감염시키는 단계는 포함하는, 상기 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 대상에서 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유발시키기에 충분한 수준에서 발현되는, 조류 대상에서 면역원성 반응을 유발시키는 방법을 제공한다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 조류 인플루엔자에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 또는 뉴라미니다제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 방법은 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 감염시키는 방법은 난내 전달에 의해 수행할 수 있다.
대안적으로, 감염시키는 방법은 에어로졸 분무 전달에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역학적 유효량의 면역원성 조성물로 조류 대상을 감염시키는 단계는 포함하는, 상기 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 대상에서 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유발시키기에 충분한 수준에서 발현되는, 조류 대상에서 면역원성 반응을 유발시키는 방법을 제공한다.
관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 조류 인플루엔자에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 또는 뉴라미니다제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 방법은 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
조류 대상은 날개 웨브, 날개 끝, 흉근 또는 대퇴 근조직의 근육내 주사에 의해 감염될 수 있다.
조류 대상은 또한 난내 또는 에어로졸 분무에 의해 감염될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 조류 대상의 병원체의 항원을 암호화하는 이종 핵산 분자를 함유하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스의 난내 또는 에어로졸 분무 투여를 포함하는 조류 대상의 접종 방법을 제공한다.
인간 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래된 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 아데노바이러스는 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 조류의 병원체의 항원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래된다.
또다른 구현예에서, 조류의 병원체의 항원은 조류 인플루엔자에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 또는 뉴라미니다제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 방법은 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스를 조류 배아에게 전달하는, 조류 배아에게 면역원성 조성물을 전달하기 위한 난내 투여 기구를 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스를 하나 이상의 조류에게 전달하는, 하나 이상의 조류에게 면역원성 조성물을 전달하기 위한 에어로졸 분무 투여 기구를 제공한다.
하나의 구현예에서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터는 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래된 서열을 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터는 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 인간 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래된 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래된다.
또다른 구현예에서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자에서 유래될 수 있다.
또다른 구현예에서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌, 핵단백질, 매트릭스 또는 뉴라미니다제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또다른 구현예에서, 관심의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원은 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 또는 9 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 방법은 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 임의의 이전에 공지된 제품, 그 제품의 제조 방법 또는 그 제품의 이용 방법을 본 발명에 포함시키지 않음으로써, 출원인이 그에 대한 권리를 보류하고, 임의의 이전에 공지된 제품, 절차 또는 방법에 대한 권리포기를 본원에서 표명하는 것이 본 발명의 목적이다. 또한 본 발명은 USPTO (35 U.S.C. §112, first paragraph) 또는 EPO (Article 83 of the EPC) 의 서면명세요건 및 실시가능요건을 충족시키지 않는 임의의 제품, 절차 또는 그 제품의 제조 또는 그 제품의 이용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키는 않음으로써, 출원인이 그에 대한 권리를 보류하고 임의의 이전에 기술된 제품, 그 제품의 제조 방법 또는 그 제품의 이용 방법에 대한 권리포기를 본원에서 표명하려 한다는 점에 주의한다.
본 명세서에서, "포함한다", "포함된" 및 "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 정의하는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어 "포함한다", "포함된" 및 "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어진다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 정의하는 의미를 갖고, 예를 들어 이 용어는 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하지만, 종래의 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 악영향을 미치는 존재는 배제한다.
상기 및 다른 구현예는 개시되거나 하기 발명의 상세한 설명으로부터 명백하고 그에 포함되어 있다.
하기 발명의 상세한 설명은 예시적으로 제시된 것으로, 기술된 특정 구현예에 본 발명을 한정시키려는 것이 아니며, 본 발명에 참고적으로 포함되는 첨부 도면과 함께 이해할 수 있을 것이다.
도 1 은 조류 인플루엔자 HA 를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 난내 및 근육내 주사에 의한 닭의 면역화를 도시하는 그래프이다. 군 1 은 9 일령의 닭 수정란을 나타내고, 군 2 는 18 일령의 닭 수정란을 나타내며, 각각 수정란 당 5×1010 pfu 의 용량을 200 ㎕ 의 부피로 주사했다. 군 3 에서는, 조류 인플루엔자 HA 를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 동물 1 마리당 2.5×lO10 pfu 의 용량의 100 ㎕ 의 부피로 4 주령의 닭 3 마리에게 근육내 주사했다.
도 2 는 AdTW68.H5 를 인큐베이션 10 일 또는 18 일째 난내 만으로 백신접종한 28 일령의 SPF 닭, 및 인큐베이션 10 일 또는 18 일째 난내 백신접종하고 부화후 15 일째 비측 경로로 추가접종한 닭에서 탐지되는 적혈구응집 억제 항체 역가 (점) 를 도시한 그래프이다. 막대는 기하평균 log2[HI 역가] 이다. 순수 대조군 닭에서는 HI 역가가 탐지되지 않았다 (데이터는 미제시).
도 3 은 AdTW68.H5 를 수정 18 일째 난내로만 백신접종하거나 (병아리 7 마리) 또는 난내 백신접종하고 부화 후 15 일째 비강내 추가접종한 (병아리 12 마리), 부화후 23 일 및 29 일째 SPF 닭에 존재하는 적혈구응집반응 억제 항체 역가를 도시한 그래프이다. D23 및 D29 는 각각 부화후 23 일 및 29 일째의 HI 역가이고; 점은 각 병아리의 log2[HI 역가] 이고; 막대는 기하 평균 log2[HI 역가] 이다. 부화 후 23 일과 29 일째 순수 대조군 병아리 11 마리에서는 HI 역가가 탐지되지 않았다 (데이타는 미제시).
도 4 는 18 일령 백색 레그혼 (leghorn) 닭 배아의 난내 백신접종을 도시한 그래프이다. 난내 백신접종은 1011 vp 의 AdTW68.H5 를 이용하여 수행했다 (난내). 별도의 군에서, 난내 백신접종한 병아리에게 부화후 15 일째 동일한 용량의 AdTW68.H5 를 비강내 점하하여 추가접종했다 (난내 + 비측 추가접종). 면역화하지 않은 순수 배아를 음성 대조군으로서 제공했다 (대조군). 34 일령의 닭을 고병원성 A/Ck/Queretaro/14588-19/95 (H5N2) AI 바이러스 균주의 치사 용량으로 후비공 세극 (choanal slit) 을 통해 비강내로 공격했다. 생존률의 통계학적으로 유의한 변화는 Logrank 검사 (Prism 4.03, GraphPad Software) 를 이용한 연구를 통해 측정했다. AdTW68.H5 의 난내 백신접종은 비측 추가접종을 했거나 안했거나 백신접종하지 않은 대조군과 비교했을 때, AI 바이러스의 치사량 공격에 대하여 닭을 유의하게 방어했다 (100 %) (P ＜ O.001).
도 5 는 고병원성 AI 바이러스로 비강내 공격 후 백신접종한 닭과 대조군 닭에서 채취한 구강인두 시료에 존재하는, 정량적 실시간 RT-PCR (16) 로 정량화된 A/Chicken/Queretaro/14588-19/95 바이러스 RNA 를 도시한 그래프이다. 닭을 도 3 의 설명에 기술한 바와 같이 백신접종했다. 시료를 감염 후 2 일, 4 일 및 7 일째에 채취했다. 백신접종한 군과 백신접종하지 않은 대조군 사이의 바이러스 농도 (viarl load) 의 유의한 차이 (P ＜ O.05) 는 7 일째 달성되었다.
도 6 은 AdTW68.H5 벡터를 3×lO8 ifu 의 용량으로 접종하여 수행한 18 일째 난내 백신접종을 도시한 그래프이다. 상기 Ad5 벡터는 Sartobind Q5 막 (Sartorius North America, Inc., Edgewood, NY) 으로 정제하여 A195 완충액 (Evans, 2004) 에 재현탁시켰다. D25 일째에는 공격전 혈청 HI 항체를 분석했다. 마이너스 부호 (-) 는 공격으로 죽은 닭을 나타낸다; 플러스 부호 (+) 는 공격에서 살아남은 닭을 나타낸다. 생존한 닭은 죽은 닭과 비교했을 때 (무비교 t-검증(unpaired t-test); Prism 4.03) 상당히 상승된 공격전 혈청 HI 활성을 나타냈다 (P ＜ O.001). 모든 순수 대조군 닭 및 대조군 벡터 AdCMV-tetC 로 면역화된 닭은 측정가능한 HI 항체 역가를 나타내지 않았다.
도 7 은 AdTW68.H5 벡터를 3×lO8 ifu 의 용량으로 접종하여 수행한, 18 일째 난내 백신접종을 도시한 그래프이다. 상기 Ad5 벡터는 Sartobind Q5 막 (Sartorius North America, Inc., Edgewood, NY) 으로 정제하여 A195 완충액 (Evans, 2004) 에 재현탁시켰다. D31 일째에는 105 EID50 의 H5N1 AI 바이러스 A/swan/Mongolia//244L/2005 를 비강내 투여하여 대조군 및 면역화된 닭을 공격했다.
도 8 은 1 일령에 에어로졸 분무 백신접종 후 닭의 누액 중 존재하는 IgA 항-H7 을 도시한 그래프이다. 군 A - 단일 용량 중 1 ㎖ 당 1.1 × 1010 감염성 단위 (ifu) 를 함유하는 8 ㎖ 의 부피로 AdChNY94.H7 을 에어로졸 분무; 군 B - 24 ㎖ 의 부피로 동일한 백신을 에어로졸 분무 (또한 1 ㎖ 당 1.1 × 1010 ifu 의 Ad5) 및 16 일령에 추가접종 적용; 군 C - 백신접종하지 않은 대조군.
도 9 는 닭 혈청 중 적혈구응집 억제 (HI) 항체 역가를 도시한 그래프이다. 군 A - 단일 용량 중 1 ㎖ 당 1.1 × 1010 감염성 단위 (ifu) 를 함유하는 8 ㎖ 의 부피로 AdChNY94.H7 을 에어로졸 분무; 군 B - 24 ㎖ 의 부피로 동일한 백신을 에어로졸 분무 (또한 1 ㎖ 당 1.1 × 1010 ifu 의 Ad5) 및 16 일령에 추가접종 적용; 군 C - 백신접종하지 않은 대조군.
도 10. 안구 Ad5-H5 노출 후 9 일째 닭 하르더샘 내 조류 인플루엔자 헤마글루티닌의 발현. X 일령의 백색 레그혼을 AI 헤마글루티닌 유전자 혈청형 5 를 발현하는 아데노바이러스 2.5 × 108 감염성 단위에 노출시켰다. 조직을 2 시간 동안 산성 아세테이트-알콜 내에 고정시키고, 이어서 수크로스 (30 %) 내에서 인큐베이션하고, 그 뒤에 조직을 Neg 50 배지 내에 포매시키고, 동결시켰다. 냉동미세절단기로 5 ㎛ 절편을 절단하여 슬라이드 위에 놓아 건조시켰다. 상기 슬라이드를 아세톤으로 처리하고, 항-H5 친화도-정제된 토끼-항 H5 항체로 4 시간 동안 염색하기 전에 1 시간 동안 10 % FCS 로 차단했다. 상기 슬라이드를 깨끗이 세척하고, 커버 글라스를 Vectashield Hard Set 봉입제로 봉입했다. Ad5-H5 는 HDGL 을 노출시켰으나, 대조군은 H5 를 발현하지 않았다.
도 11. Ad5-H5 로 면역화한 닭 안구의 혈장 중 적혈구응집 억제 (HI) 역가. 대조군 닭 (n=11) 및 2.5 × 108 i.f.u. 의 Ad5-H5 로 2 회 (n=15) 또는 3 회 (n=9) 면역화한 닭에서 혈장 시료를 채취했다. HI 역가를 4 적혈구응집 단위의 저병원성 A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9) 균주를 이용하여 측정했다. 1.0 Log2 미만의 역가에 임의로 역가 0 을 부여했다. 대조군 닭에서는 HI 역가가 탐지되지 않았고, 한편 각각의 Ad5-H5 투여에 의해 안구 투여 후 14 일째 검사시 HI 역가가 증가했다.
도 12. Ad5-H5 의 안구 투여 후 Ad5-특이적 항체의 유도. Ad5-특이적 항체를 상기 기술된 바와 같이 ELISA 로 탐지했다. 간략히, 웰을 사멸 야생형 Ad5 바이러스로 코팅하고, 차단하고, 시료의 연속적 2 배 희석액을 밤새 인큐베이션했다. HRP-접합된 IgA 및 IgG 닭-특이적 항체를 이용하여 Ad5-특이적 항체를 탐지했다. 실온에서 30 분 후 반응을 중단시키고, 405 ㎚ 에서의 흡광도를 측정했다. 배경보다 .100 이상의 OD4O5 를 갖는 최고 희석액을 종말점-역가로 규정했다. 대조군 닭의 눈물 및 혈청에서 IgG 또는 IgA 항체 수준이 탐지되지 않았다.
도 13. 안구 면역화 후 하르더샘 내의 IgA 분비 세포. 면역화 후 9 일째 하르더샘에서 단리한 백혈구를 단리하고 항원-코팅된 ELISPOT 플레이트 위에 적재하고, CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션했다. HRP 에 접합된 항-IgA 항체로 항체 분비 세포를 탐지한 후, 물질 및 방법에서 기술한 바와 같이 기질을 부가하여 점을 시각화했다. 대조군 또는 안구 접종한 닭에서 유래된 하르더샘 백혈구를 함유하는 단일 웰을 도시했다.
도 14. Ad5-H5 에 의한 안구 면역화 후 하르더샘 내 H5- 및 Ad5-특이적 IgG 항체 분비 세포. Ad5-H5 투여 후 다양한 날에 하르더샘 (HDGL) 에서 백혈구를 단리하여 H5 및 Ad5 에 대한 항체 분비 세포에 대해 분석했다. 백혈구 106 개 당 IgG 점 형성 세포의 평균 개수 및 하나의 표준 오차를 나타냈다. 안구 Ad5-H5 투여 후 하르더샘에서 Ad5-특이적 및 H5-특이적 IgG 항체가 모두 생산된다.
도 15. Ad5-H5 에 의한 안구 면역화 후 하르더샘 내 H5- 및 Ad5-특이적 IgA 항체 분비 세포. Ad5-H5 투여 후 다양한 날에 하르더샘에서 백혈구를 단리하여 H5 및 Ad5 에 특이적인 IgA 항체 분비 세포에 대해 분석했다. 백혈구 106 개 당 IgA 점 형성 세포의 평균 개수 및 하나의 표준 오차를 나타냈다. 하르더샘에서 Ad5-특이적 및 H5-특이적 IgA 항체가 모두 생산되고, Ad5-H5 투여 후 9 일 및 11 일째 최고조에 달한다.
도 16. 닭의 하르더샘 내 중합체성-Ig 수용체 발현. Tri-시약 (Molecular Research, Inc.) 을 제조사 프로토콜에 따라 이용하여 닭 3 마리의 하르더샘에서 총 RNA 를 단리했다. 1 마이크로그램의 총 RNA 를 역전사시키고, 35 회의 PCR 사이클 (94 ℃, 1 분, 58 ℃, 1 분) 로 증폭시켰다. RT-PCR 산물 및 100 bp DNA 래더 (ladder) 를 1.5 % 아가로스 겔 상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색했다. 하르더샘에서 pIgR mRNA 가 생산됨을 확인하는 400 bp 앰플리콘을 관찰했다.
도 17. 눈물 및 혈청 내 닭 IgA 의 면역침전. 비오티닐화된 마우스-항-닭 IgA 모노클로날 항체 또는 비오티닐화된 폴리클로날 염소-항-닭 IgA 로 밤새 4 ℃ 에서 눈물 및 혈청을 인큐베이션했다. 다음날 4 ℃ 에서 밤새 연속적으로 교반하면서 세척된 스트렙타아비딘-접합된 세파로스 비드를 부가했다. 다음날 비드를 세척하고, SDS 시료 완충액 내에서 100 ℃ 에서 10 분 동안 끓였다. 4-12 % 프리-캐스트 구배 겔 상에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 면역침전제를 분석했다. Silver SNAP® silverstain kit 를 제조사 프로토콜에 따라 이용하여 단백질을 시각화했다. 이용된 약어: 단량체성 IgA = mIgA, 중합체성 IgA = pIgA, 4합체성 IgA = tIgA.
발명의 상세한 설명
용어 "핵산" 또는 "핵산 서열" 은 단일- 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 이 용어는 합성 백본을 보유한 핵산 유사 구조를 포함하며, 예를 들어 [Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; 및 Samstag, 1996] 을 참조한다.
본원에서 이용된, "재조합" 은 시험관내에서 합성되거나 다르게 조작된 폴리뉴클레오티드 (예, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 재조합 폴리뉴클레오티드를 이용하여 세포 또는 다른 생물학적 시스템 내에서 유전자 산물을 생산하는 방법, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 ("재조합 단백질") 를 의미한다. "재조합 방법" 은 또한 본 발명의 벡터에서 폴리펩티드 암호 서열의 발현, 예를 들어 유도성 또는 구성적 발현을 위해 발현 카세트 또는 벡터 내로 상이한 공급원 유래의 다양한 암호 영역 또는 도메인 또는 프로모터 서열을 보유한 핵산을 결찰시키는 것을 포함한다.
용어 "이종" 은 핵산과 관련하여 이용될 때에는 그 핵산이 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 세포 또는 바이러스 내에 있거나; 서로 자연에서 정상적으로 발견되는 것과 동일한 관계로 발견되지 않는 2 이상의 부분서열 (subsequence) 을 포함하거나; 또는 세포 또는 구조 내의 다른 핵산 또는 다른 분자에 대한 물리적 관계 또는 발현 수준이 자연에서 정상적으로 발견되지 않을 정도로 재조합적으로 조작된 것을 나타낸다. 이러한 상황에서 이용되는 유사한 용어는 "외인성" 이다. 예를 들어, 이종 핵산은 전형적으로는 관련이 없는 유전자 유래의 2 이상의 서열을 자연에서 발견되지 않는 방식으로 배열하여 (예를 들어, 본 발명의 아데노바이러스계 벡터에 삽입된 프로모터 서열에 인간 유전자를 작동가능하게 연결함) 재조합적으로 생산된다. 하나의 예로서, 관심의 이종 핵산은 면역원성 유전자 산물을 암호화할 수 있고, 여기서 아데노바이러스는 백신 또는 백신 조성물로서 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 이종 서열은 다양한 조합의 프로모터 및 서열을 포함할 수 있고, 그 예가 본원에 상세히 기술되어 있다.
"항원" 은 면역계에 의해 인식되고 면역 반응을 유도하는 물질이다. 이러한 상황에서 이용되는 유사한 용어는 "면역원" 이다.
"조류 대상" 본 발명의 상황에서 조 (Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하며, 신조상목 (Neognathae) 및 치조상목 (Palaeognathae) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 신조상목은 특히 기러기목 (Anseriformes), 칼새목 (Apodiformes), 부세로포메스 (Buceroformes), 쏙독새목 (Caprimulgiformes), 도요목 (Charadriiformes), 황새목 (Ciconiiformes), 쥐새목 (Coliiformes), 비둘기목 (Columbiformes), 파랑새목 (Coraciiformes), 뻐꾸기목 (Cuculiformes), 매목 (Falconiformes), 갈벌리포메스 (Galbuliformes), 닭목 (Galliformes), 아비목 (Gaviiformes), 두루미목 (Gruiformes), 무소파기포메스 (Musophagiformes), 오피스토코미포메스 (Opisthocomiformes), 참새목 (Passeriformes), 사다새목 (Pelecaniformes), 홍학목 (Phoenicopteriformes), 딱다구리목 (Piciformes), 논병아리목 (Podicipediformes), 바다제비목 (Procellariiformes), 앵무목 (Psittaciformes), 펭귄목 (Sphenisciformes), 올빼미목 (Strigiformes), 벌새목 (Trochiliforaies), 비단날개새목 (Trogoniformes), 세가락메추라기목 (Turniciformes) 및 후투티목 (Upupiformes) 을 포함한다. 치조상목은 특히 키위새목 (Apterygiformes), 화식조목 (Casuariiformes), 공조목 (Dinornithiformes), 레아목 (Rheiformes), 타조목 (Struthioniformes) 및 티니아미포메스 (Tiniamiformes) 를 포함한다. 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.
유전자 또는 핵산의 "발현" 은 세포에서의 유전자 발현 뿐만 아니라 클로닝계 및 임의의 다른 환경에서의 핵산(들)의 전사 및 해독을 포함한다.
본원에서 이용된 "벡터" 는 한 환경에서 또다른 환경으로 실체의 전달을 가능하게 하거나 용이하게 하는 도구이다. 예로서, 재조합 DNA 기술에 이용되는 일부 벡터는 DNA 분절 (예컨대, 이종 DNA 분절, 예컨대 이종 cDNA 분절) 과 같은 실체가 표적 세포 내로 전달될 수 있게 한다. 본 발명은 바이러스 벡터, 세균 벡터, 원생동물 벡터, DNA 벡터 또는 이의 재조합체를 포함할 수 있는 재조합 벡터를 포함한다.
백터 내의 발현을 위한 외인성 DNA (예컨대, 관심의 에피토프 및/또는 항원 및/또는 치료제를 암호화하는) 및 이러한 외인성 DNA 를 제공하는 문헌에 관해, 뿐만 아니라 핵산 분자의 발현을 증강시키기 위한 전사 및/또는 해독 인자의 발현에 관해, 그리고 "관심의 에피토프", "치료제", "면역 반응", "면역학적 반응", "방어 면역 반응", "면역학적 조성물", "면역원성 조성물" 및 "백신 조성물" 과 같은 용어에 관해서는 특히 미국 특허 번호 5,990,091 (1999 년 11 월 23 일에 특허됨), WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 그안에 인용된 문헌과 상기 특허 및 PCT 출원 계속 중 기록 문서 (이들 모두는 본원에 참고인용된다) 를 참고한다. 따라서, 미국 특허 번호 5,990,091 및 WO 98/00166 및 WO 99/60164, 및 그안에 인용된 문헌과 상기 특허 및 PCT 출원 계속 중 기록 문서, 및 본원에서 인용된 또는 본원에 참고인용된 다른 문헌들은 본 발명의 실시에 참고될 수 있고; 본원에 인용된 모든 외인성 핵산 분자, 프로모터 및 벡터는 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 또한 미국 특허 번호 6,706,693; 6,716,823; 6,348,450; 미국 특허 출원 일련 번호 10/424,409; 10/052,323; 10/116,963; 10/346,021; 및 PCT/US98/16739 로부터 1999 년 2 월 25 일에 공개된 WO 99/08713 도 참고할 수 있다.
본원에서 이용된 용어 "면역원성 조성물" 및 "면역학적 조성물" 및 "면역원성 또는 면역학적 조성물" 은 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 바이러스로부터 발현된 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 포함하며; 예를 들어, 대상에 투여된 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킨다. 용어 "백신성 조성물" 및 "백신" 및 "백신 조성물" 은 관심의 항원(들)에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하고; 예를 들어, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 본 발명의 아데노바이러스 벡터로부터 발현된 항원 또는 면역원에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다. 용어 "수의학적 조성물" 은 예를 들어 에리트로포이에틴 (EPO) 과 같은 치료적 단백질 또는 예를 들어 인터페론 (IFN) 과 같은 면역조절성 단백질을 발현하는 수의학적 용도를 위한 벡터를 포함하는 임의의 조성물을 의미한다. 유사하게, 용어 "약학적 조성물" 은 치료적 단백질을 발현하기 위한 벡터를 포함하는 임의의 조성물을 의미한다.
"면역학적 유효량" 은 대상에 투여했을 때 관심의 유전자 산물에 대한 면역 반응을 발생시키는 관심의 유전자를 암호화하는 재조합 벡터의 양 또는 농도이다.
"순환하는 재조합 형태" 는 2 이상의 아형 또는 균주 중에서 유전자 재편성된 재조합 바이러스를 의미한다. 본 발명의 상황에서 이용되는 다른 용어는 "하이브리드 형태", "재조합된 형태" 및 "재편성 형태" 이다.
"임상 단리물" 은 예를 들어 감염된 대상에서 단리되고, 고 증식성 공여체 바이러스의 실험실 순응된 마스터 균주를 보유한 실험용 세포 또는 대상 내에서 재편성된, 흔히 이용되는 실험용 바이러스 균주를 의미한다.
"야생 단리물" 은 감염된 대상 또는 환경에서 단리되는 바이러스를 의미한다.
본 발명의 방법은 예방적 백신접종으로서 질환을 예방하거나 또는 치료적 백신접종으로서 질환의 증상을 경감시키기 위해 적당히 적용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 단독으로 또는 면역학적 또는 면역원성 조성물의 일부로서 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 단백질(들)의 생체내 발현에 의해 관심의 대상에게 하나 이상의 단백질을 전달하거나 투여하는데 이용될 수도 있다.
본 발명에 따라 수득된 면역학적 산물 및/또는 항체 및/또는 발현된 산물은 시험관내에서 발현될 수 있고, 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체는 전형적으로 이용되는 방식으로 이용될 수 있으며, 이러한 면역학적 및/또는 발현된 산물 및/또는 항체를 발현하는 세포는 시험관내 및/또는 생체외 적용에 이용될 수 있음을 유념해야 한다. 예를 들어, 이러한 용도 및 적용은 진단, 분석, 생체외 치료 (예, 유전자 산물 및/또는 면역학적 반응을 발현하는 세포는 시험관내에서 증식되어 숙주 또는 동물 내로 재도입될 수 있음) 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,990,091, WO 99/60164 및 WO 98/00166 과 그안에 인용된 문헌을 참조한다. 또한, 본원의 방법으로 단리되거나 또는 본원의 투여 방법 후 시험관내에서 증식된 세포로부터 단리된, 발현된 항체 또는 유전자 산물은 면역을 유도하고, 치료적 반응을 자극하고/거나 수동 면역을 자극하기 위한 서브유닛 에피토프 또는 항원 또는 치료제 또는 항체의 투여와 유사하게, 조성물로 투여될 수 있다.
본원에서 이용된 용어 "인간 아데노바이러스" 는 매스트아데노바이러스 (Mastadenovirus) 속의 일원을 포함하는 아데노비리대 (Adenoviridae) 과의 모든 인간 아데노바이러스를 포함한다. 지금까지 51 가지 이상의 인간 혈청형의 아데노바이러스가 확인되었다 (예를 들어, Fields et al., Virology 2, Ch. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조). 상기 아데노바이러스는 혈청군 A, B, C, D, E 또는 F 에 속할 수 있다. 상기 인간 아데노바이러스는 혈청형 1 (Ad1), 혈청형 2 (Ad2), 혈청형 3 (Ad3), 혈청형 4 (Ad4), 혈청형 6 (Ad6), 혈청형 7 (Ad7), 혈청형 8 (Ad8), 혈청형 9 (Ad9), 혈청형 10 (Ad1O), 혈청형 11 (Ad11), 혈청형 12 (Ad12), 혈청형 13 (Ad13), 혈청형 14 (Ad14), 혈청형 15 (Ad15), 혈청형 16 (Ad16), 혈청형 17 (Ad17), 혈청형 18 (Ad18), 혈청형 19 (Ad19), 혈청형 19a (Ad19a), 혈청형 19p (Ad 19p), 혈청형 20 (Ad20), 혈청형 21 (Ad21), 혈청형 22 (Ad22), 혈청형 23 (Ad23), 혈청형 24 (Ad24), 혈청형 25 (Ad25), 혈청형 26 (Ad26), 혈청형 27 (Ad27), 혈청형 28 (Ad28), 혈청형 29 (Ad29), 혈청형 30 (Ad30), 혈청형 31 (Ad31), 혈청형 32 (Ad32), 혈청형 33 (Ad33), 혈청형 34 (Ad34), 혈청형 35 (Ad35), 혈청형 36 (Ad36), 혈청형 37 (Ad37), 혈청형 38 (Ad38), 혈청형 39 (Ad39), 혈청형 40 (Ad40), 혈청형 41 (Ad41), 혈청형 42 (Ad42), 혈청형 43 (Ad43), 혈청형 44 (Ad44), 혈청형 45 (Ad45), 혈청형 46 (Ad46), 혈청형 47 (Ad47), 혈청형 48 (Ad48), 혈청형 49 (Ad49), 혈청형 50 (Ad50), 혈청형 51 (Ad51) 또는 혈청형 5 (Ad5) 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 아데노바이러스 혈청형 유래의 부분바이러스 입자를 포함할 수 있는 재조합 아데노바이러스, 면역원성 조성물 및 재조합 벡터를 제공한다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 특정 조직 또는 세포 유형에 대해 변형된 향성을 나타낼 수 있고 (Havenga, M.J.E. et al., 2002), 따라서 상이한 아데노바이러스 캡시드, 즉, 다양한 아데노바이러스 혈청형 유래의 섬유 또는 펜톤 단백질의 혼합 및 매칭이 유리할 수 있다. 섬유 및 펜톤을 포함하는 아데노바이러스 캡시드의 변형은 미변형 아데노바이러스와 상이한 향성을 갖는 아데노바이러스 벡터를 초래할 수 있다. 표적 세포를 감염시키는 능력이 변형되어 최적화된 아데노바이러스 벡터는 치료적 또는 예방적 용량을 유의하게 감소시킬 수 있고, 이로써 국소적 및 전파되는 독성의 감소를 초래할 수 있다.
아데노바이러스는 무외피 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스 유래의 벡터는 유전자 전이에 특히 유용한 많은 특징을 갖는다. 본원에서 이용된 "재조합 아데노바이러스 벡터" 는 이종 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 (예, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 그 이상의 이종 뉴클레오티드 서열) 보유하는 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들어, 아데노바이러스의 생물학은 상세하게 특성이 규명되어 있으며, 아데노바이러스는 중증 인간 병리 상태와 연관되지 않으며, 이 바이러스는 자신의 DNA 를 숙주 세포에 도입시키는데 매우 효과적이며, 이 바이러스는 다양한 세포를 감염시킬 수 있어, 광범위한 숙주 범위를 갖고, 비교적 용이하게 대량 생산될 수 있으며, 바이러스 게놈의 조기 영역 1 ("E1") 을 결실시킴으로써 복제 결손성 및/또는 비복제성이 될 수 있다.
아데노바이러스의 게놈은 약 36,000 개의 염기쌍 ("bp") 을 보유하는 선형 이중가닥 DNA 분자로서, 각 가닥의 5' 말단에는 55 kDa 말단 단백질이 공유결합되어 있다. Ad DNA 는 약 100 bp 의 동일한 역방향 말단 반복 ("Inverted Terminal Repeats, ITR) 을 함유하며, 이의 정확한 길이는 혈청형에 따라 다르다. 바이러스 복제 원점은 게놈 단부에 있는 ITR 내에 위치해 있다. DNA 합성은 2 단계로 일어난다. 먼저, 복제가 가닥 치환에 의해 진행되어, 딸 이중 가닥 분자 및 부모의 치환된 가닥이 생성된다. 치환된 가닥은 단일 가닥이며, "팬핸들(panhandle)" 중간체를 형성할 수 있어, 복제 개시 및 딸 이중 가닥 분자의 생성을 가능하게 한다. 대안적으로, 복제가 게놈의 양 단부로부터 동시에 진행될 수 있고, 이는 팬핸들 구조의 형성을 필요로 하지 않는다.
증식성 감염 사이클 동안, 바이러스 유전자는 2 단계, 즉 바이러스 DNA 복제 전까지의 기간인 조기 단계, 및 바이러스 DNA 복제의 개시와 일치하는 후기 단계로 발현된다. 조기 단계 동안, E1, E2, E3 및 E4 영역에 의해 암호화된 조기 유전자 산물만이 발현되어, 바이러스 구조 단백질의 합성을 위해 세포를 준비시키는 많은 기능을 수행한다 (Berk, A. J., 1986). 후기 단계 동안, 조기 유전자 산물에 더하여 후기 바이러스 유전자 산물이 발현되고, 숙주 세포 DNA 및 단백질 합성이 중단된다. 결과적으로, 세포는 바이러스 DNA 및 바이러스 구조 단백질의 생산만을 담당하게 된다 (Tooze, J., 1981).
아데노바이러스의 E1 영역은 표적 세포의 감염 후 발현되는 아데노바이러스의 제 1 영역이다. 이 영역은 2 개의 전사 단위, E1A 및 E1B 유전자로 이루어져 있고, 이는 모두 일차(배아) 설치류 배양물의 종양원성 형질전환에 필요한 것이다. E1A 유전자 산물의 주요 기능은 휴지 세포가 세포 주기를 시작하고 세포 DNA 합성을 재개하도록 유도하고, E1B 유전자 및 바이러스 게놈의 다른 조기 영역(E2, E3 및 E4)을 전사적으로 활성화시키는 것이다. E1A 유전자 단독에 의한 일차 세포의 트랜스펙션은 무제한적 증식 (불멸화) 을 유도할 수 있지만, 완전한 형질전환을 초래하지는 않는다. 그러나, E1A 의 발현은 대부분의 경우 세포예정사 (세포자멸사) 의 유도를 초래하고, 가끔씩만 무한증식이 수득된다 (Jochemsen et al., 1987). E1B 유전자의 동시발현은 세포자멸사의 유도를 방지하고 완전한 형태적 형질전환이 일어나는데 필요하다. 확립된 불멸 세포주에서, E1A 의 고농도 발현은 E1B 의 부재 하에서 완전한 형질전환을 야기할 수 있다 (Roberts, B. E. et al., 1985).
E1B 암호화된 단백질은 E1A 가 바이러스 복제가 가능하도록 세포 기능을 전용하는 것을 돕는다. E1B 55 kD 및 E4 33 kD 단백질은 본질적으로 핵에 위치하는 복합체를 형성하고, 숙주 단백질의 합성을 억제하고 바이러스 유전자의 발현을 촉진하는 기능을 한다. 이들의 주요 영향은 감염의 후기 단계의 개시와 동시에, 핵에서 세포질로 바이러스 mRNA 의 선택적 수송을 확립하는 것이다. E1B 21 kD 단백질은 증식성 감염 주기의 정확한 일시적 조절에 중요하며, 이로써 바이러스 생명주기가 완료되기 전에 숙주 세포가 조기 사망하는 것을 방지한다. E1B 21 kD 유전자 산물을 발현할 수 없는 돌연변이 바이러스는 숙주 세포 염색체 DNA 의 과도한 분해 (deg-표현형) 및 증강된 세포변성 효과 (cyt-표현형; Telling et al., 1994) 가 동반되는 단축된 감염 주기를 나타낸다. deg 및 cyt 표현형은 E1A 유전자가 추가로 돌연변이될 때 억제되며, 이는 이 표현형들이 E1A 의 기능임을 시사한다 (White, E. et al., 1988). 게다가, E1B 21 kDa 단백질은 E1A 가 다른 바이러스 유전자 상에서 전환되는 속도를 늦춘다. E1B 21 kD 이 어떠한 메카니즘에 의해 상기 E1A 종속적 기능을 억제하는지는 아직 알려지지 않았다.
예를 들어 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 숙주 세포의 게놈 내로 효과적으로 통합되지 않고, 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 재조합 유전자를 생체내에서 효과적으로 전이할 수 있다 (Brody et al., 1994). 이러한 특징은 아데노바이러스를 예를 들어 관심의 항원 또는 면역원을 이를 필요로 하는 세포, 조직 또는 대상 내로 생체내 유전자 전이하기에 매력적인 후보로 만든다.
복수의 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 벡터의 운반능을 증가시키고, 복제 가능성 아데노바이러스 (RCA) 를 생성할 재조합의 가능성을 감소시킬 수 있다. 아데노바이러스가 복수의 결실을 함유할 때, 각 결실이 단독으로 존재하는 경우에 복제 결손성 및/또는 비복제성 아데노바이러스를 산출하는 것일 필요는 없다. 결실들 중 하나가 아데노바이러스를 복제 결손성 또는 비복제성이 되게 하는 한, 부가적 결실들은 다른 목적을 위해, 예를 들어 아데노바이러스 게놈의 이종 뉴클레오티드 서열 운반능을 증가시키기 위해 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 결실은 기능성 단백질의 발현을 방지하여 아데노바이러스를 복제 결손성 및/또는 비복제성 및/또는 약독화 (attenuated) 되게 한다. 또다른 구현예에서, 모든 결실은 아데노바이러스를 복제 결손성 및/또는 비복제성 및/또는 약독화되게 하는 결실이다. 그러나, 본 발명은 또한 복제 가능성 및/또는 야생형인, 즉 대상에서의 감염 및 복제에 필요한 모든 아데노바이러스 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스도 포함한다.
아데노바이러스 재조합체를 이용하는 본 발명의 구현예는 E1 및 E3, 또는 E1 및 E4, 또는 E3 및 E4, 또는 E1, E3 및 E4 의 결실을 포함하는, E1-결손성 또는 결실된, 또는 E3-결손성 또는 결실된, 또는 E4-결손성 또는 결실된 아데노바이러스 벡터, 또는 모든 바이러스 유전자가 결실된 "알맹이가 없는 (gutless)" 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 이 아데노바이러스 벡터는 E1, E3 또는 E4 유전자에 돌연변이를 포함하거나, 이들 또는 모든 아데노바이러스 유전자에 결실을 포함할 수 있다. E1-결손성 아데노바이러스 돌연변이체가 비-허용 세포에서 복제 결손성 및/또는 비복제성이라고 전해지고, 적어도 매우 약독화되기 때문에, E1 돌연변이는 벡터의 안전역 (safety margin) 을 상승시킨다. E3 돌연변이는 아데노바이러스가 MHC 클래스 I 분자를 하향조절하는 메카니즘을 붕괴시켜 항원의 면역원성을 증강시킨다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제함으로써 아데노바이러스 벡터의 면역원성을 감소시키고, 이로써 동일한 벡터를 이용한 반복된 재백신접종이 가능하도록 할 수 있다. 본 발명은 E1, 또는 E3, 또는 E4, 또는 E1 및 E3, 또는 E1 및 E4 에서 결실되거나 돌연변이된 임의의 혈청형 또는 혈청군의 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 아데노바이러스 유전자의 결실 또는 돌연변이는 상기 단백질들이 활성에 손상 또는 실질적으로 완전한 상실을 초래한다.
"알맹이가 없는" 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터과에 속하는 또다른 유형의 벡터이다. 이 벡터의 복제에는 자연 환경에 존재하지 않는 조건인 E1a 및 Cre 를 모두 발현하는 특별한 인간 293 세포주와 헬퍼 바이러스가 있어야 하고; 이 벡터에는 모든 바이러스 유전자가 결실되어 있어서, 이 벡터는 백신 담체로서 비면역원성이어서, 재백신접종을 위해 여러번 접종될 수 있다. "알맹이가 없는" 아데노바이러스 벡터는 또한 관심의 항원 또는 면역원(들)을 수용하기 위한 36 kb 공간을 함유하며, 따라서 세포 내로 다수의 항원 또는 면역원의 동시전달이 가능하다.
당업계에 공지된 다른 아데노바이러스 벡터 시스템은 AdEasy 시스템 (He et al., 1998) 및 이후에 변형된 AdEasier 시스템 (Zeng et al., 2001) 을 포함하며, 이들은 BJ5183 세포와 같은 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) 세포 내에서 밤새 공여체 벡터 및 Ad 헬퍼 벡터 사이에 상동성 재조합이 일어나게 함으로써 293 세포 내에서 재조합 Ad 벡터가 신속하게 생성되도록 개발되었다. pAdEasy 는 관심의 항원 또는 면역원을 발현하는 pShuttle-CMV 와 같은 공여체 벡터와 트랜스로 (in trans) 공급되었을 때 아데노바이러스 캡시드 내 항원 또는 면역원 (예, 면역원들 및/또는 항원들) 의 패키징을 초래하는 아데노바이러스 구조 서열을 함유한다. pAdEasy 의 서열은 당업계에 공지되어 있고, Stratagene 을 통해 구매할 수 있다.
본 발명은 AdHigh 시스템 (미국 특허 가출원 일련번호 60/683,638) 을 이용하여 생성될 수 있다. AdHigh 는 조류 대상에게 유해하거나 치명적일 수 있는 RCA 를 생성할 위험 없이, 고역가의 재조합 아데노바이러스를 생성하는 안전하고, 신속하고, 효과적인 방법이다. 또한, RCA 는 인간에게 병원성일 수 있고, 먹이사슬에 존재하는 것은 바람직하지 않다. AdHigh 시스템은 E. 콜리 세포에서 아데노바이러스 백본 플라스미드와 재조합체를 형성한 후 AdHigh 와 같은 변형된 셔틀 플라스미드를 이용하여 PER.C6 세포와 같은 허용 세포에서 RCA-프리 아데노바이러스의 생산을 촉진한다. 이러한 셔틀 플라스미드는 예를 들어 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원과 같은 조류 면역원 또는 항원의 용이한 삽입을 위한 다클로닝부위 (MSC) 또는 폴리링커를 함유한다. 아데노바이러스 셔틀 플라스미드의 재조합은 세균 세포 (즉, BJ5183) 에서 pAdEasy 와 같은 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드와 함께 용이하게 수행되어 본 발명의 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스를 생산할 수 있다. 클로닝 및 제한 분석에 의한 재조합 벡터의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
인간 Ad5 는 새에서 자연적으로 발견되지 않고, RCA-프리 Ad5 벡터는 E1 의 부재 하에 인간 세포에서 복제하지 않는다; 따라서, E1/E3-결손성 인간 Ad5 벡터를 이용하는 면역화 요법의 안전성 프로필이 매우 바람직하다. 또한, 상기 벡터는 조류 세포에서의 형질도입 가능성 및 복제 불가능성으로 인해 가금류에서 백신 담체로서 이용될 수 있다. Ad5 벡터는 닭 세포의 표면에서 발견되는 콕사키에바이러스 및 아데노바이러스 수용체 (CAR) 에 대한 그의 섬유의 결합을 통해 점막피부 경계면을 따라 닭 세포의 일부를 형질도입시켰을 수 있었다 (Tan et al., 2001). 하나 이상의 Ad5 구성요소, 헥손은 고면역원성이고 외인성 항원에 대해 보강제 활성을 부여한다 (Molinier-Frenkel et al., 2002).
Ad5 벡터화된 백신은 주 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 I 제한된 T-세포 반응을 유도하는 능력에 있어서 자연 감염의 효과를 모방하나, 이 벡터로부터 병원체 게놈의 아분절만이 발현되기 때문에 다시 독성으로 복귀할 가능성은 없다. 이러한 "선택적 발현" 은 백신접종된 미감염 동물을 감염된 동물과 구별하는 문제를 해결할 수 있는데, 이는 상기 벡터에 의해 암호화되지 않는 병원체의 특정 마커가 두 동물을 구별하는데 이용될 수 있기 때문이다. Ad5 벡터화된 백신은 용이하게 생성되고, 생물조작되고, 제조되고, 저장된다. 특히, 관련 항원 유전자를 합성할 수 있기 때문에 벡터화된 백신의 제조에 병원체의 증식이 필요하지 않다 (Toro et al., 2008). 이는 H5N1 AI 백신의 생산에 특히 중요한데, 그 이유는 이 균주가 증식하는 것이 너무 위험하고 어렵기 때문이다 (Wood et al., 2002).
RGD 모티프와 같은 특정 서열 모티프가 아데노바이러스 벡터의 H-I 루프에 삽입되어 아데노바이러스 벡터의 감염성을 증강시킬 수 있다. 이 서열은 인테그린으로 불리는 세포 표면 수용체의 상과와 특정 세포외 매트릭스 및 부착 단백질의 상호작용에 필수적인 것으로 밝혀졌다. RGD 모티프의 삽입은 유리하게는 면역저하된 대상에서 유용할 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 상기 기술한 바와 같은 임의의 아데노바이러스 벡터에 특정 항원 또는 면역원 또는 이의 조각을 클로닝시켜 구성된다. 이러한 아데노바이러스 재조합체는 척추동물용의 세포를 형질도입시키는데 면역화 물질로서 이용된다 (예를 들어, 참고인용된 미국 특허 출원 일련 번호 10/424,409 참조).
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 핵산을 세포로 시험관내 및 생체내 모두에서 전달하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 벡터는 핵산을 동물 세포에 전달하거나 전이시키는데 유리하게 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 동물 세포는 조류 및 포유류 세포이다. 관심의 핵산은 펩티드 및 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 핵산은 치료적 (예, 의학용 또는 수의학용) 또는 면역원성 (예, 백신용) 펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다.
하나의 구현예에서, 관심의 항원 또는 면역원을 암호화하는 코돈은 "최적화된" 코돈, 즉, 예를 들어 인플루엔자에 의해 흔히 이용되는 코돈 대신, 고도로 발현되는 조류 유전자에서 흔히 나타나는 코돈이다. 이러한 코돈 이용은 인간 또는 조류 세포에서 항원 또는 면역원의 효과적인 발현을 제공한다. 하나의 구현예에서, 예를 들어, 관심의 항원 또는 면역원이 세균, 효모 또는 다른 발현 시스템에서 발현될 때, 코돈 이용 패턴이 변경되어 상기 항원 또는 면역원이 발현되고 있는 유기체에서 고도로 발현되는 유전자에 대한 코돈 편향을 나타낸다. 코돈 이용 패턴은 많은 종의 고도로 발현되는 유전자에 관한 문헌에 공지되어 있다 (예, Nakamura et al., 1996; Wang et al, 1998; McEwan et al. 1998).
추가의 대안으로서, 아데노바이러스 벡터는 배양물 중의 세포를 감염시켜 원하는 유전자 산물을 발현시키는데, 예를 들어 관심의 단백질 또는 펩티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 단백질 또는 펩티드는 배지로 분비되고, 당업계에 공지된 통상적인 기술 뿐만 아니라 본원에 제공된 기술을 이용하여 배지로부터 정제될 수 있다. 단백질의 세포외 분비를 안내하는 신호 펩티드 서열은 당업계에 공지되어 있고, 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 관심의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 세포는 용해될 수 있고, 발현된 재조합 단백질이 이 세포 용해물로부터 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 동물 세포이다. 또다른 구현예에서, 동물 세포는 조류 또는 포유류 세포이다. 또다른 구현예에서, 세포는 아데노바이러스에 의한 형질도입이 가능할 수 있다.
이러한 세포는 PER.C6 세포, 911 세포 및 HEK293 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 조류 배아 섬유아세포, 예컨대 DF-1 세포, 조류 줄기 세포, 예컨대 본원에 참고인용된 미국 특허 번호 6,872,561; 6,642,042; 6,280,970; 및 6,255,108 에 기술된 세포, 조류 림프아세포, 조류 상피 세포, 특히 예컨대 닭 배아 유래의 세포주 CHCC-OU2 (Ogura, H. et al., 1987; 일본 특허 공개 번호 9-173059), 메추라기 유래의 세포주 QT-35 (일본 특허 공개 번호 9-98778) 등과 같은 조류 세포의 이용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 감염, 트랜스펙션 또는 임의의 유형의 유전자 전이가 가능한 임의의 조류 세포가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
숙주 세포를 배양하기 위한 배양 배지는 조직 배양에 통상적으로 이용되는 배지, 특히 예컨대 M199-어얼리 베이스, Eagle MEM (E-MEM), Dulbecco MEM (DMEM), SC-UCM102, UP-SFM (GIBCO BRL), EX-CELL302 (Nichirei), EX-CELL293-S (Nichirei), TFBM-01 (Nichirei), ASF104 를 포함한다. 특정 세포 유형에 적합한 배양 배지는 미국모식균배양물수집소 (American Type Culture Collection, ATCC) 또는 유럽 세포배양물 수집소 (European Collection of Cell Cultures, ECACC) 에서 찾을 수 있다. 배양 배지는 L-글루타민과 같은 아미노산, 염, 항진균제 또는 항균제, 예컨대 Fungizone®, 페니실린-스트렙토마이신, 동물 혈청 등으로 보충될 수 있다. 세포 배양 배지는 임의로 무혈청일 수 있다.
본 발명은 또한 백신으로서 유용한 벡터를 제공한다. 면역원 또는 항원은 아데노바이러스 캡시드 내에서 제시될 수 있고, 대안적으로, 항원은 재조합 아데노바이러스 게놈 내로 도입되어 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반되는 항원 또는 면역원으로부터 발현될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 임의의 관심의 항원 또는 면역원을 제공할 수 있다. 면역원의 예가 본원에 기술되어 있다.
항원 또는 면역원은 적당한 발현 조절 서열과 작동가능하게 연관될 수 있다. 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 원점 (이는 예를 들어, pBR322 와 같은 세균 벡터에서 유래된 세균 기원, 또는 진핵 기원, 예를 들어, 자가 복제 서열 (ARS)), 프로모터, 인핸서, 및 필수적 정보 처리 자리, 예컨대 리보솜 결합 자리, RNA 스플라이스 자리, 폴리아데닐화 자리, 패키징 신호, 및 전사 종결자 서열을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 표적 세포에 전달될 항원 또는 면역원 서열(들) 과 작동가능하게 연관된 적당한 전사/해독 조절 신호 및 폴리아데닐화 신호 (예, 소 성장 호르몬에서 유래된 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호) 를 함유할 수 있다. 원하는 조직-특이적 발현 및 수준에 따라 다양한 프로모터/인핸서 요소가 이용될 수 있다. 프로모터는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적 또는 유도성 (예, 메탈로티오네인 프로모터) 일 수 있다. 프로모터는 선천성 또는 외래성일 수 있고, 자연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래란, 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서 그 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것을 의미한다. 프로모터는 관심의 표적 세포(들) 또는 조직(들)에서 기능하도록 선택된다. 뇌 특이적, 간 특이적 및 근육 특이적 (골격, 심장, 평활근 및/또는 횡경막 특이적을 포함함) 프로모터가 본 발명에 포함된다. 포유류 및 조류 프로모터가 또한 본 발명의 구현예에 포함된다.
프로모터는 유리하게는 "조기 (early)" 프로모터일 수 있다. "조기" 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 새로운 단백질 합성의 부재 하에 신속하고 일시적으로 발현되는 유전자의 발현을 추진하는 프로모터로 정의된다. 프로모터는 또한 "강한" 또는 "약한" 프로모터일 수 있다. 용어 "강한 프로모터" 및 "약한 프로모터" 는 당업계에 공지되어 있고, 프로모터에서의 전사 개시의 상대적 빈도 (1 분 당 회수) 에 의해 정의된다. "강한" 또는 "약한" 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제에 대한 친화도에 의해 정의될 수도 있다.
하나의 구현예에서, 항원 또는 면역원은 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 주 즉시-조기 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α (EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스 프로모터와 작동가능하게 연관된다. 다른 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스 등에서 유래된 프로모터를 포함한다. 임의의 조류 바이러스 프로모터 외에도, 임의의 포유류 바이러스 프로모터가 또한 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 바이러스 기원의 조류 프로모터 중에서, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 바이러스의 즉시 조기 (즉, ICP4, ICP27) 유전자, 마렉병 바이러스 (즉, gB, gC, pp38, pp14, ICP4, Meq) 의 조기 (즉, 티미딘 키나제, DNA 헬리카제, 리보뉴클레오티드 리덕타제) 또는 후기 (즉, gB, gD, gC, gK) 유전자 또는 칠면조의 헤르페스 바이러스 (즉, gB, gC, ICP4) 의 유전자의 프로모터가 본 발명의 방법 및 벡터에 이용될 수 있다. 더욱이, 과도한 실험 없이 항원 또는 면역원에 대한 면역 반응을 유도 또는 유발시키기에 충분히 높은 수준에서 관심의 항원 또는 면역원을 발현하는 적합한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 당업자의 영역 내이다.
CMV 프로모터에 의한 이종 뉴클레오티드 전사의 추진은 면역적격 동물에서 발현의 하향조절을 초래할 수 있는 것으로 생각되었다 (예를 들어, Guo et al., 1996 참조). 항원 또는 면역원 서열은, 예를 들어, 항원 또는 면역원 발현의 하향조절을 초래하지 않는 변형된 CMV 프로모터와 작동가능하게 연관될 수 있다.
본 발명의 벡터는 유리하게는 프로모터의 하류에 위치할 수 있는 폴리링커 또는 다클로닝부위 ("MCS") 를 또한 포함할 수 있다. 폴리링커는 프로모터 서열과 "프레임이 일치하는 (in-frame)" 항원 또는 면역원 분자의 삽입을 위한 자리를 제공하여, 프로모터 서열을 관심의 항원 또는 면역원에 "작동가능하게 연결" 시킨다. 다클로닝부위 및 폴리링커는 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서 이용된 용어 "작동가능하게 연결된" 은 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 것을 의미한다.
항생제 내성을 암호화하는 선택 마커는, 시험관내 증폭 및 정제에 이용될 때, 그리고 시판되는 AdEasy, AdEasier 및 AdHigh 아데노바이러스 시스템의 환경에서는 공여체 벡터와 아데노바이러스 헬퍼 벡터 사이의 동종 재조합을 모니터링하기 위해, 벡터에 따라 존재할 수 있다. AdEasy, AdEasier 및 AdHigh 시스템은 ITR 서열에서 공여체 벡터 및 아데노바이러스 헬퍼 벡터 사이의 상동성 재조합을 촉진한다. 각각의 벡터는 상이한 항생제 내성 유전자를 포함하고, 재조합된 벡터를 발현하는 재조합체가 이중 선택에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 상기 항생제 내성 유전자의 예는 특히 암피실린, 테트라사이클린, 네오마이신, 제오신, 카나마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하나 이상의 항원 또는 면역원이 존재하는 구현예에서, 항원 또는 면역원 서열은 단일 상류 프로모터 및 하나 이상의 하류 내부 리보솜 도입 자리 (IRES) 서열 (예, 피코나바이러스 EMC IRES 서열) 과 작동가능하게 연관될 수 있다.
항원 또는 면역원 서열(들)이 표적 세포에서 전사된 후 해독될 본 발명의 구현예에서, 삽입된 단백질 암호 서열의 효과적인 해독을 위해 일반적으로 특정 개시 신호가 필요하다. 이러한 외인성 해독 조절 서열은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있고, 자연 및 합성의 다양한 기원에서 유래할 수 있다.
조류 병원체에서 유래된 임의의 조류 항원 또는 면역원이 본 발명의 방법 및 재조합 벡터에 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항원 또는 면역원은 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래된 항원 또는 면역원, 예컨대 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 매트릭스, 및 핵단백질 항원 또는 면역원, 감염성 점액낭병 바이러스 항원 예컨대 VP1, VP1s1, VP1s2, VP2 (Heine, H.G. et al., 1991; Dormitorio, T. V. et al., 1997; 및 Cao, Y.C. et al., 1998), VP2S, VP3, VP4, VP4S 및 VP5, 마렉병 바이러스 항원 예컨대 티미딘 키나제, gA, gB, gC, gD, gE, gH, gI 및 gL (Coussens et al. 1988; Ross et al. 1989; Ross et al. 1991; 국제 공개 번호 WO 90/02803 (1990); Brunovskis and Velicer, 1995; 및 Yoshida et al. 1994), 헤르페스바이러스류 예컨대 gA, gB, gD, gE, gI 및 gG 를 포함하는 감염성 후두기관염 바이러스 항원 (Veits, J. et al 2003), 조류 감염성 기관지염 바이러스 항원 예컨대 돌기 당단백질, 통합 막 단백질 M, 소형 막 단백질 E, 및 다기능단백질 (Casais, R. et al 2003), 조류 레오바이러스 항원 예컨대 캡시드, 시그마 NS, 시그마 A, 시그마 B 및 시그마 C 단백질 (Spandidos, D. A. et al, 1976), 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스 및 도브폭스를 포함하는 폭스바이러스류 항원 예컨대 티미딘 키나제, 조류 폴리오마바이러스 항원 예컨대 VPl, VP2, VP3 및 VP4 (Rott, O. et al 1988), 뉴캣슬병 바이러스 항원 예컨대 HN, P, NP, M, F 및 L 단백질 (Alexander, D.J., 1990 에서 리뷰됨), 조류 폐렴바이러스 항원 SH, F, G 및 N (Seal, B.S., 2000), 조류 비기관염 바이러스 항원 예컨대 당단백질, 매트릭스, 융합 및 뉴클레오캡시드 (Cook, J.K., 1990), 조류 망상내피증 바이러스 항원 예컨대 p29, 엔벨로프, gag, 프로테아제 및 폴리머라제 (Dornburg, R. 1995), 조류 레트로바이러스 예컨대 조류 암종 바이러스 항원 gag, pol 및 env, 조류 내인성 바이러스 gag, pol, env, 캡시드 및 프로테아제 (Rovigatti, U.G. et al, 1983), 조류 적아구증 바이러스 gag, erbA, erbB (Graf, T. et al, 1983), 조류 간염 바이러스 코어 단백질, pol, 및 표면 단백질 (Cova, L. et al, 1993), 조류 빈혈 바이러스 VP1, VP2, VP3 (Rosenberger, J.K. et al, 1998), 조류 장염 바이러스 항원 폴리머라제, 52K 단백질, 펜톤, IIIa 및 코어 단백질 (Pitcovski, J. et al., 1988), 파체코병 바이러스 IE 단백질, 당단백질 K, 헬리카제, 당단백질 N, VP11-12, 당단백질 H, 티미딘 키나제, 당단백질 B 및 핵 인단백질 (Kaleta E.F., 1990), 조류 백혈병 바이러스 항원 엔벨로프, gag 및 폴리머라제 (Graf, T. et al, 1978), 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스 항원 예컨대 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6 및 VP7 (Mori, Y. et al, 2003; Borgan, M. A. et al, 2003), 조류 백혈증 바이러스 항원 예컨대 엔벨로프, gag 및 폴리머라제 (Bieth, E. et al, 1992); 조류 근건막 섬유육종 바이러스 (Kawai, S. et al, 1992), 조류 골수아구증 바이러스 항원 p15, p27, 엔벨로프, gag, 및 폴리머라제, 뉴클레오캡시드 및 gs-b (Joliot, V. et al., 1993), 조류 골수아구증 연관 바이러스 (Perbal, B., 1995), 조류 골수구종증 바이러스 (Petropoulos, C.J., 1997), 조류 육종 바이러스 항원 예컨대 p19 및 엔벨로프 (Neckameyer, W.S. et al, 1985), 및 조류 비장 괴사 바이러스 gag, 엔벨로프 및 폴리머라제 (Purchase, H.G. et al, 1975) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상황에서 이용될 수 있는 다른 면역원/항원은 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 균주 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 39 kDa 피막 단백질 (Ali, H.A. et al, 2004; Rimler, R.B. 2001), 16-kDa 외막 단백질 (Kasten, R.W., et al, 1995), 지질다당류 (Baert, K. et al, 2005); 에세리키아 콜리 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 유형 1 술(fimbriae), P 술, 및 컬리(curli) (Roland, K. et al, 2004); F1 섬모 어드해신, P 섬모 어드해신, 에어로박틴 수용체 단백질 및 지질다당류 (Kariyawasam, S. et al, 2002); 마이코플라스마 갈리셉티컴 (Mycoplasma gallisepticum) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 주요 막 항원 pMGA (또한 P67 로도 알려짐; Jan, G. et al, 2001; Noormohammadi, A.H. et al, 2002a), TM-1 (Saito, S. et al, 1993), 어드해신 (Barbour, E.K. et al, 1989), P52 (Jan, G. et al, 2001) 혈청평판응집 (SPA) 항원 (Ahmad, I. et al, 1988); 마이코플라스마 갈리나슘 (Mycoplasma gallinaceum), 마이코플라스마 갈리나럼 (Mycoplasma gallinarum), 마이코플라스마 갈로파보니스 (Mycoplasma gallopavonis), 마이코플라스마 시노비애 (Mycoplasma synoviae) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 주요 막 항원 MSPB (Noormohammadi, A.H. et al, 2002b) 및 165-kDa 단백질 (Ben Abdelmoumen, B. et al, 1999); 마이코플라스마 멜레아그리디스 (Mycoplasma meleagridis), 마이코플라스마 이오웨 (Mycoplasma iowae), 마이코플라스마 풀로럼 (Mycoplasma pullorum), 마이코플라스마 이미탄스 (Mycoplasma imitans), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis) 유래의 조류 세균 항원, 예컨대 편모, 포린, OmpA, SEF21 및 SEF 14 술 (Ochoa-Reparaz, J. et al, 2004); 예를 들어, SEF14 및 SEF21 을 발현하는 갈리나럼 (Gallinarum) 및 티피뮤리엄 (Typhimurium) 과 같은 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 혈청형 유래의 항원 (Li, W. et al, 2004); 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 항원, 예컨대 편모, 67-kDa 항원, CjaA, CjaC 및 CjaD 단백질 (Widders, P.R. et al, 1998; Wyszynska, A. et al, 2004), 헤모필러스 파라갈리나럼 (Haemophilus paragallinarum) 유래의 항원, 예컨대 혈청군 A, B 및 C 항원 예컨대 헤마글루티닌 (Yamaguchi, T. et al, 1988); 리메렐라 아나티페스티퍼 (Riemerella anatipestifer) 유래의 항원, 예컨대 벡테린 항원 (Higgins, D.A. et al, 2000); 클라미디아 시타시 (Chlamydia psittaci) 유래의 항원, 예컨대 예를 들어, 주요 외막 단백질 (MOMP) 을 발현하는 혈청형 A 및 6B (Vanrompay, D. et al, 1999); 에리시펠로트릭스 류시오파티에 (Erysipelothrix rhusiopathiae) 유래의 항원, 예컨대 66-64 kDa 단백질 항원 (Timoney, J.F. et al, 1993); 에리시펠로트릭스 인시디오사 (Erysipelothrix insidiosa) 유래의 항원, 예컨대 박테린 (Bigland, C.H. and Matsumoto, J.J., 1975), 브루셀라 아보투스 (Brucella abortus) 유래의 항원, 예컨대 항원 P39 및 박테리오페린 (Al-Mariri, A. et al, 2001), 보렐리아 안세리나 (Borrelia anserina) 유래의 항원, 예컨대 22-킬로달톤 주요 외표면 단백질 (Sambri, V. et al, 1999), 외막 단백질 P66 (Bunikis, J. et al, 1998), 및 OspC (Marconi, R.T. et al, 1993); 알칼리제네스 페컬리스 (Alcaligenes faecalis), 스트렙토코커스 페컬리스 (Streptococcus faecalis), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 항원을 포함한다.
또한 본 발명은 조류의 원생동물 항원 유래의 면역원/항원, 특히 예컨대 에이메리아 아세르불리나 (Eimeria acervulina) 유래의 항원, 예컨대 3-1E 항원 (Lillehoj, H.S. et al, 2005; Ding, X. et al, 2004), 첨단복합체 항원 (Constantinoiu, C.C. et al, 2004), 및 젖산염 탈수소효소 (Schaap, D. et al, 2004), 에이메리아 막시마 (Eimeria maxima) 유래의 항원, 예컨대 gam56 및 gam82 (Belli, S.I. et al, 2004), 56 및 82 kDa 항원 단백질 (Belli, S.I. et al, 2002), 및 EmTFP250 (Witcombe, D.M. et al, 2004), 에이메리아 네카트릭스 (Eimeria necatrix) 유래의 항원, 예컨대 35-kD 단백질 (Tajima, O. et al, 2003), 에이메리아 테넬라 (Eimeria tenella) 유래의 항원, 예컨대 TA4 및 SO7 유전자 산물 (Wu, S.Q. et al, 2004; Pogonka, T. et al, 2003) 및 12-kDa 난포낭 벽 단백질 (Karim, M.J. et al, 1996), 에이메리아 버미포미스 (Eimeria vermiformis), 에이메리아 아데노에이데스 (Eimeria adenoeides), 류코사이토존 카울러리 (Leucocytozoon caulleryi) 유래의 항원, 예컨대 R7 외막 항원 (Ito, A., et al, 2005), 플라스모듐 렐릭텀 (Plasmodium relictum), 플라스모듐 갈리나슘 (Plasmodium gallinaceum) 유래의 항원, 예컨대 CSP 단백질 (Grim, K.C. et al, 2004) 및 17- 및 32-kDa 단백질 항원 (Langer, R.C. et al, 2002), 및 플라스모듐 엘롱가텀 (Plasmodium elongatum) 유래의 항원의 이용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서는 조류 인플루엔자 바이러스 항원 또는 면역원을 이용한다. 본 발명은 또한 예를 들어, 단일 주사로 조류를 다수의 조류 질환에 대해 방어할 수 있는 다가 백신 또는 면역원성 조성물과 같은 다양한 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
조류 인플루엔자 바이러스는 인간, 돼지, 말 및 심지어 해양 포유류에게도 전염되었고, 인간 인플루엔자 유행병 출현의 핵심 원인이었다. 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae) 과에 속하는 인플루엔자 바이러스는 그의 핵단백질 (NP) 및 매트릭스 (M1) 단백질의 항원성 차이에 기초하여 A, B 및 C 로 분류된다. 모든 조류 인플루엔자 바이러스는 유형 A 로 분류된다. 또한 2 개의 표면 당단백질인 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 의 항원성에 기초하여 아형이 분류된다. 현재, 인플루엔자 A 바이러스 중에서 15 HA 및 9 NA 아형이 확인되었다 (Murphy, B.R. et al, 1996; Rohm, C. et al, 1996b). HA 항원성을 책임지는 HA1 영역의 아미노산 서열은 아형 간에 30 % 이상 상이하다 (Rohm, C. et al, 1996b). 모든 HA 및 NA 아형을 보유하는 바이러스가 조류 종에서 발견되지만, 포유류 인플루엔자 바이러스의 바이러스 아형은 제한적이다.
조류 인플루엔자 A 바이러스는 독성에 의해 하기와 같이 분류된다; 조류 흑사병을 야기할 수 있는 고독성 유형, 및 일반적으로 오직 경도 질환 또는 무증상 감염을 야기하는 무독성 유형. 드문 경우지만, 실험실에서는 저병원성인 바이러스도 야생에서는 중증 질환의 발발을 야기하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 바이러스들과 연관된 이환율 및 치사율은 치명적 바이러스에 의해 야기되는 것보다 훨씬 낮은 경향이 있다.
오스트레일리아 (1976 년 [H7] (Bashiruddin, J.B. et al, 1992); 1985 년 [H7] (Cross, G.M., 1987; Nestorowicz, A. et al, 1987), 1992 년 [H7] (Perdue, M.L. et al, 1997), 1995 년 [H7] 및 1997 년 [H7]), 영국 (1979 년 [H7] (Wood, G.W., et al, 1993) 및 1991 년 [H5] (Alexander, D.J. et al, 1993)), 미국 (1983 년에서 1984 년까지 [H5] (Eckroade, R.J. et al, 1987), 아일랜드 (1983 년에서 1984 년까지 [H5]) (Kawaoka, Y. et al, 1987), 독일 (1979 년 [H7] (Rohm, C. et al, 1996a), 멕시코 (1994 년에서 1995 년까지 [H5] (Garcia, M. et al, 1996; Horimoto, T. et al, 1995), 파키스탄 (1995 년 [H7] (Perdue, M.L. et al, 1997), 이탈리아 (1997 년 [H5]) 및 홍콩 (1997 년 [H5] (Claas, E.J. et al, 1988) 에서 고독성 조류 인플루엔자 바이러스가 가금류에서의 발발을 야기했다. 임의의 한 이론에 구속되려는 것은 아니지만, 모든 병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스가 H5 또는 H7 아형인 것으로 여겨지며, 이러한 아형 특이성에 대한 이유는 아직 알려지지 않았다. NA 아형은 독성 바이러스와 연관되지 않는 것으로 보인다. 2 가지 추가의 아형인 H4 [A/Chicken/Alabama/7395/75 (H4N8)] (Johnson, D.C. et al, 1976) 및 H1O [A/Chicken/Germany/N/49 (H10N7)] 은 중증 조류흑사병과 같은 발발 동안에 닭으로부터 단리되었다.
인플루엔자 A 바이러스의 구조는 상당히 유사하다 (Lamb, R.A. et al, 1996). 전자 현미경에서 이 바이러스들은 대략 구형 (직경이 약 120 ㎚) 및 사상인 비리온을 포함하는, 다형태성이다. HA 및 NA 분자에 해당하는 2 가지 독특한 유형의 돌기 (길이가 약 16 ㎚) 가 비리온의 표면에 존재한다. 이러한 2 가지 당단백질은 짧은 소수성 아미노산 서열 (경막 영역) 에 의해 숙주 세포의 원형질 막 유래의 지질 엔벨로프에 고정된다. HA 는 N 말단 엑토도메인 (ectodomain) 및 C 말단 앵커 (anchor) 를 함유하는 유형 I 당단백질인 반면, NA 는 N 인접 앵커 및 C 말단 엑토도메인을 함유하는 유형 II 당단백질이다. HA 는 세포 표면의 시알릴올리고당에 비리온을 부착시킬 수 있고 (Paulson, J.C., 1985), 그의 적혈구응집 활성을 초래한다 (Hirst, G.K., 1941). HA 는 감염에 대한 방어에 중요한 바이러스 중화 항체를 유발시킨다. NA 는 세포 및 비리온 표면의 시알산 (HA 에 의해 인식되는 시알릴올리고당의 주요 부분) 을 제거함으로써 비리온 응집을 방지하는 (Paulson, J.C., 1985) 시알리다제이다 (Gottschalk, A., 1957). NA 에 대한 항체는 또한 숙주 방어에도 중요하다 (Webster, R.G., et al, 1988).
HA 및 NA 에 더하여, 제한된 수의 M1 단백질이 비리온에 통합된다 (Zebedee, S.L. et al, 1988). 이들은 4합체를 형성하고, H1 이온 채널 활성을 갖고, 엔도솜에서 낮은 pH 에 의해 활성화될 때, 비리온의 내부를 산성화시켜, 그의 탈피를 촉진한다 (Pinto, L.H. et al, 1992). 엔벨로프 내에 존재하는 M1 단백질은 조립 및 출아시에 기능하는 것으로 생각된다. 단일 가닥 RNA 분자 (mRNA 에 상보적이거나 네거티브 센스임) 의 8 개 분절이 바이러스 엔벨로프 내에 NP 및 3 개 서브유닛의 바이러스 폴리머라제 (PB1, PB2 및 PA) 와 함께 함유되어 있고, 이는 RNA 복제 및 전사에 참여하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 함께 형성한다. 현재 비리온 내에 존재하는 것으로 알려진 NS2 단백질 (Richardson, J.C. et al, 1991; Yasuda, J. et al, 1993) 은 M1 단백질과의 상호작용을 통해 (Ward, A.C. et al, 1995) 핵으로부터 RNP 의 외수송에서 한 역할을 하는 것으로 생각된다 (O'Neill, R.E. et al, 1998). 인플루엔자 A 바이러스의 유일한 비구조 단백질인 NS1 단백질은 세포 mRNA 의 스플라이싱 및 핵 외수송의 조절 뿐만 아니라 해독의 자극 등을 포함하여 다수의 기능을 갖는다 (Lamb, R.A. et al, 1996). 이의 주요 기능은 숙주의 인터페론 활성에 반대작용하는 것이라고 생각되는데, 이는 NS1 녹아웃 바이러스가 인터페론-무결손성 세포에서 부모 바이러스보다 덜 효율적으로 성장하기는 하지만 생육성이기 때문이다 (Garcia-Sastre, A. et al, 1988).
본 발명에 유용한 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원은 HA, NA 뿐만 아니라 M1, NS2 및 NS1 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원은 HA 및 NA 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원은 모든 조류 인플루엔자 A 균주, 임상 단리물, 야생 단리물, 및 이의 재편성체를 포함하는 임의의 공지된 AI 균주에서 유래될 수 있다. 이러한 균주 및 아형의 예는 H10N4, H10N5, H10N7, H10N8, H10N9, H11N1, H11N13, H11N2, H11N4, H11N6, H11N8, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N8, H13N2, H13N3, H13N6, H13N7, H14N5, H14N6, H15N8, H15N9, H16N3, H1N1, H1N2, H1N3, H1N6, H2N1, H2N2, H2N3, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N5, H7N7, H7N8, H8N4, H8N5, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8 및 H9N9 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 특히 항원 소변이 (antigenic drift) 및 항원 대변이 (antigenic shift) 를 반영하는 돌연변이된 또는 다르게 변경된 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스의 항원성은 점 돌연변이 (항원 소변이) 에 의해 점차적으로 변화하거나 또는 유전자 재편성 (항원 대변이) 에 의해 급격하게 변화한다 (Murphy, B.R. et al, 1996). HA 및 NA 에 대한 면역학적 압력은 항원 소변이를 추진하는 것으로 생각된다. 항원 대변이는 비인간 인플루엔자 바이러스가 인간에게 직접 전염되거나, 또는 단일 세포를 감염시킨 2 가지 상이한 인플루엔자 바이러스 유래의 유전자의 재편성을 통해 야기될 수 있다 (Webster, R.G. et al, 1982). 이론적으로, 8 가지 상이한 바이러스 게놈 분절의 셔플링 (shuffling) 으로부터 256 가지 다른 조합의 RNA 가 생산될 수 있다. 유전자 재편성은 실험실 조건 하에서 시험관내 및 생체내 모두에서 충분히 연구되었다 (Webster, R.G. et al, 1975). 더욱 중요한 것은, 혼합 감염이 자연계에서 비교적 빈번하게 발생하고 유전자 재편성을 유도할 수 있어, 새로운 야생 단리물, 하이브리드 형태 또는 재편성 형태를 초래할 수 있다는 점이다 (Bean, W.J. et al, 1980; Hinshaw, V.S. et al, 1980; Young, J.F., et al, 1979). 종래에 순환하는 바이러스의 재출현은 항원 대변이가 발생할 수 있는 또다른 메카니즘이다.
따라서, 본 발명은 또한 조류 인플루엔자의 임상 단리물, 조류 인플루엔자의 야생 또는 환경 단리물, 하이브리드 형태, 및 조류 인플루엔자의 재편성 형태를 포함하는, 항원 소변이 또는 항원 대변이를 겪은 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 하나 이상의 조류 인플루엔자 균주 및/또는 하이브리드에 대한 면역원성 반응을 자극하거나 조절하는 다가 조류 인플루엔자 백신 또는 면역원성 조성물을 제공하도록 하나의 재조합 벡터에 함께, 또는 별도의 재조합 벡터에 전달되는 본원에 개시된 벡터 및 방법에 이용되는 하나 이상의 조류 인플루엔자 면역원 또는 항원의 용도를 포함한다.
많은 집 및 야생 조류 종이 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된다. 이들은 닭, 칠면조, 오리, 뿔닭, 집거위, 메추라기, 꿩, 자고새류, 찌르레기과 새, 연작류새, 양무새, 잉꼬, 갈매기, 섭금류, 바다새 및 에뮤를 포함한다 (Easterday, B.C. et al, 1997; Webster, R.G. et al, 1988). 일부 감염된 새는 인플루엔자의 증상을 보이지만, 그렇지 않은 새도 있다. 집 조류 종 중에서 칠면조는 인플루엔자 발발이 가장 빈번한 조류이며, 닭도 인플루엔자가 발발하지만 덜 빈번하다. 조류 인플루엔자 A 바이러스는 무증상에서부터 경도의 상기도 감염, 난 생산의 감소 및 급격히 치명적인 전신 질환에 이르기까지 일련의 증후군을 조류에서 나타낸다 (Eckroade, R.J. et al, 1987). 질환의 중증도는 바이러스의 독성, 숙주의 면역 상태 및 식단, 동반되는 세균 감염 및 숙주에게 부과되는 스트레스를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다. 닭 및 칠면조에서의 병원성에 따라, 조류 인플루엔자 A 바이러스는 독성 (조류흑사병을 유발할 수 있음) 또는 무독성 (경도 또는 무증상 질환을 유발함) 으로 분류된다. 하나의 조류 종에 대해 고병원성이더라도, 인플루엔자 A 바이러스는 또다른 조류 종에 대해서는 병원성이 아닐 수 있다 (Alexander, D.J. et al, 1986). 예를 들어, 오리는 닭에 치명적인 바이러스에 전형적으로 내성이 있다. 또다른 예로서, 닭 및 칠면조를 쉽게 죽이는 A/Turkey/Ireland/1378/85 (H5N8) 는 감염된 새의 다양한 내부 기관 및 혈액에서 탐지될 수 있지만 오리에서 질환 증상을 야기하지는 않는다 (Kawaoka, Y. et al, 1987).
인플루엔자 바이러스는 감염된 새의 장관으로부터 분변으로 분비된다 (Kida, H., et al, 1980; Webster, R.G. et al, 1978). 전염 방식은 직접적 또는 간접적일 수 있다; 그 예는 에어로졸 및 다른 바이러스 오염물과의 접촉을 포함한다. 감염된 새는 그 분변으로 다량의 바이러스를 배출하므로, 많은 상이한 물품이 오염되어 (예, 사료, 물, 설비 및 우리) 바이러스 전염의 원인이 될 수 있다. 수계 전염은 자연 물새 서식지에서 조류 인플루엔자 바이러스가 해마다 보전되는 메카니즘을 제공할 수 있다. 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 가금류와 같은 상업적 조류에서 나타나는 전형적인 징후 및 증상은 난 생산 감소, 호흡 징후, 소포음, 과도 노루, 동염, 깃털이 없는 피부 (특히, 계관 및 아랫볏) 의 청색증, 머리 및 얼굴의 부종, 주름진 깃털, 설사 및 신경계 장애 등을 포함한다.
드러나는 특징의 수는 새의 종 및 나이, 바이러스 균주 및 동반되는 세균 감염에 따라 달라진다 (Easterday, B.C. et al, 1997; Webster, R.G. et al, 1988). 때때로, 새는 병의 임의의 징후를 나타냄 없이 죽을 수 있다 (Alexander, D.J. et al, 1993; Wood, G.W., et al, 1994). 고병원성 바이러스를 접종한 닭에서 육안적 및 조직학적 병변은 상당히 유사하지만, 약간의 균주 변이를 나타낸다 (Alexander, D.J. et al, 1986; Mo, I.P. et al, 1997; Swayne, D.E. et al, 1997). 보고된 증례 중에서 일부 차이는 접종 경로, 닭의 품종 및 연령, 및 바이러스의 용량을 포함하는 실험 조건의 차이를 반영할 수 있다. 미세혈관 내피의 종창, 전신울혈, 다병소성 출혈, 혈관주위 단핵세포 침윤 및 혈전증은 고독성 바이러스에 감염된 닭에서 통상적으로 나타난다. 이러한 바이러스는 혈관 내피 및 혈관주위 실질 세포에서 효과적으로 복제하며, 이는 바이러스 전염 및 전신 감염에 중요할 수 있는 성질이다 (Kobayashi, Y. et al, 1996; Suarez, D.L. et al, 1998). 또한, 바이러스 항원은 괴사 및 염증성 변화가 있는 다른 기관의 세포 외에도 괴사성 심장 근육세포에서도 발견될 수 있다 (Kobayashi, Y. et al, 1996).
또한, 본 발명은 세포에서 하나 이상의 항원 또는 면역원을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 실험실 환경에서의 예비 단계로서, 항원 또는 면역원은 리포터 단백질 (예, 효소) 을 암호화하는 것을 포함하는, 단백질 및 펩티드를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있다. 리포터 단백질은 당업계에 공지되어 있고, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 리포터 단백질의 다수와 이들의 탐지 방법은 시판되는 많은 진단 키트에 일부로서 포함되어 있다. 관심의 항원 또는 면역원은 안티센스 핵산, 소형 간섭 RNA (siRNA), 리보자임, 또는 다른 비해독 RNA, 예컨대 "안내" RNA (Gorman et al., 1998) 등을 암호화할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터 및 방법은 재조합 벡터 또는 면역원성 조성물의 전달시 면역 반응을 조절할 수 있는 보강제 분자 및 치료적 단백질의 용도도 포함한다. 이러한 치료적 단백질 또는 보강제 분자는 면역조절성 분자, 예컨대 인터루킨, 인터페론 및 동시자극성 분자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 조류 대상의 면역 반응을 조절하는 것으로 당업계에 공지된 조류 사이토카인은 닭 인터페론-α (IFNα) (Karaca, K. et al, 1998; Schijns, V.E. et al, 2000), 닭 인터페론-γ (IFNγ) , 닭 인터루킨-1β (ChIL-1β) (Karaca, K. et al, 1998), 닭 인터루킨-2 (ChIL-2) (Hilton, L.S. et al, 2002) 및 닭 골수단핵세포 성장 인자 (cMGF1 York, J.J. et al, 1996; Djeraba, A. et al, 2002) 이다. 면역조절성 분자는 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 동시투여되거나, 또는 대안적으로 면역조절성 분자(들)의 핵산이 본 발명의 재조합 벡터 내에 조류 면역원 또는 항원과 함께 동시발현될 수도 있다.
대상에서 이종 서열, 즉 조류 인플루엔자 면역원의 발현은 그 항원 또는 면역원의 발현 산물에 대한 대상이 면역반응을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 면역학적 조성물 또는 백신에 이용되어, 방어적일 수 있으나, 반드시 방어적일 필요는 없는 면역 반응을 유도하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 상황에서 이용되는 분자생물학 기술은 Sambrook et al. (2001) 에 의해 기술되어 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명에 포함되는 면역원성 또는 면역학적 조성물에서, 항원 또는 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 이로부터 경막 도메인을 암호화하는 부분을 결실시킬 수 있다. 또한 대안적으로 또는 부가적으로, 벡터 또는 면역원성 조성물은 추가로 이종 tPA 신호 서열 예컨대 인간 또는 조류 tPA 및/또는 안정화 인트론, 예컨대 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II 를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 이종 뉴클레오티드 서열을 시험관내 또는 생체내에서 세포에 전달 및/또는 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따르면, 세포는 본 발명에 따른 재조합 인간 아데노바이러스 벡터로 감염된다 (본원에서 상세히 기술된 바와 같음). 세포는 바이러스 형질도입의 자연 과정에 의해 아데노바이러스 벡터로 감염될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 표적 아데노바이러스 벡터 (하기 기술된 바와 같음) 에 접촉되고 예를 들어 수용체 매개 세포내이입과 같은 교대 메카니즘에 의해 흡수될 수 있다. 또다른 예로서, 벡터는 항체 또는 다른 결합 단백질을 이용하여 내재화 세포표면 단백질을 표적으로 할 수 있다.
벡터는 유전자 산물 (예, 에피토프, 항원, 치료제 및/또는 항체) 조성물에 대해 제시된 양에 도달하는 양으로 조류 대상에 투여될 수 있다. 본 발명은 본원에 예시된 용량 미만 및 초과의 용량을 포함하나 이에 제한되지 않고, 조류 대상에게 투여되는 임의의 조성물 (그의 성분을 포함함) 및 임의의 특정 투여 방법에 대해 하기가 측정될 수 있다: 독성, 적합한 조류 모델에서 치사량 (LD) 및 LD50 을 측정하는 것에 의함; 및 적절한 반응을 유발시키는 조성물(들)의 용량, 그 안의 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기, 예를 들어 ELISA 및/또는 혈청중화 분석에 의한 혈청의 적정 및 이의 분석에 의함. 이러한 측정은 당업자의 지식 및 본 명세서 및 여기에 인용된 문헌들로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
본 발명의 조성물의 예는 오리피스, 또는 점막, 예를 들어 구강, 비측, 항문, 질, 경구, 위내 등의 투여를 위한 액체 제제, 예컨대 현탁액, 용액, 분무, 시럽 또는 엘릭시르; 및 비경구, 경피, 피하 (즉, 하경부를 통해), 피내, 복강내, 근육내 (즉, 날개 웨브, 날개 끝, 흉근 및 대퇴 근조직 천자를 통해), 비강내 또는 정맥내 투여 (예, 주사 투여), 예컨대 멸균 현탁액 및 에멀전을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 전문이 참고인용되고, 비침습적 전달 방식, 즉 경피 및 비강내 투여를 통해 면역원성 또는 백신 조성물의 전달 및 면역화를 개시하고 있는, 2004 년 4 월 6 일에 교부된 미국 특허 번호 6,716,823; 2004 년 3 월 16 일에 교부된 미국 특허 번호 6,706,693; 2002 년 2 월 19 일에 교부된 미국 특허 번호 6,348,450; 미국 출원 일련 번호 10/052,323 및 10,116,963; 및 10/346,021 이 언급되어 있다. 조류에 대한 다른 투여 및 전달 방법은 음료수 또는 사료 중에서 재조합 벡터 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신의 용량은 101 내지 104/마리 사이에서 선택될 수 있다.
근육내 주사 시, 투여는 흉부 (흉근), 다리 (상부 대퇴/측면 옆구리 근조직), 날개 웨브 (비막), 하부 날개 (겨드랑이), 및 날개 끝을 통해 수행될 수 있다. 이용되는 바늘의 길이 및 직경 (게이지) 은 선택된 근육의 중심으로 백신을 전달할 수 있게 하는 것이어야 한다.
특정 구현예는 난내 전달에 의한 투여 방법을 포함한다 (Gildersleeve, R.P., 1993a; Gildersleeve, R.P. et al, 1993b; Sharma, J.M., 1985; Sharma, J.M. et al, 1984). 난내 전달은 자동 주사기에 의한 균일한 용량의 백신 투여가 노동 및 시간 절약적이므로, 조류의 집단 면역화에 유망한 방법으로서 최근 생겨난 방법이다 (Johnston et al., 1997; Oshop et al., 2002). 지금까지, 미국 육계의 80 % 이상이 마렉병에 대하여 기계식 주사기로 난내 처리되었다 (Wakenell et al., 2002). 이 방법은 또한 감염성 점액낭병 (IBD) 및 뉴캣슬병 (ND) 백신을 투여하는데 점차적으로 이용되고 있다. 또한, DNA 백신 (Kapczynski et al., 2003; Oshop et al., 2003) 및 복제성 알파바이러스 벡터화된 백신 (Schultz-Cherry et al., 2000) 의 난내 전달에 의해 닭에서 면역 반응이 유발되었다. 이들의 복제성 해당체와 비교했을 때, DNA 및 바이러스 벡터화된 난내 백신 및 면역원성 조성물은 배아를 사멸시키거나 해를 입힐 가능성이 적고, Ad 벡터는 특히 난내에서의 복제 불능성으로 인해 더 높은 순응도율을 갖는다.
기계식 시스템, 기구 및 장치, 예컨대 INOVOJECT® 로서 시판되는 것은 발육 배아에 외상을 야기함 없이 정확하게 조정된 부피로 화합물, 백신 및 면역원성 조성물을 서서히 주사하여, 병아리 취급을 감소시키고, 자동화를 통해 부화장 운영능을 향상시키며, 육계 생산 비용을 감소시킨다. INOVOJECT® 및 다른 기계식 시스템, 장치 또는 기구는 주사 헤드를 난의 상부 위로 서서히 낮추고 작은 직경의 중공의 펀치가 껍질에 작은 구멍을 뚫어 작동한다. 주사바늘은 튜브를 통해 조절된 깊이 (보통 2.54 ㎝) 까지 내려가서, 예정된 작은 부피의 백신, 면역원성 조성물 또는 화합물을 배아로 전달한 후, 바늘은 회수되고 멸균 세정액으로 세척된다. 난내 백신 및 유전자 전달 방법은 전문이 분명하게 참고인용된 미국 특허 번호 4,458,630; RE 35973; 6,668,753; 6,601,534; 6,506,385; 6,395,961; 6,286,455; 6,244,214; 6,240,877; 6,032,612; 5,784,992; 5,699,751; 5,438,954; 5,339,766; 5,176,101; 5,136,979; 5,056,464; 4,903,635; 4,681,063; 2003 년 10 월 16 일에 출원된 미국 출원 일련 번호 10/686,762; 2002 년 8 월 9 일에 출원된 10/216,427; 2002 년 2 월 13 일에 출원된 10/074/714; 및 2002 년 1 월 9 일에 출원된 10/043,025 에서 찾아볼 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 재조합 벡터, 백신 또는 면역원성 조성물을 난내 전달 또는 투여하기 위한 장치 또는 기구를 포함한다. 이러한 장치 또는 기구는 임의로 본 발명의 재조합 인간 아데노바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물을 포함할 수 있고, 즉 조류에 난내 투여하기 위한 벡터 또는 면역원성 조성물이 사전에 적재되어 있을 수 있다.
또다른 투여 방법은 에어로졸 분무 전달이다. 인간 Ad5 벡터화된 백신의 비강내 투여가 닭을 면역화시키지 못함이 밝혀졌다 (Gao et al., 2006; Toro et al., 2007). 인간 Ad5 벡터화된 백신의 에어로졸 분무가 닭을 백신접종하는데 효과적이라는 본원의 놀라운 입증은 안구내 투여, 복수의 경로 (비강내, 안구내, 경피 및 경구 투여) 의 조합, 및/또는 에어로졸 분무 중 생성된 미세한 박무로 인한 것일 수 있다.
에어로졸 분무 전달은 조류의 집단 면역화에 유용한 방법으로서 노동 및 시간 절약적이므로, 가금 산업에서 상업적 업체들이 에어로졸 분무와 같은 투여 방법을 매우 선호한다.
그러므로 에어로졸 분무 전달을 가능하게 하는 기계식 시스템, 기구 및 장치는 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 재조합 벡터, 백신 또는 면역원성 조성물을 에어로졸 분무 전달 또는 투여하기 위한 장치 또는 기구를 포함한다. 이러한 장치 또는 기구는 임의로 본 발명의 재조합 인간 아데노바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물을 포함할 수 있고, 즉 조류에 에어로졸 분무 투여하기 위한 벡터 또는 면역원성 조성물이 사전에 적재되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물의 연속 투여 또는 본원의 방법의 연속 수행, 예를 들어 상태의 요법 또는 치료 과정 및/또는 면역학적 조성물의 추가접종 투여 및/또는 초회-추가접종 요법에서 본 발명의 조성물의 주기적 투여를 포함하며; 연속 투여의 시간 및 방법은 과도한 실험 없이도 확인될 수 있다.
또한, 본 발명은 벡터를 제조하고 이용하기 위한 조성물 및 방법, 예컨대 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 생체내 및/또는 시험관내 및/또는 생체외에서 생산하는 방법 (예, 뒤의 2 가지는, 예를 들어 본 발명에 따라 투여된 숙주 유래의 세포로부터 단리한 후, 예를 들어 이러한 세포의 임의적인 증식 후), 및 이러한 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체의 예컨대 진단, 분석, 요법, 치료 등에 있어서의 용도를 포함한다.
벡터 조성물은 벡터를 적절한 담체 또는 희석제와 혼합하여 조제하고, 유전자 산물 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체 조성물도 마찬가지로 유전자 및/또는 면역학적 산물 및/또는 항체를 적절한 담체 또는 희석제와 혼합하여 조제한다; 예를 들어 미국 특허 번호 5,990,091, WO 99/60164, WO 98/00166, 그안에 인용된 문헌들, 및 본원에 인용된 다른 문헌들, 및 본원의 다른 교시들 (예컨대, 담체, 희석제 등에 관해) 을 참고한다.
이러한 조성물에서, 재조합 벡터는 적절한 수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리학적 식염수, 포도당 등과 혼합될 수 있다. 또한, 조성물은 동결건조될 수도 있다. 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보강제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등을 원하는 제제 및 투여 경로에 따라 함유할 수 있다.
DMSO 는 특히 벡터 또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 난내 또는 에어로졸 분무 전달과 관련하여 백신 및 면역원성 조성물의 효능을 증강시키는 것으로 알려져 있다. DMSO 는 세포막의 투과성을 증가시켜 백신의 효능을 증강시키는 것으로 생각된다 (Oshop et al, 2003). 세포를 투과하고, 양수의 점도를 감소시키고, DMSO 에 비해 더 높은 순응도율을 나타낼 수 있는 다른 물질 또는 첨가제는 백신 또는 면역원성 조성물의 조제에, 특히 난내 또는 에어로졸 분무 전달에 의해 투여될 때 이용될 수 있다. 인슐린, 렙틴 및 소마토트로핀과 같은 다양한 단백질의 흡수는 비강내 투여 후 현저한 부작용 없이 테트라데실 말토시드 (TDM) 와 같은 계면활성제에 의해 증강되는 것으로 밝혀져 있다 (Arnold, et al, 2004). 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 방법 및 조성물에 있어서의 TDM 의 용도도 포함한다.
0.125 % TDM 을 함유하는 제형물은 세포 형태에 적당한 변경을 야기할 수 있지만, 고농도의 TDM (즉, 0.5 %) 은 일시적으로 더욱 대규모의 형태 변화를 유도할 수 있다. TDM 은 조류 수정란의 양수 및 포유류의 점성 비점막으로 인해 난내 또는 에어로졸 분무 전달 환경에서 벡터 전달을 증강시키는 것으로 생각된다. [Arnold, et al (2004)] 에 기술된 TDM 의 안전성 프로필은 또한 면역화된 조류의 건강 및 먹이사슬에 들어가는 순응도를 촉진시키는데 특히 유리하다.
투여되는 벡터의 양은 치료되는 대상 및 상태에 따라 달라지며, 1 일 체중 당 1 또는 수 마이크로그램에서부터 수백 또는 수천 마이크로그램까지 다양할 수 있고, 백신 또는 면역원성 조성물의 용량은 바람직하게는 101 - 106 플라크 형성 단위 (PFU), 바람직하게는 102 - 105 PFU/마리 사이에서 선택된다. 주사의 경우, 상기 역가를 함유하는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 액체, 예컨대 생리적 식염수로, 날개 웨브 투여용인 경우에 약 0.1 ㎖ 또는 0.01 ㎖ 의 최종 부피로 희석되어야 한다. 본 발명의 벡터 및 방법은 난내 백신접종 및 1 일령 병아리의 에어로졸 분무에 의한 백신접종 뿐만 아니라 더 성숙한 병아리 및 닭의 백신접종도 허용한다.
벡터는 유전자 산물 (예, 에피토프, 항원, 치료제 및/또는 항체) 조성물에 대해 기술된 양을 달성하는 양으로 조류 대상에게 비침습적으로 투여될 수 있다. 물론, 본 발명은 본원에 예시된 용량 미만 및 초과의 용량도 예상하지만, 조류 대상에게 투여되는 임의의 조성물 (그의 성분을 포함함), 및 임의의 특정 투여 방법에 대해 하기가 측정될 수 있다: 독성, 예컨대 적절한 조류 모델에서 치사량 (LD) 및 LD50 을 측정하는 것에 의해; 및 적절한 반응을 유발시키는 조성물(들)의 용량, 그 안의 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기, 예컨대 ELISA 및/또는 혈청중화 분석에 의한 혈청의 적정 및 그의 분석에 의해. 이러한 측정은 당업자의 지식, 본 명세서 및 본원에 인용된 문헌으로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
재조합 벡터는 본원에 및/또는 본원에 인용된 문헌에 기술된 용량에 해당하는 생체내 발현을 수득하기에 적절한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 현탁액에 적절한 범위는 실험적으로 측정될 수 있다. 하나 이상의 유전자 산물이 하나 이상의 재조합체에 의해 발현되는 경우, 각 재조합체는 상기 양으로 투여될 수 있거나, 또는 각 재조합체는 재조합체의 총합이 상기 양을 포함하도록 투여될 수 있다.
본 발명에 이용된 벡터 또는 플라스미드 조성물에서, 용량은 본원에 인용된 문헌에 기술되거나 또는 본원에 기술되거나 또는 본원에 인용된 문헌에서 참고되거나 인용된 문헌에 기술된 바와 같은 것일 수 있다. 유리하게는, 용량은 항원(들)이 직접적으로 존재하는 조성물과 유사한 반응을 유발시키거나; 그러한 조성물의 용량과 유사한 발현을 나타내거나; 또는 재조합 조성물에 의해 생체내에서 수득되는 발현과 유사한 발현을 나타내기에 충분한 플라스미드 양이어야 한다.
그러나, 적절한 면역학적 반응을 유발시키는 조성물(들)을 용량, 그안에 함유된 성분들의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기는, 예를 들어 ELISA 및/또는 혈청중화 검정 분석에 의한 혈청의 항체 적정과 같은 방법에 의해 측정할 수 있다. 이러한 측정에는 당업자의 지식, 본 명세서 및 본원에 인용된 문헌으로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 그리고, 연속 투여 시기도 마찬가지로 본 명세서 및 당업계의 지식으로부터 지나친 실험 없이 확인할 수 있는 방법으로 확인할 수 있다.
본 발명에서 고찰되는 면역원성 또는 면역학적 조성물은 또한 보강제를 함유할 수 있다. 적절한 보강제는 fMLP (N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌; 미국 특허 번호 6,017,537) 및/또는 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및/또는 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체가 있다. 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체는 예를 들어 폴리알콜의 또는 당의 폴리알케닐 에테르와 교차연결될 수 있다. 이러한 화합물은 "카르보머(carbomer)" 라는 용어로 알려져 있다 (Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, June 1996). 또한, 당업자는 미국 특허 번호 2,909,462 (참고인용됨) 를 참고할 수도 있으며, 이 문헌에는 3 개 이상의 하이드록시 기를 함유하는 폴리하이드록시화된 화합물, 하나의 구현예에서 8 개 이하의 하이드록시 기를 함유하는 폴리하이드록시화된 화합물, 또다른 구현예에서 3 개 이상의 하이드록시의 수소 원자가 탄소 원자 2 개 이상을 함유하는 불포화 지방족 라디칼로 치환되어 있는 화합물, 다른 구현예에서 라디칼이 약 2 개 내지 약 4 개의 탄소원자를 함유하는 것, 예를 들어 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기인 화합물과 교차연결된 상기 아크릴 중합체가 논의되어 있다. 상기 불포화 라디칼은 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. Carbopol® (Noveon Inc., Ohio, USA) 이라는 상품명으로 판매되는 제품이 보강제로서 이용하기에 특히 적합하다. 이 제품은 알릴 수크로스 또는 알릴펜타에리트리톨과 교차연결되어 있고, 이러한 제품으로 Carbopol® 974P, 934P 및 971P 가 예시되어 있다.
말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체에 관해서는, 말레산 무수물 및 에틸렌의 공중합체이고, 선형 또는 교차연결될 수 있는, 예를 들어 디비닐 에테르와 교차연결될 수 있는 EMA® 제품 (Monsanto) 이 예시되어 있다. 또한, 참고 인용된 미국 특허 번호 6,713,068 및 [Regelson, W. et al., 1960] 도 예시되어 있다.
4차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질은 전문이 참고인용된 미국 특허 번호 6,713,068 에 기술되어 있고, 본 발명의 방법과 조성물에도 이용될 수 있다. 이러한 양이온 지질은 유리하게는 중성 지질, 유리하게는 DOPE (디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr J.P., 1994) 와 결합하여 DMRIE-DOPE 를 형성하는, DMRIE (N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 재조합 백신 또는 면역원성 또는 면역학적 조성물은 수중유 에멀전의 형태로 조제될 수도 있다. 수중유 에멀전은 예를 들어 경 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 유형); 이소프레노이드 오일, 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, EICOSANE™ 또는 테트라테트라콘탄; 알켄(들), 예를 들어 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로 생성된 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 알콜 또는 산의 에스테르, 예컨대 플랜트 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 예를 들어 이소스테아르산 에스테르에 기초할 수 있다. 이러한 오일은 유리하게는 에멀전을 형성하기 위해 유화제와 조합되어 이용된다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 소르비탄, 만나이드(예, 안하이드로만니톨 올레이트), 글리세롤, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르 (이는 임의로 에톡시화될 수 있음), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 Pluronic® 제품, 예를 들어 L121 일 수 있다. 보강제는 유화제(들), 미셀 (micelle) 형성제 및 오일의 혼합물, 예컨대 상품명 Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) 로 시판되는 것일 수 있다.
하나 이상의 관심의 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 따른 벡터는 약 5 ℃ 에서 액체 형태로 또는 동결건조된 형태로 안정화제의 존재 하에 보전 및/또는 보존되고 저장될 수 있다. 동결건조는 공지된 표준 동결건조 절차에 따라 실시할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 안정화제는 SPGA (수크로스 포스페이트 글루타메이트 알부민; Bovarnick, et al., 1950), 탄수화물 (예, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 수크로스, 글루코스, 덱스트란, 트레할로스), 나트륨 글루타메이트 (Tsvetkov, T. et al., 1983; Israeli, E. et al., 1993), 단백질 예컨대 펩톤, 알부민 또는 카세인, 단백질 함유 물질, 예컨대 탈지유 (Mills, C.K. et al., 1988; Wolff, E. et al., 1990), 및 완충액 (예, 포스페이트 완충액, 알칼리 금속 포스페이트 완충액) 일 수 있다. 보강제 및/또는 운반체 또는 부형제는 동결 건조된 제제를 용해시키는데 이용될 수 있다.
이제, 본 발명을 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 기술할 것인데, 이는 본 발명의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것이지, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1. A/Panama/2007/99 HA 를 암호화하는 Ad 벡터의 제작
2003-2004 년에 백신 생산을 위해 선택한 인플루엔자 바이러스 균주, A/Panama/2007/99 (H3N2) (SEQ ID NOs: 1, 2) 는 질병관리센터 (CDC) 에서 입수했다. 이 인플루엔자 RNA 의 연전사에 의해 헤마글루티닌 (HA) 유전자를 클로닝한 후, 하기 표 1 의 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 으로 상기 HA 유전자를 증폭시켰다.
표 1: Ad 벡터의 제작에 이용된 프라이머
Figure pct00001
이러한 프라이머들은 A/Panama/2007/99 HA 유전자의 5' 및 3' 말단에 어닐링하는 서열 뿐만 아니라, 상기 HA 개시 ATG 코돈의 상류에 바로 인접한 진핵세포 리보솜 결합 자리 (Kozak, 1986) 에 해당하는 서열, 및 후속 클로닝을 위한 KpnI 자리를 함유한다. 전장 HA 유전자를 함유하는 KpnI 조각을 pShuttle-CMV (He et al., 1998) (T. He 에 의해 제공됨) 의 KpnI 자리에, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 프로모터의 전자 조절 하에 정확한 배향으로 삽입했다. A/Panama/2007/99 HA (AdPNM2007/99.H3) 를 암호화하는 E1/E3-결손성 Ad5 벡터를 개시된 바와 같이 (Zeng et al., 2001) 간소화된 재조합 시스템을 이용하여 인간 293 세포에서 생성했다.
AdPNM2007/99.H3 벡터를 HA 삽입체와 벡터 사이의 5' 및 3' 연접부를 서열분석하여 확인했다. A/Panama/2007/99 에 대한 HI 항체를 AdPNM2007/99.H3 의 비강내 투여 후 마우스에서 유도해 냈다.
실시예 2. 재조합 Ad 벡터의 난내 및 근육내 주사에 의한 닭의 면역화
인간 Ad 벡터화된 백신의 접종에 의한 닭을 면역화는 지금까지 보고되지 않았다. Ad5 는 자연의 새에서는 발견되지 않으므로, 이 벡터는 닭 세포에서 효과적으로 감염 및/복제될 수 없을 것으로 여겨졌다. 놀랍게도 AdPNM2007/99.H3 을 근육내 주사한 닭 3 마리 모두에서 2 주 후 512 의 혈청 HI 역가가 달성되었다 (도 1).
AdPNM2007/99.H3 벡터를 9 일령 및 18 일령의 닭 수정란에 주사한 경우에는, 부화 후 2 주째 9 일령의 수정란에서는 8 및 16 의 혈청 HI 역가가 달성되었고, 18 일령의 수정란에서는 < 4, 4 및 8 의 HI 역가가 달성되었다. 이러한 결과는 E1/E3 결손성 인간 Ad5 벡터가 조류 세포에서 복제 불능성 및 형질도입 가능성이 있기 대문에 조류에서 백신 담체로서 이용될 수 있다는 것을 시사한다. 난내 백신접종에 의해 유도된 비교적 낮은 HI 역가는 무엇보다 용량 및 배아의 연령 때문일 수 있다. Ad5 벡터는 닭 세포의 표면에서 발견되는 콕사키에바이러스 및 아데노바이러스 수용체 (CAR) 에 대한 그의 섬유의 결합을 통해 닭 배아의 일부를 형질도입시켰을 것이다 (Tan et al., 2001). 면역 반응은 닭에서 소수의 세포만을 형질도입시킨 후에 유도해낼 수 있는데, 그 이유는 Ad 가 내재화 후 엔도솜을 파괴하여 벡터 DNA 를 보호할 수 있는 강력한 벡터이기 때문이다 (Curiel, 1994). 또한, 하나 이상의 Ad 성분, 헥손은 고면역원성이어서, 외인성 항원에 보강 활성을 부여한다 (Molinier-Frenkel et al., 2002).
AdPNM2007/99.H3 벡터를 9 일령 (군 1) 및 18 일령 (군 2) 의 닭 수정란의 양막에 각각 5 × 1010 pfu/난 의 용량을 200 ㎕ 의 부피로 주사했다. 군 당 6 개의 난이 존재했지만, 군 1 에서는 2 마리만, 군 2 에서는 3 마리만 부화했다. 혈청 HI 역가를 부화 후 2 주째 종래 기술된 바와 같이 (Van Kampen et al., 2005) 측정했다. 군 3 에서는 AdPNM2007/99.H3 벡터를 4 주령의 닭 3 마리에게 2.5 × 1010 pfu/동물 용량을 100 ㎕ 의 부피로 근육내 주사했다. HI 역가를 면역화 후 2 주째 측정했다.
군 1 (9 일령 배아의 난내 면역화) 에서는 8 및 16 의 HI 역가가 달성되었고; 군 2 (18 일령 배아의 난내 면역화) 에서는 < 4 (임의로 2 의 역가가 부여됨), 4 및 8 의 HI 역가가 달성되었고; 군 3 (4 주령 닭의 근육내 면역화) 에서는 512 의 HI 역가가 3 마리 모두에서 달성되었다. 도 1 은 log2 스케일로 HI 역가를 나타낸다. 사각형은 군 1 에 속하는 각 닭의 HI 역가에 해당하고; 삼각형은 군 2 에 속하는 각 닭의 HI 역가에 상관된 것이다. 원은 군 3 에 속하는 각 닭의 HI 역가에 해당한다.
실시예 3. A/turkey/Wisconsin/68 H 유전자를 암호화하는 Ad 벡터 (AdTW68.H5) 의 제작
AI 바이러스 균주의 H 를 암호화하는 A/Turkey/WI/68 H (SEQ ID NOs: 3, 4) 의 DNA 주형을 USDA Southeast Poultry Research Laboratory (Athens GA) 에서 입수하여 표 2 에 제시된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다.
표 2: Ad 벡터의 제작에 이용된 프라이머
Figure pct00002
이러한 프라이머들은 A/turkey/Wisconsin/68 H 유전자의 5' 및 3' 말단에 어닐링하는 서열, 상기 H 개시 ATG 코돈의 상류에 바로 인접한 진핵세포 리보솜 결합 자리 (Kozak, 1986) 및 후속 클로닝을 위한 고유 제한효소 자리를 함유한다. 전장 H 유전자를 함유하는 조각을 셔틀 플라스미드 pAdApt (네덜란드 Leiden 소재, Crucell 에 의해 제공됨) 의 HindIII-BamHI 자리에, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 프로모터의 전사 조절 하에 정확한 배향으로 삽입했다. 이어서, A/turkey/Wisconsin/68 H 유전자를 암호화하는, RCA-프리, E1/E3-결손성 Ad 벡터 (AdTW68.H5) 를 개시된 바와 같이 (Shi et al., 2001) Ad5 백본 플라스미드 pAdEasy1 (He et al., 1998) 과 pAdApt-TW68.H5 의 동시트랜스펙션에 의해 인간 PER.C6 세포 (Crucell 에서 제공) 에서 생성했다. AdTW68.H5 벡터를 H 삽입체와 벡터 백본 사이의 5' 및 3' 연접부를 서열분석하여 확인했다.
Ad 벡터화된 난내 AI 백신은 신속하게 생산될 수 있고, 출현하는 AI 유행병에 대응하여 최고의 안전성 프로필을 보장하는 상황에서 닭 개체군에 집단 투여될 수 있다. 크로마토그래피 매개 정제 (Konz, 2005) 및 장기 저장용 동결기를 필요로 하지 않는 완충액 (Evans, 2004) 과 함께 무혈청 현탁액 생물반응기 (Lewis, 2006) 에서 특성이 잘 규명되어 있는 PER.C6 세포주 중의 RCA-프리 Ad5 벡터의 대량 생산은 Ad5 벡터의 생산 비용을 크게 감소시킬 것이다. AI 백신 생산의 기질로서 수정란 대신에 배양된 세포의 이용은 특히 수정란의 공급이 부족할 수 있을 때 AI 의 발발 동안에 중요하다. 이러한 Ad5 벡터화된 AI 백신은 이 벡터가 오직 바이러스 HA 를 암호화하기 때문에 DIVA 전략에 부응한다. 따라서, 효소결합 면역흡착 측정에 의한 항 AI 핵단백질의 측정과 함께 혈청 HI 항체의 분석은 AI 백신 또는 바이러스에 대한 노출을 신속하게 측정할 수 있게 할 것이다.
RCA-프리 Ad5 벡터화된 난내 AI 백신은 DIVA 전략에 부응하는 비복제성 AI 백신의 균일한 용량을 자동 전달함으로써 면역화된 새의 HPAI 바이러스 감염을 저지할 수 있는 특별한 기반을 제공한다. 복귀돌연변이체 생성 위험과 연관되고 환경의 표적 종 및 비표적 종 모두에서 유전자 변형된 유기체를 확산시킬 수 있는 복제성 재조합 벡터와 달리, RCA-프리 Ad5 벡터는 야생에서 증식하지 않을 것이다. 동시에 순환하는 야생 인플루엔자 바이러스와 바람직하지 않은 추가 재편성체를 생성할 수 있는 재편성 AI 바이러스 백신 (Hilleman, 2002) 과 반대로, Ad5 의 DNA 게놈은 인플루엔자 바이러스의 분절화된 RNA 게놈과 재편성될 수 없다.
실시예 4. AdTW68.H5 의 난내 접종
난내 접종을 종래 기술된 바와 같이 수행했다 (Senne, 1998; Sharma et al., 1982). 접종 전에 모든 배아를 촛불에 비추어 생육력을 살피고, 접종 부위를 표시하고, 3.5 % 요오드를 함유하는 70 % 에틸 알콜 용액으로 소독했다. 뾰족한 팁이 구비된 회전 드릴을 이용하여 껍질에 구멍을 만들었다. 접종을 양막-요막 경로를 통해 1 ㎖ 주사기를 이용하여 수행했다. 접종 후, 구멍을 용융 파라핀으로 밀봉했다.
실시예 5. AdTW68.H5 의 접종 후 혈청학
AI 균주 A/turkey/WI/68 을 SPF 닭 수정란에서 계대배양하여 106 배아 감염 용량 50 %/㎖ 의 역가를 달성했다. 양막요막액을 적혈구응집 활성에 대해 검사했다. 각 혈청 시료의 항체 역가를 종래 기술된 바와 같이 (Swayne et al., 1998, Thayer et al., 1998) AI 바이러스의 4 적혈구응집 단위를 이용하여 적혈구응집 억제에 의해 측정했다.
실시예 6. AI 게놈의 시료채취 및 정량 분석
각 새로부터의 구인두 시료를 뇌심장침출배지 (Difco, Detroit, Mich.) 1.0 ㎖ 에 현탁시키고 -70 ℃ 에서 저장했다. RNA 를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen) 를 이용하여 추출했다. 정량적 실시간 RT-PCR 을 이전에 기술된 바와 같이 (Spackman, 2002) 유형 A 인플루엔자 바이러스 매트릭스 RNA 에 특이적인 프라이머로 수행했다. 공지된 양의 대조군 A/Chicken/Queretaro/14588-19/95 RNA (101.0 내지 106.0 EID50/㎖) 로부터 작도된 표준 곡선을 이용하여 순환 분계점으로부터 바이러스 RNA 를 보간했다.
실시예 7. AdTW68.H5 의 난내 접종과 이어서 부화후 추가접종에 의한 닭의 면역화
접종에 의한 닭의 면역화를 1011 바이러스 입자/㎖ (vp/㎖) 를 함유하는 AdTW68.H5 300 ㎖ 를 SPF 수정란에 수정 10 일째 또는 18 일째 투여하여 수행했다. 각 군의 부화된 병아리를 2 개의 군으로 동일하게 나누었다: 병아리 절반은 부화 후 15 일째 동일한 용량의 AdTW68.H5 를 비측 경로를 통해 재백신접종하고, 나머지 병아리는 부화후 추가접종하지 않았다.
이러한 닭 군에서 부화 후 28 일째 수득한 혈청에서 탐지된 HI 항체 역가를 도 2 에 도시했다. 수정 후 10 일째 난내 백신접종된 병아리는 2 내지 7 log2 (평균 4.2) 사이의 HI 역가를 나타냈고; 수정 후 10 일째 백신접종하고 부화 후 추가접종한 병아리는 2 내지 9 log2 (평균 5.5) 사이의 HI 역가를 나타냈고; 수정 후 18 일째 백신접종한 병아리는 2 내지 9 log2 (평균 5.5) 사이의 역가를 나타냈고; 수정 후 18 일째 백신접종하고 부화 후 15 일째 추가접종한 병아리는 2 내지 8 log2 (평균 5.7) 사이의 HI 역가를 나타냈다. 종합하면, 상기 인간 Ad 벡터화된 AI 백신의 난내 투여는 닭에서 AI 에 대한 강한 면역 반응을 유도한 반면, 닭에 상기 벡터화된 백신의 비강내 점적주사은 최근 입증된 바와 같이 (Gao, 2006) 비효과적이다.
실시예 8. 고병원성 조류 인플루엔자 균주 HPAI A/Chicken/Queretaro/19/95 (H5N2) 에 의한 치명적 공격에 대한 AdTW68.H5 난내 접종의 방어성
19 마리 SPF 닭 배아를 배양 18 일째 실시예 7 에서 기술한 바와 같이 동일한 용량의 AdTW68.H5 로 난내 경로를 통해 면역화시켰다. 부화된 병아리를 날개 밴드로 각각 식별했다. 12 마리 닭 군에게 부화 후 15 일째 비측 경로를 통해 추가접종하고, 나머니 닭 7 마리는 추가접종하지 않았다. 날개 밴드가 달린 각 닭으로부터 23 일째와 29 일째에 혈액 시료를 채취하여 조류 인플루엔자 균주 A/turkey/Wisconsin/68 에 대한 항체의 HI 를 검사했다. 종합하면, 상기 닭에서 탐지된 HI 항체 역가 (도 3) 는 이전 시험 (도 2) 에서 수득된 값과 유사했다. 대부분의 닭들은 ≥ 5 log2 의 역가를 달성했다. 난내로만 접종된 병아리는 부화 후 23 일째 5 내지 9 log2 의 역가를 달성했다 (도 3). 이 닭들의 항체 역가는 부화후 29 일까지 유지 또는 증가했다. 비강내 추가접종과 함께 난내 백신접종 시에는, 부화 후 23 일까지 3 내지 9 log2 사이의 다양한 항체 역가를 나타냈다 (도 3). 이전 군에서와 같이 마찬가지로, 대부분의 병아리의 역가는 부화 후 29 일까지 1 또는 2 log2 단계만큼 증가했다.
생물안전 등급 3+ 인 시설에서 HPAI A/Chicken/Queretaro/19/95 (H5N2) (Horimoto, 1995, Garcia, 1998) 의 105 배아 감염 용량 (EID50) 을 구인두로 접종하여 공격을 수행했다. 이 공격 균주의 H 유전자는 Ad 벡터화된 백신에 이용된 AI 균주 A/turkey/Wisconsin/68 의 H (GenBank 수탁번호 U79448 & U79456) (SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8) 와 90.1 % 뉴클레오티드 동일성 및 94.4 % 추정된 아미노산 유사성을 갖는다.
난내 백신접종한 병아리 7 마리, 난내 백신접종하고 이어서 부화후 15 일째 비강내 추가접종한 병아리 12 마리, 및 백신접종하지 않은 대조군 11 마리를 포함하는, 총 30 마리 닭에게 부화후 34 일째 공격했다.
14 일의 실험 기간 동안 공격된 닭의 이환율 및 치사율을 매일 관찰했다. AI 의 임상 징후, 예컨대 닭볏 및 아래볏의 부종, 결막염, 식욕감퇴 및 저체온증을 대조 닭 11 마리 중 10 마리에서 공격 후 2 일째에 관찰했다. 2 일 후, 대조군에 속하는 대부분의 생존 닭은 닭볏 괴사, 아랫볏 부종, 설사, 탈수, 기면 및 다리 정강이의 피하 출혈을 보였다. 백신접종한 닭에서는 질병의 징후가 발생되지 않았다. AdTW68.H5 (19/19) 를 백신접종한 (난내로만 및 난내 + 비측 추가접종) 모든 닭은 공격에도 살아남았다 (도 4).
공격된 닭의 A/Chicken/Queretaro/19/95 의 바이러스 게놈을 공격 후 2 일, 4 일 및 7 일째 채취한 구인두 면봉채취물에서 실시간 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 정량적으로 분석했다. 공격 후 7 일째 백신접종한 닭과 백신접종하지 않은 닭 사이에 AI 바이러스 게놈 농도의 유의한 차이가 나타났다 (P < 0.05) (도 5). 면역화된 닭에서 탐지가능한 바이러스 RNA 의 부재는, 난내 백신접종이 1 주 안에 파급되는 AI 바이러스를 저지할 수 있는 면역 반응을 유도했다는 증거를 제공한다.
이러한 결과는 종합적으로 상이한 인플루엔자 바이러스 (인간 및 조류 기원) 유래의 H 유전자를 암호화하는 RCA-프리 인간 Ad 벡터로 난내 면역화된 닭이 동종 AI 바이러스에 대한 HI 항체 역가를 발생시켰고, 동일한 H 유형의 고병원성 AI 바이러스 균주에 의한 치명적인 공격에 대해서 방어되었음을 보여준다.
실시예 9. 고병원성 조류 인플루엔자 균주 A/swan/Mongolia/244L/2005 (H5N1) 에 의한 치명적 공격에 대한 AdTW68.H5 난내 접종의 방어성
AdTW68.H5 벡터화된 AI 백신이 최근의 H5N1 HPAI 바이러스 균주에 대한 방어를 제공할 수 있는지를 확인하기 위해, 닭 31 마리에게 2 × 108 ifu 용량으로 AdTW68.H5 벡터를 난내 백신접종했다. 대조군은 Ad5 벡터에 노출되지 않은 닭 10 마리 및, 무관련 항원 (파상풍 독소 C 조각) (Shi et al., 2001) 을 암호화하는 Ad5 벡터 (AdCMV-tetC) 를 백신접종한 닭 10 마리를 포함한다.
D31 일에, 대조군 및 면역화된 닭을 H5N1 AI 바이러스 A/swan/Mongolia/244L/2005 (이 공격 균주의 HA 는 A/turkey/Wisconsin/68 균주의 HA 와 89 % 추정된 HA 아미노산 서열 유사성을 가짐) 로 공격했다. 도 6 에 나타난 바와 같이, 난내 면역화는 D52 일에 1 내지 6 log2 범위의 항체를 유도했다. 백신접종하지 않은 닭 (10/10) 과 AdCMV-tetC-면역화된 닭 (10/10) 은 모두 측정가능한 HI 항체를 생산하지 않았고, 모두 공격 후 9 일 안에 AI 로 인해 죽은 반면, AdTW68.H5-백신접종한 닭의 68 % (21/31) 는 공격 후 10 일째에도 임상 징후 없이 살아남았다 (도 7). 주목할만하게도, HI 역가가 ≥ 3 log2 인 면역화된 군의 닭 7 마리 (도 6) 이 상기 매우 치명적인 H5N1 AI 바이러스로 인해 사망했다. 이러한 H5N1 AI 바이러스에 대한 생존률은 항원성이 더욱 유사한 HA 를 암호화하는 Ad5 벡터를 난내 백신접종한 경우 향상될 수 있을 것으로 생각된다.
이러한 결과는 조류 H5 HA 를 암호화하는 RCA-프리 인간 Ad5 벡터로 난내 면역화된 닭이 HPAI 바이러스에 대한 방어 면역을 유도해낼 수 있음을 입증한다.
실시예 10. A/Chicken/New York/13142-5/94 헤마글루티닌을 암호화하는 아데노바이러스 벡터의 제작
조류 인플루엔자 (AI) 바이러스 균주 A/Chicken/New York/13142-5/94 H7 헤마글루티닌 (HA) 을 암호화하는 E1/E3-결손성 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 유래의 벡터를 종래에 기술된 바와 같이 (Toro et al., 2008) 생성했다. AI 바이러스의 전장 H7 HA 유전자를 셔틀 플라스미드 pAdApt 에 삽입하여 플라스미드 pAdApt-NY94.H7 을 생성했다. 이 H7 HA 를 암호화하는 복제 가능성 아데노바이러스 (RCA)-프리 Ad5 벡터 (AdChNY94.H7) 를 pAdApt-NY94.H7 및 Ad5 백본 플라스미드 pJM17 로 PER.C6 세포를 동시트랜스펙션시키고, 이어서 세포병변 효과 (CPE) 가 나타난 후 플라크 정제를 여러 주기 수행함으로써 생성했다.
실시예 11. AdChNY94.H7 벡터의 에어로졸 분무에 의한 닭의 면역화
1 일령의 닭을 3 개의 군으로 나누고, 각각에게 에어로졸 분무를 통해 조성물을 투여했다. 군 A (n=15) 는 AdChNY94.H7 벡터화된 AI 백신 (실시예 10 에서 제조한 바와 같음) 을 단회 요법에서 1.1 × 1010 감염성 단위 (ifu)/㎖ 를 함유하는 8 ㎖ 의 부피로 에어로졸 분무하여 면역화했다. 군 B (n=15) 는 동일한 백신을 24 ㎖ 의 부피로 (또한 1.1 × 1010 ifu/㎖ 의 Ad5) 에어로졸 분무하고, 부가적으로 16 일령에 추가접종하여 면역화했다. 군 C 는 백신접종하지 않은 대조군이다.
도 8 은 ELISA 로 측정한 누액 중 특이적 IgA 수준을 나타낸다.
도 9 는 닭 혈청 중 적혈구응집 억제 (HI) 항체 역가를 나타낸다.
이 도면들에 나타난 바와 같이, 군 A 및 B 모두에서 면역 반응이 유발되었고, 군 B 의 일원은 16 일째 추가접종 후 면역 반응의 증가를 나타냈다. 인간 Ad5 벡터화된 백신의 에어로졸 분무가 닭의 백신접종에 효과적이라는 상기 입증은 안구내 투여, 복수의 경로 (비강내, 안구내, 경피 및 경구 투여) 의 조합, 및/또는 에어로졸 분무 중 생성된 미세한 박무로 인한 것일 수 있다.
실시예 12. 조류 인플루엔자 H5 헤마글루티닌을 암호화하는 복제 결손성 인간 아데노바이러스 벡터에 의한 조류 하르더샘에서의 점막 면역의 유도
닭
특정 무병원체 (SPF) 백색 레그혼 닭 수정란 (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) 을 인큐베이션하여 부화시켰다. 실험 기간 동안 닭을 Horsfall-유형 격리 구역 내에서 BSL2 조건 하에 유시시켰다. 연방 및 기관 동물 관리 및 사용 규정에 따라 실험 절차 및 동물 관리를 수행했다.
RCA-프리 Ad 벡터화된 AI 백신
사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 프로모터의 전사 조절 하에 A/turkey/Wisconsin/68 AI 바이러스의 코돈 최적화된 H5 HA 를 암호화하는 RCA-프리 E1/E3-결손성 AdTW68.H5ck 벡터를 PER.C6 세포 (Crucell Holland BV 에 의해 제공됨) 에서 생성했다.
안구 백신접종
H5-특이적 면역을 유도하기 위해 9 또는 10 일령 SPF 백색 레그혼 닭 (Charles River Labs) 에게 안구 경로를 통해 2.5 × 108 ifu/마리 의 AdTW68.H5ck 를 80-100 ㎕ 의 부피로 백신접종했다. 특정 실험에서 닭에게 안구 경로를 통해 동일한 백신 용량을 14 일 간격으로 2 회 추가접종했다. 대조군은 순수 닭 또는 무관련 단백질 (파상풍 독소 C 조각) 을 발현하는 Ad5 를 백신접종한 닭이었다.
시료 채취
위팔 정맥을 천자한 후 혈액 시료를 채취하여, 응고되도록 놔두고 1 분 동안 4,500 xg 에서 원심분리하여 혈청을 수득했다. 혈청을 수집하고, 4 ℃ 에서 저장 또는 장기간 동안 -80 ℃ 에서 저장하기 전에 [4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오리드 히드로클로리드, 아프로티닌, 베스타틴 히드로클로리드, [N-(트랜스-에폭시숙시닐)-L-류신 4-구아니디노부틸아미드], EDTA, 류펩틴을 함유하는 1O × 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma, Saint Louis, MO) 을 혈청에 부가했다. 이전에 기술된 바와 같이 (Toro, 1996) 누액을 수득하여, 5 분 동안 3,300 xg 에서 원심분리하고, 1O × 프로테아제 칵테일과 혼합하고, 4 ℃ 에서 또는 장기간 -80 ℃ 에서 저장했다. 항체 측정을 위해 17, 40, 50, 63 및 68 일령에 혈청 및 누액을 채취했다.
항체 측정
혈청 AI H5 항체 수준을 4 적혈구응집 단위의 저병원성 A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9) 균주에 대한 적혈구응집 억제 (HI) 분석에 의해 측정했다. 1.0 Log2 미만의 역가에 임의로 1.0 의 역가를 부여했다. 대조군 닭에서는 HI 항체가 탐지되지 않았다.
혈청 및 누액의 Ad5-특이적 IgA 및 IgG 수준을 ELISA 로 분석했다. Ad5 에 대한 ELISA 를 HRP-접합된 염소-항 닭 IgA, IgG 및 IgM 항체 (Gallus Immunotech Inc., Fergus, 캐나다) 를 제외하고는 이전에 보고된 바와 같이 (van Ginkel) 수행했다. ELISA 플레이트를 108 입자/웰 의 야생형 Ad5 로 코팅했다. 웰을 차단하고, 시료의 연속적 2 배 희석액을 부가하고 밤새 4 ℃ 에서 인큐베이션했다. 호오스래디시 퍼옥시데이스 (HRP) 접합된 염소 항-닭 IgA 또는 IgG 항체 (Gallus Immunotech Inc., Fergus, 캐나다) 를 이용하여 Ad5-특이적 항체를 탐지했다. 웰을 세척하고, 기질을 부가했다. 실온에서 30 분 후 반응을 중단시키고 405 ㎚ 에서 흡광도를 측정했다. 배경보다 .100 이상의 OD405 를 갖는 최고 희석액을 종말점-역가로 규정했다.
닭 B 세포 효소-연결 면역스팟 (ELISPOT) 분석
기술된 바와 같이 (Czerkinsky) ELISPOT 분석을 이용하여 Ad5 또는 H5 (A/tk/WI/68 AI 균주로 코팅됨) 에 특이적인 IgA 및 IgG 항체 분비 세포의 수를 측정하기 위해, 20, 30, 40, 50 및 60 일령의 병아리에서 하르더샘 및 지라를 채취했다. 간단히, HG 를 기계적으로 파괴하고, 1.077 g/㎖ 히스토파크-피콜 밀도 구배 (histopaque-ficoll density gradient) 로 원심분리하여 백혈구를 단리했다. 단리된 백혈구를 트립판 블루 배제를 이용하여 혈구계로 계수했다. 2 × 적혈구응집 역가의 UV 사멸된 조류 인플루엔자 바이러스 (A/tk/WI/68) 또는 열 사멸된 Ad5 바이러스로 코팅되고 (108 입자/웰), 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 을 함유하는 완전 RPMI-1640 배지로 차단된, 96-웰 마이크로플레이트 (뒤에 니트로셀룰로스가 있음) 에 백혈구를 다양한 농도로 적재했다. 세포를 5 % CO2 를 함유하는 가습이 되는 인큐베이터에서 37 ℃ 로 약 18 시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 PBS-Tween 20 (0.05 %) 으로 5 회 세척하고, 밤새 40 ℃ 에서 HRP 에 접합된 염소-항-IgG 또는 염소-항-IgA (Gallus Immunotechnology, Inc.) 와 함께 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 15-30 분 동안 퍼옥시데이스 기질 (Moss Inc.) 과 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 물로 세척하여 반응을 중단시켰다.
면역침전
눈물 또는 혈청을 밤새 4 ℃ 에서 16.5 ㎕ 비오티닐화된 마우스-항-닭 IgA 모노클로날 항체 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) 또는 16 ㎕ 비오티닐화된 염소-항-닭 IgA (Southern Biotechnology Associates, Inc.) 와 함께 인큐베이션했다. 다음날 밤새 4 ℃ 에서 교반기에서 연속 교반하면서 50 ㎕ 의 세척된 스트렙트아비딘-접합된 세파로스 비드 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, 스웨덴) 를 부가했다. 다음날 비드를 원심분리에 의해 침전시키고 0.05 % Tween20 을 함유하는 PBS 1 ㎖ 로 3 회 세척하고 PBS 로 마지막 1 회 세척했다. 2 × Tris-글라이신 SDS 시료 완충액 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 부가하고, 시료를 10 분 동안 100 ℃ 에서 끓였다. 이어서 시료를 원심분리하여 비드를 제거하고, 4-12 % 프리-캐스트 구배 겔 (Invitrogen) 상에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 상청액을 분석했다. Silver SNAP® 실버스테인 키트를 제조사의 지침 (Pierce, Rockford, IL) 에 따라 이용하여 단백질을 시각화했다.
면역화학
백색 레그혼을 2.5 × 108 ifu 의 AdTW68.H5ck 에 노출시켰다. 조직을 산성 아세테이트-알콜에 2 시간 동안 4 ℃ 에서 고정시키고, 이어서 조직을 동해방지하기 위해 PBS 중 수크로스 (30 %) 에서 인큐베이션하고, 그 후 조직을 Neg 50 배지 (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) 에 포매시키고, 액체 질소로 냉각된 이소펜탄 (Fisher Scientific) 중 포매 몰드 (Fisher Scientific) 내에서 동결시켰다. 5 ㎛ 절편을 냉동미세절단기 (Microm HM550, Waldorf, 독일) 로 자르고, 미리 세척된 (precleaned), Superfrost® Plus 현미경 슬라이드 (Labsco, Inc., Louisville, KY) 위에 놓고 건조되도록 놔뒀다. 지질을 제거하기 위해 슬라이드를 빙냉 아세톤으로 4 분 동안 처리하고, 건조시키고, 10 % FCS 로 1 시간 동안 실온에서 차단한 후, 10 % FCS 중 희석된 항-H5 친화도-정제된 토끼-항 H5 항체 (eEnzyme LLC, Gaithersburg, MD) 와 함께 밤새 4 ℃ 에서 인큐베이션했다. 이 단계 후에 비오티닐화된 당나귀-항-토끼 IgG (R&D Systems) 와 함께 4 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 마지막 단계로 1 % FCS 중 Neutralite Avidin-FITC (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) 로 4 시간 동안 실온에서 염색했다. 단계들 사이에 슬라이드를 PBS 에서 깨끗이 세척하고, 커버 글라스를 Vectashield Hard Set 봉입제 (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 로 봉입했다. 모든 이미지를 SPOT 소프트웨어 (Diagnostic Instruments) 를 이용하여 그레이 스케일로 캡춰하고, Microsoft Office Picture Viewer 에서 편집했다. 사진을 하기 설정을 이용하여 녹색으로 착색했다: "보정 정도(amount)" 를 70 으로 조정, "색조" 를 100 으로 조정, "채도" 를 100 으로 조정.
RT-PCR 닭 중합체성 면역글로불린 수용체
Tri-시약 (Molecular Research, Inc.) 을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 닭 3 마리의 하르더샘으로부터 총 RNA 를 단리했다. 1 마이크로그램의 총 RNA 를 역전사하여, 35 회의 PCR 사이클 (94 ℃, 1 분, 58 ℃, 1 분) 로 증폭시켜 닭 중합체성 면역글로불린 수용체 (pIgR) 의 발현을 탐지했다. 정방향 프라이머는 뉴클레오티드 206 3'-CCAGGAGTTGCTTGACTGT-5' 에서 시작하고, 역방향 프라이머는 nt 605 3'-CTCAGCAGGATTCTCCCTTG-5' 에서 시작하므로, pIgR mRNA 가 증폭될 경우 1.5 % 아가로스 겔 상에서 분리하고 에티듐 브로미드로 염색했을 때 400 bp 진단적 PCR 산물이 관찰될 것이다. 상기 프라이머들이 인트론을 커버하므로 게놈 DNA 증폭 후 약 ~750 bp 앰플리콘이 보였다. 잠재적 DNA 오염을 방지하기 위해 RNA 를 RNase-프리 DNase (Sigma) 로 처리했다.
통계적 분석
모든 통계적 분석을 스튜던트의 무비교 양쪽꼬리 t 검정을 이용하여 수행했다.
결과
면역형광 염색을 이용하여 안구 면역화 후 9 일째 HG 에서 AdTW68.H5ck 로부터 H5 HA 의 발현이 탐지될 수 있었음을 입증했다 (도 10). H5 발현 세포는 HG 에 존재하는 관에 대해 상당한 정도로 정렬했다. 대조군 조직에서는 H5 의 발현을 관찰하지 못했다. 인간 Ad5 가 특정 닭 세포를 생체내에서 형질도입시킬 수 있음을 보여주는 강력한 증거가 있다.
AI 바이러스에 대한 전신 항체 반응을 측정하기 위해 혈청 시료에 대해 HI 분석을 수행했다. AdTW68.H5ck 를 2 번째 및 3 번째 안구 투여한 후 2 주째 채취한 혈청으로부터 연속적 희석물을 제조했다. 도 11 에서 나타나는 바와 같이, 2 번째 AdTW68.H5ck 적용 (HI 역가 6.4, n=15) 및 3 번째 적용 (HI 역가 7.7, n=9) 후 강한 HI 항체 반응이 관찰된 반면, 접종하지 않은 대조군 (HI=O, n=11) 에서는 HI 역가가 탐지되지 않았다.
ELISA 로 눈물에서 높은 IgA 및 IgG Ad5-특이적 항체를 나타낸 반면, 혈청에서는 오직 높은 IgG 역가만이 탐지되었다 (도 12). IgA 탐지를 위해 2 × 희석된 시료 또는 IgG 탐지를 위해 32 × 희석된 시료로 시작한 경우 대조군 닭에서 IgA 또는 IgG 항체가 탐지되지 않았다 (데이타는 미제시). 눈물 및 혈청 중 IgG 수준은 유의하게 상이하지 않았다 (P=0.4072). 이는 눈물 중 IgG 항체가 HG 에서 생산되었거나 혈청 삼출물에서 유래되었거나 더욱 가능성 있게는 이들 둘의 조합에서 유래되었음을 시사할 수 있다. 상승된 IgA 수준이 눈물에서 관찰된 반면 (평균 Log2 종말점 역가 6.8), IgA 혈청 수준은 대부분의 닭에서 탐지불가능했다 (평균 Log2 종말점 역가 0.3). 눈물 중 IgA 수준은 혈청 중 관찰된 IgA 수준보다 유의하게 더 높았다 (P<0.0001). 이는 대부분의 IgA 항체가 안구 면역화 후 HG 에서 국부적으로 생산되었음을 시사했다. 이를 확인하고 또한 HG 내 IgG 생산을 측정하기 위해, 닭 ELISPOT 분석을 개발했다.
물질 및 방법에서 상세히 기술한 바와 같이 발현된 H5 HA 및 Ad5 벡터에 대해 IgA 및 IgG ELISPOT 분석을 개발했다. HG 에서 안구 공격 후 관찰된 IgA 점 형성 세포 (SFC) 를 도 13 에 도시했다. 안구 공격 후 HG 에서 유도된 Ad5 및 H5 에 특이적인 IgG SFC 반응을 도 14 에 나타냈다. 752 SFC / 106 백혈구에 의한 안구 투여 후 9 일째 Ad5-특이적 면역 반응이 최고조에 달했다. H5 HA 에 대한 최고조 IgG 반응은 2 일 더 늦어, AdTW68.H5ck 투여 후 11 일째였고, 2,047 SFC / 106 백혈구였다. 이는 Ad5 IgG SFC 반응보다 규모에서 2.7 × 더 높다 (도 14). 동일한 2 일 지연이 H5 IgA SFC 반응을 Ad5 반응과 비교할 때 관찰되었고 (도 15), Ad5 IgA SFC 반응보다 2.4 × 더 높았다 (도 15). H5 및 Ad5 최고조 IgA 반응은 각각 605 SFC / 106 백혈구 및 257 SFC / 106 백혈구였다.
HG 는 눈에 인접해 있으므로, 중합체성 IgA 를 분비함으로써 침입하는 병원체에 대한 첫번째 방어선을 형성하기에 완벽한 위치에 있다. 닭 중합체성 면역글로불린 수용체 (pIgR) 가 클로닝되고, 다양한 조직에서의 발현이 분석되고 (Wieland, 2004), 또한 중합체성 IgM 및 IgA 와의 상호작용이 입증되었지만 (Kobayahi, 1980), 닭 HG 에서 점막 항체 반응을 발생시키는 이 본질적 수용체의 발현에 대해서는 데이타가 입수가능하지 않다. HG 에서 단리한 총 RNA 를 잠재적 DNA 오염을 방지하기 위해 RNase-프리 DNase 로 처리한 후 RT-PCR 로 분석했다. 도 16 에서 나타나는 바와 같이, pIgR 이 HG 에서 발현되었다. RNA 의 역전사를 배제한 경우 PCR 산물이 관찰되지 않았다. 게다가, pIgR DNA 의 증폭은 관찰되지 않은 ~750 bp 산물을 초래했을 것이다. 이러한 관찰은 pIgR mRNA 가 HG 에서 발현되었음을 확인한다. 또한, RT-PCR 산물을 Auburn University 서열분석 시설에서 서열분석하여, 공표된 닭 pIgR mRNA 서열 (Wieland, 2004) 과 동일함을 밝혔다.
HG 내 pIgR 의 발현이 눈물 중 중합체성 IgA 의 분비를 초래했음을 확인하기 위해, 눈물 및 혈청 IgA 모두에 대해 면역침전을 수행했다. 이러한 절차로 단리한 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하고, Silver SNAP® 염색 키트를 제조사의 지침 (Pierce, Rockford, IL) 에 따라 이용하여 시각화했다 (도 17). 닭 IgA 에 대한 마우스 모노클로날 항체로 3 가지 상이한 크기의 단백질을 침전시켰다. 가장 작은 단백질은 추정 분자량이 ~200-230 kDa 사이였고, 이는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄로 이루어진 단량체성 IgA (mIgA) 분자와 일치했다. 눈물 및 혈청 단백질 중 mIgA 의 양에서 명확한 차이가 관찰되었다. mIgA 는 혈청에서 가장 많이 존재하는 IgA 의 형태이고, 눈물에서 가장 적게 존재하는 IgA 의 형태이다. 추정 MW 가 ~470 kDa 인 분자량 (MW) 이 다음으로 큰 단백질은 눈물에서 가장 많이 존재하는 단백질이고 혈청에서 가장 적게 존재하는 단백질이다. 이 단백질은 크기에 기초할 때 (Wieland, 2004; Watanabe, 1975; Watanabe, 1974) pIgR 의 분비 성분 (SC) 과 연관된 이합체성 IgA 였다. 침전된 단백질 중 가장 큰 단백질은 추정 MW 가 -710 kDa 이고 크기에 기초할 때 (Watanabe, 1975; Watanabe, 1974) 4 합체성 IgA (tIgA) 였을 것이다. tIgA 는 눈물 및 혈청 모두에 풍부하게 존재했다. 이 데이타는 단량체성 IgA 는 혈청에 가장 많이 존재하는 한편, 이합체성 IgA 는 눈물과 같은 점막 분비물에 가장 많이 존재함을 입증한다. 이 시나리오는 포유류에서 관찰된 바와 동일했다.
따라서, 이러한 결과들은 인간 복제 결손성 AdTW68.H5ck 백신 벡터가; 1) 안구 노출시 HG 의 세포를 효과적으로 형질도입시켜서, 2) 전신 및 점막 면역 반응을 모두 초래했음을 입증한다. 또한, 이는 ELISPOT 분석을 이용한 닭 HG 내 항체 분비 세포의 첫번째 정량적 분석이고, 닭에서의 IgA ELISPOT 이용에 대한 첫번째 보고이다. H5 이식유전자 및 Ad5 벡터 모두에 대해 IgG 및 IgA 반응의 유도가 관찰되었다. 이는 HG 가 눈물에서 pIgR 을 발현하고 pIgA 를 우세하게 분비했다는 발견과 함께, 전신 및 점막 영역 모두에서 병원체에 대한 방어 면역 반응을 발생시킴에 있어서 HG 의 중요성을 확인했다.
인간 Ad5 벡터가 어떻게 닭 세포를 형질도입시켰는지에 대한 의문이 여전히 미해결 상태이다. 야생형 인간 Ad5 가 조류 변원체가 아니라는 사실에 기초할 때, 닭은 Ad5 섬유 마디와 상호작용하는 것으로 알려진 (Bergelson, 1997) 전통적 콕사키에-아데노바이러스-수용체 (CAR) 를 발현하지 않을 것이다. Ad5 가 CAR 수용체를 통하지 않고 세포를 형질도입시키는 다른 메카니즘이 제안되었다. 예를 들어, MHC 클래스 I 은 Ad5 섭취에 관여할 수 있는 (Hong, 1997) CAR 미모토프 (mimotope) 를 함유할 수 있다. 또한, 펜톤 베이스 단백질은 αv-인테그린에 의한 아데노바이러스의 내재화를 촉진하는 (Wickham, 1993; Davison, 2001) RGD 모티프를 갖는다. 더 짧은 가닥의 (shorter shafted) 아데노바이러스에 대해 보고된 바와 같이 (Roelvink, 1998), CAR 수용체의 부재 하에 닭 세포를 Ad5 에 의해 형질도입시킬 때 인테그린이 참여하는지 여부가 알려지지 않았다. Ad5 는 수지상세포 (DC) 를 시험관내 형질도입시켰는데, 수지상세포 상의 CAR 수용체 발현의 결여로 인해 효율이 비교적 낮았다 (Okada, 2001; Rea, 1999). 피내 전달 후 DC 를 형질도입시키는 능력에 대해 Ad5 및 Ad35 (CD46 을 통해 DC 를 표적화하는 것으로 알려짐) 를 비교하는 최근의 연구는, Ad35 가 Ad5 보다 DC 를 형질도입시키는데 있어서 약 2 × 더 효율적이나, CD83+ 성숙 DC 를 포함하는 상당한 백분율의 DC 가 Ad5 에 의해 형질도입되었음을 입증했다 (de Gruijl, 2006). 후천성 면역 반응의 강력한 유도자로서 기능하는 DC 의 능력을 고려할 때, CAR 수용체의 부재 하에 (닭에서 추정되는 시나리오임) Ad5 는 DC 를 표적화하는 경향을 더욱 가질 수 있다고 추측된다. 초회항원자극 동안 유도된 Ad5 에 대한 IgG 항체가 Ad5 를 식균하여 이를 DC 상의 CD64+ (높은 친화도 Fcγ-Rl 수용체) 에 표적화시킬 수 있기 때문에, Ad5-특이적 면역 반응을 증가시켰을 때 DC 의 표적화가 추가로 증가할 수 있다. Ad5 벡터를 CD64 로 표적화시킨 한 연구는 인간 DC 형질도입이 미변형 Ad5 에 비해 10-15 배 증가했음을 입증했다 (Sapinoro, 2007). 이러한 상황에서 흥미롭게도 안구 Ad5-H5 투여 후 HG 에서 H5-발현 세포가 HG 의 배출관을 따라 상당한 정도로 정렬하는 것으로 보였고, 최근 닭 HG 에서 CD83+ DC 에 대해 유사한 분포가 보고되었다 (Hansell, 2007).
닭에서의 B 세포 ELISPOT 분석과 관련하여 오직 2 개의 문헌이 출판되었다. 첫번째는 1998 년에 출판된 Poultry Science 에서의 연구 기록으로서, 비장에서 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 에 특이적인 IgG 및 IgM 점 형성 세포 (SFC) 를 입증했고 (Wu, 1998), ELISPOT 이 닭의 면역 반응을 분석하는 유용하고 민감한 도구라는 생각을 뒷받침했다. 두번째 출판은 말초 혈액 단핵 세포 및 비장에서 감염성 기관지염 바이러스-특이적 IgG SFC 의 역동학을 더욱 상세히 분석한 더욱 정교한 연구였다 (Pei, 2005). 본 발명자는 HG 에서 Ad5 및 AI H5 에 특이적인 IgG 및 IgA SFC 모두를 분석했다. 닭에서의 IgA SFC 에 대한 분석이 이전에 보고된 바 없고, HG 에서 유도된 SFC 에 대한 분석이 행해진 바 없다. HG 에서 Ad5-H5 유도된 H5-특이적 IgA 및 IgG 반응은 Ad5-특이적 반응보다 약 2.5 × 더 높았다. HG 내 IgG SFC 반응은 H5 및 Ad5 에 대한 IgA SFC 반응보다 약 3 × 더 높았다. 백혈구의 단리 전에 HG 를 PBS 로 관류시키지 않았기 때문에, IgG SFC 반응의 일부는 혈액 유래의 백혈구에서 기원했을 수 있다. 그럼에도 불구하고, HG 에서 강한 IgG 반응이 관찰되었고, 이는 또한 눈물 중 Ad5-특이적 IgG 항체 수준에 의해 반영되었다. Ad5-특이적 반응과 비교할 때 H5-특이적 항체 SFC 반응에서의 2 일 지연은 Ad5 벡터에 대한 노출과 H5 이식유전자의 발현 사이에 지연이 존재함을 입증할 것이다. 이러한 지연이 발생하는 이유는 분명하지 않고, 이러한 관찰은 Ad5 를 이용하여 마우스에서 밝혀진 바 (van Ginkel, 1995) 와 상이했다. 이것이 닭 세포의 Ad5 벡터에 의한 감염 경로와 관련되는지 여부가 확인되지 않고 있다.
IBV-특이적 눈물 IgA 수준은 안구 IBV 공격에 대한 내성 수준과 관련된다 (Toro, 1994). 이는 병원체로의 노출에 대한 점막 표면의 방어에 있어서 눈물 중 IgA 항체의 중요성을 설명한다. 응용된 관점으로부터, 이러한 발견은 난내 백신접종 후 닭을 효과적으로 방어하는 것으로 이전에 보고된 동일한 아데노바이러스 재조합 기술에 의해 현존하는 (성체) 닭 집단을 AI 에 대해 백신접종하는 것의 실행가능성을 증명하므로 유의미하다.
조류 J 사슬이 클로닝되고 HG B 세포에서 발현됨이 증명되었지만 (Takahashi, 2000), 눈물 유래의 IgA 의 분자 조성물에 대해서는 한정된 분석만이 존재한다. Watanabe 등은 눈물에서 분자량이 약 650 kDa 인 4 합체성-IgA (tIgA) 가 분비됨을 보고했고, 이 tIgA 는 중합체성 면역글로불린 수용체 (pIgR) 의 분비 성분 (SC) 과 연관되지 않았다 (Watanabe, 1975). 창자는 IgA 분비가 SC 와 연관되었던 유일한 기관이다 (Wieland, 2004; Watanabe, 1975; Watanabe, 1974). 이 중합체성 IgA (pIgA) 의 분자량은 350-500 kDa 으로 추정되었다 (van Ginkel, 1995; Watanabe, 1975; Watanabe, 1974). 닭 pIgR 의 클로닝은 노던 블롯 분석에 의해 pIgR mRNA 를 입증할 수 있게 했다. mRNA 는 창자에서 뿐만 아니라 간, 흉선 및 파브리시우스낭에서도 발현되었다. 이전의 보고와는 반대로 (Watanabe, 1975), SC 가 또한 담즙 유래의 IgA 와 연관됨이 입증되었다 (Wieland, 2004). 닭의 눈물 및 혈청 유래의 면역침전된 IgA 의 분석에 기초할 때, 닭에는 3 가지 이상의 상이한 형태의 IgA 가 존재한다. 분자량에 기초할 때 IgA 의 단량체성 형태가 혈청에 가장 많이 존재하고, 눈물에는 거의 부존재한다. 분자량에 기초할 때 SC 와 연관된 것으로 추정되는 2 합체성 IgA 는 혈청과 비교할 때 눈물에서 가장 많이 존재하는 형태였다. 마지막으로, 다합체성, 아마도 tIgA 는 눈물 및 혈청 모두에서 거의 동등한 수준으로 존재했다.
또한, RT-PCR 에 의해 닭 HG 에서 pIgR 이 발현되었음이 입증되었다. HG 내 pIgR 발현의 결여는 닭에서 pIgR 의 기능에 대해 의문을 제기했을 것이다. 이러한 발견은 점막 상피를 통해 pIgA 를 눈물로 수송함에 있어서 pIgR 의 역할 및 닭의 점막 분비물 내 (그러나 혈청 내에서는 아님) pIgA 의 높은 존재비와 일치한다. 혈청에는 단량체성 IgA (mIgA) 가 우세하게 존재한다. 포유류에서 이와 동일한 시나리오가 밝혀졌다. 즉, 닭 IgA 내의 힌지 영역 (이 영역은 포유류에서 단백질분해에 가장 감수성임) 의 결여 (Mansikka, 1992) 는 점막 분비물 중 SC 와 pIgA 의 연관을 변경시키지 않았다. SC 와의 연관이 프로테아제에 대해 조류 pIgA 를 더 많이 방어하지 않은 경우, 그것의 유일한 기능이 상피를 통해 pIgA 를 수송하는 것이었는지 여부에 대한 의문이 제기되었다. 이러한 상황에서 흥미롭게도 2 합체성 IgA 및 5 합체성 포유류 IgM 이 모두 pIgR 에 의해 점막 상피를 통해 수송되었다. 5 합체성 IgM 은 적절한 조립을 위해 J-사슬을 필요로 했고, 한편 6 합체성 IgM 은 J-사슬을 함유하지 않았다 (Randall, 1990; Wiersma, 1998). J-사슬은 포유류에 비해 닭에서 고도로 보존되어 있고 (Takahashi, 2000) 2 개의 보존된 영역을 함유했는데, 이는 pIgR 과의 상호작용에 중요했다 (Braathen, 2007). 6 합체성 IgM 내 J-사슬의 결여는 이를 보체 고정에 있어서 J-사슬을 함유하는 5 합체성 IgM 보다 ~20 배 더욱 효과적으로 만든다 (Randall, 1990; Wiersma, 1998). 따라서, 보체의 활성화, 염증 및 점막 표면의 연관된 조직 손상을 방지하기 위해, SC 와 조합된 J-사슬이 중합체성 항체에 결합했다고 가정할 수 있다. 이러한 기능은 IgA 보다 IgM 에 대해 더욱 중요할 수 있는데, 이는 포유류 IgA 가 보체 활성화에 있어서 본질적으로 불량하기 때문이다. 이러한 항체가 조류 점막 표면에서 유사한 역할을 수행할지 여부에 대한 데이타는 입수가능하지 않다.
닭의 혈청 및 눈물 모두에서 발견되는 tIgA 는, SC 를 함유하지 않는 것으로 보고된 (Kobayashi, 1980, Watanabe, 1975), 닭 내 담즙 및 눈물 유래의 IgA 에 대해 상이한 연구자에 의해 보고된 크기 차이를 설명할 수 있다 (Kobayashi, 1980, Watanabe, 1975; Watanabe, 1974). 인간의 점막 분비물 중 IgA 는 또한 4 합체성 및 3 합체성 형태도 함유했으나, 이들 형태는 pIgR 에 결합되고 이 수용체의 SC 를 함유했다 (Song, 1995). 이러한 관점에서 닭 IgA 는 포유류 IgA 와 상이할 수 있고, tIgA 가 닭의 눈물, 담즙 및 침과 같은 점막 분비물 내로 수송되는 메카니즘에 대해 추가의 분석이 필요하다. 또한, 이러한 데이타는 안구 노출 후 점막 및 전신 면역 모두를 발생시킴에 있어서 HG 의 중요성을 입증했고, 인간 Ad5 벡터화된 백신으로 조류 병원체에 대해 성체 닭을 눈물 백신접종시키는 것의 실행가능성을 입증한다.
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이와 같이 본 발명의 상세한 구현예를 기술했지만, 이의 다양한 분명한 변형이 본 발명의 정신 또는 범주에서 벗어남 없이 가능하므로, 첨부된 청구항에 의해 규정되는 본 발명은 상기 상세한 설명에 기술된 특별한 세부사항들에 의해 한정되지 않는다고 이해되어야 한다.
본 발명은 하기 번호가 매겨진 단락에 의해 추가로 기술될 것이다:
1. 동물에서 방어 면역 반응이 유도되도록 유효량의 면역원성 또는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 투여가 에어로졸 분무를 통해 이루어지는, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
2. 제 1 단락에 있어서, 면역원성 또는 백신 조성물이 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
3. 제 2 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 에서 유래되는 방법.
4. 제 2 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 및 야생형 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
5. 제 4 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 방법.
6. 제 2 단락에 있어서, 프로모터 서열이 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α (EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
7. 제 2 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
8. 제 7 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래되는 방법.
9. 제 7 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
10. 제 7 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및, 비구조 단백질 예컨대 효소 또는 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
11. 제 7 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
12. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터 및 수의학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제를 포함하는, 조류 대상에게 에어로졸 분무 전달하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신.
13. 제 12 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
14. 제 12 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 및 야생형 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
15. 제 14 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 면역원성 조성물 또는 백신.
16. 제 12 단락에 있어서, 프로모터 서열이 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α (EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
17. 제 12 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
18. 제 12 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
19. 제 12 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
20. 제 19 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및, 비구조 단백질 예컨대 효소 및 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
21. 제 20 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3 및 5 로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
22. 제 12 단락에 있어서, 보강제를 추가로 포함하는 조성물 또는 백신.
23. 제 12 단락에 있어서, 부가적 백신을 추가로 포함하는 조성물 또는 백신.
24. 제 12 단락 내지 제 23 단락 중 어느 한 단락에 따른 조성물의 면역학적 유효량을 조류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상에서 조류 인플루엔자에 대한 면역원성 반응을 유발시키는 방법.
25. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역학적 유효량의 면역원성 조성물로 조류 대상을 감염시키는 단계를 포함하는, 상기 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 대상에서 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유발시키기에 충분한 수준에서 발현되는, 면역원성 조성물이 에어로졸 분무를 통해 투여되는, 조류 대상에서 면역원성 반응을 유발시키는 방법.
26. 제 25 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
27. 제 25 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
28. 제 27 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및, 비구조 단백질 예컨대 효소 및 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
29. 제 28 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
30. 제 25 단락에 있어서, 부가적 백신을 추가로 포함하는 방법.
31. 조류 대상의 병원체의 항원을 암호화하는 이종 핵산 분자를 함유하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스를 에어로졸 분무 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법.
32. 제 31 단락에 있어서, 인간 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래되는 서열을 포함하는 방법.
33. 제 31 단락에 있어서, 인간 아데노바이러스가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래되는 서열을 포함하는 방법.
34. 제 33 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 방법.
35. 제 31 단락에 있어서, 조류의 병원체의 항원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
36. 제 35 단락에 있어서, 조류의 병원체의 항원이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
37. 제 36 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및, 비구조 단백질 예컨대 효소 및 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
38. 제 36 단락에 있어서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
39. 제 31 단락에 있어서, 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
40. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스를 하나 이상의 조류에게 전달하는, 면역원성 조성물을 하나 이상의 조류에게 전달하기 위한 에어로졸 분무 투여 기구.
41. 제 40 단락에 있어서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터가 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래되는 서열을 포함하는 기구.
42. 제 40 단락에 있어서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 인간 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래되는 서열을 포함하는 기구.
43. 제 40 단락에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 기구.
44. 제 40 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 기구.
45. 제 40 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
46. 제 40 단락에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제를 암호화하는 유전자 및, 비구조 단백질 예컨대 효소 및 다른 조절 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
47. 제 40 단락에 있어서, 관심의 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
48. 제 40 단락에 있어서, 부가적 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
참고문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> VAXIN, INC. <120> IMMUNIZATION OF AVIANS BY MUCOSAL ADMINISTRATION OF NON-REPLICATING VECTORED VACCINES <130> 858610-2014.WO <140> PCT/US2009/058617 <141> 2009-09-28 <150> 61/100,623 <151> 2008-09-26 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1698) <400> 1 atg aag act atc att gct ttg agc tac att tta tgt ctg gtt ttc gct 48 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 caa aaa ctt ccc gga aat gac aac agc acg gca acg ctg tgc ctg ggg 96 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 cac cat gca gtg tca aac gga acg cta gtg aaa aca atc acg aat gac 144 His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 caa att gaa gtg act aat gct act gag ctg gtt cag agt tcc tca aca 192 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 50 55 60 ggt aga ata tgc gac agt cct cac caa atc ctt gat gga gaa aac tgc 240 Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys 65 70 75 80 aca cta ata gat gct cta ttg gga gac cct cat tgt gat ggc ttc caa 288 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln 85 90 95 aat aag gaa tgg gac ctt ttt gtt gaa cgc agc aaa gcc tac agc aac 336 Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tat gcc tcc ctt agg tca cta gtt 384 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 gcc tca tcc ggc aca ctg gag ttt aac aat gaa agc ttc aat tgg act 432 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 gga gtc gct cag aat gga aca agc tct gct tgc aaa agg aga tct aat 480 Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160 aaa agt ttc ttt agt aga ttg aat tgg ttg cac caa tta aaa tac aaa 528 Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu Lys Tyr Lys 165 170 175 tat cca gca ctg aac gtg act atg cca aac aat gaa aaa ttt gac aaa 576 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys 180 185 190 ttg tac att tgg ggg gtt cac cac ccg agt acg gac agt gac caa atc 624 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Ser Asp Gln Ile 195 200 205 agc ata tat gct caa gca tca ggg aga gtc aca gtc tct acc aaa aga 672 Ser Ile Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 agc caa caa act gta atc ccg aat atc gga tct agt ccc tgg gta agg 720 Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Ser Pro Trp Val Arg 225 230 235 240 ggt gtc tcc agc aga ata agc atc tat tgg aca ata gta aaa ccg gga 768 Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 gac ata ctt ttg att aac agc aca ggg aat cta att gct cct cgg ggt 816 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 tac ttc aaa ata cga agt ggg aaa agc tca ata atg agg tca gat gca 864 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 ccc att ggc aaa tgc aat tct gaa tgc atc act cca aat gga agc att 912 Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 ccc aat gac aaa cca ttt caa aat gta aac agg atc aca tat ggg gcc 960 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 tgt ccc aga tat gtt aag caa aac act ctg aaa ttg gca aca ggg atg 1008 Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 cgg aat gta cca gag aaa caa act aga ggc ata ttc ggc gca atc gcg 1056 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 ggt ttc ata gaa aat ggt tgg gag gga atg gtg gac ggt tgg tac ggt 1104 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 ttc agg cat caa aat tct gag ggc aca gga caa gca gca gat ctt aaa 1152 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 agc act caa gca gca atc aac caa atc aac ggg aaa ctg aat agg tta 1200 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 atc gag aaa acg aac gag aaa ttc cat caa att 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Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 100 105 110 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 130 135 140 Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn 145 150 155 160 Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu Lys Tyr Lys 165 170 175 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys 180 185 190 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Ser Asp Gln Ile 195 200 205 Ser Ile Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg 210 215 220 Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Ser Pro Trp Val Arg 225 230 235 240 Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 245 250 255 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 260 265 270 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285 Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 290 295 300 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335 Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400 Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 450 455 460 Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 485 490 495 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540 Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 545 550 555 560 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 3 <211> 1647 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <400> 3 gac caa atc tgc atc ggt tat cat gca aac aat tca aca aaa caa gtt 48 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 gac aca atc atg gag aag aat gtg acg gtc aca cat gct caa gat ata 96 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 ctg gaa aaa gag cac aac ggg aaa ctc tgc agt ctc aaa gga gtg agg 144 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 ccc ctc att ctg aag gat tgc agt gtg gct gga tgg ctt ctt ggg aac 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gag ttc cta aat gta ccg gaa tgg tca tat att gta 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 gag aag gac aat cca acc aat ggc tta tgt tat ccg gga gac ttc aat 288 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 gat tat gaa gaa ctg aag tat tta atg agc aac aca aac cat ttt gag 336 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 aaa att caa ata atc cct agg aac tct tgg tcc aat cat gat gcc tca 384 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 tca gga gtg agc tca gca tgc cca tac aat ggt agg tct tcc ttt ttc 432 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 agg agt gtg gtg tgg ttg atc aag aag agt aat gta tac cca aca ata 480 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 aag agg acc tac aat aac acc aat gta gag gac ctt ctg ata ttg tgg 528 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 gga atc cat cac cct aat gat gca gcg gaa caa acg gaa ctc tat cag 576 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 aac tcg aac act tat gtg tct gta gga aca tca aca cta aat cag agg 624 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 tca att cca gaa ata gct acc agg ccc aaa gtg aat gga caa agt gga 672 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 aga ata gaa ttt ttc tgg aca ata cta agg ccg aac gat gca atc agc 720 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 ttt gaa agt aat ggg aac ttt ata gct cct gaa tat gca tac aag ata 768 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 gtt aaa aag gga gat tca gca atc atg aga agc gaa ctg gag tat ggc 816 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gtg ggt gct ata aat tcc agt 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 atg cct ttt cac aat gtt cat ccc ctt acc att gga gag tgt ccc aaa 912 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 tat gtc aaa tca gat aaa ctg gtc ctt gca aca gga ctg agg aac gtg 960 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 cct cag aga gaa aca aga ggt ctg ttt gga gca ata gca gga ttc ata 1008 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 gaa ggg ggg tgg caa gga atg gta gat gga tgg tat ggt tac cat cat 1056 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 agc aac gag cag gga agt gga tat gct gca gac aaa gag tcc act cag 1104 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 aaa gca atc gac ggg atc acc aat aaa gtc aac tca atc att gac aaa 1152 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 atg aac act caa ttc gaa gcc gtt ggg aaa gaa ttc aac aac tta gaa 1200 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat gga ttt cta gat 1248 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 gta tgg act tac aat gca gaa ctt ctg gtg ctc atg gaa aat gaa aga 1296 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 act ctg gat ttc cat gat tca tat gtc aag aac cta tac gat aag gtc 1344 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 cga ctc cag ctg aga gat aat gca aaa gaa ttg ggc aat ggg tgt ttg 1392 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 gag ttc tcc cac aaa tgt gac aat gaa tgc atg gaa agt gtg aga aac 1440 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca agg ctg aac aga 1488 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 gag gaa ata gat gga gtc aaa ttg gag tca atg ggc acc tat cag ata 1536 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 cta tca att tac tca aca gtg gcg agt tcc cta gca ctg gca atc atg 1584 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 gta gct ggt ctg tct ttt tgg atg tgc tcc aat gga tca ttg caa tgc 1632 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 aga att tgc atc tag 1647 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 4 <211> 548 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 5 <211> 1659 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1656) <400> 5 gac caa atc tgc att ggt tat cat gca aac aat tca aca aaa cag gtt 48 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 gac aca atc atg gag aag aat gtg acg gtc aca cat gct cag gac ata 96 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 ctg gaa aaa gaa cac aat gga aga ctc tgc agt ctt aaa gga gtg aag 144 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Arg Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Lys 35 40 45 ccc ctc att ctg aag gat tgc agt gta gct gga tgg ctt ctt gga aat 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gaa ttc ctg aat gta ccg gaa tgg tca tat att gtg 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 gaa aag gac aat cca gcc aat ggc ctg tgt tat ccg gga aac ttc aac 288 Glu Lys Asp Asn Pro Ala Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 gat tat gaa gaa ctg aag cat tta atg agc agc aca aac cat ttt gag 336 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 aaa att cag ata ttt cct agg agc tct tgg tcc aac cat gat gcc tca 384 Lys Ile Gln Ile Phe Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 tca gga gtg agc tct gca tgc cca tac aat ggt agg tct tcc ttt ttc 432 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 agg aat gta gtg tgg ctg atc aag aag aat aat gtg tac cga aca ata 480 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Val Tyr Arg Thr Ile 145 150 155 160 aag agg acc tac cat aac act aat gta gaa gac ctt tta ata tta tgg 528 Lys Arg Thr Tyr His Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 gga att cat cac cct aat gat gca gct gaa cag ata aaa ctc tac cag 576 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Ile Lys Leu Tyr Gln 180 185 190 aac ccg aac act tac gtg tca gtg gga aca tca aca ttg aat caa agg 624 Asn Pro Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 tca atc cca gaa ata gcc acc aga ccc aag gtg aac gga cag agt gga 672 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 agg atg gaa ttt ttt tgg aca ata cta agg ccg aac gac tca atc aac 720 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ser Ile Asn 225 230 235 240 ttt gag agt act ggg aac ttt ata gct cct gaa tat gca tac aag ctt 768 Phe Glu Ser Thr Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Leu 245 250 255 att aaa aaa gga gat tca gca atc atg aaa agt gaa ctg aat tat ggt 816 Ile Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Asn Tyr Gly 260 265 270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gcg ggt gct ata aat tcc agg 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ala Gly Ala Ile Asn Ser Arg 275 280 285 atg cct ttt cac aat gtc cat cct ttt act att ggg gag tgc ccc aag 912 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Phe Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 tat gtc aaa tcg aaa aaa cta gtt ctt gca aca ggg cta aga aac gta 960 Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 ccc caa aga aaa aga aaa aga aaa aca aga ggc cta ttt gga gca ata 1008 Pro Gln Arg Lys Arg Lys Arg Lys Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 325 330 335 gcc gga ttc ata gaa gga gga tgg caa gga atg gtg gat gga tgg tat 1056 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350 gga tat cat cat agc aat gag cag gga agt gga tat ggt gaa gac aac 1104 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Gly Glu Asp Asn 355 360 365 gaa tct aca cag aaa gca atc gat ggg atc act aat aaa gtc aac tca 1152 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 atc att gac aaa atg aac act caa ttc gaa gcc gtt ggg aaa gaa ttc 1200 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe 385 390 395 400 aac aac cta gaa agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat 1248 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415 ggc ttt ata gat gta tgg act tac aat gcg gaa ctt cta gtg ctc atg 1296 Gly Phe Ile Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430 gaa aac gaa aga act ctg gat ctc cat gat tca aat gtc aag aaa tta 1344 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Leu His Asp Ser Asn Val Lys Lys Leu 435 440 445 tac gat agg gtc cga ctc cag ctg aga gac aat gcc aaa gaa tta ggc 1392 Tyr Asp Arg Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460 aat ggg tgc ttt gaa ttc tac cac aag tgt gac aat gaa tgc atg gaa 1440 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480 agt gtg aga aat gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca 1488 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser 485 490 495 aga ctg aac agg gag gaa ata gac gga gtc aaa tta gaa tca atg ggg 1536 Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly 500 505 510 act tat cag ata ctt tca atc tat tca aca gta gcg agt tcc cta gca 1584 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525 ctg gca atc atg gta gct ggt cta tct ttt tgg atg tgt tcc aat gga 1632 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 tca tta cag tgc aga att tgc atc tag 1659 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 6 <211> 552 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 6 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Arg Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Ala Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Phe Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Val Tyr Arg Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr His Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Ile Lys Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ser Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Thr Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Leu 245 250 255 Ile Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Asn Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ala Gly Ala Ile Asn Ser Arg 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Phe Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Lys Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Lys Arg Lys Arg Lys Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Gly Glu Asp Asn 355 360 365 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe 385 390 395 400 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415 Gly Phe Ile Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Leu His Asp Ser Asn Val Lys Lys Leu 435 440 445 Tyr Asp Arg Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser 485 490 495 Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly 500 505 510 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 7 <211> 1647 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <400> 7 gac caa atc tgc atc ggt tat cat gca aac aat tca aca aaa caa gtt 48 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 gac aca atc atg gag aag aat gtg acg gtc aca cat gct caa gat ata 96 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 ctg gaa aaa gag cac aac ggg aaa ctc tgc agt ctc aaa gga gtg agg 144 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 ccc ctc att ctg aag gat tgc agt gtg gct gga tgg ctt ctt ggg aac 192 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 cca atg tgt gat gag ttc cta aat gta ccg gaa tgg tca tat att gta 240 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 gag aag gac aat cca acc aat ggc tta tgt tat ccg gga gac ttc aat 288 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 gat tat gaa gaa ctg aag tat tta atg agc aac aca aac cat ttt gag 336 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 aaa att caa ata atc cct agg aac tct tgg tcc aat cat gat gcc tca 384 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 tca gga gtg agc tca gca tgc cca tac aat ggt agg tct tcc ttt ttc 432 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 agg agt gtg gtg tgg ttg atc aag aag agt aat gta tac cca aca ata 480 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 aag agg acc tac aat aac acc aat gta gag gac ctt ctg ata ttg tgg 528 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 gga atc cat cac cct aat gat gca gcg gaa caa acg gaa ctc tat cag 576 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 aac tcg aac act tat gtg tct gta gga aca tca aca cta aat cag agg 624 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 tca att cca gaa ata gct acc agg ccc aaa gtg aat gga caa agt gga 672 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 aga ata gaa ttt ttc tgg aca ata cta agg ccg aac gat gca atc agc 720 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 ttt gaa agt aat ggg aac ttt ata gct cct gaa tat gca tac aag ata 768 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 gtt aaa aag gga gat tca gca atc atg aga agc gaa ctg gag tat ggc 816 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 aac tgt gat acc aaa tgt cag acc cca gtg ggt gct ata aat tcc agt 864 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 atg cct ttt cac aat gtt cat ccc ctt acc att gga gag tgt ccc aaa 912 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 tat gtc aaa tca gat aaa ctg gtc ctt gca aca gga ctg agg aac gtg 960 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 cct cag aga gaa aca aga ggt ctg ttt gga gca ata gca gga ttc ata 1008 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 gaa ggg ggg tgg caa gga atg gta gat gga tgg tat ggt tac cat cat 1056 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 agc aac gag cag gga agt gga tat gct gca gac aaa gag tcc act cag 1104 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 aaa gca atc gac ggg atc acc aat aaa gtc aac tca atc att gac aaa 1152 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 atg aac act caa ttc gaa gcc gtt ggg aaa gaa ttc aac aac tta gaa 1200 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 agg aga ata gaa aat ttg aat aag aaa atg gaa gat gga ttt cta gat 1248 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 gta tgg act tac aat gca gaa ctt ctg gtg ctc atg gaa aat gaa aga 1296 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 act ctg gat ttc cat gat tca tat gtc aag aac cta tac gat aag gtc 1344 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 cga ctc cag ctg aga gat aat gca aaa gaa ttg ggc aat ggg tgt ttg 1392 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 gag ttc tcc cac aaa tgt gac aat gaa tgc atg gaa agt gtg aga aac 1440 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 gga acg tat gac tat cca caa tac tca gaa gaa tca agg ctg aac aga 1488 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 gag gaa ata gat gga gtc aaa ttg gag tca atg ggc acc tat cag ata 1536 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 cta tca att tac tca aca gtg gcg agt tcc cta gca ctg gca atc atg 1584 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 gta gct ggt ctg tct ttt tgg atg tgc tcc aat gga tca ttg caa tgc 1632 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 aga att tgc atc tag 1647 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 8 <211> 548 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 8 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 9 cacacaggta ccgccatgaa gactatcatt gctttgagc 39 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 10 cacacaggta cctcaaatgc aaatgttgca cc 32 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 11 cacacaggat ccatctgaac tcacaatcct agatgc 36 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 12 cacacaaagc ttgccgccat ggaaagaata gtgattgc 38 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 13 tgtcagttcg ttgaggacc 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 14 gttccctctt aggacgactc 20

Claims (48)

  1. 동물에서 방어 면역 반응이 유도되도록 유효량의 면역원성 또는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 투여가 에어로졸 분무를 통해 이루어지는, 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 면역원성 또는 백신 조성물이 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 에서 유래되는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 및 야생형 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 프로모터 서열이 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α (EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래되는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 효소 또는 다른 조절 단백질과 같은 비구조 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  12. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터 및 수의학적으로 허용가능한 운반체 또는 부형제를 포함하는, 조류 대상에게 에어로졸 분무 전달하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신.
  13. 제 12 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  14. 제 12 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 및 야생형 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  15. 제 14 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 면역원성 조성물 또는 백신.
  16. 제 12 항에 있어서, 프로모터 서열이 바이러스 프로모터, 조류 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, 알부민 프로모터, 연장 인자 1-α (EF1-α) 프로모터, PγK 프로모터, MFG 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  17. 제 12 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  18. 제 12 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 하나 이상의 조류 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  19. 제 12 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  20. 제 19 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 효소 및 다른 조절 단백질과 같은 비구조 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  21. 제 20 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3 및 5 로 이루어진 군에서 선택되는 면역원성 조성물 또는 백신.
  22. 제 12 항에 있어서, 추가로 보강제를 포함하는 조성물 또는 백신.
  23. 제 12 항에 있어서, 추가로 부가적 백신을 포함하는 조성물 또는 백신.
  24. 제 12 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 면역학적 유효량을 조류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상에서 조류 인플루엔자에 대한 면역원성 반응을 유발시키는 방법.
  25. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 아데노바이러스 DNA 서열을 포함하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 면역학적 유효량의 면역원성 조성물로 조류 대상을 감염시키는 단계를 포함하는, 상기 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 대상에서 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원에 대한 면역원성 반응을 유발시키기에 충분한 수준에서 발현되는, 면역원성 조성물이 에어로졸 분무를 통해 투여되는, 조류 대상에서 면역원성 반응을 유발시키는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 효소 및 다른 조절 단백질과 같은 비구조 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 추가로 부가적 백신을 포함하는 방법.
  31. 조류 대상의 병원체의 항원을 암호화하는 이종 핵산 분자를 함유하고 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스를 에어로졸 분무 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 인간 아데노바이러스가 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래되는 서열을 포함하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 인간 아데노바이러스가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래되는 서열을 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 방법.
  35. 제 31 항에 있어서, 조류의 병원체의 항원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 조류의 병원체의 항원이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 효소 및 다른 조절 단백질과 같은 비구조 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, 조류 인플루엔자 항원 또는 면역원이 헤마글루티닌 아형 3, 5, 7 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  39. 제 31 항에 있어서, 추가로 부가적 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 발현하는 재조합 인간 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스를 하나 이상의 조류에게 전달하는, 면역원성 조성물을 하나 이상의 조류에게 전달하기 위한 에어로졸 분무 투여 기구.
  41. 제 40 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터가 아데노바이러스 혈청형 5 에서 유래되는 서열을 포함하는 기구.
  42. 제 40 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 발현 벡터가 복제 결손성 아데노바이러스, 비복제성 인간 아데노바이러스, 복제 가능성 아데노바이러스 또는 야생형 아데노바이러스에서 유래되는 서열을 포함하는 기구.
  43. 제 40 항에 있어서, 아데노바이러스 DNA 서열이 E1/E3 결손되어 있는 기구.
  44. 제 40 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스, 감염성 점액낭병 바이러스, 마렉병 바이러스, 조류 헤르페스바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류폭스, 계두, 카나리폭스, 피전폭스, 메추라기폭스, 도브폭스, 조류 폴리오마바이러스, 뉴캣슬병 바이러스, 조류 폐렴바이러스, 조류 비기관염 바이러스, 조류 망상내피증 바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 내인성 바이러스, 조류 적아구증 바이러스, 조류 간염 바이러스, 조류 빈혈 바이러스, 조류 장염 바이러스, 파체코병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 근건막 섬유육종 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 골수아구증 연관 바이러스, 조류 골수구종증 바이러스, 조류 육종 바이러스 또는 조류 비장 괴사 바이러스에서 유래되는 기구.
  45. 제 40 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원이 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래되는 방법.
  46. 제 40 항에 있어서, 관심의 하나 이상의 조류 항원 또는 면역원을 암호화하는 외래 서열이 헤마글루티닌, 돌기 단백질, 다른 외부 단백질, 핵단백질, 매트릭스, 뉴라미니다제, 및 효소 및 다른 조절 단백질과 같은 비구조 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
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