KR20110061552A

KR20110061552A - 할로겐 안정화된 인슐린

Info

Publication number: KR20110061552A
Application number: KR1020117003855A
Authority: KR
Inventors: 마이클 웨이스
Original assignee: 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2011-06-09
Also published as: CN102171245B; EP2318432B1; RU2555557C2; AU2009276346A1; BRPI0916560A2; HK1161275A1; AU2009276346B2; WO2010014946A3; ES2552636T3; RU2011106744A; CN102171245A; EP2982687A1; CA2732439A1; EP2318432A2; JP5780958B2; EP2318432A4; MY158627A; JP2011529692A; WO2010014946A2; JP2015180647A

Abstract

인슐린은 할로겐화 페닐알라닌이 B24, B25 혹은 B26 위치에 삽입되어 있는 B폴리펩티드를 포함한다. 할로겐화 페닐알라닌은 오르토-모노플루오로-페닐알라닌, 오르토-모노브로모-페닐알라닌 혹은 오르토-모노크로모-페닐알라닌일 수 있다. 유사체는 인간 인슐린 등의 포유동물 인슐린일 수 있다. 핵산은 이러한 인슐린 유사체를 암호화한다. 할로겐화 인슐린 유사체는 중요한 활성을 보유한다. 환자의 치료방법은, 생리학적 유효량의 인슐린 유사체 또는 이의 생리학적 수용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 할로겐 치환에 기초한 인슐린 안정화에 따라 냉장시설이 부족한 개발도상국 지역에서의 당뇨병 치료 효과를 개선할 수 있다.

Description

할로겐 안정화된 인슐린 {HALOGEN-STABILIZED INSULIN}

본원은 2008년 7월 31일에 제출된 미국 가출원 61/085,212의 장점을 특허청구의 범위로 한다.

본 발명은 국가 보건연구소와 체결한 협력 양해각서, 계약번호 DK 40949 및 DK 074176에 따라 정부의 지원하에 완성된 것으로서 본 발명에 관한 모든 권한은 미국정부에 있다.

본 발명은 열분해에 대한 내성이 있는 폴리펩티드 유사체에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 열안정화된 인슐린 유사체에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로 설명하면, 본 발명은 원소 형태의 불소, 염소 혹은 브롬을 인슐린 유사체의 아미노산에 삽입시켜 얻은 화학적 및 열적으로 안정화된 인슐린 유사체에 관한 것이다. 이들 원소는 통상 할로겐이라고 분류되며, 원자 반경, 전자중력(혹은 전자친화력), 부분 전하의 입체전자적 분포, 및 분자내 이웃 원자의 입체전자적 성질에 미치는 영향 등에 있어서, 단백질의 일반 성분들과는 구별된다.

치료제 및 백신 등을 포함한 초안정성(ultra-stable) 단백질의 가공은, 전기 및 냉장 시설이 적절히 갖추어지지 않은 개발도상국에서 폭넓은 사회적 이점이 될 수 있다. 열분해되기 쉬운 치료용 단백질은 인슐린으로부터 공급받는다. 화학적 및 물리적 분해로 야기된 문제점은, 현재 아프리카와 아시아에서 당뇨병이 확산되고 있어 더욱 심화되는 추세이다. 인슐린 유사체의 화학적 분해율은 상대적 안정도와 반비례하므로, 초안정성 제형을 설계하면, 상기의 문제 지역에서 인슐린 대체요법의 안전성과 효능을 향상시킬 수 있다.

작은 유기분자에 불소 치환물을 사용하는 것은 의약화학 분야에서 공지되어 있다. 불화 작용기는 이러한 광범위하게 규정된 소분자들의 효능에 중요한 영향을 미치며 이러한 소분자 중에는, 콜레스테롤 생체합성 저해제인 아토르바스타틴 (Liptor^TM), 및 우울증 및 기타 정서적 질병을 치료하는데 이용되는 선택적 세로토닌 재흡수 저해제인 플루옥세틴 히드로클로라이드 (Prozac^TM) 등이 있다. 불소의 원자반경은 수소와 비슷하지만 유도 효과가 커서 상술한 약물의 입체전자적 성질을 변형하여 결과적으로 생물학적 활성을 향상시킨다. 물리적 유기화학 측면에서 이와 유사한 고려사항이 상대적으로 큰 할로겐 원자, 예컨대 염소 및 브롬의 도입에 적용될 수 있다. 소분자 "몬테루카스트 소듐 (Singulair^TM)"은 류코트리엔 저해제로서 불소원자의 공유삽입(covalent incorporation)에 의해 이의 약제학적 성질이 향상된다.

과거에는, 변형에 연계된 소수성을 최대화하는 복수의 불화 지방족 측쇄 (트리플루오로-γ-CF₃-Val, 트리플루오로-δ-CF₃-Val, 트리플루오로-δ-CF₃-Ile, 헥사플루오로-γ_1,2-CF₃-Val, 및 헥사플루오로-δ_1,2-CF-Leu)의 용도에 주목하였다. 한 예로서, 호모다이머릭 나선인 α-나선형 모티프 모델의 안정화를 들 수 있다. 이의 계면에 있는 지방족 사슬은 트리플루오로-유사체로 동시치환되어 불소형 코어를 형성하며 이 코어는 0.3 내지 2.0 kcal/몰 정도 향상된 안정성을 갖는다.

불소 원자당 안정화도는 0.1 kcal/몰 미만이다. 불소 원자당 더욱 현저한 안정화도는, 단일 내부 Phe를 펜타플루오로-Phe (F₅-Phe)¹ (5개의 불소원자당 0.6 kcal/몰의 ΔΔG_u)로 치환함으로써, 관련없는 α-나선 영역에서 달성되었다. 안정화는 단백질내 한 특정 위치에서만 일어나며 이는 그 메카니즘이 특정의 공간적 환경을 필요로 한다는 것을 시사한다. 관련된 F₅-Phe-변형 영역의 구조는 변형되지 않은 영역의 구조와 동일하다. 그러나, 구조적 안정화는 생물학적 활성 폴리펩티드의 필수요건 중 하나에 불과하다. 활성 작용은 실질적으로 계속 유지되어야 한다.

단백질에서 불소 라벨을 "¹⁹F-NMR" 프로브 형태로 사용하는 것에 대해 다수 문헌에서 개시하고 있다. 이러한 라벨은 비-교란성으로 널리 인식되고 있는 반면, 불화 아미노산을 단백질 가공에 적용하는 경우 물리화학적 성질의 변화에 일조한다. 단일 F₅-Phe 치환물을 함유하는 α-나선 폴드 모델 (빌린의 헤드부 서브영역)에 대한 연구에서, 상술한 변형이 단백질 안정성에 영향을 미치는지의 여부 및 그러한 영향이 구조적 환경과 어느 정도 밀접한 관계가 있는지를 확인하였다. 실제로, 상기 폴드 모델의 안정도는 코어내 7곳의 시험 부위 중 한 곳에서 F₅-Phe 치환물 단독에 의해 향상되었다. 그러나, 이러한 안정화 효과는 단지 불화 반응 부위에 가까운 주사슬에 황 원자를 함유하는 규정외 폴리펩티드 유사체에서만 나타났다; 자연 폴리펩티드 주사슬을 가진 빌린 헤드부 서브영역 내 자체동일 F₅-Phe 치환물은 안정성에 아무런 영향도 미치지 않는다. 따라서, 우리가 아는 지식 내에서 믿을만한 데이타에 따르면, 자연 단백질이었던 방향족 잔기의 할로겐화에 기인하여 단백질 안정성이 개선되는 사실은 과거에는 보고된 바 없다. 이러한 관찰 결과는 일반적으로 소수성 환경 자체가 변형물을 안정화시킬 수 있는 것은 아님을 시사한다. 단백질 내부는 특정의 거리 및 각도에 따라 방향족-방향족 상호작용에 의해 안정화되므로, F₅-Phe 치환물을 안정화하는 서브군은 특히 바람직한 퍼플루오르아릴/아릴 결합구조를 채택할 수 있다. 이러한 상호작용은 방향족계 내에서 부분적 전하의 비대칭 분포로부터 야기된다. 염소나 브롬 원자를 변형된 아미노산 내 특정 위치에 삽입함으로써 단백질의 화학적, 물리적 및 생물학적 성질을 조절하는 것은 상술한 불소 원자의 삽입효과와 달리 기술 문헌에 거의 구체적으로 언급된 바가 없다.

방향족 측쇄는 다양한 약한 극성 상호작용에 관여할 수 있으며 이웃한 방향족 고리 뿐만 아니라 다른 양성 혹은 음성 정전기 전위를 수반한다. 예를 들면, 펩티드 결합에 주사슬 카르보닐 및 아미드기를 포함한다.

인슐린 투여는 오랫동안 실시되어온 당뇨병 치료법이다. 인슐린은 척추동물의 대사 과정에서 중추적인 역할을 하는 소형구 형태의 단백질이다. 인슐린은 두개의 사슬, 즉, 21개의 잔기를 함유하는 A 사슬 및 30개의 잔기를 함유하는 B 사슬을 포함한다. 호르몬은 Zn² ⁺ 안정화된 헥사머로서 췌장 β-세포에 저장되나 혈류 내에서 ²⁺-무함유 모노머 역할을 한다. 인슐린은 단사슬 선구물질인 프로인슐린의 산물로서, 연결영역 (35개 잔기)에서 B 사슬의 C-말단 잔기 (잔기 B30)를 A 사슬의 N-말단 잔기에 연결하고 있다 (도 1A). 프로인슐린 구조는 정확히 알려져 있지 않으나, 인슐린형 코어와 장애결합 펩티드로 이루어져 있음이 다수 입증되고 있다 (도 1B). 3개의 특이적 디설파이드 브릿지 (A6-A11, A7-B7 및 A20-B19; 도 1A 및 1B) 형성은 조면 소포체(ER) 내에서 프로인슐린의 산화적 사슬접힘(폴딩: folding)에 연계하는 것으로 생각된다. 프로인슐린은 ER로부터 골지(Golgi) 장치에로 공급된 직후 조합되어 가용성 Zn² ⁺-배위결합 헥사머를 형성한다. 연속절단형 소화(endoproteolytic digestion) 및 인슐린 전환은 미성숙 분비과립에서 일어나며 그 후 형태응축이 이루어진다. 성숙 저장과립 내의 아연 인슐린 헥사머 결정 배열은 전자현미경(EM)에 의해 육안 관찰되었다.

인슐린내 아미노산 치환물에 대하여 열역학적 안정성 및 생물학적 활성에 미치는 영향을 연구했다. 이들 안정성과 활성간의 밀접한 관계는 관찰되지 않았다. 일부 치환물은 열역학적 안정성을 개선하고 또한 인슐린 수용체에 대한 결합력을 향상시키지만, 또다른 치환물은 안정성을 개선하는 반면 결합은 방해하였다.

Thr^A8를 수종의 다른 아미노산으로 치환하는 경우의 효과를 야생형 인간 인슐린에서 연구하였으며, 또한 B-사슬에 3개의 무관련 치환물 (His^B10→Asp, Pro^B28→Lys 및 Lys^B29→Pro)을 함유하는 가공된 인슐린 모노머에 관하여 보고되었다. 흡수 기간을 가속하거나 지연시키는 치환물에 대한 구체적인 예가 공지되어 있다. 이러한 치환물 (Novaog®의 Asp^B28 및 Humalog®의 [Lys^B28, Pro^B29] 등)은 고속 세동(fibrillation) 및 신체 안전성 저하 등에 종종 관련되거나 연계되기도 한다.

이러한 치환물 (예컨대, 노발로그^®의 Asp^B28 및 휴말로그^®의 [Lys^B28, Pro^B29])은 고속 세동 및 신체 안정성의 저하 등에 종종 관련되거나 연계될 수도 있다. 실제로, 세동에 대한 감수성에 관련하여, Asp^B28-인슐린 및 Asp^B10-인슐린을 포함한 10종의 인간 인슐린 유사체군에 대해 시험하였다. 10종의 유사체 모두가 pH 7.4 및 37℃에서 세동에 대해 인간 인슐린보다 더욱 감수성이 높은 것으로 확인되었다. 상기 10개의 치환물은 인슐린 분자내 여러 위치에 존재하며 열역학적 안정성의 폭넓은 변화와 관련이 있는 것으로 생각된다. 효과의 범위를 관할한 결과, 활성 및 열역학적 안정성 간에 특별한 상호관계는 존재하지 않았다.

인슐린은 화학 합성 및 반합성으로 쉽게 변화할 수 있는 소구체형 단백질이며, 비천연형(non-standard) 측쇄의 삽입을 촉진한다. 인슐린에는 3개의 페닐알라닌 잔기 (위치 B1, B24 및 B25)가 포함되며 구조적으로 유사한 티로신이 B26 위치에 존재한다. 척추동물 인슐린 및 인슐린 유사 성장인자 중에서 보존되는 것은 Phe^B24의 방향족 고리로서, 소수성 코어를 감싸 (단 내부에 함유되지는 않음) B-사슬의 초월 2차구조(super-secondary structure)를 안정화한다. Phe^B24는 통상 수용체-결합면에 존재하며 수용체 결합의 형상을 변화시키는 것으로 제시되었다. Phe^B25 는 인슐린 모노머의 표면에서 방출되며 Tyr^B26은 코어의 한 모서리부에 있는 지방족 측쇄 (Ile^A2, Val^A3 및 Val^B25) 부근에 집단을 이룬다. 인슐린 수용체의 개별 영역에 Phe^B25 및 Tyr^B26이 접촉할 수 있도록 B24-관련 형상의 변화가 제시되었다.

단백질 세동에 관한 본 연구이론은, 세동 메카니즘이 부분폴딩된 중간체 과정을 거쳐 진행되고 이것이 응집하여 아밀로이드 형성 핵을 형성하는 것을 가설로 한다. 상기 이론에서, 초기 상태를 안정화하는 아미노산 치환물은 부분폴딩된 중간체를 안정화하거나 하지 않을 수도 있으며 또한 초기 상태와 중간체 간의 자유에너지 계면을 증대(혹은 감소)시키거나 하지 않을 수도 있다. 따라서, 상기 연구는 인슐린 분자에 들어있는 문제의 아미노산 치환물이 세동 위험을 증대 혹은 감소시키는 경향이 실질적으로 예측불가함을 지적하고 있다.

단백질 치료를 위한 인슐린 및 인슐린 유사체의 제조, 보관 및 사용에 큰 영향을 미치는 세동은 고온, 저 pH, 교반 혹은 뇨, 구아니딘, 에탄올 공용매 혹은 소수성면 등의 존재에 따라 진행된다. 현재의 미국 의약법상 1% 이상의 농도에서 세동이 일어날 경우 인슐린을 폐기할 것을 요구하고 있다. 세동은 고온에서 진행되기 때문에 당뇨 질환자는 인슐린 사용전 이를 냉장 상태로 최적 보관해야 한다. 인슐린이나 인슐린 유사체의 세동은, 소량의 인슐린 혹은 인슐린 유사체를 환자의 체내에 일정 간격으로 주입하는, 외부 인슐린 펌프를 이용하는 당뇨 환자에 있어 특별한 관심의 대상이 될 수 있다. 이러한 용도의 경우, 펌프 장치 내의 인슐린 혹은 인슐린 유사체는 냉장 상태가 아니며 인슐린 세동이 체내에 인슐린 혹은 인슐린 유사체를 주입하는데 이용되는 카테터를 차단할 수 있으며, 따라서 예상할 수 없는 혈당치 변동 혹은 위험한 고혈당을 야기할 가능성이 있다. 최근의 보고서에 따르면, 리스프로 인슐린 (B28 및 B29 잔기가 야생형 인간 인슐린내 이들 위치에 대하여 상호교환되는 유사체; 상표 Humalog®)은 특히 세동되기 쉬우며 이에 따라 인슐린 펌프 카테터를 차단할 수 있다는 사실이 지적되었다.

인슐린 세동은 이식형 인슐린 펌프에도 중요한 고려사항이며 이는, 상기 펌프의 경우 인슐린이 고농도 및, 외부 (인슐린) 펌프가 이용되는 실온이 아닌, 생리학적 온도 (예, 37℃)에서 1 내지 3개월간 임플란트에 함유되기 때문이다. 또한, 정상 이동에 의한 교란도 인슐린 세동을 가속화하는 경향이 있다. 인슐린 세동을 위한 전위 증가에도 불구하고, 이식형 인슐린 펌프는 잠재적 이점 때문에 지속적인 연구의 대상이 되고 있다. 이러한 장점은 인슐린을 문맥 순환계로 복강내 전달하는 것을 포함하며, 이는 피하주사보다 더욱 밀접한 정규의 생리학적 인슐린 전달을 모방한 것으로 인슐린을 전신 순환계를 통해 환자에게 공급하는 시스템이다. 복강내 전달은 피하주사와 비교시 더욱 신속하고 일관적인 인슐린 흡수를 가능하게 하고, 이에 따라, 한 곳의 주사부위에서 다른 곳으로 흡수 및 분해를 가변화 할 수 있다. 이식형 펌프를 통한 인슐린 투여는 또한 환자의 편의를 증대시킬 수 있다. 계면활성제를 저장기에 첨가하는 등의 세동 방지를 위한 노력에도 불구하고, 일부 개선은 있으나 당뇨 환자에게 이식된 인슐린 펌프의 사용에 있어 신뢰성은 충분치 않아 엄격한 임상실험 관리를 면할 수 없었다.

상술한 바와 같이, 개발도상국에서는 약품과 백신의 안전한 보관, 전달 및 사용이라는 도전에 직면한다. 이러한 도전은 전기 및 냉장 시설을 지속적으로 이용할 수 없는 아프리카나 아시아내 지역에서 온도에 민감한 인슐린 제형을 사용하는 난제를 안고 있으며 이러한 문제는 개발도상국에서의 당뇨 질환이 확대되는 추세와 함께 더욱더 심화되고 있다. 인슐린은 25℃ 이상의 온도에서 10℃ 증가시마다 분해율이 10배 이상 증가하며 지침에 따르면 30℃ 미만의 온도에서 보관해야 하고 바람직하게는 냉장 보관이 필요하다. 온도가 증가하면 인슐린은 화학적 분해 (이소아스파탐산 형성, 이황화물 브릿지 재배열, 공유결합 고분자 형성 등과 같은 공유결합 구조의 변화) 뿐만 아니라 물리적 붕괴 (비-자연적 응집과 세동)도 일어난다.

아미노산 치환물은 인슐린 내에서 단백질을 안정화하지만, 발암기전의 위험을 야기하는 방식으로 인슐린 수용체(IR)에 대한 단백질 결합 및 인슐린-유사 성장인자(IGFR)의 동종 수용체에 대한 가교결합을 증대하는 것으로 알려졌다. 공지 기술의 한 예를 들면, His^B10를 아스파탐산으로 치환할 수 있다. Asp^B10-인슐린은 안정성과 약동학적 성질에 관련하여 바람직한 약제학적 성질을 나타내며, 수용체 결합성 증대는 스프라그-다울리 래트 실험에서 종양유발과 관련이 있었다. Asp^B10-인슐린 혹은 관련 유사체에 도입하여 IR 및 IGFR에 대한 결합을 인간 인슐린에 대한 결합과 유사한 수준까지 감소시킬 수 있는 A 혹은 B 사슬내에 다수의 잠재성 있는 치환물이 존재하나, 이러한 치환물은 일반적으로 인슐린 (혹은 인슐린 유사체)의 안정성을 손상하며 화학적 및 물리적 분해에 대한 용이성이 증대한다. 따라서, 수용체-결합 친화성을 "조절" 하는 동시에 안정성 및 세동에 대한 저항성을 개선할 수 있는 새로운 인슐린 및 인슐린 유사체의 개질 방법을 발견하는 것이 요망된다 하겠다. 이에 관련한 출원은 IR 및 IGFR에 대한 결합의 감소 정도를 다변화하여, 수용체 결합력이 초활성화된 유사체의 종양유발능력을 감퇴시키는 일련의 안정 수식화(stabilizing modification) 기술을 필요로 한다.

따라서, 할로겐 원자를 비천연 작용기로서 할로겐 원자를 함유하는 비천연 아미노산을 삽입하고 동시에 유사체의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지함에 따라 안정화된 인슐린 유사체가 요구된다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 아미노산 내 할로겐 치환에 따라 안정성을 증대하고, 이 경우 유사체는 이에 상응하는 비할로겐화된 인슐린 혹은 인슐린 유사체의 생물학적 활성을 부분적으로 유지할 수 있는 것인, 인슐린 유사체를 제공하는 것이다.

일반적으로, 본 발명은 할로겐화(halogenated) 페닐알라닌을 B24, B25 혹은 B26 위치에 삽입한 B-사슬 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체를 제공한다. 한 실시형태에 따르면, 할로겐화 페닐알라닌은 B24 위치에 있다. 또다른 실시형태에서, 할로겐화 페닐알라닌은 오르토-모노플루오로-페닐알라닌, 오르토-모노브로모-페닐알라닌 혹은 오르토-모노클로로-페닐알라닌 등이다. 또다른 실시형태에서, 인슐린 유사체는 포유류 인슐린 유사체, 예를 들어 인간 인슐린 유사체이다. 한 구체적인 일련의 실시형태에서, B-사슬 폴리펩티드는 서열번호 No. 4 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 및 3개 이하의 추가적인 아미노산 치환물을 가진 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 할로겐화 페닐알라닌이 B24, B25 또는 B26 위치에 삽입된 B-사슬 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체를 암호화하는 핵산도 제공한다. 한 예로서, 할로겐화 페닐알라닌은 정지 코돈, 예컨대, 핵산 서열 TAG에 의해 암호화된다. 발현벡터는 이러한 핵산을 포함할 수 있으며 숙주 세포는 이러한 발현벡터를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 환자를 치료하는 방법도 제공한다. 치료방법은 생리학적 유효량의 인슐린 수용체나 이의 생리학적 수용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 인슐린 유사체나 이의 생리학적 수용가능한 염은 할로겐화 페닐알라닌을 B24, B25 혹은 B26 위치에 삽입하는 B-사슬 폴리펩티드를 함유한다. 한 실시형태에서, 환자에게 투여한 인슐린 유사체 내의 할로겐화 페닐알라닌은 B24 위치에 있다. 또다른 실시형태에서, 할로겐화 페닐알라닌은 오르토-모노플루오로-페닐알라닌, 오르토-모노브로모-페닐알라닌 혹은 오르토-모노클로로-페닐알라닌이다. 또다른 실시형태에서, 인슐린 유사체는 포유동물 인슐린 유사체, 예컨대, 인간 인슐린의 유사체이다. 구체적인 일련의 실시형태에서, B-사슬 폴리펩티드는 서열번호 No. 4 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 및 3개 이하의 추가적인 아미노산 치환물이 함유된 폴리펩티드를 포함한다.

도 1A는 A- 및 B-사슬과 양끝 이염기 분할 부위 (검은 원) 및 C-펩티드 (하얀 원)를 수반한 연결 영역을 포함하는 인간 인슐린 서열을 개략적으로 도시하고;
도 1B는 인슐린-유사 성분 및 이상이 생긴 연결 펩티드 (점선)로 이루어진 프로인슐린의 구조 모델을 도시하고;
도 1C는 B-사슬내 B24 잔기의 위치를 표시하는 인간 인슐린 서열을 개략적으로 도시하며;
도 1D는 3개의 이황화물 브릿지에 관련하여 Phe^B24의 방향족 잔기를 나타내는 인슐린 모노머의 리본 모델을 도시하고, 여기서 Leu^B15(화살표) 및 Phe^B24의 인접 측쇄를 볼 수 있으며, 그외의 경우, A- 및 B-사슬은 연하거나 진한 회색으로 각각 표시되며 시스테인의 황 원자는 원으로 표시하고;
도 1E는 소수성 코어 모서리측 포켓에 들어있는 Phe^B24 측쇄를 보여주는 인슐린의 공간 충전 모델를 나타내고;
도 2A는 펜타플루오로-페닐알라닌 (F₅-Phe)을 나타내고;
도 2B는 오르토-모노플루오로-페닐알라닌 (2F-Phe)를 나타내며,
도 2C는 메타-모노플루오로-페닐알라닌 (3F-Phe)를 나타내고,
도 2D는 파라-모노플루오로-페닐알라닌 (3F-Phe)를 나타내고,
도 3은 원자외선(UV) 파장에 대한 4개의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼군을 도시하며, 구체적으로는, A 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (□); B 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 3F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▲); C 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 4F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▼); D 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 F₅-Phe^B24-DKP-인슐린 (●) 을 각각 도시하고;
도 4는 CD-검출된 가이드라인 변성 연구에 대한 4개의 그래프군을 도시하며, 구체적으로, A 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (□); B 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 3F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▲); C 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 4F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▼); D 패널: DKP-인슐린 (실선) 및 F₅-Phe^B24-DKP-인슐린 (●) 을 각각 도시하며;
도 5는 인슐린 유사체의 수용체-결합 연구의 결과를 나타내는 그래프로서, 수용체-결합된 ¹²⁵I-라벨 인간 인슐린이 DKP-인슐린(■) 또는 그의 다음과 같은 유사체, 즉: 펜타플루오로-Phe^B24 (▲), 2F-Phe^B24 (▼), 3F-Phe^B24 (◆) 및 4F-Phe^B24 (●) 각각의 농도 증가에 의해 변위되는 경쟁적 결합 분석법에 따라 측정된 상대 활성도를 도시하며;
도 6은 인슐린 유사체의 수용체-결합 연구의 결과를 나타내는 그래프로서, 수용체-결합된 ¹²⁵I-라벨 인간 인슐린이 KP-인슐린(■) 또는 그의 다음과 같은 유사체, 즉: 2Br-Phe^B24-KP-인슐린 (▲), 2Cl-Phe^B24-KP-인슐린 (▼), 3F-Phe^B24-KP-인슐린 (◆) 및 4F-Phe^B24-KP-인슐린 (●) 각각의 농도 증가에 의해 변위되는 경쟁적 결합 분석법에 따라 측정된 상대 활성도를 도시하며;
도 7A는 인간 인슐린 (실선), KP-인슐린 (점선; "모체"), 2F-Phe^B24-KP-인슐린 (▲), 3F-Phe^B24-KP-인슐린 (■), 및 4F-Phe^B24-KP-인슐린 (○)의 모노플루오로 치환물이 함유된 KP-인슐린 유사체들의 CD-검출 가이드라인 변성 연구의 결과를 나타내는 그래프를 도시하고;
도 7B는 인간 인슐린 (실선), KP-인슐린 (점선; "모체"), 2-Cl-Phe^B24-KP-인슐린 (▼) 및 2-Br-Phe^B24-KP-인슐린 (△)의 CD-검출 가이드라인 변성 연구의 결과를 나타내는 그래프를 도시하고;
도 8A는 700 MHz, 32℃ 및 pD 7.0에서 기록한 DKP-인슐린 유사체에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을, DKP-인슐린에 대한 Phe^B24의 제 2, 3 및 4 위치의 플루오로-치환물과 비교 도시하고; 및
도 8B는 700 MHz, 32℃ 및 pD 7.0에서 기록한 KP-인슐린 유사체에 대한 NMR 스펙트럼을, KP-인슐린에 대한 Phe^B24의 제 2 위치의 플루오로-, 브로모- 및 클로로-치환물과 비교 도시한다.

본 발명은 아미노산 내의 할로겐 치환을 이용하여 안정성을 증가시키는 인슐린 유사체에 관한 것으로서, 이에 따라 상기 유사체는 상응하는 비-할로겐화 인슐린이나 인슐린 유사체의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지할 수 있다. 특히, 본 발명은 아미노산 내에서 단일 할로겐을 치환함으로써 안정성을 증가시키며, 이에 따라 상응하는 비-할로겐화 인슐린이나 인슐린 유사체의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지할 수 있는, 인슐린 유사체를 제공한다.

한 실시예에서, 본 발명은 아미노산 내에서 불소, 염소 혹은 브롬 치환에 따라 안정성을 증가시키며, 이에 따라 상응하는 비-할로겐화 인슐린이나 인슐린 유사체의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 유지할 수 있는 인슐린 유사체를 제공한다. 적용가능한 방법 중 하나는, 인슐린 유사체의 화학적 및 물리적 안정성을 증대하는 동시에 생물학적 활성을 일부 유지하는 것이다; 또다른 응용 방법은 인슐린 유사체의 수용체-결합성이 인간 인슐린의 경우보다 초과하지 않도록 보상처리하는 것이다. 이러한 결과, 본 발명은 할로겐화 페닐알라닌(Phe) 잔기가 위치 B24, B25 혹은 B26에서 치환물이 되는 인슐린 유사체를 제공한다. 한편, B24 및 B25 위치에 있는 할로겐화 페닐알라닌의 치환물은 밑줄 표시된 인슐린 혹은 인슐린 유사체의 아미노산 서열을 변화시키지 않으며, 반면 인슐린의 B26 위치의 할로겐화 페닐알라닌은 인슐린의 야생형 서열에서 발견된 티로신 (Tyr)을 치환해야 한다.

그러나 본 발명은 상기의 인간 인슐린이나 그의 유사체에 한정되지 않는다. 이들 치환물은 또한 비제한적인 예로서 돼지, 소, 말 및 개 인슐린 등의 동물 인슐린 내에서도 생성될 수 있다. 또한, 인간 및 동물 인슐린 간의 유사성 측면 및 동물 인슐린을 당뇨 환자에게 사용해온 용도 측면에서, 인슐린 서열 내에 다른 부수적 변형을 도입하는 것도 생각할 수 있다. 특히 이러한 치환물은 "보존형"으로 간주한다. 예를 들면, 부가적인 아미노산 치환물은 본 발명에서 벗어나지 않는 한도에서 유사한 곁사슬을 가진 아미노산군 중에서 형성될 수 있다. 이들은 중립 소수성 아미노산, 예컨대, 알라닌(Ala 혹은 A), 발린(Val 혹은 V), 류이신(Leu 혹은 L), 이소류이신(Ile 혹은 I), 프롤린(Pro 혹은 P), 트립토판(Trp 혹은 W), 페닐알라닌(Phe 혹은 F) 및 메티오닌(Met 혹은 M)을 포함한다. 마찬가지로, 중립 극성 아미노산은 글리신(Gly 혹은 G), 세린(Ser 혹은 S), 트레오닌(Thr 혹은 T), 티로신(Tyr 혹은 Y), 시스테인(Cys 혹은 C), 글루타민(Glu 혹은 Q) 및 아스파라긴(Asn 혹은 N)의 그룹 내에서 서로 치환될 수 있다. 염기성 아미노산은 리신(Lys 혹은 K), 아르기닌(Arg 혹은 R) 및 히스티딘(His 혹은 H)을 포함하는 것으로 생각된다. 산성 아미노산은 아스파탐산(Asp 혹은 D) 및 글루탐산(Glu 혹은 E)이다. 별도의 언급이나 명시가 없을 경우, 여기서의 아미노산은 L-아미노산을 의미한다. 한 예로서, 본 발명의 인슐린 유사체는 본 발명의 할로겐화-Phe 치환물 이외에 3개 이하의 보존성 치환물을 함유한다. 또다른 예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 본 발명의 할로겐화-Phe 치환물 이외에 하나 이하의 보존성 치환물을 함유한다.

본원의 상세한 설명 및 특허청구범위에서와 같이, 인슐린이나 인슐린 유도체내 각종 아미노산은 해당 아미노산 잔기로 표시하며 선택적으로 아미노산 위치를 D윗첨자로 표시한다. 해당 아미노산의 위치는 치환물이 위치하는 인슐린의 A 또는 B 사슬을 포함한다. 따라서, Phe^B24 는 인슐린의 B 사슬의 24번 아미노산에 위치하는 페닐알라닌이며, Phe^B25 는 인슐린의 B 사슬의 25번 아미노산에 위치하는 페닐알라닌을 의미한다. 마찬가지로, Phe^B26 은 인슐린의 B 사슬의 26번 아미노산에 위치하는 티로신의 페닐알라닌 치환물이 된다. 불화 아미노산은 접두사 "F-", 브롬화 아미노산은 접두사 "Br-", 또한 염소화 아미노산은 "Cl-"로 각각 표시한다. 따라서 불화 페닐알라닌은 "F-Phe", 염소화 페닐알라닌은 "Cl-Phe" 및 브롬화 페닐알라닌은 "Br-Phe"로 각각 약칭될 수 있다. 페닐알라닌의 경우, 할로겐 치환물이나 또는 페닐측 사슬 상의 치환물의 위치를, 할로겐이 부착되는 탄소의 번호로 표시할 수 있다.

따라서, 오르토-모노플루오로-페닐알라닌 (도 2B 참조)은 "2F-Phe", 메타-모노플루오로-페닐알라닌 (도 2C 참조)은 "3F-Phe" 및 파라-모노플루오로-페닐알라닌 (도 2D 참조)은 "4F-Phe"로 각각 약칭한다. 펜타플루오로-페닐알라닌 (도 2A 참조)는 "F₅-Phe"로 약칭한다. 이와 유사하게, 오르토-모노브로모-페닐알라닌은 약칭하여 "2Br-Phe"라고 하고 오르토-모노클로로-페닐알라닌은 "2Cl-Phe"라고 약칭할 수 있다.

B24 위치의 페닐알라닌은 기능성 인슐린에 존재하는 무변이(invariant) 아미노산이며 방향족 측쇄를 함유한다. 인슐린에 함유된 Phe^B24의 생물학적 중요성은 인간 당뇨를 유발하는 임상적 돌연변이 (Ser^B24)로 확인한다. 도 1D 및 1E에 도시한 바와 같이 또한 특별히 이론에 근거하지 않아도, Phe^B24는 통상의 수용체 결합면에 있는 소수성 코어의 모서리에 집합을 형성하는 것으로 판단된다. 이러한 모델은 결정학적 촉진제 (2-Zn 분자 1; 단백질 데이타정보 식별자 4INS)에 근거한다. B-사슬의 C-말단 β-가닥 (잔기 B24-B28) 내에 형성되면, Phe^B24는 중앙α-나선 (잔기 B9-B19)를 서로 연결한다. 방향족 고리의 한 면 및 모서리부는 leu^B15 및 Cys^B19 에 의해 정의된 쉘로우형 포켓에 존재하며; 다른 면 및 모서리부는 용매에 노출된다 (도 1e 참조). 이 포켓은 일부가 주사슬 카르보닐 및 아미노기에 의해 둘러싸여 있고 또한 착염 및 비대칭 정전기 환경을 조성할 수 있다. 인슐린 안정성에 대하여, 거의 대칭 형태인 치환 테트라플루오로-페닐알라닌 (F₅-Phe^B24) (통상의 소수성 및 플루오로아릴-아릴 상호작용 개선 등)(도 2A) 및 단일 오르토-, 메타- 또는 파라-플루오로 치환물 (2F-Phe, 3F-Phe 또는 4F-Phe, 각각 도 2B 내지 2D 참조)를 함유하는 "비평형" 유사체가 각각 영향을 미친다.

Phe^B25 는 인슐린 모노머의 표면에 존재하며, 용액 상태로, Phe^B24 보다 조직성이 떨어지는 용매 속에 주입한다. 이것의 생물학적 중요성은 상술한 바와 같이 인간 당뇨를 유발하는 임상 돌연변이 (Leu^B25) 실험을 통해 확인한다. Phe^B24와 유사하게 Tyr^B26는 소수성 코어의 모서리부에 위치하며 이곳에서 비극성 잔기 Ile^A2, Val^A3 및 Val^B12 부근에 집합한다. 광가교화 연구는 잔기 B24, B25 및 B26의 측쇄는 각각 인슐린 수용체와 접촉하는 것을 시사하였다. 인슐린 잔기의 다이머와 헥사머에서, 잔기 B24 내지 B26 및 대칭 관계에 있는 잔기 B24'-B26'는 분자내 항평형 β-시트에 관여하는 것으로 생각된다. 이들 위치에 있는 방향족 측쇄는 상기 β-시트 계면에서 모노머간 집합을 안정화하는 것으로 생각된다.

본 발명의 치환물은 다수의 기존 인슐린 유사체 중 어느 것에서도 형성할 수 있다. 예를 들면, 여기서 언급하는 할로겐화 페닐알라닌 (X-Phe) 치환물은 리스프로 인슐린, 인슐린 아스파트, 기타의 변형 인슐린이나 인슐린 유사체 등, 인슐린 유사체에서 형성될 수 있으며 또는 인간 인슐린 외에 각종 약제학적 제형, 예컨대, 레귤러 인슐린, NPH 인슐린, 렌테 인슐린 혹은 울트라렌테 인슐린 등의 인슐린 유도체에서 형성될 수 있다. 아스파트 인슐린은 Asp^B28 치환물을 함유하며 Novalog® 라는 상품명으로 시판되고 있으며, 리스프로 인슐린은 Lys^B28 및 Pro^B29 치환물을 함유하고 Humalog® 라는 상품명으로 시판되고 있다. 이들 유사체는 미국특허 제 5,149,777호 및 제 5,474,978호에 개시되어 있으며 이들의 내용을 본원에 참고로서 수록한다. 상기 유사체는 모두 속효성 인슐린으로 알려져 있다.

B24, B25 및/또는 B26 위치에 있는 할로겐화-Phe 치환물은 또한 인간 인슐린의 유사체 속에 도입될 수 있는데, 이는 임상실험에 아직 이용된 선례가 없으나, 하기에 상세히 기술할 DKP 인슐린, 또는 마니프로인슐린, 인슐린의 A 사슬과 B 사슬 부분 사이에 디펩티드(Ala-Lys) 링커를 함유하는 프로인슐린 유사체 등과 같이, B 사슬의 C-말단 잔기와 A 사슬의 N-말단 잔기 사이에 있는 통상의 35 아미노산 연결 영역을 대신함에 있어 실험적으로 유용하다. DKP-인슐린 (또는, Asp를 함유하거나 인간 인슐린보다 높은 수용체 결합 친화성을 나타내는 기타의 인슐린 유사체)의 B24, B25 혹은 B26 위치에 있는 할로겐화 방향족 잔기는 이러한 수용체-결합 친화성을 인간 인슐린과 유사한 수준 혹은 그보다 낮은 수준으로 감소시킬 수 있으며, 따라서 임상적 용도로 사용할 수 있다. 상기 방식에 따르면, 미토겐 IGFR에 대한 인슐린 유사체의 가교 결합 역시 감소할 수 있다.

인간 프로인슐린의 아미노산 서열은 비교의 목적으로 제공되며 서열번호(SEQ. ID.) No.1이다.

SEQ. ID. No. 1 (프로인슐린)

[서열번호 1]

인간 인슐린의 A 사슬의 아미노산 서열은 SEQ. ID. No. 2로 제공된다.

SEQ. ID. No. 2 (A 사슬)

[서열번호 2]

인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 서열은 SEQ. ID. No. 3으로 제공된다.

SEQ. ID. No. 3 (B 사슬)

[서열번호 3]

인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 서열은 B24, B25 또는 B26 위치에서 할로겐화-Phe의 치환에 따라 변형될 수 있다. 이러한 서열의 예를 들면 SEQ. ID. No. 4와 같으며 여기서 Xaa는 Tyr 또는 Phe일 수 있다. 이들 치환물에 사용되는 할로겐은 불소, 염소 혹은 브롬 등일 수 있다.

SEQ. ID. No. 4

[서열번호 4]

(여기서 Xaa 는 Tyr 또는 Phe 이다).

다른 치환물의 조합도 본 발명의 범주에 속한다. 본 발명의 치환물을 또한 공지의 인슐린 유사체의 치환물과 조합하는 것도 생각할 수 있다. 예를 들어, 할로겐화 Phe 치환물이 도입될 수 있는 리스프로 인슐린 (Humalog®)의 Lys^B28 Pro^B29 치환물을 함유하는 인간 인슐린의 B 사슬의 유사체는 SEQ. ID. No. 5의 아미노산 서열을 갖는다. 마찬가지로, F-Phe^B24 치환물이 도입될 수 있는 아스파트 인슐린의 Asp^B29 치환물을 함유하는 인간 인슐린의 B 사슬의 유사체는 SEQ. ID. No. 6의 아미노산 서열을 갖는다.

SEQ. ID. No. 5

[서열번호 5]

(여기서 Xaa 는 Tyr 또는 Phe 이다).

SEQ. ID. No. 6

[서열번호 6]

(여기서 Xaa 는 Tyr 또는 Phe 이다).

F-Phe 치환물은 또한 다른 인슐린 유사체 치환물, 예컨대, 현재 계류중인 국제출원 PCT/US07/00320 및 미국출원 12/160,187에 상세히 기술된 바와 같이 잔기 A4, A8 및/또는 B1에 His 치환물이 존재하는 인간 인슐린의 유사체 등과 조합하여 도입할 수도 있다. 상술한 문헌의 내용을 본원에 참조로서 수록한다. 예를 들어, F-Phe^B24 치환물은 인슐린 유사체 혹은 SEQ. ID. No. 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 프로인슐린 유사체 내에 [His^A4, His^A8] 및/또는 His^B1 치환물과 더불어 존재할 수도 있다.

SEQ . ID . No . 7

[서열번호 7]

여기서 R1은 His 또는 Phe이고, R2는 Tyr 또는 Phe, R3은 Pro, Lys 또는 Asp이며, R4는 Lys 또는 Pro 이고, R5는 His 또는 Glu이며, R6은 His 또는 Thr이고, 또한 Xaa 는 임의의 아미노산의 0 내지 35이거나 아미노산 사슬의 파단부이고; 또한,

하기의 아미노산 치환물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 치환물이 존재하며;

R1은 His 이고;

R6은 HiS 이고; 또한

R5 및 R6은 함께 His 이다.

또한 현재 계류중인 미국 특허 가출원 60/828,153에 개시된 바와 같이 B24, B25 혹은 B26 위치에 있는 할로겐화-Phe 치환물도 또한 단사슬 인슐린 유사체에 도입할 수 있다. 상기 문헌의 내용을 본원에 참고로서 수록한다.

불소 치환물은 고활성도로 분류된 DKP-인슐린의 가공된 인슐린 모노머 내에 도입되었으며, 상기 인슐린은 치환물 Asp^B10 (D), Lys^B28 (K) 및 Pro^B29 (P)를 함유한다. 상기 3종의 치환물은 B-사슬 표면상에 있으며 다이머 및 헥사머 형성에 관여하는 것으로 생각된다. 가공된 모노머를 사용하면 안정도 분석에서 자체조립체와 혼동할 우려가 있다. DKP-인슐린의 구조는 결정형 프로토머와 매우 유사하다. DKP 인슐린을 위한 B-사슬 폴리펩티드의 서열은 SEQ. ID. No. 8로서 제공되며 여기서 Xaa 는 Tyr 또는 Phe 이다.

SEQ . ID . No . 8 ( DKP B-사슬 서열)

[서열번호 8]

DKP-인슐린의 유사체는 트립신-촉매화 반합성에 따라 제조하고 고속 액체 크로마토그래피로 정제했다 (Mirmira, R.G., 및 Tager, H.S., 1989. J. Biol. Chem. 264:6349-6354). 이 프로토콜은 (i) 합성 옥타펩티드 발현 잔기 (N)-GF*FYTKPT (변형 잔기(F*) 및 "KP" 치환물 (밑줄친 부분); SEQ. ID. No.9) 및 (ii) 절두형 유사체 des-옥타펩티드[B23-B30]-Asp^B10-인슐린 (SEQ. ID. No. 16)를 이용한다. 옥타펩티드는 Pro^B28 및 Lys^B29 (이탤릭체)의 상호교환으로 인해 야생형 B23-B30 서열 (GFFYTPKT: SEQ. ID. No. 10)과는 상이하므로, 트립신 처리중 리신 ε-아미노기를 보호할 필요가 없다. 간단히 말하면, des-옥타펩티드 (15mg) 및 옥타펩티드 (15mg)을 디메틸아세트아미드/1,4-부탄디올/10mM 아세트산칼슘 및 1mM 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA)(35:35:30, v/v, 0.4mL)을 함유하는 0.2M 트리스 아세테이트 (pH 8)의 혼합물에 용해했다. 10μL의 N-메틸모르폴린을 이용하여 최종 pH를 7.0 으로 조정했다. 용액을 12℃로 냉각하고 1.5mg의 TPCK-트립신을 첨가하여 12℃에서 2일간 배양했다. 24시간 후 1.5mg의 트립신을 추가로 첨가했다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 가하여 반응을 산성화하고 이를 조제형 역상 HPLC (C4)를 통해 정제했다. 매트릭스 보조형 레이저 흡착/이온화 타임-오브-플라이트 (MALDI-TOF; 어플라이드 바이오시스템, 포스터 시티, CA)를 이용한 질량 분광 측정법으로 각 경우에서의 값을 예측했다 (도시하지 않음). 고상 합성의 일반적인 방식은 공지된 바와 같다 (Merrifield et al., 1982, Biochemistry 21: 5020-5031). 9-플루오렌-9-일-메톡시-카르보닐 (F-moc)-보호형 페닐알라닌 유사체를 Chem-Impex 인터내셔날사 (Wood Dale, IL)로부터 구입했다.

원편광 이색성(CD) 스펙트럼은 4℃ 및 25℃에서 아비브 스펙트럼 편광측정기 (Weiss et al., Biochemistry 39: 15429-15440)을 이용하여 수득했다. 시료는 50mM 인산칼륨 (pH 7.4)에 용해한 약 25μM DKP-인슐린 혹은 그 유사체를 함유했다; 시료는 25℃에서 실시할 구아니딘-유래 변성 연구를 위해 5μM으로 희석했다. 접히지 않은 상태 (언폴딩 상태)의 자유 에너지를 구하기 위해, Sosnick et al. (Methods Enzymol. 317:393-409)에 개시된 2-상태 모델에 대한 비선형 최소제곱법으로 변성 전이를 도식화하였다. 요약하면, CD 데이타 θ(χ) (여기서 x 는 변성체의 농도를 나타낸다)를 다음 수학식 1에 따른 비선형 최소-제곱법 프로그램을 통해 작성하였다:

[수학식 1]

여기서, x는 가이드라인의 농도이며 θ_A과 θ_B는 자연 및 언폴딩 상태에서의 기저값이다. 기저값은 전이 전 및 후의 수준, 다음 수학식 2 및 수학식 3

[수학식 2]

및

[수학식 3]

에 의해 근사치로서 구했다. 변형 전이를 도식화하여 얻은 m 값은 야생형 언폴딩 곡선을 도식화하여 얻은 m 값보다 낮다. 이러한 차이점 및 뚜렷한 자유에너지 변화 (ΔG_u) 가 완전 언폴딩 상태일 때의 CD 신호를 측정하는 능력이 결핍된 결과인지를 검사하기 위해, 자극을 실행했으며 이는 데이타를 외삽처리하여 고농도 구아니딘에서 CD 값을 안정화한 것으로서; 근본적으로 동일한 계산치의 ΔG_u 및 m을 얻었다.

상대 활성도는, 50%의 특이결합된 ¹²⁵I-인간 인슐린이 변위하는데 필요한 야생형 인간 인슐린에 대한 유사체의 비로 정의한다. 인슐린 수용체(IR)을 함유하는 인간 태반 조제물 (IR)을 공지의 방식대로 이용했다. 막의 단편(0.025mg 단백질/관)을, 무라벨 유사체의 소정 농도 하에, 0.05M 트리스-HCl 및 pH8의 0.25% (w/v) 소혈청 알부민을 함유한 최종 부피 0.25ml의 용액 속에서 ¹²⁵I-라벨 인슐린 (DIR 30,000 cpm)을 이용하여 4℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후의 혼합물을 1ml의 얼음 냉각 완충액에 희석하고 이를 4℃에서 5분간 원심분리했다 (10,000g). 상청액은 흡출제거하고, 남아있는 막 펠릿의 개수를 방사선으로 카운트했다. 비특이적 결합에 대해 데이타를 보정하였다 (1μM 인간 인슐린의 존재하에 관련된 막을 잔류시키는 방사선량). 모든 분석 작업에서, 경쟁 리간드의 결핍하에 결합된 트레이서의 백분율은 15% 미만으로 하여 리간드-분리 가공물이 발생되지 않게 했다. 37℃에서 인슐린 유사체를 배양하는 동안의 활성 변화를 관측하기 위해 추가적인 인슐린 수용체-결합 분석은 종래기술에서와 같이 마이크로적정 플레이트 항체 포집물을 이용하여 수행했다. 마이크로적정 스트립판 (Nunc Maxisorb)을 AU5 IgG (100㎕/웰, 인산염 완충염수에 용해된 40mg/ml의 용액)을 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 결합력 데이타를 2-지점 연속 모델로 분석했다. IGF I형 수용체를 이용하는 해당하는 마이크로적정 플레이트 항체 분석법에 따라 이 동종 수용체에 대한 가교-결합력을 분석했다.

단일 불화 유사체의 원자외선 원편광 이색성(CD) 스펙트럼은 모계 유사체 (도 3)과 실질적으로 동일하며; 약간의 왜곡이 F-Phe 유사체의 스펙트럼에서 관찰된다 (도 3, 패널 D). 유사체의 안정성과 수용체-결합 활성을 표 1에 나타낸다. 변형 B24 잔기를 DKP-인슐린 조건에 도입하였다. 표기된 활성치는 인간 인슐린에 대한 호르몬-수용체 해리상수의 비에 근거한다; 인간 인슐린의 활성은 따라서 1.0으로 규정한다. 활성치의 표준오차는 일반적으로 25% 미만이었다. 25℃에서 언폴딩의 자유 에너지 (ΔG_u)는 변성제의 농도 제로(0)에 대해 외삽처리된 2-상태 모델을 근거로 산출하였다. 래그 타임 (지연시간)은 아연 무함유 인산 완충염수 (pH 7.4) 내에서 37℃에서 느린 교반시 단백질 세동의 초기화에 걸리는 시간(일)을 가리킨다.

[표 1]

인슐린 유사체의 활성 및 안정성

F₅-Phe에 의한 Phe^B24의 치환시 DKP-인슐린의 안정도가 25℃에서 0.8±0.1 kcal/mol 증가한다 (도 4, 패널 D). 안정도에 미치는 이러한 바람직한 효과에도 불구하고, 상기 유사체의 활성은 미미하다 (모계 유사체에 대한 수용체-결합 친화도는 1% 미만이다; 표 1 및 도 5 참조). 이러한 결점은 표준 단일 아미노산 치환에서 일반적으로 관찰되는 수준보다 훨씬 뚜렷하다. 대조적으로, 단일 치환된 유사체는 각각 큰 활성을 유지한다: 오르토 (인간 인슐린 대비 37%), 메타 (100%), 및 파라 (43%). 이러한 활성은 최저 10% (호르몬-수용체 해리상수가 1 nM 미만인 것에 상응하는) 이상에서 치료 효능이 예상된다. 또한, 3F-Phe^B24 및 4F-Phe^B24 인슐린 유사체는 모계 유사체 (도 4 및 표 1) 보다 더 안정하지는 않은 반면 (또한 안정성이 약간 떨어질 수도 있다), 2F-Phe^B24-DKP-인슐린은 적어도 F₅-Phe 유사체 수준의 안정성을 나타낸다 (ΔΔG_u 0.9±0.1 kcal/mole). 유사체의 물리적 안정성은 37℃에서 pH7.4의 60μM의 인산염 완충염수(PBS)에 넣어 느린 교반과 함께 배양하였을 때 유사체의 물리적 안정도는 3배로 증가하였다. 시료는 20일간 혹은 유리병내 침전이나 동결 징후가 관측될 때까지 관찰하였다. F₅-, 2F- 및 3F-Phe^B24-DKP 인슐린 유사체는(단 4F-Phe^B24-DKP 인슐린은 제외) 단백질 세동 개시전 래그 타임의 증가를 나타낸다 (표 1). 따라서 단일 불소 원자의 치환은 모노머형 인슐린 유사체의 안정성을 증대시킬 수 있으며 동시에 다소 저하되었으나 임상적으로 무시할 수 없는 활성을 유지하였다; 변형체는 pH 7.4 및 37℃에서 느린 교반시 단백질 세동 전 래그 타임을 연장할 수 있다.

F₅-Phe^B24 치환물은 고 안정성인 반면 실질적으로 생물학적 활성이 없는 인슐린 유사체이다. 부위특이적 변형체인 2F-Phe^B24는 마찬가지로 안정성이며 인슐린 수용체에 대해 실질적으로 높은 친화도 (감소되긴 했으나)를 보유한다.

불소 치환물도 또한 상술한 것과 마찬가지로 도입되었으나, 리스프로 인슐린 (즉, 치환물 Lys^B28, Pro^B29 (Humalog 상품명으로 시판중) 등을 함유하는 인슐린 유사체) 내의 B24, B25 및 B26 위치에 도입되는 오르토-, 메타- 및 파라-불화 페닐렌은 제외한다. B24 위치에 오르토-, 메타-, 파라 및 펜타-불화 페닐알라닌 치환체를 갖는 유사체는 2F-Phe^B24-KP-인슐린, 3F-Phe^B24-KP-인슐린, 4F-Phe^B24-KP-인슐린, F₅-Phe^B24-KP-인슐린으로 각각 분류된다. B25 위치에 오르토-, 메타-, 파라 및 펜타-불화 페닐알라닌 치환체를 갖는 유사체는 2F-Phe^B25-KP-인슐린, 3F-Phe^B25-KP-인슐린, 4F-Phe^B25-KP-인슐린, F₅-Phe^B25-KP-인슐린으로 각각 분류된다. B26 위치에 오르토-, 메타-, 파라 및 펜타-불화 페닐알라닌 치환체를 갖는 유사체 (티로신을 치환하는)는 2F-Phe^B26-KP-인슐린, 3F-Phe^B26-KP-인슐린, 4F-Phe^B26-KP-인슐린, F₅-Phe^B26-KP-인슐린으로 각각 분류된다. 덧붙여서, 오르토-브로모 및 오르토-클로로 페닐알라닌은 B24 위치에서 리스프로 인슐린으로 치환되었다. 이들 유사체는 2Br-Phe^B24-KP-인슐린 및 2Cl-Phe^B24-KP-인슐린으로 각각 분류된다. KP-인슐린 및 DKP-인슐린의 각 유사체에 대한 분류는 편의를 위해 표 및 도면에서 "인슐린"을 생략하고 각각 KP 및 DKP로 약칭한다.

더 구체적으로, B24 위치의 할로겐화 페닐알라닌 치환물에 있어서, (N)-GF*FYTKPT 잔기를 나타내는 합성 옥타펩티드 ("F*" 로 표기되는 할로겐화 페닐알라닌 잔기 및 "KP" 치환물 (밑줄 표시); SEQ ID No. 9) 및 절두형 유사체 des-옥타펩티드 [B23-B30]-인슐린 (B10 위치에 있는 야생형, SEQ. ID No. 17)를 사용했다. B25 위치의 불화 페닐알라닌 치환물에 있어서, (N)-GFF*YTKPT 잔기를 나타내는 합성 옥타펩티드 ("F*" 로 표기되는 할로겐화 페닐알라닌 잔기 및 "KP" 치환물 (밑줄 표시); SEQ ID No. 9) 및 절두형 유사체 des-옥타펩티드 [B23-B30]-인슐린 (B10 위치에 있는 야생형, SEQ. ID No. 17)를 사용했다. 또한, B26 위치의 불화 페닐알라닌 치환물에 있어서, (N)-GFFF*TKPT 잔기를 나타내는 합성 옥타펩티드 ("F*" 로 표기되는 할로겐화 페닐알라닌 잔기 및 "KP" 치환물 (밑줄 표시); SEQ ID No. 18) 및 절두형 유사체 des-옥타펩티드 [B23-B30]-인슐린 (B10 위치에 있는 야생형, SEQ. ID No. 17)를 사용했다. 이와 유사하게, B24 위치의 클로로- 및 브로모-페닐알라닌에 있어서 (2Cl 및 2Br), (N)-GF*FYTKPT 잔기를 나타내는 합성 옥타펩티드 ("F*" 로 표기되는 할로겐화 페닐알라닌 잔기 및 "KP" 치환물 (밑줄 표시); SEQ ID No. 9) 및 절두형 유사체 des-옥타펩티드 [B23-B30]-인슐린 (B10 위치에 있는 야생형, SEQ. ID No. 17)를 사용했다. 통상적으로, des-옥타펩티드 (15mg) 및 옥타펩티드 (15mg)을 디메틸아세트아미드/1,4-부탄디올/10mM 아세트산칼슘 및 1mM 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA)(35:35:30, v/v, 0.4mL)을 함유하는 0.2M 트리스 아세테이트 (pH 8)의 혼합물에 용해했다.

10μL의 N-메틸모르폴린을 이용하여 최종 pH를 7.0 으로 조정했다. 용액을 12℃로 냉각하고 1.5mg의 TPCK-트립신을 첨가하여 12℃에서 2일간 배양했다. 24시간 후 1.5mg의 트립신을 추가로 첨가했다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 가하여 반응을 산성화하고 이를 조제형 역상 HPLC (C4)를 통해 정제했다. 매트릭스 보조형 레이저 흡착/이온화 타임-오브-플라이트 (MALDI-TOF; 어플라이드 바이오시스템, 포스터 시티, CA)를 이용한 질량 분광 측정법으로 각 경우에서의 값을 예측했다 (도시하지 않음). 상대 활성 및 해리상수는 상술한 바와 같이 결정했다.

결과로 나온 데이타를 인슐린의 B24 위치에 있는 불화 페닐알라닌의 치환에 관련하여 표 2에 나타낸다. 비교의 목적으로, 야생형 인슐린 및 2F-Phe^B24-DKP 인슐린을 37℃ 및 동일 조건에서 시험했다. 37℃에서 시험한 결과의 데이타를 하기의 표 3에 나타낸다. B24, B25 및 B26 위치에 있는 불화 페닐알라닌의 치환물, 및 리스프로 인슐린 유사체 배경에 함유된 브로모- 및 클로로-치환 페닐알라닌에 관한 데이타는 하기의 표 4에 수록한다.

[표 2]

Phe^B24-DKP의 안정성 및 활성

[표 3]

인슐린 및 Phe-DKP^B24-인슐린의 안정성 및 활성 [37℃]

[표 4]

리스프로 인슐린의 할로겐화-Phe 유사체의 안정도 및 활성

경쟁적 변위에 의한 리스프로 인슐린의 수용체에 대한 수용체 결합력에 관한 데이타를 도 6에 나타낸다. 분석에 인슐린 수용체의 B-이성체형 및 ¹²⁵I-Tyr-인간 인슐린을 트레이서로 이용했다.

B24 위치에 클로로- 또는 브로모-치환 페닐알라닌을 함유하는 리스프로 인슐린 유도체 (각각 2Cl-Phe^B24-KP-인슐린 및 2Br-Phe^B24-KP-인슐린)를 당뇨 래트의 혈당 저하능력 시험에 이용했으며 비교로써 비할로겐화 리스프로(KP) 인슐린을 이용했다. 수컷 루이스 래트 (무게 최고 250g)는 스트렙토조신에 의해 당뇨가 유발되었다. 리스포 인슐린 유사체, 2Cl-Phe^B24-KP-인슐린 및 2Br-Phe^B24-KP-인슐린을 HPLC로 정제한 후, 건조하여 분말로 만들고 이를 인슐린 희석제에 넣어 용해했다 (Eli Lily Corp.). 래트에 제로 시점 (t=0)에서 100㎕의 희석제에 용해한 20㎍ 또는 6.7㎍의 인슐린 유사체를 피하주사했다. 제로 시점 및 최고 90분까지 매 10분마다 꼬리의 절단부로부터 혈액을 채취했다. 하이퍼가드 어드밴스 마이크로-드로우(Hypoguard Advanced Micro-Draw) 측정기로 혈당을 측정했다. 혈당농도 변화 (시간(h)당 데칼리터(dL)당 밀리그램(mg))을 표 5 및 6에 기록한다 (이들 연구는 상이한 래트군에 대해 시행했으며 따라서 KP-인슐린 주사량을 조절하기 위한 약동학적 기저반응에 있어 차이를 나타낸다; 각 표의 상단행 참조).

[표 5]

리스프로 인슐린의 할로겐화 유사체에 따른 혈당치

[표 6]

할로겐화 인슐린 유사체에 따른 혈당치

표 5 및 6에서 보는 바와 같이, 인슐린 유사체를 함유하는 할로겐-페닐알라닌은, 2F-Phe^B24-KP-인슐린을 제외하고, 리스프로 (Humalog®) 인슐린과 동등하거나 이보다 큰 효능을 나타냈다. 2F-Phe^B24 인슐린 유사체의 효능은, 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 유사체 내에 Asp^B10 치환체를 포함함으로써, KP-인슐린의 수준으로 회복할 수 있다 (표 6의 제2행 참조). 또한, 할로겐화 페닐알라닌이 B24에 위치하면 세동 래그 타임이 3배 내지 4배 수준으로 증가한다; 따라서 상술한 실험 조건하에서 KP-인슐린은 약 3일의 래그 타임을 나타내는 반면, Phe^B24을 2F-Phe^B24, 2Cl-Phe^B24 혹은 2Br-Phe^B24 로 치환하는 경우 래그 타임은 10일 내지 12일 수준으로 연장된다. 이러한 변형체는 또한 열역학적 안정성을 0.5 내지 1 kcal/mol 정도 증대시킨다 (구아니딘 변성에 의해 확인됨) (표 4).

해리상수 (K_d)는, 휘태커 앤 휘태커 (2005, J. Biol. Chem. 280: 20932-20936)에 개시된 바와 같이, I-Tyr-인슐린 (Novo-Nordisk 제공)를 이용한 경쟁적 변위 분석법 및 마이크로적정 플레이트 항체 포집 분석법을 약간 변형시켜 정제 가용화된 인슐린 수용체 (B 이성체형)를 이용함으로써 측정하였고; FLAG 에피토프 (DYKDDDDK; SEQ. ID. No. 11)를 3회 반복하여 트랜스팩트 수용체를 C-말단에 태그하고 마이크로적정 플레이트를 항-FLAG M2 모노클로날 항체(Sigma)로 코팅했다. 경쟁 리간드가 없는 상태에서 결합된 트레이서의 비율은 15% 미만으로서 리간드-소모 가공물을 피할 수 있었다. 결합력 데이타를 헤테로 경쟁 모델을 이용한 비선형 회귀법에 따라 분석하여 (Wang, 1995, FEBS Lett. 360:111-114) 해리상수를 구했다.

[표 7]

IGF 수용체에 대한 인슐린 유사체의 가교결합

IGF 수용체에 대한 선택된 인슐린 유사체의 가교결합의 측정 결과가 표 7에 요약되어 있다. 위 조건 하에 인간 인슐린은 IGF-I 보다 IGFR에 대한 결합력이 260배 약하다. Asp^B10-인슐린의 가교결합은 2배 증가한 반면 임상적 용도로 널리 쓰이는 유사체, Arg^B31, Arg^B32, Gly^A21-인슐린 (인슐린 글라진^TM; 란투스^TM)에 의한 가교결합은 3배가 증가한다. 스프라그-다울리 래트를 Asp^B10-인슐린으로 치료시 유방암 발병율 증가와 관련이 있으므로 이러한 IGFR 가교결합의 증대는 바람직하지 않다. 또한 최근의 임상 연구에서 상기 란투스를 인간에 적용시 약량 의존적으로 각종 암을 유발할 위험성이 증가할 수 있음을 시사하였다 (IGF-I 서열에는 B10 위치에 Glu가 존재하며, 이는 Asp^B10 에 대한 음전하와 유사하다). 이론에 특별히 근거하지 않더라도, 란투스의 가교결합력은 B-사슬의 C 말단에 있는 2개의 염기성 잔기에 의해 증대되는 것으로 생각된다. IGF-I 역시 B28 위치에 Lys를 또한 B29 위치에 Pro를 포함하므로, KP-인슐린은 가교결합력이 다소 증가할 수 있으나 상기 데이타는 이점을 명확히 보여주지 않는다. DKP-인슐린은 IGFR 가교결합력이 6배 증가하는 것으로 나타난다. 이러한 증가는 B24 위치의 오르토-모노플루오로-치환체에 의해 상쇄되는 점에 유의한다: 2F-Phe^B24-DKP-인슐린은 야생형 인간 인슐린과 유사한 낮은 가교결합력을 나타낸다. 당뇨 래트에서의 저혈당 효능 역시 인간 인슐린의 경우와 유사했다 (표 6). 2F-Phe^B24-DKP-인슐린은 단백질 농도가 0.5mM 초과할 경우에도 모노머 형태를 유지하므로, 이 유사체를 임상적 용도의 초고속 활성 및 초안정화 인슐린 제형으로 활용할 수 있다. 2Cl-Phe^B24-KP-인슐린 및 2Br-Phe^B24-KP-인슐린의 가교결합 친화력도 인간 인슐린의 경우와 유사하게 낮은 수준을 유지한다. 이러한 유사체 역시 당뇨 래트에서 충분히 활성화한다 (표 5).

CD 스펙트럼을 상술한 인간 인슐린, KP-인슐린(리스프로) 및 할로겐화 Phe^B24-인슐린 유사체에 대해 측정하였다. CD 검출될 단백질 변성 결과를 도 7A 및 7B에서와 같이 구아니딘 히드로클로라이드의 농도에 대한 함수로 제공한다. 도 7A는 인간 인슐린 (실선) 및 KP-인슐린 (점선: "모계")을 제2, 3 혹은 4 위치에 Phe^B24의 모노플루오로 치환물을 함유하는 KP-인슐린 유사체와 비교한 결과를 나타낸다 (각각 검은색 삼각형, 검은색 사각형, 흰색 원). 도 7B는 또한 인간 인슐린 (실선) 및 KP-인슐린 (점선: "모계")을 Phe^B24의 2-Cl 또는 2-Br 변형체와 비교한 결과를 나타낸다 (각각 검은색 역삼각형 및 흰색 삼각형). 추론되는 열역학 파라미터를 표 4에 열거한다. 25℃ 및 222nm에서 평균 타원율을 통해 부분적 언폴딩이 관측되었다.

선택된 인슐린 유사체의 NMR 구조를 통해 할로겐 치환물이 인슐린에 정상적으로 제공되고 있으며 전달 교란을 야기하지 않음을 확인하였다. ¹H-NMR 스펙트럼을 도 8A 및 8B에 나타낸다. 2Cl-Phe^B24-DKP 인슐린 (용액에서 모노머로 존재함)의 NMR 구조는 DKP-인슐린과 유사하다. 2F-Phe^B24-KP-인슐린 및 2Br-Phe^B24-KP-인슐린의NMR 스펙트럼에 대한 정성분석에서 자연형과 유사한 구조를 나타냈다.

결정 구조는 보존성 페놀의 존재하에 아연-안정화된 헥사머로서 2F-Phe^B24-KP-인슐린 및 4F-Phe^B24-KP-인슐린에 대하여 측정했다 (데이타 포함되지 않음). 그 구조는, 페놀 존재하의 아연-안정화 헥사머로서 선행 보고된 KP-인슐린의 구조와 유사하다. 각 경우에서, 헥사머의 형태는 2개의 축방향 아연 이온 및 3개의 결합 페놀 분자를 함유하는 T₃R^f ₃ 이다. 할로겐 원자의 전자밀도는 쉽게 관측된다. 할로겐화 유사체에서 다이머- 및 트리머- 형성면의 구조는 그대로 보존되며 이는, KP-인슐린이나 기타 다른 속효성 인슐린 유사체에 이용되는 것과 유사한 약제학적 제형을 제조할 수 있음을 시사하는 것이다.

환자 치료방법은 환자에게 할로겐-치환 인슐린 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 할로겐-치환 인슐린 유사체는 할로겐-치환 페닐알라닌, 예컨대, 플루오로-, 클로로- 또는 브로모-치환 페닐알라닌을 함유하는 인슐린 유사체이다. 한 특정의 실시예에서, 할로겐-치환 페닐알라닌은 2F-Phe^B24, 2F-Phe^B25 또는 2F-Phe^B26등이다. 또다른 실시예에서, 할로겐-치환 인슐린 유사체는 체내에서의 유사체 작용 속도를 변화하도록 설계된 인슐린 분자 내부의 어느 위치에서든 하나 이상의 치환물을 더 포함한다. 또다른 실시예에서, 인슐린 유사체는 외부형 인슐린 펌프 혹은 이식형 인슐린 펌프를 통해 투여할 수 있다. 본 발명의 인슐린 유사체는 또한, 계류중인 국제출원 PCT/US07/080467에 상세히 개시된 바와 같이, 기타의 변형체, 예컨대, B-사슬의 C-말단 및 A-사슬의 N-말단 사이에 테이터(tether)를 함유할 수도 있다. 위의 문헌을 본원에 참고로서 수록한다.

약제학적 조성물은 위와 같은 인슐린 유사체를 포함하며 선택적으로 아연도 함유할 수 있다. 아연 이온은 인슐린 유사체의 헥사머당 2.2 내지 3.0의 몰비에 해당하는 함량으로 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 제형에서, 인슐린 유사체의 농도는 통상 약 0.1 내지 3mM의 범위이며; 최대 3mM의 농도가 인슐린 펌프의 저장기에 이용될 수 있다. 식사시 인슐린 유사체의 변형체는 (a) 휴밀린^TM (Eli Lilly and Co.), 휴말로그^TM (Eli Lilly and Co.), 노발린^TM (Novo-Nordisk), 노발로그^TM (Novo-Nordisk) 등의 "레귤러" 제형 및 현재 인체에 대한 사용이 허가된 기타 속효성 인슐린 제형, (b) 상술한 유사체 및 기타 인슐린 유사체의 "NPH" 제형, 및 (c) 이들제형의 혼합물 등으로 제형화할 수 있다.

부형제는 글리세롤, 글리신, 기타의 완충제와 염류, 및 페놀 및 메타-크레졸 등의 항균성 보존제를 포함할 수 있으며; 후자와 같은 보존제는 인슐린 헥사머의 안정성을 개선하는 것으로 알려졌다. 약제학적 조성물은 생리학적 유효량으로 당뇨 혹은 기타 의료적 문제를 안고 있는 환자에게 투여하여 이를 치료하는데 이용될 수 있다.

암호화 서열을 포함하는 핵산도 생각할 수 있으며, 이때의 서열은 불화 페닐알라닌이 B24, B25 또는 B26 위치에 존재하는 인슐린의 적어도 B-사슬을 암호화하는 서열이 함유된 인슐린 유사체를 암호화할 폴리펩티드를 암호화하는 것이다. 이 목적은, 정지 코돈 (앰버 코돈, TAG 등)을 억제자 tRNA (앰버 코돈 사용시의 앰버 억제자) 및 이에 상응하는 tRNA 합성효소와 더불어 B24 위치에 도입함으로써 달성되며, 이 방법은 공지 기술에서와 같이 (Furter, 1998, Protein Sci. 7:419-426; Xie et al., 2005, Methods, 36:227-238) 정지 코돈에 대응하여 비표준 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하는 것이다. 특정 서열은 핵산 서열이 도입될 특정 종류에 대한 적절한 코돈의 용도에 따라 달라진다. 핵산은 또한 다른 야생형 인슐린의 변형체도 암호화할 수 있다. 핵산 서열은 폴리펩티드 혹은 변형 프로인슐린 유사체 내부의 임의의 위치에 무관련 치환물이나 연장물을 포함하는 변형 A- 또는 B-사슬 서열을 암호화할 수 있다. 또한 핵산은 발현벡터의 일부일 수 있으며 이 백터는 대장균 세포주 등의 원핵 숙주세포 혹은 S. cerreviciae 나 Pischia pastoris 균주 혹은 세포주 같은 진핵 세포주 등의 숙주세포에 삽입될 수 있다.

예를 들어, 이스트 Piscia pastoris 및 기타 미생물에서 B-사슬 폴리펩티드을 발현시키도록 합성 유전자를 합성하는 것도 생각할 수 있다. 할로겐화 페닐알라닌을 B24 위치에 삽입할 목적으로, 이 위치에 있는 정지 코돈을 활용하는 B-사슬 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 서열 혹은 이의 변이체를 포함한다:

(a) 인간 코돈 선호성:

[서열번호 12]

(b) 효모 (Pichia) 코돈 선호성:

[서열번호 13]

마찬가지로, 인간 코돈 선호성을 갖고 또한 할로겐화 페닐알라닌을 B24 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하는 전길이 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 14의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 14]

또한 이와 유사하게, 할로겐화 페닐알라닌을 B24 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하고 또한 P. pastoris가 선호하는 코돈을 갖는 전길이 인간 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 15의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 15]

이와 유사하게, 할로겐화 페닐알라닌을 B25 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하는 B-사슬 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열은 다음의 서열 및 이의 변이체를 포함한다:

(b) 인간 코돈 선호성:

[서열번호 19]

(b)) 효모 (Pichia) 코돈 선호성:

[서열번호 20]

인간 코돈 선호성을 갖고 또한 불화 페닐알라닌 같은 할로겐화 페닐알라닌을 B25 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하는 전길이 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 21의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 21]

또한 이와 유사하게, 불화 페닐알라닌 같이 할로겐화 페닐알라닌을 B25 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하고 또한 P. pastoris가 선호하는 코돈을 갖는 전길이 인간 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 22의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 22]

이와 유사하게, 할로겐화 페닐알라닌을 B26 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하는 B-사슬 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열은 다음의 서열 및 이의 변이체를 포함한다:

(c) 인간 코돈 선호성:

[서열번호 23]

(b) 효모 (Pichia) 코돈 선호성:

[서열번호 24]

인간 코돈 선호성을 갖고 또한 할로겐화 페닐알라닌을 B26 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하는 전길이 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 25의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 25]

또한 이와 유사하게, 할로겐화 페닐알라닌을 B26 위치에 삽입할 목적으로 이 위치의 정지 코돈을 활용하고 또한 P. pastoris가 선호하는 코돈을 갖는 전길이 인간 프로-인슐린 cDNA은 SEQ. ID. No. 26의 서열을 가질 수 있다.

[서열번호 26]

동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 상기 서열의 기타 변이체도 가능하며 동일한 유전자코드를 부여한다.

상술한 내용에 근거하여, 할로겐 치환 인슐린 유사체가 앞서 언급한 목적을 수행함을 명확히 알 수 있다. 즉, 이들 인슐린 유사체는 개선된 열역학적 안정성, 세동에 대한 내성 및 혈당 감소 효능 등을 발휘한다. 할로겐 치환 페닐알라닌-함유 인슐린 유사체는 또한 인슐린-유사 성장인자(IGFR)에 대한 가교반응성이 낮다. 따라서, 다양한 변이체가 본 발명의 특허보호 범위 내에 속하는 것이 명백하며 특정 구성분을 선택하는 것은 상술한 본원의 사상에서 벗어나지 않는 것으로 판단할 수 있다.

본원에 기술된 다양한 시험법 및 분석법은 다음과 같은 문헌에 공지되어 있으며 당해 분야의 지식을 가진 자라면 이를 충분히 이해할 수 있을 것이다:

[공지문헌목록]

<110> CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY <120> HALOGEN-STABILIZED INSULIN <130> 110238-CASEWESTERN <150> US 61/085,212 <151> 2008-07-31 <160> 26 <170> KoPatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> One Phe is halogenated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> One Phe is halogenated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 5 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> One Phe is halogenated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 7 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is His or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> One Phe is halogenated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa is Pro, Lys or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is Lys or Pro <220> <221> VARIANT <222> (31)..(65) <223> Any 0-35 residues or a break in the amino acid chain may be present. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(65) <223> Residue at any positions 31-65 may be any amino acid residue; no relative information regarding relative frequency of alternative residues is implied. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69) <223> Xaa is His or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73) <223> Xaa is His or Thr <400> 7 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Gly Ile Val Xaa Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> One Phe is halogenated <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 8 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> One Phe is halogenated <400> 9 Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> One Phe is halogenated <400> 10 Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct agttctacac acccaagacc 90 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt agttttacac tccaaagact 90 <210> 14 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct agttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggcgg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaacta g 261 <210> 15 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt agttttacac tccaaagact agaagagaag ctgaagattt gcaagttggt 120 caagttgaat tgggtggtgg tccaggtgct ggttctttgc aaccattggc tttggaaggt 180 tctttgcaaa agagaggtat tgttgaacaa tgttgtactt ctatttgttc tttgtaccaa 240 ttggaaaact actgtaacta a 261 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Phe is halogenated <400> 18 Gly Phe Phe Phe Thr Lys Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tctagtacac acccaagacc 90 <210> 20 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt tttagtacac tccaaagact 90 <210> 21 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tctagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggcgg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaacta g 261 <210> 22 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt tttagtacac tccaaagact agaagagaag ctgaagattt gcaagttggt 120 caagttgaat tgggtggtgg tccaggtgct ggttctttgc aaccattggc tttggaaggt 180 tctttgcaaa agagaggtat tgttgaacaa tgttgtactt ctatttgttc tttgtaccaa 240 ttggaaaact actgtaacta a 261 <210> 23 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctagac acccaagacc 90 <210> 24 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt ttttttagac tccaaagact 90 <210> 25 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct tcttctagac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggcgg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaacta g 261 <210> 26 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt ttttttagac tccaaagact agaagagaag ctgaagattt gcaagttggt 120 caagttgaat tgggtggtgg tccaggtgct ggttctttgc aaccattggc tttggaaggt 180 tctttgcaaa agagaggtat tgttgaacaa tgttgtactt ctatttgttc tttgtaccaa 240 ttggaaaact actgtaacta a 261

Claims

할로겐화 페닐알라닌이 B24, B25 혹은 B26 위치에 삽입되어 있는 B-사슬 폴리펩티드를 갖는 인슐린 유사체.
제 1항에 있어서,
할로겐화 페닐알라닌이 B24 위치에 있는 것인 인슐린 유사체.
제 1항에 있어서,
할로겐화 페닐알라닌은 오르토-모노플루오로-페닐알라닌, 오르토-모노브로모-페닐알라닌 혹은 오르토-모노클로로-페닐알라닌인 것인 인슐린 유사체.
제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
유사체는 포유류 인슐린의 유사체인 것인 인슐린 유사체.
제 4항에 있어서,
상기 유사체는 인간 인슐린의 유사체인 것인 인슐린 유사체.
제 4항에 있어서,
B-사슬 폴리펩티드는 서열번호 No. 4 내지 8로 이루어진 군에서 선택괸 아미노산 서열 및 3개 이하의 추가적인 아미노산 치환체를 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
제 4항에 따른 인슐린 유사체를 암호화하는 핵산.
제 7항에 있어서,
할로겐화 페닐알라닌이 정지 코돈에 의해 암호화되는 것인 핵산.
제 8항에 있어서,
정기 코돈은 핵산 서열 TAG 인 것인 핵산.
제 7항, 8항 또는 9항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 10항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
생리학적 유효량의 인슐린 유사체 혹은 이의 생리학적 수용가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 치료방법으로서, 인슐린 유사체나 이의 생리학적 수용가능한 염은 할로겐화 페닐알라닌이 B24, B25 혹은 B26 위치에 삽입된 B-사슬 폴리펩티드를 함유하는 것인 치료방법.
제 12항에 있어서,
할로겐화 페닐알라닌은 B24 위치에 있는 것인 치료방법.
제 13항에 있어서,
할로겐화 페닐알라닌은 오르토-모노플루오로-페닐알라닌, 오르토-모노브로모-페닐알라닌 또는 오르토-모노클로로-페닐알라닌인 것인 치료방법.
제 14항에 있어서,
B-사슬 폴리펩티드는 서열번호 No. 4 내지 8 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 및 3개 이하의 추가적인 아미노산 치환체를 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 치료방법.